Az alvásdepriváció hatása a patkány agykérgének és thalamusának fehérjekészletére

Az alvásdepriváció hatása a patkány agykérgének és thalamusának fehérjekészletére Diplomamunka Biológus mesterszak Idegtudomány és Humánbiológia szakirány

Készítette: Györffy Balázs András

Témavezető: Dr. Kékesi Adrienna Katalin, egyetemi docens Eötvös Loránd Tudományegyetem, Biológiai Intézet, Proteomikai Csoport

EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI INTÉZET

Budapest, 2012.

Tartalomjegyzék 1. Rövidítésjegyzék ................................................................................................................... 2 2. Bevezetés ............................................................................................................................... 3 3. Irodalmi áttekintés ............................................................................................................... 4 3.1. Hipotézisek az alvás biológiai funkcióiról a központi idegrendszer működésében ........ 4 3.1.1. Az alvás homeosztatikus szerepe .............................................................................. 5 3.1.2. Memóriakonszolidáció az alvás során ...................................................................... 9 3.1.3. A különböző alvási fázisok jelentősége a memórianyomok megerősítésében és a plaszticitásban ................................................................................................................... 10 3.2. Molekuláris szintű változások az alvás és ébrenlét során, valamint alvásmegvonás hatására ................................................................................................................................. 13 4. A diplomamunka célkitűzései ........................................................................................... 15 5. Anyagok és módszerek ....................................................................................................... 16 5.1. A felhasznált anyagok listája ......................................................................................... 16 5.2. Az alvásdepriváció kivitelezése..................................................................................... 17 5.3. A szinaptoszóma preparátum elkészítése ...................................................................... 18 5.4. A teljes szöveti minta feldolgozása ............................................................................... 18 5.5. Proteomikai vizsgálat 2D-DIGE technikával ................................................................ 18 5.6. Fehérjefunkciók meghatározása .................................................................................... 23 6. Az eredmények és megvitatásuk ....................................................................................... 23 6.1. Az eredmények közlése ................................................................................................. 23 6.2. A proteomikai megközelítés és módszertan előnyei, valamint korlátai ........................ 35 6.3. Az azonosított fehérjék sejtes funkciói .......................................................................... 36 6.4. Az eredmények értelmezése a különböző vizsgálati szituációk alapján ....................... 49 7. Következtetések .................................................................................................................. 57 8. Összefoglalás ....................................................................................................................... 59 9. Summary ............................................................................................................................. 60 10. Hivatkozások..................................................................................................................... 61 11. Köszönetnyilvánítás ......................................................................................................... 82

1

1. Rövidítésjegyzék 2D-DIGE: two-dimensional differential in-gel electrophoresis ACSF: artifical cerebrospinal fluid (mesterséges agy-gerincvelői folyadék) AMPA: α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole propionic acid Arc:

activity-regulated

cytoskeleton-associated

protein

(akitivitás-regulált

sejtvázhoz

asszociált fehérje) ATP: adenosine triphosphate (adenozin-trifoszfát) BDNF: brain-derived neurotrophic factor (agyi eredetű neurotróp faktor) CA1: cornu Ammonis cAMP: cylic adenosine monophosphate (ciklikus adenozin-monofoszfát) CHAPS: 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate CREB: cAMP response element-binding protein (cAMP-reszponzív elemet kötő fehérje) Cy: cyanine EEG: electroencephalogram (elektroenkefalogram) EMG: electromyogram (elektromiogram) ERK: extracellular-signal-regulated kinase (extracelluláris jel-regulált kináz) GABA: gamma-aminobutyric acid (gamma-aminovajsav) GDP: guanosine diphosphate (guanozin-difoszfát) GluR1: glutamate receptor 1 (glutamát receptor-1) GTP: guanosine triphosphate (guanozin-trifoszfát) HEPES: (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) I.p.: intraperitoneális LTD: long-term depression (hosszútávú szinaptikus hatékonyság-csökkenés) LTP: long-term potentiation (hosszútávú szinaptikus hatékonyság-fokozódás) MAPK: mitogen-activated protein kinase (mitogén-aktiválta protein kináz) mEPSC: miniature excitatory postsynaptic current (miniatűr serkentő posztszinaptikus áram) mGluR: metabotropic glutamate receptor (metabotróp glutamát receptor) mRNS: messenger ribonukleinsav MS: mass spectrometry (tömegspektrometria) NA: noradrenalin NHS: N-Hydroxysuccinimide NMDA: N-Methyl-D-aspartate NR1: NMDA receptor 1 2

NR2: NMDA receptor 2 NR2B: NMDA receptor 2B PDE4: phosphodiesterase 4 (foszfodiészteráz-4) PGO: ponto-geniculo-occipitalis PKA: protein kinase A (protein kináz-A) PVDF: polyvinylidene difluoride REM: rapid eye movement (gyors szemmozgásokkal jellemezhető alvás) SDS: sodium dodecyl sulfate SNARE: soluble NSF-attachment receptor (szolubilis NSF-kötő receptor) SWS: slow wave sleep (lassú hullámú alvás) TEMED: Tetramethylethylenediamine Tris: tris(hydroxymethyl)aminomethane zif-268: zinc finger protein-268 (cink-ujj fehérje-268) A vizsgálat során azonosított fehérjékhez tartozó génkódok jelentése az 1-4. táblázatokban, illetve a 6.3. fejezetben olvasható.

2. Bevezetés Az állatvilágban elterjedten jellemző, hogy az alvás és ébrenlét periodikus váltakozása a szervezet normális működésének egyik alapvető feltétele. Az alvás agyi folyamatokra gyakorolt hatásának megértése fontos lehet a központi idegrendszerben zajló élettani mechanizmusok kutatásában. Az alvásra jellemző jelenségek vizsgálata több megközelítés szerint lehetséges. A neurokémiai, neurofiziológiai kutatások révén ma már sok adat ismert többek között az extracelluláris térben ható faktorok, és neurotranszmitterek hatásairól (Friedman és Walker, 1969; Krueger és mtsai, 1999a; de Lecea és Sutcliffe, 2005; Fiske és mtsai, 2006; Kalia, 2006; Zeitzer és mtsai, 2006), vagy például az agyterületekre és alvásfázisokra specifikus, elektrofiziológiai technikákkal detektálható idegrendszeri jelenségekről (Diekelmann és Born, 2000; Tinguely és mtsai, 2006). Egyre több információ lát napvilágot az alvás-ébrenléti ciklus különböző fázisaira jellemző intracelluláris, illetve sejtfelszínen zajló molekuláris mechanizmusokról (lásd: a 3.2. fejezetben). A specifikusan az alvás során zajló jelenségek megismeréséhez összehasonlíthatjuk alvásában nem akadályozott és alvásdeprivációt elszenvedő élőlények valamely jellemzőit – vizsgálatunkban a proteom komponenseit. A fehérjekészletben történt változások a 3

sejtműködés módosulásáról nyújthatnak fontos információkat számunka, mivel a proteinek a celluláris folyamatok és funkciók kivitelezésében játszanak szerepet. A rendszerbiológiai megközelítést használó proteomikai vizsgálatok célja a lehetőségekhez képest legtöbb fehérje detektálásának, és esetleges expresszió-változásainak, vagy poszttranszlációs módosulásaiknak kimutatása. E módszerek alkalmazásával hatékonyan bővíthetjük ismereteinket különböző betegségekre jellemző molekuláris markerekről, vagy beavatkozások

hatására

specifikusan

megváltozó

fehérje-hálózatokról.

A

kutatások

eredményei későbbi vizsgálatok új molekuláris célpontjainak kijelölésére is használhatóak. A diplomamunkában az alvás teljes, 8 órán keresztül tartó meggátlásának hatását vizsgáltam patkányok különböző agyterületeinek fehérjekészletére.

3. Irodalmi áttekintés Ahhoz, hogy értelmezni tudjuk az alvás, illetve az alvásmegvonás hatására jelentkező molekuláris különbségeket, ismernünk kell az alvásra specifikus folyamatokat, és ezek feltételezett biológiai szerepét. Ebben a fejezetben ezeknek a funkcióknak és jelenségeknek a tárgyalása olvasható. 3.1. Hipotézisek az alvás biológiai funkcióiról a központi idegrendszer működésében Az alvás az állatok között széles körben elterjedt jelenség, amelynek így minden bizonnyal megkerülhetetlen szerepe van az élő szervezet működésében (Cirelli és Tononi, 2008). Bár pontos biológiai funkciói ma sem teljesen ismertek, sok vizsgálati eredmény született az alvás alatt zajló folyamatokról a szervezet egészének szintjétől kezdve a neuronok közötti szinapszisokig. A központi idegrendszerben a tartós működéshez elengedhetetlen homeosztatikus szabályozásban játszhat komoly szerepet az alvás. Az energia-háztartás befolyásolása mellett, az élő rendszert alkotó komponensek alvás alatt zajló, mennyiségi és minőségi szabályozása is nélkülözhetetlen lehet a hosszútávon fenntartható működéshez. A szervezet környezethez való alkalmazkodásához szükséges idegrendszeri plaszticitásban szintén kiemelten fontos funkciót feltételeznek az alvásnak. Ez utóbbi leginkább az alváshoz kapcsolt memóriakonszolidáció jelenségéből ismert. Az alábbiakban az alvás homeosztázisban és neuronális plaszticitásban játszott szerepét alátámasztó szakirodalmi adatok olvashatóak. 4

3.1.1. Az alvás homeosztatikus szerepe Az alvás homeosztatikus funkciója az aktív idegi működés által produkált fokozott energetikai szükséglet kompenzálásában lehet elsősorban fontos. Az éber állapothoz képest csökkent energiafelhasználás mutatkozik az úgynevezett lassú hullámú alvás során, amelynek jelenléte a tartós működés fenntartásához így nélkülözhetetlen (Maquet, 1995). Az alvás energiaháztartásban játszott szerepének interpretációjakor elsősorban a lassú hullámú alvást is magában foglaló nem-REM fázist emelik ki a szakirodalomban. A REM-szakasz idején ezzel szemben fokozott energiafelhasználás mutatható ki (Zhang és mtsai, 2007; Mignot, 2008). E két alvási szakasz néhány jellemzője látható az 1. ábrán.

5

1. ábra: Az alvási szakaszok, és a különböző fázisokra, illetve agyi struktúrákra jellemző, neurofiziológiai módszerekkel mérhető paraméterek. a.) A REM (REM sleep =„rapid eye movement sleep”, vagy paradox alvás) és nem-REM szakaszokkal jellemezhető, embernél kimutatható alvási struktúra. A nem-REM fázis szakaszai közé tartozik a feltüntetett lassú hullámú alvás (SWS sleep =„slow wave sleep”). b.) A nem-REM stádiumra jellemző lassú oszcillációk (agykérgi aktivitás eredménye), orsók (thalamocorticalis eredetűek) és éles-hullámú fodrok (a hippocampusban detektálhatóak), valamint a REM alvásban mérhető PGO-hullámok (agytörzsi eredetűek) és a theta-aktivitás (elsősorban a hippocampusban mérhető bizonyos fajoknál) specifikus megjelenési formái. c.) Különböző neuromodulátorok extracelluláris koncentrációjának változása a két fő alvási szakaszban. d.) A mezőpotenciál mérése során detektálható szinkronizált idegi működés, és az egysejt-aktivitás követésekor látható aktív (depolarizált) és inaktív (hiperpolarizált) állapot bemutatása (Diekelmann és Born, 2010, nyomán). 6

A csökkent energiafelhasználást kimutató vizsgálatokkal szemben a nem-REM fázisában az éber állapotban mérthez képest fokozott fehérjeszintézist írtak le több agyterületen is (Ramm és Smith, 1990; Nakanishi és mtsai, 1997), ami sejtszinten egyfajta hibajavító funkciót tölthet be. A fehérjék szintéziséhez szükséges proteinek átírásában bekövetkező növekedést mutattak ki alvás során egy génexpressziós változásokat vizsgáló munkában, ami szintén a fokozott bioszintetikus mechanizmusokat támasztja alá (Mackiewicz és mtsai, 2007). Feltételezések szerint a lassú hullámú alvás játssza a legfontosabb szerepet az alvás homeosztatikus funkciójában, már csak azért is, mivel mennyisége pozitívan korrelál a megelőző ébrenlét, illetve az alvásmegvonás hosszával (Borbély, 2001). Az alvási fázisok arányainak globálisan tapasztalt változása mellett lokális módosulásokat is kimutattak. Egy vizsgálatban jellemzően a nem-REM alvási stádiumok mennyiségének növekedését írták le a szomatoszenzoros kéreg specifikusan stimulált területén a beavatkozást követő alvás során (Vyazowskiy és mtsai, 2000). Ébren tartott patkányok bizonyos agykérgi neuronpopulációi az alvásmegvonás során úgynevezett „kikapcsolt” állapotba kerülnek, a helyileg mért EEG-n lassú hullámú aktivitás jelentkezik (Vyazowskiy és mtsai, 2011). Feltételezik, hogy a viselkedésbeli és elektrofiziológiai jellemzők alapján beazonosítható alvás akkor következik be, amikor elegendő számú – információ-feldolgozó tevékenysége révén megváltozott működésű – neuroncsoport mutat szinkronizált aktivitást (Krueger és mtsai, 1999b). A homeosztázist kiemelő hipotézis egyik fontos eleme a szinaptikus transzmisszió alvás-ébrenléti ciklusban váltakozó erősödése, illetve gyengülése (Tononi és Cirelli, 2006). A környezettel való interakció az ébrenlét során folyamatos információ-fogadást és feldolgozást is jelent, amely a processzáló neuronális hálózatokban általánosan a szinapszisok megerősödéséhez vezet (Tononi és Cirelli, 2003). Az alvás során folyamatos csökkenés tapasztalható a lassú hullámú alvás oszcillációjának amplitúdójában. A jelenség magyarázata a szinaptikus kapcsolatok alvás alatti fokozatos gyengülés lehet, ami a neuronális hálózatokban mért szinkronizált aktivitás csökkenéséhez, sejtszinten pedig az egyes neuronok membránpotenciáljában kimutatható oszcilláció redukciójához vezet (Esser és mtsai, 2007). A hipotézist a 2. ábra mutatja be.

7

2. ábra: A szinaptikus homeosztázis hipotézisének bemutatása. Az ébrenlét idején (sárga háttéren) történő tanulási mechanizmusok révén bizonyos szinapszisok megerősödnek: az ábrán a kiindulási állapotra jellemző 100-as értékről 150-es értékre nő a szinaptikus erősséget jelző mutató. Emellett új szinapszisok is kialakulhatnak: egy új, 5-ös értékkel bíró szinapszis jön létre az éber állapot végére. Mindehhez a neurotranszmitterek és neuromodulátorok megfelelő extracelluláris koncentrációja szükséges (az ábrán: NA=noradrenalin). A felvázolt folyamatok energia- és térigényesek, ezért ezt az állapotot felváltja az alvás (kék háttéren). A kezdetben általánosan hatékony szinaptikus átvitel a lassú hullámú oszcillációk során egyre csökken (a 100-as értékkel jellemezhető szinaptikus erősség 80-ra csökken, míg a 150-es 120-ra). A mindenhol egyforma arányú csökkenés kiemeli a hatékonyabban működő szinapszisokat és a jel-zaj viszony javul (Tononi és Cirelli, 2006, nyomán).

Az agykérgi idegsejtek közti szinaptikus transzmisszió hatékonyságának ébrenlét alatti növekedésére és alvás során történő redukciójára utal, hogy a frontális agykérgi szeleteken mért mEPSC (miniatűr, serkentő posztszinaptikus áram) frekvenciája és amplitúdója is nő az ébrenléttel és csökken az alvással (Liu és mtsai, 2010). Kimutatták, hogy bizonyos szinaptikus fehérjék (a preszinaptikus cisztein húr fehérje, szinapszin, szintaxin és „bruchpilot”-fehérje, valamint a posztszinaptikus „discs-large protein”) expressziója az alvásdepriváció következtében szignifikánsan megnő, míg az alvással csökken (Gilestro és mtsai, 2009). Egy kutatás során azt találták, hogy éber állapotban megnő a dendrittüskék száma, valamint a szinapszisok

mérete,

és

ugyanezen

paraméterek

az

alvás

során

redukálódnak,

„renormalizálódnak” (Bushey és mtsai, 2011). 8

Látható tehát, hogy több hipotézis is létezik, melyek különböző irányból közelítik meg az alvás homeosztatikus szerepét. Közös ugyanakkor bennük, hogy az alvás legfőbb szerepének a „hibajavító” és renormalizáló funkciókat tekintik. 3.1.2. Memóriakonszolidáció az alvás során Az új információk megszerzéséhez, memórianyomok tartós rögzítéséhez a beírás (vagy másként tanulás) és a memóriakonszolidáció folyamata szükséges. Az ébrenlét során szerzett, és rövidtávon rögzített információ megerősítése, a memóriakonszolidáció rendkívül fontos funkciója az alvásnak (Rauchs és mtsai, 2005). Míg egyesek az alvási fázisok specifikus szerepét emelik ki a különböző típusú memórianyomok rögzítésében (Plihal és Born, 1999), addig mások a nem-REM és REM stádiumok egymásutániságát tartják fontosnak a jól működő memóriakonszolidációban (Giuditta és mtsai, 1995). A memórianyomok tartóssá válásának, megerősítésének mechanizmusára vonatkozóan még nem született egységesen elfogadott elképzelés. Egy, már említett, hipotézis szerint a szinaptikus erősség – lassú hullámú alváshoz köthető – globális csökkenése mellett fent maradnak az arányaiban erősebb jelközvetítő neuronális kapcsolatok, és egy a homeosztázis fenntartását is biztosító folyamatban rögzülnek a lényeges információk (Tononi és Cirelli, 2006). A „jel-zaj” arány ezáltal javul, és lehetővé válik a rendszer „telítődésének” kiküszöbölése.

Mindemellett

nagy

jelentősége

lehet

az

aktív

konszolidációs

mechanizmusoknak is (Diekelmann és Born, 2010). Az aktív folyamatokat hangsúlyozó modell szerint az ébrenlét alatt rövidtávon rögzített információ a hippocampalis-neocorticalis útvonalon haladva, összehangolt működés eredményeként beíródik az agykéregben a hosszútávú memórianyomok tárolására szolgáló neuronális hálózatokba (Sirota és mtsai, 2003). A lassú hullámú alvás szinaptikus erősséget csökkentő, és információ-továbbító szerepe mellett a REM-szakasz is fontos funkcióval bírhat a memóriarögzítésben. Bizonyos tanulási folyamatok után specifikusan megnő a paradox-alvás hossza, és megemelkedik bizonyos neuronális aktivitás-függő gének (CREB, Arc, BDNF) expressziója több agyterületen is (Ulloor és Datta, 2005). Feltételezhető, hogy a szinaptikus transzmisszió általános csökkenése, tehát a lényeges információk relatív megerősítése mellett a rövidtávon rögzített információk aktív – lassú hullámú alváshoz, és ezt követően REM-fázishoz kapcsolt – megerősítése, rögzítése együtt szükséges a memóriakonszolidációhoz. 9

3.1.3. A különböző alvási fázisok jelentősége a memórianyomok megerősítésében és a plaszticitásban A különböző alvási fázisok más-más memória típusok megerősítésében játszhatnak szerepet (Diekelmann és Born, 2010). A hippocampusszal kapcsolatba hozható deklaratív memória megerősítéséért a feltevések szerint elsősorban a lassú hullámú alvás felelős. Ezzel szemben a nem-deklaratív típusú memórianyomok konszolidációja a REM-fázissal áll összefüggésben (Plihal és Born, 1999). A REM-szakasznak minden bizonnyal kiemelt szerepe van az emocionálisan nagy jelentőségű emlékek megerősítésében, szemben a semleges információkkal (Nishida és mtsai, 2009) – ez alátámasztja a „paradox alvás” nem-deklaratív memória megerősítésében játszott szerepét. Ugyanakkor Rauch és mtsai. leírták a REMszakasz jelentőségét deklaratív típusú tanulási mechanizmusban is (Rauchs és mtsai, 2004), míg

Aeschbach

és

mtsai.

a

nem-REM

stádium

szerepét

nem-deklaratív

memóriakonszolidációs folyamatban (Aeschbach és mtsai, 2008). Mindezek alapján nem állíthatjuk egyértelműen, hogy az egyes memória-típusok alvás alatti rögzítéséért csak az egyik vagy másik alvási fázis a felelős. Ismert jelenség, hogy az alvás során reaktiválódnak azok a neuronális körök, idegsejtcsoportok, amelyek az alvást megelőző ébrenlét során is jellemző tüzelési mintázatot mutattak (Benington és Frank, 2003). Az alvás idején bekövetkező, ébrenlét alatt szerzett tapasztalatfüggő, lokális neuronális aktiváció az egyre elfogadottabb nézet szerint a szinaptikus plaszticitás támogatása szempontjából nélkülözhetetlen. A memórianyomok megerősítésében játszott szerepének tisztázására néhány ebben a tekintetben releváns agyi struktúrában vizsgálták az ébrenlét során rögzített tüzeléssel korreláló aktivációs mintázatokat. A hippocampuson (Wilson és McNaughton, 1994), és különböző agykérgi területeken végzett kutatások (Hoffman és McNaughton, 2002) eredményei is alátámasztották a megfigyeléseket. A lassú hullámú alvás során kimutatott, ébrenlét alatti aktivitás-függő tüzelési mintázat az elképzelések szerint bizonyos szinaptikus kapcsolatok éber állapotban bekövetkező megerősödésének felerősítésére szolgál. Ekkor történhet az átmenetileg a hippocampusban tárolt információ neocorticalis hálózatokba való beírása, és így a memórianyom hosszútávú rögzítése (McClelland és mtsai, 1995; Born, 2010). A lassú hullámú alvás ideje alatt az új információk feldolgozása feltehetően gátolt a hippocampusban, amennyiben ekkor a szinaptikus átvitel megerősítésére alkalmazott protokollal jóval nehezebb a szinaptikus transzmisszió potencírozása, mint éber állatban (Leonard és mtsai, 1987). Egy vizsgálat során kimutatták, hogy a lassú hullámú alvás alatti „visszajátszás” a hippocampus 10

CA1-es rétegének sejtjeiben, érdekes módon, az éber állapotban, adott szituációban mért térés időbeli tüzelési mintázattal korreláltan, de annál gyorsabban játszódik le (Nádasdy és mtsai, 1999). Az aktivációs mintázat alvás alatti ismétlődése mellett a tapasztalat megszerzését követő lokális változásokra adott válaszként értelmezhető az alvási fázisok időtartamának módosulása az ébrenlét során fokozott működést végző idegsejt-populációkban (Vyazowskiy és mtsai, 2000). A nem-REM fázis lassú hullámú oszcillációinak idején a külvilágból érkező stimulusok nem érik el hatékonyan az agykérget, ami az alvás biztosításához szükséges. Ennek feltétele a thalamocorticalis neuronok hiperpolarizációja, az idegsejtek akciós potenciáljának kiváltásához szükséges „küszöb” állítása (Steriade és Timofeev, 2003). A lassú hullámú alvás plaszticitással, a memória konszolidációjával fennálló kapcsolatát alátámasztja, hogy lokálisan megnőtt mennyisége mellett annak kiiktatása meggátolja a tanulási procedúra elsajátításában bekövetkező fejlődést (Huber és mtsai, 2004; Huber és mtsai, 2007). Feltételezik, hogy a neuronok szinkron tüzelése a nem-REM szakasz lassú hullámú fázisában az intracelluláris Ca2+-szint jelentős megemelkedéséhez vezet, amely a plaszticitásban szereplő gének expresszióját eredményezi (Buzsáki, 1998; Steriade és mtsai, 1993). Ez a mechanizmus új neuronok csoportjának bevonását teheti lehetővé a tartós információrögzítéshez. A nem-REM fázis információ-rögzítésben játszott kiemelt szerepére utal, hogy megzavarása – az alvás teljes hosszának csökkentése nélkül – rontja a hippocampus-függő tanulási mechanizmusokat az alvást követő ébrenlét során (Van Der Werf és mtsai, 2009). A lassú hullámú alvás funkciója lehet tehát a későbbi információ-beíráshoz szükséges körülmények biztosítása. A lassú hullámú alvás idején jellemző, hippocampus és agykéreg közti kommunikációt szemlélteti a 3. ábra.

11

3. ábra: A lassú hullámú alvás szerepe a memóriakonszolidációban. A) Az új információk az ideiglenes raktározás helyéről, a hippocampusból, a hosszútávú rögzítésben szereplő agykérgi neuronális körökbe íródnak át az alvás alatt. B) Az átírás a neocortex és a hippocampus közti kétirányú kommunikáció eredménye, amely fentről-lefelé irányuló szabályozás által, az agykéreg lassú hullámú aktivitásától függően működik (Born és Wilhelm, 2012, nyomán).

REM-fázisban a megelőző ébrenlét során jelentkező tér- és időbeli tüzelési mintázattal összefüggésbe hozható reaktivációt írtak le, mely egy adott viselkedési állapot akár percekig tartó szakaszával mutatott egyezést (Louie és Wilson, 2001). A REM-szakaszban a korábban rögzített információ újra előhívhatóvá és processzálhatóvá válhat. A tanult elemekért felelős neuronális-körök excitabilitása az ébrenléti állapothoz hasonló mértékben nő meg, így biztosítva a korábban szerzett és a REM-fázisban előhívott új információk ismételt beírásának, és végső soron, rögzítésének lehetőségét (Hennevin és mtsai, 1995). A memórianyom-rögzítés egyik sejtszintű modelljeként értelmezhető a szinaptikus átvitel hosszú távú megerősödése, az LTP („long-term potentiation”, hosszútávú potencírozás) (Lynch, 2004). Az alvás REM-stádiumának hosszútávú (48 vagy 72 órás) megvonása rontja az LTP kialakulását a hippocampus CA1-es régiójában (Davis és mtsai, 2003). E jelenség hátterében minden valószínűség szerint a szinaptikus plaszticitás specifikusan a REM-fázistól függő fokozódásának meggátlása állhat. Külső ingerekben gazdag környezetben tartott patkányokon végzett kutatás során a neuronális aktivációval összefüggő zif-268-as gén expresszióját vizsgálták hippocampalis és agykérgi területeken. A neuronális plaszticitással összefüggő gén expressziója éber állapotban bizonyult a legmagasabbnak, majd a lassú hullámú alvás során csökkenést, míg a REMfázisban ismételt növekedést mutatott (Ribeiro és mtsai, 1999). Egy későbbi munkában, a fent leírtakhoz hasonlóan, fokozott zif-268-expressziót találtak extrahippocampalis területeken a

12

REM-szakaszban, ebben az esetben az ébrenlét ideje alatt a hippocampusban kiváltott LTP hatására (Ribeiro és mtsai, 2002). A lassú hullámú alvás során a hippocampusból az agykéregbe átírt információ a REM-fázis ideje alatt a kérgi területeken további feldolgozáson eshet át (Born és Wilhelm, 2012), amire ez a plaszticitással összefüggő marker jelenléte is utalhat. A paradox-alvás memóriakonszolidációt serkentő hatása kapcsolatba hozható az ez idő alatt megemelkedett kolinerg tónussal, mivel ismert az acetilkolinerg transzmisszió pozitív hatása plaszticitás-függő gének expressziójára, és a memórianyomok tartós rögzítésére (Lopes Aguiar és mtsai, 2008). Vizsgálatok alapján feltételezhető a REM-fázisban egy ún. „REM-ablak”, amely kiemelt szerepet játszik bizonyos tanulási folyamatokban, és melynek memóriakonszolidációt fokozó hatása fehérjeszintézishez kötött (Smith és mtsai, 1991; Legault és mtsai, 2004). Az alvás alatti memóriakonszolidáció sok ponton precízen vizsgált folyamat, amelyhez tehát a különböző alvási fázisok megfelelő sorrendben következő megjelenése lehet szükséges. 3.2. Molekuláris szintű változások az alvás és ébrenlét során, valamint alvásmegvonás hatására Az elektrofiziológiai vizsgáló-módszerekkel kimutatott reaktiváció, és a memória konszolidációja mögött rejlő molekuláris mechanizmusok tisztázására egyre több kutatás folyik napjainkban. Mint ahogy azt több vizsgálat is igazolta, alvásmegvonás hatására romlik a memóriakonszolidáció (Maquet, 2001; Walker és Stickgold, 2004). Alvásdepriváció hatására a plasztikus, szinaptikus folyamatok, melyek az új információk eltárolásának, a memórianyomok rögzítésének feltételeit képezik, zavart szenvednek. A háttérben zajló molekuláris változások felderítésére komoly erőfeszítéseket tettek az utóbbi években. Kimutatták a szinaptikus plaszticitás képességének, az LTP kialakulásának szignifikáns romlását 12 órás teljes alvásdepriváció hatására (Campbell és mtsai, 2002). Érdekes adat, hogy egy későbbi vizsgálat során bizonyították, hogy ugyanennyi ideig tartó teljes alvásmegvonás viszont fokozza a hosszú távú gátlást, az LTD-t („long-term depression”, hosszútávú depresszió) (Tadavarty és mtsai, 2009). A régóta kutatott LTP-nek több, különböző molekuláris mechanizmust igénylő típusa is ismert, így felvetődik a kérdés, hogy vajon mely formája szenved zavart az alvásdepriváció következtében. Egy vizsgálat során azt találták, hogy a rövidtávú, 5 órás alvásmegvonás specifikusan gátolta a 13

hippocampusban az LTP egy, a cAMP-szint által befolyásolt formáját, mely a foszfodiészteráz enzim 4-es izoformája (PDE4) aktivitásának megváltozásával van összefüggésben (Vecsey és mtsai, 2009). A cAMP/PKA jelátivteli út mellett azonban más mechanizmusok megváltozott működése is kapcsolatba hozható az alvásmegvonás szinaptikus plaszticitást csökkentő hatásával. 24 órás alvásdeprivációt követően az LTP kialakulásának romlása mellett az NMDA típusú glutamát-receptor NR1 alegységének a szinaptikus plazmamembránon való csökkent jelenlétét találták (Chen és mtsai, 2006). Ehhez hasonlóan, 72 órás teljes alvásdepriváció után kimutatták az NMDA-receptor NR1 és NR2A alegységének internalizáció következtében lecsökkent sejtfelszíni jelenlétét, az NMDAreceptorok közvetítette kisebb serkentő posztszinaptikus potenciált, valamint az LTPkialakulás zavarát is (McDermott és mtsai, 2006). Az alvásdeprivációt követő, NMDAreceptor-függő, csökkent szinaptikus plaszticitás e fehérjék alegység-összetételében bekövetkező specifikus változásokra is visszavezethető (Kopp és mtsai, 2006). A paradoxalvás 72 órán át tartó megvonása lényegesen lecsökkent NR1 és GluR1 (a szintén glutamátot kötő AMPA-receptor 1-es alegysége) expressziót eredményezett. Emellett kevesebb foszforilált ERK1/2 fehérjét kaptak, amely azért figyelemre méltó eredmény, mivel az ERK1/2-t is tartalmazó ERK/MAPK jelátivteli útvonal aktiválása szükséges az LTP bizonyos típusainak kiváltásához (Ravasaard és mtsai, 2009). Az AMPA-receptor alegységeiben napszakosan történő változást is kimutattak agykérgi glutamáterg szinapszisokban, és ez a módosulás jelentősen befolyásolja a szinaptikus átvitel hatékonyságát (Lanté és mtsai, 2011). A 12 órás alvásdepriváció a metabotrop GABAB-receptorok és mGluR fehérjék bizonyos alegységeinek csökkent expresszióját indukáló hatását is leírták (Tadavarty és mtsai, 2011). Egyre több kutatás mutatja tehát ki a neurotranszmitter-receptorok szinapszisokba történő transzportjának, majd az onnan való visszavételüknek alvás-ébrenléti állapottól függő váltakozását. Egy vizsgálat során pedig azt találták, hogy a szinaptikus plaszticitásban szereplő CREB, Arc és BDNF expressziója az ébrenlét során folyamatosan nő, míg az alvással csökken, és ez a jelenség a noradrenerg rendszer irányítása alatt áll (Cirelli és Tononi, 2000a). Jelentős változások mutathatóak ki a génexpressziós szinten az alvás-ébrenléti ciklus eltérő szakaszaiban. Egy tanulmányban 44 génről átírt mRNS mennyiségének szignifikáns növekedését írták le az ébrenlét illetve az alvásdepriváció eredményeként, míg 10 gén expressziója csökkent. A kapott mRNS-ek által kódolt fehérjék nagy része aktívan részt vesz a szinaptikus transzmisszióban (Cirelli és Tononi, 2000b). Basheer és munkatársai, proteomikai munkájukban, patkányok 6 órás alvásdeprivációja után szintén több olyan fehérje 14

expressziójában találtak jelentős változást a basalis előagyban, amelyek szinaptikus folyamatokban játszott szerepe a szakirodalmi adatok alapján bizonyított (Basheer és mtsai, 2005). A hippocampus proteomjának rövidtávú (4 órás) alvásmegvonást követő vizsgálata során elsősorban a metabolikus folyamatokban funkcionáló fehérjék mennyiségének változását mutatták ki, de több citoszkeletális, és szinaptikus átvitelben szereplő komponens expressziója is módosult (Poirrier és mtsai, 2008). Egy fiatal (2,5 hónapos) és idős (24 hónapos) egereken végzett, alvásdeprivácó hatását elemző tanulmányban újabb fehérjék váltak ismertté az alvás és meghosszabbított ébrenlét során specifikusan módosult expresszióval (Pawlyk és mtsai, 2007). E vizsgálati eredmények fényében tehát a sejtfelszínen illetve intracellulárisan is intenzíven zajló molekuláris változásokat feltételezhetünk az alvás-ébrenléti ciklus különböző fázisaiban, amelynek vizsgálata nagy-áteresztőképességű technikai megközelítést igényel. Az egyes fehérjék funkcióinak ismeretében pedig a rendszert alkotó komponensek szerepe és az egyes elemek közti kapcsolatok is felderíthetőek.

