Analýza zázvorového extraktu II

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ KATEDRA FARMACEUTICKÉ BOTANIKY A EKOLOGIE ___________________________________________________________________

DIPLOMOVÁ PRÁCE

Analýza zázvorového extraktu II.

Vedoucí diplomové práce: Prof. RNDr. Luděk Jahodář, CSc. Hradec Králové, květen 2010

Kateřina Zárubová

Prohlašuji, že jsem svou diplomovou práci vypracovala samostatně. Veškerá literatura a podkladové materiály, z nichž jsem při zpracování čerpala, jsou uvedeny v seznamu použité literatury a v práci řádně citovány.

V Hradci Králové 15. května 2010

Kateřina Zárubová

Tento výstup vznikl v rámci projektu Specifického vysokoškolského výzkumu 2010-261-002.

Ráda bych na tomto místě poděkovala vedoucímu diplomové práce Prof. RNDr. Luďku Jahodářovi, CSc. za odborné vedení, cenné rady a trpělivost při vypracování diplomové práce.

OBSAH 1

ÚVOD ........................................................................................................................................................... 6

2

CÍL PRÁCE ................................................................................................................................................. 8

3

TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................................................ 9 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.3 3.3.1 3.3.2 3.3.3 3.3.4 3.3.5 3.3.6 3.4 3.5 3.5.1 3.5.2 3.6 3.6.1

4

ŘÁD ZINGIBERALES (ZÁZVORNÍKOTVARÉ)............................................................................. 9 ČELEĎ ZINGIBERACEAE (Zázvorníkovité)................................................................................. 9 CURCUMA LONGA (Kurkuma dlouhá)...................................................................................... 10 ELETTARIA CARDAMOMUM (Kardamom pravý) .................................................................... 11 ALPINIA OFFICINARUM (Galgán lékařský) ............................................................................. 11 KAEMPFERIA GALANGA (Maraba galgánová) ........................................................................ 12 ZINGIBER OFFICINALE................................................................................................................. 13 HISTORIE ZÁZVORNÍKU ........................................................................................................... 13 BOTANICKÝ POPIS .................................................................................................................... 15 DRUHY ZÁZVORNÍKŮ ............................................................................................................... 16 ROSTLINNÁ DROGA...................................................................................................................... 17 Vlastnosti drogy ........................................................................................................................... 17 Geografické rozložení .................................................................................................................. 18 Zkoušky totožnosti ........................................................................................................................ 18 Zkoušky na čistotu........................................................................................................................ 19 Stanovení obsahu ......................................................................................................................... 19 Lékové formy................................................................................................................................ 20 OBSAHOVÉ LÁTKY ....................................................................................................................... 20 FARMAKOLOGIE............................................................................................................................ 23 TRADIČNÍ UŽITÍ ZÁZVORU ...................................................................................................... 23 EXPERIMENTÁLNÍ A KLINICKÁ FARMAKOLOGIE ............................................................... 23 LÉČIVÉ PŘÍPRAVKY, DOPLŇKY STRAVY ................................................................................ 32 KLOSTERFRAU MELISANA....................................................................................................... 33

EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST .................................................................................................................... 35 4.1 CHEMIKÁLIE A POMŮCKY .......................................................................................................... 35 4.1.1 CHEMIKÁLIE.............................................................................................................................. 35 4.1.2 ANALYZOVANÝ VZOREK........................................................................................................... 35 4.1.3 VODNÝ EXTRAKT ZÁZVORNÍKU.............................................................................................. 35 4.1.4 ČERSTVÝ MATERIÁL ................................................................................................................. 36 4.1.5 PŘÍSTROJE.................................................................................................................................. 36 4.1.6 CHROMATOGRAFICKÝ MATERIÁL ......................................................................................... 36 4.1.7 SESTAVA PRO HPLC.................................................................................................................. 36 4.2 PRAKTICKÉ PROVEDENÍ.............................................................................................................. 37 4.2.1 POKUS Č. 1 ................................................................................................................................. 38 4.2.2 POKUS Č. 2 ................................................................................................................................. 39 4.2.3 POKUS Č. 3 ................................................................................................................................. 40 4.2.4 POKUS Č. 4 ................................................................................................................................. 41 4.2.5 POKUS Č. 5 ................................................................................................................................. 42 4.2.6 POKUS Č. 6 ................................................................................................................................. 43 4.2.7 POKUS Č. 7 ................................................................................................................................. 45 4.2.8 POKUS Č. 8 ................................................................................................................................. 46 4.2.9 POKUS Č. 9 ................................................................................................................................. 48 4.2.10 POKUS Č. 10 ............................................................................................................................... 49 4.2.11 POKUS Č. 11 ............................................................................................................................... 51 4.2.12 POKUS Č. 12 ............................................................................................................................... 52 4.2.13 POKUS Č. 13 ............................................................................................................................... 54 4.2.14 POKUS Č. 14 ............................................................................................................................... 54 4.2.15 POKUS Č. 15 ............................................................................................................................... 55 4.2.16 POKUS Č. 16 ............................................................................................................................... 57

5

VÝSLEDKY............................................................................................................................................... 58

4

6

DISKUZE ................................................................................................................................................... 60 6.1 6.2 6.3 6.4

ANALYZOVANÝ VZOREK............................................................................................................ 60 TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE ........................................................................................ 60 KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) A UV / VIS SPEKTROSKOPIE......................... 62 ČERSTVÁ DROGA .......................................................................................................................... 66

7

ZÁVĚR ....................................................................................................................................................... 67

8

LITERATURA .......................................................................................................................................... 68

9

PŘÍLOHY .................................................................................................................................................. 71

ABSTRAKT......................................................................................................................................................... 77 ABSTRACT......................................................................................................................................................... 78

5

1 ÚVOD Přírodní léčba provází člověka od nepaměti. Již v dobách před naším letopočtem, začínal člověk objevovat a užívat „léčiva“, které mu nabízela příroda. Paracelsus říká, že každou nemoc lze léčit látkami z rostlin. Byly položeny základy léčitelství, které se vyvíjely v závislosti na poznatcích nejen o přírodě a přírodním bohatství, ale také na poznatcích o fungování lidského těla a nemocech, které jej mohou postihnout. Vyvíjely se různé druhy medicín, různé léčebné techniky a filozofie, které pak vyústily do vzniku tradičních medicín, z nichž některé existují dodnes. V dnešní době se střetáváme s přítomností dvou rozdílných přístupů. Moderní medicína, která je medicínou západních zemí a je charakterizována užíváním „chemických léčiv“, a tradiční medicíny, které k léčbě používají rozličné způsoby léčby, ať už se jedná o terapii rostlinnými drogami, práci s energií a dalšími. I když medicínu západních zemí řadíme jako protiklad k tradičním medicínám, je nutné přiznat, že i moderní léčiva pocházejí větší či menší měrou z přírodních předloh. Buď se užívají sloučeniny, které jsou izolované z rostlin, případně se jedná o jejich modifikace. Proto můžeme říct, že přírodní zdroje jsou velkým rezervoárem sloučenin a potenciálně účinných látek. Řada výzkumů směřuje právě tímto směrem. Existuje celá řada rostlin, které nejsou prozkoumány. Je známo velmi málo o jejich složení a účincích. V dnešní době je realizováno mnoho studií, které vedou k odhalení případných farmakologicky účinných sloučenin. Výzkum se soustředí nejen na odhalení nových látek z přírodních zdrojů, ale také na modifikaci již objevených účinných látek. Studium přírodních zdrojů je velmi významné a důležité, vede k rozšíření palety již dnes známých látek. Skutečnost, že neznáme ještě některé účinné látky, nebo že jejich účinek není dosud experimentálně zdůvodněn, vede k podceňování léčivých rostlin, a to často i druhů velmi významných. Je otázkou času a náhody, kdy budou tyto látky objeveny, analyzovány a případně přiřazeny k seznamu léčiv běžné moderní terapie.

Jednou z velmi významných rostlin je právě Zingiber officinale. Jeho užívání sahá daleko do minulosti, do doby před naším letopočtem. Už v této době byl známý jeho léčivý efekt. Zázvorník se začal používat k mírnění nauzey zvracení při kinetózách a často byl také využíván pro své blahodárné účinky na podporu trávení. Proto se hojně užíval jako koření. Postupem času byl několikrát zapomenut a znovuobjeven. Dnes probíhá a již bylo 6

realizováno mnoho výzkumů, které byly zaměřené na identifikaci jeho obsahových látek a jeho účinků. Zázvorník prokazuje velké spektrum léčebných účinků. Vykazuje významnou antioxidační a antitumorózní aktivitu, pro kterou může být v budoucnosti hojně terapeuticky využíván. Je nutné také zmínit jeho význačný vliv na kardiovaskulární systém. Existuje velké množství klinických i preklinických studií, které byly realizovány a posuzovaly účinnost zázvorníku. Zázvorník se postupně stává velmi cennou drogou, která bude jistě v budoucnu využita.

7

2 CÍL PRÁCE Cílem této práce je potvrdit, že analyzovaný vzorek obsahuje gingeroly, a dokázat, že obsahuje deklarované množství gingerolů tak, jak je uvedeno v analytickém protokolu, který je uveden v příloze (Obr. 21: Analytický protokol). Budou hledány takové chromatografické podmínky a vhodná analytická metoda, která umožní analyzovat obsahové látky typu gingerolů ve vzorku jako celek. V budoucnu bude extrakt použit k preklinickým případně i klinickým studiím, proto je nutné jej reanalyzovat a zjistit přesné množství obsahových látek. Po provedení analýzy bude potom možné pracovat s extraktem, který bude mít přesné deklarované složení. To bude přispívat k možnosti případného srovnání účinků tohoto extaktu s placebem či jinou terapií.

8

3 TEORETICKÁ ČÁST 3.1 ŘÁD ZINGIBERALES (ZÁZVORNÍKOTVARÉ) Tento řád zahrnuje byliny rozmanitého vzrůstu, vzácně druhotné dřeviny s trachejemi zpravidla jen v kořenech. Stonek je většinou zkrácený. Často jsou vyvinuté dlouhé zdánlivé stonky, které jsou tvořené nahloučenými a objímavými listovými pochvami. Listy dosahují mnohdy značných rozměrů, jsou eliptičné až podlouhlé, se silnou střední žilkou. Květy většinou oboupohlavné, spíše velké, cyklické, homochlamydní nebo heterochlamydní, trojčetné, zygomorfní až asymetrické, entomogamní. Bývají sdružené v květenství. V květech se nachází 3 + 3 tyčinky nebo pouze jediná tyčinka. Synkarpní nebo parakarpní gyneceum je složené ze tří plodolistů, spodní semeník obsahuje velký nebo malý počet vajíček o dvou integumentech. Plodem je tobolka nebo plod bobulovitého typu [1]. Řád Zingiberales je dosti početným řádem, obsahuje 8 čeledí [1] – Cannaceae (Dosnovité),

Costaceae,

Heliconiaceae

(Helikoniovité),

Lowiaceae,

Marantaceae

(Marantovité), Musaceae (Banánovníkovité), Strelitziaceae (Strelíciovité) a Zingiberaceae (Zázvorníkovité) [2].

3.1.1 ČELEĎ ZINGIBERACEAE (Zázvorníkovité) Říše Planta (rostliny) Oddělení Magnoliophyta (rostliny krytosemenné) Třída Liliopsida (rostliny jednoděložné) Řád Zingiberales (zázvorníkotvaré) Čeleď Zingiberaceae (zázvorníkovité) [1]

Do této čeledi patří vytrvalé byliny s oddenkem nebo hlízovitými kořeny. Stonky jsou krátké nebo zcela chybí. Listy jsou kopinaté, řapíkaté, dvouřadě sestavené s pochvami a s jazýčkem. Květy jsou převážně oboupohlavné a heterochlamydní (obaly vytvářejí naspodu trubku), trojčetné a zygomorfní až asymetrické. Tvoří buď květenství nebo jsou jednotlivě. Obsahují pouze jednu tyčinku, která je přirostlá ke koruně. Protilehlé dvě tyčinky jsou přeměněné v korunovité labellum a tvoří pysk.

Synkarpní gyneceum je složené ze tří

plodolistů s bliznou. Spodní třípouzdrý semeník má mnoho vajíček. Plodem je tobolka. Jsou to rostliny, které jsou rozšířené v tropech celého světa, zvláště v jižní a jihovýchodní Asii [1]. 9

Tato čeleď obsahuje několik podčeledí. Nejvýznamnějšími zástupci jsou Zingiber officinale (Zázvorník lékařský), Curcuma longa (Kurkuma dlouhá), Kaempferia galanga, Alpinia galanga a Elettaria cardamomum (Kardamom obecný) [2].

3.1.2 CURCUMA LONGA (Kurkuma dlouhá) Kurkuma dlouhá pochází z jižní a jihovýchodní Asie. V současnosti je nejvíce rozšířená v Indii, Vietnamu a Kambodži. Curcuma longa je vytrvalá bylina s hlíznatě zduřelým článkovaným oddenkem, ze kterého vyrůstají listy a kořeny, které jsou často na koncích ztloustlé. Listy s dlouhými řapíky jsou široce kopinaté, až 0,5 m dlouhé, před rozvinutím kornoutovitě stočené. Mezi listy vyrůstá přímý stvol, který je zakončený hustým klasem světle žlutých květů. Plodem je trojpouzdrá mnohosemenná tobolka, která se v době zralosti Obrázek 1: Curcuma longa, (převzato z cit. [2]).

otevírá třemi chlopněmi. Drogou je Curcumae rhizoma. Obsahuje především

barvivo a silici. Hlavní podíl barviva tvoří žlutý fenolický kurkumin, příbuzný desmethoxykurumin a bis-desmethoxykurkumin. Pigmenty jsou citlivé na změnu pH. V kyselém prostředí se barví žlutočerveně, v alkalickém červenohnědě. Množství silice v droze je 1,5 - 6 %. Je složena především ze seskviterpenů, a- a b-pinenu, kampfenu, limonenu, eugenolu a cineolu. Droga slouží k léčení zažívacího ústrojí, jater a působí i proti parazitům. Užívá se při bolestech břicha a nadýmání, kolikách, při bolestech v krku a zubů a také při poruchách menstruace. Zevně ji lze aplikovat na hnisavé záněty spojivek, nehojící se vředy, lišeje a různá poranění [3].

10

3.1.3 ELETTARIA CARDAMOMUM (Kardamom pravý) Tato zázvorníku příbuzná bylina pochází z vlhkých tropických horských oblastí jižní Indie [1]. Roste v tropických deštných lesích Indie, Kambodže, na Sumatře a ve vlhkých lesích jižní Číny. Dnes se pěstuje i jinde v tropech např. ve Střední Americe [4]. Je to tropická vytrvalá bylina se silným kořenem a velkými oválnými zašpičatělými listy, které dosahují délky 30 - 60 cm. Z oddenků vyrůstají květonosné stvoly a na nich, Obrázek 2: Elettaria cardamomum, (převzato z cit. [5]).

v úžlabí dvouřadých listenů, vyrůstají krátké hrozny květů. Malé květy mají žlutou barvu a nachové okraje.

Kvete od června do srpna. Plodem je trojpouzdrá, podélně rýhovaná tobolka, která obsahuje velký počet tmavohnědých semen. Plody jsou zelené, aromatické, s černými semeny. Při dotyku vydává celá rostlina skořicovou vůni [1,4,5]. Semena obsahují 2 - 8 % silice složené zejména z a-terpinylacetátu, cineolu, borneolu, a-terpineolu, pinenů, myrcenu, citralu a linaloolu. Dále obsahují 10 % tuku, pryskyřici, škrob, barviva, bílkoviny, mangan a železo [4,5]. Semena a tobolky se již od starověku používají jako koření, léčivka i jako afrodiziakum. Plody kardamomu se odedávna užívají v drcené formě jako součást směsi koření kari. Egypťané jím navíc též aromatizovali kávu. Semena znal již Dioskorides v roce 77 našeho letopočtu [4,5]. Droga podporuje trávení, působí při nadýmání a kolikách, zvyšuje produkci slin a chuť k jídlu. Má stimulační účinky. Používá se rovněž při impotenci, průjmu, zvracení a bolestech břicha. Ájurvéda předepisuje kardamom při kašli, nachlazení, bronchitidě, astmatu a poruchách zažívání. Čínská medicína jej užívá jako všeobecně posilujícího prostředku a k léčbě močové inkontinence [1,4,5].

