Analisa Mikrosatelit dalam Bioteknologi Reproduksi Ternak (Suatu Kajian Pustaka)

Analisa Mikrosatelit dalam Bioteknologi Reproduksi Ternak (Suatu Kajian Pustaka) (Microsatellite analysis in biotechnology of animal reproduction) (A Review) 1

Siti Darodjah Rasad1 Laboratorium Reproduksi Ternak, Fakultas Peternakan, Unpad

ABSTRACT In year 1970 was found nucleotide sequence which have repeated sequence of nucleotide. with high polymorh and using PCR could be amplified. That sequenz of nucleotide called Microsatelite. Microsatelite consist of 1 – 6 repeated nucleotide, which is CA repeated as mostly a repeated DNA in the animal (Tautz and Renz, 1984). Based on difference of long and amount ofrepeated nucleotide, there are three kind of DNA satelite, midi-, mini- and microsatelite

(Matiat and Vergmaud, 1982). Microsatelite analysis was used to analyse of paternity and identity of animal, which was done as a conventional analysis with blood group analysis. The advantage of microsatelite analysis compare to blood group system are the exclution probability was high (EXP 99.9%), needs small sampel (tissues, sperm or follicel of hair), could be use for all animal without special age and possible for died animal.

Key words : Microsatelite analysis, paternity, reproductive biotechnolgy

2009 Agripet : Vol (9) No. 2: 49-54 PENDAHULUAN1 Karakteristik dan Fungsi Marker Mikrosatelit Karakteristik dan fungsi mikrosatelit marker yang selalu berulang tidak secara jelas dapat diterangkan. Banyak sekali teori-teori yang mengemukakan akan hal tersebut. Dengan demikian dapat diduga bahwa terjadinya pengulangan tersebut selama proses replikasi dimana adanya penyimpangan untai polimerase sebagai akibat terjadinya kesalahan dalam pembentukan nukleotida (Levinson and Gutman, 1987; Schlötterer and Tautz, 1992). Gordenin et al. (1997) dalam penelitiannya telah berhasil melihat bagian dari struktur potongan rambut dengan metode Okazaki. Selain itu adanya ketidak seimbangan penempatan kromosom untai DNA melalui crossing over selama proses replikasi, sama seperti halnya perpanjangan untai DNA masih merupakan hal yang didiskusikan para peneliti. Adapun tugas dari Mikrosatelit tersebut adalah melakukan pengaturan ekspresi gen (Naylor and Clark, 1990), sedangkan fungsinya sama seperti rekombinan dari DNA (Pennisi,

Corresponding author: [email protected]

1998). Fu et al. (1991), Klesert et al. (1997) and Thornton et al. (1997) menunjukkan adanya keterkaitan dari mikrosatelit dengan kesehatan atau penyakit. Susunan dari Mikrosatelit Mikrosatelit adalah urutan DNA dalam genom yang mempunyai sifat bertulang (Short Tandem Repeat/STR) dan dibentuk dari monohingga hexanukleotida Motiv, dimana kebanyakan terletak pada daerah Genom yang tidak di kode. Mikrosatelit mempunyai karakter sangat polimorf dengan rata-rata 11 hingga 12 alel, dimana untuk singel alel bervariasi tergantung dari perbedaan jumlah pengulangannya (Tautz and Renz, 1984; Litt and Luty, 1989; Weber and May, 1989). Setiap mikrosatelit akan membentuk kombinasi susunan nukleotida yang berulang di dalam motive, dimana yang sering muncul adalah pengulangan susunan CA-CA-CA-GT-GT-GT (Hamada et al, 1984; Tautz and Renz, 1984; Wintero et al, 1992). Penurunan atau pewarisan karakter mikrosatelit diketahui setelah ditetapkannya Hukum Mendel dan adanya angka mutasi sekitar 10-3 (Jeffreys et al., 1988). Dengan demikian angka mutasi untuk susunan DNA

