SEMMELWEIS EGYETEM
Gyógyszertudományok Doktori Iskola
TERMÉSZETES OPIOID PEPTIDEK, SZINTETIKUS ANALÓGOK, PEPTIDÁZOK: FARMAKOLÓGIAI ELEMZÉS ÉS HATÓANYAGTERVEZÉS Rónai András Zoltán Doktori értekezés tézise i
Témavezeto: Prof. Dr. Magyar Kálmán, D.Sc. A Magyar Tudományos Akadémia rendes tagja
Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet Semmelweis Egyetem, Budapest
Budapest, 2004
1
ELOZMÉNYEK Az ópioid peptidkutatás kiindulópontjának az enkephalinok (Tyr-Gly-Gly-Phe-Met, (Met5 ) enkephalin és Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu, (Leu5 )-enkephalin) felfedezése tekintheto, melyeket sertésagyból izoláltak Hughes, Kosterlitz és munkatársaik 1975-ben (29). A kutatástörténet, a jelek szerint, hiven engedelmeskedett annak a receptorelméleti szabálynak, hogy egy valódi receptornak kell, hogy legyen(ek) endogén ligandja(i). Az elso opioid receptormodellt Beckett és Casy állitotta fel (6). A receptorok létezésének közvetlen, kisérletes bizonyitékát egymástól függetlenül három kutatócsoprt „szállitotta”, ugyanazon évben, sikeres receptorkötési teszt elvégzése útján (44, 74, 80). Az enkefalinok felfedezését követoen igazolták az ópioid receptorok heterogenitását azaz több receptortipus létezését. Az eltéro farmakológiai és receptorkötési sajátságok alapján három fo receptortipust különböztettek meg, s ezeket ?-, ?és ?- tipusunak nevezték el (17, 36, 38). Mivel a (Met5 )-enkephalin szekvenciával megegyezo pentapeptid-szakasz megtalálható egy hipofizishormonban, a ?-lipotropinban (LPH(1-91), ?-LPH), a 61-65 számú aminosavak közötti szerkezeti részben , a kutatói társadalom figyelme értheto módon e peptidhormonra irányult. ?-LPH-ból származtatható számos természetes ópioid peptid, melyek Nterminálisukon valamennyien hordozzák a Tyr-Gly-Gly-Phe-Met pentapeptid motivumot. Ilyennek tekinthetok az ? -, ?- és ?-endorfin, míg az enkefalinok más biológiai „forrásból” vezethetok le. A ß-lipotropinból származó ópioid peptidek közül valószinuleg a ?-endorfin (LPH(61-91), ? -EP) a legjelentosebb (7, 26, 35). A késoi hetvenes években azonositottak egy harmadik, különálló opioid peptidcsaládot, amelynek tagjai az N-terminális Tyr-Gly-Gly-PheLeu motivum alapján épülnek fel; ezek voltak a dinorfinok és neo-endorfinok (18, 31). A nyolvanas évek elején a fenti három opioid peptidcsalád nagy molekulatömegu prekurzorait is azanositották. Pre-proopio-melanokortinnak nevezték el az endorfinok, preproenkefalinnak az enkefalinok valamint természetes enkefalin-származékok és preprodinorphinnak pedig a dinorfinok és neo-endorfinok prekurzorát (11, 30, 40). Közel azonos idoszakban felismertek két új termeszetes peptidcsoportot, melyek alapvetoen eltéro szerkezeti elven épültek fel. Az egyik csoport a Tyr-Pro-peptidek néven vált ismertté; ezen csoportban azoknál a peptideknél, ahol az N-terminális Tyr-Pro motivumot aromás aminosav követte, jelentos volt az opioid receptoriális hatás. Kazomorfinok, hemorfinok és citokrofinok voltak a csoport legkorábban leirt tagjai (8-10) de elvileg ide sorolható az ? -gliadorfin (21), és a Tyr-MIF-1/Tyr-W-MIF-1 (13, 32) is. A másik csoport a „kétéltu bor-eredetu peptidek” gyujtonevet kapta; a család legkorábban felismert tagja(i) a dermorfin(ok) volt(ak) (14).Itt a
2
jellegzetes N-terminális motivum aTyr-D-Ala/D-Met -Phe—tripeptid-sor volt. Az elozo csoport kutatástörténeti csúcspontját az endomorfinok felefedezése hozta el, 1997-ben (82) míg az utóbbi család a dermenkefalin illetve deltorfinok azonositása révén bovült (15). A három fo receptortipus (?, ? és ?) proteinjeinek elsodleges szerkezetét a genomikus kódok alapján levezették 1992 és 1994 között (16, 33, összefoglaló irodalmát l. 81). Ez a felfedezés további lendületet adott a ligandkötés és a receptoriális jelátvitel módját elemzo vizsgálatoknak (pl.. 45, 83)..