3.1.4 ALPINIA OFFICINARUM (Galgán lékařský) Rostlina se vyskytuje ve východní Indii a na přilehlých ostrovech. Pěstuje se v Japonsku, Číně a Thajsku [3]. Z vytrvalého ztlustlého oddenku vyrůstají přímé, až 2 m vysoké lodyhy, které jsou porostlé dvouřadými přisedlými listy. Ty jsou úzce kopinaté, kožovité, s blanitými jazýčky.

11

Lodyhy jsou zakončeny hroznem zelenavě bílých vonných květů. Plodem je zdužnatělá kulovitá tobolka, která obsahuje tvrdá semena nepříjemné chuti [3]. Galangae rhizoma obsahuje 0,5 - 5 % silice (cineol, eugenol, pineny), flavonoidy (kempferol, kvercetin, isorhamnetin). Pálivou chuť oddenku způsobuje netěkavý fenol galangol [3]. Droga se užívá jako stomachikum při dyspepsiích, bolestech žaludku a chronických zánětech střev. Je možno jej použít i při otravách alkoholem, bolestech zubů a malárii [3].

3.1.5 KAEMPFERIA GALANGA (Maraba galgánová) Této rostlině se říká také galgant, galgánové koření či čínský zázvor. Pochází z Afriky a jižní Asie. Vyskytuje se v deštných pralesech tropických oblastí [5]. Kaempferia galanga má uzlovitý oddenek, ze kterého vyrůstají velké listy, v jejichž středu rozkvétá bělavý, asi 2,5 cm velký, pomíjivý květ. Kvete v červnu až červenci. Drogou je Rhizoma kaempferiae galanga (oddenek maraby galgánové, galgán). Silně aromatický, příjemně vonící oddenek je často ve formě prášku [5]. Oddenky mají vysoký obsah silic, jejichž některé složky jsou pravděpodobně odpovědné za halucinogenní účinky. O chemickém složení obsahových látek je dosud známo jen velmi málo [5]. V oblastech původního výskytu se maraba již odedávna používá jako koření (zvláště při přípravě rýže). Z oddenků maraby se připravují nápoje s halucinogenními, euforizujícími a afrodiziakálními účinky. V Malajsii se maraba používá spolu s výtažkem z Antiaris toxicaria k přípravě šípového jedu. V Japonsku slouží oddenky jako přísada k vykuřovadlům a v Thajsku se oddenky a mladé listy přidávají do směsí kari [5]. V domorodé medicíně se používá k uvolňování hlenů a proti nadýmání. Čaj připravený z listů pomáhá proti otokům, revmatismu, bolestem v krku a zánětům očí. Oddenky jsou součástí prášků se stimulujícími účinky sloužících k prodloužení života a posílení sexuální činnosti [5]. Má silné stimulující, případně i halucinogenní účinky. Ve větším množství je na Nové Guiney používána k vyvolání halucinací. Nejsou známy žádné patrné vedlejší účinky [5].

12

3.2 ZINGIBER OFFICINALE 3.2.1 HISTORIE ZÁZVORNÍKU Zázvorník lékařský (Zingiber officinale) pochází původně z vlhkých oblastí střední a východní Asie [6]. Jeho tradice a historie sahá daleko do minulosti, do doby několika tisíců let před naším letopočtem. Stal se významným obchodním artiklem, byl používán nejen jako koření, ale také byly objeveny jeho léčivé a blahodárné účinky. Během času několikrát upadl do zapomnění a později byl opět objeven. I dnes se postupně dostává do povědomí veřejnosti a stále častěji se stává běžnou součástí většiny moderních domácností, ať už v kuchyni jako koření, nebo pro jeho léčivé účinky [6]. Obrázek 3: Zingiber officinale, (převzato z cit. [5]).

První zmínky nacházíme již 2700 let před naším

letopočtem. Jeden ze tří žlutých císařů, Šen-nung, popsal zázvor a jeho užívání ve svém díle o léčivých

rostlinách,

které

se

bohužel

nedochovalo.

Považoval

jej

za

jednu

z nejvýznamnějších rostlin. Další záznamy o užívání zázvorníku se objevují v nejstarších hinduistických náboženských spisech védách (1200 let před naším letopočtem) a v koránu a bibli, kde je popisována léčivá zázvorníková tráva. Mořeplavci v jižní Asii dokázali léčit nebo předcházet nemocem spojených s cestováním a užívali za tímto účelem zázvorník již v době dvou tisíc let před naším letopočtem. Díky nim se dostal do Egypta, kde se stal po skořici dalším důležitým obchodním artiklem. V Asýrii byla vytvořena největší starověká knihovna v roce 650 před naším letopočtem. Bylo v ní popsáno na 250 léčivých rostlin, mezi nimi i zázvor jako koření a přísada do nápojů. I čínský filosof Konfucius v 5. století před naším letopočtem objevil zázračné účinky zázvorníku a konzumoval jej po každém jídle na podporu trávení. Do Řecka se zázvor dostal díky Alexandru Velikému, který v roce 332 před naším letopočtem dobyl Egypt a kořen zázvoru odvezl s sebou.

13

Lék složený z bílého pepře, zázvorníku, medu, kdoulové šťávy a octa byl předepisován proti nechutenství Galénem z Pergamonu, řeckým lékařem, v období druhého stolení před naším letopočtem. V roce 78 našeho letopočtu bylo vydáno dílo Materia medica, které pojednává o lékárnictví v západních zemích. Toto dílo sepsal lékař a farmakolog z Malé Asie Dioskorides, který radil užívat zázvorník při žaludečních potížích. Zázvor měl podle něho hřejivou sílu usnadňující trávení, uvolňující břicho a blahodárně působící na žaludek. Zázvorníkový oddenek se dostal i do Říma. Byl užíván jako vzácné koření a patřil mezi běžně užívané léky v říši. Po rozpadu západořímské říše, v době stěhování národů (4. - 7. století), se Germáni rozšířili po celé Evropě a zázvor zmizel z povrchu zemského. Jeho tradice se pěstovala pouze v křesťanských klášterech. Až v 10. století byl znovuobjeven německými kupci a získal zpět své zasloužené místo mezi kořením jako je hřebíček, kardamom a skořice. V dobách křížových výprav obchod se „zbožím z Orientu“ ještě stoupl a poptávka se zvýšila. Ve středověku se zázvorník užíval jako prostředek proti moru. Přestože vyléčit jej nedokázal, alespoň zmírnil či předcházel nepříznivým zdravotním následkům nemoci. Bohatí lidé ve středověku si kořenili pokrmy zázvorem, ti chudší s oblibou popíjeli zázvorové pivo. Lékaři používali zázvorník k léčení běžných i vážných onemocnění. Žaludeční problémy, zácpa, podpora trávení a kožní lišeje – ve všech těchto případech předepisovala zázvorník pacientům Hildegarda z Bingenu (1098 - 1179).

Německý

alchymista, lékař a mystik, zakladatel homeopatie Paracelsus (Theophrastus Bombastus von Hohenheim, 1493 – 1541) sám na sobě zkoušel účinky zázvorníku [6,7]. Do Evropy se dostal zázvor i zásluhou Španělů, kteří ho v 16. století dovezli na Jamajku, kde ho začali úspěšně pěstovat a poté jej distribuovali dále. V tomto století vzniká významné dílo v oblasti fytoterapie. Petr Ondřej Mathioli je autorem slavného Mathioliho herbáře, který pojednává o všech rostlinách používaných ve farmacii od doby Paracelsa až do dnešních dnů. Zmínka je zde i o zázvorníku. Kapitola obsahuje botanický popis rostliny, účinky a způsob jeho vnitřního i zevního použití [6,8]. 17. století nepřálo zázvorníku jako koření. Spíše než zázvorník se čaj, káva a kakao stali žádanými. Stejná situace byla i v 18. století [6]. Až 19. století vrhá světlo na zapomenutý zázvorník. Opět se začíná hojně užívat především v Anglii. V této zemi se můžeme setkat se zázvorovou marmeládou, perníkem se zázvorem, zázvorovými sušenkami a s nápojem s příchutí zázvoru.

14

Se zázvorem se v 60. letech 19. století setkávají i v Německu, kde je součástí tradičního currywurstu. 20. století představuje přímo rozkvět pro zázvor. Lidé znají nejenom samotný oddenek zázvorníku, ale také jeho účinky. Zázvorníkový oddenek je běžně k dostání ve větších i menších supermarketech, je proto snadno dostupný. Hlavně ženy si jej kupují k použití nejen do kuchyně, k přípravě zákusků, ale také si z něj připravují čaj. Zázvorník najdeme téměř všude, od sušenek, pečiva, nápojů, marmelád a alkoholických nápojů, až po pokrmy z masa právě s tímto kořením. Na trhu jsou bylinné směsi, které obsahují sušený zázvorníkový oddenek, a doplňky stravy s účinkem proti nevolnosti a zvracení při cestování dopravními prostředky [6].

3.2.2 BOTANICKÝ POPIS Název: Zingiber officinale, Zázvorník lékařský Čeleď: Zingiberaceae (zázvorníkovité) Synonyma: Zázvorovník lékařský, Zázvor lékařský, Amomum zingiber, Zingiber aromaticum Lidový název: Zázvor [1,2,3]

„Kořen má uzlovatý a hrbolatý, který se vykopává, když na něm počne vadnouti listí. Ačkoliv uvedené kořeny nejsou stejné velikosti, přece časem se najde mezi nimi i kus vážící celou libru. Kořen netkví v zemi hlouběji přes 2 pídě. Při vykopávání nechává se v důlku jeden hrbolek kořene a přikryje se zemí jako zárodek budoucího kmene, čili semeno na kořen pro příští rok Obrázek 4: Zingiberis rhizoma, (převzato z cit. [2]).

[8].“

Zingiber officinalis (zázvorník lékařský) je pravděpodobně původem z Asie; dnes se vyskytuje i v Americe, Africe i Austrálii. Jedná se o starou kulturní rostlinu, která neroste planě a musí se pěstovat [9,10].

15

Náleží do čeledi zázvorovníkovitých (Zingiberaceae) spolu s kurkumou dlouhou (Curcuma longa) a kardamomem pravým (Elettaria cardamomum) [2]. Zázvorník je vytrvalá rostlina, která dorůstá do výšky až 1 metru. Oddenky jsou hlízovité, mohutně rozvětvené, dužnaté, světle žluté, na povrchu kryté šedou borkou. Z oddenku vyrůstají na jaře z jednotlivých článků jednoleté zdánlivé lodyhy, které tvoří až 0,5 metru dlouhé listové pochvy. Listová čepel je čárkovitě kopinatá, velmi tenká a přisedlá. Její báze je zaoblená, špička úzká špičatá [9,10,11]. Rostlina kvete v dubnu až srpnu. Květenstvím jsou klasy, tvořené drobnými bílými příjemně vonícími květy, které se tvoří jen zřídka. Jsou umístěné na stvolu, který vyrůstá přímo z oddenku. Květy jsou souměrné, s jednou tyčinkou, zbylé dvě jsou přeměněné v nachově zbarvený pysk. Korunu tvoří drobné lístky zelenožluté barvy. Ve spodní části jsou trubicovité, směrem nahoru se rozšiřují a jsou zakončené třemi cípy. Tyčinka má 6 prašníků, 5 z nich je zdegenerováno a tvoří staminodia (staminodium = patyčinka; ve svém vývoji a vzhledu různě potlačená nebo pozměněná tyčinka bez prašníků). Kalich je krátký, rourkovitý a rozštěpený na jedné straně [9,10,11]. Plodem je bobule. Rozmnožuje se vegetativně pomocí oddenků. Za půl roku až rok po výsadbě je možné sklízet. Sklizeň se provádí vždy po uvadnutí a opadání listů [6].

Mladé oddenky zázvorníku jsou světle žluté a mají jemnou citrusovou vůni. Tyto se kandují nebo se používají k výrobě čaje a sirupu. Starší oddenky mají palčivější chuť, jsou ostřejší a dřeň oddenku obsahuje velké množství pevných vláken. Suší se a používá se v mletém stavu [11].

Tato vytrvalá rostlina ke svému růstu potřebuje dostatek vláhy a tropické klima – tedy stálou teplotu po celý rok a půdu bohatou na živiny [9].

3.2.3 DRUHY ZÁZVORNÍKŮ Existují dvě základní formy zázvoru: − Černý zázvor: řádně omyté kousky oddenků, které jsou spařené, usušené a neloupané, případně zčásti zbavené korku. − Bílý zázvor: oloupané kousky oddenků zbavené korku, často jsou bělené roztokem chlorového vápna nebo pomocí sádry či křídy [11].

16

Dále je možno zázvorník rozlišit dle toho, ze které země pochází. Jednotlivé druhy se pak od sebe liší nejenom vzhledem, ale i barvou, chutí a vůní. − Australský zázvor – jedná se o nejjemnější druh, který je lehce vláknitý. − Brazilský zázvor – má velké hlízy. − Zázvor z ostrovů Fidži – je mnohem vlhčí než ostatní druhy, proto nikdy nevypadá vyschle. Má ostrou chuť a je méně vláknitý. − Indický zázvor – tento druh má typicky citrónovou vůni a sladkou chuť. − Jamajský zázvor – vyznačuje se intenzivní vůní. − Nigerijský zázvor – je málo aromatickou odrůdou. Chuť je štiplavá. − Zázvor ze Srí Lanky – není štiplavý, chuť je intenzivní, kořenitá. Divoce rostoucí rostlina je menší a má výraznější aroma než pěstovaná. − Thajský zázvor – neboli galgant: jedná se o kořenovou zeleninu z čeledi zázvorovitých. Květy mají bílou až krémovou barvu s růžovými konečky. Galgant lze nahradit čerstvým zázvorem. Používá se v thajské kuchyni díky jeho ostré pepřové chuti. − Západoafrický zázvor – je velmi ostrý [6].

3.3 ROSTLINNÁ DROGA Rostlinnou drogu tvoří zázvorníkový oddenek (oddenek zázvoru, Zingiberis rhizoma) druhu Zingiber officinale Rosc., který je celý nebo řezaný, usušený, zčásti nebo úplně zbavený korku. Obsahuje nejméně 15 ml silice na kilogram řezané nebo neřezané drogy v přepočtu na bezvodou drogu [12].

3.3.1 Vlastnosti drogy Droga má charakteristický aromatický zápach s kořenitou pálivou chutí [12].

Makroskopický popis: Zázvorový oddenek je ze stran zploštělý, obvykle je 5 - 10 cm dlouhý, 3 - 4 cm široký a 1 - 1,5 cm silný. Často bývá podélně rozštěpený a nepravidelně rozvětvený. Na horní špičce má krátké ploché oválné výběžky, které bývají na horním konci ukončené jizvou [12,13].

17

Oddenek bez korku (loupaný oddenek) je na svrchní straně světle hnědý, podélně rýhovaný, vláknitý. Neloupaný oddenek je na svrchní straně světle až tmavě hnědý, má sbíhavé, úzké, podélné či příčné rýhy. Droga je na lomu krátká, škrobnatá a obsahuje velké množství vyčnívajících vláken. Na příčném řezu je možno vidět úzkou kůru, která je oddělená pomocí endodermis od široké žluté dřeně. Na řezu jsou snadno rozpoznatelné roztroušené cévní svazky šedivé barvy a pryskyřičné buňky se žlutým obsahem. Pokud se jedná o neloupanou drogu, na příčném řezu je patrná ještě zevní tmavě hnědá vrstva korku [12,13].

