UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ VLIV EXTRAKTU Z BRUSINEK A OBEZITY NA ANTIOXIDAČNÍ ENZYMY U MYŠÍ IN VIVO

UNIVERZITA KARLOVA V PRAZE FARMACEUTICKÁ FAKULTA V HRADCI KRÁLOVÉ Katedra biochemických věd

VLIV EXTRAKTU Z BRUSINEK A OBEZITY NA ANTIOXIDAČNÍ ENZYMY U MYŠÍ IN VIVO Diplomová práce

Vedoucí diplomové práce: PharmDr. Hana Bártíková, PhD. Hradec Králové 2014

Lucie Vášková

„Prohlašuji, ţe tato práce je mým původním autorským dílem. Veškerá literatura a další zdroje, z nichţ jsem čerpala, jsou uvedeny v seznamu pouţité literatury a v práci řádně citovány. Práce nebyla vyuţita k získání jiného nebo stejného titulu.“

...................................

PODĚKOVÁNÍ Děkuji své školitelce PharmDr. Haně Bártíkové, PhD. za odborné vedení, trpělivost, cenné rady a pomoc při vypracování mé diplomové práce. Dále děkuji pracovníkům Katedry biochemických věd za příjemné pracovní prostředí.

ABSTRAKT Univerzita Karlova v Praze Farmaceutická fakulta v Hradci Králové Katedra biochemických věd Kandidát: Lucie Vášková Školitel: PharmDr. Hana Bártíková, PhD. Název diplomové práce: Vliv extraktu z brusinek a obezity na antioxidační enzymy u myší in vivo Obezita je v současné době celosvětovým problémem, který ohroţuje zdraví milionů jedinců. Obezitu charakterizujeme jako nadměrné zvýšení obsahu tukové tkáně v organismu. Zvýšená masa adipocytů produkuje pro tělo škodlivé oxidované LDL částice, které poškozují tkáně organismu. Plody Vaccinium macrocarpon obsahují řadu přírodních látek. Prokázaný účinek brusinek zahrnuje antibakteriální působení na infekce močových cest, antiaterogenní působení v kardiovaskulárním systému, antikancerózní, antiulcerózní efekt a působí téţ proti rozvoji obezity. Většina těchto účinků je z velké části dána antioxidačním působením obsahových látek, především anthokyanidinů. V nedávné době velmi vzrostla popularita potravních doplňků s obsahem brusinek, které jsou uţívané často jako náhrada pestré stravy či k redukci hmotnosti. Prvním úkolem mé práce bylo stanovit vliv obezity na vybrané antioxidační enzymy u myší in vivo. Myším určeným k výzkumu byla uměle navozena obezita glutamátem sodným. Druhým cílem mé práce bylo porovnat vliv extraktu z brusinek na stejné antioxidační enzymy u myší in vivo u normálních a obézních myší. Zvýšení antioxidační aktivity enzymů vlivem brusinek bylo prokázáno u normálních myší u glutathion-S-reduktasy v játrech, u NADPH:chinonoxidoreduktasy v tenkém střevě, u obézních myší se aktivita zvýšila u peroxidasy v tenkém střevě. Zvýšené hodnoty aktivit vybraných enzymů vlivem obezity byly prokázány u enzymů glutathionreduktasy,

NADPH:

chinonoxidoreduktasy,

peroxidasy

a thioredoxinreduktasy. U ostatních testovaných vzorků došlo ke sníţení aktivity enzymů, nebo extrakt z brusinek či obezita neměly ţádný vliv na jejich aktivitu.

ABSTRACT Charles University in Prague Faculty of Pharmacy in Hradec Králové Department of Biochemical Sciences Candidate: Lucie Vášková Supervisor: PharmDr. Hana Bártíková, PhD. Title of diploma thesis: The impact of cranberry extract and obesity on antioxidant enzymes in mice in vivo

The obesity is the worldwide problem nowadays which threatens health of millions of people. The obesity is characterized as an excessive increase in the content of body adipose tissue. Increased quantity of adipocytes produces oxidized LDL particles which are deleterious for the body and damage the tissue of the organism. Fruit of Vaccinium macrocarpon contains range of natural substances. Proven effects of cranberries include action on the urinary tract infections, anti-atherogenic effects in the cardiovascular system, anticancer, antiulcer effect and also acts againts the development of the obesity. Most of these effects are largely determined by antioxidant actions of contained substances, particularly anthocyanidins. Recently, the nutritional supplements containing cranberries which are used frequently as a substitute for a varied diet or weight reduction have became very popular. The first aim of my study was to determine the influence of obesity on selected antioxidant enzymes of mice in vivo. Obesity by monosodium glutamate was artifically induced in mice destined for research. The second objective of the study was to compare the effect of cranberries extract on the same antioxidant enzymes in normal and obese mice in vivo. Increased antioxidant enzymes activity due to the consumption of cranberries was demonstrated in normal mice for glutathione-S-reductase in the liver and NADPH:quinoneoxidoreductase in the small intestine; the elevated activity for peroxidase in the small intestine was observed in obese mice. Increased values in activity of selected enzymes due to the obesity were found for enzymes glutathione reductase, NADPH: quinoneoxidoreductase, peroxidase and thioredoxinreductase. In other tested samples, reduction or no effect of cranberries extract or obesity on enzymatic activity were observed. .

OBSAH 1. ÚVOD ................................................................................................................................ 9 2. OBEZITA ........................................................................................................................10 2.1. Charakteristika a faktory ovlivňující obezitu ............................................................................. 10 2.2. Tuková tkáň................................................................................................................................. 10 2.3. Hormony tukové tkáně ................................................................................................................ 10 2.3.1. Leptin ................................................................................................................................... 11 2.3.2. Adiponektin .......................................................................................................................... 11 2.4. Modely obezity užívané ve výzkumu ........................................................................................... 12 2.4.1. Model navození obezity pomocí MSG ................................................................................... 12 2.4.2. Model navození obezity mutací leptinu .................................................................................. 13 2.4.2.1. Mutace v signální dráze pro leptin ................................................................................. 13 2.4.2.2. Mutace receptoru pro leptin ........................................................................................... 13 2.4.3. Model obezity indukované dietou (DIO) ................................................................................ 13

3. BRUSINKY......................................................................................................................14 3.1. Anthokyanidiny ........................................................................................................................... 15 3.2. Proanthokyanidiny ...................................................................................................................... 16 3.2.1. Proanthokyanidin typ A ......................................................................................................... 17

4. ANTIOXIDAČNÍ LÁTKY ...............................................................................................18 4.1. Volné radikály ............................................................................................................................. 18 4.2. Antioxidanty ................................................................................................................................ 19 4.3. Antioxidační enzymy ................................................................................................................... 19 4.3.1. Katalasa (CAT), EC 1.11.1.6 ................................................................................................ 19 4.3.1.1. Charakteristika CAT ..................................................................................................... 19 4.3.1.2. Princip působení CAT v organismu ............................................................................... 19 4.3.2. Glutathionreduktasa (GR), EC 1.8.1.7. ................................................................................... 20 4.3.2.1. Charakteristika GR........................................................................................................ 20 4.3.2.2. Princip působení GR v organismu ................................................................................. 20 4.3.3. Glutathion-S-tranferasa (GST), EC 2.5.1.18. .......................................................................... 20 4.3.3.1. Charakteristika GST...................................................................................................... 20 4.3.3.2. Princip působení GST v organismu ............................................................................... 21 4.3.4. NAD(P)H:chinonoxidoreduktasa (NQO1), EC 1.6.5.2. .......................................................... 21 4.3.4.1. Charakteristika NQO1 ................................................................................................... 21 4.3.4.2. Princip působení NQO1 v organismu ............................................................................ 21 4.3.5. Peroxidasa (Px), EC 1.11.1.7. ................................................................................................ 22 4.3.5.1. Charakteristika Px ......................................................................................................... 22 4.3.5.2. Princip působení Px v organismu................................................................................... 22 4.3.6. Superoxiddismutasa (SOD), EC 1.15.1.1. .............................................................................. 23 4.3.6.1. Charakteristika SOD ..................................................................................................... 23

6

4.3.6.2. Princip působení SOD v organismu ............................................................................... 23 4.3.7. Thioredoxinreduktasa (TrxR), EC 1.8.1.9. ............................................................................. 24 4.3.7.1. Charakteristika TrxR ..................................................................................................... 24 4.3.7.2. Princip působení ........................................................................................................... 25

5. CÍL PRÁCE ......................................................................................................................26 6. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ............................................................................................27 6.1. Použité přístroje .......................................................................................................................... 27 6.2. Použité chemikálie ....................................................................................................................... 27 6.3. Pracovní postup ........................................................................................................................... 28 6.3.1. Navození obezity u NMRI myší glutamátem sodným ............................................................. 28 6.3.2. Příprava subcelulárních frakcí ............................................................................................... 29 6.3.3. BCA stanovení bílkoviny ...................................................................................................... 29 6.3.4. Elektroforéza proteinů na polyakrylamidovém gelu, imunoblotting, detekce proteinů ............. 31 6.3.4.1. Zásobní roztoky a pufry ................................................................................................ 31 6.3.4.2. Příprava gelu................................................................................................................. 33 6.3.4.3. Elektroforéza ................................................................................................................ 34 6.3.4.4. Imunoblotting ............................................................................................................... 34 6.3.4.5. Detekce proteinů ........................................................................................................... 34 6.3.4.6. Chemiluminiscenční detekce a vyhodnocení exprese proteinů ........................................ 35 6.3.5. Stanovení aktivity antioxidačních enzymů ............................................................................. 36 6.3.5.1. CAT ............................................................................................................................. 36 6.3.5.2. GR................................................................................................................................ 37 6.3.5.3. GST .............................................................................................................................. 39 6.3.5.4. NQO1 ........................................................................................................................... 41 6.3.5.5. Px ................................................................................................................................. 43 6.3.5.6. SOD ............................................................................................................................. 44 6.3.5.7. TrxR ............................................................................................................................. 47

7. VÝSLEDKY .....................................................................................................................49 7.1. Stanovení obsahu bílkoviny ......................................................................................................... 49 7.2. Aktivita CAT ............................................................................................................................... 50 7.3. Aktivita GR ................................................................................................................................. 52 7.4. Aktivita GST................................................................................................................................ 53 7.5. Aktivita NQO1............................................................................................................................. 55 7.6. Aktivita Px ................................................................................................................................... 56 7.7. Aktivita SOD ............................................................................................................................... 58 7.8. Aktivita TrxR .............................................................................................................................. 59 7.9. Exprese proteinu enzymů GST a NQO1 ..................................................................................... 61

8. DISKUZE .........................................................................................................................64 9. ZÁVĚR .............................................................................................................................70 7

10. SEZNAM OBRÁZKŮ ...................................................................................................71 11. SEZNAM ROVNIC .......................................................................................................72 12. SEZNAM TABULEK ....................................................................................................72 13. SEZNAM ZKRATEK ....................................................................................................73 14. POUŽITÁ LITERATURA............................................................................................75

8

1. Úvod Slovo obezita vychází z latinského slova obesus, jenţ v překladu znamená dobře ţivený, stavěný a tučný. Obezita znamená nadměrné nakupení tukové tkáně v organismu, nikoliv však zvýšenou hmotnost (Pastucha 2011). Příčinami obezity mohou být vlivy genetické, ale v současné době převaţují vnější vlivy vycházející z prostředí, kde jedinec ţije. Obezita je rizikovým faktorem pro mnoho dalších onemocnění. Zvýšený obsah tukové tkáně v organismu přispívá ke zvýšení hladin oxidovaných LDL částic a triacylglycerolů a ke sníţení protektivního HDL-cholesterolu. Zde se ukazuje rozdíl mezi lidskou populací a zvířaty. U zvířat volně ţijících se obezita přirozeně nevyskytuje, proto je nutné ji uměle indukovat pro výzkumné účely (Pastucha 2011, Svačina 2013). Cílem mé práce, jeţ je součástí grantu financovaného Grantovou agenturou České republiky (P303/12/G163), bylo zjistit vliv obezity na vybrané antioxidační enzymy u myší in vivo, u nichţ byla uměle indukovaná obezita glutamátem sodným. Dalším cílem této diplomové práce bylo stanovit vliv brusinek na aktivitu antioxidačních enzymů u normálních i obézních jedinců myší. Vliv brusinek jakoţto významných antioxidantů byl prokázán ve studiích in vitro. Brusinky obsahují antioxidační látky, které mají v organismu řadu důleţitých funkcí. Anthokyanidiny, obsahové látky brusinek, fungují jako látky vychytávající volné radikály vznikající v metabolismu a brání tím poškození buněčných membrán způsobeným oxidací tuků. V současné době se uznává, ţe reaktivní formy kyslíku jsou příčinami vzniku zánětu, aterosklerózy a také rakovinného bujení. Studie s anthokyanidiny prokazují jejich antioxidační potenciál, který se podílí na deaktivaci vzniklých reaktivních forem kyslíku (Havlík a Marounek 2012).

9

2. Obezita 2.1. Charakteristika a faktory ovlivňující obezitu Obezitu můţeme definovat jako abnormální a nadměrné hromadění tuku (Pastucha 2011) nebo jako zmnoţení tukové tkáně nad normu, která je dána pro kaţdého jedince jeho pohlavím, věkem a rasou. Podstatou obezity je jednak hyperplazie, ale i hypertrofie adipocytů tukové tkáně (Owen 2012). Na vzniku obezity se podílí několik základních faktorů. Energetický příjem je častěji vyšší neţ výdej. Schopnost jinak metabolizovat především z důvodu různého genetického základu, okolního prostředí, kulturního klimatu, ale i socioekonomického statusu ovlivňuje kaţdého jedince. Dietní zvyklosti, zejména příjem tuku, mírný příjem alkoholu a nízká fyzická aktivita mají značný vliv, zvyšují prevalenci obezity. Naopak kouření zvyšuje klidový energetický výdej a hmotnost tedy nestoupá (Svačina 2013).

2.2. Tuková tkáň Tuková tkáň je derivátem mezodermu a zakládá se v období kolem porodu. Buňky tukové tkáně se diferencují z adipoblastu, následně proliferují a dalším vývojem vznikají preadipocyty, předchůdci adipocytů. Tuková tkáň je tvořena bílou a hnědou hmotou. Hnědý tuk se v lidském organismu vyskytuje během začátku ţivota, poté mizí a občas se vyskytují pouze kapénky hnědého tuku v tuku bílém. U zvířat tvoří hnědý tuk samostatné orgány a zůstává zachován během ţivota. Bílá tuková tkáň se u myší tvoří aţ po porodu (Hainer 2004). Funkcí tukové tkáně je tvořit a udrţovat energetickou rezervu. Tuková tkáň obsahuje především triacylglyceroly (TAG), které jsou štěpeny na volné mastné kyseliny a glycerol. Další významnou funkcí je úloha termoregulační a mechanická. U obézních je tuková tkáň typicky zánětlivě infiltrována krevními elementy. Tuková tkáň tak plní úlohu imunologickou, neboť secernuje protizánětlivé adipokiny a interleukiny. Tuková tkáň má řadu pozitivních a negativních funkcí (Svačina 2013).

2.3. Hormony tukové tkáně Hormony tukové tkáně můţeme rozdělit na pravé adipokiny a adipokiny v širším smyslu. Mezi pravé adipokiny sekretované převáţně, či jenom tukovou tkání řadíme např.

leptin,

adipsin,

rezistin,

interleukin

10

6,

tumor

nekrotizující

faktor

α

(TNF-α). K adipokinům v širším smyslu patří např. C-reaktivní protein, monocyty chemoatrahující protein, sérový amyloid A a další (Svačina 2013). 2.3.1. Leptin Klíčovým hormonem bílé tukové tkáně je leptin. Proteohormon tvořený 167 aminokyselinami je produktem tzv. ob genu. Je exprimován pouze adipocyty více v abdominální tukové tkáni neţ subkutánní. Leptin jde z tukové tkáně do krve, následně putuje do místa působení, kde je vázán přes leptinový receptor v hypotalamu. Hladina leptinu informuje o stavu tukových zásob na periferii organismu (Drbalová 1998), ovlivňuje energetickou rovnováhu zvýšením energetického výdeje přes aktivaci sympatického nervového systému a má inhibiční vliv na příjem další potravy (Hainer 2004). Sekrece leptinu je variabilní během dne, u myší dochází ke vzestupu hladiny v noci a naopak ke sníţení během odpoledne, odchylky dosahují rozdílu aţ 30 – 40 %. Hladina leptinu koreluje pozitivně s aktuálním stavem tukových buněk a negativně s energetickým výdejem. Hladinu leptinu jde uměle indukovat podáním inzulinu, tedy společně s vysokou hladinou leptinu dochází v organismu k hyperinzulinémii. Sníţenou hladinu leptinu lze navodit podáním noradrenalinu (Svačina 2013). Leptinový receptor je v centrální nervové soustavě vázán negativní vazbou s neropeptidem Y, který způsobí na periferii vzestup chuti k jídlu a pokles energetického výdeje (Drbalová 1998). 2.3.2. Adiponektin Adiponektin je hormon tukové tkáně, monomerní protein o hmotnosti 30 kDa, který je produkován adipocyty v bílé tukové tkáni, v menší míře i svalovou tkání a následně uvolňován do krevní cirkulace v poměrně vysokých koncentracích. Bývá označován také jako AdipoQ, ACRP30 nebo GBP28 (Novotný a kol. 2008). Adiponektin působí přes specifické receptory, známé jsou 2 formy – AdipoR1 a AdipoR2 (Housová a kol. 2005). V endoteliálních buňkách adiponektin tlumí produkci reaktivních forem kyslíku (ROS). Adiponektin inhibuje transformaci makrofágů na pěnové buňky, redukuje v nich intracelulární obsah cholesterolu. V těchto buňkách také redukuje adiponektin produkci TNF-α, která byla stimulována lipopolysacharidy. Současné klinické studie ukazují

11

pozitivní korelaci plasmatických hladin adiponektinu a interleukinu 10. Tyto poznatky ukazují adiponektin jako antiaterogenní činitel organismu (Novotný a kol. 2008). V experimentálních studiích bylo prokázáno, ţe sérová hladina adiponektinu negativně koreluje s obsahem viscerálního tuku v organismu, u pacientů s diabetem 2. typu a inzulínovou rezistencí, s aterosklerotickými a zánětlivými markery. Naopak pozitivní zvýšení plasmatické hladiny je zajištěno se stoupající hladinou HDL cholesterolu (Novotný a kol. 2008).

