Antwoorden COIG-cursus Moleculaire biologie najaar 2015 Vraag 1.1.a. Een germ-line mutatie komt voor in alle cellen van het lichaam, en bloed (met witte bloedcellen met DNA erin) is prima materiaal om de mutatie aan te tonen. Als alternatief kan bijvoorbeeld wangslijmvlies dienen. Een somatische mutatie komt alleen in een bepaald weefsel voor - hier dus in de tumor - en om de mutatie aan te tonen is dus tumormateriaal om het DNA te isoleren. Vraag 1.1.b. Op chromosoom 1 De chromosoomlocatie is gevonden m.b.v. koppelingsonderzoek (zie hoofdstuk 3). Vraag 1.1.c. 531 aminozuren betekent een code van 1593 nucleotiden. Daarvoor zit de 5’ untranslated region behorende bij exon 1, en aan het einde de 3’ untranslated region behorende bij het laatste exon. In het mRNA molecuul zijn de intronen er al uit gespliced. In dit geval wordt het mRNA bedoeld en niet het RNA molecuul met nog intronen erin; die worden er al uit geknipt terwijl het RNA molecuul nog in de kern zit. Vraag 1.2.a. Bij een mutatie die gevonden wordt in het tumor DNA is niet duidelijk of het om een aangeboren (germ-line) mutatie gaat of een somatische mutatie in de tumor. Bloed is het makkelijkst te krijgen, en de witte boedcellen worden meestal gebruikt als bron om germline DNA uit te isoleren. Als er toevallig ander goed celmateriaal aanwezig is (spier in dit geval) kan dat natuurlijk ook. Vraag 1.2.b. Als er een mutatie in het tumor DNA gevonden wordt, dan wil men graag weten of het een somatische mutatie is (dus in de tumor ontstaan) of een germ-line mutatie. Alleen in het laatste geval is de mutatie ook in het DNA uit bloedcellen te vinden. Vraag 1.3.a. Promotergebied met daarin silencer, enhancer, promoter – transcriptie-initiatiesite – exon 1, met aan het begin de 5’UTR en startcodon als begin van coderende gedeelte – GT splice site - intron1- AG splice siteexon2……exon17 met als onvertaalde laatste gedeelte na het stopcodon de 3’ UTR met aan het eind de polyadenylatie site waarna de transcriptie eindigt. Voorbeeld mutatie in splice site: splicing lukt niet meer, en intron blijft aanwezig in mRNA. Hoogst waarschijnlijk zit hier wel ergens, na een kortere of langere serie triplets, wel een stopcodon. Mocht de mutatie in de splice sites voor het laatste intron vallen, ontstaat waarschijnlijk een abnormaal en te kort eiwit, met een het eind aan aantal verkeerde aminozuren. Indien in eerdere splice sites, gebeurt dit in principe ook, alleen wordt dan door het mechanisme van “nonsense-mediated-decay” het mRNA vernietigd, waardoor effectief geen eiwit gevormd wordt. Vraag 1.3.b Een RNA molecuul kan nog intronen bevatten en geen polyA-staart hebben: het is nog geen boodschapper RNA molecuul. In de praktijk wordt de term RNA vaak gebruikt voor zowel onaf RNA als mRNA. Een mRNA molecuul bevat alleen nog de exonen en heeft als belangrijk kenmerk een polyA-staart. Met behulp van deze polyA-staart kan met een polyT primer (een groot aantal T’s op een rij) en het enzym transverse transcriptase een mRNA-DNA duplex molecuul gemaakt worden. Na verwijderen van de mRNA streng kan de nieuwe DNA streng met een PCR reactie dubbelstrengs gemaakt worden en vermenigvuldigd worden: cDNA (copyDNA of complementary DNA). Je maakt cDNA dus van RNA en niet van DNA. Vraag 1.3.c De reden is dat de PCR primers de sequence reactie verstoren! Die gaat immers ook met primers.
pagina 1 van 13
Vraag 1.3.d. Lees de onderstaande sequencing reactie. Rood = T, zwart = G, groen = A, blauw = C.
Vraag 1.4.a. Als er een mutatie in het tumor DNA gevonden wordt, dan wil men graag weten of het een somatische mutatie is (dus in de tumor ontstaan) of een germ-line mutatie. Alleen in het laatste geval is de mutatie ook in het DNA uit bloedcellen te vinden. Vraag 2.1.a. Door verlies of invoegen van een of meerdere nucleotiden kan het open reading frame van steeds drie nucleotiden verstoord worden: frameshift. Dit soort veranderingen in het DNA worden in de vakliteratuur vaak “indels” genoemd: inserties en deleties... Dit heeft altijd een effect op het eiwit! Het heeft meestal als consequenctie dat er vroegtijdig een stopcodon ontstaat. Daarvoor kunnen natuurlijk al enige abnormale codes voor aminozuren ontstaan zijn. Er ontstaat dus een abnormaal en te kort eiwit als de mutatie in het laatste exon plaatsvindt, en waarschijnlijk geen eiwit als het in een eerder exon zit (door nonsense-mediated decay). Vraag 2.1.b. Bij de PCR worden beide allelen geamplificeerd, waardoor een mengsel ontstaat van PCR product met de normale hoeveelheid nucleotiden en PCR product met een nucleotide te weinig (deletie) of te veel (insertie). Bij het direct sequencen worden beide PCR producten ook door elkaar gesequenced. Het begin is hetzelfde, pas bij de mutatie gaan ze uit de pas lopen en ontstaat het dubbelpatroon. Vraag 2.2.a. Doordat een oplossing met een bepaalde plasmide erin (bevattende bv een PCR product), bij een overmaat aan bacterieen gedaan wordt (die competent gemaakt zijn waardoor ze het DNA kunnen opnemen), wordt maximaal 1 plasmide per bacterie opgenomen 9en in veel bacterieen niets). Als deze bacterie zich vervolgens gaat vermenigvuldigen ontstaat een clone van bacterieen die allemaal hetzelfde DNA en plasmide – met het stukje te cloneren DNA in de plasmide, de insert- bevatten: Het cloneren van het stukje DNA. Vraag 2.2.b. Bij het transformeren van E.Coli neemt een E.Coli bacterie één plasmide met daarin 1 PCR molecuul op, daar ontstaat een kolonie van. Zo kijkt u dan alleen maar naar één allel, als u vanuit het plasmide het PCR product gaat sequencen.