4. A diplomamunka célkitűzései Az alábbiakban a vizsgálat céljainak összefoglalása olvasható: 

Olyan fehérjék meghatározása, amelyek mennyisége szignifikánsan megváltozik a 8 órás alvásdepriváció hatására.



A sejtek működési folyamataiban bekövetkező változások megállapítása a kapott fehérjék funkcióinak megismerésével.



A különböző agyi struktúrákban – a parietalis cortexben, illetve a thalamusban – kimutatott változások összehasonlítása.



A teljes szöveti minták, valamint a szinaptoszómák közötti molekuláris változások összevetése.



Potenciálisan a szinaptikus plaszticitásban szereplő fehérjék meghatározása – az alvás memóriakonszolidációban játszott szerepének ismeretében.

15

5. Anyagok és módszerek Ebben a fejezetben olvasható az elvégzett vizsgálat lépéseinek részletes leírása. A munka a kísérleti állatok alvásdeprivációjából, a teljes szöveti minták előkészítéséből, a fehérjék elválasztásából majd meghatározásukból, valamint a kapott molekulák funkcióinak megállapításából állt. A proteomikai analízist az agykérgi és thalamicus mintákból készített szinaptoszóma preparátumokon is elvégeztük. A szinaptoszóma-preparálást a Proteomikai Laboratórium munkatársai hajtották végre, az ebből kapott eredmények kiértékelését viszont magam végeztem. A szinaptoszóma-preparátum elkészítésének folyamata 5.3. fejezetben olvasható. 5.1. A felhasznált anyagok listája Az alábbi anyagokat használtuk az alvásdepriváció kivitelezése és a proteomikai vizsgálat során (zárójelben a vegyszert gyártó cég nevével): aceton (Reanal Finomvegyszergyár Zrt.), ACSF-oldat (mesterséges agy-gerincvelői folyadék) (Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet, Budapest), agaróz (Sigma-Aldrich Kft.), akrilamid (Sigma-Aldrich

Kft.),

ammónium-perszulfát

(GE

Healthcare),

ammónium-szulfát

((NH4)2SO4) (Reanal Finomvegyszergyár Zrt.), brómfenol-kék (GE Healthcare), CHAPS (Sigma-Aldrich Kft.), Complete Protease Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich Kft.), Coomassie Brilliant Blue G-250 (GE Healthcare), dentakrilát cement (GC America), ditiotreitol (SigmaAldrich Kft.), ecetsav (Reanal Finomvegyszergyár Zrt.), equitesin (Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet, Budapest), glicerin (Reanal Finomvegyszergyár Zrt.), glicin (Merck Kft.), H3PO4 (foszforsav) (Reanal Finomvegyszergyár Zrt.), HEPES-puffer (Sigma-Aldrich Kft.), jódacetamid (Sigma-Aldrich Kft.), lizin (Sigma-Aldrich Kft.), magnézium-acetát (SigmaAldrich Kft.), magnézium-klorid (MgCl2) (Sigma-Aldrich Kft.), merkaptoetanol (SigmaAldrich Kft.), metanol (Reanal Finomvegyszergyár Zrt.), N,N-metilén-biszakrilamid (SigmaAldrich Kft.), Phosphatase Inhibitor Cocktail (Sigma-Aldrich Kft.), Protease Inhibitor Mix (Sigma-Aldrich Kft.), SDS (sodium dodecyl sulfate) (Sigma-Aldrich Kft.), szaharóz (Merck Kft.), szilanizáló oldat (Bind-Silane) (GE Healthcare), TEMED (GE Healthcare), thiourea (Sigma-Aldrich Kft.), Tris (GE Healthcare), urea (Sigma-Aldrich Kft.) A vizsgálathoz használt eszközök, berendezések pontos megnevezése – az azt gyártó cég feltüntetésével együtt – a következő alfejezetekben található, a felhasználásuk tárgyalásánál. 16

5.2. Az alvásdepriváció kivitelezése Kísérleteink során az Európai Közösségek Tanácsa 86/609/EEC direktívában, illetve az 1998. évi XXVIII törvényben (az állatok védelméről és kíméletéről), a 243/1998 kormányrendeletben (az állatkísérletek végzéséről) és az egyetemi állatvédelmi előírásokban foglaltak szerint jártunk el. Vizsgálatunkat felnőtt (4 hónapos), hím Sprague-Dawley patkányokon (350-400 g) végeztük. Az állatokat 12 órás fény-sötét ciklusra beállított szobában tartottuk az alvásdepriváció előtt 14 napig (8-20 óráig fény, 20-8 óráig sötét ciklusban). A 8 órás alvásmegvonás idején az agyi elektromos aktivitást az occipitalis, a parietalis és a frontalis cortex fölé beültetett 2-2 csavarelektród segítségével ellenőriztük, az izomműködés regisztrálására pedig a kétoldali nyakizomzatban rögzített 1-1 miogram elektródot használtunk. Az elektródok elhelyezéséhez szükséges krónikus műtéthez a patkányokat equitesine-nel (3 ml/kg, i.p.) altattuk el. A 0,8 mm átmérőjű, rozsdamentes acélból készült csavarelektródokat a koponyába fúrt lyukakon keresztül csavartuk be úgy, hogy azok érintkezzenek a dura mater felszínével. A szintén rozsdamentes acélból készült miogram elektródokat a nyakizomzatba szúrtuk és stabilan rögzítettük. Az elektródokat egy 10csatornás csatlakozóhoz kapcsoltuk. A műtét végén az elektródokat a koponya felszínére juttatott dentakrilát cementtel rögzítettük. A beavatkozás után két héttel, az állatok felépülését követően végeztük kísérletünket. Az alvásmegvonás az úgynevezett „gentle handling” technikával történt, ami az állatok alvásának megakadályozását jelenti, azok óvatos megmozdításával, nyugalmi állapotuk megzavarásával. Az adatok alapján ez a módszer egyike a kísérleti állatok számára legkevesebb stresszel járó technikáknak (Rechtschaffen és mtsai, 1999; Palchykova és mtsai, 2006; Fenzl és mtsai, 2007). 6 patkányon 8 órán keresztül végeztük az alvásdeprivációt (reggel 8 órától délután 16 óráig). Az EEG- és EMG-kontrollhoz egy EEG-készüléket (Grass Model 8-10 B, Grass Instrument Company) használtunk, amelyhez egy CED 1401 µII analógdigitális átalakító egységet (Cambridge Electronic Design Ltd) kapcsoltunk. Az EEG-jeleket 1 Hz és 10 kHz, míg az EMG-jeleket 5 Hz és 10 kHz között rögzítettük. A detektált jelek analóg-digitális átalakítása 900 Hz-es mintavételezési frekvenciával történt. Az alvásmegvonás után az állatokat halotánnal azonnal túlaltattuk, agyukat eltávolítottuk. Az agyak szárazjéggel hűtött friss ACSF-oldatba kerültek, majd szárazjéggel lehűtött steril üveglapon manuálisan leválasztottuk a parietalis cortexet mindkét féltekéből,

17

valamint eltávolítottuk a thalamust. Az egyik nagyagy-félteke parietalis cortexét, valamint az egyik oldali thalamicus mintát szinaptoszóma-preparálásra használtuk fel, minden állatból. A szinaptoszóma preparálása a minta kivétele után azonnal elkezdődött, a teljes szöveti mérés mintáit pedig Eppendorf-csövekbe helyeztük, és -80 °C-on tároltuk azok későbbi felhasználásáig. 5.3. A szinaptoszóma preparátum elkészítése A preparálás lépései az alábbiak voltak: A leválasztott egyik oldali thalamus és a parietalis agykéreg 1 ml-es homogenizáló pufferbe helyezése (5 mM HEPES puffer, pH 7,4; 320 mM szaharóz; 1 mM MgCl2; Complete Protease Inhibitor Cocktail; Phosphatase Inhibitor Cocktail). Homogenizálás üvegből készült Dounce Tissue Grinder (Cole-Parmer) eszköz használatával. A homogenizálás után kapott minta 10 percig, 4 °C-on, 1000 x g beállítással történő centrifugálása. A felülúszó folyadék pipettával való leszívása, majd átszűrése egy 5 m pórus-átmérőjű PVDF-membránon (Millipore). A filtrátum centrifugálása 30 percen keresztül, 4 °C-on, 12 000 x g beállítással. A felülúszó eltávolítása. A szinaptoszómákat tartalmazó pellet-frakció kicsapása egy éjszakán át, majd másnap ennek kiszárítása. Az így kapott szinaptoszóma preparátumot -80 °C-on tároltuk a proteomikai vizsgálat megkezdéséig. 5.4. A teljes szöveti minta feldolgozása A teljes szöveti mintákat 100 l lízis-pufferbe helyeztük (7 M urea, 2 M thiourea, 4% CHAPS, 20 mM Tris, 5 mM magnézium-acetát, Protease Inhibitor Mix, 1:1000; pH 8,5) és előbb Sample Grinding Kit (GE Healthcare) segítségével manuálisan, majd ultrahanggal (10szer 10 másodpercig, jégen) homogenizáltuk. Ezt követően 1 órán keresztül, 4 °C-on, 14 000 x g beállítás mellett centrifugáltuk a preparátumot. A keletkezett felülúszó folyadékot leszívtuk, pH-ját 8,5 értékre állítottuk be, majd meghatároztuk a minta fehérjekoncentrációját PlusOne 2-D Quant Kit (GE Healthcare) segítségével. 5.5. Proteomikai vizsgálat 2D-DIGE technikával A kezelt és a kontroll állatok cortexének és thalamusának proteomikai analízise 2DDIGE technikával történt. Az eljárás az egyes mintákban lévő fehérjék különböző fluoreszcens festékekkel való megjelölését, majd megjelenítését foglalja magában. A kapott 18

eredményből látható, hogy a gél mely pontjain – mely spotokban – jött létre változás az alvásdepriváció hatására, tehát végeredményben az, hogy melyek azok a fehérjék, amelyek mennyisége megváltozott a beavatkozás következtében. Ez a módszer lehetőséget biztosít a minták hiteles összehasonlítására és elemzésére. A szinaptoszomális és a teljes szöveti minták fehérjekoncentrációjának meghatározása után kezdtünk hozzá 2D-DIGE technika kivitelezéséhez. Először az analitikai géleket készítettük el, amelyeken a gélképek elemzése végezhető el. A mintákhoz fluoreszcens festéket adtunk - 400 pmol/50 μg fehérje arányban - CyDye DIGE Fluor Minimal Labeling Kit (GE Healthcare) használatával. Az alvásdeprivált és a kontroll állatokból felhasznált mintákat, valamint a „poolozott” – tehát az alvásdeprivált és a kontroll állatokból származó mintákat együttesen tartalmazó, referencia (belső standard) – agyi lizátumot más-más hullámhosszon gerjeszthető, és egymástól eltérő – nem átfedő – hullámhosszokon emittáló fluoreszcens festékkel jelöltük meg (Cy2, Cy3, Cy5). Cy2-vel jelöltük a poolozott mintát, és Cy3-mal, vagy Cy5-tel, 3-3 gélenként cserélve, a kontroll és kezelt állatból származó fehérjéket. A metodika kémiai háttere, hogy a fehérjékben található lizin ε-aminocsoportjával NHS-észtert képez a festék, a 30 perces reakcióidő alatt az elegyben található minden egyes fehérje 1 %-át festve meg. Ezért az 50 μg fehérjét tartalmazó mintákat a festékek hozzáadása után 30 percig jégen inkubáltuk, majd a reakciót 1-1 μl 10 mM-os lizinnel állítottuk le (15 perc jégen), megkötve a fel nem használt festéket. Ezután egyesítettük az egy gélen futtatandó mintákat, tehát 50-50 μg fehérjét a kontroll, illetve kezelt állatokból, valamint 25 μg fehérjét a kontrollból és szintén 25 μg-ot a kezeletből tartalmazó, poolozott oldatból. A gélképek elemzése során a kezelt és kontroll mintákat is a poolozott mintákhoz hasonlítjuk, és így kiküszöbölhetjük a nem azonos fehérjemennyiségek felviteléből adódó hibákat. Ezekkel a mintákkal dolgoztunk tovább, és első lépésben elvégeztük az izoelektromos fókuszálást a fehérjék első dimenzióban történő elválasztásához. A kapott, kevert mintához hozzáadtuk a 450 μl végtérfogathoz szükséges rehidratáló puffert. A rehidratáló puffer tartalma: 8 M urea, 4% CHAPS, 15% glicerin, 13 mM ditiotreitol. Az oldatot 24 cm-es 3-10 pH-tartományú, nem-lineáris (NL) „stripekre” („gél-csíkokra”) vittük fel (Immobiline DryStrip, GE Healthcare), amelyekben a fehérjék elválasztása történt. A stripek rehidratálása szobahőmérsékleten, egy éjszakán át tartott. Ezt követően indítottuk el az izoelektromos fókuszálást, amelyhez Ettan IPGphor 3 IEF System (GE Healthcare) fókuszáló berendezést használtunk. A művelet több lépcsőben zajlott, az alábbiak szerint: 30 V – 3,5 óra, 500 V – 5 óra, 1000 V – 6 óra, 8000 V – 9 óra. 19

Ezután a stripeket 20-20 percig ekvilibráltuk, előbb egy redukáló, majd egy karbamidometiláló oldatban. A redukáló oldat tartalma: 50 mM Tris, 6 M urea, 30 % glicerin, 5% SDS, 0,1% brómfenol-kék, 0,1% merkaptoetanol. A karbamidometiláló oldat tartalma: 50 mM Tris, 6 M urea, 30% glicerin, 5% SDS, 0,1% brómfenol-kék, 0,25% jódacetamid. A stripeket üveglapok közé polimerizált, 10%-os akrilamid gélre (10% akrilamid, 0,3% N,Nmetilén-biszakrilamid, 1,5 M Tris, pH 8,8, 0,1% SDS, 0,1% TEMED, 0,05% ammóniumperszulfát) vittük fel, majd 0,5%-os agarózzal rögzítettük. A futtatáshoz SDS-glicin-Tris puffert (1% SDS, 14,4% glicin, 3% Tris) használtunk. A második dimenziós gélelektroforézis az alábbiak szerint történt: 1 óra – 2 W/gél, 3 óra – 12 W/gél. A 4. ábrán a 2D-DIGE-technika rövid összefoglalása látható.

4. ábra: A 2D-DIGE technika lépései. A mintafeldolgozás, és fehérjekoncentráció-meghatározás után a kezelt, kontroll, és poolozott mintákból származó fehérjéket különböző fluoreszcens sajátságokkal rendelkező festékekkel jelöltük meg. A különbözően jelölt mintákat egyesítettük, majd azonos géleken futtattuk meg. Ezután először az izoelektromos pont, majd a tömeg szerinti szeparálást végeztük el. A kapott géleket beszkenneltük a fluoreszcens festékek szerint meghatározott hullámhosszokon. Így egy gélen kaptuk meg a kezelt és kontroll állatokból származó fehérje-mennyiségeket (ábra a GE Healthcare 2D-DIGE technikát bemutató kiadványa alapján).

Az analitikai gélek beolvasásához Typhoon TRIO+ konfokális fluoreszcens szkennert (GE Healthcare) használtunk. A szkenneléshez a Cy-festékek gerjesztési és elnyelési maximumait vettük figyelembe: Cy2: Amax (abszorbciós maximum) = 489 ± 3 nm, Emax (emissziós maximum) = 502 ± 5 nm; Cy3: Amax = 548 ± 3 nm, Emax = 560 ± 5 nm; Cy5: Amax =

20

=641 ± 3 nm, Emax = 660 ± 5 nm. Egy, a vizsgálathoz használt gél beolvasott képe látható az 5. ábrán.

5. ábra: Az agykérgi szinaptoszomális fehérjék második dimenziós gélelektroforézise után kapott gélkép. Az üveglapok közé polimerizált gélt Typhoon TRIO+ szkennerrel olvastuk be a Cy3 fluoreszcens festék spektrális jellemzőinek megfelelően.

A Typhoon TRIO+ szkennerrel előállított DIGE fájlokat a DeCyder szoftvercsomag 7.0. verziójával (GE Healthcare) értékeltük ki. A Minimal kit-tel jelölt mintákról gélenként három képet kaptunk, a három fluoreszcens festék (Cy2, Cy3, Cy5) szerint. A szoftver DIA (Differential Image Analysis) moduljában megjelenített egyedi géleken (illetve az ezekhez tartozó 3-3 képen) detektáltuk a fehérje-spotokat, illetve szelektáltunk azok között. A DIA segítségével határoztuk meg az azonos gélen megfuttatott kontroll állat és a referencia, illetve a kezelt állat és a referencia mintákban talált spotok fluoreszcencia-intenzitásainak hányadosait. A BVA (Biological Variance Analysis) modulban a csoportbeosztást tettük meg, valamint a különböző gélek egymásnak megfeleltethető spotjait párosítottuk, és a belső standarddal (referencia mintával) képzett arányszám alapján statisztikát számoltunk egy-utas ANOVA (analysis of variance) statisztikai módszerrel (Norton és Strube, 1985). A 6. ábrán az agykérgi szinaptoszóma fehérjéinek gélelektroforézise után kapott gélkép látható, egy fehérje-spot kiemelésével.

21

6. ábra: A DeCyder szoftver BVA moduljának kezelőfelülete. Az ábrán az agykérgi szinaptoszómából származó fehérjék két-dimenziós gélelektroforézise után kapott gélképe látható, egy szignifikánsan megváltozott mennyiségű, tetszőleges fehérje-spot (a 105. spot) kiemelésével. A bal oldalon egy-egy kezelt és kontroll állatból felhasznált fehérjeminta gélképe látható. Bal oldalon, alul, egyetlen spot kijelölése, jobb oldalon felül pedig a spot háromdimenziós képe található. Jobb oldalon, alul, 6 kezelt és 6 kontroll állatból meghatározott azonos fehérje-spotok változásainak összehasonlítása van feltüntetve.

Az elemzés végén összesen 12 adatsorozatot kaptunk: a 6 kontroll és a 6 kezelt mintából, mintánként nagyjából 2000-2000 spotból. Az összes összetartozó spotra kiszámoltuk a p-értéket párosított Student’s t-test statisztikai módszerrel (David és Gunnink, 1997), és a 0,05 p-érték alatti spotokat kijelöltük kiszedésre. Az analízis után preparatív gélt készítettünk a szignifikáns változást mutató spotok kivágásához. A protokoll megegyezett az analitikai gélnél, fent leírtakkal, néhány különbséget leszámítva. A preparatív gélekhez 800 µg fehérje-mintát használtunk, rehidratáló pufferrel 450 µl térfogatra kiegészítve. Külön preparatív gélt készítettünk a kezelt, és külön a kontroll állatokból származó fehérjék kétdimenziós elválasztásához. Ezeket a mintákat nem jelöltük meg Cy-festékekkel. Az így készült gélek sérülékenyek lehetnek, ezért gélöntés előtt az üveglapokat szilanizáló oldattal kezeltük, ezáltal a gélek az üveglaphoz tapadtak, így könnyen kezelhetővé váltak a spot-kiszedés során. A második dimenziós elválasztás után a géleket metanolt és foszforsavat tartalmazó oldatban fixáltuk 1 órán keresztül, majd kolloidális Coomassie Brilliant Blue-val festettük (0,05% G-250, 1% H3PO4, 8% (NH4)2SO4, 20% metanol). A festék eltávolítása 0,1 M pH 6,5 Tris-oldattal (3 perc), majd 25%-os metanol22

oldattal (1 perc) történt. A géleket a spotok kiszedéséig 20%-os (NH4)2SO4-oldatban tároltuk. A számítógépes elemzéssel talált, szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjéket (p<0,05)

tartalmazó

spotokat

manuálisan

vágtuk

ki

a

preparatív

gélből

és

a

tömegspektrometriás meghatározásig 0,5 %-os ecetsavas oldatban tároltuk. Az eltávolított spotokat meghatározásra küldtük el. A spotok fehérjéit tandem tömegspektrometriával (MS/MS) azonosították a Szegedi Tudományegyetem Orvosi Vegytani Intézetének kutatói. A kivágott spotok fehérjéit előkezelés után tripszinnel (TrypsinGold, Promega) peptid fragmentekre emésztették (24 óra, 37 °C), majd elvégezték a tömegspektrometriás méréseket. Az így kapott adatsorokból MASCOT program (Matrix Science) segítségével az NIH Protein Database és az Expasy Swiss Genomic Database adatbázisokat használva határozták meg a spotban található proteineket. Az azonosítás az adatbázisokban lévő fehérjék in silico végzett triptikus emésztésével történt. A spotok proteinjeinek hasításával kapott peptideket az adatbázis fehérjéinek elméleti hasításával kapott peptidjei között keresték ki, és így határozták meg az egyes fehérjéket. Egy-egy spotban, különböző lefedettséggel, több fehérje is jelen lehetett. Ez annak az eredménye, hogy bizonyos fehérjék kémiai tulajdonságaikból kifolyólag nem váltak el megfelelőn egymástól a kétlépcsős gélelektroforézis során. A helyük a gélképen így egyetlen spot-ként azonosítható. Mivel sok esetben nem egyértelmű, hogy melyik fehérje okozta a változást a spot fluoreszcencia-intenzitásában, ezért mindegyik meghatározott proteint figyelembe vettük az eredmények kiértékelésénél. 5.6. Fehérjefunkciók meghatározása A szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjék funkcióját az NCBI Medline adatbázisban

megtalálható,

publikált

szakirodalmi

cikkek

elolvasásával,

alapos

feldolgozásával határoztuk meg.

6. Az eredmények és megvitatásuk 6.1. Az eredmények közlése A proteomikai vizsgálat során 25 db szignifikánsan megváltozott fehérje-spotot találtunk az agykéreg és 21-et a thalamus teljes szöveti mintáiból, ezenkívül 49-et a cortex és 11-et a thalamus szinaptoszomális preparátumaiból. A teljes agykérgi mintából azonosított 25 23

spotból 17-et sikerült megtalálni, valamint megfelelően kivágni a preparatív gélből, 13-at a thalamusból származó 21 spotból, 42-t a corticalis szinaptoszómákban talált 49 spotból és mind a 11-et a thalamicus szinaptoszomális preparátumból. MS/MS-sel a 17 spotból mind a 17, a 13-ból 12, a 42-ből 41 és a 11-ből mind a 11 spot fehérjéje volt azonosítható. A teljes agykérgi szövetminta 17 spotjában összesen 29 különböző fehérjét mutattak ki, a teljes thalamus 12 spotjában 17-et, a corticalis szinaptoszómából származó 41 fehérje-spotból 36-ot, és a thalamicus szinaptoszómában talált 11-ből 19 féle proteint. A fehérjék sejtes szerepük szerinti csoportosításához a kutatócsoport egy korábban végzett proteomikai munkájában használt funkcionális kategóriákat vettük alapul (Szego és mtsai, 2010). A csoportok valamelyikébe való pontos besoroláshoz a szakirodalmi források alapos megismerésére volt szükség. A szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjéket celluláris funkciójuk alapján az alábbi kategóriákba helyeztük: szénhidrát anyagcsere és energia háztartás; aminosav anyagcsere; lipid anyagcsere és szállítás; nukleotid anyagcsere; szinaptikus transzmisszió; fehérjeszintézis és feltekeredés; proteolízis; oxidatív stressz; a sejtváz felépítésében szereplő, citoszkeletális; jelátvitelben résztvevő; valamint az egyértelműen ezek egyikébe nem besorolható, egyéb fehérjék csoportja. Az azonosított fehérjék adatait tartalmazzák az alábbi összefoglaló táblázatok (1-4. táblázat). A táblázatokban láthatóak a fehérjék azonosításához legszükségesebb adatok: hivatalos gén-, illetve fehérjenév és azonosítószám. Ezenkívül feltüntettük a spotra jellemző információkat: a spot gélre jellemző számát, a szoftveres analízissel kapott értékeket a fluoreszcencia-intenzitás változásáról, és a p-értéket. A változás mértéke a kezelt és kontroll állatokból származó mintákban talált spotok fluoreszcencia-intenzitásának egymáshoz viszonyított aránya. Növekedés esetén az alvásdepriváció hatására nagyobb fehérjemennyiséget mértünk, míg csökkenéskor a kontrollként használt állatok mintáiban találtunk nagyobb kópiaszámot. A táblázatban látható még a molekulatömeg, a sejtes lokalizáció és az azonosított peptidek lefedettsége a fehérje teljes szekvenciájában. A proteinek sejtes lokalizációjának

meghatározásához

a

fehérje-funkciók

megállapításához

használt

publikációkat (lásd a 6.3. fejezetben), illetve a széleskörűen használt UniProt adatbázis (http://www.uniprot.org) idevonatkozó adatait vettük alapul. Gén név

Fehérje név

Szénhidrát anyagcsere és energia háztartás CKB Creatine kinase, brain CKB Creatine kinase, brain CYCS Cytochrome c, somatic CYCS Cytochrome c, somatic

Azonosító

Spot szám*

p-érték

Változás mértéke

Molekulatömeg (Da)

Szekvencia lefedettsége

Sejtszintű lokalizáció

P07335 P07335 P62898 P62898

443/I 443/II 1134/I 1134/II

0,01188 0,01188 0,03995 0,03995

-1,1732 -1,1732 -1,6054 -1,6054

42 696,10 42 696,10 11 588,00 11 588,00

11,50% 64,80% -

Citoplazma Citoplazma Mitokondrium Mitokondrium

24

PGAM1 PGAM1

Phosphoglycerate mutase 1 Phosphoglycerate mutase 1 Succinyl-CoAligase [ADPSUCLA2 forming] subunitbeta, mitochondrial Succinyl-CoAligase [ADPSUCLA2 forming] subunitbeta, mitochondrial Aminosav anyagcsere Lipid anyagcsere és szállítás Nukleotid anyagcsere Szinaptikus transzmisszió DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2 DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2 DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2 DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2

P25113 P25113

835/I 835/II

0,03962 0,03962

-1,421 -1,421

28 786,80 28 786,80

18,10% 46,50%

Citoplazma Citoplazma

Q9Z219

443/I

0,01188

-1,1732

50 096,70

-

Mitokondrium

Q9Z219

443/II

0,01188

-1,1732

50 096,70

22,50%

Mitokondrium

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

P47942

166/I

0,04552

-1,1732

62 259,90

-

Citoplazma

P47942

166/II

0,04552

-1,1732

62 259,90

3,67%

Citoplazma

P47942

231/I

0,01657

-1,1954

62 259,90

-

Citoplazma

P47942

231/II

0,01657

-1,1954

62 259,90

15,90%

Citoplazma

SYN2

Synapsin-2

Q63537

164/I

0,04886

1,1052

63 439,50

28,70%

SYN2

Synapsin-2

Q63537

164/II

0,04886

1,1052

63 439,50

45,40%

Plazmamembrán Plazmamembrán

Fehérjeszintézis és feltekeredés Endoplazm. retikulum, citoplazma Endoplazm. retikulum, citoplazma Citoplazma, mitokondrium, sejtmag

