Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola
Ph.D értekezés
A gerincvelői µ és δ opioid receptorok szerepe az opioid tolerancia kialakulásában
Dr. Riba Pál
Témavezető: Dr. Fürst Zsuzsanna D.Sc.
Semmelweis Egyetem Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet Budapest, 2004
1
Szigorlati Bizottság: Elnök: Dr. Monos Emil D.Sc., egyetemi tanár, SE II. Élettani Intézet Dr. Darvas Katalin Ph.D., egyetemi tanár, SE I.sz. Sebészeti Klinika Dr. Zelles Tibor Ph.D, MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet
Bírálók: Dr. Barthó Lóránd D.Sc., tanszékvezető egyetemi tanár, Pécsi Egyetem, Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet Dr. Keller Éva Ph.D., tanszékvezető egyetemi tanár, Semmelweis Egyetem, Igazságügyi Orvostani Intézet
2
TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ................................................................................................... 6 2. ÖSSZEFOGLALÁS.................................................................................................................. 8 2.1. SUMMARY ....................................................................................................................... 9 3. BEVEZETÉS .......................................................................................................................... 10 3.1 Az endogén opioid rendszer és az opioid receptorok ........................................................ 10 3.2 Opioid receptor ligandok ................................................................................................... 12 3.2.1 Nem peptid szerkezetű opioidok................................................................................. 12 3.2.2 Peptid szerkezetű opioidok ......................................................................................... 13 3.3 Opioid receptor altípusok .................................................................................................. 13 3.3.1 µ opioid receptor altípusok ......................................................................................... 14 3.2.2 δ opioid receptor altípusok.......................................................................................... 15 3.4 Az opioid receptorok szerepe a fájdalomcsillapításban..................................................... 16 3.5 Opioid receptor interakciók ............................................................................................... 18 3.5.1 Lokális interakciók...................................................................................................... 18 3.5.2 Nem lokális interakciók .............................................................................................. 20 3.6 Az opioid tolerancia lehetséges mechanizmusai ............................................................... 21 3.7 Opioid receptorok polimorfizmusa.................................................................................... 24 4. CÉLKITŰZÉSEK ................................................................................................................... 26 5. MÓDSZEREK ........................................................................................................................ 27 5.1 Kísérleti állatok.................................................................................................................. 27 5.2 Az opioid tolerancia létrehozása........................................................................................ 27 5.3 Anyagok ............................................................................................................................ 28 5.3.1 Heterociklikus opiátok ................................................................................................ 28 5.3.2 Opioid peptidek........................................................................................................... 28 5.3.3 Az in vivo kísérletekben használt egyéb anyagok ...................................................... 28 5.3.4 A DNS preparáláshoz használt anyagok ..................................................................... 28 5.3.5 Az RNS preparáláshoz használt anyagok ................................................................... 28 5.3.6 A PCR -hez és RT-PCR -hez használt anyagok.......................................................... 29 5.4 Az állatok kezelése a kísérletek során ............................................................................... 30 5.5 Az antinociceptív teszt....................................................................................................... 31 5.6 A tail-flick teszten kapott adatok elemzése és az alkalmazott statisztikai vizsgálat.......... 31 5.7 A tolerancia mértékének meghatározása ........................................................................... 32 5.8 Az antagonista vegyületek pA2 értékének meghatározása................................................. 33
3
5.9 A polimorfizmus vizgálatához alkalmazott molekuláris biológiai módszerek.................. 34 5.9.1 Genomiális DNS preparálása ...................................................................................... 34 5.9.2 Totál RNS preparálása agyszövetből és gerincvelőből ............................................... 35 5.9.3 PCR és RT-PCR kivitelezése ...................................................................................... 36 5.9.4 DNS szekvencia meghatározása és összehasonlítása a génkönyvtárban megadott nukleotid sorrenddel............................................................................................................. 36 6. EREDMÉNYEK ..................................................................................................................... 37 6.1 A különböző egértörzsek szubkután adott morfinhoz kialakuló toleranciája.................... 37 6.2 A különböző egértörzsek intratekálisan adott morfinhoz kialakuló toleranciája............... 37 6.3 A magas és alacsony morfintoleranciájú egértörzsek primer opioid receptor szekvenciáinak összehasonlítása ............................................................................................. 38 6.4 A [Dmt1]DALDA antinociceptív hatásának vizsgálata naív és morfintoleráns egerekben39 6.4.1 A szubkután adott [Dmt1]DALDA antinociceptív aktivitása naív és morfin toleráns egerekben ............................................................................................................................. 39 6.4.2 Az intratekálisan (it.) és intracerebroventrikulárisan (icv.) adott [Dmt1]DALDA antinociceptív hatása ............................................................................................................ 43 6.4.3 Az it. és icv. adott naloxon-metiodid hatása az it. és icv. adott [Dmt1]DALDA által kifejtett antinociceptív hatásra ............................................................................................. 43 6.4.4 A [Dmt1]DALDA opioid receptor szelektivitása a gerincvelőben.............................. 44 6.5 A gerincvelői szinten megvalósuló µ és δ kölcsönhatások vizsgálata naív és morfintoleráns egerekben ........................................................................................................ 46 6.5.1 A szelektív µ-agonista DAMGO és a szelektív δ-agonista DPDPE antinociceptív hatása naiv és morfin-toleráns egerekben ............................................................................ 46 6.5.2 A DAMGO és DPDPE antinociceptív hatásának antagonizálása CTAP-pal ............. 47 6.5.3 A szelektív δ antagonista TIPPψ hatása a DAMGO és DPDPE antinociceptív hatására naív és morfintoleráns egerekben ........................................................................................ 50 7. MEGBESZÉLÉS..................................................................................................................... 55 7.1 Morfintolerancia kialakulása a különböző egértörzsekben ............................................... 55 7.1.1 Három napos morfinpellet beültetésének hatására szubkután adott morfinhoz kialakuló tolerancia .............................................................................................................. 55 7.1.2 Az opioid receptor gének polimorfizmusa a vizsgált egértörzsekben......................... 56 7.1.3 A különböző opioid agonisták között kialakuló kialakuló kereszttolerancia vizsgálata szubkután adagolás mellett .................................................................................................. 58 7.2 Különböző opioid agonisták spinális antinociceptív hatásának vizsgálata morfintoleráns egerekben................................................................................................................................. 59
4
7.2.1 A [Dmt1]DALDA antinociceptív hatásainak vizsgálata naív állatokban.................... 60 7.2.2 A morfin, DAMGO, DPDPE és [Dmt1]DALDA spinális hatásainak vizsgálata morfintoleráns egerekben..................................................................................................... 61 7.3 Gerincvelői kölcsönhatás a µ és δ opioid receptorok között ............................................. 62 7.3.1 µ-δ kölcsönhatás gerincvelőben naív állatokban ........................................................ 62 7.3.2 µ-δ kölcsönhatások szerepe a gerincvelői szinten kialakuló opioid toleranciában ..... 63 7.4 A gerincvelői opioid tolerancia kialakulásának hipotetikus modellje ............................... 66 7.5 Az új eredmények összefoglalása...................................................................................... 68 7.6 Zárszó ................................................................................................................................ 68 8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS................................................................................................. 69 9. IRODALOMJEGYZÉK.......................................................................................................... 70
5
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE [3H]DPDPE:
[3H]Tyr-D-Pen2,5-enkefalin, triciált, radioaktív DPDPE
[3H]DSLET:
[3H]Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr, triciált, radioaktív DSLET
[Dmt1]DALDA:
(2’6’-dimetil-Tyr)-D-Arg-Phe-Lys-NH2
AD50:
a kísérleti állatok 50%-ában effektív antinociceptív dózis
BNTX:
η-benziliden-naltrexon
cDNS:
komplementer DNS
CTAP:
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2
CTOP:
D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Orn-Thr-Pen-Thr-NH2
DADLE:
D-Ala2-D-Leu5-enkefalin
DALCE:
[D-Ala2, Leu5, Cys6]enkephalin
DALDA:
Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2
DALE:
D-Ala2-Leu5-enkefalin
DAMGO:
H-Tyr-D-Ala2-Gly-(N-Me)Phe-Gly-ol
DIPP-NH2ψ:
(2’6’-dimetil-Ticψ[CH2NH]-Phe-Phe-NH2
dNTP:
dezoxi-nukleozid-trifoszfát
DOR-1:
delta-opioid-receptor-1
DPDPE:
D-Pen2,5-enkefalin
DSLET:
Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr
DTLET:
Tyr-D-Thr-Gly-Phe-Leu-Thr
ICI 154129:
N,N-diallyl-Tyr-Gly-ψ-(CH2)-Phe-Leu-OH
ICI 174864:
N,N-diallyl-Tyr-Aib-Aib-Phe-Leu-OH
Leu-enkefalin:
Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, leucin-enkefalin
Met-enkefalin:
Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, metionin-enkefalin
MOR-1:
mű-opioid-receptor-1
norBNI:
norbinaltorphimin
NTB:
naltriben
NTI:
naltrindol
NTII:
naltrindol-5’-izotiocianát
oligo-dT:
oligo-dezoxitimidin
pCl-DPDPE:
[D-Pen2, pCl-Phe4, D-Pen5]enkephalin
6
PCR:
polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció
RT-PCR:
reverz transzkriptáz-PCR
SNC-80:
(+)-4-[(alpha R)-alpha-((2S,5R)-4-allyl-2,5-dimethyl-1piperazinyl)-3- methoxybenzyl]-N,N-diethylbenzamide
SNP:
single nucleotide polymorphism
TAN-67:
2-metil-4aα-(3-hidroxifenil)-1,2,3,4,4a,5,12,12aα-oktahidrokinolino[2,3,3-g]-izokinolin
TIPPψ:
H-Tyr-Ticψ[CH2NH]Phe-Phe-OH
TIPP:
H-Tyr-Tic-Phe-Phe-Thr-OH
U50488H:
transz-(±)-3,4-dikloro-N-metil-N(2-(1-pirrolidinil)-ciklohexil)benzacetamid metán szulfonát
U69593:
(5α,7α,8β)-(+)-N-metil-N-(7-(1-pirrolidinil)-1-oxaspiro(4,5)dec8-il)benzénacetamid
7
2. ÖSSZEFOGLALÁS Ismert, hogy a klinikumban a mai napig igen gyakran alkalmazott morfin krónikus adása esetén több hatásához is tolerancia fejlődik ki. Emellett légzésdepresszív mellékhatása, valamint a hozzászokás veszélye is korlátozza alkalmazását. A kutatások egyik fő célja e hátrányok kiküszöbölése vagy csökkentése. Kutatásainkban az opioid tolerancia egyes aspektusait vizsgáltuk morfinpellet beültetéses egérmodell segítségével. Megállapítottuk, hogy a különböző egértörzsekben a morfintolerancia eltérő mértéke nem függ a három opioid receptor genetikai szekvenciáinak polimorfizmusaitól. A szubkután adott morfinhoz jelentős tolerancia alakul ki, míg a morfin intratekális adásakor a tolerancia alig mérhető. Megvizsgáltuk a rendkívül hatékony és szelektív µ agonista [Dmt1]DALDA opioid peptid hatásait naív és morfintoleráns egérben. A [Dmt1]DALDA mind szubkután, mind intratekálisan bejuttatva a morfinnál sokkal hatékonyabb, hatástartama pedig elnyújtottabb. A morfin és a [Dmt1]DALDA között nem jött létre kereszttolerancia. A gerincvelői µ és δ receptorok közötti interakciót vizsgálva kimutattuk, hogy morfintoleráns egérben a rendkívül szelektív δ antagonista TIPPψ potencírozta a µ receptor szelektív agonista DAMGO antinociceptív hatását intratekális adagolás esetén. Eredményeink magyarázatához segítséget adhatnak a legújabb kutatások, amelyek µδ receptor heterodimerek képződését igazolták. Mivel a δ receptorok denzitása morfintolerancia kialakulása során megnő, valószínűleg a µδ dimerek száma is nagyobb lesz. A különböző opioid agonisták és antagonisták eltérő viselkedése a µδ heterodimeren magyarázatot adhat a morfin és a [Dmt1]DALDA között kialakuló inkomplett kereszttoleranciára és a TIPPψ-nek a DAMGO hatását potencírozó tulajdonságára morfintoleráns egérben.
8
2.1. SUMMARY It is a well-know phenomenon that in case of chronic administration of morphine tolerance develops to its most effects. Besides, its respiratory depressive effect and the risk of dependence further limit its use. Eliminating or reducing these drawbacks is one of the main purposes of the opioid research. We studied some aspects of the opioid tolerance by means of a mouse model applying morphine pellet implantation. We found different levels of morphine tolerance in several mouse strains. The levels of tolerance did not depend on the polymorphisms of the genetic sequences of the three main opioid receptors. While significant tolerance developed to subcutaneously given morphine, we could hardly detect tolerance to it. given morphine. We also investigated the analgesic effect of the highly potent and selective µ opioid agonist peptide [Dmt1]DALDA on naive and morphine tolerant mice. [Dmt1]DALDA proved to be a much more potent and longer acting agonist than morphine given both subcutaneously and it. Cross-tolerance did not developed between morphine and [Dmt1]DALDA. Studying the interactions between the spinal µ and δ opioid receptors we found a potentiating synergism between the highly selective δ antagonist TIPPψ and the µ receptor agonist DAMGO in morphine tolerant mice when both drugs were given it. Recent studies suggested that µ and δ receptors may form a µδ heterodimer. During the development of morphine tolerance the δ receptor density increases in the central nervous system and the number of the µδ heterodimers may also be higher. The different behaviours of the opioid agonists and antagonists on the µδ heterodimer may explain the incomplete cross-tolerance between morphine and [Dmt1]DALDA and the potentiating effect of TIPPψ on the antinocicpetive activity of DAMGO at the spinal level.
9
3. BEVEZETÉS Régóta, már a történelmi időktől fogva ismert, hogy a mákgubóból készült bódító készítmények több hatásához is tolerancia fejlődik ki, amennyiben rendszeresen alkalmazzák őket. A medicinában a mák egyes alkaloidjait (morfin, kodein), és a velük megegyező
hatásmechanizmusú
gyógyszereket
főképpen
fájdalomcsillapításra
használják. Mind a mai napig, a legkedveltebb és leggyakrabban alkalmazott opioid hatású vegyület a morfin (Sertürner, 1805). Kiválóan alkalmas mind az elviselhetetlen akut fájdalom (pl. miokardiális infarktus), mind az erős krónikus fájdalom (pl. tumoros fájdalom) csillapítására. Használatát azonban korlátozza, hogy jelentős nemkívánatos hatásai is vannak (pl. gátolja a légzőközpont működését, euforizál, szedatív), valamint krónikus alkalmazása során dependencia, illetve legtöbb hatásához - különböző mértékben ugyan, - de tolerancia fejlődik ki. A morfinhoz hasonló hatáserősségű, ám kevesebb mellékhatással rendelkező gyógyszerek kifejlesztésére irányuló kutatások két legfőbb célja az, hogy a fájdalomcsillapító hatás erőssége ne csökkenjen, illetve krónikus alkalmazás során ne, vagy csak jóval lassabban fejlődjön ki tolerancia. Jelen dolgozat az opioid tolerancia egyes aspektusait tárgyalja, különös tekintettel arra, hogy a
tolerancia
kialakulásában
mi
a
szerepe
a
különböző
opioid
receptorok
polimorfizmusának, a µ receptor iránti szelektivitásnak és a gerincvelői δ opioid receptornak. Mivel a dolgozatnak nem témája a κ opioid receptor, ezért ennek jellemzőit csak érintőlegesen tárgyalja. 3.1 Az endogén opioid rendszer és az opioid receptorok Az opioidok, hasonlóan a legtöbb gyógyszerhez, a szervezetben receptorok aktiválásán keresztül fejtik ki hatásaikat. Már 1954-ben fölmerült, hogy legalább két opioid receptor típus létezik (118). Később különböző opioid ligandok segítségével három alapvető opioid receptor létezését valószínűsítették, nevezetesen a µ, a κ és a δ receptorét (67, 126, 130 191), amelyek mind szervezeten belüli eloszlásukban, mind pedig ligandkötő képességeikben és funkcióikban eltérően viselkednek. A receptorokat gyakorlatilag egyidőben írták le az endogén opioidokkal, azóta beszélhetünk endogén opioid rendszerről, amelynek működése mind a mai napig intenzív kutatások tárgya.
10
1973-ban Snyder, 1975-ben Terenius és mtsai., valamint Hughes és mtsai. mutatták ki először, hogy agyszövet kivonatok opioid hatásokat mutatnak (89, 168, 220, 243, 244). Röviddel ezután izolálták az agyszövet kivonat opioid hatásáért felelős pentapeptideket, amelyeket enkefalinoknak neveztek el (88, 162). A Leu- és Met-enkefalin opioid receptor kötését 1976-ban Snyder és mtsai. elemezték (219). Hamarosan más endogén opioid peptideket is izoláltak, 1976-ban az endorfinokat (15, 44, 45, 70), majd 1979-ben a dinorfinokat (69). Az endogén opioid vegyületcsalád legutóbbi, 1997-ben felfedezett tagjai az endomorphinok (endomorphin-1 és endomorphin-2), amelyek a µ receptorhoz kötődnek (272). Minden endogén opioid peptid szerkezetű, és nagyobb prekurzor molekulákból képződik. Az enkefalinok prekurzora a proenkefalin (156), a dinorfinoké a prodinorfin (98), az endorfinoké pedig a proopiomelanocortin (150). Az endomorfinok előanyagát eddig még nem sikerült izolálni. A molekuláris biológiai kutatások végül elvezettek az opioid receptor klónozásához is, így az aminosav-sorrend megállapítása is megtörténhetett. Legelőször a δ receptor génjét találták meg, amelyet rövidesen követett a κ receptor génje, végül pedig a µ receptor kódja is ismertté vált (31, 56, 102, 267). A kutatások eddig mindössze egyetlen allél létezését igazolták, µ, κ és δ receptorokra egyaránt. A klónozott δ-receptort az irodalom DOR-1-nek, a µ receptort MOR-1-nek, a κ receptort pedig KOR-1-nek nevezi (31, 56, 102, 267). Mindhárom opioid receptor a hét transzmembrán doménnel rendelkező Gprotein kapcsolt receptorok közé tartozik (7, 99, 140, 175). A receptorok között nagyfokú homológia figyelhető meg, különösen a transzmembrán régiók aminosavsorrendje hasonló (31, 56, 102, 267,). Az opioid receptorok Gi/Go és Gq proteineket aktiválnak, így a következő second messenger rendszerekhez kapcsolódnak: adenilcikláz gátlás, (7, 34, 104, 140, 142, 217) Ca++-csatorna gátlás, (142, 183, 215) K+csatorna nyitás, (6, 127, 157) valamint a foszfoinozitol kaszkád aktiválása (96, 141, 222). Az opioidok fájdalomcsillapító hatását mindezek a celluláris aktivációk illetve gátlások magyarázhatják (180, 205, 206, 207).
11
3.2 Opioid receptor ligandok Az újabb és újabb opioidok utáni kutatás számtalan vegyületet eredményezett, amelyek
hatáserőssége,
hatékonysága,
affinitása
és
szelektivitása
rendkívüli
változatosságot mutat. Alapvetően két kémiai csoportra, peptidekre és nem peptid szerkezetekre oszthatók.
3.2.1 Nem peptid szerkezetű opioidok
A nem peptid szerkezetű opiátok prototípusa a morfin, amely kiindulási vegyületként számos opiát ligand kifejlesztésében játszott szerepet. A dolgozatnak nem célja ennek a hatalmas variabilitásnak a bemutatása, így csak néhány, a kutatásokban gyakran felbukkanó szerkezetet említek meg. Referencia antagonistaként a naloxont (Nallyl-noroxymorfon) alkalmazzuk, amely kis szelektívitású opioid antagonista (137). Hasonló jellemzőkkel bír a naltrexon is (N-ciklopropylmetil-noroxymorfon) (16, 131). Az opiát hatás egyik kritériuma a naloxonnal való kompetitív antagonizálhatóság (46, 107). Az opioid receptorok fő típusainak elnevezése is részben a ligandoknak köszönhető, így a µ receptor a morfin első betűjéről, míg a κ receptor egy benzomorfán szerkezet, a ketociklazocin első betűjéről kapta a nevét (130). A δ receptor elnevezésének eredete az egér vas deferensének a d betűje (126). A κ receptorok kutatásában agonistaként többek között az etilketociklazocint (82), az U50488H (252) és az U69593 (113) jelzésű szintetikus agonistákat, illetve a norbinaltorfimint (norBNI) (176), mint antagonistát alkalmazzák. A δ receptorok szelektív ligandjai között sokáig csak peptideket találtak, majd megjelentek a nem peptid antagonisták is, melyek prototípusa a naltrindol (NTI) (178), egyéb képviselői a naltriben (NTB) (226), a benzilidénnaltrexon (BNTX) (177), és az irreverzibilis kötődésű naltrindol-izotiocianát (NTII) (95). A nem peptid szerkezetű δ agonisták a TAN-67 (236) és az SNC-80 (13).
12
3.2.2 Peptid szerkezetű opioidok
Amint arra már korábban utaltam, a nem peptid vegyületek mellett a farmakológiai kutatásokban használt opioid hatású vegyületek másik csoportját a peptid szerkezetek alkotják. Az endogén opioid peptidek egy része gyorsan, más része lassabban metabolizálódik. A kutatásokban azonban stabil vegyületekre van szükségünk, ezért számos, a metabolikus enzimekre rezisztens peptidet fejlesztettek ki. Az egyik első stabil opioid peptidszármazék a DALE volt (184, 223). A farmakológiai receptorok kutatásában elengedhetetlen a szelektív kötődésű és hatású vegyületek keresése és vizsgálata. A mai napig az egyik legszelektívebb, a kutatásokban referencia anyagként alkalmazott µ receptor agonista peptid a DAMGO (108). Kísérleteinkben mi is ezt a peptidet használtuk szelektív, referencia µ agonistaként. Egy másik, a µ receptor iránt nagy affinitást mutató peptid az 1981-ben felfedezett dermorphin, amelyet egy délamerikai béka bőréből izoláltak (24, 143, 144). A dermorphin jó kiindulási alapnak bizonyult nagy szelektivitású µ agonisták kifejlesztéséhez, amelyek ellenállónak bizonyultak a metabolizáló enzimekkel szemben is (204). Így szintetizálták előbb a DALDA-t (212), majd a [Dmt1]DALDA-t (211). A µ antagonista peptidek közül a CTOP és a CTAP szomatosztatin származékok mutatnak jelentős µ szelektivitást (166). Referencia µ antagonistaként mi is CTAP-ot alkalmaztunk. A ma is leggyakrabban használt, referencia δ agonistát, a DPDPE-t, 1983-ban szintetizálták (146), a deltorphin II-t pedig 1989-ben írták le. (55, 112) Rajtuk kívül számos egyéb δ-receptor szelektív peptidet ismerünk: agonisták például a DTLET (273), DSLET (49), deltorphin I (55, 112) és a pCl-DPDPE (250), míg antagonista peptid az irreverzibilis kötődésű DALCE (23) a kompetitív antagonista ICI 154129 (43), ICI 174864 (42), TIPP és TIPPψ (152, 213). 3.3 Opioid receptor altípusok A szelektív agonistákkal és antagonistákkal végzett kutatások eredményeképpen opioid receptor altípusokat sikerült elkülöníteni, amelyeket farmakológiai altípusoknak nevezünk, elkülönítendő a genetikai módszerekkel izolált eltérő szekvenciáktól.
13
3.3.1 µ opioid receptor altípusok
A µ receptoroknak három farmakológiai altípusát írták le eddig: a µ1-et, µ2-t és a µ3-at. Először radioaktív ligand-kötési kísérletekben mutattak ki két különböző affinitású morfin kötőhelyet. Az úgynevezett nagy affinitású morfin kötőhelyet, amelyhez az enkefalinok is nagy affinitással kötődnek, µ1-nek, az ettől különböző, kis affinitású morfin-szelektív kötőhelyet µ2-nek nevezték el (75, 160, 257). A µ1 receptorok abban is eltérnek a µ2-től, hogy egyes δ agonista enkefalin analógokat (DADLE, DSLET) nagy affinitással kötnek (36), míg a DPDPE-t nem (37). Az elkülönítés másik alapjául a µ1 szelektív irreverzibilis antagonistákkal, a naloxazonnal és naloxonazinnal végzett kísérletek szolgáltak (72, 160, 161). A naloxonazin előkezelés 24 óra múlva is gátolta a morfin analgéziát, míg a légzésdepressziót nem. Ennek alapján arra következtettek, hogy a morfin antinociceptív hatásáért naloxonazin szenzitív µ1 receptorok, a légzésdepresszív hatásért viszont a naloxonazin inszenzitív µ2 receptorok felelősek (123). A µ3 receptort 1994-ben gerinctelenek immunsejtjein és egér makrofág sejteken írták le (128), majd megtalálták emlős macroglia sejteken és asztrocitákon (52), valamint endothel sejteken is (234). A µ3 receptor nagy affinitással köti a morfinszármazékokat, míg a természetes peptid szerkezetű opioidokat (Met-enkephalin, dinorfin1-17, deltorphin) és analógjaiakat (DAMGO, DADLE) alig (128). A µ receptor génjének megismerése után genetikai alapon is megpróbálták elkülöníteni a µ receptor altípusokat. A különböző MOR-1 exonok ellen készített antiszensz-oligo-DNS-ekkel különítették el a morfin és aktív metabolitja, a morfin-6glükuronid antinociceptív hatását. A MOR-1 exon 1 és exon 4 elleni antiszensz-DNS csak a morfin antinociceptív hatását gátolta, míg a MOR-1 exon 2 és 3 elleni antiszenszDNS csak a morfin-6-glükuronidét (192, 193). Később számos MOR-1 splice variánst izoláltak (106, 159), azonban közvetlen kapcsolatot a farmakológiai módszerekkel leírt µ receptor altípusokkal még nem mutattak ki.