Agripet Vol 9, No. 2, Oktober 2009

49

(CA)n(GT)n dimer pada manusia adalah 5 x 104 (Ellegren, 1995). Ditinjau dari jenis pengulangannya, Mikrosatelit terbagi menjadi tiga jenis, yaitu pengulangan sempurna, pengulangan tidak sempurna dan pengulangan campuran keduanya (Weber, 1990). Pada pengulangan sempurna, pada urutan sekuen DNA, tidak terjadi penghentian pengulangan di bagian tengah urutan sekuen DNA nya, sedangkan pada pengulangan tidak sempurna merupakan kebalikan dari pengulangan sempurna, dimana di bagian tengah urutan sekuen akan terjadi penghentian pengulangan, dan selanjutnya dibagian lain muncul kembali pengulangan nukleotida tersebut. Sedangkan pada jenis ketiga adalah campuran ke dua jenis pengulangan tersebut. Sebagai contoh susunan DNA yang mengandung mikrosatelit dapat dilihat pada Gambar 1. Pada gambar 1 tersebut,

Untuk lebih meyakinkan pengamatan, maka dapat dilakukan teknik pewarnaan dengan pewarna fluoresens, sehingga produk PCR hasil elektroforesa akan dapat lebih jelas terlihat (Smith et al, 1986; Diehl et al, 1990; Nie et al, 1991). Selanjutnya dengan menggunakan bantuan program computer, maka produk hasil pewarnaan yang timbul berupa pita-pita dapat dikonversi dalam bentuk nilai atau angka yang menunjukkan berbagai besaran fragmen. Dengan demikian, dengan metode ini dapat dilakukan penghitungan berbagai sampel dan selanjutnya dilakukan analisa genotipenya (Cornnell et al, 1987; Ziegle et al, 1992). Pada Gambar 2. dan 3 dapat dilihat berupa proses pewarnaan elektroforesa dan produk PCR berupa pita-pita fragmen yang dihasilkan.

terlihat susunan mikrosatelit dengan pengulangan DNA berupa CA.CA.Ca. dan seterusnya.

Gambar

1.

Susunan Nucleotida Mikrosatelite (CA.CA.CA.Ca) (Sonnentag, et al., 2009)

Penampilan Ekspresi Mikrosatelit Secara teknis, ekspresi urutan alel mikrosatelit dapat ditunjukan dengan bantuan alat PCR (Polymerase Chain Reaction). Segera setelah dilakukan penggandaan alel mikrosatelit dengan metode PCR tersebut, pemisahan alel tersebut dapat diketahui dengan bantuan gel elektroforesa. Pada hasil yang duperoleh melalui gel elektroforesa tersebut, urutan sekuen nukleotida spesifik akan terbentuk dan terlihat, dimana dapat dibandingkan dengan bagian komplemennya sebagai kontrol pembanding berupa primer starter oligonukleotida pada reaksi PCR (Mullis and Faloona, 1987; Saiki et al, 1988). Fragmen hasil dari PCR akhirnya memperlihatkan jumlah pengulangan yang timbulnya (Litt and Luty, 1989; Weber and May, 1989).

Gambar 2. Contoh pewarnaan Elektroforesa (Sonnentag, et al., 2009)

Gambar 3. Produk hasil PCR dengan Elektroforesa (Sonnentag, et al., 2009)

Aplikasi Analisa Mikrosatelit untuk Pengujian Kekerabatan Ternak Babi Analisa Mikrosatelit dapat digunakan dalam rangka pengujian tingkat kekerabatan pada berbagai ternak. Hal ini disebabkan mikrosatelit mempunyai karakter kodominan dan akan diwariskan pada keturunannya. Dengan demikian, sejumlah alel akan diekspresikan dan mikrosatelit ini merupakan marker atau pencirian genetik yang sangat informativ untuk digunakan dalam pengujian kekerabatan atau uji keturunan (Jamieson and Taylor, 1997). Baumung et al. (2004) menyatakan bahwa penggunaan mikro-satelit

Analisa Mikrosatelit dalam Bioteknologi Reproduksi Ternak (Suatu Kajian Pustaka (Dr. Agr. Ir. Siti Darodjah Rasad, MS)

