Az allergiás légúti gyulladás súlyosságát és kezelhetőségét befolyásoló tényezők Doktori értekezés
Dr. Komlósi Zsolt István Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Losonczy György egyetemi tanár, az orvostudományok doktora
Hivatalos bírálók: Dr. Geiszt Miklós egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Helyes Zsuzsanna egyetemi adjunktus, Ph.D.
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Cserháti Endre egyetemi tanár, az orvostudományok doktora
Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Gálffy Gabriella egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Herjavecz Irén egyetemi magántanár, kandidátus
Budapest 2007
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK .............................................................................................................. 3 1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS...................................................................................... 6 1.1. AZ ASTHMA EPIDEMIOLÓGIÁJA ................................................................... 6 1.2. AZ ASTHMA PATOMECHANIZMUSA.......................................................... 11 1.2.1. Légúti gyulladás.......................................................................................... 11 1.2.2. Gyulladás és hiperreaktivitás .................................................................... 12 1.2.3. Gyulladásos sejtek ...................................................................................... 12 1.2.3.1. Hízósejtek .............................................................................................. 12 1.2.3.2. Macrophagok ........................................................................................ 14 1.2.3.3. Dendritikus sejtek ................................................................................. 14 1.2.3.4. Eosinophil granulocyták ...................................................................... 16 1.2.3.5. Neutrophil granulocyták ...................................................................... 17 1.2.3.6. T-lymphocyták ...................................................................................... 17 1.2.3.7. B-lymphocyták ...................................................................................... 20 1.2.3.8. Basophil granulocyták.......................................................................... 20 1.2.3.9. Vérlemezkék (thrombocyták)................................................................ 21 1.2.3.10. A légutak strukturális sejtjei............................................................... 21 1.2.4. Gyulladásos mediátorok ............................................................................ 21 1.2.4.1. Lipid mediátorok................................................................................... 22 1.2.4.2. Cytokinek .............................................................................................. 23 1.2.4.3. Kemokinek ............................................................................................ 26 1.2.4.4. Nitrogén-monoxid................................................................................. 27 1.2.5. A természetes (veleszületett) immunitás szerepe ..................................... 30 1.2.5.1. Az Lps .................................................................................................... 32 1.3. A TERHESSÉG IMMUNOLÓGIÁJA................................................................ 34 1.3.1. Terhesség és asthma ................................................................................... 36 2. KUTATÁSI EREDMÉNYEK ................................................................................. 38 2.1. ÁLLATKÍSÉRLTES VIZSGÁLATOK.............................................................. 38 2.1.1. Bevezetés és célkitűzések............................................................................ 38 2.1.1.1. Célkitűzések .......................................................................................... 39 2.1.2. Módszerek ................................................................................................... 39 2.1.2.1. Állatok ................................................................................................... 39 2.1.2.2. Allergizálás............................................................................................ 40 2.1.2.3. Lps kezelés és előkezelés (priming) ...................................................... 41 2.1.2.4. Szteroid kezelés ..................................................................................... 41 2.1.2.5. 1400W kezelés ....................................................................................... 41 2.1.2.6. Tüdőellenállás (RL) mérése .................................................................. 42 2.1.2.7. Bronchoalveolaris lavage (BAL).......................................................... 43 2.1.2.8. Szövettan ............................................................................................... 44 2.1.2.9. Nitrát és nitrit mérések ......................................................................... 44 2.1.2.10. Cytokin mérések.................................................................................. 46 2.1.2.11. Kísérleti terv ........................................................................................ 48 2.1.2.12. Statisztika ............................................................................................ 49 2.1.3. Eredmények ................................................................................................ 50 2.1.3.1. Légúti gyulladás.................................................................................... 50 2.1.3.2. Nitrát és nitrit........................................................................................ 52
1
2.1.3.3. Cytokinek .............................................................................................. 53 2.1.3.4. Légúti reaktivitás .................................................................................. 54 2.1.3.5. A dexamethason hatásai....................................................................... 54 2.1.3.6. Az 1400W hatásai ................................................................................. 56 2.1.4. Megbeszélés és következtetések................................................................. 56 2.2. HUMÁN VIZSGÁLATOK................................................................................. 59 2.2.1. Bevezetés és célkitűzések............................................................................ 59 2.2.1.1. Célkitűzések .......................................................................................... 60 2.2.2. Módszerek ................................................................................................... 61 2.2.2.1. Vizsgálati alanyok................................................................................. 61 2.2.2.2. A lymphocyták cytokintermelésének meghatározása .......................... 63 2.2.2.3. Statisztika .............................................................................................. 63 2.2.3. Eredmények ................................................................................................ 64 2.2.3.1. Általános eredmények........................................................................... 64 2.2.3.2. Lymphocyta szubpopulációk ................................................................ 65 2.2.3.3. Összefüggések a lymphocyta szubpopulációk, légzésfunkciós paraméterek és a magzatok születési súlya között ............................................ 67 2.2.4. Megbeszélés és következtetések................................................................. 69 3. ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................. 73 4. SUMMARY............................................................................................................... 74 5. IRODALOMJEGYZÉK .......................................................................................... 75 6. KÖZLEMÉNYEK .................................................................................................. 106 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS.................................................................................... 107
2
RÖVIDÍTÉSEK 1400W
N-(3-(Aminometil) benzil) acetamidin, szelektív iNOS bénító
ACAAI
American College of Allergy, Asthma and Immunology
ACOG
American College of Obstetricians and Gynecologists
ANOVA
varianciaanalízis
ATS
American Thoracic Society
BAL
bronchoalveolaris lavage
BALF
bronchoalveolaris lavage folyadék
BS
belső standard
BSA
szarvasmarha szérumalbumin
CD
cluster of differentiation
COPD
krónikus obstruktív tüdőbetegség
COX
cikloxigenáz
CpG
nem-metilált citozin-guanozin motívumokat tartalmazó oligonukleotidok
CysLT
ciszteinil-leukotrién
Dex
dexamethason
dsRNS
kettősszálú RNS
ECP
eosinophil kationos protein
EGF
epidermális növekedési faktor
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
EMTU
epithelialis mesenchymalis trofikus egység
eNOS
endothelialis nitrogén-monoxid szintetáz, NOS3
EP
eosinophil peroxidáz
ERS
European Respiratory Society
FACS
áramlási cytometria
FcεRI
nagy affinitású IgE receptor
FcεRII
alacsony affinitású IgE receptor
FCS
foetalis borjú szérum
FENO
a kilégzett nitrogén-monoxid frakcionális koncentrációja
FEV1
forszírozott kilégzési másodperctérfogat
FGF
fibroblast növekedési faktor
Fitc
fluoreszcens isotiocianát
GINA
Global Initiative for Asthma
3
GM-CSF
granulocyta-macrophag kolóniastimuláló faktort
GSNO
S-nitrozo-glutation
HEPA
nagy hatékonyságú részecskeszűrő
Hgmm
higanymilliméter
ICAM-1
intercellularis sejtadhéziós molekula-1
IFN-γ
interferon-γ
IgE
Immunglobulin E
IGF-1
inzulin-szerű növekedési faktor
IL
interleukin
iNOS
indukálható nitrogén-monoxid szintetáz, NOS2
ip.
intraperitonealis
ITP
izotachoforézis
iv.
intravénás
LBP
lipopoliszacharid-kötő fehérje
LFA-1
leukocyta funkcionális antigén-1
LHR
légúti hiperreaktivitás
Lps
lipopoliszacharid
LT
leukotrién
Lx
lipoxin
MBP
major bázikus protein
MCh
methacholin, acetil-β metilkolin klorid
MCP-1
monocyta kemotaktikus protein-1
MCP-4
macrophag kemotaktikus protein-4
MD-2
lymphocyta antigén 96
MDC
monocyta eredetű kemokin
MHC
fő hisztokompatibilitási komplex
MIP-2
macrophag inflammációs protein-2
NADPH
nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát
NK-sejt
természetes ölő (natural killer) sejt
NKT-sejt
természetes ölő (natural killer) T-sejtek
nNOS
neuronalis nitrogén-monoxid szintetáz, NOS1
NO
nitrogén-monoxid
NOS
nitrogén-monoxid szintetáz
Ova
ovalbumin
PAF
vérlemezke-aktiváló faktor
4
PAMP
patogénekhez kötött molekuláris mintázatok
PBS
fiziológiás foszfát-puffer
PDGF
vérlemezke eredetű növekedési faktor
Pe
phycoerythrein
PEF
kilégzési csúcsáramlás
PerCP
peridinin-klorofill-protein complex
PG
prosztaglandinok
pO2
oxigén parciális nyomás
pCO2
szén-dioxid parciális nyomás
PRR
mintázatfelismerő receptor
RANTES
regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted
Raw
légúti ellenállás
RL
tüdőellenállás
ROS
reaktív oxigén-származékok
RSV
respiratory syncytial vírus
sCD14
szolubilis CD14
SEM
átlag szórása (standard error of the mean)
SNO
S-nitroso-thiolok
SPF
meghatározott patogénektől mentes
sc.
szubkután
TGF-β
transzformáló növekedési faktor-β
Th1
1. típusú T-helper sejtek
Th2
2. típusú T-helper sejtek
TLR
Toll-like receptor
TNF-α
tumor nekrózis faktor-α
Treg
regulációs T-sejt
Tx
tromboxán
VCAM-1
vascularis sejtadhéziós molekula-1
VEGF
vascularis endothelialis növekedési faktor
VLA-4
very late antigén-4
vs.
versus
5
1. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 1.1. AZ ASTHMA EPIDEMIOLÓGIÁJA Nicholas J. Gross találó megállapítása szerint: „az asthma olyan, mint a szerelem – mindenki tudja, hogy mi az, de mégsem tudja senki definiálni” [1]. Bár az asthma klinikai diagnózisa általában nem ütközik különösebb nehézségekbe, az epidemiológiai vizsgálatok
korrekt
elvégzéséhez
szükséges
egységes
definíció
nem
áll
rendelkezésünkre [2]. Egy általánosan elfogadott meghatározás szerint: „Az asthma a légutak krónikus gyulladásos betegsége. A gyulladás következtében visszatérően lépnek fel sípoló légzéssel, dyspnoeval, mellkasi feszüléssel, köhögéssel járó epizódok, főként éjszaka és kora reggel. A tünetek kiterjedt, változó mértékű légúti áramlási nehezítettséggel kapcsolatosak, ami spontán, vagy gyógyszeres kezelés hatására rendszerint reverzibilis. A kórképet különböző stimulusokkal szemben fennálló fokozott bronchialis reaktivitás jellemzi” [3]. Az asthma egyik fő jellemzője tehát a spontán, vagy gyógyszer (β2-mimetikum) hatására reverzibilis obstruktív ventilációs zavar. A diagnózis felállítása az anamnézis, a fizikális és légzésfunkciós vizsgálat, az obstrukció reverzibilitásának vizsgálata (pharmacodynamiás próba) és más diagnózisok lehetőség szerinti kizárása útján történik. Kérdéses esetekben a légúti hiperreaktivitás (LHR) kimutatása megerősíti a kórismét. Ugyanakkor ma már egyértelműen bizonyított, hogy az asthma hátterében a légutak gyulladásos elváltozása, károsodása áll. A legtöbb alkalmazott diagnosztikai eljárás nem ad felvilágosítást a gyulladás természetéről és súlyossági fokáról. A légúti gyulladás és az LHR pedig nem mutat olyan szoros korrelációt [4], mint korábban feltételezték [5]. A légutakban zajló folyamatokba bronchofiberoszkópos vizsgálattal, biopszia és bronchoalveolaris lavage (BAL) végzésével – invazív módon, – valamint az indukált köpet és a kilégzett levegő kondenzátum analízisével, illetve a kilégzett nitrogén-monoxid (NO) meghatározásával – noninvazív módon – is valódi betekintést nyerhetünk. Azonban míg az invazív vizsgálat fokozott kockázattal jár, az utóbb felsorolt – noninvazív – módszerek rutinszerű alkalmazása egyelőre széles körben (hazánkban) nem terjedt el. Ugyanakkor a legtöbb szakértő az asthmát egyre inkább egy szindrómának tekinti: számos különböző légútkárosító folyamat (pl.: respiratory syncytial vírus – RSV – fertőzés) és
6
inhalatív ágens (allergének, izocianát, dízel-üzemanyag égéstermék, stb.) a tüdőben hasonló, vagy részben hasonló patológiás elváltozások kialakulásához és ezzel párhuzamosan Következésképp
nehézlégzéshez, a
széles
diffúz
körben
légúti
alkalmazott
obstrukcióhoz
vezethet
[6].
diagnosztikus
eljárások
(pl.:
légzésfunkciós vizsgálat) egyrészt nem eléggé specifikusak (pl.: krónikus obstruktív tüdőbetegségben hasonló eltérések vannak), másrészt nem is eléggé szenzitívek (pl.: gyermekkori „kinőtt” asthmások tünetmentes, szubklinikai légúti gyulladása esetében [7]) a betegség incidenciájának és prevalenciájának pontos meghatározásához. Mindezek a tények és lokális egészségpolitikai tényezők (pl.: hazánkban a gyógyszertámogatási rendszer) befolyásolhatják, torzíthatják az epidemiológiai adatokat. Számos, különböző populációkon végzett és változatos módszereket alkalmazó (kérdőíves, vagy orvosi vizsgálaton alapuló) tanulmány mutatta ki [8;9], hogy a fejlett ipari országokban az asthma incidenciája és prevalenciája jelentősen emelkedett az elmúlt 20 évben. Ez a tendencia valószínűleg csak részben magyarázható az egészségügyi ellátó rendszer és a diagnosztikus eljárások fejlődésével valamint a társadalom egészségtudatának változásával. Míg a prevalencia-növekedés egyes országokban, az utóbbi években lelassulni látszik [10-12], máshol továbbra is megfigyelhető [13;14]. Összességében jelenleg az asthmás betegek kezelése az egészségügyi kiadások jelentős hányadát emészti fel, továbbá az akut asthma exacerbatiók szignifikánsan hozzájárulnak a morbiditási és hospitalizációs adatok alakulásához mind hazánkban, mind az „asthma epidémia” által érintett más országokban. Az asthma- és allergia-kutatás kétségkívül legnagyobb kérdése, hogy mi állhat a betegség rendkívüli gyakoriság-növekedésének a hátterében, továbbá mi az oka annak, hogy főként a fejlett, úgynevezett „nyugati típusú” társadalmak érintettek? Genetikai vizsgálatok kimutatták, hogy az asthma kialakulásával szembeni fogékonyság örökölhető. Ha egyik szülő sem allergiás, akkor az allergiás betegség előfordulási gyakorisága gyermekeikben csak 11-13%, míg ha mindkét szülő érintett, akkor ez 5070%-ra nő [15]. Egypetéjű ikrekben az asthma konkordanciája 26-75% között van [1517], tehát a betegség együttes előfordulásának valószínűsége meglehetősen tág tartományban mozog. Ez felveti, hogy a genetikai prediszpozíción túl nagy jelentősége lehet a környezeti hatásoknak is. Az asthma öröklésmenete nem követi a Mendeltörvényeket, genetikai asszociációs vizsgálatokban eddig több mint 500 gént hoztak
7
összefüggésbe az allergiás hajlammal, valamint az asthma iránti fogékonysággal [18]. Mivel azonban a vizsgált emberi populációkban a mutációs ráta alacsony, a genom jelentős mértékű megváltozása nem állhat a betegség gyakoriság-növekedésének hátterében. Mindez szintén arra utal, hogy bizonyos környezeti hatások, melyek a „nyugati típusú életformával” együtt jelentkeznek, döntően befolyásolják az (inhalatív) antigénekre – potenciális allergénekre – adott immunválasz irányát (Th1-Th2-Treg, lásd még az 1.2.3.3. és 1.2.3.6. fejezeteket), illetve időbeli lefolyását. Számos környezeti és életvezetéssel kapcsolatos tényező szerepét vizsgálták az allergiás betegségekkel és az asthmával kapcsolatban: bizonyos allergének (pl.: házipor-atka, parlagfű) [19;20], környezetszennyező
anyagok
(pl.:
dízel-üzemanyag
égéstermékek)
fokozott
expozícióját [21]; táplálkozási szokások megváltozását (pl.: kevés probiotikum fogyasztását) [22]; túlzott antibiotikum-használatot [23] mind összefüggésbe hozták a kórkép megnövekedett gyakoriságával. A témában főként keresztmetszeti (crosssectional) epidemiológiai vizsgálatokat végeztek, amelyek nem teszik lehetővé a folyamatok időbeliségének megítélését. Bár a felsorolt tényezőknek mind hajlamosító szerepe lehet, az eddigi vizsgálatok alapján egyértelműen egyikük sem tehetők felelőssé az asthma kialakulásáért. Ugyanakkor az elmúlt másfél évtized asthma-kutatását uraló egyik elmélet – a higiéné-hipotézis – szerint az allergiás betegségek gyakoribbá válásáért részben a korai életévekben elszenvedett fertőzések számának és gyakoriságának, valamint bizonyos mikroorganizmusok által termelt anyagok (pl.: lipopoliszacharid – Lps) expozíciójának a csökkenése lehet felelős (lásd még az 1.2.5. fejezetben) [24]. Először 1989-ben írták le, hogy az idősebb testvérek száma és a szénanátha kialakulási valószínűsége között fordított arányosság figyelhető meg [25]. Ennek hátterében az újszülött- vagy kisgyermekkorban a testvérektől, vagy a prenatalisan a gyermekei
által
megfertőzött
anyától
akvirált
fertőzések
protektív
szerepe
valószínűsíthető. Számos további vizsgálatban erősítették meg, hogy a korai baktérium és vírusfertőzések kiállása [26], valamint a krónikus féregfertőzés [27] véd az asthmás fenotípus
kialakulásától,
vélhetően
az
immunrendszer
fejlődésének
előnyös
befolyásolása révén. Kimutatták, hogy a fejlődő országok elmaradott régióinak lakosai, valamint az alacsony jövedelmű családokban, illetve farmgazdaságokban élők (a fejlett országokban is) egyformán nagy baktérium-expozíciónak vannak kitéve, és ez a
8
környezet csökkenti az allergiás megbetegedések kockázatát. A fertőzések védő hatása csak gyermekkorban igazolt. Ugyanakkor a természet-közeli életmód, az állatok közvetlen közelsége (farmokon) nagy mennyiségű nem kórokozó, talajban élő (szaprofita) baktérium kontaktusával jár együtt. Ebben a környezetben, a porban jelen lévő baktériumok többsége inaktív állapotban van, továbbá hatalmas tömegben megtalálhatók az elhalt baktériumokból származó (Lps, peptidoglikánok, nem-metilált citozin-guanozin – CpG – motívumokat tartalmazó oligonukleotidok, stb.) és gombákból származó (pl.: β-glukánok) egyéb bioaktív vegyületek, az úgynevezett patogénekhez kötött molekuláris mintázatok (PAMP – pathogen associated molecular patterns). A PAMP elnevezés – ebben az esetben – nem teljesen helyénvaló, mivel a nem-kórokozó baktériumok is hordoznak ilyen molekuláris mintázatokat (pl.: Lps-t). A teljes bakteriális expozíció mértéke tehát messze meghaladja a kórokozók mennyiségét. Ugyanakkor a veleszületett (természetes) immunrendszer a betegséget nem okozó mikrobákat, illetve azok egyes molekuláris elemeit szintén felismeri, ami az adaptív immunválaszt – bizonyos esetekben – regulációs T-sejt (Treg) proliferáció és tolerancia irányába tolhatja el (lásd később a 1.2.3.3. fejezetben) [28;29]. Kimutatták továbbá, hogy ez a protektív környezet felnőttekben is kifejti hatását [30]. Mindezek alapján feltételezik, hogy a védőoltások és antibiotikum terápia következtében ritkábbá váló (vagy kevésbé súlyos lefolyású) infekciók, a kis mértékű helmint átfertőzöttség, valamint
a
csökkent
környezeti
mikroba-expozíció
(alacsony
csíraszám)
az
immunrendszer szabályozási zavarát okozza [31], ami az allergiás betegségek előretörését eredményezheti. Másrészről viszont bizonyos kora-gyermekkori vírusinfekcióknak (pl.: RSV) oki szerepet tulajdonítanak az asthma kialakulásában [32]. Arra hajlamos gyermekekben, RSV bronchiolitis esetén, és azt követően időről-időre fulladásos rohamok jelentkeznek. Ez az úgynevezett „ismételten fulladó” fenotípus később asthma kialakulásához vezethet [33;34]. Mind gyermekkori, mind felnőttkori asthmában szerepet játszhatnak légúti vírus (Rhinovirus, RSV) [35] és baktérium-fertőzések (Chlamydia, Mycoplasma) [36;37] az asthma exacerbatiók kialakulásában. A környezeti tényezők közül a legszorosabb kapcsolatot az asthma kialakulásával [38;39] és exacerbatiójával [40] összefüggésben az aktív vagy passzív dohányzás esetében találtak. Mivel a dohányfüst jelentős mennyiségben tartalmaz Lps-t [41], így más összetevői mellett részben ez is
9
szerepet játszhat hatásában. Egy másik vizsgálat kimutatta, hogy asthmával vagy más allergiás betegségekkel szemben örökletesen fogékony (0-1 éves) gyermekek esetében az otthoni (házipor) Lps expozíció független rizikófaktora bármilyen (esetenként ismétlődő) nehézlégzésnek [42]. Már kialakult asthmában a betegség súlyossági foka egyenesen arányos a házipor Lps-tartalmával [43]. Mindezek alapján úgy tűnik, hogy – bár számos érv szól mellette – a higiéné-hipotézis mégis csak bizonyos korlátok között lehet érvényes. Az asthmás fenotípust a genetikai fogékonyság és a környezeti hatások interakciója alakítja ki, és az infekcióknak, illetve egyes bakteriális termékeknek (pl.: Lps) szerepük lehet a betegség bizonyos (esetleg terápia-rezisztens) formáinak létrehozásában (lásd később a 1.2.5.1. fejezetben). Terhesség során szintén megváltozhat az asthma súlyossági foka, és a betegség gyakorisága – a teljes populáció prevalenciaértékeihez hasonlóan – a várandós asszonyok körében is nő. A fejlett országokban a terhes nők körülbelül 3-12%-a asthmás [44], és mintegy harmadukban a tünetek súlyosbodását figyelték meg a terhesség alatt [45]. Egy multicentrikus vizsgálatban kimutatták [46], hogy az orvosi beavatkozást igénylő exacerbatiók a terhes asthmások 20%-ában alakultak ki – jellemzően a második trimeszter végén – és mintegy 5,8 (2,4-8,2 interkvartilis tartomány) százalékukban vált szükségessé kórházi kezelés [47]. A szülés utáni 3 hónapban viszont az esetek 73%-ában visszatér a betegség a terhesség előtti súlyossági fokra és az egymást követő terhességek során szintén konkordancia figyelhető meg az asthma kórlefolyása tekintetében [45]. Ugyanakkor az asthma és a terhesség egymásra gyakorolt negatív hatása valószínűleg kölcsönös, mivel – több ezer alanyt magába foglaló, népesség-alapú vizsgálatok alapján – még az enyhe és középsúlyos asthma is növeli a magzati növekedési retardáció, a koraszülés, a praeeclampsia és más szülészeti szövődmények előfordulási gyakoriságát [48;49]. Az akut súlyos asthma fellépése ugyanakkor mind az anya, mind a magzat életét veszélyezteti. Bár az asthma súlyosbodása terhesség alatt részben szokványos okok (vírusinfekció, inhalációs szteroid nem megfelelő használata) miatt következik be [47], mégis valószínűsíthető, hogy ebben a folyamatban a terhesség és az asthma immunológiai kölcsönhatása is szerepet játszhat. A szteroid-használattól független okok szerepére utal, hogy az asthmás panaszok miatti orvosi vizitek száma azokban a nőkben is megnőtt terhesség alatt, akik korábban soha nem szedtek inhalációs szteroidokat [50].
10
1.2. AZ ASTHMA PATOMECHANIZMUSA Az asthmás betegek szervezetében zajló komplex kórélettani folyamatok ismertetése messze meghaladja az értekezés kereteit. Jelen dolgozat csak a témához szorosabban kötődő, újabb keletű közlemények rövid ismertetését tartalmazza.
1.2.1. Légúti gyulladás Az asthma bronchiale legfontosabb jellegzetessége a légúti gyulladás. Mind az akut súlyos asthmában elhunytak, mind a balesetben meghalt (enyhe vagy középsúlyos) asthmások tüdejének vizsgálata kimutatta, hogy a betegségre a klinikai súlyossági foknak megfelelő mértékű légúti gyulladás jellemző. A légúti epithel részleges lehámlása, a bronchusfal ödémás duzzanata, a fokozott mucus-elválasztás és perivascularis
valamint
peribronchialis
–
főként
lymphocyták
és
eosinophil
granulocyták alkotta – gyulladásos infiltratio minden esetben megfigyelhető [51]. Bronchofiberoszkópos vizsgálat során a gyulladásra utaló vöröses nyálkahártyaduzzanat szintén gyakran látható és a biopsziás mintákban valamint a BAL folyadékban (BALF) emelkedett számban találhatók hízósejtek, eosinophil (és neutrophil) granulocyták valamint lymphocyták. Az így nyerhető alveolaris macrophagok és hízósejtek bizonyíthatóan aktivált állapotban vannak [52;53]. Ez a sajátos, sejtimmunológiai tekintetben parazita és féregfertőzések által kiváltott immunaktivációra emlékeztető gyulladásos állapot enyhe asthmában is fennáll, sőt olyan tünetmentes egyedekben is megfigyelhető, akiknek anamnézisében gyermekkori asthma szerepel [7]. Allergiás („extrinsic”) asthmában a folyamat hátterében egy vagy több antigén (allergén) hatására kialakuló, specifikus Immunglobulin E (IgE) termelődéséhez kötött, túlzott mértékű immunaktiváció áll, amely exogén (pl.: folyamatos allergénexpozíció) és/vagy endogén stimulusok következtében krónikus légúti gyulladás formájában perzisztál. A folyamat krónikussá válásában szerepet játszó tényezők jelenleg kevéssé ismertek. A betegek egy kisebb csoportját képező úgynevezett „intrinsic” asthmások betegsége rendszerint idősebb korban jelentkezik és többnyire súlyosabb lefolyású, de a tüneteik lényegében azonosak [54]. Esetükben nem bizonyítható a szisztémás IgE hiperprodukció, illetve a bőrteszt pozitivitás, ugyanakkor viszont az extrinsic formához
11
hasonló elváltozások hátterében baktérium vagy vírusfertőzések hatására fellépő fokozott lokális IgE képződés valószínűsíthető [55]. Mindkét betegcsoportban megfigyelhető időnként heveny állapotromlás, exacerbatio, melynek oka például a kezelés elégtelensége, allergének és egyéb ágensek – pl.: Lps, dohányfüst, por – fokozott expozíciója, illetve vírus (pl.: RSV) vagy baktérium (pl.: Chlamydia) fertőzés lehet.
1.2.2. Gyulladás és hiperreaktivitás A bronchusok krónikus eosinophilsejtes gyulladása és az asthma tünetei közötti összefüggés nem minden részletében feltárt. A gyulladás önmagában felelős lehet a köhögés, mellkasi szorító érzés kialakulásáért, továbbá szerepet játszik a hörgőrendszer simaizomzatának specifikus (allergén) és különböző aspecifikus provokáló anyagok (pl.: methacholin, hisztamin, hiperozmotikus oldatok, desztillált víz) hatására fellépő fokozott mértékű spazmusa, azaz az LHR kiváltásában is. Ez utóbbi az asthma definíció szerinti tünete, és a különböző stimulusok légúti szűkületet okozó hatásának fokozódása révén, a bronchushám gyulladásos duzzanatával és a fokozott nyákszekrécióval együtt (Herxheimer-triász) hozzájárul az obstrukció kialakulásához. Ugyanakkor kimutatták, hogy asthmásokban a légúti gyulladás és az LHR között nincs szoros korreláció [4]. Valószínűleg a gyulladásos infiltratio, illetve a fokozott légúti válaszkészség nem egyszerű ok-okozati kapcsolatban van, hanem részben egymástól független kórélettani mechanizmusok vezethetnek e két elváltozás kialakulásához [56].
1.2.3. Gyulladásos sejtek Az asthma kórélettani folyamataiban számos különböző típusú sejt vesz részt. A pontos patogenetikai funkciójuk többnyire még nem minden részletében tisztázott, de bizonyos sejttípusok kulcsfontosságú szerepe már bizonyítást nyert. 1.2.3.1. Hízósejtek Mind atópiás, mind nem-atópiás és foglalkozási asthmában a hízósejtek krónikus aktivációja és felfokozott szekréciós tevékenysége, degranulációja figyelhető meg. A
12
hízósejtek gyulladáskeltő (interleukin-4 – IL-4, IL-5, IL-13) és profibrotikus cytokinek (transzformáló növekedési faktor-β – TGF-β, fibroblast növekedési faktor – FGF), továbbá gyulladásos mediátorok (hisztamin, ProsztaglandinD2, LeukotriénC4) és szerinproteázok (triptáz, kimáz) termelése révén vesznek részt a kórfolyamatban [57]. Asthmásokban a hízósejtek elsősorban a légúti simaizom-sejtkötegek között szaporodnak fel, és számuk jól korrelál az LHR súlyosságával [58] és szteroidkezelés hatására csökken [59]. A légúti simaizomzatot jellemzően sem lymphocyták, sem eosinophilek nem infiltrálják asthmában, továbbá ezen sejttípusok csak gyengén képesek simaizom-sejtekhez kötődni. A hízósejtek viszont kapcsolódnak a simaizomsejtekkel [60] és az általuk termelt anyagok (TGF-β, FGF, kimáz) révén hozzájárulnak a remodeling, azaz a simaizomzat hipertrófia és hiperplázia, valamint egyes fibrotikus elváltozások
(pl.:
bazálmembrán-megvastagodás)
kialakulásához.