2.4. Modely obezity užívané ve výzkumu Pro studium obezity ve výzkumu je uţíváno velké mnoţství různých zvířecích modelů. Výskyt obezity stoupá po celém světě, a proto je nutné, aby zvířecí modely velmi dobře charakterizovaly lidskou obezitu a byly přínosem v pátrání po nových moţnostech prevence a léčby. Většina zvířecích modelů jsou drobní hlodavci (potkani, myši). Současné přístupy výzkumu jsou velmi moderní díky vyuţití molekulární genetiky (Lutz a Woods 2012). 2.4.1. Model navození obezity pomocí MSG MSG model je zvířecí model, kde neonatální myši nebo potkani jsou injektováni MSG do hypotalamu v krátkém časovém úseku. Tato technika poškozuje metabolismus monoaminů v mozku a zapříčiňuje zvýšený příjem potravy a v důsledku navození obezity. Tento model pouţívaný pro studium obezity má výrazně zvýšenou hladinu leptinu (hyperleptinémie) a inzulinu (hyperinzulinémie). Tukové zásoby jsou zvýšené především v oblasti podkoţní, abdominální a gonadální. Celková hmotnost zvířete bývá pouze nepatrně zvýšena (Lutz a Woods 2012, Matyšková a kol. 2008). Obrázek 1 ukazuje mládě myši pár dní po porodu, skupinu normálních myší a jednoho jedince, jehoţ obezita byla navozena MSG.

Obrázek 1 Myši – narození, normální a obézní jedinci (vlastní zdroj) 12

2.4.2. Model navození obezity mutací leptinu Jako model slouţí zvířata, která postrádají produkci leptinu a / nebo, která jsou necitlivá na leptin v důsledku mutací receptoru pro leptin nebo v důsledku extrémní rezistence na leptin. Mutace jsou spontánní, nebo geneticky upravené (Lutz a Woods 2012). 2.4.2.1. Mutace v signální dráze pro leptin Spontánní mutace v signální dráze pro leptin brání sekreci leptinu, neboť jeho syntéza je ukončena předčasně. Nedostatečné mnoţství leptinu v organismu vede k výrazně obéznímu fenotypu myši. Projevem je raný nástup obezity charakterizovaný hyperfágií, sníţeným energetickým výdejem, hypotermií, inzulinovou rezistencí a hyperglykémií (Lutz a Woods 2012). 2.4.2.2. Mutace receptoru pro leptin Spontánní mutace receptoru pro leptin je často generalizovanou dysfunkcí pro všechny leptinové receptory. Myši jsou fenotypově podobné předchozímu modelu (hyperfágie, sníţený energetický výdej, hypotermie a také neplodnost). Tento model je často uţíván ke studiu onemocnění diabetes mellitus 2. typu a podobných syndromů. Geneticky navozená mutace receptoru pro leptin je rozdílná od spontánní mutace v počtu dysfukčních receptorů (Lutz a Woods 2012).

2.4.3. Model obezity indukované dietou (DIO) Obezita je navozena na základě vysokoenergetického příjmu potravy. Některé kmeny DIO myší se stávávají obézními bez nutnosti vystavení vysokoenergetické stravě. Tento jev je častěji viditelný u samců neţ u samiček. Selektivně odchované DIO myši mají sníţenou produkci leptinu a zároveň jsou méně citlivé na působení exogenně dodávaného leptinu (Lutz a Woods 2012).

13

3. Brusinky Brusinky, lat. Vaccinium macrocarpon, jsou plodem brusnice velkoplodé. Brusinky jsou červené plody obsahující řadu přírodních antioxidantů, a to flavonoidy, třísloviny, vitamíny A, B a C, karotenoidy, organické kyseliny (skořicovou, citronovou a štavelovou), fruktózu a fenolové glykosidy, k nejznámějším patří arbutin. Důleţitou sloţku brusinek tvoří prvky jako draslík, vápník, hořčík, ţelezo, fosfor a sodík. Brusinky se vyuţívají především v potravinářském a farmaceutickém průmyslu (Sochorová a kol. 2012). Brusinky jsou často léčebně uţívané jako obrana před rozvojem bakteriálních infekcí močových cest, neboť upravují pH a proanthokyanidiny zabraňují uchycení fimbrie bakterie na stěnu močové trubice. Vyuţívají se také v prevenci nedostatku vitamínu C a nízké hladiny antioxidantů. Jejich konzumace téţ zajišťuje efekt antiulcerózní a antikancerózní (viz 3.2) (Dolejš a kol. 1991). Flavonoidy tvoří rozsahlou skupinu rostlinných fenolů. Dnes je známo více neţ čtyři tisíce flavonoidních látek. Základní strukturu tvoří flavanový skelet (sloţen ze dvou benzenových kruhů a kruhu odvozeného od 2H-pyranu) zobrazený na následujícím obrázku 2 (Velíšek 2002).

Obrázek 2 Základní skelet flavonoidů (Velíšek 2002)

14

Podle stupně oxidace na C3 rozeznáváme základní struktury flavonoidů, a to katechiny (flavan-3-oly), flavan-3,4-dioly, flavanoly, flavonoly, flavony, flavonony a anthokyanidiny. Některé flavonoidy jsou důleţité jako přírodní rostlinná barviva. Z barviv jsou významné převáţně červené, ale i fialové a modré pigmenty antokyany (Velíšek 2002). Významnou antioxidační kapacitu vykazují flavanoly vyskytující se ve formě monomerů

(katechin,

epikatechin),

dimerů

aţ

polymerů

(theaflaviny,

proanthokyanidiny), které jsou popsány dále (Higdon 2005).

3.1. Anthokyanidiny Anthokyany, téţ anthokyaniny, jsou nejrozšířenější skupinou rostlinných barviv. Anthokyany představují svojí chemickou strukturou deriváty 3-glykosidanthokyanidinů. Anthokyanidiny se vyskytují jako samostatné aglykony zřídka. V přírodě existuje přibliţně patnáct druhů různých anthokyanidinů, v potravě jich má význam však pouze šest, a to právě kyanidin, pelargonidin, peonidin, delfinidin, petunidin a malvidin. Glykosidická část je tvořena základními pěti sacharidy (D-glukosa, L-rhamnosa, D-galaktosa, D-xylosa a L-arabinosa). Cukerná část je vázána v poloze 3, v případě, ţe je vázána další cukerná část, potom se váţe do polohy 7, 3‘, 5‘ a 4‘ jako mono, di nebo trisacharid. Nejčastěji se vyskytujícími antokyanovými pigmenty jsou kyanidin-3-glykosidy ukázané na obrázku 3 (Velíšek 2002).

Obrázek 3 Kyanidin-3-O-ß-D-glukosid (Velíšek 2002)

15

Anthokyany jsou ve vodě rozpustné vakuolární pigmenty červené, fialové, či modré barvy v závisloti na pH. Rozdíl v chemické struktuře, ke kterému dochází v reakci na změny v pH, je důvodem, proč se antokyany často pouţívají jako indikátory pH, které se mění z červené barvy v kyselém prostředí na barvu modrou v prostředí zásaditém (Havlík a Marounek 2012). Anthokyany, látky bez chutě a zápachu, se vyskytují v tkáních květů, plodů, ale i listů, stonků a kořenů všech vyšších rostlin. Hlavní zdroje vyuţívané jako potraviny jsou hrozny vinné révy, jahody, ostruţiny, černý a červený rybíz, brusinky, borůvky, ředkvičky, červené zelí. Stabilita těchto sloučenin je poměrně nízká. Mezi hlavní faktory, které ji ovlivňují, patří struktura molekuly, přítomnost enzymů, pH prostředí, teplota, přítomnost kyslíku a působení záření (Velíšek 2002). Anthokyany absorbují světelné záření a chrání tak buňky před poškozením. Roli hrají také jako antioxidanty, nicméně není jasné, zdali anthokyaniny mohou významně přispět k vychytávání volných radikálů, které se tvoří v listech, neboť anthokyany a ROS jsou prostorově v buňce odděleny. Některé studie ale ukázaly, ţe peroxid vodíku je vyráběn také v jiných organelách, a proto můţe být neutralizován pomocí antokyanů (Karageorgou a Manetas 2006).

3.2. Proanthokyanidiny Proanthokyanidiny jsou látky přírodního původu, chemicky definované jako oligomerní sloučeniny, kondenzované taniny, či polymery derivátů flavan-3-olů. Taniny jsou hydroxylované sloučeniny, které mohou se sacharidy a proteiny tvořit nerozpustné komplexy (Fine 2000). V rostlinách se vyskytují od jednoduchých molekul aţ po sloţité molekuly sloţené z mnoha jednotek. Největší mnoţství proanthokyanidinů se nachází v semenech hroznů, v červeném víně, v dřevinách, brusinkách, borůvkách a šípku, ale také v čokoládových bobech, zeleném a černém čaji. Vykazují adstringentní účinky (U.S. Department of Agriculture 2004, Sterling 2000). Proanthokyanidiny fungují jako vynikající antioxidanty potlačující existenci volných radikálů, podporující a zesilující funkci jiných antioxidantů. Studie prováděné in vitro ukazují, ţe proanthokyanidiny obsaţené v brusinkách a borůvkách mají také antikancerogenní efekt. Protoanthokyanidiny neumoţňují růst nádoru tím, ţe zabraňují syntéze proteinů v nádorových buňkách a brání tak jejich mnoţení. Proanthokyanidiny 16

mohou také dle studií in vitro chránit organismus před nakaţením viry (U.S. Department of Agriculture 2004). Další studie in vitro prokazují, ţe vazoaktivní látky typu proanthokyanidinů obsaţené v červeném víně jsou spojeny se sníţením rizika ischemické choroby srdeční a sníţením celkové mortality. Tyto látky potlačují produkci proteinu endotelinu 1, který se podílí na zuţování cév (Sterling 2000). 3.2.1. Proanthokyanidin typ A Patrně

nejúčinnějším

antioxidantem

ze

skupiny

proanthokyanidinů

je

proanthokyanidin typu A. Jedná se o dimer epikatechinu (viz obrázek 4), který je vázán ve dvou místech, a to vazbami mezi C v polohách 2β → 7 a 4β → 8 (Dolejš a kol. 1991).

Obrázek 4 Proanthokyanidin typ A (Pascual-Teresa a kol. 2010)

17

4. Antioxidační látky Antioxidační

ochrana

organismu

se

vyznačuje

sloţitým

komplexem

mechanismů, které se vzájemně doplňují, podporují a jsou v rovnováze s prooxidačními účinky jiných látek. Antioxidační látky jsou popisovány jako ochranné látky organismu před molekulami volných radikálů vytvářených při normální látkové výměně. Molekuly volných radikálů vznikají v organismu jako produkt vedlejší látkové výměny, plní řadu důleţitých fyziologických funkcí. Tvoří-li se ale v nadměrném mnoţství, stávají se pro organismus nebezpečné. Lidský organismus je vybaven ochrannými antioxidačními systémy, které reaktivní molekuly radikálů pohlcují, případně jenom brzdí jejich růst. Navíc je ţádoucí, aby do organismu byly doplňovány vnější cestou další antioxidanty, které celý systém podpoří (Důleţité antioxidanty [online]).

4.1. Volné radikály Volné radikály (VR) jsou chemické látky schopné samostatné existence charakterizované jedním či více nepárovými elektrony ve svém elektronovém obale. VR si snaţí doplnit dalším elektronem svůj elektronový pár a získat tak stabilní konfiguraci. Tyto molekuly s krátkou ţivotností jsou velmi reaktivní, napadají lipidy, nukleové kyseliny, sacharidy, bílkoviny včetně enzymů. Pro organismus jsou nejdůleţitější VR kyslíku a dusíku, které mohou prodělat další přeměny na jiné reaktivní látky. Souhrnně tyto látky jsou nazývány jako reaktivní formy kyslíku či dusíku (ROS či RSN) (Racek a Holeček 1999). VR mohou být pro organismus jak prospěšné, tak škodlivé. Tvorba VR zahrnuje celou řadu neenzymových dějů (ionizující záření, kouření atd.), zároveň existuje i velké mnoţství dějů katalyzovaných enzymy. Proti škodlivým procesům organismus vyvinul antioxidační obranné mechanismy (Racek a Holeček 1999). Mezi enzymy tvořící ROS jsou zařazeny různé oxidasy, cyklooxygenasa, enzymy terminálních oxidací. Superoxiddismutasa (SOD) patří k enzymům přeměňující jednu reaktivní formu kyslíku na jinou. K enzymům odstraňujím ROS řadíme katalasu (CAT) a různé enzymy zahrnující peroxidasovou aktivitu. Glutathionreduktasa (GR) a thioredoxinreduktasa (TrxR) redukují oxidované formy molekul a umoţňují tak jejich regeneraci (Racek a Holeček 1999).

18

4.2. Antioxidanty Antioxidanty můţeme dělit na přirozené a umělé. Přirozené antioxidační látky přijímá člověk v potravě, či si je dokáţe sám vytvořit. Rozdělení na hydrofilní, lipofilní a amfifilní antioxidanty nám umoţňuje se lépe orientovat v této rozsáhlé skupině. Hydrofilní antioxidanty tvoří enzymy, např. SOD, CAT a peroxidasa, neenzymovým zástupcem je glutathion (GSH), vysokomolekulární látky zastupují bílkoviny a mezi nízkomolekulární jsou řazeny kyselina askorbová, resveratrol a polyfenolické bioflavonoidy. Mezi lipofilní antioxidanty patří vitamin E, karotenoidy, estrogeny a dalšími steroidy, amfifilní antioxidanty charakterizuje např. melatonin či kyselina lipoová. Umělé antioxidanty zahrnují léky, jeţ jsou uměle modifikované struktury přírodních antioxidantů, např. chemická modifikace bioflavonoidů významně zvyšuje jejich antioxidační účinek (Štípek a kol. 2000).

4.3. Antioxidační enzymy 4.3.1. Katalasa (CAT), EC 1.11.1.6 4.3.1.1. Charakteristika CAT Katalasa je jeden z nejsilnějších známých katalyzátorů patřící do třídy oxidoreduktas o velikosti cca 230 kDa. Ve vysokých koncentracích se vyskytuje v peroxisomech hepatocytů. Existuje několik druhů katalasy, odlišují se v počtu a totoţnosti domén, ale i přesto sdílí jednu obecnou strukturu. Katalasa se skládá ze čtyř identických podjednotek, které jsou sloţeny z polypeptidového řetězce. Kaţdá jednotka se skládá z jedné hemové skupiny na katalytickém aktivním centru a jedné molekuly nikotinamidadenindinukleotidfosfátu (NADPH). Katalasy jsou neobvykle stabilní enzymy kvůli boji proti reaktivním molekulám (Boon a kol. 1997, Goodsell 2004). 4.3.1.2. Princip působení CAT v organismu Kaţdá molekula katalasy můţe rozkládat aţ miliony molekul peroxidu vodíku za sekundu dle následující reakce: 2 H2O2 → 2 H2O + O2. Reakce vyjadřuje dvouelektronovou dismutaci peroxidu vodíku na kyslík a je významná pro jeho inaktivaci. Druhou reakci, kterou můţe katalasa také katalyzovat, je peroxidasová reakce typu H2O2 + ROOH → H2 O + ROH + O2. Tato reakce jiţ nemá 19

v antioxidační

ochraně

velký

význam

vzhledem

k nízké

reaktivitě

katalasy

s alkylperoxidy (ROOH) (Štípek a kol. 2000).

