AZ ABERRÁNS SZOMATIKUS HIPERMUTÁCIÓ ÉS AZ AKTIVÁCIÓ-INDUKÁLT CITIDIN DEAMINÁZ SZEREPE A MEDIASTINALIS NAGY B-SEJTES LYMPHOMA PATOGENEZISÉBEN

AZ ABERRÁNS SZOMATIKUS HIPERMUTÁCIÓ ÉS AZ AKTIVÁCIÓ-INDUKÁLT CITIDIN DEAMINÁZ SZEREPE A MEDIASTINALIS NAGY B-SEJTES LYMPHOMA PATOGENEZISÉBEN

Doktori értekezés

Bödör Csaba

Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola

Témavezető:

Dr. Matolcsy András, egyetemi tanár, MTA doktora

Hivatalos bírálók:

Dr. Sármay Gabriella, egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Kovács Gábor, egyetemi docens, Ph.D.

Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Demeter Judit, egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kulka Janina, egyetemi docens, Ph.D. Dr. Réz Gábor, egyetemi docens, Ph.D.

Budapest 2007

ASHM és AID expresszió MNBL-ben

Bödör Csaba

TARTALOMJEGYZÉK

I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ....................................................................................... 4 II. IRODALMI HÁTTÉR................................................................................................. 7 II. 1. Bevezetés ............................................................................................................. 7 II. 1. 1. A B-sejtes lymphomák sejteredete és felosztása........................................... 7 II. 2. A mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma (MNBL)........................................... 10 II. 2. 1. Az MNBL előfordulása és klinikai megjelenése......................................... 10 II. 2. 2. Az MNBL morfológiája és immunfenotípusa ............................................. 11 II. 2. 3. Az MNBL genotípusa ................................................................................. 12 II. 2. 4. Az MNBL sejteredete ................................................................................. 13 II. 3. A genetikai instabilitás szerepe a daganatok kialakulásában............................. 15 II. 3. 1. Kromoszóma szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás ....................... 15 II. 3. 2. Nukleotid szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás............................. 15 II. 3. 3. Az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM)......................................... 16 II. 4. Az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) .................................................. 21 III. CÉLKITŰZÉSEK..................................................................................................... 25 IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK............................................................................... 26 IV. 1. Szövetminták .................................................................................................... 26 IV. 2. Sejtvonalak ....................................................................................................... 27 IV. 3. DNS szintű vizsgálatok .................................................................................... 28 IV. 3. 1. DNS izolálás ............................................................................................. 28 IV. 3. 2. A c-MYC, PAX-5 és RhoH gének PCR amplifikálása............................... 29 IV. 3. 3. A PCR termékek elválasztása, detektálása és tisztítása............................ 30 IV. 3. 4. A c-MYC, PAX-5 és RhoH gének szekvencia analízise............................. 31 IV. 4. RNS szintű vizsgálatok .................................................................................... 35 IV. 4. 1. Lézer mikrodisszekció ............................................................................... 35 IV. 4. 2. RNS izolálás.............................................................................................. 36 IV. 4. 3. Reverz transzkripció (RT) ......................................................................... 37 IV. 4. 4. Valós-idejű kvantitatív PCR (Q-RT-PCR) ................................................ 37

2


Bödör Csaba

IV. 5. Fehérje szintű vizsgálatok ................................................................................ 42 IV. 5. 1. Immunhisztokémiai vizsgálat szövettani mintákon ................................... 42 IV. 5. 2. Immunhisztokémiai vizsgálat sejtvonalakon............................................. 43 IV. 6. Etikai vonatkozások ......................................................................................... 43 V. EREDMÉNYEK........................................................................................................ 44 V. 1. A c-MYC, PAX-5 és RhoH gének szekvencia analízise..................................... 44 V. 2. Az AID mRNS expressziós szintjének meghatározása ..................................... 48 V. 3. Az AID kimutatása fehérje szinten.................................................................... 51 V. 3. 1. Immunhisztokémiai vizsgálat szövettani mintákon .................................... 51 V. 3. 2. Immunhisztokémiai vizsgálat sejtvonalakon .............................................. 52 VI. MEGBESZÉLÉS...................................................................................................... 54 VII. KÖVETKEZTETÉSEK .......................................................................................... 61 VIII. ÖSSZEFOGLALÁS .............................................................................................. 62 IX. SUMMARY ............................................................................................................. 63 X. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................................ 64 XI. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE..................................................................... 81 XI. I. Az értekezés témájában megjelent közlemények ............................................. 81 XI. II. Egyéb témában megjelent közlemények ......................................................... 81 XI. III. Idézhető absztraktok....................................................................................... 83 XI. IV. Előadások, poszterek...................................................................................... 83 XII. KÖZLEMÉNYEK IDÉZETTSÉGE ....................................................................... 87 XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ............................................................................... 89

3


Bödör Csaba

I. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE A-

adenin

AID -

aktiváció-indukált citidin deamináz

AIDS -

szerzett immunhiányos tünetegyüttes

ALCL -

anaplasias nagy-sejtes lymphoma

ALL -

akut lymphoblastos leukaemia

APE -

apurin/apirimidin-endonukleáz

ASHM -

aberráns szomatikus hipermutáció

BCL-2 -

B-cell CLL/lymphoma 2 onkoprotein

BCL-6 -

B-cell CLL/lymphoma 6 onkoprotein

BER -

bázis excíziós rendszer

BL -

Burkitt lymphoma

bp -

bázispár

C-

citozin

CD -

„cluster of differentiation”

CDR 1, 2, 3 -

„complementarity determining region 1, 2, 3”

CG -

centrum germinativum

CLL -

krónikus lymphocytás leukaemia

CT -

„cycle threshold”

CSR -

„class switch” rekombináció (izotípus váltás)

D-

diverzitás immunglobulin géncsalád

DAB -

3-3’ - diaminobenzidin

DEPC -

dietil-pirokarbonát

DLBL-

diffúz nagy B-sejtes lymphoma

DNS -

deoxyribonukleinsav

dNTP -

deoxy-nukleotid trifoszfát

ddNTP -

dideoxy-nukleotid trifoszfát

EBV -

Epstein-Barr vírus

EDTA -

etilén-diamin-tetraecetsav

EMA -

epitheliális membrán antigén

FCS -

„fetal calf serum” (magzati borjúsavó)

4


Bödör Csaba

FDC -

follicularis dendriticus sejt

FL -

follicularis lymphoma

FFPE -

formalin-fixált paraffinba ágyazott („embedded”)

FRET -

fluoreszcencia rezonancia energia transzfer

G-

guanin

g-

nehézségi gyorsulás

GAPDH -

glyceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz

GTP -

guanozin-trifoszfát

HCV -

Hepatitis C vírus

HL -

Hodgkin lymphoma

hMSH -

humán mutS homológ, mismatch repair géncsalád

HRP -

„horseradish peroxidase” (tormaperoxidáz)

Ig -

immunglobulin

IgH -

immunglobulin nehézlánc gén

IMDM -

„Iscove’s modified Dulbecco’s medium”

J-

„joining” (kapcsoló) immunglobulin géncsalád

JAK2 -

Janus-kináz 2

LBL -

lymphoblastos lymphoma

MALT -

mucosa asszociált lymphoid szövet

MGB -

„minor groove binder” molekula

MM -

myeloma multiplex

MMR -

„mismatch repair” (hibajavítás)

MNBL -

mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma

mRNS -

messenger (hírvivő)-RNS

MSI -

mikroszatellita instabilitás

NaCl -

nátrium-klorid

NCBI -

„National Center for Biotechnology Information”

NFκB -

nukleáris faktor kappa B

NFQ -

nem fluoreszcens „quencher”

NHL -

non-Hodgkin lymphoma

NK sejt -

„natural killer” sejt

p16INK4A -

tumorszuppresszor gén

5


Bödör Csaba

PBS -

„phosphate buffer saline“

PC-1, PCA-1 -

plazmasejt asszociált antigének

PCR -

polimeráz láncreakció

PTLD -

poszt-transzplantációs lymphoproliferatív betegség

PV -

perifériás vér

Q-RT-PCR -

kvantitatív valós-idejű polimeráz láncreakció

R-

reporter

Ras -

„rat-sarcoma“ fehérje szupercsalád

RNS -

ribonukleinsav

RPA -

replikációs protein A

rpm -

percenkénti fordulatszám

RT -

reverz transzkripció

ssDNS -

„single-stranded” (egyszálú) DNS

SDS -

nátrium-dodecil-szulfát

SE -

„standard error” (standard hiba)

SHM -

szomatikus hipermutáció

SOCS-1 -

„suppressor of cytokine signaling 1”

STAT 5, 6 -

„signal transducer and activator of transcription 5, 6”

T-

timin

TCR -

T-sejt receptor

TH -

T-helper sejt

TAE -

Tris-acetát-EDTA

TBS -

„Tris buffered saline”

TE -

Tris-EDTA

TRS -

„target retrieval solution”

TSR -

„template suppression reagent”

U-

„unit” (nemzetközi egység)

UNG -

uracil-N-glikoziláz

V-

variábilis immunglobulin géncsalád

v% -

vegyes-százalék

WHO -

„World Health Organization” (Egészségügyi Világszervezet)

6


Bödör Csaba

II. IRODALMI HÁTTÉR II. 1. Bevezetés Az Egészségügyi Világszervezet (WHO) adatai alapján a lymphoid rendszer daganatai az összes tumoros megbetegedés mintegy 4%-át képezik. Európában a lymphoid tumorok 85-90%-a B-sejt eredetű, a T-sejtes illetve NK-sejtes daganatok aránya meglehetősen alacsony. A lymphoid daganatok döntő többsége egyetlen, malignus transzformáción átesett B-, T- vagy NK-sejtből származik, azaz monoklonális. Minden további tumorsejt ebből a sejtből származik. (68) II. 1. 1. A B-sejtes lymphomák sejteredete és felosztása A lymphoproliferatív megbetegedések, így a B-sejtes lymphomák / leukaemiák kialakulása a normál B-sejt differenciáció bizonyos fejlődési stádiumában való megrekedéssel

és

az

adott

stádiumban

lévő

sejtek

számának

aránytalan

megnövekedésével magyarázható. A tumorsejtek érettségi foka ennek megfelelően gyakran megfelel a fiziológiás B-sejt differenciáció egyes stádiumainak (1. ábra).

(52)

Ez morfológiai, immunfenotípus és genotípus jellegzetességek alapján követhető nyomon, és lehetővé teszi az egyes lymphoma típusok elkülönítését is, továbbá kulcsfontosságú az adott lymphoma típus biológiai és klinikai viselkedése szempontjából. Ennek megfelelően, az esetek többségében, az érett sejtekből felépülő tumorok esetén – ahol a tumorsejtek proliferációja alacsony – mérsékelt malignitás, míg az éretlen – magas proliferációjú –sejtekből álló tumorok esetén kifejezett malignitás, kedvezőtlen prognózis várható.

(68)

Továbbá ismert az érett sejtekből felépülő

daganatoknak éretlen, blastos lymphomákká történő transzformációja is, ami a betegség progressziójával jár. (69) Az 1. ábra a normál B-sejt fejlődés lépéseit, valamint néhány entitás sejteredetét mutatja be sematikusan. A B-sejt fejlődés kezdeti stádiumához kötődik az akut lymphoid

leukaemiák/lymphoblastos

lymphomák

(ALL/LBL)

kialakulása.

(17)

Az éretlen B-sejt progenitor eredetű ALL/LBL-ekben az immunglobulin (Ig) gének szomatikus rekombinációja már lezajlott, ugyanakkor antigénnel való találkozás

7


Bödör Csaba

hiányában Ig génjeik bázissorrend tekintetében a csíravonal (germline) konfigurációt mutatják,

azaz

szomatikus

mutációkat

nem

hordoznak.

A

nyirokcsomók

csíraközpontjaiban (centrum germinativum CG) lezajló folyamatok alkotják a B-sejt fejlődés mondhatni legfontosabb elemét. Az itt található centroblastok és centrocyták daganatos megbetegedéseiként tartjuk számon többek között a follicularis lymphomát (FL), a diffúz nagy B-sejtes lymphomák egy részét (DLBL), a Burkitt lymphomát (BL), valamit a Hodgkin lymphomát (HL).

(48, 51, 54, 133)

A csíraközpontokban lezajló

szomatikus hipermutáció (SHM) eredményeként ezen entitások tumorsejtjeinek Ig génjei szomatikus mutációkat hordoznak. A B-sejt fejlődés terminális stádiumát képviselő plasma- és memóriasejteket a myeloma multiplex (MM), illetve a krónikus lymphocytás leukaemia (CLL) progenitorainak tekintjük.

(29, 37)

Természetesen nem

minden entitás esetében állapítható meg egyértelmű kapcsolat a tumorsejtek érettségi foka és a normál B-sejt fejlődés valamely stádiuma között. A lymphomákat, mondhatni ma már csak tradicionális okokból, Hodgkin (HL)- és non-Hodgkin lymphomákra (NHL) osztjuk. Klonálisan átrendeződött és szomatikus mutációkat hordozó Ig génjeiknek köszönhetően a HL-ák B-sejtes eredete mára bizonyítást nyert.

(51, 53)

A HL-ák elkülönítését a betegség klinikai viselkedése,

szövettani megjelenése továbbá a NHL-áktól eltérő kezelése indokolja.

(55)

Az összes

B-NHL több mint 90%-a sorolható az érett B-sejtes NHL-ák közé. A prekurzor B-sejtes NHL-ák mindössze 10%-ot tesznek ki. Az érett B-sejtes NHL-ák esetében a lymphomás transzformáció a naiv B-sejt éréstől a plasmasejtes differenciációt elérő B-sejt érési stádiumok bármelyikét érintheti, azaz a különböző mértékben differenciált, perifériás B-sejtek daganatos megbetegedéséről van szó. (68) Az érett B-sejtes NHL-ák mintegy 35-40%-át képviselik a diffúz nagy B-sejtes lymphomák (DLBL). Ez az entitás kifejezett malignitású, agresszív lymphomák heterogén csoportját foglalja magába, melyet a klinikai megjelenés, biológiai viselkedés valamint szövettani jellegzetességek alapján altípusokra osztanak. (28)

8


Bödör Csaba

1. ábra: A B-sejt differenciáció és a B-sejtes lymphomák sejteredetének összefüggése. A lymphomák tumorsejtjeinek érettségi foka gyakran megfelel a B-sejt fejlődés egyes stádiumainak. Ennek megfelelően a B-sejt differenciáció kezdeti stádiumához köthető az akut lymphoblastos leukaemiák/lymphoblastos lymphomák (ALL/LBL) kialakulása. Ezen sejtekben az immunglobulin (Ig) gének rekombinációja már lezajlott, viszont antigénnel való találkozás hiányában Ig génjeik szomatikus mutációkat még nem hordoznak. A későbbi fejlődési stádiumot képviselő, Ig génjeikben szomatikus mutációkat hordozó centroblastok és centrocyták daganatos megbetegedéseiként tartjuk számon többek között a follicularis lymphomát (FL), a diffúz nagy B-sejtes lymphomák csoportját (DLBL), a Burkitt lymphomát (BL), valamint a Hodgkin lymphomát is (HL). A myeloma multiplex (MM) és a krónikus lymphocytás leukaemia (CLL) normál megfelelőiként a B-sejt differenciáció végső stádiumát jelentő plasmasejteket, illetve memóriasejteket tartjuk számon. Az ábra természetesen nem tünteti fel az összes lymphoma entitást, továbbá nem minden esetben állapítható meg, hogy az adott lymphoma a B-sejt fejlődés mely stádiumából származik. (Rövidítések: TH- T-helper sejt, FDC- follicularis dendriticus sejt)

9


Bödör Csaba

II. 2. A mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma (MNBL) II. 2. 1. Az MNBL előfordulása és klinikai megjelenése A mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma (MNBL) a diffúz nagy B-sejtes lymphomák (DLBL) különálló altípusa. Önálló entitásként való besorolását sajátos klinikopatológiai megjelenése indokolja.

(4)

Az összes B-NHL mintegy 2%-át adja.

A betegség leggyakrabban 20-40 éves korban fordul elő, nőkben kétszer gyakoribb, mint férfiakban. Kifejezett malignitású megbetegedésről van szó, melynek 3 éves átlagos túlélése a különböző klinikai tanulmányok alapján 52 és 85% közötti. (58, 145) Az elülső mediastinumra lokalizálódik. Az esetek többségében a diagnózis felállításakor már jelentős méretű mellkasi térfoglaló folyamat, gyakran 10 cm-nél nagyobb átmérőjű, ún. „bulky” tumor figyelhető meg.

(129)

Gyakori a mellkasi

szerveknek (tüdő, pleura, pericardium) már a diagnóziskor fennálló infiltrációja is.

(132)

A betegek mintegy 30%-ában a mellkasi nagyerek kompressziója következtében vena cava superior szindróma alakul ki. Az ún. B-tünetek (fogyás, láz, éjszakai izzadás) jelenléte is gyakori.

(58, 100)

Késői stádiumban, a betegség disszeminációja során –

a lymphomákra egyébként nem jellemző agresszivitással – extranodális szerveket, az agyat, a vesét, a bőrt és a májat is érintheti, ugyanakkor csontvelői manifesztáció nem jellemző. (7, 73) A kezdeti stádiumban, amikor a tumor kizárólag a mediastinumra korlátozódik, kemoterápiás, illetve a kemo- és radioterápiás kezelés kombinált alkalmazásával jó eredmények érhetőek el. A betegség disszeminációja viszont rossz prognózissal jár. (58, 105, 136) A morfológiai megjelenésben megfigyelhető variációk nem prognosztikus értékűek,

és

a

fenotípus

illetve

genotípus

sajátságok

közül

mindössze

az MHC-II típusú molekulák expressziójának elvesztése hozható kapcsolatba a kedvezőtlen prognózissal. (46, 114) Differenciál-diagnosztikus

szempontból

a

mediastinalis

lokalizáció,

a tumorszövetben kialakuló hegesedés, valamint a gyakori CD30 expresszió miatt Hodgkin lymphoma merül fel a leggyakrabban. A kérdés eldöntésében az alapos morfológiai vizsgálódás mellett a CD45 marker segíthet, amely szemben a Hodgkin illetve Sternberg-Reed sejtekkel, az MNBL tumorsejtjeiben expresszálódik. (56, 70)

10


Bödör Csaba

II. 2. 2. Az MNBL morfológiája és immunfenotípusa Morfológiáját tekintve a daganat nagy, éretlen, a DLBL-hoz hasonló tumorsejtekből épül fel, melyek gyakran széles, világos citoplazmával rendelkeznek. A sejtek mérete (25-40 μm) és a sejtmagok alakja változó, leggyakrabban centroblastokra emlékeztet (2. A, B ábrák). A tumorsejtek kisebb-nagyobb klasztereket formálnak, melyeket alveoláris jellegű struktúrákat képző reticuláris rosthálózat ír körül. A tumor állományában gyakoriak a nekrózisok. A tumorsejtek B-sejt specifikus sejtfelszíni antigéneket hordoznak (CD19, CD20, CD22, CD79α). A sikeres immunglobulin (Ig) génátrendeződés ellenére sejtfelszíni Ig expresszió az esetek többségében nem mutatható ki. (44, 84)

A

B

2. ábra: Mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma. A: A tumorsejtek centroblastokra emlékeztetnek, citoplazmájuk világosan festődik. A tumorsejtfészkeket alveoláris jellegű rosthálózat írja körül. (Hematoxilin-eosin festés, 400x). B: A felvételen látható, hogy a tumorsejtek citoplazmája széles, a sejtek „utcakőszerűen” simulnak egymáshoz (CD20 immunhisztokémiai reakció 400x).

Az esetek egy részében a HL-ára is jellemző CD30 aktivációs marker expressziója is megfigyelhető, azonban ez általában a HL-ban megfigyeltnél gyengébb, és a tumorsejtek csak egy részén észlelhető.

(36)

A CD5, CD15 és CD21 sejtfelszíni

markerek expressziója sosem figyelhető meg, míg a CD10 kifejeződését illetően az irodalmi adatok ellentmondásosak.

(24, 84)

A tumorsejtek mintegy 80%-a pozitív

festődést mutat a Ki-67 antitesttel, ami magas proliferációs aktivitására utal (3. A ábra).

11


Bödör Csaba

Reticulin festéssel a sejteket hálózatosan körülölelő rosthálózat jelenik meg (3. B ábra). A 2. és 3. ábra felvételei jelen vizsgálat tárgyát képező MNBL esetek szövetmintáiból készültek.

A

B

3. ábra: Mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma. A: A tumorsejtek kb. 80%-a Ki-67 pozitivitást mutat, ami a magas proliferációs rátára utal (Ki-67 immunhisztokémiai reakció, 400x) B: A képen az MNBL-re jellegzetes alveolaris jellegű, kis tumorsejt csoportokat körülíró reticularis rosthálózat látható. A sejteket körülvevő fibroticus stróma kötegek reticulin festéssel tűnnek elő (Gömöri féle ezüstimpregnáció, 400x)

II. 2. 3. Az MNBL genotípusa Az MNBL több szempontból is különleges, mondhatni egyedi lymphoma típus. Bár a DLBL esetében leírt genetikai abnormalitások egy része, mint a 12q és Xq kromoszóma eltérések vagy a p53 gén mutációi kimutathatóak ebben a betegségben is, az MNBL patogenezisére specifikus genetikai rendellenességek még nem teljesen ismertek.

(42, 127, 135)

Továbbá a tumor számos olyan genetikai sajátsággal rendelkezik,

amelyek a DLBL-ra egyébként nem jellemzők: az MHC molekulák expressziója kapcsán különböző defektusok figyelhetőek meg

(83, 113)

, az Ig expresszió hiányának

ellenére a sejtfelszíni Ig asszociált molekula, a CD79α konstitutív kifejeződése észlelhető

(44)

, illetve az egyébként T-sejt specifikus markerként leírt MAL gén

overexpressziója is jellemző a betegségre. (16) Az MNBL-re szinte specifikus eltérésnek számítanak a Janus-2 tirozin kináz (JAK-2) és a c-REL géneket érintő 9p és 2p genetikai

12


Bödör Csaba

anyag nyeréssel járó mutációk, amelyek különböző fehérjék (STAT-5, STAT-6, JAK2) konstitutív aktivitásához vezetnek.

(6, 34, 42)

Ugyanakkor a DLBL-ák esetében gyakori,

a BCL-2 és BCL-6 géneket érintő átrendeződések az MNBL-ben nem figyelhetők meg, és a DLBL-ákra ugyancsak jellemző MYC gén érintettsége is ritkának számít. (126, 127, 135) Az MNBL-re jellemző genetikai abnormalitások egy része az MNBL eredetű MedB-1 és Karpas 1106 sejtvonalban is detektálhatóak.

(82)

Többek között a citokin jelátviteli

utakat szabályozó „suppressor of cytokine signaling 1” (SOCS-1) molekula biallélikus mutációjának következményeként létrejött konstitutív JAK-2 foszforiláltság is jellemzője e sejtvonalnak.