Mikroskopický popis: Droga se upráškuje dle lékopisu. Vzniklý prášek je světle žluté až nahnědlé barvy. Vloží se do chloralhydrátu a pozoruje se pod mikroskopem. Tam je možno vidět velké množství parenchymu dřeně. Tyto buňky jsou tenkostěnné a isodiametrické (všechny 3 rozměry jsou stejně velké). Některé z buněk parenchymu obsahují hnědou oleopryskyřici. Jsou patrné úlomky hnědého korku. Droga obsahuje velké množství velkých tenkostěnných komůrkových vláken, které jsou ve skupinkách. Vždy jedna ze stěn buňky má zubatý okraj. Droga obsahuje velké síťovitě ztlustlé cévy vyskytující se společně s úzkými tenkostěnnými buňkami, které obsahují hnědé barvivo [12,13]. Pokud se upráškovaná droga pozoruje v roztoku glycerolu R 50 % jsou patrná škrobová zrna. Ta jsou jednoduchá, zploštělá, oválná až vejčitá nebo nepravidelná. Dosahují velikosti 50 mm na délku a 25 mm na šířku a jsou 7 mm silné. Užší konec zrna obsahuje malé hilum. Škrobová zrna bývají někdy nezřetelně příčně vrstevnatá [12,13].

3.3.2 Geografické rozložení Rostlina pochází pravděpodobně z jihovýchodní Asie a pěstuje se v tropickém pásu východní i západní polokoule. Komerčně se pěstuje v oblastech Afriky, Číny, Indie a Jamajky. Největším světovým producentem zázvorníku je Indie [13].

3.3.3 Zkoušky totožnosti Zkoušky totožnosti zahrnují makroskopickou a mikroskopickou charakteristiku, organoleptické vlastnosti – typický tvar, barva, štiplavá chuť, a stanovení obsahu těkavých látek (Stanovení silice) [13].

18

3.3.4 Zkoušky na čistotu Dle Českého lékopisu se provádí stanovení cizích příměsí, stanovení vody destilací a stanovení celkového popela [12].

3.3.5 Stanovení obsahu Provádí se Stanovení silic v rostlinných drogách dle Českého lékopisu. Droga obsahuje nejméně 15 ml silice na kilogram drogy [12]. Obsah ne méně než 2 % (v/w) silice se liší dle zvolené analytické metody. Kvalitativní analýza se provede pomocí tenkovrstvé chromatografie. Plynová chromatografie a kapalinová chromatografie slouží ke stanovení kvalitativní a kvantitativní analýzy gingerolů, shogaolů, a-zingiberenu, b-bisabolenu, b-seskvifelandrenu a curcumenu [13].

Kapalinová chromatografie je nejčastěji používanou metodou ke kvantitativnímu stanovení 6-gingerolu. Mobilní fází může být voda/acetonitril/methanol v poměru 52:43:5. Detekce je prováděna při 280 nm a retenční čas gingerolu je 19 minut [14]. Jinou možností je použití mobilní fáze diethylether/n-hexan v poměru 60:40. V tomto případě se stanovovaly methanolové extrakty zázvorového oddenku, retenční čas 6-gingerolu je 0,40. K identifikaci 6-gingerolu a dalších příbuzných látek z extraktu zázvorového oddenku se využívá také metod kapalinové chromatografie s hmotnostně spektrometrickou detekcí (LC/ESI-MS/MS). Tyto metody umožňují detekci, identifikaci i kvantitativní analýzu gingerolů a dalších strukturně podobných látek v doplňcích stravy, které obsahují zázvorníkový oddenek či extrakt [14,15]. Další metody zahrnují plynovou chromatografii s hmotnostně-spektrometrickou detekcí

(GC-MS),

kapalinovou

chromatografii

s UV detekcí,

HPLC

s hmotnostní

spektrometrií (LC-MS) a vysokoúčinnou tenkovrstvou chromatografi (HPTLC) [14,15]. Jinou možností je identifikace pomocí TLC. Jako adsorbent se užívá silikagel. Mobilní fáze může být toluen/ehytlacetát v poměru 93:7, detekce je prováděna anisaledehydem v kyselině sírové nebo vanilinem v kyselině sírové. Jinou mobilní fází je ether/n-hexan v poměru 60:40, detekuje se vanilinem v kyselině sírové [16].

19

3.3.6 Lékové formy Mezi lékové formy patří práškovaná droga, extrakty, tablety a tinktury. Práškovaná droga musí být uchovávána v dobře uzavřené nádobě, chráněná před světlem a vlhkostí [12,13].

3.4 OBSAHOVÉ LÁTKY V zázvorníku se vyskytuje velké množství obsahových látek, jejichž zastoupení závisí na místě původu rostliny a na tom, zda jsou oddenky v čerstvém nebo sušeném stavu [17]. Za vůni zázvorníku jsou odpovědné silice, jejichž množství se pohybuje v rozmezí 1-3 %. Silice obsahuje přes 50 látek, největší zastoupení mají monoterpeny a seskviterpeny. Z monoterpenů jsou to hlavně b-felandren, (+)-kampfen, cineol, geraniol, kurkumen, citral, terpineol a borneol. Mezi seskviterpeny se řadí a-zingiberen, b-seskvifelandren, b-bisabolen, (E-E)-a-farnesen, kurkumen a zingiberol. Některé z těchto součástí se v průběhu procesu sušení přeměňují na méně vonící sloučeniny [17]. Geranial (a-citral) a neral (b-citral) dávají čerstvému zázvorníku citronové aroma, kafrová vůně znamená přítomnost cineolu. Při sušení se obsah monoterpenů snižuje a naopak se zvyšuje množství seskviterpenů [13,18,19]. Pryskyřice může být získána extrakcí pomocí acetonu a následným odpařením tohoto rozpouštědla. Její obsah se pohybuje od 4 - 7,5 % v suché droze a dosahuje až 20 % v čerstvém oddenku zázvorníku. Je charakterizována obsahem látek, které jsou odpovědné za štiplavou chuť [14]. Štiplavost čerstvého zázvorníku je způsobena především přítomností 1-(3´-methoxy4´-hydroxyfenyl)-5-hydroalkan-3-onů, známých jako gingeroly, které jsou homology fenolických ketonů [13,17,18]. V největším množství je zastoupen 6-gingerol, ostatní gingeroly jsou zastoupené v mnohem menším množství. Za štiplavost usušeného zázvorníku mohou shogaoly např. 6-shogaol, které jsou dehydratovanou formou gingerolů. Shogaoly vznikají z gingerolů při zvýšené teplotě při sušení a v průběhu uchovávání [17,18]. Degradační procesy přeměny 6-gingerolu na 6-shogaol jsou závislé na pH. Největší stabilitu mají při pH 4, zatímco při pH 1 a při 100 °C probíhá reversibilní degradace velmi rychle. Při vyšší teplotě probíhá termální degradace gingerolů na gingerony, shogaoly a další příbuzné sloučeniny [17]. Při zkoumání obsahových látek v čerstvém oddenku zázvorníku bylo objeveno a identifikováno na 63 sloučenin, z nichž 31 bylo již dříve popsáno jako součásti zázvorníku, 20

a 20 z nich bylo objeveno nově. gingeroly,

shogaoly,

Sloučeniny obsažené v čerstvém zázvorníku zahrnují

3-dihydroshogaoly,

paradoly,

dihydroparadoly,

acetyl-deriváty

gingerolů, gingerdioly, mono- a di-acetyl deriváty gingerdiolů, 1-dehydrogingerdiony, diarylheptanoidy a methyl-ether deriváty některých těchto sloučenin. Kromě 6-gingerolu, 4-, 7-, 8-, a 10-gingerolu byly indentifikovány další sloučeniny, jako methyl-4-gingerol a methyl-8-gingerol, 4-, 6-, 8-, 10-, a 12-shogaol, methyl-4-, methyl-6- a methyl-8-shogaol. Dalšími v řadě byly identifikovány 6-paradol spolu s 7-, 8-, 9-, 10-, 11- a 13-paradoly a methyl-[6]-paradol. Paradoly jsou 5-deoxygingeroly [17]. Diarylheptenony, např. gingerenony A, B a C, byly izolovány z vodno-ethanolického extraktu oddenku. Další látky, galanolakton (diterpen) a 6-gingersulfonová kyselina, byly izolovány z vodné frakce [18]. Pomocí HPLC byly zkoumány oddenky zázvorů, které mají odlišný geografický původ. Bylo zjištěno, že japonský zázvorník obsahuje 6-gingerol, 6-dehydrogingerdion a galanolakton. Tyto látky však nebyly detekovány v dovážených zázvorových vzorcích. Později se odhalilo, že množství 6-gingerolu a galanolaktonu nápadně klesá při zpracování čerstvé drogy do Zingiberis rhizoma [18]. Čerstvá droga obsahuje velké množství proteázy [18]. Stejně tak byly zkoumány obsahové látky obsažené v usušené droze, která byla zpracována běžným komerčním způsobem. Bylo objeveno 115 sloučenin; 88 z nich bylo popsáno již dříve a 45 z nich již bylo předem zaznamenáno v čerstvém zázvoru. Zcela nově bylo objeveno 31 látek. Mezi tyto látky se řadí methyl-8-paradol, methyl-6-isogingerol, methyl-6-isoshogaol a 6-isoshogaol. Mezi další látky, které byly objeveny, jsou 6-, 8-, 10- a 12-gingerdiony. Jsou to sloučeniny, které však nebyly dokázány v čerstvém zázvorníku [18]. Koncentrace gingerolů v usušeném zázvorníku je nižší ve srovnání s obsahem gingerolů v čerstvém oddenku zázvorníku, zatímco koncentrace shogaolů v usušené droze je vyšší než v droze čerstvé [17]. Diarylheptanoidy jsou obsaženy jak v čerstvém, tak usušeném oddenku zázvoru. Jedna z nově

identifikovaných

sloučenin

je

3-methosyfenyl)heptan [17].

21

(3S,5S)-3,5-diacetoxy-1,7-bis(4-hydroxy-

Obrázek 5: Hlavní obsahové látky zázvorníku [17].

Kromě těchto látek droga obsahuje škrob až v množství 50 %. Z lipidických látek jsou zastoupeny volné mastné kyseliny (palmitová, olejová, linoleová, kaprylová, laurová, myristová, pentadekanová, heptadekanová, stearová, linoleová a arachidonová kyselina), triglyceridy, fosfatidové kyseliny a lecitin. Celkem zaujímají 6 - 8 % celkového množství [19]. Dalšími látkami v droze Zingiber officinale jsou aminokyseliny (arginin, asparagová kyselina, cystein, glycin, isoleucin, leucin, serin, threonin, valin), proteiny (kolem 9 %), pryskyřice, vitaminy (niacin a vitamin A) a minerály [19].

22

3.5 FARMAKOLOGIE 3.5.1 TRADIČNÍ UŽITÍ ZÁZVORU Droga se používá v prevenci nevolnosti, zvracení a při kinetózách. Mírní nachlazení a dráždivý kašel. Používá se při střevních infekcích, zánětu varlat a slinivky břišní. Podporuje trávení, zvyšuje slinění a vylučování žaludečních šťáv. Pomáhá při trávicích obtížích a zvyšuje chuť k jídlu, proto se užívá při nechutenství. Hojně je užíván ke snížení cholesterolu v krvi [3,6]. Rostlina je také užívána při špatném prokrvení končetin a při pocitu chladu. Sráží horečku a působí preventivně u nakažlivých nemocí, neboť usmrcuje choroboplodné zárodky. Zevně se užívá jako kloktadlo při angíně. Zázvorník se může použít i ve formě obkladů a mastí, při revmatických bolestech a špatném prokrvení [6]. Zázvorník se používá jako koření. Přidává se do mnoha různých pokrmů. Je také součástí cukroví, zákusků a sušenek. V Anglii je oblíbené zázvorové pivo a zázvorové sušenky. V asijských zemích se můžeme často setkat s kandovaným nebo nakládaným zázvorem. Rostlina se uplatňuje při výrobě voňavek [5,6]. Na trhu se dnes běžně setkáváme s čerstvým i sušeným oddenkem zázvorníku. Jako práškovaný je ve formě koření, buď samostatně, nebo je součástí kari koření a kořenících směsí.

3.5.2 EXPERIMENTÁLNÍ A KLINICKÁ FARMAKOLOGIE 3.5.2.1 Farmakokinetika Ve farmakokinetické studii byl podán 6-gingerol v dávce 3 mg/kg intravenózně krysám. 6-gingerol se z plazmy eliminoval poměrně rychle s terminálním poločasem 7,23 min., celková tělesná clearance byla 16,8 ml/min/kg. Pomocí těchto dat byl popsán dvoukompartmentový otevřený model. Vaznost na bílkoviny séra byla 92,4 % [17,18]. Jestliže bylo zaznamenáno, že farmakologický efekt přetrvává až 180 min. po intravenózní aplikaci dávky 3,5 mg/kg, bylo navrhnuto, že gingerol může být ireversibilně rozdělen do tkání nebo může být účinný v plazmě v nižších koncentracích, než je možno detekovat pomocí HPLC [18]. Stejná studie kinetiky byla prováděna na krysách s experimentálně navozeným jaterním nebo renálním selháním. Bylo zjištěno, že mezi kontrolou a nefrektomizovanými

23

krysami nebyly rozdíly v závislosti plazmatické koncentrace na čase ani v plazmatických parametrech. Z toho vyplývá, že renální exkrece nepřispívá k úbytku plazmatické koncentrace 6-gingerolu v terminální fázi. Naopak jaterní toxicita zvyšuje jeho plazmatickou koncentraci v terminální fázi. Eliminační poločas 6-gingerolu se prodlužuje z 8,5 až na 11,0 min. u krys s jaterním poškozením. Jeho množství, které se váže na proteiny v plazmě, přesahuje 90 % a působí mírně toxicky. Tyto aspekty vedou k tomu, že 6-gingerol je eliminován částečně játry [17].

3.5.2.2 Účinky na hladinu lipidů a glukózy v krvi Zjistilo se, že léčba pomocí methanolického extraktu z usušeného oddenku drogy způsobuje

snížení

hladiny

krevních

lipidů,

tělesné

hmotnosti,

hyperglykémie

a hyperinzulinémie. Léčba ethylacetátovým extraktem drogy měla vliv pouze na snížení hladiny lipidů v krvi a tělesnou hmotnost. Koncentrace 6-gingerolu v methanolovém extraktu byla vyšší než v ethylacetátovém extraktu. Z tohoto vyplývá, že methanolický extrakt má mnohem lepší výsledky v ovlivnění výše uvedených parametrů. Zdá se, že rozsah účinku je přímo úměrný koncentraci 6-gingerolu v extraktu [17]. V další studii byl podáván methanolový a ethylacetátový extrakt zázvorníku myším po dobu 8 týdnů. V průběhu této doby se snížila obezita u léčených myší a byly sníženy hladiny glukózy a inzulínu v krvi. Toto nasvědčuje k tomu, že zázvor zvyšuje citlivost k inzulínu u myší [17]. Potenciálními léčivy při léčbě diabetu a jeho komplikací bez rizika hypoglykémie jsou inhibitory aldózoreduktázy. Při analýze zázvoru bylo identifikováno 5 účinných látek, které je možno

řadit

do

této

skupiny.

