ANALISIS KARAKTER PSEUDOMONAS SP. SEBAGAI AGEN PEMACU PERTUMBUHAN TANAMAN DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN RIKA INDRI ASTUTI G

ANALISIS KARAKTER PSEUDOMONAS SP. SEBAGAI AGEN PEMACU PERTUMBUHAN TANAMAN DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN

RIKA INDRI ASTUTI G351060471

SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

PERNYATAAN MENGENAI TESIS DAN SUMBER INFORMASI Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis Analisis Karakter Pseudomonas sp. Sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen adalah karya saya sendiri dan belum diajukan dalam bentuk apapun kepada perguruan tinggi manapun. Sumber informasi yang berasal atau dikutip dari karya yang diterbitkan maupun tidak diterbitkan dari penulis lain telah disebutkan dalam teks dan dicantumkan dalam Daftar Pustaka di bagian akhir tesis ini. Bogor, Mei 2008

Rika Indri Astuti NRP G351060471

ABSTRAK RIKA INDRI ASTUTI. Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan GIYANTO. Beberapa galur bakteri rhizosfer dari kelompok Pseudomonas sp. telah cukup banyak diteliti belakangan ini. Hal ini terutama disebabkan kemampuan kelompok bakteri tersebut dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman. Oleh karena itu, dalam penelitian ini diisolasi bakteri Pseudomonas sp. dari rhizosfer tanaman kedelai yang berasal dari Plumbon, Cirebon. Sebanyak 50 isolat Pseudomonas sp. berhasil diisolasi dengan menggunakan media semi selektif King’s B. 48 isolat mampu memproduksi asam indol asetat pada medium King’s B yang ditambah triptofan 0.5 mM. Sebanyak 9 isolat diantaranya secara signifikan dapat meningkatkan panjang akar primer, panjang batang dan/atau jumlah akar lateral dari kecambah kedelai. 33 isolat diketahui dapat memproduksi siderofor secara kualitatif pada medium CAS dan 13 isolat diketahui dapat memproduksi enzim kitinase. Untuk mengetahui aktivitas biokontrol dari isolat Pseudomonas sp., maka dilakukan uji penghambatan pertumbuhan fungi patogen tanaman yakni Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani dan Fusarium oxysporum. Sebanyak 10 isolat berhasil menghambat F. oxysporum, 9 isolat dapat menghambat S. rolfsii dan 27 isolat menghambat R. solani. Berdasarkan karakter pemacuan pertumbuhan dan biokontrol kemudian terpilih empat isolat potensial yakni Crb-3, 16, 17 dan 44. Selain itu, ke-empat isolat potensial ini memperlihatkan hasil negatif pada uji hipersensitivitas yang mengindikasikan karakter non-patogenik. Berdasarkan analisis gen 16S-rRNA, Crb-3 memiliki homologi terbesar dengan P. monteilii, Crb-16 memiliki homologi terbesar dengan Pseudomonas sp. M41, Crb-17 dan Crb 44 berturut-turut memiliki homologi yang besar dengan P. plecoglossicida dan P. beteli. Deteksi gen yang terlibat dalam biosintesis senyawa antibiosis 2,4- diacetyl phloroglucinol dilakukan dengan teknik PCR dan hanya isolat Crb-16 yang terbukti positif memiliki gen penyandi DAPG dibuktikan dengan kemunculan amplikon sebesar ~745 pb. Kata kunci : Pseudomonas sp., asam indol asetat, siderofor, kitinase, DAPG

ABSTRACT RIKA INDRI ASTUTI. Character Analysis of Pseudomonas sp. as Plant Growth Promoting Agent and Biocontrol for Plant Pathogenic Fungi. Supervised by ARIS TRI WAHYUDI dan GIYANTO. Certain strains of rhizosphere colonizing Pseudomonas sp. have gained attention in recent years due to their abilities in promoting plant growth. Therefore, in this study, we isolated Pseudomonas sp. from the rhizosphere of soybean plant from Plumbon, Cirebon field area. 50 isolates were isolated by using the se semi selective King’s B medium. 48 isolates were able to produce indole acetic acid on the King’s B medium supplemented with 0.5 mM tryptophan. Nine isolates among them significantly induced elongation of primary root, shoot growth and/or number of lateral root. Furthermore, 33 isolates showed siderophore producing activity in CAS medium and 13 isolates were observed to be chitinase positive. Screening for inhibiting fungal growth of Sclerotium rolfsii, Rhizctonia solani and Fusarium oxysporum also were conducted in order to find potential biocontrol agent. Ten isolates were able to inhibit the growth of F. oxysporum, 9 isolates capable to inhibit S. rolfsii, and 27 isolates revealed inhibition activity against R. solani. Based on those plant growth promoting characters, we further selected some potential strains for molecular analysis. Crb 3, 16, 17 and 44 were chosen, due to remarkable plant growth promoting parameters instead of having negative hypersensitivity test. 16S-rRNA analysis confirmed the species taxa of those potential as Pseudomonas group. Crb-3 showed the highest similarity to P. monteilii, Crb-16 exhibited the highest similarity to Pseudomonas sp. M41. Crb-17 and Crb-44 showed the highest similarity to P.plecoglossicida and P. beteli. Detection of antifungal compound that may be indigenously possessed by those isolates were conducted by used PCR technique with specific primers of 2,4- diacetyl phloroglucinol (DAPG). Crb-16 was detected of having DAPG gene identified by the appearance of specific band at 745 bp. Key Words: Pseudomonas sp., Indole Acetic Acid, siderophore, chitinase, DAPG

RINGKASAN RIKA INDRI ASTUTI. Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen. Dibimbing oleh ARIS TRI WAHYUDI dan GIYANTO. Mikroorganisme yang berada di tanah atau rizosfer tanaman telah diketahui memegang peranan penting dalam berbagai proses di dalam tanah yang secara tidak langsung akan mempengaruhi pertumbuhan tanaman. Kelompok bakteri rhizosfer ini ada yang memiliki kemampuan untuk memacu pertumbuhan tanaman dan dikenal sebagai kelompok bakteri rhizosfer pemacu pertumbuhan tanaman atau Plant Growth Promoting Rhizobacteria (PGPR). Salah satu bakteri PGPR yang telah banyak diteliti ialah dari kelompok Pseudomonas. Pseudomonas sp. telah diketahui dapat menghasilkan fitohormon, meningkatkan ketersediaan nutrisi bagi tanaman, berperan sebagai agen bioremediasi serta memiliki kemampuan dalam mengendalikan mikroorganisme patogen tanaman. Melihat betapa potensialnya bakteri Pseudomonas sp., khususnya dalam interaksinya dengan tanaman, maka dalam penelitian ini dilakukan isolasi bakteri Pseudomonas sp. dari rizosfer tanaman kedelai untuk kemudian dikarakterisasi kemampuan masing-masing isolat sebagai agen pemacu pertumbuhan tanaman dan agen biokontrol. Dari penelitian ini diharapkan tersedia data isolat Pseudomonas sp. potensial yang dapat digunakan sebagai inokulan untuk mengatasi berbagai masalah pertanian seperti meminimalisasi penggunakan pupuk sintetik dan fungisida sintetik. Sebanyak 50 isolat Pseudomonas sp. berhasil diisolasi dengan menggunakan media semi selektif King’s B dari rhizosfer tanaman kedelai asal Plumbon, Cirebon. Sebanyak 48 isolat diantaranya mampu menghasilkan fitohormon indole acetic acid (IAA) pada media King’s B yang ditambahkan triptofan 0.5 mM. Isolat Crb-16 menghasilkan IAA pada tertinggi yakni 16,02 ppm, sedangkan isolat Crb-7 dan 38 tidak mampu menghasilkan IAA. Sembilan isolat terbukti dapat meningkatkan parameter pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai. Isolat Crb-44 merupakan isolat yang secara signifikan dapat meningkatkan semua parameter pertumbuhan kecambah yakni panjang akar primer, panjang batang dan jumlah akara lateral. Sedangkan beberapa isolat yang lain dapat meningkatkan satu atau dua parameter pertumbuhan kecambah kedelai seperti isolat Crb- 8, 7, 3, 16, dan 1 yang secara signifikan mampu meningkatkan panjang batang dibandingkan dengan kontrol. Crb-35 secara signifikan dapat meningkatkan jumlah akar lateral. Peningkatan panjang batang sekaligus panjang akar primer ditunjukkan oleh aktivitas isolat Crb-15. Sedangkan, isolat Crb-17 memperlihatkan kemampuan yang baik dalam meningkatkan panjang akar primer dan jumlah akar lateral. Hasil uji pemacuan pertumbuhan kecambah ini mengindikasikan bahwa IAA yang dihasilkan oleh bakteri eksogenus (Pseudomonas sp.) dapat menunjang pembentukan sistem perakaran dari kecambah. Analisis karakter Pseudomonas sp. sebagai agen biokontrol dilakukan dengan mendeteksi kemampuan isolat-isolat tersebut dalam menghasilkan siderofor, kitinase serta aktivitas antagonis terhadap fungi patogen (S. rolfsii, R. solani dan F. oxysporum). Sebanyak 33 isolat terdeteksi mampu menghasilkan

siderofor pada media Chrome Azurol Sulfonate (CAS agar) serta 13 isolat terdeteksi memiliki aktivitas kitinolitik pada media kitin 1%. Dari 50 isolat yang diuji, terdapat 4 isolat Pseudomonas sp. memiliki kemampuan yang rendah (< 10%) dalam menghambat F. oxysporum, masing-masing 2 dan 4 isolat mampu menghambat pertumbuhan F. oxysporum dalam tingkatan sedang (11-20%) dan tinggi (>21%). Sedangkan berdasarkan uji antagonis isolat Pseudomonas sp. terhadap S. rolfsii diketahui sebanyak 9 isolat memiliki kemampuan yang rendah dalam menghambat pertumbuhan fungi ini. Untuk uji antagonis Pseudomonas sp. dengan R. solani diketahui sebanyak 2 isolat menghambat kuat pertumbuhan fungi ini dan 8 isolat Pseudomonas sp. menghambat pertumbuhan fungi ini dalam tingkat penghambatan sedang. Beberapa isolat Pseudomonas sp. yang seperti Crb-1, 2, 5, 24, 26, dan 49, menunjukkan karakter yang menarik yakni mampu menghasilkan siderofor atau enzim kitinase dan tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap ketiga fungi yang diujikan dalam uji oposisi langsung. Hal ini diduga disebabkan adanya aktivitas spesifik dari senyawa siderofor dan kitinase yang dihasilkan Pseudomonas sp. Sedangkan isolat yang lain seperti isolat Crb-21, 33, 34, 36, 37, 38 dan 40 tidak menghasilkan siderofor dan enzim kitinase namun demikian isolat-isolat tersebut menunjukkan aktivitas penghambatan fungi patogen walaupun dalam tingkatan penghambatan sedang dan lemah. Hal ini diduga disebabkan adanya mekanisme penghambatan fungi patogen selain siderofor dan kitinase yang dimiliki oleh ketujuh isolat tersebut seperti diantaranya aktivitas HCN atau antibiosis. Berdasarkan hasil uji isolat Pseudomonas sp. sebagai agen pemacu pertumbuhan dan biokontrol maka dipilih empat isolat potensial yakni Crb-3, 16, 17 dan 44. Selain aktivitas pemacuan pertumbuhan dan aktivitas biokontrol yang baik, ke-empat isolat ini juga tidak menunjukkan gejala hipersensitivitas pada tanaman tembakau yang mengindikasikan bahwa ke-empat isolat ini tidak patogen terhadap tanaman. Hasil analisis sekuen 16S-rRNA dari isolat-isolat potensial memperlihatkan bahwa ke-empat isolat ini termasuk dalam kelompok Pseudomonas. Berdasarkan analisis BLASTN diperoleh hasil bahwa Crb-3 memiliki kemiripan tertinggi dengan P. monteilii sebesar 94%, Crb-16 memiliki kemiripan tertinggi sebesar 94%, dengan Pseudomonas sp. M41, Crb-17 memiliki kemiripan tertinggi sebesar 99% dengan P. plecoglossicida dan Crb-44 memiliki kemiripan tertinggi terbesar 99% dengan P. beteli. Keberadaan gen phlD yang terlibat dalam biosintesis senyawa antibiosis 2,4-diacetyl phloroglucinol (2,4 DAPG) dilakukan dengan teknik PCR menggunakan primer spesifik phl2a dan phl2b. Dari ke-empat isolat potensial yang diuji (Crb-3, 16, 17 dan 44) hanya Crb-16 yang terdeteksi memiliki gen phlD (~745 pb). Kata kunci: Pseudomonas sp., asam indol asetat, siderofor, kitinase, DAPG

© Hak cipta milik Rika Indri Astuti, tahun 2008 Hak cipta dilindungi Dilarang mengutip dan memperbanyak tanpa izin tertulis dari Institut Pertanian Bogor, sebagian atau seluruhnya dalam bentuk apapun, baik cetak, fotokopi, mikrofilm dan sebagainya

ANALISIS KARAKTER PSEUDOMONAS SP. SEBAGAI AGEN PEMACU PERTUMBUHAN TANAMAN DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN

RIKA INDRI ASTUTI

Tesis Sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Magister Sains pada Departemen Biologi

SEKOLAH PASCA SARJANA INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2008

HALAMAN PENGESAHAN Judul Penelitian

Nama NRP Program Studi

: Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen : Rika Indri Astuti : G351060471 : Biologi

Disetujui Komisi Pembimbing

Dr. Ir. Giyanto, M.Si Anggota

Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si Ketua

Diketahui

Ketua Program Studi Biologi

Dekan Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor

Dr. Ir. Dedy Duryadi S, DEA

Prof. Dr. Ir. Khairil Anwar Notodiputro, MS

PRAKATA

Puji syukur penulis panjatkan ke Hadirat Tuhan Yang Maha Esa atas segala limpahan rahmat dan karunia-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan penulisan tesis penelitian ini yang berjudul “Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Biokontrol Fungi Patogen”. Pada kesempatan ini, penulis menghaturkan terimakasih kepada Bapak Dr. Aris Tri Wahyudi, M.Si selaku ketua komisi pembimbing serta kepada Bapak Dr. Ir. Giyanto, M.Si selaku anggota komisi pembimbing yang telah memberi masukan dan saran kepada penulis dalam penulisan tesis penelitian ini. Selain itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada Ibu Dr. Ir. Tri Asmira Damayanti, M. Agr yang berkenan menjadi penguji luar komisi atas saran dan bimbingan yang diberikan guna perbaikan tesis ini. Penulis juga mngucapkan terima kasih kepada Dr. Iman Rusmana, M.Si dan Dr. Nisa Rachmania, M.Si atas bimbingan materil dan imateril yang sangat bermanfaat bagi penulis. Penelitian ini didanai oleh Program Insentif Penelitian Dasar dari Kementrian Negara Riset dan Teknologi (KNRT) melalui Dr. Aris Tri Wahyudi. Untuk itu Kami mengucapkan terima kasih atas kepercayaan dan dukungan dana yang diberikan untuk melakukan penelitian ini. Pada kesempatan ini, penulis juga berterimakasih kepada segenap pegawai Mbak Heny, Pak Jaka, Pak Endang dan Pak Husen serta rekan-rekan sesama peneliti di Laboratorium Mikrobiologi atas kerjasama yang selama ini terjalin dengan baik. Terimakasih penulis sampaikan kepada Bapak, Ibu, Andri, Henry dan seluruh keluarga atas doa dan kasih sayangnya. Semoga tesis ini dapat bermanfaat dan dapat menambah perbendaharaan riset di Indonesia.