HSPA5

78 kDa glucose-regulated protein

P06761

121/I

0,000906

1,1103

72 405,60

35,30%

HSPA5


P06761

121/II

0,000906

1,1103

72 405,60

35,40%

PFDN2

Prefoldin subunit 2

B0BN18

1010/I

0,02222

1,6697

16 515,70

69,50%

PFDN2

Prefoldin subunit 2

B0BN18

1010/II

0,02222

1,6697

16 515,70

63,60%

Citoplazma, mitokondrium, sejtmag

PURB

Transcriptional activator protein Pur-beta

Q68A21

575/I

0,03113

-1,1793

33 401,10

-

Sejtmag, citoplazma

PURB

Transcriptional activator protein Pur-beta

Q68A21

575/II

0,03113

-1,1793

33 401,10

21,30%

Sejtmag, citoplazma

O70593

614/I

0,0206

-1,5031

34 305,00

22,20%

Citoplazma

O70593

614/II

0,0206

-1,5031

34 305,00

19,70%

Citoplazma

SGTA

SGTA

Small glutaminerichtetratricopeptide repeat (TPR)-containing, alpha Small glutaminerichtetratricopeptide repeat (TPR)-containing, alpha

Proteolízis UCHL1

Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1

Q00981

842/I

0,01239

1,0459

24 820,20

30,90%

UCHL1

Ubiquitin carboxyl-terminal hydrolase isozyme L1

Q00981

842/II

0,01239

1,0459

24 820,20

33,20%

P04906 P04906

902/I 902/II

0,04016 0,04016

1,044 1,044

23 421,80 23 421,80

43,30% 43,80%

Oxidatív stressz GSTP1 Glutathione S-transferase P GSTP1 Glutathione S-transferase P

Citoplazma, endoplazm. retikulum Citoplazma, endoplazm. retikulum Citoplazma Citoplazma

25

Citoszkeletális ARHGDIA ARHGDIA CFL1 CFL1 CFL2 CFL2 INA INA GMFB GMFB Jelátvitel PEBP1 PEBP1 STRAP STRAP Egyéb ALB ALB ALB ALB ANXA3 ANXA3 CA1 CA1 FKBP1A FKBP1A FKBP1A FKBP1A FKBP1A FKBP1A FUBP1 FUBP1 HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB HBB HPR HPR NDRG1 NDRG1

Rho GDP-dissociation inhibitor 1 Rho GDP-dissociation inhibitor 1 Cofilin-1 Cofilin-1 Cofilin-2 Cofilin-2 Alpha-internexin Alpha-internexin Glia maturation factor beta Glia maturation factor beta Phosphatidylethanolaminebinding protein 1 Phosphatidylethanolaminebinding protein 1 Serine-threonine kinase receptor-associated protein Serine-threonine kinase receptor-associated protein Serum albumin Serum albumin Serum albumin Serum albumin Annexin A3 Annexin A3 Carbonic anhydrase 1 Carbonic anhydrase 1 Peptidyl-prolylcis-trans isomerase FKBP1A Peptidyl-prolylcis-trans isomerase FKBP1A Peptidyl-prolylcis-trans isomerase FKBP1A Peptidyl-prolylcis-trans isomerase FKBP1A Peptidyl-prolylcis-trans isomerase FKBP1A Peptidyl-prolylcis-trans isomerase FKBP1A Far upstream elementbinding protein 1 Far upstream elementbinding protein 1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Haptoglobin-related protein Haptoglobin-related protein Protein NDRG1 Protein NDRG1

Q5XI73

842/I

0,01239

1,0459

23 390,00

54,40%

Citoplazma

Q5XI73

842/II

0,01239

1,0459

23 390,00

25,50%

Citoplazma

P45592 P45592 P45591 P45591 P23565 P23565 Q63228 Q63228

1010/I 1010/II 1010/I 1010/II 614/I 614/II 1053/I 1053/II

0,02222 0,02222 0,02222 0,02222 0,0206 0,0206 0,04401 0,04401

1,6697 1,6697 1,6697 1,6697 -1,5031 -1,5031 1,089 1,089

18 515,20 18 515,20 18 692,30 18 692,30 56 098,70 56 098,70 16 718,60 16 718,60

71,70% 71,70% 59,00% 47,00% 17,20% 57,70% 63,40%

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma

P31044

842/I

0,01239

1,0459

20 783,30

-

Citoplazma

P31044

842/II

0,01239

1,0459

20 783,30

36,90%

Citoplazma

Q5XIG8

575/I

0,03113

-1,1793

38 468,20

-

Q5XIG8

575/II

0,03113

-1,1793

38 468,20

34,60%

P02770 P02770 P02770 P02770 P14669 P14669 B0BNN3 B0BNN3

166/I 166/II 902/I 902/II 713/I 713/II 835/I 835/II

0,04552 0,04552 0,04016 0,04016 0,03795 0,03795 0,03962 0,03962

-1,1732 -1,1732 1,044 1,044 1,2754 1,2754 -1,421 -1,421

68 713,20 68 713,20 68 713,20 68 713,20 36 347,20 36 347,20 28 281,90 28 281,90

26,30% 49,00% 6,41% 11,70% 32,70% 64,40% 57,10%

Szekretált Szekretált Szekretált Szekretált Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma

Q62658

1134/I

0,03995

-1,6054

11 904,70

25,00%

Citoplazma

Q62658

1134/II

0,03995

-1,6054

11 904,70

-

Citoplazma

Q62658

1141/I

0,04918

-1,8232

11 904,70

41,70%

Citoplazma

Q62658

1141/II

0,04918

-1,8232

11 904,70

-

Citoplazma

Q62658

1142/I

0,03334

-1,7432

11 904,70

41,70%

Citoplazma

Q62658

1142/II

0,03334

-1,7432

11 904,70

-

Citoplazma

Q32PX7

164/I

0,04886

1,1052

68 521,80

16,00%

Q32PX7

164/II

0,04886

1,1052

68 521,80

9,83%

P02091 P02091 P02091 P02091 P02091 P02091 P02091 P02091 P06866 P06866 Q6JE36 Q6JE36

1053/I 1053/II 1134/I 1134/II 1141/I 1141/II 1142/I 1142/II 614/I 614/II 443/I 443/II

0,04401 0,04401 0,03995 0,03995 0,04918 0,04918 0,03334 0,03334 0,0206 0,0206 0,01188 0,01188

1,089 1,089 -1,6054 -1,6054 -1,8232 -1,8232 -1,7432 -1,7432 -1,5031 -1,5031 -1,1732 -1,1732

15 961,30 15 961,30 15 961,30 15 961,30 15 961,30 15 961,30 15 961,30 15 961,30 38 545,00 38 545,00 42 936,20 42 936,20

17,70% 62,60% 77,60% 83,70% 25,60% 19,80% -

Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag

Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Szekretált Szekretált Citoplazma Citoplazma

26

PARK7

Protein DJ-1

O88767

905/I

0,04983

1,038

19 956,30

75,70%

PARK7

Protein DJ-1

O88767

905/II

0,04983

1,038

19 956,30

76,20%

P62828

902/I

0,04016

1,044

24 405,10

23,60%

P62828

902/II

0,04016

1,044

24 405,10

25,00%

GTP-binding nuclear protein Ran GTP-binding nuclear protein Ran

RAN RAN

Citoplazma, mitokondrium, sejtmag Citoplazma, mitokondrium, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag

1. táblázat: Az agykéreg teljes szöveti mintájából meghatározott, szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjék listája * Az I-es jelölés a kontroll állatokból származó minta fehérje-spotjaira vonatkozik, míg a II-es a kezeltekére.

Gén név

Fehérje név

Szénhidrát anyagcsere és energia háztartás FructoseALDOC bisphosphatealdolase C FructoseALDOC bisphosphatealdolase C Malate dehydrogenase, MDH1 cytoplasmic Malate dehydrogenase, MDH1 cytoplasmic Malate dehydrogenase, MDH1 cytoplasmic Malate dehydrogenase, MDH1 cytoplasmic Malate dehydrogenase, MDH1 cytoplasmic Malate dehydrogenase, MDH1 cytoplasmic Cytochrome b-c1 complex UQCRC1 subunit 1, mitochondrial Cytochrome b-c1 complex UQCRC1 subunit 1, mitochondrial Aminosav anyagcsere CRYM Mu-crystallin homolog CRYM Mu-crystallin homolog CRYM Mu-crystallin homolog CRYM Mu-crystallin homolog CRYM Mu-crystallin homolog CRYM Mu-crystallin homolog QDPR Dihydropteridinereductase QDPR Dihydropteridinereductase Lipid anyagcsere és szállítás APOE Apolipoprotein E APOE Apolipoprotein E APOE Apolipoprotein E APOE Apolipoprotein E APOE Apolipoprotein E APOE Apolipoprotein E Nukleotid anyagcsere Szinaptikus transzmisszió Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1

Azonosító

Spot szám*

p-érték


Molekulatömeg (Da)



P09117

581/I

0,04319

1,1168

39 266,30

76,30%

Citoplazma

P09117

581/II

0,04319

1,1168

39 266,30

71,60%

Citoplazma

O88989

705/I

0,01774

-1,3364

36 465,90

17,40%

Citoplazma

O88989

705/II

0,01774

-1,3364

36 465,90

11,40%

Citoplazma

O88989

741/I

0,04411

-1,3621

36 465,90

17,40%

Citoplazma

O88989

741/II

0,04411

-1,3621

36 465,90

11,40%

Citoplazma

O88989

1274/I

0,04828

-1,4238

36 465,90

17,40%

Citoplazma

O88989

1274/II

0,04828

-1,4238

36 465,90

11,40%

Citoplazma

Q68FY0

408/I

0,006006

-1,1267

52 830,60

29,60%

Mitokondrium

Q68FY0

408/II

0,006006

-1,1267

52 830,60

25,20%

Mitokondrium

Q9QYU4 Q9QYU4 Q9QYU4 Q9QYU4 Q9QYU4 Q9QYU4 P11348 P11348

705/I 705/II 741/I 741/II 1274/I 1274/II 1246/I 1246/II

0,01774 0,01774 0,04411 0,04411 0,04828 0,04828 0,03366 0,03366

-1,3364 -1,3364 -1,3621 -1,3621 -1,4238 -1,4238 -1,1036 -1,1036

33 535,90 33 535,90 33 535,90 33 535,90 33 535,90 33 535,90 25 534,30 25 534,30

30,70% 30,70% 30,70% 43,20% -

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma

P02650 P02650 P02650 P02650 P02650 P02650

705/I 705/II 741/I 741/II 1274/I 1274/II

0,01774 0,01774 0,04411 0,04411 0,04828 0,04828

-1,3364 -1,3364 -1,3621 -1,3621 -1,4238 -1,4238

35 848,30 35 848,30 35 848,30 35 848,30 35 848,30 35 848,30

19,30% 19,30% 19,30% -

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma

-

-

-

-

-

-

-

Q9Z2L0

949/I

0,02486

-1,0549

30 723,80

12,70%

Mitokondrium citoplazma

27

Voltage-dependent anionselective channel protein 1 Fehérjeszintézis és feltekeredés Eukaryotic translation EIF3J initiation factor 3 subunit J Eukaryotic translation EIF3J initiation factor 3 subunit J Eukaryotic translation EIF3J initiation factor 3 subunit J Eukaryotic translation EIF3J initiation factor 3 subunit J Eukaryotic translation EIF3J initiation factor 3 subunit J Eukaryotic translation EIF3J initiation factor 3 subunit J VDAC1

Q9Z2L0

949/II

0,02486

-1,0549

30 723,80

16,30%

Mitokondrium citoplazma

A0JPM9

705/I

0,01774

-1,3364

29 468,80

21,70%

Citoplazma

A0JPM9

705/II

0,01774

-1,3364

29 468,80

-

Citoplazma

A0JPM9

741/I

0,04411

-1,3621

29 468,80

21,70%

Citoplazma

A0JPM9

741/II

0,04411

-1,3621

29 468,80

-

Citoplazma

A0JPM9

1274/I

0,04828

-1,4238

29 468,80

21,70%

Citoplazma

A0JPM9

1274/II

0,04828

-1,4238

29 468,80

-

Citoplazma Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag

PCBP1

Poly(rC)-binding protein 1

P60335

581/I

0,04319

1,1168

37 480,20

28,40%

PCBP1

Poly(rC)-binding protein 1

P60335

581/II

0,04319

1,1168

37 480,20

36,80%

-

-

-

-

-

-

-

-

Q9Z0V6

949/I

0,02486

-1,0549

28 277,40

18,30%

Mitokondrium

Q9Z0V6

949/II

0,02486

-1,0549

28 277,40

8,95%

Mitokondrium

P60711 P60711 P60711 P60711 P60711 P60711

408/I 408/II 486/I 486/II 496/I 496/II

0,00601 0,00601 0,03477 0,03477 0,04119 0,04119

-1,1267 -1,1267 1,1182 1,1182 1,1244 1,1244

41 818,90 41 818,90 41 818,90 41 818,90 41 818,90 41 818,90

29,30% 20,20% 34,60% 43,10% 20,20%

Q7TQD2

932/I

0,03183

-1,4271

23 556,70

12,40%

Q7TQD2

932/II

0,03183

-1,4271

23 556,70

-

Q7TQD2

933/I

0,04499

-1,4556

23 556,70

13,80%

Q7TQD2

933/II

0,04499

-1,4556

23 556,70

-

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag

P54311

705/I

0,01774

-1,3364

37 359,50

-

Citoplazma

P54311

705/II

0,01774

-1,3364

37 359,50

9,41%

Citoplazma

P54311

741/I

0,04411

-1,3621

37 359,50

-

Citoplazma

P54311

741/II

0,04411

-1,3621

37 359,50

9,41%

Citoplazma

P54311

1274/I

0,04828

-1,4238

37 359,50

-

Citoplazma

P54311

1274/II

0,04828

-1,4238

37 359,50

9,41%

Citoplazma

Proteolízis Oxidatív stressz

Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial Thioredoxin-dependent peroxide reductase, mitochondrial

PRDX3

PRDX3 Citoszkeletális ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB ACTB TPPP TPPP TPPP TPPP

Actin, cytoplasmic 1 Actin, cytoplasmic 1 Actin, cytoplasmic 1 Actin, cytoplasmic 1 Actin, cytoplasmic 1 Actin, cytoplasmic 1 Tubulin polymerizationpromoting protein Tubulin polymerizationpromoting protein Tubulin polymerizationpromoting protein Tubulin polymerizationpromoting protein

Jelátvitel GNB1

GNB1

GNB1

GNB1

GNB1

GNB1

Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1 Guanine nucleotide-binding protein G(I)/G(S)/G(T) subunit beta-1

28

Egyéb GSTM1 GSTM1 GSTM1 GSTM1 HBB HBB HBB HBB HBB HBB HSD17B10 HSD17B10 HSD17B10 HSD17B10 HSD17B10 HSD17B10 NDRG2 NDRG2 NDRG2 NDRG2

Glutathione S-transferase Mu 1 Glutathione S-transferase Mu 1 Glutathione S-transferase Mu 1 Glutathione S-transferase Mu 1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 Hemoglobin subunit beta-1 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase type-2 Protein NDRG2 Protein NDRG2 Protein NDRG2 Protein NDRG2

P04905

932/I

0,03183

-1,4271

25 897,80

35,30%

Citoplazma

P04905

932/II

0,03183

-1,4271

25 897,80

-

Citoplazma

P04905

933/I

0,04499

-1,4556

25 897,80

50,90%

Citoplazma

P04905

933/II

0,04499

-1,4556

25 897,80

-

Citoplazma

P02091 P02091 P02091 P02091 P02091 P02091

932/I 932/II 933/I 933/II 1246/I 1246/II

0,03183 0,03183 0,04499 0,04499 0,03366 0,03366

-1,4271 -1,4271 -1,4556 -1,4556 -1,1036 -1,1036

15 961,30 15 961,30 15 961,30 15 961,30 15 961,30 15 961,30

36,70% 61,20% 15,60% -

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma

O70351

408/I

0,00601

-1,1267

27 227,40

16,90%

Mitokondrium

O70351

408/II

0,00601

-1,1267

27 227,40

-

Mitokondrium

O70351

932/I

0,03183

-1,4271

27 227,40

49,40%

Mitokondrium

O70351

932/II

0,03183

-1,4271

27 227,40

-

Mitokondrium

O70351

933/I

0,04499

-1,4556

27 227,40

44,40%

Mitokondrium

O70351

933/II

0,04499

-1,4556

27 227,40

-

Mitokondrium

Q8VBU2 Q8VBU2 Q8VBU2 Q8VBU2

486/I 486/II 496/I 496/II

0,03477 0,03477 0,04119 0,04119

1,1182 1,1182 1,1244 1,1244

40 761,70 40 761,70 40 761,70 40 761,70

49,60% 39,60% 29,60%

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma

2. táblázat: A thalamus teljes szöveti mintájából meghatározott, szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjék listája * Az I-es jelölés a kontroll állatokból származó minta fehérje-spotjaira vonatkozik, míg a II-es a kezeltekére.

Gén név

Fehérje név

Szénhidrát anyagcsere és energia háztartás FructoseALDOC bisphosphatealdolase C FructoseALDOC bisphosphatealdolase C ATP synthase subunit d, ATP5H mitochondrial ATP synthase subunit d, ATP5H mitochondrial ATP synthase subunit d, ATP5H mitochondrial ATP synthase subunit d, ATP5H mitochondrial ATP synthase subunit d, ATP5H mitochondrial ATP synthase subunit d, ATP5H mitochondrial Cytochrome c oxidase COX5A subunit 5A, mitochondrial Cytochrome c oxidase COX5A subunit 5A, mitochondrial

Azonosító

Spot szám*

p-érték


Molekulatömeg (Da)



P09117

520/I

0,02827

1,1423

39 266,30

58,70%

Citoplazma

P09117

520/II

0,02827

1,1423

39 266,30

40,50%

Citoplazma

P31399

1057/I

0,02366

1,1643

18 746,00

42,20%

Mitokondrium

P31399

1057/II

0,02366

1,1643

18 746,00

39,10%

Mitokondrium

P31399

1453/I

0,04943

-1,0776

18 746,00

63,40%

Mitokondrium

P31399

1453/II

0,04943

-1,0776

18 746,00

76,40%

Mitokondrium

P31399

1464/I

0,04008

1,1292

18 746,00

-

Mitokondrium

P31399

1464/II

0,04008

1,1292

18 746,00

18,60%

Mitokondrium

P11240

1321/I

0,03557

-1,0841

16 717,40

22,40%

Mitokondrium

P11240

1321/II

0,03557

-1,0841

16 717,40

22,40%

Mitokondrium

29

Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma, mitokondrium Citoplazma, mitokondrium Citoplazma, mitokondrium Citoplazma, mitokondrium

ENO1

Alpha-enolase

P04764

271/I

0,02028

-1,1555

47 111,00

56,70%

ENO1

Alpha-enolase

P04764

271/II

0,02028

-1,1555

47 111,00

35,00%

ENO1

Alpha-enolase

P04764

309/I

0,03929

1,2464

47 111,00

6,68%

ENO1

Alpha-enolase

P04764

309/II

0,03929

1,2464

47 111,00

24,90%

P14408

348/I

0,02741

1,1205

54 446,30

27,60%

P14408

348/II

0,02741

1,1205

54 446,30

20,90%

P14408

349/I

0,01069

1,0747

54 446,30

21,50%

P14408

349/II

0,01069

1,0747

54 446,30

27,60%

P04797

688/I

0,02443

-1,0934

35 792,10

27,90%

Citoplazma

P04797

688/II

0,02443

-1,0934

35 792,10

-

Citoplazma

P04797

1471/I

0,01977

-1,1347

35 792,10

50,20%

Citoplazma

P04797

1471/II

0,01977

-1,1347

35 792,10

45,90%

Citoplazma

O88989

731/I

0,01093

1,2497

36 465,90

38,00%

Citoplazma

O88989

731/II

0,01093

1,2497

36 465,90

31,10%

Citoplazma

P04636

1471/I

0,01977

-1,1347

35 593,90

40,80%

Mitokondrium

P04636

1471/II

0,01977

-1,1347

35 593,90

41,70%

Mitokondrium

P16617 P16617

468/I 468/II

0,04488 0,04488

-1,1227 -1,1227

44 521,00 44 521,00

24,90% 42,70%


Q68FY0

330/I

0,01483

1,0845

52 830,60

3,96%

Mitokondrium

Q68FY0

330/II

0,01483

1,0845

52 830,60

-

Mitokondrium

Q68FY0

336/I

0,01386

-1,1968

52 830,60

-

Mitokondrium

Q68FY0

336/II

0,01386

-1,1968

52 830,60

21,90%

Mitokondrium

P12007

441/I

0,03894

-1,1369

46 418,30

22,90%

Mitokondrium

P12007

441/II

0,03894

-1,1369

46 418,30

5,42%

Mitokondrium

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Q6AYH5 Q6AYH5

307/I 307/II

0,03287 0,03287

-1,0675 -1,0675

44 130,40 44 130,40

13,90% 31,30%


P47942

105/I

0,0292

1,1219

62 259,90

10,50%

Citoplazma

P47942

105/II

0,0292

1,1219

62 259,90

-

Citoplazma

P47942

143/I

0,02191

1,1015

62 259,90

-

Citoplazma

Fumaratehydratase, mitochondrial Fumaratehydratase, FH mitochondrial Fumaratehydratase, FH mitochondrial Fumaratehydratase, FH mitochondrial Glyceraldehyde-3GAPDH phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde-3GAPDH phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde-3GAPDH phosphate dehydrogenase Glyceraldehyde-3GAPDH phosphate dehydrogenase Malate dehydrogenase, MDH1 cytoplasmic Malate dehydrogenase, MDH1 cytoplasmic Malate dehydrogenase, MDH2 mitochondrial Malate dehydrogenase, MDH2 mitochondrial PGK1 Phosphoglycerate kinase 1 PGK1 Phosphoglycerate kinase 1 Cytochrome b-c1 complex UQCRC1 subunit 1, mitochondrial Cytochrome b-c1 complex UQCRC1 subunit 1, mitochondrial Cytochrome b-c1 complex UQCRC1 subunit 1, mitochondrial Cytochrome b-c1 complex UQCRC1 subunit 1, mitochondrial Aminosav anyagcsere Isovaleryl-CoA IVD dehydrogenase, mitochondrial Isovaleryl-CoA IVD dehydrogenase, mitochondrial Lipid anyagcsere és szállítás Nukleotid anyagcsere Szinaptikus transzmisszió DCTN2 Dynactin subunit 2 DCTN2 Dynactin subunit 2 DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2 DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2 DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2 FH

30

Dihydropyrimidinaserelated protein 2 DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2 DihydropyrimidinaseDPYSL2 related protein 2 SEPT3 Neuronal-specific septin-3 SEPT3 Neuronal-specific septin-3 SNCA Alpha-synuclein SNCA Alpha-synuclein Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Voltage-dependent anionVDAC1 selective channel protein 1 Fehérjeszintézis és feltekeredés Endoplasmic reticulum ERP29 resident protein 29 Endoplasmic reticulum ERP29 resident protein 29 DPYSL2

P47942

143/II

0,02191

1,1015

62 259,90

41,40%

Citoplazma

P47942

150/I

0,00258

1,11

62 259,90

12,10%

Citoplazma

P47942

150/II

0,00258

1,11

62 259,90

34,60%

Citoplazma

Q9WU34 Q9WU34 P37377 P37377

441/I 441/II 1230/I 1230/II

0,03894 0,03894 0,02687 0,02687

-1,1369 -1,1369 -1,1598 -1,1598

40 580,40 40 580,40 14 466,30 14 466,30

18,20% 52,10%

Q9Z2L0

803/I

0,00468

-1,0618

32 334,70

15,90%

Q9Z2L0

803/II

0,00468

-1,0618

32 334,70

53,70%

Q9Z2L0

858/I

0,04176

1,1216

32 334,70

46,30%

Q9Z2L0

858/II

0,04176

1,1216

32 334,70

25,70%

Q9Z2L0

895/I

0,03853

-1,1339

32 334,70

-

Q9Z2L0

895/II

0,03853

-1,1339

32 334,70

60,10%

Q9Z2L0

950/I

0,01355

1,292

32 334,70

-

Q9Z2L0

950/II

0,01355

1,292

32 334,70

8,11%

Q9Z2L0

953/I

0,02718

1,1028

32 334,70

60,10%

Q9Z2L0

953/II

0,02718

1,1028

32 334,70

61,80%

Q9Z2L0

993/I

0,02523

1,4225

32 334,70

13,90%

Q9Z2L0

993/II

0,02523

1,4225

32 334,70

37,80%

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma Mitokondrium citoplazma

P52555

868/I

0,02885

1,1918

28 558,30

33,50%

P52555

868/II

0,02885

1,1918

28 558,30

31,20%

Endoplazm. retikulum Endoplazm. retikulum Endoplazm. retikulum, citoplazma Endoplazm. retikulum, citoplazma

HSPA5


P06761

96/I

0,01622

1,1524

72 362,60

35,60%

HSPA5


P06761

96/II

0,01622

1,1524

72 362,60

26,10%

P63018

105/I

0,0292

1,1219

70 788,60

10,40%

Citoplazma

P63018

105/II

0,0292

1,1219

70 788,60

-

Citoplazma

P63018

118/I

0,01996

1,2435

70 788,60

47,20%

Citoplazma

P63018

118/II

0,01996

1,2435

70 788,60

36,80%

Citoplazma

P48721

105/I

0,0292

1,1219

73 840,40

26,10%

Mitokondrium

P48721

105/II

0,0292

1,1219

73 840,40

23,70%

Mitokondrium

P63039

180/I

0,02083

1,26

60 938,80

35,80%

Mitokondrium

P63039

180/II

0,02083

1,26

60 938,80

25,80%

Mitokondrium

P63039

183/I

0,01777

1,2643

60 938,80

58,50%

Mitokondrium

HSPA8 HSPA8 HSPA8 HSPA8 HSPA9 HSPA9 HSPD1 HSPD1 HSPD1

Heat shock cognate 71 kDa protein Heat shock cognate 71 kDa protein Heat shock cognate 71 kDa protein Heat shock cognate 71 kDa protein Stress-70 protein, mitochondrial Stress-70 protein, mitochondrial 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 60 kDa heat shock protein,

31

HSPD1 HSPD1 HSPD1 HSPD1 HSPD1 PDIA3 PDIA3 PPIA PPIA RPS16 RPS16 Proteolízis PSMC4 PSMC4 Oxidatív stressz PRDX6 PRDX6 Citoszkeletális ARPC5 ARPC5 CAPZB CAPZB MBP MBP MBP MBP MBP MBP MYL6 MYL6 PFN2 PFN2 TUBB5 TUBB5 TUBB5 TUBB5 TUBB5 TUBB5 Jelátvitel Egyéb HIST1H2BH HIST1H2BH PARK7

mitochondrial 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 60 kDa heat shock protein, mitochondrial 60 kDa heat shock protein, mitochondrial Protein disulfide-isomerase A3 Protein disulfide-isomerase A3 Peptidyl-prolylcis-trans isomerase A Peptidyl-prolylcis-trans isomerase A 40S ribosomal protein S16 40S ribosomal protein S16 26S protease regulatory subunit 6B 26S protease regulatory subunit 6B Peroxiredoxin-6 Peroxiredoxin-6

P63039

183/II

0,01777

1,2643

60 938,80

41,40%

Mitokondrium

P63039

197/I

0,04557

-1,1181

60 938,80

-

Mitokondrium

P63039

197/II

0,04557

-1,1181

60 938,80

9,25%

Mitokondrium

P63039

1464/I

0,04008

1,1292

60 938,80

47,10%

Mitokondrium

P63039

1464/II

0,04008

1,1292

60 938,80

30,90%

Mitokondrium

P11598

197/I

0,04557

-1,1181

56 607,50

-

P11598

197/II

0,04557

-1,1181

56 607,50

17,00%

P10111

1232/I

0,01103

1,0907

17 856,80

38,40%

Citoplazma

P10111

1232/II

0,01103

1,0907

17 856,80

59,80%

Citoplazma

P62250 P62250

1271/I 1271/II

0,01677 0,01677

-1,117 -1,117

16 427,90 16 427,90

14,40%


Q63570

330/I

0,01483

1,0845

47 349,70

6,46%

Citoplazma

Q63570

330/II

0,01483

1,0845

47 349,70

-

Citoplazma

O35244 O35244

950/I 950/II

0,01355 0,01355

1,292 1,292

24 801,90 24 801,90

68,80%


Q4KLF8

1215/I

0,02457

-1,0816

16 302,60

16,60%

Citoplazma

Q4KLF8

1215/II

0,02457

-1,0816

16 302,60

29,10%

Citoplazma

Q5XI32

751/I

0,04006

-1,1247

33 724,20

41,90%

Citoplazma

Endoplazm. retikulum Endoplazm. retikulum

Actin-related protein 2/3 complex subunit 5 Actin-related protein 2/3 complex subunit 5 F-actin-capping protein subunit beta F-actin-capping protein subunit beta Myelin basic protein S Myelin basic protein S Myelin basic protein S Myelin basic protein S Myelin basic protein S Myelin basic protein S Myosin light polypeptide 6 Myosin light polypeptide 6 Profilin-2 Profilin-2 Tubulin beta-5 chain Tubulin beta-5 chain Tubulin beta-5 chain Tubulin beta-5 chain Tubulin beta-5 chain Tubulin beta-5 chain

Q5XI32

751/II

0,04006

-1,1247

33 724,20

36,90%

Citoplazma

P02688 P02688 P02688 P02688 P02688 P02688 Q64119 Q64119 Q9EPC6 Q9EPC6 P69897 P69897 P69897 P69897 P69897 P69897

1215/I 1215/II 1230/I 1230/II 1271/I 1271/II 1271/I 1271/II 1377/I 1377/II 688/I 688/II 755/I 755/II 1351/I 1351/II

0,02457 0,02457 0,02687 0,02687 0,01677 0,01677 0,01677 0,01677 0,04976 0,04976 0,02443 0,02443 0,04242 0,04242 0,03441 0,03441

-1,0816 -1,0816 -1,1598 -1,1598 -1,117 -1,117 -1,117 -1,117 1,1318 1,1318 -1,0934 -1,0934 -1,1384 -1,1384 1,1676 1,1676

21 484,90 21 484,90 21 484,90 21 484,90 21 484,90 21 484,90 16 911,80 16 911,80 14 984,10 14 984,10 49 652,60 49 652,60 49 652,60 49 652,60 49 652,60 49 652,60

14,90% 26,70% 16,90% 12,30% 24,50% 15,90% 30,70% 7,78% 7,11% 10,10% -

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma

-

-

-

-

-

-

-

-

Histone H2B type 1 Histone H2B type 1

Q00715 Q00715

1271/I 1271/II

0,01677 0,01677

-1,117 -1,117

13 934,70 13 934,70

20,60%

Protein DJ-1

O88767

993/I

0,02523

1,4225

19 956,30

-

Sejtmag Sejtmag Citoplazma, mitokondrium

32

PARK7 PDZD11 PDZD11 WDR61 WDR61

Protein DJ-1 PDZ domain-containing protein 11 PDZ domain-containing protein 11 WD repeat-containing protein 61 WD repeat-containing protein 61

sejtmag Citoplazma, mitokondrium sejtmag

O88767

993/II

0,02523

1,4225

19 956,30

42,30%

Q9CZG9

1232/I

0,01103

1,0907

16 137,60

-

Citoplazma

Q9CZG9

1232/II

0,01103

1,0907

16 137,60

26,40%

Citoplazma

Q4V7A0

755/I

0,04242

-1,1384

33 755,20

23,60%

Q4V7A0

755/II

0,04242

-1,1384

33 755,20

-


3. táblázat: Az agykéreg szinaptoszóma preparátumából meghatározott, szignifikánsan megváltozott expressziójú fehérjék listája * Az I-es jelölés a kontroll állatokból származó minta fehérje-spotjaira vonatkozik, míg a II-es a kezeltekére.

