Az alvadási rendszer fehérjéi
Kappelmayer János DE OEC, KBMPI
Fehérje diagnosztika, Pécs, 2006
1. Az alvadási rendszer fehérjéinek áttekintése 2. Alvadási fehérje abnormalitások 3. Az alvadási rendszer fehérjéinek vizsgálata
Az alvadási rendszer fehérjéivel kapcsolatos kórképek
Thrombocyta funkciós zavarok - thrombocyta túlmûködés - thrombocytopathia - glikoprotein hiány - denz-test hiány - alfa granulum hiány - jelátviteli zavar
A von Willebrand megbetegedés tipizálása Teszt
IIB típus
Thr-vWd
vWf:Ag
±
±
ø
R:Co
±
±
ø
normál
normál
ø
ø
aggregál
aggregál
ø
10-12%
3-5%
0-1%
1-3%
RIPA RIPA-LD Gyakoriság
I típus
IIA típus
± ø 70-80%
III típus
vWf multimerek:
ø
Normál
Coagulopathiák 1./ Alvadási tényezôk,
fibrinolízis inhibitorok hiánya vagy csökkent szintje 2./ Kóros alvadási faktorok, fibrinolízis inhibitorok szintézise 3./ Inhibitorok
Alvadási tényezôk, hiánya vagy csökkent szintje A/ Öröklött B/ Szerzett a. csökkent szintézis (májelégtelenség) b. consumptio C/ Terápiás (thrombolysis)
Öröklésmenet
Prevalencia 1 millió lakosra
Haemophilia A
XR
100
Haemophilia B
XR
20
vonWillebrand bet AD AR
>100 1
XI-es faktor hiány
ritka
AR
Abnormális alvadási faktorok szintézise A/ Congenitalis B/ Szerzett (dysfibrinogenaemia májbetegségekben, K vitamin hiány) C/ Terápiás (syncumar) D/ Iatrogén (cephalosporin)
Inhibitorok A/ Faktor ellenes neutralizáló vagy nem neutralizáló antitestek a. öröklött faktor hiánnyal b. öröklött faktor hiány nélkül B/ Globális inhibitorok (terápiás: heparin)
Az alvadási rendszer fehérjéinek vizsgálómódszerei
A véralvadás szûrôtesztjei Vérzési idô Aktivált parciális tromboplasztin idô (APTI): az intrinsic út vizsgálatára, FXII → fibrin aktivátor, foszfolipid, kalcium Protrombin idô (PI): az extrinsic út vizsgálatára szöveti faktor → fibrin szöveti faktor, kalcium Trombin idô (TI): fibrinogén-fibrin átalakulás, trombin → fibrin
Platelet Function Analyser
GpIIb/IIIa complex Cell count
Patient
Control
Negativ control
M1
M2
M3 M4
Fluorescence intensity
Cell count
Vitronectin receptor
b- KONTROLL TRAP (100/thr)
Control Control + TRAP
a- KONTROLL (100/thr)
Patient Patient + TRAP
Fluorescence intensity
c- BETEG (470/thr) d- BETEG TRAP (720/thr)
Intrinsic út XIIa
PI
XIa Ca2+
Extrinsic út
VIIa VII + Ca2+ TF, Ca2+ TF
IXa Ca2+ VIII PL
APTI
XII XI
IX
Közös út Xa Ca2+ V PL
X
Protrombin
TI
Trombin
Fibrinogén
XIII Ca2+ Fibrin XIIIa Ca2+ Fibrin (keresztkötött)
APTI normál
nincs teendô
megnyúlt igen
citráthiba (1)
az eredmény nem értékelhetô
nem kumarin
PI meghatározás (2)
heparin
TI meghatározás (3)
nem APTI keverék
korrigál (4a)
Faktormeghatározá s FXII, XI, IX, VIII PK, HK
nem korrigál (4b)
lupus antikoaguláns faktor ellenes gátlótest
Coagulopathiák- Speciális vizsgálatok A: Alvadási tényezô hiányának kimutatása:
-Extrinsic-Intrinsic út faktorok aktivitásának meghatározása - alvadási teszt (egyfázisú, kétfázisú) - kromogén teszt -FXIII, Alfa-2 plazmin inhibitor
B: Kóros alvadási faktorok kimutatása:
-Extrinsic-Intrinsic út faktorainak antigén meghat. (immunológiai módszerrel:IRMA, ELISA) -Aktivitás meghatározása, Reptiláz idô
C: Gátlótestek meghatározása
Gátlótestek alvadási faktorok ellen 1. Specifikus alvadási faktorok elleni Ig-k Gyenge- erôs típusú gátlótestek 2. Gyakorisága: FVIII, FIX elleni gátlótest a leggyakoribb (FXI, FXII, FV, FX, FXIII, fibrinogén elleni gátlótest igen ritka 3. Elôfordulás: Haemophilia, autoimmun betegségek, gyógyszerek (INH, Streptomycin)
FVIII elleni gátlótest FVIII:C ellen (vWF-ra nem hat) Kialakulása: Haemophiliás betegek Post partum RA, SLE Malignitás Gyenge-erôs típus Mennyiségét Bethesda-egységben fejezzük ki.