pagina 2 van 13
Vraag 2.3. Ze wilden weten of het hier ging om mutaties of om relatief frequent voorkomende polymorfismen (variaties). In het laatste geval zou het voorkomen bij de patiënten waarschijnlijk weinig betekenis hebben. Exonen waarin geen mutaties gevonden werden in de patiëntengroep waren dus niet relevant. Vraag 2.4.a. D1S542 ligt op 1q31.1 (centromere kant), HRPT op 1q31.2 en D1S413 op 1q.31.3 (telomere kant). Er zit dus nog een flink stuk tussen de twee markers en het HRPT2 gen. Vraag 2.4.b. Twee dezelfde genen (bv voor BRCA1) op twee chromosomen (van de vader en van de moeder) zijn twee allelen van dat gen. Het verschil tussen een polymorfisme en een mutatie zit alleen in de frequentie van voorkomen. Een polymorfisme is een nucleotidevariant die zich kan handhaven vanwege een weinig schadelijk fenotype, soms gepaard gaande met een biologisch voordeel, en komt dus vaker voor dan een mutatie (soms wordt 2 of 5 % van de populatie als grens gesteld, dit is natuurlijk arbitrair). Op de plek van een polymorfisme kan bv, een A staan of een G, men spreekt dan van een A-allel of een G-allel. In het genoom komen om de paar honderd baseparen polymorfismen voor van een enkele nucleotide: single nucleotide polymorphisms of SNPs genaamd. Dinucleotide repeat: een sequentie waarin een volgorde van twee nucleotiden (bv GA) zich een aantal keren herhaalt. Bij het verdubbelen van het DNA tijdens de celdeling “slipt” het DNA polymerase wel eens bij zich herhalende sequenties, waardoor er bv een GA te veel of te weinig ontstaat. Daardoor variëren dinucleotide repeats veelvuldig in lengte in de populatie, en zijn dus heel polymorf (variabel). De verschillende allelen zijn dus ook makkelijk op lengte van elkaar te scheiden in het lab. Vraag 2.4.c Hoe verder weg, hoe makkelijker er een crossover plaats kan vinden tijdens de meiose waardoor de repeat niet meer overerft samen met het gen waarvan je wil weten of het er nog is. Als dat gebeurt is, is de repat niet meer informatief over de aanwezigheid of deletie van het gen. Vraag 2.4.d. Primers moeten: Een unieke sequentie hebben, dat wil zeggen: komt maar 1x voor in het genoom Ongeveer 20-30 nucleotiden lang zijn Geen palindroom bevatten, dus bijv. aan de ene kant veel T’s en aan de andere kant veel A’s; dan wordt een hairpin gevormd en kan de primer niet meer aan zijn targetsequentie binden. De primers mogen geen te lange stukken complementaire nucleotiden bevatten: dan binden ze aan elkaar, in plaats van aan het te amplificeren DNA. De hoeveelheden purines (A,G) en pyrimidines (C,T) moeten ongeveer gelijk zijn in de twee primers, zodat de temperatuur waarbij ze goed binden aan het DNA dan ongeveer gelijk is. Vraag 2.4.e. Forward primer: Reverse primer:
5’ AGCTCCCACAATTGCATAAA 3’ 5’ ACCATCAGACCACGATCAAT 3’
PCR Profile: denature: 30 seconds at 94 degrees C annealing: 75 seconds at 55 degrees C extension: 15 seconds at 72 degrees C PCR cycles: 27 extension: 6 minutes at 72 degress C Vraag 2.4.f. Het verlies van één marker allel in tumormateriaal is makkelijker aantoonbaar als er in het germline twee dinuclotide-allelen van verschillende lengte voorkomen. Als ze dezelfde lengte hebben is het alleen een quantitatief verschil als er één allel ontbreekt, en dat is moeilijk aan te tonen.
pagina 3 van 13
Vraag 3.1.a. Bij een prematuur stopcodon is er een mutatie opgetreden in een codon voor een aminozuur, waardoor een stopcodon is ontstaan. Dit heeft als gevolg dat door het ribosoom een te kort eiwit molecuul (laatste exon), of geen eiwit (eerder exon) gemaakt wordt. Als het eiwit als een dimeer moet functioneren, is de eerste mogelijkheid potentieel erg schadelijk: a. als het te korte eiwit niet functioneel is maar wel kan dimeriseren, zal gemiddeld ¾ van de dimeren niet functioneren b. Als het te korte eiwit niet kan dimeriseren en verder niet schadelijk is, zal gemiddeld 50% van de dimeren nog functioneel zijn, namelijk die moleculen die van de gezonde gencopie komen c. Als het mRNA direct wordt afgebroken zal er ook nog 50% dimeren zijn, eveneens van de gezonde gencopie. Vraag 3.1.b. Bij transport van het mRNA molecuul naar het cytoplasma gaan de splicing-eiwitcomplexen die nog aan het RNA vast zitten mee. Ze worden er vervolgens “afgeritst” als het mRNA door het ribosoom gaat lopen. Bij een stopcodon in het eerste exon worden deze eiwitcomplexen er niet afgehaald en dat zorgt ervoor dat het mRNA molecuul snel afgebroken wordt: er zal dus geen abnormaal eiwit gemaakt worden. Bij een stopcodon in het laatste exon werkt dit mechanisme niet omdat dan alle splicing-complexen er al af zijn, waardoor een abnormaal, te kort, eiwit gemaakt wordt. Het is niet uitgesloten dat zo’n eiwit nog gedeeltelijk kan functioneren. Als dat eiwit functioneert als onderdeel van een dimeer of trimeer, kan het ervoor zorgen dat het hele eiwitcomplex niet meer werkt ondanks het feit dat het andere deel van het complex wel normaal is! Vraag 3.1.c In exon 1 vier nucleotiden verloren op positie 82 (nucleotide). Daardoor ontstaat een frameshift bij het corresponderende aminozuur 28 (3x28=84, de code voor dit aminozuur bevindt zich dus op positie 82-84), resulterend in een stopcodon bij de code voor aminozuur 35. Tussen aminozuur 28 en 35 is de code veranderd in onzin-aminozuren. Het gevolg van dit stopcodon is waarschijnlijk uiteindelijk een eiwit tekort, omdat het abnormale eiwit via nonsense-mediated decay wordt afgebroken (omdat het in het eerste exon zit). Alleen in het laatste exon is dit niet het geval, er ontstaat dan een abnormaal eiwit. De tweede mutatie kunt u op vergelijkbare manier beschrijven. Vraag 3.1.d. 1. Primary tumor 82del4 in exon 1 Somatic Frame shift at amino acid 28; stop codon at 35 No 732delT in exon 8 Somatic Frame shift at amino acid 244; stop codon at 256 Twee verschillende mutaties in het tumor DNA, daardoor zijn beide allelen van het HRPT gen niet meer functioneel, en wordt er (waarschijnlijk) geen functioneel eiwit meer gemaakt waardoor de cel een groeivoordeel heeft behaald. 8. Local recurrence 679insAG in exon 7 Germ line Frame shift at amino acid 227; stop codon at 257 No 162C>G in exon 2 Somatic Stop codon Y54X Een al in het germ-line DNA aanwezige mutatie resulteert in het wegvallen van één HRPT2 allel, een tweede loss-of-function mutatie in een tumorcel geeft die cel waarschijnlijk een voordeel boven zijn omgeving. Mogelijk erfelijke predispositie voor deze tumor, in elk geval bij een deel van het nageslacht. 4. Local recurrence 39delC in exon 1 Somatic¶ Frame shift at amino acid 13; stop codon at 20 Yes¶ Een mutatie in de tumor samen met een deletie van het tweede HRPT2 allel in de tumor veroorzaken waarschijnlijk een totaal verlies aan functioneel eiwit. Niet erfelijk. Vraag 3.2.a. Niet erfelijk, beide mutaties in de tumor ontstaan, in verschillende allelen waardoor beide allelen geïnactiveerd werden.
