STANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ

Katedra analytické chemie PřF UK Praha

STANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ 1 Úkol Separovat a metodou kalibrační křivky stanovit azobarviva (methyloranž - MO, dimethylová žluť - DMŽ) ve směsi metodou RP-HPLC se spektrofotometrickou detekcí, určit meze detekce (LOD) a meze stanovitelnosti (LOQ), stanovit koeficienty linearity detektoru a ověřit jeho lineární dynamický rozsah pro obě barviva.

2 Princip Netěkavé a polární látky, jejichž analýza plynovou chromatografií je velmi obtížná, lze s výhodou analyzovat metodou HPLC. Pricnipiálně rozlišujeme dva druhy HPLC: - kapalinovou chromatografii na normálních fázích (NP-HPLC), kdy stacionárními fázemi jsou polární oxid křemičitý (silikagel) nebo oxid hlinitý (alumina) a mobilní fází je nepolární kapalina, nejčastěji uhlovodík - HPLC na obrácených (reverzních) fázích (RP-HPLC), kde separace probíhá na nepolární stacionární fázi, nejčastěji na silikagelu chemicky modifikovaném nepolárními skupinami, jako jsou C8 (oktyl) nebo C18 (oktadecyl), přičemž jako mobilní fáze se používá polárnějších kapalin (methanol, acetonitril) a jejich směsí s vodou či vodnými pufry. K separaci studovaných azobarviv vyhovuje ve spojení s C18 stacionární fází směs methanolu s vodou (9:1). Studovaná barviva lze detegovat fotometrickým detektorem při vlnové délce 290 nm, kde všechna vykazují dostatečně silnou absorbci záření. Identifikace se provádí na základě shody retenčních časů, tR, případně retenčních faktorů, k, měřených látek a standardů. Kvantitativní složení vzorku se zjistí metodou absolutní kalibrace na základě proměření kalibračních křivek pro jednotlivé standardní roztoky čistých azobarviv.

Pokročilé praktikum - HPLC

1


3 Pracovní postup 3.1

Příprava mobilní fáze

Pokud není k dispozici dostatek mobilní fáze, připravte asi 500 ml mobilní fáze o složení methanol + voda (9:1) - smíchejte 450 ml methanolu a 50 ml destilované vody odměřené příslušnými odměrnými válci; nedoplňujte - při míšení methanolu a vody není v důsledku vysoké polarity obou kapalin plně zachována aditivita objemů - přefiltrujte připravenou mobilní fázi - pokud je to nutné, odplyňte mobilní fázi (mf) v ultrazvukové lázni asi 10 min

3.2

Příprava měřícího zařízení

- zapněte pumpu a detektor alespoň 20 - 30 min před první analýzou - zapněte lampu detektoru a nechte systém stabilizovat; před první analýzou detektor vynulujte (ZERO, AUTOZERO) - naplňte pístovou pumpu mobilní fází, popř. propojte láhev s mf s pumpou - odstraňte vzduchové bubliny ze všech propojovacích trubiček a z pumpy - nastavte a zapněte průtok mf 0,5 až 1 ml/min - zapněte počítač, nastartujte program Clarity a připravte ho pro sběr dat pod vaším jménem

3.3

Příprava vzorků

Pokud nejsou vzorky v odměrných baňkách, jsou připraveny přímo k měření, není třeba žádné operace a lze je přímo použít k dávkování. Pokud jsou v odměrných baňkách je třeba je doplnit mobilní fází po rysku. Vzorky jsou směsné a obsahují obě barviva.

3.4

Příprava kalibračních roztoků

- zásobní roztoky standardů azobarviv mají koncentraci 1.10-3 mol/l - vhodným ředěním připravte do odměrných baněk roztoky jednotlivých azobarviv o vhodných koncentracích (rozsah sdělí dozor). Pozor, ředíme mobilní fází, nikoliv vodou!