50

merupakan metode standar untuk menduga keragaman genetik (gentic diversity) pada ternak. Hal ini diperkuat oleh hasil penelitian Diez-Tascon et al. (2000), Arranz et al. (2001), Rendo et al. (2004), Alvarez et al. (2004) yang telah melakukan analisa mikrosatelit pada sekelompok kecil ternak kambing. Pada babi, mikrosatelit telah banyak digunakan pada penelitian biodiversitas baik pada bangsa komersial maupun bangsa liar (Groenen et al., 2003). Penggunaan analisa mikrosatelit sebagai uji keturunan pada ternak Kuda sudah secara rutin digunakan diberbagai laboratorium dan balai penelitian. Pada Sapi dan Anjing, pengujian ini telah ditawarkan secara pengujian komersial. Berbagai penelitian telah dilakukan, terutama mengenai keuntungan dan kemungkinan analisa mikrosatelit sebagai alat kontrol keturunan dan tingkat kekerabatan pada berbagai ternak. Sebagai contoh pada Kuda (Bowling et al, 1997 and Hertner et al, 1999), Sapi (Glowatzki-Mullis et al, 1995; Usha et al, 1995 and Heyen et al, 1997), Anjing (Binns et al, 1995; Fredholm and Wintero, 1996 and Koskinen and Bredbacka, 1999) serta Babi (Hohenhörst et al, 1994 and van Zeveren et al, 1995). Analisa mikrosatelit pada tiga bangsa babi telah diteliti oleh Rasad (2001) dengan menggunakan 25 marker mikrosatelit. Dari hasil penelitiannya telah dapat dihasilkan tiga kelompok marker PCR masing-masing terdiri dari lima marker mikrosatelit yang dapat digunakan untuk menguji tingkat kekerabatan dan identitas tiga bangsa babi (Deutsche Edelschwein/DE, Deutsche Landrace/DL dan Pitrain), dimana dari analisa mikriosatelit tersebut dihasil angka EXP 99,9%. Adapun susunan marker mikrosatelit tersebut seperti tertera pada tabel 1 berikut. Tabel 1. Susunan Marker Mikrosatelit untuk Uji Kekerabatan dan Identitas Ternak Babi Multiplex-PCR 1

Multiplex-PCR 2

SW936

SW240

Multiplex-PCR 3 S0026

SW857

S0101

SW951

S0115

S0355

S0225

CGA

SW122

S0227

S0068

SW911

S0178

Keunggulan analisa mikrosatelit Adapun keunggulan dari analisa mikrosatelit, bila dibandingkan dengan analisa golongan darah, adalah tingkat kecermatan dan ketelitiannya yang lebih dengan hanya menggunakan sedikit penciri atau marker pada analisa mikrosatelit, dimana tingkat ketepatan pengujian keturunan dengan metode atau analisa mikrosatelit tinggi (EXP 99,9%) dibandingkan dengan sistem golongan darah. Dengan demikian dari segi ekonomis, jauh lebih ekonomis metode analisa mikrosatelit serta secara teknis pelaksanaan lebih sederhana tanpa diperlukan sampel serum sebagai bahan test dalam hal ini sampel darah, yang akan menimbulkan efek stres pada ternak saat pengambilan darah sebagai bahan sampel pengujian. Analisa ini juga memungkinkan untuk analisa produk hasil ternak seperti daging (Hohenhörst et al., 1994; Lauk, 1999). Keunggulan lain adalah, untuk pengujian kekerabatan dengan metode analisa mikrosatelit, sampel yang diperlukan selain sedikit sampel darah, juga dapat digunakan sampel sel, berupa sel sperma, jaringan, atau folikel rambut. Dari aspek umur ternak, tidak ada batasan umur ternak, bahkan ternak yang telah matipun dapat diuji. Dengan demikian sampel yang diperlukan sangat mudah didapat, dengan jumlah sampel yang sedikit, dan dengan bantuan PCR, alat sekuenser serta program computer, analisa kekerabatan dan uji keturunan dapat dilakukan dengan praktis (Hohenhörst, 1997). Perhitungan Produk Analisa Mikrosatelit Pada analisa mikrosatelit, selanjutnya produk yang dihasilkan dari PCR akan dianalisa dengan bantuan alat sekuenser, sehingga dapat diketahui urutan alel yang dihasilkan, yaitu berupa pita-pita nukleotida. Dari tampilan analisa sekuenser tersebut, dapat dihitung setiap alel spesifik yang terekspresi dari sampel yang diuji. Hal ini dikarenakan kodominan alel yang diwariskan pada keturunan harus berasal dari 50% induk dan 50% dari bapaknya. Dengan demikian alel yang diekspresikan pada keturunan atau anak, sebagian akan berasal dari induk (50%) dan sebagian dari bapak (50%). Dari tampilan pita-pita alel keturunan yang muncul, dapat dibandingkan dengan