pagina 4 van 13
Vraag 3.2.b. De gemeten fluorescentie-activiteit is lager dan bij de germ-line sequencing reactie. Als beide sequencing reacties tegelijkertijd met dezelfde fluorescerende labels (dus niet verschillend in fluorescentie-capaciteit) gedaan zijn geeft het wel een indicatie, maar is natuurlijk niet bewijzend voor LOH. Vraag 3.2.c. Omdat er twee verschillende fluorescentiesignalen zijn die bijna even sterk zijn, namelijk van het normale allel en van het gemuteerde allel. In dat geval wordt er geen keuze gemaakt maar een N aangegeven. Vraag 3.2.d. Er kan theoretisch ook een mutatie ontstaan zijn in de geslachtscellen van een van de ouders en die is dan niet in het overige DNA aantoonbaar. Vraag 3.3. Om uit te sluiten dat het hier gaat om variaties (polymorfismen) die geen pathologische consequenties hebben. Dit is met name zo belangrijk omdat geen experimenten zijn gedaan om aan te tonen dat de gevonden veranderingen inderdaad functionele consequenties hebben voor het gecodeerde eiwit. Sommige aminozuren kunnen ongestraft veranderen, zonder dat de functie van het eiwit verandert. Vraag 3.4.a. Er zou een mutatie in het andere allel kunnen zitten die met deze PCR reacties niet werd gevonden, maar die wel consequenties heeft voor het eiwit. Bv een mutatie in het promotergebied in een response element of in het promoterelement (bv TATAA) zelf, waardoor minder eiwit gemaakt wordt. Of in het 3’ UTR gedeelte waardoor bv de polyA staart niet aan het RNA molecuul wordt gezet, en het RNA te snel wordt afgebroken. Vraag 3.4.b. Hot spots in het genoom zijn nucleotiden waar veel makkelijker en frequenter dan elders een mutatie plaats vindt. Het gaat dan vaak om de verandering van een C naar een T. (en in de andere strand van een G naar een A). Daarom komen dergelijk mutaties/variaties relatief veel voor, bv bij Factor V Leiden (G→A). C’s zijn relatief vaak gemethyleerd als ze vooraf gaan aan een G. De gemethyleerde C gaat makkelijk over in een base die op een T lijkt, en daar tijdens de replicatie voor wordt aangezien. Vraag 4.1. Er zijn vele mogelijkheden te vinden, hieronder een paar referenties. Belangrijkste is dat er een zogenaamde “gain-of-function” mutatie in het gen plaatsvindt, waardoor de werking van het eiwit versterkt wordt, een goed voorbeeld is de mutatie in het EGF receptor gen (o.a. bij longkanker) waardoor deze groeifactor receptor continu actief is en niet meer op een normale manier geactiveerd hoeft te worden door een ligand. Zo’n mutatie kan in het algemeen maar op een plek in het gen zitten. Abl Oncogene Bypasses Normal Regulation of JAK/STAT Activation Cell Cycle. 2004 Dec 12;3(12) Li C, Teng RH, Tsai YC, Ke HS, Huang JY, Chen CC, Kao YL, Kuo CC, Bell WR, Shieh B. H-Ras oncogene counteracts the growth-inhibitory effect of genistein in T24 bladder carcinoma cells. Br J Cancer. 2004 Dec 21; [Epub ahead of print] N, Senz J, Ferreira P, Masoudi H, Cox K, Nabais S, Lopes C, Machado JC, Seruca R, Carneiro F, Huntsman DG.Genes Chromosomes Cancer. 2004 Dec 17; [Epub ahead of print]beta-Catenin (CTNNB1) gene amplification: A new mechanism of protein overexpression in cancer. Suriano G, Vrcelj Lui WO, Foukakis T, Liden J, Thoppe SR, Dwight T, Hoog A, Zedenius J, Wallin G, Reimers M, Larsson C.Oncogene. 2004 Dec 20; Expression profiling reveals a distinct transcription signature in follicular thyroid carcinomas with a PAX8-PPARgamma fusion oncogene.