2


3.5

Dávkování

- dávkování se provádí dávkovacími ventily vybavenými dávkovacími smyčkami o velikosti 20 nebo 10 μl - dávkovací smyčky plníme plastovými stříkačkami o vhodném objemu, když je dávkovací ventil v poloze pro plnění smyčky (LOAD); smyčku bychom měli proplachovat alepoň 10ti násobným objemem smyčky - po naplnění smyčky vzorkem přepneme rychlým a plynulým pohybem páky dávkovací ventil do dávkovací polohy (INJECT) a spustíme okamžitě sběr dat počítačem - po ukončení analýzy zastavíme sběr dat a zapíšeme retenční čas, plochu a výšku píků

4 Provedení 4.1

Identifikace azobarviv

- analýzou libovolného roztoku z kalibrační řady samostatných standardů azobarviv určete jejich retenční časy, tR

4.2

Kalibrace

- proměřte všechny připravené kalibrační roztoky azobarviv a zaznamenejte plochy a výšky píků; každý roztok změřte 3 krát, výsledná data statisticky zpracujte a zapište do výsledkových listů - ze získaných dat sestrojte pro obě barviva grafy kalibračních závislostí, jednu pro plochy píků a jednu pro výšky píků; k jednotlivým bodům kalibračních závislostí udejte směrodatné odchylky ve formě chybových úseček (jen pro y osu) - analýzou rozptylu experimentálních dat kolem kalibrační přímky vypočítejte meze detekce a meze stanovitelnosti metody - sestrojte příslušné grafy a vypočítejte z nich koeficienty linearity detektoru jak pro výšky tak i pro plochy píků - graficky ověřte a doložte, že vaše kalibrační řady leží v lineárním dynamickém rozsahu detektoru

4.3

Analýza vzorků

- stejným způsobem jako kalibrační roztoky proměřte vaše vzorky azobarviv a zaznamenejte příslušné tR , výšky a plochy píků; měření opakujte min. 3 krát - dosazením do regresních rovnic či odečtem z kalibračních závislostí pro plochu a pro výšku určete koncentraci azobarviv ve vašem vzorku v jednotkách mol/l


3


- pro obě barviva srovnejte na α = 0,05 zda jsou výsledky získané z kalibračních závislostí pro plochu a pro výšku statisticky rozdílné - dejte pozor, zda vaše naměřené koncentrace vzorků neleží pod mezemi detekce či stanovitelnosti - pokud ano, vyvoďte z toho patřičné závěry a důsledky K protokolu se odevzdává 6 grafů: 2 x kalibrace, 2 x linearita, 2 x lin. dynamický rozsah (každý graf se dvěma barvivy).

Poděkování Tato úloha je prováděna na přístrojovém vybavení získaném díky Fondu rozvoje vysokých škol v rámci projektu FRVŠ 275/2006.


4


VÝSLEDKOVÉ LISTY – HPLC – Stanovení azobarviv ve směsi metodou RP-HPLC se spektrofotometrickou detekcí Příjmení, jméno:

Úloha vypracována dne:

Turnus číslo:

Datum odevzdání protokolu:

Studijní obor:

V pořádku dne:

Přepracovat a doplnit (+ datum): Výsledky: formát ( výsledek ± L1,2 ) . společný exponent mol/l (RSD %) Vzorek obsahuje: z výšky píku MO ( ........................ ± ......................... ) ............... mol/l ( ............ % ) …………………… DMŽ ( ........................ ± ......................... ) ............... mol/l ( ............ % ) ………………….... z plochy píku MO ( ........................ ± ......................... ) ............... mol/l ( ............ % ) …………………… DMŽ ( ........................ ± ......................... ) ............... mol/l ( ............ % ) …………………… Statistická shoda výsledků počítaných z výšky a z plochy : methyloranž - ANO / NE, dimethylová žluť - ANO/NE (zakroužkujte)

Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list

1


VÝSLEDKOVÝLIST – HPLC

Příjmení, jméno:

Experimentální podmínky Typ přístroje:

HPLC Pumpa: ................................................................. HPLC Detektor: .......................................................................................