4.3.2. Glutathionreduktasa (GR), EC 1.8.1.7. 4.3.2.1. Charakteristika GR Glutathionreduktasa je členem rodiny disulfidoxidoreduktas, do které patří také thioredoxinreduktasy,

lipoamiddehydrogenasa a reduktasa iontů rtuti. GR je

homodimerní flavoprotein o velikosti monomeru 52kDa. U savců existuje jako samostatný enzym, u plochých červů je sdruţen dohromady s thioredoxinreduktasou a tento enzym se jmenuje thioredoxinglutathionreduktasa (TGR) (Zhao a kol. 2010, Mittl a Schulz 1994). 4.3.2.2. Princip působení GR v organismu Enzym katalyzuje přeměnu glutathiondisulfidu (oxidovaného glutathionu) GSSG na glutathion (GSH, L - γ - glutamyl - L – cysteinylglycin). K této reakci je vyuţíván koenzym NADPH, který pochází z pentosového cyklu (Zhao a kol. 2010, Mittl a Schulz 1994). Obecný princip reakce je charakterizován na obrázku 5 (Sentürk a kol. 2008).

Obrázek 5 Princip obecného působení GR v organismu

4.3.3. Glutathion-S-tranferasa (GST), EC 2.5.1.18. 4.3.3.1. Charakteristika GST Glutathion-S-transferasa patří do rodiny multifunkčních enzymů, které se podílí na ochraně buněk před poškozením organismu. GST se podílí na konjugačních reakcích, v menší míře vykazuje peroxidasovou aktivitu nezávislou na selenu. Dnes jsou známé tři hlavní rodiny, a to cytosolické, mitochondriální a mikrosomální GST. Cytosolické GST jsou v nejvyšší míře zastoupeny v játrech a ledvinách, jsou prezentovány jako

20

homodimery, nebo heterodimery o velikosti jedné podjednotky okolo 25kD (Salinas a Wong 1999, Racek 2003a, Sherrat a Haydes 2002). 4.3.3.2. Princip působení GST v organismu Škodlivé látky působící na organismus jsou odbourávány během dvou fází, přičemţ GST hrají důleţitou roli v druhé fázi metabolismu léčiv. V první fázi biotransformace xenobiotik je hlavním katalyzátorem systém cytochromu P450 (CYP). Druhá konjugační fáze je katalyzována především pomocí GST. GST vykazují vysokou specifitu ke glutathionu (GSH), ale elektrofilní druhý substrát se významně mění mezi jednotlivými třídami GST. Katalýzou dochází ke vzniku konjugátu s GSH (Sherrat a Haydes 2002). Obecný princip reakce katalyzované tímto enzymem je: GSH + RX → GS-R + HX (Racek 2003a). 4.3.4. NAD(P)H:chinonoxidoreduktasa (NQO1), EC 1.6.5.2. 4.3.4.1. Charakteristika NQO1 Enzym kódovaný genem nqo1 je znám pod několika alternativními názvy, např. NAD(P)H:dehydrogenasa,

NAD(P)H:menadionoxidoreduktasa

či

NAD(P)H:chinonoxidoreduktasa. Enzym NQO1 tvoří homodimerní flavoprotein patřící do skupiny chinonreduktas. Kaţdý monomer se skládá z 273 aminokyselin. Enzym se primárně ve vyšším mnoţství vyskytuje v cytosolu, niţší úrovně byly také nalezeny v buněčném jádře, mitochondriích a endoplazmatickém retikulu za normálních podmínek. V podmínkách stresu se přesouvá NQO1 do jádra (Siegel a kol 2012, NQO1 NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 [online]) 4.3.4.2. Princip působení NQO1 v organismu Enzym NQO1 katalyzuje dvouelektronovou redukci substrátu za přítomnosti elektronového

donoru

nikotinamidadenindinukleotidu

(NADH)

nebo

NADPH.

Nejčastějším substrátem je chinon, který je redukován na hydrochinon dle reakce na obrázku 6. Tato redukce je povaţována za proces detoxikace v organismu, neboť zabraňuje tvorbě reaktivních semichinonů. Při zvýšené produkci NQO1 jsou chráněny buňky před oxidačním působením tím, ţe NQO1 redukuje superoxid na peroxid a vytváří antioxidační formy vitaminu E a koenzymu Q. Kromě své antioxidační funkce

21

chrání enzym také celou řadu proteinů. Předpokládá se, ţe NQO1 migrující při stresu do jádra chrání protein p53 před proteosomální degradací (Siegel a kol 2012, NQO1 NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 [online]).

Obrázek 6 Redukce chinonu na hydrochinon pomocí NQO1 (Lee 2009)

4.3.5. Peroxidasa (Px), EC 1.11.1.7. 4.3.5.1. Charakteristika Px Peroxidasy jsou široce rozšířeny v přírodě a mohou být jednoduše extrahovány z rostlin a některých tkání ţivočichů. Peroxidasy mohou být děleny do několika nadrodin, a to na rostlinné peroxidasy, ţivočišné peroxidasy a katalasy. Rostlinné peroxidasy jsou monomerní proteiny s nekovalentně vázanou hemovou skupinou, ţivočišné peroxidasy se vyskytují jako dimerní molekuly s kovalentně vázanou prostetickou skupinou. Peroxidasa, jinými názvy také křenová peroxidasa (HRP), laktoperoxidasa

či pyrokatecholperoxisa,

je

polypeptidový řetězec

obsahující

308 aminokyselin o celkové velikosti cca 34 kDa. Peroxidasy jsou enzymy, které vyuţívají peroxid vodíku jako elektronový donor pro katalýzu oxidační reakce (Azevedo a kol. 2003) 4.3.5.2. Princip působení Px v organismu Peroxidasa katalyzuje oxidaci širokého spektra substrátů díky různým donorům elektronů jako jsou fenoly, aromatické aminy či thioanisol pomocí peroxidu vodíku jako oxidačního činidla (Azevedo a kol. 2003). Obecně působí dle reakce H2O2 + RH2 → H2O + RH-OH (Racek 2003b). Dle obrázku 7 probíhá reakce ve třech krocích. Nejprve je peroxidasa oxidována peroxidem vodíku, který je rozštěpen na vodu a kyslík, a právě ten je začleněn do enzymu. Enzym následně redukuje molekulu substrátu mechanismem zahrnujícím

22

přenos elektronu a enzym je tak uveden opět do původního stavu (Azevedo a kol. 2003).

Obrázek 7 Reakční schéma peroxidasy katalyzující přeměnu substrátu (Azevedo a kol. 2003) AH ... redukovaná forma substrátu A ... oxidovaná forma substrátu

4.3.6. Superoxiddismutasa (SOD), EC 1.15.1.1. 4.3.6.1. Charakteristika SOD Enzym SOD je znám ve třech různých variantách lišících se obsaţeným kofaktorem, kterým je atom kovu. SOD obsahující Mn2+ a Fe2+ jsou tvořeny podjednotkami o molekulové hmotnosti 23 kDa. FeSOD se vyskytuje jako dimer, MnSOD jako dimer i tetrametr. Třetím typem je dimerická SOD o molekulové hmotnosti 32kDa obsahující v jedné podjednotce Cu2+

a v druhé Zn2+ v centru

molekuly. Jedná se o velmi stabilní enzym, který katalyzuje při pH 4,5 – 9,5 (Racek a Holeček 1999). 4.3.6.2. Princip působení SOD v organismu Superoxid vzniká jednoelektronovou redukcí kyslíku, tvoří se při mnohých enzymových reakcích, ale sám se spontánně přeměňuje dismutací na peroxid vodíku (H2O2) a další škodlivé formy kyslíku jako hydroxylový radikál, peroxynitrit či kyselina 23

chlorná. Enzym SOD urychluje dismutaci superoxidu o několik řádů. Vzniklý peroxid vodíku je dále katalyzován katalasou a peroxidasami na neškodné sloučeniny. Superoxiddismutasa katalyzuje přeměnu superoxidového aniontu (O2-) na peroxid vodíku a molekulární kyslík (O2), reakci vyjadřuje obecně rovnice: 2O2- + 2H+ → H2O2 + O2 (Racek a Holeček 1999). Následné odstranění vzniklého peroxidu vodíku ukazuje obrázek 8.

Obrázek 8 Katalýza ROS superoxiddismutasou a účinné odstranění H2O2 pomocí katalasy a glutathionperoxidasy GSHPx ... glutathionperoxidasa

4.3.7. Thioredoxinreduktasa (TrxR), EC 1.8.1.9. 4.3.7.1. Charakteristika TrxR Thioredoxinreduktasa je členem rodiny disulfidoxidoreduktas. Jedná se o homodimerní flavoprotein obsahující skupinu redox-aktivního disulfidu a jeden pevně vázaný flavinadenindinukleotid (FAD) a NADPH na jednu jednotku. TrxR byla podrobně zkoumána u Escherichia coli, ale výsledky ukazují na odlišnost struktury TrxR u savců a jiných druhů od Escherichia coli. Velikost TrxR u savců a potkanů byla stanovena na cca 55 kDa, zatímco u Escherichia coli je velikost cca 35 kDa. 24

Sekvenování a klonování TrxR prokázalo, ţe TrxR lidí a potkanů je velmi podobná sloţením a velikostí GR (Zhong a kol. 2000, Williams a kol. 2000). 4.3.7.2. Princip působení Thioredoxinreduktasa je jediný známý enzym, který katalyzuje redukci thioredoxinu v thioredoxinovém systému. Obrázek 9 popisuje redukci disulfidových vazeb thioredoxinu (Trx). Elektrony putující z NADPH jsou přeneseny na FAD. Tyto elektrony jsou následně přeneseny pomocí TrxR na aktivní místo Trx, coţ vede k redukci disulfidu thioredoxinu a dalších proteinových substrátů (Holmgren a Jun 2010).

Obrázek 9 Princip působení TrxR v savčích organismech (Holmgren a Jun 2010)

25

5. Cíl práce Cílem této diplomové práce bylo stanovit vliv extraktu z brusinek a vliv obezity na jednotlivé antioxidační enzymy u myší v experimentech in vivo. Jednotlivé cíle zahrnují: 

Příprava obézního kmene myší injektováním glutamátu sodného



Zisk vybraných orgánů a tkání z normálních a obézních myší



Příprava subcelulárních frakcí z jater a tenkého střeva z normálních a obézních myší



Stanovení koncentrace bílkoviny v cytosolických frakcích



Stanovení specifické aktivity vybraných antioxidačních enzymů v cytosolických frakcích z jater a tenkého střeva



Srovnání aktivit enzymů mezi skupinou ovlivněnou příjmem brusinek a kontrolní skupinou u normálních a obézních myší – zhodnocení vlivu brusinek, statistické vyhodnocení



Srovnání aktivit enzymů mezi kontrolními skupinami normálních a obézních myší – zhodnocení vlivu obezity, statistické vyhodnocení

26

6. Experimentální část 6.1. Použité přístroje Analytické váhy Scaltec SBC 31 Centrifuga Coulter Avanti J-301 Centrifuga Heraeus Biofuge Stratos Centriguga Eppendorf 5415D Digitální pH-mert Thermo Orion model 410 Pístový homogenizátor Potter Elvehjem Tecan Infinite M 200 Thermoblok s nástavcem Thermomixer Eppendorf Třepačka (Reax top) Ultrazvukový homogenizátor Sonoplus Bandelin HD 2070

6.2. Použité chemikálie 1-chlor-2,4-dinitrobenzen (Fluka) 2-merkaptoethanol (Sigma-Aldrich) 5,5‘-dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina (Sigma-Aldrich) Akrylamid (Sigma-Aldrich) Anilin (Sigma-Aldrich) Bromfenolová modř (Lachema) BSA 1% (Sigma-Aldrich) Bis-akrylamid (Sigma-Aldrich) Cytochrom C (Fluka) Dihydrogenfosforečnan draselný (Lachema) Dihydrogenfosforečnan sodný (Penta) Dikumarol (Sigma-Aldrich) Dodecylsíran sodný (BDH Chemicals) EDTA (Sigma-Aldrich) Ethanol (Dr. Kulich Pharma) Glutathion redukovaný (Fluka) Glutathion oxidovaný (Koch. Light Laboratories) Glycin (Sigma-Aldrich) Glycerol (Dr. Kulich Pharma) 27

Hydrogenfosforečnan didraselný (Penta) Hydrogenfosforečnan disodný (Penta) Chemiluminiscenční kit (GE Healthcare) Chlorid sodný (Lachema) Isobutanol (Merck) Kit pro stanovení proteinů s kyselinou bicinchoninovou (Sigma-Aldrich) Kyselina chlorovodíková (Penta) Menadion (Sigma-Aldrich) Methanol (Penta) Molybdenan amonný (Lachema) MSG (Sigma-Aldrich) NADPH (Serva) NADH (Boehringer Mannhaim) N,N,N‘,N‘ – tetramethylethylendiamid (Merck) Peroxid vodíku (Penta) Persíran amonný (Sigma-Aldrich) Polyoxyethylensorbitanmonolaurát (Sigma-Aldrich) Pyrokatechol (Lachema) SOD assay Kit-WST (Dojindo Molecular Technologies) Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Penta) Ustalovač, univerzální, kyselý, Fomafix (Foma Bohemia) Vývojka, negativní, FOMADON (Foma Bohemia)

6.3. Pracovní postup 6.3.1. Navození obezity u NMRI myší glutamátem sodným Novorozeným myším bylo od 2. dne ţivota podáváno denně 50 µl roztoku MSG nebo NaCl (viz tabulka 1) po dobu 7 dní do podkoţní řasy na zádech. Subkutánní aplikace MSG způsobí vznik lézí v nukleus arcuatus hypothalami, coţ vede k narušení leptinové a inzulinové signalizace v této části mozku. U těchto zvířat je zpomalen metabolismus, zvýšen podíl tuku, přestoţe přijímají menší mnoţství potravy. U samců dochází k rozvoji leptinové i inzulinové rezistence, u samic k rozvoji pouze rezistence leptinové (Maletínská a kol. 2006, Matyšková a kol. 2008) 28

Tabulka 1 Rozpis podávání MSG či NaCl dle koncentrací po dnech MSG₁

10mg/50µl

2. - 6. den

MSG₂

20mg/50µl

7. - 8. den

NaCl

10mg/50µl

2. - 8. den

6.3.2. Příprava subcelulárních frakcí Myši byly dekapitovány v celkové anestézii a z těla jim byla vyjmuta játra a střeva, která byla ihned zamraţena v tekutém dusíku a skladována při – 80°C do zpracování subcelulárních frakcí. Játra a střeva byla rozstříhána na menší kousky, rozváţena do malých mističek (hmotnost materiálu maximálně 5g). Biologický materiál z jedné mističky byl vloţen do 30 ml homogenizátoru s 15 ml 0,1 M Na-fosfátového pufru o pH 7,4 a zhomogenizován pístem. Materiál byl vpraven do centrifugační kyvety, píst a homogenizátor byl opláchnut dalšími 15 ml pufru a ty následně také vpraveny do stejné kyvety. Naplněné kyvety byly dány do centrifugy Heraeus obsahující rotor #3335 a stočeny na 5000 G po dobu 20 minut při teplotě 4°C. Výsledkem 1. točení byla peleta obsahující potrhané buněčné membrány, vazivo, jádra a cévy. Následně byl supernatant z 1. točení vpraven do čistých kyvet a opět točen ve stejném rotoru v téţe centrifuze na 20000 G po dobu 60 minut při 4°C. Výsledná peleta po 2. točení obsahovala mitochondrie. Supernatantem z 2. točení byly plněny centrifugační kyvety pro ultracentrifugu Beckman maximálně do ¾ objemu. Kyvety byly vloţeny do rotoru, rotor byl přišroubován k centrifuze a točen na 105000G po dobu 65 minut při 4°C (3. točení). Po 3. točení byly kyvety vyndány z ultracentrifugy a odebrán supernatant, který obsahoval cytosol. Ten byl rozpipetován po 500 µl do mikrozkumavek za stálého míchání. Následně byl zmraţen v hlubokomrazícím boxu při -80°C. 6.3.3. BCA stanovení bílkoviny Principem stanovení mnoţství bílkoviny ve vzorcích je reakce proteinů s Cu 2+ v alkalickém prostředí (pH 10). Cu2+ přechází na Cu+ a v alkalickém prostředí vytváří stabilní modrofialový komplex s kyselinou bicinchoninovou (BCA). Intenzita zabarvení je přímo úměrná mnoţství bílkoviny. Absorbance byla měřena při 562 nm.

