Metody vyhledávání biologicky aktivních látek

Metody vyhledávání biologicky aktivních látek Ing. Jiří Kopecký, CSc. Mikrobiologický ústav AVČR, Třeboň, Ústav fyzikální biologie Jihočeské univerzity [email protected]

Využívání různých chemických látek pro léčebné účely sahá k samotným počátkům lidské civilizace. Způsob získávání i vlastní použití léčivých látek prodělal ohromný vývoj. Ve svých prvopočátcích byly léčivé látky získávány výhradně z přírodních zdrojů metodou pokus-omyl. V současné době je příprava léčiv záležitostí především organické syntézy prováděné v rámci farmaceutického průmyslu. Vznikl tak nový obor - medicinální chemie integrující organickou chemii, biochemii a farmakologii s hlavním cílem vyhledávání novách biologicky aktivních látek. Metody využívané při vyhledávání nových biologicky aktivních látek představují první krok v celkovém procesu vývoje léčiv, tzv. farmakologický screening a lze je shrnout do následujících bodů: 1. Metoda strukturních variací spočívá v modifikaci chemické struktury látky o známém biologickém účinku. Je založena na představě, že za biologickou aktivitu odpovídá pouze určitá část molekuly, tzv. farmakofor. Prakticky se postupuje tak, že se strukturní vzorec látky rozdělí na jednotlivé fragmenty, které se pak systematicky obměňují s cílem zjistit který z fragmentů je: (i) nepostradatelný pro zachování biologické aktivity. (ii) zaměnitelný bez ztráty účinnosti nebo (iii) postradatelný. Jednou z pracovních hypotéz využívaných v této metodě je princip isosterie. Tento princip je založen na předpokladu, že v případě nahrazení určitého atomu nebo skupiny jiným má odvozená sloučenina podobné biologické vlastnosti pokud zůstane zachováno rozložení elektronové hustoty. Praxe však ukázala, že v řadě případů tvar molekuly ovlivňuje její biologickou aktivitu daleko více než rozložení elektronové hustoty, neboť rozhodujícím způsobem ovlivní dostupnost v oblasti receptoru atd.

2. Využití kvantitativních vztahů mezi strukturou a biologickou aktivitou (QSAR). Tato metoda je založena na obecné možnosti kvantitativního vyjádření vztahu mezi chemickou strukturou a její biologickou aktivitou. Tuto závislost je možno popsat obecným vztahem Φ=f(x). Predikce biologické aktivity látek metodami QSAR má ohromný význam pro vývoj nových léčiv, neboť může významně snížit počet testovaných sloučenin ve vyhledávací fázi vývoje nových léčiv. Pro popis parametru chemické struktury (x) se ve farmaceutické praxi používá celá řada charakteristik jako např. rozdělovací koeficient oktanol-voda, polarita, lipofilita, topologické indexy atd. 3. Molekulové modelování. Tato metoda je založena na studiu interakcí studovaných sloučenin (ligandů) s receptory za použití matematického modelování (CADD, 3D-QSAR, in silico atd.). Podstata těchto metod spočívá ve vytvoření prostorového modelu příslušného receptoru a k tomuto modelu se pak generují farmakofory s komplementární strukturou. Základním problémem těchto metod je neznalost prostorového uspořádání cílových receptorů na úrovni atomů a funkčních skupin. 4. Kombinatoriální chemie. Tuto metodu lze stručně definovat jako systematické a opa-kované kovalentní spojování vhodných typů stavebních bloků různých chemických struktur. Tímto způsobem vznikají velmi rozsáhlé soubory chemických struktur tzv. chemické knihovny. Je třeba však mít na paměti, že příprava chemických knihoven skrývá určité problémy. Patrně nejzávažnějším je skutečnost, že žádná z chemických reakcí používaných pro syntézu těchto knihoven látek neprobíhá se stoprocentní konverzí. Důsledkem je přítomnost nečistot jenž mohou poskytovat vedlejší efekty při testování biologických aktivit. Proto velmi důležitým kritériem je dosažení stupně konverze lepší než 98. Tohoto požadavku lze dosáhnout pouze metodou syntézy na pevném nosiči (SPS). 5. Izolace biologicky aktivních látek z přírodních zdrojů. V posledních letech je patrný zvýšený zájem o získávání biologicky aktivních látek z přírodních zdrojů (tradiční léčivé rostliny i mikroorganismy).Všechny výše uvedené tzv. racionální metody jsou velmi užitečné avšak ani ve zlomku nedosahují ohromné variability chemických struktur produkovaných přírodou. Z hlediska chemického představují biologicky aktivní látky izolované z přírodních zdrojů velice pestrou paletu struktur, např. alkaloidy, isoprenoidy, steroidy, glykosidy, peptidy, eikosanoidy, polysacharidy a mnohé další. Stejně pestrý je i výčet jejich biologických účinků. V tomto smyslu je pak možno přistupovat k jejich vyhledávání (screening):