14
3.2.2 δ opioid receptor altípusok
A δ receptor altípusainak leírása, illetve létezésük felvetése két eltérő irányból indult el. 1980-as évek elején Rothman és mtsai. azt találták, hogy a morfin nonkompetitív módon gátolta a triciált Leu-enkefalin kötődését agyszövetben (201, 202, 203). Eredményeiket úgy magyarázták, hogy a µ és δ receptorok valamilyen módon komplexálódnak, el is nevezték a szerintük komplexálódó receptort δcx-nek („komplexált δ receptor”), a µ receptor független δ altípust pedig δncx-nek („nemkomplexált δ receptor”). A µ és δ receptor komplexálódásával kapcsolatos ismereteket a 3.5 fejezetben részletezem. A másik megközelítési módot a szelektív µ és δ agonistákkal és antagonistákkal végzett kísérletek jelentették. Egyrészt úgy találták, hogy DPDPE-t és deltorphin II-t icv. adva, egér tail-flick teszten az adott vegyülettel icv. történő krónikus kezelést követően nem alakult ki kereszttolerancia (135), másrészt pedig különböző, szelektív δ antagonisták eltérő mértékben gátolták a DPDPE és a deltorphin II antinociceptív aktivitását. A szelektív, irreverzibilis δ antagonista DALCE, szupraspinális szinten erősebben antagonizálta a DPDPE antinociceptív hatását, mint a deltorphin II-ét, míg a NTII a deltorphin II-re fejtett ki nagyobb antagonista hatást (95). Az antagonizmusok különbözőségén, és a kereszttolerancia hiányán alapuló felosztás szerint beszélünk DPDPE, DALCE és BNTX érzékeny δ1 receptorról (95, 177, 224, 225) valamint deltorphin II, NTII és NTB érzékeny δ2 receptorról (30, 95, 226,). Gerincvelői szinten nem sikerült kimutatni DALCE által létrehozott antagonizmust DPDPE és deltorphin II ellen tail-flick teszten, ezért egyes vélemények szerint spinálisan nincsenek δ1, csak δ2 receptorok. Mind a deltorphin II, mind a DPDPE hatását NTII-vel sikerült antagonizálni gerincvelőben, de DPDPE ellen 10x akkora NTII dózisra volt szükség, mint deltorphin II ellen (134). A δ1 receptorok gerincvelőbeni hiányát cáfolják azok az eredmények, melyek szerint a szintetikus δ agonista TAN-67 spinális antinociceptív hatását a δ1 szelektív BNTX-szel lehet antagonizálni (246). A κ receptornak eddig 4 altípusát különítették el, a κ1a-t, κ1b-t, κ2-t és a κ3-at (26, 38, 145).
15
3.4 Az opioid receptorok szerepe a fájdalomcsillapításban A morfin fájdalomcsillapító hatásmechanizmusának megértéséhez tudnunk kell, hogy milyen opioid receptorok vesznek részt a hatás közvetítésében. A kutatások során kiderült, hogy hatást közvetítő receptor típusa függ az alkalmazott fájdalmas stimulus természetétől, a kísérletben vizsgálni kívánt opioid agonistától és annak alkalmazási módjától, vagyis hogy milyen úton juttatjuk be. A hőhatáson alapuló antinociceptív tesztek főleg a µ receptor közvetítette analgetikus hatásra érzékenyek (130, 265), míg a kémiai ingerekkel kiváltott fájdalomérzetet a κ mediálta hatások csillapítják jobban (173, 214). A morfin és a hozzá hasonló szerkezetű vegyületek kötési és bioassay kísérletekben mért µ affinitásai jól korrelálnak az analgetikus hatásukkal (5, 46). Genetikai módszerekkel is bizonyították a µ receptor meglétének alapvető fontosságát. A µ receptor knock-out állatokban teljesen megszűnt a morfin analgetikus hatása, és dependencia sem alakult ki (132, 230). Mindezek egyértelművé teszik a µ receptor alapvető szerepét a morfin antinociceptív hatásában. A legnagyobb vitát mind a mai napig a δ receptor fájdalomcsillapításban betöltött szerepe váltja ki. A szelektív δ agonistákkal végzett kísérletek sokáig nem adtak egyértelmű választ a kérdésre. A δ receptor mediálta analgéziát először Frederickson valószínűsítette (61). A δ agonisták antinociceptív aktivitása azonban attól is függ, hogy melyik központi idegrendszeri régióban vizsgáljuk a fájdalomcsillapító hatást. A δ szelektív DPDPE-ről kimutatták, hogy tail-flick teszten icv. adva δ receptoron keresztül ható analgetikum, míg it., az L3-L5 csigolyák magasságában bejuttatva µ agonistaként viselkedik (77, 172). Ugyanakkor a deltorphin II a gerincvelő liquorterébe adva is δ agonistaként viselkedik (135). Mivel a DPDPE-t δ1 szelektív vegyületnek tartják, fölmerül az a lehetőség is, hogy a gerincvelőben nincsenek δ1 receptorok (lsd. 3.3.2 fejezet), ezért nem is tud máshol hatni, mint a µ receptoron (134). Ezt támasztaná alá az is, hogy egyes kutatók szerint a természetes enkefalinok is δ1-en keresztül hatnak szupraspinálisan, δ2-n keresztül pedig spinálisan (240). Ennek azonban ellentmondani látszik, hogy a DPDPE éppen olyan jól kötődik és hat a csak δ receptorokat expresszáló NG108x15 sejteken, mint a deltorphin II, és az NG108x15 sejteken, valamint δ receptor génnel transzfektált CHO sejteken a δ agonisták kötési és
16
hatásprofiljai nagy hasonlóságot mutatnak az in vivo kísérletekben δ2-nek leírt receptorhoz mértekhez (103, 120, 182). A δ receptor altípusok szempontjából nem szelektív naltrindollal végzett kísérletek is érdekes funkcionális eltérésekre világítottak rá. Mind icv. mind it. adva, a naltrindol erősebben gátolta a δ2 szelektív DSLET antinociceptív hatását, mint a δ1 szelektív DPDPE-ét (216). Kötési kísérletekben viszont a δ affinitás nem mutatott különbséget, akár [3H]-DSLET, akár [3H]-DPDPE leszorítást mértek. Ez már felveti annak gyanúját, hogy a δ1 receptor csak funkcionálisan kimutatható altípus. Icv. kísérletek ellentmondásos eredményekre vezettek a δ altípusok szerepének tisztázásában. Porreca és mtsai. szerint mind a DPDPE, mind a deltorphin II potencírozta a morfin antinociceptív hatását, és ezt a potencírorzó hatást δ2 antagonistával tudták ellensúlyozni (174). Ezzel szemben Suzuki és mtsai. a DPDPE és a
TAN-67
morfinhatást
potencírozó
képességét
a δ1
szelektív
BNTX-szel
antagonizálták sikeresen (236). Formalin teszttel mérve, δ1 antagonisták alkalmazásával ugyancsak igazolták a δ1 receptorok jelenlétét a gerincvelőben (74). A δ receptor analgéziában betöltött szerepét vizsgálták DOR-1 exonok elleni antiszensz-oligo-DNS szekvenciák alkalmazásával is. Az ellene történő antiszenszoligo-DNS kezelés hatása ellentmondásos, egyes szerzők szerint csak a szelektív δ2 agonista deltorphin II által előidézett antinociceptív hatást gátolja (11, 116), mások a szelektív δ1 agonista DPDPE antinociceptív hatásának csökkenését is leírták (115, 232, 247, 253). Rossi és mtsai. kimutatták, hogy spinálisan mindhárom DOR-1 exon ellen ható oligonukleotidok blokkolták az analgetikus hatást, míg szupraspinálisan az 1-es és 2-es exon inaktívnak bizonyult. (196). Ez fölveti δ splice variánsok létezését, azonban erre közvetlen genetikai bizonyítékot még nem találtak. A DOR-1 elleni antiszenszoligo-DNS-sel végzett kísérletekből arra a következtetésre jutottak, hogy a klónozott DOR-1 farmakológiailag a δ2 receptornak felel meg (11, 12, 253). A µ receptor hiányos és µ knock-out egerekkel végzett kísérletek arra utalnak, hogy a µ receptor megléte szükséges a δ mediálta antinociceptív hatásokhoz. Kest és mtsai. kimutatták, hogy µ receptor deficiens CXBK egerekben az icv. adott δ receptor agonisták antinociceptív aktivitása csökkent, mind a δ1 agonista DPDPE, mind a δ2 agonista deltorphin II tail-flick teszten mért AD50 értékei szignifikánsan nőttek a kontroll egerekhez képest (100). A µ knock-out egerekben pedig nemcsak a morfin
17
antinociceptív hatása csökkent drámaian, hanem az icv. adott, δ1 szelektív DPDPE-é is (133, 229). A µ receptor meglétének fontosságát a δ receptor mediálta hatásokban nemrég funkcionális assay-n ([35S]GTPγS kötésen) is igazolták (87). 3.5 Opioid receptor interakciók Már a 70-es évek végén felmerült, hogy az opioid receptorok egymással kölcsönhatásba léphetnek, akár helyileg, egy jól körülhatárolt idegrendszeri régión belül (117, 251), akár különböző régiókban, úgynevezett nem lokális interakciók révén (268, 269). A nem lokális interakciók értelemszerűen mindig különböző sejteken található opioid receptorok között jönnek létre, míg a lokális kölcsönhatásoknál vagy azonos sejten található receptorok lépnek interakcióba, vagy ekkor is különböző sejteken kifejtett hatások modulálják egymást. Ha a kölcsönhatásért azonos idegsejten lokalizált receptorok felelősek, akkor fölmerülhet a receptorok fizikai asszociációjának lehetősége is (201, 202, 203)
3.5.1 Lokális interakciók
Lokális interakciót először 1979-ben mutattak ki. Az agyban a Leu-enkephalin dózisfüggően potencírozta a morfin antinociceptív hatását tail-flick teszten, míg a Metenkefalin vagy nem hatott így, vagy antagonistának bizonyult (122, 251). A gerincvelőben a Leu-enkefalin potencírozta a morfin hatását tail-flick teszten (117). Az icv. és it. adott szelektív δ agonisták potencírozták az icv. illetve it. adott morfin analgetikus hatását (80, 173). A szelektívebb µ és δ agonisták kifejlesztésével lehetővé vált az interakciók részletesebb tanulmányozása. Míg az icv. adott DPDPE az icv. adott morfin antinociceptív hatását potencírozta, az icv. adott DAMGO-ét nem (81). A vegyületeket it. adva azonban a DPDPE a µ szelektív DAMGO hatását is potencírozta tail-flick teszten (77, 129). Rothman és mtsai. azt találták, hogy a morfin nonkompetitív módon gátolta a triciált Leu-enkefalin kötést agyszövetben. Eredményeiket úgy magyarázták, hogy nem minden δ receptor lép kölcsönhatásba a µ receptorral (201, 203). A δ receptor altípusok
18
leírásakor néhányan pedig felvetették, hogy az egyik altípus nem más, mint egy µδ receptorkomplex (95, 135). Vajon össze lehet-e egyeztetni a δ1 és δ2 altípusokat a korábban leírt δcx és δncx receptorokkal? Kezdetben a δncx kötőhelyet azonosították a klasszikus δ receptorral (199), ám a képet tovább bonyolítja, hogy a δcx és δncx altípusokat is tovább lehet osztani δcx-1, δcx-2 (28), δncx-1 és δncx-2 (260, 261, 262) receptorokra. A δcx-2 hasonló ligandkötési profillal rendelkezik, mint a δncx, ám a kettő nem ugyanaz, mert a δcx-2 kötés nem csökkent δ-antiszensz-oligo-DNS kezelés hatására (28) A klasszikus, klónozott δ receptornak a δncx-2 altípus felelhet meg, mivel ez érzékeny antiszensz-oligo-nukleotid kezelésre úgy, mint a δ2 receptor (27). Némileg ellentmondásos, hogy 1998-ban ugyanez a kutatócsoport a δncx-1 altípust találta hasonlónak a klasszikus, klónozott δ receptorhoz (153). Mindenesetre a fentiek alapján azt mondhatjuk, hogy a kötési kísérletek szerint a klasszikus, klónozott δ receptor egy nem-komplexált receptor altípus. A µ és δ receptorok fizikai összekapcsolódására az első közvetlen bizonyítékot 2000-ben találták. George és mtsai. µ és δ receptor génnel kotranszfektált sejteken immunprecipitációval bizonyították a µδ komplex létét, sőt sikerült ligandaffinitásokat is mérniük (65). A DAMGO és a DPDPE egyaránt relatíve nagy affinitással kötődött a komplexhez, mindkettő esetében az affinitás a saját receptor iránti affinitásnak körülbelül a tizede volt. Ezzel némileg ellentmondásban egy másik kutatócsoport mérései szerint a DPDPE egyáltalán nem kötődött a µδ komplexhez, ellentétben a DAMGO-val és a szelektív δ2 agonistának tartott deltorphin II-vel (71). Az ellentmondás mindazonáltal nem tűnik súlyosnak, mivel az SDS gélanalízisek szerint mind homodimerek (µµ, δδ), heterodimerek (µδ), sőt tetramerek képződése is valószínűsíthető, így az intakt sejt membránkörülményeinek pontos ismerete nélkül a mért affinitásértékeket csak nagy óvatossággal lehet figyelembe venni. A homodimerek léte először 1977-ben merült fel (50), fluoreszcens módszerekkel pedig NG108x15 sejteken a δ receptorok clusterbe rendeződését mutatták ki (75). A δ homodimerek létét 1997-ben, (48) a κ homodimerekét pedig 1999-ben igazolták (97). A ligandok jelenlétének hatása a dimerképződésre ellentmondásos, a δδ dimerek képződését egyes esetekben gátolták, így inkább a homomer formáció jelenléte volt meghatározó (48),
19
más esetekben a ligandok nem voltak hatással a dimerképződésre (97, 139, 181). A µµ homodimerek képződésére He és mtsai. szolgáltattak közvetlen bizonyítékot (76). 1999-ben δκ heterodimerek létét is kimutatták. Fontos különbségnek tűnik, hogy míg a µδ dimerek SDS érzékenyek, addig a δκ dimerek SDS-ben is stabilnak bizonyultak. A stabilitás kovalens kapcsolódás mellett szól (97). A korábban leírtakból adódik a kérdés, vajon a receptorkomplexeknek van-e fiziológiás jelentőségük. Ma a κ2 (δκ) és a δ2 (µδ) receptor altípus tűnik receptorkomplexnek (51). Mindez azonban korántsem eldöntött tény, hisz a kötési kísérletek szerint a δncx a klasszikus δ receptor, amely a csak δ receptort kifejező NG108x15 sejteken is megtalálható, az antiszensz oligo-nukleotidokkal végzett kísérletek szerint pedig a δ2 altípus felelne meg a klónozott δ receptornak. Emellett az irodalomban leírták, hogy a δ1 agonista DPDPE és TAN-67 is potencírozza a morfin antinociceptív hatását (236). Ezek szerint tehát inkább a δ1 lenne a komplexált receptor. Ez ellen szól, hogy mások szerint (174) a δ2 agonista deltorphin II potencírozta a morfin analgetikus hatását, valamint a δ1 agonista DPDPE affinitása sokkal kisebb a komplex iránt, mint az önálló δ receptor iránt. A későbbiekben (7.4 fejezet) a dolgozat részletesebben ismertet egy alternatív magyarázatot, melynek lényege, hogy a δ2 agonista deltorphin II és a δ antagonista TIPPψ is képes lehet úgy fokozni a µ agonista DAMGO hatását, hogy a µδ komplexet szétválasztja, és ezzel növeli a µ kötőhelyek számát. A hipotézisből azonban nem következik, hogy a δ1 receptor lenne a µδ komplex.
3.5.2 Nem lokális interakciók
A nem lokális, tehát különböző központi idegrendszeri régiók opioid receptorai között létrejövő interakciókat először 1980-ban írták le. It. és icv. egyszerre adott morfin dózisai között potencírozó szinergizmust mutattak ki (268). A szerzők ezt a fajta kölcsönhatást „multiplikatív interakció”-nak nevezték. Később más agyi régiók opioid receptorai között is kimutattak potencírozó szinergizmust, például a periaqueduktális szürkeállomány, rostroventrális medulla, amygdala és a locus coeruleus között (17, 165, 194, 195). Egyes kutatók szerint a kölcsönhatásba lépő helyek közül az egyikben
20
szükséges a µ receptor megléte (186, 187), mások szerint szelektív δ agonisták között is kimutatható nem lokális potencírozás (91, 109). 3.6 Az opioid tolerancia lehetséges mechanizmusai A morfintolerancia jelensége nagyon régóta ismert. A klasszikus farmakológiai definíció szerint akkor beszélünk toleranciáról (bármilyen gyógyszer kapcsán), amikor a gyógyszer folyamatos adása esetén ugyanazon hatás eléréséhez egyre nagyobb dózisokra van szükségünk. Az opioid tolerancia gyakran jár együtt az opioid dependenciával, amely sokkal komplexebb jelenség, és az opioid elvonásakor megjelenő, egyébként pedig nem jellemző pszichés és szomatikus tünetekben, úgynevezett elvonási szindrómában érhető tetten. A dolgozatban csak a tolerancia kialakulásának mechanizmusaival foglalkozom, és csak a dolgozat szempontjából érdekes tolerancia mechanizmus elméleteket ismertetem részletesebben. Az opioid tolerancia kialakulásában több mechanizmus is szerepet játszik, és bármelyik opioid receptoron ható anyagot is vizsgáljuk, valószínűleg mindhárom receptor valamilyen mértékben részt vesz a folyamatban. A µ receptor alapvető jelentőségét az analgetikus hatáshoz kialakuló morfintoleranciában µ knock-out egerekben igazolták. A µ knock-out egerekben a morfin nem antinociceptív hatású. (228). A δ receptor ugyancsak lényegesnek tűnik a tolerancia kialakításában, bár szerepe valószínűleg a µ receptorral történő interakciókban nyilvánul meg (lsd. később). Az opioid tolerancia lehet akut, amikor egyetlen nagyobb dózissal előkezelt állatokat vagy sejttenyészeteket vizsgálnak (90, 227), és krónikus, amikor az opioid vegyületet többször, több napig adagolják, vagy folyamatosan, pellet beültetéssel idézik elő (58, 149, 163). Feltételezések szerint az opioidok receptor adaptációt hoznak létre, amelynek része a deszenzitizáció, internalizáció és a receptorszám csökkenése, a down-reguláció (18, 41, 197). A különböző opioidok nem egyenlő mértékben képesek a fent említett receptor adaptációs folyamatokat indukálni, sőt a krónikus morfinkezelés az opioid kötőhelyek növekedését, tehát up-regulációját is eredményezheti (83, 167), amely részben a δ receptor denzitás emelkedéséből adódik (2, 4, 33, 85, 200). A morfin például deszenzitizálja a µ receptort, de nem internalizálja (256), az etorfin és a
21
DAMGO viszont gyorsan internalizál (242, 263). A képet tovább bonyolítja, hogy a klónozott µ receptor, a MOR-1 egyes splice-variánsait a morfin is képes internalizálni (105). A δ agonista peptidek ugyancsak képesek a δ receptort internalizálni (22), és ez a hatásuk a receptor intracellulárisan elhelyezkedő C-terminálisától függ (245). A krónikus alkalmazás során kialakuló tolerancia azonban más adaptív folyamatokat is beindít, a receptorszám változásán kívül érinti a G proteinek, adenilcikláz és a proteinkinázok szintjét is (68, 121). Emellett különböző neuronhálózatok és neurotranszmitter rendszerek közötti interakcióknak is nagy jelentőségük van az adaptív folyamatokban (155, 197). Krónikus, 5 napig tartó morfin kezelés hatására az intracellulárisan elhelyezkedő µ receptorok száma megnőtt, a 10 napos kezelés pedig a sejtfelszíni µ receptor számot is megnövelte. Ráadásul a mikroszomális µ receptor frakció G protein aktiválási képessége is megnőtt (57). Ezeknek az eredményeknek viszont ellentmond az, hogy mások 7 napos morfinkezelés után µ receptor downregulációt mértek (231). Ugyanez a kutatócsoport 3 napos morfinkezelés után még nem mért down-regulációt, ami összhangban van korábbi eredményekkel, melyek szerint a receptor szám csökkenés közvetlenül nem szükséges az opioid tolerancia kialakulásához (125, 179, 242). A tolerancia kialakulásában egyre fontosabbnak tűnik az opioid receptor szignáltranszdukciós mechanizmust váltó képessége is (29). Ez a váltás akár stimulációs mechanizmusok beindulását is jelentheti a szokásos gátlók helyett (68). Felvetődik a kérdés, hogy ha a receptorok denzitásának változása nem egyértelmű, vajon változik-e az egyes ligandok affinitása a receptorok iránt? Számos kutatócsoport igazolta, hogy az egész állatban kialakuló tolerancia nem jár a ligandok receptor iránti affinitásának változásával (10, 86, 171, 190, 242). Az opioid tolerancia egyik érdekes magyarázata a kétállapotú receptormodellen alapul. A modell lényege, hogy egy adott receptornak, például a µ-nek, két stabil konformációja képzelhető el, az aktivált, amelynek a jele µ*, és az inaktív, amelyet µnek jelölünk (32). Az aktivált állapot jellemzője a konstitutív aktivitás, vagyis a receptor agonista jelenléte nélkül is aktiválja a másodlagos hírvivő rendszereket. Wang és mtsai. az SH-SY5Y jelű humán neuroblastoma sejtvonalon kimutatták, hogy a krónikus agonista expozíció megnövelte a µ* konformáció arányát, ami az agonista hatékonyságának csökkenését is jelentette (kevesebb µ konformáció van jelen, csökken az aktivitás fokozás képessége). A naloxon nemcsak gátolta az agonisták hatását, hanem
22
a µ* konformáció arányát is csökkentette, ezzel a konstitutív aktivitás is csökkent, a naloxon tehát inverz agonista hatást fejtett ki a toleráns rendszerben. A szelektív µ antagonista CTAP az agonista hatást is, és a naloxon inverz agonista hatását is gátolta. Ez összhangban áll azzal, hogy míg toleráns állatban a naloxon kiváltott elvonási tüneteket, a CTAP nem (254). Érdemes pár szót szólni a kereszttolerancia jelenségéről is. A fogalom azt jelenti, hogy
egy
adott
vegyülettel
létrehozott
tolerancia
más
hasonló
vegyület
hatásgyengülésével is jár (237, 255). Ha két opioid hatásához nem alakult ki kereszttolerancia, azt különböző receptorokon történő hatásnak tulajdonították (39, 93). Az inkomplett kereszttolerancia azt jelenti, hogy az egyik opioiddal létrehozott tolerancia nem teszi a kísérleti állatot toleránssá a másik opioidra, ellenben a másik opioiddal történő kezelés az előző anyag ellen is toleranciát alakít ki. Az ilyen jelenség receptor altípusok szerepére, vagy receptor interakciókra utalhat (94, 148). Nemcsak a tolerancia ténye, hanem a tolerancia kialakulásának sebessége is döntő lehet az esetleges terápiás alkalmazás szempontjából. Több, igen erős µ agonista aktivitású vegyületet írtak le, amelyhez lassabban alakult ki tolerancia, mint például a morfinhoz (54, 63). Eredetileg ezt a jelenséget úgy magyarázták, hogy a nagy specifikus aktivitással rendelkező vegyületek számára nagyobb receptortartalék áll rendelkezésre, így a down-reguláció lassabban alakul ki (94, 170, 271). Ma már azonban tudjuk azt is, hogy a morfin akutan és rövidebb időtávon belül (3-5 nap) nem képes down-regulálni a µ receptort, mégis nagymértékű tolerancia alakul ki hatásaihoz (154, 171). Az opioid tolerancia kialakulásában opioid receptor interakciók is szerepet játszanak. A lokális interakciók szempontjából alapvetőnek tűnik a µ és δ receptorok kölcsönhatása. Korábban már említésre került, hogy krónikus morfinkezelés a δ kötőhelyek számát megnöveli (2, 4, 33, 85). Az interakcióra pedig egyrészt az utal, hogy δ antagonistákkal történő előkezelés csökkentette a morfin antinociceptív hatásához kialakuló toleranciát (1, 62), másrészt a nem toleráns állatokban a DAMGO és a DPDPE között mért potencírozó szinergizmus megszűnt (77). A µ-δ interakciónak viszont nincs szerepe a morfin légzésdepresszív hatásához kialakuló toleranciában (79). Emellett a δ-antiszensz oligo-DNS szekvenciákkal végzett kutatások kimutatták, hogy a δ receptorok ellen irányuló kezelés gátolta a morfin tolerancia és az akut dependencia kialakulását egerekben (101). A spinális és szupraspinális opioid receptorok szinergista
23
kölcsönhatásának a csökkenése vagy eltűnése az opioid tolerancia kialakulásának egyik mechanizmusa lehet. (185, 189, 268) Az opioid tolerancia kialakulásában szerepet játszhatnak például excitátoros aminosav rendszerek is, elsősorban az NMDA típusú glutamát receptor. NMDA antagonisták gátolták a morfin antinociceptív hatásához kifejlődő toleranciát, míg a szelektív µ és δ agonistákhoz létrejövőt nem (14). A spinális-szupraspinális kölcsönhatásban fontos szerepet játszhat az endogén opioid dinorfinból származó, ám opioid hatással nem rendelkező dinorfinA(2-17) (más néven deztirozil-dinorfin), mivel a toleráns állatokban képes részlegesen visszaállítani a tolerancia kialakulása előtti állapotot (78). A deztirozil-dinorfinról kimutatták, hogy az NMDA antagonista MK801-hez hasonló aktivitásprofillal rendelkezik egyes teszteken, és kötődik az NMDA receptorhoz (241). 3.7 Opioid receptorok polimorfizmusa Közismert, hogy a gyógyszerek iránti érzékenység rendkívül nagy individuális különbségeket mutathat. A valószínűleg számos mechanizmuson alapuló jelenség egyik meghatározó tényezője lehet az egy-egy nukleotidot érintő polimorfizmus (SNP). Emberben számos µ receptor polimorfizmust mutattak ki, az egyik ilyen polimorfizmus háromszorosára növelte a β-endorfin affinitását a µ receptor iránt (19). Számos más kutatás azonban nem talált összefüggést a polimorfizmusok és az opioid dependencia kialakulásának valószínűsége között (59, 64, 111, 208). A negatív eredményekből egyesek arra következtettek, hogy a nem kódoló régiókban előforduló mutációk, amelyek a gének expressziójának mértékét szabályozhatják, fontosabb szereppel bírhatnak (249). A µ receptor polimorfizmus és az opioid dependencia közötti kapcsolat hiányával ellentétben a δ receptor egyik SNP-je nagyobb gyakorisággal fordul elő opiát függőkben, habár a nukleotid csere a receptor aminosav szekvenciáját nem változtatta meg (136). Az opioid dependencia, más emberi viselkedésformákhoz hasonlóan, rendkívül nehezen vizsgálható a többrétű, genetikai és nem genetikai változások lehetősége miatt. Az állatkísérletes modellekben azonban az opioid tolerancia, amely ugyan csak egyetlen részjelensége a dependenciának, jól definiált és körülírt modell, megfelelően
24
tanulmányozható. Ezért az opioid dependencia megértésének egyik első lépése lehet a krónikus morfinkezelésre kialakuló tolerancia mértékének különbözősége és az opioid receptorokban esetleg megjelenő SNP-k közti összefüggés tanulmányozása.