29

Pouţité roztoky Kit pro stanovení proteinů s kyselinou bicinchoninovou obsahující roztok A a B, pracovní roztok C byl připraven dle návodu v kitu. Roztok A: NaHCO3, Na2CO3, BCA v 0,1 M NaOH Roztok B: 4% CuSO4 * 6 H2O Pro sestrojení kalibrační přímky byl jako standard pouţit hovězí sérový albumin (BSA, 0,1 %). Jeho naředěním bylo připraveno šest roztoků o různé koncentraci bílkoviny (viz tabulka 2). Kalibrační přímka byla tvořena šesti body, pro kaţdý bod bylo měřeno osm paralelních vzorků. Tabulka 2 Kalibrační křivka Roztok

koncentrace

roztok 0,1% BSA

redestilovaná voda

1

0 µg/ml

0 µl

100 µl

2

200 µg/ml

20 µl

80 µl

3

400 µg/ml

40 µl

60 µl

4

600 µg/ml

60 µl

40 µl

5

800 µg/ml

80 µl

20 µl

6

1000 µg/ml

100 µl

0 µl

Vzorky cytosolu byly naředěny 20x ve dvou ředěních, z kaţdého ředění připraveny 4 vzorky (tj. 2x4 paralelní vzorky). Do mikrotitrační destičky typu GAMA bylo napipetováno 10 µl vzorku bílkoviny a 200 µl pracovního roztoku C, pro slepý vzorek bylo pouţito 10 µl redestilované vody. Vzorky byly inkubovány při 37°C po dobu 30 minut a následně proměřeny spektrofotometrickou čtečkou (Tecan Infinite M 200). Od naměřených hodnot absorbance vzorků bílkoviny byla odečtena průměrná hodnota absorbance pro slepý vzorek. Dosazením absorbance do rovnice kalibrační přímky byla spočítána koncentrace bílkovin ve vzorcích.

30

6.3.4. Elektroforéza proteinů na polyakrylamidovém gelu, imunoblotting, detekce proteinů 6.3.4.1. Zásobní roztoky a pufry 4M HCl 150 ml redestilované vody bylo smíseno s 88 ml koncentrované HCl a následně doplněno vodou do 250 ml, uchováváno v lednici. Zásobní roztok AA + bis AA S opatrností v rukavicích a s rouškou bylo naváţeno 30 g akrylamidu (AA) a 0,8 g bisakrylamidu (bisAA), které byly následně rozpuštěny v malém mnoţství vody na míchačce. Po rozpustění byla voda doplněna do objemu 100 ml a roztok uchováván v lednici pod argonovou atmosférou.

1,5 M Tris-HCl pufr, pH 8,8 18,5 g Trisu se 75 ml redestilované vody bylo rozpuštěno mícháním na míchačce a následně upraveno pomocí 4 M HCl na poţadovanou hodnotu pH, doplněno v odměrné baňce do 100 ml a uchováváno v lednici.

0,5 M Tris-HCl pufr, pH 6,8 6 g Trisu se 75 ml redestilované vody bylo rozpuštěno mícháním na míchačce a následně upraveno pomocí 4 M HCl na poţadovanou hodnotu pH, doplněno v odměrné baňce do 100 ml a uchováváno v lednici.

10% SDS 10g SDS bylo rozpuštěno v 80 ml redestilované vody, následně byl roztok doplněn redestilovanou vodou do 100 ml v odměrné baňce a uchováván při laboratorní teplotě. Koncentrovaný elektrodový pufr 72 g glycinu, 15 g Trisu a 5 g SDS bylo rozpuštěno v 900 ml redestilované vody, upraveno na pH metru na poţadované pH 8,3 pomocí 4 M HCl, doplněno do 1000 ml v odměrné baňce.

31

4xSDS vzorkový pufr sloţka (konečná koncentrace)

koncentrace zás. roztoku

pipetované mnoţství

200 mM Tris/HCl pH 6,8

1M

4 ml

40% glycerol

85 %

9,41 ml

6% SDS

prášek

1,2 g

0,2 M DTT

prášek

0,617 g

0,1 g bromfenolová modř

prášek

špetka

redestilovaná voda

20 ml

Lyzační pufr sloţka (konečná koncentrace)

koncentrace zás. roztoku

pipetované mnoţství

50 mM Tris/HCl pH 7,4

1M

50 ml

150 mM NaCl

prášek

8,766 g

10% glycerol

85 %

11,65 ml

1% Triton X-100

100 %

10 ml

2 mM EDTA

prášek

0,58 g

2 mM EGTA

prášek

0,76 g

ß-glycerolfosfát

prášek

8,52 g

50 mM fluorid sodný

prášek

2,09 g

10 mM pyrofosfát sodný

prášek

4,46 g

2 mM dithiotreitol

prášek

0,3085 g

200 µM vanadičnan sodný

prášek

0,03678 g

Před pouţitím byl k zásobnímu roztoku lyzačního pufru přidán roztok inhibitorů proteas a takto upravený lyzační pufr byl skladován v lednici. Isobutanol nasycený vodou Čistý isobutanol byl smíchán s redestilovanou vodou a roztok uchováván v lednici.

10% APS 25 mg persíranu amonného bylo rozpuštěno ve 250 µl redestilované vody. Roztok byl připraven těsně před pouţitím.

32

Elektrodový pufr Elektrodový pufr vznikl smísením 70 ml zásobního elektrodového pufru s 280 ml redestilované vody. 6.3.4.2. Příprava gelu Skla umytá redestilovanou vodou a lihomethanolem byla spojena k sobě, postavena na gumovou podloţku v nalévacím stojánku a ukotvena. Roztok na separační gel byl namíchán dle rozpisu (viz tabulka 3) a ihned nalit mezi skla do výšky cca 4,5 cm od spodního okraje, následně byl převrstven isobutanolem nasyceným vodou (cca 200 µl) a gel byl nechán polymerovat po dobu 60 minut. Poté byl isobutanol slit a vlhkost vysušena filtračním papírem. Roztok na zaostřovací gel byl namíchán dle rozpisu (viz tabulka 4) a ihned pipetou nalit mezi skla na spodní gel aţ po horní okraj, následně byl zasunut hřeben po dráţky a gel nechán polymerovat po 30 minut. Tabulka 3 Separační gel 12,5 % - 2 gely; 1,5 mm redestilovaná voda

6,4 ml

pufr 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8

5 ml

roztok AA + bis AA

8,4 ml

10% SDS

0,2 ml

iniciace polymerace roztok APS

200 µl

TEMED (v digestoři)

16 µl

Tabulka 4 Zaostřovací gel 2 gely; 1,5 mm redestilovaná voda

6,1 ml

pufr 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8

2,5 ml

roztok AA + bis AA

1,3 ml

10% SDS

0,1 ml

iniciace polymerace roztok APS

200 µl

TEMED (v digestoři)

16 µl

33

6.3.4.3. Elektroforéza Vzorky biologického materiálu byly naředěny 4xSDS vzorkovým pufrem a lyzačním pufrem s roztokem inhibitorů (SDS zde tvořil ¼ celkového objemu), aby obsah bílkoviny ve vzorku měl koncentraci 1µg/µl. Vzorky byly povařeny v předem vyhřátém termobloku na 95°C po dobu 5 minut. Stojánek na elektroforézu byl vloţen do vaničky, vnitřní elektrodový prostor byl zalit elektrodovým pufrem aţ po ponoření celého gelu, vnější část vaničky byla zalita elektrodovým pufrem cca do 1/3 svého objemu. Pomocí nanášecího bloku bylo naneseno do jednotlivých jamek 25 µl vzorku a do jedné jamky 5 µl molekulárního standardu. Poté proběhla vlastní elektroforéza při konstantním napětí 90V. 6.3.4.4. Imunoblotting Blotovací pufr 6,06 g TRISu (25 mM) s 28,8 g glycinu (192 mM) bylo rozpuštěno v 500 ml redestilované vody, poté přidáno 400 ml methanolu a redestilovanou vodou doplněno do 2000 ml v odměrné baňce. Roztok byl uchováván v lednici. Gel společně s nitrocelulózovou membránou a tlustým filtračním papírem byl ponořen do blotovacího pufru na cca 20 minut. Vlastní blotování bylo provedeno pomocí přístroje BioRad Trans Blot Turbo dle návodu, který je součástí přístroje. 6.3.4.5. Detekce proteinů Zásobní roztoky 0,1 M TRIS pufr, pH 8,0 12,11 g TRISu bylo rozpuštěno v 800 ml redestilované vody, pH pufru upraveno na poţadovanou hodnotu pomocí 4 M HCl, následně doplněno redestilovanou vodou v odměrné baňce do objemu 1000 ml.

TBST 8,77 g NaCl bylo rozpuštěno v 300 ml redestilované vody. 3 ml Tweenu 20 a 100 ml 0,1 M TRIS pufru o pH 8,0 bylo přidáno a doplněno redestilovanou vodou v odměrné baňce do 1000 ml.

34

Primární protilátky Zásobní primární protilátky byly naředěny 1:3000 TBST pufrem s 1 % BSA. Byly skladovány v mrazničce a v čas potřeby vyndány k pouţití a rozmraţeny. Sekundární protilátky Zásobní sekundární protilátky byly naředěny 1:3000 TBST pufrem s 1 % BSA. Byly skladovány v mrazničce a v čas potřeby vyndány k pouţití a rozmraţeny.

Postup Membrána byla po opláchnutí redestilovanou vodou blokována 5 % roztokem mléka v TBST pufru po dobu 2 hodin na kývačce. Po následném slití mléka v TBST pufru a po opláchnutí redestilovanou vodou proběhla inkubace s primární protilátkou před noc. Následující den byla membrána oplachována TBST pufrem 4x po dobu 15 minut a následně inkubován se sekundární protilátkou s navázanou křenovou peroxidasou 1 hodinu, poté oplachována 4x 15 minut s TBST pufrem. 6.3.4.6. Chemiluminiscenční detekce a vyhodnocení exprese proteinů Použité chemikálie Vývojka (negativní, Fomadon) Roztok naředěn redestilovanou vodou z koncentrátu 1:14 dle údajů výrobce. Ustalovač (univerzální, kyselý, Fomafix) Roztok naředěn redestilovanou vodou z koncentrátu 1:4 dle údajů výrobce. Roztok ustalovače byl pouţíván opakovaně. Pro detekci byl pouţit chemiluminiscenční kit (Amersham ECL Prime Western Blotting detection reagent), s jehoţ substráty byla membrána inkubována po dobu 5 minut při tlumeném světle v temné komoře. Poté byla membrána umístěna do kazety, na ni přiloţen film (doba expozice 3-5 minut). Následovalo vyvolání filmu. Kvantitativní vyhodnocení bylo provedeno programem Image Studio Lite Ver. 3.1. Mnoţství exprimovaného proteinu jednotlivých enzymů bylo standardizováno na mnoţství stabilně exprimovaného proteinu (ß-aktin). Poměr mezi obsahem bílkoviny enzymu a ß-aktinu u kontrolních skupin je udáváno jako 100%, vzorky cytosolu myší 35

krmených brusinkami jsou vztaţeny k tomuto základu. Zároveň byl srovnáván vliv obezity na expresi proteinu mezi kontrolní skupinou normálních a obézních myší. 6.3.5. Stanovení aktivity antioxidačních enzymů 6.3.5.1. CAT Principem reakce je tvorba ţlutého komplexu molybdenanu amonného s peroxidem vodíku za katalytického působení CAT (Góth 2003). Absorbance byla měřena na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M 200 při 405 nm. Použité roztoky Sodno-draselný fosfátový pufr, 60 mM, pH 7,4 10,74 g Na2HPO4 * 12 H2O bylo rozpuštěno v 500 ml redestilované vody 4,08 g KH2PO4 bylo rozpuštěno v 500 ml redestilované vody Roztoky byly postupně míseny aţ do dosaţení poţadovaného pH.

H2O2, 6,5 mM 14,78 µl 30 % H2O2 bylo vpraveno do 20 ml sodno-draselného fosfátového pufru. Molybdenan amonný, 32,4 mM 0,8 g (NH4)6 Mo7O24 * 4H2O bylo rozpuštěno ve 20 ml H2O. Mikrotitrační destička byla napipetována dle tabulky 5. Tabulka 5 Rozpis pipetovaného mnoţství v jedné jamce pro CAT blank 1

vzorek

blank 2

blank 3

100 µl H2O2

100 µl H2O2

100 µl H2O2

100 µl pufru

100 µl molyb.

20 µl frakce

20 µl pufru

20 µl pufru

inkubace 1 min při 37°C, třepání ============

100 µl molyb.

100 µl molyb.

100 µl molyb.

1 min nechat stát 20 µl frakce

===========

============

změřit absorbanci při 405 nm 36

============

Aktivita katalasy v 1 ml byla spočítána dle rovnice 1. Rovnice 1 Výpočet aktivity enzymu CAT v 1 ml vzorku

U / ml 

Abl1  Avz * 32,5 * zř  Abl 2  Abl3 (µmol/ml/min)

Avz ..……… absorbance vzorku Abl1 ………. absorbance blanku 1 Abl2 ………. absorbance blanku 2 Abl3 ………. absorbance blanku 3 Vzorky byly zředěny 10x. Vztaţením aktivity CAT v 1 ml vzorku na mnoţství proteinu ve vzorku (mp) byla spočítána specifická aktivita Uspec dle rovnice 2. Rovnice 2 Výpočet specifické aktivity enzymu Uspec 

U (µmol/min/mg) mp

6.3.5.2. GR Glutathionreduktasa je spolu s thioredoxinreduktasou důleţitým enzymem, který hraje důleţitou roli v obraně organismů před oxidačním stresem. Metoda je zaloţena na přeměně oxidovaného glutathionu (GSST) na redukovaný glutathion (GSH) za současné oxidace NADPH (Bonita a kol. 2008, Carlberg a Mannervick 1985). Spotřeba NADPH je zaznamenávána pomocí sledování sniţování absorbance na přístroji Tecan Infinite M 200 při 340 nm po dobu šesti minut v minutových intervalech. Používané roztoky K-fosfátový pufr (0,1 M, pH 7) K2HPO4 (17,52 mg/ml) : KH2PO4 (13,61mg/ml), cca 5 : 2 EDTA (5 mM) – 1,86 mg/ml redestilované vody NADPH (2,5 mM) – 2,08 mg/ml redestilované vody GSSG (4 mM, Mr = 612,63) – 2,45 mg/ml redestilované vody 37

Postup práce Do všech jamek bylo napipetováno 50 µl biologické frakce, do jamek pro slepý vzorek bylo pipetováno stejné mnoţství sodno-fosfátového pufru pH 7,4 a přidáno 150 µl mastermixu (40 µl EDTA, 50 µl GSSG, 10 µl NADPH a 50 µl pufru). Biologická frakce byla před pipetováním naředěna 5x 0,1M sodno-fosfátovým pufrem pH 7,4. Ihned po napipetování byla měřena absorbance po dobu šesti minut v minutových intervalech při 340 nm. Z naměřených hodnot byl spočítán rozdíl absorbance A vzorku za 1 minutu (ΔA/min). Následně k získání hodnoty výsledné absorbance Avýsl byla odečtena průměrná hodnota absorbance slepého roztoku Aslep/min od rozdílu absorbance ΔA/min dle rovnice 3. Rovnice 3 Výpočet pro hodnotu výsledné absorbance za 1 minutu Avýsl / min  A / min  Aslep / min

Pomocí molárního extinkčního koeficientu (εNADPH = 6,22 mM-1 * cm-1) a výšky roztoku v jamce (l = 0,75 cm) byla vypočítána koncentrace spotřebovaného NADPH za 1 minutu dle rovnice 4. Rovnice 4 Výpočet koncentrace bílkoviny ve vzorku c / min 

Avýsl / min ε *l

(mM)

Vynásobením koncentrace celkovým objemem v jamce (Vcelk) byla vyjádřena aktivita enzymu U1 v pipetovaném mnoţství frakce dle rovnice 5. Rovnice 5 Výpočet aktivity enzymu v pipetovaném mnoţství cytosolu

U 1  c / min* V celk

(mmol/min)

38

Z hodnoty aktivity enzymu U1 jsme získali hodnotu enzymové aktivity v 1 ml (U/ml) biologické frakce dle rovnice 6. Do výpočtu bylo zahrnuto zředění vzorku 5x. Rovnice 6 Výpočet aktivity enzymu v 1 ml cytosolu U / ml  U 1 *

1 * zř. (mmol/ml/min) Vf

Vf … objem cytosolické frakce Vztaţením aktivity GR na mnoţství proteinu ve vzorku (mp) byla spočítána specifická aktivita Uspec dle rovnice 2. 6.3.5.3. GST Principem měření aktivity glutathion-S-transferasy je zaloţeno na tvorbě GSHCDNB konjugátu, který má absorpční maximum při 340 nm (Ye a Zhang 2001). Schéma je znázorněno na obrázku 10.

