MASARYKOVA UNIVERZITA Fakulta přírodovědecká Ústav chemie
Analýza biologicky aktivních látek ve vinohradnickém materiálu metodou kapilární elektroforézy
Diplomová práce
BRNO, Duben 2011
Bc.Vendula Roblová
Poděkování Především děkuji vedoucí mé diplomové práce Mgr. Miroslavě Bittové, Ph.D. za cenné rady a čas, který mi věnovala, pomoc při praktickém měření a sepisování práce. Díky patří také PharmDr. Karlu Šmejkalovi, Ph.D. z Veterinární a farmaceutické univerzity Brno, za umoţnění a pomoc s provedením nadkritické fluidní extrakce. Dále bych chtěla poděkovat Bc. Elišce Hanzlíkové za spolupráci na tomto tématu a provedení identifikace analytů metodou LC-MS. Dále také rodině a přátelům za podporu po čas mého studia.
Prohlášení Prohlašuji, ţe jsem diplomovou práci vypracovala samostatně. Pouţila jsem pouze uvedenou literaturu a experimentální výsledky dosaţené v laboratořích Ústavu chemie Masarykovy univerzity.
V Brně dne 30.4.2011
OBSAH OBSAH.................................................................................................................................. 4 1.
ÚVOD............................................................................................................................ 7
2.
CÍL PRÁCE ................................................................................................................... 8
3.
TEORETICKÁ ČÁST ................................................................................................... 9 3.1.
Úvod do kapilární zónové elektroforézy (CZE) ..................................................... 9
3.1.1.
Elektroforetická pohyblivost ......................................................................... 10
3.1.2.
Elektroosmotický tok ..................................................................................... 11
3.1.3.
Instrumentace................................................................................................. 12
3.2.
Extrakce pevnou fází ............................................................................................ 13
3.3.
Superkritická fluidní extrakce ............................................................................... 16
3.4.
Réva vinná (Vitis vinifera) ................................................................................... 17
3.5.
Polyfenolické látky ............................................................................................... 18
3.5.1. 4.
CZE V ANALÝZE POLYFENOLICKÝCH LÁTEK ................................................ 23 4.1.
5.
Rozdělení polyfenolů: ................................................................................... 19
Statistické zpracování výsledků ............................................................................ 25
EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST ....................................................................................... 27 5.1.
Přístrojové vybavení ............................................................................................. 27
5.2.
Pouţité chemikálie ................................................................................................ 27
5.3.
Optimalizace separačních podmínek .................................................................... 29
5.4.
Vyhodnocení opakovatelnosti metody pro CE ..................................................... 31
5.5.
Stanovení limitu detekce a limitu stanovitelnosti metody .................................... 33
5.6.
Příprava vzorků ..................................................................................................... 33
5.7.
Extrakce pevnou fází (SPE) .................................................................................. 36
5.8.
Extrakce kapalina- kapalina .................................................................................. 42
5.9.
Nadkritická fluidní extrakce ................................................................................. 47
5.10. Identifikace a kvantifikace vzorků mouček z hroznových semínek ..................... 50 5.11. Identifikace vzorků stonků vinné révy.................................................................. 56 5.12. Identifikace a kvantifikace vzorků listů vinné révy .............................................. 58 6.
7.
ANALÝZA DOPLŇKŮ STRAVY ............................................................................. 62 6.1.
Separační podmínky ............................................................................................. 62
6.2.
Příprava vzorků ..................................................................................................... 63
6.3.
Identifikace polyfenolických látek v potravinových doplňcích ............................ 65
ZÁVĚR A DISKUZE .................................................................................................. 66 4
8.
SEZNAM POUŢITÝCH ZKRATEK ......................................................................... 68
9.
SEZNAM OBRÁZKŮ ................................................................................................ 68
10.
POUŢITÁ LITERATURA ....................................................................................... 70
Příloha 1: Absorbční spektra standardů polyfenolických látek .......................................... 74 Příloha 2: Struktury pouţitých polyfenolických .................................................................. 76 Příloha 3: Testování opakovatelnosti retenčních charakteristik .......................................... 78
5
ANOTACE Předkládaná diplomová práce je zaměřena na vyuţití kapilární zónové elektroforézy pro analýzu polyfenolických látek v různých částech vinné révy. Zabývá se zpracováním a úpravou rostlinných vzorků, separací a identifikací vybraných polyfenolických látek v těchto vzorcích. Analyzovaným rostlinným materiálem byly části vinné révy, a to mletá hroznová semínka, stonky a listy. Pro přípravu vzorků bylo testováno několik extrakčních metod a to SPE, SFE a L-L extrakce. Vybraný postup byl aplikován na přípravu vzorků, které byly poté separovány pomocí kapilární zónové elektroforézy. Metodou přídavku standardu byla provedena identifikace polyfenolických látek ve vzorcích.
Cílem bylo porovnat výskyt a obsah
vybraných polyfenolů v jednotlivých částech vinné révy.
ANOTATION Presented diploma thesis is focused on application of capillary zone electrophoresis for analysis of polyphenolic substances in the different parts of vine. It deals with processing and modification of plant samples, separation and identification of selected polyphenolic substances in these samples. The analyzed plant materials were parts of vine, namely vine seeds, stalks and leaves. For preparation of samples a several extraction methods SPE, SFE and L-L extraction were tested. Chosen technique was applied on the preparation of the samples, which were afterwards separated by capillary zone electrophoresis. The identification of polyphenolic substances in the samples was realized by standard addition method. The goal was to compare the presence and content of polyphenols in vine parts.
6
1. ÚVOD Analýza biologicky aktivních látek v přírodních materiálech je velmi aktuální téma. Pod pojem biologicky aktivní látky lze zahrnout všechny látky, které více či méně ovlivňují ţivot organismů. Nemalou část této skupiny tvoří polyfenolivké látky. Polyfenolické látky jsou přírodní látky obsaţené v téměř kaţdé vyšší rostlině, kde plní především funkci sekundárních metabolitů. Pro jednotlivé druhy rostlin se struktura a vlastnosti těchto látek liší. V posledních letech se tyto látky stávají středem pozornosti jak vědců z oborů medicíny, biologie, biochemie, ekologie, lesnictví nebo agronomie, tak odborníků na výţivu. Jiţ delší dobu je znám jejich pozitivní vliv na zdraví člověka, především v oblasti kardiovaskulárních onemocnění. V 1819 popsal lékař Samuel Black skutečnost, ţe Francouzi, i přes konzumaci velkého mnoţství nasycených tuků a vína, trpí nízkým výskytem akutních srdečních příhod. Tento jev se dnes označuje jako francouzský paradox. Dnes víme, ţe červené víno je bohatým zdrojem flavonoidů, z nichţ neznámější je resveratrol, u kterých byl prokázán pozitivní vliv při boji proti rakovině, srdečním chorobám nebo proti degenerativním nervovým onemocněním. Vinná réva je jednou z nejstarších pěstovaných kulturních plodin. Podle archeologických nálezů pěstovali vinou révu jiţ staří Egypťané v roce 2240 př. n. l. Zásluhou starých Římanů se réva rozšířila po celé Evropě, během posledních století se pěstování révy rozšířilo téměř po celém světě. Réva je liána dorůstající délky aţ 30 m, je to opadavá a samosprašná rostlina, jejíţ délka ţivota je aţ 70 let. Víme, ţe vysoké mnoţství polyfenolů obsahují slupky vinných hroznů, z kterých se tyto látky dostávají do vína. Jsou ale polyfenolické látky také v jiných částech vinné révy? Nalézt odpověď na tuto otázku bylo jedním z úkolů této práce. Tato diplomová práce se zabývala analýzou vybraných polyfenolických látek ve vinohradnickém materiálu. Úkolem práce bylo najít vhodný postup pro zpracování rostlinných vzorků a porovnat zastoupení vybraných polyfenolů v hroznových jádrech, stoncích a listech vinné révy.
7
2. CÍL PRÁCE Hlavním cílem této práce bylo srovnání a výběr vhodného postupu pro zpracování a analýzu vzorků vybraného vinohradnického materiálu. Součástí práce bylo: Porovnání extrakčních metod pro úpravu vzorků Optimalizace separačních podmínek CZE pomocí modelové směsi vybraných polyfenolů Separace a identifikace vybraných látek ve vzorcích jednotlivých částí vinné révy Porovnání obsahu polyfenolických látek v jednotlivých vzorcích Aplikace metody na přípravu a analýzu vzorků potravinových doplňků, připravených z vinné révy a zeleného čaje
8
3. TEORETICKÁ ČÁST 3.1. Úvod do kapilární zónové elektroforézy (CZE) Kapilární elektroforéza obecně, je elektromigrační metoda, slouţící k separaci nabitých částic účinkem elektrického pole. Elektromigrační metody obecně vyuţívají k separaci rozdílných pohyblivostí látek ve stejnosměrném elektrickém poli, které vzniká vkládáním konstantního napětí mezi dvě elektrody. Molekuly látek jsou rozdělovány na základě rozdílných elektroforetických mobilit. Vhodným výběrem techniky lze separovat anionty, kationty i neutrální částice ve směsi. Mezi průkopníky v kapilární elektroforéze patří švédský vědec Arne Tiselius, který za své objevy v problematice separace proteinů dostal v roce 1948 Nobelovu cenu. O další rozvoj této techniky se zaslouţil Stellan Hjertén, který prováděl elektroforézu v úzké skleněné trubici s vnitřní stěnu pokrytou methylcelulózou. Elektroforetická separace se v CZE provádí v kapiláře, která je naplněna základním elektrolytem a umístěna v elektrickém poli. V kapilární zónové elektroforéze se pouţívá pouze jeden tzv. základní elektrolyt BGE (background electrolyte). Molekuly látek jsou rozdělovány na základě rozdílných elektroforetických mobilit. Malé částice s větším nábojem se budou v kapiláře pohybovat rychleji, neţ větší částice s menším nábojem. Na separaci jak kladně a záporně nabitých molekul (iontů), ale také neutrálních částic, se podílí také elektroosmotický tok (EOF). Do kapiláry je dávkován vzorek o objemu 10-100 nl, vloţené konstantní napětí vytvoří stejnosměrné elektrické pole a dochází k separaci částic. Na druhém konci kapiláry je umístěn detektor a vyhodnocovací zařízení, které umoţňuje získat záznam tzv. elektroforeogram pro následné vyhodnocení. Kapilární elektroforéza má široké spektrum uplatnění, je to metoda vhodná k separaci anorganických částic, organických a biologických materiálů (DNA, proteiny) v posledních letech je také hojně vyuţívanou metodou při studiu nanočástic a farmak. Velkou výhodou je malá spotřeba rozpouštědel a malé objemy vzorků, ale také vysoká citlivost a dobré dělicí schopnosti. Při správné volbě separačních podmínek můţe dosahovat kapilární elektroforéza účinnosti separace aţ milion teoretických pater. [1, 2]
9
Na principu migrace nabitých látek v elektrickém poli jsou odvozeny také následující metody: Elektroforéza v plošném uspořádání Kapilární gelová elektroforéza (CGE) Kapilární izotachoforéza (CITP) Kapilární izoelektrická fokusace (CIEF) Micelární elektrokinetická kapilární elektrochromatografie (MEKC) Kapilární elektrochromatografie (CEC) 3.1.1. Elektroforetická pohyblivost Elektricky nabitá částice se pohybuje v elektrickém poli ve směru, který je dán znaménkem jejího náboje a orientací elektrického pole. Rychlost tohoto pohybu ovlivňuje náboj částice ale i odpor prostředí. Částice je uváděna do pohybu elektrickou silou, ale zároveň ji odpor viskózního prostředí ji zpomaluje. Elektroforetickou pohyblivost (mobilitu) udává rychlost pohybu iontu v roztoku. Směr pohybu je pak výsledkem součtu směru elektrické síly a zmíněného odporu prostředí. Elektroforetickou pohyblivost μe lze snadno vypočítat z experimentálně zjištěných migračních časů analytu tm, tj. čas, za který analyt doputuje z místa nástřiku na místo detekce. Je-li v systému uplatňován elektroosmotický tok, je potřeba znát migrační čas neutrálních částic t0. Elektroforetická pohyblivost se tak počítá ze vztahu: (1) kde lt je celková délka kapiláry, ls je separační délka kapiláry a U je vloţené pracovní napětí, tm je migrační čas analytu a t0 je migrační čas neutrálních látek. Vliv pH Při elektroforéze slabých kyselin nebo bází je jednou z moţností jak změnit elektroforetickou pohyblivost částic je změna pH pracovního elektrolytu. Při změně pH se mění
elektroosmotický
tok,
zvýšením
pH
základního
elektrolytu
se
zvyšuje
elektroosmotický tok, mění se také ionizace a tím i pohyblivost dané látky. Při separaci dvojice látek je optimální hodnota pH taková, při které je rozdíl pohyblivostí těchto látek největší.
10
Vliv organických rozpouštědel Organická rozpouštědla se do elektrolytu přidávají pro zvýšení rozpustnosti analytu nebo pro ovlivnění stupně ionizace sloţek vzorku. Přídavek organického rozpouštědla způsobuje sníţení elektroosmotického toku. Nejčastěji se jako organický modifikátor pouţívá metanol nebo acetonitril. [1, 2, 38, 39] 3.1.2. Elektroosmotický tok Elektroosmotický tok (EOF – electroosmotic flow) je děj zejména u křemenných kapilár s vnitřním průměrem v desítkách μm. Na stěně křemenné kapiláry jsou volné silanolové skupiny, které se v kontaktu s roztoky elektrolytů o vyšším pH disociují a stěna získává záporný náboj. Ke stěně jsou přitahovány kladné ionty z elektrolytu a vytváří tak elektrickou dvojvrstvu, nazývanou také Sternova vrstva. Blíţe středu kapiláry je tzv. difúzní vrstva (Gouy- Chapmanova vrstva), ve které je převaha kationtů. Po aplikaci napětí začnou ionty difúzní vrstvy migrovat k záporné elektrodě, katodě. Přebytek kationtů v difúzní vrstvě umoţňuje tok celého systému k elektrodě rychlostí elektroosmotického toku νeof, která je konstantní. U křemenných kapilár je moţnost eliminovat EOF pomocí tzv. pokrývání. Pokryté kapiláry (coated capillaries) mají na vnitřní povrch například kovalentně vázaný polymer, který eliminuje záporný náboj stěny a tím i elektroosmotický tok. Nepokryté kapiláry (uncoated capillaries) nemají modifikovaný vnitřní povrch a uplatňuje se zde efekt silanolových skupin.