25
4. CÉLKITŰZÉSEK A Bevezetésben összefoglalt ismereteket figyelembe véve kísérleteinkben a következő kérdésekre kerestük a választ: 1. Van-e különbség a különböző egértörzsekben kialakuló morfintolerancia mértéke között, és ha igen, összefügg-e ez az opioid receptorokat kódoló gének esetleges polimorfizmusával?. 2. Létrejön-e kereszttolerancia az analgetikus hatáshoz a morfin és a kifejezetten µ receptor szelektív opioid peptid [Dmt1]DALDA között? 3. Van-e szerepe a spinális µ/δ opioid receptor interakcióknak az opioid tolerancia kialakulásában egéren?
26
5. MÓDSZEREK 5.1 Kísérleti állatok A morfintolerancia és a receptor polimorfizmus összefüggéseinek vizsgálatához hat egértörzset használtuk, amelyek egy eredeti Swiss törzsből származtathatóak, így genetikailag valószínűleg elég közel állnak egymáshoz. Az egértörzsek a következők voltak (a tenyésztő zárójelben, a zárójel után pedig a dolgozatban használt rövidítések): 1. NIH Swiss (Harlan Sprague-Dawley Inc. Indianapolis, IN, USA) → H/NIH Swiss 2. ND4 (Harlan Sprague-Dawley Inc. Indianapolis, IN, USA) → H/ND4 3. ICR (Harlan Sprague-Dawley Inc. Indianapolis, IN, USA) → H/ICR 4. Simonsen Swiss Webster (Simonsen Laboratories, Gilroy, CA, USA) → S/SW 5. Hilltop Swiss Webster (Hilltop, Scottsdale, PA, USA) → Hilltop/SW 6. Charles River Swiss Webster (Charles River Laboratories, Wilmington, MA, USA) → CR/SW A receptor interakciók vizsgálatához CR/SW és H/ND4 egereket, a [Dmt1]DALDAval végzett kísérletekhez pedig a H/ICR törzset használtuk. 5.2 Az opioid tolerancia létrehozása Az egerek hátbőre alá 75mg morfin bázist tartalmazó pelleteket ültettünk be. A beültetés utáni negyedik napon végeztük a kísérleteket úgy, hogy a pellet a helyén maradt. A pellet módszert tolerancia kialakítására 1970 óta alkalmazzák (35, 66). Előnye az elméletileg folyamatos hatóanyag utánpótlás, hátránya, hogy megbízhatósága nagymértékben függ a pellet gyógyszertechnikai minőségétől és az állatok esetlegesen eltérő farmakokinetikai tulajdonságaitól.
27
5.3 Anyagok 5.3.1 Heterociklikus opiátok 1. morfin-szulfát 2. naloxon 3. naloxon-metiodid 4. nor-binaltorfimin → nor-BNI 5.3.2 Opioid peptidek 1. (2’6’-dimetil-Tyr)-D-Arg-Phe-Lys-NH2 ([Dmt1]DALDA) 2. H-Tyr-D-Ala2-Gly-(N-Me)Phe-Gly-ol (DAMGO) 3. (D-Pen2-5)-enkephalin (DPDPE) 4. H-TyrTicPsi[CH2NH]Phe-Thr-OH (TIPPψ) 5. D-Phe-Cys-Tyr-D-Arg-Thr-Pen-Thr-NH2 (CTAP) 5.3.3 Az in vivo kísérletekben használt egyéb anyagok 1. 2%-os 2-hidroxipropil-β-ciklodextrin a DPDPE feloldásához 5.3.4 A DNS preparáláshoz használt anyagok 1. folyékony nitrogén 2. extrakciós puffer (10mM TrisHCl [pH=8], 0,1M EDTA [pH=8], 20µg/ml pankreatikus RNA-áz, 0,5% SDS [Na-dodecil-szulfát dtergens]) 3.
20mg/ml proteináz K
4. 0,5M TrisHCl-dal (pH=8) ekvilibrált fenol 5. dializáló membrán 6. 70% etanol 5.3.5 Az RNS preparáláshoz használt anyagok 1. Guanidinium 2. Merkaptoetanol 3. Fenol-kloroform-izoamilalkohol 4. Izopropilalkohol 5. Etanol
28
5.3.6 A PCR -hez és RT-PCR -hez használt anyagok PCR reakciós elegy (Gibco BRL/Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA): 1. Mg2+-mentes PCR-puffer 2. 0,2mM dNTP keverék 3. 1,5mM MgCl2 4. 0,5µM primer 5. 2,5 egység Taq DNS-polimeráz Az RT-PCR-hez továbbá (GeneAmp RNA PCR kit a PE Applied Biosystemstől, Foster City, CA, USA): 6. oligo-dT primerek 7. reverz transzkriptáz A különböző opioid receptorok exonjainak amplifikálásához az alább felsorolt primereket használtuk (a primereket az Operon Technologies Inc. Alameda, CA, USA, szintetizálta): Amplifikálás a genomiális DNS-ből: δ exon 1 forward
CAGGGCGCACGGTGGAGACGGA
δ exon 1 reverse
GGGGAGTCAGGGTTGGGTATCCTGG
δ exon 2 forward
GGTACACCAAATTGAAGACCGCC
δ exon 2 reverse
CACTGCCATGACCATGATGGGG
δ exon 3 forward
GATGGTGCAGTGGTATGCATGC
δ exon 3 reverse
CGTTTAAGGGGAAGGTCGGGTAG
µ exon 1 forward
GTGCTCTCAGTTACAGCCTACCG
µ exon 1 reverse
GCCTTACCTTACAATCAC
µ exon 2 forward
CCAAAATGAAGACTGCCACC
µ exon 2 reverse
CCCTTACCCTGCCTGTATTTTG
µ exon 3 forward
CCTTCCAGGGTCCATAGATTGC
µ exon 3 reverse
GCACATACCTGGTGGTTAGTTCG
κ exon 1 forward
GCAAGTGCCACCTTCTCGCTTTCC
κ exon 1 reverse
CCACCACCGAGACCTGTCCCTGAAC
29
κ exon 2 forward
GTCACTCTCATTCACACTCTGGG
κ exon 2 reverse
GGTATGAAAACAGTAGCTCTTACC
κ exon 3 forward
GTTGACTTTGATCACCACGGC
κ exon 3 reverse
CTCTACCTGGAGAACAATAAGAAG
Amplifikálás mRNS-ből (RT-PCR): δ exon 1 forward
CAGGGCGCACGGTGGAGACGGAC
δ exon 2 reverse
CACTGCCATGACCATGATGGGG
δ exon 2 forward
GGTACACCAAATTGAAGACCGCC
δ exon 3 reverse
CGTTTAAGGGGAAGGTCGGGTAG
µ exon 1 forward
GTGCTCTCAGTTACAGCCTACCG
µ exon 4 reverse
GCAGCCTCTAAGTTTAGCGAGGGTC
κ exon 1 forward
CAGGTACTCAGGATCTAAAGTGGTG
κ exon 3 reverse
CATTGAACTCTTCTCTACCTGGAG
További, az RT-PCR termékek szekvenálásához használt primerek: µ
GGTCAAGGCCCTGGATTTCCG
κ
GGACCGCTACATTGCTGTGTGC
δ
CCTCAACCCGGTTCTCTATGC
5.4 Az állatok kezelése a kísérletek során A szubkután alkalmazások során a morfin-szulfátot, [Dmt1]DALDA-t, DAMGO-t, naloxont, és naloxon-metiodidot fiziológiás sóoldatban (0,9% NaCl)oldottuk fel, a dózist µmol/kg-ban adtuk meg. Az antinociceptív hatást 30 perccel a beadás után mértük, kivéve a [Dmt1]DALDA esetén, mivel a vegyülettel felvett időgörbén a beadás után két órával mutatkozott maximális hatás. It. és icv. alkalmaztuk a fenti bekezdésben említett vegyületeken kívül a többi opioid peptidet. Mindkét adagolási módnál 250µl-es Hamilton fecskendőt használtunk, amelyet egy 1/50 osztású diszpenzerbe helyeztünk, így egy gombnyomásra az állat 5µl
30
oldatot kapott. Az alkalmazott tű mérete 25G1/2” volt. A dózist nmol/egér egységben adtuk meg. Az it. injekciót a lumbális 2-3-as csigolyánál, Hylden és Wilcox módszere szerint (92) juttattuk be. Az intracerebroventrikuláris injekciónál 2,5mm hosszú tűvel, a nyílirányú és a haránt koponyavarrattól egyaránt 2mm-re átszúrtuk az állat koponyáját, így a vegyület közvetlenül az egyik oldalkamrába került (73). Az antagonistákkal végzett kísérletek során az antagonistát az agonistával egyszerre juttattuk be az állatba. Az antinociceptív hatást a beadás után 30 perccel mértük. 5.5 Az antinociceptív teszt A vegyületek fájdalomcsillapító hatását egér tail-flick teszten mértük (248). A módszer lényege, hogy az állat farkát belehelyezzük egy vájatba, amely fölött egy lámpa és egy lencse található. A gép bekapcsolásakor az egér farkát intenzív, fókuszált hővel sugározzuk, és amikor az állat fájdalmat érez, elrántja a farkát. Ekkor egy fotocella kikapcsolja a hő- és fénysugarat, az idő, amíg az állat a farkát a vályúban tartotta, (tail-flick latencia) pedig a kijelzőről leolvasható. A hősugár intenzitását úgy állítottuk be, hogy az egerek átlagosan 2 másodpercig viselték el a hő okozta fájdalmat. A maximálisan megengedhető besugárzási idő kb. 4 másodperc, ennél hosszabb expozíció esetén az egér farkán égési sérülés keletkezik. A maximális idő pontos értékének a későbbiekben részletezett statisztikai metodika miatt nincs nagy jelentősége. 5.6 A tail-flick teszten kapott adatok elemzése és az alkalmazott statisztikai vizsgálat A kísérletben alkalmazott vegyületek beadása előtt minden állat kontroll latenciáját megmértük. A vegyületek beadása után 30 perccel (szubkután adott [Dmt1]DALDA esetén 2 órával) újra megmértük a latenciát. Az egereket tízes csoportokba osztottuk. Általában három pontból határoztuk meg a vegyület antinociceptív dózis-hatás görbéjét. A dózisokat a 2 hatványai szerint adtuk. (Tehát 1 egység, 2 egység, 4 egység, illetve a tolerancia kialakulása esetén, vagy antagonista alkalmazásakor, amennyiben szükséges volt, az egységnyi dózis 2, 4, 8, 16, stb. szorosát injektáltuk be). Az összes, az adott kísérletben használt egér latenciájának
31
átlagához hozzáadtuk a standard deviáció értékének háromszorosát, és az így kapott értéket tekintettük limitnek. A limitérték alatti latenciaidőt, a vegyület beadása után mérve, negatív válasznak, az e fölötti értéket pedig pozitív válasznak értékeltük, hisz ez esetben annak a valószínűsége, hogy a pozitív válasz véletlen következménye, kevesebb, mint 0,5%. Az alkalmazott dózis hatását a pozitív választ adó egerek száma alapján százalékban határoztuk meg. Ezek után a dózisokat, mint független változókat logaritmikus tengelyen, a hatások mértékét, mint függő változókat pedig lineáris tengelyen jelöltük be (szemilogaritmikus ábrázolási mód.). Az egyenest a kapott adatok alapján lineáris regresszióval határoztuk meg, majd az egyenesből kiszámítottuk az 50%-os hatást eredményező dózist, amelyet AD50-nel (antinociceptív dózis 50%) jelöltünk. Az AD50 érték 95%-os konfidencia limitjeit Litchfield és Wilcoxon (124) közelítő módszere szerint számítottuk ki. A módszer lényege a következő: A kapott dózis-hatás görbéből az AD50 értéken kívül kiszámoljuk az AD16 és AD84 értéket is, és az alábbi képlet alapján meghatározzuk az fAD50 értéket: fAD50=[([AD84/AD50]+[AD50/AD16])/2](2,77/√N) ahol N az adott dózis-hatás görbe meghatározásához felhasznált egerek száma. Ezután a konfidencia limit alsó értéke AD50/fAD50, felső értéke pedig AD50 x fAD50. A módszer előnye, hogy képes kezelni a 0%-os és 100%-os hatást is, hátránya, hogy a konfidencia limit nem teljesen szimmetrikus az AD50 értékhez képest. Két dózis-hatás görbe, illetve két AD50 között akkor tekintettük a különbséget szignifikánsnak, ha a konfidencia limitek nem fedték át egymást. 5.7 A tolerancia mértékének meghatározása A morfin pellet által létrehozott tolerancia meghatározásához egyidőben két dózishatás görbét hoztunk létre. 30 placebo pellettel, és 30 morfin pellettel kezelt állatot 3-3 dózis szubkután morfinnal kezeltünk a kontroll latencia idő meghatározása után. A toleranciát (függetlenül annak mértékétől) akkor tekintettük kialakultnak, ha a morfin pellettel kezelt állatok kontroll latenciája visszaállt a placebo pellettel kezelt egerekéihez. Ez a visszaállás gyakorlatilag mindig megtörtént. Ezek után meghatároztuk
32
a kontroll egereknél és a morfinnal pelletált egereknél kapott morfin AD50 értéket, majd a két értéket elosztottuk egymással, és a kapott számot tekintettük a szubkután adott morfinra kialakuló tolerancia mértékének. A tolerancia mértékek közötti szignifikanciát ANOVA teszttel számítottuk ki. 5.8 Az antagonista vegyületek pA2 értékének meghatározása Az antagonista vegyületek hatékonyságának meghatározására szolgál a pA2 érték. A koncepciót először Schild írta le (209), majd Arunlakshana és Schild fejlesztette tovább (3). A módszert Schild-regressziónak is hívjuk, az opioid kutatásban gyakran alkalmazzák, főleg McGilliard és Takemori kutatásai óta. (138). A módszer abból indul ki, hogy egy kompetitív antagonista dózisától függő mértékben párhuzamosan jobbra tolja az agonista dózis-hatás görbéjét. Az eltolás mértékét a következő képlet adja meg: DR=1+[antagonista]/Ke , ahol a DR az úgynevezett „dose ratio”, dózis arány, amely az antagonista jelenlétében mért EC50 és az antagonista nélkül mért EC50 aránya, [antagonista] jelenti a kompetitív antagonista koncentrációját, Ke pedig az antagonista ekvilibrációs konstansa, amely gyakorlatilag a disszociációs állandónak felel meg. Az EC50 az a koncentráció, amelynél az agonista által, az adott kísérleti rendszerben kifejthető maximális hatás 50%-át mérjük. Eredetileg ugyanis in vitro kísérletekkel határozták meg az értékeket. A disszociációs állandó mutatja a ligand affinitását az adott receptorhoz. Olyan in vivo rendszerekben, ahol nem mérünk szöveti koncentrációkat, csak dózisokat ismerünk (dózis=beadott mennyiség), ezért a Ke sem jelenti az affinitást, csak utal rá, az [antagonista] jelölés pedig a kísérletben használt kompetitív antagonista dózisát jelenti. Az alábbi matematikai levezetés vezet el bennünket a pA2 érték definíciójához: (1) DR-1=[antagonista]/Ke (2) logn(DR-1)=logn[antagonista]-lognKe (n a logaritmus alapja, rendszerint 10, ekkor a képlet így módosul: lg(DR-1)= lg[antagonista]-lgKe) (3) Az ábrázolás egyszerűsítése érdekében még egy változtatást hajtunk végre a képleten: lg(DR-1)=-1x(-lg[antagonista]) +-1x(lgKe) Különböző (legalább három) kompetitív antagonista dózisokat használva, és az agonista dózis-arány értékeinek logaritmusát az antagonista dózisának logaritmusa függvényében
33
ábrázolva egy egyenest kapunk, amelynek meredeksége –1, az x tengelyt metsző pontja pedig –lgKe, ami nem más, mint a pA2 érték. Ennek értelmében pA2-nek nevezzük egy kompetitív antagonista azon dózisának negatív logaritmusát, amely dózis az agonista dózis-hatás görbéjét kétszeresére tolja el jobbra. A képletből, illetve az ábrázolásból más következtetést is levonhatunk: Kompetitív antagonista használatakor az egyenes meredeksége –1, ami azt is jelenti, hogy az antagonizmus csak egy receptoron következik be. Több receptorhoz való kötődés esetén ugyanis nagy valószínűséggel nem –1 lesz a meredekség, hisz az esetek nagy részében a nem szelektív antagonisták affinitása is a különböző receptorokhoz valamennyire eltérő. Ugyancsak kimondható, hogy ha a meredekség nem –1, akkor vagy nem kompetitív antagonistát használtunk, vagy a kompetitív antagonista egynél több receptoron is gátolta az agonista hatását. Ha azonban a meredekség –1, az önmagában még nem teszi egyértelművé, hogy egy receptoron ható kompetitív antagonistával állunk szemben. Amennyiben korábbi kísérletekben analizált kompetitív antagonistát használunk, és különböző agonisták hatását gátoljuk vele, nagy valószínűséggel kimondhatjuk, hogy amennyiben minden agonista esetében a meredekség –1 és a pA2 érték ugyanaz, akkor az agonisták ugyanazon a receptoron hatnak. (A pA2 érték ugyanis utal az antagonista affinitására, amely ugyanazon receptorhoz való kötődés esetén értelemszerűen ugyanaz). 5.9 A polimorfizmus vizgálatához alkalmazott molekuláris biológiai módszerek
5.9.1 Genomiális DNS preparálása 1.
Frissen kipreparált egér lépet folyékony nitrogénben fagyasztottunk le. Szövethomogenizátorral a fagyott lépet porrá törtük, majd hagytuk a nitrogént elpárologni.
2.
A szövethez kis frakciókban extrakciós puffert adtunk, majd a port rázással kevertük bele a pufferbe.
3.
Miután a szövet feloldódott, 37°C-on, 1 órát inkubáltuk.
4.
Ezután a viszkózus folyadékhoz proteináz K-t adtunk, az enzim koncentrációja 100µg/ml lett.
5.
Eztuán 3 órát inkubáltuk 50°C-os vízfürdőben.
34
6.
Az oldatot szobahőmérsékletre hűtöttük, majd azonos térfogatú fenolt adtunk hozzá.
7.
A centrifuga csövet lassan forgattuk le-föl 10 percig.
8.
Szobahőmérsékleten 5 percig centrifugáltuk 5000g-n.
9.
A viszkózus vizes fázist tiszta centrifuga csőbe szívtuk át, majd a fenol extrakciót kétszer megismételtük.
10. Az összegyűjtött vizes fázisokat 4°C-on, 4 liter 50mM-os Trist és 10 mM EDTA-t tartalmazó pufferrel szemben dializáltuk, amíg a dializátum 270nm-en mért OD értéke 0,05 alá csökkent. 11. A DNS UV abszorpcióját 260 és 280nm-en mértük meg, az A260/A280 értéknek 1,75-nál nagyobbnak kellett lennie, ez jelentett megfelelő tisztaságú DNS-t. 12. A DNS mennyiségének megmérése után (1 OD érték 260 nm-en kb. 50 µg/ml DNS-nek felel meg) agaróz gélen történt futtatással ellenőriztük a DNS méretét.
5.9.2 Totál RNS preparálása agyszövetből és gerincvelőből 1.
Frissen preparált egér agyat és gerincvelőt guanidinium-merkaptoetanol oldatban homogenizáltunk.
2.
A homogenizátumhoz fenol-chloroform-izoamylalkoholt adtunk, felráztuk, jégen lehűtöttük, majd 12000g-n 20 percig 4°C-on centrifugáltuk.
3.
A felső, vizes fázist, óvatosan, pipettával leszívtuk úgy, hogy az interfázis érintetlen maradjon.
4.
A fenol-chloroform-izoamylalkoholos szeparálást megismételtük.
5.
A leszívott vizes fázist azonos térfogatú izopropilalkohollal összekevertük, majd 2 órán keresztül -20°C-on inkubáltuk.
6.
12000g-n, 20 percig 4°C-on centrifugáltuk, majd a felülúszót eltávolítottuk.
7.
A pellethez 1ml izopropilalkoholt adtunk, felráztuk, majd az inkubálást és a centrifugálást megismételtük.
8.
A felülúszót eltávolítottuk, majd a pellethez 1ml 75%-os etanolt adtunk, felráztuk, majd 10 percig, 4°C-on, 7500g-vel centrifugáltuk.
9.
A felülúszót leszívtuk, majd a pelletet száradni hagytuk.
35
10. A kiszáradt pelletet 1mM-os , dietilpirocarbonáttal előkezelt EDTA oldatban feloldottuk. 11. Az RNS UV abszorpcióját 260 és 280nm-en mértük meg, az A260/A280 értéknek 1,9-nál nagyobbnak kellett lennie, ez jelentett megfelelő tisztaságú RNS-t. 12. Az RNS minőségét etidiumbrobid tartalmú agaróz gélen történő futtatással, UV fényben ellenőriztuk.
5.9.3 PCR és RT-PCR kivitelezése 1.
PCR (polymerase chain reaction): A PCR reakciós elegyhez 0,5-1µg genomiális DNS-t adtunk. A reakciót a Stratagene (La Jolla, CA, USA) Robocycler készülékével végeztük. A beállítások a következők voltak: 30 ciklus, ciklusonként 1 perc 95ºC-on, 1 perc 55ºC-on (ha a primer GC tartalma < 50%-nál) vagy 60ºC-on (ha a primer GC tartalma > 60%-nál), majd 1 perc 72ºC-on. A PCR termékeket 1%os TAE-agaróz gélen tisztítottuk (Geneclean Kit, BIO 101, Vista, CA,USA).
2.
RT-PCR: A totál RNS-t fél egéragyból illetve egy kis darab egér gerincvelőből izoláltuk. A reverz transzkriptáz reakciót oligo-dT primerek jelenlétében végeztük, így cDNS-t kaptunk, majd az opioid receptorokat kódoló génszakaszokat megfelelő primerek használatával PCR reakcióval amplifikáltuk. µ és κ receptornál a teljes hosszúságú cDNS-t amplifikáltuk, a δ receptor esetében az 1-2 exont és a 3-4 exont külön amplifikáltuk úgy, hogy a végtermékek bázissorrendje átfedést mutasson.
5.9.4 DNS szekvencia meghatározása és összehasonlítása a génkönyvtárban megadott nukleotid sorrenddel A kapott DNS láncokat tisztítás után szekvenálásra küldtük, majd a kapott eredményt a Megalign program (DNAStar, Madison, WI, ISA) segítségével analizáltuk. A génbank számai a következők voltak: δ receptorhoz #L11064, µ receptorhoz #U26915, κ receptorhoz #L11065. A génbankban szereplő egér opioid receptor szekvenciák C57-es inbred egértörzsből származnak.
36
6. EREDMÉNYEK 6.1 A különböző egértörzsek szubkután adott morfinhoz kialakuló toleranciája Az általunk használt egértörzseknek a morfinpellet beültetése utáni negyedik napon mért, szubkután adott morfinhoz kialakuló toleranciájának mértékét az 1. táblázat mutatja. 1. táblázat: A szubkután adott morfin AD50 értékeinek összehasonlítása nagy- és kisfokú morfintoleranciájú Swiss egértörzsekben tail-flick teszten. *:Nagyfokú toleranciát mutató törzsek Morfin AD50 µmol/kg (95% konfidencia limit) Egértörzs
Tolerancia mértéke
Placebo pellettel
Morfin pellettel
implantált
implantált
S/SW
10,5 (7,5-14,7)
39,0 (26,0-58,4)
3,7
H/NIH Swiss
12,0 (8,1-17,8)
40,0 (26,8-59,8)
3,3
H/ND4
10,5 (7,7-14,3)
23,0 (16,8-31,6)
2,2
H/ICR*
12,5 (8,5-18,4)
87,0 (58,7-129,0)
7,0*
CR/SW*
11,0 (8,2-14,7)
84,0 (58,3-121,1)
7,6*
Hilltop/SW*
10,0 (7,0-14,2)
84,0 (41,9-168,4)
8,4*
Látható, hogy a hat törzs a morfintolerancia kialakulásának szempontjából két csoportra osztható: három törzsben kisfokú (H/NIH Swiss, H/ND4 és S/SW), három törzsben pedig nagyfokú tolerancia alakult ki (H/ICR, CR/SW és Hilltop/SW). A két csoport közötti toleranciakülönbség szignifikáns volt (p<0,05). 6.2 A különböző egértörzsek intratekálisan adott morfinhoz kialakuló toleranciája A szubkután morfinra kialakuló toleranciával ellentétben a morfin pellet beültetése mindössze egyetlen törzs, a H/ICR esetében okozott szignifikáns változást az intratekálisan adott morfin antinociceptív hatásában. Az it. morfin AD50 értékeit mutatja a 2. táblázat.