CÉLKITUZÉSEK Célkituzéseim többirányúak voltak, és az opioid peptidkutatás éppen aktuális szakaszához kapcsolódtak. A korai szakaszban jellemzni kivántam a természetes enkefaliok és rokonszerkezetu természetes peptidek, igy a ß-lipotropinból származó peptidek farmakológiai sajátságait. Ezt követoen gyakorlati motivációtól is vezérelve, in vitro kisérletes hátteret biztositottam fájdalomcsillapitó hatással is rendelkezo enkefalin-analógok tervezéséhez. Mivel alapvetoen új hatóanyag-családról volt szó, a munka során tisztáznom kellett a különbözo opioid hatásokért –receptor tipus-szelektivitás, hatáserosség, hatás agonista vagy antagonista jellege- felelos szerkezeti feltételeket, s törekednem kellett azon prognosztikus elemek felismerésére, melyek potenciális fájdalomcsillapitó hatást jelezhettek. Peptidfarmakológiai elemzovizsgálatok során mindig felmerül annak a kérdése is, hogy a vizsgált peptidek hatását mely peptidázok befolyásolhatják. Igy történt esetünkben is; ennek kapcsán figyeltem fel egy ujtipusú dipeptidil-karboxipeptidázra, melynek jellemzésére mind farmakológiai, mind biokémiai elemzovizsgálatokat folytattam. Végül pedig, számos saját tapasztalati elemet és irodalmi információt integrálva arra vetemedtem, hogy farmakológus létemre tipus-szelektiv d- és ?-opioid receptorantagonistákat tervezzek-és a peptidszintetikus partnerekkel együttmuködve szabadalomképes peptidanalógokat fejlesszünk ki. A célok megvalósitásának leggyakrabban használt technikai eszközei az izoláltszerv-készitmények voltak. A munkát lényegében két fo idoszakban, 1976 és 1984 illetve 1988 és 2001 között végeztem. Az egyes témavezetések között elofordult idobeni átfedés is, és néhány esetben egy egy téma „újraélesztése” 8-10 éves hibernáció után következett be. 1976-1981 között a munka a Gyógyszerkutató Intézetben folyt, az együttmuködo partnerek preparativ biokémikusok (csoportvezeto: Gráf László), peptidszintetikusok (csoportvezeto: Bajusz Sándor) és viselkedésfarmakológusok (csoportvezeto: Székely József Iván) voltak. Mint az izoláltszervi
3
farmakológiai csoport vezetojének induló feladatom a természetes enkefalinok, valamint a ßendorfin és fragmenseinek in vitro farmakológiai jellemzése volt (2. Fejezet). A feladat teljesitéséhez eloször meg kellett keresnem azokat az izoláltszervi vizsgálati rendszereket és kisérletvezetési paradigmákat, melyek lehetové tették a morfinszármazékok és az opioid peptidek hatásjellegének differenciálását, majd a peptidszármazékokon belüli hatásjellegek elkülönitését (1. Fejezet). Fentieken alapultak a következo tevékenységi fázisok, azaz az enkefalin-analógok tervezésének logisztikai támogatása (3. Fejezet) és a hatásjellegekért (analgetikus hatás beleértve) felelos szerkezeti elemek feltárása (4. Fejezet). Peptidfarmakonok hatáselemzése során a kutató törvényszeruen szembesül különbözo peptidázok hatásmódositó szerepével. A természetes enkefalinokat és több, pro-enkefalin prekurzorból származó természetes opioid peptidet számos peptidáz hasitja. Ezek vizsgálata során figyeltem fel egy sajátos (feltételezetten új) peptidáz aktivitására, amely érfali idegelemekben és mellékvese veloállományban is elofordul (5. Fejezet); a peptidáz jellemzésére irányuló farmakológiai-biokémiai vizsgálatok 1981-1983 illetve 1990-1997 között folytak. A farmakológus illetve a szintetizáló vegyész számára örökös kihivás egy új neurotranszmitter/hormon megismerését követoen, hogy a –szabály szerint - agonista hatásjellegu természetes anyag ismeretében specifikus, receptor/tipus-szelektiv kompetitiv antagonistát tervezzen (6. Fejezet). Ahhoz, hogy a farmakológiai hatás és a kémiai szerkezet közötti összefüggéseket felismerhessük, a hatóanyagok konformációs sajátságainak ismerete is kulcsfontosságú. A ?-LPH-ból származtatható aktiv peptidek konformációs vizsgálatát a preparativ biokémiai csoport vezetoje irányitotta (19, 20), a (D-Met2 ,Pro 5 )-enkefalinamid esetében a szintetikus vegyészcsoport vezetoje (27). Enkefalin-analógok egy választott csoportjának konformáció-analizisét én koordináltam, és a d-receptorantagonista peptidek esetében már a tervezés is tekintettel volt a késobbi konformációs elemzés valószinusitheto szempontjaira (28, 56, 75). A fejezetekben bemutatott munkák kidolgozottsági foka különbözo. Valamennyiben eljutottam/eljutottunk addig a pontig, mely a leglényegesebb eredeti kérdésfelvetésre kisérletes választ adott. Néhány projekt valósan lezártnak tekintheto, míg több esetben szinte önmagát kinálja a továbbvitel (ez alapvetoen finansziális kérdés). Remélem, hogy az alapötletek és az esetleges folytatások ötleteinek eredetisége elegendo volt/lesz ahhoz, hogy a megoldásokat is mi találhassuk meg.
4
EREDMÉNYEK ÉS KÖVETKEZTETÉSEK A disszertációban az eredményeket hat fejezetben mutattam be. Az általános összefoglalót és a következtetéseket is e hat fejezet alapján adom meg. 1. Fejezet. A vizsgálatokhoz használt izoláltszerv-készitmények áttekintése. Tájékozódó kisérleteket végeztem hat, opioid receptor(oka)t tartalmazó izoláltszerv-készitményen. Ezek az alábbiak voltak: izolált, téringerelt tengerimalac ileum hosszanti simaizom-Auerbach plexus (GPI, 48, 60, 61), izolált, téringerelt egér (MVD, 48, 51, 61), patkány (RVD, 52-54) és nyúl (LVD, 69) vas deferens, izolált, téringerelt macska pislogóhártya mediáliis rész (CNM, 51, 52) és izolált, átáramoltatott, téringerelt nyúlfül-artéria (ART, 48, 51, 52, 63, 70). ?
Jelentos, lényegi módszertani változtatás volt szükséges az egér vas deferens és a nyúlfül-artéria esetében. A többi készitménynél a módszerbeállitás az eredeti leirásokat követte kisebb módszertani változtatások mellett.
?
A három fo opioid receptortipust, melyeket ma is széles körben elfogadnak (µ, d és ?), közelitoleg abban az idoszakban definiálták (1976-1977), amikor a tájékozódó kisérleteket végeztem (1976 -1978). Az izoláltszerv-készitmények opioid receptorkészletének jellemzésére kezdetben normorfint használtam jó µ-opioid receptorszelektivitású agonistaként, melyet késobb a lényegesen magasabb szelektivitású DAMGO váltott fel; hasonlóképpen, a kezdetben alkalmazott, farmakológiailag jó d-receptor szelektivitású agonista (Met5)-enkefalint a szelektivebb DADLE, DPDP illetve deltorfin-II követte (38, 41 -43, 48, 49, 51, 56-58, 61, 65-67), míg a ?/µ agonista etilketociklazocin (EKC) mellett a szelektiv ? agonista PD-117 302-t alkalmaztam(38, 41-43, 56-58, 63, 65-67). A kompetitiv opioid receptorantagonisták közül kezdetben a 5
viszonylagos µ receptor szelektivitású naltrexont és naloxont használtam (48, 49), amely mellett a késobbiekben magas receptortipus szelektivitású antagonisták is az elemzés eszközeivé vátak (pl. 38, 58, 62, 66, 67). ?