Gén név

Fehérje név

Szénhidrát anyagcsere és energia háztartás ATP synthase subunit alpha, ATP5A1 mitochondrial ATP synthase subunit alpha, ATP5A1 mitochondrial ATP synthase subunit alpha, ATP5A1 mitochondrial ATP synthase subunit alpha, ATP5A1 mitochondrial ATP synthase subunit beta, ATP5B mitochondrial ATP synthase subunit beta, ATP5B mitochondrial Pyruvate dehydrogenase E1 PDHA1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial Pyruvate dehydrogenase E1 PDHA1 component subunit alpha, somatic form, mitochondrial Aminosav anyagcsere

Azonosító

Spot szám*

p-érték


Molekulatömeg (Da)



P15999

356/I

0,04649

-1,1348

59 737,20

-

Mitokondrium

P15999

356/II

0,04649

-1,1348

59 737,20

9,95%

Mitokondrium

P15999

429/I

0,0493

-1,0604

59 737,20

-

Mitokondrium

P15999

429/II

0,0493

-1,0604

59 737,20

32,30%

Mitokondrium

P10719

903/I

0,025

-1,0866

56 542,50

22,50%

Mitokondrium

P10719

903/II

0,025

-1,0866

56 542,50

21,90%

Mitokondrium

P26284

520/I

0,01904

1,0695

43 214,50

30,30%

Mitokondrium

P26284

520/II

0,01904

1,0695

43 214,50

23,10%

Mitokondrium

Citoplazma, mitokondrium Citoplazma, mitokondrium Citoplazma, mitokondrium Citoplazma, mitokondrium

GLUL

Glutamine synthetase

P09606

520/I

0,01904

1,0695

42 250,30

39,70%

GLUL


P09606

520/II

0,01904

1,0695

42 250,30

46,10%

GLUL


P09606

808/I

0,01008

-1,1625

42 250,30

14,50%

GLUL


P09606

808/II

0,01008

-1,1625

42 250,30

5,63%

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

P47942

265/I

0,01202

-1,1098

62 259,90

43,70%

Citoplazma

P47942

265/II

0,01202

-1,1098

62 259,90

50,50%

Citoplazma

Q9CWZ7

718/I

0,04371

-1,0691

34 728,90

42,00%

Citoplazma

Q9CWZ7

718/II

0,04371

-1,0691

34 728,90

50,00%

Citoplazma

Lipid anyagcsere és szállítás Nukleotid anyagcsere Szinaptikus transzmisszió Dihydropyrimidinase-related DPYSL2 protein 2 Dihydropyrimidinase-related DPYSL2 protein 2 Gamma-soluble NSF NAPG attachment protein NAPG Gamma-soluble NSF

33

attachment protein SEPT6 Septin-6 SEPT6 Septin-6 SEPT6 Septin-6 SEPT6 Septin-6 SYN2 Synapsin-2 SYN2 Synapsin-2 Fehérjeszintézisés és feltekeredés Endoplasmic reticulum resident ERP29 protein 29 Endoplasmic reticulum resident ERP29 protein 29

Q9R1T4 Q9R1T4 Q9R1T4 Q9R1T4 Q63537 Q63537

429/I 429/II 641/I 641/II 356/I 356/II

0,0493 0,0493 0,04176 0,04176 0,04649 0,04649

-1,0604 -1,0604 1,1273 1,1273 -1,1348 -1,1348

49 602,20 49 602,20 49 602,20 49 602,20 63 439,50 63 439,50

33,60% 37,60% 12,40% 36,30% 31,60%

P52555

1017/I

0,04128

-1,1054

28 558,30

55,40%

P52555

1017/II

0,04128

-1,1054

28 558,30

44,20%

Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Citoplazma Endoplazm. retikulum Endoplazm. retikulum Endoplazm. retikulum, citoplazma Endoplazm. retikulum, citoplazma

HSPA5


P06761

159/I

0,03854

1,1653

72 405,60

22,10%

HSPA5


P06761

159/II

0,03854

1,1653

72 405,60

42,00%

P10111

1429/I

0,01667

-1,2266

17 857,00

57,00%

Citoplazma

P10111

1429/II

0,01667

-1,2266

17 857,00

32,00%

Citoplazma

Q68A21

718/I

0,04371

-1,0691

33 401,10

34,00%

Q68A21

718/II

0,04371

-1,0691

33 401,10

21,90%

PPIA PPIA PURB PURB

Peptidyl-prolylcis-trans isomerase A Peptidyl-prolylcis-trans isomerase A Transcriptional activator protein Pur-beta Transcriptional activator protein Pur-beta

Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag

RPLP0

60S acidic ribosomal protein P0

P19945

808/I

0,01008

-1,1625

34 198,40

-

RPLP0

60S acidic ribosomal protein P0

P19945

808/II

0,01008

-1,1625

34 198,40

33,40%

Cathepsin D Cathepsin D Ubiquitin-conjugating enzyme UBE2L3 E2 L3 Ubiquitin-conjugating enzyme UBE2L3 E2 L3 Oxidatív stressz Citoszkeletális F-actin-capping protein subunit CAPZA2 alpha-2 F-actin-capping protein subunit CAPZA2 alpha-2 F-actin-capping protein subunit CAPZA2 alpha-2 F-actin-capping protein subunit CAPZA2 alpha-2 EF-hand domain-containing EFHD2 protein D2 EF-hand domain-containing EFHD2 protein D2 TPM3 Tropomyosin alpha-3 chain TPM3 Tropomyosin alpha-3 chain Jelátvitel Egyéb Peptidyl-prolylcis-trans PIN1 isomerase NIMA-interacting 1 Peptidyl-prolylcis-trans PIN1 isomerase NIMA-interacting 1

P24268 P24268

641/I 641/II

0,04176 0,04176

1,1273 1,1273

44 664,00 44 664,00

27,80% 19,70%

P68036

1429/I

0,01667

-1,2266

17 844,00

29,00%

P68036

1429/II

0,01667

-1,2266

17 844,00

27,00%

-

-

-

-

-

-

-

Q3T1K5

429/I

0,0493

-1,0604

32 949,20

-

Citoplazma

Q3T1K5

429/II

0,0493

-1,0604

32 949,20

19,90%

Citoplazma

Q3T1K5

808/I

0,01008

-1,1625

32 949,20

43,40%

Citoplazma

Q3T1K5

808/II

0,01008

-1,1625

32 949,20

75,20%

Citoplazma

Q4FZY0

903/I

0,025

-1,0866

26 742,20

43,90%

Citoplazma

Q4FZY0

903/II

0,025

-1,0866

26 742,20

23,80%

Citoplazma

Q63610 Q63610

903/I 903/II

0,025 0,025

-1,0866 -1,0866

28 989,20 28 989,20

50,00%


-

-

-

-

-

-

-

Q13526

1429/I

0,01667

-1,2266

18 256,00

25,00%

Q13526

1429/II

0,01667

-1,2266

18 256,00

39,00%

Proteolízis CTSD CTSD

Citoplazma Citoplazma Citoplazma, sejtmag Citoplazma, sejtmag


34

4. táblázat: A thalamus szinaptoszóma preparátumából meghatározott, szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjék listája * Az I-es jelölés a kontroll állatokból származó minta fehérje-spotjaira vonatkozik, míg a II-es a kezeltekére.

6.2. A proteomikai megközelítés és módszertan előnyei, valamint korlátai Az élettani jelenségek megértéséhez szükség van a sejtszintű folyamatok kivitelezésében szereplő fehérjék expressziójában vagy poszttranszlációs módosításában bekövetkező változások megismerésére egy-egy vizsgálati szituáció esetén. A proteomikai vizsgálómódszerrel

egy

adott

pillanatban

rögzíthetjük

és

hasonlíthatjuk

össze

a

beavatkozásnak kitett és a kontrollként használt élőlények valamely szöveti mintájának, vagy az abból készített szubcelluláris preparátumának fehérjekészletét kvantitatív és kvalitatív szempontból is. A proteomikai technikákkal potenciálisan több ezer fehérje detekciójára vagyunk képesek (Gauci és mtsai, 2011). Ismert, hogy az mRNS-szint és a ténylegesen expresszált fehérjék mennyisége között nem vonhatunk egyértelműen párhuzamot (Gygi és mtsai, 1999; Taniguchi és mtsai, 2010; Ravasaard és mtsai, 2009). Ennek következtében a sejtben funkciójukat ellátó fehérjék aktuális mennyiségének meghatározása megbízhatóan csak a már szintetizált molekulák kvantitatív analízisével lehetséges. A leggyakrabban alkalmazott proteomikai technikák egyik hátránya, hogy a membránfehérjék legnagyobb része kevéssé oldható csak a kétlépcsős fehérje-elválasztási metodikában alkalmazott körülmények között, így a kapott gélekben az intracelluláris fehérjékhez képest kis számban találhatóak meg. Ezenkívül fontos megemlíteni, hogy a fluoreszcens festés során a legnagyobb kópiaszámban jelenlévő proteinek jelölhetőek meg elsősorban, és a használt fehérje-elválasztási technikából kifolyólag a túl nagy molekulatömegű (>250 kDa), vagy a 3-10 pH tartománytól eltérő izoelektromos ponttal rendelkező fehérjék detektálása nem lehetséges (Chevalier, 2010). A molekulatömeg korlátozó szerepére utal, hogy vizsgálataink során 73 840,40 Da-os (HSPA9) volt a legnagyobb, és 11 588,00 Da-os (CYCS) a legkisebb tömegű fehérje. A fehérjék poszttranszlációs módosulásai (többek között foszforilációjuk, vagy enzimatikus hasításuk) természetesen befolyásolhatják elektroforetikus mobilizációjukat, így a gélekben elfoglalt helyüket. A szintézis utáni molekuláris változásokra utalnak az egy gélen több fehérje-spotban megjelenő azonos proteinek. Az egyetlen spotban kimutatott fehérjék

35

esetén viszont nem tudhatjuk, hogy a fehérje poszttranszlációs módosulása, vagy expressziósváltozása vezetett a protein megjelenéséhez. Napjainkban azonban léteznek már technikák az ilyen bizonytalanságok kiküszöbölésére. A foszforilációs változások azonosításával például információt nyerhetünk az úgynevezett „foszfoproteom”-ról (Mumby és Brekken, 2005; Mertins és mtsai, 2011). Ezzel még egzaktabb eredmények születhetnek egy-egy beavatkozás élő szervezetre kifejtett hatásairól. Az általunk végzett vizsgálatban használt technika nem tette lehetővé számunkra a fehérje-expressziós változások és poszttranszlációs módosítások biztos megkülönböztetését. Ez nem jelent azonban problémát esetünkben, mivel a vizsgálat által a fehérjekészletben bekövetkező globális változásokra vagyunk kíváncsiak, és elsősorban arra, hogy az alvás megvonása mely funkciókban szereplő fehérjékre volt hatással - legyen szó akár a kópiaszám megnöveléséről, akár egy fehérje foszforilált formájának mennyiségi változásáról. 6.3. Az azonosított fehérjék sejtes funkciói Az alvásmegvonás hatására szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjék között összességében a legtöbb sejtszintű folyamatban szereplő proteineket mutattunk ki. A négy kísérleti szituációban (teljes szövetből származó, illetve szinaptoszomális, agykérgi és thalamicus minták) összesen 17 féle, a szénhidrát anyagcserében szereplő, és 16 féle citoszkeletális fehérjét találtunk. 14 protein vesz részt a fehérjék szintézisében vagy feltekeredésük mechanizmusában, 8 a szinaptikus transzmisszióban és 4 az aminosav anyagcserében. 4 fehérje a proteolítikus rendszer része, 3 valamely jelátviteli folyamatban játszik szerepet, míg szintén 3 az oxidatív stresszre adott válaszreakcióban működik közre. A lipid anyagcserében és transzportban 1 fehérje bír funkcióval. 17 másik protein nem volt egyértelműen besorolható csak egy kategóriába. Jelenlegi ismereteink szerint a nukleotid anyagcsere folyamataiban egy megváltozott mennyiségű fehérje sem tölt be szerepet. Az alábbiakban az egyes fehérjék funkcióinak bemutatása olvasható, a létrehozott funkcionális kategóriák szerinti csoportosításban. A szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban történt változások A szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban szereplő 17 fehérje közül több is kiemelt szerepet játszik a szinaptikus transzmisszió összetett folyamatának bizonyos lépéseiben. A kutatások alapján ismert az aldoláz-C (ALDOC), az enoláz-1 (ENO1), enoláz-2 36

(ENO2), a gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH), a foszfoglicerát mutáz-1 (PGAM1) és a foszfoglicerát kináz-1 (PGK1) glikolítikus enzimek jelenléte a szinaptikus vezikulákon, illetve a szinaptikus plazmamembránon (Knull, 1980; Bähler és mtsai, 1991; Ikemoto és Ueda, 2003; Lundmark és Carlsson, 2004; Ueta és mtsai, 2004; Morciano és mtsai, 2005; Burré és Volknandt, 2007). A glikolítikus enzimek lokalizációja a szinaptikus vezikulák membránján, egymással kapcsolt fehérje-komplexként, a neurotranszmitterek szinaptikus vezikulákba történő bejuttatásának nagy energiaigénye miatt lehet szükséges. Egy vizsgálat eredménye szerint a neurotranszmitter-feltöltés a mitokondriális ATP-szintézistől kevésbé függ, mint a helyi – vezikulumokhoz asszociáltan zajló – ATP-t produkáló mechanizmusoktól (Ikemoto és mtsai, 2003). A gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) mindemellett a posztszinaptikus denzitásban, aktinszálakhoz kötve is megtalálható (Rogalski-Wilk és Cohen, 1997). Az agyban előforduló kreatin kináz (CKB) szintén közreműködik a glutamát vezikuláris felvételében a preszinaptikus területeken. Egy kutatás során kimutatták, hogy a foszfokreatin-függő glutamát-transzport az ATP-t igénylő mechanizmus mellett különösen nagy jelentőségű lehet – akár a glutamát neurotranszmittert transzportáló folyamatok 25-50%ának energiaszükségletét is fedezheti (Xu és mtsai, 1996). A malát dehidrogenáz-1 és malát dehidrogenáz-2 (MDH1, MDH2) a citromsavciklusban szereplő enzimek, melyek minden bizonnyal fontos funkcióval bírnak a neurotranszmitterként is felhasznált glutamát szintézisében, az úgynevezett malát-aszpartát biokémiai anyagcsere-körön keresztül (Chatziioannou és mtsai, 2003; Lund és mtsai, 2009). A fumarát dehidrogenáz (FH) pedig a fumarát-malát átalakítást katalizálja (Akiba és mtsai, 1984). A mitokondriális szukcinát koenzim-A ligáz (SUCLA2) szintén a citromsav-ciklus egyik lépését, méghozzá a szukcinát keletkezését segíti elő szukcinil koenzim-A-ból (Przybyla-Zawislak és mtsai, 1998). A piruvát dehidrogenzáz (PDHA1) a piruvát metabolizmusában játszott szerepével a glikolízist, citromsav-ciklust és a zsírsav-anyagcserét is befolyásolja (Sugden és Holness, 2003). Kutatások eredményei azt mutatták, hogy az idegsejt-aktiváció befolyásolja a piruvát dehidrogenáz foszforilációját in vitro (Browning és mtsai, 1981a; Lynch és mtsai, 1983). Ezt egy in vivo végzett vizsgálattal is alátámasztották (Morgan és Routtenberg, 1981). Ennek a folyamatnak a Ca2+-szint módosításában, valamint különböző, Ca2+-közvetített plasztikus mechanizmusoknak a megváltoztatásában lehet szerepe (Browning és mtsai, 1981b; Lynch és mtsai, 1983). Az energia háztartásban központi szerepet játszó mitokondriális enzim, az ATPszintáz több alegységének, így az alfa (ATP5A1) (Kataoka és Biswas, 1991), béta (ATP5B) 37

(Ohta és mtsai, 1988), és delta (ATP5H) (Norais és mtsai, 1991) komponensek mennyiségében is változások történtek. A citokróm-c oxidáz 5A alegysége (COX5A) (Fornuskova és mtsai, 2010), valamint az ubiquinol-citokróm-c reduktáz (UQCRC1) (Hoffman és mtsai, 1993), a mitokondriális elektrontranszport-lánc elemeiként ismertek. Egy munkában kimutatták a szintén elektronszállító citokróm-c (CYCS) fehérje felszabadulását a mitokondriumból az idegsejtek serkentésének – NMDA-hozzáadásának – hatására (Li és mtsai, 2010). A mintában szignifikáns változást mutató fehérjék, zárójelben a

Minta

változás mértékével CKB (-1,1732), CYCS (-1,6054), PGAM1 (-1,421), SUCLA2

agykéreg, teljes szövet

(-1,1732)

thalamus, teljes szövet

ALDOC (1,1168), MDH1 (-1,3364; -1,3621; -1,4238) ALDOC (1,1423), ATP5H (1,1643;-1,0776;

agykéreg, szinaptoszóma

1,1292), COX5A

(-1,0841), ENO1 (-1,1555; 1,2464), FH (1,1205; 1,0747), GAPDH (-1,0934; -1,1347), MDH1 (1,2497), MDH2 (-1,1347), PGK1 (-1,1227), UQCRC1 (1,0845; -1,1968)

thalamus, szinaptoszóma

ATP5A1 (-1,1348; -1,0604), ATP5B (-1,0866), PDHA1 (1,0695)

5. táblázat: A szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

Az aminosav anyagcserében történt változások A glutamin szintetáz (GLUL) fontos szerepet játszik a glutamát és GABA neurotranszmitterek metabolizmusában (Okere és Kaba, 2000). Az izovaleril koenzim-A dehidrogenáz (IVD) különböző, elágazó láncú aminosavak lebontását katalizálja (Gu és mtsai, 2010a). A µ-krisztallin (CRYM) a serkentő aminosav neurotranszmitterek anyagcseréjében játszik szerepet (Kim és mtsai, 1992; Hallen és mtsai, 2011). A kinoid dihidropteridin reduktáz

(QDPR)

bizonyos

aminosavak

metabolizmusában

és

a

katekolamin

neurotranszmitterek lebontásában vesz részt (Musacchio és mtsai, 1971; Koslow és Butler, 1977; Butler és mtsai, 1978).

38

A mintában szignifikáns változást mutató fehérjék, zárójelben a

Minta

változás mértékével


-


CRYM (-1,3364; -1,3621; -1,4238), QDPR (-1,1036)


IVD (-1,1369)


GLUL (1,0695; -1,1625)

6. táblázat: Az aminosav anyagcserében szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

A lipid anyagcserében és szállításban történt változások Az apolipoprotein-E (APOE) fehérjének funkciója lehet a szinaptogenezisben, a szinapszisok átépítésében, lipidmolekulák megfelelő helyre történő szállításán keresztül (Hesse és mtsai, 1999). A lipidtranszportban játszott szerepe mellett az apolipoprotein-E befolyásolja a citoszkeleton stabilitását, valamint módosíthatja az intracelluláris Ca2+-szintet (Masliah és mtsai, 1996). Kimutatták, hogy AMPA- és NMDA-receptort szabályozó hatással is bírnak, amiből arra következtethetünk, hogy e receptorokon keresztül a szinaptikus plaszticitást is befolyásolhatják (Valastro és mtsai, 2001; Rogers és Weeber, 2008; Chen és mtsai, 2010).


Minta



-


APOE (-1,3364; -1,3621; -1,4238)


-


-

7. táblázat: A lipid anyagcserében és szállításban szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

A szinaptikus transzmisszióban történt változások A dynactin (DCTN2) a preszinaptikus régió egyik fontos komponense, amely a szinapszisok stabilizálását segíti elő (Eaton és mtsai, 2002). A mikrotubulusokkal, illetve a 39

hozzájuk kötődő motorfehérjével, a dyneinnel is kapcsolatba lép és modulálhatja a szinaptikus vezikulák szállításáért felelős mechanizmusokat (Waterman-Storer és mtsai, 1997; Burré és Volknandt, 2007; Kimura és mtsai, 2012). A dihidropirimidináz-szerű fehérje 2 (DPYSL2) rendkívül széles körben képes szabályozni a szinaptikus folyamatokat. A fehérje működése lecsökkenti az NMDAreceptorok NR2B alegységének számát a szinaptikus plazmamembránon (Bretin és mtsai, 2006). Kapcsolatban áll a tubulin, kinezin, valamint dynein molekulákkal, így befolyásolva többek közt a vezikulák szállítását, és a neurit-növekedést (Rahajeng és mtsai, 2010; Arimura és mtsai, 2005). Ezenkívül közvetlen kölcsönhatást tud létrehozni feszültségfüggő Ca2+csatornákkal, ami a beáramló Ca2+-ionok mennyiségének szabályozásával módosítja a neurotranszmitter-ürülést (Brittain és mtsai, 2009; Wang és mtsai, 2010). Az N-etilmaleimid-érzékeny faktort kötő fehérje (NAPG) a szinaptikus vezikulák ürülésének komplex folyamatában vesz részt (Tani és mtsai, 2003). A szeptin-3 (SEPT3) és szeptin-6 (SEPT6) fehérjék szintén a preszinaptikus területen látják el elsősorban funkciójukat, amely ismereteink szerint a szinaptikus vezikulumok transzportjának, exo- és endocitózisának, tehát reciklizációjának befolyásolásából áll (Caltagarone és mtsai, 1998; Xue és mtsai, 2004). A szeptin molekulák a citoszkeletális apparátus részét képező mikrotubulusokkal és aktin-szálakkal is kapcsolatban állnak (Silverman-Gavrila és Silverman-Gavrila, 2008). Az alfa-szinuklein (SNCA) szintén befolyásolja a neurotranszmitter-ürülést (Liu és mtsai, 2004), feltehetően a SNARE-komplex elemeivel való kapcsolata révén (Burré és mtsai, 2010). A szinapszin-2 (SYN2) funkciója ugyancsak a neurotranszmitter-tartalmú vezikulák szállításának és ürülésének szabályozásában van (Gitler és mtsai, 2008). A feszültségfüggő anion-csatorna-1 (VDAC1) megtalálható a szinaptikus plazmamembránban, feszültség-függő Ca2+-csatornákhoz kapcsoltan (Shafir és mtsai, 1998). Emellett kimutatták a jelenlétét szinaptikus vezikulákon (Takamori és mtsai, 2006), illetve GABAA-receptorokhoz asszociáltan is (Darbandi-Tonkabon és mtsai, 2003). A Ca2+-homeosztázisban is feltételezhető a fehérje szerepe (Traina és mtsai, 2006). A szakirodalmi adatok alapján tehát több ponton is befolyásolja a szinaptikus transzmissziót.

40

Minta

A mintában szignifikáns változást mutató fehérjék, zárójelben a változás mértékével


DPYSL2 (-1,1732; -1,1954), SYN2 (1,1052)


VDAC1 (-1,0549) DCTN2 (-1,0675), DPYSL2 (1,1219; 1,1015; 1,110), SEPT3 (-1,1369),


SNCA (-1,1598), VDAC1 (-1,0618; -1,1339; 1,1216; 1,292; 1,1028; 1,4225)


DPYSL2 (-1,1098), NAPG (-1,0691), SEPT6 (-1,0604; 1,1273), SYN2 (-1,1348)

8. táblázat: A szinaptikus transzmisszióban szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

A fehérjeszintézist és feltekeredést végző rendszerben történt változások Az eukarióta transzlációs iniciációs faktor-3 (EIF3J) a fehérjeszintézishez szükséges komplex molekuláris rendszer egyik tagja (Fraser és mtsai, 2004). Az endoplazmatikus retikulum rezidens fehérje-29 (ERP29) szekretálandó illetve endomembrán fehérjék szintézisét segíti elő, jelenlegi ismereteink szerint (MacLeod és mtsai, 2004). A hősokk-75 kDa-os fehérje-5 (HSPA5) expressziója nagymértékben megnő fokozott stressz (például glükóz-hiány) esetén (Chang és mtsai, 1987). A fehérje többek között az excitotoxicitás károsító hatásai elleni védekezésben is szerepet játszhat (Yu és mtsai, 1999; Lim és mtsai, 2003). Chaperon funkcióval is bír ez a protein, működése fontos bizonyos fehérjék processzálásában (Chun és mtsai, 1994; Wanamaker és Green, 2007). Érdekes módon, feltekeredést segítő funkcióját a glutamátot kötő AMPA-receptorok alegységein is ellátja (Rubio és Wenthold, 1999). Egy vizsgálatban kimutatták, hogy expresszióját a cAMP-szint befolyásolja (Alexandre és mtsai, 1991). A hősokk-70 kDa-os fehérje-8 (HSPA8) jelen van a posztszinaptikus denzitásban (Moon és mtsai, 2001). Emellett fontos szerepe van a preszinaptikus oldalon is, ahol a neurotranszmitter-ürülést

szabályozza szinaptikus

vezikulához asszociált

fehérjékhez

kapcsolódva (Stahl és mtsai, 1999; Hsu és mtsai, 2000; Tobaben és mtsai, 2001; Morgan és mtsai, 2001). Az elsősorban a mitokondriumokban található hősokk-70 kDa-os fehérje-9 (HSPA9) számos funkciója között szerepel a mitokondriális import-folyamatok segítése, receptor-internalizáció, molekulák intracelluláris szállítása (Wadhwa és mtsai, 2002). A

41

fehérje kapcsolatban áll a szinaptikus működésben rendkívül fontos feszültség-függő anion csatornákkal is (VDAC) (Schwarzer és mtsai, 2002). A fent említettekhez hasonló, chaperon funkciót lát el a mitokondriális hősokk-60 kDa-os fehérje-1 (HSPD1) (Voos és Röttgers, 2002). A poli(rC)-kötő fehérje-1 (PCBP1) az mRNS-ek stabilizálásában játszik szerepet (Czyzyk-Krzeska és Bendixen, 1999; Yeap és mtsai, 2002). DNS-, illetve RNS-kötő képességgel is rendelkezik, és működésével rendkívül sok fehérje szintézisét befolyásolja (Huo és Zhong, 2008), köztük a citoszkeletális neurofilamentumokét is (Thyagarajan és Szaro, 2008). A fehérje-diszulfid izomeráz A-család, 3 (PDIA3) az endoplazmatikus retikulumban segíti a szintetizált fehérjék feltekeredését (Oliver és mtsai, 1997). A szintén chaperon-szerepű prefoldin (PFDN2) az aktin és tubulin molekulák szintézis utáni processzálásáért felelős (Vainberg és mtsai, 1998; Rommelaere és mtsai, 2001; Simons és mtsai, 2004). A peptidilprolil izomeráz-A (PPIA) chaperonként a citoszkeletális rendszer több szabályozó eleméhez is kapcsolódhat és módosítja a mikrotubulusokon zajló intracelluláris szállítási folyamatokat, valamint az aktin-polimerizációt (Galigniana és mtsai, 2004; Calhoun és mtsai, 2009). A purinban gazdag-szakaszt kötő fehérje-B (PURB) a DNS-sel, illetve RNS-ekkel is kapcsolatban állhat (Ohashi és mtsai, 2000), működése révén pedig szabályozza az mRNSátírást és szállítást, valamint a fehérjeszintézist (Gupta és mtsai, 2003). A P0 riboszomális fehérje (RPLP0), és a riboszomális fehérje-S16 (RPS16) a fehérjeszintézis helyét jelentő riboszómák egy-egy komponensei (Hagiya és mtsai, 2005; Ian’shina és mtsai, 2007). A kis glutaminban-gazdag tetratrikopeptid-ismétlődést tartalmazó fehérje (SGTA) a chaperonok közé tartozik és más, feltekeredést segítő proteinek – mint a hősokk-rokon 70 kDa-os fehérje-1 (HSC70) – működését befolyásolja (Angeletti és mtsai, 2002). Ezenkívül hatással lehet a neurotranszmitter-ürülésre, mivel kapcsolatban áll a vezikula-exocitózisban is szereplő cisztein húr fehérjével (CSP) és más szinaptikus chaperonokkal (Natochin és mtsai, 2005; Andreyeva és mtsai, 2010).

42

Minta

A mintában szignifikáns változást mutató fehérjék, zárójelben a változás mértékével


HSPA5 (1,1103), PFDN2 (1,6697), PURB (-1,1793), SGTA (-1,5031)


EIF3J (-1,3364; -1,3621; -1,4238), PCBP1 (1,1168) ERP29 (1,1918), HSPA5 (1,1524), HSPA8 (1,1219; 1,2435), HSPA9


(1,1219), HSPD1 (1,260; 1,2643; -1,1181; 1,1292), PDIA3 (-1,1181), PPIA (1,0907), RPS16 (-1,117)


ERP29 (-1,1054), HSPA5 (1,1653), PPIA (-1,2266), PURB (-1,0691), RPLP0 (-1,1625)

9. táblázat: A fehérjeszintézisben és feltekeredésben szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

A proteolítikus rendszerben történt változások A katepszin-D (CTSD) lizoszomális proteáz, amelynek működése jelentősen befolyásolja a szinaptikus transzmissziót (Shimizu és mtsai, 2005). A fehérje hiánya komoly morfológiai változásokhoz és a normális működés zavarához vezet, leginkább a preszinaptikus oldalon (Partanen és mtsai, 2008; Koch és mtsai, 2011). A proteaszóma 26S alegysége (PSMC4) az intracelluláris, nem-lizoszomális fehérjelebontás központi eleme (Hartmann-Petersen és mtsai, 2001). Az ubiquitinproteaszóma rendszer szinaptikus folyamatokban játszott kiemelkedően fontos szerepe több tanulmány témáját is képezi (Patrick és mtsai, 2003; Speese és mtsai, 2003; Bingol és Schuman, 2004; Upadhya és mtsai, 2006; Haas és mtsai, 2007; Bingol és Sheng, 2011). Az ubiquitin-konjugáló enzim-E2L 3 (UBE2L3) szintén a fehérjelebontást végző rendszer tagja. Feladata a degradálandó molekulák „megjelölése” ubiquitinnel, de emellett számos más celluláris mechanizmusban is ismert a funkciója (Hemelaar és mtsai, 2004). Az ubiquitin karboxil-terminális észteráz L1 (UCHL1) az ubiquitin lehasítását végzi a fehérjékről, poliubiquitin-láncokról és egyéb molekulákról (Case és Stein, 2006; Barrachina és mtsai, 2006; Walters és mtsai, 2008). A fehérje működése hatással van a CREB foszforilálásához vezető jelátviteli útvonalra (Gong és mtsai, 2006; Sakurai és mtsai, 2008). Képes befolyásolni a szinaptikus működést monomer ubiquitin molekulák előállításán keresztül (Lansbury, 2006; Cartier és mtsai, 2009).