Bogor, Mei 2008

Rika Indri Astuti

RIWAYAT HIDUP Penulis dilahiran di Ponorogo pada tanggal 10 Oktober 1983 sebagai anak dari pasangan Sriyanto dan Sujiati. Penulis merupakan anak sulung dari dua bersaudara. Pendidikan sarjana ditempuh di Departemen Biologi, Fakultas Matematikan dan Ilmu Pengetahuan Alam, IPB lulus pada tahun 2006. Pada tahun yang sama penulis mendapatkan kesempatan untuk melanjutkan studi pada Departemen yang sama pada program studi Biologi, sub-program studi Mikrobiologi. Kesempatan studi jenjang master ini diberikan atas kebaikan hati segenap staf Dosen Mikrobiologi terutama Dr. Iman Rusmana; M.Si, Dr. Aris Tri Wahyudi dan Dr. Nisa Rachamnia M. Si. Selama masa studi, penulis pernah menjadi penanggung jawab praktikum Mikrobiologi Dasar program S-1 pada tahun ajaran 2006/2007 dan 2007/2008. Selain itu, penulis juga menjadi asisten praktikum beberapa mata kuliah program Pasca Sarjana diantaranya Mikrobiologi Lanjut (tahun ajaran 2006/2007), Genetika Mikroba (tahun ajaran 2007/2008) dan Matrikulasi Mikrobiologi Dasar (tahun ajaran 2006/2007 dan 2007/2008). Penulis juga berkesempatan untuk mempresentasikan sebagian hasil penelitian ini pada forum internasional yaitu pada International Conference and Workshop on Basic and Applied Sciences 2007 (ICOWOBAS), pada tanggal 6-8 Agustus 2007 yang diselenggarakan oleh Universitas Airlangga. Sebagian hasil penelitian ini juga telah dipublikasikan pada Proceeding II on International Conference and Workshop on Basic and Applied Sciences 2007 (ICOWOBAS) dengan judul Plant Growth Promoting Rhizobacteria Attributes of Pseudomonas sp Isolated from Rhizosphere of Soybean Plant.

DAFTAR ISI Halaman DAFTAR TABEL ........................................................................................ xiii DAFTAR GAMBAR .................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN................................................................................. xv PENDAHULUAN ........................................................................................ Latar Belakang......................................................................................... Tujuan Penelitian ..................................................................................... Manfaat Penelitian ...................................................................................

1 1 3 3

TINJAUAN PUSTAKA Pseudomonas sp....................................................................................... Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman .............. Produksi Fitohormon IAA oleh Pseudomonas sp...................................... Pseudomonas sp. sebagai Agen Biokontrol Fungi Patogen Tanaman........ Siderofor ............................................................................................. Enzim Kitinase.................................................................................... Antibiotik : 2,4 Diacetylphloroglucinol (DAPG) ................................. Analisis Genetika..................................................................................... Gen 16S rDNA....................................................................................

4 4 6 7 8 8 9 11 11

METODE Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai.......................... Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman............................................................................. Penapisan Isolat Pseudomonas sp. Penghasil IAA .............................. Uji Pemacuan Pertumbuhan terhadap Kecambah Kedelai................... Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Biokontrol Fungi Patogen Tanaman.......................................................................... Uji Produksi Siderofor secara Kualitatif ............................................ Uji Produksi Enzim Kitinase ............................................................. Penapisan Isolat Pseudomonas sp. yang Memiliki Kemampuan Antifungi........................................................................................... Analisis Genetika Isolat Pseudomonas sp. Potensial................................ Isolasi DNA Genom ......................................................................... Amplifikasi Gen Penyandi 16S-rDNA.............................................. Deteksi Gen Penyandi Senyawa Antifungi 2,4 DAPG dengan Teknik PCR .....................................................................................

12 12 12 13 14 14 15 15 16 16 17 18

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil ....................................................................................................... 19

Isolasi Pseudomonas sp. dari Rizosfer Tanaman Kedelai..................... 19 Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman........................................................................ Penapisan Isolat Pseudomonas sp. Penghasil IAA ........................ Uji Pemacuan Pertumbuhan terhadap Kecambah Kedelai ............. Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Biokontrol Fungi Patogen Tanaman. ..................................................................... Uji Produksi Siderofor secara Kualitatif........................................ Uji Produksi Enzim Kitinase ........................................................ Penapisan Isolat Pseudomonas sp. yang Memiliki Kemampuan Antifungi...................................................................................... Analisis Genetika Isolat Pseudomonas sp. Potensial........................... Amplifikasi Gen Penyandi 16S-rDNA ......................................... Deteksi Gen Penyandi Senyawa Antifungi 2,4 DAPG dengan Teknik PCR ................................................................................ Pembahasan ............................................................................................

19 19 20 23 23 23 24 26 26 27 29

SIMPULAN.................................................................................................. 35 DAFTAR PUSTAKA ................................................................................... 36 LAMPIRAN ................................................................................................. 41

DAFTAR TABEL Halaman 1

Produksi IAA oleh isolat Pseudomonas sp. ............................................. 20

2

Data panjang akar primer, panjang batang dan jumlah akar lateral pada kecambah kedelai setelah diberi perlakuan isolat Pseudomonas sp. ......... 21

3

Karakter isolat Pseudomonas sp. sebagai agen biokontrol fungi patogen berdasarkan uji produksi siderofor, enzim kitinase dan uji penghambatan fungi patogen .......................................................................................... 25

4

Hasil analisis sekuen gen 16S-rRNA dengan menggunakan program BLASTN ................................................................................................ 27

DAFTAR GAMBAR Halaman 1

Lintasan biosintesis IAA dengan menggunakan prekursor triptofan pada A. brasilense ................................................................... 7

2

Situs pemotongan beberapa enzim yang umumnya terlibat dalam degradasi senyawa kitin......................................................................... 9

3

Stuktur kimia senyawa DAPG............................................................... 10

4

Lintasan biosintesis senyawa DAPG yang melibatkan gen PhlABC dan PhlD............................................................................................... 10

5

Peta genetik dari gen phlH, phlG dan phlF ........................................... 11

6

Skema uji antagonisme antara isolat Pseudomonas dengan fungi patogen pada media PDA ...................................................................... 15

7

Penampilan koloni Pseudomonas Crb-17 pada media King’s B (24 jam) ................................................................................................ 19

8

Salah satu uji pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai oleh isolat Pseudomonas (Crb-44).......................................................................... 22

9

Produksi senyawa siderofor oleh isolat Crb-10 pada medium CAS dan aktivitas kitinolitik Crb-12 dan Crb 13 .................................................. 23

10

Aktivitas penghambatan, A) F. oxysporum oleh isolat Pseudomonas Crb-3, B) R. solani oleh Crb-31 dan C) S. rolfsii oleh Crb-44 ............. 24

11

Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S-rRNA menunjukkan pita DNA berukuran 1300 pb. ............................................................... 26

12

Pohon filogenetika isolat Crb-3, 16, 17 dan 44 dengan beberapa spesies Pseudomonas yang lain berdasarkan sekuen gen 16S-rRNA.................. 28

13

Hasil deteksi gen penyandi senyawa antifungi DAPG dengan PCR ....... 29

DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1

Data urutan nukleutida gen 16S-rRNA dari isolat Crb-3 dan hasil analisis BLASTN dengan data GenBank . .............................................. 42

2

Data urutan nukleutida gen 16S-rRNA dari isolat Crb-16 dan hasil Analisis BLASTN dengan data GenBank .............................................. 43

3

Data urutan nukleutida gen 16S-rRNA dari isolat Crb-17 dan hasil analisis BLASTN dengan data GenBank ............................................... 44

4

Data urutan nukleutida gen 16S-rRNA dari isolat Crb-44 dan hasil analisis BLASTN dengan data GenBank ............................................... 45

PENDAHULUAN Latar Belakang Kemampuan untuk memproduksi senyawa ekstraseluler yang mampu meningkatkan pertumbuhan tanaman merupakan salah satu kemampuan yang dimiliki oleh bakteri dan fungi (Wu et al. 2005). Golongan bakteri pada rhizosfer tanaman dengan kemampuan tersebut digolongkan ke dalam kelompok Bakteri Rhizosfer

Pemacu

Pertumbuhan

Tanaman

(Plant-Growth

Promoting

Rhizobacteria, PGPR). Senyawa ekstraseluler yang dihasilkan bakteri kelompok PGPR ini amat beragam dan dapat bersifat langsung maupun tidak langsung dalam memacu pertumbuhan tanaman (Ahmad et al. 2004). Hingga saat ini telah banyak dilakukan penelitian mengenai enzim, hormon pertumbuhan, maupun senyawaan yang bersifat antibiosis yang dapat menghambat pertumbuhan mikroba patogen tanaman yang dihasilkan oleh bakteri PGPR. Salah satu efektivitas PGPR dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman ialah dengan dihasilkannya senyawa antifungi untuk menanggulangi mikrob patogen tanaman. Penggunaan PGPR sebagai salah satu mekanisme intensifikasi pertanian dalam mengendalikan penyakit tanaman merupakan langkah yang baik dalam rangka mengurangi penggunaan bahan kimia fungisida maupun bakterisida yang dapat mencemari lingkungan dan peningkatan resistensi mikroba patogen (Atlas & Bartha 1998). Beberapa PGPR diketahui dapat menghasilkan senyawa antifungi yang dapat menghambat mikrob patogen. Senyawa antifungi yang diproduksi dapat berupa enzim, antibiosis, siderofor atau senyawa toksin. Salah satu bakteri PGPR yang telah banyak diteliti ialah dari kelompok Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. telah banyak diteliti dan digunakan sebagai agen pemacu pertumbuhan tanaman dan juga agen biokontrol terhadap patogen tanaman. Beberapa isolat Pseudomonas sp. telah diketahui mampu menghasilkan hormon pertumbuhan tanaman seperti hormon indole acetic acid (IAA) (Vasanthakumar & Mc Manus 2004; Dey et al. 2004; Picard & Bosco 2005), siderofor (Dey et al. 2004), mampu melarutkan posfat (Dey et al. 2004) maupun kalium (Wu et al. 2005), memiliki aktivitas enzim ACC deaminase yang dapat meningkatkan pertumbuhan dan panjang akar, serta mampu mendegradasi

senyawa toksik seperti phorate (Bano & Musarrat 2003). Selain itu, Pseudomonas sp. merupakan kelompok bakteri PGPR yang cukup banyak diteliti mengenai kemampuannya dalam menghasilkan senyawa antifungi sehingga Pseudomonas seringkali digunakan sebagai agen pengendali hayati beberapa patogen tanaman. Seperti yang dilaporkan oleh Dey et al. (2004) mengenai kemampuan Pseudomonas dalam menghambat pertumbuhan fungi patogen Aspergillus niger dan A. flavus. Mekanisme biokontrol Pseudomonas terhadap fungi patogen diantaranya disebabkan kemampuan Pseudomonas dalam menghasilkan enzim hidrolitik dan senyawa antibiosis. Enzim hidrolitik yang memiliki kemampuan antifungi yang dapat diproduksi Pseudomonas diantaranya adalah enzim kitinase dan glukanase. Sedangkan untuk senyawa antibiosis, Pseudomonas diketahui mampu memproduksi senyawa antifungi seperti 2,4-diacetylphloroglucinol, (DAPG), pirolnitrin, pyoluteorin, dan phenazin (Compant et al. 2005). Melihat betapa potensialnya bakteri Pseudomonas, khususnya dalam interaksinya dengan tanaman, maka dalam penelitian ini dilakukan isolasi bakteri Pseudomonas sp. dari rhizosfer tanaman kedelai.

Untuk kemudian diseleksi

kemampuannya sebagai agen pemacu pertumbuhan tanaman berdasarkan kemampuannya dalam menghasilkan IAA serta memacu pertumbuhan kecambah kedelai. Selain itu, juga dilakukan penapisan Pseudomonas sp. sebagai agen biokontrol berdasarkan kemampuannya dalam menghasilkan siderofor, enzim kitinase dan kemampuannya dalam menghambat fungi patogen bagi akar tanaman yakni Rhizoctonia solani, Fusarium oxysporum dan Sclerotium rolfsii. Isolat Pseudomonas sp. yang menunjukkan karakter pemacu pertumbuhan tanaman dan biokontrol yang baik kemudian dipilih sebagai isolat potensial. Isolat-isolat potensial tersebut kemudian akan dianalisis 16S-rRNA-nya, hal ini berguna untuk menentukan spesies dari isolat Pseudomonas sp. yang telah diisolasi.Selain itu, juga dilakukan deteksi salah satu gen yang terlibat dalam biosintesis senyawa antibiosis DAPG dengan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Dari penelitian ini diharapkan dapat ditemukan isolat Pseudomonas sp. potensial yang dapat digunakan sebagai inokulan untuk mengatasi berbagai masalah pertanian seperti meminimalisasi penggunakan pupuk sintetik dan fungisida sintetik.

Tujuan Penelitian Penelitian ini bertujuan mengisolasi dan menemukan isolat Pseudomonas sp. yang berpotensi sebagai agen pemacu pertumbuhan tanaman dan agen biokontrol fungi patogen. Selain itu juga untuk mendeteksi gen penyandi DAPG dengan PCR.

Manfaat Penelitian Beberapa manfaat penting yang dapat diambil dari penelitian ini adalah ditemukannya isolat-isolat Pseudomonas sp. potensial yang selain dapat memacu pertumbuhan tanaman juga dapat digunakan sebagai agen pengendali hayati. Selain itu diharapkan melalui penelitian ini diperoleh data mengenai isolate-isolat Pseudomonas sp. yang memiliki salah satu gen penyandi senyawa antibiosis.

TINJAUAN PUSTAKA Pseudomonas sp. Pseudomonas sp. merupakan kelompok bakteri yang memiliki habitat cukup beragam. Pseudomonas sp. dapat ditemui di tanah (Hagedorn et al. 1987), sebagai patogen pada hewan atau manusia dan di tubuh tanaman sebagai bakteri endofitik maupun parasit, di perairan tawar maupun laut (Krueger & Sheikh 1987), bunga dan buah. Pseudomonas sp. memiliki ciri-ciri berupa bakteri gram negatif dengan sel berbentuk batang berukuran 0.5-0.8 µm x 1-3 µm. Pseudomonas sp. memberikan hasil positif pada uji katalase dan oksidase; mengakumulasi β-polihidroksi butirat sebagai sumber karbon; bersifat motil dengan flagela tipe polar; aerobik; kemoorganotrof; dan memiliki kandungan GC tinggi yakni berkisar 58-68 % (Ballows et al. 1992). Berdasarkan kemampuannya dalam berfluoresensi, bakteri Pseudomonas dikelompokkan menjadi bakateri Pseudomonas berfluoresens dan non fluoresens (Balows et al. 1992). Beberapa bakteri patogen pada tanaman seperti P. fluoresens, P putida, P syringae pv. Syringae tergolong ke dalam bakteri Pseudomonas berfluoresens. Hal yang menarik dari bakteri patogen ini ialah kemampuannya dalam menghasilkan hormom IAA yang tinggi (Fett et al. 1987).