a) chemický screening. Založen na vyhledávání již známých chemických struktur se známou biologickou aktivitou. b) biologický screening rozlišuje dva základní typy testů: In vivo: odrážejí celkovou bioaktivitu včetně biotransformací In vitro: jsou založeny na interakci s tzv. rozpoznávacím elementem (RE) „ Imunologické testy RE je protilátka produkovaná živočišnými buňkami jako imunologická obrana organismu na danou látku. „ Funkcionální testy RE je farmakologický receptor Receptorové testy jsou založeny na kompetici vazby ligandu na receptor (aktivní místo) v rovnovážném stavu. Enzymatické testy jsou založeny na inhibici tvorby produktu určité enzymatické reakce. Buněčné testy jsou založeny na celkové biologické odezvě buněk na určitou látku a mohou zahrnovat jak vazbu na receptory, tak i inhibici enzymů. Testování nových léčiv

1

Struktura buněčné membrány

Testování nových sloučenin představujících potencionální léčiva probíhá v několika úrovních. Každá z těchto úrovní reprezentuje určitá kriteria hodnocení a představuje jakési síto při výběru optimálních kandidátů pro určité terapeutické využití (therapeutic target). Úvodní farmakologický screening (body 1-5) slouží ke zjištění míry selektivity účinku látky vůči různým enzymům, afinity k různým receptorům či vazbu na různé buněčné struktury. Takto získaná znalost o farmakologickém účinku nových látek na molekulární úrovni se dále

studuje na enzymových systémech metabolizujících xenobiotika (jaterní multienzymový systém cytochrom P-450). Látky které postoupí do další fáze se testují na buněčné úrovni. K těmto testům slouží tkáňové kultury (tzv. buněčné linie) nebo přímo izolované tkáně. Těmito testy lze zjistit receptorovou aktivitu (agonismus či antagonismus) a především postihují i transport látky přes buněčnou membránu (ADMET), Obr. 1. Další úroveň testů představují testy na systémové úrovni. Tyto testy se provádějí in vivo na pokusných zvířatech a slouží především ke zjištění účinků na krevní tlak, respiraci, gastrointestinální trakt na centrální nervový systém apod. Látky, které úspěšně projdou všemi výše uvedenými testy jsou v následující fázi podrobeny tzv. preklinickým testům. Hlavním smyslem této fáze vývoje léčiv je odhalit míru možných rizik při aplikaci testované látky. Výsledkem preklinických zkoušek jsou údaje o toxicitě, mutagenitě, kancerogenitě, teratogenitě a celkovém mechanismu působení látky na organismus. Poslední fází celého procesu jsou tzv. klinické zkoušky prováděné ve čtyřech stupních: I.

„ Na malém počtu zdravých dobrovolníků se sleduje účinek látky ve vztahu k podané dávce.

II.

„ Na malém počtu pacientů trpících chorobou, k jejímuž léčení je látky vyvíjena.

III.

„ Pracuje se s velkým souborem pacientů za podmínek běžné klinické praxe.

IV.

„ Bezpečnost již schváleného léčiva se sleduje při širokém klinickém použití.

Závěrem je nutno podotknout, že celý proces vývoje nového léčiva trvá 10 – 15 let a finanční náklady se v dnešní době odhadují na minimálně 500 tisíc dolarů. Autotrofní mikroorganismy jako zdroj biologicky aktivních látek. Autotrofní mikroorganismy - řasy a sinice - stejně jako vyšší rostliny, produkují vedle základních konstituentů jejich buněk i celou řadu látek, které se souhrnně nazývají sekundární metabolity. Tyto látky jsou většinou syntetizovány za stresových podmínek či z důvodů reprodukčních a komunikačních. Řasy a sinice jakožto převážně vodní mikroorganismy mají vyvinuté biochemické a fyziologické mechanismy značně odlišné od vyšších rostlin, neboť i jejich přirozené životní prostředí je značně odlišné. Syntetizované látky jsou tedy také velmi různorodé jak z hlediska jejich chemické struktury, tak i fyziologické funkce. Souhrnně se tyto vlastnosti označují jako bioaktivita. Tento pojem je velmi široký a zjednodušeně jej můžeme charakterizovat jako látky, které i v nízkých koncentracích mohou ovlivňovat životní pochody a to jak pozitivně tak i negativně.