43


Minta



UCHL1 (1,0459)


-


PSMC4 (1,0845)


CTSD (1,1273), UBE2L3 (-1,2266)

10. táblázat: A proteolítikus rendszerben szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

Az oxidatív stressz indukálta változások Az oxidatív stressz elleni védekező-mechanizmusban résztvevő glutation S-transzferáz P (GSTP1) (Kamada és mtsai, 2004), peroxiredoxin-3 (PRDX3) (Nonn és mtsai, 2003) és peroxiredoxin-6 (PRDX6) (Fatma és mtsai, 2005) mennyisége változott meg jelentősen az alvásmegvonás hatására.


Minta



GSTP1 (1,044)


PRDX3 (-1,0549)


PRDX6 (1,292)


-

11. táblázat: Az oxidatív stressz elleni válaszreakcióban szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

A citoszkeletális komponensekben történt változások A citoszkeleton nagymértékű átrendeződését eredményezte minden bizonnyal az alvásdepriváció. Megváltozott a citoplazmális aktin (ACTB) (Ponte és mtsai, 1984) és a tubulin-béta (TUBB5) (Wang és mtsai, 1986) monomerek mennyisége, valamint több, aktinszálakhoz és mikrotubulusokhoz kapcsolódó elemé is. A Rho GDP-disszociációs inhibitor-1 (ARHGDIA) képes az aktinfilamentumokat szabályozni, és új nyúlványok képződését elősegíteni (Larsen és mtsai, 2008; Maddala és 44

mtsai, 2008). Az aktinhoz-kapcsolt fehérje-2/3 komplex (ARPC5) az aktin-polimerek növekedését segíti (Robinson és mtsai, 2001). A szintén aktinszálakat reguláló F-aktin lezáró fehérjék (CAPZA2, CAPZB) szerepét kimutatták a szinaptikus kapcsolatok átalakításában (Kitanishi és mtsai, 2010). A kofilin-1 (CFL1) és kofilin-2 (CFL2) aktinvázat módosító hatásukkal ugyancsak a meglévő szinapszisok méretének szabályozását, új szinapszisok kialakítását végzik, valamint befolyásolják a neurotranszmitter-receptorok számát (Yang és mtsai, 1998; Asrar és mtsai, 2009; Gu és mtsai, 2010b; Yuen és mtsai, 2010). Ennek következtében szerepük van a szinapszisok megerősítésében, ami a memórianyomok képződésének sejtszintű alapja lehet (Zhang és mtsai, 2010; Pontrello és mtsai, 2012). Az EF-kéz domént tartalmazó fehérje-D2 (EFHD2) Ca2+-szinttől függően képes módosítani az aktinfilamentumok szerkezetét (Ramesh és mtsai, 2009; Dütting és mtsai, 2011). A glia maturációs faktor-béta (GMFB) az aktinhoz és aktinszálakhoz asszociált fehérjékhez is kötődhet (Nakano és mtsai, 2010), valamint szerepe van a jelátvitelben is (Zaheer és Lim, 1996). Az alfa-internexin (INA) az intermedier filamentumok hálózatának része (Pachter és Liem, 1985). A fehérje funkcióval rendelkezik a neuritek növekedésében és a dendrittüskék morfológiájának meghatározásában (Benson, és mtsai, 1996; Chien és mtsai, 1996). A mielin bázikus fehérje (MBP) központi szerepet játszhat a sejtváz-rendszer szabályozásában, mivel mind az aktinszálakhoz, mind a mikrotubuláris elemekhez kapcsolódhat (Boggs és mtsai, 2011). Interakciós partnerei közé tartozik a kalmodulin (CALM1), és ez a kölcsönhatás befolyásolja az aktinfilamentumok polimerizációját, illetve depolimerizációját (Bamm és mtsai, 2011). Érdekes adat, hogy a hosszútávú szinaptikus potenciáció (LTP) a mielin bázikus fehérje foszforilációját eredményezi (Atkins és mtsai, 1997), tehát a szinaptikus működéstől függő citoszkeletális átrendeződések egyik szabályozó komponense lehet. A miozin (MYL6) aktin-kötő képességével (Nieznanska és mtsai, 2002) hozzájárul a szinaptikus vezikulák aktív zónába szállításához és így a neurotranszmitterürüléshez (Polo-Parada és mtsai, 2005). A profilin-2 (PFN2) az aktin molekulák polimerizációjának szabályozásában játszik szerepet, befolyásolja a neurit-növekedést, szinaptogenezist, valamint a szinaptikus vezikulák exocitózisát (Faivre-Sarrailh és mtsai, 1993). A tropomiozin (TPM3) aktinfilamentumokat szervező képességgel bír, ami a miozinnal létrehozott kölcsönhatásán keresztül valósul meg (Bryce és mtsai, 2003; Schevzov és mtsai, 2005).

45

A tubulin polimerizációt elősegítő fehérje (TPPP) rendkívül fontos tagja a mikrotubulus-szálak szerkezetét meghatározó rendszernek (Hlavanda és mtsai, 2002; Acevedo és mtsai, 2007).

Minta agykéreg, teljes szövet thalamus, teljes szövet agykéreg, szinaptoszóma thalamus, szinaptoszóma

A mintában szignifikáns változást mutató fehérjék, zárójelben a változás mértékével ARHGDIA (1,0459), CFL1 (1,6697), CFL2 (1,6697), INA (-1,5031), GMFB (1,089) ACTB (-1,1267;1,1182; 1,1244), TPPP (-1,4271; -1,4556) ARPC5 (-1,0816), CAPZB (-1,1247), MBP (-1,0816; -1,1598; -1,117), MYL6 (-1,117), PFN2, (1,1318), TUBB5 (-1,0934; -1,1384; 1,1676) CAPZA2 (-1,0604; -1,1625), EFHD2 (-1,0866), TPM3 (-1,0866)

12. táblázat: A citoszkeletális rendszerben szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

A jelátvitelben történt változások A guanin nukleotid-kötő fehérje béta alegységének (GNB1) szerepe lehet a neurotranszmitter-kibocsátást befolyásoló feszültségfüggő Ca2+-csatornák működésének modulációjában (De Waard és mtsai, 1997; García és mtsai, 1998; Luiro és mtsai, 2006; Tedford és mtsai, 2010). A foszfatidiletanolamin-kötő fehérje-1 (PEBP1) több celluláris folyamatban is részt vesz különböző jelátviteli rendszerek tagjaként (Banfield és mtsai, 1998; Yeung és mtsai, 1999; Yeung és mtsai, 2001; Klysik és mtsai, 2008; Hellmann és mtsai, 2010). Hatással van az NMDA-receptorok aktivációjával induló és géntranszkripciós változásokhoz vezető szignáltranszdukciós rendszerre (Yamada és mtsai, 2007). A szerin-treonin kináz receptor-asszociált fehérje (STRAP) szintén több jelátviteli útvonal közös komponense (Datta és mtsai, 1998; Seong és mtsai, 2005; Reiner és mtsai, 2011).

46


Minta



PEBP1 (1,0459), STRAP (-1,1793)


GNB1 (-1,3364; -1,3621; -1,4238)


-


-

13. táblázat: A jelátviteli rendszerben szereplő fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

Egyéb fehérjék expressziójában történt változások

Az

annexin-A3

(ANXA3)

részt

vesz

az

intracelluláris

Ca2+-homeosztázis

fenntartásában, és feltehetően jelátviteli folyamatokban is (Naciff és mtsai, 1996). A fehérje Ca2+-kötő funkciója mellett a membrán foszolipid-komponenseivel is képes kapcsolatba lépni (Sopkova és mtsai, 2002). A karbonikus anhidráz-1 (CA1) a neuronális aktivitás hatására bekövetkező extracelluláris pH-változásokat tudja módosítani, és megszabja az idegsejtek excitabilitását, ami nagymértékben befolyásolhatja a szinaptikus átvitelt (Chen és Chesler, 1992; Sun és Alkon, 2001). Az

FK506-kötő

fehérje-1A

(FKBP1A)

az

intracelluláris

Ca2+-koncentráció

szabályozásában játszik szerepet, Ca2+-áteresztő ioncsatornákkal létrehozott külcsönhatásán keresztül (Cameron és mtsai, 1995; Shin és mtsai, 2002). A posztszinaptikus neuron sejten belüli Ca2+-szintjének módosításával befolyásolja a szinaptikus transzmisszió hatására induló, Ca2+-függő jelátviteli folyamatokat (Terashima és mtsai, 2000; Hoeffer és mtsai, 2008). A FUSE-kötő fehérje-1 (FUBP1) különböző proteinek transzkripcióját, valamint a keletkező mRNS-ek kifejeződését regulálja, és működésével többek közt a mikrotubuláris rendszerre is hatással van (He és mtsai, 2000; Singer és mtsai, 2009; Olanich és mtsai, 2011). A glutation S-transzeráz µ-5 (GSTM5) xenobiotikumok átalakításában, lipofil természetű anyagok szállításában játszik közre (Johnson és mtsai, 1993). A

hiszton

H2B-típus

1-H

(HIST1H2BH)

a

nukleoszóma

egyik

eleme

(Mosammaparast és mtsai, 2001), de specifikusan az idegi működésben játszott szerepe nem felderített. A hidroxiszteroid (17-beta) dehidrogenáz-10 enzim (HSD17B10) többek közt a GABA-erg szinaptikus átvitelt befolyásolhatja a GABAA-receptorokat moduláló szteroid típusú molekulák metabolizmusával (Yang és mtsai, 2005; He és mtsai, 2005). A fehérje-

47

NDRG1 (NDRG1) expressziója a szakirodalmi adatok alapján stresszhatásra (pl. oxidatív stressz vagy tartósan magas intracelluláris Ca2+-koncentráció) nő meg (Salnikow és mtsai, 1999; Banz és mtsai, 2009). Több interakciós partnere ismert ma már, de a fehérje funkciói még nem kellően tisztázottak (Kachhap és mtsai, 2007; Tu és mtsai, 2007). Ezzel szemben a fehérje-NDRG2 (NDRG2) esetében feltételezhető a szinaptogenezisben, neurit-növekedésben való részvétel (Nichols, 2003; Takahashi és mtsai, 2005). A fehérje-DJ 1 (PARK7) minden bizonnyal egy oxidatív stressz hatására aktiválódó chaperon (Shendelman és mtsai, 2004). Kimutatták a kolokalizációját szinaptikus vezikulához asszociált fehérjékkel (Usami és mtsai, 2011). A protein hiánya rontja a szinapszisok plaszticitásának képességét (Wang és mtsai, 2008). Egy vizsgálatban pedig azt találták, hogy a fehérje befolyásolja az NMDA-receptor működését, ami alátámaszthatja a szinaptikus folyamatokban betöltött szerepét (Chang és mtsai, 2010). A Ca2+-homeosztázis megőrzéséhez szükséges Ca2+-ATP-ázok plazmamembránban való elhelyezkedését szabályozhatja a PDZ-domént tartalmazó fehérje-11 (PDZD11) (Goellner és mtsai, 2003). Ezenkívül más típusú ATP-ázokkal is kölcsönhatásba lép ez a protein (Stephenson és mtsai, 2005), de a pontos celluláris funkciói még nem ismertek. A szinaptikus aktiváció hatására a dendritekben meginduló fokozott fehérjeszintézist – mely a szinaptikus átvitel hosszútávú megerősödésének feltétele – gátolja a peptidil-prolil cisz-transz izomeráz NIMA-interakciós fehérje-1 (PIN1) (Westmark és mtsai, 2010). Gátló hatását a transzkripciós szinten is kifejti, mivel közvetett módon a fontos transzkripciós faktor, CREB működését szuppresszálja (Nakatsu és mtsai, 2010). Több citoszkeletális komponenst is befolyásol – elsősorban a neurofilamentumok rendszerét –, de hatását a glicin neurotranszmitter receptorára is kifejti (Kesavapany és mtsai, 2007; Zita és mtsai, 2007; Rudrabhatla és mtsai, 2009; Rudrabhatla és Pant, 2010). A GTP-kötő sejtmagi fehérje-RAN (RAN) a különböző fehérjék citoplazma és sejtmag közötti transzportjához szükséges (Becker és mtsai, 1995; Ren és mtsai, 1995). A WD ismétlődést tartalmazó fehérje-61 (WDR61) a hisztonok metilálásában vesz részt (Higa és mtsai, 2006). Az albumin (ALB) és a haptoglobin (HPR) a vérszérum kis molekulatömegű fehérjéi közé tartoznak (Tirumalai és mtsai, 2003), míg a hemoglobin (HBB) a vörösvérsejtek komponense (Kakhniashvili és mtsai, 2004). Jelentőségüket ebben a munkában nem tárgyaljuk.

48

Minta

A mintában szignifikáns változást mutató fehérjék, zárójelben a változás mértékével ALB (-1,1732; 1,044), ANXA3 (1,2754), CA1 (-1,421), FKBP1A


(-1,6054; -1,8232; -1,7432), FUBP1 (1,1052), HBB (1,089; -1,6054; -1,8232; -1,7432), HPR (-1,5031), NDRG1 (-1,1732), PARK7 (1,038), RAN (1,044)

thalamus, teljes szövet agykéreg, szinaptoszóma thalamus, szinaptoszóma

GSTM1 (-1,4271; -1,4556), HBB (-1,4271; -1,4556; -1,1036), HSD17B10 (-1,1267; -1,4271; -1,4556), NDRG2 (1,1182; 1,1244) HIST1H2BH (-1,117), PARK7 (1,4225), PDZD11 (1,0907), WDR61 (-1,1384) PIN1 (-1,2266)

14. táblázat: A kategóriáinkba egyértelműen be nem sorolható fehérjék listája mintánként, a változások mértékének feltüntetésével

6.4. Az eredmények értelmezése a különböző vizsgálati szituációk alapján A proteomikai vizsgálatot a parietalis cortexen és a thalamuson végeztük. Az ébrenlét ideje alatt a szenzoros információk egy jelentős hányada ugyanis a thalamuson keresztül az agykéreg fali lebenyt alkotó régiójába jut (Kandel és mtsai, 2000). A két központi idegrendszeri struktúra pedig az alvás során is kölcsönös befolyást gyakorol egymás működésére (Steriade és mtsai, 1991). Az idegi aktivitásból adódó molekuláris változások azonban a két struktúra összehangolt működése ellenére is figyelemre méltó eltéréseket mutathatnak. A fehérjekészletben bekövetkező módosulásokat tehát e két területen vizsgáltuk. A munka során szinaptoszóma-preparátumokat is készítettünk, amelyek csak a pre- és posztszinaptikus területek fehérjéit tartalmazzák (Bai és Witzmann, 2007). Ezzel a teljes szöveti változások mellett specifikusan a szinaptikus módosulásokat is vizsgálhatjuk. Az agykérgi mintákból több megváltozott mennyiségű fehérjét kaptunk, mint a thalamusból: 26 fehérje a teljes corticalis idegszövetből, szemben a 16 thalamicussal, illetve 36 féle az agykérgi szinaptoszómákból, összevetve a 19, thalamusból azonosított proteinnel. Ez utalhat az agykéreg jelentős információ-feldolgozó szerepére, és a sok fehérje részvételét igénylő plaszticitására, amely a tanulás alapfeltételét képezi (Mégevand és mtsai, 2009). Meglepő lehet, hogy az összesen 62 agykérgi és 35 thalamicus fehérjeváltozás összehasonlítása után mindössze 10 közös, mindkét struktúrában kimutatott proteint találtunk, melyek az alábbiak: ALDOC, DPYSL2, ERP29, HBB, HSPA5, MDH1, PPIA, PURB, SYN2, 49

VDAC1. Ezt az eredményt a két agyterület eltérő működési sajátságai, funkciói magyarázhatják. A teljes szöveti, illetve a szinaptoszomalis mintákban kimutatott változások száma között nem volt jelentős eltérés: összesen 52 szinaptoszomalis, és 46 teljes szöveti fehérjeváltozást találtunk. A fehérjék funkcióinak megismerése után megállapíthatjuk, hogy mely sejtszintű folyamatokat módosította elsősorban az alvásmegvonás. Kiugróan nagyszámú, 17 fehérje mennyisége változott a szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban szereplő rendszerből, illetve a citoszkeletális hálózat elemei közül (utóbbiban 16 féle). Említésre méltó még a fehérjék szintéziséhez, és feltekeredéséhez szükséges apparátusból 14 komponens mennyiségének megváltozása és 8 darab, a szinaptikus transzmisszióban szereplő fehérjék közül. Eszerint jelentős metabolikus és strukturális módosulásokat, valamint a szinaptikus átvitel megváltozását eredményezte a beavatkozás, ami ebből fakadóan a fehérjék keletkezését és processzálását végző rendszert is komolyan befolyásolta. Az azonosított fehérjekészlet egészét tekintve elmondható, hogy az alvás során nagyobb kópiaszámban vannak jelen bizonyos fehérjék, mint az alvás megvonásakor: összesen 94 negatív irányú fehérje-változást mutattunk ki a kezelés hatására, szemben az 57 pozitívval. Ez az eredmény összhangban lehet azokkal a hipotézisekkel, amelyek az alvás alatti fokozott molekula-szintézist hangsúlyozzák (Ramm és Smith, 1990; Mackiewicz és mtsai, 2007). A változások irányának sejtfunkciók szerinti vizsgálatakor a szénhidrát és aminosav anyagcserében, valamint a citoszkeletális rendszerben szereplő fehérjéket leszámítva nem látható ilyen egyértelmű tendencia (amennyiben az 1-2 proteint tartalmazó kategóriákat itt nem vesszük figyelembe). A szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban szereplő fehérjék között 18 csökkenést, és 10 növekedést találtunk, az aminosav-anyagcsere esetében 6 csökkenést és 1 növekedést, míg a sejtváz komponenseinél 16 csökkenést, illetve 8 növekedést. A különböző anyagcsere folyamatokban szereplő fehérjék mennyiségének alvás alatti növekedése a fokozott felépítő mechanizmusokhoz lehet szükséges. Az energia háztartásban résztvevő proteinek nagyobb mennyisége például az energia-raktározó ATPmolekulák sejten belüli szintjének alvás idején jellemző növekedésével állhat összefüggésben (Dworak és mtsai, 2010). A citoszkeletális rendszer részét képező fehérjék mennyiségének alvásmegvonást követő csökkenése egyrészt ellentmondásban lehet két 2011-ben publikált – ébrenlét alatti fokozott citoszkeletális felépítést mutató – kutatás eredményével (Bushey és mtsai, 2011; Maret és mtsai, 2011). Ugyanakkor magyarázhatja az alvás alatt zajló plasztikus folyamatokat, amelyek a sejtváz változtatásán keresztül a szinapszisok struktúráját módosítják 50

(Geinisman, 2000). A kategóriákon belül egy-egy kiemelt fehérje változásainak elemzése az adott protein későbbi tesztelése, vizsgálata során lehet szükséges. A teljes szöveti minták esetén számolnunk kell azzal, hogy a legnagyobb mennyiségben jelenlévő – és így a vizsgálat során megkapott – fehérjék gliasejtekből is származhatnak. Az ideg- és gliasejtek számára vonatkozóan ellentmondásosak az adatok, de az agyterületenkénti különbségek e tekintetben biztosnak tűnnek. Becslések szerint 10- vagy akár 50-szeres is lehet a gliasejtek túlsúlya a központi idegrendszerben az idegsejtekkel szemben (Kandel és mtsai, 2000). Ezt az általánosan elfogadott nézetet azonban sok vizsgálat eredménye megkérdőjelezi. Egy 2001-ben megjelent tanulmányban kimutatták, hogy a rhesus majom (Macaca mulatta) prefrontalis agykérgében a gliasejtek számának neuronokhoz viszonyított aránya átlagosan körülbelül 1,0 (azaz számuk megegyezik), a corticalis rétegek közötti különbségekkel együtt (Dombrowski és mtsai, 2001). Egy korábbi munkában, a rhesus majom látókérgének vizsgálatakor, még ennél is kisebb, 0,5 körüli értéket kaptak a sejtszámok arányára (O’Kusky és Colonnier, 1982). Christensen és munkatársai pedig ugyanezen a fajon, a teljes neocorticalis területen végzett kutatásukban összesítve a 0,56-os arányszámot kapták a gliasejtek számát a neuronok számához viszonyítva (Christensen és mtsai, 2007). Csimpánz prefrontalis kérgének II/III rétegében 1,2, emberben pedig ugyanitt 1,65 az arány (Sherwood és mtsai, 2006). Humán neocorticalis minták felhasználásakor nőknél 1,32-nek, férfiaknál pedig 1,49-nek adódott a glia/neuron arány (Pelvig és mtsai, 2008). A patkány – általunk is vizsgált – parietalis agykérgében az arányszám hozzávetőleg 1,7 (Peinado és mtsai, 1997). Az állat teljes cortexében pedig az asztrociták, becslések szerint, 1,4-szer nagyobb mennyiségben vannak jelen, mint az idegsejtek (Nedergaard és mtsai, 2003). Egy 2004-ben megjelent publikációban 33 és 63 napos patkányok agykérgi mintáiban a neuronoknál kevesebb gliasejtet mutattak ki (Schwartz és mtsai, 2004). Az idegsejteknél kevesebb gliasejtet írtak le szintén, a patkány látókérgi területén (Gabbott és Stewart, 1987). Az agykérgen kívül a patkányok thalamusát is felhasználtuk, ezért ebben a struktúrában is ismernünk kell a neuronális és nem-neuronális sejtek arányát. A thalamusról ugyanakkor jóval kevesebb információ áll rendelkezésünkre e kérdésben. Egy tanulmányban kimutatták, hogy emberben ezen agyterület mediodorsalis magjában a gliasejtek körülbelül hétszer nagyobb számban vannak jelen, mint az idegsejtek (Nielsen és mtsai, 2008). Ezzel szemben az egér thalamusának anterodorsalis magjában a gliasejt-neuron arány 1,0 alatt van (Sturrock és mtsai, 1989). Látható tehát az agyi struktúrák között bizonyos mértékű változatosság a glia- és idegsejtek számára vonatkozóan.

51

A sejtszámok ismerete mellett az adott celluláris elemek által elfoglalt térfogat nagysága is fontos adat az idegrendszeri struktúrák pontos felépítésének megértéséhez. Erre vonatkozóan közelítő becslést adhatnak egy 2006-os vizsgálat eredményei. Ebben leírták, hogy az ember agykérgének temporális régiójában a gliasejtek átlagosan 1,36-szor nagyobb területet foglalnak el, mint a neuronok (illetve, hogy a különböző pszichiátriai kórképekben ez az arány megváltozik) (Brauch és mtsai, 2006). A munka eredményeként tehát neuronális és gliális fehérjéket egyaránt kaphattunk. Ugyanakkor azt is meg kell jegyeznünk, hogy a gélképek elemzése után csak az egymáshoz képest szignifikánsan megváltozott spotok fehérjéit ismertük meg. Abban az esetben tehát, ha az idegsejtek fehérjekészletében következett be jelentős változás, akkor a munka eredményeként neuronális proteineket azonosíthattunk. Bár a teljes szöveti minták vizsgálata esetén inkább globálisan, a celluláris folyamatokban történt változások mértékére következtethetünk, érdekes információ lehet az idegsejtekből származó fehérjék száma. A neuronális fehérjék megállapításának egy lehetséges módja a specifikusan szinaptikus proteinek keresése. A régebb óta alkalmazott immuncitokémiai vizsgálatok mellett erre ma már proteomikai munkák eredményeit is használhatjuk, amelyekben specifikusan a preszinaptikus aktív zóna, vagy a posztszinaptikus denzitás fehérjekészletét határozták meg. A preszinaptikus oldalra való besorolást a következő publikációk alapján végeztük: Coughenour és mtsai, 2004; Morciano és mtsai, 2005; Takamori és mtsai, 2006; Burré és Volknandt, 2007; Morciano és mtsai, 2009; Volknandt és Karas, 2012. A posztszinaptikus denzitásba történő beosztást pedig az alábbi közlemények alapján tettük meg: Cheng és mtsai, 2006; Collins és mtsai, 2005; Collins és mtsai, 2006; Dosemeci és mtsai, 2006; Jordan és mtsai, 2004; ; Li és mtsai, 2004; Li és mtsai, 2005; Peng és mtsai, 2004; Phillips és mtsai, 2004; Trinidad és mtsai, 2005; Trinidad és mtsai, 2006; Yoshimura és mtsai, 2004. Az agykéregből és a thalamusból származó teljes szöveti mintákban összesen meghatározott 46 fehérje között 33 található meg a szinapszis pre- vagy posztszinaptikus oldalán. 21 mindkét régióban jelen van, melyek az alábbiak: ACTB, ALDOC, ANXA3, APOE, CKB, CYCS, DPYSL2, GNB1, GSTM5, GSTP1, HSPA5, INA, MDH1, NDRG2, PARK7, PGAM1, SYN2, TPPP, TUBB, UQCRC1, VDAC1. 11 db molekula csak a posztszinapszisban mutatható ki: CFL1, CFL2, FKBP1A, FUBP1, GMFB, HSD17B10, PCBP1, PURB, RAN, SUCLA2, UCHL1. Az SGTA génnévvel azonosított fehérje pedig csak a preszinaptikus régióban található. A neuronális folyamatok módosulását támaszthatja alá a szinaptikus fehérjék ilyen nagy száma a teljes szöveti mintákban is.

52

Fontos azonban hozzátennünk, hogy a szinaptikus átvitelben szerepet játszó molekulák is expresszálódhatnak gliasejtekben, amit az alábbi publikációk is alátámasztanak: Parpura és mtsai, 1995; Jeftinija és mtsai, 1997; Conti és mtsai, 1999; Madison és mtsai, 1999; Kinoshita és mtsai, 2004. Mivel az egyes fehérjék kópiaszáma is befolyásolja a detektálhatóságukat, így egy-egy olyan fehérje mennyiségének megváltozása, amely kisebb gliális jelenlét mellett nagyobb mértékű neuronális expresszióval jellemezhető, szintén az idegi működés módosulására utalhat. A teljes szövetekből származó minták vizsgálatának eredményeiből tehát biztosan csak a különböző fehérjék sejtes folyamatokban betöltött szerepe és száma alapján vonhatunk le következtetéseket – bár a szinapszis jelentős molekuláris átrendeződése az adataink ismeretében feltételezhető. A fehérjék funkcióinak megismerése és a

molekulák

csoportosítása után az alábbi eredményt kaptuk. A citoszkeletális rendszer felépítésében 7 fehérje vesz részt, a szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban 6, a fehérjeszintézisben és feltekeredésben szintén 6, a szinaptikus transzmisszióban és jelátvitelben 3-3, az aminosav anyagcserében 2. Az oxidatív stresszre adott válaszreakcióban szintén 2 protein játszik szerepet, a lipid anyagcserében és szállításban 1, a proteolízisben pedig szintén 1. 13 fehérjét egyértelműen egy kategóriába sem lehet besorolni. A sejtváz, a szénhidrát anyagcsere, valamint

fehérjeszintézis

folyamata

tehát

jelentős

változásokat

szenvedhetett

az

alvásdepriváció következtében. A központi idegrendszer működésének alapfeltétele az ideg- és gliasejtek közötti funkcionális kapcsolat. Mindemellett, specifikusan a neuronok közötti szinapszisok működésének vizsgálata szintén érdekes adatokat szolgáltathat, ezért kizárólag szinaptikus fehérjéket tartalmazó szinaptoszóma preparátumokat is készítettünk. A cortex és thalamus szinaptoszomális mintáiból meghatározott fehérjék sejtműködésben játszott szerepének megismerésével a szinapszisban zajló molekuláris folyamatok módosulásáról kaphatunk képet. 13 megváltozott mennyiségű fehérje a szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban vesz részt, 10 a sejtvázzal kapcsolt, szintén 10 pedig a fehérjeszintézisben és feltekeredésben működik közre. 8 protein a szinaptikus transzmisszió, 3 a proteolízis, 2 az aminosav anyagcsere folyamataiban látja el szerepét. 1 fehérje az oxidatív stresszre adott válaszreakcióban vesz részt. 5 fehérjét egyértelműen egy kategóriába sem lehet besorolni. A szénhidrát

metabolizmusban

szereplő

fehérjék

nagy

száma

mutatja,

hogy

a

neurotranszmisszióban bekövetkező változás nem választható el az energiaszolgáltató anyagcsere-folyamatoktól. A szinapszisok térbeli átalakulására következtethetünk az arányaiban sok citoszkeletális protein kimutatásából. A szinaptikus átvitelben szigorúan véve 53

funkcióval bíró molekulák száma szintén jelentős. Az új fehérjék szintézis utáni processzálásában szerepet játszó komponensek száma a molekuláris összetétel nagymértékű módosulásából következően szintén magas. A funkcionális csoportosítás mellett a pre- vagy posztszinaptikus elhelyezkedés tisztázása

különösen

fontos

a

szinaptikus

preparátumok

esetén.