Obr. 1: Znázornění elektroosmotického toku
11
Rychlost elektroosmotického toku přímo závisí na intenzitě elektrického pole a také na velikosti náboje, který je na vnitřní stěně kapiláry. Náboj stěny výrazně ovlivňuje pH základního elektrolytu, kterým je kapilára naplněna, čím vyšší je pH elektrolytu tím je negativní náboj stěny větší a elektroosmotický tok je rychlejší. Rychlostní profil EOF je téměř rovinný, tím je eliminováno rozmývání zón a píky jsou mnohem uţší neţ v kapalinové chromatografii. [2, 38, 39]
3.1.3. Instrumentace Zařízení pro CZE tvoří: separační jednotka tj. kapilára, zdroj stejnosměrného vysokého napětí, dvě elektrody ponořené do nádobek s roztokem základního elektrolytu, detektoru a vhodného zapisovače nebo počítače.
Obr. 2: Schéma základního uspořádání kapilární zónové elektroforézy Kapiláry Mezi nejvíce pouţívané kapiláry v kapilární elektroforéze patří kapiláry křemenné, jsou velmi křehké, a proto se pokrývají tenkou vrstvou polyimidu. Dalším vhodným materiálem pro výrobu kapilár je teflon, jejich pouţití je spíše výjimečné. Obvyklý vnitřní průměr kapiláry je 50 nebo 75 μm, délka kapiláry od 20 cm aţ 1 m. U kapilár se rozlišují dvě délky, první je celková délka kapiláry lt a druhou je tzv. efektivní (separační) délka ls tj. délka kapiláry od konce na který byl dávkován vzorek po místo detekce. Kapiláru je vhodné termostatovat na poţadovanou teplotu. Chlazením kapiláry dochází k rychlému odvodu Jouleova tepla, nedochází tak k negativnímu ovlivnění píků. Je tak zlepšována stabilita systému a lepší reprodukovatelnost analýz. 12
Zdroj napětí Principem elektroforézy je migrace elektricky nabitých částic v stejnosměrném elektrickém poli. Elektrické pole je vytvořeno vloţením konstantního stejnosměrného napětí
mezi
elektrody.
Nejčastěji
se
jako
zdroj
elektrického
pole
vyuţívá
vysokonapěťových zdrojů. Separace probíhá při napětí v rozmezí 0-30 kV, proud je potom v hodnotách 0-300 μA.
Detektory Detektory pro kapilární elektroforézu jsou velmi citlivé a detekce probíhá tzv. online, signál je získáván přes detekční celu přímo z kapiláry. Mezi nejpouţívanější způsoby detekce patří spektrofotometrická, která je zaloţena na absorpci ultrafialového nebo viditelného záření. Dalším typ detekce vyuţívá fluorescenci, velmi citlivou metodou je vyuţití LIF (Laser Induced Fluorescence). Mezi další typy detekcí patří konduktometrická, refraktometrická, vodivostní nebo amperometrická detekce. Výběrem vhodného detektoru můţeme získat jak kvalitativní, tak kvantitativní výsledek analýzy. V posledních době je často
vyuţívána
moţnost
spojení
kapilární
elektroforézy
s jinými
technikami,
tzv. „hyphenated techniquies“. Jednou z těchto technik je spojení kapilární elektroforézy s hmotnostním spektrometrem (CE-MS), kdy je výsledkem nejen identifikace analytu, ale také je moţno získat informace o struktuře látky. [1, 17, 41]
3.2. Extrakce pevnou fází Extrakce pevnou fází (Solid phase extraction, SPE) je technika vyuţívaná především pro přípravu vzorků před analýzou, pro izolaci, čištění a zakoncentrování analytů. Pouţívá se především při zpracování kapalných vzorků, pro extrakci středně těkavých a netěkavých látek, jejich zakoncentrování a odstranění neţádoucích látek, které mohou rušit následná analytická stanovení. Principem SPE je sorbce analytu na tuhou fázi z fáze kapalné. Interakce analytu s tuhou fází musí být silnější neţ s fází kapalnou, ve které je analyt rozpuštěn. Princip sorbce je obdobný jako u kapalinové chromatografie. Extrakce probíhá nejčastěji v kolonkách, tj. trubičkách z polypropylenu nebo skla, naplněných vhodným sorbentem, nebo můţe být analyt slisován se skleněnými vlákny do disků. Nejdůleţitějším krokem je volba správného sorbentu.
13
Nejčastěji se pouţívají chemicky obrácené vázané fáze na bázi silikagelu, normální fáze a iontově výměnné fáze, ale existuje celá řada dalších různě selektivních sorbentů. SPE má oproti jiným technikám mnoho výhod, především oproti extrakci v soustavě kapalina- kapalina. Hlavní výhodou SPE je úspora organických rozpouštědel a dobrá selektivita, ale také moţnost metodu automatizovat a navázat další instrumentální metody. Metoda je rychlá, přesná a dobře reprodukovatelná. [1, 17, 19]
Instrumentace Základem SPE jsou extrakční kolonky, různých velikostí naplněné vhodných sorbentem, do kterých je aplikován kapalný vzorek a pouţitá rozpouštědla. Sorbent je tvořen částicemi obvykle průměru 30 aţ 160 µm, které jsou v kolonce uzavřeny fritami z polyetylenu (nebo polytetrafluorethylenu). Průtok kapalin přes kolonku můţeme urychlovat třemi způsoby: centrifugací vakuem na výstupu z kolonky tlakem na vstupu do kolonky
Obr. 3: Zařízení pro SPE extrakci [46] Sorbenty Sorbenty pro SPE
jsou nejčastěji na bázi modifikovaných částic silikagelu,
na povrchu silanolových skupin jsou chemicky vázány skupiny různých vlastností, (např. C8, fenol, CH, CN) ty určují vlastnosti sorbentu. Při separaci se vyuţívá několika mechanismů zachycování látek, které spočívají v různých molekulárních interakcích mezi analytem a sorbentem. Nejčastější interakce jsou: van der Waalsovy síly kation-aniontové interakce vodíkové vazby a dipól-dipól interakce
14
Podle typu sorbentu převaţuje jedna z interakcí, označovaná jako primární, vedlejší interakce jako sekundární. Při volbě sorbentu zvaţujeme chemické vlastnosti vzorku a výslednou podobu vzorku, tj. polaritu, rozpustnost a čistotu analytu, vlastnosti matrice vzorku, ale také další analytický postup zpracování vzorku. a. Nepolární sorbenty - nepolární fáze mají hydrofobní vlastnosti, pouţívají se pro extrakci nepolárních a středně polárních látek. Jako extrakční rozpouštědlo se pouţívají polární kapaliny (např. voda), ze které se nejselektivněji váţou nejméně polární látky, např. sorbenty C18, C8, C2, CH, CN b. Polární sorbenty - polární fáze jsou selektivní pro polární sloučeniny, ochotně zadrţují vodu i vzdušnou vlhkost, proto se kolonky musí uchovávat v suchém prostředí, např. Silica, DIOL c. Iontově- výměnné sorbenty - umoţňují výměnu iontů mezi vzorkem a sorbentem. Jsou to sorbenty označované SAX, CBA, SCX, PRS. d. Speciální sorbenty - jsou sorbenty, jejichţ základem není silikagel, ale například alumin (oxid hlinitý). Povrch sorbentu lze upravit kyselými, neutrálními nebo zásaditými roztoky, např. Florisil Extrakce pevnou fází je vyuţívána především v přípravě vzorku na vhodnou formu pro samotnou analýzu. Umoţňuje nám zakoncertování analytu ve vzorku, výměnu rozpouštědel ale i odstranění neţádoucích substancí. [1, 10, 11, 19] Postup extrakce tuhou fází: Postup samotné extrakce je tvořen čtyřmi po sobě jdoucími kroky: a. Kondicionování kolonky – před samotnou extrakcí je nutné zajistit vhodnou smáčivost kolonky. Kolonky se nejčastěji promývají metanolem, acetonitrilem nebo jiným vhodným organickým rozpouštědlem. Vhodný objem rozpouštědla na solvataci je 0,8 -1,0 ml na 100 mg sorbentu. b. Dávkování vzorku - vzorek se aplikuje přímo na kolonku a nechá se protékat. Pro kolonku se 100 mg náplně je vhodný průtok 1-2 ml/min. Pokud je hmotnost sorbentu větší, musí se průtok přizpůsobit. c.
Promývání vzorku - úkolem tohoto kroku je odstranění neţádoucích látek obsaţených ve vzorku, bez eluce analytu. Důleţitý je zde výběr rozpouštědla, vhodné je to rozpouštědlo, ve kterém analyt není rozpustný.
15
d. Eluce analytu – posledním krokem postupu je vymytí analytu vázaného na sorbent do poţadovaného rozpouštědla. Objem elučního rozpouštědla je 250 µl na 100 mg sorbentu. [1, 11, 19]
3.3. Superkritická fluidní extrakce Superkritická fluidní extrakce (Supercritical Fluid Extraction, SFE) je další z prekoncentračních technik, vyuţívajících k extrakci analytů z pevného vzorku oxid uhličitý v nadkritickém (superkritickém) stavu, např. oxid uhličitý (kritická teplota < 31 °C a kritický tlak < 7149 kPa). Za těchto podmínek má CO2 vlastnosti kapaliny a je ideálním rozpouštědlem pro nepolární a málo polární sloučeniny, tím vznikají ideální podmínky pro rychlé extrakce s maximální výtěţností. Protoţe je oxid uhličitý nepolární, přidává se při extrakci polárních látek k nadkritické kapalině polární rozpouštědlo tzv. modifikátor. Vlastnosti superkritické kapaliny se mění nejen přidaným mnoţstvím modifikátoru, ale také regulací tlaku a teploty, mění se tak hustota kapaliny a její extrakční síla, tím se dosahuje vlastností organických rozpouštědel v řadě od chloroformu aţ po hexan. SFE je díky variabilní síle rozpouštědla vyuţívána pro čištění, extrakci, frakcionaci i rekrystalizaci materiálů. Velkou výhodou této techniky je jak rychlost, která se zkracuje na desítky minut aţ minuty, tak moţnost spojení s analyzátorem a kombinace s plynovou chromatografií, vysoce účinnou kapalinovou chromatografií nebo FTIR (Fourier transform infrared spectroscopy). [1, 13, 14]
Obr. 4: Schéma extraktoru pro nadkritickou fluidní extrakci
16
3.4. Réva vinná (Vitis vinifera) Réva vinná patří mezi jednu z nejstarších kulturních plodin pěstovaných člověkem. O původu kulturních odrůd révy (Vitis vinifera subsp. vinifera) se spekuluje, protoţe není jednoznačně vysvětlen. Jeden z názorů říká, ţe vznikla šlechtěním divoké révy vinné lesní (Vitis vinifera subsp. sylvestris), ale někteří botanikové s tím nesouhlasí a její původ odvozují od v dnešní době vyhynulých třetihorních druhů rostlin. V dnešní době se kulturní odrůdy vinné révy pěstují v mírném pásu celé zeměkoule. V České Republice jsou čtyři základní vinohradnické oblasti: znojemsko-mikulovská, hustopečsko-hodonínská, bzenecko-stráţnická a česká. [21] Botanické taxonomické zařazení: Říše:
rostliny
(Plantae)
Podšíře:
cévnaté rostliny
(Tracheobionta)
Oddělení:
krytosemenné
(Magnoliophyta)
Třída:
vyšší dvouděloţné
(Rosopsida)
Řád:
řešetlákotvaré
(Rhamnales)
Čeleď:
révovité
(Vitaceae)
Rod:
réva
(Vitis)
Popis rostliny Réva je liána, která se pomocí úponů přichycuje k oporám. Ve volné přírodě mohou jedinci divoké révy dorůstat do výšek aţ 30 m a průměru kmene 1,5 m. Kulturní odrůdy pěstované na vinicích dosahují maximálních výšek do 4 m a průměru kmene do 30 cm. Listy mají 3 aţ 5 laloků, jsou okrouhlé o průměru do 15 cm. Kmen je světlehnědý a v dlouhých svislých pruzích se loupe. Jednotlivé květy jsou ţlutozelené a vytváří bohaté laty. Kulturní druhy jsou jednodomé, ale divoké druhy dvoudomé. Plodem révy jsou bobule. Velikost, tvar a barva bobulí je různá podle odrůdy. Obecně můţeme říct, ţe bobule jsou kulovitého nebo vejčitého tvaru mají průměr 0,4 0,5 cm a délku aţ 2,5 cm. Barva bobulí je od zelené, zelenoţluté, ţluté aţ po červenou nebo tmavě fialovou. Kořeny jsou i přes 10 m dlouhé, proto se révě dobře daří i na skalnatém podloţí. [21, 22, 40]
17
Obr. 5: Popis částí vinné révy: 1 hrozen, 2 list, 3semeno, 4 jednoleté dřevo, 5 úpon, 6 květenství, 7 dvouleté dřevo, 8 pupen, 9 článek. [40]
3.5. Polyfenolické látky Polyfenolické látky jsou z velké části produkty sekundárního metabolismu rostlin. V rostlinách plní mnoho důleţitých funkcí, slouţí jako ochrana před UV zářením a patogeny, proti oţírání nebo jako výztuha těla rostlin. Do dnes bylo identifikováno na 8 000 fenolických látek. Nejběţněji se vyskytujícími rostlinnými polyfenoly jsou fenolové kyseliny, flavony a stilbeny. Pro člověka mají tyto látky také mnoho pozitivních biologických vlastností. Dosavadní studie uvádí, ţe působí jako antioxidanty a pomáhají tlumit kardiovaskulární a nádorová onemocnění. Mechanismus účinku polyfenolů je závislý na jejich chemické struktuře, která je velmi různorodá. Polyfenoly jsou jednoduché sloučeniny tvořené jedním aromatickým jádrem aţ po polymerní struktury taninů. V současné době je velmi aktuální výzkum jejich uplatnění při léčbě Parkinsonovy a Alzheimerovy choroby. Vysoké hladiny polyfenolů se obecně nacházejí v slupce ovocných plodů. Mezi nejvýznamnější zdroje polyfenolů patří bobuloviny, čaj, pivo, hroznové víno (víno jako nápoj), olivový olej, kakao/čokoláda, káva, vlašské ořechy a arašídy. Obsah polyfenolů v běţně konzumovaných potravinách je uveden v Tabulce 1. [18, 20, 25]
18
Tabulka 1. Obsah polyfenolů v potravinách1 Cereálie ječmen proso kukuřice čirok cizrna
mg/100g 1200-1500 590-1060 30,9 170-10260 78-230
37-429 17-20
Ořechy arašídy pekanové ořechy
% obsahu 0,04 8-14
jahody
38-218
Nápoje
mg/l
Zelenina rajčata kapusta pórek
mg/100g 85-130 25 20-40
pivo červené víno bílé víno čaj
60-100 1000-4000 200-300 750-1050
cibule
100-2025
Ovocné šťávy
mg/l
petrţel celer
55-180 94
Ovoce jablka černý rybíz borůvky brusinky pomeranče hrušky
mg/100g 27-298 140-1200 135-280 77-247 50-100 2-25
maliny červený rybíz
jablečná jablečná pomerančová
2-16 2- 16 370-7100
3.5.1. Rozdělení polyfenolů: Podle literatury existuje několik dělení polyfenolických látek. Jde o velmi obsáhlou skupiny látek a proto je jejich zařazení obtíţné. Jedním z moţných rozdělení je od J. Trny a E. Táborské [47]. Polyfenolické látky můţeme rozdělit podle počtu aromatických kruhů a podle vazby mezi jednotlivými kruhy do 4 základních skupin: fenolové kyseliny (kyselina benzoová a její deriváty, deriváty kyseliny skořicové) flavonoidy (dále se dělí na flavonoly, flavony, isoflavony, flavanony, flavanoly) stilbeny (např. resveratrol) lignany (např. enterodiol a enterolakton) Fenolové kyseliny V molekule obsahují jeden benzenový kruh, na který jsou navázány karboxylové a hydroxylové skupiny. Fenolové kyseliny lze rozdělit do dvou skupin: a. deriváty kyseliny benzoové (např. kyselina galová, kyselina ellagová) b. deriváty kyseliny skořicové (kyseliny kávová, ferulová a sinapová) Zendulka, O., Polyfenoly ve výživě jako možná prevence nádorových onemocnění. Brno 2008. Diplomová práce. Masarykova Univerzita.