Obrázek 10 Princip reakce katalyzované GST (Ye a Zhang 2001)

39

Použité roztoky 0,1 M Na-fosfátový pufr pH 6,5 1,79 g Na2HPO4 bylo rozpuštěno v redestilované vodě a doplněno do 50 ml odměrné baňky. 1,56 g NaH2PO4 bylo rozpuštěno v redestilované vodě a doplněno do 100 ml odměrné baňky. Roztoky byly smíchány v poměru 1:3 a upraveny na poţadované pH. Roztok GSH (5,15 mM) – 1,584 mg GSH/ml 0,1 M Na-fosfátovém pufru pH 6,5 Roztok CDNB (51,5 mM) – 10,44 mg CDNB/ml ethanolu Master mix Do jedné zkumavky těsně před stanovením byly napipetovány 4 ml GSH, 0,4 ml CDNB a 15,6 ml 0,1 Na-fosfátového pufru. Roztok je v mnoţství na jednu destičku. Průběh stanovení Do šesti jamek v kaţdém sloupci bylo napipetováno 6 µl 10x ředěného cytosolu a do dvou jamek v kaţdém sloupci bylo napipetováno 6 µl pufru (blank). Do všech jamek bylo multikanálovou pipetou pipetováno 194 µl Master mixu. Lehce bylo protřepáno a vloţeno k změření do spektrofotometrické čtečky. Absorbance byla změřena 6x v minutových intervalech při 340 nm. Výsledkem byl rozdíl hodnot absorbance za 1 minutu (ΔA/min). Od ΔA/min jsme odečetli průměr hodnot absorbance pro slepé vzorky (Aslep/min) a získali jsme tím hodnoty výsledné absorbance pro jednotlivé vzorky (Avýsl/min) dle rovnice 3. Mnoţství konjugovaného substrátu bylo vypočítáno z

výsledné hodnoty

absorbance za 1 minutu s pouţitím extinkčního koeficientu (ε = 9,6 mM-1 * cm-1) a výšky roztoku v jamce (l = 0,6 cm). Dosazeno bylo do rovnice 4. Vynásobením koncentrace celkovým objemem v jamce (V) byla vyjádřena aktivita enzymu U1 pro pipetované mnoţství frakce. Hodnota byla vypočítána podle rovnice 5. Přepočítáním aktivity enzymu U1 jsme získali hodnotu enzymové aktivity v 1 ml (U/ml) biologické frakce. V úvahu bylo nutné také započítat zředění frakce (zř.) 10x. Pro výpočet byla vyuţita rovnice 6. 40

Vztaţením aktivity enzymu na mnoţství proteinu ve vzorku (mp) byla spočítána specifická aktivita Uspec dle rovnice 2. 6.3.5.4. NQO1 Princip metody je zaloţen na spektrofotometrickém stanovení redukce cytochromu c při 550 nm v přítomnosti NADH či NADPH a menadionu (elektronový akceptor). Nárůst redukovaného CYP byl zaznamenáván na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M 200. Aktivita NQO1 odpovídá aktivitě inhibované dikumarolem (inhibitor enzymu) (Benson a kol. 1980, Cullen a kol. 2003, Fitzsimmons a kol. 1996). Použité roztoky TRIS/HCl pufr, 50 mM, pH 7,5 0,606 g TRIS /100 ml roztoku (redestilovaná voda, 1 M HCl bylo upraveno pH roztoku na 7,5)

TRIS/HCl pufr s BSA (0,2188 %) 0,2188g BSA/ 100 ml TRIS/HCl pufru Cytochrom c (M = 13000, čistota 80 %), 308 µM 0,005 g cytochromu c / ml pufru

NADH (M = 709,5), 4 mM 0,0029 g / ml redestilované vody

Menadion (M = 172,18), 2 mM 0,00034 g / ml ethanolu

Dikumarol (M = 336,3), 2 mM 0,000672 g / ml DMSO

Postup Do kaţdé jamky mikrotitrační destičky bylo napipetováno sloţení dle tabulky 6. Do 10 sloupců bylo napipetováno po 10 µl vzorku, který byl 20x naředěný, do posledního sloupce bylo napipetováno 10 µl 0,1 M Na-fosfátového pufru pH 7,4 pro 41

slepý vzorek. Následně byl připraven Master mix (TRIS/HCl + BSA, CYP, NADH/NADPH, menadion) s inhibitorem (dikumarol) a bez inhibitoru (DMSO). 190 µl Master mixu bylo pipetováno pomocí multikanálové pipety a napipetované vzorky byly ihned měřeny na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M 200. Tabulka 6 Rozpis pipetovaného mnoţství v jedné jamce pro NQO1 Sloţka

vzorek

TRIS/HCl+BSA 128 µl

slepý vzorek vzorek+inhib. sl.vzorek+inhib. 128 µl

128 µl

128 µl

50 µl

50 µl

50 µl

50 µl

NADH/NADPH 10 µl

10 µl

10 µl

10 µl

1 µl

cytochrom c

menadion

1 µl

1 µl

1 µl

dikumarol

========= ========= 1 µl

1 µl

DMSO

1 µl

1 µl

=========

Cytosol

10 µl

========= 10 µl

Na-P pufr 7,4

========= 10 µl

=========

=========

10 µl

Z naměřených hodnot absorbance byla vypočítána absorbance za 1 minutu (ΔA/min). Výsledná hodnota absorbance za 1 minutu byla získána odečtením průměrné hodnoty absorbance slepého roztoku za 1 minutu od absorbancí vzorku za 1 minutu dle rovnice 3. Pomocí molárního extinkčního koeficientu redukovaného cytochromu c (ε = 28 mM

-1

* cm-1) a výšky roztoku v jamce (l = 0,75 cm) byla spočítána koncentrace

spotřebovaného NADPH za 1 minutu dle rovnice 4. Vynásobením koncentrace celkovým objemem v jamce (Vcelk) byla vyjádřena aktivita enzymu U1 v pipetovaném mnoţství frakce dle rovnice 5. Z hodnoty aktivity enzymu U1 jsme získali hodnotu enzymové aktivity v 1 ml (U/ml) biologické frakce dle rovnice 6. Zároveň bylo do výpočtu nutné zahrnout zředění biologické frakce 20x. Vztaţením aktivity NQO1 na mnoţství proteinu ve vzorku (mp) byla spočítána specifická aktivita Uspec dle rovnice 2. 42

Aktivita NQO1 (ANQO1) byla vypočítána dle následující rovnice 7. Rovnice 7 Výpočet pro aktivitu enzymu NQO1

ANQO1  Aneinhib  Ainhib Aneinhib ……………aktivita neinhibované reakce Ainhib ……………...aktivita inhibované reakce 6.3.5.5. Px Princip reakce katalyzované peroxidasou spočívá v rozkladu peroxidu vodíku a dvojice pyrokatechol-anilin zde slouţí jako vodíkový donor pro peroxidasu. Pyrokatechol-anilin je přeměňován na růţově zbarvený produkt [4-(fenylamino)benzen1,2-diol], jehoţ přírůstek je zaznamenáván na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M 200 při 510 nm (Molaei a kol. 2007). Použité roztoky Sodno-fosfátový pufr, 0,2 M, pH 7 Na2HPO4 * 12 H2O (7,16 g/ 100 ml), NaH2PO4 (3,12 g/100 ml), oba roztoky byly slévány, neţ bylo dosaţeno poţadovaného pH.

H2O2 (1,7 mM) 1,935 µl 30% H2O2/ 10ml pufru Substrát 0,1872 g pyrokatecholu (170 mM, Mr = 110,1) + 2,28 µl anilinu (2,5 mM, Mr = 181,07, ρ = 1,0217 g/ml) + 10 ml pufru Postup práce Do jamek bylo napipetováno multikanálovou pipetou 90 µl substrátu, 100 µl H2O2 a destička byla preinkubována na thermomixeru po dobu 4 minut. Pyrokatechol je velmi nestálý na světle, proto byl naředěn těsně před pipetováním do destičky. Poté bylo přidáno 10 µl biologické frakce či 0,1 M sodno-fosfátového pufru pH 7,4 (slepé vzorky). Kaţdý vzorek byl pipetován 4x. Přírůstek tvorby produktu byl sledován pomocí vzrůstu absorbance. 43

Z naměřených hodnost byl spočítán rozdíl absorbance A vzorku za 1 minutu (ΔA/min). Hodnoty výsledné absorbance Avýsl byly vypočteny odečtením průměrné hodnoty absorbance slepého roztoku Aslep od ΔA/min dle rovnice 3. Zahrnutím molárního extinkčního koeficientu (ε2,3 - diaminofenazin = 5 mM-1 * cm-1) a výšky roztoku v jamce (l = 0,75 cm) byla vypočítána koncentrace vytvořeného produktu [4-(fenylamino)benzen-1,2-diol] za 1 minutu dle rovnice 4. Vynásobením koncentrace celkovým objemem v jamce (Vcelk) byla vyjádřena aktivita enzymu U1 v pipetovaném mnoţství frakce dle rovnice 5. Z hodnoty aktivity enzymu U1 jsme získali hodnotu enzymové aktivity v 1 ml (U/ml) biologické frakce dle následující rovnice 8. Rovnice 8 Výpočet aktivity enzymu v 1 ml cytosolu bez ředění U / ml  U 1 *

1 Vf

(mmol/ml/min)

Vf … objem cytosolické frakce Vztaţením aktivity Px na mnoţství proteinu ve vzorku (mp) byla spočítána specifická aktivita Uspec dle rovnice 2. 6.3.5.6. SOD Aktivita enzymu byla stanovena pomocí kitu SOD Assay Kit-WST. Principem metody je nepřímé stanovení zaloţené na přeměně WST na barvivo formazan pomocí redukce superoxidovým aniontem. Tato redukce superoxidovým aniontem je zároveň inhibována superoxiddismutasou. Mnoţství vzniklého superoxidového aniontu je závislé na aktivitě xantinoxidasy (SOD determination kit [online]).

44

Obrázek 11 Princip reakce katalyzované pomocí SOD (SOD determination kit [online]). Absorpční maximum formazanu je při 440 nm, kdy hodnoty absorbance přímo úměrně odpovídají mnoţství superoxidu. Aktivita SOD byla vypočítána z poklesu hodnot absorbance.

Obsah kitu: WST Solution, Enzyme solution, Buffer Solution, Dilution Buffer byl skladován před pouţitím při 0-5°C. Použité roztoky Pracovní roztok WST (p. r. WST) 1 ml WST Solution byl smíchán s 19 ml Dilution Buffer Pracovní roztok enzymu (p. r. enzymu) 15 µl Enzyme Solution bylo zředěno s 2,5 ml Dilution Buffer

45

Tabulka 7 Rozpis pipetovaného mnoţství v jedné jamce pro SOD vzorek

blank 1

blank 2

blank 3

frakce

20 µl

=====

20 µl

=====

redest. voda

=====

20 µl

=====

20 µl

p. r. WST

200 µl

200 µl

200 µl

200 µl

p. r. enzymu

20 µl

20 µl

=====

=====

ředící pufr

=====

=====

20 µl

20 µl

blank … slepý vzorek Připravená napipetovaná destička byla inkubována při 37°C po dobu 20 minut. Následně byly změřeny absorbance při 450 nm a byla spočítána výsledná absorbance dle rovnice 9. Rovnice 9 Výpočet výsledné absorbance enzymu SOD

Avýsl  ( A1  A3)  ( Avz  A2) Avz … absorbance vzorku A1 … absorbance blanku 1 A2 … absorbance blanku 2 A3 … absorbance blanku 3 Potom byla spočítána absorbance formazanu vzniklého za 1 minutu (ΔA/min) dle rovnice 10. Rovnice 10 Výpočet absorbance vzniklého formazanu za 1 minutu A / min 

Avýsl t

t … doba měření absorbance Koncentrace vzniklého formazanu byla spočítána dle rovnice 4 pomocí extinkčního koeficientu (ε = 37000 M-1 * cm-1) a výšky jamky (0,9 cm). Aktivita U/ml byla vyjádřena pomocí rovnic 5 a 8. Specifická aktivita Usp byla vypočtena dle rovnice 2. 46

6.3.5.7. TrxR Thioredoxinreduktasová aktivita je součástí aktivity enzymu thioredoxinglutathionreduktasy. Princip zjištění aktivity thioredoxinreduktasové aktivity je zaloţen na přeměně 5,5‘-dithiobis-2-nitrobenzoové kyseliny (DTNB) na 5‘-thionitribenzoovou kyselinu (TNB) za současné oxidace NADPH (viz obrázek 12) (Kuntz a kol. 2007). Mnoţství vznikajícího TNB bylo zaznamenáváno pomocí sledování přírůstku absorbance při maximu 412 nm po dobu 6 minut na přístroji Tecan Infinite M 200.

Obrázek 12 Redukce DTNB na TNB pomocí TrxR Použité roztoky K – fosfátový pufr (0,1 M, pH 7) – K2HPO4 (17,42 mg/ml) a KH2PO4 (13,61 mg/ml) byly smíchány cca v poměru 5:2, aby bylo dosaţeno poţadovaného pH EDTA ( 50 mM) – 18,61 mg/ml redestilované vody NADPH (2 mM) – 1,67 mg/ml redestilované vody DTNB (12 mM, Mr = 396,35) – 4,76 mg/ml K-fosfátového pufru Postup práce Do jamek bylo napipetováno 50 µl frakce, do jamek pro slepý vzorek bylo napipetováno 50 µl sodno-fosfátového pufru pH 7,4 a do všech jamek bylo přidáno 150 µl Master mixu. Master mix pro jednu jamku byl sloţen ze 40 µl EDTA, 50 µl DTNB, 10 µl NADPH a 50 µl pufru. Kaţdý vzorek byl pipetován 4x. Vzrůst absorbance byl měřen po dobu šesti minut při absorpčním maximu při 412 nm na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M 200.

47

Z naměřených hodnot byl spočítán rozdíl absorbance A vzorku za 1 minutu (ΔA/min). Hodnotu výsledné absorbance za jednu minutu Avýsl/min jsme vypočítali dle rovnice 3. S vyuţitím molárního extinkčního koeficientu (εTNB = 13,6 mM-1 * cm-1) a výšky roztoku v jamce (l = 0,75 cm) byla vypočítána koncentrace vzniklého produktu TNB za 1 minutu c/min dle rovnice 4. Dále počítáno jako předchozí enzymy s vyuţitím rovnic 5, 6 a 2.

48

7. Výsledky 7.1. Stanovení obsahu bílkoviny Nejprve byla vytvořena kalibrační křivka za pouţití roztoku BSA jako standardu, která udává závislost absorbance jednotlivých roztoků BSA na jejich koncentraci (viz obrázek 13). Následně pomocí rovnice kalibrační křivky byly odečítány hodnoty koncentrace bílkovin ve zkoumaných tkáních.

y = 0,000743x R² = 0,986988 A

0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0

200

400

600

800

1000

1200 c (µg/ml)

Obrázek 13 Kalibrační křivka roztoku BSA (závislost absorbance na vzrůstající koncentraci roztoku BSA) Biologické frakce z jater byly proměřeny a dosazením hodnot absorbance vzorku do rovnice kalibrační přímky byl vypočítán obsah bílkoviny ve vzorcích. Výsledné koncentrace bílkovin v biologických frakcích jsou shrnuty v následující tabulce 8.

49

Tabulka 8 Obsah bílkoviny v cytosolické frakci z jater a tenkého střeva játra

KH

BH

KT

BT

mg/ml

11,67

13,27

10,86

11,64

smodch

1,05

0,19

0,32

1,47

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

mg/ml

5,91

6,70

6,09

5,93

smodch

0,41

0,31

0,30

0,08

mg/ml … obsah bílkoviny ve frakci v mg/ml – aritmetický průměr ze dvou měření, v kaţdém měření byly proměřeny čtyři vzorky smodch … směrodatná odchylka KH … frakce z hubených myší – kontrolní skupina BH … frakce z hubených myší - skupina krmená brusinkami KT … frakce z tlustých myší – kontrolní skupina KB … frakce z tlustých myší - skupina krmená brusinkami

7.2. Aktivita CAT Specifická aktivita Usp enzymu CAT byla stanovena na základě reakce molybdenanu amonného s peroxidem vodíku, který spolu tvoří ţlutý komplex, a tato reakce je katalyzována katalasou. Naměřené výsledky Usp jsou zahrnuty v tabulce 9. Tabulka 9 Specifická aktivita CAT v cytosolu z jater a tenkého střeva játra

KH

BH

KT

BT

µmol/min/mg

27,03

24,15

20,92

18,36

smodch

5,48

2,33

3,46

4,38

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

µmol/min/mg

59,62

34,98

38,23

26,62

smodch

6,72

8,11

4,49

4,15

50

Výsledky jsou vyjádřeny graficky na obrázku 14 a 15.

35 30 25 20 aktivita µmol/min/mg 15 10

5 0

27,03

24,15

20,92

18,36

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 14 Specifická aktivita CAT v játrech

70 60 50

+

*

40 aktivita µmol/min/mg 30

*

20 10 0

59,62

34,98

38,23

26,62

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 15 Specifická aktivita CAT v tenkém střevě +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity) *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KH vs BH, KT vs BT (vliv extraktu z brusinek)

51

7.3. Aktivita GR Metoda je zaloţena na přeměně GSSG na GSH za současné oxidace NADPH. Tato reakce je katalyzována GR. Výsledné hodnoty Usp shrnuje tabulka 10. Tabulka 10 Specifická aktivita GR v cytosolu z jater a tenkého střeva játra

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

24,62

25,54

29,31

26,99

smodch

1,34

0,68

2,24

1,76

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

55,91

48,43

61,66

57,00

smodch

1,06

1,84

1,16

1,25

Výsledky jsou vyjádřeny graficky na obrázku 16 a 17.