(71, 72)

A SOCS-1 molekulát érintő mutáció az MNBL esetek

több mint 50%-ában is előfordul, ami a SOCS-1-nek az MNBL-ben betöltött tumor szupresszor szerepére utalhat. (75, 76) II. 2. 4. Az MNBL sejteredete Az

MNBL

sejteredetével

kapcsolatos

eredmények

ellentmondásosak.

Valószínűleg a thymusban található normál B-sejtekből származik, melyek a thymus medullájában, a Hassal testek közelében találhatóak és ún. asteroid morfológiával rendelkeznek.

(40)

Thymus eredetre utal a tumor lokalizációja, illetve a tumorsejtek

közötti thymicus „maradványok” gyakori jelenléte.

(1)

Ezt az elképzelést támasztja alá

a thymicus B-sejtek és a tumorsejtek nagyfokú immunfenotípusos hasonlósága is. (20, 38) Ugyancsak erre utal az a megfigyelés, mely szerint az MNBL tumorsejtjeinek illetve a thymus B-sejtjeinek szomatikus mutációs mintázata az Ig nehézláncgén (IgH) és a BCL-6 gén esetében nagyfokú hasonlóságot mutat. (19) A plasmasejt-asszociált antigének (PC-1, PCA-1) expressziója, a sejtfelszíni Ig expresszió hiánya és a CD19+, CD20+, CD21- fenotípusnak köszönhetően eleinte úgy gondolták, hogy az MNBL thymus eredetű tumorsejtjei a B-sejt fejlődés terminális szakaszának megfelelő sejtek. (84) Későbbi megfigyelések azonban a tumorsejtek BCL-6 és CD10 expressziója alapján CG (centrum germinativum) eredetre utaltak, mivel e két fehérje expressziója a másodlagos nyirokszervekben a CG sejtjeire korlátozott. (21) Ezzel szemben, több közlemény alapján is az MNBL tumorsejtjek többsége CD10 negatív. (2, 44) Az MNBL tumorsejtjei, a DLBL-ákkal megegyezően, az Ig nehézlánc gén variábilis régióiban (IgVH) és a BCL-6 gén 5’ nem kódoló régióiban is szomatikus

13


mutációkat hordoznak,

(54)

Bödör Csaba

ami szintén a CG eredetet támasztja alá, mivel az említett

géneket érintő szomatikus hipermutáció (SHM) folyamata a CG fejlődési stádiumot elért B-sejtekben megy végbe.

(134)

Az, hogy CG vagy post-CG stádiumot képvisel-e

az adott tumorsejt, az ún. intraklonális divergencia, vagyis a mutációk kontinuus („ongoing”)

jellegének

vizsgálatával

állapítható

meg.

Ez

azt

jelenti,

hogy a neoplastikussá vált sejtek megőrzik hipermutációs aktivitásukat, és folyamatosan újabb mutációkat szereznek, ami a tumorklónok genetikailag instabil állapotát jelenti. Ez végeredményében addicionális genetikai rendellenességek megjelenésével járhat. Az MNBL esetében intraklonális divergencia nem tapasztalható, azaz a kontinuus mutációs aktivitás nem jellemzője a betegségnek. szomatikus

hipermutáción

átesett

(59)

Ezek alapján az MNBL aktivált,

post-CG sejtekből

származhat,

amelyekben

a mutációs aktivitás a malignus transzformáció bejeződése előtt kikapcsolt. (5) A legújabb cDNS chip technológián alapuló globális génexpressziós vizsgálatok eredményei szerint az MNBL génexpressziós profilja eltérő a DLBL-étól. Ugyanakkor nagyfokú hasonlóságot mutat a klasszikus Hodgkin lymphomáéval, ami felveti e két tumor közös eredetének lehetőségét. (118, 125)

14


Bödör Csaba

II. 3. A genetikai instabilitás szerepe a daganatok kialakulásában A genetikai instabilitás központi szerepet tölt be a humán daganatok kialakulása és progressziója során. A genom instabilitás néven is ismert jelenség a humán tumorok szinte mindegyikében kimutatható, kromoszóma és nukleotid szinten egyaránt megnyilvánulhat. (60) II. 3. 1. Kromoszóma szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás A kromoszóma szinten észlelhető genetikai instabilitás a kromoszómaszegregáció zavarain keresztül vezet numerikus vagy strukturális kromoszóma eltérésekhez. Egyik típusát a génamplifikációk alkotják, melyek 0,5-10 megabázisnyi járulékos örökítőanyag megjelenését jelentik. Lymphomákban a génamplifikációk gyakoriak, példaként említhető az MNBL-ben előforduló c-REL gén amplifikációja. (42, 139)

A kromoszóma-transzlokációk ugyancsak szerepet játszanak a lymphomák

kialakulásában. Jól ismert példa a follicularis lymphomában (FL) leírt t(14;18) transzlokáció, melynek során a 18. kromoszómán lokalizálódó BCL-2 onkogén transzlokálódik a 14. kromoszómán lokalizált Ig nehézlánc génhez, és kerül az Ig gén promoterének kontrollja alá.

(138)

A kromoszómális szinten megynyilvánuló genetikai

instabilitás harmadik típusát a kromoszómákat érintő számbeli változások alkotják, ami egész kromoszómák elveszését, illetve számfeletti megjelenését jelenti. Szinte az összes humán daganatos megbetegedésre jellemző a genetikai instabilitásnak e formája,

(78, 79)

a lymphomák közül többek között a FL-ra jellemző 5., 7. és

X. kromoszóma triszómiája ismert. (80) II. 3. 2. Nukleotid szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás A nukleotid szinten észlelhető, azaz a DNS szekvenciában eltérést okozó genetikai instabilitásnak is több típusa ismert. Gyakran eredményez aberrációkat a genomban az ún. „repair” (hibajavító) gének és tumorszupresszor gének különböző típusú (pontmutáció, deléció, hipermetiláció) inaktiválódása.

(43, 60)

Erre példaként

szolgál a hMSH1 mismatch-repair gén promoterének hipermetilációja krónikus

15


lymphocytás leukaemiában (CLL), pontmutációi MNBL-ben.

(127)

Bödör Csaba

(25)

illetve a p16INK4A tumorszupresszor gén

A DNS bázissorrendjét módosító változások egy másik

csoportját képezik a tandem-ismétlődő rövid szekvenciák (mikroszatelliták) hosszbeli változásai, azaz a mikroszatellita instabilitás (MSI). (3) B-sejtes NHL-ákban az MSI nem túl gyakori jelenség, ugyanakkor a CLL és FL esetek egy részében megfigyelhető, és szerepet játszik ezen entitásoknak magasabb malignitású, ún. „high grade” lymphomába történő transzformációja során. (27, 89, 123) II. 3. 3. Az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM) A nukleotid szinten megnyilvánuló genetikai instabilitás egy újonnan leírt formája az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM). Ez a folyamat a normál B-sejt érés során lezajló szomatikus hipermutáció (SHM) meghibásodásának tekinthető.

(99)

Az SHM egy alapvető immunológiai folyamat, melynek során a nyirokcsomók csíraközpontjaiban a B-lymphocyták funkcionálisan átrendeződött Ig génjeinek variábilis régióiban (IgV) szomatikus mutációk jelennek meg (4. ábra).

(47)

Az SHM

ezáltal hozzájárul az ellenanyag molekulák affinitáséréséhez, az antigén-felismerő készlet diverzitásának kialakulásához.

(134)

Az SHM a fiziológiás B-sejt fejlődés során

egy, az Ig lókuszokon kívüli gént is érint, mégpedig a BCL-6 gén 5’ nem-kódoló régióját.

(98)

A BCL-6 génben leírt SHM fiziológiás vagy patológiás jelentőségére máig

nem derült fény. (11, 130) Az ASHM során viszont a hipermutációs aktivitás átterjed más, a fiziológiás célgéneken

kívüli

lókuszokra

is,

ahol

proto-onkogének

találhatóak

(5. A-D ábrák). E proto-onkogének mutációi normál B-sejtekben és egyéb B-sejtes NHL-ákban sem mutathatók ki, tehát egy DLBL-asszociált folyamatról van szó. Az ASHM a DLBL-ák mintegy 50%-ban fordul elő, leírták a központi idegrendszer DLBL-jában, illetve az AIDS-asszociált NHL-ákban is. (26, 85, 99)

16


V1

V2

5’

Bödör Csaba

Vn

J 1-4

D 1-12

*

*

CΗ

*

3’

3’

5’ V2-D2-J1

CΗ

5’

3’ CDR1

CDR2

CDR3

CH

4. ábra: A szomatikus rekombináció és szomatikus hipermutáció folyamata. A szomatikus rekombináció során a csontvelőben a csíravonal konfigurációjú V, D és J immunglobulin (Ig) géncsaládok kiválasztott tagjainak rekombinálódása során kialakul a funkcionálisan átrendeződött Ig gén. Antigénnel való találkozást követően a nyirokcsomók csíraközpontjaiban zajlik le a szomatikus hipermutáció (SHM) folyamata, amely során az Ig gének hipervariábilis régióiban (CDR1, CDR2, CDR3) szomatikus mutációk jelennek meg. Az SHM folyamata alapvető fontosságú az Ig molekulák affinitásérése szempontjából. (Rövidítések: CDR1, 2 és 3: complementaritást meghatározó régió 1, 2 és 3, V, D és J: variábilis, diverzitás és joining géncsaládok, CH: immunglobulin konstans domén)

Az ASHM által érintett gének egyike a c-MYC proto-onkogén (5. A ábra). Ez a gén egy, a sejtnövekedés, proliferáció, differenciáció és apoptózis kontrolljában központi szerepet betöltő transzkripciós faktor kódolásáért felelős. Tumor-asszociált folyamatokban a c-MYC gén szerepe már régóta ismert, például a t(8;14) kromoszóma transzlokáción keresztül a Burkitt-lymphomák kialakulásában játszik szerepet.

(107, 108)

Az ASHM során kialakuló mutációk döntő többsége a gén két régiójára, mégpedig a P1/P2 major promotertől, illetve a P3 minor promotertől downstream irányba található 1,5 illetve ~0,9 kb hosszúságú szakaszokra lokalizálódik. A második gén, amelyet gyakran érint az ASHM a PAX-5 (5. B ábra), amely egy B-sejt specifikus transzkripciós faktort kódol. A PAX-5 génterméknek fontos szerepe van a B-sejt irányba való elköteleződés során. transzlokációját.

(86)

(92)

Bizonyos lymphomákban leírták az Ig génekhez való

A gént érintő mutációk az 1B exon környezetében, mintegy

1 kb-nyi szakaszt felölelve fordulnak elő. A RhoH gén ugyancsak érintett az ASHM által (5. C ábra). A RhoH gén egy, a Ras szupercsaládba tarozó kis GTP-kötő fehérje

17


Bödör Csaba

kódolásáért felelős, és feltehetően egy proto-onkogén. Különböző B-sejtes NHL-ákban gyakran transzlokálódhat az Ig génekhez.

(106)

A génben található szekvencia variánsok

az 1B exon 3’ irányban található nem kódoló régióra lokalizálódnak. Egy további mutált gén a PIM-1 proto-onkogén, melyet egy provírus integrációs génszakaszként azonosítottak egér T-sejtes lymphomákban, és érintett néhány humán DLBL-asszociált kromoszóma-transzlokációban.

(18)

A mutációk 90%-a a transzkripciót iniciáló régió

3’ végétől 2 kb-nyira található, mintegy 1,2 kb-nyi hosszúságú szakaszon (5. D ábra). (99)

P0

+2300

+2600

P1 P2

P3

+3000

+3400

MYC

+3800

+4200

+4600

+5000

5. A ábra: A c-MYC gén szomatikus hipermutációnak kitett részei. A c-MYC gén egy transzkripciós faktort kódol, mely a sejtnövekedés, proliferáció, differenciáció és az apoptózis kontrolljában tölt be meghatározó szerepet. A c-MYC gén a t(8;14) kromoszóma transzlokáción keresztül a Burkitt-lymphomák kialakulásában játszik szerepet. Az ASHM két régiót – a P1/P2, illetve a P3 promotertől downstream irányban található szakaszokat – érint. A mutációkat hordozó régiókat a skálán látható piros szakaszok jelölik, míg a függőleges nyilak kromoszóma transzlokációk által érintett területet reprezentálják.

PAX-5

Exon 1A +194

Exon 1B +794

+46

+646

+1246

+1746

5. B ábra: A PAX-5 gén szomatikus hipermutációnak kitett részei. A B-sejt differenciációban központi szerepet betöltő, B-sejt specifikus transzkripciós faktort kódoló PAX-5 génre jellemző, a bizonyos lymphoma típusokban leírt, Ig génekhez történő transzlokációja. Az ASHM az 1B exon 3’ végét és az azt követő szekvenciákat érinti. A mutációkat hordozó régiókat a skálán látható piros szakaszok jelölik, míg a függőleges nyilak kromoszóma transzlokációk által érintett területet reprezentálják.

18


Bödör Csaba

RhoH

Exon 1B +1

+200

+400

+600

+800

+1000

+1200

+1400

+1600

+1800

5. C ábra: A RhoH gén szomatikus hipermutációnak kitett részei. A RhoH gén, mely feltehetően egy proto-onkogén, egy kis GTP kötő fehérjét kódol, amely a Ras szupercsaládba tartozik. Lymphomákban leírták az Ig génekhez való transzlokációját. Az ASHM az 1B exont követő nem kódoló, szabályozó régiót érinti. A mutációkat hordozó régiókat a skálán látható piros szakaszok jelölik, míg a függőleges nyilak kromoszóma transzlokációk által érintett területet reprezentálják.

Pim-1

+740

+1140

+1540

+1940

+2340

+2740

+3040

5. D ábra: A PIM-1 gén szomatikus hipermutációnak kitett részei. A provírus integrációs génszakaszként azonosított PIM-1 proto-onkogén érintett néhány humán DLBL-re jellemző kromoszóma-transzlokációban. Az ASHM a transzkripciót iniciáló szakasztól 3’ irányban lévő régiót érinti. A mutációkat hordozó régiókat a skálán látható piros szakaszok jelölik, míg a függőleges nyilak kromoszóma transzlokációk által érintett területet reprezentálják.

A felsorolt lókuszokban detektált mutációk mintázata megegyezik az IgV és a BCL-6 génekre jellemző SHM mintázatával: a mutációk többsége egyszerű nukleotid szubsztitúció, az inszerciók, deléciók előfordulása ritka. A mutációk a transzkripciót iniciáló régióktól megközelítőleg 2 kb-ig terjedő távolságban lokalizálódnak, gyakran érintik az RGYW (ahol R= A vagy G; Y= C vagy T; W= A vagy T) szekvencia-motívumot. A tranzíciók (purin → purin) aránya valamivel gyakoribb a transzverzióknál (purin → pirimidin, pirimidin → purin), illetve preferencia mutatható ki a G+C nukleotid párokat érintő mutációk irányába. (116, 117, 140)

19


Bödör Csaba

Feltételezik, hogy az ASHM a felsorolt géneken kívül még egyéb lókuszokat is érinthet, ún. genom szintű instabilitást létrehozva ezáltal.

(99, 137)

Ebből kifolyólag

az ASHM számos mechanizmuson keresztül vezethet lymphomák kialakulásához. A

mutációk

lokalizációja

transzlokációkra

jellemző

az

egyes

génekben

gyakran

fő

kromoszóma-töréspontokkal

átfed (5.

a

különböző

A-D

ábrák).

Továbbá az, hogy a mutációk kódoló és nem-kódoló regulációs szekvenciákat egyaránt érintenek, arra utal, hogy az ASHM, a fehérjeszerkezet megváltoztatásán kívül, gének inaktiválásán, expressziójuk szabályozásán keresztül is hozzájárulhat a malignus transzformáció folyamatához. Az ASHM a malignus transzformáció kialakulásában szerepet játszó újonnan leírt mechanizmus, amely a DLBL-ák patogenezisében – különféle genetikai abnormalitások mediálásán keresztül – feltehetően központi szerepet játszik. Ugyanakkor az MNBL esetében az ASHM jelenlétéről a szakirodalomban nincs adat.

20


Bödör Csaba

II. 4. Az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) Az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) a citidin deamináz fehérjék családjába tartozó molekula, amely esszenciális szerepet tölt be az SHM és az izotípusváltás („class switch” rekombináció - CSR) folyamatában.

(87, 88)

Az AID hatásmechanizmusára vonatkozóan több elképzelés is született. Az egyik elgondolás szerint az AID az mRNS „editálásán” keresztül fejti ki hatását.

(90)

Mára azonban bizonyítást nyert az az elképzelés, miszerint az AID egy DNS mutátor molekula, amely a transzkripció során, közvetlenül az egyszálú DNS (ssDNS) molekulán képes citidin deamináz aktivitását kifejteni, különböző, többségében még ismeretlen kofaktorok segítségével (6. ábra).

(9, 103)

Ezt támasztják alá azok a biokémiai

vizsgálatok is, amelyek az AID-nek az ssDNS molekulákhoz való preferenciális kapcsolódásáról számolnak be. (57, 110)

RPA +?

AID

RNS polimeráz II. 6. ábra: Az AID működése a transzkripció során. Az AID a transzkripció során, az ún. transzkripciós buborék keletkezésekor képes citidin deamináz aktivitását kifejteni az egyszálú DNS molekulán. Ehhez több kofaktor szükséges, melyek többsége még ismeretlen. (Rövidítések: RPA- replikációs protein A, AID- aktiváció-indukált citidin deamináz)

A folyamat során a deoxy-citidin (dC) deaminálása történik deoxy-uridinné (dU), ami a DNS molekulában egy guanin-uracil (G-U) bázispárosodási hibát (mismatch) eredményez.

(101, 102)

Ezek a G-U mismatchek képezik az SHM és CSR

folyamatainak intermediereit. E mismatchek javítására a 7. ábrán látható módon több mechanizmus

is

életbe

lép,

és

ezek

jellegétől

függően

különböző

típusú

szomatikus mutációk vagy DNS törések létrejötte lehet az AID működésének

21


eredménye.

(39, 67, 141-143)

Bödör Csaba

A bázispárosodási hibák javítás nélkül is replikálódhatnak,

G-C > A-T tranzíciókat eredményezve ezáltal (7. ábra: 1. A). A hibajavító mechanizmusok aktiválódása során az egyik lehetőség az ún. bázis-excíziós rendszer (BER) általi korrekció. Ebben az esetben egy nagyobb régió kerül eltávolításra, aminek pótlása ún. „error-prone”, azaz hibázásra hajlamos polimerázok által történik, további mutációk megjelenését eredményezve (7. ábra: 2. A). Az itt létrejövő mutációk tranzíciók és transzverziók egyaránt lehetnek. A G-U mismatchek eltávolítása végbemehet továbbá a DNS uracil-N-glikoziláz (UNG) enzim működésével, amikoris az uracil eltávolításával abázikus pozíciók keletkeznek. Az ekkor lezajló transzléziós polimerázok általi replikációnak köszönhetően valamennyi típusú mutáció létrejöhet (7. ábra: 3. A). Az abázikus pozíciókat az apurin/apirimidin endonukleáz (APE) is képes eltávolítani, egyszálú réseket („nick”) eredményezve, amelyek „error prone”polimerázok általi pótlása során különböző típusú mutációk jöhetnek létre (7. ábra: 2. A). A duplaszálú DNS törések létrejöttére egy magyarázat lehet az, amikor a bázispárosodási hibák javítása azok pozíciójából kifolyólag eredményezi a DNS törését (7. ábra: 1. B).

(121)

Összességében tehát az AID „mindössze” a bázispárosodási

hibák kialakításáért felelős, a mutációk sokasága pedig ezen mismatchek feloldása céljából aktiválódó mechanizmusok eredménye. (12) Az AID expressziója a normál B-sejt fejlődés során a csíraközpontok CD19+/CD38+ B-sejtjeire korlátozott, ahol a fent vázolt mechanizmusokon keresztül alapvető immunológiai folyamatokban (SHM és CSR) tölt be központi szerepet. Hiánya különböző immundeficiens állapotokban nyilvánul meg.

(45, 91)

(88)

A konstitutív

AID expresszió azonban daganatok kialakulásához vezet. Okazaki és munkatársai transzgén egerekkel végzett kísérleteik során T-sejtekben és fibroblastokban expresszáltatták az AID fehérjét. Megfigyeléseik alapján az AID expresszió számos daganat

(pl:

T-sejtes

lymphoma,

microadenoma)

kialakulását,

valamint

a TCR és c-MYC génekben mutációk megjelenését eredményezte, ami a kísérleti állatok korai elpusztulásához vezetett.

(93)

Az AID a c-MYC gén transzlokációk által érintett

régióihoz képes kapcsolódni, szerepét a jól ismert c-MYC-IgH kromoszóma transzlokáció esetében is igazolták. (109) Az AID kóros expressziója tehát illegitim DNS rekombinációk kialakulásán keresztül okoz genetikai instabilitást a genomban, és vezet ezáltal lymphomák kialakulásához, továbbá nagy valószínűséggel az AID expresszió

22


Bödör Csaba

tehető felelőssé a már említett ASHM kialakulásáért is, aminek során mutációk jelennek meg különböző proto-onkogénekben. (97, 109)

A

B

G C

G C

C G

1.A

AID G C

A T

G C

Replikáció

BER

G U

A U

UNG

Mutációk (tranzíciók)

G

T

A T

A

C G

C

G C

G

G U

G

EPP G

G

APE

Mutációk (tranzíciók, transzverziók)

APE

U G

UNG G

Transzléziós replikáció T A

AID

G

G

2.A

G

G G

Mutációk (tranzíciók, transzverziók)

Duplaszálú DNS törés 3.A

1.B

7. ábra: A G-U mismatchek feloldására működésbe lépő mechanizmusok és kimenetelük. Az AID működése kapcsán létrejövő mismatchek első lehetőségként javítás nélkül is replikálódhatnak. Ennek eredményeképp mutációk (csak tranzíciók) jönnek létre (1. A). A további lehetőségek egyikeként a bázispárosodási hibák a bázis-excíziós rendszer (BER) által kerülnek javításra, aminek eredményeképp egy nagyobb régió vágódik ki. Ennek pótlása ún. „error-prone”-polimerázok segítségével történik, ami addicionális mutációk (tranzíciók és transzverziók) megjelenését is eredményezi (2. A). A hibajavítás egy következő lehetősége, amikor a DNS uracil-N-glikoziláz (UNG) molekula egy abázikus pozíciót hoz létre. Ebben az esetben is, a transzléziós replikációnak köszönhetően, mutációk jönnek létre (3. A). Az abázikus pozíciókat az apurin/apirimidin endonukleáz (APE) is eltávolíthatja, ún. réseket („nick”) létrehozva a DNS molekulán, melyek pótlása „error-prone”polimerázok által történik, különböző típusú mutációkat kialakítva (2. A). Az ábra B oldalán a duplaszálú DNS törések keletkezésének egy lehetősége látható, ahol a hibajavítás az eltérések pozíciójából adódóan vezethet a DNS molekula töréséhez (1. B). (Rövidítések: AID- aktiváció-indukált citidin deamináz, BER- bázis excíziós rendszer, UNG- uracil-N-glikoziláz, APE- apurin/apirimidin endonukleáz, EPP- error- prone polimeráz)

23


Bödör Csaba

Az AID konstitutív expresszióját leírták különböző CG-típusú B-sejtes NHL-ákban.