Ugyanakkor
bronchoconstrictor hatású mediátorokat is elválasztanak (pl.: triptáz, IL-4, IL-13, hisztamin, PGD2, LTC4). A hízósejtek tehát elsődlegesen allergén vagy egyéb indirekt stimulusok (pl.: fizikai terhelés és hiperventiláció okozta ozmotikus és hőmérsékletváltozások, köd) hatására kialakuló akut bronchusgörcs létrehozásában vesznek részt. A légúti epithelben fellelhető hízósejtek pedig a kehelysejt-metaplázia és a fokozott nyákszekréció kialakításában játszanak szerepet [57]. Mindezek révén hozzájárulnak a légúti obstrukció kialakulásához. A hízósejtek az 1. típusú (azonnali) túlérzékenységi reakcióban IgE-függő módon aktiválódnak. Ennek feltétele, hogy az immunrendszer az allergénnel szemben – az első expozíció alkalmával – specifikus IgE típusú ellenanyagokat képezzen (atópia). Az antitestek a hízósejteken expresszált nagy affinitású FcεRI-hez kötődnek, így az allergén ismételt expozíciója (allergén-IgE keresztkötés) a sejtek gyors aktiválódását és degranulációját eredményezi. Egyes elképzelések szerint azonban a hízósejteknek a kórfolyamat korábbi fázisában, a 2. típusú T-helper (Th2) sejtek dominanciájának kialakításában (IL-4 cytokinmiliő létrehozásában) is szerepe lehet [57]. Ezen korai aktiválódás elsődleges oka nem ismert, de a felszínükön kifejeződő Toll-like receptorok (TLR) felvetik a veleszületett immunitás szerepét is ebben a folyamatban [61-63]. A krónikus légúti gyulladás fenntartásában feltehetően szintén részt vesznek a hízósejtek cytokintermelésük (IL-4, IL-13) révén. Korábban, hisztidin-dekarboxiláz génkiütött (knock-out) egereken végzett kísérleteinkben kimutattuk, hogy a hisztaminszintézisért felelős enzim hiánya az
13
allergiás asthma modelljében csökkenti az eosinophil gyulladás, az LHR valamint a hisztopatológiai eltérések súlyosságát és az allergénspecifikus IgE szintézisét is [64]. 1.2.3.2. Macrophagok A vérben keringő monocytákból képződő macrophagok a felszínükön található alacsony affinitású IgE receptoron (FcεRII) keresztül aktiválódhatnak allergének hatására. A légutakban található alveolaris macrophagok szerepet játszhatnak az immunválasz irányának meghatározásában, mivel az őket ért stimulusoktól függően különböző mediátorokat képesek elválasztani, hozzájárulva ezzel a cytokinmiliő kialakításához. Fiziológiás körülmények között, IL-10 termelése révén gátolják az effektor
lymphocyták
működését
(tolerogén
hatás),
de
megfigyelték,
hogy
asthmásokban, allergén expozíciót követően ez jelentősen csökken [65;66]. A macrophagok IL-12 szintézise szintén mérséklődik asthmában, ami a Th2-irányú immundeviáció kialakulásának egyik eleme lehet [67]. Az alveolaris macrophagok antigénprezentáló képessége kisebb, mint például a peritonealis macrophagoké [68]. Ezt a funkciót a tüdőben nagyobb részt a dendritikus sejtek töltik be. 1.2.3.3. Dendritikus sejtek A dendritikus sejtek olyan specializált, macrophag-szerű sejtek, amelyek professzionális antigénprezentáló sejtekké differenciálódtak [69]. A dendritikus sejtek hálózatot képeznek a légúti epithelben, folyamatosan felveszik és feldolgozzák a belélegzett környezeti antigéneket, majd a mediastinalis nyirokcsomókba vándorolva prezentálják azokat a naív T-sejteknek. Az elvándorolt dendritikus sejtek folyamatosan pótlódnak a vérben keringő monocytákból [70]. A belélegzett veszélytelen antigénekre fiziológiásan a szervezet immuntoleranciával válaszol (lásd a 1.2.3.6. fejezetben is) [71]. Ez alapvetően kétféle módon valósulhat meg: A természetes immunitást stimuláló ágensek hiányában a dendritikus sejtek nem aktiválódnak (alacsony marad a fő hisztokompatibilitási komplex – MHC – és a kostimulációs molekulák expressziója) és nem jön létre T-sejtes immunválasz, tehát anergia alakul ki [72]. Amennyiben viszont a dendritikus sejtek aktiválódnak, de az antigén feldolgozását és prezentációját nem kísérik veszélyt jelző, úgynevezett „danger”-szignálok (lásd később ebben a fejezetben) [73], az immunválasz során IL-10 termelő Treg sejtek proliferálódnak [71]. Mindez – a
14
gyulladásos környezetben kialakuló immunválaszhoz hasonlóan – lymphocyták felszaporodásával
járó,
antigénspecifikus
aktív
immunfolyamat,
melyben
a
plasmocytoid dendritikus sejtek játszanak fontos szerepet. Azonban a Treg aktiváció és proliferáció nem eredményez az adott antigén eliminációjára irányuló immunkaszkád folyamatot, hanem fokozott IL-10 termelés mellett tolerancia alakul ki. Infekció vagy allergén expozíció esetén a dendritikus sejtek aktivációja, migrációja és ezzel együtt az antigénprezentáció felgyorsul [74], melyben főként a myeloid dendritikus sejtek vesznek részt. A fertőzést – és valószínűleg az allergiás szenzitizációt is – „danger”szignálok kísérik, amelyek fokozzák a dendritikus sejtek MHC II és a kostimulációs molekulák expresszióját valamint cytokin termelését, és a nyirokcsomókban effektor Tsejt proliferációt eredményeznek. Az adaptív immunválasz, azaz a CD4+ T-helper és CD8+ T-killer sejtek felszaporodása fertőzésekben, illetve - ezzel analóg módon - az allergénspecifikus Th2 sejtszaporulat tehát csak abban az esetben jön létre, ha az antigén (allergén) expozíciójával egy időben a szervezet számára veszélyt jelző ágensek kötődnek a dendritikus sejtek megfelelő receptoraihoz (danger-szignál). Például a mintázatfelismerő receptorokhoz (PRR – pattern recognizing receptor) kötődő PAMPok is betölthetik ezt a funkciót [73]. Fontos megjegyezni azonban, hogy egyes PAMPok nem sorolhatók a „danger”-szignál kategóriába, mivel hatásukra Treg proliferáció és immuntolerancia alakul ki (lásd korábban az 1.1. fejezetben) [28;29]. Másrészről viszont a T-sejt – dendritikus sejt kölcsönhatást a PRR-ek endogén ligandjai szintén szabályozzák. A természetes immunitás szerepét a kórfolyamatban további vizsgálatok erősítik meg: állatkísérletekben kimutatták, hogy Lps (esetleg más PRR-ligand?) jelenléte nélkülözhetetlen az allergiás szenzitizációhoz az asthma ovalbuminnal (Ova) létrehozott modelljében [75;76]. A dendritikus sejtek ily módon kulcsfontosságú szerepet
játszanak
az
allergiás
immunfolyamat
kialakulásában:
felveszik
és
feldolgozzák az allergént, majd a regionális nyirokcsomókba vándorolva kapcsolatba lépnek a naiv T-lymphocytákkal. Az antigénprezentáció során a természetes immunstimulusok jelenléte és minősége, a kostimulációs szignálok, a dendritikus sejt típusa és a helyi cytokinmiliő együttesen határozzák meg az immunválasz irányát, a Tlymphocyták további differenciálódását 1. típusú T-helper sejt (Th1) vagy Th2 illetve Treg irányba. A cytokinek szerepe vélhetően döntő fontosságú (lásd később a 1.2.3.6. fejezetben). Az alveolaris epithelsejtek és macrophagok nagy mennyiségben képesek
15
granulocyta-macrophag kolóniastimuláló faktort (GM-CSF) termelni, amely elősegíti az éretlen dendritikus sejtek myeloid dendritikus sejtté fejlődését, és ily módon az antigénprezentáció során a lymphocyták differenciálódását Th2-es irányba tolja el [77]. Állatkísérletekben kimutatták hogy a myeloid dendritikus sejtek nélkülözhetetlenek a Th2-es immunválasz és az eosinophil gyulladás kialakulásához. 1.2.3.4. Eosinophil granulocyták Az eosinophil infiltratio az allergiás gyulladás fő jellemzője. Az asthma úgy is tekinthető, mint egy fajta „krónikus eosinophil bronchitis” [78]. Az allergén inhalációját követő késői allergiás válasz során a BALF eosinophil sejtszáma lényegesen megnő, és a tüdőben kialakul a jellegzetes peribronchialis és perivascularis eosinophil beszűrődés. Az eosinophil sejtek számos mediátort – például major bázikus proteint (MBP), eosinophil kationos proteint (ECP), eosinophil peroxidázt (EP) – termelnek, melyek hozzájárulnak az asthmában jellegzetes légúti epithelialis károsodás létrehozásához és a gyulladás súlyosbításához [79]. Az MBP interferálhat az NO szintézisével (gátolja az Larginin-felvételt), továbbá az EP révén reaktív oxigénből származó szabadgyökök is felszabadulnak. Mindez arra utal, hogy az eosinophil sejtek közreműködnek az LHR kiváltásában is (lásd később az 1.2.4.4. fejezetben) [80;81]. A csontvelői prekurzor sejtekből differenciálódó eosinophil granulocytákat számos mechanizmus vonzza a légutakba [82]. A késői allergiás válasz során a tüdőben bekövetkező lokális eosinophil sejtszám-emelkedés a perifériás vérben ugyanezen sejtpopuláció csökkenésével, továbbá eosinophil progenitorok megjelenésével jár együtt [83]. A fokozott eosinophilképződés szignálja a gyulladt légutakból származik. Az eosinophil sejtek toborzásának főbb lépései: adhézió a légúti erek vascularis endotheliumán, migráció a submucosába és aktiváció. A sejtek kitapadását elősegíti, hogy az eosinophilek felszínén bizonyos adhéziós molekulák jelennek meg: az integrinek (pl.: leukocyta funkcionális antigén-1 – LFA-1) a vascularis endothel sejtek felszínén expresszálódó intercellularis sejtadhéziós molekula-1-gyel (ICAM-1) létesítenek kapcsolatot [84;85], míg a very late antigen-4 (VLA-4) a vascularis sejtadhéziós molekula-1-gyel (VCAM1) kapcsolódik [86]. Az IL-4 képes az endothelsejtek VCAM-1 expressziójának fokozására [87]. Az eosinophil sejtek aktiválódásához és túléléséhez bizonyos növekedési és érési faktorok jelenléte szintén szükséges. Az allergiás gyulladás során
16
főként a GM-CSF és az IL-5 tölti be ezt a szerepet [88], ugyanis hiányukban az eosinophilek apoptosis (programozott sejthalál) -készsége fokozott [89]. Az eosinophil sejtek vándorlását a keringésből a légutak falába és a bronchoalveolaris térbe számos kemotaktikus hatású anyag termelődése szintén előmozdítja. Ilyen kemokinek pl.: a RANTES (regulated on activation, normal T-cell expressed and secreted), az eotaxin 13, és a macrophag kemotaktikus protein-4 (MCP-4) [90]. 1.2.3.5. Neutrophil granulocyták Habár enyhe és középsúlyos asthmások légutaiban az eosinophil és nem a neutrophil granulocyták dominálnak, súlyos asthmások indukált köpetében mégis jelentős számban fellelhetők a neutrophil sejtek [91;92]. Akut súlyos asthmában elhunytak légutaiban szintén nagy mennyiségű neutrophil található [93]. Mindez részben a neutrophil sejtek jellegzetes, rendkívül gyors migrációs kinetikájával [94] és a szteroid kezelés neutrophil granulocyták apoptosisát gátló hatásával [89;95] lehet megmagyarázható. Ugyanakkor súlyos asthmások köpetében emelkedett IL-8 koncentráció mérhető [92], ami a neutrophilek aktív toborzására utal ezekben a betegekben. Ily módon valószínűsíthető, hogy a neutrophil granulocyták szerepet játszanak az akut exacerbatiók kialakulásában, és – egyes megfigyelések szerint – jelenlétük együtt jár a szteroid-válaszkészség csökkenésével is. Ezen betegek esetében az akut exacerbatiók hátterében nem csak tisztán allergiás immunmechanizmusok állhatnak. 1.2.3.6. T-lymphocyták Asthmában a kórfolyamat beindításában és a betegség fenntartásában egyaránt fontos szerepe van a 2. típusú T-helper sejteknek (Th2). Egészségesekben a tüdőben található leukocyták csak kis része lymphocyta. Asthmában viszont a légutakban nagy mennyiségben jelennek meg Th2 sejtek [96] amelyek aktivációs markereket expresszálnak. A prominens Th2-es cytokinek (IL-4, IL-5, IL-13) fehérje és mRNS koncentrációja a BALF-ban, a BAL sejtekben és a bronchusbiopsziás mintákban megemelkedett [96;97], továbbá a lavage CD4+ sejtjeiben a GATA-3 transzkripciós faktor nagymértékben expresszálódik, míg a t-bet mRNS kimutathatatlan [98]. Mindezek alapján egyértelmű hogy a betegséget Th2 dominancia jellemzi.
17
Transzgenikus és génkiütött állatokon végzett kísérletekben bizonyították, hogy a Th2es cytokinek hozzájárulnak az asthmás fenotípus kialakításához. A krónikus Th2 sejt aktiváció – mesterségesen előidézett Th2 túlsúly t-bet -/- állatokban – önmagában elegendő az asthmában tapasztalható légúti gyulladás, LHR és szövettani elváltozások létrejöttéhez [99]. Egérben a Th1 és Th2 sejtek az általuk termelt cytokinek révén kölcsönösen képesek egymás differenciálódását és működését gátolni [100]. Részben ez a felismerés alapozta meg azt az elméletet, mely szerint a Th1/Th2 egyensúly Th2 irányú eltolódása vezetne az allergiás betegségek kialakulásához. Az úgynevezett higiéné-hipotézis
a
betegségcsoport
prevalenciájának
jelentős
növekedését
a
gyermekkori Th1 stimulusok (fertőzések) csökkenésével magyarázta. A gyermekkori bakteriális kontaktus és fertőzések protektív szerepe mellett számos bizonyíték szól (lásd korábban az 1.1. fejezetben), de hátterében a környezeti ágensek, a természetes immunitás és T-sejt érés bonyolult interakciója nem pedig egyszerű Th1/Th2 arányeltolódás áll. Számos vizsgálatban kimutatták, hogy a Th1-es sejtek és az általuk termelt cytokinek (interferon-γ – IFN-γ, IL-12) képesek meggátolni a Th2-es sejtek által koordinált eosinophil gyulladás, fokozott nyáktermelődés és LHR kifejlődését állatmodellekben [101;102]. Ugyanakkor más kísérletekben a már kialakult allergiás gyulladást és LHR-t a Th1-es sejtek súlyosbították [103-105]. A légúti vírusfertőzések az asthma exacerbatiójának gyakori okai, és valószínűleg hozzájárulnak a kórkép manifesztációjához is, pedig hatásukra főleg IFN-γ-termelő CD4+ és CD8+ T-sejtek aktiválódnak. A Th1-es sejtek specifikus antigén hiányában is képesek Th2 lymphocytákat toborozni a gyulladás helyére [106] ami az egyik magyarázata lehet annak, hogy milyen módon súlyosbíthatják a Th1 sejtek az allergiás gyulladást. Ezzel összhangban a Th1 lymphocyták fellelhetők a légutakban és IFN-γ mérhető a lavageban már az allergiás szenzitizáció valószínű bekövetkezésekor gyermekkorban [107], továbbá a felnőtt asthmásokban is [108] (különösen az exacerbatiók alatt). A Th1/Th2 egyensúly elmélet további hiányossága, hogy nem ad magyarázatot az alábbi jelenségekre: 1. A Th2 túlsúlyú gyulladást okozó féregfertőzések nem okoznak asthma exacerbatiót, hanem ellenkezőleg, inkább védenek a betegség kialakulásával szemben [109].
18
2. Epidemiológiai adatok alapján, a 60-as évektől kezdődően nem csak az allergiás betegségek prevalenciája nő, hanem ezzel párhuzamosan Th1 aktivációhoz kötött (auto-) immunbetegségek, mint az I. típusú diabetes, a szklerózis multiplex vagy a Crohn-betegség esetében is hasonló tendencia figyelhető meg [110;111]. A higiéné-hipotézis elméleti alapját képező másik feltételezés, mely szerint az intrauterin Th2 dominancia következtében születéskor az immunválasz „alapbeállítása” Th2-es irányú, szintén nem állja meg a helyét (lásd még az 1.3. fejezetben). Mindezek alapján valószínű, hogy a felsorolt betegségek előretörésében az immunrendszer olyan szabályozási zavara állhat, mely érinti a T-sejt differenciáció és az immuntolerancia folyamatát. Az antigén prezentáló sejtek és a naiv T-sejtek kölcsönhatása meghatározza a további differenciálódás irányát. Allergiás immunfolyamatok során a myeloid dendritikus sejtek által kifejezett egyes kostimulációs molekulák (B7-2) és a helyi cytokinmiliő (IL-4) a Th2-es lymphocytafenotípus megjelenését eredményezik. Ezen sejteket legjobban az általuk termelt cytokinek sajátos mintázata jellemzi: főként az IL4-et, IL-5-öt, IL-9-et és IL-13-at [112] választanak el, amelyek mind részt vesznek az asthma kórfolyamatában (lásd még az 1.2.4.2. fejezetben). A légutakba kerülő idegen fehérjék (antigének) azonban fiziológiásan nem indukálnak gyulladásos választ. A nyálkahártya-felszín a környezetben található nem toxikus ágensek (potenciális allergének) folyamatos expozíciójának van kitéve, rendszerint ezek az antigének mégsem váltanak ki immunválaszt. Ennek oka egyrészt az, hogy a légúti hám nyákbevonata valamint az epithelsejtek közötti szoros sejtkapcsolat (tight-junction) gátolja az immunrendszer és az antigének találkozását (barrier funkció), másrészt viszont aktív mechanizmusok is akadályozzák a specifikus immunválasz kialakulását. Állatkísérletekben kimutatták, hogy a belélegzett antigének csökkentik a naiv T-sejtek válaszkészségét, és a helyi nyirokcsomók közreműködésével egy szisztémásan is ható részben antigén-specifikus, részben aspecifikus tolerogén hatás figyelhető meg az expozíciót követően [112;113]. A belélegzett antigének fiziológiás körülmények között képesek specifikus T-sejt anergia kiváltására, továbbá elősegítik a Treg sejtek differenciálódását. Ebben a folyamatban az antigénprezentáló sejteknek kitüntetett szerepe van. A mucosa dendritikus sejtjeinek felszínén – egyéb immunstimulusok hiányában (lásd később az 1.2.5. fejezetben) – alacsony az MHC II és a kostimulációs molekulák expressziója, továbbá IL-10-et is termelnek [71], ami elősegíti a T-sejt
19
anergia kialakulását, továbbá IL-10 és TGF-β termelő Treg sejtek felszaporodását. Az IL-10 csökkenti az MHC II és a CD80 expresszióját a dendritikus sejteken [114]. Mindezek
a
mechanizmusok
együttesen
(egymást
erősítve)
vezetnek
az
immuntolerancia kifejlődéséhez [115]. Allergiás asthmásokban azonban a belélegzett ártalmatlan antigének (allergének) specifikus Th2-típusú immunválaszt váltanak ki. A Th2 irányú polarizáció a myeloid dendritikus sejtek révén jön létre IL-4 és IL-13 gazdag cytokinkörnyezetben. Ezen cytokinek elsődleges forrása jelenleg nem ismert, de a hízósejtek [57], és az natural killer T-sejtek (NKT) is képesek a termelésére [116], ily módon szerepet játszhatnak a Th2 fenotípus létrejöttének korai szakaszában. Később, a már kialakult krónikus betegségben a Th2 sejtek maguk a fő cytokintermelők. A számos, eddig feltárt genetikai prediszponáló tényezőn (polimorfizmuson) kívül a természetes (veleszületett) immunitás bizonyos stimuláló ágensei (pl.: Lps) szintén fontos szerepet játszhatnak a kórfolyamatban. Az antigénprezentáló sejtek (pl.: dendritikus sejtek) felszínén expresszálódnak PRR-ek a természetes immunrendszer fontos elemei. Endogén és exogén ligandjaik (pl.: a PAMP-ok) meghatározó szerepet töltenek be a T-sejt differenciáció folyamatában, ily módon befolyásolhatják az allergiás asthma kialakulását és kórlefolyását (lásd még a 1.2.5. és 1.3. fejezetekben). 1.2.3.7. B-lymphocyták Allergiás kórállapotokban a B sejtek izotípusváltása következik be, melynek nyomán IgE termelő plazmasejtekké differenciálódnak. Ezt az átalakulást részben az IL4 idézi elő. Egyes újabb eredmények arra utalnak, hogy az IgE szisztémásan, illetve lokálisan fellépő túlprodukciója extrinsic, illetve intrinsic asthmában egyaránt kulcsfontosságú eleme a patomechanizmusnak [54]. 1.2.3.8. Basophil granulocyták Asthmás betegek légutaiban kissé emelkedett számban találhatók basophilok, és ez tovább nő allergén inhaláció után, továbbá az indukált köpetben is megjelennek ezek a sejtek [117]. Ugyanakkor mennyiségük sokkal kevesebb, mint az eosinophil granulocytáké, és pontos funkciójuk sem ismert. Számos vizsgálati eredmény utal arra, hogy
a
hízósejtekéhez
részben
hasonló
patomechanizmusában.
20
szerepet
töltenek
be
az
asthma
1.2.3.9. Vérlemezkék (thrombocyták) Egyes bizonyítékok arra utalnak, hogy a thrombocytáknak is szerepe lehet az asthma kórfolyamatában. A Th2-es gyulladás során felszabaduló kemokinek képesek a thrombocyták aktiválódását és aggregációját kiváltani [118], és az aktivált thrombocyták pedig RANTES-t termelnek [119]. Asthmások bronchusbiopsziás mintáiban emelkedett thrombocytaszám figyelhető meg [120], és allergénprovokáció hatására jelentősen esik a keringő thrombocyták száma [121], valószínűleg a tüdőbe irányuló migrációjuk következtében. 1.2.3.10. A légutak strukturális sejtjei A hám- és endothelsejtek, fibroblastok, valamint a simaizom-sejtek, tehát légutakat alkotó szövetek – epithelialis mesenchymalis trofikus egység (EMTU) – sejtjei mind képesek különbféle proinflammatorikus anyagok termelésére. A strukturális sejtek, a krónikus kórfolyamat során bizonyos mediátorok fő forrásaivá válhatnak, mivel számuk még súlyos gyulladás esetén is messze meghaladja az inflammatorikus sejtek mennyiségét. Az alábbi okok miatt különösen az epithelsejtek kulcsfontosságú szerepe valószínűsíthető: 1. elsőként találkoznak az inhalatív környezeti ágensekkel (allergénekkel), 2. sérülésük és lehámlásuk az asthma patológiájának elsődleges jelensége, 3. gyulladáskeltő, kemotaktikus és profibrotikus hatású anyagok (lipid mediátorok, eotaxin, RANTES, MCP-4, IL-6, IL-8, IL-11, IL-16, TARC – thymus and activation regulated chemokine), növekedési faktorok (GM-CSF, PDGF, EGF, FGF, IGF-1, VEGF) széles spektrumát képesek elválasztani [122;123], 4. inhalációs kortikoszteroidok hatásának elsődleges célsejtjei.
1.2.4. Gyulladásos mediátorok Asthmás betegek tüdejében megfigyelhető patológiás elváltozások és az ehhez társuló funkcionális eltérések kialakulását számos különböző mediátorral hozták összefüggésbe. Ezen anyagok, és az általuk kiváltott hatások rendkívül szerteágazó sokfélesége és redundanciája jellemző, ezért egy-egy ágens tényleges, mással nem pótolható szerepe a kórfolyamatban ritkán határozható meg. Következésképp egyetlen mediátor bizonyos hatásának vagy szintézisének (farmakológiai) gátlása többnyire nem
21
eredményez jelentős változást asthmásokban. Ugyanakkor a sejtek és mediátorok képezte bonyolult hálózatban centrális helyet elfoglaló anyagok blokkolásával (pl.: CysLT1 receptor antagonista, anti-IgE antitesttel) sokszor látványosabb hatás érhető el, bár ez sem feltétlenül jelent szignifikáns javulást a betegek állapotában (pl.: anti-IL-5 antitest esetében – lásd a 1.2.4.2. fejezetben). A nagyszámú, részben párhuzamos és átfedő interakciós útvonal jelenlétének másik fontos következménye, hogy az asthma kezelésének legfontosabb, csaknem szuverén gyógyszerei a glükokortiko-szteroidok, amelyek széles spektrumú hatást fejtenek ki számos gyulladásos mechanizmus egyidejű blokkolásával. Az alábbiakban néhány – önkényesen választott – mediátor hatásait ismertetem, melyek vélhetően fontos szerepet töltenek be a kórfolyamatban. 1.2.4.1. Lipid mediátorok A gyulladt légutakban inflammatorikus és strukturális sejtekben egyaránt zajlik ezen anyagok szintézise, aktiválódhat az úgynevezett „arachidonsav kaszkád” valamely reakció-útvonala. A membránlipidekből foszfolipáz A2 révén arachidonsav képződik, ami szubsztrátja az 5-lipoxigenáz, 15-lipoxigenáz és a cikloxigenáz (COX) enzimeknek. Az 5-lipoxigenáz a leukotriének (LT) képzésében vesz részt, ezen belül asthmában a ciszteinil-leukotriéneknek (CysLT) – LTC4, LTD4 és LTE4 – van jelentőségük, mivel erős bronchoconstrictorok fokozzák az LHR-t [124] és enyhe gyulladáskeltő hatásuk is van (növelik az eosinophil sejtszámot az indukált köpetben [125]). Mindezt jelentősen csökkentik a CysLT1 receptor antagonista hatású gyógyszerek,
melyek
hosszú
távon
javítják
a
légzésfunkciót.
Ugyanakkor
gyulladáscsökkentő hatásuk gyengébb, mint az inhalációs szteroidoknak [126]. Ebből a megfontolásból a CysLT1 receptor antagonisták alkalmazása csak kiegészítő kezelésként kerül szóba, kifejezetten azokban az esetekben, amikor jó terápiás válaszra számítunk.
Például
egyes
megfigyelések
szerint
terhelés-indukált
asthmában
hatékonyabbnak bizonyultak ezek a gyógyszerek [127]. Az aszpirin szenzitív asthma (lásd később ebben a fejezetben) fokozott ciszteinil-leukotrién szintézissel jár együtt [128], ezért CysLT1 receptor antagonisták szintén hatékonyak. Arachidonsavból a 15-lipoxigenáz enzim révén lipoxinok (Lx) képződnek, melyek főként antiinflammatorikus hatású mediátorok (LxA4, 15-epi-Lx) és ciszteinil-
22
leukotrién antagonista funkciót töltenek be [129]. Ezen anyagok csökkent termelődése figyelhető meg aszpirin szenzitív asthmásokban, ami hozzájárulhat a súlyos gyulladás fenntartásához. A prosztaglandinok (PG) és a tromboxánok (Tx) szintézise arachidonsavból COX enzimek működése révén valósul meg. A COX-1 konstitutív, míg a COX-2 indukálható izoforma. Az utóbbi indukciója gyulladásos mediátorok hatására következik be és expressziója megnő az asthmás légutakban [130]. A PGD2 egy erős bronchoconstrictor, amelyet főként a hízósejtek termelnek. Állatkísérletben kimutatták, hogy a receptorának hiánya jelentősen csökkenti az allergén által kiváltott gyulladásos választ és az LHR-t [131]. Kimutatták továbbá, hogy a PGD2 aktivál egy kemotaktikus receptort – a Th2-es sejtek kemoattraktáns receptorát (CRTH2) – amely megtalálható még az eosinophil és basophil sejteken is [132]. Mindez újabb kapcsolatot jelent a hízósejt-aktiválódás és az allergiás gyulladásos infiltratio kialakulása között. A PGF2α szintén
bronchoconstrictor
hatású
prosztanoid.
Mindazonáltal
a
COX-bénító
gyógyszereknek (aszpirin, ibuprofen) nincs semmilyen terápiás hatása asthmásokban, ami részben megkérdőjelezi ezen mechanizmusok jelentőségét. Másrészről viszont a PGE2 kulcsfontosságú gyulladáscsökkentő mediátor, amely csökkenti a hisztamin felszabadulását a hízósejtekből és mérsékelni képes a ciszteinil-leukotriének szintézisét (úgynevezett PGE2-fék mechanizmus). Kimutatták, hogy a COX-1-en is ható (nem COX-2 szelektív) inhibitorok egyes asthmásokban súlyos rohamot tudnak kiváltani. Valószínűleg ezen aszpirin szenzitív asthmás betegek esetében az PGE2 szintézisének csökkenése egyúttal a ciszteinil-leukotriének túlprodukcióját eredményezi. Egyes eredmények arra utalnak, hogy a vérlemezke-aktiváló faktor (PAF) is szerepet játszhat az asthma bizonyos formáinak patomechanizmusában, bár hatékony antagonistája (modipafant) nem javítja a tüneteket [133]. 1.2.4.2. Cytokinek A cytokinek általában 80 kD-nál kisebb, többségükben glikozilált extracelluláris jelátvivő fehérjék. Szerepet játszanak az immunválasz irányának (Th1-Th2-Treg) meghatározásában, a gyulladásos sejtes infiltratio kialakításában valamint a krónikus gyulladás fenntartásában [134]. Bizonyos körülmények között csaknem mindegyik sejttípus képes cytokinek elválasztására: asthmában az immunsejtek, illetve a
23
strukturális sejtek közül az endothel, a légúti epithel és simaizom-sejtek termelnek jelentős mennyiségű cytokint, részt vállalva ezzel a krónikus gyulladás kialakításában, szabályozásában és fenntartásában. Néhány cytokin esetében számos kutatási eredmény utal arra, hogy kitüntetett szerepet töltenek be az asthma patomechanizmusában. Ezek többsége úgynevezett lymphokin, mivel főként lymphocyták vesznek részt a szintézisükben: Az IL-3 pluripotens haemopoeticus növekedési faktor, melynek mRNS expressziója jelentősen fokozott az asthmás betegekből nyert BALF sejtekben és biopsziás mintákban. Fő forrása az aktivált T-helper sejt. Fontos szerepet tölt be a hízósejtek szöveti túlélésében, az eosinophil infiltratio kialakulásában, ugyanakkor jelentős hatása van más myeloid sejtek (macrophag, neutrophil) differenciálódására és migrációjára is. A GM-CSF fokozza a neutrophil granulocyták IL-3 válaszkészségét. Az IL-4 talán az egyik legfontosabb cytokin allergiás betegségekben és asthmában. A gyulladt légutakban számos sejttípus: basophil és eosinophil granulocyták, hízósejtek és egyes lymphocyta altípusok (NKT-sejtek) termelik, de fő forrása valószínűleg a Th2-es lymphocyta. Ugyanakkor viszont az IL-4 egyik legfontosabb funkciója, hogy jelenlétében a naiv Th0 lymphocytákból az antigénbemutatás és a kostimulációs szignálok hatására Th2-es sejtek differenciálódnak [135]. Ez a jelenség valószínűleg a betegség kialakulásának egyik első, kulcsfontosságú lépése. Bár az előrehaladott, krónikus asthmában az IL-4 nagy mennyiségben van jelen (mivel sok sejt termeli), az allergiás gyulladás kialakulásának korai fázisában kérdéses, hogy milyen forrásból származik ez a cytokin. A korai allergiás válaszban fontos szerepet játszó hízósejtek képesek IL-4 termelésére [57]. Egy nemrég megjelent közlemény szerint a BALF-ból nyerhető lymphocyták jelentős hányada (mintegy 60%a) NKT-sejt [116] amely szintén választ el IL-4-et, így ezek a sejttípusok is funkcionálhatnak elsődleges IL-4 forrásként. Egy újabb közlemény azonban nem erősítette meg az NKT-sejtek ilyen mértékű dominanciájára vonatkozó mérési eredményeket [136]. Az IL-4 másik fontos szerepe (az IL-13-mal együtt), hogy aktiválja a B-lymphocytákat és izotípusváltást indukál, melynek hatására a B-sejtek IgE-termelő plazmasejtekké differenciálódnak. Az IL-4 fokozza az endothelsejteken a VCAM-1 expresszióját [137] és transzgén egereken végzett megfigyelések szerint szerepe lehet az asthmában jellegzetesen fokozott mucinszekréció (és MC5AC
24
génexpresszió) valamint a kehelysejt-metaplázia kialakulásában is [138]. Szintén állatkísérletes eredmények mutatják, hogy IL-4 hiányában – génkiütött egerekben – nem hozható létre az allergiás gyulladás és LHR hagyományos (Ova) modellje. Ezekben az állatokban nem termelődik allergénspecifikus IgE, nem infiltrálják Th2-sejtek a légutakat és nem alakul ki sem eosinophil gyulladás sem LHR [139]. Mindez jól mutatja ezen cytokin alapvető szerepét a kórfolyamat korai fázisában. Másrészről viszont ugyanezen modell létrehozásának egy előrehaladottabb szakaszában – a már érzékenyített állatok allergén (Ova) inhalációi alatt – hatástalan az IL-4-et neutralizáló antitest [140]. Az IL-4 gátolja a macrophagokban az IFN-γ és az IL-12 szintézisét, amivel hozzájárul a Th1 irányú differenciálódás gátlásához [100]. Összefoglalva tehát az IL-4 nélkülözhetetlen mind a Th2 dominancia kialakulásában, mind a fokozott IgE termelés megindításában, ezért alapvető jelentősége van az asthma kifejlődésének korai szakaszában. Az eosinophilia létrehozásában valószínűleg az IL-5 a legfontosabb mediátor. Leginkább a Th2-es lymphocyták termelik, de kimutatható hízósejtekben [141] és magukban az eosinophilekben is [142]. Asthmásokból nyert BALF jelentős mennyiségben tartalmazza, és koncentrációja tovább nő allergénprovokáció után, vagy akut súlyos asthmában [143]. Az IL-5 receptora csak az eosinophil sejteken és egyes magasan differenciált prekurzorsejtjeiken expresszálódik, következésképpen hatását is itt fejti ki: elősegíti az eosinophilek differenciálódását, érését [144], meghosszabbítja életidejüket [145], továbbá részt vesz az aktivációjukban [146]. Az IL-5 mobilizálja az eosinophil sejteket a csontvelőből és más kemotaktikus anyagok (pl.: eotaxin) termelésének szabályozása révén hozzájárul a gyulladás helyére irányuló migráció és homing [147;148] megvalósulásához. Anti-IL-5 antitest (mepolizumab) adását követően markánsan csökken az eosinophil sejtszám mind a vérben, mind az asthmás légutakban (indukált köpetben), azonban az LHR és a klinikai tünetek nem változnak jelentős mértékben [149;150]. Mindez megkérdőjelezi az eosinophil sejtek szerepét a perzisztáló asthmaticus tünetek fenntartásában. Az IL-9 fő forrása a Th2-es sejt. Fokozza az aktivált T-sejtek proliferációját, az IgE szintézist és előmozdítja a hízósejtek differenciálódását és megsokszorozódását. IL9 transzgenikus állatban az asthmára jellemző elváltozások többsége megjelenik, így valószínűleg többféle módon is hozzájárul a betegség kialakulásához.