*
19
V rostlinném materiálu se hojněji vyskytují polyfenoly odvozené od kyseliny skořicové, deriváty kyseliny benzoové se v přírodě vyskytují převáţně vázané se sacharidy nebo organické kyseliny.
Flavonoidy Flavonoidy jsou nejobsáhlejší skupinou polyfenolických látek, jejich funkcí je ochrana rostliny před UV zářením, mikroby a hmyzem. Jsou to rostlinné pigmenty zodpovědné za barvu květů, plodů někdy také listů. Jejich struktura je tvořena dvěma benzenovými jádry a jedním kyslíkatým heterocyklem. Všechny tři cykly mohou být substituovány methylovými nebo hydroxylovými skupinami.
Obr. 6: Obecná struktura flavonoidu Podle stupně oxidace kruhu s kyslíkem se dělí do těchto skupin: a. Flavanony - mají na uhlíku C4 navázanou oxo- skupinu např. esperetin, eriodictyol.
Obr. 7: Obecná struktura flavanonu b. Flavony - vyskytují se ve volné, esterové nebo glykosidické formě. Jsou velmi málo rozpustné ve vodě a nerozpustné v tucích např. fisetin, krysin.
Obr. 8: Obecná struktura flavonu
20
c. Flavanoly - se vyskytují jak ve volné formě jako např. katechin, epikatechin tak ve formě polymerů tzv. proanthokyanidinů, to jsou katechiny spojené C4 a C8 vazbou.
Obr. 9: Obecná struktura flavanolu d. Flavonoly - vyskytují se většinou jako glykosidy, ve kterých je cukernou sloţkou glukóza nebo rhammóza. Mají antioxidační účinky, glykosidem je např. rutin, kvercetin a kaempferol jsou aglykony.
Obr. 10: Obecná struktura flavonolu e. Isoflavony – jsou jednou z nejprozkoumanějších skupin polyfenolů, jejich struktura je podobná estrogenům a proto jsou schopny vázat se na estrogenové receptory. Mají antioxidační a antibakteriální účinky ale některé deriváty jsou toxické např. genistein, glycitein, daizein.
Obr. 11: Obecná struktura isoflavonu f. Anthokyaniny – vyskytují převáţně u vyšších rostlin jako glykosidy, ve kterých je cukernou sloţkou glukóza, galaktóza nebo arabinóza. U rostlin se vyskytují v buněčných vakuolách a jsou dobře rozpustné ve vodě např. kyanidin, enidin.
21
Stilbeny Jsou látky, které jsou v organismu syntetizovány při vstupu patogenu. Mají významné antimikrobiální vlastnosti. Do skupiny stilbenů patří i jeden z nejznámějších polyfenolů vůbec, resveratrol. Resveratrol je stále předmětem mnoha vědeckých studii, vyskytuje se v bobulích vinné révy, ořechách a zelenině. (V červeném víně je obsah resveratrolu 2 - 6 mg/l). [43]
Lignany Lignany vznikají metabolickou dráhou z kyseliny skořicové nebo p-kumarové. Jejich funkce nebyla zcela objasněna, ale studie uvádí, ţe hrají důleţitou roli v chemických interakcích mezi rostlinami a houbami, rostlinami a hmyzem, a rostlinami navzájem. Mezi nejznámější patří enterodiol a enterolakton. [18, 20, 25, 47]
22
4. CZE V ANALÝZE POLYFENOLICKÝCH LÁTEK Polyfenolické látky jsou v dnešní době předmětem mnoha studií, mezi nejběţnější techniky pouţívané k jejich separaci, identifikaci a kvantifikaci patří HPLC, CE a GC. Jejich výskyt ve velkém mnoţství běţně dostupných potravin, klade otázku: Je, a v jaké míře, jejich konzumace prospěšná pro člověka? Na tuto otázku se snaţí odpovědět mnoho studií [44] o jejich antioxidačních vlastnostech a o jejich pozitivním působení na kardiovaskulární systém. Kapilární zónová elektroforéza je hojně vyuţívanou metodou pro analýzu přírodních materiálů. Její pouţití má mnoho výhod, malé objemy vzorků (µl), rychlost separace, ale hlavně vyuţití online pre-koncetračních technik, které umoţňují zakoncentrování vzorku bez předchozích úprav přímo během analýzy. Tyto techniky jsou popsány v práci autorek Kartsova, L.A., et al. [28]. Pouţitím těchto technik při stanovení polyfenolů v rostlinných extraktech z trubkovce tyčinkovitého, který je hlavní sloţkou ledvinových čajů, se ve své studii zabývali Honegr, Jan, et al. [29]. Trendem posledních let není pouze analýza polyfenolických látek ve vínech a vinné révě, za poslední léta bylo publikováno několik studií o analýze polyfenolických kyselin v různých přírodních produktech například v medu, Pyrzynska, Krystyna, et al. [30], v olivovém oleji, Gómez Caravaca, Ana María, et al. [31] dále také v propolis, Volpi, Nicola [33], nebo v rozmarýně Crego, Antonio Luis, et al. [32]. Základní parametry pro separaci polyfelických sloučenin pomocí kapilární zónové elektroforézy byly publikovány ve studii autorů Peres, Renato G., et al. [6]. Ta se zabývá optimalizací separačních podmínek a jejich aplikací při stanovení polyfenolických kyselin ve vzorcích brazilských vín. Separací fenolických kyselin ve vínech se dále zabývali Cartoni, Giampaolo; et al. [5]. Tyto dvě studie mají společné pouţití nepokrytých křemenných kapilár na separaci a spektrofotometrickou detekci. V článku Kubáň, Petr; et al. [4], vyuţili spojení kapilární elektroforézy s nepřímou konduktometrickou detekcí pro separaci směsi standardů fenolických kyselin. Zajímavé výsledky přinesla studie Priego Capote, Feliciano; et al. [35], která se zabývala analýzou polyfenolů v hroznových slupkách kapilární elektroforézou s kombinací fluorescenční a DAD detekce. Autoři zvolili jako základní elektrolyt 50 mmol.l-1 tetraborát sodný s 10% přídavkem methanolu o pH 8,4.
23
Přídavek organického modifikátoru do základního elektrolytu vyuţili při separaci také Peres, Renato G., et al. [6]., kteří metodou faktorového designu stanovili jako nejvhodnější separační elektrolyt 17 mmol.l-1 s 20% přídavkem methanolu. S vyšším přídavkem organického modifikátoru se při aplikace stejných hodnot napětí, sniţují hodnoty proudu, důsledkem je delší času jednotlivých analýz. Při analýze polyfenolů v rostlinách jsou často pouţívány různé typy extrakcí, zejména pak extrakce tuhou fází (SPE), extrakce nadkritickou tekutinou (SFE) a extrakce L-L, které umoţňují vzorky získané z rostlinných materiálů zakoncentrovat nebo zbavit matrice. Aplikaci a optimalizaci postupu SPE při stanovení fenolických sloučenin ve vzorcích vín popsali ve své studii Matějíček, D., et al. [10]. Autoři navrhli postup extrakce pevnou fází tak, aby dosáhli největší účinnosti pro fenolické kyseliny obsaţené ve vzorcích. Testovali různé typy extrakčních kolonek, z nichţ největší účinnost měli kolonky označení Strata X a RP-105. Obr. 12 ukazuje úspěšnost SPE z výše uvedené práce [10].
Obr. 12: Separace polyfenolických sloučenin ve víně metodou HPLC na koloně Hypersil BDS C18. Záznam A je přímý nástřik 10 µl vzorku, na chromatogram B je vzorek vína po SPE. [10] V kapilární elektroforéze se zakoncentrováním vzorků vyuţitím SPE zabývali Pazourek, J., et al. [7], jeţ tuto metodu pouţili k zakoncentrování vzorků vín pro stanovení trans- resveratrolu a kyseliny sorbové. Porovnáním separací polyfenolických látek ve víně s a bez vyuţití SPE se ve své studii opět věnovali autoři Pazourek, J., et al. [34]. Technikou nejčastěji pouţívanou k přípravě vzorků z pevného materiálu je superkritická fluidní extrakce. Optimalizací podmínek SFE pro její pouţití při studiu obsahu polyfenolyckých látek v hroznech se zabývali Palma, M.; et al. [14]. Vyuţití SFE pro stanovení resveratrolu v hroznových slupkách je popsáno ve studii Pascual-Martí, M.C., et al. [12], této problematice se věnují také autoři Chafer, Amparo, et al. [13], kteří ve své práci mapovali obsah polyfenolických látek v závislosti na odrůdě vinné révy. 24
Nadkritická fluidní extrakce se nevyuţívá jenom při analýze vinohradnického materiálu, ve studii autorů Vaher, M., et al. [23] byla SFE pouţita při přípravě vzorků u plodů šípkové růţe, řešetláku a vřesny bahení. Jednou z mnoha dalších metod pro úpravu vzorků, kterou si vybrali autoři Peres, R.G., et al [6] pro stanovení polyfenolických látek v brazilských vínech je extrakce kapalina kapalina. Porovnáním úprav vzorků vín před analýzou extrakčními metodami se zabývaly ve své práci autorky Nicolaou, I. N., et al. [24].
4.1. Statistické zpracování výsledků Kvůli omezené přesnosti měřících přístrojů, proměnlivosti podmínek a nedokonalé homogenitě materiálu, nezískáváme během měření stejné výsledky. Výsledkem měření je tak náhodná veličina, která se skládá z analytického signálu ze skutečné hodnoty a z příspěvku šumu, jenţ odpovídá chybě měření. Přítomnost hrubé chyby ve výsledku v souboru se projeví tím, ţe je tento výsledek odlehlý. Odlehlost výsledků zle zjistit pomocí Dean - Dixonova test, který se pouţívá pro testování souboru s menším počtem paralelním výsledků. Pro 3 ≤ n ≤ 10: (2) kde R je rozpětí xmax - xmin, hodnoty Q1 a Qn se porovnávají s kritickou hodnotou Qα pro zvolenou hladinu významnosti. Je-li výsledek větší neţ tabelovaná hodnota, je odlehlý a je nutné jej vyloučit. Odhadem parametru variability souboru výsledků je směrodatná odchylka, kterou lze vypočíst z rozpětí R. (3) kde kn je tabelovaný koeficient pro n počet měření, R je rozpětí xmax - xmin. Relativní směrodatná odchylka je definována vztahem: (4) SR je směrodatná odchylka, x je průměr.
25
Na základě matematické statistiky lze určit oblast, v níţ se má výsledek pro předem zvolenou spolehlivost nacházet. Tato oblast, interval spolehlivosti (IS) udává spolehlivost výsledku: (5)
kde Ka je kritická hodnota Lordova rozdělení pro danou hladinu významnosti a počet měření a x je průměr. Důleţitým parametrem při měření je jaké nejmenší mnoţství analytu je moţné detekovat, tj. mez detekce. Mez detekce odpovídá tomu, při jaké koncentraci látky se signál významně statisticky liší od šumu. (6) kde hn je výška šumu a m je směrnice kalibrační křivky. Mez stanovitelnosti, matematicky vyjádřená jako desetinásobek výšky šumu, odpovídá koncentraci, kdy přesnost stanovení dovoluje kvantitativní vyhodnocení. [41, 42] (7)
26
5. EXPERIMENTÁLNÍ ČÁST 5.1. Přístrojové vybavení Kapilární zónová elektroforéza CE 3D Agilent Technologies Pro měření byl pouţit komerční přístroj HP
3D
Capillary Electrophoresis (Hewlett
Packard, SRN) vybavený UV detektorem s diodovým polem. Vakuová aparatura pro SPE (Labicom s.r.o., Olomouc, Česká Republika) Na extrakci byly pouţity extrakční kolonky Strata-X se nepolárním sorbentem C-18 (200 mg/3ml). Extraktor pro SFE pevných vzorků (Ústav analytické chemie AV ČR) pH metr EUTECHS Instrument Ion 15 (Vernon Hills, USA) pH-metru Cyberscan pH/log 510 se skleněnou iontově selektivní elektrodou. Analytické váhy OHAUS PA 114 (OHAUS Corp. Pine brook, NJ, USA) Centrifuga EDA 20 (Hettich Zentrifugen, Německo) Ultrazvuková lázeň PS 04000 A (Slovensko)
5.2. Použité chemikálie Acetonitril CH3CN PENTA, Chrudim, Česká Republika
Mr = 41,05 g.mol.l-1 čistota p.a.
Diethylether p.a. C4H10O PENTA, Chrudim, Česká Republika
Mr = 74,12 g.mol-1 čistota p.a.
Ethanol 99,8 % C2H6O Lach-Ner, Neratovice, Česká Republika
Mr = 46,07 g.mol-1
Hydroxid sodný NaOH Merck, Darmstadt, Německo
Mr = 40,00 g.mol-1
Methanol CH3OH PENTA, Chrudim, Česká Republika
Mr = 32,04 g.mol-1 čistota p.a.