(32, 131)

Újabb eredmények szerint az AID expressziója mRNS és fehérje

szinten is kimutatható a CG-típusú DLBL-ák nagy részében, illetve néhány aktivált B-sejt típusú DLBL-ban is.

(63, 97)

Arról, hogy az MNBL-re jellemező-e az AID

expressziója, az irodalomban nem található adat.

24


Bödör Csaba

III. CÉLKITŰZÉSEK

Munkánk

során

a

mediastinalis

nagy

B-sejtes

lymphoma

(MNBL)

kialakulásában szerepet játszó genetikai tényezők vizsgálatát tűztük ki célul.

Főbb kérdéseink a következők voltak:

1. A c-MYC, PAX-5 és RhoH gének mutációs státuszának feltárásával arra kerestük a választ, vajon szerepet játszhat-e az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM) az MNBL patogenezisében.

2. Az

aktiváció-indukált

citidin

deamináz

(AID)

fehérjének

az

MNBL

kialakulásában betöltött szerepére génexpressziós, illetve fehérje szintű vizsgálatokkal kívántunk választ kapni.

3. A szekvencia analízis és a génexpressziós vizsgálatok eredményeinek összevetésével az ASHM és az AID expresszió lehetséges kapcsolatát elemeztük.

25


Bödör Csaba

IV. ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK IV. 1. Szövetminták Vizsgálatainkhoz hat, a Semmelweis Egyetem I. sz. Patológiai és Kísérleti Rákkutató Intézetben mediastinalis nagy B-sejtes lymphomával (MNBL) diagnosztizált beteg biopsziás mintáit használtuk. A diagnózis a WHO (World Health Organization) lymphoid

szövetek

tumoros

megbetegedéseinek

osztályozására

vonatkozó

kritériumainak megfelelően, hisztopatológiai és immunfenotípus vizsgálatok alapján történt.

(4)

Valamennyi tumorminta CD20 és CD79α pozitív, azonban CD3, CD5,

CD10, CD15, CD23, EMA és CD68 negatív volt. A tumorsejtek három esetben CD30 pozitivitást is mutattak. A tumorsejtek aránya valamennyi biopsziás mintában legalább 90% volt. Extranodális manifesztáció egyik esetben sem volt megfigyelhető. A vizsgált betegek klinikai adatai az 1. táblázatban láthatóak. 1. Táblázat: A betegek klinikai adatai Esetszám

Életkor

Nem

Extranodális manifesztáció

1.

26

férfi

nincs

2.

22

férfi

nincs

3.

31

nő

nincs

4.

60

férfi

nincs

5.

24

nő

nincs

6.

37

nő

nincs

Tanulmányunk során kontrollként szerepelt négy follicularis lymphomával (FL), öt diffúz nagy B-sejtes lymphomával (DLBL) és egy anaplasias nagysejtes lymphomával (ALCL) diagnosztizált beteg biopsziás mintája, továbbá két, reaktív elváltozást mutató nyirokcsomó. A diagnózis ezekben az esetekben is a WHO kritériumainak megfelelően lett felállítva.

26


Bödör Csaba

IV. 2. Sejtvonalak A szövettani minták mellett vizsgálatainkhoz különböző sejtvonalakat is használtunk. Az MNBL modellrendszereként a MedB-1 sejtvonalat alkalmaztuk, amelyért köszönet illeti Dr. Peter Möllert (Institute of Pathology, University of Ulm, Németország). E sejtvonal egy 27 éves férfi beteg mediastinalis tumorából lett létrehozva és feno- illetve genotípusát tekintve is megegyezik az MNBL-nél leírtakkal. (82)

A sejtvonal CD20 és CD79a pozitivitása, valamint a CD3, CD5 és CD10

negativitása általunk is megerősítést nyert. Kontrollként használtuk továbbá a Ramos, BL-41, HT58, CEM, Jurkat és a K562 sejtvonalakat, amelyek fontosabb jellemzői a 2. táblázatban találhatók.

2. Táblázat: A kontrollként használt sejtvonalak jellemzői Sejtvonal

Eredet

Ramos

Burkitt lymphoma

BL-41

Burkitt lymphoma

HT58

Burkitt lymphoma

CEM

Akut lymphoid leukaemia

Jurkat

Akut lymphoid leukaemia

K562

Krónikus myeloid leukaemia

A különböző sejtvonalak tenyésztése a standard szövettenyésztési protokolloknak megfelelően történt, 10% FCS-t (magzati borjúsavó), 2 mM glutamint, 100 U/ml penicillint, 100 μg/ml streptomycint tartalmazó RPMI-1640 tápoldatban, 37 °C-os termosztátban (5% CO2). A MedB-1 sejtvonal speciális IMDM tápoldatot (Iscove’s modified Dulbecco’s medium) igényelt. Az IMDM tápoldat további komponensei megegyeztek az RPMI-1640 esetében leírtakkal. Valamennyi oldat és reagens beszerzése a Sigma kft-től (St. Louis, USA) történt.

27


Bödör Csaba

IV. 3. DNS szintű vizsgálatok A DNS szintű vizsgálataink munkamenete a 8. ábrán látható összefoglalva. Az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM) vizsgálata során hat MNBL, egy ALCL esetből, továbbá a MedB-1 és HT58 sejtvonalakból végeztünk DNS izolálást a c-MYC, PAX-5 és RhoH gének szekvencia analízisének céljából. A felsorolt gének polimeráz lánc-reakcióval (PCR) történő amplifikációját követte azok szekvenálása kapilláris elektroforézissel.

DNS izolálás

Szekvenálás

PCR

8. ábra: A mutáció analízis munkamenetének vázlata. A tumormintákból történt DNS izolálást követően, a célgénekre specifikus oligonukleotidok segítségével végeztük el a PCR amplifikációt, majd a vizsgált gének mutációs mintázatának feltárása céljából, kapilláris elektroforézissel történő szekvenálását.

IV. 3. 1. DNS izolálás A genomiális DNS izolálása a fagyasztott szövetmintákból telített NaCl felhasználásával, a hagyományos kisózásos módszerrel történt.

(77)

A tumormintákból

10 darab, 30 μm vastagságú metszetet készítettünk, melyeket 3 ml mag-lízis pufferben (10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl, 2 mM EDTA és 5% SDS) szuszpendáltunk, majd 50 μl proteináz-K oldat (1 mg proteináz-K, 2 mM EDTA) hozzáadása után egy éjszakán át 37 °C-on emésztettük. Ezt követően 1 ml telített NaCl (6 M) oldatot mértünk az

elegyhez,

majd

2500

rpm

fordulatszámmal

20

percig

centrifugáltuk.

A felülúszóból kétszeres térfogatnyi abszolút alkohollal csaptuk ki a DNS-t, majd a precipitátumot 80%-os etanolban kétszer mostuk. A DNS-t 150 μl TE oldatban (10 mM Tris-HCl, 2 mM EDTA) vettük fel, a tökéletes oldódás érdekében 55 °C-on 1 órán keresztül inkubáltuk. A minták koncentrációját fotométer segítségével (Gene Quant II, Cambridge, UK) mértük le 260 nm hullámhosszon. Az így izolált DNS

28


Bödör Csaba

mintákat a további felhasználásig 4 °C-on tároltuk. A sejtvonalak esetében a DNS izolálást 105 sejtből kiindulva a High Pure PCR Template Preparation Kit-tel (Roche, Mannheim, Németország) végeztük el a gyártó utasításainak megfelelően. IV. 3. 2. A c-MYC, PAX-5 és RhoH gének PCR amplifikálása A vizsgálni kívánt gének PCR amplifikációjához a Triple Master PCR System kitet (Eppendorf, Hamburg, Németország) használtuk, mely a szekvencia analízishez megfelelő másolási hűséggel rendelkező DNS-polimerázt tartalmaz. A reakciókat valamennyi gén esetében 100 ng DNS templátot használva, 25 μl végtérfogatban hajtottuk végre. A reakcióelegy pontos összetétele a 3. táblázatban látható.

3.Táblázat: A PCR reakciók összetétele Komponens

Bemérés

High fidelity puffer (10x)

2 μl

dNTP mix (2 mM)

2 μl

Forward primer (10 μM)

1 μl

Reverse primer (10 μM)

1 μl

TripleM polimeráz (5U/μl)

2 μl

DNS templát

100 ng

Desztillált víz

25 μl-ig

Az amplifikáció a PE 2400 Gene Amp (Perkin-Elmer, USA) PCR készülékben zajlott 35 cikluson keresztül, a 4. táblázatban látható hőprofilnak megfelelően. Valamennyi esetben két párhuzamos reakciót futtattunk.

4. Táblázat: A PCR reakció hőprofilja Hőmérséklet / Idő

Lépés Kezdeti denaturáció

94 °C

2 min.

Denaturáció

94 °C

30 sec.

Anelláció

58 / 68 °C

45 sec.

Extenzió

72 °C

50 sec.

Végső extenzió

72 °C

7 min.

29

}

30 ciklus


Bödör Csaba

A c-MYC, PAX-5 és RhoH gének meghatározott szakaszaira specifikus primerek kiválasztása irodalmi adatok alapján

(26)

, illetve a Primer Express 1.1 (Applied

Biosystems) primer-tervező program segítségével történt. Az általunk használt primerek szekvenciája és olvadási hőmérséklete az 5. táblázatban látható. A PCR reakciók anellációs lépésének hőmérsékletét ezek figyelembevételével határoztuk meg. Ennek megfelelően az anellációs hőmérséklet a c-MYC exon-1, PAX-5 és RhoH amplifikálása során 58 °C, míg a c-MYC exon-2 esetében 68 °C volt.

5. Táblázat: A PCR és szekvencia analízis során használt primerek adatai. Lokalizáció

Primer szekvencia

Olvadáspont (°C)

5´-CCCAGAGACTCGGAGAAGCA-3´

60 °C

5´-AAGAGCTGAAATGTCGCCGCCG-3´

64 °C

c-MYC exon-1

5´-CACCGGCCCTTTATAATGCG-3´

62 °C

5´-CGATTCCAGGAGAATCGGAC-3´

59 °C

c-MYC exon-2

5´-CTTTGTGTGCCCCGCTCCAG-3´

66 °C

5´-GCGCTCAGATCCTGCAGGTA-3´

61 °C

5´-CCTTAAAAGTATTTCTTTGGTGTC-3´

55 °C

5´-AACTCTTCAAGCCTGTGCTG-3´

55 °C

PAX-5

RhoH

A c-MYC génre specifikus két primerpárral egy 1300 bp (c-MYC exon 1), illetve egy 580 bp (c-MYC exon 2) hosszúságú szakasz amplifikálását is elvégeztük. Az 1300 bp hosszúságú termék az 1-es exonnak a P1/P2 major promoterétől downstream elhelyezkedő régióját, míg az 580 bp nagyságú termék a 2-es exonnak a P3 minor promoterétől downstream található régióját reprezentálja. A Pax-5 génre specifikus primerpár egy 859 bp hosszú régiót zár közre. Ez a régió az 1B exon 3’-végét és az 1-es intron egy részét foglalja magába. A RhoH gén esetében egy 844 bp hosszúságú, az 1-es intron 5’-végét tartalmazó szakaszt amplifikáltunk. IV. 3. 3. A PCR termékek elválasztása, detektálása és tisztítása A PCR termékek elválasztása agaróz-gélelektroforézissel történt, 2 vegyes %-os (v%) agaróz gélben (2g agaróz, 100 ml 1x TAE puffer), ethidium-bromid (1μg/ml) jelöléssel. Futtató pufferként is 1x TAE oldatot (10X TAE törzsoldat: 0,4 M TRIS,

30


Bödör Csaba

0,2 M ecetsav, 0,01 M EDTA) használtunk. A 130 V feszültségen 40 percen át zajló elektroforézist követően a migrációs mintázat UV fényben történő detektálásához az Eagle-eye géldokumentációs rendszert (Stratagene, USA) használtuk. A PCR termékek tisztítására a Montage PCR Filter Device (Millipore, Billerica, USA) kitet használtuk a gyártó utasításainak megfelelően. Erre a lépésre azért van szükség, hogy a reakcióelegyből eltávolítsuk a továbbiakban a szekvencia analízis szempontjából felesleges és zavaró reakció komponenseket (lásd: 3. táblázat). A tisztítási lépés után a PCR termékek meglétét agaróz-gélektroforézissel ellenőriztük a fentebb leírtakkal megegyezően. IV. 3. 4. A c-MYC, PAX-5 és RhoH gének szekvencia analízise A szekvencia analízis elvi alapja a Sanger által leírt ún. láncterminációs eljárás, melynek részletei a 9. ábrán láthatóak. (122) Az adott minta szekvenálása a tisztított PCR termék és egy primer (forward vagy reverz orientációjú) felhasználásával történik. A speciális reakcióelegy kiemelt fontosságú komponensei a fluorokrómmal konjugált 2’-3’ dideoxy-nukleotid trifoszfát analógok (ddNTP), amelyek a deoxy-nukleotid trifoszfátokhoz (dNTP) képest a nukleotid cukor komponensének 3-as szénatomján sem hordoznak hidroxil funkciós csoportot. E funkciós csoport megléte esszenciális a következő nukleotid beépüléséhez; tehát az extenzió során egy ddNTP beépülése egy adott pozícióba láncterminációt eredményez. A nagy számok törvénye alapján a megfelelő (komplementer) ddNTP beépülése valamennyi pozícióban megtörténik az amplifikáció során. Így a szekvenáló reakció eredményeként a teljes szekvenálandó mintát reprezentáló, különböző hosszúságú termékekkel rendelkezünk. A termékek méret szerinti elválasztása kapilláris elektroforézissel történik, ami egy speciális összetételű polimerben zajlik. Tekintve, hogy a négy különböző ddNTP (ddATP, ddGTP, ddCTP, ddTTP) különböző fluoreszcens molekulával van jelölve, a méret alapján történő szeparálás mellett a terminális nukleotidok azonosítása is lehetővé válik. Ez egy lézerrel történő gerjesztéssel, majd az emittált fény hullámhosszának azonosítása által történik. Ezek alapján a számítógép valamennyi termék esetében azonosítja a terminális nukleotidot és azok „összeolvasásával” valósul meg a szekvencia meghatározása (9. ábra).

31


3’-

A

G

C

5’- T

G

A C

T T

G

C A

G

A C

Bödör Csaba

G T

T - 5’

T C

A

A

- 3’

C

A

C

A

T

G

T

G

dNTP elegy

Templát DNS

ddNTP elegy

Szekvenáló reakció („cycle sequencing”) 3’-

A 5’-

C

G

A

T

C

G

A

G

Lézer

T

T - 5’ AGCTC

A

5’-

Prime r

A

G

5’-

Prime r

A

G

C

5’-

Prime r

A

G

C

T

5’-

Prime r

A

G

C

T

C

5’-

Prime r

A

G

C

T

C

A

5’-

Prime r

A

G

C

T

C

A

AG

AG CT

AG C

CA CT

-

A

AG C T C

Kapilláris elektroforézis

A

AG C TC A

A

Detektor

AG

Prime r

+

9. ábra: A szekvenálás módszertani alapjai. A Sanger-féle lánctermináción alapuló szekvencia meghatározás központi elemei a 2’-3’ dideoxynukleotid analógok (ddNTP). A normál deoxy-nukleotidokhoz képest (dNTP) a deoxy-ribóz 3-as szénatomján sem hordoznak hidroxil csoportot. A 3-as hidroxil csoport feltétlenül szükséges a következő nukleotiddal kialakítandó foszfodiészter kötéshez; hiánya láncterminációhoz vezet. A szekvenáló reakció során az elegy a normál dNTP-k mellett ddNTP analógokat is tartalmaz, amelyek különböző fluorokrómmal vannak konjugálva a négy különböző nukleotid analóg esetében. A reakció során a megfelelő ddNTP-k beépülésének eredményeként különböző hosszúságú, fluoreszcensen jelölt termékeket nyerünk. E termékek elválasztása kapilláris elektroforézissel történik, amely során azok méretüknek megfelelően érnek a lézersugár útjába. A bekövetkező gerjesztés, majd az adott fluorokróm emissziója által a számítógép képes a megfelelő terminális nukleotidot a termékhez rendelni, ami végeredményben az egész szekvencia leolvasását jelenti.

A szekvenciák meghatározását a tisztított PCR termékek direkt, mindkét irányból történő szekvenálásával végeztük el, Big Dye Terminator 3.1 (Applied Biosystems) kitet használva. A PE 2400 Gene Amp (Perkin-Elmer, USA) PCR készülékben 25 cikluson át zajló szekvenáló reakció (ún. cycle sequencing) pontos

32


Bödör Csaba

összetétele és az amplifikáció hőmérsékleti paraméterei a 6. illetve 7. táblázatban láthatóak. A szekvenáláshoz a PCR-rel megegyezően az 5. táblázatban felsorolt primereket használtuk.

6. Táblázat: A szekvenáló reakció összetétele Komponens

Bemérés

Big Dye Terminator

1 μl

Big Dye Puffer (10x)

1 μl

Primer (10 μM)

1 μl

PCR termék

2 μl

7. Táblázat: A szekvenáló reakció hőprofilja Lépés

Hőmérséklet / Idő

Kezdeti denaturáció

94 C°

2 min.

Denaturáció

94 C°

30 sec.

Anelláció

54 C°

15 sec.

Extenzió

60 C°

4 min.

}

30 ciklus

A „cycle sequencing” reakció termékeinek tisztítása során a feleslegben megmaradt és a későbbiekben zavaróvá váló fluoreszcens komponensek eltávolítása történt. Ezt a lépést a DyeEx 2.0 kittel (Qiagen, USA) végeztük el a gyártó utasításai szerint. A tisztított termékeket 20 μl TSR reagensben vettük fel, majd 95 °C-on 1 perces denaturációt követően az analízisükig jégen tartottuk azokat. A szekvenciák leolvasása kapilláris elektroforézis módszerével történt, az ABI 310 genetikai analizátor (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével. A nyers adatok értékeléséhez a Sequencing Analysis 3.7 (Applied Biosystems), illetve a BioEdit (Isis Pharmaceuticals, USA) programokat használtuk. Az általunk nyert szekvenciákat az NCBI GenBank adatbázisban található, egészséges donoroktól származó referencia szekvenciákhoz illesztettük, melyek azonosító kódjai a következők voltak: c-MYC: X00346, PAX-5: AF386791, RhoH: AF386789. A mutáció analízisből kizártuk a már leírt polimorfizmusokat, illetve azokat a mutációkat, amelyek különálló

33


Bödör Csaba

esetekben (különböző mintákban) is megjelentek, mivel ezek szomatikus eredetének valószínűsége

rendkívül

kicsi;

feltehetően

polimorfizmusok.

A

mutációk

az elektroferogramokon dupla csúcsok formájában jelentkeztek, vagyis a vad és mutáns típust reprezentáló bázis egyaránt látható. Ez a mutációk heterozigóta jellegével, illetve a normál, mutációt nem hordozó sejteknek a tumorsejtek közötti jelenlétével magyarázható. Valamennyi mutáció meglétét két, párhuzamos PCR termékből való kimutatással igazoltuk forward és reverz irányból egyaránt. Ezzel kizártuk azt, hogy az enzim esetleges másolási hibájából adódó változást valós mutációnak tekintsük. A génenkénti átlagos mutációs frekvenciák számolása során csak a mutációkat hordozó eseteket vettük figyelembe. Az alábbiakban látható képlet szerint: a mutációk számát (n) osztottuk el a megszekvenált bázispárok számával (N), mindkét allélt figyelembe véve.

Mutációs gyakoriság / 100 bp =

34

n 2N

* 100


Bödör Csaba

IV. 4. RNS szintű vizsgálatok Az RNS szintű vizsgálataink munkamenete a 10. ábrán látható összefoglalva. Az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) mRNS expresszió meghatározásának céljából teljes RNS izolálást végeztünk hat MNBL, négy FL, öt DLBL, öt normál perifériás vér (PV) mintán, valamint a MedB-1, Ramos, BL-41, HT58, CEM, Jurkat és a K562 sejtvonalakon. Ugyancsak a génexpressziós vizsgálatok tárgyát képezték a két reaktív folyamatot mutató nyirokcsomóból lézer mikrodisszekcióval szeparált csíraközpont (centrum germinativum) sejtek. Valamennyi minta esetében valós-idejű kvantitatív

PCR-rel

(Q-RT-PCR)

végeztük

el

az

AID

mRNS

mennyiségi

meghatározását.

RNS izolálás

Reverz transzkripció

Valós-idejű PCR

10. ábra: Génexpressziós analízis munkamenetének vázlata. A szövetmintákból, perifériás vérből és sejtvonalakból történő RNS izolálást reverz transzkripció követte. Ezután végeztük el az AID mRNS expressziós szintjének meghatározását az MNBL és a különböző kontroll mintákban kvantitatív valós-idejű PCR segítségével. A relatív expressziós szintek meghatározása a ΔΔCT módszer alkalmazásával történt.

IV. 4. 1. Lézer mikrodisszekció Két, reaktív folyamatot mutató nyirokcsomóból, RNS izolálás céljából, csíraközpontokat

(centrum

germinativum)

mikrodisszekáltunk

a

Leica

lézer

mikrodisszekciós rendszer (Leica Microsystems, Wetzlar, Németország) segítségével. A fagyasztott szövetmintákból a speciális, mikrodisszekcióra alkalmas tárgylemezre 8 μm vastagságú metszeteket készítettünk, melyeket toluidin-kék (Sigma, St. Louis, USA) festékkel festettünk meg. Ezt követően a csíraközpontokra jellemző morfológiai kép alapján végeztük el a mikrodisszekciót. A sejteket Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA,

35


Bödör Csaba

USA) reagensbe gyűjtöttük. Az RNS degradációját elkerülendő, a folyamat során valamennyi eszközt RNA later (Qiagen, USA) reagenssel kezeltünk.