A természetes opioid peptidek, enkefalin-analógok valamint a receptorantagonista hatás elérésére tervezett peptidszármazékok rutinszeru hatáselemzésére elsosorban az MVD készitményt alkalmaztam, mely mindhárom fo opioid receptortipust tartalmazza. Összehasonlitó elemzovizsgálat céljaira rendszeresen használtam a GPI preparátumot is, melyet funkcionális µ és ? receptorkészlet jellemez.
?
Igazoltam (jelenlegi terminológia szerinti) funkcionális d- és ?-opioid receptorok jelenlétét ART készitményen (37, 48, 51, 63, 69, 70). A preparátumot nem rutinszeru elemzések céljaira használtam, hanem elsosorban egy, a kutatási folyamat során észlelt újtipusú dipeptidilkarboxipeptidáz létezésének farmakológiai bizonyitására (5. Fejezet).
?
Vizsgáltam az opioid receptorok posztnatális funkcionális változását RVD készitményen (53, 54). Megerositettem, hogy a természetes ópioid peptidek között a ß-endorfin kiemelkedoen magas hatáserosségu agonista ezen a preparátumon. Az itt található ópioid receptorokat a µ tipusúhoz hasonlónak, de nem teljesen azonosnak találtam. A posztnatális változás úgy jellemezheto, hogy az(ok) a mechanizmus(ok), melyek az agonisták hatékonyságát (efficacy) szervezik, fokozatosan csökkent muködésre állnak be a születés utáni 8 -30 nap között.
?
Az LVD készitményt, melyet dominánsan ? receptorok jelenléte jellemez, célzottan csak e profil vizsgálata céljából alkalmaztam (37, 42, 69), míg a CNM preparátumot elhagytam a vizsgálati együttesbol.
6
2. Fejezet. A természetes enkefalinok valamint a ß-endorfin és fragmenseinek farmakológiai jellemzése. ?
A sertés hipofizisbol kivont és biokémiai egynemuségig tisztitott ßlipotropin izoláltszervi vizsgálatokban nem rendelkezett opioid agonista hatással (25, 72), de tripszines emésztést követoen opioid agonista hatású fragmens(ek) jelent(ek) meg. Sertés hipofizis membránokban is jelen van(nak) olyan enzim(ek) melyek aktiv opioid fragmenseket képeznek a ß-LPH-ból.
?
Csak azok a fragmensek voltak aktiv opioid agonisták, melyek tartalmazták N-terminálisukon a ß-LPH-ban 61-es pozicióban található tirozint (19, 22-24).
?
5
A (Met )-enkefalin (LPH-(61-65)), LPH-(61-69) és LPH-(61-79) 16 -28 szor erosebb agonisták voltak izolált egér vas deferens készitményen mint tengerimalac ileum hosszanti simaizmon mig a ? -endorfin (LPH(61-91)) azonos hatáserosségune k bizonyult a két preparátumon (48, 61).
?
Tengerimalac ileumon valamennyi LPH fragmens azonos, vagy legalábbis igen hasonló receptortipuson fejtette ki hatását, melyen az opiát agonista normorfin, míg MVD-n a peptidek és a normorfin különbözo receptortipusokon hatottak (48, 49).
?
A harmadik agykamrába (intracerbroventrikulárisan, i.c.v.) adott ? endorfin igen eros, opioid tipusú (naloxonnal antagonizálható) fájdalomcsillapitónak bizonyult a patkány tail-flick tesztben, míg a rövidebb opioid fragmensek számottevo fájdalomcsillapitó hatást nem mutattak (26, 76-78). Az in vivo hatásbeli különbségek elsosorban a különbözo opioid receptortipusokon kifejtett eltéro agonista hatásspektrummal magyarázhatók (50, 55).
?
Azonos adásmód (i.c.v.) mellett a ? -LPH naloxonnal antagonizálható fájdalomcsillapitó hatást fejtett ki ugyanebben a fájdalmi tesztben (72). Mivel az intakt LPH opioid agonista hatással nem rendelkezett, 7
feltételeztem, hogy a hatást a belole keletkezett aktiv fragmens(ek) (valószinuleg ß-endorfin) hozta/hozták létre.
3. Fejezet. Kiemelkedoen eros fájdalomcsillapitó hatású enkefalin-analóg kifejlesztése: a (D-Met2,Pro 5)-enkefalinamid. ?
A Gyógyszerkutató Intézetben 1976-1977 között egy olyan programot inditottunk, melynek célja eros fájdalomcsillapitó hatással rendelkezo enkefalin analóg(ok) kifejlesztése volt (1, 3; GO-1350/76 jelu magyar szabadalom).
?
Az induló szakaszban a hatóanyagtervezés kulcslépéseinek eldöntéséhez vizsgáltam a Bajusz Sándor által tervezett enkefalin-analógok ópioid sajátságait GPI és MVD készitményen (48, 49-51).
?
A kiinduló természetes peptidhez (YGGFM) viszonyitva in vitro magasabb hatáserosségu analógok állithatók elo a 2 pozíció megfelelo helyettesitésével (alifás, hidrofób D-aminosav bevitelével) valamint a Cterminális szerkezetének megfelelo módositásával (178 004 (GO 1448/1979) és 181 013 (155/80) jelü magyar szabadalmak; 2-4, 55, 71).
?
A fejlesztési folyamat „célpeptidje”, a (D-Met2,Pro5)-enkefalinamid (GO1350/76 jelu magyar, 85843 jelu belga és 4465625/1984 jeu USA szabadalom)a morfinnál mintegy 80-szor nagyobb hatáserosségu ópioid tipusú fájdalomcsillapitó hatást fejtett ki agykamrai adagolás mellett a patkány tail-flick tesztben (4, 79).
?
Az analóg a normorfinnál 8-20-szor erosebb ópioid agonistának bizonyult valamennyi izoláltszerv-rendszerben, melyben az ópiát referens hatékony volt (48, 50-52, 55, 71, 79).
?
2
5
A (D-Met ,Pro )-enkefalinamid receptortipus-szelektivitása közelebb került a normorfinéhoz, de emellet a kiinduló peptid (Met5)-enkefalinhoz képest szignifikánsan kisebb mértékben, de agonista hatású volt a
8
természetes peptid által „preferált” receptortipuson is (49, 52, 55).