Pseudomonas sp. Sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman

Berdasarkan banyak penelitian sebelumnya, Pseudomonas sp. telah diketahui merupakan salah satu anggota kelompok bakteri PGPR atau bakteri rhizosfer pemacu pertumbuhan tanaman (Glickmann et al. 1998; Lindow et al. 1998; Vasanthakumar & Mc Manus 2004; Dey et al. 2004; Picard & Bosco 2005). Menurut Woitke (2004), PGPR merupakan kelompok mikroorganisme yang hidup bebas yang dapat memberikan keuntungan bagi pertumbuhan tanaman dengan cara mengkolonisasi bagian perakarannya atau hidup di daerah rhizosfer. Mikroorganisme yang ada di tanah atau rhizosfer tanaman memegang peranan penting dalam berbagai proses di dalam tanah yang secara tidak langsung akan mempengaruhi pertumbuhan tanaman (Tilak et al. 2005). Beberapa bakteri

rhizosfer selain Pseudomonas yang memiliki kemampuan tersebut diantaranya Rhizobium (Zahran 1999; Matiru & Dakora 2004), Bacillus (Shishido et al. 1996; Bai et al. 2003; Woitke 2004), Azotobacter (Ahmad et al. 1998; Wu et al. 2005), Azospirillum (Somers et al. 2004), dan Kluyvera ascorbata (Burd et al. 1998). Penggunaan bakteri PGPR seperti Pseudomonas sebagai inokulan pupuk alami (biofertilizer) telah dilakukan sejak 60 tahun lalu, dan saat ini telah terbukti bahwa PGPR merupakan inokulan potensial yang ternyata tidak hanya meningkatkan pertumbuhan tanaman (Alvarez et al. 1995), namun pada beberapa galur bakteri potensial ternyata mampu membantu tanaman dalam menghadapi cekaman lingkungan seperti limitasi air dan nutrien serta pencemaran senyawa toksik (Shen 1997). Hingga kini mekanisme pemacuan tumbuh tanaman oleh Pseudomonas sp. belum sepenuhnya diketahui, namun demikian terdapat banyak jalur mengenai bagaimana aktivitas pemacu tumbuh Pseudomonas sp. terhadap pertumbuhan tanaman (Cattelan et al. 1999). Jalur aktivitas tersebut diantaranya dengan memproduksi atau mengubah konsentrasi dari hormon pertumbuhan tanaman seperti IAA, asam giberelat (Bottini et al. 1989), sitokinin dan etilen serta dengan melarutkan posfat, kalium atau nutrien yang lain sehingga tersedia bagi tanaman (Dey et al. 2004) . Peningkatan produktivitas tanaman dengan memanfaatkan PGPR salah satunya Pseudomonas sp. sebagai inokulan pemacu tumbuh merupakan langkah yang efektif. Hal ini berkaitan dengan pengurangan penggunaan pupuk atau bahan kimia yang kurang baik jika diaplikasikan terus menerus pada lahan pertanian. Beberapa keuntungan nyata penggunaan mikrob sebagai pupuk biologis dibandingkan bahan kimia diantaranya: (1) produk mikrob umumnya lebih aman daripada bahan kimia karena bersifat bio-degradable sehingga tidak menimbulkan efek berbahaya jika terakumulasi dalam rantai makanan (2) penggunaan mikrob sebagai inokulan akan mengurangi penggunaan pupuk yang terus menerus akibat adanya replikasi dari mikrob di dalam ekosistemnya (3) Target organisme bagi PGPR dengan aktivitas antifungi akan sangat spesifik sehingga meminimalisasi pengaruhnya terhadap pertumbuhan tanaman (Shen 1997).

Produksi Fitohormon IAA oleh Pseudomonas sp. Hormon indole acetic acid (IAA) merupakan salah satu hormon pertumbuhan tanaman yang sangat penting. Hormon ini diketahui berperan dalam berbagai aspek pertumbuhan tanaman, meliputi pembelahan sel dan pemanjangan, diferensiasi, tropisme, dominansi apikal, senesensi, absisi dan pembungaan (Zhao et al. 2001). Salah satu produser IAA yang cukup besar adalah bakteri rhizosfer (PGPR). Sekitar 80% bakteri rhizosfer diketahui dapat menghasilkan hormon ini (Patten & Glick 1996). Pada bakteri pemacu tumbuh, IAA dihasilkan dari proses biosintesis yang kompleks dan melibatkan banyak enzim. Pada Azospirillum brasilense, terdapat tiga senyawa prekursor dalam biosintesis IAA yakni asam antranilat, indol dan triptofan (Trp). Namun berdasarkan penelitian yang dilakukan oleh Zakharova et al, (1999) diketahui bahwa prekursor yang paling efisien digunakan oleh bakteri ialah Trp. Suplementasi Trp pada media kultur P. syringae pv. Syringae dapat meningkatkan produksi IAA hampir 10 kali lipat dibandingkan tanpa penambahan Trp (Fett et al. 1987). Patten & Glick (2002) juga melaporkan kemampuan P. putida GR12-2 dalam menghasilkan IAA yang cukup besar yakni sebesar 68,3 ± 2,2 µg/ml dengan suplementasi Trp 500 µg/ml. IAA yang diproduksi ternyata dapat meningkatkan pembentukan akar adventif dan meningkatkan pemanjangan akar primer. Lintasan dan enzim-enzim yang diperlukan dalam biosintesis IAA telah dipelajari dengan baik pada tanaman Arabidopsis thaliana (Woodward & Bartel 2005). Terdapat tiga lintasan biosintesis IAA yang diketahui yakni lintasan IPA, IAM dan TAM (Gambar 1). Lintasan asam indol-3-piruvat (IPA) merupakan lintasan umum pada mikroorganisme seperti Enterobacter cloacae dan Azospirillum. Sedangkan, lintasan IAM merupakan lintasan yang digunakan bakteri Agrobacterium tumefaciens dan P. syringae dalam mensintesis IAA (Patten & Glick 1996).

Triptofan

Lintasan IPA

Lintasan TAM Trp-dekarboksilase

Trp-aminotransferase

Trp-monooksigenase

Indole-3-acetaldyoxyme

Indole-3-piruvic acid

Indole-3-acetamide

indol-3-piruvat dekarboksilase

Indole-3-acetonitrile

Indol 3-asetamida hidrolase

Indole-3-acetaldehyde

Indole-3-acetic acid

Gambar 1 Lintasan biosintesis IAA dengan menggunakan prekursor Trp pada A. brasilense (Zakharova et al, 1999).

Pseudomonas sp. sebagai Agen Biokontrol Fungi Patogen Tanaman

Penyakit tanaman yang disebabkan oleh mikrob patogen telah menjadi salah satu kendala terbesar dalam peningkatan produktivitas tanaman (Compant et al. 2005). Pengendalian penyakit tanaman

dengan bahan kimia baik berupa

fungisida, bakterisida maupun pestisida belakangan diketahui membuat beberapa permasalahan lain seperti pencemaran lingkungan dan peningkatan resistensi patogen terhadap bahan kimia yang digunakan. Alternatif potensial dalam mengendalikan penyakit tanaman adalah dengan menggunakan agen pengendali hayati. Beberapa PGPR diketahui dapat menghasilkan senyawa antifungi yang dapat menghambat fungi patogen. Senyawa antifungi yang diproduksi dapat berupa enzim, antibiosis, siderofor atau senyawa toksin. Pseudomonas merupakan kelompok bakteri PGPR yang cukup banyak diteliti mengenai kemampuannya sebagai agen biokontrol atau agen pengendali hayati. Mekanisme Pseudomonas sp. dalam menekan pertumbuhan fungi patogen tanaman diantaranya dengan menghasilkan siderofor, β-1,3 glukanase (Chernin & Chet 2002), kitinase (Selitrennikoff 2001), antibiosis, dan sianida.

Siderofor Siderofor merupakan senyawa bioaktif yang berperan penting dalam pengambilan ion besi (Fe3+) dari lingkungan. Beberapa senyawa siderofor telah cukup banyak dipelajari pada bakteri Pseudomonas sp. beberapa diantaranya seperti pyoverdine (Loper & Buyer 1991), pyochelin (Buysens et al. 1996) dan asam salisilat. Struktur senyawa siderofor yang dihasilkan mikroba sangatlah bervariasi, namun demikian sebagian besar senyawa siderofor ini mengandung molekul hidroksamat dan katekol. Kedua molekul inilah yang terlibat dalam pengikatan ion Fe3+ di lingkungan (Neilands 1995). Selain terlibat dalam mekanisme kompetisi logam, beberapa senyawa siderofor terutama pyoverdine dan asam salisilat telah dilaporkan berperan sebagai senyawa penginduksi sistem resistensi sistemik (ISR) tanaman (Metraux 1990). ISR merupakan salah satu mekanisme biokontrol secara tidak langsung yang dimiliki oleh bakteri rhizosfer pemacu pertumbuhan tanaman dalam menghadapi patogen tanaman (Compant et al. 2005). Kemampuan senyawa siderofor yang dihasilkan oleh Pseudomonas sp. dalam menghambat pertumbuhan patogen tanaman telah banyak dilaporkan. Bahkan molekul siderofor yang dihasilkan juga telah terkarakterisasi dengan baik. Loper & Buyer (1991) melaporkan kemampuan senyawa pyoverdine yang dihasilkan Pseudomonas sp. dalam mengendalikan pertumbuhan fungi patogen Pythium dan Fusarium. Selain itu, Buysens et al. (1996) juga melaporkan adanya aktivitas penghambatan oleh siderofor pyochelin yang dihasilkan Pseudomonas aeruginosa terhadap fungi patogen Pythium.

Enzim Kitinase Enzim kitinase merupakan enzim hidrolitik yang berperan penting dalam aktivitas antifungi. Enzim ini berperan dalam mendegradasi senyawa kitin yang merupakan salah satu komponen penyusun dinding hifa fungi. Kitin merupakan senyawa polimer berbentuk rantai linear yang tersusun atas N-asetilglukosamin yang saling berikatan β-1,4 melalui ikatan hidrogen (Gambar 2). Kitinase dapat memecah senyawa kitin menjadi oligosakarida, diasetilkitobiosa dan N-

asetilglukosamin. Degradasi senyawa kitin akan lebih efisien jika melibatkan aktivitas enzim eksokitinase dan endokitinase (Folders et al. 2001). kitobiosidase

N-asetil-β-

Gambar 2

endokitinase

Situs pemotongan enzim endokitinase yang terletak pada ikatan hidrogen bagian dalam dari senyawa kitin.

Aktivitas penghambatan pertumbuhan fungi patogen tanaman seperti F. oxysporum dan R. solani oleh aktivitas enzim kitinase yang dihasilkan oleh Pseudomonas telah dilaporkan oleh Folders et al. (2001). Analisis genetik yang dilakukan oleh Folders et al. (2001) menunjukkan bahwa enzim kitinase ekstraseluler pada P. aeruginosa dikodekan oleh gen ChiC. Gen ini mengkodekan polipeptida yang mengandung 483 residu asam amino.

Antibiosis: 2,4 Diacetylphloroglucinol (DAPG) Senyawa dengan aktivitas antifungi yang cukup banyak diteliti dari Pseudomonas sp. ialah 2,4-diacetylphloroglucinol (DAPG) (Gambar 3). DAPG merupakan metabolit sekunder yang dihasilkan P. fluorescens saat fase stasioner. Bottiglieri & Keel (2006) melaporkan kemampuan isolat P. fluorescens CHA0 dalam menghasilkan senyawa DAPG. Aktivitas DAPG efektif dalam menghambat pertumbuhan beberapa fungi patogen penyebab busuk akar tanaman gandum dan tembakau. Selain itu Vincent et al. (1991) melaporkan kemampuan bakteri P. aerofaciens dalam menghasilkan senyawa 2,4 DAPG yang dapat menghambat fungi patogen tanaman Gaeumannomyces graminis var. tritici, Pythium ultimum, dan Rhizoctonia solani. Senyawa 2,4 DAPG yang disintesis oleh bakteri PGPR dihasilkan sepanjang fase pertumbuhan tanaman. Diversitas bakteri Pseudomonas sp. penghasil senyawa 2,4 DAPG telah diteliti dari rhizosfer tanaman jagung dan

diduga dipengaruhi oleh fase pertumbuhan tanaman dan konsentrasi eksudat akar tanaman (Picard & Bosco 2005).

Gambar 3 Stuktur kimia senyawa DAPG (Bottiglieri & Keel 2006).

Selain 2,4 DAPG terdapat senyawa monoacetylphloroglucinol (MAPG) dan triacetylphloroglucinol (TAPG) yang disintesis oleh P. fluorescens. MAPG memiliki aktivitas antifungi yang kurang efektif, sehingga diduga senyawa ini merupakan prekursor atau senyawa hasil katabolit DAPG. Ekspresi senyawa DAPG memerlukan operon phlACBD. Hasil ekspresi phlACB diduga berperan dalam konversi MAPG menjadi DAPG melalui jalur biosintesis dengan prekursor asetil-S-KoA Sedangkan, gen PhlD berperan dalam mengkodekan enzim poliketida sintase yang terlibat dalam reaksi konversi asetosetil-S-KoA menjadi senyawa poliketida (Gambar 4) (Bangera & Thomasow 1999).

Gambar 4

Lintasan biosintesis senyawa DAPG yang melibatkan gen PhlABC dan PhlD (Bangera & Thomashow 1999).

Peta genetik dari operon phlACBD yang terlibat dalam biosintesis 2,4 DAPG tertera pada Gambar 5. Pada gambar tersebut juga terdapat gen phlE dan phlF yang mengapit operon phlACBD. Gen phlE berperan dalam mengkodekan enzim transmembran permease yang berguna dalam proses transport senyawa DAPG. Sedangkan gen phlF berperan dalam menyandikan protein regulator (Bangera & Thomashow 1999).

Gambar 5 Peta genetik dari operon phlACBD dan daerah regulator phlE dan phlF dari P. fluorescens Q2-Q8; A, AccI, B, BamHI; E, EcoRV; Eg, EagI; P, PstI;R, EcoRI; S, SalI; Sp, SphI; St, StuI; arah transkripsi ditunjukkan oleh anak panah (Bangera & Thomasow 1999). Analisis Genetika

Gen 16S rRNA Daerah 16S rRNA merupakan daerah terkonservasi pada organisme prokariot dan memberikan ciri spesifik dari tiap organisme prokariot. Sehingga daerah 16S rRNA ini digunakan oleh Woose untuk mengklasifikasikan makhluk hidup ke dalam tiga kelompok yakni Archaea, Bakteria dan Eukarya. Ribosomal RNA (rRNA) merupakan salah satu jenis molekul RNA yang unik, selain RNA duta (mRNA) dan RNA transfer (tRNA). rRNA berperan dalam pembentukan kerangka ribosom yang merupakan organel penting dalam proses translasi RNA menjadi asam amino (Glick & Pasternack 2003). Seluruh jenis molekul RNA ini terlibat dalam proses translasi. Saat ini, rRNA terutama komponen 16S rRNA telah banyak dijadikan sumber analisis filogeni dan pengklasifikasian makhluk hidup. Hal ini disebabkan molekul rRNA bersifat homolog baik secara fungsional ataupun evolusinya pada organisme yang berbeda dan merupakan molekul yang strukturnya terkonservasi (conserved) (Broun-Howland et al. 1992).