25
Az IL-13-at szintén főleg a Th2-sejtek szintetizálják. Allergiás légutakban az expressziója fokozott, és allergénprovokáció hatására tovább nő. Az IL-13 és az IL-4 receptora részben azonos (IL-4Rα lánc) így hatásaik is átfednek. Az IL-13 részt vesz az IgE izotípusváltás indukciójában, a VCAM-1 expressziójának fokozásában és az IFN-γ és az IL-12 szintézisének gátlásában. Ezen kívül aktiválja az eosinophil sejteket (megnöveli a CD69 expresszióját) és megnyújtja életidejüket [151]. Míg az IL-4 főleg az asthma kialakulásának korai szakaszában nélkülözhetetlen, az IL-13 valószínűleg a betegség későbbi stádiumában a krónikus gyulladás fenntartásában játszik fontos szerepet, mivel ekkor nagy mennyiségben képződik a gyulladt légutakban. Számos egyéb cytokin (pl.: IL-1β, IL-6, tumor nekrózis faktor-α – TNF-α, GMCSF) vesz részt a gyulladásos folyamat felerősítésében, melyek részletes tárgyalása túlmutat az értekezés keretein. 1.2.4.3. Kemokinek A kemokinek általában 8-10 kDa méretű kemoattraktáns hatású cytokinek, amelyek részt vesznek a különböző leukocytáknak a gyulladás helyére vonzásában. Több mint 50 különböző kemokint azonosítottak eddig, a receptoraik száma is 20 feletti. Egyes kemokinek szelektíven kötődnek bizonyos receptorokhoz, míg mások hatása átfedő. Alapvetően két nagy csoportjuk van: CC és CXC kemokineket különböztetünk meg aszerint, hogy aktív helyükön a két cisztein szomszédos, vagy azokat elválasztja egymástól egy másik aminosav. Asthmában főleg a T-lymphocytákra, eosinophilekre és monocytákra ható CC kemokineknek van jelentősége. Az eotaxin, eotaxin-2, eotaxin-3, RANTES és az MCP-4 a CCR3 receptoron fejtik ki hatásukat [152],
amely
az
eosinophil
granulocytákon,
Th2-sejteken
és
hízósejteken
expresszálódik. Így ezek a kemokinek részt vesznek az allergiás gyulladásos infiltratio sejtes összetételének kialakításában [153]. Az MCP-1 a monocytákon, T-sejteken és hízósejteken is megtalálható CCR2-n hat. Neutralizálása a gyulladás és az LHR jelentős csökkenését eredményezi asthma modellekben [153;154], következésképp szintén fontos szerepe lehet asthmában. A Th2-es sejtek felszínén megtalálható a CCR4 receptor is, melyhez MDC (monocyta eredetű kemokin) és TARC kötődik [155]. Az utóbbi anyag epithelsejtekben is képződik [156] és valószínűleg részt vesz a Th2-es sejtek toborzásában, mivel mennyisége emelkedett az asthmások BALF-jában [157]. A
26
CXC kemokinek közül az IL-8 említendő, mivel koncentrációja megnő asthmások légutaiban [91]. Az IL-8 főként a neutrophil granulocytákra ható kemoattraktáns, amely aktiválja is ezeket a sejteket, továbbá degranulációt, és a nikotinsavamid-adenindinukleotid-foszfát (NADPH) -oxidáz aktiválása révén az „oxidatív robbanás” (respiratory burst) fokozódását váltja ki [158]. Ez az oxidatív stressz erősödéséhez vezet és leginkább az asthma súlyos, neutrophiliával járó formáiban lehet fontos szerepe. 1.2.4.4. Nitrogén-monoxid Az NO egy rövid (1-5 másodperces) fél-életidejű, reaktív szabadgyök. A szervezetben az L-arginin aminosav L-citrullinná történő oxidációja során képződik. Ezt a reakciót a nitrogén-monoxid szintetáz (NOS) enzim különböző izoformái katalizálják. A három ismert izoenzim a neuronalis NOS (nNOS, NOS1), az endothelialis NOS (eNOS, NOS3) és az indukálható NOS (iNOS, NOS2), melyeket 12., 17. és 7. kromoszómán elhelyezkedő, különböző gének kódolnak [159]. Immunhisztokémiával és in situ hibridizációs technikával kimutatták, hogy a tüdőben az nNOS a légúti simaizomzatot beidegző idegrostokban van jelen, különösen a tracheában és a nagy bronchusokban [160;161], míg az eNOS főként a bronchialis epithelsejtekben és a II. típusú alveolaris pneumocytákban, valamint az erek endothelsejtjeiben található meg [162]. Az iNOS ugyanakkor számos strukturális sejtben (bronchialis epithel, II. típusú pneumocyta, fibroblast, légúti és vascularis simaizom, endothel, porc) és gyulladásos sejtekben (hízósejt, macrophag, eosinophil és neutrophil granulocyta) fellelhető [159]. Mindhárom izoenzim konstitutív módon expresszálódik az egészséges légutakban és bizonyos külső és belső hatásokra expressziójuk és működésük egyaránt fokozódhat [163-165]. Az nNOS és eNOS (korábbi nomenklatúra szerint konstitutív – c – NOS) enzimek NO szintézise kalciumfüggő, míg az iNOS működése kalciumfüggetlen, viszont szteroid-érzékeny [166]. Egészségesekben a kilégzett levegőben az NO részaránya (FENO – a kilégzett NO frakcionális koncentrációja) 5-25 ppb (parts per billion) és nem ismert pontosan, hogy mely izoenzimek milyen arányban járulnak hozzá a szintéziséhez. Számos vizsgálati eredmény utal arra viszont, hogy a légúti simaizomtónus kialakításában – fiziológiás körülmények között – nincs jelentős szerepe a bazális NO termelésnek [167] (dacára annak hogy az NO simaizom-relaxációt kiváltó hatása – például az érfalban – jól ismert). További kutatási eredmények azonban azt mutatják,
27
hogy a cNOS izoenzimekből származó NO csökkentheti az LHR-t, tehát spazmogén anyagokkal szemben bronchoprotektív hatású [168-170]. A bronchoconstrictor anyagok hatásának kivédésében mind az eNOS [171], mind az nNOS [172] szerepet játszhat, csökkentve ezzel az LHR-t. Humán vizsgálatok is alátámasztják, hogy az endogén NO termelés bronchoprotektív enyhe asthmában [173]. Allergénprovokációt követően, a korai allergiás válasz során a cNOS enzimek működése (valószínűleg részben szubsztráthiány következtében) csökken, miközben az LHR fokozódik [174-176]. A késői allergiás válasz során viszont jelentősen fokozódik az iNOS expressziója mind mRNS, mind fehérje szinten [177;178] és ezzel párhuzamosan nő a FENO [179]. Akut súlyos asthmában [180] és rhinovírus infekció esetén [181] (ami gyakran okozza a betegség fellángolását) szintén jelentősen emelkedik a FENO. Mindez asthmában fokozott LHR-rel és légúti eosinophil sejtszaporulattal jár együtt. Az eosinophil granulocyták által termelt MBP (major basic protein) polikation természetű anyag, amely interferál az L-arginin-felvétellel [182]. Ugyanakkor az argináz aktivitás szintén fokozódik allergén expozíciót követően az asthmások légutaiban. Mindez hozzájárulhat a protektív cNOS enzimek szubsztráthiányának kialakulásához az epithelialis sejtekben [183]. Az asthma exacerbatio során megfigyelhető FENO emelkedést részben az is okozhatja, hogy a légúti pH jelentősen csökken, és ennek következtében nitritből – retrográd módon – NO képződhet [184]. Stabil, enyhe és középsúlyos asthmásokban a légúti pH savasodása azonban nem figyelhető meg [185]. Az IL-4, valamint az asthma súlyosbodásával párhuzamosan gyakran emelkedő IFN-γ szinergista hatású az iNOS expressziójának fokozásában [186]. Akut asthma állatmodelljében kimutatták, hogy az NO mintegy 80%-a az eosinophil sejtekben található iNOS-ból származik [187]. Megfigyelték
továbbá,
hogy
asthmásokban,
szteroid
[188;189]
és
egyéb
gyulladáscsökkentő (leukotriénreceptor antagonista [190], anti-IgE [191]) terápiát követően jelentősen csökken a FENO. Az iNOS tehát fontos forrása az NO-nak gyulladt tüdőben, és a termelődő nagy mennyiségű NO további proinflammatorikus hatást fejt ki a légutakban: fokozza az érfal permeabilitását, a gyulladásos sejtes infiltratiót, és cytotoxicus hatású. Mindez – a természetes immunitás részeként – hozzájárul a kórokozók elleni védelemhez. Az iNOS veleszületett hiánya a knock-out állatokat fokozottan fogékonnyá teszi vírus- [192], baktérium [193] és parazitafertőzésekkel [194] szemben. Másrészről viszont asthmában a magas légúti NO koncentráció a
28
korábban felsorolt – a gyulladást súlyosbító – hatásai miatt hozzájárul a betegség progressziójához [195]. In vitro a NOS enzimek (nem szelektív) gátlása csökkenti a monocyták [196], eosinophil [197] és neutrophil [198] granulocyták kemotaxisát, míg NO donorokkal – az apoptosis gátlása révén – meghosszabbítható az eosinophilek életideje [199]. Az NO fokozza egyes kemokinek – MIP-2 (macrophag inflammációs protein-2) és MCP-1 (monocyta kemotaktikus protein-1) – expresszióját és ezzel is hozzájárul a gyulladásos sejtes infiltratio súlyosbításához [177] Számos vizsgálati eredmény [200-202] utal arra, hogy asthmában a reaktív oxigén-származékok (ROS – reactive oxygen species) mennyisége is jelentősen megnő. Ezek fő forrásai a membránhoz kötött NADPH-oxidázok (pl.: légúti epithel sejtekben) és a gyulladásos sejtekben fokozottan expresszálódó eosinophil peroxidáz és myeloperoxidáz. Az NO és a ROS-ok együttes jelenléte következtében erősen oxidáló hatású úgynevezett reaktív nitrogén-származékok képződnek. Ilyen például a peroxinitrit, amely NO és szuperoxid anion egyesüléséből keletkezik [203]. Ez a rövid életidejű, rendkívül reaktív anyag gyorsan kölcsönhatásba lép a keletkezés helyén található egyéb molekulákkal – többnyire fehérjékkel – és azok módosulását (nitrálását) okozza. Állatkísérletben kimutatták, hogy a peroxinitrit fokozza az LHR-t, és aktiválja az eosinophil sejteket [204], továbbá képes növelni az IL-8 (neutrophil kemoattraktáns) szintézisét. Másrészt viszont a fehérjék nitrálásában – 3-nitrotirozin képződésében – az NO mellett az eosinophil granulocytákból származó eosinophil peroxidáznak is jelentős szerepe van [205]. Ez a folyamat többnyire a fehérjék funkciójának károsodását eredményezi. A reaktív nitrogén származékok ily módon hozzájárulhatnak a légúti epithelialis sejtek károsodásához és lehámlásához asthmában (137). Állatkísérletben kimutatták, hogy 1400W szelektív iNOS inhibitorral jelentősen csökkenthető az allergizálást követően kialakuló gyulladás és LHR [187;206;207]. Másrészről viszont az NO-ból bronchodilatator hatású anyagok is képződnek a légutakban, mint például az S-nitrozotiolok (pl.: S-nitrozo-glutation – GSNO). Asthma modellben kimutatták ugyanakkor, hogy a GSNO reduktáz enzim megnövekedett expressziója következtében csökken a protektív GSNO mennyisége és – többek között – ezért fokozott az LHR [208]. Összességében a fokozott – iNOS eredetű – NO szintézis számos ponton kapcsolódik az asthma patomechanizmusához, ezért – az American Thoracic Society (ATS) és az European Respiratory Society (ERS) közös ajánlása alapján [209] – a FENO jól
29
használható a betegek kezelésének nyomon követésére [210]. A FENO meghatározás előnye, hogy a mérése könnyen, nem invazív módon kivitelezhető és a FENO érték direkt mutatója a légutakban zajló gyulladásos folyamatoknak. A megemelkedett FENO támogatja az asthma diagnózisát, de más betegségekben, többek között a krónikus obstruktív tüdőbetegség (COPD) akut exacerbatióban is magas értéket kaphatunk [211]. Fontos szem előtt tartani azonban, hogy a FENO abszolút számértékéből nem következtethetünk az asthma súlyossági fokára, mivel értéke (különösen szteroidkezelt asthmásokban) rosszul korrelál a légzésfunkciós eltérésekkel, továbbá számos tényező, például a dohányzás [212], infekciók [181;213] és a légúti gyulladás minősége (pl.: eosinophil vagy neutrophil túlsúly) befolyásolhatja [214].
1.2.5. A természetes (veleszületett) immunitás szerepe A természetes immunitás a szervezet első védelmi vonalát képezi a fertőző ágensekkel szemben. A veleszületett immunvédekezésben résztvevő molekulák csíravonalban öröklődő géneken kódolódnak, és nem tartalmaznak variábilis elemeket. Számos sejttípusok (pl.: granulocyták, hízósejtek) folyamatosan expresszálja a természetes immunitás kulcsfontosságú elemeit, a PRR-eket, melyek fertőzés esetén lehetővé teszik a szervezet azonnali válaszadását és a védekező mechanizmusok beindulását (ellentétben az adaptív immunreakcióval, amely hosszabb időt – napokat – vesz igénybe). A PRR-ek egyes kórokozók – túléléshez nélkülözhetetlen – molekuláit (a PAMP-okat) ismerik fel, és ez a specificitásuk az evolúció során alakult ki [215]. Ugyanakkor egyes PRR-eknek endogén ligandjai is lehetnek, ami alátámasztja azt a felvetést, miszerint döntő szerepük van az adaptív immunválasz koordinálásában (lásd még az 1.3. fejezetben) [73]. A PRR-ek közé tartoznak – többek között – a Toll-szerű receptorok (TLR-ek) és a mannózkötő fehérje (mannose-binding lectin: MBL). Eddig mintegy 12 TLR-t azonosítottak, de valószínűleg a PRR-család folyamatosan bővülni fog. Az utóbbi néhány évben a természetes immunitás az allergiás immunfolyamatok és az asthma kutatásának homlokterébe került. Ennek alapvetően két oka van: 1. Ebben a betegségcsoportban a genetikai hajlamosító tényezők és a környezeti hatások interakcióját (ún.: gene-environment interaction) meghatározónak tartják. Az immunmodulációban szerepet játszó PRR-ek számos polimorfizmusáról kimutatták,
30
hogy hajlamosító [216], vagy éppen védő [217] hatású, míg a PAMP-ok fokozott [42] vagy csökkent [218] expozíciója szintén hozzájárulhat ezen kórképek kialakulásához. A természetes immunitás tehát az allergiás betegségek vonatkozásában a gén-környezet kölcsönhatás frontvonalán helyezkedik el. 2. Néhány újabb keletű eredmény alapján [219] a természetes immunszignálok kulcsfontosságú
szerepet
töltenek
be
az
adaptív
immunválasz
irányának
meghatározásában. A PRR-ek alapvető funkciója valószínűleg a szervezet számára veszélyes, illetve nem-veszélyes mikroorganizmusok elkülönítése és ennek megfelelően T-effektor illetve Treg irányú immunválasz kiváltása [28;29]. A kórokozók inváziójával általában együtt jár a PAMP-ok megjelenése, amit az immunrendszer úgynevezett „danger”-szignálként értékel, és erre adaptív immunválasz kiváltásával reagál. A Teffektor sejtek további (Th1 vagy Th2) differenciálódását szintén meghatározhatják egyes PAMP-ok [220-222], ily módon szerepük lehet asthmában a Th2 dominancia kialakításában is. Ennek a folyamatnak bizonyos részleteit korábban, epidemiológiai fejezetben, valamint a hízósejtekről, dendritikus sejtekről és T-lymphocytákról szóló szakaszokban tárgyaltam. Mindazonáltal a természetes immunstimulusoknak az allergiás asthma kórfolyamatában betöltött szerepe meglehetősen ellentmondásos. Ezt jól példázza, hogy az 1. pontban hivatkozott közlemények mindegyike az Lps-sel kapcsolatos. Tehát az Lps hatásmechanizmusában fontos CD14 159T variánsa mind kóroki [216], mind protektív [217] tényező lehet; ugyanígy a fokozott Lps expozíció védő [218] és káros [42] hatását egyaránt leírták. Megfigyelték továbbá, hogy az Lps nagy dózisban Th1 irányú differenciációt (illetve allergizált állatokban a Th2 gyulladás csökkenését [223]) eredményezi, míg kis dózisban hozzájárulhat a Th2 dominancia kialakulásához [76]. Humán és kísérletes vizsgálatokban is kimutatták, hogy a kellőképp korai Lps expozíció képes megakadályozni az szenzitizációt [25;224;225], míg a már kialakult allergiás gyulladás súlyosbítható Lps-sel [226;227]. A PAMP-ok aktuális hatását számos tényező együttesen
határozza
meg:
többek
között
az
egyed
genotípusa
(milyen
polimorfizmusokat hordoz?), a PAMP típusa (melyik TLR-hez kötődik?), az expozíció dózisa és időzítése mind befolyásolhatja. Az egymásnak ellentmondó eredmények egyik magyarázata, hogy egy receptoron – például a TLR-4-en – keresztül közvetített szignál erősségére a genetikai háttér (polimorfizmusok), a ligand (Lps) dózisa, valamint az
31
adott sejt aktivációs állapota egyaránt hatással van [228]. A PRR-ek a professzionális antigénprezentáló sejteken is expresszálódnak. A PAMP-ok kötődése receptorukhoz aktiválja a dendritikus sejtet, fokozza az MHC II és a kostimulációs molekulák expresszióját valamint a sejt cytokin termelését. Ez utóbbi tényező alapvetően meghatározza a T-sejt differenciáció irányát. Kimutatták, hogy az Lps kötődése a TLR4-hez Lps-kötő fehérje (LBP – Lps binding protein) közvetítésével alapvető feltétele a Th2-es immunválasz kialakulásának az allergiás asthma egérmodelljében [75;76;229]. Megfigyelték továbbá, hogy a hízósejteken kifejeződik a TLR-4, és a felszíni IgE molekulák allergén-keresztkötésével egyidőben alkalmazott Lps stimuláció fokozott Th2 cytokintermelést eredményez [230]. 1.2.5.1. Az Lps A Gram-negatív baktériumok külső sejtmembránjának külső rétegét nagyrészt endotoxin
alkotja,
ami
vegytanilag
lipopoliszacharid
(Lps)
természetű.
Az
szakirodalomban egyaránt használatos az Lps és endotoxin elnevezés, és ugyanazt a molekula-csoportot jelöli. Az Lps felépítése az egyes baktérium-fajokban lényegében egyforma. Alkotóelemei: az O-specifikus antigén, ami poliszacharid természetű, és szerkezete az adott baktérium szerotípusra jellemző; a külső és belső mag (core), amelyek oligoszacharidok; és végül a lipid-A. Ez utóbbi a különböző fajokból származó Lps molekulák leginkább hasonló (konzervált) része, és nagyrészt ez felelős a toxicitásért [231]. Az Lps már nagyon kis mennyiségben is kifejt immunstimulátor hatást (sejtenként kb.: 10 molekula elegendő lehet [232]), és rendkívüli módon stabil, ellenálló
ágens
(inaktiválás:
4
óra
160ºC-on
[233]).
Ennek
köszönhetően
környezetünkben – kisebb, vagy nagyobb koncentrációban – mindenütt megtalálható. A szervezetbe jutva az LBP-hez kötődik [234], ami szállító-molekulaként juttatja el az Lps-t a CD14-hez. A CD14 mind sejtmembránhoz kötött, mind szolubilis (sCD14) formában nagy affinitással képes az Lps-t megkötni [235], viszont nem rendelkezik intracytoplasmaticus domainnel. Az Lps-LBP-CD14 komplexe a sejtfelszínen a TLR-4hez kapcsolódik. A TLR-4 egy PRR, és ily módon a kórokozók elleni nemspecifikus védelem – azaz a természetes immunitás – egyik fontos eleme [236]. A TLR-4 aktív – dimer – formájának kialakításához szükséges még az MD-2 (lymphocyta antigén 96) kötődése, és az így létrejött membrán-komplex képes beindítani a sejten belüli
32
jeltovábbító reakciósort. [237]. Az eddig feltárt másodlagos hírvivő mechanizmusok részletes tárgyalása meghaladja jelen dolgozat kereteit, ezért a továbbiakban csak az Lps néhány, – az értekezés témáját tekintve – fontos hatását ismertetem. A nagy dózisú Lps-inhaláció – egyes foglalkozási kórképekben (pl.: gyapot és gabonaipari munkások esetében) – lázzal, köhögéssel, dyspnoeval járó akut betegség képében jelentkezik [238]. Kísérletes vizsgálatok kimutatták, hogy súlyos, szteroid rezisztens neutrophil gyulladás és oedema alakul ki a tüdőben, melyet LHR kísér [239]. Ennek hátterében részben a macrophagok fokozott IL-12 produkciója és az IFN-γ termelő lymphocyták felszaporodása állhat [240;241]. Kisebb dózisú krónikus, vagy ismételt Lps-inhaláció egyik oka a dohányzás, mivel a dohányfüst jelentős mennyiségben tartalmaz Lps-t [41]. Ezen kívül a rossz lakás-körülmények velejárója, vagy munkahelyi ártalmak következménye is lehet. Hatása hozzájárul a COPD kialakulásához [242;243]. Állatkísérletben, ismételt intratrachealis Lps instillatióval COPD-hez hasonló szövettani elváltozások hozhatók létre a tüdőben [244]. Az Lps többféle módon is ronthat az asthmás betegek állapotán: 1. Súlyosbíthatja a légúti gyulladást. A korábbiakban ismertetett módon az Lps „adjuváns-szerű” hatást fejt ki az antigénprezentáló sejteken, elősegítve ezzel az antigén (allergén) bemutatását. Az Lps fokozhatja az ECP képződését a légutakban [245], és a GM-CSF elválasztásának megnövelése révén megnyújthatja az eosinophil granulocyták életidejét [246]. Lps hatására nő az allergénspecifikus IgE termelése [247], valamint az iNOS expresszió fokozódása révén emelkedhet az NO-produkció [186]. Asthmában egyébként a légutakban nagyobb mennyiségben található sCD14, mint egészségesekben [248], és allergénprovokáció hatására mind az sCD14, mind az LBP koncentrációja megnő [249]. 2. Befolyásolhatja a betegség gyógyszeres kezelését. Kimutatták, hogy asthmásokban a dohányzás jelentősen csökkenti a légúti gyulladás szteroid-válaszkészségét [250]. A szteroidok csökkent hatékonyságáért valószínűleg részben a dohányfüst Lps tartalma lehet felelős, azonban erre vonatkozó kutatási eredmények eddig nem álltak rendelkezésre. Állatkísérletünkben elsőként vizsgáltuk meg, hogy hogyan befolyásolja az Lps az allergiás légúti gyulladás és LHR szteroidérzékenységét [227].
33
3. Végül a krónikus Lps inhaláció asthmásokban előmozdíthatja az irreverzibilis légúti obstrukció kialakulását.
1.3. A TERHESSÉG IMMUNOLÓGIÁJA Már 1953-ban felismerték, hogy a terhesség – immunológiai értelemben – az allogén szerv-transzplantációhoz hasonlatos [251]. Bár a magzat – mint „allograft” – fele részben az anya számára idegen, apai antigéneket hordoz, fiziológiásan mégsem alakul ki rejectio. Mivel ezen immunológiai paradoxon magyarázata jelenleg sem minden részletében ismert [252], ezért ebben a fejezetben csak a foeto-maternalis immunkölcsönhatás néhány alapvető mechanizmusát, és egyes olyan következményeit ismertetem, melyek hatással lehetnek az asthma patomechanizmusára. A magzat és az anya szervezete közötti határfelületet a placenta képezi, amely – ismert barrierfunkciója ellenére – nem teljesen átjárhatatlan a magzati antigének számára [253]. Az anya keringésében mind magzati szomatikus sejtek [254], mind trophoblastok [255] megtalálhatóak: állatkísérletben kimutatták, hogy körülbelül 105 fehérvérsejtre jut 1 foetalis eredetű sejt [253]. Ezen kívül a trophoblast-óriássejtekből származó membránvezikulák (microparticulumok) [256] és magzati DNS-fragmentumok [257] szintén fellelhetőek az anya keringésében, továbbá a haemochorialis placentával rendelkező emlősökben (pl.: ember, egér, patkány) a trophoblast és az anya vére közvetlen kontaktusban van egymással [258]. A placenta által közvetlenül az anyai vérbe kiválasztott számos mediátor (pl.: cytokinek, hormonok), és a trophoblastsejtek felszínén megjelenő egyes molekulák ily módon jelentősen befolyásolják az anya immunműködését (lásd később ebben a fejezetben). A terhesség alatt a deciduában natural killer (NK), NKT és γδT fenotípusú lymphocyták szaporodnak fel [259-261]. Kísérletesen kimutatták, hogy a B sejtek száma, valamint az IgG és IgM termelődés szintén megnő [262]. A deciduában található dendritikus sejtek myeloid típusúak, és leírták, hogy IL-4, IFN-γ, IL-10 és TGF-β szintézist egyaránt folytatnak [263]. Ebből következik, hogy a T-sejtek több irányú – Th1, Th2 és Treg – differenciációja is végbe mehet a deciduában, a terhesség során. Az egyes T-effektor altípusok jelenlétét és működését furcsa kettősség jellemzi: míg a Th1 (és NK) sejtek termelte IFN-γ fontos szerepet játszik a decidua fiziológiás vascularis átépülésében [264], a túlprodukciója
34
abortuszhoz vezet [265;266]; ugyanígy a Th2-es cytokinek antiabortogén hatást tulajdonítanak [267], de az IL-4 nagy dózisban szintén vetélést idéz elő [266]. A progeszteron a Th2-es típusú cytokinképződés (IL-4, IL-5) és a GM-CSF szintézis hatékony stimulátora [268]. Egy korábbi elmélet szerint a Th2 cytokintúlsúly „immuntrofikus”, azaz védő hatású, míg a Th1 dominancia abortuszhoz vezet [267]. Ugyanakkor más szerzők eredményeivel összhangban [269;270] saját kutatócsoportunk is kimutatta [271], hogy terhességben az IL-4 és az IFN-γ képződése egymással arányos mértékben növekszik. A lymphocytapopulációk expanziója és aktivitása élettani terhességben valószínűleg szorosan szabályozott, mivel – úgy tűnik – egyes cytokinek lokalizációtól, időzítéstől és dózistól függően gyökeresen eltérő hatást fejthetnek ki. Az anya immunrendszerének a foetalis antigének ellen irányuló specifikus immunválaszát többféle mechanizmus hivatott kivédeni. A magzati antigenitású trophoblastsejteken sem MHC II, sem a nagy polimorfizmust mutató MHC I molekulák (HLA-A, HLA-B és HLA-D) nem expresszálódnak [258;272]. Mint korábban említettem, ezen molekulák hiányában T-sejt anergia alakul ki, tehát nincs aktív immunválasz. Ezzel szemben HLAC, HLA-G és HLA-E megjelenik a trophoblaston [273-275], viszont az előbbi kettő képes gátolni az NK sejtek aktivitását [272;276], az utóbbi kettő pedig meglehetősen monomorf struktúra, és valószínűleg nem ismeri fel őket idegenként az anya immunrendszere [273]. Kimutatták, hogy terhes nőkben csökkent a lymphocytákban az NFκB koncentrációja [277], ami azt jelzi, hogy aktivációs szintjük viszonylag alacsony. Az antifoetalis immunválasz kivédésének másik módja az aktív immuntolerancia. Ha in vitro kísérletben petesejteket, spermiumokat és lymphocytákat együtt inkubálnak, megnő a lymphocyták IL-10 szintézise [278], ami elősegíti a Treg sejtek differenciálódását. Megfigyelték továbbá hogy a terhes nők vérében az apai HLA-DR antigénre specifikus TCR-ek (T-sejt receptorok) ellen irányuló antiidiotípus antitestek is keringenek [279]. Ezen kívül valószínűleg számos egyéb mechanizmus (pl.: indolamin 2,3-dioxigenáz indukció – csökkent triprofánszint – T-sejt gátlás [280]) csökkenti a magzat kilökődésének veszélyét. Az adaptív immunválasz tekintetében megfigyelhető anergia és magzat-specifikus tolerancia kialakulásával párhuzamosan az anya természetes (veleszületett) immunrendszerének fokozott működése is megfigyelhető terhességben. A várandós nők vérében felszaporodnak az aktivált neutrophil granulocyták és a monocyták [281]. Ezzel párhuzamosan az akut-fázis fehérjék szintje
35
is megnő a szérumban [282], és összességében mindez a szepszisben tapasztalt eltérésekre emlékeztet. Ez a „fiziológiás gyulladás” valószínűleg fontos szerepet játszik az uteroplacentaris vascularis remodeling kialakulásában is. A természetes immunitás aktiválódásának egyik oka lehet, hogy az extraembrionális trophoblaston bizonyos endogén PRR-ligandok expresszálódnak. Az óriássejtek (syncytium) képződése során nem-metilált DNS-fragmentumok jelennek meg a trophoblaston [283]. Ezek az nemmetilált CpG motívumokat tartalmazó oligonukleotidok a TLR-9 ligandjai. Egy másik megfigyelés
szerint
a
trophoblaston
humán
endogén
retrovírustermékek
is
expresszálódnak [284], amelyek a kettősszálú RNS-re (dsRNS) specifikus TLR-3-hoz kötődhetnek [285]. A monocytákon és granulocytákon expresszálódó PRR-ek tehát felismerik ezeket a molekulákat, és hatásukra a sejtek „előaktivált” állapotba kerülnek (priming). Ennek során fokozódik az MHC és a kostimulációs molekulák, továbbá a CD14 expressziója is [281]. Mindez jelentős mértékben hasonlít az Lps-kezelés hatásaira [258]. Ezt bizonyítja az is, hogy a terhesség fokozott fogékonyságot eredményez a generalizált Shwartzman-reakcióval [286] szemben: kimutatták, hogy míg kontroll állatokban 2 egymást követő Lps injekció szükséges a halálos gyulladásos reakció kialakulásához, a terhes alanyokban már 1 oltás is kiváltja ugyanezt [287]. Bár a természetes immunitás fokozott működése következtében a terhes asszonyok védettebbek az extracelluláris baktérium-fertőzésekkel szemben [288], az adaptív immunválasz általánosan csökkent aktivitása miatt viszont esendőbbekké válnak az intracelluláris patogének (pl.: vírusok) okozta betegségekre [289]. Kimutatták továbbá, hogy
praeeclampsiában
szenvedő
betegekben
a
TLR-4
fokozott
mértékben
expresszálódik a trophoblaston, ami felveti az Lps, vagy más (endogén) PRR-ligand szerepét a kórfolyamatban [290].
1.3.1. Terhesség és asthma Az asthma súlyossági foka a terhesség alatt különbözőképp alakulhat. A várandós nők körülbelül 1/3-ában súlyosbodnak, 1/3-ában nem változnak, míg 1/3-ában javulnak az asthma tünetei [45]. Ennek oka részben az is lehet, hogy az asthmás fenotípus (asthma szindróma) hátterében különböző típusú (pl.: eosinophil, vagy
36
neutrophil túlsúlyú) légúti gyulladásos elváltozások állhatnak [6]. A természetes immunitás felfokozott működése, vagy a progeszteron hatására megnövekedett Th2 cytokinszintézis (és valószínűleg számos más mechanizmus) ronthatja a légúti gyulladást asthmában. Ugyanakkor az asthma súlyosbodása, vagy esetleges akut exacerbatiója a terhesség során veszélyeztetheti mind a magzat, mind az anya életét. E két megváltozott immunállapot (asthma és terhesség) hátterének és kölcsönhatásának pontosabb megértése segíthet egyes – asthmában gyakoribbá váló – szülészeti szövődmények patomechanizmusának feltárásában is.
37
2. KUTATÁSI EREDMÉNYEK A továbbiakban az értekezés alapját képező közlemények tartalmát két külön fejezetben ismertetem (2.1. és 2.2.).
2.1. ÁLLATKÍSÉRLTES VIZSGÁLATOK 2.1.1. Bevezetés és célkitűzések Az Lps (bakteriális endotoxin) a környezetünkben mindenütt jelen lévő anyag, amely megtalálható a belélegzett levegőben [291], alkotóeleme a házipornak [292], (munkahelyi) szerves eredetű pornak [226], dohányfüstnek [41]. Az Lps inhaláció hozzájárulhat mind a légúti allergiás gyulladás kiváltásához, mind az asthma tüneteinek romlásához. Kimutatták, hogy a kis dózisú Lps expozíció elengedhetetlen feltétele a légúti allergia kialakulásának egérben [76], továbbá az Lps felismeréséhez nélkülözhetetlen LBP hiányában az allergizált állatoknál nem fejlődik ki LHR [229], és nem emelkedik a légutakban a peroxi-nitrit koncentrációja sem [293]. Az Lps okozhatja az allergiás asthma exacerbatióját [292], és az allergiás asthmás egyedek bizonyítottan érzékenyebbek az Lps hörgőgörcs-keltő hatásával szemben [294;295]. Ráadásul az Lps inhaláció 1/5-ödére csökkenti az allergén PD20 értékét asthmásokban [296]. A tisztán allergiás gyulladás kifejezetten jól reagál glükokortikoidokra [297], ugyanakkor az asthmás betegek körében a szteroid-válaszkészség meglehetősen nagy változékonyságot mutat [298]. Az utóbbi jelenség magyarázata nem ismert. Figyelemreméltó, hogy az Lps-keltette gyulladás és LHR emberben [299;300] és egérben [239] egyformán csak kis mértékben reagál a glükokortikoid kezelésre. Az elmúlt években számos kísérletben tanulmányozták az Lps és allergén koexpozíció légúti gyulladásra gyakorolt hatását [76;223-225;229;301-303], de egy esetben sem vizsgálták, hogy az Lps hogyan befolyásolja az allergiás légúti gyulladás és LHR kezelhetőségét.
38
2.1.1.1. Célkitűzések 1. Az eosinophil légúti gyulladás és LHR olyan egérmodelljének létrehozása és jellemzése, amelyben a szenzitizált állatok allergén (Ova) provokációját megelőzően egy Lps előkezelést (priming-ot) alkalmazunk. 2. A dexamethason (Dex) hatékonyságának összehasonlítása az Lps előkezelt allergizált és a tisztán allergizált állatok között. Az NO fontos mediátor mind az allergiás, mind a nem allergiás légúti gyulladásban [177;304;305], és az indukálható NO szintetáz (iNOS) inhibitorainak terápiás alkalmazása asthmában szintén felmerült [206]. Ennek alapján a harmadik célkitűzésünk: 3. Az Lps előkezelt allergizált és a tisztán allergizált állatok légúti NO produkciójának becslése (nitrit méréssel), és az 1400W – szelektív iNOS inhibitor [306] – hatásainak vizsgálata.
2.1.2. Módszerek 2.1.2.1. Állatok Kísérleteinkben 6-8 hetes nőstény BALB/c beltenyésztett egereket használtunk. Az SPF (meghatározott patogénektől mentes) állatokat a Charles River Laboratories hazai tenyészetéből (Isaszegről) szereztük be (higiénés státusukat a forgalmazó által rendszeresen végzett állatorvosi és szerológiai vizsgálatok biztosítják). Az egereket 38×23×18 cm méretű ketrecekben (maximum 6 állat/ketrec), 12/12 óra világos/sötét ciklusra beállított fényviszonyok között tartottuk. A ketreceket egy külön erre a célra kialakított, légkondicionált (hőmérséklet 24±2ºC, páratartalom: 60±10% ), légcserélővel ellátott állatházban elhelyezett, HEPA szűrővel (leválasztás 0,3 µm-nél 99,997%) védett, túlnyomásos (50 Pa), szellőztetett ketrecszekrényben ( KAT-F-SZ-1000, Radel & Hahn, Mattersburg, Ausztria) helyeztük el. A műanyag ketrecaljakat, itató üvegeket folyékony felületfertőtlenítővel (Incidur liquid spray) tartottuk tisztán, a ketrecfedő rácsokat és az alomanyagot (Lignocell, JRS, Rosenberg, Németország) hőlégben (180 ºC, 30 perc) sterilizáltuk, míg a tápot mikrohullámú sütőben (700W, 2 perc) csírátlanítottuk. Az állatok igény szerint kaptak Ova-mentes rágcsálótápot (R/M-Z+H, 15mm, Ssniff, Soest, Németország) és sósavval pH 3-ra savanyított ivóvizet. Az állatok
39
gondozásával kapcsolatos kérdésekben Prof. Dr. Kállai László laborállat tanulmányát tekintettük irányadónak [307]. Az egereket csak az akklimatizáció és a kísérlet ideje alatt tartottuk saját állatházunkban (tenyésztést nem végeztünk), hogy SPF státusukat minél jobban megőrizzék. 2.1.2.2. Allergizálás Kísérletünkben – részben – egy széles körben elterjedt allergiás asthma modellt használtunk (1. ábra). Az egereket Ova-val szemben érzékenyítettük (szenzitizáltuk), majd ugyanezen fehérjével végzett légúti provokációval eosinophil légúti gyulladást hoztunk létre a tüdőben. A szenzitizációt a kísérlet 1. és 14. napján intraperitonealis (ip.) oltással végeztük. Az oltóanyag 20 µg Ova-t (PBS-ben oldva) és 2,25 mg alumíniumhidroxidot (szuszpenzióban, Imject Alum) tartalmazott. Az allergizált állatok 100 µL-t kaptak a fenti oldatból, míg a kontrollok 100 µL PBS-t placeboként. Ezt követően, a kísérlet 28. 29. és 30. napján, naponta 20 percig 1% Ova-t tartalmazó aeroszolinhalációval kezeltük az állatokat (allergénprovokáció). Az egereket egy műanyag dobozban helyeztük el, melybe szilikon-csövön keresztül bevezettük a kompresszorporlasztóval (Laborex-Sanesco, Bécs, Ausztria) létrehozott aeroszolt. A porlasztáskor Ova 1%-os, PBS-ben készült oldatát használtuk, míg a kontroll állatokat tiszta PBSaeroszollal kezeltük (placebo). A tüdőellenállás-mérés és a mintagyűjtés a kísérlet befejező, 31. napján történt.
1400W (iNOS inhibitor) − 2 óra
sc. Dexamethason napok 1
28 30 27 29
14
31
in. LPS ip. OVA (szenzitizáció) 1% OVA (provokáció) RL mérése, mintagyűjtés 1. ábra: Az egyes kezelések, valamint a mérés és mintagyűjtés időzítése a II. és III. kísérletben.