A

lokalizáció

megállapításához a fent említett, a teljes szöveti minták fehérjéinél is használt publikációkat vettük alapul. Az agykéregből és a thalamusból származó szinaptoszómákban összesen azonosított 52 fehérjét ennek megfelelően soroltuk be valamelyik – adott esetben akár mindkét – szinaptikus oldalra. Összesen 40 fehérjét mutattak ki eddig a preszinaptikus aktív zónában, vagy a posztszinaptikus denzitásban, az 52 megváltozott mennyiségű fehérje közül. 33 protein mindkét területen jelen van, 5 csak a posztszinaptikus denzitásban, 2 pedig csak a preszinaptikus régióban található meg. E fehérjék sejtes lokalizációja látható a 7., illetve 8. ábrán. A 7. ábrán az agykérgi, míg a 8. ábrán a thalamicus szinaptoszómák elemzése után megkapott szinaptikus változások egy lehetséges rekonstruálása látható. Ezekben az összefoglalásokban egyrészt követjük a fehérjék pre- és posztszinaptikus elhelyezkedéséről ismert információinkat, másrészt figyelembe vesszük a sejtműködésben – pontosabban a szinaptikus folyamatokban – játszott szerepüket. Így próbáljuk a lehetőségekhez képest legpontosabb képet kialakítani az alvásdepriváció által előidézett szinaptikus módosulásokról.

54

7. ábra: Az agykérgi szinaptoszómákban szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjék helyzete, és feltételezett szerepük a szinapszisban. A piros ellipszisbe írt, génnevükkel feltüntetett fehérjék mennyisége nőtt, a kék háttéren szereplőké csökkent a beavatkozás hatására. A zöld ellipszisben látható proteinek egy mintán belül növekedést és csökkenést is mutattak. (Az ábrázoláshoz az Ariadne Genomics Pathway Studio szoftverének 7.1.-es verzióját használtuk).

55

8. ábra: A thalamicus szinaptoszómákban szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjék helyzete, és feltételezett szerepük a szinapszisban. A piros ellipszisbe írt, génnevükkel feltüntetett fehérjék mennyisége nőtt, a kék háttéren szereplőké csökkent a beavatkozás hatására. A zöld ellipszisben látható proteinek egy mintán belül növekedést és csökkenést is mutattak. (Az ábrázoláshoz az Ariadne Genomics Pathway Studio szoftverének 7.1.-es verzióját használtuk.)

A proteomikai vizsgálat után kapott, 87 fehérjét tartalmazó listában több olyan protein is jelen van, amelyeket korábban, hasonló témában végzett kutatások során is kimutattak – jóllehet az azonosított fehérje-alegység eltérhet. 6 órás alvásdepriváció után a basalis ganglionokból származó mintákban szignifikánsan megváltozott mennyiségű 11 fehérje között találták meg a munkánkban is megjelenő mielin bázikus fehérjét, a Rho GDPdisszociációs inhibitort, tubulint és ubiquitin-konjugáló enzimet (Basheer és mtsai, 2005). A szintén 6 órás alvásdepriváció és az életkor közötti összefüggéseket vizsgálták egy tanulmányban, ahol az agykéregben 43 módosult kópiaszámú proteint találtak (Pawlyk és mtsai, 2007). Közéjük tartozik a kutatásunk során is azonosított dihidropirimidináz-szerű fehérje, malát dehidrogenáz, feszültségfüggő anion-csatorna-1, hősokk-70 kDa-os fehérje 8, foszfoglicerát mutáz, Rho GDP-disszociációs inhibitor, tubulin, tropomiozin, és ubiquinolcitokróm-c reduktáz. A hippocampusban a 4 órás alvásmegvonást követően jelentősen módosult expressziójú 12 fehérje között közös volt internexin, dihidropirimidináz-szerű fehérje, fehérje-diszulfid izomeráz, kreatin kináz, az N-etilmaleimid-érzékeny faktort kötő fehérje, és a Rho GDP-disszociációs inhibitor (Poirrier és mtsai, 2008). Az alvás hosszútávú 56

(7 napos) megakadályozásának hatására a nálunk is megjelenő citokróm-c fehérje mennyiségének szignifikáns változását találták (Cirelli és mtsai, 2009). Összesen tehát 16 olyan proteint mutattunk ki, amelyek a különböző körülmények között végzett, korábbi alvásdeprivációs vizsgálatokból már ismertek voltak. A szinaptikus transzmisszió aktivitás-függő módosulásában sok neurotranszmitterreceptor (például az NMDA-, vagy az AMPA-receptor) játszik szerepet (Barry és Ziff, 2002; Nicoll, 2003). A ligandum megkötésével szerteágazó intracelluláris változások következnek be. A munka egyik célja olyan intracelluláris fehérjék megtalálása, amelyeknek szerepük van azokban a plasztikus folyamatokban, melyek a memórianyomok rögzítésének feltételét képezik az alvás során. Itt elsősorban a szinaptoszómában csökkenést mutató fehérjék lehetnek fontosak számunkra, hiszen ezek feltételezhetően hatással vannak a szinaptikus átvitelre, és mennyiségük az alvás során nagyobb, mint a mesterségesen fenntartott ébrenlét idején. Érdekes lehet a GAPDH és a PGK1 enzimek további vizsgálata, melyek a preszinaptikus oldalon, a szinaptikus vezikulák neurotranszmitter-felvételéhez szükséges, lokálisan zajló glikolízisben vesznek részt. Több olyan fehérjét is találtunk, amelyek a sejtváz befolyásolásán keresztül szerepet játszhatnak a szinapszisok felépítésének módosításában, illetve részt vehetnek a szinaptikus vezikulumok szállításában, és ürülésükben. Ezek közül csökkenést mutattak az alábbiak: ARPC5, CAPZA2, CAPZB, DCTN2, EFHD2, MBP, MYL6, PPIA, SEPT3 és TPM3. A szinaptikus vezikulumok ürülésének szabályozásában, illetve neurotranszmitter-receptorok befolyásolásában szereplő DPYSL2, NAPG, SNCA és SYN2 mennyisége szintén csökkent a beavatkozás hatására. Ezeken kívül fontos lehet még a dendritikus fehérjeszintézisben közreműködő PIN1 és PURB, valamint a proteolízisben, és több más folyamatban lényeges funkciót betöltő UBE2L3 szerepe. A fent kiemelt molekulák hatásának pontos tisztázása az alvás során jelentkező szinaptikus módosulásokra természetesen külön vizsgálatokat igényel. Más megfontolások szerint pedig a kapott fehérjelista egyéb tagjainak tesztelése is eredményes lehet az alvásra jellemző molekuláris folyamatok feltérképezésekor.

7. Következtetések Az alábbiakban a vizsgálat eredményeiből általánosan levonható következtetések olvashatóak, „A diplomamunka célkitűzései” című fejezet pontjait követve.

57

 Összesen 87 különböző, az alvásdepriváció hatására szignifikánsan megváltozott mennyiségű (p<0,05) fehérjét mutattunk ki. Ez a számadat a korábban végzett, hasonló vizsgálatok eredményeihez képest sok fehérje-spot változását jelenti. Ebben minden bizonnyal közre játszott a vizsgálathoz használt technika érzékenysége (10 %osnál kisebb változást is detektálhattunk így), illetve az alvásmegvonás 8 órás időtartama, amely már jelentősen befolyásolhatta a sejtek működését.  A beavatkozás hatására a legkülönbözőbb sejtes funkciókban résztvevő fehérjék mennyisége változott meg. Minden vizsgálati szituációban jelentős viszont a szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban szereplő, a citoszkeletális, a szinaptikus

átvitelben

közreműködő

és

a

fehérjeszintézisben

és

fehérjék

feltekeredésében funkcionáló fehérjék módosulása.  Jelentős különbséget találtunk az általunk vizsgált két agyi struktúrában mért változások között. Amíg a parietalis agykéregben 62, addig a thalamusban mindössze 35 fehérje mennyisége változott meg jelentősen. Feltételezhető, hogy ez az eltérés az agykéreg nagymértékű információ-feldolgozó képességének köszönhető. A változó környezetből származó afferens ingerek processzálásához elengedhetetlen a neuronális plaszticitás, ami magyarázatot adhat a fehérjekészlet – elsősorban az agykéregben kimutatott – dinamikus változására. A megváltozott mennyiségű fehérjékben leggazdagabb sejtes funkciók a 2. pontban említettekkel megegyezőek mindkét agyi struktúrában.  A teljes szöveti és a szinaptoszomális mintákban kimutatott változások száma között nincs jelentős különbség: 46 teljes szöveti és 52, szinaptoszómából azonosított fehérjeváltozást találtunk. A legtöbb elemet tartalmazó sejtes kategóriák mindkét esetben a 2. pontban feltüntetettekkel megegyezőek. Érdekes tény lehet a teljes szöveti mintákból kimutatott szinaptikus fehérjék nagy száma, ami elsősorban az idegi működés módosulására utalhat.  A szinaptikus plaszticitásban szereplő intracelluláris fehérjék közreműködhetnek a memórianyomok alvás alatti rögzítésekor bekövetkező szinaptikus átrendeződésben. Több protein is megemlíthető a munkánk eredményéül kapott fehérje-listából, amelyek szerepelhetnek e mechanizmusokban. Ezek közül is elsődlegesen a szinaptikus vezikulumok feltöltésében, szállításában és ürítésében, valamint a neurotranszmitter-receptorok

szabályozásában

szereplő,

illetve

a

sejtváz

módosításában résztvevő fehérjéket lehet kiemelni.

58

8. Összefoglalás Az alvás az élővilágban rendkívül elterjedt jelenség, amely szükséges a szervezet normális működéséhez. A központi idegrendszer élettani folyamataiban játszott szerepét egyrészt a homeosztázis fenntartásában, másrészt a neuronális plaszticitás elősegítésében feltételezik. A háttérben zajló, alvásra specifikus molekuláris mechanizmusok azonban még nem kellően ismertek. A vizsgálatunk során felnőtt, hím patkányok 8 órás alvásdeprivációját végeztük el, majd a parietalis cortex és a thalamus fehérjekészletében történt változásokat hasonlítottuk össze kontrollként használt, alvásukban nem akadályozott állatok ugyanezen agyi struktúráinak proteomjával. A munkához az egyik oldali parietalis agykéreg és thalamus teljes szöveti mintáit, valamint az ellenoldali területekből készített szinaptoszómapreparátumokat használtuk. A teljes szöveti és szinaptoszomális minták vizsgálatához a 2DDIGE proteomikai technika kivitelezését végeztük el. A metodika a fehérjék fluoreszcens festékkel történő megjelölését, majd kétlépcsős elválasztásukat (izoelektromos fókuszálás és tömeg szerinti szeparálás) foglalja magában. Az így nyert gélképek szoftveres analízise után kaptuk meg a szignifikánsan megváltozott mennyiségű fehérjéket tartalmazó fehérje-spotokat. A spotok proteinjei ezt követően MS/MS-sel kerültek meghatározásra. A vizsgálat eredményeként összesen 87 db, az alvásmegvonás hatására jelentősen megváltozott mennyiségű fehérjét találtunk. A fehérjék sejtes folyamatokban betöltött funkcióit a publikált szakirodalmi adatok felhasználásával határoztuk meg. Ezek alapján elmondhatjuk, hogy az alvás hiánya a szénhidrát anyagcserében és energia háztartásban, a szinaptikus átvitelben, a fehérjeszintézisben és a fehérjék feltekeredésben, valamint a sejtváz felépítésében szereplő proteineket befolyásolta elsősorban. Amíg a thalamusban mindössze 35 fehérje szignifikáns mennyiségi változása következett be, addig az agykéregben 62, ami utalhat a cortex jelentős információ-feldolgozó képességére és plaszticitására. A leginkább érintett sejtes folyamatok megállapítása mellett specifikusan a szinaptikus működésben bekövetkező változásokra is következtethettünk a szinaptoszómákból meghatározott fehérjék szerepének megismerésével. Az eredmények szerint feltételezhető a szinaptikus struktúrák átalakulása, a citoplazmában, mitokondriumokban és szinaptikus vezikulumokhoz asszociáltan zajló szénhidrát anyagcserefolyamatok megváltozása, a vezikula-ürülés módosulása, összességében tehát a szinaptikus átvitel jelentős változása. A munka eredményeként az alvás alatti szinaptikus plaszticitásért felelős fehérjéket is megismerhettünk, melyek pontos szerepe további vizsgálatokkal tisztázható.

59

9. Summary Sleep is a common phenomenon in animals, which is necessary for the appropriate function of the organism. It is suggested that sleep has its role in the physiologic mechanisms of the central nervous system partly in the maintenance of homeostasis and partly in the facilitation of neuronal plasticity. The underlying sleep specific molecular mechanisms however are not sufficiently known yet. In our examination we carried out 8 hours long sleep deprivation of adult male rats. Then we compared the changes in the proteome of their parietal cortex and thalamus with the same brain structures’ proteome of control animals, which were allowed to sleep. We used for the work the whole tissue samples of the parietal cortex and thalamus from one side, and prepared synaptosomes from regions of the other side. We carried out the 2D-DIGE proteomic technique for the examination of the whole tissue and synaptosomal samples. The method includes the marking of proteins with fluorescent dyes and their separation in two steps (isoelectric focusing and separation by mass). We acquired protein spots contained proteins with significantly changed amounts after the analysis of the gained gel images with softwares. The proteins of the spots were identified then by MS/MS. As a result of the examination we found 87 proteins with significantly changed amounts caused by the sleep deprivation. We defined the functions of the proteins in cellular processes by the published literature. According to the acquired information we could say that sleep deprivation influenced particularly the proteins which have role in the carbohydrate and energy metabolism, in the synaptic transmission, in the biosynthesis and folding of proteins, and in the organization of the cytoskeleton. Whereas there were 35 proteins’ significant quantitative changes in the thalamus, than 62 in the cerebral cortex, that may refer to the information processing ability and plasticity of the cortex. Besides establishing the most influenced cellular processes we could also conclude the functional changes specific for the synapses by finding out the roles of the proteins gained from the synaptosomes. The results suggest the remodeling of the synaptic structures, changes in the mechanisms of carbohydrate metabolism take place in the cytoplasm, in mitochondrions and associated to the synaptic vesicles, modifications in the vesicle exocytosis, altogether notable changes in the synaptic transmission. As a result of the work we might gained proteins responsible for the synaptic plasticity during sleep. They exact role could be clarified by further studies.

60

10. Hivatkozások 1.

Acevedo K, Li R, Soo P, Suryadinata R, Sarcevic B, Valova VA, Graham ME, Robinson PJ, Bernard O. The phosphorylation of p25/TPPP by LIM kinase 1 inhibits its ability to assemble microtubules. Exp Cell Res. 2007 Dec 10;313(20):4091-106.

2.

Aeschbach D, Cutler AJ, Ronda JM. A role for non-rapid-eye-movement sleep homeostasis in perceptual learning. J Neurosci. 2008 Mar 12;28(11):2766-72.

3.

Akiba T, Hiraga K, Tuboi S. Intracellular distribution of fumarase in various animals. J Biochem. 1984 Jul;96(1):189-95.

4.

Alexandre S, Nakaki T, Vanhamme L, Lee AS. A binding site for the cyclic adenosine 3',5'monophosphate-response element-binding protein as a regulatory element in the grp78 promoter. Mol Endocrinol. 1991 Dec;5(12):1862-72.

5.

Andreyeva A, Leshchyns'ka I, Knepper M, Betzel C, Redecke L, Sytnyk V, Schachner M. CHL1 is a selective organizer of the presynaptic machinery chaperoning the SNARE complex. PLoS One. 2010 Aug 11;5(8):e12018.

6.

Angeletti PC, Walker D, Panganiban AT. Small glutamine-rich protein/viral protein U-binding protein is a novel cochaperone that affects heat shock protein 70 activity. Cell Stress Chaperones. 2002 Jul;7(3):258-68.

7.

Arimura N, Ménager C, Kawano Y, Yoshimura T, Kawabata S, Hattori A, Fukata Y, Amano M, Goshima Y, Inagaki M, Morone N, Usukura J, Kaibuchi K. Phosphorylation by Rho kinase regulates CRMP-2 activity in growth cones. Mol Cell Biol. 2005 Nov;25(22):9973-84.

8.

Asrar S, Meng Y, Zhou Z, Todorovski Z, Huang WW, Jia Z. Regulation of hippocampal long-term potentiation by p21-activated protein kinase 1 (PAK1). Neuropharmacology. 2009 Jan;56(1):73-80.

9.

Atkins CM, Chen SJ, Klann E, Sweatt JD. Increased phosphorylation of myelin basic protein during hippocampal long-term potentiation. J Neurochem. 1997 May;68(5):1960-7.

10. Bähler M, Klein RL, Wang JK, Benfenati F, Greengard P. A novel synaptic vesicle-associated phosphoprotein: SVAPP-120. J Neurochem. 1991 Aug;57(2):423-30. 11. Bai F, Witzmann FA. Synaptosome proteomics. Subcell Biochem. 2007;43:77-98. 12. Bamm VV, De Avila M, Smith GS, Ahmed MA, Harauz G. Structured functional domains of myelin basic protein: cross talk between actin polymerization and Ca(2+)-dependent calmodulin interaction. Biophys J. 2011 Sep 7;101(5):1248-56. 13. Banfield MJ, Barker JJ, Perry AC, Brady RL. Function from structure? The crystal structure of human phosphatidylethanolamine-binding protein suggests a role in membrane signal transduction. Structure. 1998 Oct 15;6(10):1245-54.

61

14. Banz VM, Medová M, Keogh A, Furer C, Zimmer Y, Candinas D, Stroka D. Hsp90 transcriptionally and post-translationally regulates the expression of NDRG1 and maintains the stability of its modifying kinase GSK3beta. Biochim Biophys Acta. 2009 Oct;1793(10):1597-603. 15. Barrachina M, Castaño E, Dalfó E, Maes T, Buesa C, Ferrer I. Reduced ubiquitin C-terminal hydrolase1 expression levels in dementia with Lewy bodies. Neurobiol Dis. 2006 May;22(2):265-73. 16. Barry MF, Ziff EB. Receptor trafficking and the plasticity of excitatory synapses. Curr Opin Neurobiol. 2002 Jun;12(3):279-86. 17. Basheer R, Brown R, Ramesh V, Begum S, McCarley RW. Sleep deprivation-induced protein changes in basal forebrain: implications for synaptic plasticity. J Neurosci Res. 2005 Dec 1;82(5):650-8. 18. Becker J, Melchior F, Gerke V, Bischoff FR, Ponstingl H, Wittinghofer A. RNA1 encodes a GTPaseactivating protein specific for Gsp1p, the Ran/TC4 homologue of Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 1995 May 19;270(20):11860-5. 19. Benington JH, Frank MG. Cellular and molecular connections between sleep and synaptic plasticity. Prog Neurobiol. 2003 Feb;69(2):71-101. 20. Benson DL, Mandell JW, Shaw G, Banker G. Compartmentation of alpha-internexin and neurofilament triplet proteins in cultured hippocampal neurons. J Neurocytol. 1996 Mar;25(3):181-96. 21. Bingol B, Schuman EM. A proteasome-sensitive connection between PSD-95 and GluR1 endocytosis. Neuropharmacology. 2004 Oct;47(5):755-63. 22. Bingol B, Sheng M. Deconstruction for reconstruction: the role of proteolysis in neural plasticity and disease. Neuron. 2011 Jan 13;69(1):22-32. 23. Boggs JM, Rangaraj G, Heng YM, Liu Y, Harauz G. Myelin basic protein binds microtubules to a membrane surface and to actin filaments in vitro: effect of phosphorylation and deimination. Biochim Biophys Acta. 2011 Mar;1808(3):761-73. 24. Borbély AA. From slow waves to sleep homeostasis: new perspectives. Arch Ital Biol. 2001 Feb;139(12):53-61. 25. Born J, Wilhelm I. System consolidation of memory during sleep. Psychol Res. 2012 Mar;76(2):192203. 26. Born J. Slow-wave sleep and the consolidation of long-term memory. World J Biol Psychiatry. 2010 Jun;11 Suppl 1:16-21. 27. Brauch RA, Adnan El-Masri M, Parker JC Jr, El-Mallakh RS. Glial cell number and neuron/glial cell ratios in postmortem brains of bipolar individuals. J Affect Disord. 2006 Mar;91(1):87-90. 28. Bretin S, Rogemond V, Marin P, Maus M, Torrens Y, Honnorat J, Glowinski J, Prémont J, Gauchy C. Calpain product of WT-CRMP2 reduces the amount of surface NR2B NMDA receptor subunit. J Neurochem. 2006 Aug;98(4):1252-65. 29. Brittain JM, Piekarz AD, Wang Y, Kondo T, Cummins TR, Khanna R. An atypical role for collapsin response mediator protein 2 (CRMP-2) in neurotransmitter release via interaction with presynaptic voltage-gated calcium channels. J Biol Chem. 2009 Nov 6;284(45):31375-90.

62

30. Browning M, Baudry M, Bennett WF, Lynch G. Phosphorylation-mediated changes in pyruvate dehydrogenase activity influence pyruvate-supported calcium accumulation by brain mitochondria. J Neurochem. 1981b Jun;36(6):1932-40. 31. Browning M, Bennett WF, Kelly P, Lynch G. Evidence that the 40,000 Mr phosphoprotein influenced by high frequency synaptic stimulation is the alpha subunit of pyruvate dehydrogenase. Brain Res. 1981a Aug 10;218(1-2):255-66. 32. Bryce NS, Schevzov G, Ferguson V, Percival JM, Lin JJ, Matsumura F, Bamburg JR, Jeffrey PL, Hardeman EC, Gunning P, Weinberger RP. Specification of actin filament function and molecular composition by tropomyosin isoforms. Mol Biol Cell. 2003 Mar;14(3):1002-16. 33. Burré J, Sharma M, Tsetsenis T, Buchman V, Etherton MR, Südhof TC. Alpha-synuclein promotes SNARE-complex assembly in vivo and in vitro. Science. 2010 Sep 24;329(5999):1663-7. 34. Burré J, Volknandt W. The synaptic vesicle proteome. J Neurochem. 2007 Jun;101(6):1448-62. 35. Bushey D, Tononi G, Cirelli C. Sleep and synaptic homeostasis: structural evidence in Drosophila. Science. 2011 Jun 24;332(6037):1576-81. 36. Butler IJ, Koslow SH, Krumholz A, Holtzman NA, Kaufman S. A disorder of biogenic amines in dihydropteridine reductase deficiency. Ann Neurol. 1978 Mar;3(3):224-30. 37. Buzsáki G. Memory consolidation during sleep: a neurophysiological perspective. J Sleep Res. 1998;7 Suppl 1:17-23. 38. Calhoun CC, Lu YC, Song J, Chiu R. Knockdown endogenous CypA with siRNA in U2OS cells results in disruption of F-actin structure and alters tumor phenotype. Mol Cell Biochem. 2009 Jan;320(1-2):3543. 39. Caltagarone J, Rhodes J, Honer WG, Bowser R. Localization of a novel septin protein, hCDCrel-1, in neurons of human brain. Neuroreport. 1998 Aug 24;9(12):2907-12. 40. Cameron AM, Steiner JP, Roskams AJ, Ali SM, Ronnett GV, Snyder SH. Calcineurin associated with the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor-FKBP12 complex modulates Ca2+ flux. Cell. 1995 Nov 3;83(3):463-72. 41. Campbell IG, Guinan MJ, Horowitz JM. Sleep deprivation impairs long-term potentiation in rat hippocampal slices. J Neurophysiol. 2002 Aug;88(2):1073-6. 42. Cartier AE, Djakovic SN, Salehi A, Wilson SM, Masliah E, Patrick GN. Regulation of synaptic structure by ubiquitin C-terminal hydrolase L1. J Neurosci. 2009 Jun 17;29(24):7857-68. 43. Case A, Stein RL. Mechanistic studies of ubiquitin C-terminal hydrolase L1. Biochemistry. 2006 Feb 21;45(7):2443-52. 44. Chang N, Li L, Hu R, Shan Y, Liu B, Li L, Wang H, Feng H, Wang D, Cheung C, Liao M, Wan Q. Differential regulation of NMDA receptor function by DJ-1 and PINK1. Aging Cell. 2010 Oct;9(5):83750. 45. Chang SC, Wooden SK, Nakaki T, Kim YK, Lin AY, Kung L, Attenello JW, Lee AS. Rat gene encoding the 78-kDa glucose-regulated protein GRP78: its regulatory sequences and the effect of protein glycosylation on its expression. Proc Natl Acad Sci U S A. 1987 Feb;84(3):680-4. 63

46. Chatziioannou A, Palaiologos G, Kolisis FN. Metabolic flux analysis as a tool for the elucidation of the metabolism of neurotransmitter glutamate. Metab Eng. 2003 Jul;5(3):201-10. 47. Chen C, Hardy M, Zhang J, LaHoste GJ, Bazan NG. Altered NMDA receptor trafficking contributes to sleep deprivation-induced hippocampal synaptic and cognitive impairments. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Feb 10;340(2):435-40. 48. Chen JC, Chesler M. pH transients evoked by excitatory synaptic transmission are increased by inhibition of extracellular carbonic anhydrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Aug 15;89(16):7786-90. 49. Chen Y, Durakoglugil MS, Xian X, Herz J. ApoE4 reduces glutamate receptor function and synaptic plasticity by selectively impairing ApoE receptor recycling. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jun 29;107(26):12011-6. 50. Cheng D, Hoogenraad CC, Rush J, Ramm E, Schlager MA, Duong DM, Xu P, Wijayawardana SR, Hanfelt J, Nakagawa T, Sheng M, Peng J. Relative and absolute quantification of postsynaptic density proteome isolated from rat forebrain and cerebellum. Mol Cell Proteomics. 2006 Jun;5(6):1158-70. 51. Chevalier F. Highlights on the capacities of "Gel-based" proteomics. Proteome Sci. 2010 Apr 28;8:23. 52. Chien CL, Mason CA, Liem RK. alpha-Internexin is the only neuronal intermediate filament expressed in developing cerebellar granule neurons. J Neurobiol. 1996 Mar;29(3):304-18. 53. Christensen JR, Larsen KB, Lisanby SH, Scalia J, Arango V, Dwork AJ, Pakkenberg B. Neocortical and hippocampal neuron and glial cell numbers in the rhesus monkey. Anat Rec (Hoboken). 2007 Mar;290(3):330-40. 54. Chun YS, Shima H, Nagasaki K, Sugimura T, Nagao M. PP1 gamma 2, a testis-specific proteinserine/threonine-phosphatase type 1 catalytic subunit, is associated with a protein having high sequence homology with the 78-kDa glucose-regulated protein, a member of the 70-kDa heat shock protein family. Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Apr 12;91(8):3319-23. 55. Cirelli C, Tononi G. Differential expression of plasticity-related genes in waking and sleep and their regulation by the noradrenergic system. J Neurosci. 2000a Dec 15;20(24):9187-94. 56. Cirelli C, Tononi G. Gene expression in the brain across the sleep-waking cycle. Brain Res. 2000b Dec 8;885(2):303-21. 57. Cirelli C, Tononi G. Is sleep essential? PLoS Biol. 2008 Aug 26;6(8):e216. 58. Collins MO, Husi H, Yu L, Brandon JM, Anderson CN, Blackstock WP, Choudhary JS, Grant SG. Molecular characterization and comparison of the components and multiprotein complexes in the postsynaptic proteome. J Neurochem. 2006 Apr;97 Suppl 1:16-23. 59. Collins MO, Yu L, Coba MP, Husi H, Campuzano I, Blackstock WP, Choudhary JS, Grant SG. Proteomic analysis of in vivo phosphorylated synaptic proteins. J Biol Chem. 2005 Feb 18;280(7):597282. 60. Conti F, Barbaresi P, Melone M, Ducati A. Neuronal and glial localization of NR1 and NR2A/B subunits of the NMDA receptor in the human cerebral cortex. Cereb Cortex. 1999 Mar;9(2):110-20.

64

61. Coughenour HD, Spaulding RS, Thompson CM. The synaptic vesicle proteome: a comparative study in membrane protein identification. Proteomics. 2004 Oct;4(10):3141-55. 62. Czyzyk-Krzeska MF, Bendixen AC. Identification of the poly(C) binding protein in the complex associated with the 3' untranslated region of erythropoietin messenger RNA. Blood. 1999 Mar 15;93(6):2111-20. 63. Darbandi-Tonkabon R, Hastings WR, Zeng CM, Akk G, Manion BD, Bracamontes JR, Steinbach JH, Mennerick SJ, Covey DF, Evers AS. Photoaffinity labeling with a neuroactive steroid analogue. 6-azipregnanolone labels voltage-dependent anion channel-1 in rat brain. J Biol Chem. 2003 Apr 11;278(15):13196-206. 64. Datta PK, Chytil A, Gorska AE, Moses HL. Identification of STRAP, a novel WD domain protein in transforming growth factor-beta signaling. J Biol Chem. 1998 Dec 25;273(52):34671-4. 65. David HA, Gunnink JL. The paired t test under artificial pairing. The American Statistician. Vol. 51, No. 1 (Feb., 1997) (pp. 9-12) 66. Davis CJ, Harding JW, Wright JW. REM sleep deprivation-induced deficits in the latency-to-peak induction and maintenance of long-term potentiation within the CA1 region of the hippocampus. Brain Res. 2003 May 30;973(2):293-7. 67. de Lecea L, Sutcliffe JG. The hypocretins and sleep. FEBS J. 2005 Nov;272(22):5675-88. 68. De Waard M, Liu H, Walker D, Scott VE, Gurnett CA, Campbell KP. Direct binding of G-protein betagamma complex to voltage-dependent calcium channels. Nature. 1997 Jan 30;385(6615):446-50. 69. Diekelmann S, Born J. The memory function of sleep. Nat Rev Neurosci. 2010 Feb;11(2):114-26. 70. Dombrowski SM, Hilgetag CC, Barbas H. Quantitative architecture distinguishes prefrontal cortical systems in the rhesus monkey. Cereb Cortex. 2001 Oct;11(10):975-88. 71. Dosemeci A, Tao-Cheng JH, Vinade L, Jaffe H. Preparation of postsynaptic density fraction from hippocampal slices and proteomic analysis. Biochem Biophys Res Commun. 2006 Jan 13;339(2):68794. 72. Dütting S, Brachs S, Mielenz D. Fraternal twins: Swiprosin-1/EFhd2 and Swiprosin-2/EFhd1, two homologous EF-hand containing calcium binding adaptor proteins with distinct functions. Cell Commun Signal. 2011 Jan 18;9:2. 73. Dworak M, McCarley RW, Kim T, Kalinchuk AV, Basheer R. Sleep and brain energy levels: ATP changes during sleep. J Neurosci. 2010 Jun 30;30(26):9007-16. 74. Eaton BA, Fetter RD, Davis GW. Dynactin is necessary for synapse stabilization. Neuron. 2002 May 30;34(5):729-41. 75. Esser SK, Hill SL, Tononi G. Sleep homeostasis and cortical synchronization: I. Modeling the effects of synaptic strength on sleep slow waves. Sleep. 2007 Dec;30(12):1617-30. 76. Faivre-Sarrailh C, Lena JY, Had L, Vignes M, Lindberg U. Location of profilin at presynaptic sites in the cerebellar cortex; implication for the regulation of the actin-polymerization state during axonal elongation and synaptogenesis. J Neurocytol. 1993 Dec;22(12):1060-72.