Mezi

ostatními

byl

objeven

2-(4-hydroxy-

3-methoxyfenyl)ethanol a 2-(4-hydroxy-3-methoxyfenyl)ethanová kyselina. Tyto sloučeniny výrazně potlačují ukládání cukerného alkoholu sorbitolu v lidských erytrocytech a akumulaci galaktitolu v oční čočce. Mají protektivní účinek. Užíváním potravních doplňků, které obsahují zázvorník a tedy inhibitory aldózoreduktázy, může být dosaženo zlepšení diabetických komlikací [17]. U zvířat, které trpí diabetem, nepřítomností genu pro apolipoprotein E nebo jsou krmena potravou bohatou na tuky, se při aplikaci extraktu zázvoru výrazně snížilo množství cholesterolu, LDL, VLDL, triglyceridů a fosfolipidů v krvi. Zázvor se také podílel na redukci aterosklerotických plátů a způsobil zvýšení HDL stejně účinně jako běžně užívaná hypolipidemika [20].

24

Dalším nově získaným poznatkem je to, že zázvorník svým účinkem na játra snižuje biosyntézu cholesterolu a může se podílet na přeměně cholesterolu na žlučové kyseliny, a zvyšovat tak jejich vylučování [20].

3.5.2.3 Vliv na krevní tlak Řada studií, které byly prováděny hlavně na krysách, se zabývala tím, že zázvorník má spoustu přímých i nepřímých účinků na krevní tlak a srdeční frekvenci. Surový zázvorníkový extrakt způsobuje pokles krevního tlaku v závislosti na dávce podaného extraktu. Tato studie byla prováděna na anestetizovaných krysách, kterým byl podáván zázvorový extrakt v množství 0,3 - 3 mg/kg. Výsledkem testování na morčatech bylo poznání, že zázvorníkový extrakt působí kardiodepresivně na srdeční frekvenci i na sílu srdeční kontrakce [17]. Bylo potvrzeno, že snížení krevního tlaku díky surovému zázvorníkovému extraktu je způsobeno blokací napěťově řízených vápenatých kanálů. Poté následuje vasodilatace, která je realizována pomocí centrálních mechanismů [19,20]. Tento účinek je podobný účinku verapamilu [17,20]. Pouze v klinických studiích bylo potvrzeno, že zázvorník má synergický účinek jako nifedipin [20]. Snížení krevního tlaku může být docíleno také použitím vodného extraktu zázvorníku. Toto snížení krevního tlaku je realizováno prostřednictvím duální inhibice, která je způsobena stimulací muskarinových receptorů a inhibicí vápenatých kanálů. Vazodilatační aktivita je připisována fenolickým sloučeninám 6-, 8- a 10-gingerolu, zatímco 6-shogaol vykazuje pouze slabý vazodilatační účinek [17].

3.5.2.4 Pozitivně inotropní a chronotropní efekt Byla provedena studie, která srovnávala účinek 6-shogaolu a kapsaicinu. Sloučeniny byly podány krysám intravenózně. Obě sloučeniny měly vliv nejen na snížení krevního tlaku, které bylo následováno centrálně navozenou vasokonstrikcí, bradykardií a apnoem, ale také byl prokázán inotropní účinek těchto sloučenin. Při pokusu na izolované krysí srdeční síni vykazoval 6-shogaol pozitivně inotropní a chronotropní efekt, který zahrnoval uvolnění neznámé aktivní látky z nervových zakončení. Potenciální, pozitivně inotropní aktivita 6-shogaolu, byla prokázána i při pokusu na izolované srdeční síni morčete. Byly tedy popsány kardiotonické účinky této sloučeniny, která je obsažena v zázvorníku [19,20].

25

3.5.2.5 Vliv na krevní srážlivost Vliv

vodného

extraktu

zázvoru

na

destičkový

tromboxan-B2

(TBX2)

a prostaglandin-E2 (PGE2) byl zkoušen na krysách. Denně jim byl podáván vodný zázvorníkový extrakt po dobu 4 týdnů. Podání bylo provedeno buď perorálně nebo intraperitoneálně v závislosti na dávce. Nízké dávky zázvorníku (50 mg/kg) byly podány perorálně nebo intraperitoneálně. Podání těchto nízkých dávek nemělo žádný významný vliv na snížení hladiny tromboxanu TBX2 v krevním séru, ačkoliv perorálně podaný zázvorník způsoboval významné změny v hladině prostaglandinu PGE2 v krevním séru. Vysoké dávky zázvoru (500 mg/kg) podané perorálně nebo intraperitoneálně měly významný vliv na snížení hladiny prostaglandinu PGE2. Zatímco hladiny tromboxanu TXB2 byly sníženy pouze při perorálním podání zázvorníku ve vysoké dávce. Intraperitoneální podání hladiny tromboxanu neovlivnilo. Výsledky

vedou

k tomu,

že

účinky

zázvorníku

zahrnují

antritrombotické

i protizánětlivé působení [17]. Byly provedeny také klinické studie, které přináší další poznatky o vlivu zázvorníku na krevní srážlivost. Při podávání 5 g zázvorníku denně zdravým jedincům, kteří konzumují stravu bohatou na tuky, bylo dosaženo významného snížení krevní srážlivosti. U pacientů s koronárním arteriálním onemocněním, kterým byla podávána dávka 4 g zázvorníku po dobu tří měsíců, bylo toto množství zázvorníku neúčinné. Zatímco podání 10 g zázvoru se pozitivně projevilo už po 4 hodinách [20]. Zázvor neovlivňuje farmakokinetiku ani farmakodynamiku warfarinu při jejich současném podání [20].

3.5.2.6 Protizánětlivé působení Protizánětlivý účinek zázvorníku je znám již po staletí. Již dávno bylo zjištěno, že vykazuje tyto účinky. Až v 80. letech 20. století to bylo pomocí různých studií prokázáno [17]. Arteriální záněty představují rizikový faktor pro srdeční onemocnění, která jsou převážně způsobená metabolity kyseliny arachidonové. Jedná se hlavně o produkty, které vznikají činností enzymů cyklooxygenázy a lipoxygenázy. In vitro studie ukazují, že obsahové látky v zázvorníku (např. gingerdiony, shogaoly) inhibují produkci oxidu dusnatého, prozánětlivých cytokinů a enzymů cyklooxygenázy (prostaglandin-syntetáza) a 5-lipoxygenázy. Tyto enzymy jsou zodpovědné za tvorbu

26

cytokinů, prostaglandinů a leukotrienů [17,20]. Obsahové látky zázvorníku zde představují duální inhibitory v metabolismu kyseliny arachidonové, protože se podílejí na inhibici obou enzymů zároveň [16]. Cytokiny jsou proteiny, které jsou produkované v místě zánětu lymfocyty, makrofágy, fibroblasty a dalšími buňkami. Fungují jako chemičtí poslové mezi buňkami, které jsou produkované imunitním systémem, a zánětlivou odpovědí [17]. Protizánětlivý účinek

se připisuje především gingerolům s delším alkylem

v postranním řetězci, které působí inhibici těchto enzymů. Zázvor také ovlivňuje některé biochemické cesty, které se uplatňují při chronickém zánětu. Inhibuje činnost genů, které jsou odpovědné za tvorbu zánětu a genů, které kódují cytokiny, chemokiny a indukovatelnou cyklooxygenázu-2 (COX-2) [17]. Studie, které byly prováděny in vitro, dokázaly, že extrakt z drogy Zingiber officinale potlačuje zánět způsobený artritidou pomocí suprese prozánětlivých cytokinů a chemokinů, které jsou produkovány synoviálními buňkami, chondrocyty a leukocyty [17]. Byla provedena studie, která porovnávala účinek surového zázvorového extraktu a účinek frakce, která obsahovala pouze gingeroly a jejich deriváty. Studovala se jejich schopnost inhibovat otoky kloubů při revmatoidní artritidě u krys. Oba vzorky byly účinné v předcházení zánětů kloubů. I když zázvorníkový dichlormethanový extrakt, který obsahoval silici a více polárních látek, měl větší účinnost v předcházení nejen zánětu, ale také destrukci kloubů. Tato data dokumentují významné protektivní účinky při zánětech kloubů u obou vzorků. Negingerolové komponenty rozšiřují tedy antiartritické působení gingerolů [21]. Tyto výsledky jsou potvrzeny i v klinických studiích, kdy byla testována účinnost zázvorového extraktu u pacientů s osteoartritidou kolenního kloubu. Výsledkem bylo, že standardizovaný extrakt zázvorníku působí výraznou redukci symptomů u tohoto onemocnění [22]. Zázvorník, při srovnání jeho účinků s účinky běžně užívaných protizánětlivých léků, prokázal výraznou redukci zánětu u zvířat. Minimální dávka zázvorníku, která vyplynula z klinických studií, se odhaduje na 1 g denně. Vyšší dávky se však jeví jako mnohem účinnější [20]. Je známo, že látky obsažené v zázvorníku mají mnohem méně nežádoucích účinků než konvenčně používaná NSAIDs (Non-steroidal antiinflamatory drugs) [20]. Dokonce je zázvorový extrakt stejně účinný jako aspirin [16].

27

3.5.2.7 Antiemetický účinek Práškovaný oddenek zázvorníku byl dlouhou dobu používán v tradiční medicíně k mírnění symptomů gastrointestinálních onemocnění. Acetonový extrakt zázvorníku a jeho látky v něm obsažené ukazují zvýšené vyprazdňování žaludku u myší. Extrakt prokazuje účinnost i při zvracení v těhotenství (hyperemesis gravidarum), při kinetózách a po chemoterapii. Zázvorník je vhodný k prevenci post-operativní nauzey a zvracení u lidí [17]. Bylo prokázáno, že zázvorníkový extrakt má přímé cholinergní účinky na postsynaptické muskarinové M3 receptory a působí jako možný inhibitor presynaptických muskarinových autoreceptorů podobně jako běžně užívané antimuskarinové látky [17]. Při studiu na izolovaném morčecím ileu prokazovaly 6-gingerol, 6-shogaol, galanolakton a další látky antiserotonergní efekt, který je odpovědný za antiemetické působení. Tyto látky mohou ovlivňovat 5-HT3 receptory serotoninu v mozku a působit tak centrálně. Jedná se hlavně o látky s malou molekulovou hmotností, aby mohly snadno projít skrz hematoencefalickou bariéru [17]. Ve studii na zvířatech byl srovnáván účinek 1,88 g sušeného zázvoru, 100 mg dimenhydrinátu a placeba při prevenci kinetóz. Tyto nevolnosti byly navozeny umístěním slepých jedinců na nakloněnou rotující židli. Zázvorník byl shledán účinnějším než dimenhydrinát i placebo v prevenci gastrointestinálních symptomů nevolnosti. Gingeroly a shogaoly byly tedy shledány jako hlavní antiemeticky působící součásti zázvorníku [16]. Navzdory

rozšířenému

užívání

antagonistů

serotoninových

5-HT3

receptorů - antiemetik jako jsou ondansetron a granisetron, trpí více než 70 % pacientů, kteří podstupují terapii vysoce emetogenními cytostatiky při léčbě rakoviny, nauzeou, která se dostaví do 24 hodin po chemoterapii (postchemotherapy nausea) a nauzeou, která se objeví již před chemoterapií (anticipatory nausea). Vědci zjistili, že zázvorník může mít prospěšný účinek při nauzee a zvracení, které jsou spojené nejen s chemoterapií, ale také s těhotenstvím a se stavy bezprostředně po operacích [23]. Mnoho studií testuje účinek a bezpečnost různých rostlin v léčbě premenstruačního syndromu (PMS), nauzey a zvracení v prvním trimestru těhotenství. Výsledky dokazují účinnost zázvorníku při léčbě hyperemesis gravidarum v průběhu těhotenství [24]. Jeho účinek se dá považovat za mírný. Zázvorník byl shledán bezpečným při užívání těhotnými ženami. Jeho užívání nevede ke zvýšenému výskytu malformací plodu [25].

28

3.5.2.8 Vliv na gastrointestinální trakt Dřívější japonské a čínské studie zjistily, že při podání nálevu z čerstvého zázvorníku perorálně nebo intragastricky došlo ke zvýšené žaludeční sekreci. Němečtí vědci přišli na to, že při žvýkání zázvorníku dojde k výrazně zvýšené produkci slin a větší účinnosti enzymu amylázy, který je ve slinách obsažen. Intraduodenální podání zázvorníkového extraktu stimuluje produkci žluči u krys. Zodpovědné za tento účinek byl shledán 6-gingerol a 10-gingerol. Čerstvý zázvorník také obsahuje proteolytické enzymy, které tento účinek podporují [16]. Zázvorník zvyšuje gastointestinální motilitu. Účinek je srovnatelný nebo jen o něco slabší než u metoklopraminu a domperidonu. Antiserotonergní aktivitu vykazují 6-, 8- a 10-gingerol,

která

je

pravděpodobně

zodpovědná

za

účinky

zázvoru

na

gastrointestinální motilitu. Způsob podání těchto látek hraje důležitou roli pro jejich účinek. Při podání 6-gingerolu a 6-shogaolu intravenózně dochází k inhibici intestinální motility, zatímco pokud jsou podány perorálně, zesilují motilitu gastrointestinálního traktu [13,16]. Zázvorník působí protektivně na žaludeční sliznici u pacientů s peptickými vředy [16,26]. V in vitro studiích jsou aktivní složky zázvoru – gingeroly účinné proti Helicobacter pylori, který je primárním etiologickým faktorem v souvislosti se vznikem dyspepsií, peptických vředů a rozvojem rakoviny žaludku a tlustého střeva. Byly testovány baktericidní a antiadhezivní vlastnosti zázvoru proti H. pylori. Zázvorník je velmi účinným prostředkem při eradikaci Helicobacter pylori, nižší účinnost vykazuje ve schopnosti inhibovat adhezi této bakterie na žaludeční sliznici [17]. Byly studovány antimikrobiální vlastnosti zázvoru a jeho efekt na virulentní patogeny, které jsou příčinou průjmů. Zingiber officinale nevykazoval žádnou antimikrobiální aktivitu. Ačkoliv působí inhibičně na produkci cholerového toxinu, který je produkován bakterií Vibrio cholerae, nevykazuje žádný efekt na účinek tohoto toxinu. Nemá také žádný vliv na toxiny Escherichia coli.

I

když

zázvorník

nevykazuje

antimikrobiální

působení,

působí

antidiarhoicky prostřednictvím jeho vlivu na bakteriální buněčný metabolismus [27].

3.5.2.9 Antioxidační aktivita Zázvorníkový extrakt prokazuje výraznou antioxidační aktivitu srovnatelnou se syntetickými konzervačními látkami [16].

29

Zázvorník má významnou schopnost vychytávat velké množství volných radikálů a zabránit oxidaci buněčných membránových lipidů v dávce, která je závislá na způsobu podání. Ve studiích na krysách se přišlo na to, že zázvor významným způsobem snižuje peroxidaci lipidů a zvyšuje hladiny antioxidačních enzymů společně s glutathionem a působí antioxidačním efektem, který je srovnatelný s účinky kyseliny askorbové [20]. Z drogy bylo izolováno více než 50 antioxidantů, které byly rozděleny na dvě skupiny, na látky podobné gingerolu a diarylheptanoidy. Studoval se vztah struktury a účinku izolovaných antioxidantů. Gingeroly, které byly substituovány alkylem v poloze 10, 12 a 14 základního uhlíkového řetězce, byly izolovány z dichlormethanového extraktu oddenku zázvoru opakovaným použitím chromatografických metod. Tyto sloučeniny přispívají k vychytávání radikálů a mají inhibiční efekt na autooxidaci olejů, za což jsou odpovědné právě substituenty na alkylovém řetězci. Antioxidační efekt je způsoben nejen vychytáváním radikálů, ale také díky afinitě antioxidantů k substrátům [28].