40
2.1.2.3. Lps kezelés és előkezelés (priming) Az intranasalis (in.) Lps instillatio Szarka és mtsai által korábban leírt módszer alapján történt [308]. Az egereket egy étergőzzel telt edényben altattuk el. Ily módon körülbelül 1 percig tartó anesztézia érhető el, mialatt 3 X 20 µL Lps oldatot pipettáztunk ismétlő pipettával az orrjáratokra (részben az orrjáratokba). Az állatok az oldat jelentős részét aspirálták, majd ezt követően függőleges helyzetben tartottuk őket, amíg fel nem ébredtek. A kezelés alkalmával 10 µg (055:B5 szerotípusú) Escherichia coli Lps-t adtunk be 167 µg / mL PBS-es oldatban (ami megfelel 5·104 EU-nak Limulus lysate assayjel mérve). A kontroll állatok minden esetben tiszta PBS-t kaptak. A kezelések időzítését a különböző kísérleti rendszerekben, lásd később a „Kísérleti terv” című fejezetben (2.1.2.11.). 2.1.2.4. Szteroid kezelés A szteroiddal kezelt állatcsoportok szubkután (sc.) dexamethason nátriumfoszfát (Oradexon – Organon, Oss, Hollandia) injekciót kaptak két napon keresztül, naponta egyszer 5 mg/kg dózisban. A gyógyszert összesen 100 µL térfogatban, fiziológiás sóoldatban hígítva kapták. Placebo kezelésként 100 µL fiziológiás sóoldatot adtunk a megfelelő csoportoknak. Korábban kimutatták, hogy a dexamethason ebben a dózisban, hasonló kísérleti rendszerben képes az allergiás légúti gyulladás és LHR jelentős gátlására [309]. A kezelések időzítését lásd később a „Kísérleti terv” című fejezetben (2.1.2.11.). 2.1.2.5. 1400W kezelés Az N-(3-(Aminometil) benzil) acetamidin (1400W) szelektív iNOS bénító, amelynek hatékonysága (in vitro) az iNOS-on több mint 5000-szer nagyobb, mint az eNOS-on és mintegy 200-szor nagyobb, mint az nNOS-on [306]. Az 1400W-t a kezelt állatcsoportok 2 mg/kg dózisban, sc. kapták összesen 100 µL térfogatban, PBS-ben hígítva. Placebo kezelésként 100 µL PBS-t adtunk a megfelelő csoportoknak. Az 1400W adagolását a Garvey és mtsai által [306] patkányokon alkalmazott dózis alapján számoltuk ki, figyelembe véve az állatok anyagcsere testméretét [307]. Az 1400W-t a kísérlet befejező napján (III. kísérlet, 31. nap) adtuk mintegy 2 órával a RL mérés előtt,
41
mivel az iNOS akut blokkolásának hatásait kívántuk feltárni. További részletek a kezelés időzítéséről a „Kísérleti terv” című fejezetben (2.1.2.11.). 2.1.2.6. Tüdőellenállás (RL) mérése A légúti reaktivitást – illetve LHR-t, – azaz a methacholin (MCh: acetil-β metilkolin klorid) hatására bekövetkező RL-változást invazív módon, géppel lélegeztetett állatokon mértük. Az egereket ip. adott 72 mg/kg Nembutállal (pentobarbitál nátrium) altattuk el. Ez az altatószer minimum 1 órás mély (sebészi) anesztéziát biztosít. A nyak bőrét elöl, a középvonalban egy kb. 1 cm-es hosszanti metszéssel nyitottuk meg, majd a lágyrészek tompa preparálását követően végeztük el a tracheotomiát. Az állatot 24G átmérőjű kanüllel (BD, San Jose, CA, USA) intubáltuk. Ezt követően a műtéti metszést bal haránt irányba meghosszabbítottuk egészen a vena jugularis várható helyéig. A tompán kipreparált vénát distalisan lekötöttük, lumenébe egy kanült (ID: 0,28 mm, OD: 0,61 mm SIMS Portex, Hythe, Kent, Anglia) helyeztünk. A kanül végéhez (Y csatlakozó segítségével) 50 µL-es mikrofecskendőt (Hamilton, Reno, USA) és egy infúziós pumpát csatlakoztattunk. Ezt követően az állatot egy teljestest-pletizmográfba helyeztük (Buxco Electronics, Sharon, CT, USA) és 150/perc frekvenciával, 6 mL / kg légzési térfogattal lélegeztettük (respirátor típusa: Inspira, Harvard Apparatus, Holliston, MA, USA). A tracheakanült 4-utas csatlakozó segítségével kötöttük össze a respirátor ki és bemeneti szárával, valamint a berendezéshez
tartozó
folyadék/gáz
nyomáskülönbség-mérő
száraz
(gázfázisú)
bemenetével. Ugyanezen szenzor nedves (folyadékfázisú) bemenetéhez egy vízzel telt nyomásmérő kanült csatlakoztattunk (ID:0,86 mm, OD: 1,27 mm, Intramedic PE-90, BD, San Jose, CA, USA) melyet az égér nyelőcsövébe vezettünk a pleuraűr magasságáig. Ily módon – közelítőleg – a transpulmonalis nyomás értékét tudtuk leolvasni a nyomásszenzor kimenetén. Az állathoz csatlakozó kanülöket a pletizmográf plexikamrájának erre a célra kialakított, légzáró ki- és bemeneti nyílásain vezettük keresztül, így biztosítva hogy légáramlás csak a beépített pneumotachográf-membránon keresztül történjen. A mérések előtt végzett kalibrálás során a készülék meghatározta az 1 mL levegő befecskendezése alatti nyomásváltozás-görbét, kiszámolta a membrán aktuális ellenállását, így képessé vált az állat mellkasmozgása által keltett nyomásváltozásból a légátáramlás kiszámítására. A fenti paramétereket, valamint az
42
egységnyi transpulmonalis nyomás hatására létrejövő légáramlás, azaz a tüdőellenállás (RL; H2Ocm / mL / s) értékét a szoftver (BioSystem XA, Buxco Electronics, Sharon, CT, USA) folyamatosan rögzítette. Az állatokat intravénás (iv.) MCh infúzióval provokáltuk, így határoztuk meg a légúti válaszkészséget (reaktivitást). Az alapvonal (fiziológiás sóoldat infúziója közben végzett) rögzítése után az egymást követő MCh dózisokat kétpercenként, bólusban infundáltuk a vena jugularisba. A provokációt nemkumulatív módon végeztük, mivel az egyes MCh adagok után minden esetben megvártuk, amíg az RL értéke újra stabilizálódik az alapvonal körül (≤ 120%). A kezdődózis 43 µg/kg volt, ezután a MCh adagja mindig háromszorosára emelkedett, hasonlóan a korábban leírt protokollhoz [310]. Az egyes MCh adagokat mikrofecskendővel a kanülbe injektáltuk, majd a perfúzor segítségével bemostuk a vena jugularisba. Ezt követően a RL meredeken emelkedett, majd elérte a csúcsértéket és rövid időn belül újra leesett közelítőleg az alapvonal értékéig. A kiértékelés során az egyes MCh dózisok beadása után mérhető RL csúcsértékét használtuk a válaszkészséget meghatározó mutatóként. 2.1.2.7. Bronchoalveolaris lavage (BAL) A légúti reaktivitás mérése után végeztük a bronchoalveolaris lavaget. Az állatok tracheakanüljére csatlakoztatott fecskendővel 600 µL steril, izotóniás, pH 7,4-es PBS-t injektáltunk a bronchoalveolaris térbe, majd 1 perc elteltével visszaszívtuk a folyadékot. Összesen háromszor ismételtük ezt meg, és a teljes beinjektált mennyiség átlagosan 81,9 ± 0,7%-át sikerült visszanyerni. A BAL folyadékot (BALF) 700 g-vel centrifugáltuk 10 percig 4ºC-on, majd a felülúszót több részre osztva ¯80ºC-ra fagyasztottuk a további mérésekig. A sejteket PBS-ben vettük fel, majd a sejtszuszpenzió egy részét azonos mennyiségű 0,4%-os tripánkék festékkel (Sigma, Budapest, Magyarország) kevertük össze. A sejteket Bürker kamrában számoltuk meg, és az összsejtszámot a hígítások figyelembevételével számoltuk ki. A maradék sejtszuszpenziót tovább hígítottuk PBS-sel és cytocentrifugával (Hettich-Zentrifugen, Tuttlingen, Németország) tárgylemezre centrifugáltuk a sejteket. A preparátumokat Quick Panoptic (Cypress, Langdorp, Belgium) hematológiai festékkel festettük, és a sejtes
összetételt
fénymikroszkóp
alatt
azonosításával.
43
határoztuk
meg
minimum
300
sejt
2.1.2.8. Szövettan A bronchoalveolaris lavaget követően az állatok mellkasát megnyitva 3 mL PBS-t fecskendeztünk a jobb kamrába, perfundálva ezzel a tüdőt, eltávolítva a vér jelentős részét az erekből. A tüdőt fixáló oldattal (4% pufferolt formaldehid, pH 7,4) töltöttük meg a tracheán keresztül, majd – kivéve a mellüregből – 24 óráig fixáltuk a fenti oldatba merítve. Dehidrálás és parafinba ágyazás után 5 µm vastagságú metszeteket festettünk hematoxilin-eosinnal. A perivascularis és peribronchialis eosinophil infiltratumokat fénymikroszkóp alatt értékeltük az alábbi szemikvantitatív pontrendszer szerint [311]: 0.: eosinophil festődésű sejtek teljes hiánya 1.: néhány, elszórtan található eosinophil sejt a légutak és az erek körül 2.: gyakran, több helyen látható eosinophil infiltratio, majdnem minden eosinophil sejt valamely a légutakat és/vagy ereket körülvevő egy sejtsornyi sejtréteg tagjaként azonosítható 3.: Az eosinophil infiltratio közepes sűrűségű, az eosinophil sejtek főként a légutak és az erek legalább egyharmadát körülvevő, legalább 10 µm széles sávban találhatók 4.: Kifejezett eosinophil infiltratio a legtöbb légút és ér körül, de az infiltratumok az esetek többségében elválaszthatók egymástól. 5.: Kifejezett eosinophil infiltratio, a perivascularis és peribronchialis infiltratumok legalább egynegyede nem választható szét egymástól (konfluál) A morfometriai analízist (a fenti pontrendszer szerint) dr. Nagy Andrea patológus szakorvos végezte. Az értékelés randomizált metszeteken, vakon történt, azaz a vizsgáló nem ismerte az egyes állatok kísérleti csoport szerinti besorolását. 2.1.2.9. Nitrát és nitrit mérések A BALF felülúszók nitrát és nitrit koncentrációját kapilláris elektroforézissel, a Szökő É és mtsai által leírt új módszerrel mértük [312]. A minta-indukált átmeneti izotachoforézis
prekoncentráció
alkalmazásával
kis
mennyiségű
(akár
szubmikromoláris) nitrit és nitrát is pontosan mérhető biológiai mintákból. A mérés menete röviden a következő volt:
44
Az oxihemoglobin, vagy más ferro-hemoproteinek képesek a nitritet nitráttá alakítani, ezért a minták fehérjementesítése kívánatos volt. Ennek érdekében a BALF felülúszókat kiolvasztás után ötszörösen hígítottuk 0,1 M NaOH-val, ami azonnal denaturálja a fehérjéket, majd a pH-t azonos mennyiségű 0,09 M ecetsavval 7 körüli értékre állítottuk és a mintákat lecentrifugáltuk. A NaOH oldat 100 µM káliumbromátot is tartalmazott, amely a későbbiekben belső standardként (BS) szolgált. Előzetes kísérletek kimutatták, hogy ez a minta-előkészítési procedúra nem okoz szignifikáns veszteséget az analitok mennyiségében, viszont hatékonyan gátolja meg a nitrit-nitrát átalakulást biológiai mintákban. A fenti protokoll további eredménye, hogy egyúttal egy pH 7 körüli acetát-NaOH puffer rendszert hoztunk létre a minta eredeti PBS vivőanyaga mellett. Ily módon a kapillárisba kerülő minta egyszerre tartalmazott nagy elektroforetikus mozgékonyságú kloridot, és kis mozgékonyságú acetátot, míg az analitok mobilitása az előbbi kettő közé esett. Ilyen feltételek mellett az elektromos áram hatására egyenetlen térerő-eloszlás jön létre. A nagy mobilitású Cl− (vezető – leading – ion) képezte zónában a feszültségesés kicsi, a térerő gyenge. Ugyanakkor a kis mobilitású CH3-COO− (záró – terminating – ion) zónájában jelentősebb feszültségesés és nagy térerő alakul ki. Az analitionok – mozgékonyságuknak megfelelően – a fenti két zóna között kialakuló térerő gradiens hatására keskeny sávokba rendeződnek, és felzárkóznak a vezetőion után. A fenti módszer az izotachoforézis (ITP), mely során a nagyobb térfogatú mintában, alacsony koncentrációban jelenlévő analitionok keskeny zónákban koncentrálódnak, ami jelentősen növeli az érzékenységet. Jelen esetben minta-indukált ITP alakult ki, mivel mind a vezető, mind a záró ion az előkészített mintában volt jelen. A 85 cm hosszú (a detektorig 75 cm), bevonat nélküli, öntött kvarc kapillárist (Polymicro Technology, Phoenix, AZ, USA, belső átmérő 75 µm, külső átmérő 365 µm) 30 mM pH 3,8 szulfát – β-alanin pufferrel töltöttük meg. Ez az elválasztó puffer az analitionok vándorlását lényegesen nem befolyásolta és ezen a pH-n a nitrát, nitrit és a BS (bromát) rövid idő alatt, egymástól jól elkülöníthető csúcsokat adtak. A minta a nyomásvezérelt (6 psi, 33 másodperc) feltöltés után a kapilláris kb. 30%-át foglalta el. Az áram (40 µA állandó áramerősség, 20 °C) bekapcsolását követően átmenetileg az ITP prekoncentráció (stacking) zajlik a mintában, majd ezt követően az elválasztó pufferhez érve az ionok szétválnak elektroforetikus mobilitásuk (méret és töltés) szerint,
45
azaz a folyamat átalakul zóna-elektroforézissé, ami jelentősen megkönnyíti a kiértékelést. Az egyes mérések között a kapillárist 1M NaOH oldattal, majd vízzel és az elválasztó pufferral mostuk (30 psi nyomással) egymás után, mindegyikkel 1-1 percig. A méréseket UV detektorral (214 nm) felszerelt P/ACE MDQ kapilláris elektroforézis automatával végeztük, melyet 32 Karate version 5.0 (Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA) programmal vezéreltünk. A BAL-hoz használt PBS felhasználásával ismert koncentrációjú nitrit és nitrát oldatokat (standard hígítási sort) készítetünk, majd kálium-bromát BS-t adtunk hozzájuk (azonos mennyiségben, mint a minták esetében). Az így készített kalibrációs görbét használtuk a minták nitrit és nitrát koncentrációjának meghatározására. Mind a standardok, mind a minták esetében az analit és a BS detekciós görbéinek görbe alatti terület-arányával számoltunk. A kimutatási határ 0,2 µM volt a nitrát és 0,3 µM a nitrit esetében. A BALF nitrit koncentrációja jó mutatója a tüdőben zajló NO szintézisnek, mivel oxigéntartalmú vizes oldatban az NO elsődlegesen nitritté alakul át. A további oxidációhoz (nitrát képződéséhez) oxihemoglobin, vagy más ferro-hemoproteinek jelenléte szükséges [313]. Ezt a folyamatot az alábbi 3 módszerrel igyekeztünk megakadályozni: 1. atraumatikus mintavételi technika alkalmazásával elkerültük a BALF vérrel szennyeződését, 2. a sejtes elemektől centrifugálással szétválasztott felülúszót gyorsan ¯80ºC-ra fagyasztottuk, 3. a kiolvasztás után a mintákat fehérjementesítettük. Mivel az állatokat konvencionális, nitrátot is tartalmazó kisrágcsáló-tápon és csapvízen tartottuk, a táplálék-eredetű bevitel egyformán magas nitrátszinteket eredményezett az összes vizsgálati csoport BALF mintáiban. 2.1.2.10. Cytokin mérések A BALF felülúszók IL-4, IL-5, IL-13, INF-γ, TNF-α és GM-CSF koncentrációját kereskedelmi forgalomban kapható szendvics-ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) kitekkel határoztuk meg. Az analíziseket a gyártói használati utasítások alapján végeztük. A mérés menete röviden a következő volt [314]: A vizsgálandó cytokin ellenes, monoklonális (illetve az IL-13 esetében poliklonális) befogó- (capture-) antitestekkel bevont (coated), 96 mérési helyes Takátsi (mikrotiter) lemezek egyes csöveibe (wells) bemértük a vak oldatot, a standardokat
46
valamint az előkészített mintákat duplikátumban, majd az előírás szerint inkubáltunk. Ezalatt az antitestek megkötötték a mintában, illetve a standardokban található analitmolekulákat. Mosást követően, a második lépésben szintén az adott cytokin ellenes, de biotinnal konjugált antitestoldatot pipettáztunk a csövekbe, majd inkubáció és mosás után sztreptavidinhez kötött tormaperoxidáz enzimet adtunk hozzá. Az sztreptavidin-biotin kapcsolódás révén a megkötődött második antitestek enzimmel jelöltté váltak. Az IL-13 mérés annyiban különbözött ettől, hogy a tormaperoxidázzal kapcsolt második antitestet használtunk. Az egyes inkubációk utáni mosások alkalmával eltávolítottuk a nem kötődő reagenseket, így biztosítva, hogy csak a specifikus antigénantitest reakcióban résztvevő, illetve a sztreptavidin-biotin kölcsönhatás révén kötődő anyagok maradjanak a rendszerben. Az utolsó lépésben hidrogén-peroxid és tetrametilbenzidin (kromogén) keverékét mértük a csövekbe, melyekből az enzimreakció során (10-20 perc alatt) színes termék keletkezett. A reakciót foszforsav, illetve sósav (IL-13) hozzáadásával állítottuk le. A savas pH-n, 450 nanométeren mérhető abszorbancia ebben a mérési rendszerben egyenesen arányos a mintában lévő cytokinkoncentrációval. A finomított analitból készített hígítási sort (standardokat) szintén felvittük a lemezekre minden mérésnél, így határoztuk meg az abszorbancia-koncentráció összefüggést (lineáris regresszióval). A kimutatási határértékek a következők voltak (gyári adatok): IL-4: 3 pg / mL, IL-5: 5 pg / mL, IL-13: 1.5 pg / mL, IFN-γ: 8 pg / mL, TNF-α: 4.5 pg / mL és GM-CSF: 3 pg / mL. Előkísérleteinkben megállapítottuk, hogy a BALF-ban található nyák esetenként megakadályozhatja a mérést, valamint a minta alacsony albuminkoncentrációja jelentős nemspecifikus antitestkötődést eredményezhet (mivel a kitek validálását eredetileg magas fehérjetartalmú szérumra és sejtkultúrás táptalajra végezték). Mindezek alapján az alábbi minta-előkészítési protokollt vezettük be: A mintákhoz kiolvasztás után 10%-os BSA oldatot adtunk 9:1 arányban, majd géz-szűrőn centrifugáltuk át őket [315]. Ezzel a módszerrel a mintákban 1%-os BSA koncentrációt hoztunk létre (ami jelentősen csökkentette a nemspecifikus kötődést) továbbá sikerült a nyákot eltávolítani. A minta hígulását figyelembe vettük az eredmények értékelésekor. Belső standardok rendszeres futtatásával ellenőriztük a minta-előkészítés hatását, és arra a következtetésre jutottunk, hogy a fenti procedúra nem befolyásolta jelentősen a vizsgált cytokinek mennyiségét a mintákban.
47
2.1.2.11. Kísérleti terv Három egymást követő, részben egymásra épülő állatkísérletet végeztünk. Az alábbiakban megadjuk az egyes kísérleti rendszerekben használt állatcsoportok részletes leírását, az alkalmazott kezeléseket (1. ábra), egyedszámokat és hogy milyen méréseket végeztünk el. I. Lps-keltette légúti gyulladás és LHR vizsgálata. Állatcsoportok (n=8 / csoport): CLPS: kontroll, intranasalis PBS (placebo) kezelés 24 órával az RL mérés és a BAL előtt. LPS 24h: intranasalis Lps kezelés 24 órával az RL mérés és a BAL előtt. LPS 96h: intranasalis Lps kezelés 96 órával az RL mérés és a BAL előtt. A BALF sejtek kvalitatív és kvantitatív értékelése és az LHR meghatározása minden állat esetében megtörtént. II. Lps előkezelés hatása a légúti gyulladásra, LHR-re és a szteroid-válaszkészségre allergizált egérben Állatcsoportok (n=12-14 / csoport): C: kontroll (csak placebo kezelések) LPS: intranasalis Lps kezelés 96 órával az RL mérés és a BAL előtt – a szenzitizáció és légúti provokáció csak placeboval (PBS) történt OVA: Ova szenzitizáció és provokáció (allergizálás) – intranasalis előkezelés csak placeboval (PBS) LPS/OVA: Ova szenzitizáció, intranasalis Lps előkezelés (96 órával az RL mérés és a BAL előtt) és Ova provokáció OVA+DEX: Az Ova provokáció 2. és 3. napján sc. dexamethasonnal kezelt OVA állatok LPS/OVA+DEX: Az Ova provokáció 2. és 3. napján sc. dexamethasonnal kezelt LPS/OVA állatok Minden OVA és LPS/OVA állat sc. fiziológiás só injekciót kapott (placeboként) az OVA+DEX és LPS/OVA+DEX állatok Dex kezelésével egy időben.
48
A BALF sejtek kvalitatív és kvantitatív értékelése, a felülúszó cytokin és nitrit (nitrát) koncentrációjának meghatározása és a tüdő szövettani vizsgálata minden állat esetében megtörtént. Az LHR-t az egyedek felénél mértük meg (az állatokat véletlenszerűen választottuk ki, n= 6-8). III. 1400W akut (2 órás) hatása az LHR-re. Állatcsoportok (n=6-8 / csoport): C, LPS, OVA és LPS/OVA csoportok mint az előbbi (II.) kísérleti rendszerben, kivéve, hogy az utóbbi két csoport állatai az 1400W kezelésekkel egyidőben kaptak sc. placebo (PBS) injekciót. OVA+1400W: Ova szenzitizáció és provokáció (allergizálás), sc. 1400W (2 órával az RL mérés és a BAL előtt) LPS/OVA+1400W: Ova szenzitizáció, intranasalis Lps előkezelés és Ova provokáció, majd sc. 1400W (2 órával az RL mérés és a BAL előtt) A BALF sejtek kvalitatív és kvantitatív értékelése és az LHR meghatározása minden állat esetében megtörtént. Mivel a II. és III. kísérlet C, LPS, OVA és LPS/OVA állatainak BALF sejtszámai és LHR-je között nem volt szignifikáns különbség, ezeket a csoportokat a kiértékelés során összevontuk. 2.1.2.12. Statisztika A normál eloszlást mutató adatokat átlag ± átlag szórása (SEM: standard error of the mean) formátumban, míg az ordinalis skála felhasználásával becsült eredményeket (szövettani pontrendszer) a medián és (zárójelben) az interkvartilis terjedelem feltüntetésével adtuk meg. Egyutas varianciaanalízist (ANOVA-t) alkalmaztunk az előbbi, és Kruskal-Wallis tesztet az utóbbi esetben a csoportok közötti különbség meghatározására. A csoportok páronkénti összehasonlítását a paraméteres próba esetén Neumann-Keuls, míg a nem-paraméteres esetében Dunn post-hoc teszttel végeztük.
49
2.1.3. Eredmények 2.1.3.1. Légúti gyulladás Az I. kísérletben az intranasalis Lps instillatio átmeneti (1-2 napig tartó), súlyos neutrophil légúti gyulladást és LHR-t okozott. Kilencvenhat órával a kezelés után (LPS 96h) mérsékelten emelkedett macrophag számot és kisebb mennyiségben neutrophileket találunk a BALF-ban. Az LHR ekkorra már lecsengett (2. ábra).
-1
BALF Sejtek (µL )
2500
*
Összsejtszám Neutrophil Lymphocyta Macrophag Eosinophil
2000 1500 1000
#
B
40
#
*
CLPS
-1
*
-1
A
RL (H2Ocm ml s )
3000
LPS 24h LPS 96h
30
*
20
*
10
*
500
* 0 Baseline
0 CLPS
LPS 24h
LPS 96h
1,63
2,11
2,59
3,07
Methacholin (log dózis, µg kg-1)
2. ábra: Az I. kísérlet eredményei. A.: A BALF mennyiségi és minőségi sejtösszetétele placebo-kezelést követően (CLPS), valamint 24 illetve 96 órával az Lps kezelés után (LPS 24h, LPS 96h). *: p<0,01 vs. CLPS és LPS 96h. #: p<0,05 vs. CLPS és LPS 24h (n=8/csoport). B.: Az Lps hatása az LHR-re (a tüdőellenállás – RL – változásra) ugyanezekben a csoportokban. 24 órával az Lps kezelés után (LPS 24h) LHR alakul ki, ami 96 órával a kezelést követően már nincs jelen (LPS 96h). *: p<0,01 LPS 24h vs. CLPS és LPS 96h (n=8/csoport). Az RL nyugalmi alapértékei szintén megemelkedtek p<0,01 LPS 24h (3,25 ± 0,28) vs. CLPS (2,23 ± 0,16) és LPS 96h (2,02 ± 0,08).
A II. és III. kísérletben az OVA (allergizált) állatokban – az Ova inhalációt követően – jelentősen megnőtt a BALF eosinophil és macrophag sejtszáma. Az LPS/OVA állatokban viszont a macrophagok, lymphocyták és különösen az eosinophil granulocyták száma nagyobb mértékben emelkedett, mint az OVA egerekben, tehát az egy nappal az Ova inhalációk előtt alkalmazott intranasalis Lps instillatio (priming) szignifikánsan súlyosbította a légúti gyulladást és kiváltképp annak eosinophil jellegét (4. ábra). A perivascularis és peribronchialis eosinophil infiltratumok szövettani metszeteken végzett értékelése kimutatta, hogy bár az LPS csoportban is előfordultak eosinophil sejtek a légutak és az erek körül, szemikvantitatív pontértékük alapján ezek az állatok nem különböztek szignifikánsan a kontroll egerektől (C: 0,5 (0–1); LPS: 2 (1–2); p>0,05 C vs. LPS).
50
C
LPS
OVA
LPS/OVA
OVA+DEX
LPS/OVA+DEX
3. ábra: Reprezentatív szövettani felvételek. A C és LPS csoportokban nem jött létre jelentős elváltozás. Az allergizálás hatására (OVA) kiterjedt peribronchialis és perivascularis eosinophil- és kereksejtes beszűrődés alakult ki. Az Lps előkezelést követően még súlyosabb fokú infiltrációt találtunk (LPS/OVA). A gyulladásos infiltráció Dex-kezelés hatására jelentősen mérséklődőtt az OVA+DEX állatokban, míg az LPS/OVA+DEX egerek esetében a csökkenés kisebb mértékű.
51
Az
OVA
és
LPS/OVA
csoportokban
azonban
kiterjedt
eosinophil
infiltratumokat találtunk a morfometriai analízis során (OVA: 3,5 (3–4); LPS/OVA: 4 (3–4); p<0,05 vs. C és LPS – 3. ábra)
†
-1
BALF Sejtek (µL )
#
Összsejtszám Neutrophil Lymphocyta Macrophag Eosinophil
2000
1500
ns †
¶
#
*
1000
†
¶
#
*
500
§
#
† †
0
*#
* C
LPS
OVA
§
¶ §
†
LPS/OVA OVA +DEX
¶
LPS/OVA +DEX
4. ábra: A BALF mennyiségi és minőségi sejtösszetétele a II. és III. kísérletben. Az eosinophil sejtszaporulatot súlyosbította az Lps előkezelés Ova szenzitizált és provokált állatokban (LPS/OVA). A Dex kezelés (5 mg/kg/nap) jelentősen csökkentette az eosinophil és macrophag sejtszámokat OVA egerekben (OVA+DEX). A Dex az LPS/OVA+DEX állatokban a gyulladásos sejtszámokat a kezeletlen OVA állatok esetében talált értékig csökkentette. *: p<0,05 vs. C; #: p<0,01 vs. C és LPS; †: p<0,05 vs. OVA; §: p<0,05 vs. LPS/OVA+DEX; ¶: p<0,05 vs. LPS/OVA; ns: p>0,05 vs. OVA minden típusú sejt esetében. (A II. és III. kísérlet C, LPS, OVA és LPS/OVA csoportjaiban talált BALF sejtszámok között nem volt szignifikáns különbség, ezért ezeket az eredményeket összesítve mutatjuk be. n=18-20 a C, LPS, OVA és LPS/OVA csoportokban; n=12-14 az OVA+DEX és LPS/OVA+DEX csoportokban).
2.1.3.2. Nitrát és nitrit A II. kísérlet csoportjai között különbség mutatkozott a BALF nitrit koncentrációjában. Kissé emelkedett NO2 szintet mértünk az LPS állatok esetében. Ennél magasabb volt az NO2 koncentrációja az OVA, és a legmagasabb az LPS/OVA csoportban. Az Lps előkezelés tehát fokozta az Ova inhaláció utáni NO2 képződést szenzitizált állatokban. (5. ábra) A BALF nitrát koncentrációja nem különbözött az egyes csoportok között (a C, LPS, OVA, LPS/OVA, OVA+DEX és LPS/OVA+DEX csoportok nagy átlaga: 10,46 ± 0,3 µM volt).
52
10
#†
ns
-1
BALF Nitrit (µmol L )
8
6
#
4
*
†
2
0 C
LPS
OVA
LPS/OVA OVA +DEX
LPS/OVA +DEX
5. ábra: Eredmények a II. kísérletből. A BALF nitritkoncentrációja 96 órával az Lps-kezelés után még meglehetősen magas. Az Ova szenzitizált és provokált állatokban (OVA) magasabb a nitritszint, mint a C és az LPS csoportokban. A két kezelés kombinációja (LPS/OVA) hozta létre a legmagasabb nitritkoncentráció emelkedést. A Dex kezelés csökkentette a BALF nitrit mennyiségét Ova-allergizált állatokban (OVA+DEX), viszont nem bizonyult hatékonynak az Lps előkezelt allergizált csoportban (LPS/OVA+DEX). *: p<0,01 vs. C; #: p<0,01 vs. LPS; †: p<0,01 vs. OVA; ns: p>0,05 vs. LPS/OVA (n=12-14).
2.1.3.3. Cytokinek A II. kísérletben – a várakozásnak megfelelően – kifejezetten emelkedett az IL4, IL-5 és IL-13 koncentrációja az OVA állatok BALF-jában. Ugyanakkor az OVA-hoz képest az LPS/OVA egerekben az IL-4 és IL-13 szintje kisebb volt, míg az IL-5 koncentrációját azonosnak találtuk a két csoportban. Az Lps kezelés önmagában nem okozott szignifikáns változást ezen cytokinek szintjében (6. ábra). A BALF IFN-γ, GMCSF és TNF-α koncentrációja a kimutatási határ alatt maradt minden csoportban. Az Lps által kiváltott esetleges Th1 cytokinválasz ebben a kísérleti rendszerben (96 órával az Lps kezelés után) nem volt kimutatható.
53
350
30
-1
BALF IL-4 (pg mL )
300 -1
25
*
250
20
*
200
#
15
150
#
10
#
100 †
5 0
BALF IL-5, IL-13 (pg mL )
IL-4 IL-5 IL-13
50
C
LPS
OVA
LPS/OVA
OVA +DEX
LPS/OVA +DEX
0
6. ábra: Eredmények a II. kísérletből. A Th2-es cytokinek koncentrációja a BALF felülúszóban. Az IL4 és IL-13 szintjét jelentősen csökkentette az Lps előkezelés az Ova szenzitizált és provokált állatokban (LPS/OVA) az OVA egerekhez viszonyítva. Ugyanakkor az IL-5 koncentrációja nem változott. A Dex mindegyik cytokint részarányosan csökkentette mind az OVA+DEX, mind az LPS/OVA+DEX állatokban. *: p<0,05 vs. C és LPS; #: p<0,05 vs. OVA; †: p<0,05 vs. LPS/OVA (n=12-14).
