Antioxidánsok szerepe a fehérje diszulfid kötések kialakulásában

Antioxidánsok szerepe a fehérje diszulfid kötések kialakulásában

Ph.D. értekezés

Szarka András Semmelweis Egyetem, Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézet 2002. 7pPDYH]HW Dr. Bánhegyi Gábor egyetemi docens 3URJUDPYH]HW Dr. Mandl József egyetemi tanár Semmelweis Egyetem, Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

„Ascorbic acid oxidase oxidizes the acid with oxygen to reversible dehydroascorbic acid, whereby the oxygen unites with the two labile Hatoms from the acid to form hydrogen peroxide. This peroxide reacts with peroxidase and oxidizes a second molecule of ascorbic acid. Both these molecules of dehydro-ascorbic acid again take up hydrogen from the foodstuff, possibly by means of SH-groups.” / Albert Szent-Györgyi /

2

5g9,'Ë7e6-(*<=e. %(9(=(7e6 ,52'$/0,È77(.,17e6 1.1. POSZTTRANSZLÁCIÓS MÓDOSULÁSOK ...................................................................................................... 7 1.2. A FEHÉRJE DISZULFID HIDAK KIALAKULÁSA ............................................................................................ 8 1.2.1. EGY KIS DISZULFIDKÉMIA ...................................................................................................................... 8 1.2.2. A DISZULFID KÖTÉSEK IN VIVO KIALAKULÁSA .................................................................................... 10 1.2.2.1. DISZULFID KÖTÉSEK KIALAKULÁSA PROKARIÓTÁKBAN ................................................................... 11 1.2.2.1.1. AZ OXIDATÍV ÚTVONAL ................................................................................................................. 11 1.2.2.1.1.1. DSBA, A PRIMER OXIDÁZ ............................................................................................................ 11 1.2.2.1.1.2. A-TÓL A B-IG .............................................................................................................................. 13 1.2.2.1.1.3. AZ ÚT B............................................................................................................................... 15 1.2.2.1.2. AZ IZOMERIZÁCIÓS ÚTVONAL ........................................................................................................ 17 1.2.2.1.2.1. DSBC, DSBG .............................................................................................................................. 18 1.2.2.1.2.3. AZ OXIDATÍV ÉS AZ IZOMERIZÁCIÓS ÚT ELVÁLASZTÁSA ............................................................. 21 1.2.2.2. DISZULFID KÖTÉSEK KIALAKULÁSA EUKARIÓTÁKBAN ..................................................................... 23 ........................................................................ 23 1.2.2.2.1. D 1.2.2.2.1.1. A-TÓL, AVAGY A PROTEIN DISZULFID IZOMERÁZTÓL .................................................................. 23 1.2.2.2.1.1.1. A PDI MINT ENZIMKOMPLEXEK ALEGYSÉGE ........................................................................... 25 1.2.2.2.1.2. LÉPÉS B-RE, AVAGY AZ ENDOPLAZMÁS RETIKULUM OXIDÁZ ERO1........................................... 26 ! "$#% & & 1.2.2.2.1.3. A FAD ................................................................................................. 29 1.2.2.2.1.4. AZ ALTERNATÍV ÚTVONAL: ERV2.............................................................................................. 31 ") ' ................................................................................................................ 35 1.2.2.2.1.5. F ' (% 1.2.2.3. A TEREMTÉS KORONÁJA ................................................................................................................... 37 1.2.2.4. KIS MOLEKULASÚLYÚ VEGYÜLETEK LEHETSÉGES SZEREPE A DISZULFID KÖTÉSHEZ KAPCSOLT ELEKTRONTRANSZFERBEN ............................................................................................................................. 41 1.2.2.4.1. ANTIOXIDÁNSOK ÉS ELEKTRONTRANSZFER: A GLUTATION, A C-VITAMIN ÉS AZ E-VITAMIN ......... 42 1.2.2.3.1.1. A GLUTATION ÉS AZ ASZKORBÁT TRANSZPORTJA ....................................................................... 46 1.2.2.4.2. A K-VITAMIN, AZ UBIKINON ÉS MÁS LEHETSÉGES JELÖLTEK ......................................................... 48

+,327e=,6e6&e/.,7 =e6(. 0Ï'6=(5(. 3.1. PATKÁNYMÁJ FRAKCIÓK PREPARÁLÁSA ............................................................................................ 53 3.2. AZ ASZKORBINSAV OXIDÁCIÓJÁNAK MÉRÉSE ......................................................................................... 53 3.3. A MIKROSZÓMA E-VITAMIN-TARTALMÁNAK MEGHATÁROZÁSA ............................................................ 54 3.4. ASZKORBIL GYÖK MEGHATÁROZÁSA, ELEKTRON SPIN REZONANCIA MÉRÉSEK ...................................... 55 3.5. FEHÉRJE TIOLOK MÉRÉSE........................................................................................................................ 55 3.6. A MIKROSZÓMA FRAKCIÓ KARAKTERIZÁLÁSA ....................................................................................... 56 3.6.1. CITOKRÓM C OXIDÁZ AKTIVITÁS MEGHATÁROZÁSA ............................................................................ 56 3.6.2. GLUKURONIL-TRANSZFERÁZ AKTIVITÁS MEGHATÁROZÁSA ................................................................ 56 3.6.3. GLUKÓZ-6- FOSZFATÁZ AKTIVITÁS MEGHATÁROZÁSA ........................................................................ 57

(5('0e1<(. 4.1. MIKROSZÓMÁLIS ASZKORBÁT OXIDÁCIÓ A MÁJ ENDOPLAZMÁS RETIKULUMÁBAN ................................. 58 4.2. AZ ASZKORBINSAV ÉS A PROTEIN TIOLOK OXIDÁCIÓJA ........................................................................... 61 4.3. GULONOLAKTON OXIDÁZ DEPENDENS FEHÉRJE TIOL OXIDÁCIÓ ............................................................. 64 4.4. AZ ASZKORBÁT OXIDÁCIÓ JELLEMZÉSE .................................................................................................. 68 4.4.1. AZ ASZKORBÁT OXIDÁCIÓS AKTIVITÁS LOKALIZÁCIÓJA ...................................................................... 68

3

4.4.2. AZ ASZKORBÁT OXIDÁCIÓ GÁTLÁSA.................................................................................................... 70 4.4.3. AZ ASZKORBINSAV OXIDÁCIÓ PRIMER VOLTA, AVAGY A REAKTÍV OXIGÉN SPECIESEK SZEREPE .......... 73 4.4.4. AZ ASZKORBÁT OXIDÁCIÓ GÁTLÁSÁNAK HATÁSA A FEHÉRJE TIOLOK OXIDÁCIÓJÁRA ......................... 74 $%* #" -),.. - "/01 # +#2 3 "

+ ,

4 ................................ 76 4.5. AZ E-VITAMIN- 4.5.1. AZ E-VITAMIN-MENTES DIÉTA PATKÁNYOKRA GYAKOROLT HATÁSA .................................................. 76 -),.. - "/01 #+#2 3

4 E-VITAMIN-HIÁNYOS MÁJ MIKROSZÓMÁBAN ................ 76 4.5.2. ASZKORBÁT4.5.3. ASZKORBÁT HATÁSA AZ E-VITAMIN-HIÁNYOS MIKROSZÓMÁK LIPID PEROXIDÁCIÓJÁRA .................... 78 5.1. AZ ASZKORBINSAV MIKROSZÓMÁLIS OXIDÁCIÓJA .................................................................................. 81 5.2. AZ ASZKORBÁT OXIDÁZ AKTIVITÁS JELLEMZÉSE .................................................................................... 82 5.3. JÓSLÁS: A MÁJ ASZKORBÁT OXIDÁZA EGY KUPROENZIM? ...................................................................... 84 5.4. ASZKORBINSAV OXIDÁCIÓ DEPENDENS MIKROSZÓMÁLIS FEHÉRJE TIOL OXIDÁCIÓ................................. 85 5.5. AZ E-VITAMIN A MIKROSZÓMÁLIS ELEKTRONTRANSZFERBEN ................................................................ 87

g66=()2*/$/È6 ,52'$/20-(*<=e.

4

Rövidítésjegyzék PDI

protein diszulfid izomeráz

Dsb

disulfide bond

NMR

nuclear magnetic resonance

ER

endoplazmás retikulum

MTP

mikroszómális trigliceridtranszfer protein

DTT

ditiotreitol

ERO

endoplasmic reticulum oxidase

AMS

4-acetamide-4'-maleimidylstilbene-2,2'-disulfonic acid

AUG

augmenter of liver regeneration

ERV

essential for respiration and vegetative growth

UPR

unfolded protein response

AA

ascorbic acid

DHA

dehydroascorbate

HEPES

4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid

MOPS

3-(N-morpholino) propanesulfonic acid

HPLC

high pressure liquid chromatography

UV-VIS

ultra violet - visiable

ESR

elektron spin rezonancia

DTNB

ditio-nitro-benzoát

TBARS

tiobarbiturate reactive substance

5

Bevezetés $VHMWELROyJLDHJ\LNQDSMDLQNLJLVPHJROGDWODQNpUGpVHD]HOV VRUEDQV]HNUpFLyV

IHKpUMpNEHQHO IRUGXOyGLV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiVD$IRO\DPDWDODSYHW HQR[LGiFLyV

MHOOHJ $WLROFVRSRUWRNGLV]XOILGN|WpVHNNpDODNXOiVDNpWHOHNWURQWUDQV]IHUpYHOMiUHJ\WW A kötések kialakulásában és az elektrontranszferben fehérje és nem fehérje

NRPSRQHQVHNE OiOOyUHQGV]HUYHV]UpV]W'ROJR]DWRPHOV UpV]pEHQDGLV]XOILGN|WpVHN iOWDOiQRVLVPHUWHWpVpWN|YHW HQ|VV]HIRJODORPDSURNDULyWDD]HXNDULyWDpVDKXPiQ

rendszer jelenleg ismert fehérje és nem fehérje komponenseit. Az értekezés második része tartalmazza a kis molekulasúlyú antioxidánsok elektrontranszferben betöltött szerepével kapcsolatos kísérleteinket és azok megvitatását.

6

1. Irodalmi áttekintés 3RV]WWUDQV]OiFLyVPyGRVXOiVRN $WUDQV]OiFLyVRUiQV]LQWHWL]iOWIHKpUMHOiQFRNMHOHQW VUpV]HWRYiEELUHDNFLyNWiUJ\DOHV]

KRJ\HOQ\HUMHYpJV ELROyJLDLODJDNWtYIRUPiMiW(]HNHWDWUDQV]OiFLyWN|YHW IHKpUMHOiQFRW

pULQW UHDNFLyNDW|VV]HIRJODOyDQSRV]WWUDQV]OiFLyVPyGRVXOiVRNQDNQHYH]]N

Poszttranszlációs módosulásokon mind a prokarióta, mind az eukarióta sejtek fehérjéi keresztülmennek.

$PyGRVXOiVRNHJ\UpV]HSpOGiXODV]LJQiOV]HNYHQFLiNOHKDVtWiVDD]HO IHKpUMpN proteolítikus hasítása nem igényel kofaktort. A módosulások nagyobb része azonban kofaktorigényes folyamat, a sorból néhány folyamatot kiragadva: egyes fehérjék szerin, treonin és tirozin részletei foszforilálódnak (kofaktorként ATP-t igényelve); több véralvadási faktor aszpartát és glutamát részletei további karboxil csoportokkal egészülnek ki (kofaktorként K-vitamint igényelve); izomfehérjék és a citokróm c lizin részletei PHWLOiOyGKDWQDNNRIDNWRUNpQW1DGHQR]LOPHWLRQLQWLJpQ\HOYH $NROODJpQHNI

V]HUNH]HWDONRWyMDDKLGUR[LSUROLQDV]NRUELQVDYDWLJpQ\O IRO\DPDWVRUiQMXWKR]]iKLGUR[LO csoportjához. A glikoproteinekre is poszttranszlációs módosulásuk során kerül fel szénhidrát oldalláncuk. Több bakteriális és eukarióta fehérje igényel aktivitásához kovalensen kötött prosztetikus csoportot. Ezen csoportok is a fehérjelánc riboszómáról

W|UWpQ WiYR]iVDNRUpSOQHNEH3pOGDNpQWHPOtWKHWMNDNRYDOHQVHQN|W|WWELRWLQWaz acetil-

CoA karboxiláz esetében, valamint a hem csoportot a citokróm c esetében.

$]H[SRUWUDNHUO IHKpUMpNEHQJ\DNUDQDODNXOQDNNLNRYDOHQVGLV]XOILGN|WpVHNOiQFN|]LpV láncok közötti cisztein részletek között natív konformációjuk kialakulásakor. Az így kialakult diszulfid kötések segítenek a natív fehérjeszerkezet PHJ U]pVpEHQD]

LQWUDFHOOXOiULVWyORO\NO|QE|] YLV]RQ\RNN|]|WW

7

$IHKpUMHGLV]XOILGKLGDNNLDODNXOiVD A diszulfid híd kovalens kötés, mely két cisztein tiol csoportja között alakul ki. Diszulfid hidak csak ritkán alakulnak ki intracelluláris fehérjékben. Ezen ritka esetekben is legtöbbször egyes enzimek katalítikus, tranziens állapotában jönnek létre, vagy

HQ]LPUHJXOiFLyVV]HUHSHWW|OWHQHNEH $]HO ] HNNHOHOOHQWpWEHQJ\DNUDQ PHJWDOiOKDWyDNV]HNUpFLyVIHKpUMpNEHQHOHQJHGKHWHWOHQHNDPHJIHOHO VWUXNW~UD

NLDODNtWiViKR]VWDELOL]iOMiNDIHKpUMHV]HUNH]HWHW$GLV]XOILGKLGDNHJ\HQO WOHQHORV]OiVDD]

LQWUDpVH[WUDFHOOXOiULVIHKpUMpNN|]|WWD]HOWpU UHGR[YLV]RQ\RNNDOPDJ\DUi]KDWy (J\NLVGLV]XOILGNpPLD $GLV]XOILGKLGDNNLDODNXOiVDWXODMGRQNpSSHQR[LGiFLyVIRO\DPDWtJ\pUWKHW KRJ\D

FLWRV]ROUHGXNiOyN|UQ\H]HWHJiWROMDDGLV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiViW0iVUpV]U ON|QQ\HQ

pUWKHW KRJ\DSURNDULRWiNSHULSOD]PiMiQDNYDODPLQWD]HXNDULRWiNHQGRSOD]PiV

retikulumának oxidatívabb környezete mind kialakulásukat, mind a már kialakult diszulfid hidak fennmaradását támogatja. Sokáig úgy gondolták, hogy a citoplazma és a periplazma, valamint eukarióták esetében az endoplazmás retikulum között fennálló redox különbségek IHOHO VHNDSHULSOD]PiEDQpVD]HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPEDQPHJOHY DFLWRSOD]PiEyO

KLiQ\]yGLV]XOILGNpS] GpVpUW$]HOP~OWWt]HV]WHQG EHQD]RQEDQYLOiJRVViYiOWKRJ\

mind a periplazmában, mind az endoplazmás retikulumban specifikus katalítikus UHQGV]HUHNIHOHO VHNDPHJIHOHO GLV]XOILGKLGDNNLDODNtWiVipUW

Vizsgáljuk meg a diszulfid kötés kialakulásának folyamatát. Az 1.1. ábrán látható a reakció

iOWDOiQRVVpPiMD$IHOV Q\tOLUiQ\iED]DMOyIRO\DPDWDWLROFVRSRUWRNR[LGiFLyMDD]DOVy

nyíl irányába zajló pedig a diszulfid kötés redukciója. Ahogy az egyenlet is elárulja, a tiol

R[LGiFLyKR]PHJIHOHO HOHNWURQDNFHSWRUUDDGLV]XOILGN|WpVUHGXNFLyMiKR]SHGLJPHJIHOHO elektrondonorra van szükség.

8

R-S-S-R‘ + 2e- + 2H+

R-SH + R‘-SH 1.1. ábra

A tiol-diszulfid átalakulás általános sémája $]pO V]HUYH]HWHNEHQ]DMOyGLV]XOILGNpS] GpVNDWDOL]iOWpVV]LJRU~DQV]DEiO\R]RWW folyamat, amely a „diszulfid donor” (elektronakceptor) és a célfehérje (elektrondonor) közti tiol-diszulfid csere során jön létre. Tehát ezen reakciók során nettó diszulfid kötések nem

NpS] GQHNpVQHPERPODQDNIHOHJ\V]HU HQFVDNNLFVHUpO GQHNiWYiQGRUROQDNNpWWLROSiU között (1.2.ábra). SH

S

S +

R SH

HS

R

R’

R’ S

S Diszulfid donor

HS

1.2. ábra

$WLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpViOWDOiQRVPHFKDQL]PXVD Amíg egy fehérje csak két cisztein tiolt tartalmaz, a kialakuló diszulfid híd csak ezen két aminosavrészlet között jöhet létre. A három vagy több cisztein tiolt tartalmazó

IHKpUMHOiQFRNEDQIHQQiOODOHKHW VpJHKRJ\DGLV]XOILGKtGQHPDPHJIHOHO WLROFVRSRUWRN

között alakul ki (49). Ezen hibásan kialakult diszulfid kötések elektron transzfert nem

NtYiQyiWUHQGH] GpVVRUiQL]RPHUL]iOyGKDWQDNIHOYpYHDKHO\HVNRQIRUPiFLyWiEUD R

S

R R

Diszulfid izomeráz

R

SH

S

R

S

SH

R

S

1.3. ábra

$GLV]XOILGL]RPHUi]P N|GpVH

9

$WLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVPHFKDQL]PXViWPHJYL]VJiOYDDUUDD]HUHGPpQ\UHMXWRWWDN

KRJ\D]pUNH] WLROiWDQLRQQXNOHRILOWiPDGiVWLQGtWDGLV]XOILGN|WpVHJ\LNWDJMDHOOHQtJ\ tiolát anion formájában felszabadítva a diszulfid kötés másik tagját (1.4. ábra). R’

-

S +S R

S

R’ ’

[ R’

S

S

S

R’ ’

]

R’

S

R

-

S + S R

1.4. ábra

$GLV]XOILGNLFVHUpO GpVQXNOHRILOIRO\DPDWD 0LYHODGLV]XOILGNLFVHUpO GpVPHFKDQL]PXVDHJ\WLROiWDQLRQWiPDGiViYDONH]G GLNtJ\ azon tiolok, amelyek alacsonyabb pKa értékkel rendelkeznek és így a fiziológiás pH-n deprotonált állapotban vannak, jobb nukleofil ágensként reaktívabb partnerként viselkednek. A folyamatot tovább segíti, ha a távozó csoport képes tiolát anionjának

QHJDWtYW|OWpVpWVWDELOL]iOQL$PiUHPOtWHWWWpQ\H] NPHOOHWWDGLV]XOILGNLFVHUpO GpVQHN

WHUPpV]HWHVHQWHUPRGLQDPLNDLODJOHKHWVpJHVQHNNHOOOHQQLH9DJ\LVDNLFVHUpO GpVQHND

UHGR[JUiGLHQVQHNPHJIHOHO HQNHOOYpJEHPHQQLHD]HOHNWURQRNQDNDQHJDWtYDEEUHGR[ potenciálú molekuláról a pozitívabbra kell vándorolniuk (127). $GLV]XOILGN|WpVHNin vivoNLDODNXOiVD 6RNH[WUDFHOOXOiULVIHKpUMHPHJIHOHO V]HUNH]HWpQHNNLDODNXOiViKR]YDODPLQW

UHQGHOWHWpVV]HU P N|GpVpKH]HOHQJHGKHWHWOHQHNDPHJKDWiUR]RWWKHO\HQNLDODNXOy

GLV]XOILGN|WpVHN9L]VJiODWXNVRUiQD]HOV PpUI|OGN|YHW$QILQVHQpVPXQNDWiUVDLQDN mára klasszikussá vált kísérlete jelentette, mely során a denaturált és redukált ribonukleáz

R[LGDWtYN|UQ\H]HWEHQVSRQWiQYLVV]DQ\HUWHP N|G NpSHVIRUPiMiWDPHJIHOHO KHO\HQ~MUD

kialakította diszulfid kötéseit (4). A tény, hogy a folyamat LQYLWUR rendkívül lassú (napokig

tarthat), arra utal, hogy LQYLYR egy oxidáló enzim segíti a folyamat gyorsabb lejátszódását. Ez a feltételezés vezetett a patkánymáj endoplazmás retikulumában található Protein Diszulfid Izomeráz (PDI) felfedezéséhez (54, 152, 153). Azonban majd harminc évnek kellett eltelnie, hogy baktériumok esetében az analóg enzimet, a DsbA-t leírják (13).

10

R’ ’

'LV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiVDSURNDULyWiNEDQ $SURNDULyWiNEDQW|UWpQ GLV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiViUDYRQDWNR]yDGDWRNOHJQDJ\REE

része a leggyakrabban alkalmazott modellszervezetre, az (VFKHULFKLDFROL-ra vonatkozik.

Az elmúlt tíz év kutatásai során megismertük e modellszervezetben a diszulfid kötések LQ

YLYRNLDODNXOiViQDNIRQWRVDEEOpSpVHLW$SURNDULyWiNEDQW|UWpQ GLV]XOILGpUpVL

folyamatokról rendelkezünk a legmélyrehatóbb ismeretekkel, ez indokolja részletesebb irodalmi ismertetésüket. A diszulfid kötések kialakulásának helyszíne a periplazma, amely a prokarióták - az eukarióták endoplazmás retikulumával analóg - extracitoszólikus kompartimentuma. A PHJIHOHO GLV]XOILGN|WpVHNNpWHONO|QO GH|VV]HKDQJROWDQ]DMOySHULSOD]PDWLNXV

ELRNpPLDL~WYRQDOHJ\WWP N|GpVpYHODODNXOQDNNL$]R[LGDWtY~WYRQDOIHOHO VDGLV]XOILG

hidak GHQRYR szintéziséért, az izomerizációs útvonal pedig a helytelenül kialakult kötések helyes formába izomerizálásáért (127). $]R[LGDWtY~WYRQDO 'VE$DSULPHUR[LGi] $]R[LGDWtY~WYRQDOHOV NpQWIHOIHGH]HWWWDJMDD'VE$disulfide bond) fehérje volt. A DsbA D]RQRVtWiVDNpWSiUKX]DPRVJHQHWLNDLPyGV]HUUHOW|UWpQW$]HOV PyGV]HUVRUiQHJ\

mesterségesen elkészített, diszulfid indikátor fúziós fehérjét alkalmaztak. A fúziós fehérjében a MalF integráns membránfehérjét a b-galaktozidázzal fúzionáltatták (13). A

fúziós termék MalF részlete a bJDODNWR]LGi]WDEHOV PHPEUiQEDLUiQ\tWRWWD$PHQQ\LEHQ

vad típusú törzsekben expresszáltatták a fúziós fehérjét, a b-galaktozidáz inaktív volt, mivel

a b-galaktozidáz periplazmába kinyúló részletében diszulfid hidak jöttek létre. Ellenben

DPLNRUGVE$PXWiQVW|U]VHNNHOYpJH]WpND]HO ] HOMiUiVWGLV]XOILGKLGDNQHPM|WWHNOpWUH a bJDODNWR]LGi]PHJ UL]WHDNWLYLWiViW

11

A második bizonyítási eljárás során térszerkezetükben sérült alkalikus foszfatázt tartalmazó mutáns törzseket kerestek. Az alkalikus foszfatáz két eszenciális diszulfid kötést is

WDUWDOPD] 1pKiQ\PXWiQVPHO\NpSWHOHQYROWD]HO ] HNEHQHPOtWHWWGLV]XOILGN|WpVHN kialakítására és ezért csökkent alkalikus foszfatáz aktivitást mutatott, mutáns dsbA gént

KRUGR]RWWWRYiEEHU VtWYHDIHOWHYpVWPHO\V]HULQWV]HUHSHOHKHWDGLV]XOILGN|WpVHN kialakulásában.

Azok a sejtek, amelyek dsbA gén nullmutánsok, pleiotrop fenotípusúak, mivel több

SHULSOD]PDWLNXVIHKpUMpMNLVVpUOWV]HUNH]HW (J\VpJHVHQFV|NNHQWDGLV]XOILGN|WpVW

tartalmazó fehérjéik mennyisége. Így többek között az alkalikus foszfatázé, b-laktamázé,

YDJ\DNOV PHPEUiQIHKpUMH2PS$p (]HNDPXWiQVRNPHJQ|YHNHGHWW

érzékenységet mutatnak a redukálószer ditiotreitollal, benzilpenicillinnel és néhány fémionnal (Hg2+, Cd2+) szemben (112, 141). A halocitokróm c foldingjának zavaráról is

EHV]iPROWDN YDODPLQW~V]iVNpSWHOHQVpJNU OPHO\DIODJHOOiULVPRWRU)OJO

NRPSRQHQVpQHNIROGLQJ]DYDUiUDYH]HWKHW YLVV]D /iWV]yODJD'VE$DOHJIRQWRVDEE

„oxidálószer” a periplazmatikus fehérjék diszulfid kötéseinek kialakulásában, ezt a megállapítást alátámasztani látszik a számos fenotípus, amely mutációja során megjelenik. A történeti bevezetés után lássuk, mit tudunk a DsbA és a többi diszulfidtranszferben részt YHY IHKpUMpU OYDODPLQWNDSFVRODWXNUyO

$'VE$NLVPpUHW N'DRVSHULSOD]PDWLNXVIHKpUMHDPHO\DNWtYKHO\pQNpWFLV]WHLQW

WDUWDOPD]&;;&HOUHQGH] GpVEHQ(]DV]HNYHQFLDVRNPiVR[LGRUHGXNFLyEDQUpV]WYHY fehérje, mint a protein diszulfid izomeráz, a tioredoxin és más Dsb családtagok szerkezetében is megtalálható (126). Meghatározták kristályszerkezetét, mely szerint a 'VE$NpWGRPpQE OiOOHJ\IOH[LELOLV]VDQpUUDO|VV]HN|WYH$]HJ\LNWLRUHGR[LQV]HU

V]HUNH]HWWHOUHQGHONH]LNDPiVLNSHGLJDWLRUHGR[LQGRPpQEHiJ\D]RWWW|P|UV]HUNH]HW

KHOLNiOLVGRPpQ$NpWGRPpQV]XEV]WUiWEHN|W GpVHNRUHJ\PiVKR]NpSHVWHOIRUGXO $'VE$WYDODPLQWD'VE&W'VE'WpVD'VE*WWLRUHGR[LQV]HU V]HUNH]HWNPLDWWD

tioredoxin szupercsaládba sorolták.

$V]HUNH]HWLKDVRQOyViJHOOHQpUH~J\W QLNKRJ\D'VE$pVDWLRUHGR[LQHJ\PiVVDO ellentétes szerepet töltenek be. Míg a tioredoxin mint citoszólikus reduktáz ismert, addig a DsbA egy periplazmatikus fehérje-oxidáz. Mi több, a DsbA az eddig ismert legoxidálóbb

12

fehérje –120 mV-os redoxpotenciállal (172). (Összehasonlításképp a tioredoxin

redoxpotenciálja: -270P9 +RQQDQHUHGKHWD]HUpO\HVR[LGiOyHU ".pUGpVQNUHDIHKpUMH

CXXC részletének vizsgálata adja meg a választ. Az aktív hely N-terminálishoz

OHJN|]HOHEEHV FLV]WHLQMH&\V0) szokatlanul alacsony pKa értékkel rendelkezik. A

szokványos cisztein pKa értéke §N|UOLPtJD&\V30-é §(]D]DODFVRQ\S.a érték azt

jelenti, hogy a Cys-30 fiziológiás pH környékén gyakorlatilag teljes mértékben mint tiolát anion van jelen. A tiolát anion forma ilyetén stabilizálódása a reakciót a DsbA redukciója és ezzel együtt a célfehérje oxidációjának irányába tereli (172).

$'VE$DNWtYFHQWUXPDDODWWHJ\YLV]RQ\ODJPpO\KLGURIyEKDVDGpNIXWPHO\YDOyV]tQ OHJ IHKpUMHN|W V]HUHSSHOUHQGHONH]LN (]WDIHOWHYpVWWRYiEEHU VtWHWWHD'VE$pVDKR]]i N|W G|WWIHKpUMpN105YL]VJiODWDPHO\V]HULQWD'VE$KLGURIyEPHFKDQL]PXVVDON|WLD]

oxidálandó fehérjét (28). Ezek után nézzük meg a diszulfid kötés kialakulásának folyamatát. Ahhoz, hogy a DsbA

DNWtYOHJ\HQpUWKHW HQDNpWHPOtWHWWFLV]WHLQQHNR[LGiOWiOODSRWEDQNHOOOHQQLH$]R[LGiOW

iOODSRW~'VE$QDJ\RQODELOLVJ\DNRUODWLODJD]RQQDOUHDJiODSHULSOD]PiEDOpS IHKpUMpNNHO

$WUDQ]LHQVHQD'VE$&;;&GRPpQMpQHNHOV FLV]WHLQMH&\V0) és a szubsztrátfehérje N|]|WWNLDODNXOyYHJ\HVGLV]XOILGN|WpVHNOpWUHM|WWpWN|YHW HQDGLV]XOILGN|WpVD

szubsztrátfehérjére vándorol át, a DsbA redukált formában válik szabaddá (127). $WyOD%LJ A DsbA miután diszulfid kötését átadta a célfehérjének redukálódott. Így katalítikus

V]HUHSpWFVDNDNNRUWXGMD~MIHQWEHW|OWHQLKDHO WWHYLVV]DQ\HULR[LGiOWDODNMiW$'VE$

YLVV]DR[LGiOiVipUWHJ\DEHOV PHPEUiQEDQWDOiOKDWyIHKpUMHD'VE%IHOHO V$'VE%

génben történt mutációkat ugyanazon MalF-b-galaktozidáz fúziós apparátus segítségével

L]ROiOWiNDPHO\HWD'VE$IHOGHUtWpVpUHKDV]QiOWDN 'DLOH\pV%HUJD]HO ]

PXQNDFVRSRUWWyOIJJHWOHQOV]LQWpQEHV]iPROWD'VE%OpWH]pVpU O 9L]VJiODWDLN

alapjául olyan mutáns törzseket választottak, amelyek nem voltak képesek funkcióképes flagellumot létrehozni. Missiakas és munkatársai ditiotreitol érzékeny mutáns törzsek

13

vizsgálata során, szintén dsbB mutáns egyedekre, valamint további dsb gén mutánsokra bukkantak (112). A dsbB mutáns törzsek ugyanolyan pleiotróp fenotípussal rendelkeznek, mint a dsbA mutánsok. A tény, hogy a dsbA és a dsbB mutánsok hasonló defektusokkal rendelkeznek a diszulfid hidak kialakításának terén, arra utal, hogy mindkét fehérje ugyanazon központi

MHOHQW VpJJHOEtUyR[LGiFLyV~WYRQDOHJ\HJ\HOHPH(]WDIHOWpWHOH]pVWWRYiEEHU VtWHWWHD

megfigyelés, mely szerint a dsbB törzsekben a DsbA redukált formában szaporodik fel,

PtJDYDGW|U]VHNEHQR[LGiOWIRUPiMiEDQIRUGXOHO $'VE$pVD'VE%N|]|WW

kialakuló direkt kapcsolatot bizonyította vegyes diszulfidjuk izolálása (59, 86). További PHJHU VtWpVOV]ROJiOWD]DNtVpUOHWPHO\EHQNDWDOtWLNXVPHQQ\LVpJ 'VE%WWDUWDOPD]y

membránpreparátummal a DsbA gyors LQYLWUR oxidációját érték el (25).