65

77. Fatma N, Kubo E, Sharma P, Beier DR, Singh DP. Impaired homeostasis and phenotypic abnormalities in Prdx6-/-mice lens epithelial cells by reactive oxygen species: increased expression and activation of TGFbeta. Cell Death Differ. 2005 Jul;12(7):734-50. 78. Fenzl T, Romanowski CP, Flachskamm C, Honsberg K, Boll E, Hoehne A, Kimura M. Fully automated sleep deprivation in mice as a tool in sleep research. J Neurosci Methods. 2007 Nov 30;166(2):229-35. 79. Fiske E, Grønli J, Bjorvatn B, Ursin R, Portas CM. The effect of GABA(A) antagonist bicuculline on dorsal raphe nucleus and frontal cortex extracellular serotonin: a window on SWS and REM sleep modulation. Pharmacol Biochem Behav. 2006 Feb;83(2):314-21 80. Fornuskova D, Stiburek L, Wenchich L, Vinsova K, Hansikova H, Zeman J. Novel insights into the assembly and function of human nuclear-encoded cytochrome c oxidase subunits 4, 5a, 6a, 7a and 7b. Biochem J. 2010 May 27;428(3):363-74. 81. Fraser CS, Lee JY, Mayeur GL, Bushell M, Doudna JA, Hershey JW. The j-subunit of human translation initiation factor eIF3 is required for the stable binding of eIF3 and its subcomplexes to 40 S ribosomal subunits in vitro. J Biol Chem. 2004 Mar 5;279(10):8946-56. 82. Friedman AH, Walker CA. Rat brain amines, blood histamine and glucose levels in relationship to circadian changes in sleep induced by pentobarbitone sodium. J Physiol. 1969 May;202(1):133-46. 83. Gabbott PL, Stewart MG. Distribution of neurons and glia in the visual cortex (area 17) of the adult albino rat: a quantitative description. Neuroscience. 1987 Jun;21(3):833-45. 84. Galigniana MD, Morishima Y, Gallay PA, Pratt WB. Cyclophilin-A is bound through its peptidylprolyl isomerase domain to the cytoplasmic dynein motor protein complex. J Biol Chem. 2004 Dec 31;279(53):55754-9. 85. García DE, Li B, García-Ferreiro RE, Hernández-Ochoa EO, Yan K, Gautam N, Catterall WA, Mackie K, Hille B. G-protein beta-subunit specificity in the fast membrane-delimited inhibition of Ca2+ channels. J Neurosci. 1998 Nov 15;18(22):9163-70. 86. Gauci VJ, Wright EP, Coorssen JR. Quantitative proteomics: assessing the spectrum of in-gel protein detection methods. J Chem Biol. 2011 Jan;4(1):3-29. 87. Geinisman Y. Structural synaptic modifications associated with hippocampal LTP and behavioral learning. Cereb Cortex. 2000 Oct;10(10):952-62. 88. Gilestro GF, Tononi G, Cirelli C. Widespread changes in synaptic markers as a function of sleep and wakefulness in Drosophila. Science. 2009 Apr 3;324(5923):109-12. 89. Gitler D, Cheng Q, Greengard P, Augustine GJ. Synapsin IIa controls the reserve pool of glutamatergic synaptic vesicles. J Neurosci. 2008 Oct 22;28(43):10835-43. 90. Giuditta A, Ambrosini MV, Montagnese P, Mandile P, Cotugno M, Grassi Zucconi G, Vescia S. The sequential hypothesis of the function of sleep. Behav Brain Res. 1995 Jul-Aug;69(1-2):157-66. 91. Goellner GM, DeMarco SJ, Strehler EE. Characterization of PISP, a novel single-PDZ protein that binds to all plasma membrane Ca2+-ATPase b-splice variants. Ann N Y Acad Sci. 2003 Apr;986:46171.

66

92. Gong B, Cao Z, Zheng P, Vitolo OV, Liu S, Staniszewski A, Moolman D, Zhang H, Shelanski M, Arancio O. Ubiquitin hydrolase Uch-L1 rescues beta-amyloid-induced decreases in synaptic function and contextual memory. Cell. 2006 Aug 25;126(4):775-88. 93. Gu J, Lee CW, Fan Y, Komlos D, Tang X, Sun C, Yu K, Hartzell HC, Chen G, Bamburg JR, Zheng JQ. ADF/cofilin-mediated actin dynamics regulate AMPA receptor trafficking during synaptic plasticity. Nat Neurosci. 2010b Oct;13(10):1208-15. 94. Gu L, Jones AD, Last RL. Broad connections in the Arabidopsis seed metabolic network revealed by metabolite profiling of an amino acid catabolism mutant. Plant J. 2010a Feb;61(4):579-90. 95. Gupta M, Sueblinvong V, Raman J, Jeevanandam V, Gupta MP. Single-stranded DNA-binding proteins PURalpha and PURbeta bind to a purine-rich negative regulatory element of the alpha-myosin heavy chain gene and control transcriptional and translational regulation of the gene expression. Implications in the repression of alpha-myosin heavy chain during heart failure. J Biol Chem. 2003 Nov 7;278(45):44935-48. 96. Gygi SP, Rochon Y, Franza BR, Aebersold R. Correlation between protein and mRNA abundance in yeast. Mol Cell Biol. 1999 Mar;19(3):1720-30. 97. Haas KF, Miller SL, Friedman DB, Broadie K. The ubiquitin-proteasome system postsynaptically regulates glutamatergic synaptic function. Mol Cell Neurosci. 2007 May;35(1):64-75. 98. Hagiya A, Naganuma T, Maki Y, Ohta J, Tohkairin Y, Shimizu T, Nomura T, Hachimori A, Uchiumi T. A mode of assembly of P0, P1, and P2 proteins at the GTPase-associated center in animal ribosome: in vitro analyses with P0 truncation mutants. J Biol Chem. 2005 Nov 25;280(47):39193-9. 99. Hallen A, Cooper AJ, Jamie JF, Haynes PA, Willows RD. Mammalian forebrain ketimine reductase identified as μ-crystallin; potential regulation by thyroid hormones. J Neurochem. 2011 Aug;118(3):379-87. 100. Hartmann-Petersen R, Tanaka K, Hendil KB. Quaternary structure of the ATPase complex of human 26S proteasomes determined by chemical cross-linking. Arch Biochem Biophys. 2001 Feb 1;386(1):8994. 101. He L, Weber A, Levens D. Nuclear targeting determinants of the far upstream element binding protein, a c-myc transcription factor. Nucleic Acids Res. 2000 Nov 15;28(22):4558-65. 102. He XY, Wegiel J, Yang SY. Intracellular oxidation of allopregnanolone by human brain type 10 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase. Brain Res. 2005 Apr 8;1040(1-2):29-35. 103. Hellmann J, Rommelspacher H, Mühlbauer E, Wernicke C. Raf kinase inhibitor protein enhances neuronal differentiation in human SH-SY5Y cells. Dev Neurosci. 2010 Mar;32(1):33-46. 104. Hemelaar J, Borodovsky A, Kessler BM, Reverter D, Cook J, Kolli N, Gan-Erdene T, Wilkinson KD, Gill G, Lima CD, Ploegh HL, Ovaa H. Specific and covalent targeting of conjugating and deconjugating enzymes of ubiquitin-like proteins. Mol Cell Biol. 2004 Jan;24(1):84-95. 105. Hennevin E, Hars B, Maho C, Bloch V. Processing of learned information in paradoxical sleep: relevance for memory. Behav Brain Res. 1995 Jul-Aug;69(1-2):125-35.

67

106. Hesse C, Bogdanovic N, Davidsson P, Blennow K. A quantitative and immunohistochemical study on apolipoprotein E in brain tissue in Alzheimer's disease. Dement Geriatr Cogn Disord. 1999 NovDec;10(6):452-9. 107. Higa LA, Wu M, Ye T, Kobayashi R, Sun H, Zhang H. CUL4-DDB1 ubiquitin ligase interacts with multiple WD40-repeat proteins and regulates histone methylation. Nat Cell Biol. 2006 Nov;8(11):127783. 108. Hlavanda E, Kovács J, Oláh J, Orosz F, Medzihradszky KF, Ovádi J. Brain-specific p25 protein binds to tubulin and microtubules and induces aberrant microtubule assemblies at substoichiometric concentrations. Biochemistry. 2002 Jul 9;41(27):8657-64. 109. Hoeffer CA, Tang W, Wong H, Santillan A, Patterson RJ, Martinez LA, Tejada-Simon MV, Paylor R, Hamilton SL, Klann E. Removal of FKBP12 enhances mTOR-Raptor interactions, LTP, memory, and perseverative/repetitive behavior. Neuron. 2008 Dec 10;60(5):832-45. 110. Hoffman GG, Lee S, Christiano AM, Chung-Honet LC, Cheng W, Katchman S, Uitto J, Greenspan DS. Complete coding sequence, intron/exon organization, and chromosomal location of the gene for the core I protein of human ubiquinol-cytochrome c reductase. J Biol Chem. 1993 Oct 5;268(28):21113-9. 111. Hoffman KL, McNaughton BL. Coordinated reactivation of distributed memory traces in primate neocortex. Science. 2002 Sep 20;297(5589):2070-3. 112. Hsu CC, Davis KM, Jin H, Foos T, Floor E, Chen W, Tyburski JB, Yang CY, Schloss JV, Wu JY. Association of L-glutamic acid decarboxylase to the 70-kDa heat shock protein as a potential anchoring mechanism to synaptic vesicles. J Biol Chem. 2000 Jul 7;275(27):20822-8. 113. Huber R, Esser SK, Ferrarelli F, Massimini M, Peterson MJ, Tononi G. TMS-induced cortical potentiation during wakefulness locally increases slow wave activity during sleep. PLoS One. 2007 Mar 7;2(3):e276. 114. Huber R, Ghilardi MF, Massimini M, Tononi G. Local sleep and learning. Nature. 2004 Jul 1;430(6995):78-81. 115. Huo LR, Zhong N. Identification of transcripts and translatants targeted by overexpressed PCBP1. Biochim Biophys Acta. 2008 Nov;1784(11):1524-33. 116. Ian'shina DD, Malygin AA, Karpova GG. Binding of human ribosomal protein S16 with the 18S rRNA fragment 1203-1236/1521-1698. Mol Biol (Mosk). 2007 Nov-Dec;41(6):1023-30. 117. Ikemoto A, Bole DG, Ueda T. Glycolysis and glutamate accumulation into synaptic vesicles. Role of glyceraldehyde phosphate dehydrogenase and 3-phosphoglycerate kinase. J Biol Chem. 2003 Feb 21;278(8):5929-40. 118. Ikemoto A, Ueda T. Identification of a nerve ending-enriched 29-kDa protein, labeled with [3-32P]1,3bisphosphoglycerate, as monophosphoglycerate mutase: inhibition by fructose-2,6-bisphosphate via enhancement of dephosphorylation. J Neurochem. 2003 Jun;85(6):1382-93. 119. Jeftinija SD, Jeftinija KV, Stefanovic G. Cultured astrocytes express proteins involved in vesicular glutamate release. Brain Res. 1997 Mar 7;750(1-2):41-7. 120. Johnson JA, el Barbary A, Kornguth SE, Brugge JF, Siegel FL. Glutathione S-transferase isoenzymes in rat brain neurons and glia. J Neurosci. 1993 May;13(5):2013-23. 68

121. Jordan BA, Fernholz BD, Boussac M, Xu C, Grigorean G, Ziff EB, Neubert TA. Identification and verification of novel rodent postsynaptic density proteins. Mol Cell Proteomics. 2004 Sep;3(9):857-71. 122. Kachhap SK, Faith D, Qian DZ, Shabbeer S, Galloway NL, Pili R, Denmeade SR, DeMarzo AM, Carducci MA. The N-Myc down regulated Gene1 (NDRG1) Is a Rab4a effector involved in vesicular recycling of E-cadherin. PLoS One. 2007 Sep 5;2(9):e844. 123. Kakhniashvili DG, Bulla LA Jr, Goodman SR. The human erythrocyte proteome: analysis by ion trap mass spectrometry. Mol Cell Proteomics. 2004 May;3(5):501-9. 124. Kalia M. Neurobiology of sleep. Metabolism. 2006 Oct;55(10 Suppl 2):S2-6. 125. Kamada K, Goto S, Okunaga T, Ihara Y, Tsuji K, Kawai Y, Uchida K, Osawa T, Matsuo T, Nagata I, Kondo T. Nuclear glutathione S-transferase pi prevents apoptosis by reducing the oxidative stressinduced formation of exocyclic DNA products. Free Radic Biol Med. 2004 Dec 1;37(11):1875-84. 126. Kandel ER, Schwartz JH, Jessell TM (2000) Principles of neural science, 4., Nerve cells and behavior, 22.oldal, McGraw-Hill, New York, ISBN: 0-8385-7701-6 127. Kataoka H, Biswas C. Nucleotide sequence of a cDNA for the alpha subunit of human mitochondrial ATP synthase. Biochim Biophys Acta. 1991 Jul 23;1089(3):393-5. 128. Kesavapany S, Patel V, Zheng YL, Pareek TK, Bjelogrlic M, Albers W, Amin N, Jaffe H, Gutkind JS, Strong MJ, Grant P, Pant HC. Inhibition of Pin1 reduces glutamate-induced perikaryal accumulation of phosphorylated neurofilament-H in neurons. Mol Biol Cell. 2007 Sep;18(9):3645-55. 129. Kim RY, Gasser R, Wistow GJ. mu-crystallin is a mammalian homologue of Agrobacterium ornithine cyclodeaminase and is expressed in human retina. Proc Natl Acad Sci U S A. 1992 Oct 1;89(19):9292-6. 130. Kimura N, Okabayashi S, Ono F. Dynein dysfunction disrupts intracellular vesicle trafficking bidirectionally and perturbs synaptic vesicle docking via endocytic disturbances a potential mechanism underlying age-dependent impairment of cognitive function. Am J Pathol. 2012 Feb;180(2):550-61. 131. Kinoshita N, Kimura K, Matsumoto N, Watanabe M, Fukaya M, Ide C. Mammalian septin Sept2 modulates the activity of GLAST, a glutamate transporter in astrocytes. Genes Cells. 2004 Jan;9(1):114. 132. Kitanishi T, Sakai J, Kojima S, Saitoh Y, Inokuchi K, Fukaya M, Watanabe M, Matsuki N, Yamada MK. Activity-dependent localization in spines of the F-actin capping protein CapZ screened in a rat model of dementia. Genes Cells. 2010 Jun;15(7):737-47. 133. Klysik J, Theroux SJ, Sedivy JM, Moffit JS, Boekelheide K. Signaling crossroads: the function of Raf kinase inhibitory protein in cancer, the central nervous system and reproduction. Cell Signal. 2008 Jan;20(1):1-9. 134. Knull HR. Compartmentation of glycolytic enzymes in nerve endings as determined by glutaraldehyde fixation. J Biol Chem. 1980 Jul 10;255(13):6439-44. 135. Koch S, Molchanova SM, Wright AK, Edwards A, Cooper JD, Taira T, Gillingwater TH, Tyynelä J. Morphologic and functional correlates of synaptic pathology in the cathepsin D knockout mouse model of congenital neuronal ceroid lipofuscinosis. J Neuropathol Exp Neurol. 2011 Dec;70(12):1089-96.

69

136. Kopp C, Longordo F, Nicholson JR, Lüthi A. Insufficient sleep reversibly alters bidirectional synaptic plasticity and NMDA receptor function. J Neurosci. 2006 Nov 29;26(48):12456-65. 137. Koslow SH, Butler IJ. Biogenic amine synthesis defect in dihydropteridine reductase deficiency. Science. 1977 Nov 4;198(4316):522-3. 138. Krueger JM, Obál F Jr, Fang J. Humoral regulation of physiological sleep: cytokines and GHRH. J Sleep Res. 1999a Jun;8 Suppl 1:53-9. 139. Krueger JM, Obál F Jr, Fang J. Why we sleep: a theoretical view of sleep function. Sleep Med Rev. 1999b Jun;3(2):119-29. 140. Lansbury PT Jr. Improving synaptic function in a mouse model of AD. Cell. 2006 Aug 25;126(4):6557. 141. Lanté F, Toledo-Salas JC, Ondrejcak T, Rowan MJ, Ulrich D. Removal of synaptic Ca²+-permeable AMPA receptors during sleep. J Neurosci. 2011 Mar 16;31(11):3953-61. 142. Larsen AK, Lametsch R, Elce J, Larsen JK, Thomsen B, Larsen MR, Lawson MA, Greer PA, Ertbjerg P. Genetic disruption of calpain correlates with loss of membrane blebbing and differential expression of RhoGDI-1, cofilin and tropomyosin. Biochem J. 2008 May 1;411(3):657-66. 143. Legault G, Smith CT, Beninger RJ. Scopolamine during the paradoxical sleep window impairs radial arm maze learning in rats. Pharmacol Biochem Behav. 2004 Dec;79(4):715-21. 144. Leonard BJ, McNaughton BL, Barnes CA. Suppression of hippocampal synaptic plasticity during slowwave sleep. Brain Res. 1987 Nov 3;425(1):174-7. 145. Li K, Hornshaw MP, van Minnen J, Smalla KH, Gundelfinger ED, Smit AB. Organelle proteomics of rat synaptic proteins: correlation-profiling by isotope-coded affinity tagging in conjunction with liquid chromatography-tandem mass spectrometry to reveal post-synaptic density specific proteins. J Proteome Res. 2005 May-Jun;4(3):725-33. 146. Li KW, Hornshaw MP, Van Der Schors RC, Watson R, Tate S, Casetta B, Jimenez CR, Gouwenberg Y, Gundelfinger ED, Smalla KH, Smit AB. Proteomics analysis of rat brain postsynaptic density. Implications of the diverse protein functional groups for the integration of synaptic physiology. J Biol Chem. 2004 Jan 9;279(2):987-1002. 147. Li Z, Jo J, Jia JM, Lo SC, Whitcomb DJ, Jiao S, Cho K, Sheng M. Caspase-3 activation via mitochondria is required for long-term depression and AMPA receptor internalization. Cell. 2010 May 28;141(5):859-71. 148. Lim MC, Brooke SM, Sapolsky RM. gp120 neurotoxicity fails to induce heat shock defenses, while the over expression of hsp70 protects against gp120. Brain Res Bull. 2003 Jul 15;61(2):183-8. 149. Liu S, Ninan I, Antonova I, Battaglia F, Trinchese F, Narasanna A, Kolodilov N, Dauer W, Hawkins RD, Arancio O. alpha-Synuclein produces a long-lasting increase in neurotransmitter release. EMBO J. 2004 Nov 10;23(22):4506-16. 150. Liu ZW, Faraguna U, Cirelli C, Tononi G, Gao XB. Direct evidence for wake-related increases and sleep-related decreases in synaptic strength in rodent cortex. J Neurosci. 2010 Jun 23;30(25):8671-5.

70

151. Lopes Aguiar C, Romcy-Pereira RN, Escorsim Szawka R, Galvis-Alonso OY, Anselmo-Franci JA, Pereira Leite J. Muscarinic acetylcholine neurotransmission enhances the late-phase of long-term potentiation in the hippocampal-prefrontal cortex pathway of rats in vivo: a possible involvement of monoaminergic systems. Neuroscience. 2008 Jun 2;153(4):1309-19. 152. Louie K, Wilson MA. Temporally structured replay of awake hippocampal ensemble activity during rapid eye movement sleep. Neuron. 2001 Jan;29(1):145-56. 153. Luiro K, Kopra O, Blom T, Gentile M, Mitchison HM, Hovatta I, Törnquist K, Jalanko A. Batten disease (JNCL) is linked to disturbances in mitochondrial, cytoskeletal, and synaptic compartments. J Neurosci Res. 2006 Oct;84(5):1124-38. 154. Lund TM, Risa O, Sonnewald U, Schousboe A, Waagepetersen HS. Availability of neurotransmitter glutamate is diminished when beta-hydroxybutyrate replaces glucose in cultured neurons. J Neurochem. 2009 Jul;110(1):80-91. 155. Lundmark R, Carlsson SR. Regulated membrane recruitment of dynamin-2 mediated by sorting nexin 9. J Biol Chem. 2004 Oct 8;279(41):42694-702. 156. Lynch G, Kessler M, Halpain S, Baudry M. Biochemical effects of high-frequency synaptic activity studied with in vitro slices. Fed Proc. 1983 Sep;42(12):2886-90. 157. Lynch MA. Long-term potentiation and memory. Physiol Rev. 2004 Jan;84(1):87-136. 158. Mackiewicz M, Shockley KR, Romer MA, Galante RJ, Zimmerman JE, Naidoo N, Baldwin DA, Jensen ST, Churchill GA, Pack AI. Macromolecule biosynthesis: a key function of sleep. Physiol Genomics. 2007 Nov 14;31(3):441-57. 159. MacLeod JC, Sayer RJ, Lucocq JM, Hubbard MJ. ERp29, a general endoplasmic reticulum marker, is highly expressed throughout the brain. J Comp Neurol. 2004 Sep 6;477(1):29-42. 160. Maddala R, Reneker LW, Pendurthi B, Rao PV. Rho GDP dissociation inhibitor-mediated disruption of Rho GTPase activity impairs lens fiber cell migration, elongation and survival. Dev Biol. 2008 Mar 1;315(1):217-31. 161. Madison DL, Krueger WH, Cheng D, Trapp BD, Pfeiffer SE. SNARE complex proteins, including the cognate pair VAMP-2 and syntaxin-4, are expressed in cultured oligodendrocytes. J Neurochem. 1999 Mar;72(3):988-98. 162. Maquet P. Sleep function(s) and cerebral metabolism. Behav Brain Res. 1995 Jul-Aug;69(1-2):75-83. 163. Maquet P. The role of sleep in learning and memory. Science. 2001 Nov 2;294(5544):1048-52. 164. Maret S, Faraguna U, Nelson AB, Cirelli C, Tononi G. Sleep and waking modulate spine turnover in the adolescent mouse cortex. Nat Neurosci. 2011 Oct 9;14(11):1418-20. 165. Masliah E, Mallory M, Veinbergs I, Miller A, Samuel W. Alterations in apolipoprotein E expression during aging and neurodegeneration. Prog Neurobiol. 1996 Dec;50(5-6):493-503. 166. McClelland JL, McNaughton BL, O'Reilly RC. Why there are complementary learning systems in the hippocampus and neocortex: insights from the successes and failures of connectionist models of learning and memory. Psychol Rev. 1995 Jul;102(3):419-57.

71

167. McDermott CM, Hardy MN, Bazan NG, Magee JC. Sleep deprivation-induced alterations in excitatory synaptic transmission in the CA1 region of the rat hippocampus. J Physiol. 2006 Feb 1;570(Pt 3):55365. 168. Mégevand P, Troncoso E, Quairiaux C, Muller D, Michel CM, Kiss JZ. Long-term plasticity in mouse sensorimotor circuits after rhythmic whisker stimulation. J Neurosci. 2009 Apr 22;29(16):5326-35. 169. Mertins P, Udeshi ND, Clauser KR, Mani DR, Patel J, Ong SE, Jaffe JD, Carr SA. iTRAQ labeling is superior to mTRAQ for quantitative global proteomics and phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 2011 Dec 30. 170. Mignot E. Why we sleep: the temporal organization of recovery. PLoS Biol. 2008 Apr 29;6(4):e106. 171. Moon IS, Park IS, Schenker LT, Kennedy MB, Moon JI, Jin I. Presence of both constitutive and inducible forms of heat shock protein 70 in the cerebral cortex and hippocampal synapses. Cereb Cortex. 2001 Mar;11(3):238-48. 172. Morciano M, Beckhaus T, Karas M, Zimmermann H, Volknandt W. The proteome of the presynaptic active zone: from docked synaptic vesicles to adhesion molecules and maxi-channels. J Neurochem. 2009 Feb;108(3):662-75. 173. Morciano M, Burré J, Corvey C, Karas M, Zimmermann H, Volknandt W. Immunoisolation of two synaptic vesicle pools from synaptosomes: a proteomics analysis. J Neurochem. 2005 Dec;95(6):173245. 174. Morgan DG, Routtenberg A. Brain pyruvate dehydrogenase: phosphorylation and enzyme activity altered by a training experience. Science. 1981 Oct 23;214(4519):470-1. 175. Morgan JR, Prasad K, Jin S, Augustine GJ, Lafer EM. Uncoating of clathrin-coated vesicles in presynaptic terminals: roles for Hsc70 and auxilin. Neuron. 2001 Oct 25;32(2):289-300. 176. Mosammaparast N, Jackson KR, Guo Y, Brame CJ, Shabanowitz J, Hunt DF, Pemberton LF. Nuclear import of histone H2A and H2B is mediated by a network of karyopherins. J Cell Biol. 2001 Apr 16;153(2):251-62. 177. Mumby M, Brekken D. Phosphoproteomics: new insights into cellular signaling. Genome Biol. 2005;6(9):230. 178. Musacchio JM, D'Angelo GL, McQueen CA. Dihydropteridine reductase: implication on the regulation of catecholamine biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 1971 Sep;68(9):2087-91. 179. Naciff JM, Kaetzel MA, Behbehani MM, Dedman JR. Differential expression of annexins I-VI in the rat dorsal root ganglia and spinal cord. J Comp Neurol. 1996 May 6;368(3):356-70. 180. Nádasdy Z, Hirase H, Czurkó A, Csicsvari J, Buzsáki G. Replay and time compression of recurring spike sequences in the hippocampus. J Neurosci. 1999 Nov 1;19(21):9497-507. 181. Nakanishi H, Sun Y, Nakamura RK, Mori K, Ito M, Suda S, Namba H, Storch FI, Dang TP, Mendelson W, Mishkin M, Kennedy C, Gillin JC, Smith CB, Sokoloff L. Positive correlations between cerebral protein synthesis rates and deep sleep in Macaca mulatta. Eur J Neurosci. 1997 Feb;9(2):271-9.

72

182. Nakano K, Kuwayama H, Kawasaki M, Numata O, Takaine M. GMF is an evolutionarily developed Adf/cofilin-super family protein involved in the Arp2/3 complex-mediated organization of the actin cytoskeleton. Cytoskeleton (Hoboken). 2010 Jun;67(6):373-82. 183. Nakatsu Y, Sakoda H, Kushiyama A, Ono H, Fujishiro M, Horike N, Yoneda M, Ohno H, Tsuchiya Y, Kamata H, Tahara H, Isobe T, Nishimura F, Katagiri H, Oka Y, Fukushima T, Takahashi S, Kurihara H, Uchida T, Asano T. Pin1 associates with and induces translocation of CRTC2 to the cytosol, thereby suppressing cAMP-responsive element transcriptional activity. J Biol Chem. 2010 Oct 22;285(43):33018-27. 184. Natochin M, Campbell TN, Barren B, Miller LC, Hameed S, Artemyev NO, Braun JE. Characterization of the G alpha(s) regulator cysteine string protein. J Biol Chem. 2005 Aug 26;280(34):30236-41. 185. Nedergaard M, Ransom B, Goldman SA. New roles for astrocytes: redefining the functional architecture of the brain. Trends Neurosci. 2003 Oct;26(10):523-30. 186. Nichols NR. Ndrg2, a novel gene regulated by adrenal steroids and antidepressants, is highly expressed in astrocytes. Ann N Y Acad Sci. 2003 Dec;1007:349-56. 187. Nicoll RA. Expression mechanisms underlying long-term potentiation: a postsynaptic view. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 2003 Apr 29;358(1432):721-6. 188. Nielsen RD, Abitz M, Pakkenberg B. Neuron and glial cell numbers in the mediodorsal thalamic nucleus in brains of schizophrenic subjects. Image Anal Stereol. 2008;27:133-141 189. Nieznańska H, Nieznański K, Stepkowski D. The effects of the interaction of myosin essential light chain isoforms with actin in skeletal muscles. Acta Biochim Pol. 2002;49(3):709-19. 190. Nishida M, Pearsall J, Buckner RL, Walker MP. REM sleep, prefrontal theta, and the consolidation of human emotional memory. Cereb Cortex. 2009 May;19(5):1158-66. 191. Nonn L, Berggren M, Powis G. Increased expression of mitochondrial peroxiredoxin-3 (thioredoxin peroxidase-2) protects cancer cells against hypoxia and drug-induced hydrogen peroxide-dependent apoptosis. Mol Cancer Res. 2003 Jul;1(9):682-9. 192. Norais N, Promé D, Velours J. ATP synthase of yeast mitochondria. Characterization of subunit d and sequence analysis of the structural gene ATP7. J Biol Chem. 1991 Sep 5;266(25):16541-9. 193. Norton BJ, Strube MJ. Guide for the interpretation of one-way analysis of variance. Phys Ther. 1985 Dec;65(12):1888, 1890, 1892 passim. 194. Ohashi S, Kobayashi S, Omori A, Ohara S, Omae A, Muramatsu T, Li Y, Anzai K. The single-stranded DNA- and RNA-binding proteins pur alpha and pur beta link BC1 RNA to microtubules through binding to the dendrite-targeting RNA motifs. J Neurochem. 2000 Nov;75(5):1781-90. 195. Ohta S, Tomura H, Matsuda K, Kagawa Y. Gene structure of the human mitochondrial adenosine triphosphate synthase beta subunit. J Biol Chem. 1988 Aug 15;263(23):11257-62. 196. Okere CO, Kaba H. Region-specific localization of glutamine synthetase immunoreactivity in the mouse olfactory bulb: implications for neuron-glia interaction in bulbar synaptic plasticity. Brain Res. 2000 Feb 28;857(1-2):308-12.