METODE Isolasi Pseudomonas sp. dari Rhizosfer Tanaman Kedelai Bahan atau sampel yang digunakan dalam proses isolasi adalah tanah rhizosfer tanaman kedelai asal Plumbon, Cirebon, Jawa Barat. Proses isolasi Pseudomonas sp. dilakukan dengan menggunakan media agar King’s B (pepton 20 g/l, K2HPO4 1,5 g/l, MgSO4 1,5 g/l, gliserol 15 ml/l, agar-agar 20 g/l). Media King’s B merupakan media yang umum digunakan untuk isolasi dan menumbuhkan bakteri Pseudomonas sp.. Isolasi diawali dengan pengenceran bertahap dari suspensi campuran 1 gram sampel tanah dengan 10 ml garam fisiologis (0,85% NaCl), kemudian diencerkan secara bertahap dengan memindahkan tiap 1 ml suspensi ke tabung yang berisi 9 ml garam fisiologis steril. Pengenceran dilakukan hingga 10-4 dan untuk suspensi pada tiga pengenceran terakhir disebar sebanyak 100 µl pada media agar King’s B dan diinkubasi selama 24 jam. Tiap koloni bakteri yang tumbuh pada media agar King’s B tersebut, kemudian dipindahkan satu per satu (replika) pada media yang sama. Tiap koloni kemudian di uji fisiologis untuk identifikasi isolat Pseudomonas. Uji fisiologis yang dilakukan adalah uji oksidase dan uji katalase selain itu juga dilakukan pengamatan mikroskopis dan pewarnaan Gram. Pseudomonas merupakan bakteri gram negatif, berbentuk batang (0,5-0,8 µm x 1-3 µm), dan menunjukkan hasil uji katalase dan oksidase positif (Holt et al. 1994). Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman Penapisan Isolat Pseudomonas sp. Penghasil IAA Deteksi isolat Pseudomonas sp. yang menghasilkan IAA dilakukan berdasarkan metode Salkowski seperti yang dilakukan oleh Lindow et al. 1998 dan Patten & Glick (2002). Isolat Pseudomonas sp. yang akan diuji dikulturkan terlebih dahulu pada media Kings B yang disuplementasikan dengan L-Trp 0,5 mM selama 48 jam hingga mencapai fase stasioner. Inkubasi dilakukan pada inkubator bergoyang pada temperatur kamar. Kultur kemudian di sentrifugasi

dengan kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit. Sebanyak

1 ml supernatan

kemudian diberi reagen Salkowski (150 ml H2SO4 pekat, 7,5 ml FeCl3. 6H2O 0,5 M dan 250 ml aquades) sebanyak 4 ml, uji dilakukan duplo. Suspensi kemudian diinkubasi pada ruang gelap selama 30 menit, kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 520 nm menggunakan spektrofotometer Spectronic 20D. Konsentrasi IAA yang dihasilkan tiap isolat diketahui dengan membandingkan nilai absorbannya pada kurva standar IAA.

Uji Pemacuan Pertumbuhan terhadap Kecambah Kedelai Uji pemacuan pertumbuhan dilakukan berdasarkan metode Dey et al. (2004) yang dimodifikasi. Isolat Pseudomonas sp. terlebih dahulu ditumbuhkan pada medium King’s B padat untuk tahap peremajaan yang diinkubasi selama 24 jam. Kemudian isolat Pseudomonas sp. kembali ditumbuhkan pada medium King’s B (agar cawan) dengan cara digoreskan penuh ke seluruh permukaan agar pada cawan. Hal ini dimaksudkan agar sel Pseudomonas sp. tumbuh dalam jumlah yang besar. Berdasarkan perhitungan jumlah sel dengan menggunakan hemasitometer, diketahui bahwa dari Pseudomonas sp. yang ditumbuhkan pada agar cawan diperoleh jumlah sel sekitar 1010 sel/ml. Biji kedelai yang akan diinokulasikan suspensi Pseudomonas sp. terlebih dahulu disterilisasi permukaannya dengan menggunakan H2O2 5% dan alkohol untuk kemudian dikecambahkan selama 24 jam. Biji kedelai yang telah berkecambah dengan pemanjangan radikula 2-3 mm dipilih untuk uji pemacuan pertumbuhan ini. Sebanyak sembilan kecambah kedelai diletakkan teratur pada cawan Petri yang berisi media water agar 1%, tiap kecambah kemudian di inokulasikan sebanyak 100µL suspensi sel Pseudomonas sp. dengan kisaran jumlah sel sekitar 109 sel. Uji dilakukan dengan tiga ulangan, dengan menggunakan kontrol yakni kecambah yang diinokulasikan media King’s B steril. Parameter pertumbuhan yang diamati adalah panjang akar primer, jumlah akar lateral, dan panjang batang. Seluruh data yang diperoleh dari uji ini kemudian dianalisis dengan ANOVA. Jika analisis varian menunjukkan perbedaan diantara nilai rata-rata data, maka nilai rataan dianalisis lebih lanjut

menggunakan uji Duncan (α = 0,05). Seluruh analisis dan uji statistik dilakukan dengan menggunakan program SPSS 15.

Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Biokontrol Fungi Patogen Tanaman Uji Produksi Siderofor secara Kualitatif Produksi siderofor dilakukan menggunakan media Chrome Azurol Sulfonat (CAS) agar (Husen 2003) dengan modifikasi larutan garam. Pembuatan media ini dilakukan dengan membuat terlebih dahulu empat larutan. Tiap 1 l medium CAS agar diperlukan empat larutan dengan masing-masing komposisi sebagai berikut: Larutan 1 yang merupakan larutan indikator Fe-CAS memiliki komposisi 10 ml FeCl3.6H2O 1mM (dilarutkan dalam 10 mM HCl), 50 ml larutan CAS (1,21 mg/ml) dan 40 ml larutan hexadecyl-trimetylammonium bromide (HDTMA) (1,82 mg/ml). Larutan 2 atau larutan penyangga dibuat dengan melarutkan 30,24 g PIPES (piperazine-N,N-bis[2-ethanesulfonic acid]) ke dalam 750 ml larutan garam (3 g KH2PO4, 5 g NaCl, 10 g NH4Cl, 20 mM MgSO4, 1 mM CaCl2). Akuades ditambahkan hingga volume larutan mencapai 800 ml, pH larutan kemudian diukur dan ditera dengan KOH 50% hingga mencapai pH 6.8. Kemudian sebanyak 20 g agar-agar bacto ditambahkan ke dalam larutan sebelum disterilisasi. Larutan 3 memiliki komposisi 2 g glukosa, 2 g manitol dan elemen mikro yang terdiri dari 493 mg MgSO4.7H2O, 11 mg MnSO4. H2O, 1,4 mg H3BO3, 0,04 mg CuSO4.5H2O, 1,2 mg ZnSO4.7 H2O dan 1,0 mg NaMoO4.2 H2O. Seluruh komponen larutan 3 dilarutkan dalam 70 ml akuades. Larutan 4 berupa 30 ml 10% (w:v) cassamino acid yang disterilisasi dengan menggunakan membran filter berukuran 0.45 µm. Medium CAS dibuat dengan mencampurkan larutan 2 dan 4 pada suhu sekitar 500C setelah sterilisasi, kemudian ditambahkan kembali larutan 3 dan 1 secara perlahan-lahan untuk kemudian dilakukan homogenisasi dengan menggunakan batang magnet. Medium CAS memiliki warna hjau tua. Uji produksi siderofor dilakukan dengan terlebih dahulu meremajakan isolat Pseudomonas sp. pada media King’s B. Tiap isolat tersebut kemudian digoreskan pada medium CAS. Isolat yang mampu menghasikan siderofor ditandai dengan menculnya warna oranye disekitar isolat.

Uji Produksi Enzim Kitinase Uji produksi kitinase dilakukan dengan menggunakan media kitin 1% (agar-agar 15 g/l, glukosa 5 g/l, pepton 2 g/l, kitin 10 g/l, K2HPO4 0,5 g/l, MgSO4 0,5 g/l, NaCl 0,5 g/l) (Cattelan et al. 1999). Isolat Pseudomonas sp. terlebih dahulu dikultivasi pada media King’s B selama 24 jam. Sebanyak 1µL suspensi Pseudomonas sp.tersebut kemudian diteteskan diatas media kitin 1%. Adanya aktivitas kitinolitik ditandai dengan terbentuknya zona bening disekitar suspensi isolat setelah inkubasi 48 jam. Indeks Kitinolitik (IK) dihitung dengan rumus : (Ø zona bening- Ø koloni) ÷ Ø koloni.

Penapisan Isolat Pseudomonas sp. yang Memiliki Kemampuan Antifungi Seleksi isolat Pseudomonas sp. yang menghasilkan senyawa antifungi dilakukan berdasarkan metode oposisi langsung (Ezra et al. 2004). Fungi patogen yang digunakan ialah Fusarium solani, Rhizoctonia solani dan Sclerotium rolfsii. Fungi patogen ditumbuhkan secara berpasangan dengan isolat Pseudomonas sp. di tengah media PDA (Potato Dextrose Agar) pada cawan petri berdiameter 9 cm dengan jarak 3 cm (Gambar 6). b 3 cm

a

Gambar 6 Skema uji antagonisme antara isolat Pseudomonas sp. dengan fungi patogen pada media PDA; a: fungi patogen, b: Pseudomonas sp.. Inokulum fungi patogen maupun isolat Pseudomonas sp. terdiri dari potongan biakan berdiameter 5 mm yang ditumbuhkan pada media PDA. Seluruh perlakuan dilakukan duplo. Satu plug agar fungi dari biakan awal diambil dan ditumbuhkan pada media Potato Dextrose Agar (PDA) dan pada jarak 3 cm dari plug fungi, digoreskan (3 cm) isolat Pseudomonas sp.. Selain itu juga dibuat kontrol, yakni hanya dengan menumbuhkan fungi saja pada posisi yang sama seperti perlakuan. Biakan diinkubasi selama 5 hari pada suhu ruang. Kemampuan

antagonis dari bakteri dapat dideterminasi dengan membandingkannya dengan kontrol. Indeks penghambatan (%) dihitung dengan rumus : 1-(jarak pertumbuhan fungi pada sisi isolat bakteri ÷ jarak pertumbuhan fungi pada sisi lain pada cawan yang sama sebagai kontrol) x 100%

Analisis Genetika Isolat Pseudomonas sp. Potensial sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Agen Biokontrol Fungi Patogen Isolasi DNA Genom Isolat yang terpilih untuk dianalisis secara genetika adalah isolat yang menunjukkan aktivitas yang baik sebagai agen pemacu pertumbuhan tanaman maupun agen biokontrol. Isolasi DNA genom dilakukan dengan metode MurrayThompson (Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide, CTAB). Isolat Pseudomonas sp. ditumbuhkan pada media Luria Broth (Tripton 10 g/l, NaCl 10 g/l, ekstrak khamir 5 g/l) selama semalam, pada inkubator bergoyang di suhu ruang. Sebanyak 50 ml kultur Psedomonas diambil dan dimasukkan ke dalam 2 tabung sentrifugasi 50 ml steril masing-masing 25 ml. Kemudian disentrifugasi selama 10 menit pada kecepatan 8500 rpm. Pelet yang didapat kemudian diresuspensi dengan 250 µl bufer TE (1X), dan dipindahkan ke dalam tabung mikro 1.5 ml steril. Kemudian disentrifugasi kembali pada kecepatan 9000 rpm. selama 10 menit. Suspensi kemudian ditambahkan 5 µl lisozim, suspensi lalu dicampur merata dengan cara membolak-balikkan tabung mikro hingga larutan menjadi berlendir dan bening. Selanjutnya, suspensi diinkubasi pada suhu 370C selama 30 menit. Proses lisis sel dilanjutkan dengan menambahkan 500 µl (Sodium Dodecyl Sulfate) SDS 10% dan proteinase K sebanyak 10 µl, tabung mikro 1.5 ml kemudian dibolak-balik. Suspensi diinkubasi pada suhu 370C selama 60 menit. Sebanyak 80 µl NaCl dan 100 µl CTAB 10% ditambahkan ke dalam suspensi, kemudian diinkubasi pada suhu 650C selama 20 menit, tabung kembali dibolak-balik. Purifikasi DNA dan pengendapan debris sel dilakukan dengan menambahkan 650 µl fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24:1). DNA dipisahkan dari debris sel dengan cara disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit. Supernatan yang mengandung DNA dipurifikasi dengan menambahkan

650 µl kloroform:isoamil alkohol (24:1) dan selanjutnya disentrifugasi pada 13000 rpm selama 10 menit. Untuk pengendapan DNA, supernatan yang didapat ditambahkan etanol absolut sebanyak 2 kali volume supernatan dan sodium asetat 3M 10 % volume, pengendapan dibantu dengan inkubasi di dalam mesin pembeku (-200C) selama 30 menit dan kemudian dilakukan sentrifugasi pada 13000 rpm selama 15 menit. Pelet yang didapatkan ditambahkan 70% etanol dingin untuk mengikat air. Suspensi kembali disentrifugasi (13000 rpm; 15 menit), fase supernatan dibuang sedangkan pelet dikeringudarakan dengan cara membuka tutup tabung mikro 1.5 ml dan dibiarkan selama beberapa jam (2-3 jam). Kemudian pelet DNA dilarutkan dalam 20 µl ddH2O steril dan disimpan pada suhu -200C (freezer).

Amplifikasi Gen Penyandi 16S-rRNA Primer yang digunakan untuk amplifikasi gen 16S-rRNA ialah 63f (5’CAG GCC TAA CAC ATG CAA GTC-3’) dan 1387r (5’- GGG CGG WGT GTA CAA GGC-3’) (Marchesi et al. 1998). Primer tersebut akan menghaslkan pita gen teramplifikasi dengan ukuran sekitar 1300 pasang basa (pb). PCR dilakukan pada volume 25 µl dengan komposisi LA Taq polimerase 0.25 µl, larutan penyangga (GC buffer) 12.5 µl, dNTP 8 µl, primer masing-masing 1 µl, dan DNA cetakan sebanyak 5 µl serta ditambahkan ddH2O hingga volume akhir 25 µl. Amplifikasi dilakukan untuk 30 siklus yang meliputi tahap pra-denaturasi pada suhu 94°C selama 2 menit, denaturasi pada suhu 92°C selama 30 detik, annealing pada suhu 55°C selama 30 detik, dan polimerasi pada suhu 75°C selama 1 menit, serta post-PCR pada suhu 75°C selama 5 menit. Fragmen hasil amplifikasi kemudian disekuen untuk mengetahui urutan basa DNA-nya, sekuen tersebut kemudian dibandingkan dengan database DNA pada GenBank menggunakan program BLASTN untuk mengetahui kemiripan spesies dari isolat yang diuji. Berdasarkan hasil sekuen gen 16S-rRNA dari isolat terpilih maka dilakukan analisis kekerabatan (filogenetika). Pensejajaran sekuen gen 16S-rRNA dilakukan dengan program ClustalW untuk kemudian dijadikan data pembuatan pohon filogenetik yang dibuat dengan program TreeCon.

Deteksi Gen Penyandi Senyawa Antifungi 2,4 DAPG dengan Teknik PCR Deteksi gen penyandi senyawa 2,4 DAPG dilakukan dengan menggunakan primer yang mengamplifikasi daerah gen phlD sebesar 745 pb. Primer yang digunakan ialah Phl2a (5’ GAG GAC GTC GAA GAC CAC CA 3’) dan Phl2b (5’ ACC GCA GCA TCG TGT ATG AG 3’) (Viebahn et al. 2003). Amplifikasi dilakukan dengan kondisi 94°C selama 2 menit, denaturasi pada suhu 92°C selama 30 detik, annealing pada suhu 58°C selama 30 detik, dan polimerasi pada suhu 72°C selama 1 menit, serta post-PCR pada suhu 72°C selama 10 menit. Hasil PCR kemudian dielektroforesis pada gel agarosa 1% untuk mendeteksi ukuran amplikon.

HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil Isolasi Pseudomonas sp. dari Rhizosfer Tanaman Kedelai Sebanyak 50 isolat Pseudomonas sp. berhasil diisolasi. Ke-lima puluh isolat ini kemudian diberi notasi nama Crb-1 hingga Crb-50. Penentuan isolat Pseudomonas sp. juga dilakukan dengan menggunakan serangkaian uji fisiologis seperti pewarnaan Gram, uji katalase, uji oksidase serta pengamatan morfologi koloni dan sel (Gambar 7A; 7C). Sel Pseudomonas menunjukkan ciri Gram negatif, katalase positif, oksidase positif, berbentuk batang dengan ukuran sel 0.50.8 µm x 1-3 µm serta bersifat motil (Ballows et al. 1992). Dari hasil isolasi ini, terdapat 10 isolat yang mampu berpendar fluor (fluoresensi) jika dikenakan sinar ultraviolet (UV) yakni isolat Crb-17, 19, 28, 33, 34, 41, 42, 46, 47 dan 48. Isolat demikian umumnya tergolong ke dalam kelompok Pseudomonas berfluoresens (Gambar 7B). A

C

B

1 cm

1 cm

5 µm

Gambar 7 A) Penampilan koloni Pseudomonas Crb-17 pada media King’s B (24 jam), B) Penampilan isolat Crb-17 yang mampu berpendar fluor diatas lampu UV, C) hasil pewarnaan Gram sel Pseudomonas yang menunjukkan reaksi Gram negatif (berwarna merah). Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman Penapisan Isolat Pseudomonas sp. Penghasil IAA. Berdasarkan uji produksi IAA yang dilakukan dengan menggunakan metode Salkowski diketahui bahwa terdapat dua isolat yakni Crb-7 dan Crb-38 yang tidak mampu menghasilkan IAA dari 50 isolat yang diujikan. Kisaran produksi IAA cukup beragam, produksi IAA tertinggi dihasilkan oleh isolat Crb-17 yakni sebesar 16,02 ppm (Tabel 1).