0LWXGKDWyD'VE%V]HUNH]HWpU O"$'VE%N'DRVEHOV PHPEUiQEDQHOKHO\H]NHG fehérje, négy transzmembrán szegmenssel. Mindkét periplazmás doménjében egy-egy DNWLYLWiViKR]V]NVpJHVFLV]WHLQSiURVWWDUWDOPD]$]HOV FLV]WHLQSiURV&;;&

HOUHQGH] GpV PHO\HWVRNV]RUWLRUHGR[LQV]HU IHKpUMpNEHQWDOiOXQNPHJ

+iURPGLPHQ]LyVV]HUNH]HWHXJ\DQPpJQHPLVPHUWD]RQEDQQHPYDOyV]tQ KRJ\

WLRUHGR[LQV]HU GRPpQWWDUWDOPD]QD(QQHNRNDKRJ\HOV SHULSOD]PiVGRPpQMHHJpV]

HJ\V]HU HQW~ONLVPpUHW WRYiEEiPiVWLRUHGR[LQV]HU IHKpUMpNUHMHOOHP] DGRWWViJRNNDO VHPUHQGHONH]LN$PiVRGLNFLV]WHLQSiURVDPiVRGLNQDJ\REEPpUHW SHULSOD]PiV

GRPpQEHQWDOiOKDWy $IHKpUMHP N|GpVLPHFKDQL]PXVDVHPWHOMHVHQWLV]Wi]RWW$] eddigi ismeretek irányított pontmutációs kísérleteken alapulnak, melyek során a DsbA és a

'VE%HJ\HVFLV]WHLQMHLWNO|QE|] NRPELQiFLyNEDQPiVDPLQRVDYDNUDFVHUpOWpN

(]HQNtVpUOHWHNOHKHW YpWHV]LNKRJ\D]HJ\pENpQWLJHQODELOLV'VE$pV'VE%N|]|WW

OpWUHM|Y YHJ\HVGLV]XOILGRNIHOV]DSRURGMDQDNpVtJ\YL]VJiOKDWyYiYiOMDQDN$NtVpUOHWHN

OHKHW VpJHWQ\~MWDQDNHJ\IHOWpWHOH]HWWLQYLYR folyamatsor kialakítására. Így ha a DsbA Cys-33-ját szerinre cseréljük, egy a DsbA és DsbB között kialakuló diszulfid

felszaporodása tapasztalható, mivel a Cys-33 nem képes felbontani azt (86). A DsbB Cys104 mutációja esetén a DsbA-DsbB komplex nem jön létre, ami arra utal, hogy a Cys-104

QpONO|]KHWHWOHQDYHJ\HVGLV]XOILGNLDODNtWiViKR] ËJ\QHPPHJOHS KRJ\D'VE$ Cys-30 és a DsbB Cys-104 között kialakuló vegyes diszulfidot megtalálták (59, 85). A Cys-

14

WiPDGiViWN|YHW HQIHOERPOLNDYHJ\HVGLV]XOILGD'VE$R[LGiOWIRUPiEDQV]DEDGGi válik, míg a DsbB Cys-104 és Cys-130 részletei redukálódnak. Regenerálódásukról (visszaoxidálásukról) két, a DsbB másik periplazmás doménjében található cisztein (Cys41, Cys-44) gondoskodhat (85). Ez a folyamatmodell azon a feltételezésen alapul, hogy a DsbA Cys-30 és a DsbB Cys-104

N|]|WWOpWUHM Y VWDELOYHJ\HVGLV]XOILGDUHDNFLyPHFKDQL]PXVEDQWpQ\OHJHVHQNLDODNXOy

N|]WLWHUPpN$N|]WLWHUPpNHNiOWDOiEDQPHJOHKHW VHQLQVWDELONpS] GPpQ\HNtJ\DYHJ\HV GLV]XOILGW~OVWDELOLVQDNW QLNDKKR]KRJ\WpQ\OHJHVN|]WLWHUPpNOHJ\HQ7|EEFLV]WHLQW

WDUWDOPD]yIHKpUMpNGLV]XOILGNLFVHUpO GpVLUHDNFLyLWYL]VJiOYDDN|YHWNH] PHJILJ\HOpVHNHW tették: egy ciszteint eltávolítva általában nem áll meg a reakció az adott lépésnél,

IHOKDOPR]YDDEORNNHO WWLN|]WLWHUPpNHW$]LQVWDELON|]WLWHUPpNHO V]HUHWHWWHOVWDELODEEi

UHQGH] GLNiW

$]~W%W O $]HOHNWURQRN~WMDDUHGXNiOWiOODSRW~QDWtYIHKpUMpW OD'VE$QNHUHV]WOHJ\ membránfehérje, a DsbB irányába tart. Nyilvánvaló, hogy itt sem akadhat meg, hiszen

DNNRUD]LGiLJYH]HW V]DNDV]LVÄEHGXJXOQD´0HUUHYH]HWWRYiEED]HOHNWURQRN~WMD"0L oxidálja vissza a redukálódott DsbB-t? A molekuláris oxigén, mint terminális

HOHNWURQDNFHSWRUpVDOpJ]pVLHOHNWURQWDQV]IHUOiQFPLQWN|]YHWtW V]HUHSHPiUD'VE%

L]ROiOiViWN|YHW HQIHOPHUOW 1pJ\pYQHNNHOOHWWHOWHOQLHD]HOV EL]RQ\tWpN

megszerzéséig. Ekkor felfedezték, hogy hem vagy kinon bioszintézisben sérült mutáns

W|U]VHND'VE$WpV'VE%WUHGXNiOWiOODSRWEDQIHOKDOPR]]iN .pV EEPHJILJ\HOWpN

KRJ\PLQGNpWIHKpUMH'VE$'VE% R[LGiOWViJDHU VHQIJJD]R[LJpQMHOHQOpWpW O

Oxigén jelenlétében a DsbB CXXC részletét rendkívül nehéz redukálni, a próbálkozás csak extrém magas DTT koncentráció mellett sikeres (89). Azonban ugyanezek a ciszteinek könnyen redukálhatóvá válnak, amennyiben a membránpreparátumot hem- vagy

NLQRQPHQWHVVHMWE OQ\HULN 0LQGH]HND]HUHGPpQ\HNHU WHOMHVHQVXJDOOMiNDOpJ]pVL OiQF'VE$'VE%YLVV]DR[LGiOiVLIRO\DPDWiEDQYDOypULQWHWWVpJpW$GLV]XOILGKtGpStW

IRO\DPDWWLV]WtWRWWDQ\DJRNEyOW|UWpQ LQYLWUR felépítése igazolta az elektron tanszport lánc

15

pVDGLV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiVDN|]WLNDSFVRODWPHJOpWpW /iVVXNDNNRUD%WN|YHW lépéseket. A redukált DsbB elektronjait oxidált ubikinonnak adja, amely továbbítja azokat a citokróm R[LGi]IHOpDPHO\UHGXNiOMDDYpJV HOHNWURQDNFHSWRUR[LJpQWËJ\DGyGLNDNpUGpVPLD

helyzet anaerob körülmények között? A diszulfid kötések kialakulása ekkor sem állhat le. Ekkor a DsbB elektronjait a menakinonnak adja át, majd az a fumarát reduktáz vagy a nitrát UHGXNWi]IHOpWRYiEEtWMDD]RNDW7HKiWD'VE%NO|QE|] NLQRQRNR[LGiFLyVHQHUJLiMiW használja fel a diszulfid kötések GHQRYR kialakítására.

Bader és munkatársai kísérleteik során megállapították, hogy a DsbB egyetlen egy nagy

VSHFLILWiV~NLQRQN|W KHOO\HOUHQGHONH]LN $NLQRQRNYDOyV]tQ OHJD]HOV SHULSOD]PiV domén CXXC részletén keresztül oxidálják a DsbB-t (89), továbbá a CXXC részlethez

N|]HOHV $UJPLQGHQEL]RQQ\DOIRQWRVV]HUHSHWMiWV]LND'VE%NLQRQNDSFVRODW

létrejöttében, ugyanis ha hisztidinre cseréljük a DsbB ubikinon irányába mutatott Km-je

W|EEPLQWKpWV]HUHVpUHQ|YHNV]LN $&\VpVD]$UJN|]|WWLV]DNDV]WpULQW inzerció, vagy deléció inaktív, redukált DsbB felszaporodását eredményezi (91).

$HVpYIHMOHPpQ\HLPHU EHQPiVPHJYLOiJtWiVEDKHO\H]WpND'VE%pVD'VE$N|]|WW OpWUHM|Y HOHNWURQWUDQV]IHUPHFKDQL]PXViW$]HOV PHJOHSHWpVVHO,QDEDpV,WRV]ROJiOW

amikor meghatározta a DsbB két eszenciálisnak tekintett (Cys 41-Cys 44, Cys 104-Cys130) ciszteinpárosának standard redox potenciálját. A két redox potenciálérték alapjaiban NpUG MHOH]WHPHJD'VE%DGGLJWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVUHDODSR]RWWP N|GpVL

mechanizmusát. A Cys 41-Cys 44 páros esetében -0.21 V-os, a Cys 104-Cys130 páros esetében pedig -0.25 V-os értéket mértek, amelyek ubikinon jelenlétében még tovább a redukáló irányba tolódtak (Cys 41-Cys 44: -0.28V és Cys 104-Cys130: -0.26V) (73, 128). A DsbA aktív centruma mindkét értéknél jóval oxidálóbb -0.12 V-os redox potenciállal rendelkezik. Hogyan oxidálhatja mégis a DsbB a DsbA-t a „lehetetlen” redoxpotenciálok ellenére ? Megpróbálták az elektrontranszfer útvonalat végigfejteni. Az ubikinon a DsbB 41-es és 44es ciszteinjeit diszulfiddá oxidálta, azonban a 104-es és 130-as ciszteineket nem. Az ubikinon magában DsbB nélkül nem volt képes a DsbA oxidációjára. A DsbB cisztein

16

párosait – HJ\HQNpQWpVPLQGNHWW WHJ\V]HUUH±V]HULQUHFVHUpOYHPHJYL]VJiOWiND

NO|QE|] PXWiQVRNpVDYDGWtSXV'VE$R[LGiFLyMiUDJ\DNRUROWKDWiViW8ELNLQRQ

távollétében, mindegyik változat oxidált alakja, még a teljesen ciszteinmentes is, képes volt a redukált DsbA-t oxidálni, jelezvén, hogy a ciszteinek – az eddigi elképzelésekkel ellentétben – nem feltétlenül szükségesek a DsbA oxidálásához (128). Mi lehet a DsbB diszulfidjainak szerepe ? Annak idején a DsbB DsbA-t oxidáló szerepére abból következtettek, hogy izolálták a DsbA mutáns és a DsbB között létrejött vegyes diszulfidot (59, 86). A vegyes diszulfid csak a két fehérje interakciójára utal, ami nem feltétlenül jelenti a DsbA DsbB általi oxidációját. A két fehérje között létrejött diszulfidot lehetett izolálni olyan esetekben is amikor a DsbB oxidációs képességét gátolták (89, 79). A DsbB

'VE$WR[LGiOyKDWiVDWHKiWQHPIHOWpWOHQODEEyOiOOKRJ\D]HOV OpSpVEHQD'VE%EHQ NLDODNXOyGLV]XOILGRNDNpV EELHNEHQD'VE$UDNHUOQHNiW(ONpS]HOKHW KRJ\D

diszulfidok közvetlenül a DsbA-ban alakulnak ki az oxidált kinon hatására miközben az a DsbB-n dokkol (128). A DsbB ezen modell szerinti szerepe a kinon aktivitásának növelése, valamint a DsbA és az aktivált kinon egymás közelébe hozása, a DsbA és a kinon közti közvetlen elektrontranszfer biztosítása lenne. $]L]RPHUL]iFLyV~WYRQDO $W|EEPLQWNpWFLV]WHLQWWDUWDOPD]yIHKpUMHOiQFRNHVHWpEHQIHQQiOODQQDNDOHKHW VpJH

KRJ\QHPPHJIHOHO FLV]WHLQHNN|]|WWDODNXONLDGLV]XOILGN|WpV0LYHOD'VE$YLV]RQ\ODJ NHYpVVpVSHFLILNXVHOHNWURQDNFHSWRUtJ\DNpV]O IHKpUMHOiQFEDV]pSV]iPPDONHUOQHN nem natív diszulfid kötések is (9). A sejtben életfontosságú, hogy ezek a helytelenül

NLDODNXOWGLV]XOILGN|WpVHNDOHKHW OHJJ\RUVDEEDQHOQ\HUMpNKHO\HVIRUPiMXNDWPHJHO ]YH

DQHPQDWtYV]HUNH]HW IHKpUMpNIHOKDOPR]yGiViWËJ\Q\LOYiQYDOyKRJ\OpWH]QLHNHOOHJ\ diszulfid izomeráz enzimnek, vagy enzimrendszernek, amely a helytelenül kialakult GLV]XOILGKLGDNKHO\HVLUiQ\EDYDOyWHUHOpVppUWIHOHO V

$SURNDULyWiNEDQ]DMOyL]RPHUL]iFLyV~WYRQDOHOV IHOIHGH]HWWMHD'VE&YROW

17

'VE&'VE* 5|YLGGHOD]R[LGiFLyV~WYRQDOPHJLPHUpVpWN|YHW HQDKHO\WHOHQONLDODNXOWGLV]XOILG hidak korrekciós mechanizmusára is fény derült. A hibajavító folyamatban a Dsb család három fehérjéje a DsbC, a DsbG és a DsbD vállal tevékeny szerepet (113, 114).

$'VE&NpWN'DRVUpV]E OiOOyKRPRGLPHU 0LQGHJ\LNDOHJ\VpJHQpJ\QpJ\ FLV]WHLQWWDUWDOPD](]DV]HUNH]HWNpWNO|QE|] IXQNFLyWUHMW$]L]RPHUi]/reduktáz

DNWLYLWiVpUWDIHKpUMH1WHUPLQiOLVUpV]HIHOHO VLWWWDOiOKDWyDND]DNWtYKHO\FLV]WHLQMHLLV

(Cys-98, Cys-10 $&WHUPLQiOLVV]DNDV]IHOHO VYDOyV]tQ OHJDIHKpUMHFKDSHURQ

aktivitásáért, melyet modellfehérjékkel végzett LQYLWUR kísérletek során írtak le (21). A

IHKpUMHFKDSHURQDNWLYLWiVDIRQWRVV]HUHSHWMiWV]KDWDQHPPHJIHOHO GLV]XOILGN|WpVHNPLDWW NLDODNXOWVpUOWV]HUNH]HW IHKpUMpNIHOLVPHUpVpEHQ$PHQQ\LEHQD&\V

karboximetilálásával a fehérje izomeráz aktivitását megszüntetik, attól az még mint

FKDSHURQP N|G NpSHVPDUDG$IHKpUMpEHQWDOiOKDWyPiVLNNpWFLV]WHLQ&\V&\V

HJ\LQWUDPROHNXOiULVGLV]XOILGKLGDWNpSH]PHO\QHNYDOyV]tQ OHJV]HUNH]HWLPHUHYtW szerepe van, a fehérje aktivitását közvetlenül nem befolyásolja (99). A dimer V-alakú, melyben az egyes monomerek alkotják a V egy-egy szárát (108). Mindkét monomer két

WRYiEELGRPpQUHWDJROyGLNDGLPHUL]iFLypUWIHOHO V1WHUPLQiOLVpVDWLRUHGR[LQV]HUNH]HW C-terminális, katalítikus doménre (108). A két aktív hely CXXC részlete a V belsejében egymás felé néznek. A V-alakú hasadék felszínét többnyire hidrofób, töltés nélküli

DPLQRVDYDNDONRWMiNIHOYHWYHDQQDNDOHKHW VpJpWKRJ\V]HUHSHOHKHWDV]XEV]WUiWIHKpUMpN nem kovalens megkötésében (108). Az N-terminális dimerizációban játszott szerepét limitált proteolízissel bizonyították. Amennyiben az N-terminális részt eltávolították a

IHKpUMpU ODYLVV]DPDUDGy'VE&GDUDEHOYHV]WHWWHGLPHUL]iFLyVNpSHVVpJpW). A C-

terminális részlet is teljes mértékben elvesztette izomerizációs aktivitását, pedig az aktív hely CXXC részlete sértetlen maradt, tehiW~J\W QLNDGLPHUL]iFLyHOHQJHGKHWHWOHQD]

izomeráz aktivitáshoz (145 $IHKpUMHV]HUNH]HWpWN|YHW HQYL]VJiOMXNPHJDIHOWpWHOH]HWW folyamatot, mely során a helytelenül kialakult diszulfid kötések kiigazításra kerülnek. A DsbC 98-as ciszteinje megtámadja a célfehérje helytelenül kialakult diszulfid kötését, egy

FpOIHKpUMH'VE&YHJ\HVGLV]XOILGRWDONRWYD$YHJ\HVGLV]XOILGNpV EEHJ\UpV]WD

18

FpOIHKpUMHHJ\PiVLNFLV]WHLQMpQHNWiPDGiVDQ\RPiQV] QKHWPHJHJ\VWDELODEEGLV]XOILG kötést, valamint redukált formájú DsbC-t hagyva maga után. A vegyes diszulfid

PHJV] QpVpQHNPiVLNOHKHW VpJHKRJ\D'VE&01-es ciszteinje támadja meg, amely oxidált állapotú DsbC-t, valamint redukált célfehérjét eredményez (25). 1997-ben Andersen és munkatársai leírtak egy másik bakteriális protein diszulfid izomerázt, a DsbG-t. Amennyiben a DsbG génje többszörös kópiában volt jelen, csökkenteni tudta a DsbB mutánsok magas ditiotreitol koncentrációval szembeni érzékenységét. A DsbG szintén homodimer, mely 28 % szekvencia azonosságot és 56% szekvenciahasonlóságot mutat a DsbC-vel (2). A DsbG a DsbC-hez hasonló, nem

HVV]HQFLiOLVGLV]XOILGL]RPHUi]YDOyV]tQ OHJHOWpU V]XEV]WUiWVSHFLILWiVVDO ,]RPHUi]

mivoltával jól összevág, hogy LQYLWUR chaperon aktivitással is rendelkezik (138). 0pJHJ\HOHNWURQWUDQV]SRUW UD'VE'

Ahhoz, hogy a DsbC és a DsbG újra és újra képes legyen izomeráz szerepét betölteni,

EL]WRVtWDQLNHOO±D]R[LGDWtYOpJN|U SHULSOD]PiEDQ±UHGXNiOWiOODSRWXNIHQQWDUWiViW(]pUW DIXQNFLypUWDEHOV PHPEUiQHJ\IHKpUMpMHD'VE'IHOHO V

A DsbD 59 kDa-os molekulatömegével családjának legnagyobb tagja, prekurzorként szintetizálódik, fehérjelánca egy kihasítható szignál szekvenciát tartalmaz (24, 56).

7RSROyJLDLODJKiURPNO|QE|] GRPpQE OiOOHJ\N|]SRQWLKLGURIyEGRPpQE Ob), melyet

nyolc transzmembrán szegmens alkot, valamint két periplazmás, egy N-terminális (a) és

egy C-terminális (g GRPpQE O0LQGKiURPGRPpQNpWNpWNRQ]HUYDWtYHV]HQFLiOLV ciszteint tartalmaz (144).

$'VE'PXWiQVRNPHJPXWDWWiNKRJ\DIHKpUMHPiVIRQWRVVHMWV]LQW IRO\DPDWRN

UpV]WYHY MHLVtJ\UpV]WYHV]DKRORFLWRNUyPFNLDODNXOiViEDQ (]HQFLWRNUyPRN összeszerelése során kovalens kötés (tioéter-kötés) jön létre a hem csoport és az apoprotein NpWFLV]WHLQMHN|]|WW$'VE'IHOHO VDN|WpVOpWUHM|WWpKH]V]NVpJHVFLV]WHLQHNUHGXNiOW állapotban tartásáért (129). Hozzájárul az (FROLUp]W U NpSHVVpJpKH]LV $'VE'

mutáns törzsek rézérzékenysége nagyjából kétszerese volt a vad törzsekének. Az említett

FLV]WHLQSiURNIRQWRVViJDDNO|QE|] IRO\DPDWRNV]HPSRQWMiEyOHOWpU (J\HJ\V]HU

19

cisztein-alanin csere a DsbC és a DsbG oxidált állapotú felhalmozódását eredményezi, a rézérzékenység és a citokróm c bioszintézise viszont csak akkor sérül, ha egyszerre két vagy több ciszteint cseréltek ki (56).

$]HO ] IRO\DPDWRNPHJLVPHUpVHVRUiQDN|YHWNH] NpUGpVHNPHUOWHNIHOD'VE' KRQQDQ és KRJ\DQ szállítja az elektronokat a periplazmás fehérjékhez?

Katzen és Beckwith ötletes kísérletsorozatot végzett a kérdések megválaszolásának érdekében. A fehérjét doménjeire bontották és külön-külön plazmiddal egy DsbD

QXOOPXWiQVVHMWEHMXWWDWWiN0HJYL]VJiOWiNDNO|QE|] GRPpQ|VV]HiOOtWiV~HVHWHN'VE&

redukáló képességét. Azon törzsekben, melyekben a vad típusú DsbD-t expresszáltatták a

'VE&DNWtYKHO\pQHNFLV]WHLQMHLPHJ UL]WpNUHGXNiOWiOODSRW~NDW$]RQEDQKDDKiURP

VWUXNWXUiOLV'VE'GRPpQN|]OEiUPHO\LNHWLVHOWiYROtWRWWiNDUHQGV]HUE OD'VE&R[LGiOW

állapotban halmozódott fel. Amennyiben a DsbD valamennyi alkotórészét egyszerre expresszáltatták – akár két, akár három különálló részletben is – a ciszteinek redukált állapota visszaállt. Tehát az eredmények arra engednek következtetni, hogy a DsbD

PLQGKiURPGRPpQMHV]NVpJHV±GHQHPIHOWpWOHQOPLQWHJ\HJ\EHIJJ SROLSHSWLG±

ahhoz, hogy a citoplazmából a DsbC-hez szállítsák az elektronokat (82)ËJ\DN|YHWNH] D NpUGpVKRJ\DQPLO\HQVRUUHQGEHQWHY GLNiWGRPpQU OGRPpQUHD]HOHNWURQDUHGXNiOy

ÄHU ´"$VRUUHQGHWHOG|QWHQG NO|QE|] KHO\HNHQPHJV]DNtWRWWiND]HOHNWURQWUDQV]IHU láncot és megvizsgálták az egyes domének redox állapotát, továbbá vegyes diszulfid

LQWHUPHGLHUHNHWNHUHVWHN$NtVpUOHWHNDODSMiQDN|YHWNH] HOHNWURQWUDQV]SRUWOiQFRODW

rajzolódott ki: a citoplazmatikus tioredoxin vegyes diszulfidot alkot a DsbD b-doménjének 163-as ciszteinjével. A reakció során átadott elektront felhasználva redukálja a tioredoxinV]HU gGRPpQWPDMGH]WN|YHW HQD]HOHNWURQDNDWDOtWLNXVa-doménre kerül. A

továbbiakban az a-domén 109-es ciszteinje vegyes diszulfidot képez az oxidált állapotú

SHULSOD]PDWLNXVV]XEV]WUiWRNNDOtJ\D'VE&YHOLV$YHJ\HVGLV]XOILGYDOyV]tQ OHJD103-

DVFLV]WHLQQXNOHRILOWiPDGiViYDOV] QLNPHJDIRO\DPDWYpJHUHGPpQ\HNpQWDV]XEV]WUiW redukált állapotban távozik (82, 94). Sikerült az izomerizációs apparátus tisztítása és

rekonstruálása, egyúttal meghatározták a g és az a domén redoxpotenciálját. A rekonstruált rendszer és a redox potenciál értékek (g: -0,241 V, a9 PHJHU VtWLNDKLSRWp]LV

helyességét (26).

20

1.5. ábra Az Escherichia coli periplazmatikus fehérje tiol oxcidációs és izomerizációs útvonala (Sevier HWDO, 137). $]R[LGDWtYpVD]L]RPHUL]iFLyV~WHOYiODV]WiVD A két útvonalat alaposan megvizsgálva adódhat a kérdés, hogy folyhat két ennyire

NO|QE|] IRO\DPDWHJ\D]RQWpUEHQDSHULSOD]PiEDQ"+LV]HQDKKR]KRJ\D'VE$

GLV]XOILGGRQRUNpQWN|]UHP N|GM|QR[LGiOWiOODSRWEDQNHOOOHQQLH$]HO ] IHMH]HWEHQ láttuk, hogy a DsbC-nek viszont éppen redukált állapotúnak kell lennie ahhoz, hogy mint

GLV]XOILGL]RPHUi]EHW|OWVHIHODGDWiW0LEL]WRVtWMDHNpWHOOHQWpWHVV]HUHSN|U UHQGV]HU

KDWpNRQ\HOYiODV]WiViW"+LV]HQKDQHPYiOQiQDNHOHJ\PiVWyOD'VE%HJ\HJ\V]HU

rövidzár során oxidálhatná a DsbC-t, kifogva a szelet mindkét rendszer vitorlájából. A tapasztalat azonban az, hogy a DsbB 500-szor lassabban oxidálja a DsbC-t, mint ahogy azt a DsbA-val teszi (9). Tehát a DsbB valahogyan különbséget tesz a két fehérje között.

21

Bader és munkatársai olyan DsbC mutánsokat izoláltak, amelyek képesek voltak a dsbA

QXOOPXWiQVRNDWNLHJpV]tWHQLD]WYDOyV]tQ VtWYHKRJ\DGRWWHVHWEHQLQYLYR helyettesíteni képesek a DsbA-t (6). Ezen mutánsok közös szerkezeti tulajdonságaként leírták, hogy egyikük sem képes dimert képezni, továbbá, mint diszulfid izomerázok funkcióképtelenek. A vad típusú DsbC túlexpresszáltatása nem járt hasonló eredménnyel a diszulfid kötések képzése terén. A mutáns fehérjetermékek molekulatömege egyezett a DsbC monomer molekulatömegével, tehát a dimerizációs képesség elvesztése a fehérje funkciójának totális változását eredményezte, a továbbiakban mint diszulfid donor viselkedett, diszulfid

L]RPHUi]DNWLYLWiVDKiWWpUEHV]RUXOW(]WN|YHW HQGLPHUL]iFLyVGRPpQMNEHQVpUOW

PXWiQVRNDWWHUYH]WHNPHO\HNPLQGHJ\LNHNpSHVYROWD'VE$QXOOPXWiQVRNEDQPHJV] Q alkalikus foszfatáz (szerkezetében eszenciális diszulfid hidakat tartalmaz) aktivitását a vad

szint közelébe emelni. Kérdésként adódott, hogy ebben az esetben mi biztosítja a reakció során redukálódott DsbC monomerek visszaoxidálását? A kérdés megválaszolására dsbA, dsbB nullmutánsokat hoztak létre. Ezen mutánsokban egyik DsbC monomer sem volt képes

GLV]XOILGN|WpVHNOpWUHKR]iViUDD]WYDOyV]tQ VtWYHKRJ\D'VE&PRQRPHUHN

YLVV]DR[LGiOiVipUWLVD'VE%DIHOHO V$OWHUQDWtYOHKHW VpJNpQWIHOPHUOWKRJ\D'VE& nem képes kapcsolatot teremteni a DsbD-vel, így biztosítva oxidált állapotát. Azonban, ha

tJ\OHQQHDNNRUDGLV]XOILGN|WpVHNOpWUHM|WWHQHPOHQQH'VE%IJJ WRYiEEiQHP

tapasztaltak alkalikus foszfatáz aktivitást dsbA, dsbD nullmutáns törzsekben a vad DsbC

W~OH[SUHVV]iOWDWiViWN|YHW HQ7HKiWD'VE'NLLNWDWiVDQHPEHIRO\iVROWDD'VE&

monomerek aktivitását, míg a DsbB kiesése megszüntette a hatékony diszulfidérést. A

N|YHWNH] OpSpVEHQ'VE&PRQRPHUWXELNLQRQQDOLQNXEiOWDNPHO\LQNXEiFLyDODWWQHP

történt semmiféle reakció, azonban ha a DsbB katalitikus mennyiségét is a rendszerhez adták, a kinon reducióját és a DsbC monomer párhuzamos oxidációját figyelhették meg. A kísérletet vad típusú (dimer) DsbC-vel elvégezve a DsbC oxidációja elmaradt.

gVV]HIRJODOYDHOPRQGKDWMXNKRJ\YDOyV]tQ OHJD'VE&PRQRPHUiOODSRWDWHV]LDIHKpUMpWD 'VE%V]XEV]WUiWMiYiDPLMyO|VV]HIJJpVEHKR]KDWyD'VE&PRQRPHU'VE%IJJ

R[LGiFLyMiYDO/iWKDWMXNKRJ\D'VE&GLPHUL]iFLyMDPLNpQWHOOHQ U]LD]R[LGDWtYpVD

UHGXNWtY~WYRQDON|]WPHJOpY W|UpNHQ\HJ\HQV~O\W

22

'LV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiVDHXNDULyWiNEDQ Eukarióták esetében a fehérje diszulfid hidak kialakulásának helyszíne a sejtek endoplazmás retikuluma. Ez a sejtszervecske felel meg a prokarióták periplazmájának. Az endoplazmás retikulum lumene a sejt citoszóljánál jóval oxidatívabb redox potenciállal

UHQGHONH]LNDPLWDI UHGR[SXIIHUWDGyJOXWDWLRQUHGXNiOWpVR[LGiOWIRUPiMiQDNDUiQ\D

WNU|]DOHJMREEDQ$FLWRV]yOWMHOOHP] 00:1 GSH/GSSG aránnyal szemben az endoplazmás retikulum lumenében azonos összglutation koncentráció mellett 1-3:1

GSH/*66*DUiQ\PpUKHW ËJ\QHPFVRGDKRJ\D]HO EELDUiQ\RNLVPHUHWpEHQ

kezdetben az a feltételezés volt általánosan elfogadott, hogy a szekréciós fehérjék diszulfid hídjainak kialakulásában az oxidált glutation és annak transzmembrán transzportja fontos szerepet játszhat (71).

,VPHUHWHLQND]HOP~OW|WpYVRUiQMHOHQW VHQNLE YOWHN$OHJW|EEDGDWDOHJUpV]OHWHVHEEHQ

YL]VJiOWHXNDULyWDPRGHOOV]HUYH]HWWHODSpNpOHV]W YHO6DFFKDURP\FHVFHUHYLVLDH) kapcsolatban áll rendelkezésünkre. 'LV]XOILGKLGDNNLDODNXOiVDSpNpOHV]W EHQ $WyODYDJ\DSURWHLQGLV]XOILGL]RPHUi]WyO

A protein diszulfid izomeráz (PDI) 1963-as izolálása óta tudjuk, hogy a fehérjékben

HO IRUGXOyGLV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiVDHQ]LPNDWDOL]iOWDIRO\DPDW $] HQ]LPD]HJ\LNOHJQDJ\REEPHQQ\LVpJEHQHO IRUGXOyHPO VpVpOHV]W (5OXPLQiOLV

fehérje, a sejt teljes fehérjetartalmának mintegy 0,8 %-át teszi ki (47), egyes szövetek HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPiEDQPLOOLPROiULVNRQFHQWUiFLyEDQIRUGXOHO -HOHQOpWpW

V]iPRVV]|YHWEHQpVV]HUYEHQOHtUWiNNO|QE|] IDMRNEDQWDOiOKDWyYiOWR]DWDLQDJ\IRN~ konzervativizmust mutatnak (40). Az 55 kDa-os, 510 aminosavból álló fehérjelánc tipikus &WHUPLQiOLV.'(/pOHV]W NEHQ+'(/ (5YLVV]DWDUWyV]HNYHQFLiWKRUGR]/HJW|EEV]|U

PLQWKRPRGLPHUWL]ROiOWiNGHPRQRPHUpVKRPRWHWUDPHUIRUPiEDQLVHO IRUGXO

Katalizálja az endoplazmás retikulumban a diszulfid kötések kialakulását, izomerizációját

23

és redukcióját mind LQYLWUR, mind LQYLYR, továbbá chaperon aktivitással is bír (40). Négy

WLRUHGR[LQV]HU GRPpQE OD, E, E¶ és D¶), valamint egy FUpV]E Oáll. Így a PDI – mint sok GLV]XOILGUHGR[UHDNFLyEDQUpV]WYHY WiUVD±DWLRUHGR[LQV]XSHUFVDOiGEDWDUWR]LN

Az D valamint az D¶ domén CGHC részletet tartalmaz (40). A PDI tiol-diszulfid

redox/L]RPHUi]DNWLYLWiViWH]HQ1WHUPLQiOLVWLRUHGR[LQV]HU UpV]OHWHLQHNN|V]|QKHWL

melyek egymástól függetlenül is funkcionálhatnak (22). A fehérje diszulfid formája jóval

NLVHEEVWDELOLWiVVDOUHQGHONH]LNPLQWDWLRUHGR[LQPHJIHOHO GLV]XOILGMD(]D3',±D

tioredoxin reduktív szerepével ellentétes – oxidatív funkciójában mutatkozik meg (93). Így

D]R[LGiOWiOODSRW~3',HOPpOHWLOHJN|]YHWOHQWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVLUHDNFLyEDOpSKHWD

V]XEV]WUiWIHKpUMpNNHO(UUHEL]RQ\tWpNXOV]ROJiOWKRJ\DWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVL

folyamatot megszakítva, PDI-karboxipeptidáz Y (szerkezetében eszenciális diszulfid kötéseket tartalmazó szubsztrátfehérje) vegyes diszulfidot tudtak izolálni (45). Ezen vegyes diszulfidok képviselhetik a PDI katalizálta oxidációs, redukciós, valamint izomerizációs folyamatok közti termékeit. A PDI diszulfid kötések létrejöttében betöltött szerepét jelezte

D]LVKRJ\3',KLiQ\RVpOHV]W W|U]VHNHVHWpEHQDNDUER[LSHSWLGi]
A PDI redoxpotenciálja –180 mV, jóval oxidatívabb, mint a tioredoxiné (-270 mV), viszont kevésbé, mint a bakteriális DsbA-é (-120mV) (40). A redox potenciálokban tapasztalható

NO|QEVpJpUWPLQGHQEL]RQQ\DODUHDNWtY&\V;DD;DD&\VV]HNYHQFLDNpWN|]EOV WDJMD IHOHO V $3',0V]HUQDJ\REEDNWLYLWiVWPXWDWDKLEiVV]HUNH]HW 51i]GLV]XOILG

kötéseinek izomerizációja során, mint a tioredoxin (66). Amennyiben a bakteriális tioredoxin -Cys-Gly-Pro-Cys- tioredoxin szekvenciát -Cys-Gly-His-Cys- szekvenciára

cserélték a fehérje 10V]HUR[LGDWtYDEENDUDNWHU OHWWWRYiEEiKDVRQOyPpUWpNEHQ

növekedett diszulfid izomeráz aktivitása is (47). Ezáltal képessé vált a PDI1 nullmutáns 6

FHUHYLVLDH törzs életképességének fenntartására(22).