HPLC kolona: název........................................................., délka: .............. cm, průměr: ............... mm, velikost částic nosiče sf: ........... μm, výrobce: ........................................... Průtoková rychlost mf: ............ ml/min

Citlivost detektoru: .............................................

Vlnová délka: ................... nm

Objem dávkovací smyčky: .......... μl


2




Tabulka 1: Data kalibrační závislosti pro azobarviva Koncentrace Měření (mol/l)

MO Retenční čas (min)

Plocha píku (a.u.)

DMŽ Výška píku (mV)

Retenční čas (min)

Plocha píku (a.u.)

Výška píku (mV)

1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 Blank

1

-

-

2

-

-

3

-


3




Tabulka 2: Směrodatné odchylky dat kalibrační závilsosti pro MO

Koncentrace (mol/l)

Blank

Směrodatná odchylka Retenční čas (min)

-

Plocha píku (a.u.)

Výška píku (mV)

Relativní směrodatná odchylka (%) Retenční čas

Plocha píku

Výška píku

-


4


VÝSLEDKOVÝ LIST – HPLC


Tabulka 3: Směrodatné odchylky dat kalibrační závilsosti pro DMŽ

Koncentrace (mol/l)

Blank

Směrodatná odchylka Retenční čas (min)

-

Plocha píku (a.u.)

Výška píku (mV)

Relativní směrodatná odchylka (%) Retenční čas

Plocha píku

Výška píku

-


5




Tabulka 4: Kalibrační rovnice pro azobarviva - plochy píků

Barvivo

MO

DMŽ

Směrnice (l/mol) SD Směrnice (l/mol) Úsek na ose y (a.u.) Kalibrační rovnice SD úseku (a.u.) Chyba střední hodnoty kalibrační přímky, Sy,x Korelační koeficient, R Koeficient linearity detektoru, l Detekce (LOD) Mez (mol/l) Stanovitelnosti (LOQ) SD ... směrodatná odhylka; měřené veličiny a jejich SD musejí být uváděny se stejnou přesností; R a l uvádějte na 4 desetinná místa


6




Tabulka 5: Kalibrační rovnice pro azobarviva - výšky píků

Barvivo

MO

DMŽ

Směrnice (mV.l/mol) SD Směrnice (mV.l/mol) Úsek na ose y (mV) Kalibrační rovnice SD úseku (mV) Chyba střední hodnoty kalibrační přímky, Sy,x Korelační koeficient, R Koeficient linearity detektoru, l Detekce (LOD) Mez (mol/l) Stanovitelnosti (LOQ) SD ... směrodatná odhylka; měřené veličiny a jejich SD musejí být uváděny se stejnou přesností; R a l uvádějte na 4 desetinná místa


7




Tabulka 6: Experimentální data naměřená pro vzorek

Vzorek Barvivo

Měření Retenční čas (min)

Plocha píku (a.u.)

Výška píku (mV)

1 MO

2 3 1

DMŽ

2 3


8




Tabulka 7: Statistické hodnocení experimentálních dat naměřených pro vzorek z ploch píků

Barvivo

MO

DMŽ

Aritmetický průměr (a.u.)

Plocha píku

Medián (a.u.) SD (a.u.) RSD (%) L1 L2

Koncentrace

Aritmetický průměr (mol/l) SD (mol/l) RSD (%) L1 L2 L1 a L2 jsou dolní a horní hranice intervalu spolehlivosti příslušné veličiny Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list

9




Tabulka 8: Statistické hodnocení experimentálních dat naměřených pro vzorek z výšek píků

Barvivo

MO

DMŽ

Aritmetický průměr (mV)

Výška píku

Medián (mV) SD (mV) RSD (%) L1 L2

Koncentrace

Aritmetický průměr (mol/l) SD (mol/l) RSD (%) L1 L2 L1 a L2 jsou dolní a horní hranice intervalu spolehlivosti příslušné veličiny Pokročilé praktikum - HPLC -Výsledkový list

10

STANOVENÍ AZOBARVIV VE SMĚSI METODOU RP-HPLC SE SPEKTROFOTOMETRICKOU DETEKCÍ

Recommend Documents