Mesityloxid tech. ≥ 90% C6H10O Fluka, Steinheim, Německo
Mr = 98,15 g.mol-1
Kyselina chlorovodíková 0,1 mol.l-1 HCl J.T. Baker, Deventer, Nizozemí
Mr = 36,46 g.mol-1
Tetraboritan sodný Na2B4O7·10 H2O Lachema, Brno, Česká Republika
Mr = 381,37 g.mol-1
Standardy polyfenolických látek Mr = 302,24 g.mol-1
Kvercetin C15H10O7 Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo 27
Katechin C15H14O6 Fluka, Švýcarsko
Mr = 290,26 g.mol-1
Epikatechin C15H14O6 Fluka, Švýcarsko
Mr = 290,26 g.mol-1 čistota < 96%
Resveratrol C14H12O3 Sigma-Aldrich, USA
Mr = 228,24 g.mol-1
Myricetin C15H10O8 Sigma-Aldrich, Francie
Mr = 318,24 g.mol-1
Rutin C27H30O16 Dr. Ehrenstorfer, Augsburg, Německo
Mr = 610,52 g.mol-1 čistota < 98,5%
Kaempferol C15H10O6 Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo
Mr = 286,23 g.mol-1
Kyselina ferulová C10H10O4 Sigma-Aldrich, Steinheim, Německo
Mr = 194,18 g.mol-1
Kyselina vanilová C8H8O4 Fluka, Steinheim, Německo
Mr = 168,15 g.mol-1
Kyselina gallová C7H6O5 Lachema, Brno, Česká Republika
Mr = 170,12 g.mol-1
Kyselina kávová C9H8O4 Sigma-Aldrich, Švýcarsko
Mr = 180,16 g.mol-1
Kyselina sinapová C11H12O5 Fluka, Steinheim, Německo
Mr = 224,21 g.mol-1
Kyselina p-kumarová C4H4O4 Sigma-Aldrich, Velká Británie
Mr = 116,07 g.mol-1
Kyselina trans-skořicová C9H8O2 Chem service, West Chester, Ohio
Mr = 148,17 g.mol-1 čistota < 99,5%
Vzorky vinohradnického materiálu Vzorky stonků a listů: Vinařská oblast Velké Bílovice, vinařství Skoupil Tabulka 2: Specifikace reálných vzorků vzorek Specifikace vzorek Specifikace vzorek Specifikace a) a) 1/M hrubě mletá hroznová jádra 1/S Veltlínské zelené 1/L Veltlínské zelené b) b) 2/M mletá hroznová jádra I. 2/S Veltlínské zelené 2/L Veltlínské zelené c) c) 3/M mletá hroznová jádra II. 3/S Veltlínské zelené 3/L Veltlínské zelené a) a) 4/M mletá hroznová jádra III. 4/S Zweigeltrebe 4/L Zweigeltrebe b) b) 5/M VITIS Moučka z hroznových jader 5/S Zweigeltrebe 5/L Zweigeltrebe c) c) 6/S Zweigeltrebe 6/L Zweigeltrebe a) Sběr I. délka letorostů (stonků) 25 cm. b) Sběr II. po odkvětu, délka letorostů (stonků) 50 cm. c) Sběr III. před zaměkáním hroznů, délka letorostů (stonků) 50 aţ 70 cm.
28
5.3. Optimalizace separačních podmínek Optimalizace separačních podmínek pro simultánní stanovení polyfenolických sloučenin ve vzorcích vín vycházela ze studie autorů Peres, Renato G., et al. [6] pro analyze vín. Pro měření byla pouţita křemenná nepokrytá kapilára celkové délky 48,5 cm (efektivní délka 40 cm) a vnitřním průměru 75 µm. Připravená kapilára byla promývána 30 min 0,1 mol.l-1 hydroxidem sodným, 15 min základním elektrolytem a 10 minut vodou. Kapilára byla termostatována na 25 °C. Jako základní elektrolyt byl pro separaci pouţit 17 mmol.l-1 tetraboritan sodný, protoţe však byla doba separace příliš dlouhá (viz Obr 13) byl přídavek methanolu upraven na 10 %. Důleţitým krokem optimalizace byl výběr vhodného postupu promývání po analýze k zajištění opakovatelnost analýz, před analýzou bylo promýváno 1 min elektrolytem a po analýze 1 min 0,1 mol.l-1 NaOH, 1 min 0,1 mol.l-1 HCl a 1 min elektrolytem. Separace probíhala při napětí 15 kV a vzorek byl injektován tlakem 20 mbar po dobu 5 sekund. Pro optimalizaci separačních podmínek a extrakčního postupu extrakce pevnou fází byla navrţena směs standardů (tzv. modelová směs), která obsahovala tyto analyty: resveratrol, epikatechin, rutin, kyselinu ferulovou, myricetin, kvercetin a kyselinu galovou. Koncentrace samostatně připravených standardů v 50 % methanolu byla 0,5 mg.ml-1. Pro standard rutinu byl jako rozpouštědlo zvolen 50% ethanol, protoţe se rutin v 50% methanolu nerozpouštěl. V modelové směsi byla koncentrace jednotlivých standardů 0, 0625 mg.ml-1.
29
Obr. 13: Vliv přídavku methanolu do základního elektrolytu na separaci: a) 17 mmol.l-1 STB s 20% přídavkem methanolu, b) 17 mmol.l-1 STB s 10% obsahem methanolu a c) základním elektrolytem byl 17 mmol.l-1 tetraboritan sodný. Při pouţití 17 mM STB s 20% methanolu bylo rozlišení nejlepší, ale docházelo k chvostování píků a analýza trvala téměř 50 minut. Proto byl jako nejlepší základní elektrolyt vybrán 17 mM STB s 10 % přídavkem methanolu. Bylo dosaţeno dostatečného rozlišení píků během 20 minutové analýzy.
30
5.4. Vyhodnocení opakovatelnosti metody pro CE Byla testována opakovatelnost migračních časů standardů během měření ve třech po sobě jdoucích dnech. Pro měření opakovatelnosti byla pouţita modelová směs obsahující 7 standardů: resveratrol, epikatechin, rutin, kyselina ferulová, myricetin, kvercetin a kyselina galová. Jednotlivé standardy byly připraveny v 50% methanolu, rutin v 50% ethanolu, a jejich výsledná koncentrace ve směsi byla 0, 0625 mg.ml-1. Tabulka 3: Opakovatelnost měření během 1. dne n = 5; α = 0,01; Qn;α = 0,760; Kn;α = 0,843
1
resveratrol epikatechin 5,977 7,286
rutin 7,873
kyselina ferulová 9,470
myricetin 10,662
kvercetin 10,842
kyselina galová 14,338
2 3
5,932 5,899
7,229 7,182
7,823 7,786
9,478 9,403
10,682 10,620
10,926 10,868
14,254 14,196
4
5,897
7,206
7,799
9,482
10,642
10,892
14,201
5 R IS x S
5,899 0,078 ±0,06552 5,921 0,035
7,192 0,104 ±0,08736 7,219 0,041
7,796 0,087 ±0,07308 7,815 0,035
9,431 0,067 ±0,05628 9,453 0,034
10,638 0,042 ±0,03528 10,649 0,024
10,884 0,084 ±0,07056 10,882 0,031
14,237 0,142 ±0,11928 14,245 0,057
Sr
0,0059
0,0057
0,0045
0,0036
0,0022
0,0028
0,0040
rutin 7,812
kyselina ferulová 9,413
myricetin 10,610
kvercetin 10,879
kyselina galová 14,189
Tabulka 4: Opakovatelnost měření během 2. dne n = 5; α = 0,01; Qn;α = 0,760; Kn;α = 0,843
1
resveratrol epikatechin 5,844 7,208
2 3
5,792 5,825
7,219 7,136
7,775 7,785
9,428 9,444
10,633 10,619
10,848 10,899
14,198 14,232
4
5,832
7,125
7,743
9,433
10,688
10,859
14,162
5 R
5,816 0,052
7,119 0,094
7,789 0,069
9,484 0,071
10,613 0,078
10,822 0,077
14,149 0,134
IS x
±0,04368 5,822
±0,07896 7,161
±0,05796 7,781
±0,05964 9,440
±0,06552 10,633
±0,06468 10,861
±0,11256 14,166
S
0,020
0,048
0,025
0,027
0,032
0,029
0,050
Sr
0,0034
0,0067
0,0032
0,0028
0,0030
0,0027
0,0035
31
Tabulka 5: Opakovatelnost měření během 3. dne n = 5; α = 0,01; Qn,α = 0,760; Kn,α = 0,843 resveratrol epikatechin
rutin
kyselina ferulová
myricetin
kvercetin
kyselina galová
1 2
5,848 5,829
7,184 7,212
7,877 7,773
9,431 9,420
10,699 10,640
10,896 10,859
14,234 14,215
3 4
5,832 5,841
7,133 7,178
7,763 7,801
9,478 9,435
10,622 10,663
10,923 10,864
14,154 14,265
5 R IS x S
5,833 0,012 ±0,010 5,837 0,008
7,181 0,079 ±0,066 7,178 0,028
7,753 0,071 ±0,060 7,765 0,027
9,406 0,072 ±0,061 9,434 0,027
10,671 0,049 ±0,041 10,659 0,030
10,972 0,113 ±0,095 10,923 0,047
14,223 0,111 ±0,093 14,218 0,041
Sr
0,0013
0,0040
0,0034
0,0029
0,0028
0,0043
0,0029
Hodnoty migračních časů pro všechny dny byly testovány na odlehlost podle Dean- Dixona, ţádný z výsledků nebyl odlehlý. Opakovatelnost migračních časů během dnů byla testována funkcí ANOVA v Microsoft Exel 2007. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 5. Tabulka 6: Porovnání opakovatelnosti mezi dny pomocí ANOVY n= 5, α = 0,01; F (n, α) = 11,2586
resveratrol epikatechin rutin myricetin kvercetin kyselina ferulová kyselina galová
Opakovatelnost mezi 1. a 2. den 30,969 4,118 3,233 0,818 1,209
Opakovatelnost mezi 2. a 3. den 2,475 0,420 0,960 1,825 2,826
Opakovatelnost 1. a 3. den 28,122 3,400 0,649 0,361 0,666
0,404
0,141
0,922
4,041
1,919
0,739
Testováním programem ANOVA bylo zjištěno, ţe všechny analyty mimo resveratrolu splňují podmínku, ţe vypočtená hodnota F musí být menší, neţli kritická hodnota F (n, α). Rozdíl průměrných hodnota migračního času resveratrolu mezi prvním a druhým dnem byl 0,099 min, zatímco mezi druhým a třetím dnem pouze 0,015 minuty. Proto je výsledek migračního času resveratrolu z 1. dne odlehlý a z dalších výpočtů byl vyřazen. 32
5.5. Stanovení limitu detekce a limitu stanovitelnosti metody Meze detekce jednotlivých analytů byly vypočteny podle vztahu (6), z kapitoly 3.6. Vypočtené hodnoty jsou uvedeny v tabulce 6. Tabulka 7: Hodnoty limitu detekce a stanovitelnosti pro zvolené analyty. Analyt resveratrol katechin epikatechin rutin kyselina ferulová kyselina vanilová kyselina p-kumarová kyselina galová kyselina kávová myricetin kvercetin
LOD [mg/ml] LOQ [mg/ml] 0,0014 0,0048 0,0047 0,0158 0,0095 0,0317 0,0018 0,0062 0,0011 0,0038 0,0012 0,0040 0,0017 0,0058 0,0033 0,0111 0,0018 0,0543 0,0078 0,0261 0,0121 0,0403
y = ax+b y = 459,5x + 1,008 y = 140x + 4,433 y = 70x + 6,6 y = 360x + 1,5 y = 578,5x + 0,891 y = 550x + 1,3 y = 384,5x + 0,325 y = 200x + 2,2 y = 378,9x + 0,984 y = 85x + 0,483 y = 55x + 2,35
R 0,994 0,993 0,942 0,990 0,988 0,991 1,000 0,992 0,996 0,998 0,975
5.6. Příprava vzorků Pro analýzu byly k dispozici 3 sady vzorků z různých částí vinné révy a to z listů, stonků a hroznových jader. První sada vzorků byla tvořena moučkami z hroznových jader, tyto vzorky byly značeny 1/M aţ 5/M. Vzorkem 5/M byl přírodní potravinový doplněk VITIS Moučka z hroznových jader, u kterého výrobce garantuje přítomnost katechinu a epikatechinu, vzorky 1/M aţ 4/M byly směsi hroznových jader o různé hrubosti mletí. Hroznové bobule obsahují 1 aţ 4 semena, neboli jádra, která tvoří asi 4% celkové hmotnosti bobule. Semena obsahují velké mnoţství olejů (10-20%) a třísloviny (3-6%). Oleje jsou tvořeny glyceridy kyselin stearové, linolové a palmitové. Zbytek organické hmoty tvoří cukry, bílkoviny, minerální látky a celulóza. Další vzorky tvoří stonky révy vinné. Tato sada vzorků nese označení 1/S aţ 6/S. Stonky se rozdělují podle stáří na jednoleté, dvouleté nebo staré dřevo. Jednoleté dřevo patří k nedřevnatým zeleným částem rostliny, ale asi v polovině léta začíná i tato část dřevnatět. Na jednoletém dřevě vyrůstají v uzlech květy, z kterých se po odkvetení tvoří hrozny. Vzorky stonků a listů ze sběru I. aţ III. byly rozstříhány na kousky o délce 2-3 cm, vysušeny do konstantní hmotnosti a rozemlety nejprve noţovým a poté kladívkovým mlýnkem.
33
Vzorky listů tvoří třetí sadu vzorků, která byla značena 1/L aţ 6/L. Listy vinné révy vyrůstají střídavě v uzlech a jejich hlavní funkcí je zabezpečení dostatku energeticky bohatých látek pro rostlinu. V listech mají největší zastoupení pektiny, cukry, škrob a z barviv především chlorofyl a barviva odvozená od anthrokyaninů a flavonů. Dále se zde vyskytují bílkoviny, enzymy a také vitamíny. Podle velikosti, tvaru a ţilnatění listu lze rozeznat jednotlivé odrůdy vinné révy. [37, 40] Prvním bodem přípravy vzorků bylo najít vhodné rozpouštědlo pro extrakce pevných vzorků. Podle publikovaných studií byla vybrána rozpouštědla 50% acetonitril, 100% methanol a nejčastěji pouţívaný 50% methanol.