$PiVRGLNFLV]WHLQUpV]OHWIHOHO VDV]XEV]WUiWIHKpUMpNR[LGiFLyMipUWLQYLWUR, azonban LQ

YLYRDV]XEV]WUiWIHKpUMH3',YHJ\HVGLV]XOILGRNPHJERQWiViEDQMiWV]KDWI V]HUHSHWH]iOWDO

OHKHW VpJHWDGYDDKHO\HVL]RPHUNLDODNXOiViUDWRYiEEiPHJDNDGiO\R]]DKRJ\D3', diszulfid kötött komplexben ragadjon (159, 160). Az a és az a’ tioredoxin doméneket

24

PDJXNEDQH[SUHVV]iOWDWYDPDMGQHPDWHOMHVUHGR[DNWLYLWiVWPHJ UL]WpND]RQEDQD] izomeráz aktivitás nagy mértékben visszaesett, így nagymértékben hasonlatossá vált a bakteriális DsbA fehérjéhez. Ahogy arról már korábban is szó volt, az (FROL

SHULSOD]PiMiEDQHJ\NO|QIHKpUMHD'VE&IHOHO VDKHO\WHOHQONLDODNXOWGLV]XOILGN|WpVHN izomerizálásáért. Szarvasmarha pankreász tripszin inhibitor modellszubsztrát esetében

NLPXWDWWiNKRJ\PHJIHOHO 3',UHGR[/izomeráz aktivitás eléréséhez a redox-inaktív

domének jelenléte is szükséges (33). A E¶GRPpQ~J\W QLNNLHPHOWIRQWRVViJJDOEtUD]

izomerizációs aktivitás meglétében. Ez a domén továbbá az D¶ és a F domének megléte

HOHQJHGKHWHWOHQOV]NVpJHVDNLHOpJtW PpUWpN GLV]XOILGiWUHQGH] GpVKH]MHOHQ

modellszubsztrát esetén). A PDI nélkülözhetetlen a 6FHUHYLVLDH életben maradásához,

mely eszenciális szerepe a fehérje diszulfid hidak izomerizációjából fakad, habár redox aktivitása is kiemelt fontossággal bír (131, 38, 60, 95). Több, a PDI családba tartozó fehérje +XPiQ3',(XJS(5S3 NpSHVYROWD3',KLiQ\RVpOHV]W W|U]VHNW~OpOpVpW biztosítani, izomeráz aktivitásuk révén (61, 146, 68).

7HKiWD3',IHOHO V±N|]YHWOHQWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVWNDWDOL]iOyDNWLYLWiVDUpYpQ±D]

eukarióta szervezetekben a fehérje diszulfidkötések kialakulásáért, továbbá a helytelenül kialakult kötések izomerizálásáért is. Így bakteriális analógiával élve „egy személyben”

WHVWHVtWLPHJDWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVpUWIHOHO V'VE$WYDODPLQWDGLV]XOILGNRUUHNWRU fehérje DsbC-t is. Ahogy korábban a bakteriális esetben is adódott a kérdés, most is

IHOYHW GLNPLO\HQWRYiEELWDJRN EyOiOODWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVLOiQFRODW"0LD

WRYiEELVRUVXNDUHGXNiOWIHKpUMpNU OD3',UHNHUOWHOHNWURQRNQDN"A PDI oxidoreduktáz

funkciójához az enzim aktív centrumában található tiolok folyamatos reoxidációja szükséges. Mi gondoskodik a PDI aktív oxidált állapotának fenntartásáról? $3',PLQWHQ]LPNRPSOH[HNDOHJ\VpJH A protein diszulfid izomeráz két enzim a prolil-4-hidroxiláz és a mikroszómális triacilglicerol transzfer protein eszenciális alegysége is.

$NROODJpQH]DWLSLNXVH[WUDFHOOXOiULVIHKpUMHFVDOiGMHOOHJ]HWHVLVPpWO G *O\;<

aminosavtriplettet tartalmaz. Az Y helyzetben leggyakrabban 4-hidroxiprolin található. A

25

KLGUR[LSUROLQVHJtWVpJpYHOKiURPKDVRQOyV]HUNH]HW IHKpUMHOiQFHJ\WULSODKpOL[ molekulává áll össze. A kollagén bioszintézisében ilyeténképp központi szerepet játszik a prolil-4-hidroxiláz, hiszen a 4-hidroxiprolin nélkülözhetetlen a stabil triplahélixek kialakulásához. A gerincesekben található enzim egy a2b2 tetramer (88), az enzim balegysége nem más, mint a protein diszulfid izomeráz (92). A protein diszulfid izomeráz enzimen belüli szerepe nincs összefüggésben a diszulfid izomeráz aktivitásával. A PDI

PLQGNpW&\V*O\+LV&\VDNWtYKHO\pQHNLQDNWLYiOiViYDOHO iOOtWRWWGXSODPXWiQVWHOMHVHQ ép, aktív prolil-4-hidroxiláz tetramert képzett (158). A PDI prolil-4-hidroxilázban betöltött szerepe látszólag az oldhatatlan a-alegység aktív nem aggregálódott formában tartása, tehát

PLQWHJ\KHO\LPROHNXOiULVFKDSHURQNpQWP N|GLN

A PDI heterodimert alkot egy LQYLWUR lipidtranszfer aktivitással bíró 97 kDa-os fehérjével

is. Ketten együtt alkotják a mikroszómális triglicerid transzfer proteint (MTP), mely a hepatociták és intesztinális sejtek endoplazmás retikulumának lumenében található (166, 167, 55). A PDI nélkülözhetetlen a mikroszómális transzfer protein aktivitásának

IHQQWDUWiViKR]pVD]HO|] HVHWKH]KDVRQODWRVDQPHJDNDGiO\R]]DDN'DRVDOHJ\VpJ

DJJUHJiFLyMiW $N'DRVDOHJ\VpJIHOHO VD]DSR%WDUWDOP~OLSRSURWHLQHN

szintéziséért (kilomikron, VLDL), genetikai hiánybetegsége az apobétalipoproteinémia (161, 122). /pSpV%UHDYDJ\D]HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPR[LGi](52 Az endoplazmás retikulum lumenének oxidatív környezete elengedhetetlenül szükséges a

V]HNUpFLyUDNHUO IHKpUMpNGLV]XOILGN|WpVHLQHNNLDODNtWiViKR]pVKDWpNRQ\

feltekeredésükhöz. $KRJ\DUUyOPiUNRUiEEDQV]yYROWDN|]HJPHJIHOHO UHGR[

potenciálját a redukált/oxidált glutation (GSH/GSSG) redox puffer biztosítja: a glutation teljes koncentrációja (GSH és GSSG együtt) hasonló a citoszólban és a lumenben, de a GSH/GSSG arány az endoplazmatikus retikulum lumenében és a szekréciós útvonalon végig 2:1 körül van, míg a citoszólban ez az arány körülbelül 50:1. Így nem csoda, hogy éveken keresztül élt az a feltételezés, hogy az endoplazmás retikulumban relatív túlsúllyal bíró GSSG a fehérje diszulfid hidak kialakulásához szükséges elektron akceptor (71). A

26

GSSG túlsúlyt pedig a GSSG GSH-val szemben mutatott preferált mikroszómális transzportjával magyarázták (71).

EDQ.DLVHUpVPXQNDWiUVDLJOXWDWLRQV]LQWp]LVpUHNpSWHOHQ*6+PXWiQV pOHV]W

törzsek vizsgálata során azt találták, hogy a sejtek DTT-vel kiegészített minimum táptalajon

PHJ UL]WpNQ|YHNHGpVLNpSHVVpJNHW$IHKpUMHGLV]XOILGRNNLDODNXOiVD– annak ellenére,

KRJ\DVHMWHNGHWHNWiOKDWyPHQQ\LVpJ JOXWDWLRQWnem tartalmaztak – nem szenvedett

NiURVRGiVW $N|YHWNH] pYEHQPXQNDFVRSRUWXQNSDWNiQ\PiMHQGRSOD]Pás retikulum

esetében megállapította, hogy a redukált és oxidált glutation közül – D]HO ]HWHV

hipotézisekkel ellentétben – a GSH transzportja preferált. A transzportált GSH részlegesen oxidálódik a lumenben. Mivel a GSSG transzportja igen lassú, az intravezikulárisan

NpS] G *66*DNNXPXOiOyGLNDOXPHQEHQ $]HO EEHPOtWHWWDPHULNDLPXQNDFVRSRUW

K PpUVpNOHWpU]pNHQ\PXWiQVpOHV]W W|U]VHNYL]VJiODWDVRUiQHJ\DV]HNUpFLyVIHKpUMpN

HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPEyOW|UWpQ H[SRUWMiEDQVpUOWPXWiQVEDQHUR L]ROiOWDaz ERO1 gént. A törzs képtelen volt növekedésre, továbbá a karboxipeptidáz Y endoplazmás retikulum érett alakjának létrehozására 36 oC felett (46). Az ERO1 a 65 kDa-os endoplazmatikus glikoproteint, az Ero1p-t kódolja (46, 123). Az

ERO1 fehérjetiol oxidációban betöltött szerepét több módon is alátámasztották. A szerkezetükben számos eszenciális diszulfidot tartalmazó karboxipeptidáz Y (5 intramolekuláris diszulfid híd) (37), valamint Gas1p fehérje (14 cisztein) az ero1-1 mutánsokban megrekedt az endoplazmás retikulumban, míg az esszenciális diszulfidot nem WDUWDOPD]yLQYHUWi]QRUPiOLVLG EHQHOKDJ\WDD]HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPRWpVUHQGHOWHWpVL helyére került (76, 46). Vad típusú sejteket a redukálószer DTT-vel kezelve hasonló eredményt tapasztaltak (76). A diszulfid kötést tartalmazó karboxipeptidáz Y, Gas1p endoplazmás retikulumban történt szelektív visszatartása a fehérje folding defektusát

YDOyV]tQ VtWL $]HURPXWiQVEyOV]iUPD]yNDUER[LSHSWLGi]
D]RQRVPRELOLWiVVDOUHQGHONH]HWWDYDGiPP0'77YHONH]HOWVHMWE OV]iUPD]y

mintával. AMS tiolreagens segítségével bebizonyították, hogy a karboxipeptidáz Y 10 cisztein részlete redukált állapotú maradt az ero1-1 mutáns törzsekben, míg a vad törzsekben ezek diszulfiddá oxidálódtak.

27

Megfigyelték, hogy a hibásan feltekeredett fehérjék kiváltotta stresszválasz (unfolded

protein response) indukálja D](URSH[SUHVV]LyMiW (]DWpQ\WRYiEEHU VtWHWWHaz Ero1p diszulfid kötések kialakulásában játszott szerepét, mivel ezen szabályozás azon

JpQHNYpGMHJ\pOV]ROJiOPHO\HND](5EDQIRO\yIHKpUMHIROGLQJUpV]WYHY L $]

Ero1p aktivitásában bekövetkezett csökkenés növelte a sejt DTT-vel szemben mutatott érzékenységét (46). Ero1-1 mutáns sejtek esetében, mind az életképességet, mind az oxidatív fehérjefoldingot képes volt helyreállítani a táptalajhoz adott tioloxidálószer, a diamid (46). Az újonnan felfedezett ERO1 gén terméke tehát minden bizonnyal tevékeny V]HUHSHWYiOODODIHKpUMHGLV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiViEDQ)HOYHW G|WWDNpUGpVPLO\HQ

YLV]RQ\I ]LDPiULVPHUW3',JpQFVDOiGKR]"Esetleges redundanciáról lehet szó, képesek HJ\PiVWKHO\HWWHVtWHQL"$NpUGpVWHOG|QWHQG 3',GHILFLHQVVHMWHNHWHOV OpSpVEHQ

diamiddal kezeltek, mely nem hozott D]HO ] HVHWKH]KDVRQOyVLNHUHVW~OpOpVW (]W

N|YHW HQD](52JpQWW~OH[SUHVV]iOWDWWiNDPHO\D]HO ] HVHWKH]KDVRQODWRVDQQHP

eredményezett életképes vonalat (46). Pozitív kontrollként a PDI családba tartozó EUG1, valamint MPD1 sikeresen biztosította a PDI1 deficiens vonal túlélését (146, 148). Végül a

K PpUVpNOHWpU]pNHQ\HURPXWiQVpOHWNpSHVVpJpWSUyEiOWiNPHJYLVV]DiOOtWDQLD3',pV

az EUG1 gén túlexpresszáltatásával (46). 6LNHUWHOHQO(EE ODUUDN|YHWNH]WHWKHWQNKRJ\ D](URSpVD3',HJ\PiVWyONO|QE|] GHHJ\DUiQWHVV]HQFLiOLVIXQNFLyYDOUHQGHONH]LND

fehérje tiol oxidáció folyamatában. A kérdés azonban továbbra is adott volt: milyen funkcionális kapcsolat állhat fenn a

karboxipeptidáz Y, a PDI és D](URSN|]|WW"$]HO EEHPOtWHWWJHQHWLNDLWHV]WHNYDODPLQW DGLDPLGGDONDSRWWHUHGPpQ\HND3',W OD](URSLUiQ\iEDPXWDWyHOHNWURQiUDPRW

YDOyV]tQ VtWHWWHN$PHQQ\LEHQH]DNpWIHKpUMHN|]|WWGLUHNWWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVVHO

jön létre, a feltételezett mechanizmust a vegyes PDI-Ero1p diszulfid izolálásával

EL]RQ\tWDQLOHKHW$GLV]XOILGNLFVHUpO GpVLIRO\DPDWRWPHJV]DNtWYDNLPXWDWKDWyYROWDNpW fehérje közt kialakult vegyes diszulfid (45). A teljes endogén PDI tartalom mintegy 0,7 %-a YHJ\HVGLV]XOILGRWDONRWRWWD](URSYHO+DVRQOyNpSSHQYHJ\HVGLV]XOILGRNNpS] GpVpW

figyelték meg a 31 kDa-os ER rezidens PDI homológ MPD2p és az Ero1p között is (147).

(]WN|YHW HQPHJYL]VJiOWiND3',LQYLYR oxidációs állapotát. Az AMS tiolreagenssel

HOYpJ]HWWNtVpUOHWHNWDQXOViJDV]HULQWD3',G|QW KiQ\DGDR[LGiOWiOODSRW~LQYLYR(45).

28

(]]HOHOOHQWpWEHQD]HURPXWiQVW|U]VE OV]iUPD]y3',DNWtYKHO\pQHNQpJ\FLV]WHLQMH

UHGXNiOWiOODSRW~YROW (]HQHUHGPpQ\HNHJ\UpV]U OUiYLOiJtWDQDND](52V]HUHSpUHD

PDI aktív helyének oxidált állapotú fenntartásában LQYLYRPiVUpV]U OPHJHU VtWLND3', (URSYHJ\HVGLV]XOILGIL]LROyJLiVN|]WLWHUPpNPLYROWiWD]HOHNWURQRN3',U O(URSUH

W|UWpQ iWDGiViEDQ

$WHOMHVLJD]ViJKR]D]LVKR]]iWDUWR]LNKRJ\EiUD3',G|QW UpV]HR[LGiOWiOODSRW~LQYLYR, tJ\PLQGHQEL]RQQ\DOPLQWR[LGi]P N|GLNDYDGW|U]VHNE OV]iUPD]y3',HJ\NLVHEE

hányada LQYLYR redukált állapotban volt (45). Ez talán közrejátszhat a PDI izomeráz

szerepének betöltésében, amihez ugyanis tiol formátumú PDI szükséges. A tiol-diszulfid

NLFVHUpO GpVLOiQFRWWRYiEEIHMWYHVLNHUOW3',NDUER[LSHSWLGi]YHJ\HVGLV]XOILGRWL]ROiOQL bizonyítva, hogy a PDI közvetlenül részt vesz a karboxipeptidáz diszulfid kötéseinek NLDODNtWiViEDQ $GLV]XOILGRNNpS] GpVH3',GHILFLHQVW|U]VHNEHQHOPDUDGWD

karboxipeptidáz tiol csoportjai redukáltak maradtak (45). Ezen PDI-szubsztrátfehérje YHJ\HVGLV]XOILGRND]HO ] SpOGiKR]KDVRQODWRVDQ(URS3', D3',NDWDOL]iOWD

oxidációs, redukciós és izomerizációs folyamatok fiziológiás köztitermékeit képviselhetik.

$NtVpUOHWHNDODSMiQIHOiOOtWRWWPRGHOOUHQGV]HUEHQD](URSWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVVRUiQ

R[LGiOMDD3',WDPHO\WRYiEELWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVLIRO\DPDWRNVRUiQNDWDOL]iOMDD szubsztrátfehérjék diszulfid kötéseinek érését. Az Ero1p, mind vad, mind PDI hiányos

VHMWHNEHQHJ\DUiQWR[LGiOWiOODSRW~DPHO\PHJHU VtWLDIHOWpWHOH]HWWHOHNWURQiUDPOiVLLUiQ\

helyességét. $)$'PLQWHOHNWURQiWYLY $]HO ] PHJiOODStWiV~MDEENpUGpVWYHWHWWIHOPLEL]WRVtWMDD](URSR[LGiOWiOODSRWiW"$ bakteriális rendszerrel esetleg fennálló analógia felvetette (1.2.2.1.1.3. fejezet) az elektron transzferben az ubikinon lehetséges szerepét. A kérdés megválaszolására COQ5 gén

GHILFLHQVXELNLQRQV]LQWp]LVpUHNpSWHOHQ W|U]VHNHWiOOtWRWWDNHO $NtVpUOHWHW kiegészítették HEM1 deficiens, hem szintézisére képtelen (5), valamint Nfs1p depletált FeS fehérjék szintézisében sérült törzsek (87) vizsgálatával. A kapott eredmények szerint sem a modellszubsztrát karboxipeptidáz Y diszulfid kötéseinek kialakulása, sem az Ero1p

29

reoxidálása nem sérült a vad törzsekhez képest (150). A vizsgálatot elvégezték anaerob N|UOPpQ\HNN|]|WWLVPHO\VRUiQD](URSPLQGYpJLJP N|G NpSHVPDUDGW$]

eredmények alapján a Fe-S fehérjék, a molekuláris oxigén, a hem és az ubikinon szerepét az Ero1p mediálta oxidatív folding során kizárták (150). A vizsgálatokat RIB5 gén deficiens, így riboflavin szintézisére képtelen – ezáltal FMN, FAD hiányos – törzsekre kiterjesztve érdekes eredményre jutottak. A táptalajból a riboflavint megvonva a karboxipeptidáz foldingja sérült, a PDI és az Ero1p redukált

iOODSRWEDQIHOKDOPR]yGRWW $ULERIODYLQEyOW|UWpQ )01YDODPLQW)$'V]LQWp]LVppUW

IHOHO VIHKpUMpNHWNyGROy)01YDODPLQW)$'JpQHNW~OH[SUHVV]iOWDWiViYDOHNpWDQ\DJ Ero1p mediálta fehérje foldingban betöltött szerepét igyekeztek kideríteni. Az FMN1

W~OH[SUHVV]iOWDWiVDDK PpUVpNOHWpU]pNHQ\HURW|U]VV]HUpQ\pOHWNpSHVVpJQ|YHNHGpVpW HUHGPpQ\H]WHD]RQEDQD)$'W~OH[SUHVV]iOiVDHU WHOMHVHQHOQ\RPWDD]HUR

K PpUVpNOHWpU]pNHQ\VpJpW$)$'GLV]XOILGN|WpVHNNLDODNXOiViEDQEHW|OW|WWN|]YHWOHQ

V]HUHSpWEL]RQ\tWRWWDKRJ\YDGWtSXV~W|U]VHNE OL]ROiOWPLNURV]yPiNHVHWpEHQ)$'

KR]]iDGiVDQDJ\PpUWpNEHQPHJJ\RUVtWRWWDD3',UHR[LGiFLyMiW'77NH]HOpVWN|YHW HQ

(150).

$WLV]WtWRWW(URSHJ\MyOHONO|QO DEV]RUEFLyVFV~FFVDOUHQGHONH]LND)$'UDMHOOHP] 450 nm-es hullámhossznál. Denaturált Ero1p fordított fázisú HPLC-s elemzése során a FAD sztenderddel eluálódó, egyedi fluoreszcens csúcs detektálható (150). Mindezek

DODSMiQD](URSYDOyV]tQ OHJD)$'RWQHPNRYDOHQVHQN|W IODYRSURWHLQ

Megvizsgálták, hogy az Ero1p képes-e LQYLWURR[LGi]NpQWP N|GQL0RGHOOV]XEV]WUiWQDND ribonukleáz A-t (RNáz A) választották, amely szerkezetében négy, aktivitásához szükséges GLV]XOILGN|WpVWWDUWDOPD] .DWDOtWLNXVPHQQ\LVpJ (URS3',pV)$'MHOHQOpWpEHQ NpSHVYROWD]HO ]HWHVHQUHGXNiOWULERQXNOHi]$PRGHOOV]XEV]WUiWUHDNWLYiOiViUD6'6 poliakrilamid gélelektroforézis segítségével alátámasztották, hogy az aktivitás visszanyerését a négy eszenciális diszulfid híd kialakulása (reoxidációja) okozta (150). Az

51i]UHIROGLQJMDHJ\pUWHOP 3',(URSpV)$'IJJpVWPXWDWRWW*6+UDYDJ\*66*UH nem volt szükség a folyamathoz. Piridin nukleotidok, mint a redukált vagy oxidált NAD, NADP szintén nem játszottak szerepet a folyamatban (150). $]LQYLYR megfigyelésekkel jó

30

|VV]KDQJEDQYROWDUHDNFLy)01QHOV]HPEHQPXWDWRWWHU V)$'SUHIHUHQFLiMD$](URS

PHQQ\LVpJpQHNQ|YHNHGWpYHOQ WWDUHR[LGiOW51i]PHQQ\LVpJHLV

$](URSWHKiWHJ\HIIHNWtYR[LGi]DPHO\±)$'IJJ PyGRQ±D3',YHON|]YHWOHQ

IHKpUMHIHKpUMHWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVUpYpQNDWDOL]iOMDDGLV]XOILGN|WpVHNGHQRYR NpS] GpVpWpOHV]W EHQ

$]DOWHUQDWtY~WYRQDO(59 $]HO ] IHMH]HWUiYLOiJtWRWWKRJ\D](URSV]NVpJHVDIHKpUMHWLRORNYDODPLQWDJOXWDWLRQ intraluminális oxidációjához. A redukált glutation és a fehérje tiolok között tényleges

YHUVHQ\DODNXOKDWNLD](URSW OV]iUPD]yÄR[LGiOyHNYLYDOHQVHNpUW´ $PHJILJ\HOpVW

DOiWiPDV]WRWWDKRJ\D]HURPXWiQVRNK PpUVpNOHWpU]pNHQ\VpJpWFV|NNHQWHQLOHKHWHWW gsh1D mutánsok esetén, amelyek képtelenek voltak glutation szintézisére (31). Ezzel a módszerrel a totális ERO1 deléció szintén szupresszálható volt, az ero1Dgsh1D dupla

mutáció életképes volt, növekedett, valamint normális diszulfid kötéseket alakított ki (136).

(]DPHJILJ\HOpVHJ\DOWHUQDWtY(URSW OIJJHWOHQNHUO ~WYRQDOPHJOpWpUHXWDOW

$](URSW OIJJHWOHQ~WYRQDOWDJMDLQDNIHOGHUtWpVpUHRO\DQJpQHNNHUHVpVpEHIRJWDN

PHO\HNHWKDW~OH[SUHVV]iOWDWQDNNpSHVHND]HURPXWiQVRNK PpUVpNOHWpU]pNHQ\VpJpW

elnyomni. A keresés eredményesen zárult, az ERV2 gén túlexpresszáltatása képes volt az ERO1 gén

WHOMHVGHOpFLyMiQDNOHWDOLWiViWNLYpGHQL$JpQWHUPpNHD](UYSMHOHQW VV]HNYHQFLD

homológiát mutat az Erv1p/$OUSIHKpUMHFVDOiGWDJMDLYDOPHO\DODSMiQ WLVHEEHDFVDOiGED

sorolták be (136, 142). A család egyik névadó tagja az Erv1p, amely a mitokondrium intaktságához szükséges mátrixfehérje (98, 66). A közelmúltban ismertté vált, hogy az Erv1p szulfhidril oxidáz aktivitással is rendelkezik (96), mely aktivitás a fehérje C-

WHUPLQiOLVV]DNDV]iKR]N|WKHW $]HPOtWHWWIHKpUMHUpV]OHWHJ\<3&;;&V]HNYHQFLiWpV nem kovalensen kötött FAD-ot tartalmaz. A két fehérje közötti szekvenciahasonlóság a C-

WHUPLQiOLVUpV]OHWUHpVDQQDNHU VHQNRQ]HUYiOW<3&;;&UpV]OHWpUHNRUOiWR]yGLN$NpW

31

IHKpUMHIHOWpWHOH]KHW HQQHPSyWROMDHJ\PiVWPLYHOD](UYSW~OH[SUHVV]iOWDWiVDQHPWXGWD az ERV1 mutációjának, vagy teljes deléciójának hatását kivédeni (142).

$]HOP~OWHV]WHQG NVRUiQQpKiQ\WRYiEELD](UYS&WHUPLQiOLViYDOKRPROyJGRPpQW tartalmazó fehérjét is leírtak. Ez a 80-100 aminosavas részlet az Erv1/Alrp fehérjecsalád

YpGMHJ\pYpYiOW$IHKpUMHUpV]OHW&;;&V]HNYHQFLiMDIHOHO VDGLV]XOILGN|WpVHN

NLDODNtWiVipUW(PO VV]HUYH]HWHNEHQDIHKpUMHFVDOiGWDJMDLIRQWRVQ|YHNHGpVLIDNWRURN$ humán ALR (Augmenter of Liver Regeneration) egy citoplazmatikus fehérjét kódol, amely

DPiMUHJHQHUiOyGiViWVHJtWLHO UpV]OHJHVKHSDWHNWyPLiWN|YHW HQ DIHKpUMH

karboxil-terminálisa képes az Erv1p szulfhidril oxidáz domén funkcionális helyettesítésére

$](UYSYHOpVD]$OUSYHOKRPROyJGRPpQQHOUHQGHONH] KXPiQpVFVLUNH4 fehérje a fibroblasztok osztódását regulálja (27). A csirke Q6 fehérje a család

HQ]LPDWLNXVDQOHJDODSRVDEEDQMHOOHP]HWWV]XOIKLGULOR[LGi]D$W|EELFVDOiGWDJNHWW VV]iO~

DNS vírusok genomjában kódolt (142, 170, 133). Az ER1YLUiOLVIHKpUMpU OD

közelmúltban derítették ki, hogy a citoszolban folyó diszulfid híd kialakulás egy fontos

UpV]WYHY MH, 135). Ilyen családi háttérrel nem csoda, hogy az Erv2p intenzív kutatások alanyává vált.

$](59JpQWW~OH[SUHVV]iOWDWYDPLQGD]HURK PpUVpNOHWpU]pNHQ\PXWiQVPLQGD] ero1D nullmutáns törzsek életképesnek bizonyultak, DTT toleranciájuk növekedett, valamint a karboxipeptidáz Y modellszubsztrát a vad törzsekhez hasonlóan érett állapotban hagyhatta el az endoplazmás retikulumot (136). A tisztított rekombináns Erv2p élénk sárga volt, spektrumában két abszorpciós maximumot találtak a FAD elnyelési csúcsainál (382 és

QP DPHO\D)$'N|WpVpUHXWDO)OXRUHV]FHQVYL]VJiODWRNPHJHU VtWHWWpND)$'

PLQ VpJLPHJKDWiUR]iViW$IODYLQUpV]OHWIRUUDOiVYDJ\WULNOyUHFHWVDYDVNH]HOpVKDWiViUDD

PROHNXOiUyOHOWiYROtWKDWyYROWD)$'QHPNRYDOHQVN|W GpVpWMHOH]YH

Sztöchiometriai vizsgálatok szerint egy monomer fehérje egy molekula FAD-ot köt. A tisztított rekombináns fehérje FAD jelenlétében képes volt a DTT mint modelltiol

oxidációjára. A tiolok fogyása jó összhangban állt a FAD FADH2YpW|UWpQ UHGXNFLyMiQDN mértékével. A redukált FAD az oldatba vezetett oxigénnel regenerálható, visszaoxidálható

volt. Az oxigén oldatbeli szintje azonnal csökkeni kezdett (1 mol O2/1 mol diszulfid NpS] GpVH DPLQWD](UYS)$'ROGDWKR]'77WDGWDNH]]HOSiUKX]DPRVDQ+2O2

32

megjelenését tapasztalták. Az Erv2, a molekuláris oxigént elektronakceptorként használva, képes a tiolok LQYLWURR[LGiFLyMiUD$]HURPXWiQVW|U]VK PpUVpNOHWpU]pNHQ\VpJpW

elnyomta aerob körülmények között az Erv2p túlexpresszáltatása, anaerob körülmények között azonban erre nem volt képes (136). A molekuláris oxigén tehát mind LQYLWUR, mind

LQYLYRQpONO|]KHWHWOHQD](UYSP N|GpVpKH]

Normális életkörülmények között az Erv2p nem szükséges a diszulfid kötések kialakulásához, vad típusú háttér esetén az ERV2 deléciója a diszulfid kötések kialakulásában nem okoz rendellenességet (48, 136). A fehérje sejten belüli elhelyezkedését

YL]VJiOYDPHJiOODStWRWWiNKRJ\DIHKpUMHI UpV]HLQWUDOXPLQiOLVD]1WHUPLQiOLVUpV]H pedig az ER membránba merül horgonyként (48, 136). A fehérje nem redukáló

N|UOPpQ\HNN|]|WWN'DRVGLPHUHNHWDONRWDGLPHUL]iFLypUWIHOWpWHOH]KHW HQD]&

WHUPLQiOLVV]DNDV]DIHOHO V $IHKpUMHV]HUNH]HWpQHNPHJLVPHUpVHN|]HOHEEYLWW

P N|GpVpQHNUpV]OHWHVHEEPHJpUWpVpKH]LV$)$'DIHKpUMHNpWa-hélix szakasza (a4 és

a N|]pN|W GLN -HOHQOHJLLVPHUHWHLQNV]HULQWD](UYD]ÄDOOa´RV]WiO\HOV )$' N|W WDJMD$](UYSKDWFLV]WHLQMHN|]OFVDNNHWW &\V&\V WDOiOKDWyPHJD

család összes ismert tagjában. Az Erv2p Cys-Gly-Glu-Cys szekvenciája a tioredoxin CysX-X-Cys részletéhez hasonlatosan az N-terminális részen helyezkedik el és egymással diszulfid kötéssel kapcsolódik. A családból az Erv1p, az Erv2p és az Alrp egy további ciszteinpárost is tartalmaz, melyek a 150-es és a 167-es pozíciót foglalják el az Erv2p-ben. Ez a két cisztein is diszulfid kötést alkot egymással az FAD adenin részletének közelében és az a4 hélixxel szemben rögzíti a rövid C-terminális a5 hélix szakaszt (57). Az Erv2p fentmaradó két ciszteinje a Cys 176 és a Cys 178 szintén diszulfid kötést alkot egymással

D]HQ]LP&WHUPLQiOLVV]DNDV]iQ(J\PiVWyOHJ\HWOHQDPLQRVDYYDOHONO|QO FLV]WHLQHN WLROFVRSRUWMDN|]|WWNLDODNXOyGLV]XOILGN|WpVHNFVDNUHQGNtYOULWNiQIRUGXOQDNHO D

fehérje szerkezet adatbázisokban alig néhány ilyen eset található (57). Tioredoxin irányított mutációja során az aktív hely Cys-Gly-Pro-Cys szekvenciáját Cys-Ala-Cys szekvenciára változtatták, a beavatkozás eredményeképpen egy hatástalan redukálószert nyertek, melyet ha oxidáltak dimereket alkotott (51). A feszített diszulfid kötések jó oxidálószerek, ez alapján az Erv2p Cys-Gly-Cys részlete várhatóan képes a szubsztrát fehérjékben diszulfid kötések kialakítására. A fehérje C-terminálisa rendkívüli flexibilitással rendelkezik, az

33

HVHWHNIHOpEHQHOKDMORWWDGLPHUIHOV]tQpW OpVD&\V*O\&\VUpJLyXJ\DQD]RQSURWRPHUa5

hélixével került szembe. Az esetek másik felében a C-terminális rész az aKpOL[W OWiYRO

KHO\H]NHGLNHOpVDGLPHUHOOHQNH] ROGDOiQDNDNWtYKHO\HHO WWIHNV]LN(]iOWDODWHUPLQiOLV rész Cys178 Cb atomja 4 A-ön belüli távolságra kerül a Cys121 Cb atomjától (ezzel

V]HPEHQD]HO ] NRQIRUPiFLyHVHWpEHQA volt a távolság), amely lehet VpJHWWHUHPWD két aminosav közötti diszulfid kötés kialakítására (57). Az Erv2p protomerek alegységei között létrejött diszulfid híd meglétét LQYLYR is igazolták. A Cys 121, vagy a Cys176, Cys 178 páros alaninra cserélésével az Erv2p dimer kialakulását meg tudták gátolni (57). A

&\VYDJ\D&\VHJ\HGLNLFVHUpOpVHDGLPHUNpS] GpVWQHPEHIRO\iVROWDD]W

YDOyV]tQ VtWYHKRJ\D&WHUPLQiOLVUpV]HOHJHQG IOH[LELOLWiVVDOUHQGHONH]LNKRJ\PLQGD

Cys176, mind a Cys178 képes legyen a Cys121-gyel diszulfid kötés kialakítására. Az Erv2p mutációk LQYLYR vizsgálata során mindhárom egyedi Cys-Ala mutációt ero1-1 mutáns törzsekben túlexpresszáltatták és megfigyelték, hogy képesek-e a

K PpUVpNOHWpU]pNHQ\HURPXWiQVV]XSUHVV]iOiViUD$PXWiQVRNHJ\LNHVHPYROWNpSHV D]HURK PpUVpNOHWpU]pNHQ\VpJpQHNEHIRO\iVROiViUDD]WPXWDWYDKRJ\QHP rendelkeznek LQ YLYR aktivitással (48, 57).