IV. 4. 2. RNS izolálás Totál RNS izolálást végeztünk az IV. 4. részben felsorolt fagyasztott tumor biopsziás mintákból, egészséges donorok perifériás véréből, sejtvonalakból, illetve a mikrodisszekált csíraközpontok sejtjeiből. Az RNS izoláláshoz valamennyi esetben Trizol reagenst használtunk. A fagyasztott szövetmintákból 15 darab, 30 μm vastagságú metszetet készítettünk, melyeket 1 ml Trizol reagensben homogenizáltunk. A sejtvonalak esetében 106 sejt alkotta üledéket szuszpendáltunk fel ugyancsak 1 ml Trizol reagensben. Az elegyhez 200 μl kloroformot mértünk, majd vortexelés és 3 perces szobahőmérsékleten történő inkubáció után, 15 percig 10 000 g-vel centrifugáltuk. Ezt követően leszívtuk a felső fázist, amihez 0,5 ml izopropanolt adtunk. 10 perces szobahőmérsékleten történő inkubálás után 10 000 g-vel 10 perces centrifugálás következett. A felülúszó leöntése után 1 ml 75%-os etanolt mértünk a csőbe, és 10 percig 10 000 g-vel centrifugáltuk. A felülúszó leöntését követően az RNS precipitátumot tartalmazó csövet jégben állítva hagytuk megszáradni, majd 50 μl DEPC-kezelt (dietil-pirokarbonát) vízben vettük fel és 37 °C-on, vízfürdőben inkubáltuk. Az RNS koncentrációját fotométer (Gene Quant II, Cambridge, UK) segítségével 260 nm hullámhosszon mértük meg. Az így izolált RNS mintákat további felhasználásig -70 °C-on tároltuk. A perifériás vérből történő RNS izolálás esetében az első lépés a mononukleáris sejtfrakció izolálása volt Histopaque-ágyon (Sigma, St. Louis, USA), sűrűség gradiens centrifugálással. E lépés során az EDTA-val alvadásgátolt 2 ml vért 2 ml Histopaque reagensre rétegeztünk, majd 25 °C-on, 400 g-vel 30 percig centrifugáltuk. Ezután szívtuk le az elkülönült mononukleáris sejtek frakcióját, amit 1 ml Trizol reagensben homogenizáltunk. Az ezt követő lépések megegyeztek a fentebb leírtakkal.

36


Bödör Csaba

IV. 4. 3. Reverz transzkripció (RT) A reverz transzkripciót, azaz cDNS szintézist a cDNA High Capacity Archive kit (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) segítségével végeztük el. 2,5 μg RNS kvantitatív konverzióját hajtottuk végre 100 μl végtérfogatban. A reverz transzkripciós reakció összetétele a 8. táblázatban található. A reakció a PE 2400 Gene Amp PCR készülékben zajlott – 10 perces 25 °C-on történő inkubációt követően – 120 percen keresztül, 37 °C-on. Az így készült cDNS mintákat további felhasználásig -20 °C-on tároltuk.

8.Táblázat: Reverz transzkripciós mix összetétele Komponens

Bemérés 10 μl

RT puffer (10x)

4 μl

dNTP mix (100 mM)

10 μl

Random hexamer (10x) Reverz transzkriptáz (50U/μl)

5 μl 2,5 μg

RNS templát

100 μl-ig

Nukleáz mentes víz

IV. 4. 4. Valós-idejű kvantitatív PCR (Q-RT-PCR) Az AID mRNS expressziós szintjének analízisét valós-idejű kvantitatív PCR (real-time, Q-RT-PCR) segítségével végeztük el, hat MNBL minta esetében, valamint az MNBL modellrendszereként használt MedB-1 sejtvonalban. Az MNBL-ben detektálható AID mRNS szintek más B-sejtes non-Hodgkin lymphomákkal való összehasonlítása céljából, az expressziós szinteket meghatároztuk négy FL és öt DLBL mintában is. Kontrollként öt egészséges donor perifériás vérének mononukleáris sejtjeit, két

reaktív

nyirokcsomóból

szeparált

centrum

germinativum

sejtjeit,

illetve

a 2. táblázatban felsorolt sejtvonalakat használtuk. Az AID amplifikációjához a TaqMan® alapú Assays-on-Demand™ (Applied Biosystems) génexpressziós rendszert használtuk, mely az AID több splice-variánsára is specifikus primerpárt és TaqMan® próbát tartalmaz. A belső kontrollként használt GAPDH

(glyceraldehid-3-foszfát

dehidrogenáz)

37

háztartási

gén

amplifikációját


Bödör Csaba

az ún. predeveloped TaqMan® Control Reagent (Applied Biosystems) rendszer segítségével végeztük el, amely úgyszintén egy primerpárt és egy TaqMan® próbát tartalmaz. A TaqMan® alapú módszer nagyfokú specificitást biztosít, mivel az amplifikációhoz három oligonukleotid egyidejű bekötődése szükséges.

(35)

Továbbá

a próbák tervezése valamennyi esetben exon-exon határra történt, ami kizárja a genomiális DNS-ből történő amplifikáció lehetőségét. A módszer elvi alapja a 11. ábrán látható. Az ún. TaqMan próbák kb. 20-30 bp hosszú oligonukleotidok, melyek az amplifikálandó régió középső szakaszával komplementerek. Ezen oligonukleotidok 5’ vége egy fluoreszcens festék molekulával jelölt, ez az ún. reporter (R), míg a próba 3’ vége egy, a reporter fluoreszcenciáját kioltó, ún. nem fluoreszcens quencher (NFQ) molekulát tartalmaz. Az általunk alkalmazott próbák 3’ végén az NFQ molekulához kapcsolva hordozza az ún. „minor groove binding” (MGB) molekulát is, ami a próba olvadáspontjának emelkedését eredményezi annak hossznövekedése nélkül. A próba intakt állapotában a kioltó molekula (NFQ) képes a reporter (R) fluoreszcens emisszióját elnyelni. Az energia átadás fluoreszcens rezonancia energia transzferrel (FRET) történik és a két molekula fizikai közelségén alapul (11. ábra: A). Az amplifikáció során a DNS polimeráz 5’-exonukleáz aktivitásának köszönhetően képes a próbát hasítani (11. ábra: B, C), miáltal a reporter távolabb kerül a kioltó molekulától, amely így már nem képes elnyelni a reporter által emittált fluoreszcenciát. A reakció előrehaladtával egy detektor folyamatosan érzékeli az exponenciálisan növekvő fluoreszcenciát, ami arányos az adott minta kiindulási RNS tartalmával, a vizsgálni kívánt gén expressziójának mértékével.

38


A

Bödör Csaba

R

Forward primer

Q

MG B

TaqMan próba

5’ 5’

3’ 5’

3’ 5’

Reverz primer

R

B

TaqMan próba

Forward primer

Q

MG B

P

5’

5’

3’ 5’

3’ 5’

P

Reverz primer

R

C

Q

Forward primer

MG B

P

5’

5’ 3’ 5’

3’ 5’

P

Reverz primer

11. ábra: TaqMan® alapú valós-idejű PCR elméleti alapjai. A: A TaqMan próbák mindkét végükön módosított, a célszekvencia középső részére specifikus oligonukleotidok. Az 5’ végen található a reporter (R), egy fluoreszcens festékmolekula, a 3’ végen pedig egy nem fluoreszcens quencher (NFQ) molekula, amely a reporterhez való fizikai közelségből kifolyólag képes annak fluoreszcens emisszióját kioltani. Az energiaátadás fluoreszcencia rezonancia energia transzferrel (FRET) zajlik. Az ún. minor groove binder (MGB) molekulának köszönhetően a próba anellációs hőmérséklete emelkedik, annak hossznövekedése nélkül. B: A termék szintézisének megkezdése után a DNS polimeráz (P) 5’-exonukleáz aktivitásának megfelelően hasítja a próbát, így a reporter molekula távolabb kerül a quencher molekulától. C: Ezáltal detektálni tudjuk a reporter molekula egyre növekvő fluoreszcens

emisszióját,

ami

arányos

a

termék

exponenciálisan

növekvő

mennyiségével, végeredményben pedig az adott minta kiindulási RNS tartalmával.

39


Bödör Csaba

A PCR amplifikáció során 100 ng cDNS templátot használtunk; a reakció 50 cikluson keresztül 20 μl végtérfogatban zajlott. A reakcióelegy pontos összetétele a 9. táblázatban látható. Az ABI Prism 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Weiterstadt, Németország) valós-idejű PCR készülékben zajló reakció hőprofilja a 10. táblázatban található. Ez a hőprofil az ún. két-lépéses PCR-nek felel meg, ahol az anelláció és az extenzió egyazon hőmérsékleten megy végbe. Az AID és GAPDH amplifikálása azonos feltételek mellett történt (*a GAPDH esetében a táblázatban szereplő Assays-on-Demand helyett természetesen a GAPDH TaqMan Control Reagent-t használtuk). Valamennyi esetben három párhuzamos reakciót futtattunk. 9.Táblázat: A reakcióelegy összetétele Komponens

Bemérés 10 μl

TaqMan Master mix (2x)

1 μl

AssayOnDemand (20x) cDNS templát

100 ng

Nukleáz mentes víz

20 μl-ig

10. Táblázat: A Q-RT-PCR hőprofilja Lépés

Hőmérséklet / Idő

Aktiváció

50 °C

2 min.

Kezdeti denaturáció

94 °C

10 min.

Denaturáció

94 °C

15 sec.

Anelláció-Extenzió

60 °C

1 min.

}

50 ciklus

Az adatok értékelése az SDS 1.3 (Sequence Detection Software) program segítségével történt. A valós-idejű PCR eredményeit CT értékek formájában nyertük. A CT érték („cycle threshold”) azt a ciklusszámot jelöli, ahol a relatív fluoreszcenciaszint eléri az általunk beállított küszöbértéket, a reakció exponenciális fázisában (12. ábra). A relatív expressziós szintek számolása a ΔΔCT módszerrel történt, melynek során a vizsgálni kívánt (AID) és a belső standardként használt (GAPDH) gén CT értékeit is meghatároztuk, úgy a kontrollcsoport, mint az egyes minták esetében.

40


Bödör Csaba

Valamennyi érték a három párhuzamos reakció átlagértékét reprezentálja. Az így kapott négy érték a következő: CT

(AID-minta),

CT

(AID-kontroll),

CT

(GAPDH-minta),

CT

(GAPDH-kontroll).

(Az egyes színek megfelelnek a 12. ábrán látható amplifikációs görbék színeinek.) A számolás menete az alábbiakban látható: ΔCT (AID) = CT (AID-MINTA) - CT (AID-KONTROLL) ΔCT (GAPDH) = CT (GAPDH-MINTA) - CT (GAPDH-KONTROLL) ΔΔCT = ΔCT (AID) - ΔCT (GAPDH) Relatív expresszió (AID/GAPDH) = 2 ΔΔCT

ΔCT (AID)= 6 ΔCT (GAPDH)= -1 ΔΔCT = 7

Relatív expresszió (AID/GAPDH) = 2 ΔΔCT (27) = 128

12. ábra: A relatív kvantifikáció ΔΔCT módszerének bemutatása. Az ábra egy valós-idejű PCR amplifikációs görbéit ábrázolja, relatív fluoreszcencia különbségek versus ciklusszám nézetben. Az eredményeket CT értékek formájában kapjuk meg, amelyek azt a ciklusszámot jelentik, ahol a relatív fluoreszcencia szint eléri az általunk beállított küszöbértéket (zöld vízszintes vonal). A relatív kvantifikáció során meghatározzuk a vizsgált és a kontroll minta CT értékeit a célgén (AID) és a belső kontroll gén (GAPDH) esetében is. A célgén és a kontroll gén esetében is meghatározzuk a CT értékek különbségét (ΔCT), majd ezek különbségéből – exponenciális növekedést feltételezve – határozzuk meg a célgén expressziós szintjét a vizsgált mintában a kontrollhoz képest. Az ábra egy 128-szoros expressziós különbséget eredményező példát mutat be.

Az így számolt expressziós érték azt fejezi ki, hogy az adott mintában az AID mRNS expressziója hányszorosa a kontroll mintában mérthez képest. A GAPDH-hoz való normalizálás lényege abban rejlik, hogy ezáltal elkerüljük azt, hogy az egyes minták közötti esetleges templát bemérési különbségekből, illetve RNS degradációból adódó expressziós különbségeket valós értékeknek tekintsük.

41


Bödör Csaba

IV. 5. Fehérje szintű vizsgálatok A DNS és RNS szinten vizsgált hat MNBL mintából négy esetben állt rendelkezésünkre fehérje szintű vizsgálódásokhoz is elegendő anyag. Eredményeink fehérje szinten történő megerősítése céljából immunhisztokémiai vizsgálatot végeztünk a négy MNBL eset formalin-fixált paraffinba ágyazott (FFPE) mintáiból, valamint a MedB-1 sejtvonalból. Kontrollként szerepelt egy reaktív folyamatot mutató nyirokcsomó és a Jurkat sejtvonal. IV. 5. 1. Immunhisztokémiai vizsgálat szövettani mintákon A vizsgált FFPE szövetmintákból készült 5μm vastagságú metszeteket kétszer xilol oldattal, majd leszálló etanol sor felhasználásával deparaffináltuk. Desztillált vízzel való alapos öblítés után az endogén peroxidáz aktivitás blokkolása céljából a lemezeket 20 percig 1%-os H2O2 metanolos oldatába helyeztük. Az antigénfeltárást AVAIR elektromos kuktában végeztük 900W-tal TRS pufferben (0,1 M, pH=6.1, Dako, Glostrup, Dánia), összesen 18 percig. Az immunreakciókhoz biotinmentes konjugált polimer,

Novolink™

(Novocastra,

Newcastle,

Egyesült

Királyság)

rendszert

használtunk. Első lépésként a lemezeket az aspecifikus antitest-kötődés elkerülése céljából a kit „Protein block” komponensével szobahőmérsékleten 10 percig inkubáltuk. A kétszeri, 5 perces TBS-sel való mosást követően az elsődleges monoklonális egér anti-AID ellenanyag (clone: L7E7, Cell Signaling Technology) hozzáadása következett, 1:100 hígításban (1%-os TBS). A metszeteket egy éjszakán át 4 °C-on inkubáltuk. Ezután a polimer hatékonyabb penetrációjának céljából, a mintákat kétszeri 5 perces TBS mosás után detergenst tartalmazó „Post primer blokk” komponenssel inkubáltuk 30 percig. A következő mosási lépést (2 x TBS, 5 perc) követte a HRP enzimmel konjugált

polymerrel

történő

30

perces

inkubáció

szobahőmérsékleten.

Az immunreakciót a H2O2/DAB szubsztrát/chromogén kit segítségével hívtuk elő, 10 perces inkubáció során. Záró lépésként a sejtmagokat hematoxilinnal festettük. (74)

42


Bödör Csaba

IV. 5. 2. Immunhisztokémiai vizsgálat sejtvonalakon A MedB-1 és Jurkat sejtvonalak 150 ezer sejtjét Cytospin 3 (Shandon) sejtcentrifuga segítségével tárgylemezekre rögzítettük. A lemezekre rögzített sejtek fixálása acetonnal történt 5 percig, szobahőmérsékleten. Az immunhisztokémiai vizsgálat további lépései a IV. 5. 2. pontban leírtak alapján zajlottak, kivéve egy utófixálási lépést, amely a sejtes lemezek esetében az immunreakció előhívása után történt 1,5%-os formalinnal, 1 percig szobahőmérsékleten. IV. 5. 3. Fotódokumentáció A fenti eljárásokkal készült preparátumokról a Zeiss Axioscop 2 mikroszkóp, az Olympus DP50 színes digitális kamera, valamint a Viewfinder Lite 1.0 szoftver, (Pixera Corporation) illetve a Mirax Scan metszetdigitalizáló (Zeiss, Göttingen, Németország és 3D-Histech, Magyarország) alkalmazása után Mirax Viewer szoftver segítségével készítettünk felvételeket.

IV. 6. Etikai vonatkozások Kutatásaink etikai vonatkozásait tekintve mindenben a hatályos jogszabályok szerint jártunk el a TUKEB 95/1999 számú engedélyének birtokában.

43


Bödör Csaba

V. EREDMÉNYEK V. 1. A c-MYC, PAX-5 és RhoH gének szekvencia analízise Hat MNBL esetben és a MedB-1 sejtvonal esetében végeztük el a c-MYC, PAX-5 és RhoH gének meghatározott régióinak szekvencia analízisét. A detektált mutációk típusa és pozíciója a 11. táblázatban látható. A táblázatban feltüntetett pozíciók az NCBI (National Center for Biotechnology Information) GenBank adatbázisából származó referencia-szekvenciáknak megfelelő pozíciókat jelölik. 11. Táblázat: A c-MYC, PAX-5 és RhoH génekben talált mutációk a hat MNBL és a MedB-1 sejtvonal esetben, azok típusának és pozíciójának feltüntetésével. Ezek a GenBank adatbázisból származó referencia-szekvenciáknak megfelelő pozíciók. A piros színnel jelölt mutációk tranzíciók, a kékkel jelöltek transzverziók. A csillaggal ellátott mutációk aminosav cserét eredményező missense mutációk. Esetszám

c-MYC exon 1 Pozíció (Típus)

c-MYC exon 2 Pozíció (Típus)

1

2851 (G>A)*

4723 (A ins) 4906 (T>C)*

-

-

848 (C>T) 1008 (C>A)

-

-

-

671 (T>C) 688 (T>C) 968 (G>C)

-

-

-

488 (T>G) 752 (T>C) 983 (G>C)

-

-

RhoH Pozíció (Típus) 417 (T>C) 522 (T>C) 909 (G>C)

2

-

3

3481 (C>T)

4

-

5

2357 (A>T) 3222 (C>G)

4932 (T>C)*

-

-

-

6

3271 (T>C)

4640 (A ins) 4865 (C>G)*

-

-

667 (G>C) 728 (C>A) 807 (T>C)

MedB-1

3072 (A>T)

-

-

-

389 (A>G) 1013 (A>C)

-

-

PAX-5 Pozíció (Típus)

4866 (A>C)*

-

-

44

-

-


Bödör Csaba

A három vizsgált génben összesen 28 pontmutációt találtunk, melyből 26 egyszerű nukleotid szubsztitúció, 2 pedig inszerció volt. Deléciót egyik esetben sem mutattunk ki. Valamennyi MNBL esetben legalább egy gén hordozott szomatikus mutációkat. Három esetnél (2., 4. és 5. eset) egy génben találtunk mutációkat, míg ugyancsak három esetnél (1., 3. és 6. eset) a három analizált génből kettőben detektáltunk szekvencia variánsokat (11. táblázat). A hat MNBL esetből négy hordozott mutációkat a c-MYC gén esetében. Ezek a szekvencia variánsok a major P1/P2 promoter régiótól (c-MYC exon 1), illetve a minor P3 régiótól (c-MYC exon 2) downstream irányban találhatók. Az exon 1 esetében 5 szubsztitúciót találtunk, az exon 2 pedig 4 szubsztitúciót, illetve 2 inszerciót hordozott. Az átlagos mutációs frekvencia a c-MYC exon 1 esetén 0,048 / 100 bp, míg a c-MYC exon 2-nél 0,15 / 100 bp volt. Egy esetben találtunk mutációkat a PAX-5 génben, 0,1 / 100 bp mutációs frekvenciával. Az exon 1B 3’ régióját és az intron 1 egy szakaszát magába foglaló régióban detektált mindkét mutáció szubsztitúció volt. Az RhoH génben detektált mutációk az intron 1 5’ régiójában lokalizálódtak. Négy esetben, összesen 12 pontmutációt találtunk, valamennyi szubsztitúció volt. Az átlagos mutációs frekvencia 0,175 / 100 bp volt. A MedB-1 mediastinalis lymphoma sejtvonalban két gén esetében mutattunk ki mutációkat. A c-MYC exon 1 esetében detektált 1, és RhoH gén esetében kimutatott 2 mutáció szubsztitúció volt (11. táblázat). A mutációk funkcionális hatását tekintve, a PAX-5 és RhoH génekben talált mutációk mindegyike szabályozó régiókra lokalizálódott. Ugyanakkor a c-MYC gén kódoló régióiban detektált szekvencia variánsok közül több, ún. „missense” (aminosav cserét okozó) mutációnak bizonyult (12. táblázat). A c-MYC exon 1-ben leírt 2851 (G>A) mutáció Arginin > Hisztidin cserét, a c-MYC exon 2-ben talált 4865 (C>G) Fenilalanin > Leucin , a 4866 (A>C) Izoleucin>Leucin, 4906 (T>C) Izoleucin > Threonin, míg a 4932 (T>C) mutáció Fenilalanin > Leucin aminosav cserét eredményezett. Kontrollként elvégeztük a fenti gének szekvenálását egy ALCL minta és a HT58 sejtvonal esetében is, ahol a várakozásnak megfelelően mutációkat egyik génben sem találtunk.

45


Bödör Csaba

12. Táblázat: A missense mutációk és hatásuk Gén

Pozíció (Típus)

Hatás

c-MYC exon 1

2851 (G>A)

Arginin > Hisztidin

c-MYC exon 2

4865 (C>G)

Fenilalanin > Leucin

c-MYC exon 2

4866 (A>C)

Izoleucin > Leucin

c-MYC exon 2

4906 (T>C)

Izoleucin > Threonin

c-MYC exon 2

4932 (T>C)

Fenilalanin > Leucin

Annak meghatározása céljából, hogy az általunk detektált mutációk mintázata mennyiben hasonlít a normál szomatikus hipermutáció, illetve a DLBL-ák esetében leírtakhoz,

(99)

megvizsgáltuk a mutációk típus szerinti megoszlását, és a szekvencia

környezetet, melyet a mutációk érintenek (13. táblázat).

13. Táblázat: A c-MYC , PAX-5 és RhoH gének mutációs mintázata hat MNBL és a MedB-1 sejtvonal esetében, a mutációs frekvencia, típus szerinti megoszlás és célszekvenciák minőségének feltüntetésével. (Az RGYW szekvencia-motívum esetében: R= A/G, Y= C/T, W= A/T) Gén

Mutáció Single bp Inszerció Tranzíció/ frekvencia/100bp szubsztitúció vagy Deléció transzverzió

G+C/A+T RGYW

c-Myc exon 1

0,048

5

0

3/3

3/3

3/6

c-Myc exon 2

0,15

4

2

2/2

1/3

2/6

RhoH

0,175

12

0

7/7

5/9

2/14

PAX-5

0,1

2

0

1/1

2/0

0/2

-

26

2

13/13

11/15

7/28

Összes gén

46


Bödör Csaba

Mint azt már a fentiekben láthattuk, a mutációk nagy része (26/28) szubsztitúció. A 26 szubsztitúció közül, annak típusát tekintve, a tranzíciók és transzverziók száma azonos volt (13-13). Látható, hogy egyetlen MNBL esetről és egyetlen génről sem mondható el, hogy a tranzíciók aránya magasabb lenne (11., 13. táblázat). Az is látható (13. táblázat), hogy a G+C és A+T párokat érintő mutációk száma között sincs lényeges különbség (11/15), továbbá, hogy a DLBL-ákban mutációs forrópontként megismert RGYW motívum érintettsége esetünkben ritka (7/28). Mindezek mellet azonban szem előtt kell tartani, hogy a hat esetben talált 28 mutáció alapján messzemenő következtetéseket a fentiek tekintetében nem vonhatunk le. A 13. A ábrán szemléltetésként látható a 3. MNBL eset c-MYC génjében talált A>C mutáció (4866. pozíció); a 13. B ábrán pedig ugyanez a szekvencia-részlet, a mutációkat nem hordozó kontroll esetben.