pagina 5 van 13
Vraag 4.2.a. Een construct werd gemaakt met daarin het coderende gedeelte van het oncogen met ervoor de promoter van een gen dat specifiek tot expressie komt in een bepaald weefsel, bijvoorbeeld prostaat. In cellen van dat weefseltype, maar bij voorkeur niet in andere weefsels, komen dus transcriptiefactoren tot expressie die deze promoter aanzetten. Het construct werd stabiel geïntegreerd in het genoom van een muis waardoor de promoter nu in het juiste weefsel (prostaat) ook dit oncogen zal aanzetten. Als u geïnteresseerd bent kunt u details over het maken van een transgene muis op internet opzoeken (link: books). Vraag 4.2.b. Een muis waarin alleen extra veel ras of alleen extra veel myc werd gemaakt in prostaat of mamma ontwikkelde hyperplasie, maar geen maligniteit. Na kruising werd in het doelorgaan zowel Ras als Myc gemaakt en ontwikkelden zich maligniteiten. Uit het artikel is op te maken dat dit op langere termijn pas gebeurde, reden om aan te nemen dat tussentijds nog meer genen gemuteerd moesten raken om maligne ontaarding te krijgen. Activiteit van beide genen samen is dus nodig om een maligniteit te ontwikkelen, maar niet voldoende. Vraag 4.5. Het gedeelte van het chromosoom wat verloren is gegaan zou een of meerdere cruciale tumorsuppressorgenen kunnen bevatten, en op het gedeelte dat erbij gekomen is zouden belangrijke protooncogenen kunnen liggen, bv een groeifactor. Een extra kopie kan in zo’n geval een teveel aan groeifactor veroorzaken. Vraag 4.6a. P16ink4a-p15INK4B: tumor suppressor, loss-of-function, beide allelen D-type cyclins : oncogene, gain-of-function in 1 allel (of loss-of-function in 2 allelen van een gen waarvan het eiwit deze cyclins remt) PRB: tumor suppressor, loss-of-function, beide allelen E2F: (zie legend bij Fig.1). Transcriptiefactor, geactiveerd door pRB, dus kennelijk heeft E2F een remmende werking op de progressie van de celcyclus. Het is dus een tumor-suppressorgen, dus loss-of-function, beide allelen Vraag 4.6b. Telomeren zijn overhangende enkelstrengs stukken DNA aan de einden van het chromosoom, die bij elke celdeling een stukje korter worden. Na een bepaald aantal celdelingen kan de cel zich niet meer goed delen omdat de einden te kort zijn geworden; veroudering van de cel. Hierbij lukt de replicatie van de chromosoomeinden niet goed meer, er ontstaan grove afwijkingen en dit resulteert meestal in apoptose van de cel. Het telomerase kan de telomere einden op lengte houden, waardoor de cel meer celdelingen door kan. Een kankercel zorgt ervoor dat op een of andere manier de telomeren op lengte gehouden worden, of de cel activeert weer de afschrijving van telomerase, waardoor dit hoger tot expressie komt, of er wordt een ander mechanisme geactiveerd. Vraag 4.6.c U verwacht in het Ras gen een gain-of-function mutatie. Daarvan zal er naar verwachting een zeer beperkt aantal zijn (itt loss-of-function mutaties, zie hoofdstuk 3 van het werkboek). U zou in de literatuur kunnen kijken of deze mutaties beschreven zijn en of er een simpele PCR te doen is waarmee zonder sequencen is vast te stellen of de mutatie aanwezig is. Makkelijk zou bv zijn als de plaats van de mutatie(s) deel uitmaakt van een restrictiesite (zie hoofdstuk 2) die verloren gaat in aanwezigheid van de mutatie. Door het PCR product te knippen met het juiste restrictie-enzym kan eenvoudig onderscheid gemaakt worden tussen wel/geen mutatie. De PCR producten worden op een gel op grootte van elkaar gescheiden.
pagina 6 van 13
Vraag 5.1. Mutaties in de noncoding gebieden van MLH1/MSH2 (bv promotergebied), of een epigenetische verandering (dus abnormale CpG methylering) in het promotergebied van een mismatch repair (MMR) gen, hetgeen niet met mutatiediagnostiek aan te tonen is. Daarnaast kunnen natuurlijk mutaties in de andere bekende, of nog onbekende, mismatch repair (MMR) genen aanwezig zijn. Vraag 5.2a. Vb. van een mononucleotide marker: AAAAAAAAAAAAAAAAAAA Dinucleotide marker: AGAGAGAGAGAGAGAGAGAG Een mononucleotide repeat in het coderende gedeelte van een gen kan bij mismatch repair deficiency (MMR) leiden tot een frame-shift doordat bij celdeling een nucleotide teveel of te weinig in het DNA gezet wordt. Dit leidt in het algemeen tot een prematuur stopcodon. In het eerste exon leidt dit tot “nonsensemediated decay” en dus zal geen eiwit gemaakt worden (wel natuurlijk van het andere normale allel, dus de helft van het eiwit is in principe nog aanwezig); in het laatste exon wordt het abnormaal korte eiwit dan wel gemaakt: dit kan wel of geen gevolgen hebben voor het functioneren van het eiwit, afhankelijk van de afwijking. In een intron hangt de consequentie af van de relevantie van het repeat-gedeelte voor bijvoorbeeld de regulatie van de transcriptie van het gen (er zitten in het eerste intron vaak regulatoire elementen, vergelijkbaar met die in een promoter gebied, mogelijk ook codes voor miRNAs). Maar vaak zal dit minder ernstige functionele consequenties hebben. Vraag 5.2b. Figuur 2 laat zien dat bij vergelijking van germ-line DNA (bovenste deel) en tumor DNA (onderste deel) een microsatelliet verschil zichtbaar wordt. Er zijn hier twee microsatelliet-markers gePCRed, Bat26 (een mononucleotide repeat) en D2S123 (een dinucleotide repeat). In het germ-line DNA blijken ze op beide chromosomen dezelfde lengte te hebben: homozygoot. In het tumor DNA blijkt 1 BAT26 een afwijkende lengte te hebben, en beide D2S123 allelen, wat duidt op microsatelliet-instabiliteit. Vraag 5.3. Omdat bij het I1307K polymorfisme in het APC gen een repeterende sequentie van een rij A’s ontstaat, waarop het DNA polymerase bij de celdeling makkelijk “slipt” waardoor er in de dochtercel een A te weinig of te veel voorkomt. En dat heeft wel desastreuze gevolgen! Vraag 5.4.a Kennelijk spelen MMR genen niet in alle celtypen dezelfde belangrijke rol, of omdat de cellen minder vaak delen of omdat bv andere reparatie-enzymen daar tot expressie komen die dezelfde werking hebben. Of de proto-oncogenen met microsatellieten in hun coderende gedeelte die na mutatie als oncogen een rol spelen bij de groei van colorectaaltumoren geven alleen groeivoordeel aan bepaalde celtypen, maar niet aan allemaal. Het zou ook nog kunnen dat epigenetisceh veranderingen die het tweede MMR allel moeten uitschakelen alleen voorkomen in bepaalde celtypen. Vraag 5. 