$NtVpUOHWHNVHJtWVpJpYHODN|YHWNH] PRGHOOWiOOtWRWWiNIHODYDGWtSXV~(UYS

FpOIHKpUMpLW OD&\V*O\&\VGLV]XOILGN|WpVIHOQ\tOiVDUpYHQHOHNWURQRNDWYHV]iWPDMGD] elektronok a FAD-proximális Cys-Gly-Glu-Cys részletre kerülnek a c-terminális farki rész flexibilitása segítségével egy fehérjén belüli elektroningajáratot megvalósítva (57). Adódott a kérdés: képes-e az Erv2p a potenciális célfehérjéjének tartott PDI oxidálására? A

WLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVLIRO\DPDWRWPHJV]DNtWYD(UYS3',YHJ\HVGLV]XOILGRNDW

GHWHNWiOWDNWHKiWD](UYSpVD3',N|]|WWWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVLUHDNFLyM|WWOpWUH

A diszulfid transzfer várható terméke az oxidált állapotú PDI, amely létrejöttét AMS tiolreagenssel végzett kísérletekkel bizonyították. A kísérlet során redukált Pdi1p-t és (UYSWUHDJiOWDWWDNHJ\PiVVDOD3GLSDNYDQWLWDWtYGLV]XOILGWUDQV]IHUQHNPHJIHOHO mértékben oxidálódott. Az Erv2p Cys 121-t, Cys 124-t alaninra cserélve a PDI redoxváltozása elmaradt (48).

34

) ~WpVNHUO ~WDN Az 1.6. ábra áttekintést ad a 6DFFKDURP\FHVFHUHYLVLDH endoplazmás retikulumában folyó

MHOHQOHJLVPHUW GLV]XOILGpUpVL~WYRQDODNUyOD]RNNDSFVRODWiUyO$]HOV GOHJHV~WYRQDONpW eszenciális fehérjét tartalmaz, az Ero1p-t és a Pdi1p-t. Az Ero1p-ben kialakult diszulfid

N|WpVHND3GLSDNWtYKHO\pUHNHUOQHNDNpWIHKpUMHN|]|WWOpWUHM|Y WLROGLV]XOILG

NLFVHUpO GpVUpYpQPDMGD3GLSU OKDVRQOyPyGRQWRYiEEtWyGQDNDV]XEV]WUiWIHKpUMpKH]

Az Ero1p ezúton összekötni látszik a sejt redox kémiáját az endoplazmás retikulumban

YpJEHPHQ GLV]XOILGpUpVLIRO\DPDWRNNDOD3GLSSHGLJOiWV]yODJHJ\DV]XEV]WUiWIHKpUMpN diszulfid kötésének kialakítására adaptálódott mobil elektronszállító szerepet tölt be. Az endoplazmás retikulumon belül a redukált glutation és a fehérjetiolok között verseny alakul ki az Ero1p által kínált diszulfid kötésekért (31). A fehérjetiolok oxidációs

~WYRQDOiUDQHKH]HG ÄJOXWDWLRQQ\RPiVW´MHOHQW VHQFV|NNHQWHQLOHKHWHWWDJOXWDWLRQVHMWEHQ

W|UWpQ V]LQWp]LVpQHNEORNNROiViYDO

$](URSWPHJNHUO XWDWD](UYSW~OH[SUHVV]iOWDWiVDMHOHQWL$](UYSJ\DNRUODWLODJD]

Ero1p-vel párhuzamosan vesz részt a fehérje diszulfid hidak kialakításában. Az Erv2p NpSYLVHOWHNHUO ~WFVDNDHUREN|UOPpQ\HNN|]|WWD]R[LJpQPLQWHOHNWURQDNFHSWRU MHOHQOpWpEHQP N|G NpSHV$](UYSIpPMHOH]WHGLV]XOILGpUpVL~WYRQDOQRUPiOLV

körülmények között nem eszenciális, azonban csökkent Ero1p aktivitással járó genetikai

NpSHNHVHWpEHQD](UYSMHOHQW VHQKR]]iMiUXOWD]HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPGLV]XOILGN|WpVW OpWUHKR]yNDSDFLWiViKR]$](59H[SUHVV]LyMDVWDFLRQiULXVIi]LVEDQOpY VHMWHNHVHWpEHQ

LQGXNiOWD]WYDOyV]tQ VtWYHKRJ\HEEHQD]HVHWEHQQDJ\REEV]HUHSKiUXOD](UYSUHD] HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPÄR[LGiOyHNYLYDOHQVHNNHO´W|UWpQ HOOiWiViEDQ

Az Ero1p és az Erv2p eltérnek az elektronakceptorok tekintetében is. Az Ero1p mind O2

jelenlétében, mind O2KLiQ\iEDQPHJ U]LR[LGi]DNWLYLWiViWDUUDXWDOYDKRJ\IL]LROyJLiV

elektron akceptora nem a molekuláris oxigén (136). Az Ero1p fémjelezte útvonalat LQYLWUR rekonstruálták, a fehérje tiolok hatékony oxidálásához Ero1p-re, Pdi1p-re, valamint

V]W|FKLRPHWULNXVPHQQ\LVpJ )$'UDYROWV]NVpJ 9DOyV]tQ VtWKHW KRJ\D]

oldathoz adott FAD oxidálja vissza az Ero1p-t. Egy endoplazmás retikulum-citoszol között PHJOpY )$')$'+2N|UIRUJiVYDOyV]tQ VpJHD]RQEDQFVHNpO\PLYHOD]pOHV]W )$'

35

koncentrációja messze elmarad az Ero1p visszaoxidálásához LQYLWUR szükséges koncentrációtól (52), továbbá a legtöbb flavoprotein szorosan köti a FAD-ot, ami eleve NL]iUMDD]ROGDWWDOW|UWpQ IODYLQNLFVHUpO GpVLIRO\DPDWRW$IRO\DPDWHVpO\HLWWRYiEE

gyengíti, hogy ez idáig nem ismert egyetlen endoplazmás retikulum FAD transzporter sem. Az Ero1p-vel szemben az Erv2p szorosan köti flavin kofaktorát, és kizárólagosan molekuláris oxigént használ terminális elektronakceptorként (136). Az Erv2p bár NHUO ~WYRQDOGHD]HJ\HWOHQMHOHQOHJLVPHUWHQGRSOD]PDWLNXVGLV]XOILGN|WpVHN NLDODNXOiViWNDWDOL]iOy~WYRQDODKRODYpJV HOHNWURQDNFHSWRUGHILQLiOW

1.6. ábra A 6DFFKDURPLFHVFHUHYLVLDH endoplazmás retikulumában folyó fehérje tiol oxidáció útvonalai (Sevier HWDO, 137).

36

$WHUHPWpVNRURQiMD $]HPO V|NHQGRSOD]PiVUHWLNXOXPiEDQ]DMOyGLV]XOILGpUpVLIRO\DPDWRNUyOWXGXQND OHJNHYHVHEEHW9LV]RQWUHQGHONH]QND]]DOD]HO QQ\HOKRJ\D]HJ\V]HU EE

V]HUYH]HWHNEHQIRO\yUHDNFLyNNDOpVD]D]RNEDQUpV]WYHY IHKpUMpNNHONRIDNWRURNNDO

DQDOyJLiWWXGXQNYRQQLPHJN|QQ\tWYHNXWDWiVXNDW$]HOV NtVpUOHWHNVRUiQD]pOHV]W ERO1 szekvenciájával rokon expresszált szekvenciarészleteket kerestek a humán

genomban. A humán cDNS könyvtár átvizsgálása során egy komplett ERO1 homológra leltek, melyet ERO1-L-nek (ERO1-Like) nevezték el (20). A humán gén terméke egy 468 aminosavból álló polipeptid, amely 48,5%-os hasonlóságot pVRVD]RQRVViJRWPXWDWD]pOHV]W (URSYHO5iJFViOyNEDQLVVLNHUOWHJ\URNRQ

H[SUHVV]iOWV]HNYHQFLDUpV]OHWHWWDOiOQLDPHO\~J\W QLNKRJ\HJ\WHOMHV±DKXPiQ(52

L-lel 87,3%-ban azonos – kódoló szakaszt tartalmaz. A feltételezett fehérje pedig 92,7%-os V]HNYHQFLDD]RQRVViJRWPXWDWDKXPiQIHKpUMpYHO $]pOHV]W IHKpUMHOiQFDVDMiWRVVHP a humán, sem az egér fehérjében nem található 139 aminosav hosszú C-terminális részt

WDUWDOPD]+DVRQOyLJD]QHPLO\HQKRVV]~pVV]HNYHQFLiMiEDQD]pOHV]W pYHODOHJNLVHEE

hasonlóságot sem mutató terminális résszel rendelkezik az $UDELGRSVLVWKDOLDQD

fehérjelánca is (20). A legnagyobb szekvenciaazonosságot mutató egység a CXXCXXC részlet és környéke. A legkevésbé konzervált szakasz pedig az N-terminális, azonban a

V]DNDV]KLGURIyEMHOOHJHPHJWDUWRWWDPHO\YDOyV]tQ OHJHQGRSOD]PiV

V]LJQiOV]HNYHQFLDNpQWP N|GLNDUUDXWDOYDKRJ\D]pOHV]W (URSKH]KDVRQODWRVDQD család többi tagja is az endoplazmás retikulumban lokalizált (20, 3, 39). Ezt a feltételezést a humán ERO1-L esetében több kísérleti eredmény is alátámasztotta. A

fehérjét COS-7, valamint 293T sejtekben expresszáltatva, az immunfluoreszcens vizsgálatok szerint két ER markerrel (VH-CH1-GFP kiméra, ConA) is együtt lokalizálódott

(20, 39 $IHKpUMH1JOLNR]LOiFLyQPHJ\NHUHV]WODPLD](5IHKpUMpLUHMHOOHP] $](5

EHQW|UWpQ ORNDOL]iFLyMiYDO|VV]KDQJEDQXJ\DQRO\DQPpUWpN PRELOLWiVYiOWR]iVVDOUHDJiO mind az összes N-glikánt hasító Endo-F, mind csak az éretlen N-glikánokat hasító Endo-H kezelésre (20, 39). ,QYLWUR transzkripciós/transzlációs kísérletek során egy 58 kD-os

37

fehérjecsíkot nyertek. Mikroszómális vezikulák jelenlétében egy további, lassabb mobilitású termék megjelenését tapasztalták. A lassabban migráló polipeptid glikozidáz

pU]pNHQ\QHNEL]RQ\XOWD]WYDOyV]tQ VtWYHKRJ\DPLNURV]yPDMHOHQOpWpEHQV]LQWHWL]iOyGy

(52/1JOLNR]LOiOyGLN $PLNURV]yPiEDW|UWpQ WUDQV]ORNiFLyMiWSURWHi]RN VHJtWVpJpYHOLVPHJHU VtWHWWpN$PLNURV]yPDKLiQ\iEDQWUDQV]OiOyGRWW(52/

elektroforetikus mobilitása nem különbözött a transzlokálódott és deglikozilált transzlációs

WHUPpNpW O)DPLDUUDXWDOKRJ\D](52/V]LJQiOSHSWLGV]HNYHQFLiMDYDOyV]tQ OHJ QHPYiJyGRWWOHDIHKpUMpU O(ONpS]HOKHW KRJ\DQHPOHYiJyGyV]LJQiOV]HNYHQFLD

transzmembrán doménként viselkedik. Ennek azonban ellentmond az, hogy fehérjénk, a V]ROXELOLVNDOUHWLNXOLQKH]KDVRQOyDQHU VHQO~JRVS+QJ\DNRUODWLODJWHOMHVPpUWpNEHQ

HOYiODV]WKDWyYROWD](5PHPEUiQWyO0LQGH]HNDODSMiQD](52/YDOyV]tQ OHJHJ\

V]ROXELOLVIHKpUMHDPHO\V]RURVDQN|W GLNDPHPEUiQYDODPHO\NRPSRQHQVpKH], 118, 119).

9DODPHQQ\LYL]VJiOWVHMWYRQDOpVV]|YHWHVHWpEHQNLOHKHWHWWPXWDWQLNO|QE|] PpUWpN ERO1-L expressziót, mely a fehérje sejten belüli központi szerepére utal. Megvizsgálták,

KRJ\DKXPiQIHKpUMHNpSHVHDK PpUVpNOHWpU]pNHQ\pOHV]W HURPXWiQV

V]XSUHVV]LyMiUD$NtVpUOHWHJ\pUWHOP HQLJD]ROWDKRJ\DKXPiQ(52/OHOWUDQV]IHNWiOW

sejtek képesek 37 oC-on is a növekedésre (20)$KXPiQIHKpUMHGHIHNWXVWNLYpG KDWiVD

DUUDXWDOKRJ\±DPiUNRUiEEDQHPOtWHWW±KXPiQIHKpUMpE OKLiQ\]yD]RQEDQD]

pOHV]W EHQPHJOpY KRVV]~FWHUPLQiOLVIDUNLUpV]QHPHV]HQFLiOLVD]pOHWNpSHVVpJKH]$

PHJiOODStWiVWPHJHU VtWHWWHDHVSR]tFLyQiOFVRQNROWpOHV]W (52JpQ(52DC)

ero1-1 mutáns esetében 37 o&RQWDSDV]WDOWPHQW KDWiVDLV

Az ERO1 család valamennyi tagja esetében a CXXCXXC részletben tapasztalt nagyfokú

NRQ]HUYDWLYLWiVNLHPHOWIXQNFLRQiOLVV]HUHSpUHXWDO$&;;&;;&UpV]OHWIHOHO VOHKHWD

fehérje féléletidejéért, valamint az Ero1p-PDI komplex stabilitásáért (15). A három kiemelt fontosságú ciszteint alaninnel helyettesítve megvizsgálták a hipotézis helyességét. A 394-es és a 397-es cisztein mutációja meggátolta az ERO1-L-t az ero1-1

K PpUVpNOHWpU]pNHQ\VpJpQHNNLYpGpVpEHQD]RQEDQDHVFLV]WHLQDODQLQUDFVHUpOpVH után a fehérje viselkedése nem különbözött a vad típusétól (20).

38

Az ERO1-L nagymértékben mérsékelte az ero1-1 mutáns DTT-vel szemben mutatott

pU]pNHQ\VpJpWHEEHQD]HVHWEHQLVKDVRQOyHUHGPpQ\HNHWNDSWDND]pOHV]W (52DC

mutánssal. A CXXCXXC részlet második, illetve harmadik ciszteinje most is meghatározó szereppel bírt, ellenben a Cys391 alaninra cserélésével kapott mutáns ezúttal is a vad WtSXVKR]KDVRQOyHUHGPpQ\HVVpJJHOP N|G|WW

Az ERO1-L diszulfid hidak érésében betöltött szerepe mellett további bizonyítékul szolgált, hogy az ero1-1 mutáns sejtekben képes volt visszaállítani a karboxipeptidáz Y modellszubsztrát normális érési folyamatát (20). Az ERO1-L szekvenciáját felhasználva, átvizsgálták a GénbankTM expresszált szekvenciarészleteit. A vizsgálat eredményeképpen egy, az ERO1-L-hez nagyon hasonló, GHDWWyOHJ\pUWHOP HQHOWpU KXPiQV]HNYHQFLiUDEXNNDQWDN(]WIHOKDV]QiOYDDKXPiQ

cDNS könyvtárból egy 467 aminosavból álló fehérjét kódoló klónt sikerült azonosítani. Az

(52/OHOPXWDWRWWHU VV]HNYHQFLDNRQ]HUYDWLYL]PXVPLDWW(52/b-nak nevezték el, a korábban azonosított ERO1-L elnevezését pedig ERO1-La-ra módosították. Az ERO1-Lb

JpQWHUPpNHD]pOHV]W (URSYHO 50,6%-os hasonlóságot és 40,2%-os azonosságot

mutatott, míg a humán ERO1-L-lel a hasonlóság mértéke 74,8%-os az azonosságé pedig

RVYROW 1DJ\PpUWpN NRQ]HUYDWLYLWiVWPXWDWRWWDUHGR[DNWLYLWiVKR]

elengedhetetlen CXXCXXC részlet. A legnagyobb különbséget a két humán szekvencia

N|]|WWD](5ORNDOL]iFLypUWIHOHO VQHNWDUWRWW1WHUPLQiOLVUpV]HQILJ\HOWpNPHJ$&26 és HeLa sejteken elvégzett immunfluoreszcens vizsgálatok eredménye szerint az ERO1-Lb két endoplazmás retikulum fehérjével, a PDI-vel és a kalnexinnel is együtt lokalizálódott (118). Az endoglikozidáz H-val végzett kezelés 6 kDa-os mobilitásváltozást okozott (118), PHO\PHJHU VtWHWWHDIHKpUMH(5EHQW|UWpQ DNNXPXOiFLyMiWYDODPLQWLJD]ROWDD](52 Lb 4 glikozilációs helyének meglétét. Az ERO1-Lb tehát az ERO1-La-hoz hasonlatosan az ER-ben lokalizálódik (118, 39). Szolubilis ER rezidens fehérjék C-terminálisán rendszerint egy KDEL lokalizációs részlet található (115). Ez a lokalizációs részlet egyik fehérjében sincs jelen, így talány, hogy a két fehérje miként tudja fenntartani szubcelluláris lokalizációját. A két fehérje közti hasonlóság IXQNFLRQiOLVV]HPV]|JE OQp]YHLVYDOyV]tQ VtWKHW 0LQGNpWJpQNpSHVD]pOHV]W HUR

39

PXWiQVW|U]VK PpUVpNOHWpU]pNHQ\VpJpWV]XSUHVV]iOQLYDODPLQWDW|U]]VHOHJ\WWMiUy konstitutív UPR gyengítésére (118). Az ERO1-Lb az utóbbi vizsgálat során az ERO1-Lanál valamivel kevésbé hatékonynak bizonyult. Ez a különbség a mutáns ero1-1 törzs karboxipeptidáz Y érési folyamatának segítése, valamint DTT érzékenységnek csökkentése

VRUiQLVIHQQiOOWDNpWIHKpUMHN|]|WW $]HJ\HQO WOHQVpJHJ\LNRNDOHKHWKRJ\NLVHEE PHQQ\LVpJ KXPiQ(52/bDNNXPXOiOyGLND]pOHV]W NEHQDPLDKXPiQIHKpUMH tökéletlen ER transzlokációjára utal.

$NpWIHKpUMHV]HNYHQFLiMiWpVIXQNFLRQDOLWiViWpULQW NLWHUMHGWKDVRQOyViJRNHOOHQpUHD]

ERO1-La és ERO1-Lb transzkripciós mintázatát összehasonlítva lényeges különbségekre OHOWHN(O V]|ULVD](52/bWPLQWD]835FVDOiGWDJMiWD]RQRVtWRWWiNHEE OD

V]HPSRQWEyOMREEDQKDVRQOtWD]pOHV]W (URSKH]PLQWDKXPiQ(52/a-hoz. A DTT, a tunikamicin, a thapsigarin és más UPR-t aktiváló anyagok indukálták az ERO1-Lb

WUDQV]NULSFLyMiWPtJPiVMHOOHJ VWUHVV]RURNQHPEL]RQ\XOWDNKDWiVRVQDN$](52/a transzkriptszintet az UPR aktivátorok nem befolyásolták (118).

Az ERO1-Lb és az ERO1-LaH[SUHVV]LyMDDNO|QE|] V]|YHWHNEHQMHOHQW VPpUWpNEHQ

HOWpU D]RQEDQHJ\PiVWiWIHG HORV]OiVWPXWDWRWW$](52/bWUDQV]NULSFLyMDHOV VRUEDQ

a szekréciós szövetekben (pl.: pankreász, nyálmirigyek) kifejezett (118). Az ERO1-La és az ERO1-Lb részletesebb összehasonlítása és jellemzése céljából két

immunglobulinrészlet, a J és a kOiQFPLQGNHWW GLV]XOILGN|WpVHNHWWDUWDOPD] R[LGDWtY foldingját vizsgálták meg ERO1-La és ERO1-Lb túlexpresszáltatott sejtek endoplazmás retikulumában. Az eredmények azt igazolták, hogy mind az Ero1-La, mind az Ero1-Lb

PHJJ\RUVtWRWWDDFDUJRIHKpUMpNR[LGDWtYIROGLQJMiWD]HPO VVHMWHNHQGRSOD]PiV

UHWLNXOXPiEDQV WDW~OH[SUHVV]iOWDWRWWVHMWHNIRNR]RWW'77UH]LV]WHQFLiWPXWDWWDN).

Az oxidatív folding folyamata alatt megvizsgálták, milyen vegyes diszulfidok jönnek létre. A tény, mely szerint a humán ERO fehérjék és PDI, valamint a PDI és az immunglobulinláncok között kialakul, ugyanakkor a humán ERO fehérjék és a célfehérje immunglobulinok között nem alakul ki vegyes diszulfid, arra enged következtetni, hogy az HOHNWURQRNDQDVFHQVFDUJRIHKpUMpNU OD3',N|]YHWtWpVpYHODKXPiQ(52IHKpUMpNUH

kerülnek (110)$](52IHKpUMpNYLVV]DR[LGiOiVipUWIHOHO VIRO\DPDW±D]pOHV]W K|]

40

hasonlóan – jelenleg még ismeretlen. A PDI-hERO-n kívül más endoplazmatikus oxidoreduktázokkal (Erp57, Erp72, p5) képzett hERO vegyes diszulfidokat nem sikerült

kimutatni (110)(]HNYDJ\QDJ\RQU|YLGpOHW HNYDJ\H]HQIHKpUMpNR[LGiFLyVVWiWXViW±

D]pOHV]W EHQWDSDV]WDOWDNNDOHOOHQWpWEHQ±QHPDK(52IHKpUMpNPRGXOiOMiN (J\WRYiEELNO|QEVpJHWLVIHOIHGH]WHND]pOHV]W pVDKXPiQUHQGV]HUN|]|WWDPtJD]

pOHV]W NHVHWpEHQD3',G|QW KiQ\DGDR[LGiOWIRUPiEDQYROWMHOHQ DGGLJD

KXPiQVHMWHNEHQD3',MHOHQW VUpV]HUpV]OHJHVHQUHGXNiOWiOODSRW~YROW). Azonban

DTT kezelés után a PDI oxidáltabb formáját lehetett kimutatni (110)tJ\YDOyV]tQ VtWKHW

KRJ\DVHMWHJ\URERV]WXVR[LGiOyDSSDUiWXVWPR]JyVtWKRJ\PLQpOHO EEYLVV]DQ\HUMH

RSWLPiOLVR[LGiFLyViOODSRWiW$]HPO VVHMWHNYLV]RQ\ODJDODFVRQ\R[LGiOW3',WDUWDOPD

arra utal, hogy az oxidáló ekvivalensek gyorsan jutnak el a cargofehérjékig, mely

IHOWpWHOH]pVWD'77N|]HJE OW|UWpQ HOLPLQiOiViWN|YHW HQWDSDV]WDOKDWyJ\RUV3', immunglobulin J vegyes diszulfid szintcsökkenés is alátámaszt (110). Az elektronok a

QDVFHQVIHKpUMpNU OD3',N|]YHWtWpVpYHOKDVRQOyYDOyV]tQ VpJJHONHUOKHWQHND](52

La-ra, vagy az ERO1-Lb-ra. A közvetlen fehérje-fehérje kapcsolat létrejötte képessé teheti a sejtet, hogy egyazon celluláris kompartimentumon belül végbemenjenek oxidációs és redukciós folyamatok (149).

$IRO\DPDWI V]HUHSO LYDODPLQWDPHJKDWiUR]yPROHNXOiULVHVHPpQ\HND]HGGLJ

PHJLVPHUWHNDODSMiQQDJ\IRN~NRQ]HUYDWLYL]PXVWPXWDWQDND]pOHV]W pVDKXPiQV]HUYH]HW

között. .LVPROHNXODV~O\~YHJ\OHWHNOHKHWVpJHVV]HUHSHDGLV]XOILGN|WpVKH]NDSFVROW

HOHNWURQWUDQV]IHUEHQ

Az eddigiek során nyomon követtük, milyen fehérjék vehetnek részt a frissen szintetizált fehérjelánc tiol csoportjainak diszulfid hidakká alakításában. A fehérjék mellett kis molekulasúlyú vegyületek is szerepet kap(hat)nak az elektronok közvetítésében. Ismert elektrontranszfer folyamatok szolgálnak példával: többek között ilyen a mitokondriális légzési elektrontranszferben az ubikinon. A prokarióták fehérje tiol érési folyamatában már

V]yWHMWHWWQND]XELNLQRQpVDPHQDNLQRQV]HUHSpU OIHMH]HW (]HNDNLV

41

molekulasúlyú lipidoldékony molekulák szállítják az elektronokat – teremtik meg a kapcsolatot – a DsbB fehérje és a terminális elektronakceptor között. Eukarióták esetében az ERO1 és az ERV2 kapcsán már tárgyaltuk a FAD elektrontranszferben feltételezett szerepét (1.2.2.2.1.3. fejezet). Milyen molekulák pályázhatnak még erre a szerepre? A lehetséges jelölt képes egy és/vagy két elektron

WUDQV]IHUpUHN|QQ\HQR[LGiOKDWypVYLVV]DUHGXNiOKDWy$]HO EEHPOtWHWWWXODMGRQViJRN

V]iPRVDQWLR[LGiQVUDMHOOHP] HNPHO\HNN|]OD&YLWDPLQD](YLWDPLQDJOXWDWLRQpVD

K-vitamin gyanúsan magas koncentrációban található az endoplazmás retikulum lumenében, illetve membránjában. $QWLR[LGiQVRNpVHOHNWURQWUDQV]IHUDJOXWDWLRQD&YLWDPLQpVD](YLWDPLQ A három kulcsfontosságú antioxidáns egymással összefonódó szerepet játszik a sejt

HOHNWURQWUDQV]IHUV]tQSDGiQ$NDSFVRODWRWpVDQQDNIXQNFLyLWHO V]|UNORURSODV]WRNEDQ mutatták ki (Foyer-Halliwell-Asada ciklus) (43).

Az aszkorbinsav (AAH2 HOV NpPLDLODJYLV]RQ\ODJVWDELOR[LGiFLyVWHUPpNHD

dehidroaszkorbát (DHA), amely a növényi és állati sejtekben egy- vagy kételektronos oxidáció során keletkezik (164, 69). A folyamat lehetséges köztiterméke az – egy elektron

OHDGiViYDONHOHWNH] ±DV]NRUELOJ\|N5 AAH). A szabad gyök viszonylagos stabilitásából adódóan, spontán aszkorbátra és dehidroaszkorbátra diszproporcionálódik (151). Az

DV]NRUEiWV]iPRVV]DEDGJ\|NNHOpVPiVR[LGiOyiJHQVVHONpSHVUHDJiOQLtJ\NLHPHONHG szereppel bír a sejtek antioxidáns kapacitásának biztosításában (63). Emellett számos enzim

kofaktora (prolil-4-hidroxiláz, g-butiril-betain hidroxiláz, dopamin-b-hidroxiláz stb.) (164). Ezen reakciók során az aszkorbátból szintén aszkorbil gyök, majd dehidroaszkorbát keletkezik. A dehidroaszkorbát a legtöbb biológiai szövetben megtalálható, igaz a

YLV]RQ\ODJQDJ\PHQQ\LVpJEHQHO IRUGXOyDV]NRUEiWKR]NpSHVWLJHQDODFVRQ\

koncentrációban (164, 63). A tény, hogy a dehidroaszkorbát mind a növényi, mind az állati

VHMWHNEHQHO IRUGXOiOODQGyDQIHQQiOOyR[LGiFLyVUHDNFLyNOpWpUHXWDOPiVUpV]U O

QDJ\WHOMHVtWPpQ\ DV]NRUEiWUHJHQHUiOyPHFKDQL]PXVV]NVpJHVVpJpWYHWLIHO$UHJHQHUiOy

42

mechanizmus nélkülözhetetlenségét az aszkorbát eszenciális funkciói (és egyes fajokban az DV]NRUEiWV]LQWp]LVKLiQ\D PHVV]HPHQ HQLQGROWWiWHV]LN

Szent-Györgyi Albert már 1928-ban megfigyelte, hogy a „redukáló szubsztancia” GSH,

PLQWUHGXNiOyV]HUVHJtWVpJpYHOYLVV]DQ\HUKHW R[LGiOWDODNMiEyO$GHKLGURDV]NRUEiW

JOXWDWLRQQDOW|UWpQ UHGXNFLyMDHQ]LPHNKLiQ\iEDQLVOHMiWV]yGyNpPLDLUHDNFLy $]

utóbbi években nyilvánvalóvá vált, hogy a folyamatot mind növényi, mind állati sejtekben számos enzim katalizálhatja, elektrondonorként glutationt, NADPH-t vagy fehérje tiolokat

KDV]QiOYD(O V]|UDQ|YpQ\L'+$UHGXNWi]WL]ROiOWiNpVNDUDNWHUL]iOWiN $VSHQyW HUHGHW HQ]LPUHGXNiOyV]HUNpQWNL]iUyODJ*6+WKDV]QiO.M értéke a GSH esetében 2,5 P0D'+$HVHWpEHQP0EHQ:HOOVpVPXQNDWiUVDLNpWWLV]WtWRWWHPO V

IHKpUMpU ODWLROWUDQV]IHUi]UyOYDJ\PiVQHYpQJOXWDUHGR[LQUyOpVDSURWHLQGLV]XOILG izomerázról is kimutatták, hogy dehidroaszkorbát reduktáz aktivitással bírnak (163).

+DPDURVDQLVPHUWWpYiOWDWLROWUDQV]IHUi]P N|GpVLPHFKDQL]PXVDLV $SURWHLQ

GLV]XOILGL]RPHUi]DNWtYFHQWUXPDLWLRUHGR[LQV]HU HOUHQGH] GpVWPXWDWQDN

fejezet), ennek ellenére a tioredoxin mégsem rendelkezik dehidroaszkorbát reduktáz aktivitással. Humán eritrocitákból szintén sikerült tioltranszferázt izolálni (111). Wells és munkatársai eredményeik alapján a 1.8. ábran vázolt modellt állította fel az aszkorbinsav

GHKLGURDV]NRUEiWEyOW|WpQ UHJHQHUiFLyMiUD$]DV]NRUELQVDYDWHOHNWURQWUDQV]IHUOiQFN|WL

össze a GSH-val és a GSSG-vel, mely utóbbi NADPH segítségével redukálódik vissza. PDI NADPH+H+

AA

GSSG

NADPH regeneráció

oxidálószer

Oxidatív stressz 2GSH

NADPH GSSG reduktáz

DHA Tioltranszferáz (glutaredoxin )

iEUD$]GHKLGURDV]NRUEiW*6+IJJ UHGXNFLyVHOHNWURQWUDQV]IHUOiQFRODWD

43

redukálószer

Neutrofil granulociták esetében nagyfokú aszkorbát regenerációs kapacitásról számoltak

EHDPHO\YDOyV]tQ OHJV]HUHSHWMiWV]LNDIDJRFLWy]LVVRUiQNHOHWNH] R[LGiQVRNNLYiOWRWWD intoxikáció elleni védelemben (18). A humán neutrofilek, monociták, limfociták, valamint fibroblasztok esetében a DHA felvétele a citoplazma DHA reduktáz aktivitásával arányosan változott (17).

$JOXWDWLRQQDOP N|G '+$UHGXNWi]RNPHOOHWW1$'3+YDOP N|G HQ]LPHNHWLVOHtUWDN 6]iPRVIHKpUMpU OGHUOWNLKRJ\VDMiWV]pUXPDOEXPLQ YDJ\PiV fehérjék (PDI; 116) tioljainak oxidálásával a DHA redukciójára képes.

$GHKLGURDV]NRUEiWUHGXNFLyMiQDNPpUWpNpU OiUXONRGLNKRJ\GHKLGURDV]NRUEiWDGiVDg-

gulono-lakton oxidáz deficiens törzsekben megvéd a skorbut kialakulásától. Glutation deficiens állatokban a nagyfokú glutationhiány komoly szövetkárosodásokat okozott a WG EHQ DPiMEDQ D]DJ\EDQ YDODPLQWDV]HPOHQFVpEHQ $] aszkorbinsav a szabadgyökökkel reagálva aszkorbilgyökké alakul, melyet bizonyos mennyiségben a NADH-szemidehidroaszkorbát reduktáz aszkorbáttá forgat vissza. (Az

DV]NRUELQVDYUHJHQHUiFLyDOWHUQDWtYNLVHEEMHOHQW VpJJHOEtUy~WYRQDODDPHPEUiQN|W|WW 1$'+NRIDNWRUUDOP N|G DV]NRUELOJ\|NUHGXNWi]RNP N|GpVH $*6+

deficiens állatokon tapasztalt szöveti elváltozások, azonban arra utalnak, hogy a glutationfüggetlen aszkorbát regeneráló mechanizmusok nem képesek a szövetek teljes

SURR[LGiQVYpGHOPpWHOOiWQL$JOXWDWLRQKLiQ\DV]|YHWLPiMWG YHVHDJ\V]HP

aszkorbát szint markáns csökkenését eredményezte. A totál aszkorbáttartalmon belül nagyobb arányt képviselt a dehidroaszkorbát, mint a nem glutation depletált állatok

esetében, rávilágítva az aszkorbinsav LQYLYRUHFLUNXOiFLyMiQDNHU V*6+V]NVpJOHWpUH

1DJ\QDSLDV]NRUEiWGy]LVMHOHQW VPpUWpNEHQFV|NNHQWHWWHD*6+GHSOHWiOWiOODWRN mortalitását.