37
2. táblázat: It. adott morfin AD50 értékei különböző egértörzsek naiv és morfintoleráns egyedeiben tail-flick teszten. *: szignifikáns eltérés It. morfin AD50 nmol/egér (95% konfidencia limit) Egértörzs
Placebo pellettel implantált
Morfin pellettel implantált
S/SW
1,25 (0,86-1,81)
1,8 (1,24-2,62)
H/NIH Swiss
0,73 (0,48-1,11)
1,00 (0,72-1,39)
H/ND4
0,56 (0,37-0,86)
1,2 (0,79-1,83)
H/ICR
1,65 (1,03-2,64)
4,5 (2,8-7,2)*
CR/SW
2,0 (1,12-3,6)
2,9 (1,66-5,1)
1,85 (1,23-2,79)
3,15 (2,12-3,6)
Hilltop/SW
6.3 A magas és alacsony morfintoleranciájú egértörzsek primer opioid receptor szekvenciáinak összehasonlítása Annak érdekében, hogy megállapíthassuk, hogy az opioid receptorok DNS szekvenciáiban található SNP-k összefüggenek-e a különböző egértörzsekben, morfin pellet beültetése után kialakuló eltérő mértékű morfintoleranciával, összehasonlítottuk a genomiális és cDNS opioid receptor szekvenciákat. A µ és κ receptor nukleotid sorrendjében nem találtunk SNP-ket. A genomiális DNS-ből származó δ opioid receptorok szekvenciájában talált SNP-ket a 3. táblázat mutatja. 3. táblázat: A különböző egértörzsekből származó δ receptorok nukleotid sorrendjében található SNP-k összehasonlítása, és hatásuk a receptorok aminosav sorrendjére. Kisfokú toleranciát mutató törzsek
Nagyfokú toleranciát mutató törzsek
SNP
S/SW
H/NIHS
H/ND4
H/ICR
CR/SW
HILLTOP/SW
A711G (L/L)
+
+
+
-
+
+
C771T (R/R)
+
+
+
-
+
+
G813C (V/V)
+
+
+
-
+
+
G891A (V/V)
-
+
+
-
+
+
C954T (Y/Y)
+
+
+
-
+
+
38
A 3. táblázat első oszlopában tüntettük fel a nukleotid változást a génkönyvtárban szereplőhöz képest, és azt, hogy a gén hányadik nukleotidjáról van szó, zárójelben pedig a nukleotid csere aminosavszekvenciára való hatását láthatjuk. A további oszlopokban a + jel az adott polimorfizmus jelenlétére, a – jel a hiányára utal. Mint a táblázatból is látható, nem találtunk összefüggést a receptorok nukleotid sorrendjében fellelhető SNPk és a különböző mértékben kialakuló morfin tolerancia között. Ráadásul az SNP-k nem okoztak változást a receptorfehérje aminosav sorrendjében sem. A genomiális DNS analízise mellett, a további vizsgálódás érdekében, kiválasztottunk egy alacsony (S/SW) és egy magas toleranciájú (Hilltop/SW) törzset, és megvizsgáltuk az mRNS-ekből izolált opioid receptor gének nukleotid sorrendjét is. Fölmerülhet ugyanis az a kérdés, hogy történik-e valamilyen változás a transzkripció során, ami érdemben befolyásolná az opioid receptor fehérjék szerkezetét. Ilyen változások létrejöhetnek RNS editálással, exon kihagyással (exon skipping) vagy intron szakasz transzkripciójával is. Mivel az RNS-t egéragyból és egér gerincvelőből nyertük, arra is választ kaphattunk, van-e különbség az agyi és gerincvelői opioid receptorok szekvenciáiban. Az analízis nem mutatott újabb SNP-ket a fent részletezetteken kívül, minden szekvencia megegyezett a genomiális DNS analízise során kapott adatokkal. 6.4 A [Dmt1]DALDA antinociceptív hatásának vizsgálata naív és morfintoleráns egerekben
6.4.1 A szubkután adott [Dmt1]DALDA antinociceptív aktivitása naív és morfin toleráns egerekben
A kísérletekhez a nagyfokú szubkután morfintoleranciát mutató H/ICR egereket használtuk. A szubkután adott [Dmt1]DALDA antinociceptívnek mutatkozott a tail flick teszten, hatásának maximumát pedig a beadás után két órával érte el. A különböző dózisokkal felvett időgörbét mutatja az 1. ábra. A peptid AD50 értéke 0,3 µmol/kg volt, amely az sc morfin és sc DAMGO AD50 értékének (10-12 µmol/kg) egyaránt körülbelül 40-ed része (2. ábra).
39
Antinociceptív hatás % 100
80
60
40
20
0 0
30
60
90
120 150 t (min)
180
210
240
270
1. ábra. Különböző dózisú, szubkután adott [Dmt1]DALDA antinociceptív hatásának időbeni függése naív egérben. A méréseket 30, 60, 120 és 240 perc elteltével végeztük. Dózisok: •: 0,2 µmol/kg); ■: 0,4 µmol/kg; ▲: 0,8 µmol/kg.
Antinociceptív hatás %
120 100 80 60 40 20 0 0,01
0,1
1
10
100
µmol/kg (sc.) 2. ábra. Szubkután adott [Dmt1]DALDA és morfin antinociceptív dózis-hatás görbéi naív egérben. ■: [Dmt1]DALDA; ●: morfin
40
Annak érdekében, hogy eldönthessük, vajon a [Dmt1]DALDA a periférián vagy a központi idegrendszerben fejti-e ki antinociceptív hatását, megvizsgáltuk a szelektíven perifériásan ható naloxon-metiodid antagonista hatását sc. adagolásnál. 1 µmol/kg sc. naloxon a [Dmt1]DALDA AD50 értéket 9-szeresére, a morfinét 53-szorosára növelte. A naloxon-metiodid 1 µmol/kg dózisban a morfin AD50 értékét 2,5-szeresére növelte, míg a [Dmt1]DALDA AD50 értékére nem volt hatással. (4. táblázat). 4. táblázat. A szubkután adott morfin és [Dmt1]DALDA antinociceptív hatása, és antagonizálásuk naloxonnal, illetve naloxon-metiodiddal tail-flick teszten. AD50 µmol/kg (95% konfidencia limit) Vegyületek (sc.)
és az antagonizmus mértéke [ ]
1
[Dmt ]DALDA
0,3 (0,13-0,72)
[Dmt1]DALDA + 1 µmol/kg naloxon
2,7 (1,59-4,59)
[9]
[Dmt1]DALDA + 1 µmol/kg naloxon metiodid
0,28 (0,11-0,70)
[1]
Morfin
12 (6,98-20,6)
Morfin + 1 µmol/kg naloxon
640 (320-1280)
[53]
Morfin + 1 µmol/kg naloxon-metiodid
31 (9,7-99)
[2,6]
A 3. ábra és az 5. táblázat mutatja a morfin pellet beültetése után a negyedik napra kialakuló szubkután tolerancia mértékét. Látható, hogy míg a morfin antinociceptív hatékonysága 8-9-ed részére, a DAMGO-é negyed-ötöd részére, a [Dmt1]DALDA hatékonysága pedig mindössze a felére csökkent.
41
Antinociceptív hatás % 100 80 60 40 20 0 0,1
1
10
100
1000
µmol/kg (sc.)
3. ábra. Morfin pellet beültetése után, a negyedik napon mért tolerancia mértéke szubkután adott morfinra, DAMGO-ra és [Dmt1]DALDA-ra.
□:[Dmt1]DALDA naiv egérben; ■: sc. [Dmt1]DALDA morfin pellet implantált egérben; ○: sc. morfin naiv egérben; ●: sc. morfin morfin pellet implantált egérben; ∆: sc. DAMGO naív egérben; ▲: sc. DAMGO morfin pellet implantált egérben 5. táblázat. Morfin pellet beültetése után, a negyedik napra kialakuló tolerancia mértéke szubkután adott morfinra, DAMGO-ra és [Dmt1]DALDA-ra tail-flick teszten. AD50 érték µmol/kg (95%-os konfidencia limit) Vegyületek
naiv egerekben
Morfin pellet implantált egerekben [tolerancia mértéke]
Morfin
10,0 (6,5-13,5)
DAMGO
12,5 (6,4-24,4)
1
[Dmt ]DALDA
87,0 (58,7-129,0) 56,0 (32,0-98,0)
0,30 (0,18-0,50)
0,60 (0,33-1,08)
42
[8,7] [4,48] [2]
6.4.2 Az intratekálisan (it.) és intracerebroventrikulárisan (icv.) adott [Dmt1]DALDA antinociceptív hatása A [Dmt1]DALDA mind it., mind icv. adva nagyon hatékonynak mutatkozott. Az értékeket a 6. táblázat mutatja. A vegyület icv. adva a DAMGO-hoz képest 30-szor, it. adva – a különböző kísérletekben mért kissé eltérő [Dmt1]DALDA AD50 értékek miatt, - 6-14-szer hatékonyabbnak bizonyult. 6. táblázat: A [Dmt1]DALDA és DAMGO it. és icv. AD50 értékeinek összehasonlítása naív egérben tail-flick teszten. AD50 (nmol/egér) (95% konfidencia limit) Vegyületek
It.
Icv.
[Dmt1]DALDA
0,0019 (0,00095-0,0038)
0,0057 (0,0033-0,01)
DAMGO
0,027 (0,015-0,049)
0,17 (0,089-0,33)
6.4.3 Az it. és icv. adott naloxon-metiodid hatása az it. és icv. adott [Dmt1]DALDA által kifejtett antinociceptív hatásra
Mint már láthattuk, a csak perifériásan ható naloxon-metiodid nem gátolta a szubkután adott [Dmt1]DALDA antinociceptív hatását. It. és icv. adva azonban a naloxon it. illetve ivc. dózisához képest képest tized, illetve harmad akkora dózis it. 7szeresére, icv. pedig 6-szorosára tolta el a [Dmt1]DALDA dózis-hatás görbéjét. (7. táblázat).
43
7. táblázat: A [Dmt1]DALDA AD50 értékei it. és icv., valamint naloxon (10 nmol/egér it., 25 nmol/egér icv.) és naloxon-metiodid (1 nmol/egér it., 10 nmol/egér icv.) jelenlétében tail-flick teszten. AD50 (nmol/egér) (95% konfidencia limit) It. [Dmt1]DALDA
Icv.
0,0019 (0,00095-0,0038) 0,0057 (0,0033-0,01)
1
[Dmt ]DALDA+naloxon
0,014 (0,0058-0,034)
0,057 (0,032-0,10)
[7,37]
[10]
0,014 (0,0074-0,026)
0,035 (0,016-0,077)
[7,37]
[6,1]
[gátlás mértéke]: [Dmt1]DALDA+naloxon-metiodid [gátlás mértéke]:
6.4.4 A [Dmt1]DALDA opioid receptor szelektivitása a gerincvelőben A [Dmt1]DALDA gerincvelői opioid receptor szelektivitásának megállapításához kétféle megközelítést alkalmaztunk. Egyrészt a [Dmt1]DALDA-t különböző opioid receptor szelektív antagonistákkal adtuk együtt intratekálisan, másrészt meghatároztuk a szelektív µ-antagonista CTAP pA2 értékét [Dmt1]DALDA és a szelektív µ-agonista DAMGO ellen. A 8. táblázat adataiból látható, hogy sem a szelektív κ-antagonista norBNI, sem a szelektív δ-antagonista TIPPψ nem gátolta a [Dmt1]DALDA antinociceptív hatását a gerincvelőben. A szelektív µ-antagonista CTAP azonban dózisfüggően gátolta a [Dmt1]DALDA dózis-hatás görbéjét (8. táblázat). A CTAP pA2 analízisét mutatja a 4. ábra.
44
8. táblázat: Szelektív opioid receptor antagonisták hatása az it. adott [Dmt1]DALDA antinociceptív hatására tail-flick teszten. It. AD50 nmol/egér (95% konfidencia limit) és a gátlás mértéke [ ] [Dmt1]DALDA
0,0022 (0,0013-0,0036)
[Dmt1]DALDA + 0,05 nmol/egér CTAP
0,0078 (0,0048-0,0126)
[3,54]
1
0,0125 (0,0084-0,0185)
[5,68]
1
0,03 (0,02-0,045)
[Dmt ]DALDA + 0,10 nmol/egér CTAP [Dmt ]DALDA + 0,20 nmol/egér CTAP
[13,64]
[Dmt1]DALDA
0,0045 (0,0031-0,0066)
[Dmt1]DALDA + 20 nmol/egér TIPPψ
0,0044 (0,0029-0,0067)
[Dmt1]DALDA
0,003 (0,0015-0,006)
[Dmt1]DALDA + 2 nmol/egér nor BNI
0,004 (0,0023-0,007)
lg(DR-1) 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4
y = -1,0002x + 10,695
0,2 0 9
9,5
10
10,5
11
-lg[CTAP]
4. ábra. A szelektív µ antagonista CTAP pA2 analízise [Dmt1]DALDA ellenében. Az ábráról leolvasható pA2 érték 10,69, a szelektív µ-agonista DAMGO ellen mért pA2 érték pedig 10,60 (lsd. később).
45
6.5 A gerincvelői szinten megvalósuló µ és δ kölcsönhatások vizsgálata naív és morfintoleráns egerekben Az alábbi kísérletekben az összes vegyületet it. adtuk.
6.5.1 A szelektív µ-agonista DAMGO és a szelektív δ-agonista DPDPE antinociceptív hatása naiv és morfin-toleráns egerekben
A µ és δ opioid receptorok gerincvelői kölcsönhatásának vizsgálatához két egértörzset választottunk. A H/ND4 törzset az alacsony toleranciájúak közül, a CR/SW törzset pedig a magas toleranciájúak közül (lsd. 1.táblázat). A 9. táblázat mutatja a két törzsben mért intratekális antinociceptív AD50 értékeket, mind naiv, mind toleráns állatokban. 9. táblázat: It. DAMGO és DPDPE AD50 értékei naiv és morfin-toleráns H/ND4 és CR/SW egerekben tail-flick teszten. AD50 (nmol/egér) (95% konfidencia limit) DAMGO naiv
DPDPE toleráns
Törzs
tolerancia mértéke
H/ND4 0,055 (0,039-0,078)
0,355 (0,25-0,51)
naiv
tolerancia mértéke 7,7 (4,78-12,4)
[6,45] CR/SW 0,028 (0,019-0,041)
toleráns 20,0 (12,7-31,5) [2,6]
0,58 (0,32-1,06) [20,7]
9,4 (6,3-14,0)
32,0 (19,9-51,6) [3,4]
A táblázatból leolvasható, hogy a morfin és az it. DAMGO, valamint a morfin és az it. DPDPE között kialakult a kereszttolerancia. DAMGO esetében az alacsony toleranciájú H/ND4 törzsben az azonos hatás eléréséhez 7-szeres, a magas szubkután morfin toleranciát mutató CR/SW törzs esetén pedig 20-szoros (!) dózist kelett adni. DPDPE adásakor a tolerancia mértéke mindkét egértörzsnél 3-szoros volt. Megjegyzendő azonban, hogy a CR/SW törzsben, a toleráns állatokban a kísérletek többségében nem
46
sikerült dózis-hatás görbét felvenni, mert igen nagy (120 nmol/egér) dózissal sem sikerült 50%-os hatásnál nagyobbat mérni.
6.5.2 A DAMGO és DPDPE antinociceptív hatásának antagonizálása CTAP-pal
A két kiválasztott egértörzsben megvizsgáltuk, hogy a szelektív µ antagonista CTAP, intratekálisan adva, hogyan befolyásolja a szintén intratekálisan adott DAMGO, illetve a DPDPE antinociceptív hatását. Korábban, az S/SW törzsben leírták (77), hogy a CTAP ugyanúgy gátolta a DPDPE antinociceptív hatását egér tail-flick teszten, mint a DAMGO-ét. A kísérletet azért ismételtük meg, mert látni szerettük volna, hogy a jelenség általános-e más egértörzsekben is. Az 5. ábrán a H/ND4-nél, a 6. ábrán pedig a CR/SW törzsben kapott dózis-hatás görbéket ábrázoltuk. (Az ábrákon a jobb áttekinthetőség kedvéért csak két CTAP dózist tüntettünk fel, a pA2 értéket, viszont három CTAP dózisból számítottuk ki.)
47
A
H/ND4 100
Hatás %
80 60 40 20 0 0,01
0,1
1
10
DAMGO nmol/egér it.
B
H/ND4 100
Hatás %
80 60 40 20 0 1
10
100
1000
DPDPE nmol/egér it.
5. ábra: 0,05nmol/egér és 0,25nmol/egér CTAP hatása (A) a DAMGO, és (B) DPDPE antinociceptív hatására H/ND4 egértörzsben.
■:DAMGO; ■:DAMGO + 0,05nmol/egér CTAP;■:DAMGO + 0,25nmol/egér CTAP ●:DPDPE;●:DPDPE + 0,05nmol/egér CTAP;●:DPDPE + 0,25nmol/egér CTAP
48
a
CR/SW
A
100
Hatás %
80 60 40 20 0 0,01
0,1
1
10
DAMGO nmol/egér it. CR/SW
B
100
Hatás %
80 60 40 20 0 1
10
100
1000
DPDPE nmol/egér it.
6. ábra: 0,05nmol/egér és 0,25nmol/egér CTAP hatása (A) a DAMGO, és (B) a DPDPE antinociceptív hatására CR/SW egértörzsben.
■:DAMGO; ■:DAMGO + 0,05nmol/egér CTAP;■:DAMGO + 0,25nmol/egér CTAP ●:DPDPE;●:DPDPE + 0,05nmol/egér CTAP;●:DPDPE + 0,25nmol/egér CTAP
49
Az ábrákon látható, hogy mindkét egértörzsben, a CTAP gyakorlatilag egyformán tolta jobbra a DAMGO dózis-hatás görbéit. A 10. táblázatban összefoglaltuk a CTAP pA2 értékeit, valamint a Schild regresszióval kapott meredekség értékeket. Látható, hogy a pA2 értékek nagyon közel vannak egymáshoz, a meredekségek viszont csak a nagy toleranciájú CR/SW törzsben közelítenek -1-hez. 10. táblázat: A CTAP pA2 értékei DAMGO és DPDPE ellen, zárójelben a Schild regressziós egyenes meredeksége. Törzs
A CTAP pA2 értéke (meredekség) DAMGO
DPDPE
H/ND4
10,6 (-1,35)
11,2 (-0,75)
CR/SW
11,1 (-1,06)
11,0 (-0,92)
6.5.3 A szelektív δ antagonista TIPPψ hatása a DAMGO és DPDPE antinociceptív hatására naív és morfintoleráns egerekben
A δ receptor szerepét az intratekálisan adott µ és δ agonisták antinociceptív hatásában naiv és morfin-toleráns egerekben a rendkívül szelektív δ antagonista TIPPψ (213) segítségével vizsgáltuk. Naiv H/ND4 és CR/SW egerekben 30nmol/egér dózisú TIPPψ nem gátolta sem a DAMGO, sem a DPDPE antinociceptív hatását (7.A és 8.A ábra). Morfin-toleráns egerekben azonban, mindkét törzsben, 0,2nmol/egér és 2nmol/egér dózisú TIPPψ dózisfüggően potencírozta a DAMGO antinociceptív hatását. A szubkután kezelésnél kisfokú morfin-toleranciát mutató H/ND4 törzsben a 2nmol/egér TIPPψ gyakorlatilag teljesen visszaállította a DAMGO fájdalomcsillapító hatását, a dózis-hatás görbe nem különbözött a naiv kontrollban felvett görbétől. A nagyfokú szubkután morfin-toleranciát mutató CR/SW törzsben a visszaállítás csak részleges volt (7.B és 8.B ábra).
50
A
CR/SW 100
Hatás %
80 60 40 20 0 0,001
0,01
0,1
1
DAMGO nmol/egér it.
B
CR/SW 100
Hatás %
80 60 40 20 0 0,01
0,1
1
DAMGO nmol/egér it.
7. ábra: TIPPψ hatása a DAMGO antinociceptív hatására (A) naív és (B) morfintoleráns CR/SW egerekben.
□:DAMGO; □:DAMGO + 30nmol/egér TIPPψ ■:DAMGO naív egérben; ■:DAMGO toleráns egérben; ■:DAMGO + 0,2nmol/egér TIPPψ; ■:DAMGO + 2nmol/egér TIPPψ
51
H/ND4
A
100
Hatás %
80 60 40 20 0 0,001
0,01
0,1
1
DAMGO nmol/egér it.
B
H/ND4 100
Hatás %
80 60 40 20 0 0,01
0,1
1
DAMGO nmol/egér it.
8. ábra: TIPPψ hatása a DAMGO antinociceptív hatására (A) naív és (B) morfintoleráns H/ND4 egerekben.
□:DAMGO; □:DAMGO + 30nmol/egér TIPPψ ■:DAMGO naív egérben; ■:DAMGO toleráns egérben; ■:DAMGO + 0,2nmol/egér TIPPψ; ■:DAMGO + 2nmol/egér TIPPψ
52
A
H/ND4 100
Hatás %
80 60 40 20 0 0,0001
0,001
0,01
0,1
1
DAMGO nmol/egér it.
B
CR/SW 100
Hatás %
80 60 40 20 0 0,0001
0,001
0,01
0,1
1
DAMGO nmol/egér it
9. ábra: 30nmol/egér TIPPψ hatása a µ-δ potencírozásra naiv (A) H/ND4 (B) CR/SW egerekben.
□:DAMGO; □:DAMGO + 2nmol/egér DPDPE □ és ▲:DAMGO + 2nmol/egér DPDPE + 30nmol/egér TIPPψ;
53
Az irodalomban leírták, hogy egér gerincvelőben a µ és δ receptorok tail-flick antinociceptív tesztben potencírozó kölcsönhatásban vannak, az opioid tolerancia kialakulása során pedig ez a potencírozás eltűnik (77). Kimutattuk, hogy a H/ND4 és a CR/SW törzsben hasonló potencírozás van. 2nmol/egér DPDPE DAMGO-hoz történő hozzáadása a DAMGO AD50 értékét harmad, illetve hatodrészére csökkentette. 30nmol/egér TIPPψ a potencírozást teljesen megszűntette. (9. ábra).
54
7. MEGBESZÉLÉS Az opioid toleranciának számos mechanizmusa képzelhető el. A dolgozatban, az egyes egértörzsekben morfin pellet beültetése után, a tail-flick teszten mérhető akut fájdalomcsillapító hatásához kialakuló tolerancia főbb aspektusaival foglalkozom. Az embernél kialakuló morfinfüggőség bonyolult jelenség, az élettaniakon kívül társadalmi és környezeti tényezők is hozzájárulnak kialakulásához. Ráadásul még a fiziológiai tényezők is messze sokrétűbbek, mint egyszerűen csak a tolerancia és a dependencia kialakulása, különösen igaz ez a pszichés vágyakozásra a kábítószer iránt. Ha mindezeket számba is vesszük, akkor is igaz, hogy a tolerancia/dependencia egér modellje hasznos eszköz az emberi addikció megértéséhez. A tolerancia/dependencia kialakulásában sok tényező játszhat szerepet, mi elsősorban az opioid receptorokat kívántuk vizsgálatunk tárgyává tenni. 7.1 Morfintolerancia kialakulása a különböző egértörzsekben
7.1.1 Három napos morfinpellet beültetésének hatására szubkután adott morfinhoz kialakuló tolerancia
A tolerancia mértékét a morfinexpozíciónak kitett illetve naív állatban, a mért opioid AD50 értékeinek arányával fejezzük ki. Hat olyan egértörzset választottunk, amelyek egy genetikailag körülhatárolható kis csoport Swiss egértől származnak, így a genetikai diverzitás valószínűleg nem túl jelentős. Meglepő módon, ennek ellenére azt találtuk, hogy a kiválasztott törzsek közül háromnál szubkután adott morfin antinociceptív hatásához csak kismértékű tolerancia alakult ki (2-3-szoros eltérés az AD50 értékekben), míg három másik törzsnél nagyfokú toleranciát tapasztaltunk (7-8-szoros eltérés az AD50 értékekben). A különbségnek számos farmakodinámiai, farmakokinetikai vagy egyéb oka képzelhető el. Változások történhetnek például az opioid receptorok szerkezetében, opioidok által aktivált szignál transzdukciós útvonalakban, például a G proteinekben vagy az adenilciklázban. SNP-k vagy más elvátozások érinthetik ezeket a molekulákat is (53). Emellett más neurotranszmitter rendszerek, mint például a glutamát NMDA receptorokon keresztül, ugyancsak befolyásolhatják az opioid rendszert (110).