Tabel 1 Produksi IAA oleh isolat Pseudomonas sp. No

Isolat

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Crb-1 Crb-2 Crb-3 Crb-4 Crb-5 Crb-6 Crb-7 Crb-8 Crb-9 Crb-10 Crb-11 Crb-12 Crb-13 Crb-14 Crb-15 Crb-16 Crb-17 Crb-18 Crb-19 Crb-20 Crb-21 Crb-22 Crb-23 Crb-24 Crb-25

Uji

Pemacuan

Produksi IAA (ppm) 10,21 9,58 2,32 9,46 12,75 8,35 0 7,40 8,98 7,64 8,35 6,68 7,34 3,45 13,99 4,89 16,02 7,82 3,37 5,16 14,15 3,45 13,17 15,16 2,19

Pertumbuhan

No

Isolat

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50


terhadap

Produksi IAA (ppm) 12,53 1,98 12,16 2,64 4,31 5,45 2,60 3,25 2,82 12,53 4,39 2,34 0 3,91 8,66 3,73 4,61 5,08 3,73 9,65 15,79 10,36 8,98 15,79 10,01

Kecambah

Kedelai.

Berdasarkan uji pemacuan pertumbuhan dengan menggunakan kecambah kedelai diketahui bahwa terdapat 1 isolat yang secara signifikan mampu meningkatkan ketiga parameter pertumbuhan, yakni Crb- 44. Sedangkan beberapa isolat yang lain dapat meningkatkan satu atau dua parameter pertumbuhan kecambah kedelai seperti isolat Crb- 8, 7, 3, 16, dan 1 yang secara signifikan mampu meningkatkan panjang batang dibandingkan dengan kontrol. Crb-35 secara signifikan dapat meningkatkan jumlah akar lateral. Peningkatan panjang batang sekaligus panjang akar primer ditunjukkan oleh aktivitas isolat Crb-15. Sedangkan, isolat Crb-17 memperlihatkan kemampuan yang baik dalam meningkatkan panjang akar primer dan jumlah akar lateral.

Tabel 2

Data panjang akar primer, panjang batang dan jumlah akar lateral pada kecambah kedelai setelah diberi perlakuan isolat Pseudomonas sp.

Isolat Pseudomonas sp.

Panjang akar primer (cm)

Panjang batang (cm)

Jumlah akar lateral

Kelompok 1 Kontrol Crb-19 Crb-8 Crb-7 Crb-18 Crb-3 Crb-16 Crb-20 Crb-1 Crb-17 Crb-15

13,56a 13,40a 13,80a 14,50a 16,10a 17,53ab 17,63ab 17,90ab 18,03ab 21,83b 22,27b

8,97a 9,63ab 11,47bc 12,43c 10,57abc 11,17bc 11,27bc 10,73abc 11,60bc 10,97abc 11,27bc

60,13a 56,40a 61,57a 61,30a 62,93a 67,03a 66,17a 75,20a 76,90ab 96,60b 73,80a

Kelompok 2 Kontrol Crb-27 Crb-34 Crb-37 Crb-33 Crb-31 Crb-24 Crb-42 Crb-32 Crb-41 Crb-26 Crb-22

13,57cd 7,10a 7,93ab 8,30ab 9,10abc 9,20abc 10,03abc 11,70abc 12,30bc 13,37cd 13,43cd 17,60d

8,97cd 5,60a 5,97ab 7,90abc 7,27abc 7,70abc 8,10abc 8,53bcd 8,27bc 9,50cd 8,97cd 11,07d

60,13cde 32,47a 33,20a 39,33ab 36,60ab 43,20abc 46,93abcd 48,70abcd 59,03cde 64,97de 55,97bcd 77,17e

Kelompok 3 Kontrol Crb-43 Crb-45 Crb-35 Crb-44

7,00a 8,57a 8,57a 10,33ab 12,43b

7,07a 7,63ab 8,13ab 8,80ab 10,03b

35,77a 42,73ab 40,40ab 50,37bc 55,67c

Kelompok 4 Kontrol Crb-2 Crb-14 Crb-4 Crb-10 Crb-6 Crb-9 Crb-13 Crb-12 Crb-5 Crb-11

15,03ab 10,80a 11,03a 13,17ab 14,00ab 13,77ab 11,27a 14,07a 18,17b 12,37ab 15,63ab

10,00ab 9,33a 9,00a 9,97ab 11,07ab 9,47ab 9,27a 9,33a 11,57b 9,93ab 10,10ab

63,40ab 42,47a 43,63a 52,77ab 53,40ab 56,00ab 57,07ab 59,33ab 64,27ab 64,33ab 71,00b

lanjutan Isolat Pseudomonas sp.

Panjang akar primer (cm)

Panjang batang (cm)

Jumlah akar lateral


19,20a 15,27a 16,57a 18,10a 19,90a

10,47a 9,83a 9,13a 10,73a 10,63a

74,83b 55,53a 66,90ab 76,30b 84,07b


17,80c 9,63a 13,20ab 13,73abc 14,93bc

10,97b 7,80a 9,27ab 10,53b 10,53b

71,63c 44,50a 53,07ab 60,93bc 66,40bc

Kelompok 7 Kontrol Crb-36 Crb-29 Crb-30

14,47d 8,40a 10,50b 13,20c

10,97c 6,03a 8,10b 10,43c

64,17b 42,13a 49,60a 65,43b


14,93ab 10,83a 11,47a 14,50ab 17,23b

11,03ab 7,23a 7,20a 10,57b 11,00b

72,57b 42,17a 45,30a 80,47b 74,87b

Keterangan : huruf yang berbeda diakhir angka pada masing-masing kolom (parameter) pada tiap kelompok menunjukkan nilai yang berbeda nyata sesuai uji Duncan (α=0,05). Kelompok 1-8 merupakan kelompok percobaan yang dilakukan pada waktu berbeda. Nilai parameter yang dicetak tebal mengindikasikan nilai parameter yang berbeda nyata dengan kontrol pada tiap kelompok percobaan.

30 cm

Perlakuan dengan Crb-44

kontrol

Gambar 8

Salah satu uji pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai oleh isolat Pseudomonas (Crb-44) yang menunjukkan kemampuan yang signifikan dalam meningkatkan panjang akar primer, panjang batang dan jumlah akar lateral.

Analisis Karakter Pseudomonas sp. sebagai Agen Biokontrol Fungi Patogen Tanaman Uji Produksi Siderofor secara Kualitatif. Berdasarkan uji kualitatif produksi senyawa siderofor ternyata terdapat 33 isolat yang mampu menghasilkan siderofor, namun dalam tingkatan produksi yang bervariasi (Tabel 3). Produksi siderofor ditandai dengan adanya zona oranye disekitar isolat Pseudomonas sp. (Gambar 9A). Siderofor merupakan salah satu mekanisme penghambatan pertumbuhan fungi patogen yang dimiliki Pseudomonas sp.. Sehingga, diduga isolat-isolat yang mampu memproduksi siderofor berpotensial untuk dapat menghambat fungi patogen dalam penelitian ini. Namun demikian, penentuan siderofor sebagai mekanisme utama dalam menghambat pertumbuhan fungi patogen perlu ditelaah lebih lanjut, karena beberapa galur Pseudomonas diketahui dapat memiliki lebih dari satu mekanisme biokontrol dalam mengendalikan pertumbuhan fungi patogen tanaman.

Uji Produksi Enzim Kitinase. Berdasarkan uji aktivitas kitinolitik pada media kitin 1%, terdapat 13 isolat yang memiliki aktivitas kitinolitik (Tabel 2; Gambar 9B). Kitinase telah diketahui merupakan enzim yang digunakan untuk mendegradasi kitin yang merupakan salah satu komponen penyusun dinding hifa fungi. Sehingga dapat diduga aktivitas kitinolitik yang dimiliki beberapa isolat Pseudomonas sp. merupakan salah satu mekanisme penghambatan fungi patogen. A

B

Crb-12 Gambar 9

Crb-13

A) Produksi senyawa siderofor oleh isolat Crb-10 pada medium CAS yang ditandai dengan terbentuknya zona oranye disekitar isolat (48 jam). B) Aktivitas kitinolitik oleh isolat Crb-12 dan 13 yang ditandai dengan terbentuknya zona bening disekitar isolat pada media kitin 1% (48 jam).

Penapisan Isolat Pseudomonas sp. yang Memiliki Kemampuan Antifungi. Penapisan isolat yang berpotensi sebagai agen biokontrol berhasil dilakukan (Tabel 3). Sebanyak 4 isolat Pseudomonas sp. memiliki kemampuan yang rendah dalam menghambat F. oxysporum, masing-masing 2 dan 4 isolat mampu menghambat pertumbuhan F. oxysporum dalam tingkatan sedang dan tinggi. Sedangkan berdasarkan uji antagonis isolat Pseudomonas sp. terhadap S. rolfsii diketahui sebanyak 9 isolat memiliki kemampuan yang rendah dalam menghambat pertumbuhan fungi ini. Untuk uji antagonis Pseudomonas sp. dengan R. solani diketahui sebanyak 2 isolat menghambat kuat pertumbuhan fungi ini dan 8 isolat Pseudomonas sp. menghambat pertumbuhan fungi ini dalam tingkat penghambatan sedang (Tabel 2; Gambar 10A, 10B). B

A

C

Gambar 10 Aktivitas penghambatan, A) F. oxysporum oleh isolat Pseudomonas Crb-3, B) R. solani oleh Crb-31, C) S. rolfsii oleh Crb-44 setelah pengamatan 5 hari pada media PDA (Potato Dextrose Agar). Jika dilihat hasil uji sebelumnya yakni uji produksi siderofor dan uji produksi enzim kitinase dapat diduga bahwa adanya penghambatan fungi patogen dalam uji oposisi langsung ini disebabkan oleh aktivitas senyawa aktif tersebut. Seperti isolat Crb-3 yang mampu memproduksi siderofor dan enzim kitinase ternyata dapat menghambat fungi R. solani. Beberapa isolat Pseudomonas sp. yang lain seperti Crb-1, 2, 5, 24, 26, dan 49, menunjukkan karakter yang menarik yakni mampu menghasilkan siderofor atau enzim kitinase dan tidak menunjukkan aktivitas penghambatan terhadap ketiga fungi yang diujikan dalam uji oposisi langsung. Sehingga, perlu dianalisis lebih lanjut mengenai kemungkinan adanya mekanisme penghambatan fungi patogen yang lain.

Tabel 3 Karakter isolat Pseudomonas sp. sebagai agen biokontrol fungi patogen berdasarkan uji produksi siderofor, enzim kitinase dan uji penghambatan fungi patogen

No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25

Sidero fora

Isolat Crb-1 Crb-2 Crb-3 Crb-4 Crb-5 Crb-6 Crb-7 Crb-8 Crb-9 Crb-10 Crb-11 Crb-12 Crb-13 Crb-14 Crb-15 Crb-16 Crb-17 Crb-18 Crb-19 Crb-20 Crb-21 Crb-22 Crb-23 Crb-24 Crb-25

Keterangan:

a

++ ++ +++ ++ ++ ++ ++ + ++ +++ ++ ++ ++ + ++ ++ ++ +++ ++ +++ ++ -

IK 0,30 0,40 0,39 0,24 0,23 0,29 0,32 0,32 0,27 0,32 0,32 0,42 -

Penghambatan fungi Patogen b No F.o + + +++ +++ + ++ ++ -

S.r + + + -

R.s +++ + + + + + ++ + + + ++

26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50

Isolat


Penghambatan fungi patogen b

Sidero fora

IK

++ + ++ + + ++ + ++ ++ ++ ++ ++

0,28 -

F.o +++ + +++ -

S.r + + + + + + -

R.s + + +++ ++ + ++ ++ ++ ++ ++ + + + + + + -

+ : lemah; ++: sedang; +++: kuat; - : tidak ada aktivitas. b + : indeks penghambatan ≤ 10%, ++ : indeks penghambatan 11-20%, +++: indeks penghambatan ≥ 21 %. IK : Indeks Kitinolitik ; F.o : Fusarium oxysporum; S.r : Sclerotium rolfsii; R.s: Rhizoctonia solani. Huruf yang dicetak tebal mengindikasikan isolat yang secara signifikan mampu meningkatkan pertumbuhan kecambah kedelai.

Analisis Genetika Isolat Pseudomonas sp. Potensial sebagai Agen Pemacu Pertumbuhan Tanaman dan Agen Biokontrol Fungi Patogen Berdasarkan hasil uji isolat Pseudomonas sp. sebagai agen pemacu pertumbuhan dan biokontrol maka dipilih empat isolat potensial yakni Crb-3, 16, 17 dan 44. Selain aktivitas pemacuan pertumbuhan dan aktivitas biokontrol yang baik, ke-empat isolat ini juga tidak menunjukkan gejala hipersensitivitas pada tanaman tembakau yang mengindikasikan bahwa ke-empat isolat ini tidak patogen terhadap tanaman (data tidak ditampilkan).

Amplifikasi Gen Penyandi 16S-rRNA. Amplifikasi gen 16S-rRNA dari isolat Pseudomonas sp. potensial pada penelitian ini menggunakan enzim LA taq Polimerase (Takara) karena komposisi GC Pseudomonas sp. yang cukup tinggi yakni sekitar 58-68%. Berdasarkan hasil elektroforesis didapatkan hasil amplikon DNA berukuran ~1300 pb (Gambar 11).

~1300 pb

Gambar 11

Hasil elektroforesis dari amplifikasi gen 16S-rRNA menunjukkan pita DNA berukuran 1300 pb. M: marker 1 kb DNA ladder, sumur 1: Crb-3, sumur 2: Crb-16, sumur 3: Crb-44, sumur 4: Crb-17.

Hasil PCR gen 16S-rRNA kemudian disekuen untuk mengetahui urutan nukleutidanya. Hasil sekuen gen 16S-rRNA tiap isolat kemudian dianalisis homologinya dengan menggunakan program BLASTN terhadap data GenBank (NCBI). Berdasarkan analisis program BLASTN diketahui homologi spesies dari isolat yang diujikan (Tabel 3). Sekuen 16S-rRNA dari tiap isolat terlampir pada lampiran.

Data sekuen gen 16S-rRNA dari ke-empat isolat kemudian dibandingkan dengan beberapa data sekuen gen 16S-rRNA dari beberapa spesies Pseudomonas yang lain seperti P. fluorescens CHA0, P. aeruginosa, P. stutzeri dan P. putida. Hasil perbandingan sekuen ini kemudian divisualisasikan dalam bentuk pohon filogenetika yang dapat menunjukkan kekerabatan (Gambar 12). Berdasarkan hasil analisis pohon filogenetika terlihat bahwa isolat Crb-3, Crb-16 dan Crb-17 memiliki kekerabatan yang dekat dengan P. putida. P. putida sendiri merupakan spesies Pseudomonas yang telah cukup populer digunakan sebagai agen pemacu pertumbuhan tanaman. Hal ini terutama disebabkan karena kemampuannya dalam memproduksi IAA (Patten & Glick 2002). Isolat Crb-44 memiliki kekerabatan yang besar dengan P. fluorescens pf-5 dan P. fluorescens CHA0. Ke-dua spesies P. fluorescens ini telah banyak diteliti mengenai kemampuan pemacuan pertumbuhan dan kemampuannya dalam memproduksi berbagai senyawa antibiosis (Paulsen et al. 2005).