Láttuk, hogy az aszkorbát és a glutation milyen fontos szerepet tölt be a sejt antioxidáns védelmében, csökkent szintjük, hiányuk milyen kóros elváltozásokat okoz. Mindkét PROHNXODKLGURILONDUDNWHU tJ\Q\LOYiQYDOyDQQHPNpSHVHNKLGURIyEN|UQ\H]HWEHQ

hatásukat kifejteni. A plazmamembrán és egyéb membránstruktúrák (mitokondrium,

HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPVWE YLV]RQWIRQWRVKLGURIyEVHMWDONRWyN$OHJMHOHQW VHEEGHQHP

az egyetlen) hidrofób antioxidáns az E-vitamin. A természetben nyolc E-vitamin-

44

DNWLYLWiVVDOHO IRUGXOyDQ\DJRWGa, d-b, d-g, d-d-tokoferolok és d-a, d-b, d-g, d-d-

tokotrienolok) ismerünk. Ezek közül az a-tokoferol rendelkezik a legnagyobb biológiai hatással (így ma már az irodalomban az E-vitamin szinonimájaként is szokták használni). A tokoferolok és a tokotrienolok a lipidperoxidáció hatásos inhibítorai, mivel olyan gyorsan befogják a lipid peroxidokat (LO25 ), hogy azok nem képesek zsírsav oldalláncokkal és membrán fehérjékkel reakcióba lépni. a-TocH + LO25

a-Toc5 + LO2H

A lipid peroxidok négy nagyságrenddel gyorsabban reagálnak az a-tokoferollal (k = 106 M1 -1

s ), mint a lipidekkel (k = 102 M-1s-1) (65). A tokoferolok ezen felül reagálnak az atomos

oxigénnel, megvédve a membránokat (65). Az a-tokoferol viszonylag lassan reagál a O25 - -

nal és diffúziólimitált reakcióban a OH5 -kel. Az a-Toc5 gyök reakcióba léphet további

peroxil gyökökkel, amely reakció során párosítatlan elektront nem tartalmazó (nem gyök) stabil vegyületek keletkeznek, így az a-tokoferol két peroxil lánc megszakítására is képes. LO25 + a-Toc5

aTocOOL

Az aWRNRIHUROV]DEDGJ\|NOiQFW|U DQWLR[LGiQVKDWiVDDODWWIRO\DPDWRVDQa-tokoferil

gyökké alakul. A vitamin regenerációja során a gyök a -tokoferollá redukálódik. Az E- és a

&YLWDPLQN|]|WWLHJ\WWP N|GpVOHKHW VpJpW$O7DSSHOYHWHWWHIHOHO V]|UEDQ 3XO]XVUDGLROt]LVYL]VJiODWRNPHJHU VtWHWWpNKRJ\D]DV]NRUEiWYLV]RQ\ODJJ\RUV

reakcióban (~k = 1,5*106 M-1s-1) redukálja vissza az a-tokoferil gyököt a-tokoferollá (19,

65). A reakció bizonyítottan végbemegy izolált membránokban és sejttenyészetekben LQ

YLYRLV$]DV]NRUELQVDYPHOOHWWD]XELNLQROpVQDJ\RQNRUOiWR]RWWPpUWpNEHQYDOyV]tQ OHJD GSH is képes az a-tokoferil gyök redukciójára (65), azonban LQYLYR az aszkorbinsav-

dependens regenerációs mechanizmus a domináns. Az a-tokoferil gyök redukciójával az aszkorbát aszkorbil gyökké alakul, ezen a ponton kapcsolódunk a már leírt – GSH-

45

dependens – aszkorbinsav regenerációs lépésekhez. Kiegészítve a 1.7. ábrát kapjuk az Evitamin-regenerációs mechanizmusát (1.8. ábra). GF[ 6%7,8 9:;<: =

$$

>@??>

CED@F@G B HJILK-INMINH0OLPNQ R

gh W ]V<]cXIZH`Q ^
k eQ T_lWXm n+bXW HJIbobJY

'+$

A>@?
6%7,8 9: >S??>

gh W ]-V]
\ Q ]^ W H`_aMbJYc INH0OaY d K^ UWX_aH0ILT-]eQ Mf

HJITUVWXOZY

iEUDD](YLWDPLQDV]NRUEiWIJJ UHJHQHUiFLyVPHFKDQL]PXVD $]iEUiQOiWKDWyHOHNWURQWUDQV]IHUOiQFRODWNpSHVHOHNWURQRNDWDNHWW VOLSLGUpWHJ membránon átjuttatni. Humán eritrocita ghost membránok esetében azt találták, hogy a membránhegedés alatt a vezikulákba bejutott aszkorbát nagymértékben védett az extracellulárisan adott ferricianiddal kiváltott lipid peroxidáció ellen (107). A „védelmi” folyamat az intracelluláris aszkorbát gyors membránon keresztüli oxidációjával járt együtt. A membránon keresztüli elektrontranszfer – amit az impermeábilis ferricianid aszkorbát dependens redukciójával indirekten mértek – jól korrelált az eritrocita ghost membrán atokoferol szintjével (107). Az eritrocitákat szójabab foszfolipid liposzómákkal inkubálva, a membrán E-vitamin-tartalmával arányosan csökkent az extracelluláris ferricianid redukció PpUWpNH$]DV]NRUEiWHUHGHW HOHNWURQRND](YLWDPLQWUDQV]PHPEUiQN|]YHWtWpVpYHO védelmet nyújthatnak az extracelluláris oxidatív stressz ellen. $JOXWDWLRQpVD]DV]NRUEiWWUDQV]SRUWMD Mind a glutation, mind az aszkorbát vízoldékony antioxidáns, membrántranszportjuk a diffúzió facilitálását igényli. Az aszkorbinsav pontos intraluminális koncentrációja nehezen határozható meg, de több megfigyelés arra utal, hogy az magasabb a citoszolban

46

PpUKHW QpO -RJJDOIHOWpWHOH]KHW WHKiWKRJ\PLQGNpWDQWLR[LGiQVQDN– azok redukált és/vagy oxidált alakjának – transzportere van az ER membránban. Ezek a transzporterek

PROHNXOiULVV]LQWHQPpJLVPHUHWOHQHNP N|GpVNU OD]RQEDQQpPLLQIRUPiFLyYDO rendelkezünk.

$JOXWDWLRQWUDQV]SRUWMiUyO±DOXPHQEHQpV]OHOKHW oxidatív túlsúly miatt – sokáig azt

JRQGROWiNKRJ\D*66*DSUHIHUiOWOLJDQG $]RQEDQNpV EESDWNiQ\PiM

endoplazmás retikulum esetében megállapították, hogy a GSH transzport sebessége jóval nagyobb. $*6+WUDQV]SRUWNpWLUiQ\~WHOtWKHW K PpUVpNOHWIHKpUMHLG IJJ HJ\HV

aniontranszport gátlószerekkel (flufenamát, DIDS) gátolható. A transzportált GSH részlegesen oxidálódik a lumenben. A GSSG transzportja (ha egyáltalán kimutatható) igen

lassú, ezért D]LQWUDYH]LNXOiULVDQNpS] G *66*DNNXPXOiOyGLNDYH]LNXOiNEDQ

$OXPHQEHEHOpS JOXWDWLRQWHKiWLQNiEEYHUVHQ\H]DGLV]XOILGKtGNpS] GpVVHOPLQWVHP

KRJ\HO PR]GtWDQiazt. Megállapíthatjuk, hogy GSH/GSSG redoxpáros fontos szerepet

játszik a diszulfidok kialakulásában mint redox puffer, azonban az elektrontranszferben

YDOyV]tQ OHJDNWtYDQQHPYHV]UpV]W(]]HOPHJHJ\H] OHJ.DLVHUpVPXQNDWiUVDL

NLPXWDWWiNKRJ\DJOXWDWLRQV]LQWp]LVEHQVpUOWpOHV]W W|U]VpOHWNpSHVV WDIHKpUMHWLRORN

érési folyamata sem szenvedett károsodást (részletesen 1.2.2.2.1.2. fejezet, (46)).

$]DV]NRUEiWPHPEUiQRQNHUHV]WOLWUDQV]SRUWMiQDNNpWOHKHW VpJHLVPHUWaz aszkorbátNa+ szimport és a dehidroaszkorbát facilitált diffúziója. Az utóbbit a glukóz transzporter család (GLUT) tagjai bonyolítják le. Az endoplazmás retikulum membránban igen aktív dehidroaszkorbát transzportot találtak (11). A dehidroaszkorbát transzport jóval nagyobb affinitással rendelkezik (KM=0,7 mM), mint az aszkorbát (KM=45,0 mM). A dehidroaszkorbát transzport gyorsan eléri passzív ekvilibriumát (1 perc), az aszkorbát ellenben 10 perc alatt is csak az ekvilibrium harmadáig jut. Az oxidált forma (DHA) transzportja – plazmamembrán transzportjához hasonlóan – GLUT gátlókkal (phloretin, cytochalasin B) gátolható volt (11). Redukálószerek, hemoprotein gátlószer flavonoidok, gyakorlatilag megszüntették az endoplazmás retikulumon keresztüli DHA transzportot (11). A hemoprotein gátlószerek és a redukálószerek transzportra gyakorolt gátló hatása arra utal,

hogy D]DV]NRUEiWHO ]HWHVR[LGiFLyMDHJ\IHOWpWHOH]HWWDV]NRUEiWR[LGi]iOWDO WUDQV]SRUWMiQDNHO IHOWpWHOH

47

Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a dehidroaszkorbinsav és a glutation transzportja felülmúlja az aszkorbinsav és a glutation diszulfid transzportját. A transzportfolyamatok együttesen intraluminális tiol oxidációt és dehidroaszkorbát redukciót, következésképpen glutation diszulfid és aszkorbát akkumulációt okoznak. $.YLWDPLQD]XELNLQRQpVPiVOHKHWVpJHVMHO|OWHN $.YLWDPLQDSUHQLONLQRQRNFVDOiGMiEDWDUWR]LN$FVDOiGLVPHUWHEENpSYLVHO LPpJD plastokinon, PQ-9; az ubikinon-9, UQ-9 és az ubikinon-10, UQ-10.) A K-vitamin maga is

HJ\J\ MW QpYDNLVFVDOiGRWD.1-vitamin (fillokinon) és a K2-vitamin (menakinonok) alkotják. A prenilkinonok természetes forrását a zöldleveles növények jelentik (130).

Kinoidiális szerkezetük kiváló elektrontranszfer sajátságot sejtet. A fillokinon és a PQ-9 a fotoszintetizáló növények kloroplaszt, tilakoid membránjában tölt be elektronszállító

IXQNFLyWPtJD]XELNLQRQRNDPDJDVDEEUHQG pO OpQ\HNDPHQDNLQRQSHGLJDEDNWHULiOLV

légzési elektrontranszport lánc közismert tagjai (130). A fillokinon ko-enzimként részt vesz

a glutamát (Glu) gNDUER[LJOXWDPiWWi*OD W|UWpQ SRV]WWUDQV]OiFLyViWDODNtWiViEDQ $*ODIHKpUMpNOHJI NpSSDYpUSOD]PiEDQIRUGXOQDNHO $ULWND

DPLQRVDY*ODWDSURWURPELQEDQIHGH]WpNIHOHO V]|U $,,9,,,;pV;DOYDGiVL

faktorok a protrombinhoz hasonlóan 10-12 Gla-t tartalmaznak molekulánként (35, 81). A glutamát konverzióját a mikroszomális g-glutamil-karboxiláz katalizálja. Az átalakulás során a kofaktor: K-vitamin hidrokinon (KH2) K-vitamin epoxiddá oxidálódik (KO), ezáltal EL]WRVtWYDDNDUER[LOiFLyVOpSpVHQHUJLDLJpQ\pW(]WN|YHW HQD.2NpWHJ\PiVWN|YHW lépésben KH2-ná redukálódik vissza, bezárva a K-vitamin-ciklust (154). A kétlépéses

redukciót katalizáló KO és K reduktáz lehetséges kofaktorai LQYLWUR: a szintetikus DTT és a redukált tioredoxin (139, 77). A fiziológiás redukálórendszer eredete és természete még nem ismert. Ezen a ponton csatlakozhat egy másik már sokat emlegetett poszttranszlációs módosítás: a nascens fehérjeláncok diszulfid kötéseinek kialakítása. A nascens polipeptidláncokban található tiol csoportok a PDI által katalizált reakcióban az endoplazmás retikulum

OXPHQpEHQR[LGiOyGQDNNLDODNXOQDNDIHKpUMHOiQFRWMHOOHP] QDWtYGLV]XOILGN|WpVHN

48

(1.2.2.2.1.1.fejezet). A PDI aktív centrumában található tiol csoportoknak nyilvánvalóan

YLVV]DNHOOQ\HUQLNR[LGiOWiOODSRWXNDWDKKR]KRJ\D]HQ]LPPHJ UL]]HDNWLYLWiViW$PiU DQQ\LV]RUHPOtWHWWIRO\DPDWVRUHJ\OHKHWVpJHVN|]UHP N|G MHOHKHWD.YLWDPLQLVKLV]HQ

A K-vitamin-dependens karboxilációnak és a fehérje tiolok oxidációjának is a sejt endoplazmás retikulumának lumene ad otthont. Mindkét reakció a fehérjék poszttranszlációs módosulásának korai szakaszában – nagyjából

HJ\LG EHQ±PHJ\YpJEH

0LQGNpWUHDNFLyVRUiQWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVW|UWpQLNLJD]PLQGNpWHVHWEHQ ismeretlenek a folyamatok redox kofaktorai.

$IHOVRUROWRNRNPLDWWIHOPHUOWDOHKHW VpJKRJ\DGLV]XOILGKLGDNNLDODNXOiVDEL]WRVtWMDD

.2pVD.UHGXNiOiViKR]V]NVpJHVHOHNWURQRNDWYDJ\D]HOOHQNH] ROGDOUyOQp]YHDWLRO csoportok redukciója során „felszabadult” elektronokat a K-vitamin-ciklus használja fel,

regenerálja a redukált PDI-t. A feltételezést alátámasztani látszik, hogy LQYLWUR kísérletek során a DTT és a lipoamid mellett a tioredoxin volt egyedül képes a K-vitamin-dependens NDUER[LOi]VWLPXOiOiViUDPpJSHGLJD]HO ] NpWNRIDNWRUQiOMyYDODODFVRQ\DEE.M érték

PHOOHWW,JD]D'77YHOPpUKHW PD[LPiOLVVHEHVVpJPDMGKiURPV]RURVDYROWD

WLRUHGR[LQQDOPpUKHW QHND]RQEDQDUHQGV]HUKH]3',WLVDGYDDWLRUHGR[LQ+PDI rendszer

PD[LPiOLVVHEHVVpJHPiUMyYDOIHOOP~OWDKiURPV]RUDNNRUDYROW D'77YHOPpUKHW

reakció sebességét (140). A PDI hidrogénforrása NADPH vagy redukált RNáz volt, mely a reakció végeredménye szempontjából teljesen indifferensnek bizonyult. A KO reduktáz aktivitás esetében a K-vitamin-dependens karboxilázhoz hasonló tendenciát tapasztaltak. A PDI magában nem kofaktora az enzimnek, a tioredoxin-tioredoxin reduktáz kofaktorral a

'77YHOPpUKHW PD[LPiOLVDNWLYLWiV0-40DpUKHW HODUHQGV]HUW3',YHONLHJpV]tWYH D'77YHOPpUKHW DNWLYLWiVW|EEPLQWGXSOiMDPpUKHW $]HOPpOHWQHNYDQQpKiQ\ bizonytalan pontja: a K-vitamin-regeneráció és a diszulfid kötések kialakulásának

NDSFVROWViJDIHOWpWHOH]KHW LQYLWUR, azonban a kapcsoltság mechanizmusa ismeretlen. A

UpV]WYHY NRPSRQHQVHNPLQGHJ\LNHPHJWDOiOKDWyD]HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPEDQGHSRQWRV

NRQFHQWUiFLyMXNQHPLVPHUW$]HOPpOHWVHEH]KHW VpJpWQ|YHOLDWpQ\KRJ\DWLRUHGR[LQ sokkal redukálóbb redoxpotenciállal rendelkezik, mint a PDI, így kérdéses, hogy a PDI képes-e elektronokat átadni a tioredoxin irányába.

49

$]XELNLQRQMyOLVPHUWHOHNWURQiWYLY EDNWHULiOLVpVPLWRNRQGULiOLVUHQGV]HUHNEHQ0LYHO HXNDULyWDV]HUYH]HWHNEHQV]LQWp]LVpQHNI KHO\HD]HQGRSOD]PiVUHWLNXOXP D

GLV]XOILGNpS] GpVKH]NDSFVROWHOHNWURQWUDQV]IHUEHQLVIHOWpWHOH]KHW DUpV]YpWHOHEiUD]

HUUHXWDOyDGDWRNV]yUYiQ\RVDN([RJpQPROHNXOiNSpOGiXOQ|YpQ\LIODYRQRLGRNLVMHOHQW V

mennyiségben lehetnek jelen biotranszformációjuk helyszínén, a máj endoplazmás retikulumában. Redoxpotenciál értékük alapján számos esetben helyettesíthetik a tokoferolt, illetve az aszkorbinsavat (169). A tiol oxidációs folyamatban betöltött szerepük

D]iOODQGypVQDJ\REEPHQQ\LVpJEHQHO IRUGXOyDV]NRUEiWpVa-tokoferol mellett szintén

IHOYHWKHW GHH]WDOiWiPDV]WyYDJ\H]WPHJNpUG MHOH] NtVpUOHWLPHJILJ\HOpVHNHGGLJQHP

születtek.

50

O2/H2O O2/H2O2

DHA/AAH2

AAH5 p / AAH2

DHA/AAH5 p

1.9. ábra A tiol oxidációban szerepet játszó fontosabb anyagok redox potenciálja (Sevier HW DO (137) alapján).

Egy tiol-diszulfid oxidoreduktáz redukcióra vagy oxidációra való hajlamát az egyensúlyi

UHGR[SRWHQFLiOMiYDOV]iPV]HU VtWKHWMN$UHGR[SRWHQFLiOPHJKDWiUR]KDWyDUHGXNiOWpVaz oxidált fehérjekomponensek arányából amikor redox egyensúlyban van egy ismert redox potenciálú anyaggal (pl. a GSH/GSSG párossal) (1 és 2 egyenlet). A fehérjék redox potenciálját gyakran elektrokémiai potenciáljukkal fejezik ki, melyet a Nernst-egyenlettel számítanak ki (3 egyenlet).

51

+LSRWp]LVpVFpONLW ]pVHN Az endoplazmás retikulum diszulfid híd kialakító képessége az izolált mikroszómális

YH]LNXOiNEDQPHJV] QLNDIHKpUMHWLROROGDOOiQFRNUHGR[iOODSRWDQHPYiOWR]LNPpJR[LJpQ

jelenlétében végzett inkubálás során sem (4.2. táblázat). Ez a megfigyelés, valamint az a

N|UOPpQ\KRJ\D]HPO VSURWHLQWLROR[LGiOyPHFKDQL]PXVEDQHGGLJQHPtUWDNOHR[LJpQ N|WpVpUHNpSHVIHKpUMpWYDOyV]tQ YpWHV]LKRJ\NLVPROHNXODV~O\~DPLNURV]yPD

SUHSDUiOiVDVRUiQHOYHV] NRPSRQHQVHLLVYDQQDND]HOHNWURQWUDQV]IHUQHN$V]yEDM|Y

vegyületeknek vagy diffúzióval, vagy fehérjemediált transzporttal át kell tudnia jutni a membránon, illetve természetesen alkalmasnak kell lennie elektronfelvételre és leadásra. Ilyen vegyületek például a legfontosabb intracelluláris antioxidánsok. Korábbi

PHJILJ\HOpVHLQNDODSMiQIHOWpWHOH]WNKRJ\H]HNDPROHNXOiN±HOV VRUEDQD]DV]NRUEiWpV

DWRNRIHURO±YDOyEDQHO PR]GtWMiNDGLV]XOILGKtGNpS] GpVWD]HPO VVHMWHNEHQ $NtVpUOHWLPXQNDI FpONLW ]pVHLDN|YHWNH] NYROWDN

az aszkorbinsav (és közvetlen prekurzora, a gulonolakton) betöltött szerepének

a tokoferol – mint lehetséges transzmembrán elektronszállító – szerepének tisztázása a

EL]RQ\tWiVDDGLV]XOILGN|WpVNpS] GpVpKH]V]NVpJHVHOHNWURQWUDQV]IHUEHQ

folyamatban;

az aszkorbát és a molekuláris oxigén közötti elektrontranszfer vizsgálata: egy

IHOWpWHOH]KHW PLNURV]yPiOLVDV]NRUEiWR[LGi]YDJ\SHUR[LGi]DNWLYLWiVNHUHVpVHpV

jellemzése.

52

3. Módszerek

3DWNiQ\PiMIUDNFLyNSUHSDUiOiVD

A máj mikroszómákat hím Wistar (180-230 g) patkányokból preparáltuk. A patkányokból frissen kivett májat apró darabokra vágva 0,3 M szaharózt, 20 mM HEPES-t (pH = 7,0) tartalmazó pufferbe tettük, majd Potter-Elvehjem homogenizátorral egyenletes szuszpenziót készítettünk. A szuszpenzió koncentrációját 20%-ra állítottuk szaharóz-HEPES pufferrel.

(]WN|YHW HQFHQWULIXJDFV|YHNEHW|OW|WWNpVOHFHQWULIXJiOWXNJ, 10 perc, 4 oC). A sejttörmeléket tartalmazó csapadékot eldobtuk. A felülúszót ultracentrifugával tovább

centrifugáltuk (11 000 J, 20 perc, 4 oC). A csapadék a mitokondriális frakció. A citoszólt és

mikroszómát tartalmazó felülúszót újra lecentrifugáltuk (100 000 J, 60 perc, 4 oC). A

felülúszó tartalmazza a sejt citoplazmáját. A mikroszómafrakciót tartalmazó csapadékot újraszuszpendáltuk 100 mM KCl-ot, 20 mM NaCl-ot, 1 mM MgCl2-ot és 20 mM MOPS-ot tartalmazó, pH 7,2-es pufferben (a továbbiakban MOPS puffer) és újfent lecentrifugáltuk. (100 000 J, 60 perc, 4 oC). A mikroszómákat MOPS pufferben reszuszpendáltuk (§PJ protein/ml). A szuszpenziót gyorsan lefagyasztottuk és felhasználásig folyékony nitrogénben tartottuk. A mikroszómális vezikulumok épségét, a szaharóz adására

EHN|YHWNH] R]PRWLNXVYiOWR]iVRNDODSMiQIpQ\V]yUiVPpUpVVHOHOOHQ UL]WN

Vizsgálatainkban csak szaharóz adására fenntartott zsugorodású mikroszómákat használtunk. A mikroszómális fehérje koncentrációt, standardként marha szérum albumint használva, Bio-Rad kit segítségével határoztuk meg. $]DV]NRUELQVDYR[LGiFLyMiQDNPpUpVH Az aszkorbinsav oxidációjának vizsgálata során intakt mikroszómális vezikulákat

LQNXEiOWXQNDFLWRV]ROWMHOOHP] P0DV]NRUEiWMHOHQOpWpEHQ0236SXIIHUEHQ$]

inkubációt 0,75 térfogat 5 mM-os metafoszforsav hozzáadásával termináltuk. A kicsapódott fehérjéket centrifugálással eltávolítottuk (14 000 g, 10 perc 4 oC), majd meghatároztuk a felülúszó aszkorbinsav és dehidroaszkorbinsav koncentrációját. A dehidroaszkorbinsav

53

meghatározására szolgáló minták esetében a leállító oldat a metafoszforsav mellett 5 mM DTT-t is tartalmazott. A dehidroaszkorbinsav mérése során az oxidált dehidroaszkorbátot UHGXNiOyV]HUUHO'77 YLVV]DUHGXNiOMXNDV]NRUELQVDYYitJ\NpV EEHEEHQDIUDNFLyEDQD

redukált és az oxidált formát együtt mint aszkorbátot határozzuk meg. A totál (redukált+oxidált forma) aszkorbátkoncentráció és a DTT hozzáadása nélkül meghatározott aszkorbinsav-koncentráció különbsége adja a dehidroaszkorbát koncentrációját. [DHA] = [ASC]DTT-[ASC] A felülúszó aszkorbátkoncentrációját fordított fázisú HPLC segítségével határoztuk meg.

$]L]RNUDWLNXVHOYiODV]WiVW:DWHUVV]HSDUiFLyVHJ\VpJ N|YHW HQD]DV]NRUEiW

mennyiségét 254 nm-en mutatott fényelnyelése alapján UV-VIS detektorral (Waters 2487 dual absorbance detektor) mértük. Az elválasztást Jones Chromatography APEX Octadecyl (átlagos részecskeméret 5 mm, 15 cm X 4,6 mm) állófázison, 0,1 M NaH2PO4, 0,2 mM Na2EDTA, pH=3,1 mobil fázissal végeztük. $PLNURV]yPD(YLWDPLQWDUWDOPiQDNPHJKDWiUR]iVD (YLWDPLQH[WUDNFLyPOYL]HVPiMPLNURV]yPDV]XV]SHQ]LyKR]YHOHHJ\H] WpUIRJDW~ P0RV6'6ROGDWRWDGWXQNpVDODSRVDQ|VV]HNHYHUWN$]HO ] ROGDWKR]NpWV]HUHV

PHQQ\LVpJ PO DEV]HWDQROWDGWXQNPDMG|VV]HNHYHUWN(]WN|YHW HQPOQKH[iQW

adtunk a rendszerhez, majd alaposan 30-60 sec keresztül kevertük (vortex). A vizes és a szerves fázist rövid centrifugálással elválasztottuk (1000 J, 4 perc, 4 oC), a szerves fázist

Pasteur pipettával óvatosan leszedtük. A szerves fázisból kivettünk 500 ml-t és N2 árammal

bepároltuk, majd 300 ml acetonitrilbe visszaoldottuk.

(YLWDPLQPpUpV: A bepárolt anyag E-vitamin-tartalmát fordított fázisú HPLC segítségével

KDWiUR]WXNPHJ$]L]RNUDWLNXVHOYiODV]WiVW:DWHUVV]HSDUiFLyVHJ\VpJ N|YHW HQD] E-vitamin mennyiségét 290 nm-en mutatott fényelnyelése alapján UV-VIS detektorral (Waters 2487 dual absorbance detektor) mértük. Az elválasztást Teknokroma Nucleosil 100

54

C18 (átlagos részecskeméret 5 mm, 25 cm X 4,6 mm) állófázison, metanol-hexánacetonitril (60:20:20 V/V%) mobilfázissal végeztük. $V]NRUELOJ\|NPHJKDWiUR]iVDHOHNWURQVSLQUH]RQDQFLDPpUpVHN Az elektron spin rezonanciaESR) spektrumokat X-band számítógépvezérelt Magnettech Gmbh (Berlin) spektrométer segítségével határoztuk meg. A mintaspektrumokat kvarc flat

FHOOEHQV]REDK PpUVpNOHWHQYHWWNIHODN|YHWNH] P V]HUEHiOOtWiVRNPHOOHWW Modulációs frekvencia: 100 kHz Modulációs amplitudó: 0,1762 mT 0LNURKXOOiP~HU VtWpVP:

)HOYpWHOLLG SHUF ,G NRQVWDQVV Field sweep: 2 mT

$VSHNWUXPRNNLpUWpNHOpVpWNHWW VLQWHJUiOiVVDOYpJH]WN )HKpUMHWLRORNPpUpVH A fehérje tiolok oxidációjának vizsgálata során intakt mikroszómális vezikulákat (1 ml, 1

PJPOIHKpUMH LQNXEiOWXQNDFLWRV]ROWMHOOHP] P0DV]NRUEiWMHOHQOpWpEHQ0236

pufferben. Az inkubációt 50 ml 100%-os triklórecetsav hozzáadásával fejeztük be. A kicsapódott fehérjéket centrifugálással eltávolítottuk (20 000 g, 5 perc). A felülúszót

vízsugárszivattyúval eltávolítottuk, a kicsapodott fehérjéket 1 ml foszfát pufferben (pH =

XOWUDKDQJRVVHMWIHOWiUyYDO~MUDV]XV]SHQGiOWDWWXN(]WN|YHW HQml 37,8 mM-os ditio-

QLWUREHQ]RiWRW'71% DGWXQNDV]XV]SHQ]LyKR]pVSHUFLJV]REDK PpUVpNOHWHQ

inkubáltuk, majd lecentrifugáltuk (20 000 J, 5 perc). A felülúszó abszorbanciáját 412 nmen mérve, az extinkciós koefficiens (e = 13 600 cm2*M-1) ismeretében számítottuk ki a

tiolkoncentrációt.

55

$PLNURV]yPDIUDNFLyNDUDNWHUL]iOiVD &LWRNUyPFR[LGi]DNWLYLWiVPHJKDWiUR]iVD A citokróm Foxidáz jellegzetes mitokondriális markerenzim, aktivitását meghatározva IUDNFLyQNPLWRNRQGULiOLVV]HQQ\H]HWWVpJpU ONDSKDWXQNLQIRUPiFLyW

$FLWRNUyPFR[LGiOWpVUHGXNiOWIRUPiLQDNDEV]RUEDQFLiMDNO|QE|] $]R[LGiOWFLWRNUyP FKH]PLQGDGGLJNHOONLVSRUFLRQNpQWGLWLRQLWRWDGDJROQLDPLJD]pV]UHYHKHW

DEV]RUEDQFLDYiOWR]iVWHUHGPpQ\H]WHKiWDOHKHW OHJNLVHEEIHOHVOHJHOpUpVpUHNHOO

W|UHNHGQLËJ\UHIHUHQFLDNpQWR[LGiOWFLWRNUyPFROGDWRWKDV]QiOYDHO ]HWHVHQ1DGLWLRQLWWDO redukált citokróm c oldathoz detergenssel kezelt mikroszóma frakciót adva (Detergens

KDV]QiODWDQpONODFLWRNUyPFR[LGi]QHPKR]]iIpUKHW D]H[RJpQV]XEV]WiWV]iPiUDtJ\

FVDNDURQFVROyGRWWV]HUNH]HW PLWRNRQGULXPRNKR]N|]|WWDNWLYLWiVUyONDSKDWXQN

információt. Szerkezetileg ép mitokondrium esetében, éppen ezért rendkívül alacsony FLWRNUyPFR[LGi]DNWLYLWiVPpUKHW $PLWRNRQGULXPRWRSWLPiOLVNRQFHQWUiFLyM~

detergenssel (1 ml 1%-os Triton X-100/ 1 mg fehérje) kezelve a frakció teljes citokróm c

R[LGi]DNWLYLWiViUyOQ\HUKHWQNDGDWRW D]DEV]RUEDQFLDYiOWR]iViWQPHQD]LG függvényében követve a frakció citokróm c oxidáz aktivitása meghatározható. *OXNXURQLOWUDQV]IHUi]DNWLYLWiVPHJKDWiUR]iVD

A glukuronil-transzferáz jellegzetes mikroszómális markerenzim, aktivitását meghatározva frakciónk tényleges mikroszóma tartalmáról kaphatunk információt. Inkubációs közeg: 100 ml (1 mg/ml fehérje) mikroszómaszuszpenzió; 20 ml, Triton X-100

(0,25%); 50 ml, 1 M Tris-HCl (pH=7,4); 50 ml 50 mM MgCl2; 50 ml 5 mM p-nitrofenol;

180 ml H2O és 50 ml, 50 mM UDP-glukuronsav. 2 perces 37O&RVHO LQNXEiFLyWN|YHW HQD reakciót az UDP-glukuronsav hozzáadásával indítottuk. Az inkubációs oldatból 0, 5, 10 és 15 perc elteltével 100 ml-es részeket vettünk ki, melyeket azonnal 1 ml 5%-os triklórecetsavba pipettáztunk. A kicsapódott fehérjéket centrifugálással távolítottuk el, majd a felülúszó 1 ml-éhez 250 ml 2 M-os NaOH-t adtunk. Az így kapott oldat abszorbanciáját

56

405 nm-en mértük, a S-nitro-fenol extinkciós koefficiensének (e = 18 100 cm2*M-1) ismeretében számítottuk ki a S-nitro-fenol koncentrációját és az UDP-glukuroniltranszferáz aktivitását. *OXNy]IRV]IDWi]DNWLYLWiVPHJKDWiUR]iVD A glukuronil-transzferáz mellett a glukóz-6- foszfatáz jellegzetes mikroszómális markerenzim, aktivitását meghatározva frakciónk tényleges mikroszóma-tartalmáról kaphatunk információt. Inkubációs közeg: 50 mM Tris-HCl pH=6,5; mikroszóma-frakció (10-40 mg fehérje). Az

oldat végtérfogata 0,5 ml volt. A reakciót 5 perc 37O&RVHO LQNXEiOiVXWiQP0JOXNy] 6-foszfát hozzáadásával indítottuk. A reakciót 30 perc elteltével 1 ml 20% triklórecetsav/4% SDS/4% aszkorbátot tartalmazó oldattal állítottuk le. A háttéraktivitást szubsztrát hozzáadása nélkül mértük. Az oldat glukóz koncentrációját glukóz-oxidáz kittel (Fabio kft. Budapest) határoztuk meg.

57

4. Eredmények 0LNURV]yPiOLVDV]NRUEiWR[LGiFLyDPiMHQGRSOD]PiVUHWLNXOXPiEDQ Az aszkorbinsav mikroszómális oxidációját az aszkorbát, a dehidroaszkorbát és az aszkorbilgyök szintjének alakulásával követtük nyomon. Megfigyeléseinket nagynyomású folyadékkromatográfiával és elektron spin rezonancia spektrométerrel végeztük.