Ohromná variabilita řas a sinic (v přírodě je známo více než 30.000 druhů) představuje téměř nevyčerpatelný zdroj přírodních látek. Na rozdíl od vyšších rostlin, které byly po stránce obsahových látek velmi dobře prozkoumány, jsou řasy a sinice jako zdroj biologicky aktivních látek dosud jen velmi málo prostudovány. Sinice jsou v tomto směru prostudovány poněkud lépe než řasy. Zdroj přírodních látek se postupně přesouval od vyšších rostlin přes houby k mikroorganismům, kde především streptomycety jsou jedním z nejdůležitějších a nejlépe prozkoumaných zdrojů biologicky aktivních látek. Hlavní problém při vyhledávání nových biologicky aktivních látek je “znovuobjevování“ (dereplikace) již dříve objevených chemických struktur. Jedním ze způsobů jak překonat tento problém je výběr specifických screeningových testů, které mají přímou vazbu k určitému terapeutickému využití. Další přístup je volba nových, ještě ne zcela detailně prozkoumaných skupin mikroorganismů. AMO bezesporu představují takovýto perspektivní zdroj biologicky aktivních látek. TAB. I. Biologicky aktivní látky obsažené v sinicích (J.Appl. Phycol., 12, 2000: 345).

Organismus

Látka

Efekt

Anabaena circinalis

circinamide

papain inhibitor

Anabaena cylindrica

dehydroradiosumin

trypsin inhibitor

Dichotrix baueriana

β-carbinole

antiviral

Fischerella muscicola

fischerellin A

fungicide

Lyngbya lagerheimii

sulfolipids

antiviral

Microcistis aeruginosa

lipids

algicide

Microcistis viridis

micropeptin

chymotrypsin inhibitor

Nostoc ellipsosporum

cyanovirin

antiviral

Nostoc muscorum

phenolic compounds

fungicide

Oscillatoria agardhii

oscillapeptin

tyrosin inhibitor

Oscillatoria limmetica

glycolipids

antiviral

Oscillatoria raoi

sulfolipids

antiviral

Oscillatoria trichoides

glycolipids

antiviral

Phormidium tenue

sulfolipids

antiviral

Scytonema ocellatum

phytoalexin

fungicide

Spirulina platensis

spirulan

antiviral

Symploca hydnoides

symplostatin

Cytostatik

Příklady biologicky aktivních látek produkovaných řasami a sinicemi: Vědeckovýzkumná činnost biotechnologické laboratoře MBÚ v Třeboni je zaměřena na hledání nových biologicky aktivních látek syntetizovaných autotrofními mikroorganismy – řasami a sinicemi. Studují se látky s allelopathickou aktivitou, inhibiční aktivitou vůči různým enzymům, cytotoxickou a antimutagenní aktivitou a látky které ovlivňují reaktivní formy kyslíku a chrání tak organismus před účinky reaktivních metabolitů xenobiotik. Pozornost je zaměřena především na nízkomolekulární látky typu peptidů, polyfenolů a alkaloidů produkovanými různými kmeny řas a sinic. Vhodnými metodami a postupy se izolují přírodní látky ze sterilně nakultivovaných kmenů, k určení jejich chemické struktury se používají nejmodernější spektrální metody. Takto izolované a identifikované nové sloučeniny jsou v další fázi výzkumu předmětem farmakologického hodnocení. Allelopathická aktivita To, že řasy a sinice produkují za určitých podmínek biologicky aktivní látky jejichž aktivita je namířena proti ostatním řasám nebo sinicím, je známo již velmi dlouho. Tento jev se souhrnně označuje jako allelopathie a obecně zahrnuje chemické interakce mezi rostlinami (od bakterií přes řasy a sinice až po vyšší rostliny). Vzhledem k tomu, že se jedná o fotosyntetizující organismy, je většina allelochemikálií směrována právě na ovlivnění fotosyntetického aparátu, např. inhibice elektronového transportu fotosystému II. Avšak existuje celá řada algicidních látek jejichž biologická aktivita je namířena na jiné biochemické procesy metabolismu, proteosyntézu nevyjímaje. Studium allelopathie mezi autotrofními mikroorganismy nemá význam pouze v oblasti ekofyziologie (kompetice mezi různými druhy řas a sinic), ale tyto látky díky své vysoké biologické účinnosti mohou být využity ve farmacii nebo kosmetice. Inhibitory proteáz Existuje naprosto jednoznačná korelace mezi některými nemocemi a proteolytickými enzymy. V první řadě mnoho patogenních mikroorganismů využívá celou řadu proteás jako primární atak buněčné stěny při invazi do buněk. Dále mnoho hormonů a mediátorů je aktivováno právě proteázami z jejich neaktivních prekursorů. Proteázy se také velmi významně uplatňují při rozvoji zhoubných nádorů zapříčiněných viry, neboť viry produkují