55
Az opioid receptorok szintjén a következő különbségek magyarázhatják az eltérő mértékű toleranciát: 1. A receptorokat kódoló gének nukleotid szekvenciája eltérő, és ez az eltérés az aminosav-sorrendben is változásokhoz vezet. Az így kódolt receptorok között a tolerancia kialakulása során ligandkötési és a másodlagos hírvivők aktiválásában jelentkező módosulások magyarázhatják az eltéréseket. 2. Az adott opioid receptorok genetikai kódjai között nincsenek eltérések, ez esetben splice variánsok megjelenése, exon-kihagyás (exon skipping), intron szakasz transzkripciója vagy RNS editálási folyamatok változtathatják meg a receptorok aminosav-sorrendjét, illetve ha az aminosav sorrend változatlan, akkor poszttranszlációs modifikációk eredményezhetnek eltérő viselkedést, ám ez szintén meg kellene, hogy mutatkozzon a receptorok ligandkötésében és működésében. 3. Amennyiben az aminsav-sorrendek nem változnak, és a receptorok működésében sem tapasztalunk eltéréseket, fölmerül a receptorinterakciók lehetősége. Az interakciók lehetnek lokálisak, egy körülhatárolható idegrendszeri régión belül, akár egyetlen idegsejten belül is, vagy lehetnek nem
lokálisak,
amikor
különböző
idegrendszeri
régiók
közötti
kölcsönhatások lehetnek eltérőek. A fenti lehetőségek közül mi a genetikai eltéréseket, a különböző opioid agonisták viselkedését, valamint a µ és δ receptorok gerincvelői interakcióit tanulmányoztuk.
7.1.2 Az opioid receptor gének polimorfizmusa a vizsgált egértörzsekben
Mind a hat egértörzsnél meghatároztuk a három fő opioid receptor nukleotid szekvenciáját genomiális DNS-ből, valamint két egértörzsnél (Hilltop/SW és S/SW) a cDNS szekvenciákat is. A µ, δ és κ opioid receptorok szekvenciájában nem találtunk olyan polimorfizmust, amely összefüggést mutatna az opioid tolerancia kialakulásával. Ráadásul a kimutatott SNP-k sem változtatták meg a receptorfehérjék aminosav sorrendjét. A cDNS szekvenciák összehasonlítása a genomiális DNS-sel sem mutatott semmilyen eltérést, tehát az RNS editálás, exon kihagyás (exon skipping) vagy intron
56
szakasz transzkripciója is kizárható. Mivel az RNS-t egéragyból és egér gerincvelőből nyertük, arra is választ kaphattunk, van-e különbség az agyi és gerincvelői opioid receptorok szekvenciáiban. Az analízis nem mutatott újabb SNP-ket a fent részletezetteken kívül, minden szekvencia megegyezett a genomiális DNS analízise során kapott adatokkal. Ezek az eredmények egyértelműen arra utalnak, hogy az általunk vizsgált egértörzsekben létrejövő, eltérő mértékű tolerancia nem magyarázható opioid receptoraik eltérő elsődleges szerkezetével. Az elsődleges szerkezet - az aminosav-sorrend - változatlansága még nem jelenti azt, hogy a ligandok iránti affinitás sem változhat, hisz azt a receptor térbeli szerkezete és membránkörnyezete is befolyásolná. Bár a µ receptor nukletid szekvenciájában nem találtunk eltérést, nem zárható ki, hogy a µ receptor módosulása szerepet játszhat a morfintolerancia kialakulásában. Egyes kutatók ugyanis a µ receptor génjének 10 exonját írták le, és számos splice variáns létét igazolták (193, 159). Ezek a splice variánsok mind nagy affinitással kötik a µ ligandokat, azonban egyelőre nem sikerült egyértelmű kapcsolatot kimutatni köztük és a farmakológiailag leírt µ receptor altípusok között. Eredményeink nem zárják ki azt sem, hogy más, itt meg nem figyelt mutációk befolyásolhatják a kialakuló tolerancia mértékét. A µ és δ receptorokban kimutatott pontmutációk megváltoztatták a ligandok affinitását a mutált receptorokkal transzfektált sejttenyészetekben (8, 20, 21), demonstrálva, hogy a receptorok szekvenciájában bekövetkező kis változás is befolyásolhatja az opioid affinitást. Emellett számos polimorfizmust mutattak ki az emberi µ receptor génben, beleértve legalább 11 polimorfizmust a kódoló exonokban, és még többet az intronokban és a szabályozó régiókban (84). Nem tisztázott azonban, hogy ezeknek a polimorfizmusoknak van-e szerepük az emberekben megfigyelhető, eltérő mértékű tolerancia kialakulásában. Nem találtuk meg a human limfoblastoid sejtekben kimutatott alternatív κ, és a C56-os egértörzs agyában talált δ splice variánsokat, nem találtunk patkány és emberi µ izoformákat sem (276). Mivel az emberi populáció még sokkal heterogénebb, mint az általunk vizsgált egértörzsek, az említett vagy más opioid receptor splice variánsoknak a szabályozása még fokozottabban befolyásolhatja az opioid tolerancia kialakulását (249).
57
7.1.3 A különböző opioid agonisták között kialakuló kialakuló kereszttolerancia vizsgálata szubkután adagolás mellett
Megvizsgáltuk, hogy a morfinpellet beültetés hatására kialakul-e kereszttolerancia a morfin és szelektív µ agonista DAMGO, illetve morfin és a [Dmt1]DALDA között, a peptidek szubkután adagolásakor. A [Dmt1]DALDA részletes elemzése a 7.3.1 fejezetben kerül ismertetésre, mindenképpen fontosnak tűnik azonban, hogy a szubkután adagolás melletti eredményeket itt ismertessük. Mind a DAMGO, mind a [Dmt1]DALDA antinociceptív hatással rendelkezik szubkután adagolás esetén. A DAMGO AD50 értéke gyakorlatilag megegyezik a morfinéval (12,5µmol/kg, illetve 10,0µmol/kg), a [Dmt1]DALDA equipotens dózisa 0,3µmol/kg. Ez az eredmény mindenképpen arra utal, hogy a [Dmt1]DALDA jól penetrál a vér-agy gáton keresztül. A [Dmt1]DALDA, szubkután adás esetén, csekély kereszttoleranciát mutatott a morfinnal. Szubkután adás esetén a peptid AD50 értéke elhanyagolható mértékben emelkedett a morfintoleráns állatokban. Morfin esetében a tolerancia mértéke 8-9szeres, DAMGO esetében 4-5-szörös volt. Úgy tűnik, hogy bár a [Dmt1]DALDA és a morfin ugyanazokon a receptorokon hat (lsd. később), toleráns állatokban különbségeket figyeltünk meg. A kereszttolerancia hiányát mások is igazolták (150). A morfin és a [Dmt1]DALDA kisfokú kereszttoleranciájának oka magyarázható úgy, hogy a morfin toleranciát olyan receptor konformáció változás okozza, amely csökkenti a morfin affinitását, de nem befolyásolja a [Dmt1]DALDA-ét. Nagyon érdekes eredményt kaptak Szeto és mtsa., akik 7 napig kezeltek egereket szubkután adott [Dmt1]DALDAval, és komplett kereszttoleranciát tapasztaltak morfinnal. A morfin és [Dmt1]DALDA közötti kereszttolerancia hiányának egyik lehetséges magyarázata az lehetne, hogy más receptor altípusokkal lépnének kölcsönhatásba. Számos kutatócsoport valószínűsítette több µ receptor altípus létét (147, 161). Két altípus, a µ1 és a µ2 az agyban, míg a µ3 a periférián, különböző immunsejteken (52, 235) és egyes központi idegrendszerből származó sejtvonalakon helyezkedne el (47). A µ1 és µ2 altípus érzékeny CTAP-ra, a µ3-at még nem vizsgálták ezirányban. A morfin antinociceptív hatása, valamint a morfintolerancia feltételezhetően µ1 receptorokhoz kötött, habár µ1 receptor hiányos állatokban a µ2 receptor mediálta az antinociceptív hatást, mivel az icv. adott, µ szelektív etonitazene hatását naloxon antagonizálta,
58
naltrindol pedig nem (40). Ezért elképzelhető az is, hogy a [Dmt1]DALDA a µ2, esetleg a µ3 receptor iránt szelektív. Ezt támasztaná alá, hogy a [Dmt1]DALDA hatékony analgetikumnak bizonyult morfinrezisztens CXBK egerekben, és a µ1 szelektív naloxonazin csak a szisztémásan adott [Dmt1]DALDA antinociceptív hatását antagonizálta, az icv. és it. adottét nem (151). A morfin analgéziát ezzel szemben a naloxonazin mindenhol felfüggeszti (123, 164). Ugyancsak eltérő hatásokat mutattak a MOR-antiszensz DNS szekvenciákkal végzett kísérletek, mivel a [Dmt1]DALDA hatását a MOR-1 elleni szekvencia nem befolyásolta (151). A µ2 receptor szerepével kapcsolatban felmerül a kérdés, hogy a [Dmt1]DALDA vajon hogyan befolyásolja a légzésfunkciókat. A µ receptor altípusok egyik farmakológiai bizonyítéka ugyanis épp az analgetikus (µ1) és a légzésdepresszív (µ2) hatás szétválaszthatósága (123). Ha ugyanis a [Dmt1]DALDA µ2 receptoron keresztül fejtené ki fájdalomcsillapító hatását, akkor
nagyon
erős
légzésdepresszív
tulajdonsággal
kellene
rendelkeznie.
A
légzésdepresszív hatást Shimoyama és mtsai. vizsgálták, akik azt találták, hogy a [Dmt1]DALDA anyavegyülete, a DALDA erősebb légzésdepressziót okoz, mint a morfin, viszont a [Dmt1]DALDA fájdalomcsillapító dózisban alig deprimálja a légzést (218). Mindez ellentmondásban van a feltételezett µ2 szelektivitással, azonban a kutatócsoport szerint a [Dmt1]DALDA fájdalomcsillapító hatásához egy noradrenalin visszavételt gátló hatás is hozzájárulna, amely nagymértékben csökkenti az analgéziához szükséges dózist, így a légzésdepresszió csekélyebb. A noradrenalin visszavétel gátlás szerepe ellen szól, hogy ha egy ilyen potencírozó antinociceptív szinergizmussal állunk szemben, akkor hogyan magyarázzuk a µ antagonisták kompetitív jellegű hatását a [Dmt1]DALDA fájdalomcsillapító hatásával szemben. 7.2 Különböző opioid agonisták spinális antinociceptív hatásának vizsgálata morfintoleráns egerekben Kísérleteinkben megvizsgáltuk, hogy a szisztémásan adott morfinhoz létrejövő tolerancia kialakulásában milyen szerepet játszanak a gerincvelői µ és δ opioid receptorok. Mivel µ agonistaként az irodalomban még részletesen nem tanulmányozott [Dmt1]DALDA-t is használtuk, ezért ennek fájdalomcsillapító hatását részletesebben is megvizsgáltuk.
59
7.2.1 A [Dmt1]DALDA antinociceptív hatásainak vizsgálata naív állatokban Már korábban leírták, hogy a [Dmt1]DALDA, a természetben is előforduló dermorphin analógja, 20-szor hatékonyabb a morfinnál a tengerimalac ileum hosszanti simaizmán elektromosan kiváltott összehúzódás gátlásában, és hasonló kísérletben hétszer hatékonyabb az egér vas deferensén. A µ receptor iránti affinitása hétszer nagyobb a morfinénál, és 10-szer nagyobb a DAMGO-énál, µ receptor szelektivitása pedig a δ-hoz képest több, mint 10000-szeres (211). A kísérletekhez az egyik nagyfokú morfintoleranciát mutató egértörzset, a H/ICR-t választottuk. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy a [Dmt1]DALDA sc. adás esetén 40-szer hatékonyabb a morfinnál és a DAMGO-nál egér tail-flick teszten. It. adva a [Dmt1]DALDA 6-14-szer bizonyult hatékonyabbnak, mint az it. adott DAMGO és kb. 500-szor hatékonyabb, mint az it. morfin. A [Dmt1]DALDA szisztémásan kifejtett antinociceptív hatását a klasszikus antagonista naloxon gátolta, a szelektív µ antagonista CTAP-pal végzett kísérletek pedig arra utaltak, hogy ugyanazzal a spinális µ receptor populációval lép kölcsönhatásba, mint a DAMGO. It. adagolás mellett sem a κ-antagonista norBNI, sem a δ-antagonista TIPPψ nem volt hatással a [Dmt1]DALDA antinociceptív hatására. Az eredmény összhangban van a korábbiakkal, melyek szerint a [Dmt1]DALDA a µ receptorokhoz kötődik in vitro is (211). A szubkután adott [Dmt1]DALDA erős aktivitása szokatlannak tűnhet, ugyanis a peptid ligandok gyakran nagyon nehezen jutnak be a központi idegrendszerbe, ráadásul még a keringésben metabolizálódhatnak (158). A [Dmt1]DALDA anyavegyülete, a DALDA, habár a metabolizáló enzimekre rezisztens, (238) igen csekély vér-agy gáton keresztüli penetrációs képességgel rendelkezik. (204) Ezzel szemben a szisztémásan adott [Dmt1]DALDA esetén azt találtuk, hogy antinociceptív hatása a perifériás antagonista naloxon-metiodiddal nem volt antagonizálható. A periférián és a központi idegrendszerben is ható naloxon szubkután adva viszont µ szelektív dózisban gátolta a [Dmt1]DALDA hatását. A 2’-6’ pozícióban jelenlévő két metilcsoport várhatóan lipofilebbé teszi a [Dmt1]DALDA-t a DALDA-hoz képest, ezáltal fokozza a vér-agy gáton való átjutás valószínűségét. Ebből a szempontból ugyancsak érdekes, hogy a
60
[Dmt1]DALDA nagyon hosszú hatástartamúnak bizonyult, beadás után két órával is aktív. Szeto és mtsai. kimutatták, hogy a [Dmt1]DALDA féléletideje 7.5-szer hosszabb, mint a DAMGO-é, plazma clearence pedig a DAMGO-énak tizede (239).
7.2.2 A morfin, DAMGO, DPDPE és [Dmt1]DALDA spinális hatásainak vizsgálata morfintoleráns egerekben
Amikor morfint szisztémásan adunk, akár szubkután injekció vagy beültetett pellet formájában, 3 nap alatt jelentős tolerancia alakul ki szubkután adott morfinnal szemben, azonban nem mérhető tolerancia, ha a morfint it. adjuk (169, 235, 264). A jelenséget hat különböző egértörzsben igazoltuk, a törzsekben morfinpellet hatására morfinhoz különböző mértékű tolerancia alakult ki. Emellett a tolerancia a legtöbb törzsben a morfinnál sokkal szelektívebb µ, illetve δ agonista DAMGO-ra és DPDPE-re is létrejött a peptidek intratekális alkalmazásakor. Intratekálisan adott morfinra azonban mindössze egy krónikusan kezelt törzs mutatott toleranciát. Yoburn és mtsai. (270) kimutatták, hogy intratekális morfinra is gyors tolerancia alakult ki szubkután morfinkezelés hatására, így elképzelhető, hogy a jelenség függ attól, hogy milyen egértörzset használunk a kísérleteinkben. Emellett azonban a tolerancia létrehozásának a mikéntje is kritikus lehet. Roerig és mtsai. (187) leírták, hogy a morfin pellet eltávolítása után az it. adott morfinra gyors tolerancia fejlődik ki. Az intratekálisan adott δ-agonista DPDPE-hez mind a hat törzsben kialakult tolerancia, míg a µ-agonista DAMGO hatásához 4 törzsben figyeltük meg a jelenséget (nem feltüntetett saját adat). A tolerancia jelentős mértékű volt, de nem korrelált a szubkután adott morfinra kialakuló tolerancia mértékével. Hogyan alakulhat ki tolerancia a szelektívebb agonisták antinociceptív hatásához, míg a morfinéhoz nem? Megállapítottuk, hogy a morfinhoz kialakuló spinális tolerancia hiánya általános jelenség, számos különböző egértörzsben megfigyelhető. Ezután a szelektív antagonistákkal meghatároztuk az agonistákkal interakcióba lépő opioid receptorok típusát. Korábbi kísérletekben H-SW egerekben kimutatták, hogy it. adva a szelektív µ-antagonista CTAP egyenlő mértékben gátolta a DAMGO és DPDPE által kifejtett antinociceptív hatást. A szelektív δ-antagonista naltrindol it adva, csak olyan
61
dózisban gátolta a DPDPE antinociceptív hatását, mint a DAMGO-ét (77). Ez, és más eredmények is arra utalnak, hogy a DPDPE által létrehozott antinociceptív hatása közvetlenül a µ opioid receptorok által jön létre. A fenti eredményeket ismételten megkaptuk, és kiterjesztettük jelenlegi kísérleteinkben. A hat egértörzsből kettőt választottunk ki, egy kisfokú (H/ND4) és egy nagyfokú (CR/SW) morfintoleranciát mutatót. Kimutattuk, hogy a CTAP egyforma erősséggel gátolja mindkét agonista hatását a két egértörzsben. Mindezeken túl a CTAP pA2 értékei DPDPE-vel szemben hasonlóak voltak a DAMGO-val szemben mért és számolt értékekhez. Ez arra utal, hogy ezekben a törzsekben a DPDPE µ receptorokon keresztül fejti ki antinociceptív hatását a gerincvelőben, ami felveti a µ receptor mediálta folyamatok általános jellegét a hatás kialakulásában. A DPDPE µ agonista hatását szupraspinális szinten is leírták (60). Az eredmények azt is mutatják, hogy a µ receptor által közvetített hatásra ezekben a törzsekben kialakul a tolerancia, habár a morfin esetében a gerincvelőben e jelenséget nem tudjuk kimutatni. A szelektív µ agonista [Dmt1]DALDA és a morfin között, az antinociceptív hatás ellen, a [Dmt1]DALDA it. adása esetén a DAMGO-tól eltérően, nem alakult ki számottevő kereszttolerancia (nem közölt saját adat). A jelenségre a µ-δ kölcsönhatásokat taglaló fejezetben próbálok meg magyarázatot adni. Szeto és mtsai. szubkután adott [Dmt1]DALDA-val létrehozott tolerancia során a gerincvelőben is nagymértékű toleranciát mértek, it. adva a [Dmt1]DALDA AD50 értéke 44-szerese volt a kontrollnak, míg icv. mindössze 3,4-szerese (274). A különbségre magyarázatot nem adtak, mindenesetre úgy tűnik, hogy az opioid tolerancia kifejlődésében résztvevő spinális folyamatok különböznek a szupraspinálisoktól, emellett az utóbbi eredményt patkányokban, és nem egerekben kapták. 7.3 Gerincvelői kölcsönhatás a µ és δ opioid receptorok között
7.3.1 µ-δ kölcsönhatás gerincvelőben naív állatokban
A 80-as években írták le először, hogy δ agonista vegyületek mind it., mind icv. adva potencírozzák az it. illetve icv. adott morfin antinociceptív hatását. Később sikerült
62
igazolni a δ agonista DPDPE potencírozó hatását gerincvelői szinten morfinra, illetve a µ szelektív DAMGO-ra vonatkozóan is (77, 117, 129, 172). Mi is kimutattuk, hogy habár a DPDPE közvetít antinociceptív hatást a gerincvelőben µ receptorokon keresztül, másrészt viszont potencírozza a szelektív µ agonista DAMGO hatását. Azt is igazoltuk, hogy ez a potencírozás δ receptorok közvetítésével jön létre, mivel a szelektív δ antagonista TIPPψ gátló hatással volt rá. A mechanizmus magyarázatához itt nem szükséges feltételeznünk a receptorkomplexek létrejöttét, hisz szinergizmus opioid receptorok esetén a second messengerek szintjén is létrejöhet, feltételezve, hogy mindhárom közismert, opioid receptorokhoz kapcsolt másodlagos hírvivő rendszer gátló hatásokat közvetít. A mechanizmus megértéséhez még számos további kísérlet elvégzése szükséges.
7.3.2 µ-δ kölcsönhatások szerepe a gerincvelői szinten kialakuló opioid toleranciában
Kezdeti célunk a kísérletekkel az volt, hogy választ kapjunk arra a kérdésre, hogy miért alakul ki gyors tolerancia szubkután, és miért nem intratekálisan adott morfinhoz 3 napos pellet beültetés hatására. Eredményeink egyik lehetséges magyarázata a következő. Mint nem szelektív agonista, a morfin mind a µ, mind a δ receptorokkal kölcsönhatásba lép. Azt korábban kimutatták, hogy a csak δ receptorokat tartalmazó rendszerekben, mint az NG108-15 sejtvonal, a morfin csak parciális agonista hatással bír (119). Így bizonyos koncentrációban a morfinnak antagonista hatása lehet a δ receptorokon, ezáltal a szisztémásan toleráns állatokban gátolhatja a spinális δ receptorok µ receptorra kifejtett hatásait, megakadályozva ezzel a spinális tolerancia létrejöttét. A fenti elméletből egy klinikailag is releváns következtetésre juthatunk: ha sikerülne olyan vegyületet kifejleszteni, amely hasonló dózisban µ receptor agonista és δ receptor antagonista, akkor ahhoz a vegyülethez nem, vagy csak sokkal lassabban alakulna ki tolerancia, mint a morfinhoz. Eddig egyetlen ilyen vegyületet ismerünk, a DIPP-NH2ψ nevű peptidet (210). A DIPP-NH2ψ icv. adva a morfinnál háromszor hatékonyabb. Akut tolerancia lassabban alakul ki mint a morfinhoz, krónikus adagolásnál viszont létrejött a tolerancia. A DIPP-NH2ψ elvonása nem hozott létre elvonási tüneteket patkányban. 63
A µ-δ kölcsönhatások jobb megértése érdekében morfintoleráns állatokban megvizsgáltuk, hogy a δ receptorok antagonizálása vajon hogyan befolyásolja a morfin és az it. adott DAMGO, illeve a morfin és az it. adott DPDPE között kialakuló kereszttoleranciát. A kérdés logikusan következik az előző bekezdésben feltételezett, a morfin által esetleg kifejtett δ antagonista hatásból, és a más kutatócsoportok által leírt jelenségből, miszerint δ antagonista előkezelés lelassítja a morfintolerancia kialakulását. (1, 62) A toleráns állatokban az it. adott, szelektív δ antagonista TIPPψ potencírozta az it. DAMGO antinociceptív hatását, szinte teljesen, vagy csaknem teljesen visszaállítva a naív állatokban mért értékre. A jelenség mind az alacsony, mind a nagy toleranciát mutató törzsben megfigyelhető volt. Néhány korábbi tanulmányban már közölték a δ receptorok által a µ receptorokra kifejtett potencírozó szinergizmust, (77, 117, 129, 172) elsőként a mi kutatócsoportunk írt le δ receptor által mediált antagonista kölcsönhatást toleráns állatokban. A jelenség összhangban van két kutatócsoport korábban említett eredményeivel, akik szerint δ antagonistákkal történő kezelés gátolta a morfintolerancia kialakulását (1, 62), valamint azzal, hogy δ receptor knock-out egerekben nem jött létre morfintolerancia (231, 275). A receptorkomplexek elméletéből egy olyan mechanizmusra következtethetünk, amely szerint a morfin tolerancia származhat a µ és δ receptorok fizikai összekapcsolódásából, és a morfinnak a dimerhez képesti kisebb affinitásából. Nemrég valóban kimutatták, hogy a µ és δ receptorok (65) valamint a δ és κ receptorok (97) heterodimereket hozhatnak létre, amelyeknek a ligandkötő képessége eltér az őket alkotó egyedi receptorokétól. Amennyiben a [Dmt1]DALDA affinitása és specifikus aktivitása a dimer iránt nem változik jelentősen a µ receptor iránti affinitáshoz képest, a peptid csekély kereszttoleranciát mutatna a morfinnal. A DAMGO és a DPDPE nagyfokú gerincvelői kereszttoleranciájára pedig éppen az adna magyarázatot, ha a két peptid dimer iránti affinitása vagy specifikus aktivitása vagy mindkettő csökkenne. Arra, hogy valóban megjelennek-e µδ heterodimerek morfintoleráns állatokban, közvetlen bizonyíték még nincs, de feltételezhető. Elektronmikroszkópos kísérletekkel ugyanis kimutatták, hogy a δ receptorok főként intracellulárisan helyezkednek el (4, 33), és a krónikus morfin expozíciónak kitett neuronokban kihelyeződnek a
64
sejtmembránra (25). A δ receptorok számának növekedését morfintoleráns állatokban már 1991-ben kimutatták (2). Így morfintoleráns állatokban a δ receptorok számának növekedése miatt nőhet a µδ komplexek képződésének a valószínűsége. Ilyen típusú interakciók a kereszttolerancia egyéb eseteit is magyarázhatják, amelyeket a korábban vegyületek eltérő efficacy értékével magyaráztak (94, 170, 271). A receptorkomplexek elmélete azonban önmagában nem képes megmagyarázni a szubkután [Dmt1]DALDA kezelés esetén létrejövő teljes kereszttoleranciát. A gerincvelői morfintolerancia hiányát szisztémásan morfintoleráns állatban meg lehet magyarázni a µδ receptorkomplexek létrejöttével, ha a korábban leírtakkal szemben éppen azt feltételezzük, hogy a morfin affinitása és specifikus aktivitása nem lényegesen kisebb a komplexek iránt, mint a µ receptor iránt. A µ-δ interakció mechanizmusában lehet szerepük a receptorkomplexek létrejöttének, de felmerül az is, hogy az interakció a receptorok szintjétől befelé jön létre, magában a sejtben. Például az is elképzelhető, hogy a δ receptorok aktiválása a nagymértékben toleráns állatokban olyan mechanizmust stimulál, amely egy ponton antagonizálja a µ receptor aktiválta másodlagos hírvivő rendszert. Ez a fajta változás önmagában nem eredményezne változást a receptorok számában, vagy ligand affinitásukban. A magyarázat egyik hibája lehet, hogy az opioid receptorok gátló jellegű second messenger rendszereket stimulálnak, így viszont nehéz antagonizmust elképzelni,
intracellulárisan
tehát
inkább
szinergista
kölcsönhatások
tűnnek
valószínűbbnek. A µ-δ kölcsönhatások megváltozásában további mechanizmusok is szerepet játszhatnak. Az egyik lehetséges magyarázat szerint a tolerancia kialakulása során megváltozhat a µ receptor vagy a δ receptor vagy mindkettő konformációja, ezáltal megváltozik kölcsönhatásuk is. Ilyen változást például a receptorok foszforilációja idézhet elő. (9) Másik lehetőség egy endogén δ opioid rendszer up-regulációja. Ez az aktiválódó δ rendszer gátolná a µ receptorok által mediált hatásokat. Ismert, hogy krónikus morfinkezelés hatására az agyi δ receptorok száma megnő (2, 4, 33). Mindenképpen többféle mechanizmusra utal azonban az, hogy a TIPPψ csak a kisfokú szubkután morfintoleranciát mutató H/ND4-es törzsben volt képes a DAMGO AD50
65
értékét a naív értékre visszaállítani, a nagyfokú szubkután morfintoleranciát mutató CR/SW törzsben a DAMGO dózis-hatás görbéjének balra tolása csak részleges volt. Hangsúlyozni kell azonban azt is, hogy fent leírt eredmények világosan szétválasztják a szisztémás toleranciát a gerincvelői szinten kialakuló toleranciától. Mindössze egyetlen törzsben találtunk toleranciát intratekális morfinhoz, és az összes törzsben kialakult a tolerancia DPDPE-hez és négyben DAMGO-hoz is, azonban nem találtunk korrelációt az agonisták egymással összehasonlított spinális toleranciájának mértéke, valamint a szubkután morfinra kialakuló között. Ezekre a különbségekre kísérleteink kellő magyarázatot nem adtak. Bizonyítékok vannak arra nézve, hogy a spinális és szupraspinális opioid receptorok szinergista kölcsönhatásba léphetnek, és erősíthetik az antinociceptív hatást, az opioid tolerancia ennek a szinergizmusnak a megváltozása lehet. (185, 189, 268) Az endogén opioid dinorfin szintén fontos szerepet játszhat ebben a kölcsönhatásban, mivel részlegesen képes visszaállítani a tolerancia kialakulása előtti állapotot a toleráns állatokban (78). Itt leírt eredményeink azonban felvetik az endogén δ opioid rendszer szerepét gerincvelői szinten. A δ receptorok µ receptorokra kifejtett hatásainak módosításával ez a rendszer része lehet a spinálisszupraspinális szinergizmusnak. 7.4 A gerincvelői opioid tolerancia kialakulásának hipotetikus modellje Kísérleteinkben igazoltuk, hogy a 3 napos morfinpellettel kezelt egerekben szubkután adott morfin antinociceptív hatásához tolerancia jön létre, amelynek mértéke függ a kísérletekben használt egerek típusától. Molekuláris biológiai módszerekkel ugyancsak igazoltuk, hogy a vizsgált hat egértörzsben egyik opioid receptor elsődleges szerkezete
sem
változott
meg,
amely
magyarázhatná
a
tolerancia
fokának
különbözőségét. Ugyanakkor megállapítottuk, hogy a pellet beültetése alig változtatta meg az intratekálisan adott morfin AD50 értékét tail-flick teszten. A szelektív µ agonista DAMGO-hoz és a szelektív δ agonista DPDPE-hez, it. adás mellett viszont kialakult a tolerancia. Azt is sikerült újra igazolnunk, hogy a DPDPE, annak ellenére, hogy kötési és bioassay kísérletekben nagy szelektivitást mutat a δ receptor iránt, egér gerincvelőben mégis µ receptoron keresztül fejti ki antinociceptív hatását. Morfintoleráns állatokban a szelektív δ antagonista TIPPψ intratekálisan adva majdnem
66
teljesen helyreállítja a szelektív µ agonista DAMGO fájdalomcsillapító hatását. Ez felveti egy endogén δ receptor mediálta rendszer szerepét a gerincvelői szinten kialakuló morfintoleranciában. Ezt a közvetlen „anti-antinociceptív” hatást nekünk sikerült legelőször kimutatni. A receptorkomplexek létrejöttének feltételezésével eredményeinket egységes hipotézissel magyarázhatjuk. A krónikus morfinkezelés során a gerincvelőben megnő a µδ komplexek száma, és ezáltal az önálló µ receptoroké csökken. Ha a szelektív µ agonista DAMGO affinitása vagy efficacy-ja a µδ komplexen lényegesen kisebb, mint az önálló µ receptoron, akkor az AD50 érték növekedését tapasztalhatjuk. Erre a mechanizmusra utalhatnak azok a kísérletek, amelyek mind a DAMGO, mind a DPDPE affinitásának csökkenését mutatták a µδ komplexhez (65). Hasonlóképpen, a DPDPE, még ha kötődik is a komplexekhez, (Gomes és mtsai. szerint nem kötődik. (71) azokon keresztül antinociceptív hatást nem fejt ki, számára a µ receptorok száma ugyanúgy lecsökken, mint a DAMGO számára. Ugyanakkor a morfin és a [Dmt1]DALDA képes lehet a µδ komplexhez kötődni és azt aktiválni. A [Dmt1]DALDA szerkezete különbözik
a
DAMGO-étól,
így
feltételezhető,
hogy
az
általa
létrehozott
receptorkonformáció sem teljesen olyan, mint a DAMGO által létrehozott. A
ligandok
kötődése
a
velük
kapcsolódott
receptorok
konformációját
megváltoztatja. Így lehetséges, hogy egy adott ligand olyan komformációváltozást okoz, amely elősegíti a µδ komplex kialakulását, más ligandok épp ellenkezőleg, a meglévő komplexeket szétkapcsolhatják. Amennyiben feltételezzük, hogy a szelektív δ antagonista TIPPψ akár közvetlenül, a µδ komplexhez kapcsolódva, akár közvetve, a szabad δ receptorok számának csökkentése révén a komplexet szétbontja, a µ receptorok ismét elérhetővé válnak az agonisták számára. Az it. adott morfinra kialakuló csekély mértékű toleranciát magyarázhatjuk úgy, hogy a morfin gyenge parciális δ agonista tulajdonsága a TIPPψ δ antagonista, komplexet szétkapcsoló képességéhez hasonló hatást eredményez, ezáltal a morfin saját maga számára szabadít fel µ receptorokat.