2.1.3.4. Légúti reaktivitás Bár az Lps kifejezett LHR-t okoz 24 órával a kezelés után, később, 96 óra múlva már nem eredményezett fokozott légúti válaszkészséget iv. MCh provokációval szemben. (2 / B. és 7 /A. ábra). A szenzitizált és allergénprovokált OVA állatokban ezzel szemben a – modellre jellemző – kifejezett LHR fejlődött ki (a II. és III. kísérletben). Az RL mintegy négyszer nagyobb mértékben emelkedett a két legnagyobb MCh dózis hatására, mint a C és LPS állatokban Ugyanakkor az LPS/OVA állatokban csak egy kisebb mértékű LHR alakult ki. A RL emelkedés mértéke körülbelül fele volt az OVA csoportban tapasztalhatónak (7 /A. ábra). 2.1.3.5. A dexamethason hatásai A Dex hatékonyan csökkentette az eosinophil légúti gyulladást az OVA allergizált állatokban (4. ábra, OVA+DEX). Bár az LPS/OVA egerek esetében a Dex kezelés szintén csökkentette a sejtes gyulladást (4.ábra, LPS/OVA+DEX), az eosinophil és macrophag sejtszámok mégis szignifikánsan magasabbak voltak ezekben
54
A C LPS OVA LPS/OVA
30
-1
-1
RL (H2Ocm mL s )
40
* *
*
20
# 10
0 Baseline
1,63
2,11
2,59
3,07 -1
Methacholin (log dózis, µg kg )
B
30
C 30
OVA OVA+DEX OVA+1400W
20
#
* 10
0 Baseline
*
RL (H2Ocm mL-1 s-1)
RL (H2Ocm mL-1 s-1)
40
LPS/OVA LPS/OVA+DEX LPS/OVA+1400W
20
10
*
1,63
2,11
2,59
0 Baseline
3,07
Methacholin (log dózis, µg kg-1)
1,63
2,11
2,59
3,07 -1
Methacholin (log dózis, µg kg )
7. ábra: Eredmények a II. és III. kísérletből. A. Az Lps előkezelés hatása az LHR-re (a tüdőellenállás – RL – változásra). Az Lps előkezelt, Ova szenzitizált és provokált állatok (LPS/OVA) légúti válaszkészsége kisebb, mint az OVA egereké. *: p<0,001 vs. C és LPS; #: p<0,01 vs. OVA. B. A Dex és az 1400W (iNOS inhibitor) hatása az Ova szenzitizált és provokált (OVA) állatok LHR-jére. Az 1400W jobban véd az LHR-rel szemben, mint a Dex. *: p<0,05 vs. OVA; #: p<0,05 vs. OVA+DEX. C. A Dex és az 1400W hatása az Lps előkezelt, Ova szenzitizált és provokált (LPS/OVA) állatok LHR-jére. Az LHRt sem a Dex, sem az 1400W nem csökkentette szignifikánsan. (n=14-16 a C, LPS, OVA és LPS/OVA csoportokban; n=6-8 az OVA+DEX, LPS/OVA+DEX, OVA+1400W és LPS/OVA+1400W csoportokban).
az egyedekben, mint az OVA+DEX csoportban. Figyelemreméltó ugyanakkor, hogy az LPS/OVA+DEX és az OVA (szteroiddal nem kezelt) csoportokban a fenti két sejttípus esetében egyformán magas sejtszámokat találtunk. Az eosinophil infiltratumok szövettani
metszeteken
végzett
értékelése
megerősítette
a
BALF
vizsgálati
eredményeket (OVA+DEX: 1 (1–1); p<0,001 vs. OVA; LPS/OVA+DEX: 2 (2–2); p<0,05 vs. C és LPS/OVA – 3. ábra). Az LPS/OVA+DEX és az OVA egerek szemikvantitatív pontértéke szintén hasonló volt egymáshoz (p>0,05). A BALF
55
nitritkoncentrációját hatékonyan csökkentette a Dex az OVA+DEX állatokban, ugyanakkor nem befolyásolta szignifikánsan az LPS/OVA+DEX egerekben (5. ábra, p>0,05 vs. LPS/OVA). A gyulladásos sejtszámok és a nitrit esetében tapasztaltakkal ellentétben mindhárom vizsgált Th2-es cytokin BALF-ban mérhető szintjét arányosan csökkentette a Dex mind az OVA+DEX, mind az LPS/OVA+DEX egerekben a szteroiddal nem kezelt párjaikhoz (OVA és LPS/OVA) viszonyítva (6. ábra). A tisztán allergizált állatok LHR-jét jelentősen csökkentette a Dex (OVA+DEX), míg az LPS/OVA egerek esetében csak egy kisebb mértékű (nem szignifikáns) mérséklődést figyeltünk meg (LPS/OVA+DEX, 7 / B. és C. ábra). 2.1.3.6. Az 1400W hatásai A III. kísérletben az 1400W – szelektív iNOS inhibitor – LHR-re gyakorolt hatását vizsgáltuk OVA és LPS/OVA egereken. Az állatok egyetlen 1400W injekciót kaptak 2 órával az RL mérés előtt. Az OVA állatok esetében az LHR hatékonyabb gátlószerének bizonyult ez az anyag (egyszeri dózisban), mint a két napig alkalmazott nagydózisú Dex-kezelés (OVA+1400W, 7 / B. ábra). Az LPS/OVA egereknél viszont – a
Dex-hez
hasonló
módon
–
kevéssé
bizonyult
hatékonynak
az
1400W
(LPS/OVA+1400W, 7 / C. ábra). A BALF sejtszám-értékeit egyik vizsgálati csoportban sem befolyásolta az alkalmazott rövidtávú 1400W kezelés. Az OVA és OVA+1400W valamint az LPS/OVA és LPS/OVA+1400W csoportok BALF minőségi és mennyiségi sejtösszetétele (páronként) gyakorlatilag azonos volt (az adatokat nem mutattuk be).
2.1.4. Megbeszélés és következtetések Atópiás asthmásokban végzett klinikai megfigyelések azt mutatják, hogy a tünetek gyakran társulhatnak kevert etiológiájú (pl.: allergén és Lps együttes expozíciója által kiváltott) légúti gyulladáshoz [42;43;249;292]. Az allergiás eredetű és az Lps-inhalációt követően fellépő légúti gyulladás közötti kölcsönhatás kérdése azonban meglehetősen vitatott, mivel a szenzitizáció környékén adott Lps-sel blokkolható a kísérletes asthma kialakulása [224;225]. Többek között ez a megfigyelés alapozta meg az asthma kóreredetét magyarázó egyik elméletet, az úgynevezett higiénéhipotézist. Eszerint a Th1-es és Th2-es cytokinek közötti antagonizmus révén a korai
56
Lps kezelés gátolhatja az allergia kialakulását [25]. Klinikai szempontból azonban a korai Lps expozíció szerepe az asthma megelőzésében nem ennyire egyértelmű. Egy prospektív vizsgálatban kimutatták, hogy asthmával vagy más allergiás betegségekkel szemben örökletesen fogékony (0-1 éves) gyermekek esetében az otthoni (házipor) Lps expozíció független rizikófaktora bármely (esetenként ismétlődő) nehézlégzésnek [42]. Néhány korábbi vizsgálat [76;229;247], és saját kísérletes eredményeink szintén megerősítik, hogy az Lps és az allergén együttműködhet az allergiás légúti gyulladás kialakításában. Az Lps képes fokozni az allergénspecifikus IgE szintézisét [247], és az LBP- vagy TLR-4-hiányos génkiütött (knock-out) egerekben nem lehet kísérletes Ovaasthmát létrehozni [75;229]. Az Lps kiválthatja a tünetek súlyosbodását már kialakult asthmában [292;295], továbbá – más tényezők mellett – az Lps inhaláció (pl.: dohányzás) is felelős lehet az allergiás asthmás egyedek szteroid-válaszkészségének csökkenéséért. Michel és mtsai [299] Lps inhaláció után a plazmafehérjék szteroid refrakter akutfázis-válaszát figyelték meg egészséges önkéntesekben. Trapp és mtsai [300] pedig inhalációs és szisztémás (iv.) szteroidok hatékonyságát vizsgálták magas Lps tartalmú gabonapor-kivonat okozta forszírozott kilégzési másodperctérfogat (FEV1) csökkenés kivédésében. Kimutatták, hogy a hörgőgörcs ebben az esetben nem, vagy alig csökkenthető szteroidokkal. Lefort és mtsai [239] kísérletükben intranasalis Lps instillatióval kezelték az egereket, és azt tapasztalták, hogy a kialakuló légúti gyulladás és LHR teljesen szteroid rezisztens. Ily módon a légutak egyidejű Lps és allergén expozíciója állhat a szteroidok csökkent hatékonyságának hátterében. Ezt a kérdéskört vizsgáló tudományos közlemények eddig nem jelentek meg. Kísérletünkben ezért létrehoztuk az eosinophil légúti gyulladás és LHR egy olyan modelljét, melyet az Lps hatása és az allergia együttesen alakít ki. A korábban publikált hasonló vizsgálatokban az allergizált patkányok [224] vagy egerek [223] Lps kezelése légúti neutrophil sejtszaporulatot és a gyulladás eosinophil jellegének csökkenését eredményezte. Mivel az allergiás asthmások légutaiban a gyulladást döntően az eosinophil granulocyták dominanciája jellemzi, az általunk alkalmazott kísérleti rendszer a betegséget jobban modellezi. Valójában az LPS/OVA állatokban az eosinophil gyulladás súlyosabb volt, mint az OVA csoport egyedeiben. Mivel a BALF IL-5 koncentrációja ugyanakkor nem volt magasabb az LPS/OVA, mint az OVA állatok esetében, ezért az eosinophil sejtek szöveti felhalmozódásában valószínűleg más mediátorok is részt vettek: például a
57
CCR3 receptoron ható Lps-indukálta eosinophil kemotaktikus anyag [316] szerepe szintén felmerül. Mindez és számos egyéb Lps által kiváltott gyulladáskeltő hatás [76;223] magyarázhatja ezen ágens változatos hatásait légúti allergiában. A kísérletünkben megfigyelt, nem Th2 (vagy nem csak Th2) cytokinek által mediált eosinophil gyulladás bizonyítottan kevéssé reagált nagy dózisú szteroid-kezelésre. Az allergizált
állatok
Lps
előkezelése
valószínűleg
további,
járulékos
immunmechanizmusokat aktivált, mivel az eosinophil gyulladáson kívül az NO szintézis és az LHR szteroid-válaszkészsége is csökkent. Ily módon egy szteroidrezisztens asthmamodellt sikerült létrehoznunk egérben. Az NO-t többnyire az allergiás légutak gyulladáskeltő mediátorának tartják az ember [304;317], az egér [177;318;319] és más fajok [293;320-322] esetében. A kilégzett NO emelkedett asthmásokban [323], és a glükokortikoidok csökkentik mind a tüneteket, mind a kilégzett NO mennyiségét [188;304]. Ez arra utal, hogy a fokozott NO szintézis forrása az asthmás emberek légutaiban az iNOS lehet. Néhány egérmodellben [206;319] – bár nem mindegyikben [318;324] – szintén kimutatták, hogy az iNOS expresszió megnő az allergiás légutakban. Xiong és mtsai [319] kísérletükben úgy találták, hogy az iNOS-deficiens állatok nem allergizálhatóak, ugyanakkor De Sanctis és mtsai [318] nem erősítették meg mindezt. Másrészről viszont az 1400W – nagyon szelektív iNOS inhibitor – képes tompítani az LHR-t allergizált állatokban [207]. Mivel a glükokortikoidok hatékony és szelektív iNOS bénító hatásúak, és az NO produkció jelentősen csökkent az OVA+DEX állatokban, a mi eredményeink is alátámasztják az iNOS szerepét a tisztán allergiás eredetű LHR kórfolyamatában. Első alkalommal számoltunk be ugyanakkor arról, hogy az 1400W – szelektív iNOS inhibitor – egyetlen dózisban és mindössze 2 órával a tüdőellenállás-mérés előtt alkalmazva hatékonyabban védte ki az LHR-t a tisztán allergiás eredetű légúti gyulladás esetében (OVA egerek), mint a 2 napig tartó Dex kezelés. Ezzel megerősítettük Iijima és mtsai [187], továbbá Koarai és mtsai [206] által publikált megfigyeléseket, miszerint a hosszú távú, illetve ismételt 1400W kezelés szimultán gyulladáscsökkentő és LHR-t enyhítő hatást fejt ki egérben. Az a vizsgálati eredményünk viszont, hogy az 1400W képes az LHR-t 2 óra alatt megszüntetni, arra enged következtetni, hogy ezt az abnormalitást rövid életidejű, a beteg légutakban folyamatosan képződő anyagok tartják fenn. Például az NO-ból és O2−-ból keletkező peroxi-nitrit lehet egy ilyen ágens [293], és ezáltal az 1400W
58
azonnali hatása magyarázható lenne a peroxi-nitrit képződés azonnali csökkenésével a bronchusfalban. Másrészről viszont, ha az iNOS eredetű NO az LPS/OVA egerekben szintén az LHR kulcsfontosságú eleme lenne, akkor ezen állatoknak még az OVA csoportnál is magasabb RL-választ kellene mutatniuk MCh-ra. Pont az ellenkezőjét tapasztaltuk: a magasabb nitrit szint (NO szintézis) enyhébb LHR-rel járt együtt. Bár nem vizsgáltuk tovább az LPS/OVA állatok fennmaradó LHR-jének mechanizmusát, mégis valószínűsíthető, hogy az NO-rendszer egy másik szereplője válhat dominánssá ebben az esetben. Que és mtsai nemrég leírták [208], hogy az NO-ból képződő Snitroso-thiolok (SNO) kivédhetik az LHR kialakulását egy hasonló egérmodellben. További kísérletek szükségesek annak tisztázására, hogy egy megfelelően időzített Lps expozíció az allergiás légutakban képes-e a bronchodilatator hatású SNO-k képződését nagyobb arányban fokozni, mint más, NO-hoz kötött, de bronchoconstrictor anyagok (pl.: peroxi-nitrit) keletkezését. Összefoglalva tehát, az Ova-szenzitizált egerekben az Ova-provokáció és az azt megelőző Lps-kezelés (priming) együttesen olyan kísérletes légúti allergiát hozott létre, melyet súlyosabb eosinophil gyulladás és fokozott NO képződés jellemez. A MCh-nal szembeni légúti reaktivitás és a Th2-es cytokinek szintézise mérséklődött, de még így is szignifikánsan nagyobb volt, mint a kontroll állatokban. A gyulladás és az LHR ezekben az állatokban kevésbé reagált Dex és 1400W kezelésre, mint a tisztán allergiás egyedek esetében. Új megfigyeléseink felvetik, hogy az Lps inhaláció szerepet játszhat a gyulladás-csökkentő terápiával szembeni rezisztencia kialakulásában asthmában.
2.2. HUMÁN VIZSGÁLATOK 2.2.1. Bevezetés és célkitűzések A T-lymphocyták által termelt IL-4 és más Th2-es típusú cytokinek fontos elemei az asthma kórfolyamatának [96]. Az IFN-γ és más Th1-es típusú cytokinek (pl.: IL-12) viszont képesek lehetnek meggátolni az asthma kifejlődését [101;325]. A terhesség szintén befolyásolja az immunválaszt [326]. Élettani terhességben a T-
59
lymphocyták nagyrészt Th2-es irányba polarizálódnak, azaz IL-4-et, IL-5-öt termelnek. Leírták ezen kívül az IL-10 és a TGF-β fokozott produkcióját is [267;327-333]. Ez a materno-foetalis immunválasz „immuntrofikus”, azaz védő hatású a magzatra [267;326]. Amennyiben az anya immunrendszere a terhességre Th1-es típusú cytokinek (pl.: IFN-γ, TNF-α) fokozott termelésével reagál, spontán abortusz alakul ki [267;331;334]. Ilyen terhesség esetén egérben a magzatok felszívódása vagy retardáció alakul ki [332;335]. Az immunfolyamatok változása nem csak az uterusban tapasztalható, hanem különböző szisztémás immunbetegségek lefolyása is megváltozik terhesség alatt. A Th1-es típusú autoimmun rheumatoid arthritisben a tünetek átmenetileg enyhülnek [336], míg a Th2-es mechanizmusú szisztémás lupus erythematosus [337] esetében súlyosbodnak terhesség alatt. Feltételezhető hogy a terhesség (mint Th2 irányban polarizált immunállapot) a jól ismert Th1-Th2 antagonizmus révén enyhíti a rheumatoid arthritist, míg Th2-Th2 szinergizmus révén okozza a szisztémás lupus erythematosus exacerbatióját [338]. Az asthma bronchiale súlyossági foka szintén változhat a terhesség során, bár a változás iránya nehezen jósolható meg előre [339]. A szülés utáni 3 hónapban viszont az esetek 73%-ában visszatér a betegség a terhesség előtti súlyossági fokra. Az egymást követő terhességek során szintén konkordancia figyelhető meg az asthma kórlefolyása tekintetben [45]. Az asthma és a terhesség egymásra gyakorolt negatív hatása valószínűleg kölcsönös, mivel – több ezer alanyt magába foglaló, népesség-alapú vizsgálatok alapján – még az enyhe és középsúlyos asthma is növeli a magzati növekedési retardáció, a koraszülés, a praeeclampsia és más szülészeti szövődmények előfordulási gyakoriságát [48;49]. Habár a terhes nők mintegy 3-12%-a szenved asthmában [44], az asthma és a terhesség közötti kölcsönhatás eddig mégis nagyrészt ismeretlen maradt. 2.2.1.1. Célkitűzések Mivel T-sejtek között antagonizmus vagy szinergizmus alakulhat ki terhes asthmásokban, ezért a keringő vér IL-4+ és IFN-γ+ T-lymphocyta szubpopulációinak méretét, továbbá ezen sejtcsoportok és az anyai légzésfunkció valamint a születő gyermekek születési testtömege közötti összefüggéseket vizsgáltuk. Az alábbi kérdésekre kerestük a választ:
60
1. A terhesség hatására kialakuló immunológiai változások hogyan befolyásolják az asthma hátterében lévő allergiás mechanizmusokat? 2. Az asthmát fenntartó immunfolyamatok hogyan hathatnak a magzat fejlődésére?
2.2.2. Módszerek 2.2.2.1. Vizsgálati alanyok A vizsgálatba bevont 48 asthmás terhes nő (második trimeszter: n=12; harmadik trimeszter: n=36) a Semmelweis Egyetem I. számú Szülészeti és Nőgyógyászati Klinikáján jelentkezett rutin szülészeti gondozásra. Tüneteik, panaszaik, illetve asthmás anamnézisük alapján irányították őket a Pulmonológiai Klinika ambulanciájára. A részletes anamnézisfelvétel során különös figyelmet fordítottunk az alábbi kérdésekre: 1. atópia, 2. asthmaticus tünetek súlyossága, 3. gyakorisága, 4. aktuális gyógyszeres terápia, 5. tünetek változása a terhesség alatt. A rutin vérképellenőrzéssel egy időben vettünk vért (heparinos csőbe) az áramlási cytometriás (FACS) mérések elvégzéséhez. Ezután
teljestest-pletizmográffal
(Piston,
Budapest,
Hungary)
vizsgáltuk
a
légzésfunkciót majd arterializált kapilláris vérgáz-analízis történt. Allergiás bőrpróbát, bronchoprovokációt, illetve mellkas röntgen vizsgálatot a terhesek esetében nem végeztünk.
A
légúti
infekció
tüneteivel
(láz,
purulens
köpetürítés,
pozitív
köpettenyésztés) érkező, antibiotikus kezelésre szoruló betegeket vizsgálatunkba nem vontunk be. A szülést követő első viziten feljegyeztük a vizsgálati alanyok alábbi kérdésekre adott válaszait: Hogyan változtak asthmaticus tünetei a terhesség alatt és átlagosan mennyi szükség esetén alkalmazandó, rohamoldó gyógyszert használt? Kielégítőnek érezte az asthma kezelését a terhesség során? Pontosan milyen gyógyszereket, milyen dózisban szedett? Ezen kívül adatokat gyűjtöttünk az újszülöttekről és az esetleges szülészeti szövődményekről. Vizsgálatunk során az asthmás terhes betegeken kívül további három kontroll csoportba vontunk be alanyokat: 1. egészséges terhesek (n=18), akiknek a gesztációs és életkor megoszlása a vizit időpontjában megegyezett az asthmás terhesekével (második trimeszter: n=4; harmadik trimeszter: n=14), 2. egészséges nem terhesek (n=8) és 3. asthmás nem terhesek (n=13). A kontrollok bevonására az asthmás terhesekkel párhuzamosan, azonos ütemben került sor. Légzésfunkciós vizsgálatot csak az asthmás (terhes és nem terhes) betegek esetében
61
végeztünk, míg a másik két csoport tagjainál anamnézis-felvétel és fizikális vizsgálat történt. A 18 egészséges terhes közül 12 esetében végeztünk vérgáz-analízist. Az asthmás nem terhes betegek kezelése minden esetben a GINA irányelveknek megfelelően történt [340], ugyanakkor az asthmás terhesek kezelésénél a 1. táblázatban részletezett ajánlást tekintettük irányadónak [341]. Néhány beteg esetében a vizitek során szükségessé vált a rövid vagy hosszú hatású béta-2-agonista, illetve az inhalációs kortikoszteroid adagjának megváltoztatása. Szisztémás kortikoszteroid kezelésben azonban a vizsgálat alatt és az azt megelőző 6 hét során egyik alany sem részesült. 1. táblázat: Az American College of Obstetricians and Gynecologists (ACOG) és az American College of Allergy, Asthma and Immunology (ACAAI) közös ajánlása a krónikus asthma lépcsős kezelésére terhesség alatt.
Súlyossági fok
Gyógyszeres kezelés
Enyhe intermittáló
Inhalációs β-2-mimetikum szükség esetén* (minden súlyossági fokban szükség szerint alkalmazandó)
Enyhe perzisztáló
Folytatni az inhalációs kromon kezelést, ha a beteg jól reagált rá a terhességet megelőzően Inhalációs kortikoszteroid** – amennyiben a fenti kezelés nem kielégítő (400 µg budesonidnak megfelelő adagban naponta)
Középsúlyos perzisztáló
Inhalációs kortikoszteroid** (400-800 µg budesonidnak megfelelő adagban naponta) Folytatni a hosszú hatású β-2-mimetikum kezelést, ha a beteg jól reagált rá a terhességet megelőzően Hosszú hatású β-2-mimetikum és/vagy per os retard theophyllin – amennyiben a fenti kezelés nem kielégítő
Súlyos perzisztáló
A fenti kezelés kiegészítése per os kortikoszteroiddal (lökésterápia súlyos tünetek esetén; másnaponta vagy naponta – szükség szerint)
*: A legtöbb eddig közölt vizsgálatban albuterol, metaproterenol vagy terbutalin. **: Beclomethason vagy Budesonid ha a terhesség alatt kezdjük a kezelést; ha a beteg egy másik inhalációs kortikoszteroiddal egyensúlyban volt a terhesség előtt, folytassuk ezt a kezelést; használjunk budesonidot, ha a beteg nagy dózisú inhalációs kortikoszteroid kezelést igényel.
62
2.2.2.2. A lymphocyták cytokintermelésének meghatározása A perifériás vénás vérből nyert lymphocyták in vitro cytokintermelését FastImmune Cytokine Assay (BD BioSciences, San Jose, CA, USA) felhasználásával határoztuk meg. A nátrium-heparinnal alvadásgátolt vérből Ficoll-Paque (Sigma, Budapest, Magyarország) sűrűséggradiens centrifugálással szeparáltuk a mononukleáris sejteket, majd PBS-el történő mosás után 10%-os hőinaktivált FCS tartalmú RPMI-1640 folyékony táptalajban vettük fel őket (sejtszám: 106 / mL). A cytokinszintézist forbolészter (25 ng / mL forbol-mirisztát-acetát – PMA) és ionomicin (1 µg / mL) hozzáadásával 4 órán keresztül stimuláltuk (37°C, CO2 5%) Brefeldin-A jelenlétében. Ez utóbbi ágens az intracelluláris transzport gátlása révén megakadályozta a képződő anyagok kiválasztását, ily módon az adott sejtre jellemző cytokinek intracelluláris koncentrációja megnövekedett a stimuláció során. A sejtek mosása és 4%-os paraformaldehiddel történő fixálása után első lépésben a sejtfelszíni CD3 molekulákat jelöltük PerCP-vel konjugált antihumán CD3-ellenes antitesttel. Ezt követően a sejteket 0,1%-os szaponin oldattal permeabilizáltuk, majd fluoreszcens isotiocianáttal (Fitc) jelölt antihumán IFN-γ, illetve phycoerythreinnel (Pe) jelölt antihumán IL-4 monoklonális ellenanyagokkal inkubáltuk. A méréseket a jelölés után – 2 órán belül – FACSCalibur áramlási cytométerrel (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) végeztük el. Minden esetben 3000 db CD3+ T-sejtet gyűjtöttünk össze. Az adatelemzéshez a CellQuest Pro (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) programot használtuk. 2.2.2.3. Statisztika Az eredményeket átlag ± átlag szórása (SEM) formátumban adtuk meg. Kivételt képez az asthmaellenes gyógyszerek napi adagolása, mert ebben az esetben a mediánt és (zárójelben) a legnagyobb és legkisebb értékeket tüntettük fel. A négy vizsgálati csoport eredményei közötti különbségeket varianciaanalízissel (ANOVA-val) határoztuk meg. A csoportok páronkénti összehasonlítását Dunn-Sidak post-hoc teszttel végeztük. A különböző sejtpopulációk nagysága, valamint a magzati születési súly és anyai légzésfunkció közötti összefüggést lineáris korreláció-számítással határoztuk meg. Chinégyzet tesztet és kétmintás t-próbát használtunk a külön megjelölt esetekben.
63
2.2.3. Eredmények 2.2.3.1. Általános eredmények A négy vizsgálati csoport – egészséges terhes (ET) és nem terhes (ENT), asthmás terhes (AT) és nem terhes (ANT) – tagjainak átlagéletkora egyaránt 27 év volt. A pulmonológiai vizsgálatokat a 30. terhességi hét körül végeztük mind az ET, mind az AT alanyok esetében. Az átlagos gesztációs időtartam a két terhes csoportban közel egyforma volt és a primiparák és multiparák aránya szintén hasonló volt az asthmás (21/27) és egészséges (7/11) terhes asszonyok között. Másrészről viszont az AT betegek újszülöttjeinek születési súlya szignifikánsan alacsonyabb volt, mint az ET alanyok esetében (2. táblázat). A légzésfunkciós vizsgálat kimutatta, hogy a kilégzési csúcsáramlás (PEF) értékek mindkét asthmás csoportban (AT és ANT) szignifikánsan elmaradtak a korra, nemre és testmagasságra standardizált várható értékektől (3. táblázat). Ugyanakkor az obstruktív jellegű légzészavar hasonló súlyossági fokú volt ebben a két betegcsoportban. Az AT és ANT nők vérgáz-analízise során szintén egymáshoz hasonló mértékű hypoxaemiát és hypercapniát figyeltünk meg (3. táblázat), miközben az ET asszonyok esetében a vérgáz-értékek (pO2: 100,6 ± 0,9 Hgmm, pCO2: 36,7 ± 0,7 Hgmm) a referenciatartományokon belül voltak (terhességben magasabb pO2 és alacsonyabb pCO2 jellemző). 2. táblázat: A vizsgálatba bevont személyek adatai. *: p<0,05 vs. ET.
ENT
ET
ANT
AT
8
18
13
48
27,0 ± 1,4
27,9 ± 0,7
27,0 ± 1,0
26,4 ± 0,5
A vizsgálat idején
−
30,3 ± 3,1
−
30,1 ± 1,2
szüléskor
−
39,8 ± 0,2
−
38,8 ± 0,3
Gyermekek születési súlya (g)
−
3326 ± 102
−
3132 ± 97*
Praeeclampsia
−
0
−
3
Terhességi diabetes
−
1
−
1
Hypertonia
−
0
−
2
N Életkor (év) Terhességi kor (hét)
64
Anamnézisük alapján az asthmás betegek valamennyien atópiásak voltak. A dohányos betegek részaránya – a vizsgálat időpontjában – az AT csoportban 8,3%, az ANT betegek között pedig 23,1% volt (3. táblázat). Az AT asszonyok állapota a terhesség alatt, saját megítélésük és nyilatkozatuk alapján a következőképpen változott: a betegek 25%-ában (12 fő) súlyosbodtak, 35,4%-ában (17 fő) javultak, míg 39.6%ában nem változtak az asthmaticus tünetek. Mindkét terhes csoportban emelkedett neutrophil sejtszámot találtunk a perifériás vérben. Az eosinophil sejtszámok viszont minden vizsgálati alany esetében a normál értéktartományon belül maradtak, és az egyes csoportok között nem volt különbség. Az AT csoportban a szülészeti szövődmények gyakorisága nem haladta meg az átlagpopulációra jellemző értékeket. Congenitalis malformatio, jelentett fejlődési rendellenesség vagy spontán abortusz nem fordult elő a vizsgálati alanyok esetében. 3. táblázat: Az asthma súlyossági foka terhes és a nem terhes betegek esetében. ns: p>0,05 vs. ANT (chi-négyzet teszt); *: kisebb, mint a kornak és testmagasságnak megfelelő átlagos érték −2×SD; $: nagyobb, mint a kornak és testmagasságnak megfelelő átlagos érték +2×SD; §: kisebb, mint a kornak és testmagasságnak megfelelő, terhesekre vonatkozó átlagérték −2×SD.
GINA (II/III) PEF (a referenciaérték %-ában) FEV1 (a referenciaérték %-ában) Légúti ellenállás (Raw, Pa × s / L) pO2 (Hgmm) pCO2 (Hgmm) pH Dohányos Az inhalált rövid hatású β2-agonista napi mennyisége (puff) Az inhalált elnyújtott hatású β2-agonista napi mennyisége (puff) Az inhalált kortikoszteroid napi mennyisége (µg)
ANT
AT
9/4 78 ± 6 * 85 ± 3 0,30 ± 0,02 $ 88 ± 2 * 34 ± 1 * 7,45 ± 0,01 3
37/11 ns 71 ± 2 * 93 ± 2 0,31 ± 0,02 $ 96 ± 1 § 30 ± 0,4 § 7,46 ± 0,00 4 ns
2 (0, 8)
2 (0, 8)
0 (0, 4)
0 (0, 4)
400 (0, 1600)
400 (0, 1600)
2.2.3.2. Lymphocyta szubpopulációk A lymphocyta és a T-lymphocyta (CD3+) sejtszám a perifériás vérben valamivel alacsonyabb volt az ET, mint az ENT csoportban (8. ábra), azonban az IFN-γ és – valamivel kisebb mértékben – az IL-4 termelő szubpopulációk az ET asszonyoknál
65
nagyobbak voltak, mint az ENT alanyok esetében (9. ábra). Egészséges terhességben az IL-4 pozitív szubpopuláció 5-ször, míg az IFN-γ pozitív 15-ször nagyobb volt, mint az ENT nők kontroll értékei. A nem terhes (ENT és ANT) csoportokban ezen két Tlymphocyta szubpopulációban igen alacsony sejtszámokat találtunk, továbbá az asthmás és nem asthmás alanyok értékei között nem volt különbség. Az AT betegek esetében azonban T-lymphocytosist mutattunk ki (8. ábra).
B ns2
ns1
CD3+ lymphocyta sejtszám (G/L)
Lymphocyta összsejtszám (G/L)
A ns1
Egészséges Nem terhes
Terhes
ns1
Egészséges
Asthmás Terhes
ns1
Nem terhes
Nem terhes
Terhes
Asthmás Terhes
Nem terhes
A
B
IFN-γ+ CD3+ lymphocyta sejtszám (G/L) IFN-?
IL-4+ CD3+ lymphocyta sejtszám (G/L)
8. ábra: A vizsgálatba bevont csoportok lymphocyta (A) és T-lymphocyta (CD3+) sejtszámai (B) a perifériás vérben. (ENT, n=8; ET, n=18; AT, n=48; ANT, n=13). $: p<0,05 vs. ET; #: p<0,05 vs. ANT; ns1: p>0,05 vs. ENT; ns2: p>0,05 vs. ET.
ns1
Egészséges Nem terhes
Terhes
ns1
Egészséges
Asthmás Terhes
ns1
Nem terhes
Nem terhes
Terhes
Asthmás Terhes
Nem terhes
9. ábra: A négy vizsgálati csoport IFN-γ és CD3 kettős pozitív (A), valamint IL-4 és CD3 kettős pozitív (B) lymphocyta sejtszámai a perifériás vérben. (ENT, n=8; ET, n=18; AT, n=48; ANT, n=13). *: p<0,05 vs. ENT; $: p<0,05 vs. ET; #: p<0,05 vs. ANT; ns1: p>0,05 vs. ENT.
66
A lymphocytosisért – kb. 50%-ban – az IFN-γ pozitív szubpopuláció növekedése volt a felelős: az IFN-γ pozitív T-sejtszám az AT csoportban mintegy négyszer akkora volt, mint az ET, illetve mintegy 18-szor akkora, mint az ANT alanyok esetében mérhető értékek (9. ábra). Kisebb mértékben ugyan, de hasonló tendenciákat találtunk az IL-4 termelő Tlymphocyták esetében is (9. ábra): az AT betegek sejtszám-értéke szignifikánsan meghaladta az ET, illetve az ANT csoportokban mért értékeket. Az asthmás terhesek keringő IFN-γ pozitív és IL-4 pozitív T-sejt szubpopulációinak nagysága szignifikáns pozitív korrelációt mutatott (10. ábra). Egészséges terhességben, illetve a nem terhes kontroll csoportok esetében ehhez hasonló korreláció nem volt kimutatható.
10. ábra: Pozitív korreláció az asthmás terhes betegek IL-4 és IFN-γ termelő T-sejt számai között (n=47).
2.2.3.3. Összefüggések a lymphocyta szubpopulációk, légzésfunkciós paraméterek és a magzatok születési súlya között Az asthma súlyosságának terhesség során bekövetkező változását a betegek saját nyilatkozata alapján rögzítettük. Elmondható ugyanakkor, hogy akár romlott, akár javult vagy nem változott az állapotuk, mindez nem tükröződött a perifériás vérben keringő különböző T-sejt szubpopulációk méretének számszerű változásában. A légzésfunkciós paraméterek – a PEF kivételével – és a vérgázértékek szintén nem mutattak mennyiségi
67
összefüggést a különböző sejtpopulációkkal. Az IFN-γ pozitív (11 / A. ábra) valamint az IL-4 pozitív T-sejtek száma (11 / B. ábra) azonban szignifikáns negatív korrelációt mutatott a PEF értékekkel. Megfigyeltük továbbá, hogy a magasabb dózisú inhalációs kortikoszteroid fenntartó terápiát igénylő betegek (800-1600 µg/nap budesonid; n=18) szignifikánsan magasabb IFN-γ (0,325 ± 0,056 G/L) és IL-4 (0,060 ± 0,013 G/L) pozitív T-sejtszámmal rendelkeztek, mint a 400 µg/nap budesonidot használó többi beteg (n=30; IFN-γ: 0,107 ± 0,019 G/L; IL-4: 0,030 ± 0,005 G/L; p<0,05 vs. nagy dózissal kezelt betegek – mindkét sejtpopuláció esetében).
B
PEF (%)
PEF (%)
A
p
p
IFN-γ+ CD3+ lymphocyta sejtszám (G/L)
IL-4+ CD3+ lymphocyta sejtszám (G/L)
11. ábra: Negatív korreláció az asthmás terhes asszonyok IFN-γ (A, n=48) és IL-4 (B, n=47) pozitív Tsejtszámai és a betegek PEF értékei között.
Mindezek mellett, az anyai IFN-γ pozitív T-sejtszámok és a magzati születési súly között szignifikáns negatív korrelációt találtunk az AT csoportban (12. ábra). Az anyai PEF, FEV1, Raw, illetve pO2 esetében ehhez hasonló összefüggés nem állt fenn, az anyai pH azonban pozitív korrelációt mutatott a magzati születési súllyal. Egészséges terhességben sem az IFN-γ sem az IL-4 pozitív T-sejtek nem mutattak összefüggést a születési súllyal. Három asthmás kismama esetében praeeclampsia alakult ki. Az ő perifériás vérükben szignifikánsan több IFN-γ és IL-4 pozitív T-lymphocytát, és a légzésfunkciós vizsgálatuk során alacsonyabb PEF értéket találtunk, mint az AT csoport többi egyedében. Az újszülöttjeik születési súlya szintén alacsonyabb volt (4. táblázat).