4. Fejezet. Az enkefalin analógok receptortipus-szelektivitását meghatározó szerkezeti sajátságok megállapitása A jelenleg elfogadott receptor tipus terminológiát használva (d, µ és ?) az enkefalin analógok agonista hatásának receptortipus-szelektivitását, valamint az in vivo várható fájdalomcsillapitó hatást meghatározó szerkezeti feltételeket az alábbiakban állapitottam meg: ?
Alifás, hidrofób D-aminosav (D-Ala, D-Met or D-Nle) bevitele a 2 pozicióba megnöveli az agonista hatáserosséget in vitro, de nem meghatározó tényezo a receptortipus-szelektivitás szempontjából (2, 3, 50, 71).
?
Azok a szerkezeti elemek, melyek a d vagy µ receptortipus-szelekciót eldöntik, az enkefalin-analógok C-terminálisára lokalizálhatók (5, 50, 55, 71).
?
5 helyzetben alifás, hidrofób aminosav (Met, Leu, Nle, Ile stb.) szabad karboxil-funkcióval a d receptor-szelektiv agonista hatás legjelentosebb szerkezeti feltétele. C-terminális amidálás, különösen, ha Pro az 5 helyzetben levo aminosav, az ötödik aminosav elhagyása C-terminális amidálás mellett mind a µ receptor-szelektivitás irányába „tolja el” az agonista hatást.
?
A konformációs rögzitettségi tendencia elosegiti az agonista hatást a µopioid receptortipuson mig hasonló összefüggés d receptorok esetében nem tapasztalható (71, 75).
?
Bizonyitékon alapuló okunk van elfogadni azt, hogy pozitiv korreláció áll fenn nem-peptid opiátok esetében az un. szupraspinálisan szervezodo fájdalomcsillapitó hatás erossége és az in vitro, GPI készitményen mért µ receptoragonista hatáserosségek között (un. pro-drug-ok kivételt képeznek, természetesen). Korreláltatva enkefalin-analógok esetén 9
ezeket az adatpárokat, nemcsak egyszeruen a korreláció hiányát állapitottam meg, hanem azt a tényt is, hogy ezt a peptidanalógok aktuálisan meglevo d-opioid receptoragonizmusa idézi elo. Ezen állitás agykamrai adagolás mellett a patkány tail-flick tesztre érvényes (55). 5. Fejezet. Egy újtipusú dipeptidil-karboxipeptidáz enzim részleges jellemzése rágcsáló érfalban illetve emberi pheochromocytoma -szövetben. Természetes ópioid peptideket hasitó peptidázok vizsgálata során észleltem egy újtipusú dipeptidil-karboxipeptidáz jelenlétére utaló hasitási módot nyúlfül-a rtéria idegelemeiben (39, 59, 69, 70) és emberi pheochromocytoma szövetben (64). ?
Az enzim szubsztrátjai azok a peptidek, melyeknek C-terminálisán -RF (mint a (Met5)-enkefalin-Arg 7,Phe 7 heptapeptidben) (39, 59, 64, 69, 70), -RY (mint az atriális natriuretikus peptidben) vagy--FR (mint a bradikininben) szekvencia található (39, 47, 59, 64).
?
Az enzim metallopeptidáz, mert muködése EDTA-val gátolható (64).
?
Aktiv centruma valószinuleg különbözik a „termolizin-szeru” peptidázokétól, mert muködését N-foszforil-Arg,Phe nem gátolta.
?
Különbözik az angiotenzin-konvertáló enzimtol, mert nem hasitja az angiotenzin I-et (46, 47, 59) és muködését az ACE gátló captopril csak igen magas koncentrációban (farmakológiailag >10-5 M, biokémiailag -6
>10 M, nem kompetitiv módon) gátolja (59, 64, 69). ?
Különbözik a neutrális endopeptidáztól, mert a NEP hasitási helyspecificitása különbözo és muködését a NEP-inhibitor thiorphan nem gátolja (59).
?
Különbözik a "PDP-3" jelu patkányagyi dipeptidil-karboxipeptidáztól (12), mert nem hasitja a HHL szintetikus szubsztrátot és captopril gyengén illetve thiorphan egyáltalán nem gátolja (59, 64).
10
6. Fejezet. Kiemelkedoen szelektiv, újtipusú d-opioid receptor- és szelektiv ?opioid receptorantagonista peptidek tervezése és farmakológiai hatáselemzése Az un. „address and message” elmélet elveit követve az újtipusú d-opioid receptor-szelektiv antagonisták kifejlesztése céljából a következo tervezési stratégia szerint jártam el: ?
Ha az N-terminális Tyr-Pro-motivumhoz közvetlenül vagy Gly „térelem” közbeiktatásával d-receptor „address” szekvenciákat (-LeuPhe, -Leu-Phe-Thr vagy -Leu-Phe-Thr(OtBu)) kapcsolunk és megfelelo t
N-szubsztituenseket (N BOC- vagy N,N-diallil) alkalmazunk, elvileg jó affinitású, „tiszta” (agonista hatás minimuma) kompetitiv d-opioid receptoratagonistákat állithatunk elo, csaknem abszolút receptortipus szeklektivitás biztositása mellett ( 2551/91 (23571) jelu magyar szabadalom; 56-58, 65-68). ?
t
Mivel az N,N-diallil- és N BOC-szubsztituált aktiv szekvenciák hasonló farmakológiai hatásúak voltak, úgy tunik, hogy ezeknél a hatóanyagoknál a nitrogén protonáltsági állapota közömbös a receptoriális kötodés szempontjából.
?
A legkiemelkedobb farmakológiai sajátságú peptidantagonista, a N tBOC-Tyr-Pro-Gly-Phe -Leu-Thr(OtBu) d-opioid receptoron mért Ke értéke a 30 -40 nM tartományba esett és d vs. µ illetve d vs. ? szelektivitása nagyobb, mint 5,000-szeres volt (68).
?
Egy II tipusú ß-turn konformáció a farmakológiai hatás elofeltétele, valószinuleg azért, mert ez biztosit megfelelo térállást a re ceptoriális kötodés szempontjából kulcsfontosságú N- illetve C-terminális szerkezeti 1
4
elemek (X-N-Tyr -(Pro)- és –Phe -Y) számára (28, 56, 57, 67). ?