67
7.5 Az új eredmények összefoglalása 1. A hat különböző Swiss egértörzsben 3 napos morfinpellet beültetés hatására kialakuló, eltérő mértékű morfintolerancia nem függ az opioid receptorok polimorfizmusától. 2. Morfinpelletált egérben a szubkután illetve az intratekálisan adott morfinhoz kialakuló tolerancia mértékei között nem találtunk összefüggést. 3. A morfinpellet beültetés hatására it. morfinhoz a hat vizsgált egértörzs közül csak egyben alakult ki szignifikáns tolerancia. 4. Morfintoleráns állatban jelentős tolerancia alakult ki a szelektív µ agonista DAMGO-hoz és a szelektív δ agonista DPDPE-hez. 5. A µ szelektív opioid agonista peptid [Dmt1]DALDA mind szubkután, mind it. adva hatékonyabbnak bizonyult a morfinnál és a szelektív µ agonista DAMGO-nál. 6. Szubkután adagolásnál a [Dmt1]DALDA hatástartama szignifikánsan hosszabb, mint morfiné. 7. Morfintoleráns állatokban sem a szubkután, sem az it. adott [Dmt1]DALDAhoz nem alakult ki tolerancia. 8. A δ szelektív antagonista TIPPψ it. adva morfintoleráns egérben potencírozta az it. adott DAMGO antinociceptív hatását, gyakorlatilag visszaállítva az it. DAMGO naív állatban mért hatékonyságát. Az eredmény valószínűsíti a δ receptor alapvető szerepét az egérben gerincvelői szinten kialakuló opioid toleranciában. 9. It. adagolásnál a szelektív δ agonista DPDPE-nek a DAMGO antinociceptív hatására kifejtett potencírozását a δ szelektív antagonista TIPPψ megszüntette. Ezzel igazoltuk, hogy a µ receptor mediálta fájdalomcsillapító hatást a gerincvelőben, naív állatban δ receptoron mediált hatással lehet potencírozni. 7.6 Zárszó Reményeink szerint jelen munkánkkal hozzájárultunk az opioid tolerancia mechanizmusok jobb megértéséhez, az opioid receptorok szerepének tisztázásához, mely elősegítheti új, hatékonyabb, és kedvezőbb mellékhatásprofillal rendelkező opioid hatású gyógyszerek kifejlesztését.
68
8. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönet illeti mindenek előtt szüleimet, akik mindig feltétlen szeretettel támogattak, és az egyetem befejezésekor elfogadták, hogy a gyógyítás helyett a kutatásra adtam a fejem. A kísérletes munka ízét Kalapos Miklós Péter kóstoltatta meg velem először, akinek iránytásával tudományos diákkörösként a SOTE I. számú Kémiai-Biokémiai Intézetében, Mandl József laboratóriumában dolgoztam. A SOTE Gyógyszertani Intézetébe 1991-ben, közvetlenül az egyetem elvégzése után kerültem. Az itt eltöltött, immár 13 év alatt nem juthattam volna el idáig Friedmann Tamás segítsége nélkül, aki a kezdetektől szeretettel, megértéssel és -úgy érzem- barátsággal tanított a farmakológiai gondolkodásmódra, aki tudományos munkámban sőt, sokszor a magánéletben is megszívlelendő tanácsokkal látott el. Ugyancsak köszönet illeti Rónai Andrást, akitől kísérleti metodikákat és farmakológiai gondolkodásmódot tanulhattam. Nem lehetek eléggé hálás Fürst Zsuzsanna professzornak, akinek irányításával az Opioid Munkacsoport kutatásaiba bekapcsolódtam. Az ő segítsége révén dolgozhattam két évig San Franciscoban, Nancy M. Lee munkacsoportjában. Kettejüknek köszönhetően sikerült mindazokat az eredményeket elérnem, amelyek lehetővé tették Ph.D. értekezésem elkészítését. San Francisco-i kollégáim közül köszönettel tartozom He Li-nek, aki megtanította az intratekális injekciózást, és Tracy M. Gant-nek, akinek döntő szerepe volt a molekuláris biológiai kísérletek elvégzésében. A dolgozat megírásában és jobbá tételében nyújtott segítségükért köszönetemet fejezem ki Fürst Zsuzsanna professzornak, Friedmann Tamásnak, Kecskeméti Valéria professzornak és Köles László kollégámnak és barátomnak, akik észrevételeikkel és értékes javaslataikkal nagyban hozzájárultak munkám sikeréhez. Minden, név szerint nem említett kollégámnak és barátomnak hálás vagyok segítségéért, amellyel hozzájárultak dolgozatom elkészítéséhez. Utoljára, ám nem utolsósorban fejezem ki köszönetemet feleségemnek, Melindának, aki nagyon nagy türelemmel és szeretettel viselte a dolgozat megírásának időszakát, segítette munkámat és biztosította a nyugodt légkört. Külön köszönöm gyermekeim, Enikő és Miklós türelmét, akiknek sokszor kellett nélkülözniük a játékot az apukájukkal.
69
9. IRODALOMJEGYZÉK 1
Abdelhamid EE, Sultana M, Portoghese PS, Takemori AE. Selective blockage of delta opioid receptors prevents the development of morphine tolerance and dependence in mice. J Pharmacol Exp Ther. 1991 Jul 1;258(1):299-303.
2
Abdelhamid EE, Takemori AE. Characteristics of mu and delta opioid binding sites in striatal slices of morphinetolerant and -dependent mice. Eur J Pharmacol. 1991 Jun 6;198(2-3):157-63.
3
Arunlakshana O, Schild HO. Some quantitative uses of drug antagonists. Br J Pharmacol. 1959 Mar;14(1):48-58.
4
Arvidsson U, Dado RJ, Riedl M, Lee JH, Law PY, Loh HH, Elde R, Wessendorf MW. delta-Opioid receptor immunoreactivity: distribution in brainstem and spinal cord, and relationship to biogenic amines and enkephalin. J Neurosci. 1995 Feb;15(2):1215-35.
5
Audigier Y, Mazarguil H, Gout R, Cros J. Structure-activity relationships of enkephalin analogs at opiate and enkephalin receptors: correlation with analgesia. Eur J Pharmacol. 1980 Apr 11; 63(1): 35-46.
6
Baraban SC, Lothman EW, Lee A, Guyenet PG. Kappa opioid receptor-mediated suppression of voltage-activated potassium current in a catecholaminergic neuronal cell line. J Pharmacol Exp Ther. 1995 May;273(2):927-33.
70
7
Barg J, Levy R, Simantov R. Up-regulation of opiate receptors by opiate antagonists in neuroblastoma-glioma cell culture: the possibility of interaction with guanosine triphosphate-binding proteins. Neurosci Lett. 1984 Sep 7;50(1-3):133-137.
8
Befort K, Zilliox C, Filliol D, Yue S, Kieffer BL. Constitutive activation of the delta opioid receptor by mutations in transmembrane domains III and VII. J Biol Chem. 1999 Jun 25;274(26):18574-81. Erratum in: J Biol Chem 1999 Sep 24;274(39):28058.
9
Bernstein MA, Welch SP. mu-Opioid receptor down-regulation and cAMP-dependent protein kinase phosphorylation in a mouse model of chronic morphine tolerance. Brain Res Mol Brain Res. 1998 Apr;55(2):237-42.
10 Besse D, Lombard MC, Besson JM. Up-regulation of [3H]DAMGO and [3H]DTLET opioid binding sites in laminae III of the spinal cord in intact and deafferented morphine-tolerant rats. Neurosci Lett. 1992 Mar 2;136(2):209-12. 11 Bilsky EJ, Bernstein RN, Hruby VJ, Rothman RB, Lai J, Porreca F. Characterization of antinociception to opioid receptor selective agonists after antisense oligodeoxynucleotide-mediated "knock-down" of opioid receptor in vivo. J Pharmacol Exp Ther. 1996 Apr;277(1):491-501.
71
12 Bilsky EJ, Bernstein RN, Pasternak GW, Hruby VJ, Patel D, Porreca F, Lai J. Selective inhibition of [D-Ala2, Glu4]deltorphin antinociception by supraspinal, but not spinal, administration of an antisense oligodeoxynucleotide to an opioid delta receptor. Life Sci. 1994;55(2):PL37-43. 13 Bilsky EJ, Calderon SN, Wang T, Bernstein RN, Davis P, Hruby VJ, McNutt RW, Rothman RB, Rice KC, Porreca F. SNC 80, a selective, nonpeptidic and systemically active opioid delta agonist. J Pharmacol Exp Ther. 1995 Apr;273(1):359-66. 14 Bilsky EJ, Inturrisi CE, Sadee W, Hruby VJ, Porreca F. Competitive and non-competitive NMDA antagonists block the development of antinociceptive tolerance to morphine, but not to selective mu or delta opioid agonists in mice. Pain. 1996 Dec;68(2-3):229-37. 15 Birdsall NJ, Bradbury AF, Burgen AS, Hulme EC, Smyth DG, Snell CR. Interactions of peptides derived from the C-fragment of beta-lipotropin with brain opiate receptors [proceedings]. Br J Pharmacol. 1976 Nov;58(3):460P-461P. 16 Blumberg H, Dayton HB. Naloxone, naltrexone, and related noroxymorphones. Adv Biochem Psychopharmacol. 1973;8(0):33-43. 17 Bodnar RJ. Supraspinal circuitry mediating opioid antinociception: antagonist and synergy studies in multiple sites. J Biomed Sci. 2000 May-Jun; 7(3): 181-94.
72
18 Bohm SK, Grady EF, Bunnett NW. Regulatory mechanisms that modulate signalling by G-protein-coupled receptors. Biochem J. 1997 Feb 15;322 ( Pt 1):1-18. 19 Bond C, LaForge KS, Tian M, Melia D, Zhang S, Borg L, Gong J, Schluger J, Strong JA, Leal SM, Tischfield JA, Kreek MJ, Yu L. Single-nucleotide polymorphism in the human mu opioid receptor gene alters betaendorphin binding and activity: possible implications for opiate addiction. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998 Aug 4;95(16):9608-13. 20 Bot G, Blake AD, Li S, Reisine T. Mutagenesis of a single amino acid in the rat mu-opioid receptor discriminates ligand binding. J Neurochem. 1998 Jan;70(1):358-65. 21 Bot G, Blake AD, Li S, Reisine T. Mutagenesis of the mouse delta opioid receptor converts (-)-buprenorphine from a partial agonist to an antagonist. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Jan;284(1):283-90. 22 Bot G, Blake AD, Li S, Reisine T. Opioid regulation of the mouse delta-opioid receptor expressed in human embryonic kidney 293 cells. Mol Pharmacol. 1997 Aug;52(2):272-81. 23 Bowen WD, Kelemen M, Huey R, Stewart D. Characterization of D-Ala2,Leu5,Cys6-enkephalin: a novel synthetic opioid peptide with slowed dissociation from delta receptors. NIDA Res Monogr. 1986;75:193-6.
73
24 Broccardo M, Erspamer V, Falconieri Erspamer G, Improta G, Linari G, Melchiorri P, Montecucchi PC. Pharmacological data on dermorphins, a new class of potent opioid peptides from amphibian skin. Br J Pharmacol. 1981 Jul;73(3):625-31. 25 Cahill CM, Morinville A, Lee MC, Vincent JP, Collier B, Beaudet A. Prolonged morphine treatment targets delta opioid receptors to neuronal plasma membranes and enhances delta-mediated antinociception. J Neurosci. 2001 Oct 1;21(19):7598-607. 26 Castanas E, Giraud P, Bourhim N, Cantau P, Oliver C. Kappa 3: a novel subtype of the kappa opioid site in bovine adrenal medulla, highly selective for Met-enkephalin-Arg6-Phe7. Neuropeptides. 1984 Dec; 5(1-3): 133-6. 27 Cha XY, Xu H, Ni Q, Partilla JS, Rice KC, Matecka D, Calderon SN, Porreca F, Lai J, Rothman RB. Opioid peptide receptor studies. 4. Antisense oligodeoxynucleotide to the delta opioid receptor delineates opioid receptor subtypes. Regul Pept. 1995 Oct 20;59(2):247-53. 28 Cha XY, Xu H, Rice KC, Porreca F, Lai J, Ananthan S, Rothman RB. Opioid peptide receptor studies. 1. Identification of a novel delta-opioid receptor binding site in rat brain membranes. Peptides. 1995; 16(2): 191-8. 29 Chakrabarti S, Oppermann M, Gintzler AR. Chronic morphine induces the concomitant phosphorylation and altered association of multiple signaling proteins: a novel mechanism for modulating cell signaling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2001 Mar 27;98(7):4209-14.
74
30 Chakrabarti S, Sultana M, Portoghese PS, Takemori AE. Differential antagonism by naltrindole-5'-isothiocyanate on [3H]DSLET and [3H]DPDPE binding to striatal slices of mice. Life Sci. 1993; 53(23): 1761-5. 31 Chen Y, Mestek A, Liu J, Hurley JA, Yu L. Molecular cloning and functional expression of a mu-opioid receptor from rat brain. Mol Pharmacol. 1993 Jul;44(1):8-12. 32 Cheney BV, Lahti RA, Barsuhn C, Gay DD. An analysis of binding at the opioid receptor based upon an agonist/antagonist twostate model. Mol Pharmacol. 1982 Sep;22(2):349-59. 33 Cheng PY, Svingos AL, Wang H, Clarke CL, Jenab S, Beczkowska IW, Inturrisi CE, Pickel VM. Ultrastructural immunolabeling shows prominent presynaptic vesicular localization of delta-opioid receptor within both enkephalin- and nonenkephalin-containing axon terminals in the superficial layers of the rat cervical spinal cord. J Neurosci. 1995 Sep;15(9):5976-88. 34 Childers SR, Nijssen P, Nadeau P, Buckhanna P, Le PV, Harris J. Opiate-inhibited adenylate cyclase in mammalian brain membranes. NIDA Res Monogr. 1986;71:65-80. No abstract available 35 Cicero TJ, Meyer ER. Morphine pellet implantation in rats: quantitative assessment of tolerance and dependence. J Pharmacol Exp Ther. 1973 Feb;184(2):404-8.
75
36 Clark JA, Houghten R, Pasternak GW. Opiate binding in calf thalamic membranes: a selective mu 1 binding assay. Mol Pharmacol. 1988 Sep;34(3):308-17. 37 Clark JA, Itzhak Y, Hruby VJ, Yamamura HI, Pasternak GW. [D-Pen2,D-Pen5]enkephalin (DPDPE): a delta-selective enkephalin with low affinity for mu 1 opiate binding sites. Eur J Pharmacol. 1986 Sep 9; 128(3): 303-4. 38 Clark JA, Liu L, Price M, Hersh B, Edelson M, Pasternak GW. Kappa opiate receptor multiplicity: evidence for two U50,488-sensitive kappa 1 subtypes and a novel kappa 3 subtype. J Pharmacol Exp Ther. 1989 Nov; 251(2): 461-8. 39 Clark WG, Bernardini GL. Morphine-induced hyperthermia: lack of cross-tolerance with enkephalin analogs. Brain Res. 1982 Jan 7;231(1):231-4. 40 Connelly CD, Martinez RP, Schupsky JJ, Porreca F, Raffa RB. Etonitazene-induced antinociception in mu1 opioid receptor deficient CXBK mice: evidence for a role for mu2 receptors in supraspinal antinociception. Life Sci. 1994;54(21):PL369-74. 41 Connor M, Christie MD. Opioid receptor signalling mechanisms. Clin Exp Pharmacol Physiol. 1999 Jul;26(7):493-9. 42 Cotton R, Giles MG, Miller L, Shaw JS, Timms D. ICI 174864: a highly selective antagonist for the opioid delta-receptor. Eur J Pharmacol. 1984 Jan 27;97(3-4):331-2.
76
43 Cowan A, Gmerek DE. In vivo studies with ICI 154,129, a putative delta receptor antagonist. Life Sci. 1982 Nov 15-22;31(20-21):2213-6. 44 Cox BM, Gentleman S, Su TP, Goldstein A. Further characterization of morphine-like peptides (endorphins) from pituitary. Brain Res. 1976 Oct 15;115(2):285-96. 45 Cox BM, Goldstein A, Hi CH. Opioid activity of a peptide, beta-lipotropin-(61-91), derived from beta-lipotropin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1976 Jun;73(6):1821-3. 46 Creese I, Snyder SH. Receptor binding and pharmacological activity of opiates in the guinea-pig intestine. J Pharmacol Exp Ther. 1975 Jul; 194(1): 205-19. 47 Cruciani RA, Dvorkin B, Klinger HP, Makman MH. Presence in neuroblastoma cells of a mu 3 receptor with selectivity for opiate alkaloids but without affinity for opioid peptides. Brain Res. 1994 Dec 26;667(2):229-37. 48 Cvejic S, Devi LA. Dimerization of the delta opioid receptor: implication for a role in receptor internalization. J Biol Chem. 1997 Oct 24; 272(43): 26959-64. 49 David M, Moisand C, Meunier JC, Morgat JL, Gacel G, Roques BP. [3H]Tyr-D-Ser-Gly-Phe-Leu-Thr: a specific probe for the delta-opiate receptor subtype in brain membranes. Eur J Pharmacol. 1982 Mar 12;78(3):385-7.
77
50 Davis ME, Akera T, Brody TM, Watson L. Opiate receptor: cooperativity of binding observed in brain slices. Proc Natl Acad Sci U S A. 1977 Dec; 74(12): 5764-6. 51 Devi LA. G-protein-coupled receptor dimers in the lime light. Trends Pharmacol Sci. 2000 Sep; 21(9): 324-6. 52 Dobrenis K, Makman MH, Stefano GB. Occurrence of the opiate alkaloid-selective mu3 receptor in mammalian microglia, astrocytes and Kupffer cells. Brain Res. 1995 Jul 24; 686(2): 239-48. 53 Duman RS, Tallman JF, Nestler EJ. Acute and chronic opiate-regulation of adenylate cyclase in brain: specific effects in locus coeruleus. J Pharmacol Exp Ther. 1988 Sep;246(3):1033-9. 54 Duttaroy A, Yoburn BC. The effect of intrinsic efficacy on opioid tolerance. Anesthesiology. 1995 May;82(5):1226-36. 55 Erspamer V, Melchiorri P, Falconieri-Erspamer G, Negri L, Corsi R, Severini C, Barra D, Simmaco M, Kreil G. Deltorphins: a family of naturally occurring peptides with high affinity and selectivity for delta opioid binding sites. Proc Natl Acad Sci U S A. 1989 Jul;86(13):5188-92. 56 Evans CJ, Keith DE Jr, Morrison H, Magendzo K, Edwards RH. Cloning of a delta opioid receptor by functional expression. Science. 1992 Dec 18;258(5090):1952-5.
78
57 Fabian G, Bozo B, Szikszay M, Horvath G, Coscia CJ, Szucs M. Chronic morphine-induced changes in mu-opioid receptors and G proteins of different subcellular loci in rat brain. J Pharmacol Exp Ther. 2002 Aug;302(2):774-80. 58 Fernandes M, Kluwe S, Coper H. Quantitative assessment of tolerance to and dependence on morphine in mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 1977 Mar 14;297(1):53-60. PMID: 558528 [PubMed - indexed for MEDLINE] 59 Franke P, Nothen MM, Wang T, Neidt H, Knapp M, Lichtermann D, Weiffenbach O, Mayer P, Hollt V, Propping P, Maier W. Human delta-opioid receptor gene and susceptibility to heroin and alcohol dependence. Am J Med Genet. 1999 Oct 15;88(5):462-4. 60 Fraser GL, Pradhan AA, Clarke PBS and Wahlestedt. Supraspinal antinociceptive response to [D-Pen2,5]-enkephalin (DPDPE) is pharmacologically distinct from that to other δ agonists in the rat. J Pharmacol Exp Ther. 295(3):11351141 61 Frederickson RC, Smithwick EL, Shuman R, Bemis KG. Metkephamid, a systemically active analog of methionine enkephalin with potent opioid alpha-receptor activity. Science. 1981 Feb 6; 211(4482): 603-5. 62 Fundytus ME, Schiller PW, Shapiro M, Weltrowska G, Coderre TJ. Attenuation of morphine tolerance and dependence with the highly selective deltaopioid receptor antagonist TIPP[psi] Eur J Pharmacol. 1995 Nov 3;286(1):105-8.