Tabel 3 Hasil analisis sekuen gen 16S-rRNA dengan menggunakan program BLASTN Isolat

Spesies Pseudomonas homolog

% identitas 94%

No. akses DQ095885.1

Crb-3

Gen 16S rRNA dari Pseudomonas monteilii R23

Crb-16

Gen 16S rRNA Pseudomonas sp. M41

94%

EU375659.1

Crb-17

Gen 16S rRNA dari Pseudomonas plecoglossicida NYZ12

99%

EF544606.2

Crb-44

Gen 16S rRNA dari Pseudomonas beteli

99%

AB021406

Deteksi Gen Penyandi Senyawa Antifungi 2,4 DAPG dengan Teknik PCR. Deteksi gen penyandi senyawa antifungi dilakukan untuk gen penyandi DAPG. Primer yang digunakan adalah primer phl2a dan phl2b yang secara spesifik akan mengamplifikasi gen phlD pada ukuran 745 pb (Viebahn et al. 2003). Gen phlD berperan untuk ekspresi enzim poliketida sintase yang terlibat dalam biosintesis DAPG. Dengan menggunakan teknik PCR terdeteksi bahwa, hanya isolat Crb-16 memiliki gen phlD dibuktikan dengan munculnya pita DNA sebesar 745 pb (Gambar 13).

Crb-16 Crb-3 Crb-17 P. putida T7-5 Crb-44 P. fluorescens pf-5 P. fluorescens CHA0 P. stutzeri

Gambar 12 Pohon filogenetika berdasarkan sekuen gen 16S-rRNA dari isolat-isolat Pseudomonas sp. potensial, yang dibandingkan dengan sekuen gen 16S-rRNA dari beberapa spesies Pseudomonas yang lain. Skala 0,1 menunjukkan jarak evolusi pada panjang cabang, sedangkan angka pada cabang menunjukkan nilai bootstrap.

M

1

~745 pb

Gambar 13 Hasil deteksi gen penyandi senyawa antifungi DAPG dengan PCR. Crb-16 (sumur 1) menunjukkan hasil positif ditandai adanya pita DNA ~745 pb. M: marker 1 kb DNA ladder, sumur 1: Crb-16. Pembahasan Sebanyak 50 isolat Pseudomonas sp. yang berhasil diisolasi dari tanah rhizosfer tanaman kedelai ternyata menunjukkan kemampuan untuk menghasilkan IAA. Senyawa IAA merupakan senyawa aktif yang berperan penting dalam memacu pertumbuhan tanaman. Penambahan Trp pada medium pertumbuhan isolat Pseudomonas dimaksudkan agar Trp digunakan sebagai prekursor pembentukan senyawa IAA. Terdapat tiga lintasan utama pembentukan IAA dari Trp baik di tanaman, fungi maupun bakteri. Pada bakteri khususnya Pseudomonas umumnya menggunakan lintasan IAM yakni melibatkan pembentukan senyawa indole-3-acetamide. Namun demikian menurut Fett et al. (1987) bakteri Pseudomonas khususnya P. syringae pv. savastanoi dan

P. solanacearum

sebenarnya memproduksi IAA secara konstitutif. Keberadaan Trp pada media pertumbuhannya akan meningkatkan produksi IAA dibandingkan tanpa suplementasi Trp. Hal ini seperti ditunjukkan pada penelitian Glickmann et al. (1998) yang melaporkan bahwa penambahan Trp 2,5 mM pada media pertumbuhan P. syringae pv. syringae dan P. meliae dapat meningkatkan produksi IAA hingga 4 kali lipat dibandingkan jika ditumbuhkan pada medium King’s B tanpa Trp. Berdasarkan uji produksi IAA terdapat dua isolat yakni Crb-7 dan 38 yang tidak memproduksi IAA. Hal ini diduga disebabkan kedua isolat ini tidak

memiliki perangkat enzim yang diperlukan dalam biosintesis IAA. Seperti dilaporkan oleh Patten dan Glick (2002) bahwa terdapat beberapa spesies Pseudomonas seperti P. putida GR12-2 yang tidak mampu menghasilkan IAA karena tidak memiliki enzim Trp-2-monooksigenase. Enzim tersebut merupakan enzim kunci yang diperlukan dalam biosintesis IAA melalui lintasan IAM yang umum digunakan Pseudomonas sp. untuk sintesis IAA. Dari hasil uji pemacuan pertumbuhan kecambah kedelai, terlihat bahwa isolat Crb-17 dan Crb-35 yang menghasilkan IAA cukup besar yakni 16,02 dan 12,53 ppm dan dapat meningkatkan jumlah akar lateral. Namun, isolat Crb-15 yang juga menghasilkan IAA cukup besar yakni 13,99 ppm memperlihatkan aktivitas pemacuan pertumbuhan yang lain yakni meningkatkan panjang akar primer dan panjang batang. Dari hasil uji tersebut terlihat bahwa terdapat perbedaan respon pertumbuhan kecambah kedelai terhadap masing-masing isolat Pseudomonas sp.. Namun demikain hal penting yang perlu dicermati adalah mengenai adanya pengaruh IAA dalam meningkatkan pertumbuhan tanaman. Hal ini selaras dengan penelitian Patten & Glick (2002) yang menyatakan bahwa IAA yang dihasilkan oleh bakteri rhizosfer berperan dalam menstimulasi pembentukan sistem perakaran tanaman inang (host plant root system). Selain konsentrasi IAA yang tinggi, konsentrasi IAA yang rendah ternyata tetap dapat meningkatkan pertumbuhan kecambah. Hal ini seperti terlihat pada Tabel 2, dimana isolat Crb-44 yang memproduksi IAA sebesar 3,73 ppm dapat secara signifikan meningkatkan semua parameter pertumbuhan. Sedangkan isolat yang lain seperti Crb-3, 16 yang juga menghasilkan IAA dalam konsentrasi rendah, memperlihatkan kemampuannya dalam meningkatkan panjang batang. Konsentrasi IAA yang rendah yakni berkisar 10-9-10-12 M telah dilaporkan dapat meningkatkan panjang akar primer dan panjang batang (Patten & Glick 2002). Dari hasil uji pemacuan pertumbuhan kedelai ini, diduga terdapat interaksi kompleks yang terjadi antara isolat Pseudomonas sp, IAA yang dihasilkan oleh isolat Pseudomonas sp, serta kemampuan kecambah untuk memanfaatkan IAA. Hal ini memberi dampak pada perbedaan respon pertumbuhan tanaman. Hal ini disebabkan, IAA yang disekresikan oleh bakteri dapat memacu pertumbuhan tanaman secara langsung yakni dengan menstimulasi pemanjangan sel atau

pembelahan sel maupun secara tidak langsung yakni berkaitan dengan aktivitas enzim aminosikloprana karboksilat (ACC) deaminase. Enzim ACC deaminase ini telah diketahui diproduksi oleh beberapa bakteri PGPR termasuk kelompok Pseudomonas. Enzim ini berperan untuk menghidrolisis senyawa ACC yang merupakan senyawa intermediat dalam biosintesis hormon etilen, sehingga mencegah produksi etilen oleh tanaman. IAA eksogenus yang tinggi akan meningkatkan produksi

etilen

dan akan menyebabkan

penghambatan

pertumbuhan akar (Patten & Glick 2002). Pada penelitian ini juga dijumpai isolatisolat yang tidak dapat memacu pertumbuhan tanaman walaupun mampu memproduksi IAA cukup besar, seperti Crb-5, 21, 23, 24, 26, 28, 46, 49 dan 50. Selain disebabkan adanya peningkatan produksi etilen, tidak adanya aktivitas pemacuan pertumbuhan oleh isolat-isolat tersebut diduga terjadi karena tidak terjadinya kolonisasi Pseudomonas sp. pada perakaran atau kecambah kedelai. Lebih jauh, Leveau & Lindow (2005) melaporkan bahwa IAA yang dihasilkan oleh sel bakteri terkadang tidak disekresikan untuk pemacuan pertumbuhan tanaman di sekitarnya namun dikonsumsi oleh sel bakteri sendiri untuk pertumbuhannya. Berdasarkan hasil uji oposisi langsung antara isolat Pseudomonas sp. dengan fungi patogen, didapatkan sebanyak 4 isolat yang menghambat kuat pertumbuhan F. oxysporum, 2 isolat menghambat pertumbuhan R. solani dan tidak terdapat isolat Pseudomonas yang menunjukkan kemampuan yang kuat dalam

menghambat

S.

rolfsii.

Sebagian

besar

aktivitas

penghambatan

pertumbuhan fungi patogen bersifat sedang dan lemah. Beberapa spesies Pseudomonas telah banyak dilaporkan memiliki aktivitas penghambatan terhadap fungi Fusarium oxysporum, diantaranya P. fluorescens WCS417 (Duijff et al. 1998) dan P. fluorescens WCS358 (Duijjf et al. 1999). Penghambatan R. solani oleh bakteri Pseudomonas juga telah dilaporkan sebelumnya oleh Vincent et al. (1991). Aktivitas penghambatan tersebut disebabkan oleh

produksi senyawa

antibiosis oleh isolat Pseudomonas berupa senyawa 2,4 DAPG. Adanya penghambatan fungi patogen yang ditunjukkan oleh isolat Pseudomonas sp. diduga melibatkan beberapa mekanisme diantaranya senyawa bioaktif seperti siderofor atau enzim kitinase. Seperti isolat Crb-3 yang mampu

menghasilkan

siderofor

dan

kitinase

ternyata

menunjukkan

aktivitas

penghambatan yang besar terhadap R. solani. Namun demikian mekanisme penghambatan R. solani oleh Crb-3 perlu ditelaah lebih lanjut, karena berdasarkan hasil penapisan ini belum dapat ditentukan mengenai mekanisme yang terlibat secara pasti dalam menghambat fungi patogen. Menurut beberapa penelitian sebelumnya, kemampuan penghambatan pertumbuhan fungi patogen oleh Pseudomonas sp. diduga tidak hanya melibatkan satu mekanisme biokontrol saja. Keberadaan enzim kitinase ternyata tidak menjadi jaminan adanya aktivitas litik pada dinding sel fungi, karena dibutuhkan mekanisme lain. Hal ini seperti dilaporkan Lim et al. (1991) yang melaporkan bahwa kemampuan P. stutzeri YPL-1 dalam memproduksi enzim kitinase dan β-1,3 glukanase akan lebih efektif dalam mendegradasi dinding hifa fungi Fusarium solani dibandingkan aktivitas satu enzim hidrolitik saja. Mekanisme biokontrol lain seperti keberadaan senyawa siderofor, menurut beberapa penelitian sebelumnya ternyata lebih efektif dalam pengendalian fungi patogen dibandingkan enzim hidrolitik (Meyer & Abdallah 1980). Namun penelitian lain menyatakan sebaliknya (Lim et al. 1991; Hamdan et al. 1991) hal ini mengindikasikan adanya mekanisme utama dalam penghambatan fungi patogen walaupun organisme biokontrol yang digunakan memiliki mekanisme biokontrol lebih dari satu. Contoh kasus lain dilaporkan oleh Hamdan et al. (1991) yang melaporkan bahwa mekanisme yang lebih dominan dalam penghambatan pertumbuhan fungi patogen Gaeumannomyces graminis var. tritici oleh P. fluorescens 2-79 adalah adanya aktivitas senyawa antifungi phenazin, dibandingkan siderofor, walaupun kedua senyawa bioaktif ini mampu diproduksi oleh P. fluorescens 2-79. Berdasarkan uji produksi siderofor dan kitinase, isolat Pseudomonas sp. Crb-1, 2, 5, 24, 26 dan 29 diketahui mampu menghasilkan kedua senyawa tersebut, namun demikian tidak ada aktivitas penghambatan ketiga fungi patogen yang diujikan dalam penelitian ini. Hal ini diduga disebabkan adanya spesifitas aktivitas senyawa antifungi terhadap fungi patogen target (Barea 1998). Sehingga walalupun aktivitas penghambatan Pseudomonas terhadap pertumbuhan tiga fungi patogen yang diujikan dalam penelitian ini tergolong rendah, tidak menutup kemungkinan aktivitas penghambatan akan menjadi besar terhadap pertumbuhan

fungi patogen yang lain. Adanya sifat resistensi dari fungi patogen terhadap senyawa bioaktif yang dihasilkan oleh isolat Pseudomonas juga merupakan salah satu kemungkinan tidak terjadinya penghambatan pertumbuhan fungi patogen. Seperti dilaporkan oleh Notz et al. (2002), bahwa fungi F. oxysporum mampu menghasilkan asam fusarat (fusaric acid) yang dapat menghambat ekspresi gengen dalam biosintesis senyawa antifungi DAPG. Selain itu, asam fusarat ini juga mampu merepresi ekspresi gen-gen untuk produksi senyawa antifungi phenazin pada P. chlororaphis PCL1391 (Tjeerd van Rij et al. 2005). Tidak adanya penghambatan pertumbuhan fungi patogen dari beberapa isolat yang mampu menghasilkan siderofor atau enzim kitinase ini dapat pula disebabkanoleh faktor lingkungan yang tidak mendukung diproduksinya senyawa bioaktif tersebut ketika uji oposisi langsung dilakukan. Uji oposisi langsung antara isolat Pseudomonas sp. dengan fungi patogen dilakukan pada media PDA yang merupakan media kaya yang pada umumnya tidak akan menginduksi produksi siderofor oleh isolat Pseudomonas sp. Hal ini disebabkan produksi siderofor hanya akan terjadi ketika bakteri ditumbuhkan pada media atau lingkungan yang miskin ion besi. Hal menarik lainnya dari analisis karakter Pseudomonas sp. sebagai agen biokontrol ditunjukkan oleh isolat Crb-21, 33, 34, 36, 37, 38 dan 40. Ke-tujuh isolat ini tidak menghasilkan siderofor dan enzim kitinase namun demikian isolatisolat tersebut menunjukkan aktivitas penghambatan fungi patogen walaupun dalam tingkatan penghambatan sedang dan lemah. Hal ini diduga disebabkan adanya mekanisme penghambatan fungi patogen selain siderofor dan kitinase yang dimiliki oleh ketujuh isolat tersebut seperti diantaranya aktivitas HCN atau antibiosis (Compant et al. 2005). Berdasarkan karakter-karakter yang telah diuji baik sebagai agen pemacu pertumbuhan tanaman maupun agen biokontrol terpilih empat isolat potensial yakni Crb-3, 16, 17 dan 44. Berdasarkan analisis sekuen gen 16S-rRNA ke-empat isolat tersebut memiliki kemiripan yang besar dengan spesies Pseudomonas pada data GenBank (Tabel 3). Berdasarkan analisis sekuen gen 16S-rRNA, isolat Crb-3 memiliki kemiripan terbesar dengan P. monteilii. Menurut penelitian Inoe et al. 2003 diketahui bahwa P. monteilii memiliki kemampuan dalam menghasilkan senyawa pyoverdine, yakni senyawa siderofor berupa peptida yang berperan

dalam pengambilan Fe3+ dari lingkungan. Berdasarkan uji siderofor pada penelitian ini ternyata diketahui Crb-3 merupakan salah satu isolat yang memiliki aktivitas tinggi dalam menghasilkan siderofor. Isolat Crb-44 memiliki kemiripan yang besar dengan P. beteli. P. beteli ini pernah dilaporkan oleh Minkwitz & Berg (2001) memiliki kemampuan menghambat pertumbuhan beberapa fungi patogen tanaman seperti R. solani, Verticillium dahliae, dan Sclerotinia sclerotiorum. Crb-17 yang memiliki kemiripan terbesar dengan P. plecoglossicida merupakan spesies Pseudomonas yang baru diketahui sistematika evolusi dan taksonominya pada tahun 2000. Namun demikian secara genotipe, spesies ini berkerabat dekat dengan P. putida yang umum digunakan sebagai inokulan pada berbagai pupuk pertanian (Nishimori et al. 2000). Berdasarkan hasil deteksi gen phlD dengan PCR diketahui bahwa isolat Crb-16 yang homolog dengan Pseudomonas sp. M41 memiliki gen yang terlibat dalam produksi senyawa 2,4 DAPG. Sehingga dapat diduga bahwa aktivitas penghambatan pertumbuhan fungi F. oxysporum oleh Crb-16 disebabkan oleh aktivitas senyawa antifungi 2.4 DAPG selain siderofor . Walaupun Crb-16 telah diketahui positif menghasilkan senyawa antifungi DAPG, namun berdasarkan hasil uji aktivitas penghambatan pertumbuhan fungi patogen (Tabel 1) ternyata senyawa antifungi yang dihasilkan hanya menghambat secara kuat pertumbuhan F. solani dan tidak menghambat fungi patogen yang lain. Hal ini diduga disebabkan adanya spesifisitas senyawa antifungi terhadap target. Seperti dilaporkan oleh Barea (1998), yang menyatakan bahwa adanya senyawa antibiosis yang bersifat antifungi seperti 2,4 DAPG ternyata tidak menghambat pertumbuhan fungi Glomus mosseae. Sifat spesifik ini memberikan keuntungan dalam aplikasi isolat-isolat yang potensial dalam menghasilkan senyawa antifungi ini ke lapangan. Karena dengan demikian tidak semua fungi dihambat pertumbuhannya, karena tidak semua fungi yang berada di rhizosfer bersifat patogen atau merugikan. Beberapa diantara fungi tersebut memiliki sifat menguntungkan seperi G. mosseae yang berinteraksi positif dengan tanaman dalam pembentukan mikoriza arbuskula (Barea 1998).