51

DNA sampel yang berasal baik dari induk maupun bapaknya. Berdasarkan pembandingan tersebut, urutan alel dari keturunan atau anak, dapat diidentifikasi dan dianalisa sejauh mana tingkat kekerabatan dan keturunan anak tersebut. Berdasarkan alel yang muncul, dapat juga dianalisa, tingkat ketepatan diagnosa atau uji kekerabatan dari sampel yang diuji, dalam hal ini berapa prosentase ketepatan dari uji tersebut untuk dapat diyakini, bahwa hasil yang diperoleh mendekati 100%. Selanjutnya untuk menguji apakah mikrosatelit tersebut dapat digunakan sebagai marker dalam uji keturunan dan identitas ternak dilakukan penghitungan EXP (Exclusion Probability) dan kombinasi EXP (cEXP) ) (Botstein et al., 1980). Sehingga, pengujian tersebut lebih meyakinkan apakah sampel tersebut benar-benar sesuai dengan pola yang diturunkan dari kedua tetuanya. Adapun rumus penentuan EXP adalah sebagai berikut : dimana : z

EXP

Pu(1 Pu)2 1 / 2

u 1

P ,P u

z 1

z

Pu 2 Pv 2 (4 3Pu 3Pv)

u 1v u 1

v

: Jumlah Alel : Tingkat kemunculan relative alel ke u dan ke v pada lokus k

2N 1

H

i 1 e

P

2 i

2N 1

Selain itu, melalui analisa mikrosatelit tersebut, dimana dari hasil PCR dapat dilakukan penghitungan heterosigositas dari suatu populasi, yang didapatkan dari frekuensi dan jumlah alel yang dihasilkan berdasarkan rumus yang dikemukakan oleh Nei (1987) sebagai berikut : dimana : He : Heterozygositas k : Jumlah Alel Pi : Frekuensi Alel dari Alel ke i N : Jumlah Sampel Ternak

KESIMPULAN Dari uraian tersebut, maka dapat ditarik kesimpulan sebagai berikut : 1. Analisa Mikrosatelit dapat digunakan untuk pengujian keturunan dan tingkat kekerabatan pada ternak 2. Analisa Mikrosatelit merupakan metode analisa yang mempunyai tingkat ketepatan tinggi dengan analisa yang simpel, mudah dan menggunakan sedikit sampel 3. Analisa Mikrosatelit secara aplikasi dapat diterapkan dalam rangka seleksi ternak yang lebih ekonomis karena hasil yang diperoleh tidak memerlukan waktu lama DAFTAR PUSTAKA Alvarez, I., Royo, L.J., Fernandez, I., Gutierez, J.P., Gomez, E., Goyache, F., 2004. Genetic relationships and admixture among sheep breeds from Northern Spain assessed using microsatellites. Journal of Anim. Sci. 82: 2246-2252 Arranz, J.J., Bayon, Y., San Primotivo, 2001. Differentiation among Spanish sheep breeds using microsatellites. Gen. Selec. Evol. 33: 529-542 Baumung, R., Siminier, H., Hoffmann, I., 2004. Genetic diversity studies in farm animals – a survey. J. of Anm. Breed. and Gen. 121: 361-373 Binns, M.M., Holmes, N.G., Marti, E., and Bowen, N., 1995. Dog parentage testing uaing Canine microsatelite. J. of Small Anim. Pract. 36: 493-497 Botstein, D., White, R.L., Skolnick, M., Davis RW., 1980. Construction of a genetic linkage map using restriction fragment length polymorphism. Am. J. of Hum. Gen. 32: 314-331 Bowling A.T., Eggleston, M.L., Byrns, G., Clark, R.S., de Leanis, S., Wictum, E., 1997. Validation of microsatellite markers for routine horse parentage testing. Anim. Gen. 28: 247- 252 Cornnell, C., 1987. Automated DNA sequence analysis. Bio Tech. 5: 342-348 Diehl, S.R., Ziege, J., Buck, G.A., Reynolds, T.R. and Weber, J.L., 1990. Automnated genotyping of human DNA polymorphism. Am. J. of Hum. Gen. 49: 746-756