79
63 Fürst S, Búzás B, Friedmann T, Schmidhammer H and Borsodi A: Highly potent novel opioid receptor agonist in the 14-alkoxymetopon series. Eur J Pharmacol. 1993 236:209-215. 64 Gelernter J, Kranzler H, Cubells J. Genetics of two mu opioid receptor gene (OPRM1) exon I polymorphisms: population studies, and allele frequencies in alcohol- and drug-dependent subjects. Mol Psychiatry. 1999 Sep;4(5):476-83. 65 George SR, Fan T, Xie Z, Tse R, Tam V, Varghese G, O'Dowd BF. Oligomerization of mu- and delta-opioid receptors. Generation of novel functional properties. J Biol Chem. 2000 Aug 25;275(34):26128-35. 66 Gibson RD, Tingstad JE. Formulation of a morphine implantation pellet suitable for tolerance-physical dependence studies in mice. J Pharm Sci. 1970 Mar;59(3):426-7. 67 Gilbert PE, Martin WR. The effects of morphine and nalorphine-like drugs in the nondependent, morphinedependent and cyclazocine-dependent chronic spinal dog. J Pharmacol Exp Ther. 1976 Jul;198(1):66-82. 68 Gintzler AR, Chakrabarti S. Opioid tolerance and the emergence of new opioid receptor-coupled signaling. Mol Neurobiol. 2000 Feb-Apr;21(1-2):21-33. 69 Goldstein A, Tachibana S, Lowney LI, Hunkapiller M, Hood L. Dynorphin-(1-13), an extraordinarily potent opioid peptide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1979 Dec;76(12):6666-70.
80
70 Goldstein A. Opioid peptides endorphins in pituitary and brain. Science. 1976 Sep 17;193(4258):1081-6. 71 Gomes I, Jordan BA, Gupta A, Trapaidze N, Nagy V, Devi LA. Heterodimerization of mu and delta opioid receptors: A role in opiate synergy. J Neurosci. 2000 Nov 15; 20(22): RC110. 72 Hahn EF, Carroll-Buatti M, Pasternak GW. Irreversible opiate agonists and antagonists: the 14-hydroxydihydromorphinone azines. J Neurosci. 1982 May; 2(5): 572-6. 73 Haley TJ and McCormick WG: Pharmacological effects produced by intracerebroventricular injections of drugs in conscious mice. Br J Pharmacol 1957; 12:12-16 74 Hammond DL, Wang H, Nakashima N, Basbaum AI. Differential effects of intrathecally administered delta and mu opioid receptor agonists on formalin-evoked nociception and on the expression of Fos-like immunoreactivity in the spinal cord of the rat. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Jan;284(1):378-87. 75 Hazum E, Chang KJ, Cuatrecasas P, Pasternak GW. Naloxazone irreversibly inhibits the high affinity binding of [125I]D-ala2-D-leu5enkephalin. Life Sci. 1981 Jun 29; 28(26): 2973-9.
81
76 He L, Fong J, von Zastrow M, Whistler JL. Regulation of opioid receptor trafficking and morphine tolerance by receptor oligomerization. Cell. 2002 Jan 25; 108(2): 271-82. 77 He L, Lee NM. Delta opioid receptor enhancement of mu opioid receptor-induced antinociception in spinal cord. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Jun;285(3):1181-6. 78 He L, Lee NM. DynorphinA-(2-17) restores spinal/supraspinal morphine synergy in morphinetolerant mice. J Pharmacol Exp Ther. 1997 Mar;280(3):1210-4. 79 Hepburn MJ, Little PJ, Gingras J, Kuhn CM. Differential effects of naltrindole on morphine-induced tolerance and physical dependence in rats. J Pharmacol Exp Ther. 1997 Jun;281(3):1350-6. 80 Heyman JS, Jiang Q, Rothman RB, Mosberg HI, Porreca F. Modulation of mu-mediated antinociception by delta agonists: characterization with antagonists. Eur J Pharmacol. 1989 Oct 4; 169(1): 43-52. 81 Heyman JS, Vaught JL, Mosberg HI, Haaseth RC, Porreca F. Modulation of mu-mediated antinociception by delta agonists in the mouse: selective potentiation of morphine and normorphine by [D-Pen2,DPen5]enkephalin. Eur J Pharmacol. 1989 Jun 8; 165(1): 1-10.
82
82 Hiller JM, Simon EJ. 3H-ethylketocyclazocine binding: lack of evidence for a separate kappa receptor in rats CNS. Eur J Pharmacol. 1979 Dec 20;60(4):389-90. 83 Hitzemann RJ, Loh HH. On the use of tryptic digestion to localize narcotic binding material. Life Sci. 1975 Jun 15;16(12):1809-10. 84 Hoehe and Wendel, 1998 European patent #W09833937 85 Holaday JW, Hitzemann RJ, Curell J, Tortella FC, Belenky GL. Repeated electroconvulsive shock or chronic morphine treatment increases the number of 3H-D-Ala2,D-Leu5-enkephalin binding sites in rat brain membranes. Life Sci. 1982 Nov 15-22;31(20-21):2359-62. 86 Hollt V, Dum J, Blasig J, Schubert P, Herz A. Comparison of in vivo and in vitro parameters of opiate receptor binding in naive and tolerant dependent rodents. Life Sci. 1975 Jun 15;16(12):1823-8. 87 Hosohata Y, Vanderah TW, Burkey TH, Ossipov MH, Kovelowski CJ, Sora I, Uhl GR, Zhang X, Rice KC, Roeske WR, Hruby VJ, Yamamura HI, Lai J, Porreca F. delta-Opioid receptor agonists produce antinociception and [35S]GTPgammaS binding in mu receptor knockout mice. Eur J Pharmacol. 2000 Feb 4;388(3):241-8. 88 Hughes J, Smith TW, Kosterlitz HW, Fothergill LA, Morgan BA, Morris HR. Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity. Nature. 1975 Dec 18;258(5536):577-80.
83
89 Hughes J. Isolation of an endogenous compound from the brain with pharmacological properties similar to morphine. Brain Res. 1975 May 2;88(2):295-308. 90 Huidobro-Toro JP, Way EL. Single-dose tolerance to antinociception, and physical dependence on betaendorphin in mice. Eur J Pharmacol. 1978 Nov 15;52(2):179-89. 91 Hurley RW, Grabow TS, Tallarida RJ, Hammond DL. Interaction between medullary and spinal delta1 and delta2 opioid receptors in the production of antinociception in the rat. J Pharmacol Exp Ther. 1999 May;289(2):993-9. 92 Hylden JL, Wilcox GL. Intrathecal morphine in mice: a new technique. Eur J Pharmacol. 1980 Oct 17; 67(2-3): 313-6. 93 Illes P, Zieglgansberger W, Herz A. Lack of cross-tolerance between morphine and Leu-enkephalin in the mouse vas deferens. Brain Res. 1980 Sep 15;197(1):260-3. 94 Ivarsson M, Neil A. Differences in efficacies between morphine and methadone demonstrated in the guinea pig ileum: a possible explanation for previous observations on incomplete opioid cross-tolerance. Pharmacol Toxicol. 1989 Nov;65(5):368-71.
84
95 Jiang, Q., Takemori, A.E., Sultana, M., Porthogese, P.S., Bowen, W.D., Mosberg, H.I and Porreca, F.: Differential antagonism of opioid δ antinociception by [D-Ala2,Leu5, Cys6]enkephalin (DALCE) and naltrindole-5'-isothiocyanate (5'-NTII): evidence for δ receptor subtypes. J. Pharmacol. Exp. Ther.: 257:1069-1075, 1991. 96 Jin W, Lee NM, Loh HH, Thayer SA. Opioids mobilize calcium from inositol 1,4,5-trisphosphate-sensitive stores in NG108-15 cells. J Neurosci. 1994 Apr;14(4):1920-9. 97 Jordan BA, Devi LA. G-protein-coupled receptor heterodimerization modulates receptor function. Nature. 1999 Jun 17; 399(6737): 697-700. 98 Kakidani H, Furutani Y, Takahashi H, Noda M, Morimoto Y, Hirose T, Asai M, Inayama S, Nakanishi S, Numa S. Cloning and sequence analysis of cDNA for porcine beta-neo-endorphin/dynorphin precursor. Nature. 1982 Jul 15;298(5871):245-9. 99 Kamikubo K, Murase H, Niwa M, Miura K, Nozaki M, Tsurumi K. Adrenal medullary opioid receptors are linked to GTP-binding proteins, pertussis toxin substrates. NIDA Res Monogr. 1986;75:129-32. 100 Kest B, Beczkowska I, Franklin SO, Lee CE, Mogil JS, Inturrisi CE. Differences in delta opioid receptor antinociception, binding, and mRNA levels between BALB/c and CXBK mice. Brain Res. 1998 Sep 14;805(1-2):131-7.
85
101 Kest B, Lee CE, McLemore GL, Inturrisi CE. An antisense oligodeoxynucleotide to the delta opioid receptor (DOR-1) inhibits morphine tolerance and acute dependence in mice. Brain Res Bull. 1996;39(3):185-8. 102 Kieffer BL, Befort K, Gaveriaux-Ruff C, Hirth CG. The delta-opioid receptor: isolation of a cDNA by expression cloning and pharmacological characterization. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Dec 15;89(24):12048-52. Erratum in: Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Feb 1;91(3):1193. 103 Klee WA, Nirenberg M. A neuroblastoma times glioma hybrid cell line with morphine receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1974 Sep; 71(9): 3474-7. 104 Klee WA, Nirenberg M. Mode of action of endogenous opiate peptides. Nature. 1976 Oct 14;263(5578):609-12. 105 Koch T, Schulz S, Pfeiffer M, Klutzny M, Schroder H, Kahl E, Hollt V. C-terminal splice variants of the mouse mu-opioid receptor differ in morphineinduced internalization and receptor resensitization. J Biol Chem. 2001 Aug 17;276(33):31408-14. 106 Koch T, Schulz S, Schroder H, Wolf R, Raulf E, Hollt V. Carboxyl-terminal splicing of the rat mu opioid receptor modulates agonistmediated internalization and receptor resensitization. J Biol Chem. 1998 May 29; 273(22): 13652-7.
86
107 Kosterlitz HW, Waterfield AA. In vitro models in the study of structure-activity relationships of narcotic analgesics. Annu Rev Pharmacol. 1975; 15: 29-47. 108 Kosterlitz, H.W. and Paterson, S.J.: Tyr-D-Ala-Gly-MePhe-NH(CH2)2-OH is a selective ligand for the µ-opiate binding site. Proc. B.P.S., 299P, 1980. 109 Kovelowski CJ, Bian D, Hruby VJ, Lai J, Ossipov MH, Porreca F. Selective opioid delta agonists elicit antinociceptive supraspinal/spinal synergy in the rat. Brain Res. 1999 Oct 2;843(1-2):12-7. 110 Koyuncuoglu H, Nurten A, Yamanturk P, Nurten R. The importance of the number of NMDA receptors in the development of supersensitivity or tolerance to and dependence on morphine. Pharmacol Res. 1999 Apr;39(4):311-9. 111 Kranzler HR, Gelernter J, O'Malley S, Hernandez-Avila CA, Kaufman D. Association of alcohol or other drug dependence with alleles of the mu opioid receptor gene (OPRM1). Alcohol Clin Exp Res. 1998 Sep;22(6):1359-62. 112 Kreil, G., Barna, D., Simmaco, M., Erspamer, V., Falconierei-Erspamer, G., Negri, L., Severini, C., Corsi, R. and Melchiorri, P.: Deltorphin, a novel amphibian skin peptide with high selectivity and affinity for δ opioid receptors. Eur. J. Pharmacol.: 162:123128, 1989.
87
113 Lahti RA, Mickelson MM, McCall JM, Von Voigtlander PF. [3H]U-69593 a highly selective ligand for the opioid kappa receptor. Eur J Pharmacol. 1985 Feb 26;109(2):281-4. 114 Lai J, Bilsky EJ, Porreca F. Treatment with antisense oligodeoxynucleotide to a conserved sequence of opioid receptors inhibits antinociceptive effects of delta subtype selective ligands. J Recept Signal Transduct Res. 1995 Jan-Mar; 15(1-4): 643-50. 115 Lai, J, Bilsky, EJ, Bernstein, RN, Rothman, RB, Pasternak, GW and Porreca, F: Antisense oligonucleotide to the cloned delta opioid receptor selectively inhibits supraspinal, but not spinal, antinociceptive effects of [D-Ala2, Glu4]deltorphin. Regul. Pept., 54:159-160, 1994. 116 Lai, J., Bilsky, E.J., Rothman, R.B. and Porreca, F: Treatment with antisense oligonucletide to the opioid δ receptor selectively inhibits δ2 antinociception. NeuroReport, 5:1049-1052, 1994. 117 Larson AA, Vaught JL, Takemori AE. The potentiation of spinal analgesia by leucine enkephalin. Eur J Pharmacol. 1980 Feb; 61(4): 381-3. 118 Lasagna L and Beecher HK: The analgesic effectiveness of nalorphine and nalorphine-morphine combinations in man. JPET 1954 112:356-363
88
119 Law PY, Hom DS, and Loh HH Opiate receptor down-regulation and desensitization in neuroblastoma X glioma NG108-15 hybrid cells are two separate cellular adaptation processes Mol Pharmacol 1983 24: 413-424 120 Law PY, McGinn TM, Wick MJ, Erikson LJ, Evans C, Loh HH. Analysis of delta-opioid receptor activities stably expressed in CHO cell lines: function of receptor density? J Pharmacol Exp Ther. 1994 Dec;271(3):1686-94. 121 Law PY, Wong YH, Loh HH. Molecular mechanisms and regulation of opioid receptor signaling. Annu Rev Pharmacol Toxicol. 2000;40:389-430. 122 Lee NM, Leybin L, Chang JK, Loh HH. Opiate and peptide interaction: effect of enkephalins on morphine analgesia. Eur J Pharmacol. 1980 Nov 21; 68(2): 181-5. 123 Ling GS, Simantov R, Clark JA, Pasternak GW. Naloxonazine actions in vivo. Eur J Pharmacol. 1986 Sep 23; 129(1-2): 33-8. 124 Litchfield JT Jr. and Wilcoxon F: A simplified method of evaluating dose-effect experiments. J Pharmacol Exp Ther. 1948; 96:99-113. 125 Loh HH, Tao PL, Smith AP. Role of receptor regulation in opioid tolerance mechanisms. Synapse. 1988;2(4):457-62.
89
126 Lord JA, Waterfield AA, Hughes J, Kosterlitz HW. Endogenous opioid peptides: multiple agonists and receptors. Nature. 1977 Jun 9;267(5611):495-9. 127 Ma GH, Miller RJ, Kuznetsov A, Philipson LH. kappa-Opioid receptor activates an inwardly rectifying K+ channel by a G proteinlinked mechanism: coexpression in Xenopus oocytes. Mol Pharmacol. 1995 May;47(5):1035-40. 128 Makman MH. Morphine receptors in immunocytes and neurons. Adv Neuroimmunol. 1994; 4(2): 69-82. 129 Malmberg AB, Yaksh TL. Isobolographic and dose-response analyses of the interaction between intrathecal mu and delta agonists: effects of naltrindole and its benzofuran analog (NTB). J Pharmacol Exp Ther. 1992 Oct; 263(1): 264-75. 130 Martin WR, Eades CG, Thompson JA, Huppler RE, Gilbert PE. Csak az absztrakt van meg The effects of morphine- and nalorphine- like drugs in the nondependent and morphine-dependent chronic spinal dog. J Pharmacol Exp Ther. 1976 Jun;197(3):517-32. 131 Martin WR, Jasinski DR, Mansky PA. Naltrexone, an antagonist for the treatment of heroin dependence. Effects in man. Arch Gen Psychiatry. 1973 Jun;28(6):784-91.
90
132 Matthes HW, Maldonado R, Simonin F, Valverde O, Slowe S, Kitchen I, Befort K, Dierich A, Le Meur M, Dolle P, Tzavara E, Hanoune J, Roques BP, Kieffer BL. Loss of morphine-induced analgesia, reward effect and withdrawal symptoms in mice lacking the mu-opioid-receptor gene. Nature. 1996 Oct 31;383(6603):819-23. 133 Matthes HW, Smadja C, Valverde O, Vonesch JL, Foutz AS, Boudinot E, DenavitSaubie M, Severini C, Negri L, Roques BP, Maldonado R, Kieffer BL. Activity of the delta-opioid receptor is partially reduced, whereas activity of the kappa-receptor is maintained in mice lacking the mu-receptor. J Neurosci. 1998 Sep 15;18(18):7285-95. 134 Mattia A, Farmer SC, Takemori AE, Sultana M, Portoghese PS, Mosberg HI, Bowen WD, Porreca F. Spinal opioid delta antinociception in the mouse: mediation by a 5'-NTII-sensitive delta receptor subtype. J Pharmacol Exp Ther. 1992 Feb;260(2):518-25. 135 Mattia A, Vanderah T, Mosberg HI, Porreca F. Lack of antinociceptive cross-tolerance between [D-Pen2, D-Pen5]enkephalin and [D-Ala2]deltorphin II in mice: evidence for delta receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 1991 Aug;258(2):583-7. 136 Mayer P, Rochlitz H, Rauch E, Rommelspacher H, Hasse HE, Schmidt S, Hollt V. Association between a delta opioid receptor gene polymorphism and heroin dependence in man. Neuroreport. 1997 Jul 28;8(11):2547-50.
91
137 McClane TK, Martin WR. Antagonism of the spinal cord effects of morphine and cyclazocine by naloxone and thebaine. Int J Neuropharmacol. 1967 Jul;6(4):325-7. 138 McGilliard KL, Takemori AE. Antagonism by naloxone of narcotic-induced respiratory depression and analgesia. J Pharmacol Exp Ther. 1978 Nov;207(2):494-503. 139 McVey M, Ramsay D, Kellett E, Rees S, Wilson S, Pope AJ, Milligan G. Monitoring receptor oligomerization using time-resolved fluorescence resonance energy transfer and bioluminescence resonance energy transfer. The human delta opioid receptor displays constitutive oligomerization at the cell surface, which is not regulated by receptor occupancy. J Biol Chem. 2001 Apr 27; 276(17): 14092-9. Epub 2001 Jan 22. 140 Milligan G, Simonds WF, Streaty RA, Tocque B, Klee WA. Functional control of the delta-opiate receptor by the inhibitory guanine nucleotidebinding protein. Biochem Soc Trans. 1985 Dec;13(6):1110-3. No abstract available. 141 Miyamae T, Fukushima N, Misu Y, Ueda H. Delta opioid receptor mediates phospholipase C activation via Gi in Xenopus oocytes. FEBS Lett. 1993 Nov 1;333(3):311-4. 142 Moises HC, Rusin KI, Macdonald RL. mu-Opioid receptor-mediated reduction of neuronal calcium current occurs via a G(o)-type GTP-binding protein. J Neurosci. 1994 Jun;14(6):3842-51.
92
143 Montecucchi PC, de Castiglione R, Erspamer V. Identification of dermorphin and Hyp6-dermorphin in skin extracts of the Brazilian frog Phyllomedusa rhodei. Int J Pept Protein Res. 1981 Mar;17(3):316-21. 144 Montecucchi PC, de Castiglione R, Piani S, Gozzini L, Erspamer V. Amino acid composition and sequence of dermorphin, a novel opiate-like peptide from the skin of Phyllomedusa sauvagei. Int J Pept Protein Res. 1981 Mar;17(3):275-83. 145 Morre M, Bachy A, Gout B, Boigegrain R, Arnone M, Roncucci R. Kappa binding sites in guinea-pig brain membranes: evidence for a dynorphinresistant subtype. Life Sci. 1983; 33 Suppl 1: 179-82. 146 Mosberg, H.I., Hurst, R., Hruby, V.J., Gee, K., Yamamura, H.I., Galligan, J.J and Burks, T.F.: Bis-penicillamine enkephalins possess highly improved specificity toward δ opioid receptors. Proc. Natl. Acad. Sci., 80:5871-5874, 1983. 147 Moskowitz AS, Goodman RR. Autoradiographic analysis of mu1, mu2, and delta opioid binding in the central nervous system of C57BL/6BY and CXBK (opioid receptor-deficient) mice. Brain Res. 1985 Dec 23;360(1-2):108-16. 148 Moulin DE, Ling GS, Pasternak GW. Unidirectional analgesic cross-tolerance between morphine and levorphanol in the rat. Pain. 1988 May;33(2):233-9.
93
149 Mucha RF, Kalant H. Log dose/response curve flattening in rats after daily injection of opiates. Psychopharmacology (Berl). 1980;71(1):51-61. 150 Nakanishi S, Inoue A, Kita T, Nakamura M, Chang AC, Cohen SN, Numa S. Nucleotide sequence of cloned cDNA for bovine corticotropin-beta-lipotropin precursor. Nature. 1979 Mar 29;278(5703):423-7. 151 Neilan CL, Nguyen TM, Schiller PW, Pasternak GW. Pharmacological characterization of the dermorphin analog [Dmt(1)]DALDA, a highly potent and selective mu-opioid peptide. Eur J Pharmacol. 2001 May 4;419(1):15-23. 152 Nevin ST, Toth G, Nguyen TM, Schiller PW, Borsodi A. Synthesis and binding characteristics of the highly specific, tritiated delta opioid antagonist [3H]TIPP. Life Sci. 1993;53(5):PL57-62. 153 Ni Q, Xu H, Partilla JS, Rice KC, Matecka D, Calderon SN, Porreca F, Lai J, Schmidhammer H, Krassnig R, Rothman RB. Opioid peptide receptor studies. 9. Identification of a novel non-mu- non-delta-like opioid peptide binding site in rat brain. Peptides. 1998;19(6):1079-90. 154 Nishino K, Su YF, Wong CS, Watkins WD, Chang KJ. Dissociation of mu opioid tolerance from receptor down-regulation in rat spinal cord. J Pharmacol Exp Ther. 1990 Apr;253(1):67-72.
94
155 Noble F, Cox BM. Differential desensitization of mu- and delta- opioid receptors in selected neural pathways following chronic morphine treatment. Br J Pharmacol. 1996 Jan;117(1):161-9. 156 Noda M, Furutani Y, Takahashi H, Toyosato M, Hirose T, Inayama S, Nakanishi S, Numa S. Cloning and sequence analysis of cDNA for bovine adrenal preproenkephalin. Nature. 1982 Jan 21;295(5846):202-6. 157 North RA, Williams JT, Surprenant A, Christie MJ. Mu and delta receptors belong to a family of receptors that are coupled to potassium channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Aug;84(15):5487-91. 158 Oka T, Liu XF, Kajita T, Ohgiya N, Ghoda K, Taniguchi T, Arai Y, Matsumiya T. Effects of the subcutaneous administration of enkephalins on tail-flick response and righting reflex of developing rats. Brain Res Dev Brain Res. 1992 Oct 23;69(2):271-6. 159 Pan YX, Xu J, Bolan E, Abbadie C, Chang A, Zuckerman A, Rossi G, Pasternak GW. Identification and characterization of three new alternatively spliced mu-opioid receptor isoforms. Mol Pharmacol. 1999 Aug; 56(2): 396-403. 160 Pasternak GW, Childers SR, Snyder SH. Naloxazone, a long-acting opiate antagonist: effects on analgesia in intact animals and on opiate receptor binding in vitro. J Pharmacol Exp Ther. 1980 Sep; 214(3): 455-62.
95
161 Pasternak GW, Childers SR, Snyder SH. Opiate analgesia: evidence for mediation by a subpopulation of opiate receptors. Science. 1980 May 2; 208(4443): 514-6. 162 Pasternak GW, Simantov R, Snyder SH. Characterization of and endogenous morphine-like factor(enkephalin) in mammalian brain. Mol Pharmacol. 1976 May;12(3):504-13. 163 Patrick GA, Dewey WL, Spaulding TC, Harris LS. Relationship of brain morphine levels to analgesic activity in acutely treated mice and rats and in pellet implanted mice. J Pharmacol Exp Ther. 1975 Jun;193(3):876-83. 164 Paul D, Bodnar RJ, Gistrak MA, Pasternak GW. Different mu receptor subtypes mediate spinal and supraspinal analgesia in mice. Eur J Pharmacol. 1989 Sep 22;168(3):307-14. 165 Pavlovic ZW, Bodnar RJ. Opioid supraspinal analgesic synergy between the amygdala and periaqueductal gray in rats. Brain Res. 1998 Jan 1; 779(1-2): 158-69. 166 Pelton JT, Kazmierski W, Gulya K, Yamamura HI, Hruby VJ. Design and synthesis of conformationally constrained somatostatin analogues with high potency and specificity for mu opioid receptors. J Med Chem. 1986 Nov;29(11):2370-5. 167 Pert CB, Snyder SH. Opiate receptor binding--enhancement by opiate administration in vivo. Biochem Pharmacol. 1976 Apr 1;25(7):847-53.
96
168 Pert CB, Snyder SH. Opiate receptor: demonstration in nervous tissue. Science. 1973 Mar 9;179(77):1011-4. 169 Pfeifer BL, Sernaker HL, Ter Horst UM, Porges SW. Cross-tolerance between systemic and epidural morphine in cancer patients. Pain. 1989 Nov;39(2):181-7. 170 Picker MJ, Yarbrough J. Cross-tolerance and enhanced sensitivity to the response rate-decreasing effects of opioids with varying degrees of efficacy at the mu receptor. Psychopharmacology (Berl). 1991;105(4):459-66. 171 Polastron J, Meunier JC, Jauzac P. Chronic morphine induces tolerance and desensitization of mu-opioid receptor but not down-regulation in rabbit. Eur J Pharmacol. 1994 Jan 15;266(2):139-46. 172 Porreca F, Heyman JS, Mosberg HI, Omnaas JR, Vaught JL. Role of mu and delta receptors in the supraspinal and spinal analgesic effects of [DPen2, D-Pen5]enkephalin in the mouse. J Pharmacol Exp Ther. 1987 May;241(2):393-400. 173 Porreca F, Mosberg HI, Omnaas JR, Burks TF, Cowan A. Supraspinal and spinal potency of selective opioid agonists in the mouse writhing test. J Pharmacol Exp Ther. 1987 Mar; 240(3): 890-4.