35

+

30 25 20 aktivita nmol/min/mg 15 10 5 0

24,62

25,54

29,31

26,99

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 16 Specifická aktivita GR v játrech +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity)

52

+

70 60

*

*

50 40 aktivita nmol/min/mg 30 20 10

55,91

0

48,43

KH

vzorky

BH

KH

BH

61,66

57,00

KT

BT

KT

BT

Obrázek 17 Specifická aktivita GR v tenkém střevě +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity) *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KH vs BH, KT vs BT (vliv extraktu z brusinek)

7.4. Aktivita GST Principem metody je měření aktivity GST katalyzující reakci CDNB s GSH za tvorby GS-DNB konjugátu. Výsledky naměřené U sp shrnuje tabulka 11. Tabulka 11 Specifická aktivita GST v cytosolu z jater a tenkého střeva játra

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

1105,13

955,99

813,23

781,24

smodch

95,76

55,36

63,56

77,70

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

190,17

208,07

198,89

109,31

smodch

5,76

5,69

7,27

7,78

53

Výsledky jsou vyjádřeny graficky na obrázku 18 a 19.

1400 1200

*

1000

+

800 aktivita nmol/min/mg 600 400 200 0

1 105,13

955,99

813,23

781,24

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 18 Specifická aktivita GST v játrech +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity) *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KH vs BH (vliv extraktu z brusinek u hubených myší)

250

*

200 aktivita nmol/min/mg

150

*

100 50 0

190,17

208,07

198,89

109,31

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 19 Specifická aktivita GST v tenkém střevě *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KH vs BH, KT vs BT (vliv extraktu z brusinek)

54

7.5. Aktivita NQO1 Aktivita NQO1 přímo úměrně odpovídá aktivitě inhibované dikumarolem, jenţ je inhibitorem NQO1. Výsledné hodnoty Usp zahrnuje tabulka 12. Tabulka 12 Specifická aktivita NQO1 v cytosolu z jater a tenkého střeva játra

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

3,71

2,12

24,79

19,91

smodch

1,76

0,77

1,69

1,09

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

8,41

37,36

30,63

3,69

smodch

1,67

2,43

1,76

0,96

Grafické vyjádření Usp zanamenává obrázek 20 a 21.

+

30 25

*

20 aktivita 15 nmol/min/mg 10 5 0

3,71

2,12

24,79

19,91

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 20 Specifická aktivita NQO1 v játrech +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity) *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT vs BT (vliv extraktu z brusinek u tlustých myší)

55

45 40 35 30 25 aktivita nmol/min/mg 20 15 10 5 0

*

+

* 8,41

37,36

30,63

3,69

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 21 Specifická aktivita NQO1 v tenkém střevě +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity) *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KH vs BH, KT vs BT (vliv extraktu z brusinek)

7.6. Aktivita Px Peroxid vodíku je rozkládán peroxidasou a pyrokatechol-anilin zde slouţí jako vodíkový donor pro enzym. Hodnoty specifická aktivity jsou shrnuty v tabulce 13. Tabulka 13 Specifická aktivita Px v cytosolu z jater a tenkého střeva játra

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

3,89

3,75

3,97

4,15

smodch

0,73

0,52

0,37

0,28

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

1,37

1,51

5,61

6,87

smodch

0,14

0,28

0,56

0,34

56

Grafické znázornění ukazuje obrázek 22 a 23.

5 4,5 4 3,5 3 aktivita 2,5 nmol/min/mg 2 1,5 1 0,5 0

3,89

3,75

3,97

4,15

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 22 Specifická aktivita Px v játrech

8

*

+

7 6 5 aktivita 4 nmol/min/mg 3 2 1 0

1,37

1,51

5,61

6,87

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 23 Specifická aktivita Px v tenkém střevě +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity) *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT vs BT (vliv extraktu z brusinek u tlustých myší)

57

7.7. Aktivita SOD Stanovení specifické aktivity superoxiddismutasy je nepřímé stanovení vyuţívající WST, které je redukováno na formazan při současném vzniku superoxidového aniontu. Ten je odbouráván SOD a aktivita tohoto enzymu byla vyjádřena pomocí sníţené tvorby formazanu a poklesem absorbance. Výsledné hodnoty vypočítané Usp jsou zahrnuty v tabulce 14. Tabulka 14 Specifická aktivita SOD v cytosolu z jater a tenkého střeva játra

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

13,16

11,60

14,12

13,17

smodch

0,06

0,05

0,04

0,02

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

22,81

20,45

22,74

22,96

smodch

0,34

0,27

0,27

0,91

Grafické vyjádření ukazuje obrázek 24 a 25.

16 14

*

12 10 aktivita 8 nmol/min/mg 6 4 2 0

13,16

11,60

14,12

13,17

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 24 Specifická aktivita SOD v játrech *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KH vs BH (vliv extraktu z brusinek u hubených myší)

58

30 25

*

20 aktivita 15 nmol/min/mg 10 5 0

22,81

20,45

22,74

22,96

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 25 Specifická aktivita SOD v tenkém střevě *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KH vs BH (vliv extraktu z brusinek u hubených myší)

7.8. Aktivita TrxR Metoda je zaloţena na přeměně DTNB na TNB za současné oxidace NADPH. Reakce je katalyzována TrxR a její aktivita je vypočítána pomocí přírůstku absorbance vznikajícího TNB. Výsledné hodnoty Usp jsou shrnuty do tabulky 15. Tabulka 15 Specifická aktivita TrxR v cytosolu z jater a tenkého střeva játra

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

25,03

25,24

29,53

30,03

smodch

1,04

0,66

0,50

0,62

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

nmol/min/mg

48,39

44,32

44,57

44,61

smodch

1,90

1,42

0,85

1,00

59

Graficky jsou výsledky vyjádřeny na obrázku 26 a 27.

35

+

30

25 20 aktivita nmol/min/mg 15 10 5 0

25,03

25,24

29,53

30,03

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 26 Specifická aktivita TrxR v játrech +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity)

60

*

+

48,39

44,32

44,57

44,61

KH

BH

KT

BT

50 40 aktivita 30 nmol/min/mg 20

10 0

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 27 Specifická aktivita TrxR v tenkém střevě +… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KT oproti KH (vliv obezity) *… statistický významný rozdíl (p < 0,05) KH vs BH (vliv extraktu z brusinek u hubených myší)

60

7.9. Exprese proteinu enzymů GST a NQO1 Vliv brusinek na enzymovou aktivitu byl nejvíce signifikantní u GST a NQO1, a proto byly tyto enzymy vybrány pro kvantifikaci proteinové exprese pomocí elektroforézy a Western blotu. Výsledné hodnoty exprese jsou shrnuty v tabulkách 16 a 17. Grafické vyjádření výsledků ukazují obrázky 28 aţ 31.

Tabulka 16 Hodnoty esprese enzymu GST játra

KH

BH

KT

BT

GST/ß-aktin

1,48

1,34

1,21

1,32

hodnota exprese [%] 100

90,61

100

108,51

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

GST/ß-aktin

1,41

1,19

1,52

1,66

84,29

100

109,25

hodnota exprese [%] 100

120 100 80 hodnota 60 exprese [%] 40 20 0

100,00

90,61

100,00

108,51

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 28 Proteinová exprese GST v cytosolu jater

61

120 100 80 hodnota 60 exprese [%] 40 20 0

100,00 KH vzorky

84,29 BH KH BH

100,00

109,25

KT BT

BT

KT

Obrázek 29 Proteinová exprese GST v cytosolu tenkého střeva

Tabulka 17 Hodnoty exprese enzymu NQO1 játra

KH

BH

KT

BT

GST/ß-aktin

0,16

0,34

0,67

0,75

hodnota exprese [%] 100

210,83

100

111,59

tenké střevo

KH

BH

KT

BT

GST/ß-aktin

1,46

1,33

1,43

1,13

hodnota exprese [%] 100

91,1

100

79,09

250 200 hodnota exprese [%]

150 100 50 0

100,00

210,83

100,00

111,59

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 30 Proteinová exprese NQO1 v cytosolu jater 62

120 100 80 hodnota 60 exprese [%] 40 20 0

100,00

91,10

100,00

79,09

KH

BH

KT

BT

vzorky

KH

BH

KT

BT

Obrázek 31 Proteinová exprese NQO1 v cytosolu tenkého střeva

63

8. Diskuze Antioxidační enzymy poskytují organismu ochranu před oxidačním poškozením tkání volnými radikály. Cílem tohoto výzkumu bylo zjistit, jaký vliv má obezita a brusinky na aktivitu antioxidačních enzymů. Specifické aktivity enzymů byly popsány a stanoveny pomoci příslušných metod (viz 6.3.5). U všech výsledků byla porovnávána specifická aktivita enzymů v cytosolu jater a tenkého střeva u normálních myší, které byly krmeny pouze běţnou stravou a jsou kontrolní skupinou (KH), a těmi, které byly krmeny brusinkami (brusinkový extrakt Vaccinium macrocarpon Aiton) a jsou skupinou porovnávanou (BH). Totéţ porovnání jsme provedli a sledovali u obézních myší, konkrétně mezi vzorky z tlustých kontrolních myší (KT) a tlustých myší krmených brusinkami (BT). Poslední srovnání jsme uskutečnili mezi oběma kontrolními skupinami, a to mezi KH a KT s cílem zjistit statisticky významný vliv obezity na aktivitu enzymů.

Vliv brusinek Aktivity enzymů u skupin ovlivněných příjmem brusinek, látek obsahujících antokyany, jsme porovnali s aktivitou enzymů kontrolních skupin. Specifická aktivita enzymů byla vypočítána pomocí rovnic uvedených výše. Enzym katalasa (CAT) katalyzuje reakci molybdenanu amonného s peroxidem vodíku za tvorby ţlutého komplexu, z jehoţ absorbance jsme vypočítali specifickou aktivitu enzymu. Aktivita CAT v jaterním cytosolu vykazuje podobnou hodnotu u všech měřených vzorků. Naopak pro aktivitu CAT v cytosolu tenkého střeva jsme naměřili statisticky významné rozdíly (p < 0,05) mezi hodnotami kontrolních vzorků a vzorků myší krmených brusinkami. Aktivita enzymu myší krmených brusinkami u obou porovnávaných skupin se sníţila v porovnání s kontrolními skupinami. Studie prováděné s jahodovým extraktem, jenţ obsahuje taktéţ antokyany a má antioxidační potenciál, prokázaly signifikantní zvýšení aktivity CAT a superoxiddismutasy (AlvarezSuarez a kol. 2011). Naopak dle Duthie a kol. (2006) nebyl prokázán ţádný efekt podávání brusinkové šťávy na aktivitu enzymu. Zde je patrné, ţe vţdy záleţí na obsahu, mnoţství a koncentraci jednotlivých anthokyanidinů v extraktu. Aktivita glutathionreduktasy (GR) byla změřena a vypočítána na základě mnoţství přeměněného GSSG na GSH. V cytosolu z jater jsme nenaměřili ţádné statisticky významné rozdíly v aktivitách jednotlivých vzorků. V cytosolu tenkého

64

střeva jsme získali výsledky vypovídající o niţších hodnotách aktivity u skupin s příjmem brusinek v potravě ve srovnání s kontrolními skupinami normálních i obézních myší. Palíková a kol. (2010) uvádí ve svých výzkumech, ţe brusinkový extrakt mírně sníţil hodnoty aktivity enzymu GR v porovnání s kontrolní skupinou. Aktivita glutathion-S-trasferasy (GST) byla měřena a spočítána na základě mnoţství vzniklého konjugátu glutathion-2,4-dinitrobenzenu. Aktivitu enzymu GST v jaterním cytosolu jsme naměřili nejvyšší u vzorku kontrolních hubených myší. Statisticky významný vliv brusinek, který sníţil aktivitu enzymu u skupiny s příjmem brusinek ve srovnání se skupinou normálních kontrolních myší, byl prokázán v jaterním cytosolu. Ve střevním cytosolu jsme také prokázali statisticky významné ovlivnění aktivity příjmem brusinek, u skupiny normálních myší krmených brusinkami se aktivita zvýšila, naopak u obézních myší krmených brusinkami se aktivita prudce sníţila. Dle studie prováděné Ajiboyem a kol. (2001) jsou po podávání extraktu antokyanů z ibišku aktivity enzymu in vivo u myší prokazatelně zvýšené oproti kontrolním vzorkům. Naopak dle studie Dulebohna a kol. (2008), kde byly podávány celé borůvkové plody, polyfenolový extrakt či extrakt obsahující 1 % flavonoidů a dle Palíkové a kol. (2010), kde byly podávány extrakty anthokyanů z borůvek, nebylo naměřeno ţádné signifikantní navýšení aktivity enzymu v játrech ani ve střevní mukose, dokonce při podávání pouze 0,2 % extraktu flavonoidů se aktivita enzymu sníţila ve srovnání s kontrolní skupinou. Dle Boetanga a kol. (2007) došlo ke zvýšení aktivity enzymu v játrech po podávání 5 % extraktu z mrazem sušených borůvek po dobu 13 týdnů. Ze studie vyplývá, ţe výsledky mohou být závislé na době podávání a především na koncentraci aktivních látek v celém plodu, či v extraktu. Aktivita enzymu NADPH:chinonoxidoreduktasy (NQO1) byla získána na základě stanovení redukce cytochromu c. Aktivita enzymu NQO1 se sníţila vlivem brusinek ve srovnání s kontrolními myšmi a tento rozdíl je statisticky významný v případě obézních myší. Ve střevním cytosolu jsme získali výsledky aktivit enzymu značně rozdílné, vliv brusinek zde jednoznačně podporuje antioxidační ochranu organismu normálních myší, naopak u obézních myší se aktivita vlivem brusinek statisticky

významně

sníţila.

Wiegand

a

kol.

(2009)

se

zabývá

vlivem

proanthokyanidinu katechinu na aktivitu enzymů druhé fáze, a to GST a NQO1 v jaterní tkáni myší. Samci myší byli krmeni po dobu 3 týdnů dietou bohatou na katechin a výsledné aktivity NQO1 byly sníţené ve srovnání s kontrolní skupinou.

65

Stanovení aktivity NQO1 proběhlo dle návodu, přesto se zdá být velmi pravděpodobné, ţe výsledky jsou díky velkým odchylkám zatíţeny chybou lidského faktoru. Aktivita peroxidasy (Px) byla změřena na základě přírůstku růţového produktu 4-(fenylamino)benzen-1,2-diolu. Hodnoty výsledných aktivit se shodují v jaterním cytosolu téměř ve všech vzorcích, zvýšení aktivity enzymu vlivem brusinek jsme neprokázali. Oproti tomu statisticky významné zvýšení aktivity enzymu Px v střevním cytosolu vlivem brusinek jsme zaznamenali u obézních myší. Zároveň si uvědomujeme, ţe naše měření je zatíţeno velkou odchylkou, a proto výsledky nemusí být zcela relevantní. Ve studii zkoumající vliv brusinkové šťávy na hladiny antioxidačních enzymů nebyl prokázán ţádný efekt, který by dokládal prospěšnost podávání šťávy v souvislosti s pozvednutím aktivit enzymů (Px, SOD, CAT) (Duthie a kol. 2006, Palíková a kol. 2010). Dle Wanga (2011), který v rámci svého výzkumu podával borůvky a brusinky obsahující flavonoly, anthokyanidiny, proanthokyanidiny, katechiny a glykosidy, se aktivity enzymu vlivem těchto obsahových látek zvyšují. Aktivita enzymu superoxiddismutasy (SOD) byla stanovena na základě sniţující se tvorby formazanu. Hodnoty aktivity enzymu v jaterním cytosolu jsme naměřili niţší neţ v cytosolu střevním. Sníţení aktivity enzymu vlivem brusinek bylo zaznamenáno pouze u vzorků normálních myší v játrech i ve střevě, zatímco u skupin obézních myší jsme získali hodnoty aktivit velmi podobné u kontrolních i ovlivněných myší. Deyhim a kol. (2007) prokázal zvýšení antioxidační aktivity enzymu SOD v jaterní tkáni po příjmu brusinkové šťávy. Studie zabývající se vlivem antokyanů v jahodovém dţusu na aktivitu enzymu prokázala pozitivní vliv jeho uţívání zvyšenými aktivitami enzymů SOD a CAT (Alvarez-Suarez a kol. 2011). Se stejným výsledným tvrzením byla publikována i studie vlivu kvercetinu na aktivitu antioxidačních enzymů (viz dále) (Khurana a kol. 2013). Aktivita thioredoxinreduktasy (TxrR) byla stanovena na základě přírůstku vznikající 5‘-thionitribenzoové kyseliny. Vliv podávání brusinek na zvýšení aktivity enzymu thioredoxinreduktasy jsme prokázali pouze ve střevním cytosolu normálních myší. Studie zabývající se vlivem kvercetinu jako nepřímého antioxidantu na aktivitu enzymů ukazuje zvýšení aktivity pro enzymy TxrR, GR a SOD (Khurana a kol. 2013). Nejvíce signifikantní rozdíly v aktivitě enzymů vlivem brusinek byly prokázány u GST a NQO1. Hodnota exprese GST byla niţší u normálních myší v porovnání s obézními myšmi v jaterní i střevní tkáni. Buňky inkubované společně s 25 % 66

extraktem anthokyanidinů z Vaccinium myrtillus jsou schopny bránit se zvýšené tvorbě reaktivních forem kyslíku. Anthokyanidiny a jiné fenolické sloučeniny zvyšují expresi GST proteinu v buněčné linii (Milbury a kol. 2007). Enzym NQO1 vykazuje výrazně zvýšenou expresi proteinu vlivem brusinek ve srovnání s kontrolní skupinou normálních a obézních myší v jaterní tkáni. Opačné výsledky, a to sníţení exprese proteinu vlivem brusinek, vykazují porovnávané skupiny ve střevním cytosolu. Zvýšená exprese proteinu enzymu NQO1 byla prokázána po podávání resveratrolu, který stimuluje aktivitu transkripčního faktoru Nrf-2, jenţ je svázán s genem tohoto enzymu (Khurana a kol. 2013).