Obr. 14: Výběr rozpouštědla na přípravu vzorků, vzorek 1/M ve 20 ml rozpouštědla: a) 50% methanol, b) 75% methanol a c) je 50% acetonitril. Výběr vhodného rozpouštědla byl testován na vzorcích mouček z hroznových semínek a to na vzorku 1/M a 2/M. U obou vzorků byl jako nejvhodnější rozpouštědlo vybrán 50% methanol. Na první pohled se zdá být nejvhodnějším rozpouštědlem acetonitril, protoţe jak lze vidět na obr 14, intenzity dosahovaly nejvyšších hodnot. U vzorků v acetonitrilu nebyly během separace stejné hodnoty proudu, coţ způsobovalo problém s opakovatelností migračních časů. Jako nejvhodnější rozpouštědlo byl proto vybrán 50% methanol, který poskytoval nejlepší separační účinnost.
34
Dalším důvodem pro výběr 50% methanolu bylo, ţe standardy sledovaných polyfenolů byly, s výjimkou rutinu, připravovány do roztoku 50% methanolu a také základní elektrolyt obsahoval 10% přídavek methanolu. Sjednocením rozpouštědel bylo dosaţeno opakovatelnosti proudových křivek a tím i migračních časů analytů. Dalším krokem při nalezení vhodného postupu zpracování pevných vzorků bylo porovnat, zda je účinnější extrakce za pouţití ultrazvukové lázně nebo vytřepáváním. Pro toto porovnání byly pouţity vzorky 1/M a 2/M. Srovnání obou postupů je znázorněno na Obr. 15. A. Extrakce v ultrazvukové lázni Byl naváţen 1 g pevného mletého vzorku a extrahován ve 20 ml 50% methanolu. Takto připravené vzorky byly 2 hodiny v ultrazvukové lázni při teplotě 30 °C. Dále byla nutná centrifugace po dobu 15 min na 5000 otáček/min, aby byla z roztoku oddělena pevná část vzorku. Získaný kapalný vzorek byl filtrován přes filtry s velikostí pórů 0,45 µm. Takto připravený vzorek byl uchováván v mrazáku při teplotě -10 °C. B. Extrakce vytřepáváním Naváţka 1 g mletého vzorku s 20 ml rozpouštědla byla 2 hodiny vytřepávána při rychlosti 400 otáček za minutu při teplotě 23 °C. Pro další zpracování vzorku byl pouţit stejný postup jako při pouţití ultrazvukové lázně.
Obr. 15: Vzorek 2/M po extrakci a) v ultrazvukové lázni, b) vytřepáváním.
35
Při porovnání pouţitých postupů extrakce u vzorků jader hroznů, bylo nejlepší výsledků dosaţeno extrakcí v ultrazvukové lázni. Podle vyšších hodnot absorbance vzorky obsahovaly větší mnoţství polyfenolických látek neţ při extrakci vytřepáváním. Proto byl tento postup přípravy pouţit i u ostatních vzorků hroznových jader. Toto porovnání bylo provedeno u všech sad vzorků a vţdy bylo dosaţeno stejných výsledků. Extrakty listů a stonků vinné révy tedy také byly připraveny za pouţití ultrazvukové lázně.
5.7. Extrakce pevnou fází (SPE) Extrakce pevnou fází je často pouţívaná technika pro přečištění a zakoncentrování vzorků obsahujících polyfenolické látky. Postup pro SPE byl zvolen podle studie Dobiášová, Z.; Pazourek, J.; Havel, Josef [7]. Protoţe s tímto postupem nebylo dosaţeno uspokojivých výsledků, byl krok promývání optimalizován. Pro extrakci pevnou fází byly pouţity extrakční kolonky Strata-X s 200 g náplní C-18, které mají objem 3 ml. Kolonka Strata-X má podle výsledků studie Matějíček, D., et al. [10] jednu z nejlepších účinností pro polyfenolické kyseliny (kyselina galová, vanilová, kávová, nerulová, sinapová a skořicová). Optimalizace byla prováděna na modelové směsi obsahující 6 standardů, resveratrol, epikatechin, rutin, myricetin, kvercetin a kyselinu galovou. Koncetrace jednotlivých analytů ve směsi byla 0,0714 mg.ml-1. Na této směsi bylo vyzkoušeno promývání 5 rozpouštědly: 1% MeOH, 2% MeOH, 5% MeOH, 10% MeOH, 10% MeOH + 0,1M HCl (4:1) a voda. Na grafu 4 jsou zaznamenány tři nejvhodnější rozpouštědla pouţité na promývaná vzorku během SPE extrakce. Jako nejlepší bylo vyhodnoceno promývání 5 % metanolem, kdy při pouţití tohoto rozpouštědla byla výtěţnost extrakce nejvyšší.
36
Obr. 16: Porovnání promývání modelové směsi pro SPE: a) 2ml 5% MeOH b) 2ml destilovná voda c) 2ml 10% MeOH. Dalším krokem bylo ověřit správný výběr vhodného elučního rozpouštědla. Byl testován 100 % methanol, 100% acetonitril a 50% methanol. Jak uvádí autoři článku [7], nejlepším elučním činidlem je 100 % methanol. (Obr. 17)
Obr. 17: Výběr elučního rozpouštědla na modelové směsi pro SPE a) 2 ml 50% MeOH, b) 2ml 100% acetonitril, c) 2ml 100% MeOH. 37
Výsledný extrakční postup optimalizovaný pomocí modelové směsi byl: 1. krok: 2 ml 100% methanolu 2 ml destilované vody 2. krok: 1,5 ml vzorku 3. krok: 2 ml 5% methanolu 4. krok: 1 ml 100% methanolu Tento postup byl aplikován při SPE všech reálných vzorků. Po optimalizaci vhodného exaračního postupu bylo dalším krokem zjištění kapacity kolonek. Kapacita byla určena pomocí metody kalibrační přímky a jako standard byl pouţit 10 mmol.l-1 roztok fenolu. Tabulka 8: Hodnoty pro kalibrační závislost fenolu -1
c[mmol.l ] 1,75 2,5 5 7,5 10
plocha píku 24,2 40,2 92,8 128,7 184,7
t [min] 4,155 4,098 4,136 4,092 4,184
výška píku [mAU] 6,8 10,7 19,2 24,6 29,5
plocha/čas 5,8243 9,8097 22,4371 31,4516 44,1444
50 45
korigovaná plocha píku
40 35 30
y = 4,325x R² = 0,993
25 20 15 10 5 0 0
2
4
6 c[mmol.l]
8
10
Obr. 18: Kalibrační závislost fenolu
38
12
Rovnice regrese y = 4,554x-1,633 byla statisticky testována na významnost regresního koeficientu. Na hladině významnosti 95% bylo zjištěno, ţe koeficient b je statisticky nevýznamný a tudíţ ho můţeme vyloučit. Nová regresní závislost tedy byla y = 4,325x. Tabulka 9: Naměřené hodnoty pro standardní roztok fenolu po SPE Strata-X
t[min] 3,90
plocha 120,5
plocha/čas 30,86
výška 15,2
Pomocí rovnice regrese byla vypočtena kapacita extrakční kolonky Strata-X. y = 4,325 x → pro y = 30,86 x = 7,1358 mmol.l-1 pro kolonku Strata-X Kapacita extrakční kolonky Strata-X byla stanovena na 7,14 mmol.l-1, coţ pro molární hmotnost fenolu 94,11 g/mol odpovídalo 0,6719 mg fenolu v 1 ml na 200 mg sorbentu. Po pouţití SPE extrakce na vzorky mouček z hroznových semínek nebylo dosaţeno poţadovaných výsledků, jednotlivé analyty nebylo moţno ve vzorku identifikovat. Při extrakci reálných vzorků měl na výsledek vliv velkého mnoţství matrice. Technika SPE se ukázala jako vhodná metoda k čistění a především zakoncentrování vzorků vín, jak dokládají studie Dobiášová, Z., et al. [7], Matějíček, D., et al. [10]. U rostlinných vzorků pravděpodobně docházelo k zahlcení kolonky matricí vzorku, coţ způsobilo významné ztráty sledovaných analytů. (Obr. 19)
39
Obr. 19: Výsledek SPE pro vzorek hroznových jader připravený v ultrazvukové lázni: a) vzorek 1/M po SPE, b) vzorek 1/M bez SPE. Při aplikaci postupu extrakce pevnou fází na vzorky stonků, bylo dosaţeno lepších výsledků neţ u vzorků mouček z hroznových jader, ale i přesto docházelo k výrazným ztrátám některých analytů. Pouţitím SPE došlo k odstranění přítomné matrice a zakoncentrování píku s migračním časem 12,098 min, který byl identifikován jako kvercetin glukuronid. (Obr. 20)
40
Obr. 20: Porovnání metod na úpravu vzorku stonků z ultrazvukové lázně a) vzorek 6/S po SPE b) vzorek 6/S před SPE.
Při testování metod pro úpravu vzorků listů vinné révy bylo dosaţeno nejlepších výsledků po SPE extrakci. SPE extrakcí došlo nejen k odstranění matrice ale také zakoncentrování vzorku, proto byla SPE vybrána jako vhodná technika pro úpravu vzorků listů před samotnou analýzou pomocí kapilární elektroforézy. (Obr. 21)
41
Obr. 21: Porovnání metod na úpravu vzorků pro vzorek listů z ultrazvukové lázně: a) vzorek 3/L, b) vzorek 3/L po SPE, c) vzorek 3/L po L-L extrakci. Jak je moţné, ţe SPE extrakce byla vhodnou technikou pouze pro vzorky listů? Moţným vysvětlením je jiţ zmíněný vliv matrice způsobující zahlcení extrakčních kolonek, případně vysoká koncentrace některých polyfenolů, například katechinu a epikatechin u vzorků mouček. Postup extrakce byl testován na modelové směsi obsahující takových 5 analytů, aby směs obsahovala zástupce kaţdé skupiny základního dělení polyfenolických látek (viz kapitola 3.5.1.). Vzorek modelové směsi bylo moţné pomocí SPE zakoncentrovat, a nedocházelo ke ztrátám analytů ani při nadávkování většího objemu vzorku. Proto vysvětlením neúčinnosti SPE extrakce na vzorky mouček hroznových jader a stonků bude zřejmě zahlcení kolonek vysokým obsahem matrice ve vzorcích.
5.8. Extrakce kapalina- kapalina Dalším z pouţitých postupů úpravy vzorků před analýzou byla extrakce kapalina kapalina, kterou pouţily Nicolaou, Irena N.; Kapnissi- Christodoulou, Constantina P., [24]. Autoři vyzkoušeli několik typů úprav vzorků před samotnou analýzou, nejlepší výsledky byly dosaţeny pouţitím extrakce kapalina – kapalina.
42
Jako extrakční rozpouštědlo byl pouţit diethyletheru v poměru 1:1 se vzorkem. Extrakce L-L byla provedena v zábrusových zkumavkách, kde byly vzorky třepány po dobu 10 minut pomocí laboratorní třepačky na zkumavky. Po rozdělení kapalin, byl odebraný extrakt odpařen v digestoři do sucha a poté rozpuštěn v 1,5ml 50% methanolu. Tento postup extrakce byl pouţit na všechny sady vzorků. Autorky Nicolaou, Irena N., et al. [24] pro extrakci L-L pouţili 25 ml vzorku a stejné mnoţství rozpouštědla. Pouţití takto velkého mnoţství vzorků bylo pro naše podmínky nereálné, proto byly extrakce provedeny s objemy vzorků 5 a 10 ml ale byl zachován poměr kapalin 1:1, viz Obr. 22.
Obr. 22: Porovnání množství použitého vzorku a rozpouštědla na L-L extrakci vzorků mouček z hroznových jader: a) 5 ml vzorku2/M a 5 ml diethyletheru, b) 10 ml vzorku 2/M a 10 ml diethyletheru. Při pouţití většího mnoţství vzorků a extrakčního rozpouštědla bylo dle očekávání dosaţeno většího zakoncentrování vzorků, ale zároveň došlo i k extrakci části matrice. Objem 10 ml vzorku a rozpouštědlo bylo moţné pouţít pouze u první sady vzorků, protoţe při přípravě vzorků stonků a listů nebyl k dispozici dostatek rostlinného materiálu, nebylo získáno potřebné mnoţství vzorků. 43
Největší efekt L-L extrakce byl u vzorku 1, hrubě mletých semínek, kde došlo nejvýraznějšímu rozlišení píků a odstranění rušivých elementů, coţ umoţnilo jejich identifikaci a kvantifikaci (Obr. 29). Tato metoda byla pouţita na zpracování celé sady vzorků hroznových semínek a stonků. Jak znázorňuje obr 23, L-L extrakce byla účinnější metodou pro zpracování vzorků neţ SPE, na elektroforeogramech lze vidět větší mnoţství detekovaných analytů.
Obr. 23: Porovnání metod na úpravu vzorků hroznových semínek: a) je vzorek 1/M po L-L extrakci, s objemem vzorku 10ml, b) vzorek 1/M po SPE, c) vzorek 1/M.
44
Obr. 24: Porovnání metod na úpravu vzorku stonků z ultrazvukové lázně a) vzorek 6/S po extrakci SPE, b) vzorek 6/S po extrakci L-L s objemem vzorku 5 ml. Jak je vidět na Obr. 24, při pouţití SPE na vzorky stonků opět docházelo ke ztrátám některých analytů. L-L extrakce byla lepší metodou na zpracování vzorků i přesto ţe bylo na vytřepávání pouţito pouze 5 ml vzorku a 5 ml diethyletheru. Jediným analytem, u kterého docházelo při SPE k zakoncentrování byl pík s migračním časem 12,572 min, který byl později pomocí HPLC-MS identifikován jako kvercetin glukuronid. Koncentrace tohoto derivátu kvercetinu se naopak při L-L sniţovala, podle čehoţ můţeme říct, ţe tato látka je méně polární neţ samotný kvercetin (migrační čas 11,375 min), který na rozdíl od derivátu při extrakci přechází do slabě polárního diethyletheru a na záznamu lze pozorovat nárůst výšky píku. Pro všechny vzorky sady listů bylo dosaţeno nejlepších výsledků pouţitím SPE extrakce. Ve vzorcích listů byl obsah polyfenolických látek velmi malý, majoritní podíl ve všech vzorcích tvořil výše zmíněný kvercetin glukuronid. Při L-L extrakci byly vzorky listů vytřepávány s diethyletherem pouze v objemu 5 ml, proto nelze s jistotou říct, zda by mělo větší mnoţství pouţitého vzorku na L-L extrakci pozitivní vliv. Na Obr. 25 je znázorněno porovnání L-L a SPE extrakce na vzorku listů vinné révy.
45
Obr. 25: Porovnání metod na úpravu vzorku listů vinné révy z ultrazvukové lázně a) vzorek 3/L po extrakci SPE, b) vzorek 3/L po extrakci L-L.