97
174 Porreca F, Takemori AE, Sultana M, Portoghese PS, Bowen WD, Mosberg HI. Modulation of mu-mediated antinociception in the mouse involves opioid delta-2 receptors. J Pharmacol Exp Ther. 1992 Oct; 263(1): 147-52. 175 Porthe G, Frances B, Verrier B, Cros J, Meunier JC. The kappa-opioid receptor from human placenta: hydrodynamic characteristics and evidence for its association with a G protein. Life Sci. 1988;43(6):559-67. 176 Portoghese PS, Lipkowski AW, Takemori AE. Binaltorphimine and nor-binaltorphimine, potent and selective kappa-opioid receptor antagonists. Life Sci. 1987 Mar 30;40(13):1287-92. 177 Portoghese PS, Sultana M, Nagase H, Takemori AE. A highly selective delta 1-opioid receptor antagonist: 7-benzylidenenaltrexone. Eur J Pharmacol. 1992 Jul 21;218(1):195-6. 178 Portoghese PS, Sultana M, Takemori AE. Naltrindole, a highly selective and potent non-peptide delta opioid receptor antagonist. Eur J Pharmacol. 1988 Jan 27;146(1):185-6. 179 Puttfarcken PS, Cox BM. Morphine-induced desensitization and down-regulation at mu-receptors in 7315C pituitary tumor cells. Life Sci. 1989;45(20):1937-42.
98
180 Raffa RB, Martinez RP, Connelly CD. G-protein antisense oligodeoxyribonucleotides and mu-opioid supraspinal antinociception. Eur J Pharmacol. 1994 Jun 2;258(1-2):R5-7. 181 Ramsay D, Kellett E, McVey M, Rees S, Milligan G. Homo- and hetero-oligomeric interactions between G-protein-coupled receptors in living cells monitored by two variants of bioluminescence resonance energy transfer (BRET): hetero-oligomers between receptor subtypes form more efficiently than between less closely related sequences. Biochem J. 2002 Jul 15; 365(Pt 2): 429-40. 182 Raynor K, Kong H, Chen Y, Yasuda K, Yu L, Bell GI, Reisine T. Pharmacological characterization of the cloned kappa-, delta-, and mu-opioid receptors. Mol Pharmacol. 1994 Feb;45(2):330-4. 183 Rhim H, Miller RJ. Opioid receptors modulate diverse types of calcium channels in the nucleus tractus solitarius of the rat. J Neurosci. 1994 Dec;14(12):7608-15. 184 Robson LE, Kosterlitz HW. Specific protection of the binding sites of D-Ala2-D-Leu5-enkephalin (deltareceptors) and dihydromorphine (mu-receptors). Proc R Soc Lond B Biol Sci. 1979 Aug 31;205(1160):425-32. 185 Roerig SC, Fujimoto JM. Morphine antinociception in different strains of mice: relationship of supraspinalspinal multiplicative interaction to tolerance. J Pharmacol Exp Ther. 1988 Nov;247(2):603-8.
99
186 Roerig SC, Fujimoto JM. Multiplicative interaction between intrathecally and intracerebroventricularly administered mu opioid agonists but limited interactions between delta and kappa agonists for antinociception in mice. J Pharmacol Exp Ther. 1989 Jun; 249(3): 762-8. 187 Roerig SC, Hoffman RG, Takemori AE, Wilcox GL, Fujimoto JM. Isobolographic analysis of analgesic interactions between intrathecally and nintracerebroventricularly administered fentanyl, morphine and D-Ala2-D-Leu5enkephalin in morphine-tolerant and nontolerant mice. J Pharmacol Exp Ther. 1991 Jun;257(3):1091-9. 188 Roerig SC, Lei S, Kitto K, Hylden JK, Wilcox GL. Spinal interactions between opioid and noradrenergic agonists in mice: multiplicativity involves delta and alpha-2 receptors. J Pharmacol Exp Ther. 1992 Jul;262(1):365-74. 189 Roerig SC, O'Brien SM, Fujimoto JM, Wilcox GL. Tolerance to morphine analgesia: decreased multiplicative interaction between spinal and supraspinal sites. Brain Res. 1984 Aug 13;308(2):360-3. 190 Rogers NF, el-Fakahany E. Morphine-induced opioid receptor down-regulation detected in intact adult rat brain cells. Eur J Pharmacol. 1986 May 27;124(3):221-30. 191 Ronai AZ, Berzetei I, Bajusz S. Differentiation between opioid peptides by naltrexone. Eur J Pharmacol. 1977 Oct 15; 45(4): 393-4.
100
192 Rossi GC, Leventhal L, Pan YX, Cole J, Su W, Bodnar RJ, Pasternak GW. Antisense mapping of MOR-1 in rats: distinguishing between morphine and morphine-6beta-glucuronide antinociception. J Pharmacol Exp Ther. 1997 Apr;281(1):109-14. 193 Rossi GC, Pan YX, Brown GP, Pasternak GW. Antisense mapping the MOR-1 opioid receptor: evidence for alternative splicing and a novel morphine-6 beta-glucuronide receptor. FEBS Lett. 1995 Aug 7; 369(2-3): 192-6. 194 Rossi GC, Pasternak GW, Bodnar RJ. Mu and delta opioid synergy between the periaqueductal gray and the rostro-ventral medulla. Brain Res. 1994 Nov 28; 665(1): 85-93. 195 Rossi GC, Pasternak GW, Bodnar RJ. Synergistic brainstem interactions for morphine analgesia. Brain Res. 1993 Oct 8; 624(1-2): 171-80. 196 Rossi GC, Su W, Leventhal L, Su H, Pasternak GW. Antisense mapping DOR-1 in mice: further support for delta receptor subtypes. Brain Res. 1997 Apr 4;753(1):176-9. 197 Roth BL, Willins DL, Kroeze WK. G protein-coupled receptor (GPCR) trafficking in the central nervous system: relevance for drugs of abuse. Drug Alcohol Depend. 1998 Jun-Jul;51(1-2):73-85.
101
198 Rothman RB, Danks JA, Herkenham M, Jacobson AE, Burke TR Jr, Rice KC. Evidence that the delta-selective alkylating agent, fit, alters the mu-noncompetitive opiate delta binding site. Neuropeptides. 1985 Jun; 6(3): 227-37. 199 Rothman RB, Danks JA, Herkenham M, Jacobson AE, Burke TR Jr, Rice KC. Evidence that the delta-selective alkylating agent, fit, alters the mu-noncompetitive opiate delta binding site. Neuropeptides. 1985 Jun; 6(3): 227-37. 200 Rothman RB, Danks JA, Jacobson AE, Burke TR Jr, Rice KC, Tortella FC, Holaday JW. Morphine tolerance increases mu-noncompetitive delta binding sites. Eur J Pharmacol. 1986 May 13;124(1-2):113-9. 201 Rothman RB, Westfall TC. Allosteric coupling between morphine and enkephalin receptors in vitro. Mol Pharmacol. 1982 May; 21(3): 548-57. 202 Rothman RB, Westfall TC. Interaction of leucine enkephalin with (3H)naloxone binding in rat brain: evidence for an opioid receptor complex. Neurochem Res. 1983 Jul; 8(7): 913-31. 203 Rothman RB, Westfall TC. Morphine allosterically modulates the binding of [3H]leucine enkephalin to a particulate fraction of rat brain. Mol Pharmacol. 1982 May; 21(3): 538-47.
102
204 Samii A, Bickel U, Stroth U, Pardridge WM. Blood-brain barrier transport of neuropeptides: analysis with a metabolically stable dermorphin analogue. Am J Physiol. 1994 Jul;267(1 Pt 1):E124-31. 205 Sanchez-Blazquez P, Garzon J. delta Opioid receptor subtypes activate inositol-signaling pathways in the production of antinociception. J Pharmacol Exp Ther. 1998 May;285(2):820-7. 206 Sanchez-Blazquez P, Gomez-Serranillos P, Garzon J. Agonists determine the pattern of G-protein activation in mu-opioid receptormediated supraspinal analgesia. Brain Res Bull. 2001 Jan 15;54(2):229-35. 207 Sanchez-Blazquez P, Juarros JL, Martinez-Pena Y, Castro MA, Garzon J. Gx/z and Gi2 transducer proteins on mu/delta opioid-mediated supraspinal antinociception. Life Sci. 1993;53(23):PL381-6. 208 Sander T, Gscheidel N, Wendel B, Samochowiec J, Smolka M, Rommelspacher H, Schmidt LG, Hoehe MR. Human mu-opioid receptor variation and alcohol dependence. Alcohol Clin Exp Res. 1998 Dec;22(9):2108-10. 209 Schild, H.O.: pA, a new scale for the measurement of drug antagonism. Br. J. Pharmacol, 2:189-206, 1947.
103
210 Schiller PW, Fundytus ME, Merovitz L, Weltrowska G, Nguyen TM, Lemieux C, Chung NN, Coderre TJ. The opioid mu agonist/delta antagonist DIPP-NH(2)[Psi] produces a potent analgesic effect, no physical dependence, and less tolerance than morphine in rats. J Med Chem. 1999 Sep 9;42(18):3520-6. 211 Schiller PW, Nguyen TM, Berezowska I, Dupuis S, Weltrowska G, Chung NN, Lemieux C. Synthesis and in vitro opioid activity profiles of DALDA analogues. Eur J Med Chem. 2000 Oct; 35(10): 895-901. 212 Schiller PW, Nguyen TM, Chung NN, Lemieux C. Dermorphin analogues carrying an increased positive net charge in their "message" domain display extremely high mu opioid receptor selectivity. J Med Chem. 1989 Mar; 32(3): 698-703. 213 Schiller PW, Weltrowska G, Nguyen TM, Wilkes BC, Chung NN, Lemieux C. TIPP[psi]: a highly potent and stable pseudopeptide delta opioid receptor antagonist with extraordinary delta selectivity. J Med Chem. 1993 Oct 15;36(21):3182-7. 214 Schmauss C, Yaksh TL. In vivo studies on spinal opiate receptor systems mediating antinociception. II. Pharmacological profiles suggesting a differential association of mu, delta and kappa receptors with visceral chemical and cutaneous thermal stimuli in the rat. J Pharmacol Exp Ther. 1984 Jan; 228(1): 1-12. 215 Seward E, Hammond C, Henderson G. Mu-opioid-receptor-mediated inhibition of the N-type calcium-channel current. Proc R Soc Lond B Biol Sci. 1991 May 22;244(1310):129-35.
104
216 Shah S, Davis T, Yoburn BC. The effect of naltrindole on spinal and supraspinal delta opioid receptors and analgesia. Life Sci. 1994;55(19):1451-8. 217 Sharma SK, Nirenberg M, Klee WA. Morphine receptors as regulators of adenylate cyclase activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 1975 Feb;72(2):590-4. 218 Shimoyama M, Shimoyama N, Zhao GM, Schiller PW, Szeto HH. Antinociceptive and respiratory effects of intrathecal H-Tyr-D-Arg-Phe-Lys-NH2 (DALDA) and [Dmt1] DALDA. J Pharmacol Exp Ther. 2001 Apr;297(1):364-71. 219 Simantov R, Snyder SH. Morphine-like peptides, leucine enkephalin and methionine enkephalin: interactions with the opiate receptor. Mol Pharmacol. 1976 Nov;12(6):987-98. 220 Simon EJ, Hiller JM, Edelman I. Stereospecific binding of the potent narcotic analgesic (3H) Etorphine to rat-brain homogenate. Proc Natl Acad Sci U S A. 1973 Jul;70(7):1947-9. 221 Smart D, Smith G and Lambert DG. Mu-opioid receptor stimulation of inositol (1,4,5)trisphosphate formation via a pertussis toxin sensitive G protein. J Neurochem. 1994 Mar;62(3):1009-1014.
105
222 Smart D, Smith G, Lambert DG. Mu-opioids activate phospholipase C in SH-SY5Y human neuroblastoma cells via calcium-channel opening. Biochem J. 1995 Jan 15;305 ( Pt 2):577-81. Erratum in: Biochem J 1995 May 1;307(Pt 3):879. 223 Smith JR, Simon EJ. Selective protection of stereospecific enkephalin and opiate binding against inactivation by N-ethylmaleimide: evidence for two classes of opiate receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 1980 Jan;77(1):281-4. 224 Sofuoglu M, Portoghese PS, Takemori AE. 7-Benzylidenenaltrexone (BNTX): a selective delta 1 opioid receptor antagonist in the mouse spinal cord. Life Sci. 1993; 52(8): 769-75. 225 Sofuoglu M, Portoghese PS, Takemori AE. delta-Opioid receptor binding in mouse brain: evidence for heterogeneous binding sites. Eur J Pharmacol. 1992 Jun 5; 216(2): 273-7. 226 Sofuoglu M, Portoghese PS, Takemori AE. Differential antagonism of delta opioid agonists by naltrindole and its benzofuran analog (NTB) in mice: evidence for delta opioid receptor subtypes. J Pharmacol Exp Ther. 1991 May;257(2):676-80. 227 Song SH, Takemori AE. Modulation of acute morphine tolerance by corticotropin-releasing factor and dynorphin A in the mouse spinal cord. Life Sci. 1992;51(2):107-11.
106
228 Sora I, Elmer G, Funada M, Pieper J, Li XF, Hall FS, Uhl GR. Mu opiate receptor gene dose effects on different morphine actions: evidence for differential in vivo mu receptor reserve. Neuropsychopharmacology. 2001 Jul;25(1):41-54. 229 Sora I, Funada M, Uhl GR. The mu-opioid receptor is necessary for [D-Pen2,D-Pen5]enkephalin-induced analgesia. Eur J Pharmacol. 1997 Apr 18;324(2-3):R1-2. 230 Sora I, Takahashi N, Funada M, Ujike H, Revay RS, Donovan DM, Miner LL, Uhl GR. Opiate receptor knockout mice define mu receptor roles in endogenous nociceptive responses and morphine-induced analgesia. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Feb 18;94(4):1544-9. 231 Stafford K, Gomes AB, Shen J and Yoburn BC: Mu-opioid receptor downregulation contributes to opioid tolerance in vivo. Pharmacol. Biochem. Behav, 69(1-2):233-7, 2001. 232 Standifer KM, Chien CC, Wahlestedt C, Brown GP, Pasternak GW. Selective loss of delta opioid analgesia and binding by antisense oligodeoxynucleotides to a delta opioid receptor. Neuron. 1994 Apr;12(4):805-10. 233 Standifer, K.M., Jenab, S., Su, W., Chien, C.C., Pan, Y.X., Inturrisi, C.E. and Pasternak, G.W.: Antisense oligodeoxynucleotides to the cloned δ receptor, DOR-1: Uptake, stability and regulation of gene expression. J.Neurochem. 1995, 65:1981-1987.
107
234 Stefano GB, Hartman A, Bilfinger TV, Magazine HI, Liu Y, Casares F, Goligorsky MS. Presence of the mu3 opiate receptor in endothelial cells. Coupling to nitric oxide production and vasodilation. J Biol Chem. 1995 Dec 22; 270(51): 30290-3. 235 Stevens CW, Yaksh TL. Potency of infused spinal antinociceptive agents is inversely related to magnitude of tolerance after continuous infusion. J Pharmacol Exp Ther. 1989 Jul;250(1):1-8. 236 Suzuki T, Tsuji M, Mori T, Misawa M, Endoh T, Nagase H. Effects of a highly selective nonpeptide delta opioid receptor agonist, TAN-67, on morphine-induced antinociception in mice. Life Sci. 1995;57(2):155-68. 237 Székely JI, Ronai AZ, Dunai-Kovacs Z, Miglecz E, Bajusz S, Graf L. Cross tolerance between morphine and beta-endorphin in vivo. Life Sci. 1977 Apr 1;20(7):1259-64. 238 Szeto HH, Clapp JF, Desiderio DM, Schiller PW, Grigoriants OO, Soong Y, Wu D, Olariu N, Tseng JL, Becklin R. In vivo disposition of dermorphin analog (DALDA) in nonpregnant and pregnant sheep. J Pharmacol Exp Ther. 1998 Jan;284(1):61-5. 239 Szeto HH, Lovelace JL, Fridland G, Soong Y, Fasolo J, Wu D, Desiderio DM, Schiller PW. In vivo pharmacokinetics of selective mu-opioid peptide agonists. J Pharmacol Exp Ther. 2001 Jul;298(1):57-61.
108
240 Takemori AE, Portoghese PS. Enkephalin antinociception in mice is mediated by delta 1- and delta 2-opioid receptors in the brain and spinal cord, respectively. Eur J Pharmacol. 1993 Sep 28;242(2):145-50. 241 Tang Q, Gandhoke R, Burritt A, Hruby VJ, Porreca F, Lai J. High-affinity interaction of (des-Tyrosyl)dynorphin A(2-17) with NMDA receptors. J Pharmacol Exp Ther. 1999 Nov;291(2):760-5. 242 Tao PL, Law PY, Loh HH. Decrease in delta and mu opioid receptor binding capacity in rat brain after chronic etorphine treatment. J Pharmacol Exp Ther. 1987 Mar;240(3):809-16. 243 Terenius L, Wahlstöm A. Search for an endogenous ligand for the opiate receptor. Acta Physiol Scand. 1975 May;94(1):74-81. 244 Terenius L. Stereospecific interaction between narcotic analgesics and a synaptic plasm a membrane fraction of rat cerebral cortex. Acta Pharmacol Toxicol (Copenh). 1973;32(3):317-20. 245 Trapaidze N, Keith DE, Cvejic S, Evans CJ, Devi LA. Sequestration of the delta opioid receptor. Role of the C terminus in agonistmediated internalization. J Biol Chem. 1996 Nov 15;271(46):29279-85.
109
246 Tseng LF, Narita M, Mizoguchi H, Kawai K, Mizusuna A, Kamei J, Suzuki T, Nagase H. Delta-1 opioid receptor-mediated antinociceptive properties of a nonpeptidic delta opioid receptor agonist, (-)TAN-67, in the mouse spinal cord. J Pharmacol Exp Ther. 1997 Feb;280(2):600-5. 247 Tseng, L.F., Collins, K.A. and Kampine, J.P.: Antisense oligonucleotide to a δ-receptor selectively blocks the spinal antinociception induced by δ-, but not µ- or κ-opioid receptor agonists in the mouse. Eur. J. Pharmacol., 258:R1-R3, 1994. 248 Tulunay FC, Takemori AE. The increased efficacy of narcotic antagonists induced by various narcotic analgesics. J Pharmacol Exp Ther. 1974 Sep;190(3):395-400. 249 Uhl GR, Sora I, Wang Z. The mu opiate receptor as a candidate gene for pain: polymorphisms, variations in expression, nociception, and opiate responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 Jul 6;96(14):7752-5. 250 Vaughn LK, Knapp RJ, Toth G, Wan YP, Hruby VJ, Yamamura HI. A high affinity, highly selective ligand for the delta opioid receptor: [3H]-[D-Pen2, pCl-Phe4, d-Pen5]enkephalin. Life Sci. 1989; 45(11): 1001-8. 251 Vaught JL, Takemori AE. Differential effects of leucine and methionine enkephalin on morphine-induced analgesia, acute tolerance and dependence. J Pharmacol Exp Ther. 1979 Jan; 208(1): 86-90.
110
252 Von Voigtlander PF, Lewis RA. U-50,488, a selective kappa opioid agonist: comparison to other reputed kappa agonists. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 1982;6(4-6):467-70. 253 Wang HQ, Kampine JP, Tseng LF. Antisense oligodeoxynucleotide to a delta-opioid receptor messenger RNA selectively blocks the antinociception induced by intracerebroventricularly administered delta-, but not mu-, epsilon- or kappa-opioid receptor agonists in the mouse. Neuroscience. 1996 Nov;75(2):445-52. 254 Wang Z, Bilsky EJ, Porreca F, Sadee W. Constitutive mu opioid receptor activation as a regulatory mechanism underlying narcotic tolerance and dependence. Life Sci. 1994;54(20):PL339-50. 255 Waterfield AA, Hughes J, Kosterlitz HW. Cross tolerance between morphine and methionine-enkephalin. Nature. 1976 Apr 15;260(5552):624-5. 256 Whistler JL, Chuang HH, Chu P, Jan LY, von Zastrow M. Functional dissociation of mu opioid receptor signaling and endocytosis: implications for the biology of opiate tolerance and addiction. Neuron. 1999 Aug;23(4):737-46. 257 Wolozin BL, Pasternak GW. Classification of multiple morphine and enkephalin binding sites in the central nervous system. Proc Natl Acad Sci U S A. 1981 Oct; 78(10): 6181-5.
111
258 Xu H, Lu YF, Partilla JS, Pinto J, Calderon SN, Matecka D, Rice KC, Lai J, Porreca F, Ananthan S, Rothman RB. Opioid peptide receptor studies. 8. One of the mouse brain deltaNCX binding sites is similar to the cloned mouse opioid delta receptor: further evidence for heterogeneity of delta opioid receptors. Peptides. 1998; 19(2): 343-50. 259 Xu H, Lu YF, Partilla JS, Pinto J, Calderon SN, Matecka D, Rice KC, Lai J, Porreca F, Ananthan S, Rothman RB. Opioid peptide receptor studies. 8. One of the mouse brain deltaNCX binding sites is similar to the cloned mouse opioid delta receptor: further evidence for heterogeneity of delta opioid receptors. Peptides. 1998; 19(2): 343-50. 260 Xu H, Ni Q, Jacobson AE, Rice KC, Rothman RB. Preliminary ligand binding data for subtypes of the delta opioid receptor in rat brain membranes. Life Sci. 1991; 49(18): PL141-6. 261 Xu H, Partilla JS, de Costa BR, Rice KC, Rothman RB. Differential binding of opioid peptides and other drugs to two subtypes of opioid delta ncx binding sites in mouse brain: further evidence for delta receptor heterogeneity. Peptides. 1993 Sep-Oct; 14(5): 893-907. 262 Xu H, Partilla JS, de Costa BR, Rice KC, Rothman RB. Interaction of opioid peptides and other drugs with multiple delta ncx binding sites in rat brain: further evidence for heterogeneity. Peptides. 1992 Nov-Dec; 13(6): 1207-13.
112
263 Yabaluri N, Medzihradsky F. Down-regulation of mu-opioid receptor by full but not partial agonists is independent of G protein coupling. Mol Pharmacol. 1997 Nov;52(5):896-902. 264 Yaksh TL, Kohl RL, Rudy TA. Induction of tolerance and withdrawal in rats receiving morphine in the spinal subarachnoid space. Eur J Pharmacol. 1977 Apr 7;42(3):275-84. 265 Yaksh TL. In vivo studies on spinal opiate receptor systems mediating antinociception. I. Mu and delta receptor profiles in the primate. J Pharmacol Exp Ther. 1983 Aug; 226(2): 303-16. 266 Yaksh TL. In vivo studies on spinal opiate receptor systems mediating antinociception. I. Mu and delta receptor profiles in the primate. J Pharmacol Exp Ther. 1983 Aug; 226(2): 303-16. 267 Yasuda K, Raynor K, Kong H, Breder CD, Takeda J, Reisine T, Bell GI. Cloning and functional comparison of kappa and delta opioid receptors from mouse brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6736-40. 268 Yeung JC, Rudy TA. Multiplicative interaction between narcotic agonisms expressed at spinal and supraspinal sites of antinociceptive action as revealed by concurrent intrathecal and intracerebroventricular injections of morphine. J Pharmacol Exp Ther. 1980 Dec; 215(3): 633-42.
113
269 Yeung JC, Rudy TA. Sites of antinociceptive action of systemically injected morphine: involvement of supraspinal loci as revealed by intracerebroventricular injection of naloxone. J Pharmacol Exp Ther. 1980 Dec; 215(3): 626-32. 270 Yoburn BC, Lutfy K, Sierra V, Tortella FC. Tolerance develops to spinal morphine analgesia but not morphine-induced convulsions. Eur J Pharmacol. 1990 Jan 25;176(1):63-7. 271 Young AM, Kapitsopoulos G, Makhay MM. Tolerance to morphine-like stimulus effects of mu opioid agonists. J Pharmacol Exp Ther. 1991 May;257(2):795-805. 272 Zadina JE, Hackler L, Ge LJ, Kastin AJ. A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. Nature. 1997 Apr 3;386(6624):499-502. 273 Zajac JM, Gacel G, Petit F, Dodey P, Rossignol P, Roques BP. Deltakephalin, Tyr-D-Thr-Gly-Phe-Leu-Thr: a new highly potent and fully specific agonist for opiate delta-receptors. Biochem Biophys Res Commun. 1983 Mar 16;111(2):390-7. 274 Zhao GM, Wu D, Soong Y, Shimoyama M, Berezowska I, Schiller PW, Szeto HH. Profound spinal tolerance after repeated exposure to a highly selective mu-opioid peptide agonist: role of delta-opioid receptors. J Pharmacol Exp Ther. 2002 Jul;302(1):188-96.
114
275 Zhu Y, King MA, Schuller AG, Nitsche JF, Reidl M, Elde RP, Unterwald E, Pasternak GW, Pintar JE. Retention of supraspinal delta-like analgesia and loss of morphine tolerance in delta opioid receptor knockout mice. Neuron. 1999 Sep;24(1):243-52. 276 Zimprich A, Simon T, Hollt V. Cloning and expression of an isoform of the rat mu opioid receptor (rMOR1B) which differs in agonist induced desensitization from rMOR1. FEBS Lett. 1995 Feb 13;359(2-3):142-6.
115