Vliv obezity

Při stanovování aktivit enzymů jsme se snaţili zhodnotit nejen vliv brusinek u normálních a obézních myší ve srovnání s kontrolními vzorky, ale také vliv obezity na aktivitu enzymů, kde byly porovnávány kontrolní vzorky normálních a obézních myší. Dle Bagchi a Preuss (2012) se aktivity jednotlivých antioxidačních enzymů zvyšují spolu se zvyšující se obezitou zkoumaného jedince. Zároveň však upřesňuje, ţe vzorky lidské populace v této studii byly relativně malé, rozdílného věku a mohly být ovlivňovány vnějšími faktory, proto toto tvrzení nelze brát jako 100 % směrodatné. Rozdíl v aktivitě CAT jednotlivých vzorků v jaterním cytosolu není významný, statisticky významně sníţenou aktivitu jsme zaznamenali ve střevním cytosolu u obézních myší v porovnání s myšmi normálními. Studie prováděné na myších zaměřující se na stanovení exprese proteinu CAT v mitochondriích prezentují sníţení exprese proteinu u tlustých myší (Hey-Mogensen a kol. 2012). Naopak dle Silvera a kol. (2007) byly zjištěny opačné výsledky a je velmi pravděpodobné, ţe aktivita enzymu koreluje pozitivně s expresí. Studie zabývající se vlivem extraktu polyfenolů z koky na aktivitu enzymů uvádí zvýšené aktivity CAT a SOD u obézních jedinců potkanů v porovnání se skupinou kontrolních jedinců (Jamil a kol. 2008). Enzym GR vykazuje dle našich výsledků vyšší aktivitu u obézních myší ve srovnání s normálními jedinci v jaterním i střevním cytosolu. Tento trend koresponduje s výsledky další studie (Bagchi a Preuss 2012). Vlivem obezity na aktivitu enzymu GST se sníţila aktivita enzymu pouze v jaterním cytosolu. Stejné závěry byly učiněny i ve studii, v níţ model obézních myší úspěšně prokazuje sníţení aktivity enzymu v jaterní tkáni obézních myší ve srovnání s kontrolní skupinou (Prohaska a kol. 1988). Studie zabývající se expresí proteinu GST 67

prezentuje výsledky, jeţ ukazují sníţenou expresi proteinu v tukové tkáni u obézních myší s insulinovou rezistencí ve srovnání s hubenými subjekty výzkumu (Curtis a kol. 2010). V aktivitách enzymů NQO1 jsme zaznamenali velký rozdíl mezi vzorky normálních a obézních kontrolních myší, v jaterní i střevní tkáni se vlivem obezity aktivita enzymu velmi zvýšila. Se zvyšujícím se antioxidační stresem v organismu dochází ke zvyšování aktivity NQO1. Míra mnoţství antioxidačního stresu je ovlivněna navyšující se obezitou (Savini a kol. 2013). Aktivita Px v jaterním cytosolu vykazovala podobné hodnoty pro normální i obézní jedince, statisticky významné zvýšení aktivity enzymu vlivem obezity jsme získali u myší v cytosolu tenkého střeva. Aktivita glutathionperoxidasy (GSPx) v játrech obézních myší vykazovala asi 70 % hodnoty aktivity naměřené u kontrolních vzorků

(Prohaska

a

kol.

1988).

Studie

zabývající

se

změnami

exprese

glutathionperoxidasy vlivem narůstající tukové tkáně předkládá výsledky, jeţ potvrzují rostoucí expresi proteinu enzymu s rostoucí masou tukové tkáně v organismu. Zároveň studie ukazuje zvýšující se aktivity enzymů v tukové tkáni (Curtis a kol. 2010). Dle našich měření vykazuje enzym SOD podobné aktivity v jednotlivých tkáních, vlivem obezity se jeho aktivita významně nemění. Literatura popisuje různé typy superoxiddismutasy a dle toho jejich různé aktivity v organismu. Aktivita CuZnSOD se vlivem obezity sníţila, u MnSOD nedošlo statisticky k ţádné změně (Prohaska a kol. 1988). Naopak dle Hey-Mogensena a kol. (2012) jsou hladiny aktivity MnSOD v mitochondriích zvýšené u vzorků obézních subjektů. Jamil a kol. (2008) prezentuje zvýšení aktivity enzymu SOD u obézních potkanů ve srovnání s kontrolní skupinou. Statisticky významně změněné hodnoty aktivity jsme naměřili u enzymu TxrR. Prokázali jsme zvýšení aktivity enzymu vlivem obezity v jaterní tkáni, ve střevním cytosolu se naopak aktivita sníţila u obézních jedinců v porovnání s normálními jedinci. Studie publikované v literatuře týkající se vlivu obezity na aktivitu TrxR mi nejsou známy, proto si myslím, ţe tento výsledek je přínosem této diplomové práce. Exprese proteinů GST vlivem obezity se sníţila v jaterní tkáni a zvýšila v cytosolu střevní tkáně. Studie Nteeby a kol. (2013) se zabývala vlivem obezity na tkáň vaječníků u normálních a obézních myší. Hladina mRNA GST se sniţovala, tato tendence se ale neprojevila statisticky významně u exprese proteinu GST.

68

Exprese proteinů NQO1 byla zvýšená u obézních myší v jaterním cytosolu, ve střevní tkáni byly hodnoty exprese u skupin normálních i tlustých myší velmi podobné. Stanovení exprese proteinu NQO1 bylo provedeno u ob/ob myší a výsledné hodnoty ukazují na pozitivní korelaci exprese proteinu s hladinou adipocytů tukové tkáně (Hwang a kol. 2009). Studie zabývající se porovnáváním exprese enzymu NQO1 u skupin kontrolních a obézních osmitýdenních samců myší ukazuje zvýšenou expresi proteinu u obézních myší (Wang a kol. 2012).

69

9. Závěr Cíle této diplomové práce byly jasně stanoveny a jednotlivé části úspěšně provedeny. 

Obézní kmeny myší byly připraveny injektováním glutamátu sodného do podkoţí v oblasti hypotalamu.



Byla provedena dekapitace myší v celkové anestézii a získány jednotlivé orgány a tkáně z normálních a obézních myší.



Subcelulární frakce z jater a tenkého střeva z normálních a obézních myší byly připraveny dle návodu a zmraţeny do doby jejich vyuţití.



Koncentrace bílkoviny v cytosolu byla stanovena pomocí standardu (hovězí sérový albumin, 0,1 %).



Specifické aktivity vybraných antioxidačních enzymů v cytosolu z jater a tenkého střeva byly stanoveny na základě měření jejich absorbance a následných výpočtů jejich aktivit.



Porovnání aktivit enzymů skupin, které byly krmeny brusinkami se skupinami kontrolními, a jejich statistické vyhodnocení bylo provedeno a vyhodnoceno v části výsledky. Statisticky sníţené hodnoty aktivity vlivem brusinek vykazuje enzym GST (↓BH) a NQO1 (↓BT) v jaterním cytosolu, ve střevním cytosolu se aktivita těchto enzymů také měnila (↑BH, ↓BT). Hodnoty aktivit enzymu CAT a GR se sniţovaly v cytosolu tenkého střeva vlivem brusinek u normálních i obézních jedinců. Aktivita enzymu Px se zvýšila u obézních jedinců po konzumaci brusinek ve střevní tkáni. Enzym SOD ukazuje sníţení aktivity enzymu vlivem brusinek u normálních jedinců v jaterním i střevním cytosolu. Aktivita TrxR se sníţila vlivem brusinek pouze ve střevním cytosolu u normálních jedinců.



Vliv obezity byl hodnocen porovnáním enzymových aktivit u kontrolních skupin, které ve stravě nepřijímaly brusinky. Statisticky zvýšené aktivity pro obézní skupinu vykazuje v játrech i tenkém střevě enzym GR a NQO1, pouze v játrech TrxR a pouze v tenkém střevě enzym Px. Statisticky sníţené aktivity pro obézní skupinu vykazuje v játrech GST a v tenkém střevě CAT a TrxR. 70

10. Seznam obrázků Obrázek 1 Myši – narození, normální a obézní jedinci (vlastní zdroj) ......................... 12 Obrázek 2 Základní skelet flavonoidů (Velíšek 2002) ................................................ 14 Obrázek 3 Kyanidin-3-O-ß-D-glukosid (Velíšek 2002) .............................................. 15 Obrázek 4 Proanthokyanidin typ A (Pascual-Teresa a kol. 2010)................................ 17 Obrázek 5 Princip obecného působení GR v organismu.............................................. 20 Obrázek 6 Redukce chinonu na hydrochinon pomocí NQO1 (Lee 2009) .................... 22 Obrázek 7 Reakční schéma peroxidasy katalyzující přeměnu substrátu (Azevedo a kol. 2003) ........................................................................................................................... 23 Obrázek 8 Katalýza ROS superoxiddismutasou a účinné odstranění H2O2 pomocí katalasy a glutathionperoxidasy ................................................................................... 24 Obrázek 9 Princip působení TrxR v savčích organismech (Holmgren a Jun 2010) ......25 Obrázek 10 Princip reakce katalyzované GST (Ye a Zhang 2001) .............................. 39 Obrázek 11 Princip reakce katalyzované pomocí SOD (SOD determination kit [online]). ..................................................................................................................... 45 Obrázek 12 Redukce DTNB na TNB pomocí TrxR .................................................... 47 Obrázek 13 Kalibrační křivka roztoku BSA (závislost absorbance na vzrůstající koncentraci roztoku BSA) ........................................................................................... 49 Obrázek 14 Specifická aktivita CAT v játrech ............................................................ 51 Obrázek 15 Specifická aktivita CAT v tenkém střevě ................................................. 51 Obrázek 16 Specifická aktivita GR v játrech .............................................................. 52 Obrázek 17 Specifická aktivita GR v tenkém střevě ................................................... 53 Obrázek 18 Specifická aktivita GST v játrech ............................................................ 54 Obrázek 19 Specifická aktivita GST v tenkém střevě ................................................. 54 Obrázek 20 Specifická aktivita NQO1 v játrech ......................................................... 55 Obrázek 21 Specifická aktivita NQO1 v tenkém střevě ............................................. 56 Obrázek 22 Specifická aktivita Px v játrech................................................................ 57 Obrázek 23 Specifická aktivita Px v tenkém střevě..................................................... 57 Obrázek 24 Specifická aktivita SOD v játrech ............................................................ 58 Obrázek 25 Specifická aktivita SOD v tenkém střevě ................................................. 59 Obrázek 26 Specifická aktivita TrxR v játrech............................................................ 60 Obrázek 27 Specifická aktivita TrxR v tenkém střevě................................................. 60 Obrázek 28 Proteinová exprese GST v cytosolu jater ................................................. 61

71

Obrázek 29 Proteinová exprese GST v cytosolu tenkého střeva .................................. 62 Obrázek 30 Proteinová exprese NQO1 v cytosolu jater .............................................. 62 Obrázek 31 Proteinová exprese NQO1 v cytosolu tenkého střeva ............................... 63

11. Seznam rovnic Rovnice 1 Výpočet aktivity enzymu CAT v 1 ml vzorku ............................................ 37 Rovnice 2 Výpočet specifické aktivity enzymu ........................................................... 37 Rovnice 3 Výpočet pro hodnotu výsledné absorbance za 1 minutu .............................. 38 Rovnice 4 Výpočet koncentrace bílkoviny ve vzorku .................................................. 38 Rovnice 5 Výpočet aktivity enzymu v pipetovaném mnoţství cytosolu ....................... 38 Rovnice 6 Výpočet aktivity enzymu v 1 ml cytosolu ................................................... 39 Rovnice 7 Výpočet pro aktivitu enzymu NQO1 .......................................................... 43 Rovnice 8 Výpočet aktivity enzymu v 1 ml cytosolu bez ředění .................................. 44 Rovnice 9 Výpočet výsledné absorbance enzymu SOD ............................................... 46 Rovnice 10 Výpočet absorbance vzniklého formazanu za 1 minutu ............................. 46

12. Seznam tabulek Tabulka 1 Rozpis podávání MSG či NaCl dle koncentrací po dnech........................... 29 Tabulka 2 Kalibrační křivka ....................................................................................... 30 Tabulka 3 Separační gel ............................................................................................. 33 Tabulka 4 Zaostřovací gel .......................................................................................... 33 Tabulka 5 Rozpis pipetovaného mnoţství v jedné jamce pro CAT ............................. 36 Tabulka 6 Rozpis pipetovaného mnoţství v jedné jamce pro NQO1 ........................... 42 Tabulka 7 Rozpis pipetovaného mnoţství v jedné jamce pro SOD ............................. 46 Tabulka 8 Obsah bílkoviny v cytosolické frakci z jater a tenkého střeva ..................... 50 Tabulka 9 Specifická aktivita CAT v cytosolu z jater a tenkého střeva ....................... 50 Tabulka 10 Specifická aktivita GR v cytosolu z jater a tenkého střeva ........................ 52 Tabulka 11 Specifická aktivita GST v cytosolu z jater a tenkého střeva ...................... 53 Tabulka 12 Specifická aktivita NQO1 v cytosolu z jater a tenkého střeva ................... 55 Tabulka 13 Specifická aktivita Px v cytosolu z jater a tenkého střeva ......................... 56 Tabulka 14 Specifická aktivita SOD v cytosolu z jater a tenkého střeva ..................... 58 Tabulka 15 Specifická aktivita TrxR v cytosolu z jater a tenkého střeva ..................... 59 Tabulka 16 Hodnoty esprese enzymu GST ................................................................. 61 Tabulka 17 Hodnoty exprese enzymu NQO1.............................................................. 62 72

13. Seznam zkratek AA – akrylamid APS – persíran amonný BCA – kyselina bicinchoninová BFB – bromfenolová modř BisAA – bis-akrylamid BSA – sérový hovězí albumin CAT - katalasa CDNB - 1-chlor-2,4-dinitrobenzen CuSO4 – síran mědnatý CYP - cytochrom c DIO – model obezity indukované dietou DMSO – dimethylsulfoxid DTNB - 5,5‘-dithiobis-2-nitrobenzoová kyselina EDTA – ethylendiamintetraoctová kyselina FAD – flavinadenindinukleotid GR - glutathioreduktasa GSH - redukovaný glutathion GSHPx – glutathionperoxidasa GSSG – oxidovaný glutathion GST – glutathion-S-tranferasa HCl – kyselina chlorovodíková HDL – lipoproteiny o vysoké hustotě H2O2 – peroxid vodíku HRP – křenová peroxidasa KH2PO4 – dihydrogenfosforečnan draselný K2HPO4 – hydrogenfosforečnan didraselný LDL – lipoproteiny o nízké hustotě MSG – glutamát sodný NaCl – chlorid sodný NaOH – hydroxid sodný Na2CO3 – uhličitan sodný NADH – nikotinamidadenindinukleotid

73

NADPH – nikotinamidadenindinukleotidfosfát NaHCO3 – hydrogenuhličitan sodný NaH2PO4 – dihydrogenfosforečnan sodný Na2HPO4 – hydrogenfosforečnan disodný (NH4)6 Mo7O24 * 4H2O) – molybdenan amonný NQO1 – NADPH:chinonoxidoreduktasa 1 Px - peroxidasa RNS – reaktivní formy dusíku ROS – reaktivní formy kyslíku SDS – dodecylsíran sodný SOD - superoxiddismutasa TAG – triacylglyceroly TEMED - N,N, N‘,N‘ – tetramethylethylendiamid TGR – thioredoxinglutathionreduktasa TNB - 5‘-thionitribenzoová kyselina TNF α – tumor nekrotizující faktor α TRIS – tris(hydroxymethyl)aminomethan Trx – thioredoxin TrxR - thioredoxinreduktasa TWEEN 20 - polyoxyethylensorbitanmonolaurát VR – volné radikály WST - sodná sůl (2-(4-jodofenyl)-3-(3-nitrofenyl)-5-(2,4-disulfofenyl)-2H-tetrazolia

74

14. Použitá literatura Ajiboye, T. O., Salawu, N. A., Yakubu, M. T., Oladiji, A. T., Akanji, M. A., Okogun, J. I. (2011) Antioxidant and drug detoxification potentials of Hibiscus sabdariffa anthocyanin extract. Drug and Chemical Toxicology. 34(2), 109 – 115 Alvarez-Suarez, J. M., Dekanski, D., Ristic, S., Radonjic, N. V., Petronijevic, N. D., Giampieri, F., Astolfi, P., Gonzáles-Pamarás, A. M., Santos-Buelga, C., Tulipani, S., Quiles, J. L., Mezzetti, B., Battino, M. (2011) Strawberry Polyphenols Attenuate Ethanol-Induced Gastric Lesions in Rats by Activation of Antioxidant Enzymes and Attenuation of MDA Increase. PLoS ONE. 6(10), e25878 Azevedo, A. M., Martins, V. C., Prazeres, D. M. F., Vojinovic, V., Cabral, J. M. S., Fonseca, L. P. (2003) Horseradish peroxidase: a valuable tool in biotechnology. Biotechnology Annual Review. 9, 199 -247 Bagchi, D., Preuss, H. G. (2012) Obesity: Epidemiology, Pathophysiology, and Prevention, Second Edition, CRC Press. Boca Raton. Benson,

A.