MNBL- 3.eset c-MYC exon 2; A>C

13. A ábra: A>C mutáció a c-MYC gén esetében. Az elektroferogramon a bekarikázott pozícióban jól látható a vad típusú adenin mellett a mutáns citozin is.

ALCL- kontroll c-MYC exon 2; nincs mutáció

13. B ábra: A c-MYC ugyanazon régiója mutáció nélkül. A mutációt nem hordozó esetben látható a bekarikázott pozícióban, hogy csak a vad típusú adenin van jelen.

47


Bödör Csaba

V. 2. Az AID mRNS expressziós szintjének meghatározása

Az AID mRNS expressziós szintjének meghatározása céljából valós-idejű kvantitatív PCR analízist hajtottunk végre hat MNBL eseten. Azért, hogy ezeket az értékeket összehasonlíthassuk más B-sejtes NHL-ákban mért expressziós szintekkel, öt DLBL és négy FL mintán is elvégeztük a kvantitatív analízist. Az AID mRNS mennyiségi meghatározását elvégeztük a MedB-1 sejtvonal esetében is. A MedB-1 sejtvonal expressziós értékeit a szövetmintákhoz és különböző sejtvonalak expressziós szintjeihez is viszonyítottuk. A relatív expressziós értékek számolása a IV. 4. 4. fejezetben leírtak alapján történt. A ΔΔCT módszerrel történő számolás során elsősorban szükség van abszolút referencia CT értékekre, melyekhez az összes többi értéket viszonyítjuk. Ezeket az öt egészséges donor perifériás véréből (PV) származó CT értékek átlagolásával kaptuk meg az AID-re (CT

(AID-kontroll))

és a GAPDH-ra vonatkozóan is (CT

Ezt követően valamennyi minta esetében, az AID (CT (CT

(GAPDH-minta))

(AID-minta))

(GAPDH-kontroll)).

és a GAPDH

CT értékeit felhasználva, a 41. oldalon található képlet alapján

meghatároztuk a relatív expressziós értékeket, melyek a 14. ábrán láthatóak. Ezek az értékek azt fejezik ki, hogy az adott mintában az AID mRNS expressziója hányszorosa a kontroll mintában mérthez képest, és valamennyi esetben a három párhuzamos mérés eredményéből származnak, ezért valamennyi ábra esetében a standard hibák (SE) szintjei is fel vannak tüntetve. A pozitív kontrollként használt CG-sejtekben magas AID mRNS expressziót mutattunk ki (1200x, 1000x), míg a negatív kontrollként szereplő PV mintákban, a vártnak megfelelően, alig volt detektálható a szintje (0,28x-1,71x). Az eddigi irodalmi adatoknak megfelelően

(32, 131)

a FL-ban és a DLBL-ban

is sikerült AID expressziót kimutatni. Ezek az értékek elmaradnak a CG esetében mértektől. A 4 FL minta esetében az értékek 102 és 629 között mozogtak, míg az 5 DLBL esetben 10 és 567 közötti értékeket detektáltunk. A 6 vizsgált MNBL eset mindegyikében megfigyelhető volt az AID mRNS expresszió. A kontroll értékekhez képest 50-365 -szörös expresszió figyelhető meg ezekben az esetekben. Ez nagyságrendileg összeegyeztethető a DLBL- és FL mintákban

48


Bödör Csaba

tapasztaltakkal. A MedB-1 sejtvonal AID mRNS szintje is ebbe a tartományba esett, a kontrollhoz képest 122-szeres expressziót észleltünk.

1300

1200

1200

Relatív expresszió (AID/GAPDH)

1100

1000

1000 900 800 700

629 567

600

500

500

398

365

400

374

299

300

238 159

200

1,08 100

0,84

1 1,71

122

116

87

50

0,28

102 10 25 FL 4

FL 3

FL 2

FL 1

DLBL 5

DLBL 4

DLBL 3

DLBL 2

DLBL 1

MedB-1

MNBL 6

MNBL 5

MNBL 4

MNBL 3

MNBL 2

MNBL 1

PV 5

PV 4

PV 3

PV 2

PV 1

CG 2

CG 1

0

14. ábra: AID expresszió különböző B-sejtes non-Hodgkin lymphomák esetében. Az AID mRNS kvantitatív expressziós analízisét hat MNBL, öt DLBL és négy FL eseten végeztük el. Kontrollként szerepeltek továbbá két CG sejtjei, valamint öt PV minta. Az egyes oszlopok a ΔΔCT módszerrel számolt relatív expressziós értékeket reprezentálnak, melyek azt fejezik ki, hogy az adott minta esetében az AID mRNS expressziós szintje hányszorosa a kontroll mintáénak, és minden esetben a három párhuzamos mérés eredményének átlagából származnak. Az oszlopokon a szürke jelölések a standard hibák (SE) szintjét tüntetik fel. Az abszolút referencia érték a PV minták CT értékeinek átlagolásából származik (PV=1). (Rövidítések: CG- centrum germinativum, PV- perifériás vér, MNBL- mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma, DLBL- diffúz nagy B-sejtes lymphoma, FL- follicularis lymphoma)

49


Bödör Csaba

A MedB-1 AID expressziójának egyéb sejtvonalakhoz való viszonyítása során az abszolút referencia értéket a Burkitt lymphoma eredetű HT58 sejtvonal CT értékei szolgáltatták. A MedB-1 sejtvonalban a referencia mintához képest 172-szeres AID expressziót detektáltunk. Az ugyancsak Burkitt lymphoma eredetű BL-41 és Ramos sejtvonalak 31- illetve 8,25-szörös expressziós szintekkel rendelkeztek. A T-sejtes Jurkat és CEM, valamint a krónikus myeloid leukaemia eredetű K562 a vártnak megfelelően nem mutattak AID mRNS expressziót (15. ábra).

200

Relatív expresszió (AID/GAPDH)

172 160

120

80

31

40

8,25

1

0

0

0

K562

Jurkat

CEM

0 HT58

MedB-1

BL-41

Ramos

15. ábra: AID mRNS expressziós szintek különböző sejtvonalakban. Az AID mRNS kvantitatív meghatározását a mediastinalis lymphoma eredetű MedB-1 sejtvonal esetében is elvégeztük. Kontrollként szerepeltek a Burkitt lymphoma eredetű HT58, BL-41 és Ramos, a T-sejtes lymphoma eredetű Jurkat és CEM, valamint a myeloid leukaemia eredetű K562 sejtvonalak. A relatív expressziós szintek számolása a ΔΔCT módszerrel, a fentebb leírtaknak megfelelően történt. Az abszolút referencia érték a HT58 sejtvonal CT értékeinek átlagolásából származik (HT58=1).

A mutáció analízis és az AID mRNS expressziós szintek meghatározásának eredményei alapján a mutációk száma és az AID expresszió mértéke között összefüggést nem találtunk. Az általunk detektált mutációk esetenkénti száma (2 - 6) és az egyes esetekben detektált AID expressziós szintek tartománya (50x - 365x) nem is engedi meg az ilyen irányú mélyebb következtetések levonását.

50


Bödör Csaba

V. 3. Az AID kimutatása fehérje szinten V. 3. 1. Immunhisztokémiai vizsgálat szövettani mintákon Négy MNBL eset paraffinba ágyazott szövettani mintájából végeztük el az AID fehérje in situ kimutatását immunhisztokémia segítségével. Kontrollként egy reaktív folyamatot mutató nyirokcsomót használtunk. Az elvégzett immunhisztokémiai reakciók eredményeként mind a 4 vizsgált minta esetében sikerült kimutatni az AID fehérje expresszióját. Az 16. A-B ábrák két eset reprezentatív felvételeit mutatják. A felvételeken látható, hogy a tumorsejtek többsége jelentős AID expresszióval rendelkezik, ami döntően citoplazmatikus lokalizációjú.

B

A

16. ábra: AID immunhisztokémiai reakciók MNBL szövetminták esetében. A, B: A két MNBL eset (1. és 3.) felvételén jól látható a tumorsejtek jelentős hányadának kifejezett AID pozitivitása, ami döntően a citoplazmában lokalizálódik (400x).

A

kontrollként

használt

reaktív

nyirokcsomó

átnézeti

képén

látható,

hogy elsősorban a csíraközpontok mutatnak erős pozitivitást (17. A ábra). Látható, hogy a legkifejezettebb expressziót a folliculusok köpenyzónája alatti sejtek mutatják, ugyanakkor AID pozitív sejtek láthatóak a folliculusok belső részeiben és az interfolliculáris terekben egyaránt (17. B ábra). Az AID pozitivitás ilyen jellegű megoszlása megfelel a vártnak. (13)

51


Bödör Csaba

A

B

17. ábra: AID immunhisztokémiai reakció reaktív folyamatot mutató nyirokcsomó esetében. A: A kis nagyítású felvételen látható, hogy a leghatározottabb pozitivitást a csíraközpontok köpenyzónája alatti sejtek mutatják (5x). B: A folliculusok belső területein valamint interfolliculárisan is tapasztalható az AID expressziója (10x).

V. 3. 2. Immunhisztokémiai vizsgálat sejtvonalakon A mediastinalis lymphoma eredetű MedB-1 sejtvonalból és a negatív kontrollként

használt

T-sejtes

Jurkat

sejtvonalból

végeztük

el

az

AID

immunhisztokémiai vizsgálatát. A cytospin technikával készült lemezek értékelése jól mutatja, hogy a tumorsejtek döntő többsége masszív AID kifejeződést mutat (18. A ábra). A sejtvonalra jellemző óriássejtek különösen magas AID aktivitással rendelkeznek (18. B ábra). A felvételeken jól látható, hogy a sejtek citoplazmatikus pozitivitás mellett pontszerű sejtmagi jelölődést is mutatnak, ami megfelel az irodalmi adatoknak, tekintve, hogy funkciójából eredően az AID a citoplazma és a sejtmag között „vándorol” a sejtekben.

(41)

A negatív kontrollként használt Jurkat sejtvonal esetében

a várakozásoknak megfelelően nem mutatható ki az AID expressziója (18. C ábra).

52


Bödör Csaba

A

B

C

18. ábra: AID immunhisztokémiai reakció MedB-1 és Jurkat sejtvonal esetében. A: A tumorsejtek jelentős része AID pozitivitást mutat. A fehérje expressziója a citoplazmában és a sejtmagban egyaránt megfigyelhető (400x). B: A felvétel középső részén egy, e sejtvonalra jellemző óriássejt látható, amely ugyancsak fokozott AID expresszióval rendelkezik (400x). C: A Jurkat sejtvonal esetében a vártnak megfelelően nem mutatható ki az AID expressziója.

53


Bödör Csaba

VI. MEGBESZÉLÉS Jelen tanulmányban a c-MYC, PAX-5 és RhoH gének mutációs státuszát, az AID mRNS és fehérje szintű expresszióját vizsgáltuk MNBL esetében. Az ASHM célgénjeiben talált mutációk, illetve az AID expressziója alapján eredményeink arra utalnak, hogy az ASHM, illetve a konstitutív AID expresszió szerepet játszhatnak az MNBL patogenezisében. Az ASHM kimutatása MNBL-ben tovább bővíti az ezzel a genetikai abnormalitással asszociált agresszív lymphomák körét, és alátámasztja az eddigi elképzelést, mely szerint az ASHM az agresszív, kifejezett malignitású lymphomákra specifikus genetikai rendellenesség. A vizsgált gének mutációit a DLBL-ák mintegy 50%-ában,

a

központi

NHL-ban is leírták;

idegrendszer

(26, 85, 99)

DLBL-jában

és

az

AIDS

asszociált

ezzel szemben indolens lymphomák esetében mutációk

nem mutathatóak ki a szóban forgó génekben. (99) Eredményeink szerint az ASHM mintázata MNBL-ben több vonatkozásban is egyezik a DLBL-ákban leírtakkal. (99) A mutációk gyakorisága megfelel a DLBL-ákban tapasztaltaknak, döntő többségük (26/28) szubsztitúció, ezen kívül néhány inszerciót találtunk, továbbá kódoló és nem kódoló, szabályozó régiók egyaránt érintettnek bizonyultak. Ellentétben az eddig leírtakkal, esetünkben a G+C és A+T párokat érintő mutációk aránya közel azonos volt, ahogy a tranzíciók és transzverziók aránya is. Az RGYW mutációs motívum, melyet mutációs forrópontként definiáltak, a munkánk során talált mutációk által csak ritkán érintett (7/28). Az alacsony esetszám miatt ezeknek

az

eltéréseknek

valószínűleg

nagy

statisztikai

szignifikancia

nem

tulajdonítható. Azonban ezzel kapcsolatban érdekes megfigyelés egy 24 MNBL eseten alapuló tanulmány, melyben a BCL-6 gén mutációinak részletes statisztikai elemzésére került sor. Az eredmények szerint az RGYW motívum érintettsége szignifikánsan alacsonyabb a vártnál, ehelyett elsősorban a TA dinukleotidok és TAT trinukleotidok szerepelnek mutációs célpontként. jellegének

lehetőségét

mutációs

(65)

Ez felveti az MNBL-ben zajló SHM sajátos

célszekvenciák

tekintetében.

Közleményünk

megjelenését követően Rossi és mtsai. alátámasztották megfigyeléseinket az ASHM vonatkozásában: 19 MNBL esetet tartalmazó tanulmányuk során az esetek mintegy 74%-ában tapasztalták legalább egy gén érintettségét, összesen 74 mutációt

54


detektálva.

(120)

Bödör Csaba

Ugyanakkor a mutációk eloszlása és célszekvenciája tekintetében –

munkacsoportunkkal ellenkezően – sikerült kimutatniuk a tranzíciók túlsúlyát, valamint az RGYW motívum gyakoribb érintettségét. E kérdés megnyugtató tisztázására egy nagyobb esetszámú MNBL panel részletes mutáció analízise adhatna választ. Az AID expressziója fiziológiás körülmények között a CG-ok B-sejtjeire korlátozott, jellemző.

míg

(32, 97, 131)

konstitutív

expressziója

különböző

CG-eredetű

B-NHL-ákra

Annak céljából, hogy az MNBL-ben általunk mért AID mRNS

expressziós szinteket más B-NHL-ákra jellemző értékekkel is összehasonlíthassuk, DLBL és FL esetek analízisét is elvégeztük. Az MNBL-ben mért értékek nagyságrendileg megegyeznek a DLBL- és FL-minták esetében tapasztaltakkal, és ebbe a tartományba esett a mediastinalis lymphoma sejtvonal, a MedB-1 expressziója is. Ugyanakkor ezek az értékek alacsonyabbak a CG-ok sejtjeiben mérteknél. Ez arra utalhat, hogy az AID patológiás folyamatokban betöltött szerepe nem feltétlenül tekintendő mennyiségi hatásnak. Továbbá Pasqualucci és mtsai. az ASHM és AID expresszió korrelációjának hiányáról számoltak be, azaz eredményeik szerint nem minden AID expressziót mutató esetben sikerült szomatikus mutációkat detektálni, és fordítva (nem minden szomatikus mutációkat hordozó esetben volt sikeres az AID kimutatása); valamint a mutációk száma és az AID expresszió mértéke között sem találtak összefüggést.

(97)

Bár az általunk vizsgált hat eset mindegyikében egyaránt

sikerült az AID expressziót és szomatikus mutációkat is kimutatni, az AID kifejeződés mértéke és a mutációk száma közötti szembetűnő korreláció esetünkben sem mutatkozik. Ezen jelenségekre az alacsony esetszámon kívül technikai jellegű problémák is magyarázatul szolgálhatnak: mivel az ASHM analízise során valamennyi munkacsoport a szóban forgó gének egy bizonyos, reprezentatív szakaszát vizsgálja, a vizsgált régiókon kívül található esetleges szekvencia variánsok nem kerülnek kimutatásra, ráadásul a vizsgált tumormintákban jelen lévő normál sejtek mintegy „háttérként” befolyásolják a detektált AID expresszió mértékét. Mindezek alapján a két jelenség közötti korreláció korrekt leírása szövetminták esetében meglehetősen problematikus. Bár az irodalmi adatok szerint az AID esetében az mRNS és a fehérje szint között viszonylag szoros korreláció áll fenn, fontosnak tartottuk az AID-nek in situ, fehérjeszinten történő kimutatását is a vizsgált szövetminták és sejtvonal esetében is.

55


Bödör Csaba

Valamennyi rendelkezésre álló esetben a tumorsejtek jelentős részének határozott AID expresszióját detektáltuk, ami alátámasztotta az mRNS szinten tett megfigyeléseinket. Az AID fehérjeszintű (immunhisztokémiai) kimutatása ugyanakkor még csak néhány lymphoma esetében valósult meg,

(23, 33)

Ami az AID citoplazmatikus illetve nukleáris

lokalizációját illeti, az eddigi tanulmányok döntően citoplazmatikus pozitivitásról számoltak be.

(13)

Az AID sejtmagi funkcióját figyelembe véve ez a megfigyelés arra

utal, hogy az AID a citoplazmában raktározódik és egy szigorúan szabályozott folyamat eredményeként kerül a sejtmagba, ahol képes ellátni funkcióját. (41) Fiziológiás körülmények között az AID expresszióhoz IL-4 és CD40L kostimuláció szükséges, a sikeres jelátvitel szempontjából a STAT6 és NFκB effektorok töltenek be kiemelt szerepet.

(22)

A különböző lymphomákban leírt konstitutív AID

expresszió okai még nem teljesen tisztázottak. Az MNBL esetében elképzelhető, hogy az AID expresszió erre az entitásra jellemző sajátos jelátviteli útvonalhoz köthető. Több IL-4/IL-13 dependens gén (CD23, NF-IL3, FIG1/IL-4I1), illetve az IL-4 jelátviteli út néhány effektor komponensének magas expresszióját írták le több tanulmányban is, ami az IL-4/IL13 konstitutív aktiváltságára utalhat ebben a lymphomában.

(15, 125)

Mivel normál B-lymphocyták esetében az IL-4 szignál AID expressziót eredményez, elképzelhető, hogy az AID expresszió az IL-4 útvonal konstitutív aktivitásának köszönhető MNBL-ben. (144) Ezt támasztják alá azok a megfigyelések is, melyek az IL-4 jelátvitelben központi szerepet betöltő JAK2 és STAT6 molekulák konstitutív foszforiláltságáról

és a JAK2

gén

amplifikációjáról

számolnak

be.

(15,

34)

Az IL-4 jelátviteli út instabilitásában a gátló hatású SOCS-1 molekulának MNBL-ben leírt biallélikus mutációja is minden bizonnyal szerepet játszik. (71) Az AID expresszió szabályozásában ugyancsak fontos szerepet töltenek az Id2 és Pax-5 B-sejt specifikus transzkripciós faktorok. (30) A Pax-5 különböző izoformáinak az AID kifejeződést szabályozó hatásairól normál és CLL-es B-sejtekben egyaránt beszámoltak.

(95)

Ez az AID expresszió szabályozásának egy érdekes lehetőségét veti

fel, tekintve, hogy a Pax-5 transzkripciós faktort kódoló gén éppen az ASHM egyik célgénje. (99) Hepatitis-C vírus (HCV) és Epstein-Barr vírus (EBV) infekciót követően is megfigyelhető az AID kifejeződése B-sejtekben, amely a különböző virális proteinek hatása miatt konstitutívvá is válhat.(31,

64)

Feltehetően az ilyen típusú AID aktiváció

eredményeként jön létre az ASHM a HCV fertőzéssel társult B-NHL-ákban, illetve

56


a

poszt-transzplantációs

Bödör Csaba

lymphoproliferatív

Libra és Cerri munkacsoportjai számoltak be.

betegségekben

(PTLD),

amiről

(14, 61)

Az ASHM és AID expresszió feltehetően szerepet játszik az alacsony malignitású lymphomáknak magasabb malignitású, ún „high grade” lymphomákba történő transzformációjában is. Munkacsoportunk a krónikus lymphocytás leukaemia (CLL) Richter- és prolymphocytás transzformációja (RT, PLT) esetében vizsgálta az

ASHM

és

AID

expresszió

lehetséges

szerepét.

Eredményeink

szerint

az ASHM az RT és PLT esetekben aktív volt, míg CLL-ben nem, illetve az AID mRNS expressziója is szignifikánsan magasabb volt a transzformált esetekben (RT és PLT) a CLL esetekhez viszonyítva. (111) Ez az elképzelés megerősítést nyert két munkacsoport által is; az ASHM és AID szerepét a CLL transzformációján kívül az FL, valamint a mucosa-asszociált lymphoid szövet (MALT) lymphoma DLBL-be történő transzformációja során is. (23, 119) Az MNBL AID expressziója a tumorsejtek CG-eredetére utalhat, mint ahogy előzőleg arra utalt a CD10, BCL-6 és MUM/IRF4 fehérjék expressziója, illetve az IgH és BCL-6 gének szomatikus mutációinak megléte is.

(21, 104)

Annak ellenére, hogy

az AID szerepe ismert a B-sejt fejlődés során lezajló SHM folyamatában és hozzájárul az Ig gének diverzifikációjához, a B-NHL-ákban az AID expresszió és a mutációk folyamatos („ongoing”) jellege, vagy az intraklonális divergencia mértéke között korrelációt nem sikerült kimutatni az Ig gének esetében, ahogy az ASHM célgénjei esetében sem.(23,

63)

Az MNBL-ről is elmondható ugyanez, mivel sem az Ig, sem

a BCL-6 gén esetében nem sikerült kimutatni kontinuus mutációs aktivitást.

(59, 124)

Az ASHM célgénjei közül MNBL-ben a PAX-5 vizsgálata történt meg e tekintetben, ami ugyancsak a kontinuus mutációs aktivitás hiányát eredményezte.

(120)

Az AID

expresszió és az „ongoing” mutációs aktivitás közötti diszkrepancia arra utal, hogy az MNBL-ben a hipermutáció a neoplastikus transzformáció korai szakaszára jellemző, azonban a későbbi szakaszban, mielőtt a transzformáció teljessé válna a hipermutációs aktivitás kikapcsol. Több szerző az MNBL thymicus B-sejt eredetéről számolt be, miszerint az MNBL tumorsejtjeinek normál megfelelői a thymus medullájában található ún. asteroid morfológiával rendelkező B-lymhocyták.

(1, 20, 38, 40)

Az MNBL thymicus

eredetéről, illetve centrum germinativum eredetéről szóló elképzeléseket Moldenhauer

57


Bödör Csaba

és mtsai. új megfigyelései hozzák összhangba.

(81)

Az említett munkacsoport a thymus

velőállományában AID-et mRNS és fehérje szinten is expresszáló B-sejteket azonosított,

amelyek

morfológiája

az

asteroid

B-sejtekének

felelt

meg.