3.5.2.10 Antimikrobiální aktivita Zázvorník má antibakteriální, antifungální, anthelmintické a antivirové účinky [18]. In vitro anthelmintická aktivita proti Ascaridia galli byla dokumentována na silici z drogy Zingiber purpureum Roxb. Účinek součástí silice převyšoval účinek piperazin citrátu [19]. Zázvorníkový extrakt vykazuje antimikrobiální účinnost proti Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium, Escherichia coli a Candida albicans. Antifungální aktivita není významná, ačkoliv se zjistilo, že z 29 rostlinných extraktů má zázvorníkový extrakt největší antifungální efekt. Jediný působil proti Rhizopus sp., proti kterému nepůsobí ostatní testované drogy ani antigungální látky ketokonazol a berberin. Za tyto účinky jsou odpovědné 6-, 8-, a 10-gingerol a 6-gingerdiol [17]. Infekce houbami může ohrožovat na životě u imunosupresovaných pacientů. Candida albicans je nejčastější fungální nákazou v ústní dutině. Byla hledána alternativa lokálně působící antifungální látky nystatinu. Ethanolový extrakt z drogy Zingiber officinale byl účinný proti Candida albicans. Zázvorníkový extrakt může být tedy použit k léčbě orální kandidózy [29]. Anthelmintická aktivita byla prokázána na práškovaném sušeném extraktu a vodném extraktu sušeného zázvorníku, které byly infikovány různými druhy gastointestinálních nematod. Oba extrakty se podílely na redukci zárodků nematod [17].

30

Po nějakou dobu byly zkoumány vyšší rostliny, zda by nebyla u některé z nich objevena aktivita proti rhinovirům. Tyto viry jsou běžnými původci nachlazení u lidí. Proto byla provedena řada studií na zázvorníku, který byl potenciálním zdrojem antirinovirálních látek. Byly izolovány curcumen, b-seskvifelandren, a-zingiberen a b-bisabolen. Tyto sloučeniny měly pozitivní výsledek při testování antirhinovirové aktivity, při čemž největší účinek vykazoval b-seskvifelandren [30].

3.5.2.11 Další účinky zázvorníku Zázvorníkový extrakt působí hepatoprotektivně, především díky gingerolům a shogaolům. Injekčně podaný 6-shogaol vykazuje významné antitusické účinky ve srovnání s dihydrokodeinem [16]. Při perorálním podání snižuje horečku u krys v 38 %, zatímco podání aspirinu v podobné dávce způsobí snížení horečky jen u 44 % jedinců. Antipyretická aktivita se připisuje 6-shogaolu a 6-gingerolu [16]. Je nutné zmínit i významné antitumorozní působení zázvorníku. Jeho extrakt inhibuje rozklad DNA, který je způsoben peroxidací lipidů, a zároveň potlačuje vznik kyslíkových radikálů [18]. Bylo zjištěno, že diarylheptanoidy a látky příbuzné gingerolům mají významnou cytotoxickou aktivitu a podílejí se na apoptóze proti lidským buňkám promyeloidní leukémie. Tato aktivita je způsobena těmito charakteristickými prvky ve struktuře sloučeniny: 1. acetoxylová skupina na 3. a/nebo 5. uhlíku postranního řetězce 2. etherifikace jedné fenoxylové skupiny vhodným alkylem 3. ortho-difenoxylová skupina na aromatickém kruhu 4. a-, b- nenasycená ketonická skupina v postranním řetězci [17].

3.5.2.12 Shrnutí účinků zázvorníku Bylo prokázáno, že zázvorník je vhodným prostředkem při hypoglykémii, hypotenzi i hypertenzi a kardiovaskulárních onemocněních. Inhibuje agregaci krevních destiček a vznik prostaglandinů. Má antihypercholesterolemické, cholagogení a stomachické vlastnosti [19]. Působí protektivně na žaludeční sliznici, na léčbu žaludečních a duodenálních vředů a podílí se na eradikaci Helicobacter pylori. Významné jsou jeho účinky antiemetické. Působí

31

nejen na nauzeu a zvracení způsobených chemoterapiií, ale i při hyperemesis gravidarum a kinetózách. Důležitá je také antitumorózní a antioxidační aktivita zázvoru.

3.5.2.13 Vedlejší účinky Nebyly dokumentovány žádné vedlejší účinky. Zázvorníková silice je nedráždivá, ačkoliv u citlivých jedinců může vyvolat dermatitidu. Fototoxicita není považována za významnou. Zázvorníková silice má statut nízké toxicity. Byla stanovena letální dávka LD50 = 5 g/kg [19].

3.5.2.14 Lékové interakce, kontraindikace, varování Vysoké dávky a nadměrné podávání zázvoru může ovlivnit a interferovat s antidiabetiky, s kardiovaskulární terapií a antikoaguačními látkami. Složky silice, především 6-shogaol, mají vliv na krevní tlak; nejprve jej snižují, následně zvyšují [19]. Pacienti, kteří užívají antikoaguační terapii, by měli užívání zázvoru a zázvorových preparátů konzultovat se svým lékařem. To samé platí pro pacienty se žlučníkovými kameny [13]. Dávky zázvoru, které efektivně působí proti zvracení v těhotenství, podané těhotným ženám neměly teratogenní efekt na narozené děti [13,19]. Zázvorník však má údajně vliv na vypuzení plodu a rostlinné druhy podobné zázvoru mají uterotonickou aktivitu. Proto by se v průběhu těhotenství a laktace neměl podávat v příliš vysokých dávkách [19]. Není doporučeno podávat zázvorník dětem do 6 let [13].

3.6 LÉČIVÉ PŘÍPRAVKY, DOPLŇKY STRAVY Zázvorníkový extrakt je možno nalézt ve velkém množství doplňků stravy. Je dostupný nejen ve formě kapek, tablet a tobolek, ale je také součástí lízátek a bonbonů. Mezi přípravky je velký výběr. Dostupné na trhu jsou např. Megafyt Avioplant cps. 10×250 mg ( práškovaný oddenek zázvoru), Ginger cps. 20×250 mg (Adeka, výtažek z Zingiberis rhizoma), Emesin tbl. 30 (Favea, 3 mg zázvorové silice), VitaHarmony GraviPop (lízátka pro těhotné).

32

Tyto přípravky slibují prevenci a potlačení kinetóz v dopravních prostředcích, okamžitou úlevu od bolestí hlavy či migrény, potlačování nevolnosti v těhotenství a potlačení nevolnosti po požití alkoholu [31].

3.6.1 KLOSTERFRAU MELISANA Klosterfrau Melisana koncentrát je jediný registrovaný léčivý přípravek na trhu, ve kterém je obsažen Zingiberis radix. Zároveň obsahuje i Cardamomi fructus, což je další droga, která patří do čeledi Zingiberaceae. Výrobcem je Klosterfrau

Berlín GmbH, SRN. Držitelem

registračního rozhodnutí je MCM Klosterfrau Vertriebsgesellschaft mbH, SRN. Léčivý přípravek je volně prodejný. ATC skupina je V11, Fytofarmaka. Jedná se o fytofarmakum, digestivum, sedativum, mírné

Obrázek 6: Klosterfrau melisana, (převzato z cit. [34]).

antiseptikum a derivans. 1ml alkoholového roztoku obsahuje: o Extractum herbarum ethanolicum (ut etherolea 0,5 - 0,71 mg) 40,81 mg (Melissae folium 4,20 mg, Inulae radix 5,60 mg, Angelicae radix 5,60 mg, Zingiberis radix 5,60 mg, Caryophylli flos 2,30 mg, Galangae radix 2,30 mg, Piperis nigri fructus 0,57 mg, Gentianae radix 5,60 mg, Myristicae semen 0,57 mg, Aurantii pericarpium 5,60 mg, Cinnamomi cortex 2,50 mg, Cassiae flos 0,29 mg, Cardamomi fructus 0,08 mg). Přípravek je určen pro dospělé k vnitřnímu i vnějšímu užívání. Slouží při lehčích psychovegetativních poruchách, jako je snížená chuť k jídlu, žaludeční a střevní obtíže neurotického původu, snížená schopnost uklidnění a při bolestech hlavy. Používá se při trémě, nervozitě, menstruaci, přechodu a při ztíženém usínání. Podpůrně funguje při nachlazení a chřipkových stavech. Při zevním použití působí jako derivans s možností aplikace při neuritidách, bolestech svalů po zátěži, lumbagu a gingivitis. Přítomné hořčinové drogy reflektoricky zvyšují tvorbu žaludeční šťávy a příznivě působí při dyspepsiích a nechutenství. Siličné drogy příznivě působí na vegetativní nervový

33

systém a uklidňují jej. Dochází k dráždění stěny tlustého střeva a zvýšení jeho motility díky obsahu drog, které obsahují antraglykosidy. Kontraindikací jsou žaludeční a dvanácterníkové vředy, těžké poškození jater, alkoholismus, epilepsie, poruchy mozkových funkcí, těhotenství, laktace a alergie na obsažené silice. Přípravek může ovlivňovat účinek jiných léků díky obsahu 66 % (obj.) alkoholu. V doporučených dávkách může ovlivnit pozornost a rychlost reakce osob, jejichž činnost vyžaduje zvýšenou pozornost (řidiči, obsluhy strojů, práce ve výškách) [32].

34

4 EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 4.1 CHEMIKÁLIE A POMŮCKY 4.1.1 CHEMIKÁLIE − Citral (cis-trans), Fluka Chemika − Diethylether nestabilizovaný p.a., Lachema − Ethanol 96%, denaturovaný benzínem − Kyselina chloristá, Merck − Kyselina sírová 6N, Abbot − Methanol p.a., Penta − N-hexan p.a., Balex − Resorcinol, Aldrich − Vanilin, substance, 99%, Aldrich − Voda destilovaná

4.1.2 ANALYZOVANÝ VZOREK − Bylo pracováno s extraktem z oddenku zázvorníku Zingiber officinale Rosc., vyrobeným v únoru 2006 firmou XI´AN TIANXINGJIAN PHARMCHEM ENTERPRISES CO.,LTD. Jedná se o práškovitý extrakt žluté barvy a hřejivého zápachu. Extrakce byla provedena 80% ethanolem. − Extrakt má mít deklarovaný obsah 10,5 % gingerolů a shogaolů (4 - 6 % gingerolů, 4 - 6 % shogaolů). Stanovení bylo provedeno pomocí HPLC [35]. − Analytický protokol je uveden v příloze. (Obr. 21: Analytický protokol).

4.1.3 VODNÝ EXTRAKT ZÁZVORNÍKU − Vodný extrakt závorníku z oddenku Zingiber officinale, který byl vyrobený firmou AIGI v březnu 2006. − Extrakce byla provedena destilovanou vodou. − Dle analytického protokolu má mít extrakt deklarovaný obsah 5 % gingerolů. Stanovení bylo provedeno pomocí HPLC.

35

4.1.4 ČERSTVÝ MATERIÁL − Oddenek drogy Zingiber officinale (zázvorník obecný) získaný běžným nákupem komerčního zboží v čerstvém stavu.

4.1.5 PŘÍSTROJE − Analytické váhy, Sartorius − Digestoř − Horkovzdušný vysoušeč, BaByliss − Magnetická míchačka, Merck − Mixér, AEG − Sušárna − Třepačka, Heidolph − Ultrazvuková lázeň, Sonorex super 10P, Bandeline − UV-lampa, Lamag − Vakuová odparka, Büchi − Vodní lázeň, Büchi

4.1.6 CHROMATOGRAFICKÝ MATERIÁL − TLC hliníkové folie Silikagel 60 (bez fluorescenčního indikátoru), tloušťka vrstvy 0,2 mm, 20×20cm, MERCK − TLC hliníkové folie Silikagel 60 F254 (s fluorescenčním indikátorem), tloušťka vrstvy 0,2 mm, 20×20cm, MERCK − Vyvíjecí komora, Lamag

4.1.7 SESTAVA PRO HPLC − Chromatograf: Philips PU4100 − Detektor: Philips PU4110 UV/VIS − Detektor pro UV-spektroskopii: Philips P3202, Software: Diode array PU 6003 − Kolona: Merck, Purospher RP-18 endcapped, 5 mm, 250×4 mm − Vlnová délka detektoru: 282 nm

36

− Průtoková rychlost mobilní fáze: 1,0 ml/min − Nástřik: 20 µl − Mobilní fáze Ø Acetonitril/voda (okyselená 1 ml H3PO4 v 1000 ml H2O)/methanol v poměru 55:44:1

4.2 PRAKTICKÉ PROVEDENÍ Byla provedena tenkovrstvá chromatografie dle Českého lékopisu 2009. Úprava vzorku: 0,1 g vzorku bylo smícháno s 5 ml ethanolu 96%, třepáno 15 min. ve zkumavce a zfiltrováno. Porovnávací vzorek: 5 kapek citralu + 5 mg resorcinolu bylo rozpuštěno v 5 ml methanolu R. Postřik: 15 ml roztoku vanilinu (v koncentraci 10 g / 1 l) + 15 ml kyseliny chloristé 3% + 3 ml kyseliny sírové 6N Adsorbent: Silikagel Soustava: ether + n-hexan = 6 : 4 (48 ml + 32 ml) Detekce: UV Postřik roztokem 1% vanilinu (15 ml) v kyselině chloristé (15 ml) a kyselině sírové 6N (3 ml).

Na desku s vrstvou silikagelu byl nanesen v tenké vrstvě zkoušený vzorek a porovnávací vzorek. Deska byla vyvíjena ve vyvíjecí soustavě. Následně byla deska vysušena pomocí fénu do odpaření etheru. Bylo detekováno UV světlem a případné skvrny byly zakresleny. Poté byla deska postříkána roztokem vanilinu v kyselině chloristé a kyselině sírové. Byla vysušena fénem, vložena do sušárny a zahřívána, dokud teplota nedosáhla 110 °C. Poté byla deska vyhodnocena. Tímto způsobem byly upraveny všechny vzorky v následujících „Pokusech“ a při vyhodnocování chromatografických desek bylo postupováno dle lékopisu. Pokud došlo ke změně, ať už v úpravě vzorku nebo ve způsobu provedení, bude to uvedeno. V průběhu všech pokusů byly používány TLC hliníkové desky bez fluorescenčního indikátoru. Výjimkou je „Pokus č. 5“ , kde byly použity desky s fluorescenčním indikátorem.

Na chromatogramu zkoušeného roztoku jsou dvě intenzivní fialově zbarvené skvrny (gingeroly) pod skvrnou resorcinolu na chromatogramu porovnávacího roztoku. A dále dvě

37

méně intenzivní fialové skvrny (shogaoly) uprostřed mezi skvrnou resorcinolu a dvěma skvrnami citralu na chromatogramu porovnávacího roztoku [12].

4.2.1 POKUS Č. 1 Na desku byl nanesen pomocí skleněné kapiláry vzorek a porovnávací roztok a byla provedena tenkovrstvá chromatografie.

Obrázek 7: Schéma chromatogramu č. 1 Vysvětlivky: Por.☼ …porovnávací roztok Vz …zkoušený vzorek Rf …retenční faktor

Porovnávací roztok:

Vzorek: žádná skvrna

Rf1=0,760 …citral Rf2=0,512 …citral Rf3=0,376 …resorcinol

38

4.2.2 POKUS Č. 2 Na desku byly naneseny opět oba roztoky. Roztok vzorku byl nanesen ve větší koncentraci, protože na chromatogramu vzorku se v „Pokuse č. 1“ neobjevila žádná skvrna (Obr. č. 7: Schéma chromatogramu č. 1). Další vrstva byla nanesena vždy po zaschnutí vrstvy předchozí. Roztoky byly naneseny v proužku (cca 1 cm dlouhém), ne v tečce.

Obrázek 8: Schéma chromatogramu č. 2 Vysvětlivky: Por.☼ …porovnávací roztok Vz …zkoušený vzorek Rf …retenční faktor


Vzorek:

Rf1=0,805 …citral

Rf4=0,641 …skvrna téměř není vidět

Rf2=0,539 …citral

Rf5=0,391 …skvrna téměř není vidět

Rf3=0,383 …resorcinol

39

4.2.3 POKUS Č. 3 Byl připraven extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku a byla provedena tenkovrstvá chromatografie obdobně jako v předchozích případech. Na chromatogram byl nanesen porovnávací roztok, třikrát ethanolový extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku ve třech různě velkých koncentracích (1. nejmenší koncentrace – 2 cm extraktu v kapilárce, 2. střední koncentrace – 2×2 cm extraktu v kapilárce, 3. největší koncentrace – 3×2 cm extraktu v kapilárce) a roztok vodného extraktu zázvorníku.

Extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku v 60% ethanolu: 140 g oddenku bylo smíseno se 100 ml ethanolu 60%, v mixéru bylo mixováno 3 - 5 min. (pozor, nemělo by dojít k zahřívání hmoty!), zfiltrováno do kádinky, přefiltrovaná šťáva byla zfiltrována ještě jednou. Roztok vodného extraktu zázvorníku: 0,1 g vzorku bylo smícháno s 5 ml destilované vody, třepáno 15 minut ve zkumavce a zfiltrováno.

Obrázek 9: Schéma chromatogramu č. 3 Vysvětlivky: Por.☼ …porovnávací roztok VzBB…roztok vodného extrakt zázvorníku E1 … extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu (menší koncentrace) E2 … extrakt z čerstvého zázvoníkru v 60% ethanolu (střední koncentrace) E3 … extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu (největší koncentrace) Rf …retenční faktor

40


Roztok vodného extraktu zázvorníku:

Rf1=0,858 …citral (fialová)

Rf5=0,158 (fialová)


Rf6=0,116 (modrá)


Rf7=0,092 (žlutá)

Rf4=0,242 …resorcinol (červená)

Rf8=0,058 (fialová) Rf9=0,033 (fialová)

Extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu: Rf10=0,133 (méně intenzivní fialová) Rf11=0,133 (intenzivní fialová) Rf12=0,133 (fialová)

4.2.4 POKUS Č. 4 Byla provedena tenkovrstvá chromatografie. Na desku byl nanesen porovnávací roztok,

kurkuminoidy

(v

ethanolovém

roztoku),

extrakt

z čerstvého

zázvorníku

v 60% ethanolu, roztok vodný extraktu zázvorníku a zkoušený vzorek. Deska byla vyvíjena dvakrát, aby se docílilo vzájemného oddělení jednotlivých látek.

Obrázek 10: Schéma chromatogramu č. 4

41

Vysvětlivky: Por.☼ …porovnávací roztok E1 …extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu K …kurkuminoidy VzBB… roztok vodného extrakt zázvorníku Vz…zkoušený vzorek Rf …retenční faktor


Roztok vodného extraktu závorníku:



Rf2,3=0,866 …citral (fialová)

Rf9=0,170 (modrá)

Rf4=0,375 …resorcinol (červená)

Rf10=0,134 (žlutá)

Rf5=0,027 (méně intenzivní fialová)

Rf11=0,080 (méně intenzivní fialová) Rf12=0,045 (méně intenzivní fialová)

Extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% EtOH:

Vzorek:


Rf13=0 (svítí na startu pod UV)

Rf13=0 (svítí na startu pod UV) Kurkuminoidy: Rf7=0,090 (oranžová, svítí pod UV)

4.2.5 POKUS Č. 5 Byla provedena tenkovrstvá chromatografie na desce s fluorescenčním indikátorem. Na desku byl nanesen porovnávací roztok a extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu v různě velkých koncentracích. Byla provedena detekce UV světlem.

42

Obrázek 11: Schéma chromatogramu č. 5 Vysvětlivky: Por.☼ …porovnávací roztok E1 … extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu (nejmenší koncentrace) E2 … extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu (střední koncentrace) E3 …extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu (největší koncentrace) Rf …retenční faktor


Extrakt z čerstvého zázvorníku v 60%

Rf1=0,868

EtOH:

Rf2=0,769

Rf4=0,711

Rf3=0,711

Rf5=0,116

Všechny skvrny na chromatogramu svítí pod UV světlem. .

4.2.6 POKUS Č. 6 Byl připraven extrakt z čerstvého zázvorníku v 96% ethanolu za použití zázvorníku, ze kterého byl již připraven extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu. Byla provedena tenkovrstvá chromatografie stejným způsobem jako v předchozích případech.

43

Extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku v 96% ethanolu: Hmota z čerstvého oddenku zázvorníku, ze kterého byl již připraven extrakt v 60% ethanolu, byla vložena do 100 ml 96% ethanolu, zfiltrována a tím byl získán extrakt.

Obrázek 12: Schéma chromatogramu č. 6 Vysvětlivky: K …kurkuminoidy E1 …extrakt z čerstvého zázvorníku v 60% ethanolu E96% …extrakt z čerstvého zázvorníku v 96% ethanolu Rf …retenční faktor

Kurkuminoidy:


Rf1=0,050 (oranžová, svítí pod UV)

EtOH:



EtOH:

Rf4=0,420 (svítí pod UV)


Rf5=0,294 (světle intenzivní fialová) Rf6=0,126 (fialová)

44

4.2.7 POKUS Č. 7 Byla připravena sada roztoků zkoušeného vzorku v různých koncentracích rozpouštědla a provedena tenkovrstvá chromatografie. Na chromatogram bylo naneseno z každé zkumavky stejné množství vzorku. 1. zkumavka: 100 mg vzorku + 5 ml 100% methanolu 2. zkumavka: 100 mg vzorku + 5 ml 80% methanolu 3. zkumavka: 100 mg vzorku + 5 ml 50% methanolu 4. zkumavka: 100 mg vzorku + 5 ml 30% methanolu 5. zkumavka: 100 mg vzorku + 5 ml destilované vody Každá zkumavka s roztokem vzorku v daném rozpouštědle byla protřepána v třepačce 1 minutu, zahřáta na vodní lázni na 40 °C a poté se opět protřepána na třepačce 1 minutu. Poté byly vzorky naneseny na chromatogram.

Obrázek 13: Schéma chromatogramu č. 7 Vysvětlivky: 100% …100 mg vzorku + 5 ml 100% methanolu 80% …100 mg vzorku + 5 ml 80% methanolu 50% …100 mg vzorku + 5 ml 50% methanolu 30% …100 mg vzorku + 5 ml 30% methanolu H2O …100 mg vzorku + 5 ml destilované vody Rf …retenční faktor

45

4. zkumavka (100 mg vzorku + 5 ml 30%

Rf9=0,048 (tmavě fialová)

methanolu):

1.-3. zkumavka (100 mg vzorku + 5 ml

Rf1=0,629 (světle fialová)

100%, 80%, 50% methanolu):


Retenční faktory byly stejné, jen odstín

Rf3=0,524 (svítí pod UV)

barev byl světlejší.

Rf4=0,347 (fialovo-modrá)

Skvrna s Rf6 nebyla u těchto vzorků téměř

Rf5=0,234 (intenzivní fialová)

vidět.

Rf6=0,194 (méně intenzivní fialová) Rf7=0,113 (méně intenzivní fialová, svítí

5. zkumavka (100mg vzorku + 5ml

pod UV)

destilované vody):


Žádná skvrna

U 2. a 4. zkumavky bylo zbarvení skvrn nejintenzivnější. I samotný roztok vzorku ve 2. a 4. zkumavce byl nejtmavší.

4.2.8 POKUS Č. 8 Byl připraven extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku ve 30% a 80% methanolu, roztok vzorku v 30% methanolu, roztok vodného extraktu zázvorníku v 80% methanolu a porovnávací roztok. Vše bylo naneseno na desku a byla provedena tenkovrstvá chromatografie dle předchozího způsobu.

Extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku v 30% methanolu: 50 g čerstvého oddenku zázvorníku bylo nakrájeno na tenké plátky, 3 - 5 minut bylo mixováno v mixéru spolu se 100 ml 30% methanolu, následně zfiltrováno. Získaný extrakt byl převeden do odměrné baňky o objemu 100 ml (nádobí bylo předem vypláchnuto v čistém rozpouštědle). Extrakt z čerstvého zázvorníku v 80% methanolu: Extrakt byl proveden stejným způsobem jako extrakt z čerstvého zázvorníku v 30% methanolu, jen místo 30% methanolu byl použit 80% methanol. Roztok vzorku v 30% methanolu: 0,1 g vzorku + 5 ml 30% methanolu Roztok vodného extraktu zázvorníku: 0,1 g vzorku + 5 ml 80% methanolu Roztok kurkuminoidů: 1 mg kurkuminoidů + 1 ml methanolu 100%

46

Obrázek 14: Schéma chromatogramu č. 8 Vysvětlivky: Por.☼ …porovnávací roztok Vz30% …roztok vzorku v 30% methanolu E30% …extrakt z čerstvého zázvorníku v 30% methanolu E80% …extrakt z čerstvého zázvorníku v 80% methanolu BB80% …roztok vodného extraktu zázvorníku v 80% methanolu K …kurkuminoidy Rf …retenční faktor


Extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku

Rf1=0,830 (intenzivní fialová)

v 80% methanolu:



Rf3=0,357 (červená)

Roztok vodného extraktu zázvorníku

Roztok vzorku v 30% methanolu:

v 80% methanolu:

Žádná skvrna.


Extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku

Rf7=0,580 (svítí jen pod UV)

v 30% methanolu:



Kurkuminoidy: Rf9=0,125 (žlutá, svítí pod UV)

47

Na této desce nebyl povedený postřik. Skvrny byly málo vidět a byly rozmazané. Proto byly vzorky naneseny znovu na novou desku a ve větší koncentraci.

4.2.9 POKUS Č. 9 Byla provedena tenkovrstvá chromatografie. Na desku byly naneseny pouze roztoky vzorku v 30% a 80% methanolu, extrakty z čerstvého oddenku zázvorníku v 30% a 80% methanolu a roztok vodného extraktu zázvorníku v 80% methanolu. Roztok vzorku v 80% methanolu: 0,1 g vzorku + 5 ml 80% methanolu

Obrázek 15: Schéma chromatogramu č. 9 Vysvětlivky: Vz30% …roztok vzorku v 30% methanolu Vz80% …roztok vzorku v 80% methanolu E30% …extrakt z čerstvého zázvoru v 30% methanolu E80% …extrakt z čerstvého zázvoru v 80% methanolu BB80% …roztok vodného extraktu zázvorníku v 80% methanolu Rf …retenční faktor

48




methanolu:

Rf2=0,333 (fialovo-modrá)






Rf5=0,025 (méně intenzivní fialová) Roztok vodného extraktu zázvorníku Roztok vzorku v 80% methanolu:

v 80% methanolu:

Rf1-Rf5 …odpovídají skvrnám roztoku


vzorku v 30% methanolu, jen jsou

Rf13=0,375 (růžová)

světlejší.

Rf14=0,283 (méně intenzivní fialová) Rf15=0,216 (méně intenzivní fialová)



methanolu:



Rf18=0,133 (modrá)


Rf19=0,100 (žlutá)


Rf20=0,066 (méně intenzivní fialová) Rf21=0,025 (fialovo-modrá)

4.2.10 POKUS Č. 10 Na předešlých chromatogramech u roztoku vzorku bylo vždy málo skvrn nebo téměř nebyly vidět. Proto byl nanesen na desku pouze roztok vzorku v 30% a 80% methanolu, a to ve větší koncentraci (další nanášku vždy po řádném zaschnutí nanášky předchozí).

49

Obrázek 16: Schéma chromatogramu č. 10 Vysvětlivky: Vz30% …roztok vzorku v 30% methanolu Vz80% …roztok vzorku v 80% methanolu Rf …retenční faktor







Rf3=0,595 (fialová) Rf4=0,552 (svítí jen pod UV)



Rf1-Rf11 …skvrny odpovídaly roztoku


vzorku v 30% methanolu. Barevně byly

Rf7=0,129 (růžová)

skvrny vzájemně porovnatelné.

Rf8=0,103 (fialová, svítí pod UV)

50

4.2.11 POKUS Č. 11 Byla provedena tenkovrstvá chromatografie. Na desku byl nanesen roztok vzorku v 30% methanolu, roztok vodného extraktu zázvorníku v 80% methanolu, 6-gingerol v koncentraci 1 mg/ml a extrakty z čerstvého zázvorníku v 30% a 80% methanolu.

Obrázek 17: Schéma chromatogramu č. 11 Vysvětlivky: E80% …extrakt z čerstvého zázvorníku v 80% methanolu E30% …extrakt z čerstvého zázvorníku v 30% methanol G …6-gingerol v koncentraci 1 mg/ ml BB80% …roztok vodného extraktu zázvorníku v 80% methanolu Vz30% …roztok vzorku v 30% methanolu Rf …retenční faktor


6-gingerol v koncentraci 1 mg/ml:

methanolu:


Rf1=0,120 (fialová) Extrakt z čerstvého zázvorníku v 30% methanolu: Rf2=0,120 (fialová)

51

Roztok vodného extraktu zázvorníku


v 80% methanolu:








Rf7=0,203 (méně intenzivní fialová) Rf8=0,136 (fialová)

4.2.12 POKUS Č. 12 Pomocí HPLC byla naměřena kalibrační křivka standardu 6-gingerolu. Byly připraveny tři roztoky standardu 6-gingerolu ve třech různých koncentracích. Naměřily se 3 různé koncentrace roztoku 6-gingerolu, které byly připraveny rozpuštěním krystalické látky 6-gingerolu v rozpouštědle, kterým byl 80% methanol. Každá koncentrace byla změřena třikrát. Pomocí programu Excel byla zjištěna rovnice křivky a korelační koeficient.

Rovnice kalibrační křivky standardu 6-gingerolu: Y = 13307,5 * X R = 0,99998

„R“ udává korelační koeficient. Hodnota korelačního koeficientu +1 značí zcela přímou závislost. Závislost kalibrační křivky je lineární, což znamená, že se zvyšující-se koncentrací se zvětšuje plocha peaků.

52

Obrázek 18: Kalibrační křivka 6-gingerolu

Obrázek 19: HPLC - 6-gingerol

53

4.2.13 POKUS Č. 13 Byla provedena HPLC (kapalinová chromatografie). Byly připraveny roztoky vzorku a extrakty z čerstvého oddenku zázvorníku podle následujícího postupu: 2 g vzorku bylo vloženo do odměrné baňky a doplněno 80% methanolem do 100 ml. Bylo macerováno přes noc. Potřebné množství bylo zfiltrováno do zkumavky a bylo provedeno měření. 10 g čerstvého nadrobno nakrájeného oddenku zázvorníku bylo macerováno přes noc v 50 ml 80% methanolu. Druhý den bylo zfiltrováno do odměrné baňky a doplněno rozpouštědlem do 100 ml. Potřebné množství bylo přelito do zkumavky a bylo provedeno měření.

Roztok vzorku v 80% methanolu (K1): 2,0577 g ve 100 ml 80% methanolu Roztok vzorku v 80% methanolu (K2): 2,0160 g ve 100 ml 80% methanolu Extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku v 80% methanolu (Č1): 10,4589 g ve 100 ml 80% methanolu Extrakt z čerstvého oddenku zázvoru v 80% methanolu (Č2): 10,4166 g ve 100 ml 80% methanolu Standard: 6-gingerol v koncentraci 1 mg/ml

Výsledky: Množství 6-gingerolu v jednotlivých vzorcích: K1=0,1483 % K2=0,1612 % Č1=2,1098 % Č2=1,3028 % Chromatogramy vzorků K1 a Č2 jsou uvedeny v příloze (Obr. 22: HPLC – vzorek K1, obr. 23: HPLC – vzorek Č2).