SIMPULAN Sebanyak 50 isolat Pseudomonas berhasil diisolasi dari rhizosfer tanaman kedelai dengan menggunakan media King’s B. Karakter pemacuan pertumbuhan yang cukup baik ditunjukkan oleh empat isolat yakni Crb-3, 16, 17 dan 44 karena selain dapat memacu pertumbuhan kedelai, ke-empat isolat ini dapat menghambat pertumbuhan fungi patogen. Berdasarkan analisis 16S-rRNA, ke-empat isolat tersebut masuk ke dalam kelompok Pseudomonas. Salah satu dari empat isolat terpilih yakni Crb-16 terdeteksi memiliki gen phlD yakni gen yang terlibat dalam biosintesis senyawa antibiosis DAPG.

DAFTAR PUSTAKA Ahmad F, Ahmad I, Khan MS. 2005. Indole acetic acid production by the indigenous e of Azotobacter and fluorescent Pseudomonads in the presence and absence of tryptophan. Turk J Biol 29: 29-34. Alvarez MAD, Gagne S, Antoun H. 1995. Effect of compost on rhizosphere microflora of the tomato and on the incidence of plant growth-promoting rhizobacteria. Appl Environ Microbiol 61: 194-199. Atlas RM, Bartha R. 1998. Microbial Ecology, 4th ed. California: Addison Wesley Longman, Inc. hlm 624-625. Bai Y, Zhou X,. Smith DL. 2003. Enhanced soybean plant growth resulting from coinoculation of Bacillus strains with Bradyrhizobium japonicum. Crop Sci 43:1774–1781. Balows A, Truper HG, Dworkin M, Harder W, Schleifer HH. 1992. The Prokaryotes, 2nd ed. New York: Springer Verlag Inc. Bangera MG, Thomashow LS. 1999. Identification and characterization of a gene cluster for synthesis of the polyketide antibiotic 2,4-diacetylphloroglucinol from Pseudomonas fluorescens Q2-87. J Bacteriol 181: 3155-3163. Bano N, Musarrat J. 2003. Isolation and characterization of phorate bacteria of environmental and agronomic. Lett Appl Microbiol 36: 349–353. Barea JM. 1998. Impact on arbuscular mycorrhiza formation of Pseudomonas strains used as inoculants for biocontrol of soil-borne fungal plant pathogens. Appl Environ Microbiol 64: 2304-2307. Bottglieri M, Keel C. 2006. Characterization of PhlG, a hydrolase that specifically degrades the antifungi compound 2,4-diacetylphloroglucinol in the biocontrol agent Pseudomonas fluorescens CHA0. Appl Environ Microbiol 72: 418-427. Bottini R, Fulchieri M, Pearce D, Pharis RP. 1989. Identification of gibberellins a1, a3, and iso-a3 in cultures of Azospirillum lipoferum. Plant physiol 90: 45-47. Broun-Howland EB, Danielsen SA, Niezwicki-Bauer SA. 1992. Development of rapid method for detecting bacterial cell in situ using 16S rRNA-targeted probes. Biotechniques 13: 928-933. Burd GI, Dixon DG, Glick BR. 1998. A plant growth promoting bacterium that decreases nickel toxicity in seedlings. Appl Environ Microbiol 64: 36633668.

Busyens S, Heungens K, Poppe J, Hofte M. 1996. Involvement of pyochelin and pyoverdine in supression of pythium-induced damping off of tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2. Appl Environ Microbial 62: 865-871. Cattelan AJ, Hartel PG, Fuhrmann JJ. 1999. Screening for plant growthpromoting rhizobacteria to promote early soybean growth. Soil Sci Soc Am J 63: 1670-1680. Compant S, Duffy B, Nowak J, Clement C, Barka EA. 2005. Use of plant growth promoting bacteria for biocontrol of plantdiseases: principles, mechanisms of action, and future prospects. Appl Environ Microbiol 71: 4951-4959. Chernin L, Chet I. 2002. Microbial enzymes in the biocontrol of plant pathogens and pests. Di dalam: Burns RG, Dick RP editor. Enzymes in the environment. Hlm 171-226. Dey R, Pal KK, Bhatt DM, Chauhan SM. 2004. Growth promotion and yield enhancement of peanut (Arachis hypogaea L.) by application of plant growth-promoting rhizobacteria. Microbiol Res 159: 371-394. Duijff BF, Pouhair D, Olivain C, Alabouvette C, Lemanceau P. 1998. Implication of systemic induced resistance in the suppression of Fusarium wilt of tomato by Pseudomonas fluorescens WCS417r and by non-pathogenic Fusarium oxysporum Fo47. Eur J Plant Pathol 104: 903-910. Duijff BF, Recorbet G, Baker PAHM, Loper JE, Lemanceau P. 1999. Microbial antagonism at the root level is involved in the suppression of Fusarium wilt by the combination of non-pathogenic Fusarium-oxysporum Fo47 and Pseudomonas putida WCS358. Phytopathology 89: 1073-1079 Ezra D, Hess WM, Strobel GA. 2004. New endophytic isolates of Muscodor albus, a volatile-antibiotic-producing fungus. Microbiology 150: 4023– 4031. Fett WF, Osman SF, Dunn MF. 1987. Auxin production by plant-pathogenic Pseudomonads and Xanthomonads. Appl Environ Microbiol 53: 18391845. Folders J, Algra J, Roelofs MS, van Loon LC, Tommassen J, et al. 2001. Characterization of Pseudomonas aeruginosa chitinase, a gradually secreted protein. J Bacteriol 24: 7044–7052. Glick BR, Pasternak JJ. 2003. Molecular Biotechnology, Principles and Apllications of Recombinant DNA. Washington: ASM Press. Hlm 436. Glickmann EG, Gardan L, Jacquet S, Hussain S, Elasri M, et al. 1998. Auxin production is a common feature of most pathovars of Pseudomonas syringae. Mol Plant-Microbe Interact 11: 156-162.

Hagedorn C, Gould WD, Bardinelli TR, Gustavson DR. 1987. A selective medium for enumeration and recovery of Pseudomonas cepacia biotypes from soil. Appl Environ Microbiol 53: 2265-2268. Holt JG, Krieg NR, Sneath PHA, Staley JT, Williams ST. 1994. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, 9th ed. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. Hlm 93-94. Hamdan H, Weller DM, Thomashow LS. 1991. Relative importance of fluorescent siderophores and other factors in biological control of Gaeumannomyces graminis var. tritici by Pseudomonas fluorescens 2-79 and M4-80R. Appl Environ Microbial 57: 3270-3277. Husen E. 2003. Screening of soil bacteria for plant growth promotion activities in vitro. Indo J Agri Sci. 4:27-31 Inoe H, Takimura O, Kawaguchi K, Nitoda T, Fuse H, et al. 2003. Tin-carbon cleavage of organotin compounds by pyoverdine from Pseudomonas chlororaphis. Appl Environ Microbiol 69: 878–883. Krueger CL, Sheikh W. 1987. A new selective medium for isolating Pseudomonas spp. from water. Appl Environ Microbiol 53: 895-897. Leveau JHJ, Lindow SE. 2005. Utilization of the plant hormone indole-3-acetic acid for growth by Pseudomonas putida strain 1290. Appl Environ Microbiol 71:2365-2371. Lim HS, Kim YS, Kim SD. 1991. Pseudomonas stutzeri YPL-1 genetic transformation and antifungal mechanisms against Fusarium solani, an agent of plant root rot. Appl Environ Microbial 57: 510-516. Lindow SE, Desurmont C, Elkins R, McGourty G, Clark E, et al. 1998. Occurrence of indole-3-acetic acid–producing bacteria on pear trees and their association with fruit russet. Phytopathology 88: 1149-1157. Loper JE, Buyer JS. 1991. Siderophores in microbial interactions on plant surfaces. Mol Plant Microbe Interact 4: 5-13. Matiru VN, Dakora FD. 2004. Potential use of rhizobial bacteria as promoters of plant growth for increased yield in landraces of African cereal crops. Afr J Biotechnol 3: 1-7. Marchesi JR, Sato T, Weightman AJ, Martin TA, Fry JC, et al. 1998. Design and evaluation of useful bacterium specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S-rRNA. Appl Environ Microbiol 64:795-799. Metraux JP. 1990. Increase in salicylic acid at the onset of systemic acquired resistance in cucumber. Science 250: 1004-1006.

Meyer JM, Abdallah MA. 1980. The siderochromes of non-fluorescent Pseudomonads: production of nocardamine of Pseudomonas stutzeri. J Gen Microbiol 118:125-129. Minkwitz A, Berg G. 2001. Comparison of antifungal activities and 16s ribosomal DNA sequences of clinical and environmental isolats of Stenotrophomonas maltophilia. J Clin Microbiol 39: 139-145. Neilands JB. 1995. Siderophores: structure and function of microbial iron transport compounds. J Biol Chem 270: 26723-26726. Nishimori E, Tsukamoto KK, Wakabayashi H. 2000. Pseudomonas plecoglossicida sp. nov., the causative agent of bacterial haemorrhagic ascites of ayu, Plecoglossus altivelis. Int J Syst Evol Microbiol 50:83-89. Notz R, Maurhofer M, Dubach H, Haas D, Defago G. 2002. Fusaric acidproducing strains of fusarium oxysporum alter 2,4-diacetylphloroglucinol biosynthetic gene expression in pseudomonas fluorescens cha0 in vitro and in the rhizosphere of wheat. Appl Environ Microbiol 68: 2229-2235. Paulsen IT, Press CM, Ravel J, Kobayashi DY, Myers GSA, et al. 2005. Complete genome sequence of the plant commensal Pseudomonas fluorescens Pf-5. Nature Biotechnol 23: 873-878. Patten CL, Glick BR. 1996. Bacterial biosynthesis of indole-3-acetic acid. Can J Microbiol 42:207-220. Patten CL, Glick BR. 2002. Role of Pseudomonas putida indole acetic acid in development of the plant root system. Appl Environ Microbiol 68: 37953801. Picard C, Bosco M. 2005. Maize heterosis affects the structure and dynamics of indigenous rhizospheric auxins-producing Pseudomonas populations. FEMS Microbiol Ecol 53: 349-357. Selitrennikoff CP. 2001. Antifungi protein. Appl Environ Microbiol 67: 28832894. Shen D. 1997. Microbial diversity and application of microbial products for agricultural purposes in China. Agric Ecosyst Environ 62: 237–245. Shishido M, Massicotte HB, Chanway CP. 1996. Effect of plant growth promoting Bacillus strains on pine and spruce seedling growth and mycorrhizal infection. Annals Bot 77: 433-441.

Somers E, Ptacek D, Gysegom P, Srinivasan M, Vanderleydenl J. 2004. Azospirillum brasilense produces the auxin-like phenylacetic acid by using the key enzyme for indole-3-acetic acid biosynthesis. Appl Environ Microbiol 71: 1803-1810. Tilak KVBR, Ranganyaki N, Pal KK, De R, Saxena AK, et al. 2005. Diversity of plant growth and soil health supporting bacteria. Curr Sci 89: 136-150. Tjeerd van Rij E, Girard G, Lugtenberg BJJ, Bloemberg GV. 2005. Influence of fusaric acid on phenazine-1- carboxamide synthesis and gene expression of Pseudomonas chlororaphis strain PCL1391. Microbiology 151: 2805– 2814. Vasanthakumar A, McManus PS. 2004. Indole-3-acetic acid-producing bacteria are associated with cranberry stem gall. Phytopathology 94: 1164-1171. Viebahn M, Glandorf DCM, Ouwens TWM, Smit E, Leeflang P, et al. 2003. Repeated introduction of genetically modified Pseudomonas putida WCS358R without intensified effects on the indigenous microflora of field-grown wheat. Appl Environ Microbiol 6: 3110-3118. Vincent MN, Harrison LA, Brackin JM, Kovacevich PA, Mukerji P, et al. 1991. Genetic analysis of the antifungi activity of a soilborne Pseudomonas aureofaciens strain. Appl Environ Microbiol 57 : 2928-2934. Woitke M, Junge H, Schnitzler WH, 2004. Bacillus subtilis as growth promoter in hidroponically grown tomatoes under saline conditions. Prociding VII on Prot. Cult. Mild Winter Climates. Editor: Cantliffe DJ, Stoffella PJ, Shaw N. Acta Hort 659: 363-369 Woodward AW, Bartel B. 2005. Auxin: regulation, action and interaction. Annals Bot 95: 707-735. Wu SC, Cao ZH, Li ZG, Cheung KC, Wonga MH. 2005. Effects of biofertilizer containing N-fixer, P and K solubilizers and AM fungi on maize growth: a greenhouse trial. Geoderma 125: 155-166. Zahran HH. 1999. Rhizobium-Legume Symbiosis and Nitrogen Fixation under Severe Conditions and in an Arid Climate. Microbiol Mol Biol Rev 63: 968-989. Zakharova EA, Shcherbakov AA, Brudnik VV, Skripko NG, Bulkin NS, et al. 1999. Biosynthesis of indole-3-acetic acid in Azospirillum brasilense insights from quantum chemistry. Eur J Biochem 259: 572-576. Zhao Y, Hull AK, Gupta NR, Goss KA, Alonso J, et al. 2001. A role for flavin monooxygenase–like enzymes in auxin biosynthesis. Science 291 :306309.