A fülöp-szigeti kobraméregben eloforduló Tyr-Lys-Lys-Trp-Trp szekvencia alapján közepes affinitású, tiszta és kompetitiv ?-opioid receptorantagonistákat állitottunk elo az alapszerkezet szisztematikus módositásával, különös tekintettel az N-szubsztituensre (41-43, 65). 11
?
A sikeresnek tekintheto származékok az N-acetil- és N,N-diallil-Tyr-LysLys-Trp-Trp-NH2 voltak a pentapeptid-sorozatban illetve N tBOC-TyrLys-Trp-Trp-NH2 és -Tyr-Arg-Trp-Trp-NH2 a tetrapeptid-sorozatban. Ezen peptidantagonisták ?-opioid receptoron mért Ke értékei az alacsony- közepes mikromoláris tartományba estek, és ? vs. µ szelektivitásuk 8-20-szoros volt.
?
Fenti sorozatban kedvezobb hatástani mutatók is elérhetok megfelelo továbbfejlesztéssel, kisérleteinkben csupán a lényegesebb fejlesztési irányokat tuztük ki.
?
Mindkét szerkezeti csoportban a legjelentosebb újitásnak számitó elem az N-acilálás bevezetése, mely nem teszi lehetové az N-protonációt (ez a korábbi tankönyvi „dogma” szerint az opioid receptoriális kötodés egyik alapfeltétele). Úgy tünik, hogy a nitrogén protonáltsági állapota mindkét szerkezeti csoportban közömbös tényezo a receptoriális kötodés szempontjából. Köszönetnyilvánitás
Szeretném kifejezni mély hálám Magyar Kálmán Professzor Úrnak, a Magyar Tudományos Akadémia rendes tagjának azért a megtiszteltetésé rt, hogy elvállalta a disszertáció témavezetoi tisztét. Lekötelezettje vagyok továbbá Gyires Klára Professzorasszonynak, aki tapintatos, de kitartó indukciót adott a disszertáció elkészitéséhez.
Mindenekfe lett, szeretném megköszönni barátomnak, Bajusz Sándor cimzetes egyetemi tanárnak mindazt, amit közös munkák során adott. Magasfokú intellektuális öröm volt maga a közös munka is; mindaz, amit a peptidek tervezésérol tudhatok, Tole tanultam. Nagy öröm ismerni egy
12
olyan kiváló kutatót, aki mindenkor telve van eredeti ötletekkel, s emellett egy kedves, igen becsületes ember is; ritka kombinációja ez az emberi értékeknek manapság a szakmában. Az együttmuködok –remélhetoleg teljes- névsorát a disszertáció végén adtam meg. Elnézést kérek azoktól, akik az emberi emlékezet gyarlósága miatt esetleg kimaradtak a felsorolásból.
Irodalomjegyzék 1.
Bajusz, S., Patthy, A., Kenessey, Á., Gráf, L., Székely, J.I., Rónai, A.Z. : Is there correlation between analgesic potency and biodegradation of enkephalin analogs? Biochem. Biophys. Res. Commun. 84, 1045-1053, 1978.
2.
Bajusz, S., Rónai, A.Z., Székely, J.I. Miglécz, E., Berzétei, I.: Further enhancement of analgesic activity: enkephalin analogs with terminal guanidine group. FEBS Lett. 110, 85-87, 1980a.
3.
Bajusz, S., Rónai, A.Z., Székely, J.I., Dunai-Kovács, Zs., Berzétei, I., Gráf, L. Enkephalin analogs with enhanced opiate activity. Acta Biochim. Biophys. Acad. Sci. Hung. 11, 305-309, 1976.
4.
Bajusz, S., Rónai, A.Z., Székely, J.I., Gráf, L., Dunai-Kovács, Zs., Berzétei, I. A superactive antinociceptive pentapeptide, ?D-Met2,Pro 5?-enkephalinamide. FEBS Lett. 76, 91-92, 1977.
5.
Bajusz, S., Rónai, A.Z., Székely, J.I., Turán, A., Juhász, A., Patthy, A., Miglécz, E., Berzétei, I. Enkephalin analogs containing amino sulfonic acid and amino phospnonic acid residues at position 5. FEBS Lett. 117, 308-310, 1980b.
6.
Beckett A.H., Casy A.F. Synthetic analgesics: stereochemical considerations. J. Pharm. Pharmacol. 6, 986-999, 1954.
7.
Bradbury A.F., Smyth D.G., Snell C.R., Birdsall N.J.M., Hulme E.C. C fragment of lipotropin has a high affinity for brain opiate receptors. Nature 260, 793-795, 1976.
13
Formázott: Felsorolás és számozás
8.
Brantl V., Gramsch C., Lottspeich F., Henschen A., Jaeger K.-H., Herz A. Novel opioid peptides derived from mitochondrial cytochrome b: cytochrophins. Eur. J. Pharmacol. 111, 293-294, 1985.
9.
Brantl V., Gramsch C., Lottspeich F., Mertz R., Jaeger K.-H., Herz A. Novel opioid peptides derived from hemoglobin: hemorphins. Eur. J. Pharmacol. 12, 309 -310, 1986.
10. Brantl V., Teschemacher H., Henschen A., Lottspeich F. Novel opioid peptides derived from casein (ß-casomorpohins) I. Isolation from bovine casein peptone. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 360, 1211-1216, 1979. 11. Comb M., Seeburg P. H., Adelman J., Eiden L., Herbert E. Primary structure of the human Met- and Leu-enkephalin precursor and its mRNA. Nature 295, 663-666, 1982. 12. Cushman D.W., Gordon E.M., Wang F.L., Cheung H.S., Tung R., Delaney N.G. Purification and characterization of enkephalinase, angiotensin converting enzy me, and a third peptidyldipeptidase from rat brain. Life Sci. 33, Suppl. I., 25-28, 1983. 13. Erchegyi J., Kastin A.J., Zadina J.E. Isolation of a novel tetrapeptide with opiate and antiopiate activity from human cortex: Tyr-Pro-Trp-Gly-NH2 (Tyr-W -MIF-1). Peptides 13, 623-631, 1992. 14. Erspamer V., Melchiorri P. Amphibian skin peptides and mammalian neuropeptides. I n: Growth hormone and other biologically active peptides (Pecile A., Müller E.E., eds.) Excerpta Medica, New York, pp. 185-200, 1980. 15. Erspamer V., Melchiorri P., Falconieri.Erspamer G., Negri L., Corsi R., Severini C., Barra D., Simmaco M., Kreil G. Deltorphins: A family of naturally occurring peptides with high affinity and selectivity for d opioid binding sites. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 5188-5192, 1989. 16. Evans C.J., Keith D.E. Jr., Morrison H., Magendzo K., Edwards R.H. Cloning of a delta opioid receptor by functional expression. Science 258, 1952-1955, 1992. 17. Gilbert P.E., Martin W.R. The effects of morphine- and nalorphine-like drugs in the nondependent, morphine-dependent and cyclazocine-dependent chronic spinal dog. J. Pharmacol. Exp. Ther. 198, 66-82, 1976. 18. Goldstein A., Tachibana S., Lowney L.I., Hunkapiller M., Hood L. Dynorphin -(1 -13), an extraordinarily potent opioid peptide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76, 6666 -6670, 1979.