Obr. 26: Elektroforeogram vzorku hroznových semínek 2/M: a) vzorek 2/M po L-L extrakci a po SPE b) po L-L extrakci. 46
Po vyhodnocení nejvhodnějších postupů pro jednotlivé sady vzorků, byla dále vyzkoušena kombinace technik extrakce L-L a SPE. Cílem bylo vzorky po L-L extrakci zakoncentrovat pomocí SPE. Vzorek byl po odpaření rozpuštěn v 2 ml 50% methanolu, aby byly dodrţeny stanovené podmínky pro SPE extrakci. Na Obr. 26 je patrné, ţe SPE extrakce nedávala uspokojivé výsledky ani v kombinaci s L-L extrakcí.
5.9. Nadkritická fluidní extrakce U vzorků mouček byla vyzkoušena jako metoda přípravy vzorků také nadkritická fluidní extrakce. Počáteční podmínky extrakce byly nastaveny podle článku Pascual-Martí, M.C. et al. [12]. Polyfenolické sloučeniny jsou více či méně polární látky a při extrakci nepolárním oxidem uhličitým je nutný přídavek tzv. modifikátoru, který zlepšuje rozpustnost polyfenolů v CO2. Jako modifikátor byl pouţit 7,5 a 20% ethanol, který pouţili i autoři studií Pascual-Martí, M.C. et al. [12] a Chafer, A. et al. [13]. Pro nadkritickou fluidní extrakci byly pouţity vzorky mouček hroznových jader. Do extrakční patrony byl naváţen 1g vzorku a postupně byl přidán modifikátor. Extrakce probíhala 15 minut při tlaku 15 kPa, teplotě extrakční cely 40 °C a jako modifikátor byl pouţit 7,5% ethanol. Při extrakci samotného vzorky bez pouţití modifikátoru nebyla extrakce úspěšná. Extrakt byl jímán do 5 ml 50% methanolu, poté byl odpařen do sucha a rozpuštěn v 1 ml 50% methanolu. Vliv modifikátoru na SFE je vidět na Obr. 27.
47
Obr. 27: Vzorek hroznových semínek 2/M po SFE: a) bez modifikátoru, b) 0,5 ml 7,5% EtOH, c) 0,5 ml 20% EtOH, tlak 15 kPa. Pro další extrakci SFE byly pouţity počáteční podmínky dle článku [13]. U pouţitého extrakčního přístroje byla maximální teplota extrakční cely 40 °C, proto se tento parametr oproti původním podmínkám liší. Extrakce probíhala 15 minut za tlaku 25kPa. Extrakt byl jímán do 5 ml 50% methanolu poté odpařen do sucha a poté rozpuštěn v 1 ml 50% methanolu. Výsledky ukazuje Obr. 28.
48
Obr. 28: Vzorek hroznových semínek 2/M po SFE jako modifikátor a) 0,5 ml 7,5% EtOH, b) 0,5 ml 20% EtOH, tlak 25 kPa. Postup SFE extrakce aplikovaný na vzorky hroznových slupek nepřinesl u vzorků hroznových jader očekávané výsledky.
Ve vzorcích mouček po SFE nebylo moţné
analyty identifikovat, tento postup nebyl pro zpracování vzorků hroznových semínek vhodný. Extrakční postup by bylo nutné optimalizovat, proto bylo v této práci od nadkritické fluidní extrakce upuštěno.
49
5.10. Identifikace a kvantifikace vzorků mouček z hroznových semínek Vzorky mletých hroznových semínek byly extrahovány na ultrazvuku (1g ve 20 ml 50% methanolu), centrifugovány, filtrovány a uchovány v mrazáku. Jako nejvhodnější technika úpravy vzorku byla vybrána L-L extrakce. Vzorky byly třepány s 10 ml diethyletheru (v poměru 1:1) 3 x 4 minuty na třepačce na zkumavky. Oddělený a odpařený vzorek byl rozpuštěn v 1 ml 50% MeOH. Tento postup byl pouţit na přípravu všech vzorků mletých hroznových semínek. Identifikace a kvantifikace analytů ve vzorku byla prováděna metodou přídavku standardu. Byly připraveny 3 směsi standardů, které byly ve dvou přídavcích přidány ke vzorku a doplněny na stejný objem. Koncentrace jednotlivých analytů ve směsi byla v prvním přídavku 0,01 mg.ml-1 a ve druhém přídavku 0,02 mg.ml-1. Po vytvoření závislosti byl z rovnice regrese vypočten obsah jednotlivých analytů ve vzorku. Při separaci reálných vzorků nebylo moţné úplně separovat katechin a epikatechin, proto při kvantifikaci byly tyto analyty vyhodnocovány jako suma ploch těchto dvou píků. Stejný postup byl pouţit i pro kvantifikaci cis- a trans- resveratrolu, protoţe za působení UV-Vis záření dochází k přeměně cis-resveratrolu na trans-resveratrol, byla by kvantifikace jednotlivých forem obtíţná. Prvním analyzovaným vzorkem byla hrubě mletá hroznová semínka 1/M. (Obr. 29) V tomto vzorku bylo identifikováno 9 analytů: resveratrol, katechin, epikatechin, rutin, kyseliny ferulová a p-kumarová, myricetin, kvercetin a kyselina galová. U vzorku 1/M bylo pouţitím L-L extrakce dosaţeno nejlepších výsledků coţ umoţnilo identifikovat nejvíce analytů. Kvantifikace byla úspěšná pouze 3 analytů, zbylé byly pod limitem stanovitelnosti.
50
Obr. 29: Identifikace analytů ve vzorku moučky hroznových semínek 1/M: 1 resveratrol, 2 katechin, 3 epikatechin, 4 rutin, 5 kyselina ferulová, 6 kyselina p-kumarová, 7 myricetin, 8 kvercetin, 9 kyselina galová Tabulka 10: Obsah analytů ve vzorku hroznových semínek 1/M analyt cis-/trans resveratrol katechin epikatechin kyselina ferulová kyselina galová rutin kyselina p-kumarová myricetin kvercetin
y = ax+b
R²
mg/ml
y = 213,5x + 0,735
1,000
0,0069
y = 208,0x + 8,173
0,992
0,0786
y = 190,2x + 0,069
0,998
-
y = 120,8x + 0,869 y = 138,6x + 0,445
0,994 0,998
0,0149 -
y = 146,0x + 0,094 y = 72,99x + 0,182 y = 61,32x+ 1,058
1,000 0,993 0,998
-
51
Ve vzorku 2/M, hroznová semínka, bylo identifikováno 7 látek, ale kvůli podobným migračním časům kyseliny ferulové a kaempferolu nebylo moţné tyto analyty za nastavených podmínek separace separovat a tudíţ ani kvantifikovat. (Obr. 30)
Obr. 30: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 2/M: 1 resveratrol, 2 katechin, 3 epikatechin, 4 rutin, 5 kyselina ferulová, 6 kaempferol, 7 kyselina galová Tabulka 11: Obsah analytů ve vzorku hroznových semínek 2/M analyt resveratrol katechin epikatechin kyselina galová rutin
y = ax+b y = 91,08x + 0,227
R² 0,998
mg/ml 0,0050
y = 344,4x + 19,69
0,995
0,1145
y = 41,00x + 1,846 y = 145,9x + 0,913
0,991 0,993
0,0901 0,0125
52
U hroznových semínek s označením vzorek 3/M, bylo identifikováno 6 analytů, a to katechin a epikatechin, rutin, kyselina ferulová s kaempferolem a kyselina galová (Obr. 31). I u tohoto vzorku nebylo moţné určit obsah kyselina ferulové a kaempferolu, kvůli nedostatečnému rozlišení při separaci.
Obr. 31: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 3/M: 1 katechin, 2 epikatechin, 3 rutin, 4 kyselina ferulová, 5 kaempferol, 6 kyselina galová Tabulka 12: Obsah analytů ve vzorku hroznových semínek 3/M analyt katechin epikatechin kyselina galová rutin
y = ax+b
R²
mg/ml
y = 403,7x + 12,21
0,999
0,0605
y = 122,9x + 1,012 y = 42,90x + 1,002
0,999 0,998
0,0165 0,0467
53
Ve vzorku vinohradnického materiálu 4/M bylo identifikováno celkem 9 analytů, katechin a epikatechin, rutin, kyselina ferulová a kaempferol, kyselina vanilová, myricetin, kvercetin a kyselina galová (Obr. 32). I přesto, ţe u tohoto vzorku bylo dosaţeno nejlepšího rozlišení pro kyselinu ferulovou a kaempferol, nebylo moţné tyto analyty kvantifikovat. Vypočtený obsah kyseliny ferulové, myricetin a kvercetinu byl pod limitem stanovitelnosti.
Obr. 32: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 4/M: 1 katechin, 2 epikatechin, 3 rutin, 4 kyselina ferulová, 5 kaempferol, 6 kyselina vanilová, 7 myricetin, 8 kvercetin, 9 kyselina galová Tabulka 13: Obsah analytů ve vzorku hroznových semínek 4/M analyt katechin epikatechin rutin kyselina vanilová myricetin kvercetin kyselina galová
y = ax+b
R²
mg/ml
y = 754,9x + 16,37 y = 109,1x + 0,824
0,995 0,991
0,0434 0,0151
y = 170,7x + 0,188 y = 74,89 + 0,212 y = 62,37 + 1,032
0,999 0,992 0,996
-
y = 186,8x + 1,415
0,993
0,0152
54
Ve vzorku moučky 5/M bylo identifikováno 7 polyfenolických látek, a to cis- i trans- forma resveratrolu, majoritně zastoupený je zde opět katechin s epikatechinem, dále rutin, kyselina ferulová, kaempferol a kyselina galová.
Obr. 33: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 5/M; 1 cis a trans resveratrol, 2 katechin, 3 epikatechin, 4 rutin, 5 kyselina ferulová, 6 kaempferol, 7 kyselina galová. Tabulka 14: Obsah analytů ve vzorku hroznových semínek 5/M analyt resveratrol katechin epikatechin rutin galová
y = ax+b y = 263,5x + 1,568
R² 0,988
mg/ml 0,0120
y = 1217x + 16,77 y = 234,9x + 0,678 y = 207,8x + 1,316
0,967 0,996 0,982
0,0276 0,0127
55
5.11. Identifikace vzorků stonků vinné révy Dalším bodem při analýze stonků byla identifikace jednotlivých analytů ve vzorku. Metodou přídavku standardu byly identifikovány vzorky stonků po L-L extrakci. Koncentrace analytu v prvním přídavku byla 0,01 mg.ml-1 a ve druhém přídavku 0,02 mg.ml-1. Za sady stonků byly pro ukázku vybrány tři vzorky s největšími rozdíly obsahu polyfenolických látek, a to vzorek 1/S, 3/S a 6/S.
Obr. 34: Identifikace analytů ve stoncích vzorek 1/S po extrakci L-L: 1 resveratrol, 2 katechin/epikatechin, 2 rutin, 3 kyselina ferulová, 4 kvercetin, 5 kvercetin glukuronid. Ve vzorku s označením 1/S se podařilo identifikovat 5 polyfenolických látek, (Obr. 34) ve velmi malém mnoţství zde byl identifikován resveratrol u kterého se ale nedalo s jistotou určit, je-li ve formě cis- nebo trans-. Problémem byla i identifikace katechinu a epikatechinu, protoţe při přídavcích těchto analytů ke vzorku docházelo k nárůstu pouze jednoho píku s migračním časem 8,124 minut. Proto ve vzorcích stonků byly tyto dvě formy přiřazeny jednomu píku. Dalšími analyty nalezenými v tomto vzorku byly kyselina ferulová, kvercetin a kvercetin glukuronid.
56
U stonků s označením 3/S byl podle hodnot absorbance obsah polyfenolických látek nejmenší ze všech vzorků této sady. Ke standardům se podařilo přiřadit 7 píků z elektroforeogramu na Obr. 35. Byly identifikovány tyto látky cis- i trans- resveratrol, katechin a epikatechin, v malém mnoţství také rutin, dále kyselina ferulová, kvercetin a kvercetin glukuronid.
Obr. 35: Identifikace analytů ve stoncích vzorek 3/S po extrakci L-L: 1 cis- resveratrol, 2 trans-resveratrol, 3katechin/epikatechin, 4 rutin, 5 kyselina ferulová, 6 kvercetin, 7 kvercetin glukuronid Na rozdíl od ostatních vzorků, ve vzorku 6/S byl v majoritním mnoţství zastoupen cis-/tran- resveratrol viz Obr. 36. Při analýze tohoto vzorku nabývala absorbance nejvyšších hodnot, z čeho vyplývá i největší obsah polyfenolických látek ze všech vzorků této sady. Dalším hojně zastoupeným analyty byly katechin a epikatechin, a jako u většiny vzorků zde byl identifikován rutin, kyselina ferulová, kvercetin a kvercetin glukuronid.
57
Obr. 36: Identifikace analytů ve vzorků stonku 6/S po L-L: 1 cis- resveratrol, 2 transresveratrol, 3 katechin/epikatechin, 4 rutin, 5 kyselina ferulová, 6 kvercetin, 7 kvercetin glukuronid. Většina vzorků druhé sady měla velmi podobné sloţení, lišilo pouze jejich mnoţství. U všech vzorků stonků byl zaznamenán stejný analyt, který nebylo moţné identifikovat metodou přídavku standardu. Pro jeho identifikaci byla pouţita technika LC-MS, kterou byl stanoven poměr m/z tohoto analytu 47,706 coţ odpovídá molekulové hmotnosti kvercetinu glukuronidu. Jak je moţné vidět v následující kapitole, analyt identifikovaný jako kvercetin glukuronid se vyskytoval také ve všech vzorcích sady listů.
5.12. Identifikace a kvantifikace vzorků listů vinné révy Jako poslední byly identifikovány metodou přídavku standardu vzorky listů vinné révy, které byly extrahovány pomocí ultrazvukové lázně a poté byla provedena SPE extrakce. U vzorků listů byl celkový obsah polyfenolů větší neţ u vzorků stonků, majoritní zastoupení u všech vzorků třetí sady měl kvercetin glukuronid. Zastoupení zbylých polyfenolických látek bylo stejné u většiny vzorků, lišilo se pouze mnoţství jednotlivých analytů. 58
Prvním vzorkem listů pro identifikaci byl 1/L, u kterého se podařilo určit přítomnost čtyř analytů, viz Obr. 37. Stejně jako u stonků nebylo moţné identifikovat samostatně katechin a epikatechin. Dále byla potvrzena přítomnost rutinu, kvercetinu, kvercetin glukuronidu.