4.b. Zie ook hoofdstuk 2 van het werkboek. Verandering van een aminozuur in een eiwit betekent niet automatisch dat de functie van het eiwit verandert, zoals dat bij premature stopcodons in principe wel het geval zal zijn. Een ander aminozuur in een eiwit hoeft ook niet altijd een veranderde functie te veroorzaken – hangt helemaal van de plaats en functie van het aminozuur binnen het eiwit af. Het is dus erg moeilijk/onmogelijk om vanuit een onbekende missense mutatie een voorspelling te doen tav de (klinische) consequenties.... Om de oorzakelijk rol van een mutatie bij een aandoening vast te stellen moet eerst de functieverandering aangetoond worden. Het eenvoudigste is om dat in vitro te doen, in een cellijn. Men heeft hiervoor een plasmide (een zogenaamde expressieplasmide) nodig met erin het coderend gedeelte van bv het MLH1 gen dat in dit geval niet door de eigen promoter aangestuurd wordt, maar door een artificiele promoter (bv. uit het CMV virus) die in het plasmide voor het coderend gedeelte is “geplakt”. De plasmide wordt gecloneerd (vermenigvuldigd) in E. Coli en vervolgens getransfecteerd (zie hoofdstuk 2 van het werkboek) in een cellijn. De CMV promoter zal, nu het plasmide in een cel zit, zorgen dat er continu MLH1 mRNA gemaakt wordt, en dus ook het MLH1
pagina 7 van 13
eiwit. Vervolgens kan een functietest ontworpen worden met behulp van de cel waarin het eiwit tot expressie komt. Eventueel kan het eiwit ook uit de cel geïsoleerd worden voor een in vitro test op functionaliteit. Met behulp van de site-directed mutagenesis techniek kan eenvoudig in het plasmide elke gewenste mutatie aangebracht worden in het coderende gedeelte van het MLH1 gen, waarna ook dit plasmide gecloneerd (vermenigvuldigd) en in een cellijn getransfecteerd wordt, dit keer met het doel om het abnormale eiwit tot expressie te brengen. Dan kunnen beide eiwitten functioneel met elkaar vergeleken worden. Vraag 5.4.c. Het geïsoleerde DNA knipt u met een (of meer) restrictieenzymen in kleine stukjes. U kiest restrictie-enzymen die knippen in het MSH2 gen (de plekken in het DNA sequentie waar een restrictieenzym knipt kunt u opzoeken op de site: http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html (indien gewijzigd, zoek met Google naar Webcutter). Het geknipte DNA denatureert u bij 1000C waardoor al het DNA enkelstrengs wordt. Met gelelectroforese worden de fragmenten op grootte van elkaar gescheiden. Het DNA op de gel wordt geblot. De blot wordt vervolgens geincubeerd met radioactief gelabelde DNA probes (ook enkelstrengs gemaakt), die verschillende gedeelte van het MSH gen herkennen. Als probe gebruikt u meestal cDNA dat gemaakt is van MSH2 RNA mbv reverse transcriptase, of gePCRred op genomisch DNA. Daarna is het radioactief gelabeld. (zie hoofdstuk 2 van het werkboek). De probe herkent de DNA fragmenten die de betreffende sequentie uit het MSH2 gen bevatten. Bedenk dat er in het DNA twee allelen aanwezig zijn. Als er een knipsite in een allel van het MSH2 gen weggevallen is door een deletie (of mutatie), dan is dat te zien op de blot doordat het fragment van het MSH2-gen dat gebonden wordt door de radioactieve probe langer is dan normaal. Er ontstaat dan een tweede bandje op de blot (naast het bandje van het normale allel) dat meer naar boven op de blot ligt. Vraag 6.1. Dat het gen niet meer wordt afgeschreven, dwz dat er geen mRNA meer van gemaakt wordt. Dit kan via verschillende mechanismen, een ervan is promoter CpG methylering. Vraag 6.2.a CpG eialnden bevinden zich in het promotergebied van bepaalde genen, waarbij ze een rol spelen bij het meer permanent aan- en afzetten (methylering van CpGs) van het gen. De Cs in deze gebieden zijn waarschijnlijk niet gemuteerd tijdens de evolutie omdat ze een belangrijke functie hebben en dus niet mogen verdwijnen. Vraag 6.2.b. ¼ x ¼ x ¼ x ¼ = 1/16 = 1/256 Dus theoretisch ongeveer 250 nucleotiden lang. Waarschijnlijk langer omdat relatief veel C’s gemuteerd zijn geraakt naar T’s, waarbij deze restrictieplaatsen verloren gingen. ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ x ¼ =1/4096 Gemiddeld ongeveer 4000 nucleotiden lang. Vraag 6.2.c. Hot spots zijn gemethyleerde C’s die door de-aminering (verwijdering van kunnen veranderen in een T (dus CG wordt TA). (link: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mga.figgrp.1027) . Methylering van C’s gebeurt alleen bij de dinucleotide CpG. Die komen voor in het promotergedeelte en in het coderende gedeelte van het gen. De promoter gebieden van genen zijn meestal niet CpG gemethyleerd, de coderende gedeelten wel, transcriptie geeft er geen last van. Als we de CpGs zoeken dan vinden we: CCGCCCTCCTCTCGCCCCAGGGACATATAAAGGCAGTTGTTGGCACACCCAGCCAGCAGACGCTCCCT CAGCAAGGACAGCAGAGGACCAGCTAAGAGGGAGAGAAGCAACTACAGACCCCCCCTGAAACAACCCT CAGACGCCACATCCCCTGACAAGCTGCCAGGCAGGTTCTCTTCCTCTCA met ser thr glu ser met ile arg asp val glu leu CATACTGACCCACGGCTTCACCCTCTCTCCCCTGGAAAGGACACC ATG AGC ACT GAA AGC ATG ATC CGG GAC GTG GAG CTG Een mogelijk hot spot zou kunnen zijn: de C uit CGG (Arg) en de C uit GAC (Asp). De eerste mutatie heeft als consequentie vervanging van Arg door Trp; de tweede is een neutrale mutatie waardoor geen aminozuur verandert.