Ezen eredményeknek megfelelően a thymicus asteroid B-sejtekben is lezajlik egyfajta CG jellegű reakció, és ezek a sejtek valóban a malignusan transzformált sejtek normál megfelelői lehetnek. A WHO klasszifikációja szerint az MNBL a DLBL-ák különálló altípusa, bár a két entitás pontos kapcsolata molekuláris biológiai szempontból nem teljesen ismert.

(28)

Komparatív genom hibridizáció (CGH) módszerével is tapasztalható, hogy

az MNBL bizonyos kromoszóma rendellenességei a DLBL-ákban találtakkal megegyezők, mint például a 12q és 18q kromoszóma szegmenseket érintő DNS amplifikáció, némelyek azonban a klasszikus HL-val közösek, így a 2p, 9p kromoszóma régiókat érintő amplifikáció.

(96)

Rodig és mtsai. megfigyelései szerint az MNBL

a c-REL és TRAF-1 (tumor necrosis factor associated factor-1) expresszió alapján is elkülönül a DLBL-áktól.

(115)

Ugyancsak a DLBL-áktól eltérő és a klasszikus HL-ával

megegyező molekuláris jellemzőnek bizonyult a RON és TIE1 tirozin kinázok overexpressziója, (PI3K/AKT) is

valamint (112)

a

foszfatidil-inozitol

3-kináz

útvonal

aktiváltsága

Két további tanulmány számolt be, génexpressziós profilbeli

hasonlóságra alapozva, a MNBL és a klasszikus HL közötti esetleges patogenetikai kapcsolatról.

(118,

125)

Marafioti és mtsai. feltételezései szerint a két betegség

tumorsejtjeinek közös, normál megfelelői a másodlagos nyirokszervekben található, ún. interfollicularis nagy B-sejtek lehetnek. (66) E sejteket dendritikus morfológiájuknak, valamint immunfenotípusos és genetikai jellemzőik alapján a thymicus asteroid B-lymphocyták perifériás megfelelőinek vélik. Újabb eredmények szerint ezen sejtek is pozitívnak bizonyultak az AID expresszió tekintetében, alátámasztva a malignus transzformációban betöltött szerepükről szóló elképzeléseket.

(81)

A közelmúltban

az ASHM és AID expresszió analízise is megtörtént a klasszikus HL esetében, amely eredményei alapján a klasszikus HL tumorsejtei (Hodgkin és Sternberg-Reed sejtek) érintettek az ASHM által, ugyanakkor az AID expresszió tekintetében negatívak.

(33, 62)

Az AID negativitásra magyarázat lehet az a megfigyelés, mely szerint a HL-ra több B-sejt specifikus fehérje down-regulációja is jellemző.

(10)

Attól eltekintve, hogy

eredményeink tovább erősítik az elképzelést, miszerint az MNBL és a klasszikus HL

58


Bödör Csaba

esetében bizonyos patogenetikai tényezők közösek, nem perdöntőek e két entitás pontos kapcsolata tekintetében. Bár az ASHM még minden részletet tekintve nem ismert, tudjuk, hogy akárcsak a konstitutív AID expresszió, az ASHM is hozzájárul a lymphomák kialakulásához, különböző proto-onkogénekben, tumorszupresszor génekben kialakuló mutációk által.

(94, 99)

E két jelenség malignus transzformációban betöltött szerepe mára

a lymphomák szélesebb körében is megerősítést nyert (14. táblázat). Egy friss tanulmányban Kotani és mtsai. az AID-nek a B-sejtes lymphomagenezisben betöltött direkt szerepét bizonyították egérmodell esetében. Az Emu-c-myc transzgén egerek alkotta modellrendszerben a tumor progenitor sejtek AID expressziójának stimulálása, addicionális genetikai rendellenességek felhalmozásán keresztül, B-sejtes lymphomák kialakulásához vezetett.

(49)

Sőt, két újabb tanulmány az AID-nek az immunrendszeren

kívüli esetleges mutagén szerepét is felvetette, hepatocarcinogenesis, illetve a normál spermatogenezis során, azonban ezen eredmények pontos értelmezése még várat magára. (50, 128)

14. Táblázat: Az AID és ASHM asszociált lymphomák köre. A kékkel szedett entitások esetében az AID expresszió és ASHM vizsgálata is megvalósult, míg a feketével írottak esetében csak a mutáció analízis történt meg. A félkövérrel szedett entitásokkal kapcsolatos megfigyelések munkacsoportunk eredményei. (Rövidítések: KIR- központi idegrendszer, AIDS- szerzett immunhiányos tünetegyüttes, B-NHL- B-sejtes non-Hodgkin lymphomák HCV- hepatitis C vírus), Entitás

Referencia Pasqualucci és mtsai. (97, 99)

Diffúz nagy B-sejtes lymphoma

Montesinos és mtsai. (85)

KIR diffúz nagy B-sejtes lymphomája

Gaidano és mtsai. (26)

AIDS asszociált B-NHL-ák Mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma

Bödör és mtsai. (8)

HCV asszociált B-NHL-ák

Libra és mtsai. (61)

Poszt-transzplantációs lymphoproliferatív betegség

Cerri és mtsai. (14) Greiner és mtsai (33)

Klasszikus Hodgkin lymphoma Krónikus lymphocytás leukaemia transzformációja

Reiniger és mtsai. (111) Rossi és mtsai. (119)

Folliculáris lymphoma transzformációja

Deutsch és mtsai. (23)

MALT lymphoma transzformációja

59


Bödör Csaba

Összefoglalva, az általunk MNBL-ben tapasztalt AID expresszió és az ASHM megléte közötti korreláció arra enged következtetni, hogy az AID indukált mutagén hatás szerepet játszhat ezen betegség kialakulásában. Továbbá az MNBL-re specifikus, visszatérő kromoszóma-transzlokációk hiánya, illetve a betegségre jellemző genetikai abnormalitások heterogenitása is arra utal, hogy ez a hipermutáció asszociált genetikai instabilitás részt vesz az MNBL patogenezisében.

60


Bödör Csaba

VII. KÖVETKEZTETÉSEK

A dolgozat fő megállapításai a következők:

•

Az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM) aktív a mediastinalis nagy B-sejtes lymphomában (MNBL), valamennyi minta esetében a vizsgált gének közül legalább egy hordoz szomatikus mutációkat.

•

Az MNBL-re jellemző az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) mRNS magas expressziója, az AID kifejeződése fehérjeszinten is kimutatható.

•

Az ASHM és AID különböző genetikai abnormalitások mediálásán keresztül feltehetően szerepet játszanak az MNBL patogenezisében.

61


Bödör Csaba

VIII. ÖSSZEFOGLALÁS

A mediastinalis nagy B-sejtes lymphoma (MNBL) egy kifejezett malignitású B-sejtes non-Hodgkin lymphoma (B-NHL), mely a diffúz nagy-B sejtes lymphomák (DLBL) egyik különálló altípusa. Önálló entitásként való besorolását sajátos klinikopatológiai megjelenése indokolja. Az MNBL patogenezisére specifikus genetikai rendellenességek még nem teljesen ismertek, és a sejteredetével kapcsolatos eredmények is ellentmondásosak. A genetikai instabilitás egy újonnan leírt formája az aberráns szomatikus hipermutáció (ASHM), mely a DLBL-ák mintegy 50%-ában figyelhető meg. Ez a folyamat a B-sejtek fiziológiás érése során lezajló, az immunglobulin (Ig) és BCL-6 géneket érintő szomatikus hipermutáció (SHM) meghibásodásának tekinthető, melynek eredményeképpen szomatikus mutációk jelennek meg a fiziológiás célgéneken kívül több proto-onkogénben is (c-MYC, PAX-5, RhoH, PIM-1). Az SHM folyamatához esszenciális az aktiváció-indukált citidin deamináz (AID) működése. Az AID expressziója fiziológiás állapotban a centrum germinativum (CG) típusú (CD19+/CD38+) B-lymphocytákra korlátozott. Konstitutív expressziója azonban illegitim DNS rekombinációk és szomatikus mutációk létrehozásán keresztül lymphomák kialakulásához vezet. Vizsgálataink során arra a kérdésre kerestük a választ, hogy vajon az aberráns hipermutáció és az AID expressziója szerepet játszik-e az MNBL kialakulásában. Az AID mRNS expressziós szint meghatározása céljából valósidejű PCR vizsgálatot végeztünk el hat MNBL esetben, valamint különböző sejtvonalak esetében. Az ASHM által érintett gének mutációs mintázatának meghatározásához az érintett régiók PCR amplifikációját követően, azok szekvencia analízisét végeztük el. A vizsgált MNBL-ákban és az MNBL eredetű MedB-1 sejtvonal esetében is legalább egy gén esetében mutációkat, valamint magas AID mRNS expressziós szintet detektáltunk. Eredményeinket fehérje szinten is megerősítettük, immunhisztokémiai vizsgálatok segítségével. Megfigyeléseink arra utalnak, hogy az ASHM és az AID expresszió egyaránt szerepet játszhatnak az MNBL patogenezisében.

62


Bödör Csaba

IX. SUMMARY

Mediastinal large B-cell lymphoma (MBL) is a highly aggressive B-cell non-Hodgkin lymphoma (B-NHL), categorized as a subtype of diffuse large B-cell

lymphomas

(DLBL),

with

distinct

clinicopathological

characteristics.

The specific genetic alterations associated with the pathogenesis of the disease are not fully understood and the cellular origin of MBL is still a matter of debate. A recently described form of genetic instability, termed aberrant somatic hypermutation (ASHM), plays a role in the pathogenesis of more than 50% of DLBLs. ASHM is regarded as a malfunction of the physiological somatic hypermutational mechanism (SHM) of immunoglobulin (Ig) and BCL-6 genes in B-cells. ASHM targets multiple loci outside Ig genes, including proto-oncogenes c-MYC, PAX-5, RhoH and PIM-1. Activation-induced cytidine deaminase (AID) is essential for SHM. The expression of AID is normally restricted to CD19+/CD38+ germinal centre (GC) B-cells. Constitutive expression of AID also plays a part in the pathogenesis of different types of lymphomas by generating illegitimate DNA recombinations and somatic mutations in different genes. To determine the possible role of ASHM and AID expression in the pathogenesis of MBL, we have determined the expression level of AID mRNA by real-time polymerase chain reaction, and we have analyzed the mutational status of genes affected by ASHM, including c-MYC, PAX-5 and RhoH, in tumor specimens from six patients with MBL and in different cell lines. Mutations in one or more genes and expression of AID mRNA were detected in all the six cases of MBL and in the MBL derived cell line MedB-1. Our results were proven also on protein level using immunohistochemistry. These observations suggest that ASHM and AID expression may have a role in the pathogenesis of MBL.

63


Bödör Csaba

X. IRODALOMJEGYZÉK 1.

Addis BJ and Isaacson PG. (1986) Large cell lymphoma of the mediastinum: a B-cell tumour of probable thymic origin. Histopathology, 10 (4): 379-90.

2.

al-Sharabati M, Chittal S, Duga-Neulat I, Laurent G, Mazerolles C, al-Saati T, Brousset P, and Delsol G. (1991) Primary anterior mediastinal B-cell lymphoma. A clinicopathologic and immunohistochemical study of 16 cases. Cancer, 67 (10): 2579-87.

3.

Arzimanoglou, II, Gilbert F, and Barber HR. (1998) Microsatellite instability in human solid tumors. Cancer, 82 (10): 1808-20.

4.

Banks PM and Warnke RA, Mediastinal B-cell lymphoma, In: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Wardiman JW, (szerk.) Pathology and genetics of tumours of haemopoetic and lymphoid tissues. World Health Organization Classification of tumours., IARC Press, Lyon, 2001: 175-76.

5.

Barth TF, Leithauser F, Joos S, Bentz M, and Moller P. (2002) Mediastinal (thymic) large B-cell lymphoma: where do we stand? Lancet Oncol, 3 (4): 22934.

6.

Bentz M, Barth TF, Bruderlein S, Bock D, Schwerer MJ, Baudis M, Joos S, Viardot A, Feller AC, Muller-Hermelink HK, Lichter P, Dohner H, and Moller P. (2001) Gain of chromosome arm 9p is characteristic of primary mediastinal B-cell lymphoma (MBL): comprehensive molecular cytogenetic analysis and presentation of a novel MBL cell line. Genes Chromosomes Cancer, 30 (4): 393-401.

7.

Bishop PC, Wilson WH, Pearson D, Janik J, Jaffe ES, and Elwood PC. (1999) CNS involvement in primary mediastinal large B-cell lymphoma. J Clin Oncol, 17 (8): 2479-85.

8.

Bodor C, Bognar A, Reiniger L, Szepesi A, Toth E, Kopper L, and Matolcsy A. (2005) Aberrant somatic hypermutation and expression of activation-induced cytidine deaminase mRNA in mediastinal large B-cell lymphoma. Br J Haematol, 129 (3): 373-6.

64


9.

Bödör Csaba

Bransteitter R, Pham P, Scharff MD, and Goodman MF. (2003) Activationinduced cytidine deaminase deaminates deoxycytidine on single-stranded DNA but requires the action of RNase. Proc Natl Acad Sci U S A, 100 (7): 4102-7.

10.

Brauninger A, Schmitz R, Bechtel D, Renne C, Hansmann ML, and Kuppers R. (2006) Molecular biology of Hodgkin's and Reed/Sternberg cells in Hodgkin's lymphoma. Int J Cancer, 118 (8): 1853-61.

11.

Capello D, Vitolo U, Pasqualucci L, Quattrone S, Migliaretti G, Fassone L, Ariatti C, Vivenza D, Gloghini A, Pastore C, Lanza C, Nomdedeu J, Botto B, Freilone R, Buonaiuto D, Zagonel V, Gallo E, Palestro G, Saglio G, DallaFavera R, Carbone A, and Gaidano G. (2000) Distribution and pattern of BCL-6 mutations throughout the spectrum of B-cell neoplasia. Blood, 95 (2): 651-9.

12.

Casali P, Pal Z, Xu Z, and Zan H. (2006) DNA repair in antibody somatic hypermutation. Trends Immunol, 27 (7): 313-21.

13.

Cattoretti G, Buttner M, Shaknovich R, Kremmer E, Alobeid B, and Niedobitek G. (2006) Nuclear and cytoplasmic AID in extrafollicular and germinal center B cells. Blood, 107 (10): 3967-75.

14.

Cerri M, Capello D, Muti G, Rambaldi A, Paulli M, Gloghini A, Berra E, Deambrogi C, Rossi D, Franceschetti S, Conconi A, Morra E, Pasqualucci L, Carbone A, and Gaidano G. (2004) Aberrant somatic hypermutation in posttransplant lymphoproliferative disorders. Br J Haematol, 127 (3): 362-4.

15.

Copie-Bergman C, Boulland ML, Dehoulle C, Moller P, Farcet JP, Dyer MJ, Haioun C, Romeo PH, Gaulard P, and Leroy K. (2003) Interleukin 4-induced gene 1 is activated in primary mediastinal large B-cell lymphoma. Blood, 101 (7): 2756-61.

16.

Copie-Bergman C, Gaulard P, Maouche-Chretien L, Briere J, Haioun C, Alonso MA, Romeo PH, and Leroy K. (1999) The MAL gene is expressed in primary mediastinal large B-cell lymphoma. Blood, 94 (10): 3567-75.

17.

Cox CV and Blair A. (2005) A primitive cell origin for B-cell precursor ALL? Stem Cell Rev, 1 (3): 189-96.

65


18.

Bödör Csaba

Cuypers HT, Selten G, Quint W, Zijlstra M, Maandag ER, Boelens W, van Wezenbeek P, Melief C, and Berns A. (1984) Murine leukemia virus-induced Tcell lymphomagenesis: integration of proviruses in a distinct chromosomal region. Cell, 37 (1): 141-50.

19.

Csernus B, Timar B, Fulop Z, Bognar A, Szepesi A, Laszlo T, Jakso P, Warnke R, Kopper L, and Matolcsy A. (2004) Mutational analysis of IgVH and BCL-6 genes suggests thymic B-cells origin of mediastinal (thymic) B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma, 45 (10): 2105-10.

20.

Davis RE, Dorfman RF, and Warnke RA. (1990) Primary large-cell lymphoma of the thymus: a diffuse B-cell neoplasm presenting as primary mediastinal lymphoma. Hum Pathol, 21 (12): 1262-8.

21.

de Leval L, Ferry JA, Falini B, Shipp M, and Harris NL. (2001) Expression of bcl-6 and CD10 in primary mediastinal large B-cell lymphoma: evidence for derivation from germinal center B cells? Am J Surg Pathol, 25 (10): 1277-82.

22.

Dedeoglu F, Horwitz B, Chaudhuri J, Alt FW, and Geha RS. (2004) Induction of activation-induced cytidine deaminase gene expression by IL-4 and CD40 ligation is dependent on STAT6 and NFkappaB. Int Immunol, 16 (3): 395-404.

23.

Deutsch AJ, Aigelsreiter A, Staber PB, Beham A, Linkesch W, Guelly C, Brezinschek RI, Fruhwirth M, Emberger W, Buettner M, Beham-Schmid C, and Neumeister P. (2007) MALT lymphoma and extranodal diffuse large B-cell lymphoma are targeted by aberrant somatic hypermutation. Blood, 109 (8): 3500-4.

24.

Falini B, Venturi S, Martelli M, Santucci A, Pileri S, Pescarmona E, Giovannini M, Mazza P, Martelli MF, Pasqualucci L, and et al. (1995) Mediastinal large Bcell lymphoma: clinical and immunohistological findings in 18 patients treated with different third-generation regimens. Br J Haematol, 89 (4): 780-9.

25.

Fulop Z, Csernus B, Timar B, Szepesi A, and Matolcsy A. (2003) Microsatellite instability and hMLH1 promoter hypermethylation in Richter's transformation of chronic lymphocytic leukemia. Leukemia, 17 (2): 411-5.

66


26.

Bödör Csaba

Gaidano G, Pasqualucci L, Capello D, Berra E, Deambrogi C, Rossi D, Maria Larocca L, Gloghini A, Carbone A, and Dalla-Favera R. (2003) Aberrant somatic hypermutation in multiple subtypes of AIDS-associated non-Hodgkin lymphoma. Blood, 102 (5): 1833-41.

27.

Gamberi B, Gaidano G, Parsa N, Carbone A, Roncella S, Knowles DM, Louie DC, Shibata D, Chaganti RS, and Dalla-Favera R. (1997) Microsatellite instability is rare in B-cell non-Hodgkin's lymphomas. Blood, 89 (3): 975-9.

28.

Gatter KC and Warnke RA, Diffuse large B-cell lymphoma, In: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Wardiman JW, (szerk.) Pathology and genetics of tumours of haemopoetic and lymphoid tissues. World Health Organization Classification of tumours., IARC Press, Lyon, 2001: 171-74.

29.

Ghia P and Caligaris-Cappio F. (2006) The origin of B-cell chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol, 33 (2): 150-6.

30.

Gonda H, Sugai M, Nambu Y, Katakai T, Agata Y, Mori KJ, Yokota Y, and Shimizu A. (2003) The balance between Pax5 and Id2 activities is the key to AID gene expression. J Exp Med, 198 (9): 1427-37.

31.

Gourzi P, Leonova T, and Papavasiliou FN. (2007) Viral induction of AID is independent of the interferon and the Toll-like receptor signaling pathways but requires NF-kappaB. J Exp Med, 204 (2): 259-65.

32.

Greeve J, Philipsen A, Krause K, Klapper W, Heidorn K, Castle BE, Janda J, Marcu KB, and Parwaresch R. (2003) Expression of activation-induced cytidine deaminase in human B-cell non-Hodgkin lymphomas. Blood, 101 (9): 3574-80.

33.

Greiner A, Tobollik S, Buettner M, Jungnickel B, Herrmann K, Kremmer E, and Niedobitek G. (2005) Differential expression of activation-induced cytidine deaminase (AID) in nodular lymphocyte-predominant and classical Hodgkin lymphoma. J Pathol, 205 (5): 541-7.

34.

Guiter C, Dusanter-Fourt I, Copie-Bergman C, Boulland ML, Le Gouvello S, Gaulard P, Leroy K, and Castellano F. (2004) Constitutive STAT6 activation in primary mediastinal large B-cell lymphoma. Blood, 104 (2): 543-9.

35.

Heid CA, Stevens J, Livak KJ, and Williams PM. (1996) Real time quantitative PCR. Genome Res, 6 (10): 986-94.

67


36.

Bödör Csaba

Higgins JP and Warnke RA. (1999) CD30 expression is common in mediastinal large B-cell lymphoma. Am J Clin Pathol, 112 (2): 241-7.

37.

Ho PJ, Campbell LJ, Gibson J, Brown R, and Joshua D. (2002) The biology and cytogenetics of multiple myeloma. Rev Clin Exp Hematol, 6 (3): 276-300.

38.

Hofmann WJ, Momburg F, and Moller P. (1988) Thymic medullary cells expressing B lymphocyte antigens. Hum Pathol, 19 (11): 1280-7.

39.

Imai K, Slupphaug G, Lee WI, Revy P, Nonoyama S, Catalan N, Yel L, Forveille M, Kavli B, Krokan HE, Ochs HD, Fischer A, and Durandy A. (2003) Human uracil-DNA glycosylase deficiency associated with profoundly impaired immunoglobulin class-switch recombination. Nat Immunol, 4 (10): 1023-8.

40.

Isaacson PG, Norton AJ, and Addis BJ. (1987) The human thymus contains a novel population of B lymphocytes. Lancet, 2 (8574): 1488-91.

41.

Ito S, Nagaoka H, Shinkura R, Begum N, Muramatsu M, Nakata M, and Honjo T. (2004) Activation-induced cytidine deaminase shuttles between nucleus and cytoplasm like apolipoprotein B mRNA editing catalytic polypeptide 1. Proc Natl Acad Sci U S A, 101 (7): 1975-80.

42.

Joos S, Otano-Joos MI, Ziegler S, Bruderlein S, du Manoir S, Bentz M, Moller P, and Lichter P. (1996) Primary mediastinal (thymic) B-cell lymphoma is characterized by gains of chromosomal material including 9p and amplification of the REL gene. Blood, 87 (4): 1571-8.

43.

Kakinuma S, Kodama Y, Amasaki Y, Yi S, Tokairin Y, Arai M, Nishimura M, Monobe M, Kojima S, and Shimada Y. (2007) Ikaros is a mutational target for lymphomagenesis in Mlh1-deficient mice. Oncogene, 26 (20): 2945-9.

44.

Kanavaros P, Gaulard P, Charlotte F, Martin N, Ducos C, Lebezu M, and Mason DY. (1995) Discordant expression of immunoglobulin and its associated molecule mb-1/CD79a is frequently found in mediastinal large B cell lymphomas. Am J Pathol, 146 (3): 735-41.

45.