.tVpUOHWHLQNVRUiQDSDWNiQ\PiMPLNURV]yPiOLVYH]LNXOiNDWFLWRV]ROUDMHOOHP] P0RV

aszkorbát oldatban inkubáltuk 37 oC-on. Az inkubációs elegy aszkorbát és dehidroaszkorbát koncentrációját HPLC segítségével folyamatosan mértük. Az

DV]NRUEiWV]LQWHJ\HQOHWHVPpUWpN IRO\DPDWRVFV|NNHQpVpWWDSDV]WDOWXNDGGLJDSRQWLJ amíg alacsony koncentrációja véget nem vetett a folyamatnak (4.1. ábra). A

GHKLGURDV]NRUEiWJ\DNRUODWLODJD]LQNXEiFLyHOV SLOODQDWiEDQPHJMHOHQWD]ROGDWEDQpV

V]LQWMHQDJ\MiEyOiOODQGyVXOWD]LQNXEiFLyWHOMHVLG WDUWDPiUDiEUD $]DV]NRUELQVDY

IRJ\iVpVDGHKLGURDV]NRUEiWiOODQGyVXOWiOODSRWEDQPpUKHW NRQFHQWUiFLyMDHU V

K PpUVpNOHWIJJpVWPXWDWRWWWiEOi]DW $PLNURV]yPDPHQWHVROGDWEDQD]DV]NRUELQVDY

oxidációja elhanyagolható ( < 20 pmol/min) volt. WiEOi]DW$]DV]NRUELQVDYR[LGiFLyK PpUVpNOHWIJJpVH

6]REDK PpUVpNOHW

37 OC

Aszkorbát fogyás (pmol/min/mg)

188 ± 31

359 ± 17

Dehidroaszkorbát koncentráció (mM)

12,1 ± 3,6

19,0 ± 0,7

$PLNURV]yPiNDWPJSURWHLQPO P0DV]NRUELQVDYMHOHQOpWpEHQV]REDK PpUVpNOHWHQ inkubáltuk. Az aszkorbát és a dehidroaszkorbát koncentrációkat a módszerek fejezetben leírtak szerint HPLC segítségével határoztuk meg.

58

Aszkorbát, dehidroaszkorbát és aszkorbil gyök szint (%)

,QNXEiFLyVLG SHUF

4.1. ábra Az aszkorbát fogyás, az aszkorbil gyök és a dehidroaszkorbát keletkezésének

LG IJJpVHSDWNiQ\PiMPLNURV]yPiOLVYH]LNXOiNEDQ

Mikroszómákat (1 mg fehérje/ml) inkubáltunk 100 µM aszkorbát jelenlétében 37 oC-on. Az

aszkorbinsav ( pVDGHKLGURDV]NRUEiW V]LQWHNHWIRUGtWRWWIi]LV~+3/&YHOD]DV]NRUELO

gyök ( V]LQWHW(65VSHNWURV]NySLiYDOKDWiUR]WXNPHJ$]DV]NRUEiWpVD

dehidroaszkorbát szinteket a kezdeti aszkorbát koncentráció (100 mM) százalékában, az

DV]NRUELOJ\|NV]LQWHWD]HOV SHUFEHQPpUKHW pUWpNV]i]DOpNiEDQDGWXNPHJ$] eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel, n = 6.

59

4.2. iEUD$]DV]NRUELOJ\|N|NHQ]LPHVNpS] GpVHSDWNiQ\PiMPLNURV]yPiEDQ

Aszkorbinsavat (100 mM) inkubáltunk MOPS pufferben, pH 7.2 mikroszóma távollétében (D spektrum); mikroszóma jelenlétében (1 mg fehérje/ml, EVSHNWUXP K NH]HOWPLNURV]yPD

jelenlétében (Fspektrum) mikroszóma és 100 mM neokuproin (Gspektrum); illetve tripszinnel

kezelt mikroszómák (HVSHNWUXP MHOHQOpWpEHQ$](65VSHNWUXPRNSHUFHVV]REDK PpUVpNOHWHQ

W|UWpQ LQNXEiFLyXWiQNHUOWHNUHJLV]WUiOiVUD$VSHNWUXPRNUHJLV]WUiOiVUHSUH]HQWiFLyL

60

$]DV]NRUELQVDYGHKLGURDV]NRUEiWWiW|UWpQ R[LGiFLyMDNpWHOHNWURQOHDGiViWMHOHQWLPHO\ aszkorbil gyök köztiterméken keresztül történhet, ezért az aszkorbinsav oxidációját elektron spin rezonancia spektroszkópiával is megvizsgáltuk. A tisztán aszkorbátot tartalmazó oldatban (100 mM aszkorbát MOPS pufferben) detektálhattuk az aszkorbinsav

DXWRR[LGiFLyMiUDMHOOHP] *FVDWROiVLiOODQGyM~DV]NRUELOJ\|NGXEOHWWHWiEUDD spektrum). Az aszkorbinsavat mikroszóma jelenlétében (1mg/ml) inkubálva az aszkorbil gyök szint drasztikus megemelkedését tapasztaltuk (4.2. ábra b spektrum). A

GHKLGURDV]NRUEiWLQNXEiFLyVROGDWEDQPpUKHW V]LQWMpKH]KDVRQOyDQDPHJHPHONHGHWW

DV]NRUELOJ\|NV]LQWD]LQNXEiFLyWHOMHVLG WDUWDPDDODWWPHJWDUWRWWYROWiEUD $]

HPHOWpVLG EHQPHJWDUWRWWPLNURV]yPiOLVGHKLGURDV]NRUEiWNRQFHQWUiFLyEL]WRVtWRWWQDN látszik. Kérdés: hogyan befolyásolja ez a fehérje tiolok oxidációját, a diszulfid hidak kialakulását? $]DV]NRUELQVDYpVDSURWHLQWLRORNR[LGiFLyMD $]HO ] HNKH]KDVRQOyDQSDWNiQ\WHQJHULPDODFpVKXPiQPiMPLNURV]yPiNDWLQNXEiOWXQN aszkorbát (0,1 mM) jelenlétében és párhuzamosan követtük az aszkorbát és a fehérje tiol szint változását. Aszkorbinsav hiányában a fehérjetiolok mennyisége nem változott az 1

yUiVLQNXEiFLyVLG DODWWWiEOi]DW $]LQNXEiFLyVHOHJ\KH]DV]NRUEiWRWDGYDDIHKpUMH

WLRORNPHQQ\LVpJpQHNMHOHQW VFV|NNHQpVpWWDSDV]WDOWXNWiEOi]DW $FV|NNHQpVRNDD tiolok oxidációja volt, amit merkaptoetanolos visszaredukálásukkal lehetett igazolni. Patkány máj mikroszómák esetében a fehérjetiolok mintegy 50%-a (19,9 ± 2,4 nmol/mg)

R[LGiOyGRWWyUiVLQNXEiFLyWN|YHW HQyUiVLQNXEiFLyVRUiQSHGLJH]D]DUiQ\UD

QPROPJ Q|YHNHGHWW(]WN|YHW HQMHOHQW VWLROR[LGiFLyPiUQHPN|YHWNH]HWW be, annak ellenére, hogy az inkubációs elegyben még jelen volt az aszkorbát. A fehérje tiolok oxidációja az aszkorbinsav fogyásával járt együtt, ami az aszkorbinsav oxidációjára utalt, így megvizsgáltuk a dehidroaszkorbát hatását. Az aszkorbáthoz hasonlóan a

GHKLGURDV]NRUEiWLVNLYiOWRWWDDWLRORNR[LGiFLyMiWLJD]DQQDNPpUWpNHHOPDUDGWD]HO ] HVHWEHQWDSDV]WDOWWyOWiEOi]DW $FV|NNHQWPpUWpN WLROR[LGiFLyRNiUDD

dehidroaszkorbát koncentrációjának vizsgálata adhat választ. A dehidroaszkorbátot 1 mM-

61

RVNRQFHQWUiFLyEDQDONDOPD]WXND]RQEDQDGHKLGURDV]NRUEiWRWD]LQNXEiFLyK PpUVpNOHWpQ

PiUQDJ\RQMHOHQW VVSRQWiQERPOiVMHOOHP]LtJ\WpQ\OHJHVNRQFHQWUiFLyMDQHKH]HQ

PHJMyVROKDWyD]RQEDQYDOyV]tQ OHJMyYDOHOPDUDGD]DV]NRUEiWKR]]iDGiViYDOJHQHUiOW

megtartott szinthez képest.

$]DV]NRUEiWR[LGiFLyMiWKLGURJpQSHUR[LGGDOPHJJ\RUVtWYDHPHONHGHWWPpUWpN

DV]NRUEiWIRJ\iVWWDSDV]WDOWXQND]RQEDQDWLROR[LGiFLyUDH]QHPYROWMHOHQW VKDWiVVDO

táblázat).

62

4.2. táblázat Az aszkorbinsav hatása a patkány, tengerimalac és humán mikroszómák fehérje tiol oxidációjára Patkány máj mikroszóma

Tengeri malac mikroszóma

Fehérje tiol

Aszkorbát

Fehérje tiol

Aszkorbát

oxidáció

fogyás

oxidáció

fogyás

SPROPLQPJIHKpUMH

-

12 34 (8)

30 14 (8)

18 23 (3)

ND

1 mM H2O2

26 43 (6)

NM

52 5 (3)

ND

332 40 (7)

0,1 mM AA 0,1 mM AA + 1 mM H2O2

448 46 (4)

808 161 (4)

259 10 (5)

-410 163 (5)

69 33 (3)

301 16 (3)

325 15 (5)

0,1 mM AA + 10 mM H2O2 1 mM dehidroaszkorbát

200 31 (3)

0,1 mM AA + 0.1 mM ekonazol 0,1 mM AA + 10 mM H2O2 + 0,1 mM ekonazol

362 68 (8)

135 81 (4)

149 59 (4

NM

NM

762 63 (3)

164 34 (3)

1653 137 (

12 11 (3)

31 31 (3)

9 13 (3)

82 4 (3)

92 3 (3)

A mikroszómákat (1 mg protein/ml) a jelzett anyagok hozzáadásával 60 percen keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A fehérje tiolok és az aszkorbát mennyiségi változását regisztráltuk. A kiindulási fehérje tiol tartalom 40,2 ± 1.8 nmol/mg protein (átlag ± S.D., n = 16), 52,2 ± 4,4 (6) és 42,3 ± 2,8 (8) nmol/mg protein, volt. Az eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel.(n ). ND, nem detektálható; NM, nem mérve.

63

-295 34 (3

733 102 (3

*XORQRODNWRQR[LGi]GHSHQGHQVIHKpUMHWLROR[LGiFLy Patkány mikroszómális vezikulákhoz gulonolaktont – az aszkorbát bioszintézis utolsó lépését katalizáló gulonolakton-oxidáz szubsztrátját – adva megvizsgáltuk az LQVLWX aszkorbát bioszintézis hatását a fehérje tiolok oxidációjára. Patkány máj mikroszómákat inkubáltunk 0,1 mM gulonolaktonnal, majd mértük az aszkorbil gyök szintjét. Az aszkorbil gyök szintje viszonylag gyorsan elérte maximális egyensúlyi értékét és ezen, az aszkorbát HVHWpEHQPpUKHW pUWpNQDNPHJIHOHO V]LQWHQiOODQGyVXOWWiEOi]DW 4.3. táblázat Gulonolakton kiváltotta aszkorbil gyök keletkezés ,QNXEiFLyVLG SHUF

Aszkorbil gyök szignál (T.I.E.)

5

152 ± 31

30

285 ± 8

60

274 ± 22

A mikroszómákat (1 mg fehérje/ml) 0,1 mM gulonolakton jelenlétében inkubáltuk

V]REDK PpUVpNOHWHQ$]DV]NRUELOJ\|NV]LQWHW(65VSHNWURV]NySLiYDOKDWiUR]WXNPHJ$] eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel n = 5 T.I.E., terület integrációs egység.

Mikroszómamentes inkubációs oldatban aszkorbil gyök szignált egyáltalán nem tapasztaltunk. Különösebb meglepetést az sem okozott, hogy a gulonolaktonból keletkezett aszkorbát tovább oxidálódott dehidroaszkorbáttá (4.3. ábra).

$JXORQRODNWRQEyOW|UWpQ DV]NRUELQVDYELRV]LQWp]LVDIHKpUMHWLRORNR[LGiFLyMiW

eredményezte (4.4. táblázat). A folyamat látszólagos Michaelis állandója 8,1 mM,

OiWV]yODJRVPD[LPiOLVVHEHVVpJHSPROPLQPJDiEUD $WLROR[LGiFLyLG IJJpVpW

1 mM gulonolakton jelenlétében mértük, a kezdeti (~ 15 perc) lag fázis után a tiol fogyás 60 percig lineárisnak bizonyult (4.4.b ábra). Az oxidáló hatást a gulonolakton

64

metabolizmusa okozta, mivel az effektus a gulonolakton oxidáz deficiens tengerimalac és humán mikroszómák esetében teljességgel elmaradt (4.4.b ábra).

65

$V]NRUEiWGHKLGURDV]NRUEiWNpS] GpVQPROPJIHKpUMH

,QNXEiFLyVLG SHUF iEUD*XORQRODNWRQDGDJROiViWN|YHW DV]NRUEiWpVGHKLGURDV]NRUEiWNpS] GpVSDWNiQ\ máj mikroszómákban. A mikroszómákat (1 mg fehérje/ml) 1 mM gulonolakton jelenlétében 37 °C-on inkubáltuk. Aszkorbinsav QpJ\]HWHN és a dehidroaszkorbát (N|U|N szinteket a módszerek fejezetben leírtak szerint HPLC-vel határoztuk meg. Az eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel, n = 3.

66

Fehérje tiol oxidáció (nmol/mg fehérje)

1 / aktivitás (perc/nmol)

,QNXEiFLyVLG SHUF

1 / [gulonolakton] (1/mM)

4.4. iEUD$IHKpUMHWLROR[LGiFLyJXORQRQODNWRQLG pVNRQFHQWUiFLyIJJpVHSDWNiQ\PiM

PLNURV]yPiOLVYH]LNXOiNEDQ$PLNURV]yPiNDWPJIHKpUMHPO NO|QE|] JXORQRODNWRQ

koncentrációk mellett 60 percig inkubáltuk D vagy 1 mM gulonolaton jelenlétében a jelölt inkubációs ideigEN|U|N 37°C-on. A fehérjetiolok csökkenését mértük. A mikroszóma kiindulási fehérje tiol koncentrációja 40,2 ± 1,8 nmol/mg fehérje volt (átlag ± S.D., n = 16). Összehasonlításképp a gulonolakton hatásának elmaradását tengerimalac mikroszómák esetén is közöljük EKiURPV]|JHN Az adatok of 8-16 kísérlet átlagát képezik, az S.D. értékek az átlagértékek kevesebb, mint 10 %-a.

67

4.4. táblázat A gulonolakton oxidáz aktivitás fehérje tiol oxidációra gyakorolt hatása Hozzáadott anyag

Fehérje tiol oxidáció

$V]NRUEiWNpS] GpV

SPROPLQPJIHKpUMHQ

12 34 (8)

Kontroll 1 mM gulonolakton

249 18 (8)

1854 153 (8)

50 22 (5)

2014 27 (5)

- 15 18 (5)

0.1 mM ekonazol

- 30 14 (8)

1 mM gulonolakton + 0.1 mM ekonazol

127 85 (4)

A mikroszómákat (1 mg protein/ml) a jelzett anyagok hozzáadásával 60 percen keresztül 37 °C-on inkubáltuk. A fehétrje tiol és az aszkorbinsav szintben bekövetkezett változásokat határoztuk meg. A kiindulási tiolkoncentráció 40.2 ± 1.8 nmol/mg fehérje volt (átlag ± S.D., n = 16). Az eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel (n).

$]DV]NRUEiWR[LGiFLyMHOOHP]pVH $]DV]NRUEiWR[LGiFLyVDNWLYLWiVORNDOL]iFLyMD Az aszkorbát oxidációs aktivitás szubcelluláris lokalizációjának vizsgálata során különbözö GLIIHUHQFLiOFHQWULIXJiOiVVDOQ\HUWVHMWIUDNFLyNHVHWpEHQPpUKHW DV]NRUELOJ\|NV]LQWHNHW

hasonlítottuk össze. Az összehasonlítás pontosságának fokozása érdekében meghatároztuk az egymással gyakran szennyezett mitokondriális és mikroszómális frakciók tisztaságának (egymással történt keresztszennyezésének) mértékét. A tisztaság mértékét egy mitokondriális (citokróm F oxidáz) és két mikroszómális (glukóz-6-foszfatáz, UDPglukuronil-transzferáz) markerenzim aktivitásának mérésével határoztuk meg (4.5. táblázat).

68

4.5. WiEOi]DWDNO|QE|] VHMWIUDNFLyNWLV]WDViJDPDUNHUHQ]LPDNWLYLWiVXNDODSMiQ Markerenzim

Sejtfrakció enzimaktivitása (pmol/min/mg) Mitokondrium

Mikroszóma

Citokróm c oxidáz

397 ± 20

51 ± 33

Glukóz-6-foszfatáz

59 ± 3

116 ± 2

UDP-glukuronil-transzferáz

14 ± 2

26 ± 1

$]HQ]LPDNWLYLWiVRNPHJKDWiUR]iViWV]REDK PpUVpNOHWHQDPyGV]HUHNIHMH]HWEHQOHtUWDNV]HULQW végeztük Az eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel n = 4.

$]DV]NRUELOJ\|NNpS] GpVHHJ\pUWHOP HQDPLNURV]yPiOLVIUDNFLyVDMiWMiQDNEL]RQ\XOW

WiEOi]DW .LVPpUWpN DV]NRUELOJ\|NV]LQWQ|YHNHGpVWWDSDV]WDOWXQNDPLWRNRQGULiOLV frakció esetében is (4.6. táblázat), ami akár a frakció mikroszómával történt

V]HQQ\H]HWWVpJpE OLVDGyGKDWWiEOi]DW $]DV]NRUEiWR[LGi]DNWLYLWiVWRSROyJLiMiWLV

vizsgálat tárgyává tettük. A mikroszóma tripszines kezelése az aszkorbát oxidáz aktivitás

UDGLNiOLVFV|NNHQpVpWHUHGPpQ\H]WHDUUDXWDOYDKRJ\D]HQ]LPDYH]LNXODNOV IHOV]tQpQ KHO\H]NHGLNHOWiEOi]DW $PLNURV]yPiOLVYH]LNXOiNDWDSyUXVNpS] DQWLELRWLNXP

alameticinnel permeabilizálva csak enyhe aszkorbil gyök szint emelkedést tapasztaltunk (4.6. táblázat), ami arra utal, hogy az aszkorbát jól hozzáfér az oxidáció helyéhez. Ez az

HUHGPpQ\WRYiEEQ|YHOWHD]DV]NRUEiWR[LGi]HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPPHPEUiQNOV IHOV]tQLORNDOL]iFLyMiQDNYDOyV]tQ VpJpW

69

4.6. táblázat Az aszkorbát oxidáz aktivitás lokalizációja Aszkorbil gyök szignál (T.I.E.) D D]DV]NRUEiWR[LGi]DNWLYLWiVV]XEFHOOXOiULVORNDOL]iFLyMD Patkány máj teljes homogenátum

460 ± 75 (4)

Mitokondrium

253 ± 10 (4)

Citoplazma

176 ± 96 (4)

Mikroszóma

548 ± 69 (13)

E D]DV]NRUEiWR[LGi]DNWLYLWiVPLNURV]yPiOLVORNDOL]iFLyMD Natív patkány máj mikroszóma

548 ± 69 (13)

3,5 % tripszin

207 ± 44 (4)

Alameticin (0.1 mg/mg fehérje)

670 ± 41 (4)

0.1 mM aszkorbátot inkubáltunk 10 percen keresztül mikroszóma és más szubcelluláris frakciók (1

PJSURWHLQPO MHOHQOpWpEHQV]REDK PpUVpNOHWHQ$]DODPHWLFLQWD]LQNXEiFLyVSHULyGXVNH]GHWpQ adtuk a rendszerhez, a tripszinnel kezelt mikroszómákat 60 percig tripszin jelenlétében

HO LQNXEiOWXN$]DV]NRUELOJ\|NV]LQWHW(65VSHNWURV]NySLiYDOKDWiUR]WXNPHJ$]HUHGPpQ\HNHW

átlag ± S.D. formában tüntettük fel, (n). T.I.E., terület integrációs egység.

$]DV]NRUEiWR[LGiFLyJiWOiVD $]DV]NRUELQVDYPLNURV]yPiOLVR[LGiFLyMDK pVSURWHi]pU]pNHQ\QHNHO ] SRQW

EL]RQ\XOWDPLHJ\IHKpUMHPHGLiOWIRO\DPDWRWYDOyV]tQ VtW$PLNURV]yPiNSHUFHV

IRUUDOiViWN|YHW HQDV]NRUEiWR[LGi]DNWLYLWiVXND]DXWRR[LGiFLyUDMHOOHP] V]LQWUHHVHWW

vissza (4.2. ábra c spektrum, 4.7. táblázat). A mikroszómák proteázos kezelése (3,5 %

WULSV]LQ V]LQWpQD]DXWRR[LGiFLyV]LQWMpUHYHUWHYLVV]DD]DV]NRUELOJ\|NNpS] GpVV]LQWMpW (4.6. táblázat, 4.2. ábra e spektrum). Az oxidáció enzimes mivoltát tovább vizsgálandó,

70

NO|QE|] DQ\DJRNDWDV]yEDM|KHW HQ]LPHNKHPRSURWHLQHNIODYRSURWHLQHNpV metalloproteinek) hatékony gátlószereit adtuk mikroszómális rendszerünkhöz. Az ismert

KHPRSURWHLQLQKLELWRUHNRQD]ROpVNYHUFHWLQ±DPHO\HNU OPiUNRUiEEDQOHtUWiN DV]NRUEiWR[LGiFLyWpVD]H]WN|YHW PLNURV]yPiOLVIHOYpWHOpWJiWOyKDWiViW±PLQG

mikroszóma jelenlétében, mind anélkül csökkentette az aszkorbil gyök szintet (4.7. táblázat). A flavoprotein inhibitor difenil-jodonium és a hemoprotein inhibitor nátrium azid hatástalannak bizonyult (4.7. táblázat). Ezen eredmények bizonytalanná teszik a hemo- és a

IODYRSURWHLQHNDV]NRUELQVDYR[LGiFLyEDQW|UWpQ N|]UHP N|GpVpWËJ\PDUDGWDND PHWDOORSURWHLQHN.O|QE|] NHOiWRURNPLQWDGLSLULGLOD]IHQDQWUROLQYDJ\

Up]VSHFLILNXVDQDOyJMDDQHRNXSURLQMHOHQW VPpUWpNEHQFV|NNHQWHWWpND]DV]NRUELOJ\|N

V]LQWHWiEUDGVSHNWUXPWiEOi]DW $]HO EEIHOVRUROWIpPNHOiWRURND

PLNURV]yPDPHQWHVYDJ\K NH]HOWPLNURV]yPiWWDUWDOPD]yROGDWHVHWpEHQQHP csökkentették az aszkorbát autooxidációjából származó aszkorbil gyök szintet (4.7.

WiEOi]DW $FV|NNHQWPpUWpN DV]NRUELOJ\|NNpS] GpVD]DV]NRUELQVDYIRJ\iViEDQLV

WNU|] G|WWWiEOi]DW

71

WiEOi]DW$]DV]NRUELOJ\|NNpS] GpVJiWOiVDSDWNiQ\PiMPLNURV]yPiOLVYH]LNXOiNEDQ Aszkorbil gyök szignál (T.I.E.) - mikroszóma

+ mikroszóma

152 ± 11 (6)

548 ± 69 (13)

+ NH]HOWPLNURV]yPD

-

235 ± 65 (4) *

1% dimetil-szulfoxid

-

608 ± 74 (3)

0,1 mM ekonazol

48 ± 32 (3) *

240 ± 52 (10) *

0,1 mM kvercetin

68 ± 26 (3) *

125 ± 44 (4) *

5 mM mannitol

-

443 ± 57 (7)

600 U/ml szuperoxid diszmutáz

-

498 ± 129 (5)

900 U/ml kataláz

-

509 ± 69 (4)

0,1 mM difenil-jodonium

-

441 ± 74 (3)

10 mM nátrium azid

-

394 ± 32 (3)

264 ± 21 (4)

202 ± 11 (4) *

-

164 (2)

192 ± 18 (4)

200 ± 16 (4) *

-

214 (2)

144 ± 36 (3)

198 ± 55 (3) *

-

143 (2)

Kontroll

0,1 mM 1,10-fenantrolin + NH]HOWPLNURV]yPDP0IHQDQWUROLQ 0,1 mM neokuproin + NH]HOWPLNURV]yPDP0QHRNXSURLQ 0,1 mM dipiridil + NH]HOWPLNURV]yPDP0GLSLULGLO

$PLNURV]yPiNDWPJSURWHLQPO DV]NRUELQVDYP0 pVNO|QE|] DQ\DJRNMHOHQOpWpEHQ

SHUFHQNHUHV]WOV]REDK PpUVpNOHWHQLQNXEiOWXN$]DV]NRUELOJ\|NV]LQWHW(65VSHNWURV]NySLiYDO határoztuk meg. Az eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel, (n). T.I.E., terület integrációs egység. * A kontrollértékhez képest szignifikáns eltérés (p<0,05).

72

$]DV]NRUELQVDYR[LGiFLySULPHUYROWDDYDJ\DUHDNWtYR[LJpQVSHFLHVHNV]HUHSH $UHDNWtYR[LJpQVSHFLHVHN526 DV]NRUEiWR[LGiFLyEDQYDOypULQWHWWVpJpWNLGHUtWHQG megvizsgáltuk néhány enzimes és nem-enzimes antioxidánsnak a folyamatra gyakorolt hatását. Mind a szuperoxidfogó szuperoxid diszmutáz, mind a hidrogén-peroxid bontó

NDWDOi]YDODPLQWD]iOWDOiQRVJ\|NIRJyLJD]I OHJKLGURSHUR[LOJ\|NIRJy KDWiV~PDQQLWRO és dimetil-szulfoxid nem befolyásolta (csökkentette) sem az aszkorbil gyök szintjét, sem az aszkorbátfogyás mértékét (4.7. táblázat, még E-vitaminos táblázat). Mindezek alapján arra N|YHWNH]WHWKHWQNKRJ\DUHDNWtYR[LJpQVSHFLHV]HNV]HUHSHQHPG|QW DPLNURV]yPiOLV

aszkorbinsav oxidáció folyamatában. 4.8. táblázat Az aszkorbát oxidáció gátlószereinek hatása patkány máj mikroszómákban az aszkorbinsav és a fehérje tiol oxidációra Kezelés

Aszkorbát fogyás

Fehérje tiol fogyás

(pmol/min/mg fehérje) Semmi

463 ± 32

325 ± 58

0,1 mM 1,10-fenantrolin

243 ± 39*

< 10*

NTM

< 10*

0,1 mM neokuproin

270 ± 8*

25 ± 16*

+ NH]HOWPLNURV]yPD

191 ± 36*

NTM

0,1 mM dipiridil

A mikroszómákat (1 mg protein/ml) 0.1 mM aszkorbát és a jelölt inhibítorok jelenlétében inkubáltuk 37OC-on, 60 percig. Az aszkorbát és a fehérje tiol koncentrációt a módszerek fejezetben leírt módon határoztuk meg. Az eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel, n = 4-6. * A kontrollértékhez képest szignifikáns eltérés (p<0,05). NTM; nem tötrént mérés.

73

$]DV]NRUEiWR[LGiFLyJiWOiViQDNKDWiVDDIHKpUMHWLRORNR[LGiFLyMiUD A két folyamat kapcsolatára utalna, ha az aszkorbinsav oxidációjának gátlásával a fehérje WLROR[LGiFLyPpUWpNHLVFV|NNHQQH(OV OpSpVEHQDMyOLVPHUWFLWRNUyP3LQKLELWRURN

hatásának párhuzamosságát vizsgáltuk meg. Mindhárom kipróbált anyag (ekonazol, proadifen, kvercetin) hatásosan gátolta mind az aszkorbinsav fogyását, mind a fehérjetiolok oxidációját (4.2. táblázat). Az ekonazol az aszkorbátot és hidrogén peroxidot egyszerre tartalmazó patkány, tengerimalac és humán rendszerek esetében is hatékonyan gátolta mind az aszkorbinsav, mind a tiolok oxidációját (4.2. táblázat). A gulonolakton-oxidáz dependens tioloxidációt ekonazollal gátolva, a mikroszómális aszkorbátszintézis mértéke

PHJWDUWRWWPDUDGWWiEOi]DW V WEL]RQ\RVPpUWpN ±IHOWpWHOH]KHW HQDFV|NNHQW DV]NRUEiWIRJ\iVEyOHUHG ±DV]NRUEiWV]LQWp]LVIRNR]yGiVWOHKHWHWWWDSDV]WDOQL

A gátlás mechanizmusáról ezek alapján semmit sem mondhatunk, mivel ezek a reagensek a mikroszómamentes oldatban is csökkentették az aszkorbil gyök szintjét (4.7. táblázat). Az aszkorbát oxidáció gátlása terén specifikusabbnak bizonyult fémkelátorok hatása informatívabb lehet. A dipiridil, az 1,10-fenantrolin és a neokuproin hármas 100 mM-os koncentrációban gyakorlatilag teljesen megszüntette az aszkorbát-dependens fehérje tiol

R[LGiFLyWWiEOi]DW $QHRNXSURLQHVHWpEHQNRQFHQWUiFLyIJJ JiWOiVWWDSDV]WDOWXQN már 1 mM-os koncentrációban több mint 50%-os gátlást eredményezett (4.5. ábra).

74

25

Fehérje tiol fogyás (nmol/mg fehérje/h)

20

15

10

5

0 0

5

10

95

100

105

neokuproin (µM) 4.5. ábra A fehérje tiol oxidáció gátlása neokuproinnel patkány máj mikroszóbában. A mikroszómát (1 mg fehérje/ml) 100 mM aszkorbát és a feltüntetett koncentrációjú neokuproin jelenlétében 30 percig inkubáltuk 37oC-on. A fehérje tiolok mennyiségét a

NLLQGXOiVLLG SRQWEDQpVD]LQNXEiFLyYpJpQKDWiUR]WXNPHJ$]HUHGPpQ\HNHWiWODJ± S.D. formában tüntettük fel, n = 3-6.

75

$](YLWDPLQKLiQ\KDWiVDD]DV]NRUEiWIJJ IHKpUMHWLROR[LGiFLyUD $](YLWDPLQPHQWHVGLpWDSDWNiQ\RNUDJ\DNRUROWKDWiVD Az E-vitamin mentes diéta a máj mikroszómák aWRNRIHUROV]LQWMpQHNMHOHQW V csökkenésével járt együtt (4.9. táblázat). A diéta a test és a máj súlyára nem gyakorolt

MHOHQW VKDWiVWWiEOi]DW

4.9. táblázat Az E-vitamin-mentes diéta patkányokra gyakorolt hatása Kontroll

E-vitamin hiányos

375 29

Test súly (g) Máj súly (g)

11,91 0,85

10,87 1,47

15,8 1,7

18,7 2,2

3,18 0,13

Fajlagos máj súly (%) Mikroszómális fehérje (mg/g máj) Mikroszómális a-tokoferol tartalom (pmol/mg fehérje)

385 21

378,2 59,7

2,82 0,28 6,1 1,4

Hím Wistar patkányokat 12 héten keresztül E-vitamin-mentes diétán tartottunk. Májukból mikroszómákat preparáltunk, majd a módszerek fejezetben leírtak szerint HPLC segítségével meghatároztuk a-tokoferol tartalmukat. Az eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel, n = 6.

$V]NRUEiWIJJ IHKpUMHWLROR[LGiFLy(YLWDPLQKLiQ\RVPiMPLNURV]yPiEDQ Kontroll és E-vitamin-hiányos patkánymájakból izolált mikroszómákat fiziológiás aszkorbátkoncentrációjú pufferben inkubáltunk. Ezt két módon biztosítottuk, egyrészt

GLUHNWP0DV]NRUEiWKR]]iDGiViYDOPiVUpV]U ODSUHNXU]RUJXORQRODNWRQP0 adagolásával. A gulonolakton-oxidáz aktivitásban nem mutatkozott különbség a kontroll és az E-vitamin-hiányos csoport között (4,08 ± 0,12 és 3,64 ±0,60 nmol aszkorbát/min/mg, n = 6). Az aszkorbinsav attól függetlenül, hogy direkt módon adagoltuk vagy LQVLWX

V]LQWHWL]iOyGRWWIHKpUMHWLROR[LGiFLyWYiOWRWWNL$WLROR[LGiFLyPpUWpNHD]RQEDQMHOHQW VHQ

76

eltért a kontroll és az E-vitamin-deficiens mikroszómák esetében (4.10. táblázat). Rövidebb

LQNXEiFLyVLG SHUF HVHWpEHQDMHOHQVpJPpJLQNiEENLIHMH]HWWYROWpV

SPROPLQPJIHKpUMHDV]NRUEiWKR]]iDGiViUDQ $OHKHW VpJHWNL]iUDQGyKRJ\D fehérje tiolok oxidációjának visszaesése az E-vitamin-megvonás másodlagos következménye, a deficiens mikroszómákhoz a-tokoferolt (500 pmol/mg fehérje) adtunk.

$]HO NH]HOpVKDWpNRQ\ViJiWDYLWDPLQPLNURV]yPiEDW|UWpQ EHpSOpVpW+3/&V PpUpVVHOHOOHQ UL]WNDNOV OHJEHYLWWa-tokoferol többé-kevésbé normalizálta a

mikroszóma E-vitamin tartalmát (164 ± 21 pmol/mg fehérje). A fehérjetiol oxidáció mértéke megközelítette a kontroll csoport értékeit és jól korrelált az E-vitamin-szintjével (4.10. táblázat).