14
19. Gráf L., Cseh G., Barát E., Rónai A.Z., Székely J. I., Kenessey Á., Bajusz S.: Structure-function relationships in lipotropins. Annals of N.Y. Acad. Sci. 297, 63-83, 1977a. 20. Gráf L., Hollósi M., Patthy A., Berzétei I., Rónai A.Z. Decrease of ? -helix potential and biological activity of ?-endorphin in response to modifications of Met5. Neuropeptides 1, 47-51, 1980. 21. Gráf L., Horváth K., Walcz E., Berzétei I., Burnier J. Effect of two synthetic a gliadin peptides on lymphocytes in celiac disease: Identification of a novel class of opioid receptors. Neuropeptides 9, 113-122, 1987. 22. Gráf L., Kenessey Á., Bajusz S., Pathy A., Rónai A.Z., Berzétei I.: Proteolytic processing in the biosynthesis and metabolism of endorphins. In: Endorphins in mental health research (Usdin E. ed.) MacMillan Press, London, pp. 189-202, 1978. 23. Gráf L., Kenessey Á., Berzétei I., Rónai A.Z. Demonstration of ? -lipotropin activating enzyme in porcine pituitary. Biochem. Biophys. Res. Commun. 78, 1114-1123, 1977b. 24. Gráf L., Kenessey Á., Rónai A.Z., Patthy A., Székely J.I., Bajusz S. Release and biodegradation of endorphins in the pituitary and the brain. In: Mechanisms, regulation and special functions of protein synthesis in the brain(ed: Roberts et al.Elsevier, Amsterdam) pp. 373-381, 1977c. 25. Gráf L., Rónai A.Z., Bajusz S., Cseh G., Székely J.I. Opioid agonist activity of ?-lipotropin fragments: a possible biological source of morphine-like substances in the pituitary.FEBS Lett. 64, 181-184, 1976a. 26. Gráf L., Székely J.I., Rónai A.Z., Dunai-Kovác, Zs., Bajusz S. Comparative study on analgesic effect of met-enkephalin and related lipotropin fragments. Nature 263, 240-242, 1976b. 27. Hollósi M., Dobolyi Z., Bajusz S. CD studies on enkephalin and its Pro5 -analogs. FEBS Lett. 110, 136-140, 1980. 28. Hollósi M., Majer Zs., Rónai A.Z., Magyar A., Medzihradszky K., Holly S., Perczel A., Fasman G.D. CD and Fourier transform IR spectroscopic studies of peptides. II. Detection of ß-turns in linear peptides.Biopolymers 34, 177-185, 1994. 29. Hughes J., Smith T.W., Kosterlitz H.W., Fothergill L.A., Morgan B.A., Morris H.R. Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity. Nature 258, 577-579, 1975
15
30. Kakidani H., Furutani Y., Takahashi H., Noda M., Morimoto Y., Hirose T., Asai M., Inayama S., Nakanishi S., Numa S. Cloning and sequence analysis of cDNA for porcine ß-neo-endorphin/dynorphin precursor. Nature 298, 245-249, 1982. 31. Kangawa K., Matsuo H., Igarashi M. a-neo-endorphin: a "big" Leu-enkephalin with potent opiate activity from porcine hypothalami. Biochem. Biophys. Res. Commun. 86, 153-160, 1979. 32. Kastin A.J., Stephens E., Zadina J.E., Coy D.H., Fischman A.J. Tyr-MIF-1, identified in brain tissue, and its analogs are active in two models o antinociception. Pharmacol. Biochem. Behav. 23, 1045-1049, 1985. 33. Kieffer B.L., Befort K., Gaveriaux-Ruff C., Hirth C.G. The d-opioid receptor: isolation of a cDNA by expression cloning and pharmacological characterization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 12048-12051, 1992. 34. Li C.H., Chung D. Primary structure of human ß -endorphin. Nature 260, 622-624, 1976. Lord J.A.H., Waterfield A.A., Hughes J., Kosterlitz H.W. Endogenous opioid peptides: multiple agonists and receptors. Nature 267, 495-499, 1977. 35. Li C.H., Chung D. Primary structure of human ß -endorphin. Nature 260, 622-624, 1976. 36. Lord J.A.H., Waterfield A.A., Hughes J., Kosterlitz H.W. Endogenous opioid peptides: multiple agonists and receptors. Nature 267, 495-499, 1977. 37. Makó É., Rónai, A.Z. The characterization of kappa and delta opioid receptors in isolated organs by using type/subtype selective agonists and antagonists. Med. Sci. Monitor 7, 350-356, 2001. 38. Martin W.R., Eades C.G., Thompson J.A., Huppler R.E., Gilbert P.E. The effects of morphine- and nalorphine -like drugs in the nondependent and morphine -dependent chronic spinal dog. J. Pharmacol. Exp. Ther. 197, 517-532, 1976. 39. Medzihradszky -Schweiger H., Rónai A.Z., Kátay E., Medzihradszky K. Synthetic substrate- and inhibitor profile of a dipeptidyl-carboxypeptidase in rabbit ear artery. In: Peptides 1994. (Maia H.L.S. ed.), ESCOM, Leiden, pp. 893 -894, 1995. 40. Nakanishi S., Teranishi Y., Noda M., Notake M., Watanabe Y., Kakidani H., Jingami H., Numa S. The protein-coding sequence of the bovine ACTH-ß-LPH precursor gene is split near the signal peptide region. Nature 287, 752-755, 1980.