pagina 8 van 13
In celtypen waar het TNFα gen inactief is, zou het promotergebied wel gemethyleerd kunnen zijn, in dat geval vormen de voorkomende CpGs ook mogelijke hot spots. In dat geval heeft vervanging door een T alleen consequenties als daardoor de transcriptieregulatie beïnvloed wordt, bv in een response element of doordat minder methylering kan plaatsvinden. Vraag 6.3.a. Ze binden speciale CpG-bindende eiwitten, die een rol spelen bij het minder toegankelijk maken van het DNA voor transcriptiefactoren doordat histone-eiwitten uit het chromatine gedeacetyleerd worden (daardoor worden deze eiwitten minder negatief geladen en binden steviger aan het DNA). Daarnaast interfereren methylgroepen (en bindende eiwitten) mogelijk direct met binding van transcriptiefactoren aan hun response element. Vraag 6.3.b. Bij de evolutionair geconserveerde CpG’s, mn ook die CpG’s die onderdeel uitmaken van een geconserveerd response element. Vraag 6.3.c. Verlies van imprinting: dan functioneert het IGF2 gen als een oncogen en stimuleert celgroei. Heterozygote loss-of-function mutatie: Als de mutatie op het ge-imprinte allel ligt gebeurt er niets, als het op het actieve allel ligt resulteert het in een volledig verlies aan IGF in die cel. De keuze welk X-chromosoom door imprinting geïnactiveerd zal worden gebeurt random, zodat een mozaïek zal ontstaan van cellen die wel en cellen die geen IGF maken. In het algemeen zal er in een orgaan ongeveer de helft van de normale hoeveelheid IGF geproduceerd worden. Vraag 7.1.a. Verschillende combinaties van een loss-of-function mutatie, deletie met LOH, en CpG methylering van de MLH1 promoter. Hierdoor ontstaat volledig verlies van het MLH 1 tumorsuppressoreiwit, microsatellietinstabiliteit met als gevolge colon adenoom en carcinoom. Vraag 7.1.b. Het vinden van abnormaal gemethyleerde genen kan een aanwijzing zijn dat het om een maligne cel gaat, het gemethyleerde gen zelf hoeft daarbij geen rol te spelen. De methylering op zich betekent dus niet automatisch dat het verlies van HPRT2 functie een causale rol heeft gespeeld bij het ontstaan van dit carcinoom. Misschien kwam dit gen in een niet-maligne colonepitheelcel wel helemaal niet tot expressie. Een afwijkend methyleringsmechanisme, geassocieerd met een maligniteit, heeft vaak als gevolg dat promotergedeelten van veel genen abnormaal gemethyleerd zullen worden. Bij de meeste heeft dat waarschijnlijk geen ernstige consequenties. Vraag 7.1.c. Nee, de verminderde aanmaak van mRNA die te zien is op de microarray kan het gevolg zijn van een mutatie in bv. het promotergebied van Hic-1 waardoor een belangrijke transcriptiefactor niet meer bindt, of in het poly-adenylatiesignaal waardoor de polyA-staart niet goed gemaakt wordt, of er is een prematuur stopcodon waardoor het RNA wordt afgebroken, maar ook methylering van de promoter kan een rol spelen, mits er een CpG eiland in het promotergebied aanwezig is. Verder zou het natuurlijk ook een indirect gevolg kunnen zijn van een epigetische of genetische afwijking in een ander gen dat belangrijk is voor de aanmaak van Hic-1. Vraag 7.2.a. Twee soorten: transcriptioneel actief euchromatine (hier kunnen dus genen afgeschreven worden en mRNA gemaakt), en heterochromatine waarbinnen geen transcriptie kan plaatsvinden: silent chromatin. Chromatine is opgebouwd uit histone-eiwitten. Verschillende post-translationele modificaties (acetylering, phosphorylering, methylering van bepaalde amnozuren in de histone eiwitten) aan deze histone-eiwitten bepalen de toegankelijkheid van het onderliggende DNA voor transcriptiefactoren, en dus de mogelijkheid het DNA te gebruiken en genen af te schrijven. Ze kunnen in elkaar overgaan, afhankelijk van het wel of niet plaats vinden van transcriptie op een gedeelte van een chromosoom. Sommige stukken van het genoom zijn echter tijdens de differentiatie vrij permanent geïnactiveerd door histon-eiwit veranderingen samen met DNA methylering die samen leiden tot heterochromatine.