4.2.14 POKUS Č. 14 Byla provedena opět HPLC. Pro analýzu byly použity roztoky vzorků z předešlého měření (měření bylo provedeno o měsíc později) a extrakty z čerstvého zázvorníku, které byly nově připraveny. 54

Bylo odebráno potřebné množství roztoků vzorků K1 a K2 a provedeno měření. Tyto o měsíc později změřené vzorky byly označeny K1* a K2*. 10 g čerstvého oddenku zázvorníku bylo nastrouháno na struhadle, bylo přidáno 50 ml 80% methanolu a macerováno přes noc. Druhý den byla směs zfiltrována do odměrné baňky a doplněna rozpouštědlem do 100 ml. Potřebné množství roztoku bylo odeberáno do zkumavky a byla provedena HPLC.

Roztok vzorku v 80% methanolu (K1*): 2,0577 g ve 100 ml 80% methanolu Roztok vzorku v 80% methanolu (K2*): 2,0160 g ve 100 ml 80% methanolu Extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku v 80% methanolu (Č1*): 10,7121 g ve 100 ml 80% methanolu Extrakt z čerstvého oddenku zázvorníku v 80% methanolu (Č2*): 10,6954 g ve 100 ml 80% methanolu Standard: 6-gingerol v koncentraci 1 mg/ml

Výsledky: Množství 6-gingerolu v jednotlivých vzorcích: K1*=0,4609 % K2*=0,3518 % Č1*=3,4486 % Č2*=2,6370 % Chromatogramy

vzorků

K2*

a

Č2*

jsou

uvedeny

v příloze

(Obr. 24: HPLC - vzorek K2*, obr. 25: HPLC – vzorek Č2*).

4.2.15 POKUS Č. 15 Byla naměřena UV absorpční spektra vzorků K1* a K2* z „Pokusu č. 13“. Vzorek, dle analytického protokolu, je 10%. Množství 6-gingerolu v roztoku vzorku je K1*=0,4609 % a v roztoku vzorku K2*=0,3518 %. Toto množství je o jeden řád menší než celkový obsah gingerolů ve vzorku. Je to pravděpodobně dáno tím, že byl naměřen obsah pouze 6-gingerolu ve vzorku.

55

Pomocí UV absorpčního spektra bylo ověřeno, zda další látky obsažené ve vzorku jsou podobné struktury, tedy látky jsou látkami typu gingerolů. Pokud ano, plochy peaků na chromatogramu HPLC je potom možno sečíst. Záznam UV spektra 6-gingerolu a vzorku K1* je uveden v příloze (Obr. 27: Záznam UV spektra 6-gingerolu, obr. 28: Záznam UV spektra vzorku K1*).

Vzorek K1* Číslo peaku

Retenční čas

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

2,127 2,993 3,993 4,700 4,960 5,847 6,187 6,573 7,020 7,947 11,080 15,447

Hodnoty maxim [nm] 213, 281, 307 207, 232, 289 205, 231, 289 207, 229, 286 206, 230, 287 205, 233, 284 204, 231, 287 207, 230, 286 207, 228, 287 205, 231, 289 206, 228, 287 207, 230, 289

Hodnoty minim [nm] 257 222, 267 220, 263 219, 268 219, 267 219, 264 221, 264 219, 266 223, 267 220, 262 219, 266 219, 264

Vzorek K2* Číslo peaku 1 2 3 4 5 6 7 8

Retenční čas 3,233 3,593 5,673 6,120 6,593 7,080 10,527 12,487

Hodnoty maxim [nm] 215, 280 207, 228, 289 207, 232, 278 207, 232, 282 207, 232, 278 207, 231, 278 207, 229, 282 207, 231, 282

Hodnoty minim [nm] 258 220, 269 219, 262 221, 262 219, 267 219, 262 220, 266 219, 267

Standard 6-gingerol Standard

Retenční čas

6-gingerol

6,030

Hodnoty maxim [nm] 207, 228, 289

Hodnoty minim [nm] 219, 266

56

4.2.16 POKUS Č. 16 Byla provedena ztráta sušením u čerstvého oddenku zázvorníku. Český lékopis 2009 nestanovuje ztrátu sušením u Zingiberis rhizoma. Proto byl zvolen kořen podobný zázvorníkovému kořenu a byla provedena Ztráta sušením dle příslušného článku v lékopise. Byl zvolen Ononidis radix. Ztráta sušením byla provedena při teplotě 105 °C. 3 g jemně nakrájené drogy byly naváženy do předem vysušené váženky. Droga byla vysušena do konstantní hmotnosti při 105 °C.

Výsledky: Váženka s víčkem Váženka s víčkem a drogou Hmotnost po 1,5 hod. Hmotnost po 2,5 hod. Hmotnost po 3 hod. Hmotnost čerstvé drogy Hmotnost suché drogy Množství vody

Váženka č.1 Váženka č.2 38,0695g 29,6476g 41,4282g 32,8101g 38,4430g 29,9901g 38,4400g 29,9869g 38,4392g 29,9838g 3,3587g 3,1625g 0,3697g 0,3362g 88,99% 89,37%

57

5 VÝSLEDKY Prvním cílem diplomové práce bylo zjistit, zda analyzovaný vzorek obsahuje látky typu gingerolů. Důkazem toho, že gingeroly ve vzorku opravdu jsou, je schéma chromatogramu č. 11. Na desku byl nanesen vzorek i standard 6-gingerol.

Obrázek 20: Schéma chromatogramu č. 11 Vysvětlivky: E80% …extrakt z čerstvého zázvorníku v 80% methanolu E30% …extrakt z čerstvého zázvorníku v 30% methanol G …6-gingerol v koncentraci 1 mg/ ml BB80% …roztok vodného extraktu zázvorníku v 80% methanolu Vz30% …roztok vzorku v 30% methanolu Rf …retenční faktor

6-gingerol v koncentraci 1 mg/ml:




Velikost retenčních faktorů není zcela identická, skvrny si však vzájemně odpovídají. Je to tím, že čelo na chromatogramu bylo na pravé straně o něco výše než na straně levé. Pokud by se spočítaly retenční faktory poměrově (odpovídající vzdálenost čela a vzdálenost

58

dané skvrny od startu), vyjde Rf3=0,123 a Rf11=0,126. Barevně jsou skvrny vzájemně porovnatelné a odpovídají si.

Chromatogram

je

uveden

v příloze

jako

chromatogram č. 11

(Obr. 26:

Chromatogram č. 11).

Dalším důkazem toho, že se gingeroly ve vzorku vyskytují, je záznam z HPLC vzorku K1. Modrou barvou je znázorněn standard 6-gingerol, červená barva patří vzorku K1. Peak s retenčním časem 6,33 u vzorku K1 je 6-gingerol a překrývá peak 6-gingerolu, který představuje standard.

Záznam z HPLC je uveden v příloze jako HPLC – vzorek K1 (obr. 22: HPLC - vzorek K1). Těmito pokusy bylo dokázáno, že se gingeroly v analyzovaném vzorku opravdu vyskytují.

Druhým cílem práce bylo zjistit, jaké množství gingerolů je obsaženo ve vzorku a zda zjištěné množství odpovídá analytickému protokolu. Výše uvedeným výpočtem bylo zjištěno, že množství gingerolů ve vzorku K1* je 5,82 % a ve vzorku K2* je 5,12 %. Analyzovaný vzorek tedy obsahuje průměrně 5,47 % gingerolů. Toto množství odpovídá analytickému protokolu, který je uveden v příloze (obr. 21: Analytický protokol). Dle protokolu se obsah gingerolů v analyzovaném vzorku pohybuje v rozmezí 4 - 6 %.

59

6 DISKUZE 6.1 ANALYZOVANÝ VZOREK Analyzovaným vzorkem byl extrakt z oddenku zázvorníku Zingiber officinale Rosc. Extrakce byla provedena ethanolem. Analytický protokol uvádí, že vzorek by měl být rozpustný v ethanolu [35]. Při rozpouštění vzorku v ethanolu se část vzorku rozpustila, část však zůstala na dně zkumavky jako sedlina. Je otázkou, zda to může být způsobené stářím extraktu, extrakt byl vyroben již v roce 2006, nebo jeho nekvalitním zpracováním. Dalším bodem k zamyšlení je to, zda se v nerozpuštěné části vzorku nacházely účinné látky. Pokud by tomu tak bylo, výsledná měření by byla nepřesná. I přes toto výsledky vykazují dobrou shodu s údaji uvedenými v analytickém protokolu. Obsah gingerolů se nachází v rozmezí, které analytický protokol uvádí. Protože ethanol vykazuje podobnou extrakční sílu jako methanol, byl jako rozpouštědlo pro analyzovaný vzorek zvolen methanol. Ani zde se vzorek zcela nerozpouštěl a vykazoval přítomnost sedliny na dně zkumavky.

Lékopis užívá pro označení drogy název Zingiberis rhizoma – zázvorový oddenek. Dle citace [1] užívá autor označení zázvorník. Proto je možné užít obojího způsobu pojmenování.

6.2 TENKOVRSTVÁ CHROMATOGRAFIE Analýza vzorku byla provedena pomocí tenkovrstvé chromatografie. Byly použity výše uvedené TLC hliníkové folie Silikagel 60 (bez fluorescenčního indikátoru) s tloušťkou vrstvy 0,2 mm a o rozměrech 20×20 cm značky Merck a TLC hliníkové folie Silikagel 60 (s fluorescenčním indikátorem) s tloušťkou vrstvy 0,2 mm a o rozměrech 20×20 cm značky Merck.

Bylo postupováno dle Českého lékopisu 2009, dle článku Zingiberis rhizoma (zázvorový oddenek) – Zkoušky totožnosti [12]. Lékopis pracuje s 1,0 g upráškované drogy [12]. Protože analyzovaným vzorkem byl zázvorníkový extrakt, bylo pracováno pouze s 0,1 g extraktu. Extrakt analyzovaného vzorku byl vytvořen extrakcí v poměru 10:1 (poměr drogy k získanému extraktu), proto bylo předpokládáno, že ve vzorku je 10× více obsahových látek než v původní droze. Proto bylo pracováno s množstvím 10× menším. 60

Rozpouštědlem pro analyzovaný vzorek byl zvolen ethanol místo methanolu R, protože vzorek byl získán extrakcí ethanolem. Při detekci se postřik neprovedl roztokem vanilinu v kyselině sírové R tak, jak udává lékopis [12], ale byla použita směs kyseliny chloristé, vanilinu a kyseliny sírové. Pokud by pro postřik byla použita pouze kyselina sírová R, deska by zčernala po vystavení vysoké teplotě v sušárně. V případě detekce došlo tedy k odchýlení od Českého lékopisu 2009, kde se jevila vhodnější právě směs kyseliny dusičné, vanilinu a kyseliny sírové. Český lékopis užívá citral a roztok resorcinolu jako porovnávací roztok [12], přestože např. 6-gingerol je na trhu běžně k dostání a bylo by možné jej použít jako standard. Je otázkou, zda nehraje roli příliš vysoká cena gingerolu. Vyvíjecí soustava, složená z etheru a n-hexanu v poměru 6:4, vyhovovala, docházelo k dobrému oddělení jednotlivých skvrn, proto byla zachována a byla používána ve všech „Pokusech“.

Při experimentech bylo pracováno i s vodným extraktem z oddenku zázvorníku. Tento vzorek byl použit pouze při kvalitativních hodnoceních, ne při kvantitě. Byl porovnáván ethanolový extrakt analyzovaného vzorku s tímto vodným extraktem zázvorníku. Protože bylo použito jiné rozpouštědlo k extrakci, dá se předpokládat, že i spektrum obsahových látek ve vodném roztoku zázvorníku bude odlišné od spektra obsahových látek ethanolového extraktu analyzovaného vzorku. Výsledky chromatografií slouží pouze pro demonstraci tohoto a ke vzájemnému srovnání obou extraktů.

V „Pokusu č. 7“ byla provedena tenkovrstvá chromatografie roztoků zkoušeného vzorku v různých koncentracích rozpouštědla. Cílem měření bylo zjistit, jaká koncentrace methanolu jako rozpouštědla bude pro analyzovaný vzorek nejvhodnější. Zjistilo se, že nejintenzivněji zbarvené skvrny na chromatogramu, tudíž patrně i největší podíl obsahových látek je u roztoku vzorku v 30% methanolu (Obr. 13: Schéma chromatogramu č. 7). I když skvrny u roztoku vzorku v 80% methanolu byly jen o něco méně intenzivněji zbarvené, přesto může být vzorek analyzován v 30% i 80% methanolu. Důležité je, že i když byly použity odlišné koncentrace methanolu jako rozpouštědla, skvrny u jednotlivých vzorků byly identické, tzn. nestalo se, že by určitá koncentrace methanolu způsobila, že by na chromatografické desce byla skvrna navíc, nebo chyběla.

61

80% methanol obsahuje větší množství alkoholu, proto je také vhodnější k dělení jednotlivých látek pro HPLC. Protože nebyl markantní rozdíl mezi vzorky v 30% a 80% methanolu, bylo pracováno s 80% methanolem. Vodný extrakt zázvorníku vykazoval nejlepší výsledky v 80% methanolu. Aby výsledky byly vzájemně srovnatelné, byl i pro analyzovaný vzorek použit 80% methanol jako rozpouštědlo.

Kurkuminoidy jsou látky, které jsou typické pro čeleď zingiberaceae, vykazují významný antioxidační, cholagogenní a choleretický účinek [3]. Bylo proto zkoušeno, zda se vyskytují i v analyzovaném vzorku a tedy i v zástupcích rodu Zingiber. Výsledkem bylo, že tyto látky nejsou obsaženy ve zkoušeném vzorku (Obr. 10: Schéma chromatogramu č. 4., obr. 12: Schéma chromatogramu č. 6).

V „Pokusu č. 1“ byl analyzovaný vzorek nanesen v příliš nízké koncentraci, proto se na chromatogramu neobjevily žádné skvrny (Obr. 7: Schéma chromatogramu č. 1). V následujícím pokuse byl proto analyzovaný vzorek nanesen ve větší koncentraci a tenkovrstvá chromatografie byla opakována.

6.3 KAPALINOVÁ CHROMATOGRAFIE (HPLC) A UV / VIS SPEKTROSKOPIE Pro stanovení obsahu látek ve vzorku nebylo možno použít Český lékopis 2009. Lékopis pracuje pouze se stanovením silice, ne jednotlivých obsahových látek, přestože je droga oficinální. Kapalinová chromatografie byla provedena dle Amerického lékopisu, kapitola Zingiber officinale [33]. Zvolená soustava vyhovovala, nedošlo proto k žádným změnám či úpravám, a bylo postupováno přesně tak, jak je v Americkém lékopisu uvedeno. Důkazem toho, že byla soustava vhodně zvolena, je kalibrační křivka 6-gingerolu, která je uvedena v „Pokuse č. 12“ (Obr. 18: Kalibrační křivka 6-gingerolu). Kalibrační křivka vykazovala lineární závislost, což znamená, že se zvyšující se koncentrací se zvětšuje plocha peaků. Díky tomu, že závislost byla lineární, bylo možno soustavu použít pro měření analyzovaného vzorku. Linearitu křivky dokazuje korelační koeficient R = 0,99998. Hodnota +1 korelačního koeficientu značí zcela přímou závislost. 62

Pomocí kapalinové chromatografie byl změřen roztok standardu 6-gingerolu v koncentraci 1 mg/ml. Ze záznamu tohoto měření je patrné, že soustava látky dělí, peak 6-gingerolu je ostrý a oddělený od ostatních (Obr. 19: HPLC - 6-gingerol). I toto dokazuje vhodně zvolenou soustavu.

Obsah gingerolů v analyzovaném vzorku, při provedení HPLC, neodpovídal Analytickému protokolu. Analytický protokol udává, že množství gingerolů je 4 - 6 % [35], výsledek měření HPLC byl pouze 0,350 - 4,6 %, což ani řádově neodpovídá. Je to proto, že jako standard byl použit 6-gingerol, tedy pouze jedna látka ze skupiny gingerolů. Výsledek tedy udává obsah pouze 6-gingerolu. Je nutné stanovit množství gingerolů jako celek. Bylo proto naměřeno UV spektrum jednotlivých peaků ze záznamu HPLC analyzovaného vzorku. Z tvarů UV spekter jednotlivých látek je možno odhadnout, zda daná látka patří do skupiny gingerolů nebo ne. Spektrum 6-gingerolu má maxima peaků při vlnových délkách 207, 228 a 289 nm; minima jsou při vlnových délkách 219 a 266 nm.