M.,

Hunkeler,

M.

J.,

Talalay,

P.

(1980)

Increase of

NAD(P)H:quinone reductase by dietary antioxidants: Possible role in protection against carcinogenesis and toxicity.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 77(9), 5213 – 5220 Boateng, J., Verghese, M., Shackelford, L., Walker, L. T., Khatiwada, J., Ogutu, S., Williams, D. S., Jones, J., Guyton, M., Asiamah, D., Henderson, F., Grant, L., DeBruce, M., Johnson, A., Washington, S., Chawan, C. B. (2007) Selected fruits reduce azoxymethane (AOM)-induced aberrant krypt foci (ACF) in Fisher 344 male rats. Food and Chemical Toxicology. 45, 725 - 732 Bonilla, M., Denicola, A., Novoselov, S. V., Turaov, A. A., Protasio, A., Izmendi, D., Gladyshev, V. N., Salinag, G. (2008) Platyhelminth mitochondrial and cytosolic redox homeostasis is controlled by a single thioredoxin glutathion reductase and dependent on selenium and glutathione. The Journal of Biological Chemistry. 283(26), 17898 – 17907

75

Boon, E. M., Downs, A., Marcey, D. (1997) Catalase: H2O2: H2O2 Oxidoreductase [online] Poslední revize 4.2000 [ cit. 2014-3-30] Dostupné z: http://biology.kenyon.edu/BMB/Chime/catalase/frames/cattx.htm Carlberg, I., Mannervik, B. (1985) Glutathione reductase. Methods in Enzymology. 113, 484 – 490 Cullen, J. J. a kol. (2003) Dicumarol Inhibition of NADPH:Quinone Oxidoreductase Induces Growth Inhibition of Pancreatic Cancer vis a Superoxidemediated Mechanism, Cancer Research. 63, 5513 – 5520 Curtis, J. M., Grimsrud, P. A., Wright, W. S., Xu, X., Foncea, R. E., Graham, D. W., Brestoff, J. R., Wiczer, B. M., Ilkayeva, O., Cianflone, K., Muoio, D. E., Arriaga, E. A., Bernlohr, D. A.(2010) Downregulation of adipose glutathione S-transferase A4 leads to increased protein carbonylation, oxidative stress, and mitochondrial dysfunction. Diabetes. 59(5), 1132 - 1142 Deyhim, F., Patil, B. S., Villarreal, A., Lopez, E., Garcia, K., Rios, R., Garcia, C., Gonzales, Ch., Mandadi, K. (2007) Cranberry Juice Increases Antioxidant Status Without Affecting Cholesterol Homeostasis in Orchidectomized Rats. Journal of Medicinal Food. 10(1), 49 – 53 Dolejš, A., Kott, V., Šenk, L. (1991) Méně známé ovoce. Zemědělské nakladatelství Brázda. Praha. Drbalová, K. (1998) Leptin - klíč k obezitě? Časopis lékařů českých. 137(12), 355-358 Dulebohn, R. V., Yi, W., Sritastava, A., Akoh, C. C., Krewer, G., Fischer, J. G. (2008) Effects of Blueberry (Vaccinium Asii) on DNA Damage, Lipi Peroxidation, and Phase II Enzyme Activities in Rats. Journal of Agtŕicultural and Food Chemistry. 56, 11700 – 11706 Důleţité antioxidanty [online]. Poslední revize: 1.2011 [cit. 2014-3-13] Dostupné z: http://www.knivic.unas.cz/antioxidanty.htm

76

Duthie, S. J., Jenkinson, A. McE., Crozier, A., Mullen, W., Pirie, L., Kyle, J., Yap, L. S., Christen, P., Duthie, G. G. (2006) The effects of cranberry juice consumption on antioxidant status and biomarkers relativ to heart disease and cancer in healthy human volunteers. European Journal of Nutrition. 45, 113 – 122 Fine, A. M. (2000) Oligomeric Proanthocyanidin Complexes: History, Structure, and Phytopharmaceutical Applications. Alternative Medicine Review. 5(2), 144 – 151 Fitzsimmons, S. A. a kol (1996) Reductase enzyme expression Gross the National cancer institute tumor cell line panel: Correlation with sensitivity to mytomycin C and EO9. Journal of the National Cancer Institute. 88(5), 259 – 269 Goodsell, D. (2004) Catalase [online] Poslední revize 4.2013 [cit. 2014-4-20] Dostupné

z:

http://www.rcsb.org/pdb/101/structural_view_of_biology.do?c=Enzymes&sc=Oxidored uctases_-_Shuffling_Electrons Góth, L. (2003) A simple method for determinativ of serum catalase aktivity and revision of reference range. Clinica Chimica Acta. 196, 143 – 152 Hainer, V. (2004) Základy klinické obezitologie. Grada. Praha. Havlík, J., Marounek, M. (2012) Ţiviny a ţivinové potřeby pro člověka. Česká zemědělská univerzita, Praha Hey-Mogensen, M., Jeppeses, J., Madsen, K., Kiens, B., Franch, J. (2012) Obesity augments the age-induced increase in mitochondrial capacity for H2O2 release in Zucker fatty rats. Acta Physiologica. 204(3), 354 – 361 Higdon, J. (2005) Flavonoids [online] Poslední revize: 4.2014 [cit. 2014-4-2] Dostupné

z:

http://lpi.oregonstate.edu/infocenter/phytochemicals/flavonoids/#biological_activity Holmgren, A., Amér, E. S. J. (2000) Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase. European Journal of Biochemistry.267(20), 6102 – 6109

77

Holmgren, A., Jun, L. (2010) Thioredoxin and thioredoxin reductase: Current research with special reference to human disease. Biochemical and Biophysical Research Communications 396(1), 120–124. Housová, J., Housa, D., Haluzík, M. (2005) Adiponektin - nový adipocytární hormon se vztahem k obezitě a inzulinové rezistenci. Vnitřní lékařství. 51(2), 221-225 Hwang, J. H., Kim, D. W., Jo, E. J., Kim, Y. K., Jo, Y. S., Park, J., H., Yoo, S. K., Park, M. K., Kwak, T. H., Kho, Y. L., Han, J., Choi, H. S., Lee, S. H., Kim, J. M., Lee, I. K., Kyung, T., Jang, Ch., Chung, J., Kweon, G. R., Shong, M. (2009) Pharmacological Stimulation of NADH Oxidation Ameliorates Obesity and Related Phenotypes in Mice. Diabetes. 58(4), 965 – 974 Jamil, A. M. M., Ismail, A., Pei Pei, Ch., Hamid, M., Kamaruddin, S. H. S. (2008) Effects of Cocoa Extract on Glucometabolism, Oxidative Stress, and Antioxidant Enzymes in Obese-Diabetic (Ob-db) Rats. Journal of Agtŕicultural and Food Chemistry. 56(17), 7877 – 7884 Karageorgou, P., Manetas, Y. (2006) The importace of being red when young: anthocyanins and the protection of young leaves of Quercus coccifera from insect herbivory and excess light. Three Physiology. 26, 613 – 621 Khurana, S., Venjataraman, K., Hollingsworth, A., Piche, M., Tai, T. C. (2013) Polyphenols: Benefits to the Cardiovascular System in Health and in Aging. Nutrients. 5(10), 3779 – 3827 Kuntz, A. N., Davioud-Charvet, E., Sayed, A., Califf, L. L., Dessolin, J., Arnér, E. S. J., Williams, D. L. (2007) Thioredoxin glutathione reductase from Schistosoma mansoni: an essential parasite enzyme and a key drug target. PLoS Med. 4, 206 Lee, Y.(2009) In vitro and in vivo interplay between human NAD(P)H:quinone reductase and (health-promoting) flavonoids [online] Poslední revize: 5.2009 [cit. 20143-22] Dostupné z: http://biochemistry.wur.nl/Biochem/educatio/yee.htm , upraveno autorem. Lutz, T. A., Woods, S. C. (2012) Overview of Animal Models of Obesity. Current Protocols in Pharmacology. 8. 78

Maletínská, L., Toma, R. S., Pirník, Z., Kiss, A., Slaninová, J., Haluzík, M., Ţelezná. B. (2006) Effect of cholecystokinin on feeding is attenuated in monosodium glutamate obese mice. Regulatory Peptides. 136(1-3), 58 -63 Matyšková, R., Maletínská, L., Maixnerová, J., Pirník, Z., Kiss, A., Ţelezná, B. (2008) Comparison of the obesity phenotypes related to monosodium glutamate effect on arcuate nucleus and/or the high fat diet feeding in C57BL/6 and NMRI mice. Physiological Research. 57(5), 727 - 734 Milbury, P. E., Graf, B., Curran-Celentano, J. M., Blumberg, J. B. (2007) Bilberry (Vaccinium myrtillus) Anthocyanins Modulate Heme Oxygenase-1 and Glutathione

S-Transferase-pi

Expression

in

ARPE-19

Cells.

Investigative

Ophthalmology and Visual Science. 48(5), 2343 - 2349 Mittl, P. R. E., Schulz, G., E. (1994) Structure of glutathione reductase from Escherichia coli at 1.86 A resolution: Comparison with the enzyme from human erythrocytes. Protein Science. 3, 799 – 809 Molaei Rad, A., Ghourcian, H., Moosavi-Movahedi, A. A., Hong, J., Nazari, K. (2007) Spectophotometric assai for horseradish peroxidase activity based on pyrokatechol-aniline coupling hydrogen donor. Analytical Biochemistry. 362, 39 – 43 Novotný, D., Vaverková, H., Karásek, D., Halenka, M. (2008) Adiponektin – parametr s protizánětlivým a protiaterogenním potenciálem. Klinická biochemie a metabolismus. 16(37), 171 -177 NQO1 NAD(P)H dehydrogenase, quinone 1 [online]. Poslední revize 2.2014 [cit. 2014-3-22] Dostupné z: http://atlasgeneticsoncology.org/Genes/NQO1ID375.html Nteeba, J., Ross, J. W., Perfield, J. W., Keating, A. F. (2013) High fat diet induced obesity alters ovarian phosphatidylinositol-3-kinase signaling gene expression. Reproductive Toxicology. 42, 68 - 77 Owen, K. (2012) Moderní terapie obezity. Maxdorf. Praha.

79

Palíková, I., Vostálová, J., Zdařilová, A., Svobodová, A., Kosina, P., Veřera, R., Stejskal, D., Prosková, J., Hrbáč, J., Bednář, P., Maier, V., Černochová, D., Šimánek, V., Ulrichová, J. (2010) Long-Term Effects of Three Commercial Cranberry Products on the Antioxidative Status in Rats: A pilot Study. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 58(3), 1672 – 1678 Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., García-Viguera, C. (2010) Flavanols and Anthocyanins in Cardiovascular Health: A Rewiew of current Evidence. International Journal of Molecular Sciences, 11, 1679 – 1703 Pastucha, D. (2011) Pohyb v terapii a prevenci dětské obezity. Grada. Praha Prohaska, J. R., Wittmers, L. E. Jr., Haller, E. W. (1988) Influence of Genetic Obesity, Food Intake and Adrenalectomy in Mice on Selected Trace ElementDependent Protective Enzymes. The Journal of Nutrition. 118, 739 – 746 Racek, J., Holeček, V. (1999) Enzymy a volné radikály. Chemické listy. 93(12), 774 – 780 Racek, J. (2003a) Glutathion S-transferasa [online] Poslední revize: 11.2003 [cit. 2014-3-22] Dostupné z: http://oldweb.izip.cz/ds3/hypertext/JRAAF.htm Racek, J. (2003b) Peroxidázy [online] Poslední revize: 11.2003 [cit. 2014-3-22] Dostupné z: http://oldweb.izip.cz/ds3/hypertext/JRAAB.htm Salinas, A. E., Wong, M. G. (1999) Glutathione S-transferases - a review. Current Medicinal Chemistry. 6(4), 279-309 Savini, I., Catani, M. V., Evangelista, D., Gasperi, V., Avigliano, L. (2013) Obesity-Associated Oxidative Stress: Strategies Finalized to Improve Redox State. International Journal of Molecular Sciences. 14(5), 10497 - 10538 Sentürk, M., Gülcin, I., Ciftci, M., Küfrevioglu, I. (2008) Dantrolene Inhibits Human Erythrocyte Glutathione Reductase. Biological & Pharmaceutical Bulletin. 31(11), 2036 – 2039 Sherratt, P. J., Hayes, J. D. (2002) Glutathione S-tranferases. In: Enzyme systems that metabolise drugs and other xenobiotics. J. Wiley. New York 80

Siegel, D., Kepa, J. K., Ross, D. (2012) NAD(P)H:Quinone Oxidoreductase 1 (NQO1) Localizes to the Mitotic Spindle in Human Cells. PLoS One. 7(9), 44861 Silver, A. E., Beske, S. D., Christou, D. D., Donato, A., J., Moreat, K. L., Exkurza, I., Gates, P. E., Seals, D. R. (2007) Overweight and Obese Humans Demonstrate Increased Vascular Endothelial NAD(P)H Oxidase -p47phox Expression and Evidence of Endothelial Oxidative Stress. Circulation. 115, 627 - 637 SOD determination kit [online] Poslední revize: 4.2013 [cit. 2014-12-03] Dostupné

z:

http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-

aldrich/docs/Sigma/Datasheet/6/19160dat.pdf Sochorová, N., Hilšerová, S., Vidlář, A. (2012) Brusinky nejen v urologii. Urologie pro praxi. 13(4), 180 -182 Sterling, M. (2000) Proanthocyanidin Power: Pine bark and grape seed contain the flavonoids OPCs, which offer antioxidant protection against heart disease and cancer. Nutrition Science News. June. Svačina, Š. (2013) Obezitologie a teorie metabolického syndromu. 1. vydání. Triton. Praha. Štípek, S. a kol (2000) Antioxidanty a volné radikály ve zdraví a nemoci. Grada. Praha. U.S.

Department

of

Agriculture

(2004)

USDA

Database

for

the

Proanthocyanidin Content of Selected Foods. [online] Poslední revize: 3.2014 [cit. 2014-3-23] Dostupné z: http://www.ars.usda.gov/main/site_main.htm?modecode=1235-45-00 Velíšek, J. (2002) Chemie potravin 3, 1. vydání. Ossis, Tábor Wang, S. Y. (2011) Correlation of Antioxidants and Antioxidant Enzymes to Oxygen Radical Scavenging Activities in Berries. In: Berries and Cancer Prevention. Spriger. New York.

81

Wang, H. T., Liu, Ch. F., Tsai, T. H., Chen, Y. L., Chang, H. W., Tsai, Ch. Y., Leu, S., Zhen, Y. Y., Chai, H. T., Chung, S. Y., Chua, S., Yen, Ch. H., Yip, H. K. (2012) Effect of obesity reduction on preservation of heart function and attenuation of left ventricular remodeling, oxidative stress and inflammation in obese mice. Journal of Translational Medicine. 10, 145 Wiegand, H., Boesch-Saadatmandi, Ch., Regos, I., Treutter, D., Siegfried, W., Rimbach, G. (2009) Effects of Quercetin and Catechin on Hepatic Glutathione-S Transferase (GST), NAD(P)H Quinone Oxidoreductase 1 (NQO1), and Antioxidant Enzyme Activity Levels in Rats. Nutrition and Cancer. 61(5), 717 - 722 Williams, Ch. H. jr., Arscott, L. D., Müller, S., Lennon, B. W., Ludwig, M. L., Wang, P., Veine, D. M., Becker, K., Schirmer, R. H. (2000) Thioredoxin reductase. European Journal of Biochemistry. 267, 6110 -6117 Ye, L., Zhang,Y. (2001) Total intracellular accumulation levels of dietary isothiocyanates determine their activity in elevation of cellular glutathione and induction of Phase 2 detoxification enzymes. Carcinogenesis. 22(12), 1987 -1992 Zhao, Y., Chen, T. W., Wang, X., Matthees, D., Hu, Y., Guan, X. (2010) Effects of glutathione reductase inhibition on cellular thiol redox state and related systems. Archives of biochemistry and biophysics. 485(1), 56 – 62 Zhong, L., Amér, E. S. J., Holmgren, A. (2000) Structure and mechanism of mammalian

thioredoxin

reductase:

The

active

site

is

a

redox-active

selenolthiol/selenenylsulfide formed from the conserved cysteine-selenocysteine sequence. Proceedings of the National Academy of Sciences. 97(11), 5854–5859

82