pagina 9 van 13
Vraag 7.2.b. Door een mutatie in een transcriptiefactor-gen zou de veranderde transcriptiefactor DNMT1 kunnen binden en meenemen naar de promoters van genen, die vervolgens gemethyleerd zouden kunnen worden. Als daar tumorsuppressorgenen bij zijn worden die geïnactiveerd. Vraag 7.2.c. Nucleosomen bestaan uit een octameer van vier verschillende histone-eiwitten, waaromheem twee strengen DNA gewikkeld zijn, samen ongeveer 140-150 nucleotiden. In niet actief afgeschreven DNA liggen de nucleosomen op regelmatige afstanden als beads on a string. Transcriptiefactoren kunnen niet bij het DNA van de nucleosomen komen om transcriptie te initiëren. Daarvoor moet het nucleosoom zich eerste “ontrollen”. Vraag 7.2.d. Histone 3 (H3):
Histone 4 (H4)
Zonder veranderingen → silencing? Methylering lysine 9 → silencing effect Methylering lysine 4 → activering transcriptie Acetylering lysine 14 → activering transcriptie Fosforylering serine10 en 18 → celdeling Fosforylering serine 10, methylering lysine 14: activering transcriptie Zonder veranderingen → silencing? Acetylering lysine 8 + 16 → activering transcriptie
Vraag 7.3.a Bij een celdeling wordt het als cytosine geïncorporeerd in het nieuw gemaakte DNA, echter zit op de 5 positie in de chemische ring een N in plaats van een C, waardoor er daar geen methyl (NH3) groep meer aangezet kan worden. De delende cellen verliezen dus de CpG methylering. Bijwerkingen kunnen potentieel ontstaan doordat normaal wel gemethyleerde genen nu gedemethyleerd raken en transcriptioneel actief worden. Vraag 7.3.b. This phenomenon suggests that prolonged drug regimens will be necessary to maintain the inhibition of DNA methylation and preserve transcriptionally repressive active chromatin. Vraag 7.3.c. Een verandering in methyleringspatroon zit steeds op dezelfde plek in de promoter van een gen en is dus makkelijker met de juiste methyleringsgevoelige PCR (bisulphate-PCR) aan te tonen dan een loss-of-function mutatie die overal in een gen kan zitten. Vraag 7.3.d. Omdat voor de bisulphite PCR voor het aantonen van gemethyleerde promoter andere primers zijn gekozen waardoor het PCR product korter is. We weten overigens niet hoeveel korter, want datis van het plaatje niet af te lezen. Er zijn verschillende mogelijkheden om een PCR te ontwerpen om CpG methylering aan te tonen. In dit geval zijn de primers waarschijnlijk zo gekozen dat ze binden op een plek waar CpG sites zitten. Een primer die daar G heeft staan zal alleen binden in geval van gemethyleerde CpG’s. Een primer die op die plek een A heeft staan zal alleen binden in geval van ongemethyleerde CpG’s waarvan de C veranderd is in een U. Door deze twee primers op iets verschillende plekken te kiezen ontstaan afhankelijk van de gebruikte primer een langer of een korter PCR product. Het PCR product wordt vervolgens gesequenced om eventuele tussenliggende CpG sites te karakteriseren mbt methylering. Niet alle CpG sites binnen een CpG eiland hoeven gelijkelijk gemethyleerd te zijn. AGACGATACGTTGAATGAATGCGGAG………ATGCCTGATAACGAGTCGAACGATGCCACGTGAACTATT GCCCCG TGCTATGCAACTTACTTACGCCT→ ←ACTATTGCTCAGCTTGCTACGGTGC TCTACTATACAACTTACTTACG → ←TTACTACGGTACACTTGATAACGGG
pagina 10 van 13
Vraag 7.4. Pathogenese: Abnormale methylering van de promoter van tumor-suppressorgenen leidt tot verlies van tumor-suppressoreiwit. Verlies van promoter methylering (imprinting) kan een oncogen activeren. Verlies van DNA methylering rond de centromeer van het chromosoom leidt tot genetische instabiliteit. Uiteindelijk kan dit allemaal bijdragen tot het ontstaan van een maligniteit. Onderzoek naar de functie van gemethyleerde genen geven inzicht in de tumorsuppressoreiwitten die een rol spelen bij het ontstaan van de maligniteit Vroege diagnostiek: in sputum, urine lymfklieren etc. kan met behulp van de methylering gevoelige PCR gemethyleerde genen aangetoond worden, mogelijk voordat de tumor maligne ontaard is. Prognostisch: methylering van bepaalde genen kan een aanwijzing geven over de lange termijn prognose Methylering van bepaalde DNA-reparatie eiwitten kan betekenen dat er een verhoogde gevoeligheid bestaat voor bepaalde alkylerende cytostatica (omdat de schade niet meer gerepareerd kan worden in de tumorcel). Vraag 8.1. Verbeteren van de sensitiviteit van de fecale DNA test. Toevoegen van meer markers aan het panel: Methyleringsgevoelige PCR om methylering van MLH1 promoter te detecteren Dinucleotide repeat marker D2S123 Veel voorkomende mutaties in MLH1, MSH2, MSH6 Voor de toekomst zou het waarschijnlijk ook efficiënter zijn om de verschillende mutaties met behulp van een microarray te detecteren. We komen op deze techniek in een latere opdracht terug. Vraag 8.2 Deze verrijkingsstap is nodig omdat er voornamelijk bacterieel DNA in het sample zit. (En misschien ook nog resten DNA uit de voeding) Vraag 8.3 Volgens de theorie van Vogelstein zou je kunnen verwachten dat naarmate het adenoom evolueert, er naast APC meer markers positief zouden worden. Dit lijkt mogelijk het geval te zijn voor p53, maar niet zozeer voor K-ras Opmerkelijk is ook dat bij patiënten zonder poliepen er toch positieve uitkomsten waren. De vraag is natuurlijk of deze mensen t.z.t. poliepen ontwikkelen, die bijvoorbeeld bij de coloscopie nog gemist waren. Opmerkelijk verder is dat bij High grade dysplasia zowel long DNA als K-ras vaak positief waren. De microsatelliet marker geeft geen evidente informatie in het adenoomstadium. Echter statistiek ontbreekt op deze tabel zodat de betekenis van de onderlinge verschillen niet duidelijk is. Vraag 9.1 Er wordt bedoeld dat het eiwit PTEN (en het gen) sterk lijkt op het eiwit (gen) tensin. Vraag 9.2 PTEN remt de deling en migratie van een cel (door sterkere adhesie van de cel aan de extracellulaire matrix, hierdoor kan metastasering geremd worden) en speelt een rol in apoptose. Vraag 9.3. Overexpressie van ErbB2 (HER2) wordt meestal veroorzaakt worden door amplificatie van het gen voor ErbB2 in het tumor genoom. Dat wordt nu aangetoond op eiwitniveau mbv immuunhistochemie op een weefselcoupe waarbij meer dan normaal HER2-kleuring te zien is. Een andere manier is met FISH (zie werkboek: technieken) direct het aantal genkopieën in de cellen van een weefselcoupe te bekijken. In de toekomst kan dit waarschijnlijk ook goed (en veel nauwkeuriger) met DNA sequencing technieken. Vraag 9.4 a. Indien niet gefosforyleerd, dus als de ErbB2 receptor niet geactiveerd is, remt PTEN het PI3K zodat PIP3 en Akt niet meer gefosforyleerd kunnen worden. PIP3 versterkt de kinase activiteit van PI3K, maar is zelf geen kinase (en ook geen eiwit!). b. Trastuzumab zorgt dat de ErbB2 receptor niet meer in contact komt met Src, waardoor het Src eiwit geinactiveerd wordt, en PTEN niet langer gefosforyleerd wordt. PTEN kan nu PI3K remmen zodat Akt en PIP3 niet gefosforyleerd worden.