73

197. O'Kusky J, Colonnier M. A laminar analysis of the number of neurons, glia, and synapses in the adult cortex (area 17) of adult macaque monkeys. J Comp Neurol. 1982 Sep 20;210(3):278-90. 198. Olanich ME, Moss BL, Piwnica-Worms D, Townsend RR, Weber JD. Identification of FUSE-binding protein 1 as a regulatory mRNA-binding protein that represses nucleophosmin translation. Oncogene. 2011 Jan 6;30(1):77-86. 199. Oliver JD, van der Wal FJ, Bulleid NJ, High S. Interaction of the thiol-dependent reductase ERp57 with nascent glycoproteins. Science. 1997 Jan 3;275(5296):86-8. 200. Pachter JS, Liem RK. alpha-Internexin, a 66-kD intermediate filament-binding protein from mammalian central nervous tissues. J Cell Biol. 1985 Oct;101(4):1316-22. 201. Palchykova S, Winsky-Sommerer R, Meerlo P, Dürr R, Tobler I. Sleep deprivation impairs object recognition in mice. Neurobiol Learn Mem. 2006 May;85(3):263-71. 202. Parpura V, Fang Y, Basarsky T, Jahn R, Haydon PG. Expression of synaptobrevin II, cellubrevin and syntaxin but not SNAP-25 in cultured astrocytes. FEBS Lett. 1995 Dec 27;377(3):489-92. 203. Partanen S, Haapanen A, Kielar C, Pontikis C, Alexander N, Inkinen T, Saftig P, Gillingwater TH, Cooper JD, Tyynelä J. Synaptic changes in the thalamocortical system of cathepsin D-deficient mice: a model of human congenital neuronal ceroid-lipofuscinosis. J Neuropathol Exp Neurol. 2008 Jan;67(1):16-29. 204. Patrick GN, Bingol B, Weld HA, Schuman EM. Ubiquitin-mediated proteasome activity is required for agonist-induced endocytosis of GluRs. Curr Biol. 2003 Dec 2;13(23):2073-81. 205. Pawlyk AC, Ferber M, Shah A, Pack AI, Naidoo N. Proteomic analysis of the effects and interactions of sleep deprivation and aging in mouse cerebral cortex. J Neurochem. 2007 Dec;103(6):2301-13. 206. Peinado MA, Quesada A, Pedrosa JA, Martinez M, Esteban FJ, Del Moral ML, Peinado JM. Light microscopic quantification of morphological changes during aging in neurons and glia of the rat parietal cortex. Anat Rec. 1997 Mar;247(3):420-5. 207. Pelvig DP, Pakkenberg H, Stark AK, Pakkenberg B. Neocortical glial cell numbers in human brains. Neurobiol Aging. 2008 Nov;29(11):1754-62. 208. Peng J, Kim MJ, Cheng D, Duong DM, Gygi SP, Sheng M. Semiquantitative proteomic analysis of rat forebrain postsynaptic density fractions by mass spectrometry. J Biol Chem. 2004 May 14;279(20):21003-11. 209. Phillips GR, Anderson TR, Florens L, Gudas C, Magda G, Yates JR 3rd, Colman DR. Actin-binding proteins in a postsynaptic preparation: Lasp-1 is a component of central nervous system synapses and dendritic spines. J Neurosci Res. 2004 Oct 1;78(1):38-48. 210. Plihal W, Born J. Effects of early and late nocturnal sleep on priming and spatial memory. Psychophysiology. 1999 Sep;36(5):571-82. 211. Poirrier JE, Guillonneau F, Renaut J, Sergeant K, Luxen A, Maquet P, Leprince P. Proteomic changes in rat hippocampus and adrenals following short-term sleep deprivation. Proteome Sci. 2008 May 22;6:14.

74

212. Polo-Parada L, Plattner F, Bose C, Landmesser LT. NCAM 180 acting via a conserved C-terminal domain and MLCK is essential for effective transmission with repetitive stimulation. Neuron. 2005 Jun 16;46(6):917-31 213. Ponte P, Ng SY, Engel J, Gunning P, Kedes L. Evolutionary conservation in the untranslated regions of actin mRNAs: DNA sequence of a human beta-actin cDNA. Nucleic Acids Res. 1984 Feb 10;12(3):1687-96. 214. Pontrello CG, Sun MY, Lin A, Fiacco TA, DeFea KA, Ethell IM. Cofilin under control of β-arrestin-2 in NMDA-dependent dendritic spine plasticity, long-term depression (LTD), and learning. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Feb 14;109(7):E442-51. 215. Przybyla-Zawislak B, Dennis RA, Zakharkin SO, McCammon MT. Genes of succinyl-CoA ligase from Saccharomyces cerevisiae. Eur J Biochem. 1998 Dec 1;258(2):736-43. 216. Rahajeng J, Giridharan SS, Naslavsky N, Caplan S. Collapsin response mediator protein-2 (Crmp2) regulates trafficking by linking endocytic regulatory proteins to dynein motors. J Biol Chem. 2010 Oct 15;285(42):31918-22. 217. Ramesh TP, Kim YD, Kwon MS, Jun CD, Kim SW. Swiprosin-1 Regulates Cytokine Expression of Human Mast Cell Line HMC-1 through Actin Remodeling. Immune Netw. 2009 Dec;9(6):274-84. 218. Ramm P, Smith CT. Rates of cerebral protein synthesis are linked to slow wave sleep in the rat. Physiol Behav. 1990 Nov;48(5):749-53. 219. Rauchs G, Bertran F, Guillery-Girard B, Desgranges B, Kerrouche N, Denise P, Foret J, Eustache F. Consolidation of strictly episodic memories mainly requires rapid eye movement sleep. Sleep. 2004 May 1;27(3):395-401. 220. Rauchs G, Desgranges B, Foret J, Eustache F. The relationships between memory systems and sleep stages. J Sleep Res. 2005 Jun;14(2):123-40. 221. Ravassard P, Pachoud B, Comte JC, Mejia-Perez C, Scoté-Blachon C, Gay N, Claustrat B, Touret M, Luppi PH, Salin PA. Paradoxical (REM) sleep deprivation causes a large and rapidly reversible decrease in long-term potentiation, synaptic transmission, glutamate receptor protein levels, and ERK/MAPK activation in the dorsal hippocampus. Sleep. 2009 Feb;32(2):227-40. 222. Rechtschaffen A, Bergmann BM, Gilliland MA, Bauer K. Effects of method, duration, and sleep stage on rebounds from sleep deprivation in the rat. Sleep. 1999 Feb 1;22(1):11-31. 223. Reiner J, Ye F, Kashikar ND, Datta PK. STRAP regulates c-Jun ubiquitin-mediated proteolysis and cellular proliferation. Biochem Biophys Res Commun. 2011 Apr 8;407(2):372-7. 224. Ren M, Villamarin A, Shih A, Coutavas E, Moore MS, LoCurcio M, Clarke V, Oppenheim JD, D'Eustachio P, Rush MG. Separate domains of the Ran GTPase interact with different factors to regulate nuclear protein import and RNA processing. Mol Cell Biol. 1995 Apr;15(4):2117-24. 225. Ribeiro S, Goyal V, Mello CV, Pavlides C. Brain gene expression during REM sleep depends on prior waking experience. Learn Mem. 1999 Sep-Oct;6(5):500-8. 226. Ribeiro S, Mello CV, Velho T, Gardner TJ, Jarvis ED, Pavlides C. Induction of hippocampal long-term potentiation during waking leads to increased extrahippocampal zif-268 expression during ensuing rapid-eye-movement sleep. J Neurosci. 2002 Dec 15;22(24):10914-23. 75

227. Robinson RC, Turbedsky K, Kaiser DA, Marchand JB, Higgs HN, Choe S, Pollard TD. Crystal structure of Arp2/3 complex. Science. 2001 Nov 23;294(5547):1679-84. 228. Rogalski-Wilk AA, Cohen RS. Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase activity and F-actin associations in synaptosomes and postsynaptic densities of porcine cerebral cortex. Cell Mol Neurobiol. 1997 Feb;17(1):51-70. 229. Rogers JT, Weeber EJ. Reelin and apoE actions on signal transduction, synaptic function and memory formation. Neuron Glia Biol. 2008 Aug;4(3):259-70. 230. Rommelaere H, De Neve M, Neirynck K, Peelaers D, Waterschoot D, Goethals M, Fraeyman N, Vandekerckhove J, Ampe C. Prefoldin recognition motifs in the nonhomologous proteins of the actin and tubulin families. J Biol Chem. 2001 Nov 2;276(44):41023-8. 231. Rubio ME, Wenthold RJ. Calnexin and the immunoglobulin binding protein (BiP) coimmunoprecipitate with AMPA receptors. J Neurochem. 1999 Sep;73(3):942-8. 232. Rudrabhatla P, Albers W, Pant HC. Peptidyl-prolyl isomerase 1 regulates protein phosphatase 2Amediated topographic phosphorylation of neurofilament proteins. J Neurosci. 2009 Nov 25;29(47):14869-80. 233. Rudrabhatla P, Pant HC. Phosphorylation-specific peptidyl-prolyl isomerization of neuronal cytoskeletal proteins by Pin1: implications for therapeutics in neurodegeneration. J Alzheimers Dis. 2010;19(2):389-403. 234. Sakurai M, Sekiguchi M, Zushida K, Yamada K, Nagamine S, Kabuta T, Wada K. Reduction in memory in passive avoidance learning, exploratory behaviour and synaptic plasticity in mice with a spontaneous deletion in the ubiquitin C-terminal hydrolase L1 gene. Eur J Neurosci. 2008 Feb;27(3):691-701. 235. Salnikow K, Kluz T, Costa M. Role of Ca(2+) in the regulation of nickel-inducible Cap43 gene expression. Toxicol Appl Pharmacol. 1999 Oct 15;160(2):127-32. 236. Schevzov G, Bryce NS, Almonte-Baldonado R, Joya J, Lin JJ, Hardeman E, Weinberger R, Gunning P. Specific features of neuronal size and shape are regulated by tropomyosin isoforms. Mol Biol Cell. 2005 Jul;16(7):3425-37. 237. Schwartz ML, Vaccarino F, Chacon M, Yan WL, Ment LR, Stewart WB. Chronic neonatal hypoxia leads to long term decreases in the volume and cell number of the rat cerebral cortex. Semin Perinatol. 2004 Dec;28(6):379-88. 238. Schwarzer C, Barnikol-Watanabe S, Thinnes FP, Hilschmann N. Voltage-dependent anion-selective channel (VDAC) interacts with the dynein light chain Tctex1 and the heat-shock protein PBP74. Int J Biochem Cell Biol. 2002 Sep;34(9):1059-70. 239. Seong HA, Jung H, Choi HS, Kim KT, Ha H. Regulation of transforming growth factor-beta signaling and PDK1 kinase activity by physical interaction between PDK1 and serine-threonine kinase receptorassociated protein. J Biol Chem. 2005 Dec 30;280(52):42897-908. 240. Shafir I, Feng W, Shoshan-Barmataz V. Voltage-dependent anion channel proteins in synaptosomes of the torpedo electric organ: immunolocalization, purification, and characterization. J Bioenerg Biomembr. 1998 Oct;30(5):499-510. 76

241. Shendelman S, Jonason A, Martinat C, Leete T, Abeliovich A. DJ-1 is a redox-dependent molecular chaperone that inhibits alpha-synuclein aggregate formation. PLoS Biol. 2004 Nov;2(11):e362. 242. Sherwood CC, Stimpson CD, Raghanti MA, Wildman DE, Uddin M, Grossman LI, Goodman M, Redmond JC, Bonar CJ, Erwin JM, Hof PR. Evolution of increased glia-neuron ratios in the human frontal cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 2006 Sep 12;103(37):13606-11. 243. Shimizu T, Hayashi Y, Yamasaki R, Yamada J, Zhang J, Ukai K, Koike M, Mine K, von Figura K, Peters C, Saftig P, Fukuda T, Uchiyama Y, Nakanishi H. Proteolytic degradation of glutamate decarboxylase mediates disinhibition of hippocampal CA3 pyramidal cells in cathepsin D-deficient mice. J Neurochem. 2005 Aug;94(3):680-90. 244. Shin DW, Pan Z, Bandyopadhyay A, Bhat MB, Kim DH, Ma J. Ca(2+)-dependent interaction between FKBP12 and calcineurin regulates activity of the Ca(2+) release channel in skeletal muscle. Biophys J. 2002 Nov;83(5):2539-49. 245. Silverman-Gavrila RV, Silverman-Gavrila LB. Septins: new microtubule interacting partners. ScientificWorldJournal. 2008 Jun 13;8:611-20. 246. Simons CT, Staes A, Rommelaere H, Ampe C, Lewis SA, Cowan NJ. Selective contribution of eukaryotic prefoldin subunits to actin and tubulin binding. J Biol Chem. 2004 Feb 6;279(6):4196-203. 247. Singer S, Malz M, Herpel E, Warth A, Bissinger M, Keith M, Muley T, Meister M, Hoffmann H, Penzel R, Gdynia G, Ehemann V, Schnabel PA, Kuner R, Huber P, Schirmacher P, Breuhahn K. Coordinated expression of stathmin family members by far upstream sequence element-binding protein1 increases motility in non-small cell lung cancer. Cancer Res. 2009 Mar 15;69(6):2234-43. 248. Sirota A, Csicsvari J, Buhl D, Buzsáki G. Communication between neocortex and hippocampus during sleep in rodents. Proc Natl Acad Sci U S A. 2003 Feb 18;100(4):2065-9. 249. Smith C, Tenn C, Annett R. Some biochemical and behavioural aspects of the paradoxical sleep window. Can J Psychol. 1991 Jun;45(2):115-24. 250. Sopkova J, Raguenes-Nicol C, Vincent M, Chevalier A, Lewit-Bentley A, Russo-Marie F, Gallay J. Ca(2+) and membrane binding to annexin 3 modulate the structure and dynamics of its N terminus and domain III. Protein Sci. 2002 Jul;11(7):1613-25. 251. Speese SD, Trotta N, Rodesch CK, Aravamudan B, Broadie K. The ubiquitin proteasome system acutely regulates presynaptic protein turnover and synaptic efficacy. Curr Biol. 2003 May 27;13(11):899-910. 252. Stahl B, Tobaben S, Südhof TC. Two distinct domains in hsc70 are essential for the interaction with the synaptic vesicle cysteine string protein. Eur J Cell Biol. 1999 Jun;78(6):375-81. 253. Stephenson SE, Dubach D, Lim CM, Mercer JF, La Fontaine S. A single PDZ domain protein interacts with the Menkes copper ATPase, ATP7A. A new protein implicated in copper homeostasis. J Biol Chem. 2005 Sep 30;280(39):33270-9. 254. Steriade M, Contreras D, Curró Dossi R, Nuñez A. The slow (< 1 Hz) oscillation in reticular thalamic and thalamocortical neurons: scenario of sleep rhythm generation in interacting thalamic and neocortical networks. J Neurosci. 1993 Aug;13(8):3284-99.

77

255. Steriade M, Dossi RC, Nuñez A. Network modulation of a slow intrinsic oscillation of cat thalamocortical neurons implicated in sleep delta waves: cortically induced synchronization and brainstem cholinergic suppression. J Neurosci. 1991 Oct;11(10):3200-17. 256. Steriade M, Timofeev I. Neuronal plasticity in thalamocortical networks during sleep and waking oscillations. Neuron. 2003 Feb 20;37(4):563-76. 257. Sturrock RR. A quantitative histological study of the anterodorsal thalamic nucleus and the lateral mammillary nucleus of ageing mice. J Hirnforsch. 1989;30(2):191-5. 258. Sugden MC, Holness MJ. Recent advances in mechanisms regulating glucose oxidation at the level of the pyruvate dehydrogenase complex by PDKs. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2003 May;284(5):E855-62. 259. Sun MK, Alkon DL. Pharmacological enhancement of synaptic efficacy, spatial learning, and memory through carbonic anhydrase activation in rats. J Pharmacol Exp Ther. 2001 Jun;297(3):961-7. 260. Szego EM, Janáky T, Szabó Z, Csorba A, Kompagne H, Müller G, Lévay G, Simor A, Juhász G, Kékesi KA. A mouse model of anxiety molecularly characterized by altered protein networks in the brain proteome. Eur Neuropsychopharmacol. 2010 Feb;20(2):96-111. 261. Tadavarty R, Kaan TK, Sastry BR. Long-term depression of excitatory synaptic transmission in rat hippocampal CA1 neurons following sleep-deprivation. Exp Neurol. 2009 Mar;216(1):239-42. 262. Tadavarty R, Rajput PS, Wong JM, Kumar U, Sastry BR. Sleep-deprivation induces changes in GABA(B) and mGlu receptor expression and has consequences for synaptic long-term depression. PLoS One. 2011;6(9):e24933. 263. Takahashi K, Yamada M, Ohata H, Honda K, Yamada M. Ndrg2 promotes neurite outgrowth of NGFdifferentiated PC12 cells. Neurosci Lett. 2005 Nov 18;388(3):157-62. 264. Takamori S, Holt M, Stenius K, Lemke EA, Grønborg M, Riedel D, Urlaub H, Schenck S, Brügger B, Ringler P, Müller SA, Rammner B, Gräter F, Hub JS, De Groot BL, Mieskes G, Moriyama Y, Klingauf J, Grubmüller H, Heuser J, Wieland F, Jahn R. Molecular anatomy of a trafficking organelle. Cell. 2006 Nov 17;127(4):831-46. 265. Tani K, Shibata M, Kawase K, Kawashima H, Hatsuzawa K, Nagahama M, Tagaya M. Mapping of functional domains of gamma-SNAP. J Biol Chem. 2003 Apr 11;278(15):13531-8. 266. Taniguchi Y, Choi PJ, Li GW, Chen H, Babu M, Hearn J, Emili A, Xie XS. Quantifying E. coli proteome and transcriptome with single-molecule sensitivity in single cells. Science. 2010 Jul 30;329(5991):533-8. 267. Tedford HW, Kisilevsky AE, Vieira LB, Varela D, Chen L, Zamponi GW. Scanning mutagenesis of the I-II loop of the Cav2.2 calcium channel identifies residues Arginine 376 and Valine 416 as molecular determinants of voltage dependent G protein inhibition. Mol Brain. 2010 Feb 3;3:6. 268. Terashima A, Taniguchi T, Nakai M, Yasuda M, Kawamata T, Tanaka C. Rapamycin and FK506 induce long-term potentiation by pairing stimulation via an intracellular Ca(2+) signaling mechanism in rat hippocampal CA1 neurons. Neuropharmacology. 2000 Jul 24;39(10):1920-8.

78

269. Thyagarajan A, Szaro BG. Dynamic endogenous association of neurofilament mRNAs with Khomology domain ribonucleoproteins in developing cerebral cortex. Brain Res. 2008 Jan 16;1189:3342. 270. Tinguely G, Finelli LA, Landolt HP, Borbély AA, Achermann P. Functional EEG topography in sleep and waking: state-dependent and state-independent features. Neuroimage. 2006 Aug 1;32(1):283-92. 271. Tirumalai RS, Chan KC, Prieto DA, Issaq HJ, Conrads TP, Veenstra TD. Characterization of the low molecular weight human serum proteome. Mol Cell Proteomics. 2003 Oct;2(10):1096-103. 272. Tobaben S, Thakur P, Fernández-Chacón R, Südhof TC, Rettig J, Stahl B. A trimeric protein complex functions as a synaptic chaperone machine. Neuron. 2001 Sep 27;31(6):987-99. 273. Tononi G, Cirelli C. Sleep and synaptic homeostasis: a hypothesis. Brain Res Bull. 2003 Dec 15;62(2):143-50. 274. Tononi G, Cirelli C. Sleep function and synaptic homeostasis. Sleep Med Rev. 2006 Feb;10(1):49-62. Epub 2005 Dec 22. 275. Traina G, Bernardi R, Rizzo M, Calvani M, Durante M, Brunelli M. Acetyl-L-carnitine up-regulates expression of voltage-dependent anion channel in the rat brain. Neurochem Int. 2006 Jun;48(8):673-8. 276. Trinidad JC, Specht CG, Thalhammer A, Schoepfer R, Burlingame AL. Comprehensive identification of phosphorylation sites in postsynaptic density preparations. Mol Cell Proteomics. 2006 May;5(5):91422. 277. Trinidad JC, Thalhammer A, Specht CG, Schoepfer R, Burlingame AL. Phosphorylation state of postsynaptic density proteins. J Neurochem. 2005 Mar;92(6):1306-16. 278. Tu LC, Yan X, Hood L, Lin B. Proteomics analysis of the interactome of N-myc downstream regulated gene 1 and its interactions with the androgen response program in prostate cancer cells. Mol Cell Proteomics. 2007 Apr;6(4):575-88. 279. Ueta H, Nagasawa H, Oyabu-Manabe Y, Toida K, Ishimura K, Hori H. Localization of enolase in synaptic plasma membrane as an alphagamma heterodimer in rat brain. Neurosci Res. 2004 Apr;48(4):379-86. 280. Ulloor J, Datta S. Spatio-temporal activation of cyclic AMP response element-binding protein, activityregulated cytoskeletal-associated protein and brain-derived nerve growth factor: a mechanism for pontine-wave generator activation-dependent two-way active-avoidance memory processing in the rat. J Neurochem. 2005 Oct;95(2):418-28. 281. Upadhya SC, Ding L, Smith TK, Hegde AN. Differential regulation of proteasome activity in the nucleus and the synaptic terminals. Neurochem Int. 2006 Mar;48(4):296-305. 282. Usami Y, Hatano T, Imai S, Kubo S, Sato S, Saiki S, Fujioka Y, Ohba Y, Sato F, Funayama M, Eguchi H, Shiba K, Ariga H, Shen J, Hattori N. DJ-1 associates with synaptic membranes. Neurobiol Dis. 2011 Sep;43(3):651-62. 283. Vainberg IE, Lewis SA, Rommelaere H, Ampe C, Vandekerckhove J, Klein HL, Cowan NJ. Prefoldin, a chaperone that delivers unfolded proteins to cytosolic chaperonin. Cell. 1998 May 29;93(5):863-73.

79

284. Valastro B, Ghribi O, Poirier J, Krzywkowski P, Massicotte G. AMPA receptor regulation and LTP in the hippocampus of young and aged apolipoprotein E-deficient mice. Neurobiol Aging. 2001 JanFeb;22(1):9-15. 285. Van Der Werf YD, Altena E, Schoonheim MM, Sanz-Arigita EJ, Vis JC, De Rijke W, Van Someren EJ. Sleep benefits subsequent hippocampal functioning. Nat Neurosci. 2009 Feb;12(2):122-3. 286. Vecsey CG, Baillie GS, Jaganath D, Havekes R, Daniels A, Wimmer M, Huang T, Brown KM, Li XY, Descalzi G, Kim SS, Chen T, Shang YZ, Zhuo M, Houslay MD, Abel T. Sleep deprivation impairs cAMP signalling in the hippocampus. Nature. 2009 Oct 22;461(7267):1122-5. 287. Volknandt W, Karas M. Proteomic analysis of the presynaptic active zone. Exp Brain Res. 2012 Apr;217(3-4):449-61. 288. Voos W, Röttgers K. Molecular chaperones as essential mediators of mitochondrial biogenesis. Biochim Biophys Acta. 2002 Sep 2;1592(1):51-62. 289. Vyazovskiy V, Borbély AA, Tobler I. Unilateral vibrissae stimulation during waking induces interhemispheric EEG asymmetry during subsequent sleep in the rat. J Sleep Res. 2000 Dec;9(4):36771. 290. Vyazovskiy VV, Olcese U, Hanlon EC, Nir Y, Cirelli C, Tononi G. Local sleep in awake rats. Nature. 2011 Apr 28;472(7344):443-7. 291. Wadhwa R, Taira K, Kaul SC. An Hsp70 family chaperone, mortalin/mthsp70/PBP74/Grp75: what, when, and where? Cell Stress Chaperones. 2002 Jul;7(3):309-16. 292. Walker MP, Stickgold R. Sleep-dependent learning and memory consolidation. Neuron. 2004 Sep 30;44(1):121-33. 293. Walters BJ, Campbell SL, Chen PC, Taylor AP, Schroeder DG, Dobrunz LE, Artavanis-Tsakonas K, Ploegh HL, Wilson JA, Cox GA, Wilson SM. Differential effects of Usp14 and Uch-L1 on the ubiquitin proteasome system and synaptic activity. Mol Cell Neurosci. 2008 Dec;39(4):539-48. 294. Wanamaker CP, Green WN. Endoplasmic reticulum chaperones stabilize nicotinic receptor subunits and regulate receptor assembly. J Biol Chem. 2007 Oct 26;282(43):31113-23. 295. Wang D, Villasante A, Lewis SA, Cowan NJ. The mammalian beta-tubulin repertoire: hematopoietic expression of a novel, heterologous beta-tubulin isotype. J Cell Biol. 1986 Nov;103(5):1903-10. 296. Wang Y, Brittain JM, Wilson SM, Khanna R. Emerging roles of collapsin response mediator proteins (CRMPs) as regulators of voltage-gated calcium channels and synaptic transmission. Commun Integr Biol. 2010 Mar;3(2):172-5. 297. Wang Y, Chandran JS, Cai H, Mattson MP. DJ-1 is essential for long-term depression at hippocampal CA1 synapses. Neuromolecular Med. 2008;10(1):40-5. 298. Waterman-Storer CM, Karki SB, Kuznetsov SA, Tabb JS, Weiss DG, Langford GM, Holzbaur EL. The interaction between cytoplasmic dynein and dynactin is required for fast axonal transport. Proc Natl Acad Sci U S A. 1997 Oct 28;94(22):12180-5. 299. Westmark PR, Westmark CJ, Wang S, Levenson J, O'Riordan KJ, Burger C, Malter JS. Pin1 and PKMzeta sequentially control dendritic protein synthesis. Sci Signal. 2010 Mar 9;3(112):ra18. 80

300. Wilson MA, McNaughton BL. Reactivation of hippocampal ensemble memories during sleep. Science. 1994 Jul 29;265(5172):676-9. 301. Xu CJ, Klunk WE, Kanfer JN, Xiong Q, Miller G, Pettegrew JW. Phosphocreatine-dependent glutamate uptake by synaptic vesicles. A comparison with atp-dependent glutamate uptake. J Biol Chem. 1996 Jun 7;271(23):13435-40. 302. Xue J, Tsang CW, Gai WP, Malladi CS, Trimble WS, Rostas JA, Robinson PJ. Septin 3 (G-septin) is a developmentally regulated phosphoprotein enriched in presynaptic nerve terminals. J Neurochem. 2004 Nov;91(3):579-90. 303. Yamada K, Matsukawa N, Yuasa H, Hattori M, Nakazawa H, Borlongan CV, Ojika K. Differential expression of HCNP-related antigens in hippocampus in senescence-accelerated mice. Brain Res. 2007 Jul 16;1158:169-75. 304. Yang N, Higuchi O, Ohashi K, Nagata K, Wada A, Kangawa K, Nishida E, Mizuno K. Cofilin phosphorylation by LIM-kinase 1 and its role in Rac-mediated actin reorganization. Nature. 1998 Jun 25;393(6687):809-12. 305. Yang SY, He XY, Schulz H. Multiple functions of type 10 17beta-hydroxysteroid dehydrogenase. Trends Endocrinol Metab. 2005 May-Jun;16(4):167-75. 306. Yeap BB, Voon DC, Vivian JP, McCulloch RK, Thomson AM, Giles KM, Czyzyk-Krzeska MF, Furneaux H, Wilce MC, Wilce JA, Leedman PJ. Novel binding of HuR and poly(C)-binding protein to a conserved UC-rich motif within the 3'-untranslated region of the androgen receptor messenger RNA. J Biol Chem. 2002 Jul 26;277(30):27183-92. 307. Yeung K, Seitz T, Li S, Janosch P, McFerran B, Kaiser C, Fee F, Katsanakis KD, Rose DW, Mischak H, Sedivy JM, Kolch W. Suppression of Raf-1 kinase activity and MAP kinase signalling by RKIP. Nature. 1999 Sep 9;401(6749):173-7. 308. Yeung KC, Rose DW, Dhillon AS, Yaros D, Gustafsson M, Chatterjee D, McFerran B, Wyche J, Kolch W, Sedivy JM. Raf kinase inhibitor protein interacts with NF-kappaB-inducing kinase and TAK1 and inhibits NF-kappaB activation. Mol Cell Biol. 2001 Nov;21(21):7207-17. 309. Yoshimura Y, Yamauchi Y, Shinkawa T, Taoka M, Donai H, Takahashi N, Isobe T, Yamauchi T. Molecular constituents of the postsynaptic density fraction revealed by proteomic analysis using multidimensional liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J Neurochem. 2004 Feb;88(3):759-68. 310. Yu Z, Luo H, Fu W, Mattson MP. The endoplasmic reticulum stress-responsive protein GRP78 protects neurons against excitotoxicity and apoptosis: suppression of oxidative stress and stabilization of calcium homeostasis. Exp Neurol. 1999 Feb;155(2):302-14. 311. Yuen EY, Liu W, Kafri T, van Praag H, Yan Z. Regulation of AMPA receptor channels and synaptic plasticity by cofilin phosphatase Slingshot in cortical neurons. J Physiol. 2010 Jul 1;588(Pt 13):236171. 312. Zaheer A, Lim R. In vitro inhibition of MAP kinase (ERK1/ERK2) activity by phosphorylated glia maturation factor (GMF). Biochemistry. 1996 May 21;35(20):6283-8.

81

313. Zeitzer JM, Morales-Villagran A, Maidment NT, Behnke EJ, Ackerson LC, Lopez-Rodriguez F, Fried I, Engel J Jr, Wilson CL. Extracellular adenosine in the human brain during sleep and sleep deprivation: an in vivo microdialysis study. Sleep. 2006 Apr;29(4):455-61. 314. Zhang L, Li YH, Meng K, Han TZ. Increased expression of phospho-cofilin in CA1 and subiculum areas after theta-burst stimulation of Schaffer collateral-commissural fibers in rat hippocampal slices. Chin J Physiol. 2010 Oct 31;53(5):328-36. 315. Zhang S, Zeitzer JM, Sakurai T, Nishino S, Mignot E. Sleep/wake fragmentation disrupts metabolism in a mouse model of narcolepsy. J Physiol. 2007 Jun 1;581(Pt 2):649-63. 316. Zita MM, Marchionni I, Bottos E, Righi M, Del Sal G, Cherubini E, Zacchi P. Post-phosphorylation prolyl isomerisation of gephyrin represents a mechanism to modulate glycine receptors function. EMBO J. 2007 Apr 4;26(7):1761-71.

11. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom Dr. Kékesi Adrienna Katalinnak és Dr. Juhász Gábornak, akik lehetőséget biztosítottak a vizsgálatok elvégzésére, szakmai tanácsaikkal, kritikáikkal pedig mindvégig segítették munkámat. Továbbá köszönet illeti Völgyi Katalint, Baracskay Pétert, Gulyássy Pétert, Dr. Simor Attilát és a Proteomikai Laboratórium többi kiváló munkatársát segítségükért.

82

Az alvásdepriváció hatása a patkány agykérgének és thalamusának fehérjekészletére

Recommend Documents