52

Diez-Tascon, C., Littlejohn, R.P., Almeida, P.A., Crawford, A.M., 2000. Genetic variation within the Merino sheep breeds: analysis of closely related populations using microsatellites. Anim. Gen. 31: 243-251 Ellegren, H., 1995. Mutation rates at porcine microsatellite loci. Mammalian Genome 6: 376-377 Fredholm, M., and Wintero, A.K., 1996. Efficient resolution of parentage in dogs by amplification of Microsatellites. Anim. Gen. 27: 19-23 Fu, Y.H., Kuhl, D.P.A., Pizzutii, M., Pieretti, M., Sutcliffe, J.S., Richards, S., Verkerk, A., Holden, J., Fenwick, R., and Warren, S.T., 1991. Variation of the CGG repeat at the fragile X Site result in genetic instability: Resolution of the Sherman paradox. Cell. 67: 1047-1058 Glowatski-Mulli, M.L, Gaillard, C., Wigger, G, Fries, R., 1995. Microsatellite based parentage control in cattle. Anim. Gen. 26: 7-12 Gordenin, D.A., Kunkel, T.A., Resnick, M.A., 1997. Repeat expansion all in a flap. Nat. Gen. 16: 116-118 Groenen M.A.M., Joosten, R., Boscher, M.Y., Amigues, Y., Rattink, A., Harlizius, B., van der Poel, J.J. and Crooijmans, R., 2003. The use of microsatellite grnotyping for population studies in the pig with individual and pooled DNA samples. Arch. Zoo. 52: 145-155 Hamada, H., Petrino, M.G., Kakunaga, T., Seidman, M. and Stollar, B.D., 1984. Charakterization of poly(dT-dG). poly(dC-dA) sequences: structure, organization and corformation. Mol. and Cell. Biol. 4(12): 2610-2621 Hertner, U., Ruβ, I. and Förster, M., 1999. DNA-Typisierung – die Methode der Zukunft. Arab. J. 5: 46-50 Heyen, D.W, Beever, J.E, Da, Y., Evert, R.E., Green, C., Bates, S.R.E., Ziegle, J.S. and Lewin, H.A., 1997. Exclusion probabilities of 22 bovine microsatellite markers in fluorescent multiplexes for semiautomated parentage testing. Animal Genetics 28: 21-27

Hohenhörst, J., Fries, R., Vögeli, P. and Stranzinger, G., 1994. Use microsatellites for parentage control in pigs. Anim. Gen. 25 (Suppl.2): 33 Hohenhörst, J., 1997. Hochpolymorph DNAMarkerloci im Schweinegenom und ihre Verwendung für die Abstammungs-kontrole, Characterisierung von Schweine-rassen und Kartierung von Blutgruppenloci. Dissertation, Eidgenössischtechnische Hochschule Zürich Jamieson, A. and Taylor, S.C.S., 1997. Comparisons of three probability formulae for parentage exclusion. Anim. Gen. 28: 397-400 Jeffreys, A.J., Royle, N.J., Wilson, V. and Wong, Z., 1988. Spontaneous mutation rates to new length alleles at tandemrepetitive hypervariable loci in human DNA. Nat. 332: 278-281 Klesert, R.T., Otten, A.D., Bird, T.D. and Tapscott, S.J., 1997. Trinucleotide repeat expansion at the myotonic locus reduces expression of DMAHP. Nat. Gen. 16: 402-406 Koskinen, M.T. and Bredbacka, P., 1999. A convenient and efficient microsatellite based assay for resolving parentages in dogs. Anim. Gen. 30: 148-149 Lauk, C., 1999. Abstammungsbegutachtung bei Lamas und Alpakas. Lamas: 8-9 Levinson, G. and Gutman, G.A., 1987. Slipped strand mispairing: a major mechanism for DNA sequence evolution. Mol and Biol. Evol. 4: 203-221 Litt, M. and Luty, J.A., 1989. A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene. Am. J. of Hum. Gen. 44: 397-401 Mullis, K.B. and Faloona, F.A., 1987. Specific synthesis of DNA in vitro polymerase catalyzed chain reaction. Meth. of Enz. 155: 335-350 Naylor, L.H. and Clark, E.M., 1990. d(TG) n.d (CA)n sequences upstream of the rat prolactin gene Z-DNA and inhibits gene transcription. Necl. Acids Res. 18: 1594-1601