16
41. Orosz G., Rónai A.Z., Bajusz S., Medzihradszky K. Novel, receptor-type selective tetra- and pentapeptide opioid antagonists, related to a natural sequence found in snake venom. Regulatory Peptides, Suppl. I., S53-54, 1994a. 42. Orosz G., Rónai A.Z., Bajusz S., Medzihradszky K. N-terminally protected penta- and tetrapeptide opioid antagonists based on a pentapeptide sequence found in the venom of Philippine cobra. Biochem. Biophys. Res. Commun. 202, 1285-1290, 1994b. 43. Orosz G., Rónai A.Z., Kátay E., Medzihradszky K. Kappa opioid receptor antagonists. In: Peptides 1994. (ed: Maia, H.L.D., ESCOM, Leiden) pp. 607-608, 1995. 44. Pert C.B., Snyder S.H. Opiate receptor: demonstration in nervous tissue. Science 179, 1011-1014, 1973. 45. Quock R.M., Burkey T.H., Varga E., Hosohata Y., Hosohata K., Cowell S.M., Slate C.A., Ehlert F.J., Roeske W.,. Yamamura H.I The d-opioid receptor: molecular pharmacology, signal transduction, and the determination of drug efficacy. Pharmacol. Rev 51, 503-532. 1999. 46. Rónai A.Z.: Inhibition of neurotransmission by angiotensin I. and II. in rabbit isolated ear artery. Eur. J. Pharmacol. 179, 281-286, 1990. 47. Rónai A.Z. Bradykinin and angiotensin II inhibit neurotransmission in rabbit ear artery by releasing prostanoids. Eur. J. Pharmacol. 198, 93-95, 1991. 48. Rónai A.Z., Berzétei I. Similarities and differences of poioid receptors in different isolated organs. In: Endorphins '78 (eds: Gráf, L., Palkovits, M. and Rónai, A.Z., Publishing House of Hungarian Academy of Sciences, Budapest) pp. 237-257, 1979. 49. Rónai A.Z., Berzétei I., Bajusz S. Differentiation between opioid peptides by naltrexone . Eur. J. Pharmacol. 45, 393-394, 1977a. 50. Rónai A.Z., Berzétei I., Székely J. I., Gráf L., Bajusz S. Kinetic studies in isolated organs: tools to design analgesic peptides and to analyze their receptor effects. Pharmacology 18, 18-24, 1979a. 51. Rónai A.Z., Berzétei I., Székely J.I., Bajusz S. The effects of synthetic and natural opioid peptides in isolated organs. In: Characteristics and function of opioids (eds.: Van Ree, J.M. and Terenius, L., Elsevier, Amsterdam) pp. 493-494, 1978. 52. Rónai, A.Z., Berzétei I.P., Bajusz S., Székely J.I. The in vitro pharmacology of D-Met 2, Pro5-enkephalinamide. J. Pharm. Pharmacol. 33, 534-535, 1981a.
17
53. Rónai A.Z., Berzétei I.P., Kurgyis J. Opioid effects in developing rat vas deferens.Cell. Mol. Neurobiol. 1, 335-342, 1981b. 54. Rónai A.Z., Berzétei I.P., Kurgyis J. Postnatal development of opioid mechanisms in rat vas deferens. In: Advances in endogenous and exogenous opioids (eds: Takagi H., Simon E.J., Elsevier, Amsterdam) pp. 57-59, 1981c. 55. Rónai A.Z., Berzétei I.P., Székely J. I., Miglécz E., Kurgyis J., Bajusz S. Enkephalin-like character and analgesia. Eur. J. Pharmacol. 69, 263-271, 1981d. 56. Rónai A.Z., Botyánszki J., Hepp J., Magyar A., Borsodi A., Hollósi M., Medzihradszky K. Novel, delta opioid receptor-selective peptide antagonists: the demonstration of a possible opioid interaction in the absence of a protonated nitrogen. Neuropeptides 22, p. 58, 1992a. 57. Rónai A.Z., Botyánszki J., Hepp J., Medzihradszky K. A novel opioid structure which accepts protonated as well as non-protonated nitrogen: a family of pure, delta receptor selective antagonists. Life Sci. 50, 1371-1378, 1992b. 58. Rónai A.Z., Botyánszki J., Magyar A., Borsodi A., Benyhe S., Medzihradszky K. Novel ?-opioid receptor selective peptide antagonists: demonstration of a possible opioid interaction in the absence of a protonated nitrogen and attempts to locate the protonated nitrogen site. Arch. int. Pharmacodyn. 323, 114-125, 1993a. 59. Rónai A.Z., Fehér E., Botyánszki J., Hepp J., Magyar A., Medzihradszky K. Substrate- and inhibitor-specificity of a non-endothelial enzyme which forms ?Met5? -enkephalin from ?Met5?-enkephalin-Arg 6, Phe 7 in isolated rabbit ear artery: pharmacological characterization. Neuropeptides 28, 137-145, 1995a. 60. Rónai A.Z., Földes F.F., Hahn E.F., Fishman J. Orientation of the oxygen atom at C-6 as a determinant of agonistic activity in the oxymorphone series. J. Pharmacol. Exp. Ther. 200, 496-500, 1977b. 61. Rónai A.Z., Gráf L., Székely J.I., Dunai-Kovács Zs., Bajusz S. Differential behaviour of LPH-(61-91)-peptide in different model systems: comparison of the opioid activities of LPH-(61-91)-peptide and its fragments. FEBS Lett. 74, 182-184, 1977c.. 62. Rónai A.Z., Gyires K., Schmidhammer H., Hosztafi S., Borsodi A., Spetea M., Friedmann T., Riba P., Fürst S. In vitro and in vivo pharmacology of novel, naltrindole -related compounds. Med. Sci. Monitor. 3, 1-5, 1997b. 63. Rónai A.Z., Hársing L.G., Berzétei I.P. Bajusz S., Vizi E.S. ?Met 5?-enkephalin -Arg 6 -Phe7 acts on vascular opiate receptors. European J. Pharmacol. 79, 337-338, 1982.