77

4.10. táblázat Az E-vitamin-hiány aszkorbát, valamint gulonolakton indukálta fehérje tiol oxidációra gyakorolt hatása Hatás

Kontroll

(pmol/min/mg fehérje)

E-vitamin

E-vitamin

deficiens

deficiens + E-vitamin

Semmi

46

Fehérje tiol oxidáció Aszkorbát fogyás

35

85

26 12

34 10

31 16

283 54

143 33a

216 33b

0,1 mM


Aszkorbát

Aszkorbát fogyás

519 125

925 136a

682 104b

1 mM


248 36

126 50a

NTM

Gulonolakton

Aszkorbát fogyás

2359 423

1259 107a

NTM

E-vitamin-mentes diétán tartott patkányok májából mikroszómát preparáltunk. A deficiens mikroszómák egy részét E-vitaminnal kezeltük LQYLWUR. A mikroszómákat (1 mg fehérje/ml) 0,1 mM aszkorbát vagy 1 mM gulonolakton jelenlétében 60 percig 37 °C-on inkubáltuk. Az aszkorbát és a fehérje tiol koncentrációt a módszerek fejezetben leírt módon meghatároztuk. A kezdeti tiol koncentrációk a kontroll és az E-vitamin-hiányos mikroszómák esetében 45,7 4,5 és 41,4 4,2 nmol/mg fehérje voltak (átlag ± S.D., n = 6). Az eredményeket átlag ± S.D. formában tüntettük fel, n = 4-6. * A kontrollértékhez (a) vagy az E-vitamin-deficiens esethez (b) képest szignifikáns eltérés (S<0.005). NTM; nem történt mérés. $V]NRUEiWKDWiVDD](YLWDPLQKLiQ\RVPLNURV]yPiNOLSLGSHUR[LGiFLyMiUD $FV|NNHQWPpUWpN DV]NRUEiWIJJ WLROR[LGiFLyHJ\LNRNDOHKHWDFV|NNHQWPpUWpN

DV]NRUEiWR[LGi]DNWLYLWiV$IHOWpWHOH]pVWHOOHQ UL]HQG PHJPpUWNDPLNURV]yPiOLV

DV]NRUEiWIRJ\iVPpUWpNpW$](YLWDPLQKLiQ\RVPLNURV]yPiNHVHWpEHQHPHONHGHWWV]LQW

DV]NRUEiWR[LGi]DNWLYLWiVWWDSDV]WDOWXQNDPLWDFV|NNHQWPpUWpN JXORQRODNWRQGHSHQGHQV aszkorbát produkció is jelzett (4.10. táblázat). Az E-vitamin-hiányos mikroszómákban

78

PpUKHW IRNR]RWWPpUWpN DV]NRUEiWIRJ\iVIRNR]RWWOLSLGSHUR[LGiFLyYDOMiUWHJ\WWDPLW D]HPHONHGHWW7%$56SURGXNFLyHJ\pUWHOP HQWNU|]|WWiEUD 0LQGD]DV]NRUEiW IRJ\iVWWiEOi]DW PLQGD7%$56NpS] GpVWQPROPJIHKpUMHD]

LQNXEiFLyVLG SHUFpEHQQ QRUPDOL]iOQLOHKHWHWW(YLWDPLQDGDJROiViYDO

79

E

TBARS formation (nmol/mg protein) 7%$56NpS] GpVQPROPJIHKpUMH

7%$56NpS] GpVQPROPJIHKpUMH TBARS formation (nmol/mg protein)

D

6

4

2

0

0

15

30

45

,QNXEiFLyVLG SHUF Time (min)

6

4

2

0

60

0

15

30

,QNXEiFLyVLG SHUF Time (min)

4.6. ábra Az aszkorbinsav hatása E-vitamin-deficiens és kontroll mikroszómális vezikulák lipid peroxidációjára. A mikroszómákat kontroll (a) és E-vitamin deficiens (b) patkányokból izoláltuk. A mikroszómákat (1 mg fehérje/ml) 0,1 mM aszkorbát (kitöltött négyzet), 1 mM gulonolakton (üres négyzet) jelenlétében vagy magában (csillag) inkubáltuk 60 percig 37 °C-on. A TBARS mennyiségét mértük. Az eredményeket átlag ±

S.D. formában tüntettük fel, n = 6.

80

45

60

5. Megbeszélés $V]HNUpFLyUDNHUO YDODPLQWDVHMWHQGRSOD]PiVUHWLNXOXPOXPLQiOLVIHKpUMpL szerkezetüket gyakran diszulfid hidakkal stabilizálják. A prokarióta és eukarióta sejtek a diszulfid hidak hatékony kialakulását, a tiol csoportok oxidációját két kompartimentum

N|]UHP N|GpVpYHOEL]WRVtWMiNH]HNDEDNWHULiOLVSHULSOD]PDpVD]HXNDULyWDHQGRSOD]PiV

UHWLNXOXP$EDNWHULiOLVWLROR[LGiFLyIRO\DPDWDpVUpV]WYHY LD]HXNDULyWDUHQGV]HUKH] képest jól ismertek. $]DV]NRUELQVDYPLNURV]yPiOLVR[LGiFLyMD

Intakt hepatociták endoplazmás retikulumában folytonos az újonnan szintetizált fehérjék

WLROFVRSRUWMDLQDNR[LGiFLyMD(QGRSOD]PiVUHWLNXOXPHUHGHW PLNURV]yPiOLVYH]LNXOiN esetében azonban a protein tiolok oxidációja, a diszulfid hidak kialakulása még oxigén jelenlétében is leáll, mely arra utal, hogy a folyamat nem nélkülözhet egy vagy több citoszólikus faktort, vagy membrán-permeábilis anyagot, amely a mikroszóma izolálás

során elvész. A diszulfid hidak kialakulása során „leadott” elektron további sorsáért ez a

IHOWpWHOH]HWWIDNWRUOHKHWIHOHO V$]HOHNWURQDNFHSWRUV]HUHSUHVRNiLJD*66*WWDUWRWWiN HVpO\HVQHN$IHOWpWHOH]pVWW|EEPHJILJ\HOpVLVPHJNpUG MHOH]WH i.

*OXWDWLRQV]LQWp]LVpUHNpSWHOHQ*6+PXWiQV pOHV]W W|U]VHN'77YHONLHJpV]tWHWW

PLQLPXPWiSWDODMRQPHJ UL]WpNQ|YHNHGpVLNpSHVVpJNHWYDODPLQWD

fehérjediszulfidok kialakulása – annak ellenére, hogy a sejtek detektálható

PHQQ\LVpJ JOXWDWLRQWnem tartalmaztak – nem szenvedett károsodást (46).

ii.

Patkány máj endoplazmás retikulum esetében megállapították, hogy a redukált és oxidált glutation közül a GSH transzportja preferált. A transzportált GSH részlegesen oxidálódik a lumenben. A GSSG transzportja igen lassú és az LQWUDYH]LNXOiULVDQNpS] G *66*DNNXPXOiOyGLNDOXPHQEHQ

iii.

A GSH és a fehérjetiolok között kompetíció alakul ki az oxidáló ágens megszerzéséért (123).

81

eUGHNO GpVQNHJ\PiVLNNLVPROHNXODV~O\~DFLWRV]yOEDQLVHO IRUGXOyDQ\DJaz aszkorbinsav, pontosabban az aszkorbinsav/dehidroaszkorbát redoxpáros felé fordult. Az

HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPLQWUDOXPLQiOLVDV]NRUELQVDYNpWIRUUiVEyOLVV]iUPD]KDWHJ\UpV]U O DV]NRUELQVDYELRV]LQWp]LVpUHNpSWHOHQW|U]VHNEHQSOWHQJHULPDODFHPEHU NOV

IRUUiVEyODPLNRUDGHKLGURDV]NRUEiWFLWRV]yOEyOW|UWpQ WUDQV]SRUWMiWHJ\YDOyV]tQ OHJ

*/87WtSXV~WUDQV]SRUWHUYpJ]L PiVUpV]U OIXQNFLRQiOLVJXORQRODNWRQR[LGi]]DO

UHQGHONH] W|U]VHNEHQSOSDWNiQ\ N|]YHWOHQOaz endoplazmás retikulum lumenében V]LQWHWL]iOyGLN $]DV]NRUEiWHQGRSOD]PiVUHWLNXOXPEDW|UWpQ WUDQV]SRUWMiQDN

HO IHOWpWHOHGHKLGURDV]NRUEiWWiW|UWpQ R[LGiFLyMD WRYiEEiR[LGiFLyMDHOHQJHGKHWHWOHQ

ahhoz is, hogy elektronakceptorként viselkedhessen.

0LQGDNOV OHJKR]]iDGRWW, mind az LQVLWX termeltetett aszkorbinsav oxidációját megfigyeltük kísérletes mikroszómális rendszerünkben. Gulonolakton adagolása, az aszkorbinsavéhoz hasonlóan megemelkedett aszkorbil gyök és dehidroaszkorbát szintet HUHGPpQ\H]HWW$PHJHPHONHGHWWDV]NRUELOJ\|NpVGHKLGURDV]NRUEiWV]LQWHNLG EHQ megtartottnak bizonyultak, tehát az aszkorbátból képz dött dehidroaszkorbát az endoplazmás retikulum lumenébe jutva elektronakceptorként szolgálhat a fehérje tiolok oxidációjához. $]DV]NRUEiWR[LGi]DNWLYLWiVMHOOHP]pVH $GHKLGURDV]NRUEiWWHKiWPLQWNLVPROHNXODW|PHJ az endoplazmás retikulum

PHPEUiQMiEDQWUDQV]SRUWHUUHOUHQGHONH] HOHNWURQDNFHSWRUUpV]WYHKHWD]HQGRSOD]PiV

UHWLNXOXPOXPHQpEHQWDOiOKDWyIHKpUMHWLROR[LGiFLyVJpSH]HWP N|GpVpEHQ(KKH]D]RQEDQ D]DV]NRUEiWHO ]HWHVGHKLGURDV]NRUEiWWiR[LGiOiVDV]NVpJHV$GHKLGURDV]NRUEiW

citoplazmatikus koncentrációja bomlékony természete és a redukáló citoplazmatikus környezet miatt nagyon alacsony, így az endoplazmás retikulum közvetlen környezetében található aszkorbát oxidációs apparátusra van szükség, mely képes a folyamat állandó dehidroaszkorbát igényének kielégítésére. Mit jelent ez a közvetlen környezet? Az aszkorbát oxidáz aktivitás szubcelluláris lokalizációjának vizsgálata során a mikroszómális

IUDNFLyKR]]iDGiViWN|YHW HQHPHONHGHWWmeg messze a legnagyobb mértékben az aszkorbil

82

gyök szintje. A többi sejtfrakció közül egyedül a mitokondrium mutatott – igaz a mikroszómáénál jóval alacsonyabb – aszkorbát oxidáz aktivitást. A mitokondriális frakció

DV]NRUEiWR[LGi]DNWLYLWiVDYDOyV]tQ OHJDPLWRNRQGULXPpVDPLNURV]yPDN|]|WWIHQQiOOy

V]RURVN|W GpVE OHUHGDPLWRNRQGULiOLVIUDNFLyHQGRSOD]PiVUHWLNXOXPHUHGHW PHPEUiQW

LVWDUWDOPD] (]WDOiWiPDV]WRWWiNDPLWRNRQGULiOLVIUDNFLyEDQPpUKHW YLV]RQ\ODJ magas mikroszómális markerenzim aktivitások.

A mikroszómális vezikulák permeabilizálása gyakorlatilag nem befolyásolta az aszkorbil J\|NV]LQWMpWHEE ODUUDN|YHWNH]WHWKHWQNKRJ\D]HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPPHPEUiQMD

nem jelent gátat az aszkorbát számára, azaz az aszkorbátot oxidáló enzim aktív centruma a citoszol felé néz. A proteáz kezelés hatására bekövetkezett nagyfokú aszkorbát oxidáz

DNWLYLWiVFV|NNHQpVV]LQWpQPHJHU VtWLDIHOWHYpVW(]DPHJILJ\HOpVWRYiEELWDQXOViJJDOLV szolgál. A folyamat enzim katalizálta voltára utal az aszkorbát oxidációs aktivitás HPLC-

YHOpV(65UHOIHOYHWWMHOOHP] L

patkány máj mikroszómális vezikulák jelenléte mintegy háromszorosára fokozta az

DK YHOYDJ\WULSV]LQQHOHO NH]HOWPLNURV]yPiNHOYHV]WHWWpNDV]NRUELOJ\|NNpS]

DXWRR[LGiFLyHVHWpEHQPpUKHW DV]NRUELOJ\|NV]LQWHW

képességüket;

specifikus inhibitorok hatására mind az aszkorbát fogyás, mind az aszkorbil gyök

V]LQWMHOHQW VHQFV|NNHQW

az aszkorbát oxidáz aktivitás kompartimentumhoz kötött, a mikroszómális frakcióra

MHOOHP]

Felmerült, hogy az aszkorbát oxidációja és az aszkorbil gyök keletkezése egy, a mikroszómális rendszer által termelt reaktív oxigénspecieszek keltette másodlagos

IRO\DPDW$IHOWHYpVKHO\WiOOyViJiWNO|QE|] DQWLR[LGiQVRNDV]NRUELOJ\|NV]LQWUH

gyakorolt hatásával HOOHQ UL]WN$QWLR[LGiQVHQ]LPHNV]XSHUR[LGGLV]PXWi]NDWDOi] QHP

befolyásolták az aszkorbil gyök jel intenzitását, arra utalva, hogy a szuperoxid anion és a hidrogén peroxid keletkezése nem játszanak szerepet a folyamatban. A nem enzimes hidroxil gyök fogó mannitol és dimetil-szulfoxid szintén hatástalannak bizonyult. A

83

feltevést, miszerint D]DV]NRUELOJ\|NNHOHWNH]pVpWPHJHO ] HOV GOHJHVIRO\DPDWD szuperoxid anion, vagy hidroxil gyök keletkezése lenne, elvethetjük. -yVOiVDPiMDV]NRUEiWR[LGi]DHJ\NXSURHQ]LP" Eredményeink alapján D]DV]NRUEiWPLNURV]yPiOLVR[LGiFLyMipUWIHOHO VHQ]LPHWQHPOHKHW

HJ\pUWHOP HQD]RQRVtWDQLGHDOHKHWVpJHVHQ]LPHNN|UpWOHV] NtWKHWMNA máj mikroszóma a citokróm P450 izoenzimek garmadáját tartalmazza. Növényeken kívül eddig D]pO VN|G 7U\SDQRVRPDFUX]L esetében számoltak be aszkorbát peroxidáz (168), valamint a gomba

3OHXURWXVRVWUHDWXVHVHWpEHQDV]NRUEiWR[LGi] MHOHQOpWpU OPLQGNpWHVHWEHQD]HQ]LP KHPRSURWHLQQHNEL]RQ\XOW$]HO ] PHJiOODStWiVRNYDODPLQWDWLSLNXVDQFLWRNUyP3 LQKLEtWRUNYHUFHWLQpVHNRQD]RODV]NRUEiWR[LGiFLyUDJ\DNRUROMHOHQW VJiWOyKDWiVD

felvetette a citokróm P450 izoenzimek aszkorbát oxidációs szerepét. A kvercetin és az

HNRQD]ROD]RQEDQPLNURV]yPDPHQWHVN|]HJEHQLVHJ\pUWHOP HQFV|NNHQWHWWpND]DV]NRUELO

J\|NV]LQWHWtJ\HQ]LPLQKLEtWRUKDWiVXNHJ\pUWHOP HQQHPpUWpNHOKHW $PiVLNMHOOHJ]HWHV FLWRNUyPLQKLEtWRUDQiWULXPD]LGFVHNpO\JiWOiVDD]RQEDQHU VHQPHJNpUG MHOH]LD

citokróm P450 enzimek szerepét. Az oxidázok között számos flavoprotein is található, a tipikus flavoenzim inhibítor difenilénjodónium azonban nem gátolta az aszkorbil gyök NpS] GpVWtJ\QDJ\YDOyV]tQ VpJJHOH]HNVHPMiWV]DQDNV]HUHSHWD]DV]NRUELQVDY

mikroszómális oxidációjában.

-HOHQW VJiWOiVWWDSDV]WDOWXQNIpPNHOiWRURNGLSLULGLOIHQDQWUROLQpVQHRNXSURLQ

KR]]iDGiViWN|YHW HQPHO\HNPLQGaz aszkorbil gyök szintjét, mind az aszkorbátfogyást csökkentették. Fontos momentum, hogy az említett anyagok csak natív mikroszómák jelenlétében fejtették ki hatásukat, vagyis nem csökkentették az aszkorbil gyök szintjét

PLNURV]yPDWiYROOpWpEHQYDJ\K NH]HOWPLNURV]yPDMHOHQOpWpEHQ+DWiVXNDWH]HNDODSMiQ sokkal inkább egy feltételezett metalloenzim gátlásának tudhatjuk be, mintsem a puffer átmeneti fém tartalma komplexbe vitelének, vagy az aszkorbil, gyök esetleges

visszaredukálásának. $IHOKDV]QiOWNHOiWRURNNO|QE|] DIILQLWiVVDON|WLND)H2+, Fe3+, Cu+ és Cu2+ ionokat (100). A viszonylagosan rézspecifikus neokuproin (1, 53, 121) hatása egy

Up]FHQWUXP~IHKpUMHN|]UHP N|GpVpWVHMWHWLD]RQEDQHJ\pUWHOP HQPiVPHWDOORHQ]LPHN

84

résztvételét sem zárhatjuk ki. Itt érdemes megjegyeznünk, hogy a növényekben található aszkorbát oxidázok kuproenzimek (69). $V]NRUELQVDYR[LGiFLyGHSHQGHQVPLNURV]yPiOLVIHKpUMHWLROR[LGiFLy Aszkorbinsav adagolása valamennyi vizsgált faj májából származó mikroszómális vezikula esetében kiváltotta a fehérje tiolok oxidációját. A mikroszómális rendszerhez dehidroaszkorbátot adva a korábbi megfigyelésekhez (152, 153) hasonlatosan a tiolok R[LGiFLyMiYDOSiUKX]DPRVDQDV]NRUELQVDYNpS] G|WW$IHKpUMHWLRORNR[LGiFLyMiQDN maximális sebessége hasonló volt a mikroszómákhoz gulonolaktont, aszkorbátot,

DV]NRUEiWRWpVKLGURJpQSHUR[LGRWV]LPXOWiQYDJ\GHKLGURDV]NRUEiWDGYD(EE ODUUD

következtethetünk, hogy D]HOHNWURQWUDQV]IHUV] NNHUHV]WPHWV]HWpWDIHKpUMHWLRORNpVD]

DV]NRUELQVDYN|]|WWOHKHWVpJHVMHOHQWNH] SODSURWHLQGLV]XOILGL]RPHUi]DNWLYLWiVD NHOO keresnünk. Aszkorbát szintézisére képes fajok esetében a gulonolakton-oxidáz aktivitása a máj mikroszómában fehérje tiol oxidációt eredményezett. Igaz, a hepatociták gulonolakton koncentrációja nem ismert, de a gulonolakton által kiváltott fehérjetiol oxidáció alacsony

KMpUWpNHDIRO\DPDWIL]LROyJLiVYROWiUDXWDO$]R[LGiFLyWpUWHOHPV]HU HQDJXORQRODNWRQ R[LGi]P N|GpVHVRUiQNHOHWNH] KLGURJpQSHUR[LGQDNLVWXODMGRQtWKDWQiQND]RQEDQPpJ

QDJ\PHQQ\LVpJ P0DPLNpWQDJ\ViJUHQGGHOPDJDVDEENRQFHQWUiFLyPLQWD]yUiV

LQNXEiFLyDODWWDJXORQRODNWRQR[LGi]iOWDOHO iOOtWRWW KLGURJpQSHUR[LGDGDJROiVDVHP tudta az oxidációt kiváltani. A megfigyelés arra utal, hogy az enzim másik terméke, az

DV]NRUELQVDYIHOHO VD]R[LGiOyKDWiVpUW(]]HOMyO|VV]HYiJKRJ\az aszkorbinsav oxidáció gátlószerei gátolták a fehérje tiolok oxidációját is. (5.1. ábra)

85

$V]NRUEiWIHKpUMHWLROIRJ\iVSPROPLQPJ

NRQWUROO

IHQDQW

GLSLULGLO

QHRNXSURLQ

5.1. ábra Párhuzam a mikroszómális aszkorbát- (kék oszlopok) és fehérje tiol (bordó oszlopok) oxidáció között

86

K NH]HOpV

$](YLWDPLQDPLNURV]yPiOLVHOHNWURQWUDQV]IHUEHQ Az aszkorbinsav és a lipofil E-vitamin között számos esetben dokumentált elektrontranszfer felvetette az aszkorbinsav mellett az E-vitamin fehérje tiol oxidációban való résztvételét. Az E-vitamin fehérje tiol oxidációban betöltött szerepét E-vitamin-hiányos diétán tartott patkányokból izolált mikroszómákon követtük nyomon. Az aszkorbát dependens tiol oxidáció csökkenésével párhuzamosan az aszkorbát fogyás növekedését, valamint kifejezett lipidperoxidációt tapasztaltunk az E-vitamin deficiens mikroszómák esetében. Mindezek

alapján D]WYDOyV]tQ VtWKHWMNKRJ\D]DV]NRUEiWR[LGiFLyMDVRUiQD]R[LJpQE OUHDNWtY

oxidáló ágensek keletkeznek és az E-vitamin részt vesz a fehérje tiolok és ezen anyagok közötti elektrontranszferben. Az E-vitamin-hiányos mikroszómákban ezen a ponton szakadna meg a láncolat: a luminális kompartimentum redukált állapotú maradna, a fehérje tiolok nem oxidálódnának, míg az oxidatív ágensek felszaporodnának és további aszkorbát molekulákkal, valamint membrán lipidekkel reagálnának. Tény és való, hogy az E-vitamin

GHILFLHQVPLNURV]yPiNKR]DV]NRUEiWRWJXORQRODNWRQW DGYDMyYDONLIHMH]HWWHEEPpUWpN lipidperoxidációt figyelhetünk meg. A kompartimentációval magyarázhatjuk, hogy a

PHJQ|YHNHGHWWDV]NRUEiWR[LGiFLyPLpUWQHPRNR]PHJQ|YHNHGHWWPpUWpN IHKpUMHWLRO

oxidációt az E-vitamin-hiányos mikroszómák esetében, annak ellenére, hogy a dehidroaszkorbát a fehérje tiolok oxidációjának potenciális elektronakceptora. Az aszkorbát

R[LGi]iOWDOWHUPHOWGHKLGURDV]NRUEiWQDJ\YDOyV]tQ VpJV]HULQWDPHPEUiQNOV IHOV]tQpQ NHOHWNH]LNtJ\DWLROR[LGiFLyHU VHQIJJD]DV]NRUEiWR[LGiFLyMiWyOpVD]D]WN|YHW

HQGRSOD]PiVUHWLNXOXPOXPHQEHW|UWpQ GHKLGURDV]NRUEiWWUDQV]SRUWWyO0LQGH]HNHW

ILJ\HOHPEHYpYHpUWKHW KRJ\az E-vitamin-hiány fehérje tiol oxidációra gyakorolt hatása KRVV]DEELQNXEiFLyVLG NHVHWpQNHYpVEpKDQJV~O\RV

Az általunk vizsgált antioxidánsok, fehérje tiol oxidációban betöltött szerepét az 5.2. ábrán foglalhatjuk össze.

87

FLWRV]RO

(5PHPEUiQ

DHA

redukált termék

ROS

DHA fehérje-(SH)2

E vit.

E v. gyök

transzporter

fehérje-S-Soxidáz

AA

AA

(5OXPHQ

O2

5.2. ábra Az aszkorbinsav és az E-vitamin szerepe a fehérje diszulfid kötések kialakulásában

88

6. Összefoglalás A máj endoplazmás retikulumából származó mikroszómális vezikulákon vizsgáltuk egyes

DQWLR[LGiQVRNV]HUHSpWDGLV]XOILGN|WpVNpS] GpVpKH]V]NVpJHVHOHNWURQWUDQV]IHUEHQ /HJIRQWRVDEE~MPHJiOODStWiVDLQNDN|YHWNH] N

Az endoplazmás retikulum membránja citoplazmai orientációjú aszkorbát oxidáz

DNWLYLWiVVDOUHQGHONH]LN$]DNWLYLWiVpUWIHOWHKHW OHJHJ\réztartalmú metalloprotein

IHOHO V

A mikroszómális aszkorbát oxidáz aktivitás aszkorbinsav jelenlétében a szubsztrát fogyása mellett állandó aszkorbil gyök és dehidroaszkorbát szintet tart fenn.

A mikroszómális aszkorbát oxidáz aktivitás elengedhetetlenül szükséges az

A mikroszómális membrán tokoferolja résztvesz az intraluminális aszkorbát és az

DV]NRUEiWIJJ GLV]XOILGN|WpVNpS] GpVKH]

extravezikuláris reaktív oxigéntartalmú vegyületek közötti elektrontranszferben, HO PR]GtWYiQDGLV]XOILGN|WpVHNJHQHUiOiViW

Az aszkorbinsav egy mikroszómális metalloenzim mediálta oxidáció során – aszkorbil

gyök intermedieren keresztül – GHKLGURDV]NRUEiWWiR[LGiOyGLNDPHPEUiQNOV FLWRV]yO

IHOpQp] IHOV]tQpQ$GHKLGURDV]NRUEiWWUDQV]SRUWHUpQHNVHJtWVpJpYHOaz endoplazmás

retikulum lumenébe jut. Az aszkorbát oxidációja során a membrán közvetlen közelében reaktív oxidáló ágensek is keletkeznek, melyek az E-vitaminnal (vagy membránlipideken

NHUHV]WO(YLWDPLQQDO UHDJiOKDWQDNWRNRIHULOJ\|NNpS] GpVpWHUHGPpQ\H]YH$J\|Naz intraluminális aszkorbát terhére – további dehidroaszkorbátot eredményezve – redukálódhat vissza. A lumenben a dehidroaszkorbát oxidálja a célfehérjék tioljait a protein diszulfid

L]RPHUi]LOOHWYHPiVWLROGLV]XOILGNLFVHUpO GpVUHDONDOPDVIHKpUMpN iOWDONDWDOL]iOW reakcióban.

,QYLWUR mikroszómális rendszerünkben az itt leírt mechanizmus szükséges és elégséges a GLV]XOILGKtGNpS] GpVHO PR]GtWiViKR].pUGpVKRJ\LQYLYR körülmények között az

DV]NRUEiWIJJ HOHNWURQWUDQV]IHUDI ~WYRQDOYDJ\FVDNHJ\DOHKHWVpJHVHNN|]O

89

Köszönetnyílvánítás Az értekezés alapját képezo kísérletek a Semmelweis Orvostudományi Egyetem Orvosi Vegytani, Molekuláris Biológiai és Pathobiokémiai Intézetében 1999 – 2002 között készültek, ahol 1999-ig tudományos diákkörösként, majd a Pathobiokémia Ph.D. program ösztöndíjas hallgatójaként tevékenykedtem. Munkám irányítója Dr. Bánhegyi Gábor, akinek baráti támogatásáért, szakmai- emberi tanácsaiért, kritikai megjegyzéseiért ezúton fejezem ki köszönetemet. Külön köszönöm Dr. Mandl József professzor úrnak munkám során nyújtott fontos szakmai segítségét. Elismeréssel tartozom Dr. Braun Lászlónak, Dr. Csala Miklósnak, Dr. Kardon Tamásnak és Nagy Gábornak a kutatáshoz nyújtott elméleti és gyakorlati hozzájárulásukért. Köszönettel tartozom Dr. Jakus Juditnak, Jenei Veronikának és Stadler Krisztiánnak a MTA Központi Kémiai Kutatóintézet munkatársainak az ESR mérések során nyújtott segítségükért. Tisztelettel köszönöm Mile Valéria kísérletek során végzett munkáját,

YDODPLQW.6]DEy&VLOODN|Q\YWiURVN|]UHP N|GpVpWDV]DNLURGDORPEHV]HU]pVpEHQ

90

Az értekezés témájában megjelent saját közlemények: 6]DUND$, Stadler K., Jenei V., Margittai É., Csala M., Jakus J., Mandl J., Bánhegyi G.: Ascorbyl free radical and dehydroascorbate formation in rat liver endoplasmic reticulum. J Bioenerg Biomembr. 34: 317-323 (2002). Bánhegyi G., Csala M., 6]DUND$., Varsányi M., Benedetti A., Mandl J.: Role of ascorbate in oxidative protein folding. Biofactors (közlésre elfogadva) Csala M., 6]DUND$, Margittai É., Mile V., Kardon T., Braun L., Mandl J., Bánhegyi G.: Role of vitamin E in ascorbate-dependent protein thiol oxidation in rat liver endoplasmic reticulum. Arch Biochem Biophys. 388: 55-59 (2001). Csala M., Braun L., Mile V., Kardon T., 6]DUND$, Kupcsulik P., Mandl J., Bánhegyi G.: Ascorbate-mediated electron transfer in protein thiol oxidation in the endoplasmic reticulum. FEBS Lett. 460: 539-543 (1999). Nem az értekezés témájában megjelent saját közlemény: Cavarra E., Lucattelli M., Gambelli F., Bartalesi B., Fineschi S., 6]DUND$, Giannerini F., Martorana P.A., Lungarella G.: Human SLPI inactivation after cigarette smoke exposure in a new in vivo model of pulmonary oxidative stress. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281: 412-417 (2001).

91

Irodalomjegyzék 1. Al-Sa’doni H.H., Megson I.L., Bisland S., Butler A.R., Flitney F.W.: Neocuproine, a selective Cu(I) chelator, and the relaxation of rat vascular smooth muscle by Snitrosothiols. Br J Pharmacol 121: 1047-1050 (1997). 2. Andersen C.L., Matthey-Dupraz A., Missiakas D. and Raina S.: A new Escherichia coli gene, dsbG, encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation, required for recycling DsbA/DsbB and DsbC redox proteins. Mol Microbiol 26: 121132 (1997). 3. Anelli T., Alessio M., Mezghrani A., Simmen T., Talamo F., Bachi A., Sitia R.: ERp44, a novel endoplasmic reticulum folding assistant of the thioredoxin family. EMBO J 21: 835-844 (2002). 4. Anfinsen C.B., Haber E., Sela M. and White F.H.: The kinetics of formation of native ribonuclease during oxidation of the reduced polypeptide chain. Proc Natl Acad Sci USA 47: 1309-1314 (1961). 5. Astin A.M., Haslam J.M.: The manipulation of cellular cytochrome and lipid composition in a haem mutant of Saccharomyces cerevisiae. Biochem J 166: 275-285 (1977). 6. Bader M., Hiniker A., Regeimbal J., Goldstone D., Haebel P.W., Riemer J., Metcalf P. and Bardwell J.C.: Turning a disulfide isomerase into an oxidase: DsbC mutants that imitate DsbA. EMBO J 20: 1555-1562 (2001). 7. Bader M., Muse W., Ballou D.P., Gassner C. and Bardwell J.C.: Oxidative protein folding is driven by the electron transport system. Cell 98: 217-227 (1999).

92

8. Bader M., Muse W., Zander T. and Bardwell J.C.: Reconstitution of a protein disulfide catalytic system. J Biol Chem 273: 10302-10307 (1998). 9. Bader M., Xie T., Yu C.A. and Bardwell J.C.: Disulfide bonds are generated by quinone reduction. J Biol Chem 275: 26082-26088 (2000). 10. Bánhegyi G., Lusini L., Puskas F., Rossi R., Fulceri R., Braun L., Mile V., di Simplicio P., Mandl J., Benedetti A.: Preferential transport of glutathione versus glutathione disulfide in rat liver microsomal vesicles. J Biol Chem 274:12213-12216 (1999). 11. Bánhegyi G., Marcolongo P., Puskás F., Fulceri R., Mandl J., Benedetti A.: Dehydroascorbate and ascorbate transport in rat liver microsomal vesicles. J Biol Chem 273: 2758-2762 (1998). 12. Bardwell J.C., Lee J.O., Jander G., Martin N., Belin D. and Beckwith J.: A pathway for disulfide bond formation in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 90: 1038-1042 (1993). 13. Bardwell J.C., McGovern K. and Beckwith J: Identification of a protein required for disulfide bond formation in vivo. Cell 67: 581-589 (1991). 14. Barkovich R.J., Shtanko A., Shepherd J.A., Lee P.T., Myles D.C., Tzagoloff A., Clarke C.F.: Characterization of the COQ5 gene from Saccharomyces cerevisiae. Evidence for a C-methyltransferase in ubiquinone biosynthesis. J Biol Chem 272: 9182-9188 (1997). 15. Benham A.M., Cabibbo A., Fassio A., Bulleid N., Sitia R., Braakman I.: The CXXCXXC motif determines the folding, structure and stability of human Ero1Lalpha. EMBO J 19: 4493-4502 (2000).

93

16. Bessette P.H., Cotto J.J., Gilbert H.F. and Georgiou G.: In vivo and in vitro function of the Escherichia coli periplasmic cysteine oxidoreductase DsbG. J Biol Chem 274: 77847792 (1999). 17. Bigley R., Riddle M., Layman D., Stankova L.: Human cell dehydroascorbate reductase. Kinetic and functional properties. Biochim Biophys Acta 659: 15-22 (1981). 18. Bigley R.H., Stankova L.: Uptake and reduction of oxidized and reduced ascorbate by human leukocytes. J Exp Med 139:1084-1092 (1974). 19. Burton G.W., Wronska U., Stone L., Foster D.O., Ingold K.U.: Biokinetics of dietary RRR-alpha-tocopherol in the male guinea pig at three dietary levels of vitamin C and two levels of vitamin E. Evidence that vitamin C does not "spare" vitamin E in vivo. Lipids 25: 199-21 (1990). 20. Cabibbo A., Pagani M., Fabbri M., Rocchi M., Farmery M.R., Bulleid N.J., Sitia R.: ERO1-L, a human protein that favors disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 275: 4827-4833 (2000). 21. Chen J. Sopng J.L., Zhang S., Wang Z., Cui D.F. anf Wang C.C.: Chaperone activity of DsbC. J Biol Chem 274: 19601-19605 (1999). 22. Chivers P.T., Laboissiere M.C., Raines R.T.: The CXXC motif: imperatives for the formation of native disulfide bonds in the cell. EMBO J. 15: 2659-2667 (1996). 23. Choi JL, Rose RC: Regeneration of ascorbic acid by rat colon. Proc Soc Exp Biol Med 190: 369-374 (1989).