Srovnáním hodnot maxim a minim jednotlivých peaků z analyzovaného vzorku spolu se standardem 6-gingerolem zjistíme, které peaky patří látkám, které jsou ze skupiny gingerolů a které peaky do této skupiny nepatří.

Porovnáním hodnot maxim a minim vzorků K1* a K2* v „Pokuse č. 14“ spolu s hodnotami maxim a minim standardu 6-gingerolu bylo zjištěno, že peak č. 1 ve vzorku K1* a peak č. 1 ve vzorku K2* nepatří látkám ze skupiny gingerolů. Velikost plochy těchto peaků tedy odečteme od celkové plochy všech peaků ve vzorku.

63

Vzorek K1* Číslo peaku 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 -

Retenční čas

Plocha peaku [mV.s]

2,127 45683,6796 2,993 514,4305 3,993 952,4151 4,700 89,0312 4,960 26,8166 5,847 1766,0029 6,187 692,3481 6,573 1854,3581 7,020 1738,1139 7,947 538,7614 11,080 71,9712 15,447 499,6275 Celkem 54427,556

Množství [%hm] 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,4609 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,4609

Vzorek K2* Číslo peaku 1 2 3 4 5 6 7 8 -

Retenční čas

Plocha peaku [mV.s]

3,233 10995,8611 3,593 4093,2913 5,673 3024,3340 6,120 943,8343 6,593 2242,7158 7,080 2772,3579 10,527 129,0879 12,487 540,5980 Celkem 24742,0416

Množství [%hm] 0,0000 0,0000 0,0000 0,3518 0,0000 0,0000 0,0000 0,0000 0,3518

Jednotlivé hodnoty (retenční čas, plochy peaků, množství látky) byly součástí záznamu HPLC jednotlivých vzorků.

64

Celkové množství gingerolů se získá výpočtem pomocí přímé úměry. K tomuto výpočtu je třeba znát plochu peaku patřící 6-gingerolu ve vzorku, procentuální zastoupení 6-gingerolu ve vzorku a celkovou plochu peaků všech gingerolů ve vzorku. Dále je nutné znát velikost plochy peaků látek, které nepatří do skupiny gingerolů. Tyto hodnoty odečteme od celkové plochy peaků a potom pomocí jednoduchého výpočtu se zjistí skutečné množství gingerolů ve vzorku.

VÝPOČET: Vzorek K1* Celková plocha gingerolů: 54427,5560 - 45683,6796 = 8743,8764 mV.s Plocha peaku 6-gingerolu: 692,3481 mV.s Množství 6-gingerolu ve vzorku: 0,4609 %

692,3481 mV.s …… 0,4609 % 8743,8764 mV.s …… X X= (8743,8764 * 0,4609) / 692,3481 X= 5,8208 %

Vzorek K2* Celková plocha gingerolů: 24742,0416 – 1095,8611 = 13746,1805 mV.s Plocha peaku 6-gingerolu: 943,8343 mV.s Množství 6-gingerolu ve vzorku: 0,3518 %

943,8343 mV.s …… 0,3518 % 13746,1805 mV.s …… X X= (13746,1805 * 0,3518) / 943,8343 X= 5,1237 %

Průměr: (5,8208 + 5,1237) : 2 = 5,47 %

65

Tímto výpočtem bylo zjištěno, že množství gingerolů ve vzorku K1* je 5,82 % a ve vzorku K2* je 5,12 %. Průměrné množství gingerolů ve vzorku je 5,47 %. Toto množství je v dobré shodě s údaji, které udává analytický protokol [35], který je uveden v příloze (Obr. 21: Analytický protokol).

6.4 ČERSTVÁ DROGA Při jednotlivých měřeních jsou použity extrakty z čerstvého oddenku zázvorníku. Stalo se tak proto, že analyzovaný vzorek – zázvorníkový extrakt v podobě prášku – prošel procesem zpracování a byl vyrobený již v červenci 2006 [35]. Proto bylo účelné zjistit, zda se gingeroly, látky které se stanovují v analyzovaném vzorku, vyskytují také v čerstvé droze. Tím, že byl extrakt z čerstvé drogy použit, bylo zjištěno, že gingeroly jsou běžnou součástí sekundárních metabolitů drogy. Důkazem toho je chromatogram č. 11 (Obr. 26: Chromatogram č. 11), který je uvedený v příloze, a schéma chromatogramu č. 11 (Obr. 17: Schéma chromatogramu č. 11). O obsahu gingerolů v čerstvé droze vypovídají i výsledky HPLC. V příloze je uveden záznam HPLC vzorku Č2 (Obr. 23: HPLC – vzorek Č2). Překvapivým zjištěním bylo množství vody, které obsahuje čerstvá droga. Ze zkoušky ztráta sušením bylo zjištěno, že čerstvá droga obsahuje více než 89 % vody.

66

7 ZÁVĚR Pomocí tenkovrstvé chromatografie bylo potvrzeno, že analyzovaný extrakt z rostliny Zingiber officinale Rosc. obsahuje gingeroly. Tenkovrstvá chromatografie byla provedena dle Českého lékopisu 2009 s menšími úpravami. Vyvíjecí soustavou byl ether/n-hexan v poměru 6:4, stacionární fází byl silikagel. Detekce byla provedena UV světlem a dále postřikem směsí kyseliny dusičné, vanilinu a kyseliny sírové. Tenkovrstvá chromatografie byla využita při kvalitativním měření. Kvantitativní stanovení gingerolů bylo provedeno pomocí kapalinové chromatografie dle Amerického lékopisu, za pomoci kalibrační křivky a standardu byl 6-gingerolu v koncentraci 1 mg/ml. Dále byla provedena UV-spektroskopie. Zjištěný obsah gingerolů byl 5,47 %. Tyto hodnoty odpovídají analytickému protokolu, který byl přiložen k analyzovanému vzorku.

Byly

zpracovány

literární

zdroje

a

odborné

články,

které

pojednávají

o Zingiber officinale. Byly uvedeny hlavní obsahové látky a významné farmakologické účinky.

67

8 LITERATURA [1]

HENDRYCH, R.: Systém a evoluce vyšších rostlin. 2. vyd. Praha, Stát. ped. nakl., 1986. 499 s.

[2]

www.biolib.cz, staženo 10. ledna 2010.

[3]

ANDO, V., et al.: Léčivé rostliny tradiční čínské medicíny. 1. vyd. Hradec Králové, Svítání, 1998. 321 s.

[4]

POLUNIN, M., ROBBINS, CH.: Léčiva z přírody. 1. vyd. Bratislava, Gemini, 1994. 144 s.

[5]

ALBERTS, A., MULLEN, P.: Přírodní afrodiziaka. 1. vyd. Praha, Svojtka & Co., 2004. 269 s.

[6]

HEIDBÖHMER, E.: Zázračný kořen. Praha, Brána, 2007. 136 s.

[7]

HUGHES, J.: Velká obrazová všeobecná encyklopedie. 1. vyd. Praha, Svojtka & Co., 1999. 792 s.

[8]

MATHIOLI, P. O.: Mathioli-herbář neboli bylinář. Olomouc, Fontána, 1999. 450 s.

[9]

VALÍČEK, P., KOKOŠKA, L., HOLUBOVÁ, K.: Léčivé rostliny třetího tisíciletí. Benešov, Start, 2001. 175 s.

[10] WOLF, A., HRUBÝ, S., HÁJEK, M.: Elixíry života: Povzbuzující a posilující látky. Praha, Pragma, 1997. 306 s. [11] KYBAL, J., KAPLICKÁ, J.: Naše a cizí koření. 1. vyd. Praha, Stát. zeměď. nakl., 1988. 225 s. [12] Český lékopis 2009 (ČL 2002). Praha, Grada, 2009. [13] WHO monographs on selected medicinbal plants. Vol. 1. Geneva, World Health Organisation, 1999. [14] RAI, S., KAKALI, M., MAL, M., et al.: Determination of 6-gingerol in ginger (Zingiber officinale) using hing-performance thin-layer chromatography. J. Sep. Sci., 2006. 29 (15): 2292-2295. [15] TAO, Y., LI, W., LIANG, W., et al.: Identification and quantification of gingerols and related compounds in ginger dietary supplements using high-performance liquid chromatography-tandem mass spektrometry. J. Agric. Food Chem., 2009. 57 (21): 10014-10021. [16] NATURAL REMEDIES – RESEARCH CENTRE: Zingiber officinale: The Master dokument. www.allianceingredients.com/pdfdocs/ZINGIBER_OFFICINALE.PDF, staženo 11. listopadu 2009.

68

[17] BADRELDIN, H. A., GERALD, B., MUSBAH, O. T., et al.: Some phytochemical and toxicological properties of ginger (Zingiber officinale Roscoe): A review of recent research. Food Chem. Toxicol., 2008, 46 (2): 409-420. [18] Adverse Effects of Herbal Drugs. Vol. 3. Berlin Heidelberg, Springer-Verlag, 1997. [19] NEWALL, C. A., ANDERSON, L. A., PHILLIPSON, J. D.: Herbal Medicines: A Guide for Health-care Professional. London, The Pharmaceutical Press, 1996. [20] NICOLL, R., HENEIN, M. Y.: Ginger (Zingiber officinale Roscoe): A hot remedy for cardiovascular disease?. Int. J. Cardiol., 2009. 131 (3): 408-409. [21] FUNK, J. L., FRYE, J. B., OYARZO, J. N., et al.: Comparative effects of two gingerolcontaining Zingiber officinale extracts on experimental rheumatoid arthritis. J. Nat. Prod., 2009. 72 (3): 403-407. [22] ALTMAN, R. D., MARCUSSEN, K. C.: Effects of a ginger extrakt on knee pain in patiens with osteoarthritis. Arthritis Rheum., 2001. 44 (11): 2531-2538. [23] HICKOK, J. T., ROSCOE, J. A., MORROW, G. R., et al.: A Phase II/III randomized, placebo-controlled, double-blind clinical trial of ginger (Zingiber officinale) for nausea cause by chemotherapy for cancer: A Currently accruing URCC CCOP cancer control study. Support Cancer Ther., 2007. 4 (4): 247-50. [24] BEN-ARYE, E., OREN, A., BEN-ARIE, A.: Herbal medicine in womens´life cycle. Harefuah, 2006. 145 (10): 738-42, 782. [25] PORTNOI, G., CHNG, L. A., KARIMI-TABESH, L., et al.: Prospective comparative study of the safery and effectiveness of ginger for the treatment of nausea and vomiting in pregnancy. Am. J. Obstet. Gynecol., 2003. 189 (5): 1374-7. [26] MINAIYAN, M., GHANNADI, A., KARIMAZADEH, A.: Anti-ulcerogenic effect of ginger (rhizome of Zingiber officinale Roscoe) on cysteine induced duodena ulcer in rats. Daru, 2006. 14 (2): 97-101. [27] DASWANI, P. G., BRIJESH, S., TETALI, P., et al.: Antidiarrhoeal activity of Zingiber officinale (Rosc.). Curr. Sci., 2010. 98 (2): 222-229. [28] MASUDA, Y., KIKUZAKI, H., HISAMOTO, M., et al.: Antioxidant properties of gingerol related compounds from ginger. Biofactors, 2004. 21 (1-4): 293-6. [29] ATAI, Z., ATAPOUR, M., MOHSENI, M.: Inhibitory effect of ginger extrakt on candida albicans. Am. J. Appl. Sci., 2009. 6 (6): 1067-1069. [30] DEYER, C. V., JACKSON, P., LOAKES, D. M.: Isolation of antirhinoviral sesquiterpenes from ginger (Zingiber officinale). J. Nat. Prod., 1994. 57 (5): 658-662. [31] www.phoenix.cz, staženo 10. ledna 2010. 69

[32] Souhrn SPC: Klosterfrau Melisana Koncentrát, AISLP WIN ČR. [33] United States Pharmacopoeia – National Formulary, Suplement 7, USPC, Maryland, 1996. [34] www.bayer-leky.cz/bayer/products/melisana/index.asp, staženo 10. ledna 2010. [35] Analytický protokol. Zingiber officinale Rosc. XI´AN TIANXINGJIAN PAHRMCHEM ENTERPRISES CO., LTD., 2006.

70

9 PŘÍLOHY

Obrázek 21: Analytický protokol

71

Obrázek 22: HPLC - vzorek K1

Obrázek 23: HPLC - vzorek Č2

72

Obrázek 24: HPLC - vzorek K2*

Obrázek 25: HPLC - vzorek Č2*

73

Obrázek 26: Chromatogram č. 11

74

Obrázek 27: Záznam UV spektra 6-gingerolu

75

Obrázek 28: Záznam UV spektra vzorku K1*

76

10 ABSTRAKT

ABSTRAKT Zárubová, K.: Analýza zázvorového extraktu. II. [Diplomová práce] Hradec Králové 2010, Univerzita Karlova v Praze, Farmaceutická fakulta.

Cílem práce bylo ověření deklarované kvality komerčně dodávaného suchého zázvorového extraktu. Jeho standardnost je podmínkou pro jeho testování v plánovaných preklinických pokusech. Byl analyzován ethanolový extrakt z rostliny Zingiber officinale Rosc. Ke kvalitativnímu zhodnocení byla použita metoda tenkovrstvé chromatografie. Vyvíjecí soustava byla směs etheru a n-hexanu v poměru 6:4, adsobent silikagel, detekce byla provedena postřikem roztokem 1% vanilinu v kyselině chloristé a kyselině sírové 6N. Standardem byl 6-gingerol. Bylo potvrzeno, že analyzovaný vzorek obsahuje gingeroly. Byla provedena kapalinová chromatografie ke kvantitativnímu zhodnocení extraktu. Mobilní fází byla směs acetonitrilu, vody (okyselená 1 ml kyseliny fosforečné v 1000 ml vody) a methanolu v poměru 55:44:1, kolona Merck, Purospher RP-18 endcapped, 5 mm, 250×4 mm. Průtoková rychlost mobilní fáze byla 1,0 ml/min, nástřik 20 ml, UV / VIS detekce při 282 nm. Standardem byl 6-gingerol v koncentraci 1 mg / 1 ml. Bylo stanoveno 5,47 % gingerolů.

77

11 ABSTRACT

ABSTRACT Zárubová, K.: Analysis of ginger extrakt. II. [Thesis] Hradec Králové 2010, Charles University in Prague, Faculty of Pharmacy.

The main goal of this work was verification of the declared quality of commercially available dry ginger extract. Having a standard sample is a necessary requirement for its testing in planned preclinical trials. Ethanol extract of the plant Zingiber officinale Rosc. was analyzed. For qualitative evaluation was used TLC method. Elution system was a mixture of ether and n-hexane in the ratio 6 : 4, an adsorbent was silicagel, detection was performed by spraying with solution of 1% vanillin in perchloric acid and sulfuric acid 6N. 6-gingerol was used as a standard. It was confirmed that the analyzed sample contains gingerols. Liquid chromatography for the quantitative evaluation of the extract was performed. The mobile phase was a mixture of acetonitrile and water (acidified with 1 ml of phosphoric acid in 1000 ml of water) and methanol in the ratio 55:44:1, column was Merck Purospher RP-18 endcapped, 5 µm, 250×4 mm. Flow rate of mobile phase was 1.0 ml / min, inject volume 20 µ l, UV / VIS detection at 282 nm. As a standard was used 6-gingerol in a concentration of 1 mg / 1 ml.There was determined 5,47 % of gingerols.

78

Analýza zázvorového extraktu II

Recommend Documents