53

Nei, M., 1973. Analysis of gene diversity in subdivided populations. In: Proceedings of Nature Academic Science. USA 70. pp: 3321-3323 Nie, L., Ziele, S., Su, Y., Meyer, J., MacLean, C., McBride, L., Kronick, M. and Diehl, S., 1991. Automated genotyping of highly polymorphic human DNA markers: Progress in multiplexing and optimal locus combination strategies. Am. J. of Hum. Gen. 49(Suppl.): 366 Pennisi, E., 1998. How the genome readies itself for evolution. Sci. 281: 11311134 Rasad, S.D., 2001. Abstammungs-und Identitätskontrole beim Schwein mittels microsatelitenanalyse. Dissertation PhD, Bonn University, Cuvillier, Goettingen. Rendo, F., Iriondo, M., Jugo, M.B., Mazon, L.L., Aguirre, A., Vicario, A. and Estonba, A., 2004. Tracking diversity and differentiation in six sheep breeds from north Iberian Penninsula through DNA variation. Small Ruminant Research. 52: 196-202 Saiki, R.K, Gelfund, D.H, Stoffel, S., Scharf, S.J., Higuchi, R., Horn, G.T., Mullis, K.B. and Erlich, H.A., 1988. Primerdirected enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Sci. 239: 487-491 Schlötterer, C. and Tautz, D., 1992. Slippe synthesis of simple sequence DNA. Nuc. Acid Res. 20: 211-215 Smith, L.M., Sanders, J.Z., Kaiser, R.J., Hughes, P., Dodd, C., Connell, C.R., Heiner, C., Kent, S.B.H. and Hood, L.E., 1986. Fluorescence detection in automated DNA sequence analysis. Nat. 321: 674-679 Sonnentag, J., Ronald, L.C., Martin, W., William, K. H., 2009. El Niño and Marine Iguana (Amblyrhynchus cristatus) Reproduction and Genetics. http://www.geocities.com/jsonnentag/i guana/gelrun.htm Tautz, D. and Renz, M., 1984. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukaryotic genomes. Nuc. Acids Res. 12: 389-399

Thornton, C.A., Wymer, J.P., Simmons, Z., McClain, C. and Moxleylli, R.T., 1997. Expansion of the myotonic dystrophy CTG repeat reduces expression of the flanking DMAHP gene. Nat. Gen. 16: 407-409 Usha, A.P., Simpson, S.P. and Williams, J.L., 1995. Probability of random sire exclusion using microsatellite markers for parentage verification. Animal Genetics 26: 155-161 Van Zeveren, A., Peelman, A., Van de Weghe, A. and Bouquet, Y., 1995. A genetic study of four Belgian pig populations by mean of seven microsatellite loci. J. Anim. Breed. and Gen. 112: 191-204 Weber, J.L. and May, P.E., 1989. Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction. Am. J. of Hum. Gen. 44: 388-396 Weber, J.L., 1990. Informativeness of human (dC-dA)n.(dG-dT)n polymorphisms. Genom. 7: 524-530 Wintero, A.K., Fredholm, M. and Thomsen, P.D., 1992. Variable (dG-dT)n.(dCdA)n sequences in the porcine genome. Genom. 12: 281-288 Ziegle, J.S., Su, Y., Corcoran, K.P., Nie, L., Mayrand, P.E., Hoff, L.B., McBride, L.J., Kronick, M.N. and Diehl, S.R., 1992. Application of automated DNA sizing technology for genotyping microsatellite loci. Genom. 14: 10261031


54

Analisa Mikrosatelit dalam Bioteknologi Reproduksi Ternak (Suatu Kajian Pustaka)

Recommend Documents