94

24. Chung J, Chen T. and Missiakas.: Transfer of electrons across the cytoplasmic membrane by DsbD, a membrane protein involved in thiol disulfide exchange and protein folding in the bacterial periplasm. Mol Microbiol 35: 1099-1109 (2000). 25. Collet J.F. and Bardwell J.C.: Oxidative protein folding in bacteria. Mol Microbiol 44: 1-8 (2002). 26. Collet J.F., Riemer J., Bader M. and Bardwell J.C.: Reconstitution of a disulfide isomerization system. J Biol Chem 277: 26886-26892 (2002). 27. Coppock D.L., Cina-Poppe D., Gilleran S.: The quiescin Q6 gene (QSCN6) is a fusion of two ancient gene families: thioredoxin and ERV1. Genomics 54: 460-468 (1998). 28. Couprie J., Vinci F., Dugave C., Quemeneur E. and Moutiez M: Investigation of the DsbA mechanism through the synthesis and analysis of an irreversible enzyme-ligand complex. Biochemistry 39: 6732-6742 (2000). 29. Crooke H. and Cole J.: The biogenesis of c-type cytochromes in Escherichia coli requires a membrane bound protein, DipZ with a protein disulphide isomerase-like domain. Mol Microbiol 15: 1139-1150 (1995). 30. Csala M., Mile V., Benedetti A., Mandl J., Bánhegyi G.: Ascorbate oxidation is a prerequisite for its transport into rat liver microsomal vesicles. Biochem J 349: 413-41 (2000 ). 31. Cuozzo J.W., Kaiser C.A.: Competition between glutathione and protein thiols for disulphide-bond formation. Nat Cell Biol 1: 130-135 (1999). 32. Dailey F.E. and Berg H.C.: Mutants in disulfide bond formation that disrupt flagellar assembly in Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 90: 1043-1047 (1993).

95

33. Darby N.J., Penka E., Vincentelli R.: The multi-domain structure of protein disulfide isomerase is essential for high catalytic efficiency. J Mol Biol 276: 239-247 (1998). 34. David L. Nelson, Michael M. Cox: Lehninger Principles of Biochemistry 3rd edition, Worth Publishers (2000). 1053-1054 35. Davie E.W., Fujikawa K.: Basic mechanisms in blood coagulation. Annu Rev Biochem 44: 799-829 (1975). 36. Del Bello B, Maellaro E, Sugherini L, Santucci A, Comporti M, Casini AF. Purification of NADPH-dependent dehydroascorbate reductase from rat liver and its identification with 3 alpha-hydroxysteroiddehydrogenase. Biochem J. 304: 385-390 (1994). 37. Endrizzi J.A., Breddam K., Remington S.J.: 2.8-A structure of yeast serine carboxypeptidase. Biochemistry 33: 11106-11120 (1994). 38. Farquhar R., Honey N., Murant S.J., Bossier P., Schultz L., Montgomery D., Ellis R.W., Freedman R.B., Tuite M.F.: Protein disulfide isomerase is essential for viability in Saccharomyces cerevisiae. Gene 108: 81-89 (1991). 39. Fassio A., Sitia R.: Formation, isomerisation and reduction of disulphide bonds during protein quality control in the endoplasmic reticulum. Histochem Cell Biol 117: 151-157 (2002). 40. Ferrari D.M. and Söling H.D.: The protein disulfide-isomerase family: unraveling a string of fplds. Biochem J 339: 1-10 (1999). 41. Ferrari D.M., Van Nguyen P., Kratzi H.D. and Söling H.D.: Eur J Biochem 255: 570579 (1998).

96

42. Fong S.T., Camakaris J and Lee B.T.: Molecular genetics of a chromosomal locus involved in copper tolerance in Escherichia coli K-12. Mol Microbiol 15: 1127-1137 (1995). 43. Foyer C.H. and Halliwell B: Presence of glutathione and glutathione reductase in chloroplasts: proposed a role in ascorbic acid metabolism. Planta 133: 21-25 (1976). 44. Francavilla A., Hagiya M., Porter K.A., Polimeno L., Ihara I., Starzl T.E.: Augmenter of liver regeneration: its place in the universe of hepatic growth factors. Hepatology 20: 747-757 (1994). 45. Frand A.R., Kaiser C.A.: Ero1p oxidizes protein disulfide isomerase in a pathway for disulfide bond formation in the endoplasmic reticulum. Mol Cell. 4: 469-477 (1999). 46. Frand A.R., Kaiser C.A.: The ERO1 gene of yeast is required for oxidation of protein dithiols in the endoplasmic reticulum. Mol Cell. 1: 161-170 (1998). 47. Freedman R.B., Hirst T.R. and Tuite M.F.: Protein disulfide isomerase: building bridges in protein folding. Trends Biochem Sci 19: 331-336 (1994). 48. Gerber J., Muhlenhoff U., Hofhaus G., Lill R., Lisowsky T.: Yeast ERV2p is the first microsomal FAD-linked sulfhydryl oxidase of the Erv1p/Alrp protein family. J Biol Chem 276: 23486-23491 (2001). 49. Gilbert H.F.: Molecular and cellular aspects of thiol disulfide exchange. Adv. Enzymol Relat Areas Mol Biol 63: 69-172 (1990). 50. Gilbert H.F.: Protein disulfide isomerase. Methods Enzymol 290: 26-50 (1998).

97

51. Gleason F.K., Lim C.J., Gerami-Nejad M., Fuchs J.A.: Characterization of Escherichia coli thioredoxins with altered active site residues. Biochemistry 29: 3701-3709 (1990). 52. Gliszczynska A, Koziolowa A. Chromatographic determination of flavin derivatives in baker’s yeast. J Chromatogr A 822: 59-66 (1998). 53. Gocmen C., Gokturk H.S., Ertug P.U., Onder S., Dikmen A., Baysal F.: Effect of neocuproine, a selective Cu(I) chelator, on nitrergic relaxations in the mouse corpus cavernosum. Eur J Pharmacol 406: 293-300 (2000). 54. Goldberger R.F., Epstein C.J. and Anfinsen C.B.: Acceleration of reactivation of reducedbovine pancreatic ribonuclease by a microsomal system from rat liver. J Biol Chem 238: 628-635 (1963). 55. Gordon D.A., Wetterau J.R. and Gregg R.E.: Microsomal triglyceride transfer protein: a protein complex required for the assembly of lipoprotein particles Trends Cell Biol 5:317-321 (1995). 56. Gordon E.H., Page M.D., Willis A.C. and Fergoson S.J.: Escherichia coli DipZ: anatomy of a transmembrane protein disulfide reductase in which three pairs of cysteine residues, one in each of three domans, contribute differentially to function. Mol Microbiol 35: 1360-1374 (2000). 57. Gross E., Sevier C.S., Vala A., Kaiser C.A., Fass D.: A new FAD-binding fold and intersubunit disulfide shuttle in the thiol oxidase Erv2p. Nat Struct Biol 9: 61-67 (2002). 58. Guddat L.W., Bardwell J.C. Zander T. and Martin J.L.: The uncharged surface features surrounding the active site of Escherichia coli DsbA are conserved and are implicated in peptide binding. Ptotein Sci 6: 1148-1156 (1997).

98

59. Guilhot C., Jander G., Martin N.L. and Beckwith J: Evidence that the pathway of disulfide bond formation in Escherichia coli involves reaction between the cysteines of DsbB and DsbA. Proc Natl Acad Sci USA 92: 9895-9899 (1995). 60. Günther R., Brauer C., Janetzky B., Forster H.H., Ehbrecht I.M., Lehle L., Kuntzel H.: The Saccharomyces cerevisiae TRG1 gene is essential for growth and encodes a lumenal endoplasmic reticulum glycoprotein involved in the maturation of vacuolar carboxypeptidase. J Biol Chem 266:24557-24563 (1991). 61. Gunther R., Srinivasan M., Haugejorden S., Green M., Ehbrecht I.M., Kuntzel H.: Functional replacement of the Saccharomyces cerevisiae Trg1/Pdi1 protein by members of the mammalian protein disulfide isomerase family. J Biol Chem 268: 7728-7732 (1993). 62. Hagiya M., Francavilla A., Polimeno L., Ihara I., Sakai H., Seki T., Shimonishi M., Porter K.A., Starzl T.E.: Cloning and sequence analysis of the rat augmenter of liver regeneration (ALR) gene: expression of biologically active recombinantALR and demonstration of tissue distribution. Proc Natl Acad Sci USA 91: 8142-8146 (1994). 63. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C.: Ascorbic acid pp. 200-208. in Free Radicals in Biology and Medicine 3rd edition ed. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C Oxford University Press (1999). 64. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C.: Oxydation, carboxylation and hydroxilation pp. 435., 436. in Free Radicals in Biology and Medicine 3rd edition ed. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C Oxford University Press (1999).

99

65. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C.: Vitamin E pp. 208-220. in Free Radicals in Biology and Medicine 3rd edition ed. Halliwell B. and Gutteridge J.M.C Oxford University Press (1999). 66. Hawkins H.C., Blackburn E.C., Freedman R.B.: Comparison of the activities of protein disulphide-isomerase and thioredoxin in catalysing disulphide isomerization in a protein substrate. Biochem J 275: 349-353 (1991). 67. Hofhaus G., Stein G., Polimeno L., Francavilla A., Lisowsky T.: Highly divergent amino termini of the homologous human ALR and yeast scERV1 gene products define species specific differences in cellular localization. Eur J Cell Biol 78: 349-356 (1999). 68. Holst B., Tachibana C., Winther J.R.: Active site mutations in yeast protein disulfide isomerase cause dithiothreitol sensitivity and a reduced rate of protein folding in the endoplasmic reticulum. J Cell Biol 138: 1229-1238 (1997). 69. Horemans N., Foyer C.H., Asard H.: Transport and action of ascorbate at the plant plasma membrane. Trends Plant Sci. 5: 263-267 (2000). 70. Huber-Wunderlich M., Glockshuber R.: A single dipeptide sequence modulates the redox properties of a whole enzyme family. Fold Des 3:161-171 (1998). 71. Hwang C., Sinskey A.J. and Lodish H.F.: Oxidized redox state of gluthatione in the endoplasmic reticulum. Science 257: 1496-1502 (1992). 72. Imaizumi K., Miyoshi K., Katayama T., Yoneda T., Taniguchi M., Kudo T., Tohyama M.: The unfolded protein response and Alzheimer’s disease. Biochim Biophys Acta 1536: 85-96 (2001).

100

73. Inaba K. and Ito K.: Paradoxical redox properties of DsbB and DsbA in the protein disulfide-introducing reaction cascade. EMBO J 21: 2646-2654 (2002). 74. Jain A., Martensson J., Stole E., Auld P.A., Meister A.: Glutathione deficiency leads to mitochondrial damage in brain. Proc Natl Acad Sci USA 88: 1913-1917 (1991). 75. Jakob U., Muse W., Eser M. and Bardwell J.C.: Chaperone activity with a redox switch. Cell 96: 341-352 (1999). 76. Jamsa E., Simonen M., Makarow M.: Selective retention of secretory proteins in the yeast endoplasmic reticulum by treatment of cells with a reducing agent. Yeast 10: 355370 (1994). 77. Johan L., van Haarlem M., Soute B.A., Vermeer C.: Vitamin K-dependent carboxylase. Possible role for thioredoxin in the reduction of vitamin K metabolites in liver. FEBS Lett 222: 353-357 (1987). 78. Kadokura H, Bader M., Tian H., Bardwell J.C.and Bardwell J.: Roles of a conserved arginine residue of DsbB in linking protein disulfide bond-formation pathway to the respiratory chain of Escherichia coli. Proc Natl Acad Sci USA 97: 10884-10889 (2000). 79. Kadokura H. and Beckwith J.: Four cisteines of the membrane protein DsbB act in concert to oxidize its substrate DsbA. EMBO J 21: 2354-2363 (2002). 80. Kamitani S., Akiyama Y. and Ito K.: Identification and characterization of an Escherichia coli gene required for the formation of correctly folded alkaline phosphatase, a periplasmic enzyme. EMBO J 11: 57-62 (1992). 81. Katayama K., Ericsson L.H., Enfield D.L., Walsh K.A., Neurath H., Davie E.W., Titani K.: Comparison of amino acid sequence of bovine coagulation Factor IX (Christmas

101

Factor) with that of other vitamin K-dependent plasma proteins. Proc Natl Acad Sci USA 76: 4990-4994 (1979). 82. Katzen F. and Beckwith J.: Transmembrane electron transfer by the membrane protein DsbD occurs via a disulfide bond cascade. Cell 103: 769-779 (2000). 83. Kemmink J., Darby N.J., Dijkstra K., Nilges M., Creighton T.E.: The folding catalyst protein disulfide isomerase is constructed of active and inactive thioredoxin modules. Curr Biol 7: 239-245 (1997). 84. Kim Y.R., Yu S.W., Lee S.R., Hwang Y.Y., Kang S.O.: A heme-containing ascorbate oxidase from Pleurotus ostreatus. J Biol Chem 271: 3105-3111 (1996). 85. Kishigami S. and Ito K.: Roles of cysteine residues of DsbB in its activity to reoxidize DsbA, the protein disulfide catalyst of Escherichia coli. Genes Cells 1: 201-208. (1996). 86. Kishigami S., Kanaya E., Kikuchi M. and Ito K.: DsbA-DsbB interaction through their active site cysteines. J Biol Chem 270: 17072-17074 (1995). 87. Kispál G., Csere P., Prohl C., Lill R.: The mitochondrial proteins Atm1p and Nfs1p are essential for biogenesis of cytosolic Fe/S proteins. EMBO J. 18: 3981-3989 (1999). 88. Kivirikko K.I,. Myllyla R., Pihlajaniemi T.: Protein hydroxylation: prolyl 4hydroxylase, an enzyme with four cosubstrates and a multifunctional subunit. FASEB J. 3:1609-1617 (1989). 89. Kobayashi T. and Ito K.: Respiratory chain strongly oxidizes the CXXC motif of DsbB in the Escherichia coli disulfide bond formation pathway. EMBO J 18: 1192-1198 (1999).

102

90. Kobayashi T., Kishigami S., Sone M., Inokuchi H., Mogi T. and Ito K.: Respiratory chain is required to maintain oxidized states of the DsbA-DsbB disulfide bond formation system in aerobically growing Escherichia coli cells. Proc Natl Acad Sci USA 94: 11857-11862 (1997). 91. Kobayashi T., Takahashi Z. and Ito K.: Identification of a segment of DsbB essential for its respiration- coupled oxidation. Mol Microbiol 39: 158-165 (2001). 92. Koivu J., Myllyla R., Helaakoski T., Pihlajaniemi T., Tasanen K., Kivirikko K.I.: A single polypeptide acts both as the beta subunit of prolyl 4-hydroxylase and as a protein disulfide-isomerase. J Biol Chem 262: 6447-6449 (1987). 93. Kortemme T., Darby N.J., Creighton T.E.: Electrostatic interactions in the active site of the N-terminal thioredoxin-like domain of protein disulfide isomerase. Biochemistry. 35: 14503-14511 (1996). 94. Krupp R., Chen C. and Missiakas D.: DsbD-catalyzed transport of electrons across the membrane of Escherichia coli. J Biol Chem 276: 3696-3701 (2001). 95. LaMantia M., Miura T., Tachikawa H., Kaplan H.A., Lennarz W.J., Mizunaga T.: Glycosylation site binding protein and protein disulfide isomerase are identical and essential for cell viability in yeast. Proc Natl Acad Sci USA 88: 4453-4457 (1991). 96. Lee J., Hofhaus G., Lisowsky T.: Erv1p from Saccharomyces cerevisiae is a FADlinked sulfhydryl oxidase. FEBS Lett 477: 62-66 (2000). 97. Lightowlers R.N., Lill R.: High-level mitochondriology at high altitude. Workshop on mitochondrial (dys-)function. EMBO Rep 2: 1074-1077 (2001).

103

98. Lisowsky T.: Dual function of a new nuclear gene for oxidative phosphorylation and vegetative growth in yeast. Mol Gen Genet 232: 58-64 (1992). 99. Liu X. and Wang C.: Disulfide-dependent folding and export of Escherichia coli DsbC. J Biol Chem 276:1146-1151 (2001). 100.

Lovstad R.A.: Interaction of neocuproine, 1,10-phenanthroline and 2,2’-dipyridyl

with human ceruloplasmin. Int J Biochem 20: 117-119 (1988). 101.

Lyles M.M., Gilbert H.F.: Catalysis of the oxidative folding of ribonuclease A by

protein disulfide isomerase: dependence of the rate on the composition of theredox buffer. Biochemistry 30: 613-619 (1991). 102.

Martensson J., Jain A., Stole E., Frayer W., Auld P.A., Meister A.: Inhibition of

glutathione synthesis in the newborn rat: a model for endogenously produced oxidative stress. Proc Natl Acad Sci USA 88: 9360-9364 (1991). 103.

Martensson J., Meister A., Mrtensson J.: Glutathione deficiency decreases tissue

ascorbate levels in newborn rats: ascorbate spares glutathione and protects. Proc Natl Acad Sci USA 88: 4656-4660 (1991). 104.

Martensson J., Steinherz R., Jain A., Meister A.: Glutathione ester prevents

buthionine sulfoximine-induced cataracts and lens epithelial cell damage. Proc Natl Acad Sci USA 86: 8727-8731 (1989). 105.

Martin J.L., Bardwell J.C. and Kuriyan J.: Crystal structure of the DsbA protein

required for disulfide bond formatiom in vivo. Nature 365: 464-468 (1993).

104

106.

May J.M., Mendiratta S., Hill K.E., Burk R.F.: Reduction of dehydroascorbate to

ascorbate by the selenoenzyme thioredoxin reductase. J Biol Chem 272: 22607-22610 (1997). 107.

May J.M., Qu Z.C., Morrow J.D.: Interaction of ascorbate and alpha-tocopherol in

resealed human erythrocyte ghosts. Transmembrane electron transfer and protectionfrom lipid peroxidation. J Biol Chem 271: 10577-10582 (1996). 108.

McCarthyA.A. Haebel P.W., Torronen A., Rybin V., Baker E.N. andMetcalf P.:

Crystal strucrure of the protein disulfide bond isomerase, DsbC from Escherichia coli. Nat Struct Biol 7: 196-199 (2000). 109.

Metheringham R., Griffiths L., Crooke H., Forsythe S and Cole J: An essential role

for DsbA in cytochrome c synthesis and formate- dependent nitrite reduction by Escherichia coli K-12. Arch Microbiol 164: 301-307 (1995). 110.

Mezghrani A., Fassio A., Benham A., Simmen T., Braakman I., Sitia R.:

Manipulation of oxidative protein folding and PDI redox state in mammalian cells. EMBO J 20: 6288-6296 (2001). 111.

Mieyal J.J., Starke D.W., Gravina S.A., Dothey C., Chung J.S.: Thioltransferase in

human red blood cells: purification and properties. Biochemistry 30: 6088-6097 (1991). 112.

Missiakas D., Georgopoulos C. and Raina S: Identification and characterization of

the Escherichia coli gene dsbB, whose product is involved in the formation of disulfide bonds in vivo. Proc Natl Acad Sci USA 90: 7084-7088 (1993). 113.

Missiakas D., Georgopoulos C. and Raina S: The Escherichia coli dsbC (xprA9

gene encodes a periplasmic protein involved in disulfide bond formation. EMBO J 13: 2013-2020 (1994).

105

114.

Missiakas D., Schwager F. and Raina S: Identification and characterization of a new

disulfide isomerase-like protein (DsbD) in Escherichia coli. EMBO J 14: 3415-3424 (1995). 115.

Munro S., Pelham H.R.: A C-terminal signal prevents secretion of luminal ER

proteins. Cell 48: 899-907 (1987). 116.

Nardai G., Braun L., Csala M., Mile V., Csermely P., Benedetti A., Mandl J.,

Banhegyi G.: Protein-disulfide isomerase- and protein thiol-dependent dehydroascorbate reduction and ascorbate accumulation in the lumen of the endoplasmic reticulum. J Biol Chem 276: 8825-8828 (2001). 117.

Norgaard P., Westphal V., Tachibana C., Alsoe L., Holst B., Winther J.R.:

Functional differences in yeast protein disulfide isomerases. J Cell Biol 152: 553-562 (2001). 118.

Pagani M., Fabbri M., Benedetti C., Fassio A., Pilati S., Bulleid N.J., Cabibbo A.,

Sitia R.: Endoplasmic reticulum oxidoreductin 1-lbeta (ERO1-Lbeta), a human gene induced in the course of the unfolded protein response. J Biol Chem 275: 23685-23692 (2000). 119.

Pagani M., Pilati S., Bertoli G., Valsasina B., Sitia R.: The C-terminal domain of

yeast Ero1p mediates membrane localization and is essential for function. FEBS Lett 508: 117-120 (2001). 120.

Patil C., Walter P.: Intracellular signaling from the endoplasmic reticulum to the

nucleus: the unfolded protein response in yeast and mammals. Curr Opin Cell Biol 13: 349-355 (2001).

106

121.

Pinchuk I., Gal S., Lichtenberg D.: The dose-dependent effect of copper-chelating

agents on the kinetics of peroxidation of low-density lipoprotein (LDL). Free Radic Res 34: 349-362 (2001). 122.

Pirneskoski A., Ruddock L.W., Klappa P., Freedman R.B., Kivirikko K.I. and

Koivunen P.: Domains b’ and a’ of protein disulfide isomerase fulfill the minimum requirement for function as a subunit of prolyl 4-hydroxylase. J Biol Chem 276: 1128711293 (2001). 123.

Pollard M.G., Travers K.J., Weissman J.S.: Ero1p: a novel and ubiquitous protein

with an essential role in oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Mol Cell 1: 171-182 (1998). 124.

Poon W.W., Do T.Q., Marbois B.N., Clarke C.F.: Sensitivity to treatment with

polyunsaturated fatty acids is a general characteristic of the ubiquinone-deficient yeast coq mutants. Mol Aspects Med 18 Suppl: 121-127 (1997). 125.

Puskas F., Braun L., Csala M., Kardon T., Marcolongo P., Benedetti A., Mandl J.,

Banhegyi G.: Gulonolactone oxidase activity-dependent intravesicular glutathione oxidation in rat liver microsomes. FEBS Lett. 430: 293-296 (1998). 126.

Raina S and Missiakas D: Making and breaking disulfide bonds. Annu Rev

Microbiol 51: 179-202 (1997). 127.

Regeimbal J. and Bardwell J.C.A.: Disulfide bond formation in prokaryotes and

eukaryotes. In Protein Targeting, Transport and Translocation (ed. ) pp. 131-150. Elsevier Science Ltd. (2002). 128.

Regembial J. and Bardwell J.C.: DsbB catalyzes disulfide bond formation de novo.

J Biol Chem 277: 32706-32713 (2002).

107

129.

Ritz D. and Beckwith J.: Roles of thiol-redox pathways in bacteria. Annu Rev

Microbiol 55: 21-48 (2001). 130.

Ronden J.E., Soute B.A., Thijssen H.H., Saupe J., Vermeer C.: Natural

prenylquinones inhibit the enzymes of the vitamin K cycle in vitro. Biochim Biophys Acta 1298: 87-94 (1996). 131.

Scherens B., Dubois E., Messenguy F.: Determination of the sequence of the yeast

YCL313 gene localized on chromosome III. Homology with the protein disulfide isomerase (PDI gene product) of other organisms. Yeast 7: 185-193 (1991). 132.

Schurgers L.J., Vermeer C.: Differential lipoprotein transport pathways of K-

vitamins in healthy subjects. Biochim Biophys Acta 1570: 27-32 (2002). 133.

Senkevich T.G., Koonin E.V., Bugert J.J., Darai G. and Moss B.: The Genome of

Molluscum Contagiosum Virus: Analysis and Comparison with Other Poxviruses. Virology 233: 19-42 (1997). 134.

Senkevich T.G., White C.L., Koonin E.V., Moss B.: A viral member of the

ERV1/ALR protein family participates in a cytoplasmic pathway of disulfide bond formation. Proc Natl Acad Sci USA 97: 12068-12073 (2000). 135.

Senkevich T.G., White C.L., Koonin E.V., Moss B.: Complete pathway for protein

disulfide bond formation encoded by poxviruses. Proc Natl Acad Sci USA 99: 66676672 (2002). 136.

Sevier C.S., Cuozzo J.W., Vala A., Aslund F., Kaiser C.A.: A flavoprotein oxidase

defines a new endoplasmic reticulum pathway for biosynthetic disulphide bond formation. Nat Cell Biol 3: 874-882 (2001).

108

137.

Sevier C.S., Kaiser C.A.: Formation and transfer of disulphide bonds in living cells.

Nat Rev Mol Cell Biol 3: 836-847 (2002). 138.

Shao F., Bader M., Jakob U. and Bardwell J.C.: DsbG, a protein disulfide isomerase

with chaperone activity. J Biol Chem 275: 13349-13352 (2000). 139.

Silverman R.B., Nandi D.L.: Reduced thioredoxin: a possible physiological cofactor

for vitamin K epoxide reductase. Further support for an active site disulfide. Biochem Biophys Res Commun 155: 1248-1254 (1988). 140.

Soute B.A., Groenen-van Dooren M.M., Holmgren A., Lundstrom J., Vermeer C.:

Stimulation of the dithiol-dependent reductases in the vitamin K cycle by the thioredoxin system. Strong synergistic effects with protein disulphide-isomerase. Biochem J 281: 255-259 (1992). 141.

Stafford S.J., Humphreys D.P. and Lund P.A.: Mutations in dsbA and dsbB, but not

dsbC, lead to an enhanced sensitivity of Escherichia coli to Hg2+and Cd2+. FEMS Microbiol Lett 174: 179-184 (1999). 142.

Stein G., Lisowsky T.: Functional comparison of the yeast scERV1 and scERV2

genes. Yeast 14: 171-180 (1998). 143.

Stenflo J., Fernlund P., Egan W., Roepstorff P.: Vitamin K dependent modifications

of glutamic acid residues in prothrombin. Proc Natl Acad Sci USA 71: 2730-2733 (1974). 144.

Stewart E.J., Katzen F. and Beckwith J.: Six conserved cysteines of the membrane

protein DsbD are required for the transfer of electrons from the cytoplasm to the periplasm of Escherichia coli. EMBO J 18: 5963-5971 (1999).

109

145.

Sun X.X. and Wang C.C.: The N-terminal sequence (residue 1-65) is essential for

dimerization, activities and peptid binding of Escherichia coli DsbC. J biol Chem 275: 22743-22749 (2000). 146.

Tachibana C., Stevens T.H.: The yeast EUG1 gene encodes an endoplasmic

reticulum protein that is functionally related to protein disulfide isomerase. Mol Cell Biol 12: 4601-4611 (1992). 147.

Tachikawa H., Funahashi W., Takeuchi Y., Nakanishi H., Nishihara R., Katoh S.,

Gao X.D., Mizunaga T., Fujimoto D.: Overproduction of Mpd2p suppresses the lethality of protein disulfide isomerase depletion in a CXXC sequence dependent manner. Biochem Biophys Res Commun 239: 710-714 (1997). 148.

Tachikawa H., Takeuchi Y., Funahashi W., Miura T., Gao X.D., Fujimoto D.,

Mizunaga T., Onodera K.: Isolation and characterization of a yeast gene, MPD1, the overexpression of which suppresses inviability caused by protein disulfide isomerase depletion. FEBS Lett 369: 212-216 (1995). 149.

Tortorella D., Story C.M., Huppa J.B., Wiertz E.J., Jones T.R., Bacik I., Bennink

J.R., Yewdell J.W., Ploegh H.L.: Dislocation of type I membrane proteins from the ER to the cytosol is sensitive to changes in redox potential. J Cell Biol 142: 365-376 (1998). 150.

Tu B.P., Ho-Schleyer S.C., Travers K.J., Weissman J.S.: Biochemical basis of

oxidative protein folding in the endoplasmic reticulum. Science 290: 1571-1574 (2000). 151.

Van der Zee J., Van den Broek P.J.: Determination of the ascorbate free radical

concentration in mixtures of ascorbate and dehydroascorbate. Free Radic Biol Med 25: 282-286 (1998).

110

152.

Venetianer P and Straub B: Studies on the mechanism of action ribonuclease-

reactivating enzyme. Acta Physiol Acad Sci Hung 27: 303-315 (1965). 153.

Venetianer P and Straub B: The mechanism of action of the ribonuclease-

reactivating enzyme. Biochim Biophys Acta 89: 189-190 (1964). 154.

Vermeer C.: Gamma-carboxyglutamate-containing proteins and the vitamin K-

dependent carboxylase. Biochem J 266: 625-636 (1990). 155.

Vervoort L.M., Ronden J.E., Thijssen H.H.: The potent antioxidant activity of the

vitamin K cycle in microsomal lipid peroxidation. Biochem Pharmacol 54: 871-876 (1996). 156.

Vethanayagam JG, Green EH, Rose RC, Bode AM. Glutathione-dependent

ascorbate recycling activity of rat serum albumin. Free Radic Biol Med. 11-12: 15911598 (1999). 157.

Vuorela A., Myllyharju J., Nissi R., Pihlajaniemi T and Kivirikko K.I.: Assemby of

human prolyl 4-hydroxylase and type III collagen in the yeast Pichia pastoris formation of a stable enzyme tetramer requires coexpression with collagen and assembly of a stable collagen requires coexpression with prolyl 4 –hydroxylase. EMBO J 16: 67026712 (1997). 158.

Vuori K., Pihlajaniemi T., Myllyla R., Kivirikko K.I.: Site-directed mutagenesis of

human protein disulphide isomerase: effect on the assembly, activity and endoplasmic reticulum retention of human prolyl 4-hydroxylase in Spodoptera frugiperda insect cells. EMBO J 11: 4213-4217 (1992).

111

159.

Walker K.W., Gilbert H.F.: Scanning and escape during protein-disulfide

isomerase-assisted protein folding. J Biol Chem 272:8845-8848 (1997). 160.

Walker K.W., Lyles M.M., Gilbert H.F.: Catalysis of oxidative protein folding by

mutants of protein disulfide isomerase with a single active-site cysteine. Biochemistry 35: 1972-1980 (1996). 161.

Wang L., Fast D.G. and Attie A.D.: The enzymatic and non-enzymatic roles of

protein disulfide isomerase in apolipoprotein B secretion. J Biol Chem 272: 2764427651 (1997). 162.

Wanke M., Dallner G., Swiezewska E.: Subcellular localization of plastoquinone

and ubiquinone synthesis in spinach cells. Biochim Biophys Acta 1463: 188-194 (2000). 163.

Wells W.W., Xu D.P., Yang Y.F., Rocque P.A.: Mammalian thioltransferase

(glutaredoxin) and protein disulfide isomerase have dehydroascorbate reductase activity. J Biol Chem 265: 15361-15364 (1990). 164.

Wells W.W., Xu D.P.: Dehydroascorbate reduction. J Bioenerg Biomembr 26: 369-

377 (1994). 165.

Wells W.W., Yang Y., Deits T.L., Gan Z.R.: Thioltransferases. Adv Enzymol Relat

Areas Mol Biol 66: 149-201 (1993). 166.

Wetterau J.R. and Zilversmit D.B.: J Biol Chem 259: A triglyceride and cholesteryl

ester transfer protein associated with liver microsomes. 10863-10866 (1984). 167.

Wetterau J.R., Combs K.A., McLean L.R., Spinner S.N. and Aggerbeck L.P.:

Protein disulfide isomerase appears necessary to maintain the catalytically active

112

structure of the microsomal triglyceride transfer protein. Biochemistry 30: 9728-9735. (1991). 168.

Wilkinson S.R., Obado S.O., Mauricio I.L., Kelly J.M.: Trypanosoma cruzi

expresses a plant-like ascorbate-dependent hemoperoxidase localized to the endoplasmic reticulum. Proc Natl Acad Sci USA 99: 13453-13458 (2002). 169.

Yamasaki H., Sakihama Y., Ikehara N.: Flavonoid-Peroxidase Reaction as a

Detoxification Mechanism of Plant Cells against H2O2. Plant Physiol 115: 1405-1412 (1997). 170.

Yánez R.J., Rodríguez J.M., Nogal M.L., Yuste L., Enríquez C., Rodriguez J.F. and

Vinuela E.: Analysis of the Complete Nucleotide Sequence of African Swine Fever Virus. Virology 208: 249-278 (1995). 171.

Zapun A, Missiakas D., Raina S and Creighton C.E.: Structural and functional

characteization of DsbC, a protein involved in disulfide bond formation in Escherichia coli. Biochemistry 34: 5075-5089 (1995). 172.

Zapun A., Bardwell J.C. and Creighton T.E.: The reavtive and destabilizing

disulfide bond of DsbA, a protein required for protein disulfide bond formation in vivo. Biochemistry 32: 5083-5092 (1993). 173.

Zapun A., Creighton T.E., Rowling P.J., Freedman R.B.: Folding in vitro of bovine

pancreatic trypsin inhibitor in the presence of proteins of the endoplasmic reticulum. Proteins 14: 10-15 (1992).

113

Antioxidánsok szerepe a fehérje diszulfid kötések kialakulásában

Recommend Documents