velké množství aktivátorů plasminogenů, které napadají a transformují buňky. Proteázy také přispívají k poškození tkání při zánětlivých onemocněních či dokonce mohou být samotnou příčinou zánětů. Nadměrná aktivita proteáz způsobuje řadu vážných onemocnění jako např. plicní emphysema, encephalomyelitis nebo svalová dystrofie. Toto je pouze několik typických příkladů významu proteáz ve spojitosti s metabolickými poruchami, které jasně demonstrují oprávněnost volby této skupiny enzymů jako relevantní terapeutický cíl. Inhibitory glukosidáz Glukosidázy reprezentují skupinu enzymů účastnících se v procesu trávení sacharidů. Jejich metabolická disfunkce je příčinou celé řady závažných onemocnění jako např. diabetes (cukrovka), virová onemocnění a tvorba některých typů karcinomu. Z těchto důvodů mohou být inhibitory glukosidáz velmi užitečné při studiu mechanismu vzniku těchto onemocnění, ale především pak jako efektivní terapeutika. Příkladem mohou být inhibitory α-glukosidázy, využívané k terapii diabetu. Tento enzym reguluje absorpci glukosy stěnou trávícího traktu a tímto způsobem může významně ovlivnit hladinu krevní glukosy. Z tohoto hlediska zde existuje jasný zájem o vyhledávání stále nových látek s inhibiční aktivitou vůči α-glukosidáze. Inhibitory acetylcholiesterázy Existuje úzká souvislost mezi velmi závažnou Alzheimerovou chorobou a aktivitou acetylcholinesterázy. Alzheimerova choroba je v současnosti dosud nevyléčitelný neuropatologický stav, u kterého nastává progresivní poškození kognitivních funkcí, obvykle provázené poruchami chování. Základním patologickým obrazem je degenerativní proces charakterrizovaný ztrátou buněk v určité oblasti mozku. Bylo zjištěno, že mozek pacientů trpících Alzheimerovou chorobou obsahuje značně snížený obsah acetylcholinu a ostatních neurotransmitérů. Na základě tohoto zjištění byla navržena hypotéza, že látky omezující aktivitu acetylcholinesterázy je možno potencionálně využít pro efektivní terapii této závažné choroby. Tuto hypotézu podporuje skutečnost, že jeden z nejznámějších selektivních a reversibilních inhibitorů acetycholinesterázy galanthamin již byl úspěšně použit v lékařské praxi. Vedle tohoto nejlépe prozkoumaného inhibitoru acetylcholinesterázy byla již objevena celá řada dalších inhibitorů s podobnými účinky (alkyl pyridinové nebo karbamátové). Největším problémem však stále zůstávají značné vedlejší účinky všech těchto již známých látek

Z těchto důvodů je zájem o vyhledávání nových chemických struktur s inhibiční aktivitou vůči acetylcholinesteráze stále značný a jasně demonstrující oprávněnost volby tohoto enzymu jako relevantní cílovou skupinu. Cytotoxicita Vedle velmi dobře známých sinicových toxinů je popsána rozsáhlá skupina látek, které nezpůsobují po kontaktu s živočichy a člověkem objektivní zdravotní potíže či dokonce úmrtí. Jedná se o skupinu tzv. cytotoxinů. Obecně platí, že tato skupina obsahových látek řas a především sinic je velmi heterogenní po chemické i toxikologické stránce. Bylo nalezeno několik sloučenin se silnou cytostatickou aktivitou a schopností selektivně inhibovat růst nádorů. Nejvíce nadějnými je třída cytotoxických depsipeptidů (peptidů s esterovou vazbou). Jedná se například o cryptophyciny A-F izolované z sinice rodu Nostoc a nízkomolekulární hydrofilní peptidy (cyanopeptidy, cyanopeptoliny, micropeptiny, microgininy a aeruginosiny) izolované z rodů Microcystis, Anabaena, Planktothrix a Nostoc. Jiné důležité sloučeniny byly izolovány z rodů Scytonema a Tolypothrix. Z hlediska chemické struktury patří tyto látky mezi scytophyciny, tanazoly a mirabimidy. Nejdůležitější scytophyciny jsou skupina 22 makrolidových

sloučenin,

které

vykazují

silný

cytotoxický

efekt

díky

depolarizaci

mikrofilament. Mezi látky s výraznou protinádorovou a antivirovou aktivitou patří indol[2,3]-karbamazol izolovaný z sinic rodu Nostoc a Tylopothrix. Calothrixiny A a B nalezené v rodu Calothrix jsou účinnými inhibitory růstu lidských nádorově pozměněných buněk (buněčných linií). Jedná o soubor buněk, u kterých je indukována tumorová aktivita. Jsou-li tyto buňky udržovány v optimálních podmínkách, simulují patologický stav lidského organismu. Využití tedy spočívá v testování extrakty, získanými z řas a sinic.

inhibice růstu nádorově zvrhnutých buněk