Obr. 37: Identifikace analytů v listech vinné révy vzorek 1/L po extrakci SPE: 1 katechin/epikatechin, 2 rutin, 3 kvercetin, 4 kvercetin glukuronid. Vzorek 3/L jako jediný z třetí sady vzorků obsahoval velmi malé mnoţství resveratrolu. Také se zde podařilo identifikovat jak katechin tak epikatechin, nedošlo k jejich úplné separaci, ale při přídavku standardu bylo moţné odlišit nárůst jednotlivých píků a tak identifikovat oba tyto analyty. Ve vzorku byla dále potvrzena přítomnost rutinu, kyseliny ferulové, kvercetinu a opět majoritní obsah kvercetin glukuronidu (Obr. 38).
59
Obr. 38: Identifikace analytů ve vzorku listů vinné révy 3/L po SPE extrakci:1 resveratrol, 2 katechin, 3 epikatechin, 4 rutin, 5 kyselina ferulová, 6 kvercetin, 7 kvercetin glukuronid. Jak znázorňuje Obr. 39 při analýze vzorku 5/L byly naměřeny nejvyšší hodnoty absorbance, coţ znamená nejvyšší mnoţství polyfenolických látek ve vzorku. Největší zastoupení zde opět má kvercetin glukuronid. Mezi další identifikované analyty patří katechin/epikatechin, rutin, kyselina ferulová a kvercetin.
60
Obr. 39: Identifikace analytů ve vzorku listů vinné révy 5/L po SPE extrakci:1 katechin/ epikatechin, 2 rutin, 3 kyselina ferulová, 4 kvercetin, 5 kvercetin glukuronid.
61
6. ANALÝZA DOPLŇKŮ STRAVY Součástí
diplomové
práce
byla
analýza
čtyř
potravinových
doplňků
ORAXxANTIOXx společnosti Biomedica, u kterých výrobce uvádí jako účinné látky moučku z jader vinných hroznů, extrakt ze zeleného čaje a extrakt z jader vinných hroznů. Podle „Oxygen Radical Absorption Capacity - ORAC“ (laboratorně změřený antioxidační potenciál, v jednotkách Trolox (µmol TE/g) údaj výrobce, jsou rozděleny: ORAXxANTIONXx 3 000
ORAXxANTIONXx 5 000
ORAXxANTIONXx 7 000
ORAXxANTIONXx 10 000
Obr. 40: Potravinové doplňky ORAXxANTIOXx Potravinové doplňky ORAXxANTIOXx obsahují různý poměr extraktu ze zeleného čaje a extraktu ze semínek vinných hroznů. Se vzrůstající hodnotou ORAC vzrůstá obsah extraktu ze zeleného čaje a klesá podíl extraktu z jader hroznů. Tyto výrobky mají pomáhat chránit organismus člověka proti působení volných radikálů, při únavě nebo stresu.
6.1. Separační podmínky Pro analýzu přípravků ORAXxANTIOXx byly pouţity stejné podmínky jako pro analýzu vinohradnického materiálu. Jako základní elektrolyt byl pouţit 17 mmol.l-1 tetraboritan sodný s 10% methanolu. Separace probíhala v nepokryté křemenné kapiláře celkové délky 48,5 cm, při napětí 15 kV. Vzorek byl do systému dávkován hydrodynamicky tlakem 20 mbar po dobu 5 sekund.
62
6.2. Příprava vzorků Postup při přípravě vzorků potravinových doplňků byl stejný jako při přípravě vzorků z vinné révy. Pomocí CE byly jako první porovnány vzorky připravené extrakcí v ultrazvukové lázni a vytřepáváním. Při paralelně prováděných extrakcích byl 1g vzorku extrahován ve 20 ml 50% methanolu po dobu 2 hodin, poté byly vzorky 15 min centrifugovány při 5000 otáčkách za minutu a filtrovány přes filtry s velikostí póru 0,45 µm. Takto připravené vzorky byly uchovány ve tmě v mrazničce při teplotě -10 °C.
Obr. 41: Porovnání postupu extrakce pro přípravu vzorku ORAXxANTIOXx 3000: a) vytřepáváním b) ultrazvukové lázně. Porovnání elektroforeogramů takto připravených vzorků se potvrdil předpoklad, ţe při pouţití ultrazvukové extrakce bude výtěţnost větší, vyšší hodnoty absorbance znamenají větší obsah látek ve vzorku (Obr. 41). Proto byla pro přípravu vzorků zvolena extrakce v ultrazvukové lázni, extrakce probíhala 2 hodině při 30 °C. Na takto připravených vzorcích potravinových doplňků byly zkoušeny stejné metody pro úpravu a zakoncentrování vzorků před samotnou analýzou, jako u vzorků vinohradnického materiálu.
63
Obr. 42: Porovnání metod pro úpravu vzorku ORAXxANTIOXx 3000: a) vzorek bez úprav b) po L-L extrakci, c) po extrakci SPE. Při extrakci L-L bylo 10 ml vzorku vytřepáváno do 10 ml diethylethetu po dobu 10 minut. Po rozdělení byla odebraná část vzorku odpařena do sucha a poté rozpuštěna v 1 ml 50% methanolu. Jak znázorňuje graf L-L extrakce měla vliv pouze na odstranění matrice ze vzorku, avšak zlepšení separace nebo zakoncentrování analytů ve vzorku nebylo dosaţeno. Z porovnání elektroforeogramů b) a c) v obrázku 42 je vidět, ţe pouţitím L-L extrakce bylo dosaţeno lepších výsledků neţ při pouţití SPE, kdy docházelo ke ztrátám téměř všech detekovaných analytů. Ztrátu analytů lze vysvětlit tím, ţe pro vzorky potravinových doplňků nebyl postup pouţitý při SPE vzorků vinné révy vhodný a byla by nutná jako optimalizace. Nebo při SPE docházelo opět k přesycení extrakční kolonky a tím ke ztrátám analytů.
64
6.3. Identifikace polyfenolických látek v potravinových doplňcích Identifikace jednotlivých látek ve vzorcích potravinových doplňků nebyla moţná, protoţe se metodou kapilární zónové elektroforézy se nepodařilo jednotlivé analyty ve vzorcích dostatečně separovat. Moţným vysvětlením můţe být, ţe vzorky potravinových doplňků řady ORAXxANTIOXx obsahovali látky s podobnými elektroforetickými vlastnostmi, protoţe jak můţeme vidět na obrázcích 41 a 42 všechny analyty byly soustředěny do dvou majoritních píků s migračními časy tm1 5,821 min a tm2 7,182 minut. Dalším důvodem můţe být vysoký obsah některých polyfenolických látek ve vzorcích, který způsoboval překrývání píků. Ředěním vzorků ani úpravou separačních podmínek nebylo dosaţeno lepších výsledků separace. Pouţitím ţádné z výše uvedených metod pro úpravu vzorků nebylo dosaţeno zlepšení separace tak aby bylo moţno jednotlivé analyty identifikovat. Pouze na základě shody migračních časů se lze domnívat, ţe vzorky obsahovali obě formy resveratrolu, tm(resveratrol) 5,837 min, a epikatechin, tm(epikatechin) 7,171 min, viz obrázek 41. Vzorky neobsahovaly pouze tyto dva polyfenoly, analýzou HPLC byly ve vzorcích dále identifikovány tyto analyty: katechin, kyseliny vanilová a galová.
65
7. ZÁVĚR A DISKUZE V této práci byly vytvořeny metody pro analýzu polyfenolických látek ve vzorcích různého vinohradnického materiálu. Metoda CZE byla optimalizována na modelové směsi, která obsahovala 7 analytů, relaxační metodou. Další část diplomové práce byla věnována úpravě rostlinných vzorků. Bylo potřeba najít postup zpracování pro jednotlivé sady vzorků tak, aby bylo získáno co největší mnoţství hledaných analytů ve vzorcích. Na úpravu vzorů byly pouţity tři rozdílné extrakční techniky, extrakce pevnou fází, extrakce kapalina- kapalina a nadkritická fluidní extrakce. U SFE extrakce, byly pouţity známé postupy extrakce pouţívané při analýze polyfenolických látek v slupkách hroznových bobulí. Tyto postupy nebyly pro vzorky mouček z hroznových jader vhodné, pouţitím SFE nebylo dosaţeno očekávaných výsledků. Byla nutná jejich optimalizace parametrů SFE a proto nebyla metoda pro další vzorky pouţita. Pomocí modelové směsi byl upraven postup extrakce pevnou fází. Při SPE modelové směsi byl jako nejlepší rozpouštědlo k promývání vzorku 5% methanol a elučním činidlem 100% methanol. Tento postup byl aplikován na tři sady reálných vzorků, pouze u vzorků listů vinné révy byla SPE nejlepší metodou pro úpravu vzorků. U vzorků jader a stonků docházelo při SPE ke ztrátám analytů, pravděpodobně v důsledku zanášení extrakční kolonky matricí vzorku. Pro vzorky hroznových jader a stonků byla jako metoda pro úpravu vzorků vybrána extrakce kapalina- kapalina. V připravených
vzorcích
bylo
za
úkol
identifikovat
co
největší
počet
polyfenolických látek a porovnat jejich výskyt a obsah v jednotlivých sadách vzorků. Pro identifikaci jednotlivých analytů byla pouţita metoda přídavku standardu. Nejvíce polyfenolických látek bylo nalezeno v moučkách hroznových jader. Katechin, epikatechin, rutin a kyselina galová byly v různých koncentracích identifikovány ve všech vzorcích mouček hroznových jader. Dalšími nalezenými polyfenoly byly resveratrol, kaempferol, kyseliny vanilová a ferulová. Ve stoncích a listech byl ve všech vzorcích detekován pík s migračním časem 12,243 minut, který nebylo moţné identifikovat metodou přídavku standardu. Tato látka byla identifikována metodou LC-MS jako kvercetin glukuronid. Tato látka byla ve všech vzorcích listů v majoritním zastoupení. Dalšími analyty identifikovanými v listech byly rutin, kvercetin, kvercetin glukuronid, katechin a epikatechin.
66
U vzorků stonků se výrazně lišilo zastoupení resveratrolu. Obsah resveratrolu ve vzorcích narůstal od 1/S po 6/S, kde bylo jeho mnoţství největší. Dále byl ve všech vzorcích stonků rutin, kyselina ferulová, kvercetin a kvercetin glukuronid. Celkový obsah polyfenolických látek byl nejmenší právě ve stoncích vinné révy. Kvantifikace vybraných polyfenolických látek ve vzorcích stonků a listů metodou přídavku standardu nebyla z technických důvodů provedena. Při porovnání absorbancí vybraných analytů ve vzorcích stonků a listů lze říct, ţe obsah polyfenolů je vyšší ve vzorcích odrůdy červeného vína Zwiegeltrebe. Vzorky odrůdy červeného vína Zweigeltrebe obsahovali větší mnoţství resveratrolu neţ vzorky odrůdy Veltlínské zelené, která je odrůdou vína bílého. Poslední část práce tvoří analýza potravinových doplňků ORAXxANTIOXx. Na vzorcích byly vyzkoušeny stejné postupy extrakcí jako u vzorků vinné révy. Ţádnou z těchto technik nebylo dosaţeno poţadovaných výsledků. Ve vzorcích potravinových doplňků se nepodařilo metodou přídavku standardu potvrdit přítomnost ţádného z hledaných analytů. Pouze na základě shody migračních časů můţeme předpokládat přítomnost resveratrolu, katechinu nebo epikatechinu ve vzorcích. Z paralelní studie polyfenolických látek metodou HPLC víme, ţe vzorky potravinových doplňků obsahovaly také kyseliny vanilovou a galovou.
67
8. SEZNAM POUŽITÝCH ZKRATEK CZE - capillary zone electrophoresis – kapilární zónová elektroforéza HPLC - high performance liquid chromatography – vysoce účinná kapalinová chromatografie SPE - solid phase extraction – extrakce pevnou fází SFE - supercritical fluid extraction – superkritická fluidní extrakce STB - sodium tetraborate – tetraboritan sodný L-L extrakce - liquid- liquid extrakce – extrakce kapalina – kapalina LC-MS - liquid chromatogramy - mass spectrometry- kapalinová chromatografie s hmotnostní spektrometrickou detekcí FTIR - fourier transform infrared spectroscopy – infračervená spektroskopie furierovou transformací
9. SEZNAM OBRÁZKŮ Obr. 1: Schéma základního uspořádání kapilární zónové elektroforézy Obr. 2: Znázornění elektroosmotického toku Obr. 3: Zařízení pro SPE extrakci Obr. 4: Schéma extraktoru pro nadkritickou fluidní extrakci Obr. 5: Popis částí vinné révy Obr. 6: Obecná struktura flavonoidu Obr. 7: Obecná struktura flavanonu Obr. 8: Obecná struktura flavonu Obr. 9: Obecná struktura flavanolu Obr. 10: Obecná struktura flavonolu Obr. 11: Obecná struktura isoflavonu Obr. 12: Separace polyfenolických látek metodou HPLC před a po SPE extrakci. Obr. 13: Vliv přídavku methanolu do základního elektrolytu na separaci Obr. 14: Výběr rozpouštědla na přípravu vzorků Obr. 15: Extrakce vzorku a) v ultrazvukové lázni, b) vytřepáváním Obr. 16: Porovnání promývání modelové směsi pro SPE Obr. 17: Výběr elučního rozpouštědla pro SPE Obr. 18: Kalibrační závislost fenolu Obr. 19: Výsledek SPE pro vzorek hroznových jader připravených v ultrazvukové lázni 68
Obr. 20: Porovnání metod na úpravu vzorku stonků z ultrazvukové lázně a) SPE, b) vzorek bez úprav Obr. 21: Porovnání metod na úpravu vzorků pro vzorek listů z ultrazvukové lázně a) vzorek bez úprav, b) SPE, c) L-L extrakce Obr. 22: Porovnání mnoţství pouţitého rozpouštědla na L-L extrakci a) 5ml vzorku, b) 10 ml vzorku Obr. 23: Porovnání metod na úpravu vzorků hroznových semínek a) L-L extrakce, b) SPE, c) vzorek bez úprav. Obr. 24: Porovnání metod na úpravu vzorků stonků a) SPE, b) L-L extrakce Obr. 25: Porovnání metod na úpravu vzorků vinné révy a) SPE, b) L-L extrakce Obr. 26: Elektroforeogram vzorku hroznových semínek a) L-L extrakce, b) L-L a SPE extrakce Obr. 27: Vzorek hroznových semínek po SFE za tlaku 15 kPa Obr. 28: Vzorek hroznových semínek po SFE za tlaku 25 kPa Obr. 29: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 1/M Obr. 30: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 2/M Obr. 31: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 3/M Obr. 32: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 4/M Obr. 33: Identifikace analytů ve vzorku hroznových semínek 5/M Obr. 34: Identifikace analytů ve vzorku stonků 1/S Obr. 35: Identifikace analytů ve vzorku stonků 3/S Obr. 36: Identifikace analytů ve vzorku stonků 6/S Obr. 37: Identifikace analytů ve vzorku listů 1/L Obr. 38: Identifikace analytů ve vzorku listů 3/L Obr. 39: Identifikace analytů ve vzorku listů 5/L Obr. 40: Potravinové doplňky ORAXxANTIOXx Obr. 41: Porovnání postupu extrakce pro přípravu vzorku ORAXxANTIOXx 3000 Obr. 42: Porovnání metod pro úpravu vzorku ORAXxANTIOXx 3000
69
10. POUŽITÁ LITERATURA [1]
KLOUDA, Pavel. Moderní analytické metody. Ostrava: Pavel Klouda, 2003. 130 s.