Kasahara Y, Kaneko H, Fukao T, Terada T, Asano T, Kasahara K, and Kondo N. (2003) Hyper-IgM syndrome with putative dominant negative mutation in activation-induced cytidine deaminase. J Allergy Clin Immunol, 112 (4): 755-60.

68


46.

Bödör Csaba

Kirn D, Mauch P, Shaffer K, Pinkus G, Shipp MA, Kaplan WD, Tung N, Wheeler C, Beard CJ, Canellos GP, and et al. (1993) Large-cell and immunoblastic lymphoma of the mediastinum: prognostic features and treatment outcome in 57 patients. J Clin Oncol, 11 (7): 1336-43.

47.

Klein U, Goossens T, Fischer M, Kanzler H, Braeuninger A, Rajewsky K, and Kuppers R. (1998) Somatic hypermutation in normal and transformed human B cells. Immunol Rev, 162: 261-80.

48.

Klein U, Klein G, Ehlin-Henriksson B, Rajewsky K, and Kuppers R. (1995) Burkitt's lymphoma is a malignancy of mature B cells expressing somatically mutated V region genes. Mol Med, 1 (5): 495-505.

49.

Kotani A, Kakazu N, Tsuruyama T, Okazaki IM, Muramatsu M, Kinoshita K, Nagaoka H, Yabe D, and Honjo T. (2007) Activation-induced cytidine deaminase (AID) promotes B cell lymphomagenesis in Emu-cmyc transgenic mice. Proc Natl Acad Sci U S A, 104 (5): 1616-20.

50.

Kou T, Marusawa H, Kinoshita K, Endo Y, Okazaki IM, Ueda Y, Kodama Y, Haga H, Ikai I, and Chiba T. (2007) Expression of activation-induced cytidine deaminase in human hepatocytes during hepatocarcinogenesis. Int J Cancer, 120 (3): 469-76.

51.

Kuppers R, Hansmann ML, and Rajewsky K. (1998) Clonality and germinal centre B-cell derivation of Hodgkin/Reed-Sternberg cells in Hodgkin's disease. Ann Oncol, 9 Suppl 5: S17-20.

52.

Kuppers R, Klein U, Hansmann ML, and Rajewsky K. (1999) Cellular origin of human B-cell lymphomas. N Engl J Med, 341 (20): 1520-9.

53.

Kuppers R and Rajewsky K. (1998) The origin of Hodgkin and Reed/Sternberg cells in Hodgkin's disease. Annu Rev Immunol, 16: 471-93.

54.

Kuppers R, Rajewsky K, and Hansmann ML. (1997) Diffuse large cell lymphomas are derived from mature B cells carrying V region genes with a high load of somatic mutation and evidence of selection for antibody expression. Eur J Immunol, 27 (6): 1398-405.

69


55.

Bödör Csaba

Kuppers R, Schwering I, Brauninger A, Rajewsky K, and Hansmann ML. (2002) Biology of Hodgkin's lymphoma. Ann Oncol, 13 Suppl 1: 11-8.

56.

Kurtin PJ and Pinkus GS. (1985) Leukocyte common antigen--a diagnostic discriminant between hematopoietic and nonhematopoietic neoplasms in paraffin sections using monoclonal antibodies: correlation with immunologic studies and ultrastructural localization. Hum Pathol, 16 (4): 353-65.

57.

Larijani M, Petrov AP, Kolenchenko O, Berru M, Krylov SN, and Martin A. (2007) AID associates with single-stranded DNA with high affinity and a long complex half-life in a sequence-independent manner. Mol Cell Biol, 27 (1): 2030.

58.

Lazzarino M, Orlandi E, Paulli M, Strater J, Klersy C, Gianelli U, Gargantini L, Rousset MT, Gambacorta M, Marra E, Lavabre-Bertrand T, Magrini U, Manegold C, Bernasconi C, and Moller P. (1997) Treatment outcome and prognostic factors for primary mediastinal (thymic) B-cell lymphoma: a multicenter study of 106 patients. J Clin Oncol, 15 (4): 1646-53.

59.

Leithauser F, Bauerle M, Huynh MQ, and Moller P. (2001) Isotype-switched immunoglobulin genes with a high load of somatic hypermutation and lack of ongoing mutational activity are prevalent in mediastinal B-cell lymphoma. Blood, 98 (9): 2762-70.

60.

Lengauer C, Kinzler KW, and Vogelstein B. (1998) Genetic instabilities in human cancers. Nature, 396 (6712): 643-9.

61.

Libra M, Capello D, Gloghini A, Laura P, Berra E, Cerri M, Gasparotto D, Franca S, De Re V, Gaidano G, and Carbone A. (2005) Analysis of aberrant somatic hypermutation (SHM) in non-Hodgkin's lymphomas of patients with chronic HCV infection. J Pathol, 206 (1): 87-91.

62.

Liso A, Capello D, Marafioti T, Tiacci E, Cerri M, Distler V, Paulli M, Carbone A, Delsol G, Campo E, Pileri S, Pasqualucci L, Gaidano G, and Falini B. (2006) Aberrant somatic hypermutation in tumor cells of nodular-lymphocytepredominant and classic Hodgkin lymphoma. Blood, 108 (3): 1013-20.

63.

Lossos IS, Levy R, and Alizadeh AA. (2004) AID is expressed in germinal center B-cell-like and activated B-cell-like diffuse large-cell lymphomas and is not correlated with intraclonal heterogeneity. Leukemia, 18 (11): 1775-9.

70


64.

Bödör Csaba

Machida K, Cheng KT, Sung VM, Shimodaira S, Lindsay KL, Levine AM, Lai MY, and Lai MM. (2004) Hepatitis C virus induces a mutator phenotype: enhanced mutations of immunoglobulin and protooncogenes. Proc Natl Acad Sci U S A, 101 (12): 4262-7.

65.

Malpeli G, Barbi S, Moore PS, Scardoni M, Chilosi M, Scarpa A, and Menestrina F. (2004) Primary mediastinal B-cell lymphoma: hypermutation of the BCL6 gene targets motifs different from those in diffuse large B-cell and follicular lymphomas. Haematologica, 89 (9): 1091-9.

66.

Marafioti T, Jones M, Facchetti F, Diss TC, Du MQ, Isaacson PG, Pozzobon M, Pileri SA, Strickson AJ, Tan SY, Watkins F, and Mason DY. (2003) Phenotype and genotype of interfollicular large B cells, a subpopulation of lymphocytes often with dendritic morphology. Blood, 102 (8): 2868-76.

67.

Martin A and Scharff MD. (2002) AID and mismatch repair in antibody diversification. Nat Rev Immunol, 2 (8): 605-14.

68.

Matolcsy A, A vérképző és a limforetikuláris rendszer patológiája, In: Kopper L, Schaff Z, (szerk.) Patológia, Medicina, Budapest, 2004: 531-600.

69.

Matolcsy A, Schattner EJ, Knowles DM, and Casali P. (1999) Clonal evolution of B cells in transformation from low- to high-grade lymphoma. Eur J Immunol, 29 (4): 1253-64.

70.

Meis JM, Osborne BM, and Butler JJ. (1986) A comparative marker study of large cell lymphoma, Hodgkin's disease, and true histiocytic lymphoma in paraffin-embedded tissue. Am J Clin Pathol, 86 (5): 591-9.

71.

Melzner I, Bucur AJ, Bruderlein S, Dorsch K, Hasel C, Barth TF, Leithauser F, and Moller P. (2005) Biallelic mutation of SOCS-1 impairs JAK2 degradation and sustains phospho-JAK2 action in the MedB-1 mediastinal lymphoma line. Blood, 105 (6): 2535-42.

72.

Melzner I, Weniger MA, Bucur AJ, Bruderlein S, Dorsch K, Hasel C, Leithauser F, Ritz O, Dyer MJ, Barth TF, and Moller P. (2006) Biallelic deletion within 16p13.13 including SOCS-1 in Karpas1106P mediastinal B-cell lymphoma line is associated with delayed degradation of JAK2 protein. Int J Cancer, 118 (8): 1941-4.

71


73.

Bödör Csaba

Menestrina F, Chilosi M, Bonetti F, Lestani M, Scarpa A, Novelli P, Doglioni C, Todeschini G, Ambrosetti A, and Fiore-Donati L. (1986) Mediastinal large-cell lymphoma

of

B-type,

with

sclerosis:

histopathological

and

immunohistochemical study of eight cases. Histopathology, 10 (6): 589-600. 74.

Merz H, Malisius R, Mannweiler S, Zhou R, Hartmann W, Orscheschek K, Moubayed

P,

and

Feller

AC.

(1995)

ImmunoMax.

A

maximized

immunohistochemical method for the retrieval and enhancement of hidden antigens. Lab Invest, 73 (1): 149-56. 75.

Mestre-Escorihuela C, Rubio-Moscardo F, Richter JA, Siebert R, Climent J, Fresquet V, Beltran E, Agirre X, Marugan I, Marin M, Rosenwald A, Sugimoto KJ, Wheat LM, Karran EL, Garcia JF, Sanchez L, Prosper F, Staudt LM, Pinkel D, Dyer MJ, and Martinez-Climent JA. (2007) Homozygous deletions localize novel tumor suppressor genes in B-cell lymphomas. Blood, 109 (1): 271-80.

76.

Mestre C, Rubio-Moscardo F, Rosenwald A, Climent J, Dyer MJ, Staudt L, Pinkel D, Siebert R, and Martinez-Climent JA. (2005) Homozygous deletion of SOCS1 in primary mediastinal B-cell lymphoma detected by CGH to BAC microarrays. Leukemia, 19 (6): 1082-4.

77.

Miller SA, Dykes DD, and Polesky HF. (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res, 16 (3): 1215.

78.

Mitelman F, Johansson B, and Mertens F. (2004) Fusion genes and rearranged genes as a linear function of chromosome aberrations in cancer. Nat Genet, 36 (4): 331-4.

79.

Mitelman F, Johansson B, and Mertens F. (2007) The impact of translocations and gene fusions on cancer causation. Nat Rev Cancer, 7 (4): 233-45.

80.

Mohamed AN, Palutke M, Eisenberg L, and Al-Katib A. (2001) Chromosomal analyses of 52 cases of follicular lymphoma with t(14;18), including blastic/blastoid variant. Cancer Genet Cytogenet, 126 (1): 45-51.

81.

Moldenhauer G, Popov SW, Wotschke B, Bruderlein S, Riedl P, Fissolo N, Schirmbeck R, Ritz O, Moller P, and Leithauser F. (2006) AID expression identifies interfollicular large B cells as putative precursors of mature B-cell malignancies. Blood, 107 (6): 2470-3.

72


82.

Bödör Csaba

Moller P, Bruderlein S, Strater J, Leithauser F, Hasel C, Bataille F, Moldenhauer G, Pawlita M, and Barth TF. (2001) MedB-1, a human tumor cell line derived from a primary mediastinal large B-cell lymphoma. Int J Cancer, 92 (3): 348-53.

83.

Moller P, Lammler B, Herrmann B, Otto HF, Moldenhauer G, and Momburg F. (1986) The primary mediastinal clear cell lymphoma of B-cell type has variable defects in MHC antigen expression. Immunology, 59 (3): 411-7.

84.

Moller P, Moldenhauer G, Momburg F, Lammler B, Eberlein-Gonska M, Kiesel S, and Dorken B. (1987) Mediastinal lymphoma of clear cell type is a tumor corresponding to terminal steps of B cell differentiation. Blood, 69 (4): 1087-95.

85.

Montesinos-Rongen M, Van Roost D, Schaller C, Wiestler OD, and Deckert M. (2004) Primary diffuse large B-cell lymphomas of the central nervous system are targeted by aberrant somatic hypermutation. Blood, 103 (5): 1869-75.

86.

Morrison AM, Nutt SL, Thevenin C, Rolink A, and Busslinger M. (1998) Lossand gain-of-function mutations reveal an important role of BSAP (Pax-5) at the start and end of B cell differentiation. Semin Immunol, 10 (2): 133-42.

87.

Muramatsu M, Kinoshita K, Fagarasan S, Yamada S, Shinkai Y, and Honjo T. (2000) Class switch recombination and hypermutation require activationinduced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme. Cell, 102 (5): 553-63.

88.

Muramatsu M, Sankaranand VS, Anant S, Sugai M, Kinoshita K, Davidson NO, and Honjo T. (1999) Specific expression of activation-induced cytidine deaminase (AID), a novel member of the RNA-editing deaminase family in germinal center B cells. J Biol Chem, 274 (26): 18470-6.

89.

Nagy M, Balazs M, Adam Z, Petko Z, Timar B, Szereday Z, Laszlo T, Warnke RA, and Matolcsy A. (2000) Genetic instability is associated with histological transformation of follicle center lymphoma. Leukemia, 14 (12): 2142-8.

90.

Neuberger MS and Scott J. (2000) Immunology. RNA editing AIDs antibody diversification? Science, 289 (5485): 1705-6.

91.

Notarangelo LD, Lanzi G, Peron S, and Durandy A. (2006) Defects of classswitch recombination. J Allergy Clin Immunol, 117 (4): 855-64.

73


92.

Bödör Csaba

Nutt SL, Eberhard D, Horcher M, Rolink AG, and Busslinger M. (2001) Pax5 determines the identity of B cells from the beginning to the end of Blymphopoiesis. Int Rev Immunol, 20 (1): 65-82.

93.

Okazaki IM, Hiai H, Kakazu N, Yamada S, Muramatsu M, Kinoshita K, and Honjo T. (2003) Constitutive expression of AID leads to tumorigenesis. J Exp Med, 197 (9): 1173-81.

94.

Okazaki IM, Kotani A, and Honjo T. (2007) Role of AID in Tumorigenesis. Adv Immunol, 94: 245-73.

95.

Oppezzo P, Dumas G, Lalanne AI, Payelle-Brogard B, Magnac C, Pritsch O, Dighiero G, and Vuillier F. (2005) Different isoforms of BSAP regulate expression of AID in normal and chronic lymphocytic leukemia B cells. Blood, 105 (6): 2495-503.

96.

Palanisamy N, Abou-Elella AA, Chaganti SR, Houldsworth J, Offit K, Louie DC, Terayu-Feldstein J, Cigudosa JC, Rao PH, Sanger WG, Weisenburger DD, and Chaganti RS. (2002) Similar patterns of genomic alterations characterize primary mediastinal large-B-cell lymphoma and diffuse large-B-cell lymphoma. Genes Chromosomes Cancer, 33 (2): 114-22.

97.

Pasqualucci L, Guglielmino R, Houldsworth J, Mohr J, Aoufouchi S, Polakiewicz R, Chaganti RS, and Dalla-Favera R. (2004) Expression of the AID protein in normal and neoplastic B cells. Blood, 104 (10): 3318-25.

98.

Pasqualucci L, Migliazza A, Fracchiolla N, William C, Neri A, Baldini L, Chaganti RS, Klein U, Kuppers R, Rajewsky K, and Dalla-Favera R. (1998) BCL-6 mutations in normal germinal center B cells: evidence of somatic hypermutation acting outside Ig loci. Proc Natl Acad Sci U S A, 95 (20): 1181621.

99.

Pasqualucci L, Neumeister P, Goossens T, Nanjangud G, Chaganti RS, Kuppers R, and Dalla-Favera R. (2001) Hypermutation of multiple proto-oncogenes in Bcell diffuse large-cell lymphomas. Nature, 412 (6844): 341-6.

74


100.

Bödör Csaba

Paulli M, Lazzarino M, Gianelli U, Strater E, Orlandi E, Klersy C, Viglio A, Rosso R, Gambacorta M, Rousset T, Morra E, Lavabre-Bertrand T, Bernasconi C, Manegold C, Magrini U, and Moller P. (1997) Primary mediastinal B-cell lymphoma: update of its clinicopathologic features. Leuk Lymphoma, 26 Suppl 1: 115-23.

101.

Petersen-Mahrt S. (2005) DNA deamination in immunity. Immunol Rev, 203: 80-97.

102.

Petersen-Mahrt SK, Harris RS, and Neuberger MS. (2002) AID mutates E. coli suggesting a DNA deamination mechanism for antibody diversification. Nature, 418 (6893): 99-103.

103.

Pham P, Bransteitter R, Petruska J, and Goodman MF. (2003) Processive AIDcatalysed cytosine deamination on single-stranded DNA simulates somatic hypermutation. Nature, 424 (6944): 103-7.

104.

Pileri SA, Zinzani PL, Gaidano G, Falini B, Gaulard P, Zucca E, Sabattini E, Ascani S, Rossi M, and Cavalli F. (2003) Pathobiology of primary mediastinal B-cell lymphoma. Leuk Lymphoma, 44 Suppl 3: S21-6.

105.

Popat U, Przepiork D, Champlin R, Pugh W, Amin K, Mehra R, Rodriguez J, Giralt S, Romaguera J, Rodriguez A, Preti A, Andersson B, Khouri I, Claxton D, de Lima M, Donato M, Anderlini P, Gajewski J, Cabanillas F, and van Besien K. (1998) High-dose chemotherapy for relapsed and refractory diffuse large Bcell lymphoma: mediastinal localization predicts for a favorable outcome. J Clin Oncol, 16 (1): 63-9.

106.

Preudhomme C, Roumier C, Hildebrand MP, Dallery-Prudhomme E, Lantoine D, Lai JL, Daudignon A, Adenis C, Bauters F, Fenaux P, Kerckaert JP, and Galiegue-Zouitina S. (2000) Nonrandom 4p13 rearrangements of the RhoH/TTF gene, encoding a GTP-binding protein, in non-Hodgkin's lymphoma and multiple myeloma. Oncogene, 19 (16): 2023-32.

107.

Rabbitts TH, Baer R, Davis M, Forster A, Hamlyn PH, and Malcolm S. (1984) The c-myc gene paradox in Burkitt's lymphoma chromosomal translocation. Curr Top Microbiol Immunol, 113: 166-71.

108.

Rabbitts TH, Hamlyn PH, and Baer R. (1983) Altered nucleotide sequences of a translocated c-myc gene in Burkitt lymphoma. Nature, 306 (5945): 760-5.

75


109.

Bödör Csaba

Ramiro AR, Jankovic M, Eisenreich T, Difilippantonio S, Chen-Kiang S, Muramatsu M, Honjo T, Nussenzweig A, and Nussenzweig MC. (2004) AID is required for c-myc/IgH chromosome translocations in vivo. Cell, 118 (4): 431-8.

110.

Ramiro AR, Stavropoulos P, Jankovic M, and Nussenzweig MC. (2003) Transcription enhances AID-mediated cytidine deamination by exposing singlestranded DNA on the nontemplate strand. Nat Immunol, 4 (5): 452-6.

111.

Reiniger L, Bodor C, Bognar A, Balogh Z, Csomor J, Szepesi A, Kopper L, and Matolcsy A. (2006) Richter's and prolymphocytic transformation of chronic lymphocytic leukemia are associated with high mRNA expression of activationinduced cytidine deaminase and aberrant somatic hypermutation. Leukemia, 20 (6): 1089-95.

112.

Renne C, Willenbrock K, Martin-Subero JI, Hinsch N, Doring C, Tiacci E, Klapper W, Moller P, Kuppers R, Hansmann ML, Siebert R, and Brauninger A. (2007) High expression of several tyrosine kinases and activation of the PI3K/AKT pathway in mediastinal large B cell lymphoma reveals further similarities to Hodgkin lymphoma. Leukemia, 21 (4): 780-7.

113.

Rigaud G, Moore PS, Taruscio D, Scardoni M, Montresor M, Menestrina F, and Scarpa A. (2001) Alteration of chromosome arm 6p is characteristic of primary mediastinal B-cell lymphoma, as identified by genome-wide allelotyping. Genes Chromosomes Cancer, 31 (2): 191-5.

114.

Roberts RA, Wright G, Rosenwald AR, Jaramillo MA, Grogan TM, Miller TP, Frutiger Y, Chan WC, Gascoyne RD, Ott G, Muller-Hermelink HK, Staudt LM, and Rimsza LM. (2006) Loss of major histocompatibility class II gene and protein expression in primary mediastinal large B-cell lymphoma is highly coordinated and related to poor patient survival. Blood, 108 (1): 311-8.

115.

Rodig SJ, Savage KJ, LaCasce AS, Weng AP, Harris NL, Shipp MA, Hsi ED, Gascoyne RD, and Kutok JL. (2007) Expression of TRAF1 and nuclear c-Rel distinguishes primary mediastinal large cell lymphoma from other types of diffuse large B-cell lymphoma. Am J Surg Pathol, 31 (1): 106-12.

116.

Rogozin IB and Kolchanov NA. (1992) Somatic hypermutagenesis in immunoglobulin genes. II. Influence of neighbouring base sequences on mutagenesis. Biochim Biophys Acta, 1171 (1): 11-8.

76


117.

Rogozin

IB,

Solovyov

Bödör Csaba

VV,

and

Kolchanov

NA.

(1991)

Somatic

hypermutagenesis in immunoglobulin genes. I. Correlation between somatic mutations and repeats. Somatic mutation properties and clonal selection. Biochim Biophys Acta, 1089 (2): 175-82. 118.

Rosenwald A, Wright G, Leroy K, Yu X, Gaulard P, Gascoyne RD, Chan WC, Zhao T, Haioun C, Greiner TC, Weisenburger DD, Lynch JC, Vose J, Armitage JO, Smeland EB, Kvaloy S, Holte H, Delabie J, Campo E, Montserrat E, LopezGuillermo A, Ott G, Muller-Hermelink HK, Connors JM, Braziel R, Grogan TM, Fisher RI, Miller TP, LeBlanc M, Chiorazzi M, Zhao H, Yang L, Powell J, Wilson WH, Jaffe ES, Simon R, Klausner RD, and Staudt LM. (2003) Molecular diagnosis of primary mediastinal B cell lymphoma identifies a clinically favorable subgroup of diffuse large B cell lymphoma related to Hodgkin lymphoma. J Exp Med, 198 (6): 851-62.

119.

Rossi D, Berra E, Cerri M, Deambrogi C, Barbieri C, Franceschetti S, Lunghi M, Conconi A, Paulli M, Matolcsy A, Pasqualucci L, Capello D, and Gaidano G. (2006) Aberrant somatic hypermutation in transformation of follicular lymphoma and chronic lymphocytic leukemia to diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica, 91 (10): 1405-9.

120.

Rossi D, Cerri M, Capello D, Deambrogi C, Berra E, Franceschetti S, Alabiso O, Gloghini A, Paulli M, Carbone A, Pileri SA, Pasqualucci L, and Gaidano G. (2005) Aberrant somatic hypermutation in primary mediastinal large B-cell lymphoma. Leukemia, 19 (12): 2363-6.

121.

Rush JS, Fugmann SD, and Schatz DG. (2004) Staggered AID-dependent DNA double strand breaks are the predominant DNA lesions targeted to S mu in Ig class switch recombination. Int Immunol, 16 (4): 549-57.

122.

Sanger F, Nicklen S, and Coulson AR. (1977) DNA sequencing with chainterminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A, 74 (12): 5463-7.

