A N A L I S I S S T R U K T U R - F U N G S I G E N M U T A N sa14 SENSITIF TEMPERATUR YANG DIPEROLE'H D E N G A N C A R A IN VITRO MUTAGENESIS P A D A Saccharomyces cerevisiae
ABSTRAK
Salah satu komponen terminasi translasi di ragi Saccharomyces cerevisiae adalah protein ;RF1 yang dikode oleh gen sal4. Sampai saat ini, mekanisme molekular fungsi protein eRF 1 belum banyak diketahui. Salah satu cara untuk mempelajari struktur-fungsi protein eRF1 dilakukan dengan meneliti mutan sal4 sensitif temperatur yang diperoleh melalui in vitro mutagenesis dengan metode PCR fidelitas rendah. Berdasarkan beberapa mutan yang diperoleh, tiga mutan menunjukkan fenotipik sensitif temperatur, walaupun terlihat adanya variasi tingkat sensitivitas temperatur dari ketiganya. Penentuan tingkat allosupresi ketiga mutan menunjukkan adanya peningkatan efisiensi ketiga mutan dibandingkan dengan wild typenya. Dan ketiga mutan, mutan saI4-92 menunjukkan tingkat allosupresi tertinggi, diikuti oleh mutan sal4-42, sedangkan mutan sal4-182 menunjukkan tingkat allosupresi yang tidak jauh berbeda dibandingkan dengan wild typenya. Peningkatan efisiensi allosupresi mutan sal4 bergantung pada tingkat kerusakan gennya, semakin parah mutasi yang terjadi, peningkatan tingkat allosupresinya akan semakin tinggi. Hasil penentuan urutan nukleotida menunjukkan adanya mutasi titik pada 2 mutan sal4 yang menyebabkan terjadinya perubahan asam amino, yaitu untuk mutan sa14-42 terjadi perubahan asam amino G1n41->His41, I1e42->Phe42, dan mutasi silent pada posisi asam amino 337. Pada mutan sal4-92 terjadi perubahan asam amino G1u131-4Lys131 dan Leu284—>stop (UAG). Analisis struktur sekunder berdasarkan Chou-Fasman, menyarankan bahwa mutan sal4-42 tidak mengalami perubahan struktur sekunder, demikian juga hasil prediksi hidrofatisitas tidak menunjukkan perbedaan yang berarti dibandingkan dengan wild typenya. Hasil analisis struktur sekunder mutan sal4-92 menunjukkan adanya perubahan stuktur dan a-helix menjadi /3-sheet pada posisi mutasi asam amino 131, sedangkan prediksi hidrofatisitas menunjukkan adanya sedikit perubahan pada posisi asam amino yang lama yaitu menjadi lebih terbuka ke permukaan dibanding struktur awalnya.
ABSTRACT
One of translation termination factors is eRF1 coded by SAL4 gene. The molecular mechanism of eRFI function has not been known yet. Attempt to study structure-function of the protein is investigated using temperature sensitive mutants of sal4 gene. The sal4 mutants were generated by in vitro mutagenesis employing low-PCR fidelity method. These sal4 temperature sensitive mutants have been isolated and further characterized. The mutants showed a variation level of sensitivity. Further characterization of allosuppression level showed that all mutants exhibited an allosuppressor phenotype. The sa14-92 mutant showed the highest allosuppressor phenotype, followed by so/4-42 and sa14-182, respectively. Allosuppression level variation may be caused by different mutation exhibited on the gene. Nucleotide sequence of sal4-182 showed no change in coding sequence of sa/4 clone. The sa14-42 mutant has nucleotide substitution from CAA41 (Gln) to CATd1 (His), ATT42 (Ile) to TTT42 (Phe) , and silent mutation of GAG337 (Glu) to GAA337 (Glu). The mutation on so/4-92 causes nucleotide substitution from GAA13' (Glu) to AAA131 (Lys) and TTG284 (Leu) to TAG284 (stop). Secondary structure analysis of the protein according to Chou-Fasman prediction suggested that the sal4-42 did not show any secondary structure change compared to its wild type. The hydrophaticity analysis also showed similar pattern to its wild type. However, the secondary structure analysis of sa14-92 showed some change from a-helix to 0-sheet. Hydrophaticity analysis indicated that the secondary structure was more open toward its surface compared to the original structure.