Bethesda egység meghatározás 1. A betegplazmából hígítások készítése. 2. A betegplazma hígításainak kontroll plazmával történô 1:1 arányú keverékeinek készítése. 3. A kontroll plazma és a keverékek 2 h- 37°C inkubálása. 4. FVIII aktivitás meghatározása. 5. Reziduális FVIII aktivitás megadása. 6. 1 BE az aktivitása annak a gátlótest mennyiségnek, ami a keverék FVIII aktivitását 50%-ra csökkenti.
TI
normál
megnyúlt
nincs teendô
polibrénes TI(1)
normál
heparin
megnyúlt TI keverék + RI (2)
korrigál
alacsony fibrinogén vagy dysfibrinogenemia
nem korrigál
fibrinogén/fibrin degradációs termék
Haemophilia A Thrombocyta szám
N
Vérzési idô
N
FVIII
vonWillebrand betegség N
N,
vWF-Ag
N
RIPA
N
,
Alvadási faktor meghatározás egyfázisú alvadási teszttel Ismeretlen Faktor aktivitású minta
Hiányplazma: a vizsgált Faktort nem, de minden Más faktort feleslegben tartalmaz
PI: extrinsic út faktorai APTI: intrinsic út faktorai Alvadási idôt standard plazmával nyert kalibrációról leolvasni
Faktor meghatározás kromogén teszttel I.
Direkt teszt (kallikrein, Xa, XIa, trombin) aktiválás mérendô inaktív faktor aktivált faktor aktivált faktor R-pNA R-COOH + pNA II. Indirekt teszt (XIIa→kallikrein, IXa →Xa VIIa →Xa, VIIIa →Xa) TF FVIIa FVII FVIIa+Ca FX FXa FXa R-pNA R-COOH + pNA
Faktor meghatározás kromogén teszttel Kromogén szubsztrátok: olyan szintetikus rövid peptidek (általában 3-4 tagú), melyeket az alvadási faktorok (proteolitikus enzimek) elhasítanak és ez a reakció színképzôdéshez vezet. A peptidek specifikusak a vizsgálni kivánt alvadási faktorra, a természetes szubsztrátot utánozzák. A színképzôdés arányos az enzim aktivitásával. Ile-Glu-Gly-Arg-pNA FXa
A FXa protrombin hasítási helyét utánozza.
Faktor meghatározás kromogén teszttel I.
Direkt teszt: Faktor X meghatározás kromogén szubsztrát: Arg-Gly-Arg-pNA reakció: FX
Arg-Gly-Arg-pNA+ H2O
RVV, Ca2+ FXa
FXa Arg-Gly-Arg-OH+ pNA
Fotometrálás 405 nm-en A FX aktivitás leolvasása kalibrációs görbe alapján
Faktor meghatározás kromogén teszttel II. Indirekt teszt: FVIII meghatározás kromogén szubsztrát: Arg-Gly-Arg-pNA reakció: FIXa, Ca2+, PL FX
FXa
FVIII Arg-Gly-Arg-pNA+H2O
FXa
Arg-Gly-Arg-OH+pNA
Fotometrálás 405 nm-en A FVIII aktivitás leolvasása kalibrációs görbe alapján
Kromogén teszttel végzett alvadási faktor meghatározás Elônyei: 1. Nagyobb pontosság 2. Általában nem igényel hiányplazmát, ilyenkor olcsóbb Hátránya: Hemolízis, lipémia zavar, ilyenkor minta vakot kell készíteni. A direkt teszt kóros faktor jelenlétére nem elég érzékeny.