68
Születési súly (kg)
p
p
p
IL-4+ CD3+ lymphocyta szám (G/L)
pH
pO2
p
IFN-γ+ CD3+ lymphocyta szám (G/L)
12. ábra: Az újszülöttek születési súlya, illetve az arterializált kapilláris vér pO2 (n=45), pH (n= 44), valamint a keringő IL-4 (n=44) és IFN-γ (n=46) pozitív T-sejtszámok közötti összefüggések asthmás terhes asszonyokban. 4. táblázat: A praeeclampsiás és nem praeeclampsiás asthmás terhes asszonyok vérnyomás értékei, thrombocytaszáma, PEF érétkei és T-lymphocytaszáma. ns: p>0,05 vs. asthmás terhesek praeeclampsia nélkül; *: p<0,05 vs. asthmás terhesek praeeclampsia nélkül (kétmintás t-próba).
Nem praeeclampsiás
Praeeclampsiás
AT
AT
45
3
116 ± 1,4 79 ± 1,1 negatív 234,5 ± 12,4 72 ± 2,4 0,16 ± 0,02 0,04 ± 0,01 3235 ± 84
133 ± 3,3 * 87 ± 3,3 ns + és ++++ között 292,0 ± 42,0 ns 58 ± 4,9 ns 0,51 ± 0,20 * 0,09 ± 0,06 * 1900 ± 50 *
n Vérnyomás szisztolés diasztolés Proteinuria Thrombocytaszám (×109 / L) PEF (a kell-érték %-ában) INF-γ+ CD3+ lymphocytaszám (G / L) IL-4+ CD3+ lymphocytaszám (G / L) Születési súly (g)
2.2.4. Megbeszélés és következtetések Schatz és mtsai [45] 366 asthmás terhességét végigkövetve megfigyelték, hogy a betegek 35%-ában az asthmás tünetek romlottak a terhesség alatt, de a legtöbb esetben a
69
szülés után 3 hónapon belül visszaálltak a korábbi (terhesség előtti) súlyossági fokra. Ez az epidemiológiai megfigyelés azt mutatja, hogy a terhesség – bizonyos esetekben súlyosbíthatja az asthmát. Másrészről viszont ismert, hogy az asthma intrauterin retardációt és koraszülést okozhat [48;342]. Kramer és mtsai [343] 241 koraszülő és 311 terminusban szülő nőt vizsgálva azt találták, hogy az asthmára utaló panaszok és tünetek, valamint az orvos által diagnosztizált asthma körülbelül háromszor olyan gyakori volt az előbbi, mint az utóbbi csoportban. Habár az asthma bronchiale terhességre gyakorolt negatív hatásáért részben az általánosan fokozott (bronchialis, uterinalis és méh-érrendszeri) simaizom-ingerlékenység, vagy az elégtelen magzati oxigén-ellátottság tehető felelőssé [45;339;342], egyes T-sejt populációk és az általuk termelt cytokinek (pl.: IFN-γ) „immundisztrofikus” hatása szintén lehetséges. A kórosan fokozott IFN-γ termelődés toxikus hatást fejt ki a trophoblastra [344], elősegíti a spontán abortusz és az intrauterin retardáció kialakulását. Wegman és mtsai [326], Lin és
mtsai
[328],
Raghupathy
és
mtsai
[332]
és
Palmer
és
mtsai
[338]
„immundisztrofikus” terhességként definiálták a Th1-es típusú materno-foetalis immunválasz és az intrauterin retardáció együttes (vagy következményes) kialakulását. Egészséges „immuntrofikus” terhességben a Th2-es cytokinek nagymértékben expresszálódnak mind a magzat és az anya közötti határfelület (decidua basalis) területén, mind a keringő lymphocytákban [328;329;333]. Ugyanakkor az IFN-γ szintén szerepet játszhat a normális decidualisatio kialakulásában [345-347]. Hipotézisünk az volt, hogy az élettani terhességre és az atópiás asthmára egyaránt jellemző Th2-es cytokinmintázat között szinergizmus alakulhat ki. Nagy IL-4+ és kis IFN-γ+ T-sejt szubpopulációra számítottunk. Általános megközelítésünk helyesnek bizonyult, de méréseink meglehetősen váratlan eredményeket hoztak. Az egészséges terhes nők perifériás vérében mérhetően megemelkedett mind az IL-4+/CD3+, mind az IFNγ+/CD3+ sejtpopuláció. Mindez azt mutatja, hogy egyes T-sejt szubpopulációk normál „immuntrofikus” terhesség alatt is proliferálódnak (aktiválódnak). Asthmás terhes vizsgálati alanyainkban viszont sokkal magasabb T-sejtszámokat találtunk, ami alátámasztotta eredeti elképzelésünket az ebben az állapotban várható a kulmináló Tsejtes válaszról. A várakozással ellentétben azonban nagymértékű IFN-γ-termelő Tsejtszám-emelkedést találtunk, habár az IL-4+ sejtpopuláció is nőtt. Ezen asszonyok vérében kb. 20-szor nagyobb mennyiségű IFN-γ-termelő T-sejt volt, mint a hasonló
70
súlyossági fokú asthmában szenvedő, nem terhes nők mintáiban. Az IL-4+ sejtszám az IFN-γ+ populációval arányosan, de kisebb mértékben szintén megnövekedett. Következésképp úgy tűnik, hogy a terhesség asthmásokban kevert fenotípusú, kulmináló cytokinválaszt eredményez, amelyben – az abszolút sejtszámokat figyelembe véve – az IFN-γ dominál. Habár az atópiás asthma kialakulásakor a Th2-es cytokineké (pl.: IL-4) a vezető szerep [96], az IFN-γ+ és az IL-4+ T-sejtek – vizsgálatunkban is megfigyelt – szimultán felszaporodása felnőtt atópiás asthmásokban mégsem meglepő. Leírták, hogy az asthmaticus tünetek felnőttekben kevert cytokinfenotípus (IL-4, IL-5, IFN-γ, TNF-α) megjelenésével járnak együtt [108;348]. Mitöbb, szignifikáns negatív korreláció figyelhető meg a szérum IFN-γ szint és a FEV1 között, míg ilyen összefüggés nem áll fenn az IL-4 vagy IL-5 és a FEV1 között [349]. Más szerzők kimutatták, hogy az asthmás felnőttekből izolálható T-sejt klónok mind Th1-es, mind Th2-es cytokineket termelnek [350;351]. Néhány újabb keletű, asthmás felnőtteken [352-354] valamint 7-8 éves gyermekeken végzett vizsgálatban azt találták, hogy az IL-4-gyel vagy IL-5-tel szemben az IFN-γ a domináns cytokin a BALF-ban [355], a vérben [352;353] és a tüdőszövetben [354]. Továbbá gyakran áll vírus- vagy baktérium-fertőzés és következményes Th1-es típusú lymphocyta-aktiváció az exacerbatiók hátterében [356], különösen terhesség alatt, amikor a celluláris immunitás gyengülhet [357]. Milyen mechanizmus vezetett tehát egyes T-sejt szubpopulációk terhesség alatti felszaporodásához a perifériás vérben? Eddigi ismereteink szerint ezen T-sejt szubpopulációk felbukkanása nem terhes középsúlyos asthmások esetében csak lokálisan, a légúti mucosában várható, nem pedig a perifériás vérben [358]. A terhesség során az anyai leukocyták felismerik a trophoblastsejteket, illetve egyes felszíni markereiket [329;330;333]. Talán a lymphocyták emiatt bekövetkező „előaktivált” állapota (fokozott reakciókészsége), vagy a terhesség általános adjuváns-szerű hatása (priming) eredményezhet erősebb T-sejtes reakciót allergénekkel illetve fertőzésekkel szemben, és ez lehet felelős az asthmás tünetek kialakulásáért vagy fokozódásáért. Méréseink nem hordoznak további információt arra vonatkozóan, hogy mely ismert T-sejt típusok érintettek, hogy vajon CD8+ (46, 47), γ/δT (48), Treg (CD25+/CD4+) vagy NKT-sejtek felszaporodásáról van-e szó. A felsorolt sejttípusok mind gyanúsíthatók, mert mindegyikük képes szimultán IFN-γ és IL-4 szintézisre, és mindegyikük felszaporodik terhességben és asthmában egyaránt.
71
Figyelembe véve, hogy a terhes asthmások proinflammatorikus cytokintermelése jelentősen fokozódott, meglepő, hogy a tünetek ezzel párhuzamosan – a nem terhes asthmásokhoz viszonyítva – nem voltak súlyosabbak. Elképzelhető, hogy az anyai kortizol, progeszteron és prosztaglandin E2 produkció [338] ellensúlyozhatja a fokozott IFN-γ és IL-4 szintézis hatásait. Ez alól kivételt képezhet a három praeeclampsiával végződő terhesség, mivel – feltételezések szerint – a Th1-es típusú sejteknek és az általuk termelt cytokineknek szerepe lehet a praeeclampsia patogenezisében [359] és erre a betegségre egyébként a prosztaglandin E2-hiánya jellemző [360]. Adataink arra utalnak, hogy a kiugróan magas IFN-γ-termelő T-sejtszám praeeclampsiával járhat együtt. Kimutatták továbbá hogy intrauterin retardációval járó esetekben az IFN-γ produkció [361] és ezen cytokin humán cytotrophoblastra gyakorolt apoptotizáló hatása [362] egyaránt megnövekedett. Vizsgálataink során kimutattuk, hogy az IFN-γ+ Tsejtszám és az újszülöttek születési súlya között fordított arányosság áll fenn asthmás terhesek esetében. Ezen jelenség az IFN-γ ismert, a trophoblast DNS szintézisére gyakorolt gátló [363] hatásával lehet részben magyarázható. Korábban leírták, hogy egészséges terhesek perifériás vérében mind az IFN-γ, mind az IL-4 termelő sejtek száma – kis mértékben – megemelkedik [364]. Az általunk vizsgált T-sejt szubpopulációk terhes asthmás betegekben bekövetkező változásaival foglalkozó további publikációk azonban nem állnak rendelkezésre. Murphy és mtsai vizsgálati eredményei [365] viszont azt bizonyítják, hogy asthmában szenvedő terhesek szervezetében zajló súlyos, felfokozott inflammáció nemfüggő (a nőnemű magzatokat érintő) növekedési retardációval jár együtt. Összefoglalva a terhesség asthmásokban jelentősen növelte az IFN-γ termelő – és kisebb mértékben az IL-4 termelő – T-lymphocyták mennyiségét a perifériás vérben. Ezen sejtpopulációk mérete és a PEF, továbbá a magzati születési súly között szignifikáns negatív korreláció figyelhető meg. Feltehetőleg az anyai hormonok, és más, a terhesség alatt termelődő, simaizom-relaxáns hatású faktorok többé-kevésbé ellensúlyozzák a fokozott T-lymphocyta-proliferáció potenciálisan káros hatásait terhes asthmásokban.
72
3. ÖSSZEFOGLALÁS Az asthma bronchiale hátterében perzisztáló allergiás légúti gyulladás súlyosságát és kezelhetőségét a természetes immunrendszer működése jelentősen befolyásolhatja. Lipopolisacharid (Lps) – vagy más természetes immunstimulátor anyagok – expozíciója, valamint az élettani terhesség [282] egyaránt a veleszületett immunfolyamatok aktiválódását váltja ki. Ezen tényezők szerepének feltárása céljából az alábbi vizsgálatokat végeztük: Állatkísérletünkben [227] létrehoztuk az eosinophil légúti gyulladás és légúti hiperreaktivitás (LHR) olyan modelljét, melyet az Lps hatása és az allergia együttesen alakít ki. Az allergénprovokáció, és az azt megelőző Lps kezelés (priming) szenzitizált, BALB/c egerekben súlyosabb eosinophil légúti gyulladást és nagyobb mértékű NO képződést eredményezett, mint az allergénexpozíció önmagában. A Th2-es cytokinek szintézise és az LHR csökkent az Lps előkezelést követően, de így is mindkettő esetében szignifikánsan nagyobb értékeket mértünk, mint a kontroll egyedekben. Lps előkezelés tehát valószínűleg járulékos – nem Th2-es – immun-mechanizmusokat is aktivált az allergiás gyulladás kialakulása során. Dexamethason kezelés hatására ezekben az állatokban az eosinophil gyulladás csak kis mértékben csökkent, az NO képződés és az LHR pedig nem változott. Következésképp sikerült létrehoznunk a szteroidrezisztens asthma egy állatkísérletes modelljét egérben. Ezt követően az indukálható nitrogén-monoxid szintetáz (iNOS) szerepét vizsgáltuk az LHR kiváltásában. Eredményeink azt mutatták, hogy az 1400W – szelektív iNOS inhibitor – kezelés hatékonyan és gyorsan (mintegy 2 óra alatt) megszüntette az LHR-t allergizált állatokban. Az Lps előkezelés azonban az 1400W LHR-csökkentő hatását szintén meggátolta. Megfigyeléseink felvetik tehát, hogy az Lps inhaláció – vagy egy alsó légúti bakteriális infekció – asthmásokban súlyosbíthatja a légúti allergiás gyulladást, és szerepet játszhat a gyulladáscsökkentő terápiával szembeni rezisztencia kialakulásában. Humán vizsgálatainkban [271] a terhesség és az asthma immunológiai kölcsönhatását vizsgáltuk. Asztmás terhesek perifériás vérében jelentősen emelkedett IFN-γ+ és IL-4+ T-lymphocyta sejtszámokat detektáltunk áramlási cytometriával. Ezen sejtpopulációk mérete és a kilégzési csúcsáramlás, továbbá a magzati születési súly között szignifikáns negatív korrelációt találtunk. A terhesség alatt megfigyelhető, kulmináló IFN-γ+ és IL-4+ T-sejtszám emelkedés tehát kiválthatja asthmás tünetek súlyosbodását és hozzájárulhat az intrauterin retardáció kialakulásához.
73
4. SUMMARY Severity and treatability of allergic airway inflammation persisting in the background of asthma may be influenced by the innate immunity. Exposure to lipopolysaccharide (Lps) – or other natural immune stimulatory agents – as well as pregnancy [282] can induce the activation of innate immune processes. To further clarify the role of these factors the following examinations were performed: In an experimental investigation [227], we have developed a model of eosinophil airway inflammation and airway hyper-responsiveness (AHR), which was induced by Lps and allergy together. Allergen challenge, preceded by Lps-priming resulted in more severe eosinophil inflammation and higher nitrite formation in sensitized BALB/c mice, than allergen provocation alone. After Lps priming, AHR and concentrations of Th2 cytokines in bronchoalveolar lavage fluid were decreased, but still remained significantly higher than in controls. Probably, some accessory – non-Th2 – immunemechanisms might have been activated by Lps, during the development of allergic inflammation. Eosinophil inflammation was partially, while nitrite production and AHR were observed to be largely dexamethasone resistant in Lps-primed allergized animals. Thus, an animal model of steroid-resistant asthma was established in mice. The role of inducible nitric oxide synthetase (iNOS) in AHR was also assessed. Our results demonstrated that 1400W – a selective inhibitor of iNOS – effectively and rapidly (within 2 hours) reversed AHR in allergized mice. This effect of 1400W was, however, absent after by Lps priming. In conclusion, Lps inhalation may exaggerate eosinophil inflammation and reduce responsiveness to anti-inflammatory treatment in allergic airway inflammation. In our human study [271], the immunological interferences between asthma and pregnancy were examined. The IFN-γ+ and IL-4+ T cell counts – determined by flow cytometry – were markedly increased in peripheral blood of asthmatic pregnant women. Significant negative correlations were revealed between the sizes of these cell populations and maternal peak expiratory flow, as well as birth weight of their newborns. Thus, the culminating proliferation of IFN-γ+ and IL-4+ T lymphocytes may potentially impair fetal development as well as maternal airway symptoms.
74
5. IRODALOMJEGYZÉK 1. Gross NJ. What is this thing called love? --or, defining asthma. Am Rev Respir Dis 1980; 121:203-4. 2. Viegi G, Annesi I, Matteelli G. Epidemiology of asthma. Eur Respir Mon 2003; 23:1-25. 3.
Guidelines for the Diagnosis and Management of Asthma. NIH National Heart, Lung, and Blood Institute, 1997.
4. Crimi E, Spanevello A, Neri M, Ind PW, Rossi GA, Brusasco V. Dissociation between airway inflammation and airway hyperresponsiveness in allergic asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157:4-9. 5. Jeffery PK, Wardlaw AJ, Nelson FC, Collins JV, Kay AB. Bronchial biopsies in asthma. An ultrastructural, quantitative study and correlation with hyperreactivity. Am Rev Respir Dis 1989; 140:1745-53. 6. Wenzel SE. Asthma: defining of the persistent adult phenotypes. Lancet 2006; 368:804-13. 7. Warke TJ, Fitch PS, Brown V, Taylor R, Lyons JD, Ennis M, Shields MD. Outgrown asthma does not mean no airways inflammation. Eur Respir J 2002; 19:284-7. 8.
Variations in the prevalence of respiratory symptoms, self-reported asthma attacks, and use of asthma medication in the European Community Respiratory Health Survey (ECRHS). Eur Respir J 1996; 9:687-95.
9.
Worldwide variations in the prevalence of asthma symptoms: the International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC). Eur Respir J 1998; 12:315-35.
10. Braun-Fahrlander C, Gassner M, Grize L, Takken-Sahli K, Neu U, Stricker T, Varonier HS, Wuthrich B, Sennhauser FH. No further increase in asthma, hay fever and atopic sensitisation in adolescents living in Switzerland. Eur Respir J 2004; 23:407-13. 11. Ronchetti R, Villa MP, Barreto M, Rota R, Pagani J, Martella S, Falasca C, Paggi B, Guglielmi F, Ciofetta G. Is the increase in childhood asthma coming to an end? Findings from three surveys of schoolchildren in Rome, Italy. Eur Respir J 2001; 17:881-6. 12. Verlato G, Corsico A, Villani S, Cerveri I, Migliore E, Accordini S, Carolei A, Piccioni P, Bugiani M, Lo C, V, Marinoni A, Poli A, de Marco R. Is the prevalence of adult asthma and allergic rhinitis still increasing? Results of an Italian study. J Allergy Clin Immunol 2003; 111:1232-8.
75
13. Braback L, Hjern A, Rasmussen F. Trends in asthma, allergic rhinitis and eczema among Swedish conscripts from farming and non-farming environments. A nationwide study over three decades. Clin Exp Allergy 2004; 34:38-43. 14. Latvala J, von Hertzen L, Lindholm H, Haahtela T. Trends in prevalence of asthma and allergy in Finnish young men: nationwide study, 1966-2003. BMJ 2005; 330:1186-7. 15. Barnes KC, Marsh DG. The genetics and complexity of allergy and asthma. Immunol Today 1998; 19:325-32. 16. Barnes KC. Evidence for common genetic elements in allergic disease. J Allergy Clin Immunol 2000; 106:S192-S200. 17. Duffy DL, Martin NG, Battistutta D, Hopper JL, Mathews JD. Genetics of asthma and hay fever in Australian twins. Am Rev Respir Dis 1990; 142:1351-8. 18. Szalai C. Az atópiás légúti betegségek genomikai háttere. In: Herjavecz I, ed. Légúti allergológia. Budapest: Melania, 2004: 17-35. 19. Lau S, Illi S, Sommerfeld C, Niggemann B, Bergmann R, von Mutius E, Wahn U. Early exposure to house-dust mite and cat allergens and development of childhood asthma: a cohort study. Multicentre Allergy Study Group. Lancet 2000; 356:1392-7. 20. Cullinan P, MacNeill SJ, Harris JM, Moffat S, White C, Mills P, Newman Taylor AJ. Early allergen exposure, skin prick responses, and atopic wheeze at age 5 in English children: a cohort study. Thorax 2004; 59:855-61. 21. Peden DB. The epidemiology and genetics of asthma risk associated with air pollution. J Allergy Clin Immunol 2005; 115:213-9. 22. Ellwood P, Asher MI, Bjorksten B, Burr M, Pearce N, Robertson CF. Diet and asthma, allergic rhinoconjunctivitis and atopic eczema symptom prevalence: an ecological analysis of the International Study of Asthma and Allergies in Childhood (ISAAC) data. ISAAC Phase One Study Group. Eur Respir J 2001; 17:436-43. 23. Bjorksten B. Effects of intestinal microflora and the environment on the development of asthma and allergy. Springer Semin Immunopathol 2004; 25:257-70. 24. Eder W, Ege MJ, von Mutius E. The asthma epidemic. N Engl J Med 2006; 355:2226-35. 25. Eder W, von Mutius E. Hygiene hypothesis and endotoxin: what is the evidence? Curr Opin Allergy Clin Immunol 2004; 4:113-7. 26. Matricardi PM, Rosmini F, Riondino S, Fortini M, Ferrigno L, Rapicetta M, Bonini S. Exposure to foodborne and orofecal microbes versus airborne viruses
76
in relation to atopy and allergic asthma: epidemiological study. BMJ 2000; 320:412-7. 27. Yazdanbakhsh M, Wahyuni S. The role of helminth infections in protection from atopic disorders. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005; 5:386-91. 28. Adams VC, Hunt JR, Martinelli R, Palmer R, Rook GA, Brunet LR. Mycobacterium vaccae induces a population of pulmonary CD11c+ cells with regulatory potential in allergic mice. Eur J Immunol 2004; 34:631-8. 29. van der Kleij D, Latz E, Brouwers JF, Kruize YC, Schmitz M, Kurt-Jones EA, Espevik T, de Jong EC, Kapsenberg ML, Golenbock DT, Tielens AG, Yazdanbakhsh M. A novel host-parasite lipid cross-talk. Schistosomal lysophosphatidylserine activates toll-like receptor 2 and affects immune polarization. J Biol Chem 2002; 277:48122-9. 30. Linneberg A. Hypothesis: urbanization and the allergy epidemic--a reverse case of immunotherapy? Allergy 2005; 60:538-9. 31. Le Souef PN, Goldblatt J, Lynch NR. Evolutionary adaptation of inflammatory immune responses in human beings. Lancet 2000; 356:242-4. 32. Dakhama A, Park JW, Taube C, Joetham A, Balhorn A, Miyahara N, Takeda K, Gelfand EW. The enhancement or prevention of airway hyperresponsiveness during reinfection with respiratory syncytial virus is critically dependent on the age at first infection and IL-13 production. J Immunol 2005; 175:1876-83. 33. Lemanske RF. Viral infections and asthma inception. J Allergy Clin Immunol 2004; 114:1023-6. 34. Sigurs N, Gustafsson PM, Bjarnason R, Lundberg F, Schmidt S, Sigurbergsson F, Kjellman B. Severe respiratory syncytial virus bronchiolitis in infancy and asthma and allergy at age 13. Am J Respir Crit Care Med 2005; 171:137-41. 35. Rakes GP, Arruda E, Ingram JM, Hoover GE, Zambrano JC, Hayden FG, PlattsMills TA, Heymann PW. Rhinovirus and respiratory syncytial virus in wheezing children requiring emergency care. IgE and eosinophil analyses. Am J Respir Crit Care Med 1999; 159:785-90. 36. Webley WC, Salva PS, Andrzejewski C, Cirino F, West CA, Tilahun Y, Stuart ES. The bronchial lavage of pediatric patients with asthma contains infectious Chlamydia. Am J Respir Crit Care Med 2005; 171:1083-8. 37. Kraft M, Cassell GH, Pak J, Martin RJ. Mycoplasma pneumoniae and Chlamydia pneumoniae in asthma: effect of clarithromycin. Chest 2002; 121:1782-8. 38. Strachan DP, Cook DG. Health effects of passive smoking. 6. Parental smoking and childhood asthma: longitudinal and case-control studies. Thorax 1998; 53:204-12.
77
39. Strachan DP, Cook DG. Health effects of passive smoking .5. Parental smoking and allergic sensitisation in children. Thorax 1998; 53:117-23. 40. Withers NJ, Low L, Holgate ST, Clough JB. The natural history of respiratory symptoms in a cohort of adolescents. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158:352-7. 41. Hasday JD, Bascom R, Costa JJ, Fitzgerald T, Dubin W. Bacterial endotoxin is an active component of cigarette smoke. Chest 1999; 115:829-35. 42. Park JH, Gold DR, Spiegelman DL, Burge HA, Milton DK. House dust endotoxin and wheeze in the first year of life. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163:322-8. 43. Michel O, Ginanni R, Duchateau J, Vertongen F, le Bon B, Sergysels R. Domestic endotoxin exposure and clinical severity of asthma. Clin Exp Allergy 1991; 21:441-8. 44. Kurinczuk JJ, Parsons DE, Dawes V, Burton PR. The relationship between asthma and smoking during pregnancy. Women Health 1999; 29:31-47. 45. Schatz M, Harden K, Forsythe A, Chilingar L, Hoffman C, Sperling W, Zeiger RS. The course of asthma during pregnancy, post partum, and with successive pregnancies: a prospective analysis. J Allergy Clin Immunol 1988; 81:509-17. 46. Schatz M, Dombrowski MP, Wise R, Thom EA, Landon M, Mabie W, Newman RB, Hauth JC, Lindheimer M, Caritis SN, Leveno KJ, Meis P, Miodovnik M, Wapner RJ, Paul RH, Varner MW, O'Sullivan MJ, Thurnau GR, Conway D, McNellis D. Asthma morbidity during pregnancy can be predicted by severity classification. J Allergy Clin Immunol 2003; 112:283-8. 47. Murphy VE, Clifton VL, Gibson PG. Asthma exacerbations during pregnancy: incidence and association with adverse pregnancy outcomes. Thorax 2006; 61:169-76. 48. Liu S, Wen SW, Demissie K, Marcoux S, Kramer MS. Maternal asthma and pregnancy outcomes: a retrospective cohort study. Am J Obstet Gynecol 2001; 184:90-6. 49. Triche EW, Saftlas AF, Belanger K, Leaderer BP, Bracken MB. Association of asthma diagnosis, severity, symptoms, and treatment with risk of preeclampsia. Obstet Gynecol 2004; 104:585-93. 50. Schatz M, Leibman C. Inhaled corticosteroid use and outcomes in pregnancy. Ann Allergy Asthma Immunol 2005; 95:234-8. 51. Dunnill MS. The pathology of asthma, with special reference to changes in the bronchial mucosa. J Clin Pathol 1960; 13:27-33. 52. Busse WW, Lemanske RF, Jr. Asthma. N Engl J Med 2001; 344:350-62.
78
53. Bousquet J, Jeffery PK, Busse WW, Johnson M, Vignola AM. Asthma. From bronchoconstriction to airways inflammation and remodeling. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161:1720-45. 54. Humbert M, Menz G, Ying S, Corrigan CJ, Robinson DS, Durham SR, Kay AB. The immunopathology of extrinsic (atopic) and intrinsic (non-atopic) asthma: more similarities than differences. Immunol Today 1999; 20:528-33. 55. Ying S, Humbert M, Meng Q, Pfister R, Menz G, Gould HJ, Kay AB, Durham SR. Local expression of epsilon germline gene transcripts and RNA for the epsilon heavy chain of IgE in the bronchial mucosa in atopic and nonatopic asthma. J Allergy Clin Immunol 2001; 107:686-92. 56. Holgate ST, Davies DE, Powell RM, Howarth PH, Haitchi HM, Holloway JW. Local genetic and environmental factors in asthma disease pathogenesis: chronicity and persistence mechanisms. Eur Respir J 2007; 29:793-803. 57. Bradding P, Walls AF, Holgate ST. The role of the mast cell in the pathophysiology of asthma. J Allergy Clin Immunol 2006; 117:1277-84. 58. Brightling CE, Bradding P, Symon FA, Holgate ST, Wardlaw AJ, Pavord ID. Mast-cell infiltration of airway smooth muscle in asthma. N Engl J Med 2002; 346:1699-705. 59. Bentley AM, Hamid Q, Robinson DS, Schotman E, Meng Q, Assoufi B, Kay AB, Durham SR. Prednisolone treatment in asthma. Reduction in the numbers of eosinophils, T cells, tryptase-only positive mast cells, and modulation of IL-4, IL-5, and interferon-gamma cytokine gene expression within the bronchial mucosa. Am J Respir Crit Care Med 1996; 153:551-6. 60. Yang W, Kaur D, Okayama Y, Ito A, Wardlaw AJ, Brightling CE, Bradding P. Human lung mast cells adhere to human airway smooth muscle, in part, via tumor suppressor in lung cancer-1. J Immunol 2006; 176:1238-43. 61. Kulka M, Alexopoulou L, Flavell RA, Metcalfe DD. Activation of mast cells by double-stranded RNA: evidence for activation through Toll-like receptor 3. J Allergy Clin Immunol 2004; 114:174-82. 62. McCurdy JD, Olynych TJ, Maher LH, Marshall JS. Cutting edge: distinct Tolllike receptor 2 activators selectively induce different classes of mediator production from human mast cells. J Immunol 2003; 170:1625-9. 63. Supajatura V, Ushio H, Nakao A, Akira S, Okumura K, Ra C, Ogawa H. Differential responses of mast cell Toll-like receptors 2 and 4 in allergy and innate immunity. J Clin Invest 2002; 109:1351-9. 64. Kozma GT, Losonczy G, Keszei M, Komlosi ZsI, Buzas E, Pallinger E, Appel J, Szabo T, Magyar P, Falus A, Szalai C. Histamine deficiency in gene-targeted mice strongly reduces antigen-induced airway hyper-responsiveness, eosinophilia and allergen-specific IgE. Int Immunol 2003; 15:963-73.
79
65. John M, Lim S, Seybold J, Jose P, Robichaud A, O'Connor B, Barnes PJ, Chung KF. Inhaled corticosteroids increase interleukin-10 but reduce macrophage inflammatory protein-1alpha, granulocyte-macrophage colony-stimulating factor, and interferon-gamma release from alveolar macrophages in asthma. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157:256-62. 66. Spiteri MA, Knight RA, Jeremy JY, Barnes PJ, Chung KF. Alveolar macrophage-induced suppression of peripheral blood mononuclear cell responsiveness is reversed by in vitro allergen exposure in bronchial asthma. Eur Respir J 1994; 7:1431-8. 67. Tang C, Ward C, Reid D, Bish R, O'byrne PM, Walters EH. Normally suppressing CD40 coregulatory signals delivered by airway macrophages to Th2 lymphocytes are defective in patients with atopic asthma. J Allergy Clin Immunol 2001; 107:863-70. 68. Holt PG, McMenamin C. Defence against allergic sensitization in the healthy lung: the role of inhalation tolerance. Clin Exp Allergy 1989; 19:255-62. 69. Holt PG, Stumbles PA. Regulation of immunologic homeostasis in peripheral tissues by dendritic cells: the respiratory tract as a paradigm. J Allergy Clin Immunol 2000; 105:421-9. 70. Geissmann F, Jung S, Littman DR. Blood monocytes consist of two principal subsets with distinct migratory properties. Immunity 2003; 19:71-82. 71. Akbari O, DeKruyff RH, Umetsu DT. Pulmonary dendritic cells producing IL10 mediate tolerance induced by respiratory exposure to antigen. Nat Immunol 2001; 2:725-31. 72. Gett AV, Sallusto F, Lanzavecchia A, Geginat J. T cell fitness determined by signal strength. Nat Immunol 2003; 4:355-60. 73. Matzinger P. The danger model: A renewed sense of self. Science 2002; 296:301-5. 74. Vermaelen K, Pauwels R. Accelerated airway dendritic cell maturation, trafficking, and elimination in a mouse model of asthma. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology 2003; 29:405-9. 75. Dabbagh K, Dahl ME, Stepick-Biek P, Lewis DB. Toll-like receptor 4 is required for optimal development of Th2 immune responses: role of dendritic cells. J Immunol 2002; 168:4524-30. 76. Eisenbarth SC, Piggott DA, Huleatt JW, Visintin I, Herrick CA, Bottomly K. Lipopolysaccharide-enhanced, toll-like receptor 4-dependent T helper cell type 2 responses to inhaled antigen. J Exp Med 2002; 196:1645-51. 77. Moser M, Murphy KM. Dendritic cell regulation of Th1-Th2 development. Nat Immunol 2000; 1:199-205.
80
78. Barnes PJ. Pathophysiology of asthma. Eur Respir Mon 2003; 23:84-113. 79. Yukawa T, Read RC, Kroegel C, Rutman A, Chung KF, Wilson R, Cole PJ, Barnes PJ. The effects of activated eosinophils and neutrophils on guinea pig airway epithelium in vitro. Am J Respir Cell Mol Biol 1990; 2:341-53. 80. Gleich GJ. Mechanisms of eosinophil-associated inflammation. J Allergy Clin Immunol 2000; 105:651-63. 81. Robinson DS, Kay AB, Wardlaw AJ. Eosinophils. Clin Allergy Immunol 2002; 16:43-75. 82. Adamko D, Lacy P, Moqbel R. Mechanisms of eosinophil recruitment and activation. Curr Allergy Asthma Rep 2002; 2:107-16. 83. Woolley MJ, Denburg JA, Ellis R, Dahlback M, O'byrne PM. Allergen-induced changes in bone marrow progenitors and airway responsiveness in dogs and the effect of inhaled budesonide on these parameters. Am J Respir Cell Mol Biol 1994; 11:600-6. 84. Tachimoto H, Bochner BS. The surface phenotype of human eosinophils. Chem Immunol 2000; 76:45-62. 85. Wardlaw AJ. Molecular basis for selective eosinophil trafficking in asthma: A multistep paradigm. J Allergy Clin Immunol 1999; 104:917-26. 86. Pilewski JM, Albelda SM. Cell adhesion molecules in asthma: homing, activation, and airway remodeling. Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 12:1-3. 87. Lamas AM, Mulroney CM, Schleimer RP. Studies on the adhesive interaction between purified human eosinophils and cultured vascular endothelial cells. J Immunol 1988; 140:1500-5. 88. Park CS, Choi YS, Ki SY, Moon SH, Jeong SW, Uh ST, Kim YH. Granulocyte macrophage colony-stimulating factor is the main cytokine enhancing survival of eosinophils in asthmatic airways. Eur Respir J 1998; 12:872-8. 89. Simon HU. Regulation of eosinophil and neutrophil apoptosis--similarities and differences. Immunol Rev 2001; 179:156-62. 90. Blease K, Lukacs NW, Hogaboam CM, Kunkel SL. Chemokines and their role in airway hyper-reactivity. Respir Res 2000; 1:54-61. 91. Jatakanon A, Uasuf C, Maziak W, Lim S, Chung KF, Barnes PJ. Neutrophilic inflammation in severe persistent asthma. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160:1532-9. 92. Gibson PG, Simpson JL, Saltos N. Heterogeneity of airway inflammation in persistent asthma : evidence of neutrophilic inflammation and increased sputum interleukin-8. Chest 2001; 119:1329-36.