pagina 11 van 13
c. De deactivering van Src met als gevolg remming van de PI3K–Akt stap door PTEN is kennelijk essentieel voor het werkingsmechanisme van Trastuzumab. In afwezigheid van PTEN bindt Trastuzumab waarschijnlijk nog wel aan ErbB2, en inactiveert Src, maar er kan geen PTEN geactiveerd worden, en een remmend effect op het tumorigene signaal blijft achterwege: resistentie Vraag 9.5 Mogelijk is er een deletie of mutatie in het gen voor PTEN, waardoor er onvoldoende eiwit in de cel gemaakt wordt. In afwezigheid van PTEN bindt Trastuzumab waarschijnlijk nog wel aan ErbB2, en inactiveert Src, maar er kan geen PTEN geactiveerd worden, en een remmend effect op het tumorigene signaal blijft achterwege: resistentie. Om dit vermoeden te bevestigen kunt u met een simpele immunohistochemistry test op een weefselcoupe kijken hoeveel PTEN nog aanwezig is. Andere nieuwere technieken zouden aanvullende informatie kunnen geven over de hoeveelheid PTEN, bv een quantitatieve PCR op het mRNA voor PTEN, of sequencing van het PTEN gen om een deletie of mutatie op te sporen Andere oorzaken kunnen een overactiviteit van ErbB2 of PI3K eiwitten zijn, als gevolg van een gain-offunction mutatie of gen amplificatie. En soms is er nog geen oorzaak te vinden. Vraag 9.6 Bij die patiënten wordt de helft van de normale hoeveelheid PTEN eiwit gemaakt, door het normale allel. Kennelijk is bij het PTEN gen de helft al onvoldoende voor een “normale” functie van het eiwit (we noemen dat haplo-insufficiëntie). Met een medicijn dat zou aangrijpen op bv. de promoter van het PTEN gen zou de transcriptie, en eiwit-aanmaak, kunnen toenemen. Bijvoorbeeld een klein molecuul (kan makkelijk de cel in) wat een remmende (“silencing”) transcriptiefactor zou kunnen blokkeren. Een medicijn zou echter ook kunnen aangrijpen op de turnover van mRNA of PTEN-eiwit. Hiervoor is in het algemeen wel één normaal functionerend gen nodig. Vraag 10.1 De referentiegenen zouden in gelijke mate bij elk individu tot expressie moeten komen, ze geven dus aan of de RNA isolatie en de RT-PCR reactie goed gegaan zijn Vraag 10.2 Het patiëntenmateriaal bestaat nooit uit homogeen tumormateriaal, zonder andere celtypen. Andere celtypen die aanwezig zijn in het tumor-sample kunnen de totale mRNA hoeveelheid van de 21 assay-genen (bv. een oncogen als HER2) beïnvloeden waardoor de “recurrence score” niet meer goed werkt. Het gebruikte criterium is dat minstens 5% van het preparaat uit tumorcellen moet bestaan, en bij minder dan 50% tumorcellen worden de stukken zonder tumorcellen verwijderd. Er lijkt nog een grote mate van variabiliteit toegestaan te zijn. Lees ook de ingezonden commentaar-brieven: NEJM 2005, 352:1605-1607. Vraag 10.3 De procedure heet FISH (Fluorescent In Situ Hybridization). Chromosomaal DNA in tumorweefselcoupes of tumorchromosomen wordt gedenatureerd waardoor het DNA enkelstrengs wordt. Een stukje DNA (DNA probe) waarvan de nucleotidenvolgorde identiek is aan een stuk sequentie in het ErbB2 gen in het chromosomale DNA wordt fluorescerend of radioactief gemerkt. De probe wordt gedenatureerd tot enkelstrengs DNA en de enkel-strengs DNA fragmenten zullen binden (hybridiseren) aan hun complementaire sequenties op het chromosomale DNA. Het aantal plekken op de chromosomen waar vervolgens een (radioactief of fluorescerend) signaal gevonden wordt, geeft aan hoeveel kopieën van de gezochte sequentie (dus het gen) aanwezig waren in de tumorcel (de normale twee allelen, of meer of minder dan twee). Amplificatie betekent in dit geval dat er meer dan de normale twee kopieën gevonden worden. Als alle drie allelen actief gebruikt worden om mRNA van te maken resulteert dat in overexpressie van ErbB2. Misschien is de amplificatie veroorzaakt door chromosomale instabiliteit, misschien is al eerder een cel ontstaan met deze genomische fout erin die een groot groeivoordeel gaf.
pagina 12 van 13
Vraag 10.4 Er zijn vele mogelijkheden te verzinnen: Selectie voor cellen met een mutatie in een onbekend gen (bv een tyrosine-kinase receptor voor een groeifactor), of bv amplificatie van het HER2 oncogen, waardoor een signaaltransductiepad geactiveerd wordt dat het negatieve signaal via Tamoxifen-oestrogeenreceptor teniet doet. Tamoxifen bereikt de maligne cellen onvoldoende, bv te snelle afbraak. Er is selectie opgetreden van een maligne cel met een mutatie in de oestrogeenreceptor waardoor die geen Tamoxifen meer bindt. Vraag 10.5 Voordelen 21-genen assay: op paraffine/gefixeerd materiaal, goedkoper dan microarray, makkelijker reproduceerbare resultaten, en eenvoudig te interpreteren. Dus ideaal voor (routine) klinische setting. Nadelen: bepaalde informatieve genen kunnen afwezig zijn in het samengestelde panel en wel aanwezig zijn in de microarray. Dat is echter in een research setting (bv academisch ziekenhuis) belangrijker dan in een puur klinisch diagnostische setting (perifeer ziekenhuis). Door gebruik van beperkt aantal genen waarschijnlijk alleen bruikbaar voor specifieke situatie (in dit geval niet bruikbaar zonder adjuvant-behandeling). Vraag 10.6 Een aantal genen van het panel zijn zogenaamde oestrogeen-gevoelige genen, dus genen waarvan de afschrijving omhoog gereguleerd wordt door oestrogenen via de oestrogeenreceptor in de cel. Dat betekent dat deze genen verhoogd tot expressie komen bij tumoren waarbij de oestrogeen-receptor in de tumorcellen aanwezig is. Als de bijbehorende eiwitten een oncogene werking hebben, en Tamoxifen via de oestrogeenreceptor de expressie ervan zal verlagen, voorspelt de test dus eigenlijk de anti-tumorrespons op Tamoxifen. Als geen adjuvant behandeling gegeven wordt, heeft de test dus geen waarde.
=*=*=
pagina 13 van 13