18
64. Rónai A.Z., Lengyel J., Nagy T., Orosz G., Adlesz V., Rácz K., Magyar K. Hip-Arg -P Phe-, Hip -Phe-Arg- and Hip -His -Leu- cleaving dipeptidyl-carboxypeptidases in human adrenal tumors. Neuropeptides 31, 585-588, 1997b. 65. Rónai A.Z., Magyar A., Botyánszki J., Orosz G., Blahunka A., Medzihradszky K. Two families of novel, receptor-type selective antagonists: what do they tell us? Regulatory Peptides, Suppl. I., S57-58, 1994. 66. Rónai A.Z., Magyar A., Medzihradszky K. Kinetic parameters of antagonism by the delta opioid receptor selective peptide antagonist Boc-Tyr -Pro -Gly-Phe-Leu-Thr against selective and non-selective agonists in the mouse vas deferens. Neuropeptides 25, 127-129, 1993b. 67. Rónai A.Z., Magyar A., Orosz G., Blahunka A., Kátay E., Mak M., Majer-Decker Zs., Sohar P., Hollósi M. Receptor-related conclusions drawn from the actions of type -selective opioid antagonists and novel Tyr-D-Pro-derivatives. Med. Sci. Monitor 1, Suppl. I, 19-20, 1995b. 68. Rónai A.Z., Magyar A., Orosz G., Borsodi A., Benyhe S., Tóth G., Makó É., Kátay E., Babka E., Medzihradszky K. The opioid antagonist properties of highly ?-receptor selective BOC-Tyr-Pro-Gly-Phe-Leu-Thr(OtBu) peptide and its Phe1 and Mel1 analogues. Arch. Int. . Pharmacodyn. 330, 361-369, 1995c. 69. Rónai A.Z., Serfozo P., Hársing L. G. Jr., Vizi E.S. The conversion of met-enkephalin -Arg 6, Phe 7 to met-enkephalin in rabbit ear artery. Life Sci. 33, Suppl. I 101-104, 1983. 70. Rónai A.Z., Serfozo P., Hársing L.G., Vizi E.S. The effect of captoprill on the presynaptic inhibitory action of met -enkephalin-Arg 6, Phe7 in isolated organs. In: Regulation of transmitter function: basic and clinical aspects. (eds: Vizi, E.S., Magyar, K., Publishing House of Hungarian Academy of Sciences, Budapest) pp. 265-268, 1984. 71. Rónai A.Z., Székely J.I., Berzétei I., Miglécz E., Bajusz S. Tetrapeptide-amide analogues of enkephalin: the role of C-terminus in determining the character of opioid activity. Biochem. Biophys. Res. Commun. 91, 1239-1249, 1979b. 72. Rónai A.Z., Székely J.I., Gráf L., Dunai-Kovács Zs., Bajusz S. Morphine-like analgesic effect of a pituitary hormone, ?-lipotropin. Life Sci. 19, 733-738, 1976. 73. Rónai A.Z., Timár J., Makó É., Erdo F., Gyarmati Zs., Tóth G., Orosz Gy., Fürst S., Székely J.I. Diprotin A, an inhibitor of dipeptidyl aminopeptidase IV (EC 3.414.5) produces naloxone reversible analgesia in rats. Life Sci. 64, 145-152, 1998/99
19
74. Simon E.J., Hiller J.M., Edelman I. Stereospecific binding of the potent narcotic analgesic [3 H] etorphine to rat brain homogenate. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 70, 1947 -1949, 1973. 75. Soós J., Berzétei I., Bajusz S., Rónai A.Z. Correlation between circular dichroism data and biological activities of 2,5 substituted enkephalin analogues. Life Sci. 27, 129-133, 1980. 76. Székely J.I., Dunai-Kovács Zs., Miglécz E., Rónai A.Z. , Bajusz S. In vivo antagonism by naloxone of morphine, ?-endorphin and a synthetic enkephalin analog. J. Pharmacol. Exp. Ther.207, 878-883, 1978. 77. Székely J.I., Rónai A.Z., Dunai-Kovács Zs., Gráf L., Bajusz S. C-terminal fragment (residues 61-91) of ?-lipotropin: is it the natural opiate-like neurohormone of the brain? Experientia 33, 54-55, 1977a. 78. Székely J.I., Rónai A.Z., Dunai-Kovács Zs., Miglécz E., Bajusz S., Gráf L. Cross tolerance between morphine and ? -endorphin in vivo. Life Sci. 20, 1259-1264, 1977b. 79. Székely J.I., Rónai A.Z., Dunai-Kovács Zs., Miglécz E., Berzétei I., Bajusz S., Gráf L. ?D-Met2,Pro5?-enkephalinamide: a potent morphine -like analgesic. Eur. J. Pharmacol. 43, 293-294, 1977c. 80. Terenius L. Stereospecific interaction between narcotic analgesics and a synaptic plasma membrane fraction of rat cerebral cortex. Acta Pharmacol. Toxicol. 32, 317 -320, 1973. 81. Uhl G.R., Childers S., Pasternak GW. An opiate-receptor gene family reunion. Trends in Neurosci. 17, 89-93, 1994. 82. Zadina J.E., Hackler L., Ge L.J., Kastin A.J. A potent and selective endogenous agonist for the ? -opiate receptor. Nature 386, 499-502, 1997. 83. Zaki P.A., Bilsky E.J., Vanderah T.W., Lai J., Evans C.J, Porreca F.Opioid receptor types and subtypes: The ? receptor as a model. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 36, 379-401, 1996.
Szabadalmak Bajusz S., Rónai A., Székely J., Gráf L., Mohai L. Eljárás morfin-szeru hatással rendelkezo pentapeptidek és származékaik eloállitására. Magyar szabadalom GO-1350/76; Pentapeptides and process for their preparation (covering 20
(D- Met2 ,Pro 5 NH2 ) -enkephalin). Belgian patent No. 858453. US patent 4465625/1984. Bajusz S., Rónai A., Székely J. Eljárás új enkefalin-származékok eloállitására. Magyar szabadalom 178 004(GO-1448/1979), 1985. Bajusz S., Rónai A., Székely J. Eljárás új enkefalin analógok eloállitására. Magyar szabadalom 181 013 (155/80), 1987. Rónai A., Botyánszki J., Hepp J., Medzihradszky K., Borsodi A. Eljárás uj opioid receptorantagonista penta- és hexapeptidszármazékok eloállitására. Magyar szabadalom 2551/91 (23571), 1991.
21