[2]
DOLNÍK, Vladislav. Úvod do kapilární elektroforézy. Brno, 1994. 65 s.
[3]
LÁZNÍČKOVÁ, Alice; KUBÍČEK, Vladimír. Základy fyzikální chemie: Vybrané kapitoly pro posluchače Farmaceutické fakulty. Praha: Karolinum, 2008. 167 s.
[4]
KUBÁŇ, Petr; ŠTĚRBOVÁ, Dagmar; KUBÁŇ, Vlastimil. Separation of phenolic acids by capillary electrophoresis with indirect contactless condutometric detection. Electrophoresis . 2006, 27, s. 1368-1375.
[5]
CARTONI, Giampaolo; COCCIOLI, Franco; JASIONOWSKA, Renata. Capillary electrophoretic separation of polyphenolic acids. Journal of Chromatography A. 1995, 709, s. 209-214.
[6]
PERES, Renato G., et al. Multivariant optimization, validation, and aplication of capillary electrophoresis for simultaneous determination of polyphenols and phenolic acids in Brazilian wines. J. Sep. Sci. 2009, 32, s. 3822-3828.
[7]
DOBIÁŠOVÁ, Z.; PAZOUREK, J.; HAVEL, J. Simultaneous determination of trans-resveratrol and sorbic acid in wine by capillary zone electrophoresis. Electrophoresis . 2002, 23, s. 263-267.
[8]
ZHAO, D. B., et al. Separation and determination of six active components in two Myricaria plants by capillary chromatography. Chromatographia. 2005, 61, s. 643-646.
[9]
DADÁKOVÁ, E.; PROCHÁZKOVÁ, E.; KŘÍŢEK, M. Application of micellar electrokinetic capillary chromatography for quantitative analysis of quercetin in plant material. Electrophoresis . 2001, 22, s. 1573-1578.
[10]
MATĚJÍČEK, D., et al. Application of solid-phase extraction for determination of phenolic compounds in barrique wines. Anal Bioanal Chem. 2003, 377, s. 340-345.
[11]
THIERFELDER, Bernd. Solid phase extraction 2010. s. 20. Prezentace k přednášce o SPE.
[12]
PASCUAL-MARTÍ, M.C., et al. Supercritical fluid extraction of resveratrol from grape skin of Vitis vinifera and determination by HPLC. Talanta. 2001, 54, s. 735-740.
[13]
CHAFER, Amparo, et al. Supercritical fluid extraction and HPLC determination of relevant polyphenolic compounds in grape skin. J. Sep. Sci. 2005, 28, s. 2050-2056.
[14]
PALMA, M.; TAYLOR, L.T., Statistical design for optimalization of extraction of polyphenols from an inert matrix using carbon dioxide-based fluids. Analytica Chimica Acta. 1999, 391, s. 321-329.
70
[15]
DE RIJKE, Eva, et al. Analytical separation and detection methods for flavonoids. Journal of Chromatography A. 2006, 1112, s. 31-63.
[16]
VALLS, Josep, et al. Advanced separation methods of food anthocyanins, isoflavones and flavanols. Journal of Chromatography A. 2009, 1216, s. 7143-7172.
[17]
SPANILÁ, Miroslava. Využití prekoncetračních technik v kapilární zónové elektroforéze. Brno, 2003. 82 s. Diplomová práce. Masarykova Univerzita.
[18]
ELEFANTOVÁ, Petra. Stanovení polyfenolických látek v rostlinách. Brno, 2010. 43 s. Bakalářská práce. Masarykova Univerzita. HAASOVÁ, Michaela. Analýza polyfenolů ve víně pomocí SPE a fotometrie. Brno, 2005. 33 s. Bakalářská práce. Masarykova Univerzita.
[19]
[20]
ELIÁŠOVÁ, Eliška. Význam vybraných polyfenolických látek obsažených ve víně. Zlín, 2010. 49 s. Bakalářská práce. Univerzita Tomáše Bati ve Zlíně.
[21]
KRAUS, Vilém; KUTTELVAŠER, Zdeněk; VURM, Bohumil. Encyklopedie českého a moravského vína. Praha: Melantrich, 1997. 223 s. ISBN 80-7023-250-1.
[22]
KRAUS, Vilém; FOFFOVÁ, Zuzana; VURM, Bohumil; KRAUSOVÁ, Dáša. Nová encyklopedie českého a moravského vína, 1. díl. Praha: Praga Mystica, 2005. Str. 48–49. ISBN 80-86767-00-0.
[23]
VAHER, Merike; KOEL, Mihkel. Separation of polyphenolic coumpounds extracted from plant matrices using capillary electrophoresis. Journal of Chromatography A. 2003, 990, s. 225-230.
[24]
NICOLAOU, Irena N.; KAPNISSI-CHRISTODOULOU, Constantina P. Analysis of polyphenols using capillary zone electrophoresis : Determination of the most effective wine sample pre-treatment method. Electrophoresis. 2010, 31, s. 3895-3902.
[25]
ZENDULKA, Ondřej. Polyfenoly ve výživě jako možná prevence nádorových onemocnění. Brno 2008. Diplomová práce. Masarykova Univerzita.
[26]
ĎURAČKOVÁ, Zdena. Voľné radikály a antioxidanty v medicíne. Martin: Slovak Academic Press, 1998. 285 s. ISBN 8088908116
[27]
CRAZIER, A.; CLIFFORD, M.N.; ASHIHARA, H. Plant secondary metabolites: Occurrence, Structure and Role in the Human Diet. Iowa: Blackwell Publishing Ltd, 2006. 372 s. ISBN 978-1-4051-2509-3.
[28]
KARTSOVA, L.A.; BESSONOVA, E.A. Preconcentration techniques in capillary electropohresis electrophoresis. Journal of Analytical Chemistry. 20093, 64, s. 326-337.
71
[29]
HONEGR, Jan, et al. Large-volume sampling stacking with polarity switching in CE for determination of natural polyphenols in plant extracts. Chromatographia. 2010, 72, s. 885-891.
[30]
PYRZYNSKA, Krystyna; BIESAGA, Magdalena. Analysis of phenolic acids and flavonoids in honey. Trends in Analytical Chemistry. 2009, 28, s. 893-902. GÓMEZ CARAVACA, Ana María, et al. Electrophoretic identification and quantitation of compounds in the polyphenolic fraction of extra-virgin olive oil. Electrophoresis. 2005, 26, s. 3538-3551.
[31]
[32]
CREGO, Antonio Luis, et al. Capillary electrophoresis separation of rosemary antioxidants from subcritical water extracts. European Food Research and Technology 2004, 219, s. 549-555.
[33]
VOLPI, Nicola. Separation of flavonoids and phenolic acids from propolis by capillary zone electrophoresis.Electrophoresis. 2004, 25, s. 1872-1878.
[34]
PAZOUREK, Jiří, et al. Separation of polyphenols in Canary Islands wine by capillary zone electrophoresis without preconcentration. Journal of Chromatography A. 2000, 874, s. 111-119.
[35]
PRIEGO CAPOTE, Feliciano; RODRÍGUES, José Manuel Luque; DE CASTRO, María Dolores Luque. Determination of phenolic compounds in grape skin by capillary electrophoresis with simultaneous dual fluorescence and diode array absorption detection after dynamic superheated liquid leaching. Journal of Chromatography A. 2007, 1139, s. 301-307.
[36]
KULOMAA, Anu; SIRÉN, Heli; RIEKKOLA, Marja-Liisa. Identification of antioxidative compounds in plant beverages by capillary electrophoresis with the marker index technique. Journal of Chromatography A. 1997, 781, s. 523-532.
[37]
DROBILOVÁ, Marcela. Hroznová šťáva a její využití. Brno 2009. Bakalářská práce. Vysoké učení technické v Brně.
[38]
SOMMER, Lumír, et al. Základy analytické chemie II. Brno: VUTIUM, 2000. 347 s.
[39]
FORET, František; KŘIVÁNKOVÁ, Ludmila; BOČEK, Petr. Capillary Zone Electrophoresis. Weinheim: VCH Verlagsgesellschaft, 1993. 346 s. ISBN 3-527-30019-8.
[40]
POSPÍŠILOVÁ, Dorota. Ampelografia ČSSR. Bratislava: Príroda, 1981. 347 s.
72
[41]
Eckschlager K., Horsák I., Kodejš Z. Vyhodnocování analytických výsledků a metod. Praha: Nakladatelství technické literatury Alfa, 1980.
[42]
MELOUN, Milan; MILITKÝ, Jiří. Kompendium statistického zpracování dat. Praha: Academia, 2006. 982 s.
[43]
Havel, J., Pazourek, J., Je víno zdravé? Resveratrol ano. Vesmír, 2001, 80, s. 372 – 373
[44]
ĎURAČKOVÁ, Zdena. Voľné radikály a antioxidanty v medicíne. Martin: Slovak Academic Press, 1998. 285 s. ISBN 8088908116
[45]
http://www.hplc.cz/Tip/lod_loq.htm
[46]
http://www.wine.cz/reva/index.html 12.3.2011
[47]
http://www.med.muni.cz/biochem/seminare/prirantiox.rtf 16.11.2010
[48]
http://www.filterservice.be/FR/products/produkt_gruppe.asp?p=8&pu=35 12.10.2010
15.4. 2011
73
Příloha 1: Absorbční spektra standardů polyfenolických látek Absorbční spektra byla vygenerována z elektroforeogramů standardu jednotlivých analytů při vlnové délce 254 nm.
Obr I. Absorbční spektrum katechinu
Obr II. Absorbční spektrum epikatechinu
Obr III. Absorbční spektrum kaempferolu
Obr IV. Absorbční spektrum myricetin
Obr VI. Absorpční spektrum resveratrolu
Obr VII. Absorpční spektrum rutinu 74
Obr VIII. Absorbční spektrum kys. ferulové
Obr X. Absorbční spektrum kys. kávové
Obr IX. Absorbční spektrum kys. galové
Obr XI. Absorbční spektrum kys. pkumarové
Obr XII. Absorbční spektrum kys. vanilové
75
Obr XIII. Absorbční spektrum kys. skořicové
Příloha 2: Struktury použitých polyfenolických Kyselina ferulová Vzorec Mr
C10H10O4 194,184
Myricetin Vzorec Mr
C15H10O8 318,2351 g/mol
Kyselina kávová Vzorec Mr
C9H8O4 180,16 g/mol
Kaempferol Vzorec Mr
Kvercetin Vzorec Mr
C15H10O6 286,23 g/mol
C15H10O7 302,236 g/mol
Kyselina skořicová C9H8O2 Vzorec Mr
76
148,17 g/mol
Rutin Vzorec Mr
Katechin Vzorec Mr
Kyselina galová Vzorec Mr
C27H30O16 610,52 g/mol
C15H14O6 290,26 g/mol
C7H6O5 170,12 g/mol
Resveratrol trans-/ cisC14H12O3 Vzorec Mr
Epikatechin Vzorec Mr
Kyselina vanilová Vzorec Mr
77
228,24 g/mol
C15H14O6 290,26 g/mol
C8H8O4 168,14672g/mol
Příloha 3: Testování opakovatelnosti retenčních charakteristik Tabulka I: Opakovatelnost migračních časů během jednoho dne
1 2 3 4
resveratrol epikatechin 5,844 7,208 5,792 7,219 5,825 7,136 5,832 7,125
rutin 7,812 7,775 7,785 7,743
kyselina ferulová 9,413 9,428 9,444 9,433
myricetin 10,610 10,633 10,619 10,688
kvercetin 10,879 10,848 10,899 10,859
kyselina galová 14,189 14,198 14,232 14,162
5 R
5,816 0,052
7,119 0,094
7,789 0,069
9,484 0,071
10,613 0,078
10,822 0,077
14,149 0,134
IS x
±0,04368 5,822
±0,07896 7,161
±0,05796 7,781
±0,05964 9,440
±0,06552 10,633
±0,06468 10,861
±0,11256 14,166
S
0,020
0,048
0,025
0,027
0,032
0,029
0,050
Sr
0,0034
0,0067
0,0032
0,0028
0,0030
0,0027
0,0035
Výsledky byly testovány na odlehlost podle Dean- Dixona, ţádný z výsledků není odlehlý. Tabulka II: Opakovatelnost ploch píků během jednoho dne resveratrol epikatechin plocha píku 88,5 42,3 plocha píku 85,4 45,9
rutin 66,0 63,5
kyselina ferulová 198,3 193,1
plocha píku x R IS S Sr
60,9 63,5 5,1 ±15,3 2,550 0,040
186,3 192,6 12,0 ±36,1 6,018 0,031
82,9 85,6 5,6 ±16,8 2,805 0,033
44,1 44,1 3,6 ±10,8 1,800 0,041
myricetin kvercetin 89,4 96,8 91,8 99,9 87,0 89,4 4,8 ±14,4 2,400 0,027
101,2 99,3 4,4 ±13,2 2,261 0,023
kyselina galová 160,2 165,2 173,1 166,2 12,9 ±38,8 6,504 0,039
Výsledky byly testovány na odlehlost podle Dean- Dixona, ţádný z výsledků není odlehlý. Tabulka III: Opakovatelnost výšek píků během jednoho dne
výška píku výška píku výška píku x R IS S Sr
resveratrol epikatechin 35,4 5,9 34,5 5,9 33,5 5,6 34,5 5,8 1,9 0,3 ±5,7 ±0,9 0,950 0,173 0,028 0,030
rutin 22,5 21,9 21,3 21,9 1,2 ±3,6 0,600 0,027
kyselina ferulová 45,8 45,4 44,7 45,3 1,1 ±3,3 0,557 0,012
myricetin kvercetin 22 22,9 23,2 22,1 21,7 23,4 22,3 22,8 1,5 1,3 ±4,5 ±3,9 0,794 0,656 0,036 0,029
kyselina galová 14,5 14,3 13,9 14,2 0,6 ±1,8 0,306 0,021
Výsledky byly testovány na odlehlost podle Dean- Dixona, ţádný z výsledků není odlehlý.
78