123.

Sanz-Vaque L, Colomer D, Bosch F, Lopez-Guillermo A, Dreyling MH, Bosch F, Montserrat E, and Campo E. (2001) Microsatellite instability analysis in typical and progressed mantle cell lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia. Haematologica, 86 (2): 181-6.

77


124.

Bödör Csaba

Savage KJ. (2006) Primary mediastinal large B-cell lymphoma. Oncologist, 11 (5): 488-95.

125.

Savage KJ, Monti S, Kutok JL, Cattoretti G, Neuberg D, De Leval L, Kurtin P, Dal Cin P, Ladd C, Feuerhake F, Aguiar RC, Li S, Salles G, Berger F, Jing W, Pinkus GS, Habermann T, Dalla-Favera R, Harris NL, Aster JC, Golub TR, and Shipp MA. (2003) The molecular signature of mediastinal large B-cell lymphoma differs from that of other diffuse large B-cell lymphomas and shares features with classical Hodgkin lymphoma. Blood, 102 (12): 3871-9.

126.

Scarpa A, Borgato L, Chilosi M, Capelli P, Menestrina F, Bonetti F, Zamboni G, Pizzolo G, Hirohashi S, and Fiore-Donati L. (1991) Evidence of c-myc gene abnormalities in mediastinal large B-cell lymphoma of young adult age. Blood, 78 (3): 780-8.

127.

Scarpa A, Moore PS, Rigaud G, Inghirami G, Montresor M, Menegazzi M, Todeschini G, and Menestrina F. (1999) Molecular features of primary mediastinal B-cell lymphoma: involvement of p16INK4A, p53 and c-myc. Br J Haematol, 107 (1): 106-13.

128.

Schreck S, Buettner M, Kremmer E, Bogdan M, Herbst H, and Niedobitek G. (2006) Activation-induced cytidine deaminase (AID) is expressed in normal spermatogenesis but only infrequently in testicular germ cell tumours. J Pathol, 210 (1): 26-31.

129.

Shaffer K, Smith D, Kirn D, Kaplan W, Canellos G, Mauch P, and Shulman LN. (1996) Primary mediastinal large-B-cell lymphoma: radiologic findings at presentation. AJR Am J Roentgenol, 167 (2): 425-30.

130.

Shen HM, Peters A, Baron B, Zhu X, and Storb U. (1998) Mutation of BCL-6 gene in normal B cells by the process of somatic hypermutation of Ig genes. Science, 280 (5370): 1750-2.

131.

Smit LA, Bende RJ, Aten J, Guikema JE, Aarts WM, and van Noesel CJ. (2003) Expression of activation-induced cytidine deaminase is confined to B-cell nonHodgkin's lymphomas of germinal-center phenotype. Cancer Res, 63 (14): 3894-8.

78


132.

Bödör Csaba

Smith D, Shaffer K, Kirn D, Canellos GP, Mauch PM, and Shulman LN. (1998) Mediastinal large cell lymphoma: prognostic significance of CT findings at presentation and after treatment. Oncology, 55 (4): 284-8.

133.

Staudt LM. (2007) A closer look at follicular lymphoma. N Engl J Med, 356 (7): 741-2.

134.

Tonegawa S. (1983) Somatic generation of antibody diversity. Nature, 302 (5909): 575-81.

135.

Tsang P, Cesarman E, Chadburn A, Liu YF, and Knowles DM. (1996) Molecular characterization of primary mediastinal B cell lymphoma. Am J Pathol, 148 (6): 2017-25.

136.

van Besien K, Kelta M, and Bahaguna P. (2001) Primary mediastinal B-cell lymphoma: a review of pathology and management. J Clin Oncol, 19 (6): 185564.

137.

Wang CL, Harper RA, and Wabl M. (2004) Genome-wide somatic hypermutation. Proc Natl Acad Sci U S A, 101 (19): 7352-6.

138.

Weiss LM, Warnke RA, Sklar J, and Cleary ML. (1987) Molecular analysis of the t(14;18) chromosomal translocation in malignant lymphomas. N Engl J Med, 317 (19): 1185-9.

139.

Werner CA, Dohner H, Joos S, Trumper LH, Baudis M, Barth TF, Ott G, Moller P, Lichter P, and Bentz M. (1997) High-level DNA amplifications are common genetic aberrations in B-cell neoplasms. Am J Pathol, 151 (2): 335-42.

140.

Zan H, Cerutti A, Dramitinos P, Schaffer A, Li Z, and Casali P. (1999) Induction of Ig somatic hypermutation and class switching in a human monoclonal IgM+ IgD+ B cell line in vitro: definition of the requirements and modalities of hypermutation. J Immunol, 162 (6): 3437-47.

141.

Zan H, Komori A, Li Z, Cerutti A, Schaffer A, Flajnik MF, Diaz M, and Casali P. (2001) The translesion DNA polymerase zeta plays a major role in Ig and bcl6 somatic hypermutation. Immunity, 14 (5): 643-53.

142.

Zan H, Wu X, Komori A, Holloman WK, and Casali P. (2003) AID-dependent generation of resected double-strand DNA breaks and recruitment of Rad52/Rad51 in somatic hypermutation. Immunity, 18 (6): 727-38.

79


143.

Bödör Csaba

Zeng X, Winter DB, Kasmer C, Kraemer KH, Lehmann AR, and Gearhart PJ. (2001) DNA polymerase eta is an A-T mutator in somatic hypermutation of immunoglobulin variable genes. Nat Immunol, 2 (6): 537-41.

144.

Zhou C, Saxon A, and Zhang K. (2003) Human activation-induced cytidine deaminase is induced by IL-4 and negatively regulated by CD45: implication of CD45 as a Janus kinase phosphatase in antibody diversification. J Immunol, 170 (4): 1887-93.

145.

Zinzani PL, Martelli M, Bendandi M, De Renzo A, Zaccaria A, Pavone E, Bocchia M, Falini B, Gobbi M, Gherlinzoni F, Stefoni V, Tani M, and Tura S. (2001) Primary mediastinal large B-cell lymphoma with sclerosis: a clinical study of 89 patients treated with MACOP-B chemotherapy and radiation therapy. Haematologica, 86 (2): 187-91.

80


Bödör Csaba

XI. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

XI. I. Az értekezés témájában megjelent közlemények 1.

Bödör Cs, Bognár Á, Reiniger L, Szepesi Á, Tóth E, Kopper L, Matolcsy, A. (2005) Aberrant somatic hypermutation and expression of activation induced cytidine deaminase mRNA in mediastinal large B-cell lymphoma. British Journal of Haematology, 129: 373-376.

2.

IF: 4,080

Reiniger L, Bödör Cs, Bognár Á, Balogh Zs, Csomor J, Szepesi Á, Matolcsy A. (2006) Richter's and prolymphocytic transformation of chronic lymphocytic leukemia are associated with high mRNA expression of activation-induced cytidine

deaminase

and

aberrant

somatic

20: 1089-1095.

hypermutation.

Leukemia, IF: 6,146

XI. II. Egyéb témában megjelent közlemények 1.

Bognár Á, Csernus B, Bödör Cs, Reiniger L, Szepesi Á, Tóth E, Kopper L, Matolcsy A. (2005) Clonal selection in the bone marrow involvement of follicular lymphoma. Leukemia, 19: 1656-62.

2.

IF: 6,612

Rajnai H, Bödör Cs, Reiniger L, Timár B, Csernus B, Szepesi Á, Csomor J, Matolcsy A. (2006) Új lehetőség a krónikus myeloproliferatív betegségek diagnosztikájában – a JAK2 mutáció kimutatása. Orvosi Hetilap, 45: 2175-2179.

3.

Bödör Cs, Matolcsy A, Bernáth M. (2007) Elevated expression of Cu, Zn-SOD and Mn-SOD mRNA in inflamed dental pulp. International Endodontic Journal, 40: 128-132

IF: 1,429

81


4.

Bödör Csaba

Balogh Zs, Reniger L, Deák L, Bödör Cs, Csomor J, Szepesi Á, Gagyi É, Kopper L, Matolcsy A. (2007) IgVH gene mutation status and genomic imbalances in chronic lymphocytic leukemia with increased prolymphocytes (CLL/PL). Hematol Oncol, 25: 90-5.

5.

IF:1,875

Gagyi É, Horváth E, Bödör Cs, Timár B, Matolcsy A, Pávai Z. (2007) Prognostic significance and detection of the Internal Tandem Duplication of the FLT3 gene in acute myeloid leukemia. Romanian Journal of Morphology and Embryology, 47: 331-337.

6.

Bödör Cs, Schmidt O, Csernus B, Rajnai H, Szende B. (2007) DNA and RNA isolated from tissues processed by microwave accelerated apparatus MFX-800-3 are suitable for subsequent PCR and Q-RT-PCR amplification. Pathology and Oncology Research, 13: 149-52.

7.

IF:1,241

Bödör Cs, Rajnai H, Timár B, Csomor J, Matolcsy A. (2007) BCR-ABL mRNS expressziós szintek valós-idejű kvantitatív PCR-rel történő követése krónikus myeloid leukaemiás betegek esetében. Hematológia Transzfuziológia, 40: 7-14.

8.

Dezső K, Jelnes P, László V, Baghy K, Bödör Cs, Paku S, Tygstrup N, Bisgaard HC, Nagy P. (2007) Thy-1 is expressed in hepatic myofibroblasts and not oval cells in stem cell-mediated liver regeneration. American Journal of Pathology, DOI: 10.2353/ajpath.2007.070273

IF: 5,917

82


Bödör Csaba

XI. III. Idézhető absztraktok 1.

Bödör Cs, Bognár Á, Szepesi Á, Matolcsy A. (2004) Genetic instability caused by somatic hypermutation in primary mediastinal lymphoma. Tissue Antigens, 64: 390.

2.

IF: 1,990

Bödör Cs, Bognár Á, Reiniger L, Szepesi Á, Matolcsy A. (2005) Aberrant somatic

hypermutation

and

expression

of

actvation-induced

cytidine

deaminase in primary mediastinal B-cell lymphoma. Annals Oncology, suppl 2: v144. 3.

IF: 4,335

Bognár Á, Csernus B, Bödör Cs, Szepesi Á, Matolcsy A. (2004) Clonal selection in the bone marrow involvement of follicular lymphoma. Tissue Antigens, 64: 390.

4.

IF: 1,990

Bognár Á, Csernus B, Bödör Cs, Szepesi Á, Matolcsy A. (2005) Clonal selection in the bone marrow involvement of follicular lymphoma. Annals Oncology, suppl 2: v149.

IF: 4,335

XI. IV. Előadások, poszterek 1.

Bödör Csaba, Bognár Ágnes, Szepesi Ágota, Matolcsy András. Szomatikus hipermutáció

okozta

genetikai

instabilitás

mediastinális

nagy

B-sejtes

lymphomában. (előadás) – I. díj, 63. Pathologus Kongresszus, Siófok, 2004. szeptember 23-25. 2.

Bödör Csaba, Bognár Ágnes, Szepesi Ágota, Matolcsy András. Genetic instability caused by somatic hypermutation in primary mediastinal lymphoma. (poszter), 1st International Conference on Basic and Clinical Immunogenomics, Budapest, 2004 október 3-7 .

83


3.

Bödör Csaba

Bognár Ágnes, Csernus Balázs, Bödör Csaba, Szepesi Ágota, Matolcsy András. Clonal selection in the bone marrow involvement of follicular lymphoma. (poszter), 1st International Conference on Basic and Clinical Immunogenomics, Budapest, 2004 október 3-7.

4.

Bödör Csaba, Bognár Ágnes, Reiniger Lilla, Szepesi Ágota, Matolcsy András. Aberrant somatic hypermutation and expression of actvation-induced cytidine deaminase in primary mediastinal B-cell lymphoma. (absztrakt), 9th International Conference on Malignant Lymphoma, Lugano, 2005. június 8-11.

5.

Bognár Ágnes, Csernus Balázs, Bödör Csaba, Szepesi Ágota, Matolcsy András. Clonal selection in the bone marrow involvement of follicular lymphoma. (absztrakt), 9th International Conference on Malignant Lymphoma, Lugano, 2005. június 8-11.

6.

Bödör Csaba, Bognár Ágnes, Reiniger Lilla, Szepesi Ágota, Matolcsy András. Aberráns szomatikus hipermutáció és aktiváció-indukált citidin deamináz mRNS expresszió mediasztinális nagy B-sejtes limfómában.- „legjobb előadás” díj. 64. Pathológus Kongresszus, Pécs, 2005. szeptember 22-24.

7.

Reiniger Lilla, Bödör Csaba, Bognár Ágnes, Szepesi Ágota, Matolcsy András. AID expresszió és aberráns szomatikus hipermutáció szerepe a CLL transzformációjában. 64. Pathológus Kongresszus, Pécs, 2005. szeptember 22-24.

8.

Bognár Ágnes, Csernus Balázs, Bödör Csaba, Szepesi Ágota, Matolcsy András. Klonális szelekció a folliculáris lymphomák csontvelői terjedése során. 64. Pathológus Kongresszus, Pécs, 2005. szeptember 22-24.

9.

Bödör Csaba, Rajnai Hajnalka, Matolcsy András. JAK2 mutáció szerepe a krónikus myeloproliferatív betegségek diagnosztikájában. Onkohematológia, mint a molekuláris medicina prototípusa – A Magyar Tudomány Napjához kapcsolódó tudományos ülés, Magyar Tudomámyos Akadémia, 2005. november 21.

84


10.

Bödör Csaba

Bödör Csaba, Csernus Balázs, Matolcsy András. A primer mediastinalis lymphoma sejteredete és kialakulásában szerepet játszó genetikai tényezők. Onkohematológia, mint a molekuláris medicina prototípusa – A Magyar Tudomány Napjához kapcsolódó tudományos ülés, Magyar Tudomámyos Akadémia, 2005. november 21.

11.

Reiniger Lilla, Bödör Csaba, Matolcsy András. Aberráns szomatikus hipermutáció szerepe a lymphomatranszformációban . Onkohematológia, mint a molekuláris medicina prototípusa – A Magyar Tudomány Napjához kapcsolódó tudományos ülés, Magyar Tudomámyos Akadémia, 2005. november 21.

12.

Bödör Csaba, Bognár Ágnes, Reiniger Lilla, Matolcsy András. A primer mediastinalis lymphoma sejteredete és kialakulásában szerepet játszó tényezők. Malignus Lymphoma Konferencia, Győr, 2006. április 6-8.

13.

Reiniger Lilla, Bödör Csaba, Matolcsy András. A krónikus lymphoid leukemia Richter és prolymphocytás transzformációja összefügg az aktiváció-indukált citidin deamináz magas mRNS expressziójával és a c-MYC, a PAX-5 és RhoH gének aberráns szomatikus hipermutációjával. Malignus Lymphoma Konferencia, Győr, 2006.április 6-8.

14.

Bödör Csaba, Bognár Ágnes, Reiniger Lilla, Matolcsy András. A primer mediastinalis lymphoma sejteredete és kialakulásában szerepet játszó tényezők. V. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapest, 2006. május 4-6.

15.

Reiniger Lilla, Bödör Csaba, Bognár Ágnes, Matolcsy András. AID expresszió és aberráns szomatikus hipermutáció szerepe a CLL transzormációjában. V. Magyar Sejtanalitikai Konferencia, Budapest, 2006. május 4-6.

16.

Bödör Csaba, Reiniger Lilla, Bognár Ágnes, Matolcsy András. The role of aberrant somatic hypermutation and AID mRNA expression in lymphoma transformation. 16th European Congress of Immunology, Paris, 2006. szeptember 6-9.

85


17.

Bödör Csaba

Bödör Csaba. Akut leukémiák követése real-time PCR-rel (plenáris előadás), 65. Patológus Kongresszus, Hajdúszoboszló, 2006. október 5-7.

18.

Szende Béla, Schmidt Otto és Bödör Csaba. Molekuláris pathológiai vizsgálat lehetősége mikrohullámú szövetfeldolgozó berendezéssel készült paraffinos blokkokból. 65. Patológus Kongresszus, Hajdúszoboszló, 2006. október 5-7.

19.

Bödör Csaba, Deák Linda, Sápi Zoltán. Fúziós gén transzkriptumok kimutatása valós idejű kvantitatív PCR-rel lágyrész tumorokban. 66. Patológus Kongresszus, Balatonfüred, 2007. október 4-6.

20.

Rajnai Hajnalka, Bödör Csaba, Timár Botond, Deák Linda, Csomor Judit, Matolcsy András. Az ABL gén mutációinak kimutatása és új terápiás stratégiák krónikus myeloid leukémiában. 66. Patológus Kongresszus, Balatonfüred, 2007. október 4-6.

86


Bödör Csaba

XII. KÖZLEMÉNYEK IDÉZETTSÉGE A dolgozat témájában megjelent közlemények idézettsége a Web of Science és Scopus adatbázisok alapján. Bödör Cs, Bognár Á, Reiniger L, Szepesi Á, Tóth E, Kopper L, Matolcsy, A. (2005) Aberrant somatic hypermutation and expression of activation induced cytidine deaminase

mRNA

in

mediastinal

large

B-cell

lymphoma.

British

Journal

of Haematology, 129: 373-376. Idézetek száma: 5 1.

Független idézet: 4

Rossi D, Cerri M, Capello D, Deambrogi C, Berra E, Franceschetti S, Alabiso O, Gloghini A, Paulli M, Carbone A, Pileri SA, Pasqualucci L, and Gaidano G. (2005) Aberrant somatic hypermutation in primary mediastinal large B-cell lymphoma. Leukemia, 19 (12): 2363-6.

2.

Liso A, Capello D, Marafioti T, Tiacci E, Cerri M, Distler V, Paulli M, Carbone A, Delsol G, Campo E, Pileri S, Pasqualucci L, Gaidano G, and Falini B. (2006) Aberrant somatic hypermutation in tumor cells of nodular-lymphocytepredominant and classic Hodgkin lymphoma. Blood, 108 (3): 1013-20.

3.

Mason DY. (2006) Clues to lymphoma’s cellular origin. Blood, 107 (6): 221516.

4.

Popov SW, Moldenhauer G, Wotschke B, Bruderlein S, Barth TF, Dorsch K, Ritz O, Moller P, and Leithauser F. (2007) Target sequence accessibility limits activation-induced cytidine deaminase activity in primary mediastinal B-cell lymphoma. Cancer Res, 67 (14): 6555-64.

* 5.

Reiniger L, Bodor C, Bognar A, Balogh Z, Csomor J, Szepesi A, Kopper L, and Matolcsy A. (2006) Richter's and prolymphocytic transformation of chronic lymphocytic leukemia are associated with high mRNA expression of activationinduced cytidine deaminase and aberrant somatic hypermutation. Leukemia, 20 (6): 1089-95.

87


Bödör Csaba

Reiniger L, Bödör Cs, Bognár Á, Balogh Zs, Csomor J, Szepesi Á, Matolcsy A. (2006) Richter's and prolymphocytic transformation of chronic lymphocytic leukemia are associated with high mRNA expression of activation-induced cytidine deaminase and aberrant somatic hypermutation. Leukemia, 20: 1089-1095. Idézetek száma: 3 1.

Független idézet: 2

Deutsch AJ, Aigelsreiter A, Staber PB, Beham A, Linkesch W, Guelly C, Brezinschek RI, Fruhwirth M, Emberger W, Buettner M, Beham-Schmid C, and Neumeister P. (2007) MALT lymphoma and extranodal diffuse large B-cell lymphoma are targeted by aberrant somatic hypermutation. Blood, 109 (8): 3500-4.

2.

Okazaki IM, Kotani A, and Honjo T. (2007) Role of AID in Tumorigenesis. Adv Immunol, 94: 245-73. 1

* 3.

Rossi D, Berra E, Cerri M, Deambrogi C, Barbieri C, Franceschetti S, Lunghi M, Conconi A, Paulli M, Matolcsy A, Pasqualucci L, Capello D, and Gaidano G. (2006) Aberrant somatic hypermutation in transformation of follicular lymphoma and chronic lymphocytic leukemia to diffuse large B-cell lymphoma. Haematologica, 91 (10): 1405-9.

*

függő idézet

88


Bödör Csaba

XIII. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

Elsősorban szeretném hálámat kifejezni szüleimnek és családomnak, akik szerető gondoskodása végigkísért eddigi pályám során. Köszönettel tartozom Prof. Kopper Lászlónak, hogy az általa vezetett intézetben folytathattam PhD tanulmányaimat. Köszönöm témavezetőmnek Prof. Matolcsy Andrásnak, hogy befogadott munkacsoportjába, és tudományos ténykedéseimet messzemenően támogatta. Köszönöm Prof. Nagy Péternek az értekezésem elkészítése során tett számos hasznos szakmai tanácsot és a sok baráti beszélgetést egyaránt. Dr. Csomor Juditot köszönet illeti a patológiai konzultációkért és az együtt töltött délutánok során kapott számtalan támogató, bíztató szóért. Kollégáimnak és barátaimnak, a hematopatológiai laboratórium minden dolgozójának szeretném megköszönni az önzetlen szakmai segítséget és azt, hogy munkánk mindig kellemes, baráti légkörben zajlott. Név szerint: Dr. Timár Botond, Dr. Csernus Balázs, Dr. Fülöp Zsolt, Dr. Bognár Ágnes, Dr. Reiniger Lilla, Rajnai Hajnalka, Balogh Zsófia, Dr. Szepesi Ágota, Dr. Angster Christine, Dr. Gagyi Éva, Dr. Barna Gábor. Köszönöm Prof. Kovalszky Ilonának, hogy valamennyi laboratóriumi eszközét rendelkezésemre bocsátotta, és hasznos szakmai tanácsokkal látott el. Dr. Sebestyén Annának és Dr. Krenács Tibornak szintén köszönöm, hogy laboratóriumukban dolgozhattam, és bármikor fordulhattam Hozzájuk kérdéseimmel. A „Biokémia” laboratórium munkatársainak is köszönöm a szakmai segítséget és a baráti beszélgetéseket. Többek között köszönettel tartozom Dr. Füle Tibornak, Szarvas Tibornak, Baghy Kornéliának és László Viktóriának. Bárányné Pallag Adriennenek, Deák Lindának és Lengyel Anikónak köszönöm a laboratóriumi munka során nyújtott segítséget. Csorba Gézáné Maricának köszönöm a sejtvonalak kapcsán nyújtott segítségét. Szilágyi Ilonának és Laczik Cecíliának köszönöm, hogy bármikor fordulhattam Hozzájuk ügyes-bajos dolgaimmal, köszönöm a sok türelmet.

89

AZ ABERRÁNS SZOMATIKUS HIPERMUTÁCIÓ ÉS AZ AKTIVÁCIÓ-INDUKÁLT CITIDIN DEAMINÁZ SZEREPE A MEDIASTINALIS NAGY B-SEJTES LYMPHOMA PATOGENEZISÉBEN

Recommend Documents