LAMPIRAN

Lampiran 1

Data urutan nukleutida gen 16S-rRNA dari isolat Crb-3 dan hasil analisis BLASTN dengan data GenBank

A) Urutan nukleutida gen 16S-rRNA parsial dari isolat Crb-3 5 TGTCTCGCCC 65 GCTAGTGGGG 125 GAAAAGTGGG 185 TTGGTGAGGT 245 CACACTGGAA 305 CAATGGGCGA 365 ATCACTTTAA 425 CATAATAAGC 485 TAATCTGAAT 545 CCCGGACTCA

15 ACTACTTGTT 75 GTACAACGTT 135 GGTATCTTCT 195 AATGGCTCAC 255 CTGANACACT 315 AAGCCTGATC 375 GTTGGGAGGA 435 ACCGGCTAAC 495 TACTGGGCGT 555 ACCTGGGAAC

25 TCATCGGCGG 85 TTCCAAAGGA 145 GACCTCGCGC 205 CAAGGCGACG 265 GTCCATACTC 325 CAGCCATGCC 385 AGGGCAGTAA 445 TCTGTGCCAG 505 AAAGCGCGCG 565 TGCATCCAAA

35 ACGGGTGAGT 95 AACGCTAATA 155 TATCAGATGA 215 ATCCGTAACT 275 CTACGGGAGG 335 GCGTGTGTGA 395 GTTAATACCT 455 CAGCCGCGGT 515 TACGTGGATC 575 ACTGGCGAGC

45 AATGCCTAGG 105 CCGCATACGT 165 GCCTATGTCG 225 GGTCTGAGAG 285 CATCATTGGG 345 AGAAGGTCTT 405 TGCTGTTTTG 465 AATACAGAGG 525 GTTAACTTGG 585 TAGAGTACGG

55 AATCTCCCTG 115 CCTACGGGTA 175 GATTACCTAG 235 GATGATCATT 295 GAATATTGGA 355 CTGATTGTAA 415 ACGTTACCGA 475 GTGCAAGCGT 535 ATGTGAAAGC 595 TAAACGGTGG

B) Hasil BLASTN sekuen gen 16S-rRNA parsial dengan data GenBank gb|DQ095885.1| Pseudomonas monteilii strain R23 16S ribosomal RNA genes, partial sequence; Length=1429 Score = 819 bits (443), Expect = 0.0 Identities = 499/526 (94%), Gaps = 6/526 (1%); Strand=Plus/Plus Crb-3

15

P.mon R23

45

Crb-3

75

P.mon R23

103

Crb-3

135

P.mon R23

159

Crb-3

195

P.mon R23

219

Crb-3

255

P.mon R23

279

Crb-3

315

P.mon R23

339

Crb-3

375

P.mon R23

399

Crb-3

435

P.mon R23

459

Crb-3

495

P.mon R23

519

CTTGTTTCATCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTCCCTGGCTAGTGGGGGTAC |||| |||| ||||||||||||||||||||||||||||||| ||||| ||||||||| || CTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGG-TAGTGGGGG-AC AACGTTTTCCAAAGGAAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGTAGAAAAGTGGGGGTA ||||||||| ||||| |||||||||||||||||||||||||||| || |||||||||| | AACGTTTTCGAAAGG-AACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGG-AG-AAAGTGGGGG-A TCTTCTGACCTCGCGCTATCAGATGAGCCTATGTCGGATTACCTAGTTGGTGAGGTAATG ||||| |||||| |||||||||||||||||| ||||||||| |||||||||||||||||| TCTTCGGACCTCACGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATG GCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCATTCACACTGGAACTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||| GCTCACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGA GACACTGTCCATACTCCTACGGGAGGCATCATTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGC |||| ||||| |||||||||||||||| || |||||||||||||||||||||||||||| GACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGC CTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCTGATTGTAAATCACTTTAAGTTG ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||| |||||||||||| CTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTG GGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACATAATAAGCACCG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||||||| GGAGGAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCG GCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCTGAATTACT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||| GCTAACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACT GGGCGTAAAGCGCGCGTACGTGGATCGTTAACTTGGATGTGAAAGC |||||||||||||||||| |||| ||||||| |||||||||||||| GGGCGTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGC

540 564

74 102 134 158 194 218 254 278 314 338 374 398 434 458 494 518

Lampiran 2


A) Urutan nukleutida gen 16S-rRNA parsial dari isolat Crb-16 5 GGGCCACTCC 65 GGGGGACAAC 125 GACCTTCGGG 185 AGGCCTACCA 245 GAGACACGGT 305 GCCTGATCCA 365 TGGGAGGAAG 425 GGCTAACTTC 485 TGGGCGTAAA 545 TGGGGAACTG

15 ATGATTCAGC 75 GTTTCGAAAG 135 CCTTGCGCTA 195 AGGCGACGAT 255 CCAGACTCCT 315 GCCATGCCGC 375 GGCAGTAAGT 435 GTGCCAGCAG 495 CCCCCCATAA 555 CCTTCCTAAC

25 GGCGGACGGG 85 GAACGCTAAT 145 TCAGATGAGC 205 CCGTAACTGG 265 ACGGGAGGCA 325 GTGTGTGAAG 385 TAATACCTTG 445 CCCCGGTAAT 505 GGGGTTTGGT 565 CTGCCTGAAA

35 TGAGTAATGC 95 ACCGCATACG 155 CTAGGTCGGA 215 TCTGAGAGGA 275 GCAGTGGGGA 335 AAGGTCTTCG 395 CTGTTTTGAC 455 ACAAAGGGTG 515 AAAAAGGAAT 575 AAAAAAGGTA

45 CTAGGAATCT 105 TCCTACGGGA 165 TTACCTAGTT 225 TGATCAGTCA 285 ATATTGGACA 345 GATTGTAAAG 405 GTTCCAACAA 465 CAAGCGTTTT 525 GTGAAATCCC 585 AAAGGGGGGG

55 GCCTGGTAGT 115 GAAAGCAGGG 175 GGTGGGGTAA 235 CACTGGAACT 295 ATGGGCGAAA 355 CACTTTAATT 415 AATAAGCCCC 475 TCGGAATTAC 535 CGGGCTCACC 595 GGAATTTCCT

B) Hasil BLASTN sekuen gen 16S-rRNA parsial dengan data GenBank gb|EU375659.1| Pseudomonas sp. m41 16S ribosomal RNA gene, partial sequence Score = 907 bits (491), Expect = 0.0 Identities = 565/599 (94%), Gaps = 11/599 (1%); Strand=Plus/Plus Crb-16

67

P. M41

29

Crb-16

127

P. M41

89

Crb-16

187

P. M41

149

Crb-16

247

P. M41

209

Crb-16

307

P. M41

269

Crb-16

367

P. M41

329

Crb-16

427

P. M41

389

Crb-16

486

P. M41

449

Crb-16

546

P. M41

509

CTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCCATGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGA CAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTACCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCT ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||| CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCT

126 88 186 148 246 208

ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACA

306

CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA

366

TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAATTTGGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ||||||| TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAG

426

GAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTT-CCAACAAAATAAGCCCCGGCTA ||||||||||||||||||||||||||||||||||||| |||||| ||||||| ||||||| GAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCAACAGAATAAGCACCGGCTA

485

268

328

388

448

ACTTCGTGCCAGCAGCCCCGGTAATACAAAGGGTGCAAGCGTTTTTCGGAATTACTGGGC ||||||||||||||||| ||||||||| ||||||||||||||| ||||||||||||||| ACTTCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGAAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGC

545

GTAAACCCCCCATAAGG-GGTTTGGTAAAAAGGAATGTGAAATCCCCGGGCTCA-CCTGG ||||| | | | || || |||||||||| | ||| ||||||||||||||||||| ||||| GTAAAGCGCGCGTA-GGTGGTTTGGTAAGATGGA-TGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGG

603

508

566

Lampiran 3


A) Urutan nukleutida gen 16S-rRNA parsial dari isolat Crb-17 5 GCCCCGCCAC 65 AGTGGGGGAC 125 GGGGACCTTC 185 TAATGGCTCA 245 ACTGAGACAC 305 AAAGCCTGAT 365 AGTTGGGAGG 425 CACCGGCTAA 485 TTACTGGGCG 545 AACCTGGGAC

15 TCCTTGATTC 75 AACGTTTCGA 135 GGGCCTTGCG 195 CCAAGGCGAC 255 GGTCCAGACT 315 CCAGCCATGC 375 AAGGGCAGTA 435 CTCTGTGCCA 495 TAAAGCGCGC 555 TGCATCCAAA

25 AGCGGCGGAC 85 AAGGAACGCT 145 CTATCAGATG 205 GATCCGTAAC 265 CCTACGGGAG 325 CGCGTGTGTG 385 AGTTAATACC 445 GCAGCCGCGG 505 GTAGGTGGTT 565 ACTGGCGAGC

35 GGGTGAGTAA 95 AATACCGCAT 155 AGCCTAGGTC 215 TGGTCTGAGA 275 GCAGCAGTGG 335 AAGAAGGTCT 395 TTGCTGTTTT 455 TAATACAGAG 515 CGTTAAGTTG 575 TAGAGTACGG

45 TGCCTAGGAA 105 ACGTCCTACG 165 GGATTAGCTA 225 GGATGATCAG 285 GGAATATTGG 345 TCGGATTGTA 405 GACGTTACCG 465 GGTGCAAGCG 525 GATGTGAAAG 585 TAGAGGGTGG

55 TCTGCCTGGT 115 GGAGAAAGCA 175 GTTGGTGAGG 235 TCACACTGGA 295 ACAATGGGCG 355 AAGCACTTTA 415 ACAGAATAAG 475 TTAATCGGAA 535 CCCCGGGCTC 595 TGGAATTTCC

B) Hasil BLASTN sekuen gen 16S-rRNA parsial dengan data GenBank gb|EF544606.2| Pseudomonas plecoglossicida strain NyZ12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence; Length=1394 Score = 1086 bits (588), Expect = 0.0 Identities = 591/592 (99%), Gaps = 1/592 (0%) Strand=Plus/Plus Crb-17

10

P.pl NyZ12

25

Crb-17

70

P.pl NyZ12

85

Crb-17

130

P.pl NyZ12

145

Crb-17

190

P.pl NyZ12

205

Crb-17

250

P.pl NyZ12

265

Crb-17

310

P.pl NyZ12

325

Crb-17

370

P.pl NyZ12

385

Crb-17

430

P.pl NyZ12

445

Crb-17

490

P.pl NyZ12

505

CTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CTCCTTGATTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGCCTAGGAATCTGCCTGGTAGTGGGGGA

69

CAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CAACGTTTCGAAAGGAACGCTAATACCGCATACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGACCTT

129

CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGGCCTTGCGCTATCAGATGAGCCTAGGTCGGATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTC

189

ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACCAAGGCGACGATCCGTAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAACTGAGACA

249

CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| CGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGCGAAAGCCTGA

309

TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAG |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| TCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCACTTTAAGTTGGGAG

369

GAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GAAGGGCAGTAAGTTAATACCTTGCTGTTTTGACGTTACCGACAGAATAAGCACCGGCTA

429

ACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGC |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| ACTCTGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGC

489

GTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGA |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| GTAAAGCGCGCGTAGGTGGTTCGTTAAGTTGGATGTGAAAGCCCCGGGCTCAACCTGGGA

549

84

144

204

264

324

384

444

504

564

Lampiran 4


A) Urutan nukleutida gen 16S-rRNA parsial dari isolat Crb-44 5 GCACGCGCCA 65 CTCTGTCGTG 125 AAAGCAGGGG 185 GCGGGGTAAA 245 ACTGGAACTG 305 TGGGCGCAAG 365 CCTTTTGTTG 425 AATAAGCACC 485 TCGGAATTAC 545 GGGCTCACCT

15 TGCTCTCTGG 75 GGGGATAACG 135 ATCTTCGGAC 195 GGCCCACCAA 255 AGACACGGTC 315 CCTGATCCAG 375 GGAAAGAAAT 435 GGCTAACTTC 495 TGGGCGTAAA 555 GGGAACTGCA

25 GTGGCGAGTG 85 TAGGGAAACT 145 CTTGCGCGAT 205 GGCGACGATC 265 CAGACTCCTA 325 CCATACCGCG 385 CCAGCTGGCT 445 GTGCCAGCAG 505 GCGTGCGTAG 565 GTGGATACTG

35 GCGGACGGGT 95 TACGCTAATA 155 TGAATGAGCC 215 CGTAGCTGGT 275 CGGGAGGCAG 335 TGGGTGAAGA 395 AATACCCGGT 455 CCGCGGTAAT 515 GTGGTCGTTT 575 GGCGACTAGA

45 GAGGAATACA 105 CCGCATACGA 165 GATGTCGGAT 225 CTGAGAGGAT 285 CAGTGGGGAA 345 AGGCCTTCGG 405 TGGGATGACG 465 ACGAAGGGTG 525 AAGTCCGTTG 585 ATGTGGTAGA

55 TCGGAATCTA 115 CCTACGGGTG 175 TAGCTAGTTG 235 GATCAGCCAC 295 TATTGGACAA 355 GTTGTAAAGC 415 GTACCCAAAG 475 CAAGCGTTAC 535 TGAAAGCCCT 595 GGGTAGCGGA

B) Hasil BLASTN sekuen gen 16S-rRNA parsial dengan data GenBank >AB021406|AB021406.1 Pseudomonas beteli DNA for 16S rRNA, strain ATCC 19861T. Score = 1124 bits (567), Expect = 0.0 Identities = 586/591 (99%), Gaps = 1/591 (0%); Strand = Plus / Plus Crb-44

11

P. beteli

64

Crb-44

71

P. beteli Crb-44 P. beteli Crb-44 P. beteli Crb-44 P. beteli Crb-44 P. beteli Crb-44 P. beteli Crb-44 P. beteli Crb-44 P. beteli

tgctctctgggtggcgagtggcggacgggtgaggaatacatcggaatctactctgtcgtg 70 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| tgctctctgggtggcgagtggcggacgggtgaggaatacatcggaatctactctgtcgtg 123

ggggataacgtagggaaacttacgctaataccgcatacgacctacgggtgaaagcagggg 130 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 124 ggggataacgtagggaaacttacgctaataccgcatacgacctacgggtgaaagcagggg 183 131 atcttcggaccttgcgcgattgaatgagccgatgtcggattagctagttggcggggtaaa 190 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 184 atcttcggaccttgcgcgattgaatgagccgatgtcggattagctagttggcggggtaaa 243 191 ggcccaccaaggcgacgatccgtagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactg 250 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 244 ggcccaccaaggcgacgatccgtagctggtctgagaggatgatcagccacactggaactg 303 251 agacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaag 310 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 304 agacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgcaag 363 311 cctgatccagccataccgcgtgggtgaagaaggccttcgggttgtaaagcccttttgttg 370 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 364 cctgatccagccataccgcgtgggtgaagaaggccttcgggttgtaaagcccttttgttg 423 371 ggaaagaaatccagctggctaatacccggttgggatgacggtacccaaagaataagcacc 430 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 424 ggaaagaaatccagctggctaatacccggttgggatgacggtacccaaagaataagcacc 483 431 ggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttactcggaattac 490 |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||| 484 ggctaacttcgtgccagcagccgcggtaatacgaagggtgcaagcgttactcggaattac 543 491 tgggcgtaaagcgtgcgtaggtggtcgtttaagtccgttgtgaaagccctgggctc-acc 549 ||||||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||| ||| 544 tgggcgtaaagcgtgcgtaggtggttatttaagtccgttgtgaaagccctgggctcaacc 603

ANALISIS KARAKTER PSEUDOMONAS SP. SEBAGAI AGEN PEMACU PERTUMBUHAN TANAMAN DAN BIOKONTROL FUNGI PATOGEN RIKA INDRI ASTUTI G

Recommend Documents