81
93. Sur S, Crotty TB, Kephart GM, Hyma BA, Colby TV, Reed CE, Hunt LW, Gleich GJ. Sudden-onset fatal asthma. A distinct entity with few eosinophils and relatively more neutrophils in the airway submucosa? Am Rev Respir Dis 1993; 148:713-9. 94. Lommatzsch M, Julius P, Kuepper M, Garn H, Bratke K, Irmscher S, Luttmann W, Renz H, Braun A, Virchow JC. The course of allergen-induced leukocyte infiltration in human and experimental asthma. J Allergy Clin Immunol 2006; 118:91-7. 95. Cox G. Glucocorticoid treatment inhibits apoptosis in human neutrophils. Separation of survival and activation outcomes. J Immunol 1995; 154:4719-25. 96. Robinson DS, Hamid Q, Ying S, Tsicopoulos A, Barkans J, Bentley AM, Corrigan C, Durham SR, Kay AB. Predominant Th2-like bronchoalveolar Tlymphocyte population in atopic asthma. N Engl J Med 1992; 326:298-304. 97. Huang SK, Xiao HQ, Kleinetebbe J, Paciotti G, Marsh DG, Lichtenstein LM, Liu MC. Il-13 Expression at the Sites of Allergen Challenge in Patients with Asthma. Journal of Immunology 1995; 155:2688-94. 98. Nakamura Y, Ghaffar O, Olivenstein R, Taha RA, Soussi-Gounni A, Zhang DH, Ray A, Hamid Q. Gene expression of the GATA-3 transcription factor is increased in atopic asthma. J Allergy Clin Immunol 1999; 103:215-22. 99. Finotto S, Neurath MF, Glickman JN, Qin SX, Lehr HA, Green FHY, Ackerman K, Haley K, Gatte PR, Szabo SJ, Drazen JM, de Sanctis GT, Glimcher LH. Development of spontaneous airway changes consistent with human asthma in mice lacking T-bet. Science 2002; 295:336-8. 100. Mosmann TR, Coffman RL. Th1 and Th2 cells: different patterns of lymphokine secretion lead to different functional properties. Annu Rev Immunol 1989; 7:145-73. 101. Iwamoto I, Nakajima H, Endo H, Yoshida S. Interferon-Gamma Regulates Antigen-Induced Eosinophil Recruitment Into the Mouse Airways by Inhibiting the Infiltration of Cd4+ T-Cells. Journal of Experimental Medicine 1993; 177:573-6. 102. Huang TJ, Macary PA, Eynott P, Moussavi A, Daniel KC, Askenase PW, Kemeny DM, Chung KF. Allergen-specific Th1 cells counteract efferent Th2 cell-dependent bronchial hyperresponsiveness and eosinophilic inflammation partly via IFN-gamma. Journal of Immunology 2001; 166:207-17. 103. Hansen G, Berry G, DeKruyff RH, Umetsu DT. Allergen-specific Th1 cells fail to counterbalance Th2 cell-induced airway hyperreactivity but cause severe airway inflammation. J Clin Invest 1999; 103:175-83.
82
104. Dahl ME, Dabbagh K, Liggitt D, Kim S, Lewis DB. Viral-induced T helper type 1 responses enhance allergic disease by effects on lung dendritic cells. Nat Immunol 2004; 5:337-43. 105. Randolph DA, Carruthers CJL, Szabo SJ, Murphy KM, Chaplin DD. Modulation of airway inflammation by passive transfer of allergen-specific Th1 and Th2 cells in a mouse model of asthma. Journal of Immunology 1999; 162:2375-83. 106. Stephens R, Randolph DA, Huang GM, Holtzman MJ, Chaplin DD. Antigennonspecific recruitment of Th2 cells to the lung as a mechanism for viral infection-induced allergic asthma. Journal of Immunology 2002; 169:5458-67. 107. Rowe J, Heaton T, Kusel M, Suriyaarachchi D, Serralha M, Holt BJ, de Klerk N, Sly PD, Holt PG. High IFN-gamma production by CD8+ T cells and early sensitization among infants at high risk of atopy. J Allergy Clin Immunol 2004; 113:710-6. 108. Krug N, Madden J, Redington AE, Lackie P, Djukanovic R, Schauer U, Holgate ST, Frew AJ, Howarth PH. T-cell cytokine profile evaluated at the single cell level in BAL and blood in allergic asthma. Am J Respir Cell Mol Biol 1996; 14:319-26. 109. Yazdanbakhsh M, Kremsner PG, van Ree R. Allergy, parasites, and the hygiene hypothesis. Science 2002; 296:490-4. 110. Sheikh A, Smeeth L, Hubbard R. There is no evidence of an inverse relationship between Th2-mediated atopy and Th1-mediated autoimmune disorders: Lack of support for the hygiene hypothesis. J Allergy Clin Immunol 2003; 111:131-5. 111. Bach JF. The effect of infections on susceptibility to autoimmune and allergic diseases. N Engl J Med 2002; 347:911-20. 112. Mosmann TR, Sad S. The expanding universe of T-cell subsets: Th1, Th2 and more. Immunol Today 1996; 17:138-46. 113. Cohn L, Elias JA, Chupp GL. ASTHMA: Mechanisms of disease persistence and progression. Annual Review of Immunology 2004; 22:789-815. 114. Koppelman B, Neefjes JJ, de Vries JE, Malefyt RD. Interleukin-10 downregulates MHC class II alpha beta peptide complexes at the plasma membrane of monocytes by affecting arrival and recycling. Immunity 1997; 7:861-71. 115. Martin E, O'Sullivan B, Low P, Thomas R. Antigen-specific suppression of a primed immune response by dendritic cells mediated by regulatory T cells secreting interleukin-10. Immunity 2003; 18:155-67. 116. Akbari O, Faul JL, Hoyte EG, Berry GJ, Wahlstrom J, Kronenberg M, DeKruyff RH, Umetsu DT. CD4+ invariant T-cell-receptor+ natural killer T cells in bronchial asthma. N Engl J Med 2006; 354:1117-29.
83
117. Braunstahl GJ, Overbeek SE, Fokkens WJ, Kleinjan A, McEuen AR, Walls AF, Hoogsteden HC, Prins JB. Segmental bronchoprovocation in allergic rhinitis patients affects mast cell and basophil numbers in nasal and bronchial mucosa. Am J Respir Crit Care Med 2001; 164:858-65. 118. Abi-Younes S, Si-Tahar M, Luster AD. The CC chemokines MDC and TARC induce platelet activation via CCR4. Thromb Res 2001; 101:279-89. 119. Moritani C, Ishioka S, Haruta Y, Kambe M, Yamakido M. Activation of platelets in bronchial asthma. Chest 1998; 113:452-8. 120. Herd CM, Page CP. Pulmonary immune cells in health and disease: platelets. Eur Respir J 1994; 7:1145-60. 121. Sullivan PJ, Jafar ZH, Harbinson PL, Restrick LJ, Costello JF, Page CP. Platelet dynamics following allergen challenge in allergic asthmatics. Respiration 2000; 67:514-7. 122. Levine SJ. Bronchial epithelial cell-cytokine inflammation. J Investig Med 1995; 43:241-9.
interactions
in
airway
123. Chung KF. Airway smooth muscle cells: contributing to and regulating airway mucosal inflammation? Eur Respir J 2000; 15:961-8. 124. Drazen JM, Israel E, O'byrne PM. Treatment of asthma with drugs modifying the leukotriene pathway. N Engl J Med 1999; 340:197-206. 125. Diamant Z, Hiltermann JT, van Rensen EL, Callenbach PM, Veselic-Charvat M, van der V, Sont JK, Sterk PJ. The effect of inhaled leukotriene D4 and methacholine on sputum cell differentials in asthma. Am J Respir Crit Care Med 1997; 155:1247-53. 126. Kim KT, Ginchansky EJ, Friedman BF, Srebro S, Pepsin PJ, Edwards L, Stanford RH, Rickard K. Fluticasone propionate versus zafirlukast: effect in patients previously receiving inhaled corticosteroid therapy. Ann Allergy Asthma Immunol 2000; 85:398-406. 127. Bousquet J, Clark TJ, Hurd S, Khaltaev N, Lenfant C, O'byrne P, Sheffer A. GINA guidelines on asthma and beyond. Allergy 2007; 62:102-12. 128. Sanak M, Pierzchalska M, Bazan-Socha S, Szczeklik A. Enhanced expression of the leukotriene C(4) synthase due to overactive transcription of an allelic variant associated with aspirin-intolerant asthma. Am J Respir Cell Mol Biol 2000; 23:290-6. 129. Chavis C, Vachier I, Godard P, Bousquet J, Chanez P. Lipoxins and other arachidonate derived mediators in bronchial asthma. Thorax 2000; 55 Suppl 2:S38-S41.
84
130. Taha R, Olivenstein R, Utsumi T, Ernst P, Barnes PJ, Rodger IW, Giaid A. Prostaglandin H synthase 2 expression in airway cells from patients with asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161:636-40. 131. Matsuoka T, Hirata M, Tanaka H, Takahashi Y, Murata T, Kabashima K, Sugimoto Y, Kobayashi T, Ushikubi F, Aze Y, Eguchi N, Urade Y, Yoshida N, Kimura K, Mizoguchi A, Honda Y, Nagai H, Narumiya S. Prostaglandin D2 as a mediator of allergic asthma. Science 2000; 287:2013-7. 132. Hirai H, Tanaka K, Yoshie O, Ogawa K, Kenmotsu K, Takamori Y, Ichimasa M, Sugamura K, Nakamura M, Takano S, Nagata K. Prostaglandin D2 selectively induces chemotaxis in T helper type 2 cells, eosinophils, and basophils via seven-transmembrane receptor CRTH2. J Exp Med 2001; 193:255-61. 133. Kuitert LM, Angus RM, Barnes NC, Barnes PJ, Bone MF, Chung KF, Fairfax AJ, Higenbotham TW, O'Connor BJ, Piotrowska B, . Effect of a novel potent platelet-activating factor antagonist, modipafant, in clinical asthma. Am J Respir Crit Care Med 1995; 151:1331-5. 134. Chung KF, Barnes PJ. Cytokines in asthma. Thorax 1999; 54:825-57. 135. Swain SL, Weinberg AD, English M, Huston G. Il-4 Directs the Development of Th2-Like Helper Effectors. Journal of Immunology 1990; 145:3796-806. 136. Vijayanand P, Seumois G, Pickard C, Powell RM, Angco G, Sammut D, Gadola SD, Friedmann PS, Djukanovic R. Invariant natural killer T cells in asthma and chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med 2007; 356:1410-22. 137. Schleimer RP, Sterbinsky SA, Kaiser J, Bickel CA, Klunk DA, Tomioka K, Newman W, Luscinskas FW, Gimbrone MA, Jr., McIntyre BW, . IL-4 induces adherence of human eosinophils and basophils but not neutrophils to endothelium. Association with expression of VCAM-1. J Immunol 1992; 148:1086-92. 138. Temann UA, Prasad B, Gallup MW, Basbaum C, Ho SB, Flavell RA, Rankin JA. A novel role for murine IL-4 in vivo: induction of MUC5AC gene expression and mucin hypersecretion. Am J Respir Cell Mol Biol 1997; 16:4718. 139. Coyle AJ, le Gros G, Bertrand C, Tsuyuki S, Heusser CH, Kopf M, Anderson GP. Interleukin-4 is required for the induction of lung Th2 mucosal immunity. Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 13:54-9. 140. Corry DB, Folkesson HG, Warnock ML, Erle DJ, Matthay MA, Wiener-Kronish JP, Locksley RM. Interleukin 4, but not interleukin 5 or eosinophils, is required in a murine model of acute airway hyperreactivity. J Exp Med 1996; 183:10917.
85
141. Bradding P, Roberts JA, Britten KM, Montefort S, Djukanovic R, Mueller R, Heusser CH, Howarth PH, Holgate ST. Interleukin-4, -5, and -6 and tumor necrosis factor-alpha in normal and asthmatic airways: evidence for the human mast cell as a source of these cytokines. Am J Respir Cell Mol Biol 1994; 10:471-80. 142. Broide DH, Paine MM, Firestein GS. Eosinophils express interleukin 5 and granulocyte macrophage-colony-stimulating factor mRNA at sites of allergic inflammation in asthmatics. J Clin Invest 1992; 90:1414-24. 143. Keatings VM, O'Connor BJ, Wright LG, Huston DP, Corrigan CJ, Barnes PJ. Late response to allergen is associated with increased concentrations of tumor necrosis factor-alpha and IL-5 in induced sputum. J Allergy Clin Immunol 1997; 99:693-8. 144. Clutterbuck EJ, Hirst EM, Sanderson CJ. Human interleukin-5 (IL-5) regulates the production of eosinophils in human bone marrow cultures: comparison and interaction with IL-1, IL-3, IL-6, and GMCSF. Blood 1989; 73:1504-12. 145. Yamaguchi Y, Hayashi Y, Sugama Y, Miura Y, Kasahara T, Kitamura S, Torisu M, Mita S, Tominaga A, Takatsu K. Highly purified murine interleukin 5 (IL-5) stimulates eosinophil function and prolongs in vitro survival. IL-5 as an eosinophil chemotactic factor. J Exp Med 1988; 167:1737-42. 146. Lopez AF, Sanderson CJ, Gamble JR, Campbell HD, Young IG, Vadas MA. Recombinant human interleukin 5 is a selective activator of human eosinophil function. J Exp Med 1988; 167:219-24. 147. Mould AW, Matthaei KI, Young IG, Foster PS. Relationship between interleukin-5 and eotaxin in regulating blood and tissue eosinophilia in mice. J Clin Invest 1997; 99:1064-71. 148. Collins PD, Marleau S, Griffiths-Johnson DA, Jose PJ, Williams TJ. Cooperation between interleukin-5 and the chemokine eotaxin to induce eosinophil accumulation in vivo. J Exp Med 1995; 182:1169-74. 149. Leckie MJ, ten Brinke A, Khan J, Diamant Z, O'Connor BJ, Walls CM, Mathur AK, Cowley HC, Chung KF, Djukanovic R, Hansel TT, Holgate ST, Sterk PJ, Barnes PJ. Effects of an interleukin-5 blocking monoclonal antibody on eosinophils, airway hyper-responsiveness, and the late asthmatic response. Lancet 2000; 356:2144-8. 150. Kips JC, O'Connor BJ, Langley SJ, Woodcock A, Kerstjens HA, Postma DS, Danzig M, Cuss F, Pauwels RA. Effect of SCH55700, a humanized anti-human interleukin-5 antibody, in severe persistent asthma: a pilot study. Am J Respir Crit Care Med 2003; 167:1655-9.
86
151. Wills-Karp M, Luyimbazi J, Xu X, Schofield B, Neben TY, Karp CL, Donaldson DD. Interleukin-13: central mediator of allergic asthma. Science 1998; 282:2258-61. 152. Gutierrez-Ramos JC, Lloyd C, Gonzalo JA. Eotaxin: from an eosinophilic chemokine to a major regulator of allergic reactions. Immunol Today 1999; 20:500-4. 153. Gonzalo JA, Lloyd CM, Kremer L, Finger E, Martinez A, Siegelman MH, Cybulsky M, Gutierrez-Ramos JC. Eosinophil recruitment to the lung in a murine model of allergic inflammation. The role of T cells, chemokines, and adhesion receptors. J Clin Invest 1996; 98:2332-45. 154. Campbell EM, Charo IF, Kunkel SL, Strieter RM, Boring L, Gosling J, Lukacs NW. Monocyte chemoattractant protein-1 mediates cockroach allergen-induced bronchial hyperreactivity in normal but not CCR2-/- mice: the role of mast cells. J Immunol 1999; 163:2160-7. 155. Lloyd CM, Delaney T, Nguyen T, Tian J, Martinez A, Coyle AJ, GutierrezRamos JC. CC chemokine receptor (CCR)3/eotaxin is followed by CCR4/monocyte-derived chemokine in mediating pulmonary T helper lymphocyte type 2 recruitment after serial antigen challenge in vivo. J Exp Med 2000; 191:265-74. 156. Berin MC, Eckmann L, Broide DH, Kagnoff MF. Regulated production of the T helper 2-type T-cell chemoattractant TARC by human bronchial epithelial cells in vitro and in human lung xenografts. Am J Respir Cell Mol Biol 2001; 24:3829. 157. Sekiya T, Miyamasu M, Imanishi M, Yamada H, Nakajima T, Yamaguchi M, Fujisawa T, Pawankar R, Sano Y, Ohta K, Ishii A, Morita Y, Yamamoto K, Matsushima K, Yoshie O, Hirai K. Inducible expression of a Th2-type CC chemokine thymus- and activation-regulated chemokine by human bronchial epithelial cells. J Immunol 2000; 165:2205-13. 158. Baggiolini M, Wymann MP. Turning on the respiratory burst. Trends Biochem Sci 1990; 15:69-72. 159. Ricciardolo FL, Di SA, Sabatini F, Folkerts G. Reactive nitrogen species in the respiratory tract. Eur J Pharmacol 2006; 533:240-52. 160. Ward JK, Barnes PJ, Springall DR, Abelli L, Tadjkarimi S, Yacoub MH, Polak JM, Belvisi MG. Distribution of human i-NANC bronchodilator and nitric oxide-immunoreactive nerves. Am J Respir Cell Mol Biol 1995; 13:175-84. 161. Fischer A, Mayer B, Kummer W. Nitric oxide synthase in vagal sensory and sympathetic neurons innervating the guinea-pig trachea. J Auton Nerv Syst 1996; 56:157-60.
87
162. Shaul PW, North AJ, Wu LC, Wells LB, Brannon TS, Lau KS, Michel T, Margraf LR, Star RA. Endothelial nitric oxide synthase is expressed in cultured human bronchiolar epithelium. J Clin Invest 1994; 94:2231-6. 163. Guo FH, de Raeve HR, Rice TW, Stuehr DJ, Thunnissen FB, Erzurum SC. Continuous nitric oxide synthesis by inducible nitric oxide synthase in normal human airway epithelium in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A 1995; 92:7809-13. 164. Kobzik L, Bredt DS, Lowenstein CJ, Drazen J, Gaston B, Sugarbaker D, Stamler JS. Nitric oxide synthase in human and rat lung: immunocytochemical and histochemical localization. Am J Respir Cell Mol Biol 1993; 9:371-7. 165. Watkins DN, Peroni DJ, Basclain KA, Garlepp MJ, Thompson PJ. Expression and activity of nitric oxide synthases in human airway epithelium. Am J Respir Cell Mol Biol 1997; 16:629-39. 166. Haddad EB, Liu SF, Salmon M, Robichaud A, Barnes PJ, Chung KF. Expression of inducible nitric oxide synthase mRNA in Brown Norway rats exposed to ozone: effect of dexamethasone. Eur J Pharmacol 1995; 293:287-90. 167. Redington AE. Modulation of nitric oxide pathways: therapeutic potential in asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Eur J Pharmacol 2006; 533:263-76. 168. Nijkamp FP, van der Linde HJ, Folkerts G. Nitric oxide synthesis inhibitors induce airway hyperresponsiveness in the guinea pig in vivo and in vitro. Role of the epithelium. Am Rev Respir Dis 1993; 148:727-34. 169. Ricciardolo FL, Nadel JA, Yoshihara S, Geppetti P, Yoishihara S [corrected to Yoshihara. Evidence for reduction of bradykinin-induced bronchoconstriction in guinea-pigs by release of nitric oxide. Br J Pharmacol 1994; 113:1147-52. 170. Ricciardolo FL, Rado V, Fabbri LM, Sterk PJ, Di Maria GU, Geppetti P. Bronchoconstriction induced by citric acid inhalation in guinea pigs: role of tachykinins, bradykinin, and nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 1999; 159:557-62. 171. Feletou M, Lonchampt M, Coge F, Galizzi JP, Bassoullet C, Merial C, Robineau P, Boutin JA, Huang PL, Vanhoutte PM, Canet E. Regulation of murine airway responsiveness by endothelial nitric oxide synthase. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2001; 281:L258-L267. 172. Hasaneen NA, Foda HD, Said SI. Nitric oxide and vasoactive intestinal peptide as co-transmitters of airway smooth-muscle relaxation: analysis in neuronal nitric oxide synthase knockout mice. Chest 2003; 124:1067-72. 173. de Gouw HW, Verbruggen MB, Twiss IM, Sterk PJ. Effect of oral L-arginine on airway hyperresponsiveness to histamine in asthma. Thorax 1999; 54:1033-5.
88
174. de Boer J, Meurs H, Coers W, Koopal M, Bottone AE, Visser AC, Timens W, Zaagsma J. Deficiency of nitric oxide in allergen-induced airway hyperreactivity to contractile agonists after the early asthmatic reaction: an ex vivo study. Br J Pharmacol 1996; 119:1109-16. 175. Schuiling M, Zuidhof AB, Bonouvrie MA, Venema N, Zaagsma J, Meurs H. Role of nitric oxide in the development and partial reversal of allergen-induced airway hyperreactivity in conscious, unrestrained guinea-pigs. Br J Pharmacol 1998; 123:1450-6. 176. Ricciardolo FL, Timmers MC, Geppetti P, van Schadewijk A, Brahim JJ, Sont JK, de Gouw HW, Hiemstra PS, van Krieken JH, Sterk PJ. Allergen-induced impairment of bronchoprotective nitric oxide synthesis in asthma. J Allergy Clin Immunol 2001; 108:198-204. 177. Trifilieff A, Fujitani Y, Mentz F, Dugas B, Fuentes M, Bertrand C. Inducible nitric oxide synthase inhibitors suppress airway inflammation in mice through down-regulation of chemokine expression. J Immunol 2000; 165:1526-33. 178. Eynott PR, Groneberg DA, Caramori G, Adcock IM, Donnelly LE, Kharitonov S, Barnes PJ, Chung KF. Role of nitric oxide in allergic inflammation and bronchial hyperresponsiveness. Eur J Pharmacol 2002; 452:123-33. 179. Kharitonov SA, O'Connor BJ, Evans DJ, Barnes PJ. Allergen-induced late asthmatic reactions are associated with elevation of exhaled nitric oxide. Am J Respir Crit Care Med 1995; 151:1894-9. 180. Massaro AF, Gaston B, Kita D, Fanta C, Stamler JS, Drazen JM. Expired nitric oxide levels during treatment of acute asthma. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152:800-3. 181. de Gouw HW, Grunberg K, Schot R, Kroes AC, Dick EC, Sterk PJ. Relationship between exhaled nitric oxide and airway hyperresponsiveness following experimental rhinovirus infection in asthmatic subjects. Eur Respir J 1998; 11:126-32. 182. Hammermann R, Hirschmann J, Hey C, Mossner J, Folkerts G, Nijkamp FP, Wessler I, Racke K. Cationic proteins inhibit L-arginine uptake in rat alveolar macrophages and tracheal epithelial cells. Implications for nitric oxide synthesis. Am J Respir Cell Mol Biol 1999; 21:155-62. 183. Meurs H, McKay S, Maarsingh H, Hamer MA, Macic L, Molendijk N, Zaagsma J. Increased arginase activity underlies allergen-induced deficiency of cNOSderived nitric oxide and airway hyperresponsiveness. Br J Pharmacol 2002; 136:391-8. 184. Hunt JF, Fang K, Malik R, Snyder A, Malhotra N, Platts-Mills TA, Gaston B. Endogenous airway acidification. Implications for asthma pathophysiology. Am J Respir Crit Care Med 2000; 161:694-9.
89
185. Ojoo JC, Mulrennan SA, Kastelik JA, Morice AH, Redington AE. Exhaled breath condensate pH and exhaled nitric oxide in allergic asthma and in cystic fibrosis. Thorax 2005; 60:22-6. 186. Guo FH, Uetani K, Haque SJ, Williams BR, Dweik RA, Thunnissen FB, Calhoun W, Erzurum SC. Interferon gamma and interleukin 4 stimulate prolonged expression of inducible nitric oxide synthase in human airway epithelium through synthesis of soluble mediators. J Clin Invest 1997; 100:82938. 187. Iijima H, Duguet A, Eum SY, Hamid Q, Eidelman DH. Nitric oxide and protein nitration are eosinophil dependent in allergen-challenged mice. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163:1233-40. 188. Kharitonov SA, Yates DH, Barnes PJ. Inhaled glucocorticoids decrease nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Am J Respir Crit Care Med 1996; 153:454-7. 189. Silkoff PE, McClean PA, Slutsky AS, Caramori M, Chapman KR, Gutierrez C, Zamel N. Exhaled nitric oxide and bronchial reactivity during and after inhaled beclomethasone in mild asthma. J Asthma 1998; 35:473-9. 190. Bisgaard H, Loland L, Oj JA. NO in exhaled air of asthmatic children is reduced by the leukotriene receptor antagonist montelukast. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160:1227-31. 191. Silkoff PE, Romero FA, Gupta N, Townley RG, Milgrom H. Exhaled nitric oxide in children with asthma receiving Xolair (omalizumab), a monoclonal anti-immunoglobulin E antibody. Pediatrics 2004; 113:e308-e312. 192. Maclean A, Wei XQ, Huang FP, Al-Alem UA, Chan WL, Liew FY. Mice lacking inducible nitric-oxide synthase are more susceptible to herpes simplex virus infection despite enhanced Th1 cell responses. J Gen Virol 1998; 79 ( Pt 4):825-30. 193. MacMicking JD, Nathan C, Hom G, Chartrain N, Fletcher DS, Trumbauer M, Stevens K, Xie QW, Sokol K, Hutchinson N, . Altered responses to bacterial infection and endotoxic shock in mice lacking inducible nitric oxide synthase. Cell 1995; 81:641-50. 194. Wei XQ, Charles IG, Smith A, Ure J, Feng GJ, Huang FP, Xu D, Muller W, Moncada S, Liew FY. Altered immune responses in mice lacking inducible nitric oxide synthase. Nature 1995; 375:408-11. 195. Brown RH, Zerhouni EA, Mitzner W. Airway edema potentiates airway reactivity. J Appl Physiol 1995; 79:1242-8. 196. Belenky SN, Robbins RA, Rubinstein I. Nitric oxide synthase inhibitors attenuate human monocyte chemotaxis in vitro. J Leukoc Biol 1993; 53:498503.
90
197. Thomazzi SM, Ferreira HH, Conran N, de Nucci G, Antunes E. Role of nitric oxide on in vitro human eosinophil migration. Biochem Pharmacol 2001; 62:1417-21. 198. Belenky SN, Robbins RA, Rennard SI, Gossman GL, Nelson KJ, Rubinstein I. Inhibitors of nitric oxide synthase attenuate human neutrophil chemotaxis in vitro. J Lab Clin Med 1993; 122:388-94. 199. Beauvais F, Michel L, Dubertret L. The nitric oxide donors, azide and hydroxylamine, inhibit the programmed cell death of cytokine-deprived human eosinophils. FEBS Lett 1995; 361:229-32. 200. Jarjour NN, Calhoun WJ. Enhanced production of oxygen radicals in asthma. J Lab Clin Med 1994; 123:131-6. 201. Teramoto S, Shu CY, Ouchi Y, Fukuchi Y. Increased spontaneous production and generation of superoxide anion by blood neutrophils in patients with asthma. J Asthma 1996; 33:149-55. 202. Montuschi P, Corradi M, Ciabattoni G, Nightingale J, Kharitonov SA, Barnes PJ. Increased 8-isoprostane, a marker of oxidative stress, in exhaled condensate of asthma patients. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160:216-20. 203. Muijsers RB, Folkerts G, Henricks PA, Sadeghi-Hashjin G, Nijkamp FP. Peroxynitrite: a two-faced metabolite of nitric oxide. Life Sci 1997; 60:1833-45. 204. Sadeghi-Hashjin G, Folkerts G, Henricks PA, Verheyen AK, van der Linde HJ, van Ark I, Coene A, Nijkamp FP. Peroxynitrite induces airway hyperresponsiveness in guinea pigs in vitro and in vivo. Am J Respir Crit Care Med 1996; 153:1697-701. 205. Duguet A, Iijima H, Eum SY, Hamid Q, Eidelman DH. Eosinophil peroxidase mediates protein nitration in allergic airway inflammation in mice. Am J Respir Crit Care Med 2001; 164:1119-26. 206. Koarai A, Ichinose M, Sugiura H, Yamagata S, Hattori T, Shirato K. Allergic airway hyperresponsiveness and eosinophil infiltration is reduced by a selective iNOS inhibitor, 1400W, in mice. Pulm Pharmacol Ther 2000; 13:267-75. 207. Muijsers RB, van Ark I, Folkerts G, Koster AS, van Oosterhout AJ, Postma DS, Nijkamp FP. Apocynin and 1400 W prevents airway hyperresponsiveness during allergic reactions in mice. Br J Pharmacol 2001; 134:434-40. 208. Que LG, Liu L, Yan Y, Whitehead GS, Gavett SH, Schwartz DA, Stamler JS. Protection from experimental asthma by an endogenous bronchodilator. Science 2005; 308:1618-21. 209.
ATS/ERS recommendations for standardized procedures for the online and offline measurement of exhaled lower respiratory nitric oxide and nasal nitric oxide, 2005. Am J Respir Crit Care Med 2005; 171:912-30.
91
210. Sippel JM, Holden WE, Tilles SA, O'Hollaren M, Cook J, Thukkani N, Priest J, Nelson B, Osborne ML. Exhaled nitric oxide levels correlate with measures of disease control in asthma. J Allergy Clin Immunol 2000; 106:645-50. 211. Maziak W, Loukides S, Culpitt S, Sullivan P, Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled nitric oxide in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157:998-1002. 212. Horvath I, Donnelly LE, Kiss A, Balint B, Kharitonov SA, Barnes PJ. Exhaled nitric oxide and hydrogen peroxide concentrations in asthmatic smokers. Respiration 2004; 71:463-8. 213. Kharitonov SA, Yates D, Barnes PJ. Increased nitric oxide in exhaled air of normal human subjects with upper respiratory tract infections. Eur Respir J 1995; 8:295-7. 214. Horvath I. A kilégzett nitrogén-monoxid jelentősége asthma bronchialéban – Elkülönítő diagnosztika és követés. LAM 2005; 15:265-72. 215. Bellou A, Schaub B, Ting L, Finn PW. Toll receptors modulate allergic responses: interaction with dendritic cells, T cells and mast cells. Curr Opin Allergy Clin Immunol 2003; 3:487-94. 216. Woo JG, Assa'ad A, Heizer AB, Bernstein JA, Hershey GK. The -159 C-->T polymorphism of CD14 is associated with nonatopic asthma and food allergy. J Allergy Clin Immunol 2003; 112:438-44. 217. Koppelman GH, Reijmerink NE, Colin SO, Howard TD, Whittaker PA, Meyers DA, Postma DS, Bleecker ER. Association of a promoter polymorphism of the CD14 gene and atopy. Am J Respir Crit Care Med 2001; 163:965-9. 218. von Mutius E, Braun-Fahrlander C, Schierl R, Riedler J, Ehlermann S, Maisch S, Waser M, Nowak D. Exposure to endotoxin or other bacterial components might protect against the development of atopy. Clin Exp Allergy 2000; 30:1230-4. 219. Schnare M, Barton GM, Holt AC, Takeda K, Akira S, Medzhitov R. Toll-like receptors control activation of adaptive immune responses. Nat Immunol 2001; 2:947-50. 220. Redecke V, Hacker H, Datta SK, Fermin A, Pitha PM, Broide DH, Raz E. Cutting edge: activation of Toll-like receptor 2 induces a Th2 immune response and promotes experimental asthma. J Immunol 2004; 172:2739-43. 221. Agrawal S, Agrawal A, Doughty B, Gerwitz A, Blenis J, van Dyke T, Pulendran B. Cutting edge: different Toll-like receptor agonists instruct dendritic cells to induce distinct Th responses via differential modulation of extracellular signalregulated kinase-mitogen-activated protein kinase and c-Fos. J Immunol 2003; 171:4984-9.
92
222. Dillon S, Agrawal A, van Dyke T, Landreth G, McCauley L, Koh A, Maliszewski C, Akira S, Pulendran B. A Toll-like receptor 2 ligand stimulates Th2 responses in vivo, via induction of extracellular signal-regulated kinase mitogen-activated protein kinase and c-Fos in dendritic cells. J Immunol 2004; 172:4733-43. 223. Rodriguez D, Keller AC, Faquim-Mauro EL, de Macedo MS, Cunha FQ, Lefort J, Vargaftig BB, Russo M. Bacterial lipopolysaccharide signaling through Tolllike receptor 4 suppresses asthma-like responses via nitric oxide synthase 2 activity. J Immunol 2003; 171:1001-8. 224. Tulic MK, Wale JL, Holt PG, Sly PD. Modification of the inflammatory response to allergen challenge after exposure to bacterial lipopolysaccharide. Am J Respir Cell Mol Biol 2000; 22:604-12. 225. Watanabe J, Miyazaki Y, Zimmerman GA, Albertine KH, McIntyre TM. Endotoxin contamination of ovalbumin suppresses murine immunologic responses and development of airway hyper-reactivity. J Biol Chem 2003; 278:42361-8. 226. Rylander R, Haglind P, Lundholm M. Endotoxin in cotton dust and respiratory function decrement among cotton workers in an experimental cardroom. Am Rev Respir Dis 1985; 131:209-13. 227. Komlosi ZsI, Pozsonyi E, Tabi T, Szoko E, Nagy A, Bartos B, Kozma GT, Tamasi L, Orosz M, Magyar P, Losonczy G. Lipopolysaccharide exposure makes allergic airway inflammation and hyper-responsiveness less responsive to dexamethasone and inhibition of iNOS. Clin Exp Allergy 2006; 36:951-9. 228. Vercelli D. Genetics, epigenetics, and the environment: switching, buffering, releasing. J Allergy Clin Immunol 2004; 113:381-6. 229. Strohmeier GR, Walsh JH, Klings ES, Farber HW, Cruikshank WW, Center DM, Fenton MJ. Lipopolysaccharide binding protein potentiates airway reactivity in a murine model of allergic asthma. J Immunol 2001; 166:2063-70. 230. Masuda A, Yoshikai Y, Aiba K, Matsuguchi T. Th2 cytokine production from mast cells is directly induced by lipopolysaccharide and distinctly regulated by c-Jun N-terminal kinase and p38 pathways. J Immunol 2002; 169:3801-10. 231. Rietschel ET, Brade H, Holst O, Brade L, Muller-Loennies S, Mamat U, Zahringer U, Beckmann F, Seydel U, Brandenburg K, Ulmer AJ, Mattern T, Heine H, Schletter J, Loppnow H, Schonbeck U, Flad HD, Hauschildt S, Schade UF, Di PF, Kusumoto S, Schumann RR. Bacterial endotoxin: Chemical constitution, biological recognition, host response, and immunological detoxification. Curr Top Microbiol Immunol 1996; 216:39-81.
93
232. Pabst MJ, Hedegaard HB, Johnston RB, Jr. Cultured human monocytes require exposure to bacterial products to maintain an optimal oxygen radical response. J Immunol 1982; 128:123-8. 233. Liu AH. Endotoxin exposure in allergy and asthma: reconciling a paradox. J Allergy Clin Immunol 2002; 109:379-92. 234. Dentener MA, Vreugdenhil AC, Hoet PH, Vernooy JH, Nieman FH, Heumann D, Janssen YM, Buurman WA, Wouters EF. Production of the acute-phase protein lipopolysaccharide-binding protein by respiratory type II epithelial cells: implications for local defense to bacterial endotoxins. Am J Respir Cell Mol Biol 2000; 23:146-53. 235. Ingalls RR, Heine H, Lien E, Yoshimura A, Golenbock D. Lipopolysaccharide recognition, CD14, and lipopolysaccharide receptors. Infect Dis Clin North Am 1999; 13:341-53, vii. 236. Beutler B. Endotoxin, toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity. Curr Opin Microbiol 2000; 3:23-8. 237. Palsson-McDermott EM, O'Neill LA. Signal transduction by the lipopolysaccharide receptor, Toll-like receptor-4. Immunology 2004; 113:15362. 238. Schwartz DA, Thorne PS, Yagla SJ, Burmeister LF, Olenchock SA, Watt JL, Quinn TJ. The role of endotoxin in grain dust-induced lung disease. Am J Respir Crit Care Med 1995; 152:603-8. 239. Lefort J, Motreff L, Vargaftig BB. Airway administration of Escherichia coli endotoxin to mice induces glucocorticosteroid-resistant bronchoconstriction and vasopermeation. Am J Respir Cell Mol Biol 2001; 24:345-51. 240. Le J, Lin JX, Henriksen-DeStefano D, Vilcek J. Bacterial lipopolysaccharideinduced interferon-gamma production: roles of interleukin 1 and interleukin 2. J Immunol 1986; 136:4525-30. 241. D'Andrea A, Rengaraju M, Valiante NM, Chehimi J, Kubin M, Aste M, Chan SH, Kobayashi M, Young D, Nickbarg E, . Production of natural killer cell stimulatory factor (interleukin 12) by peripheral blood mononuclear cells. J Exp Med 1992; 176:1387-98. 242. Niven RM, Fletcher AM, Pickering CA, Fishwick D, Warburton CJ, Simpson JC, Francis H, Oldham LA. Chronic bronchitis in textile workers. Thorax 1997; 52:22-7. 243. Simpson JC, Niven RM, Pickering CA, Fletcher AM, Oldham LA, Francis HM. Prevalence and predictors of work related respiratory symptoms in workers exposed to organic dusts. Occup Environ Med 1998; 55:668-72.
94
244. Vernooy JH, Dentener MA, van Suylen RJ, Buurman WA, Wouters EF. Longterm intratracheal lipopolysaccharide exposure in mice results in chronic lung inflammation and persistent pathology. Am J Respir Cell Mol Biol 2002; 26:152-9. 245. Sur S, Glitz DG, Kita H, Kujawa SM, Peterson EA, Weiler DA, Kephart GM, Wagner JM, George TJ, Gleich GJ, Leiferman KM. Localization of eosinophilderived neurotoxin and eosinophil cationic protein in neutrophilic leukocytes. J Leukoc Biol 1998; 63:715-22. 246. Saitou M, Kida S, Kaise S, Suzuki S, Ohara M, Kasukawa R. Enhancement of eosinophil survival by lipopolysaccharide through releasing granulocytemacrophage colony stimulating factor from mononuclear cells from patients with bronchial asthma. Fukushima J Med Sci 1997; 43:75-85. 247. Wan GH, Li CS, Lin RH. Airborne endotoxin exposure and the development of airway antigen-specific allergic responses. Clin Exp Allergy 2000; 30:426-32. 248. Alexis N, Eldridge M, Reed W, Bromberg P, Peden DB. CD14-dependent airway neutrophil response to inhaled LPS: role of atopy. J Allergy Clin Immunol 2001; 107:31-5. 249. Dubin W, Martin TR, Swoveland P, Leturcq DJ, Moriarty AM, Tobias PS, Bleecker ER, Goldblum SE, Hasday JD. Asthma and endotoxin: lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD14 in bronchoalveolar compartment. Am J Physiol 1996; 270:L736-L744. 250. Tomlinson JE, McMahon AD, Chaudhuri R, Thompson JM, Wood SF, Thomson NC. Efficacy of low and high dose inhaled corticosteroid in smokers versus non-smokers with mild asthma. Thorax 2005; 60:282-7. 251. Medawar PB. Some immunological and endocrinological problems raised by the evolution of viviparity in vertebrates. In: Society for Experimental Biology. New York: Academic Press, 1953: 320-38. 252. Moffett A, Loke YW. The immunological paradox of pregnancy: a reappraisal. Placenta 2004; 25:1-8. 253. Bonney EA, Matzinger P. The maternal immune system's interaction with circulating fetal cells. J Immunol 1997; 158:40-7. 254. Bianchi DW, Zickwolf GK, Weil GJ, Sylvester S, DeMaria MA. Male fetal progenitor cells persist in maternal blood for as long as 27 years postpartum. Proc Natl Acad Sci U S A 1996; 93:705-8. 255. Sargent IL. Maternal and fetal immune responses during pregnancy. Exp Clin Immunogenet 1993; 10:85-102.
95
256. Knight M, Redman CW, Linton EA, Sargent IL. Shedding of syncytiotrophoblast microvilli into the maternal circulation in pre-eclamptic pregnancies. Br J Obstet Gynaecol 1998; 105:632-40. 257. Lo YM, Corbetta N, Chamberlain PF, Rai V, Sargent IL, Redman CW, Wainscoat JS. Presence of fetal DNA in maternal plasma and serum. Lancet 1997; 350:485-7. 258. Sacks G, Sargent I, Redman C. An innate view of human pregnancy. Immunol Today 1999; 20:114-8. 259. Mincheva-Nilsson L, Hammarstrom S, Hammarstrom ML. Human decidual leukocytes from early pregnancy contain high numbers of gamma delta+ cells and show selective down-regulation of alloreactivity. J Immunol 1992; 149:2203-11. 260. Mincheva-Nilsson L, Kling M, Hammarstrom S, Nagaeva O, Sundqvist KG, Hammarstrom ML, Baranov V. Gamma delta T cells of human early pregnancy decidua: evidence for local proliferation, phenotypic heterogeneity, and extrathymic differentiation. J Immunol 1997; 159:3266-77. 261. Carter J, Newport A, Keeler KD, Dresser DW. FACS analysis of changes in T and B lymphocyte populations in the blood, spleen and lymph nodes of pregnant mice. Immunology 1983; 48:791-7. 262. Dresser DW. The potentiating effect of pregnancy on humoral immune responses of mice. J Reprod Immunol 1991; 20:253-66. 263. Gardner L, Moffett A. Dendritic cells in the human decidua. Biol Reprod 2003; 69:1438-46. 264. Monk JM, Leonard S, McBey BA, Croy BA. Induction of murine spiral artery modification by recombinant human interferon-gamma. Placenta 2005; 26:8358. 265. Leonard S, Murrant C, Tayade C, van den Heuvel M, Watering R, Croy BA. Mechanisms regulating immune cell contributions to spiral artery modification - facts and hypotheses -- a review. Placenta 2006; 27 Suppl A:S40-S46. 266. Hayakawa S, Fujikawa T, Fukuoka H, Chisima F, Karasaki-Suzuki M, Ohkoshi E, Ohi H, Kiyoshi FT, Tochigi M, Satoh K, Shimizu T, Nishinarita S, Nemoto N, Sakurai I. Murine fetal resorption and experimental pre-eclampsia are induced by both excessive Th1 and Th2 activation. J Reprod Immunol 2000; 47:121-38. 267. Raghupathy R, Makhseed M, Azizieh F, Omu A, Gupta M, Farhat R. Cytokine production by maternal lymphocytes during normal human pregnancy and in unexplained recurrent spontaneous abortion. Hum Reprod 2000; 15:713-8.
96
268. Piccinni MP. T cells in normal pregnancy and recurrent pregnancy loss. Reprod Biomed Online 2006; 13:840-4. 269. Ekerfelt C, Lidstrom C, Matthiesen L, Berg G, Sharma S, Ernerudh J. Spontaneous secretion of interleukin-4, interleukin-10 and interferon-gamma by first trimester decidual mononuclear cells. Am J Reprod Immunol 2002; 47:15966. 270. Jones CA, Finlay-Jones JJ, Hart PH. Type-1 and type-2 cytokines in human lategestation decidual tissue. Biol Reprod 1997; 57:303-11. 271. Tamasi L, Bohacs A, Pallinger E, Falus A, Rigo J, Jr., Muller V, Komlosi ZsI, Magyar P, Losonczy G. Increased interferon-gamma- and interleukin-4synthesizing subsets of circulating T lymphocytes in pregnant asthmatics. Clin Exp Allergy 2005; 35:1197-203. 272. Moffett-King A. Natural killer cells and pregnancy. Nat Rev Immunol 2002; 2:656-63. 273. King A, Allan DS, Bowen M, Powis SJ, Joseph S, Verma S, Hiby SE, McMichael AJ, Loke YW, Braud VM. HLA-E is expressed on trophoblast and interacts with CD94/NKG2 receptors on decidual NK cells. Eur J Immunol 2000; 30:1623-31. 274. King A, Boocock C, Sharkey AM, Gardner L, Beretta A, Siccardi AG, Loke YW. Evidence for the expression of HLAA-C class I mRNA and protein by human first trimester trophoblast. J Immunol 1996; 156:2068-76. 275. Rajagopalan S, Long EO. A human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)G-specific receptor expressed on all natural killer cells. J Exp Med 1999; 189:1093-100. 276. Munz C, Holmes N, King A, Loke YW, Colonna M, Schild H, Rammensee HG. Human histocompatibility leukocyte antigen (HLA)-G molecules inhibit NKAT3 expressing natural killer cells. J Exp Med 1997; 185:385-91. 277. McCracken SA, Gallery E, Morris JM. Pregnancy-specific down-regulation of NF-kappa B expression in T cells in humans is essential for the maintenance of the cytokine profile required for pregnancy success. J Immunol 2004; 172:458391. 278. Kelemen K, Paldi A, Tinneberg H, Torok A, Szekeres-Bartho J. Early recognition of pregnancy by the maternal immune system. Am J Reprod Immunol 1998; 39:351-5. 279. Suciu-Foca N, Reed E, Rohowsky C, Kung P, King DW. Anti-idiotypic antibodies to anti-HLA receptors induced by pregnancy. Proc Natl Acad Sci U S A 1983; 80:830-4.
97
280. Munn DH, Zhou M, Attwood JT, Bondarev I, Conway SJ, Marshall B, Brown C, Mellor AL. Prevention of allogeneic fetal rejection by tryptophan catabolism. Science 1998; 281:1191-3. 281. Sacks GP, Studena K, Sargent K, Redman CW. Normal pregnancy and preeclampsia both produce inflammatory changes in peripheral blood leukocytes akin to those of sepsis. Am J Obstet Gynecol 1998; 179:80-6. 282. Losonczy G, Bohacs A, Komlosi ZsI, Tamasi L, Rigo J, Jr., Muller V, Magyar P. Anergia és immunstimuláció terhességben. Med Thor 2006; 59:37-46. 283. Ohgane J, Hattori N, Oda M, Tanaka S, Shiota K. Differentiation of trophoblast lineage is associated with DNA methylation and demethylation. Biochem Biophys Res Commun 2002; 290:701-6. 284. Mi S, Lee X, Li X, Veldman GM, Finnerty H, Racie L, LaVallie E, Tang XY, Edouard P, Howes S, Keith JC, Jr., McCoy JM. Syncytin is a captive retroviral envelope protein involved in human placental morphogenesis. Nature 2000; 403:785-9. 285. Akira S, Hemmi H. Recognition of pathogen-associated molecular patterns by TLR family. Immunol Lett 2003; 85:85-95. 286. Ozmen L, Pericin M, Hakimi J, Chizzonite RA, Wysocka M, Trinchieri G, Gately M, Garotta G. Interleukin 12, interferon gamma, and tumor necrosis factor alpha are the key cytokines of the generalized Shwartzman reaction. J Exp Med 1994; 180:907-15. 287. Mori W. The Shwartzman reaction: a review including clinical manifestations and proposal for a univisceral or single organ third type. Histopathology 1981; 5:113-26. 288. Shibuya T, Izuchi K, Kuroiwa A, Okabe N, Shirakawa K. Study on nonspecific immunity in pregnant women: increased chemiluminescence response of peripheral blood phagocytes. Am J Reprod Immunol Microbiol 1987; 15:19-23. 289. Brabin BJ. Epidemiology of infection in pregnancy. Rev Infect Dis 1985; 7:579603. 290. Kim YM, Romero R, Oh SY, Kim CJ, Kilburn BA, Armant DR, Nien JK, Gomez R, Mazor M, Saito S, Abrahams VM, Mor G. Toll-like receptor 4: a potential link between "danger signals," the innate immune system, and preeclampsia? Am J Obstet Gynecol 2005; 193:921-7. 291. Bonner JC, Rice AB, Lindroos PM, O'Brien PO, Dreher KL, Rosas I, faroMoreno E, Osornio-Vargas AR. Induction of the lung myofibroblast PDGF receptor system by urban ambient particles from Mexico City. Am J Respir Cell Mol Biol 1998; 19:672-80.
98
292. Michel O, Kips J, Duchateau J, Vertongen F, Robert L, Collet H, Pauwels R, Sergysels R. Severity of asthma is related to endotoxin in house dust. Am J Respir Crit Care Med 1996; 154:1641-6. 293. de Boer J., Meurs H, Flendrig L, Koopal M, Zaagsma J. Role of nitric oxide and superoxide in allergen-induced airway hyperreactivity after the late asthmatic reaction in guinea-pigs. Br J Pharmacol 2001; 133:1235-42. 294. Eldridge MW, Peden DB. Allergen provocation augments endotoxin-induced nasal inflammation in subjects with atopic asthma. J Allergy Clin Immunol 2000; 105:475-81. 295. Michel O, Duchateau J, Sergysels R. Effect of inhaled endotoxin on bronchial reactivity in asthmatic and normal subjects. J Appl Physiol 1989; 66:1059-64. 296. Eldridge MW, Peden DB. Airway response to concomitant exposure with endotoxin and allergen in atopic asthmatics. J Toxicol Environ Health A 2000; 61:27-37. 297. Kumar RK, Herbert C, Thomas PS, Wollin L, Beume R, Yang M, Webb DC, Foster PS. Inhibition of inflammation and remodeling by roflumilast and dexamethasone in murine chronic asthma. J Pharmacol Exp Ther 2003; 307:34955. 298. Szefler SJ, Martin RJ, King TS, Boushey HA, Cherniack RM, Chinchilli VM, Craig TJ, Dolovich M, Drazen JM, Fagan JK, Fahy JV, Fish JE, Ford JG, Israel E, Kiley J, Kraft M, Lazarus SC, Lemanske RF, Jr., Mauger E, Peters SP, Sorkness CA. Significant variability in response to inhaled corticosteroids for persistent asthma. J Allergy Clin Immunol 2002; 109:410-8. 299. Michel O, Olbrecht J, Moulard D, Sergysels R. Effect of anti-asthmatic drugs on the response to inhaled endotoxin. Ann Allergy Asthma Immunol 2000; 85:30510. 300. Trapp JF, Watt JL, Frees KL, Quinn TJ, Nonnenmann MW, Schwartz DA. The effect of of glucocorticoids on grain dust-induced airway disease. Chest 1998; 113:505-13. 301. Cochran JR, Khan AM, Elidemir O, Xue H, Cua B, Fullmer J, Larsen GL, Colasurdo GN. Influence of lipopolysaccharide exposure on airway function and allergic responses in developing mice. Pediatr Pulmonol 2002; 34:267-77. 302. Tulic MK, Knight DA, Holt PG, Sly PD. Lipopolysaccharide inhibits the latephase response to allergen by altering nitric oxide synthase activity and interleukin-10. Am J Respir Cell Mol Biol 2001; 24:640-6. 303. Tulic MK, Holt PG, Sly PD. Modification of acute and late-phase allergic responses to ovalbumin with lipopolysaccharide. Int Arch Allergy Immunol 2002; 129:119-28.
99
304. Hamid Q, Springall DR, Riveros-Moreno V, Chanez P, Howarth P, Redington A, Bousquet J, Godard P, Holgate S, Polak JM. Induction of nitric oxide synthase in asthma. Lancet 1993; 342:1510-3. 305. Kristof AS, Goldberg P, Laubach V, Hussain SN. Role of inducible nitric oxide synthase in endotoxin-induced acute lung injury. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158:1883-9. 306. Garvey EP, Oplinger JA, Furfine ES, Kiff RJ, Laszlo F, Whittle BJ, Knowles RG. 1400W is a slow, tight binding, and highly selective inhibitor of inducible nitric-oxide synthase in vitro and in vivo. J Biol Chem 1997; 272:4959-63. 307. Kállai L. Egértan - laborállat könyv. Budapest: Kallé-K, 2003. 308. Szarka RJ, Wang N, Gordon L, Nation PN, Smith RH. A murine model of pulmonary damage induced by lipopolysaccharide via intranasal instillation. J Immunol Methods 1997; 202:49-57. 309. Kumagai K, Ohno I, Imai K, Nawata J, Hayashi K, Okada S, Senoo H, Hattori T, Shirato K. The involvement of matrix metalloproteinases in basement membrane injury in a murine model of acute allergic airway inflammation. Clin Exp Allergy 2002; 32:1527-34. 310. Peebles RS, Jr., Dworski R, Collins RD, Jarzecka K, Mitchell DB, Graham BS, Sheller JR. Cyclooxygenase inhibition increases interleukin 5 and interleukin 13 production and airway hyperresponsiveness in allergic mice. Am J Respir Crit Care Med 2000; 162:676-81. 311. Morse B, Sypek JP, Donaldson DD, Haley KJ, Lilly CM. Effects of IL-13 on airway responses in the guinea pig. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 2002; 282:L44-L49. 312. Szoko E, Tabi T, Halasz AS, Palfi M, Magyar K. High sensitivity analysis of nitrite and nitrate in biological samples by capillary zone electrophoresis with transient isotachophoretic sample stacking. J Chromatogr A 2004; 1051:177-83. 313. Ignarro LJ, Fukuto JM, Griscavage JM, Rogers NE, Byrns RE. Oxidation of nitric oxide in aqueous solution to nitrite but not nitrate: comparison with enzymatically formed nitric oxide from L-arginine. Proc Natl Acad Sci U S A 1993; 90:8103-7. 314. Engvall E, Jonsson K, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay. II. Quantitative assay of protein antigen, immunoglobulin G, by means of enzymelabelled antigen and antibody-coated tubes. Biochim Biophys Acta 1971; 251:427-34. 315. Walters EH, Gardiner PV. Bronchoalveolar lavage as a research tool. Thorax 1991; 46:613-8.
100
316. Penido C, Castro-Faria-Neto HC, Vieira-de-Abreu A, Figueiredo RT, Pelled A, Martins MA, Jose PJ, Williams TJ, Bozza PT. LPS induces eosinophil migration via CCR3 signaling through a mechanism independent of RANTES and Eotaxin. Am J Respir Cell Mol Biol 2001; 25:707-16. 317. Guzik TJ, Korbut R, mek-Guzik T. Nitric oxide and superoxide in inflammation and immune regulation. J Physiol Pharmacol 2003; 54:469-87. 318. De Sanctis GT, MacLean JA, Hamada K, Mehta S, Scott JA, Jiao A, Yandava CN, Kobzik L, Wolyniec WW, Fabian AJ, Venugopal CS, Grasemann H, Huang PL, Drazen JM. Contribution of nitric oxide synthases 1, 2, and 3 to airway hyperresponsiveness and inflammation in a murine model of asthma. J Exp Med 1999; 189:1621-30. 319. Xiong Y, Karupiah G, Hogan SP, Foster PS, Ramsay AJ. Inhibition of allergic airway inflammation in mice lacking nitric oxide synthase 2. J Immunol 1999; 162:445-52. 320. Schuiling M, Meurs H, Zuidhof AB, Venema N, Zaagsma J. Dual action of iNOS-derived nitric oxide in allergen-induced airway hyperreactivity in conscious, unrestrained guinea pigs. Am J Respir Crit Care Med 1998; 158:1442-9. 321. Sugiura H, Ichinose M, Oyake T, Mashito Y, Ohuchi Y, Endoh N, Miura M, Yamagata S, Koarai A, Akaike T, Maeda H, Shirato K. Role of peroxynitrite in airway microvascular hyperpermeability during late allergic phase in guinea pigs. Am J Respir Crit Care Med 1999; 160:663-71. 322. Yeadon M, Price R. Induction of calcium-independent nitric oxide synthase by allergen challenge in sensitized rat lung in vivo. Br J Pharmacol 1995; 116:2545-6. 323. Kharitonov SA, Yates D, Robbins RA, Logan-Sinclair R, Shinebourne EA, Barnes PJ. Increased nitric oxide in exhaled air of asthmatic patients. Lancet 1994; 343:133-5. 324. Feder LS, Stelts D, Chapman RW, Manfra D, Crawley Y, Jones H, Minnicozzi M, Fernandez X, Paster T, Egan RW, Kreutner W, Kung TT. Role of nitric oxide on eosinophilic lung inflammation in allergic mice. Am J Respir Cell Mol Biol 1997; 17:436-42. 325. Maggi E, Parronchi P, Manetti R, Simonelli C, Piccinni MP, Rugiu FS, Decarli M, Ricci M, Romagnani S. Reciprocal Regulatory Effects of Ifn-Gamma and Il4 on the Invitro Development of Human Th1 and Th2 Clones. Journal of Immunology 1992; 148:2142-7. 326. Wegmann TG, Lin H, Guilbert L, Mosmann TR. Bidirectional Cytokine Interactions in the Maternal-Fetal Relationship - Is Successful Pregnancy A Th2 Phenomenon. Immunology Today 1993; 14:353-6.
101
327. Kuhnert M, Strohmeier R, Stegmuller M, Halberstadt E. Changes in lymphocyte subsets during normal pregnancy. European Journal of Obstetrics Gynecology and Reproductive Biology 1998; 76:147-51. 328. Lin H, Mosmann TR, Guilbert L, Tuntipopipat S, Wegmann TG. Synthesis of THelper 2-Type Cytokines at the Maternal-Fetal Interface. Journal of Immunology 1993; 151:4562-73. 329. Makhseed M, Raghupathy R, Azizieh F, Omu A, Al-Shamali E, Ashkanani L. Th1 and Th2 cytokine profiles in recurrent aborters with successful pregnancy and with subsequent abortions. Human Reproduction 2001; 16:2219-26. 330. Nagaeva O, Jonsson L, Mincheva-Nilsson L. Dominant IL-10 and TGF-beta mRNA expression in gamma delta T cells of human early pregnancy decidua suggests immunoregulatory potential. American Journal of Reproductive Immunology 2002; 48:9-17. 331. Piccinni MP, Beloni L, Livi C, Maggi E, Scarselli G, Romagnani S. Defective production of both leukemia inhibitory factor and type 2 T-helper cytokines by decidual T cells in unexplained recurrent abortions. Nature Medicine 1998; 4:1020-4. 332. Raghupathy R, Tangri S. Immunodystrophism, T cells, cytokines, and pregnancy failure. American Journal of Reproductive Immunology 1996; 35:291-6. 333. Reinhard G, Noll A, Schlebusch H, Mallmann P, Ruecker AV. Shifts in the Th1/Th2 balance during human pregnancy correlate with apoptotic changes. Biochemical and Biophysical Research Communications 1998; 245:933-8. 334. Hill JA, Polgar K, Anderson DJ. T-Helper 1-Type Immunity to Trophoblast in Women with Recurrent Spontaneous-Abortion. Jama-Journal of the American Medical Association 1995; 273:1933-6. 335. Tangri S, Wegmann TG, Lin H, Raghupathy R. Maternal Anti-Placental Reactivity in Natural, Immunologically-Mediated Fetal Resorptions. Journal of Immunology 1994; 152:4903-11. 336. Berner IC, Theumann N, Dudler J. [Rheumatoid arthritis and pregnancy]. Rev Med Suisse 2005; 1:694-8. 337. Davidson A, Keiser HD. Diagnosing and Treating the Predominantly Female Problems of Systemic Autoimmune Diseases. Medscape Womens Health 1997; 2:6. 338. Palmer GW, Claman HN. Pregnancy and immunology: selected aspects. Annals of Allergy Asthma & Immunology 2002; 89:350-9. 339. Schatz M. Interrelationships between asthma and pregnancy: A literature review. Journal of Allergy and Clinical Immunology 1999; 103:S330-S336.
102
340.
Pocket Guide for Asthma Management Initiative for Asthma. www.ginasthma.com, 2003.
and
Prevention,
Global
341. Callaghan ML. The use of newer asthma and allergy medications during pregnancy. Annals of Allergy Asthma & Immunology 2000; 84:475-80. 342. Schatz M, Zeiger RS, Hoffman CP. Intrauterine Growth Is Related to Gestational Pulmonary-Function in Pregnant Asthmatic Women. Chest 1990; 98:389-92. 343. Kramer MS, Coates AL, Michoud MC, Dagenais S, Moshonas D, Davis GM, Hamilton EF, Nuwayhid B, Joshi AK, Papageorgiou A, Usher RH. Maternal Asthma and Idiopathic Preterm Labor. American Journal of Epidemiology 1995; 142:1078-88. 344. Berkowitz RS, Hill JA, Kurtz CB, Anderson DJ. Effects of Products of Activated Leukocytes (Lymphokines and Monokines) on the Growth of Malignant Trophoblast Cells-Invitro. American Journal of Obstetrics and Gynecology 1988; 158:199-203. 345. Brown M, Gustafson M, Saldana S, Baradaran A, Miller H, Halonen M. Correlation of human decidual and cord blood mononuclear cell cytokine production. Human Immunology 2004; 65:1336-43. 346. Macaubas C, de Klerk NH, Holt BJ, Wee C, Kendall G, Firth M, Sly PD, Holt PG. Association between antenatal cytokine production and the development of atopy and asthma at age 6 years. Lancet 2003; 362:1192-7. 347. Ashkar AA, Di Santo JP, Croy BA. Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy. Journal of Experimental Medicine 2000; 192:259-69. 348. Pene J, Lagier B, Rivier A, Chanez P, Vendrell JP, Bousquet J. Phenotype of TCell Clones Obtained from Bronchial Biopsies and Peripheral-Blood from 3 Asthmatics. Cell Biology International 1993; 17:353-7. 349. ten Hacken NHT, Oosterhoff Y, Kauffman HF, Guevarra L, Satoh T, Tollerud DJ, Postma DS. Elevated serum interferon-gamma in atopic asthma correlates with increased airways responsiveness and circadian peak expiratory flow variation. European Respiratory Journal 1998; 11:312-6. 350. Krouwels FH, Hol BEA, Bruinier B, Lutter R, Jansen HM, Out TA. Properties of Pulmonary T-Cell Clones from Patients with Allergic-Asthma. American Review of Respiratory Disease 1993; 147:A782. 351. Maestrelli P, Delprete GF, Decarli M, Saetta M, Distefano A, Ricci M, Romagnani S, Fabbri LM. Activated Cd8 Lymphocytes-T Producing InterferonGamma (Ifn-Gamma) and Interleukin-5 (Il-5) in Bronchial-Mucosa of Subjects
103
Sensitized to Toluene Diisocyanate (Tdi). Journal of Allergy and Clinical Immunology 1993; 91:220. 352. Cho SH, Stanciu LA, Begishivili T, Bates PJ, Holgate ST, Johnston SL. Peripheral blood CD4(+) and CD8(+) T cell type 1 and type 2 cytokine production in atopic asthmatic and normal subjects. Clinical and Experimental Allergy 2002; 32:427-33. 353. Magnan AO, Mely LG, Camilla CA, Badier MM, Montero-Julian FA, Guillot CM, Casano BB, Prato SJ, Fert V, Bongrand P, Vervloet D. Assessment of the Th1/Th2 paradigm in whole blood in atopy and asthma - Increased IFN-gammaproducing CD8(+) T cells in asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2000; 161:1790-6. 354. O'Sullivan S, Cormican L, Faul JL, Ichinohe S, Johnston SL, Burke CM, Poulter LW. Activated, cytotoxic CD8(+) T lymphocytes contribute to the pathology of asthma death. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2001; 164:560-4. 355. Brown V, Warke TJ, Shields MD, Ennis M. T cell cytokine profiles in childhood asthma. Thorax 2003; 58:311-6. 356. Lieberman D, Lieberman D, Printz S, Ben-Yaakov M, Lazarovich Z, Ohana B, Friedman MG, Dvoskin B, Leinonen M, Boldur I. Atypical pathogen infection in adults with acute exacerbation of bronchial asthma. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2003; 167:406-10. 357. Luft BJ, Remington JS. Effect of Pregnancy on Augmentation of Natural-Killer Cell-Activity by Corynebacterium-Parvum and Toxoplasma-Gondii. Journal of Immunology 1984; 132:2375-80. 358. Walker C, Bode E, Boer L, Hansel TT, Blaser K, Virchow JC. Allergic and Nonallergic Asthmatics Have Distinct Patterns of T-Cell Activation and Cytokine Production in Peripheral-Blood and Bronchoalveolar Lavage. American Review of Respiratory Disease 1992; 146:109-15. 359. Wilczynski JR, Tchorzewski H, Glowacka E, Banasik M, Lewkowicz P, Szpakowski M, Zeman K, Wilczynski J. Cytokine secretion by decidual lymphocytes in transient hypertension of pregnancy and pre-eclampsia. Mediators Inflamm 2002; 11:105-11. 360. Pedersen EB, Christensen NJ, Christensen P, Johannesen P, Kornerup HJ, Kristensen S, Lauritsen JG, Leyssac PP, Rasmussen A, Wohlert M. PreEclampsia - A State of Prostaglandin Deficiency - Urinary Prostaglandin Excretion, the Renin-Aldosterone System, and Circulating Catecholamines in Pre-Eclampsia. Hypertension 1983; 5:105-11. 361. Banerjee S, Smallwood A, Moorhead J, Chambers AE, Papageorghiou A, Campbell S, Nicolaides K. Placental expression of interferon-gamma (IFN-
104
gamma) and its receptor IFN-gamma R2 fail to switch from early hypoxic to late normotensive development in preeclampsia. Journal of Clinical Endocrinology and Metabolism 2005; 90:944-52. 362. Crocker IP, Cooper S, Ong SC, Baker PN. Differences in apoptotic susceptibility of cytotrophoblasts and syncytiotrophoblasts in normal pregnancy to those complicated with preeclampsia and intrauterine growth restriction. American Journal of Pathology 2003; 162:637-43. 363. Starkey PM. The decidua and factors controlling placentation. In: Redman CW, Sargent LL, Starkey PM, eds. The human placenta. Oxford: Blackwell, 1998: 362-413. 364. Matthiesen L, Ekerfelt C, Berg G, Ernerudh J. Increased numbers of circulating interferon-gamma- and interleukin-4-secreting cells during normal pregnancy. Am J Reprod Immunol 1998; 39:362-7. 365. Murphy VE, Gibson PG, Giles WB, Zakar T, Smith R, Bisits AM, Kessell CG, Clifton VL. Maternal asthma is associated with reduced female fetal growth. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine 2003; 168:1317-23.
105
6. KÖZLEMÉNYEK Az értekezés témájában megjelent saját közlemények Komlósi ZsI, Pozsonyi É, Tábi T, Szökő É, Nagy A, Bartos B, Kozma GT, Tamási L, Orosz M, Magyar P, Losonczy Gy. Lipopolysaccharide exposure makes allergic airway inflammation and hyper-responsiveness less responsive to dexamethasone and inhibition of iNOS. Clin Exp Allergy 2006; 36:951-9. IF: 3.668 Tamási L, Bohács A, Pállinger E, Falus A, Rigó J, Jr., Müller V, Komlósi ZsI, Magyar P, Losonczy Gy. Increased interferon-gamma- and interleukin-4-synthesizing subsets of circulating T lymphocytes in pregnant asthmatics. Clin Exp Allergy 2005; 35:1197-203. IF: 3.553 Losonczy G, Bohács A, Komlósi ZsI, Tamási L, Rigó J, Jr., Müller V, Magyar P. Anergia és immunstimuláció terhességben. Med Thor 2006; 59:37-46.
Egyéb közlemények Kozma GT, Losonczy G, Keszei M, Komlósi ZsI, Buzás E, Pállinger E, Appel J, Szabó T, Magyar P, Falus A, Szalai Cs. Histamine deficiency in gene-targeted mice strongly reduces antigen-induced airway hyper-responsiveness, eosinophilia and allergen-specific IgE. Int Immunol 2003; 15:963-73. IF: 3.690
Konferencia absztraktok Komlósi ZsI, Pozsonyi É, Tábi T, Magyar P, Losonczy Gy. Bacterial lipopolysaccharide interferes with late phase allergic airway response in mice. Tissue Antigens 2004; 64:418-419. Komlósi ZsI, Pozsonyi É, Bartos B, Magyar P, Losonczy Gy. Endotoxin interferes with allergy-induced airway inflammation in mice. Eur Respir J 2004; 24: Suppl. 48, 348s. Komlósi ZsI, Kunos L, Yang D, Magyar P, Losonczy Gy. Effects of high dietary salt intake on airway inflammation in mice. Eur Respir J 2005; 26: Suppl. 49, 160s. Komlósi ZsI, Joetham A, Balhorn A, Magyar P, Gelfand EW, Dakhama A, Losonczy Gy. Airway allergy in pregnant mice: reduced Th2 responses but enhanced airway hyperresponsiveness. Eur Respir J 2006; 28: Suppl. 50, 590s.
106
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönöm Szüleimnek és Feleségemnek a támogatást és a türelmet. Köszönöm szépen témavezetőmnek, Prof. Dr. Losonczy Györgynek, valamint Prof. Dr. Magyar Pálnak, a légzőszervi megbetegedések Ph. D. program vezetőjének, hogy lehetőséget biztosítottak kutatási munkám elvégzésére és mindvégig támogattak. Losonczy György professzor úrnak köszönettel tartozom a sok-sok pótolhatatlan szakmai segítségért is, melyet tudományos munkám során tőle kaptam. Köszönetet mondok továbbá az alábbi személyeknek a hasznos együttműködésért: Vannay Ádám, Tábi Tamás, Halász Attila Sándor, Pozsonyi Éva, Tamási Lilla, Kozma Gergely, Nagy Andrea, Horváth Ildikó, Szökő Éva, Bornemisza Beryll és a Pulmonológiai Klinika valamennyi munkatársa. Hálás vagyok Nekik, mert megosztották velem tudásukat és tapasztalataikat.
107
