AKTIVITAS SELULOLITIK BEBERAPA KAPANG
MUCHAMMAD ZAINAL ARIEF
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
ABSTRAK MUCHAMMAD ZAINAL ARIEF. Aktivitas Selulolitik beberapa Kapang. Dibimbing oleh GAYUH RAHAYU dan ANJA MERYANDINI. Selulosa adalah komponen utama penyusun dinding sel tumbuhan dan merupakan biopolimer yang jumlahnya paling melimpah di alam. Selulosa di alam didegradasi oleh mikroorganisme dengan memproduksi enzim selulase yang terdiri atas endoglukanase, eksoglukanase, dan selobiase. Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan selulolitik beberapa isolat kapang. Sebanyak 42 isolat kapang diuji aktivitas selulolitiknya pada media agar-agar CMC. T. reesei QM6a digunakan sebagai isolat pembanding. Aspergillus niger, Aspergillus ornatus, dan Paecilomyces sp. memiliki indeks selulolitik pada media agar-agar CMC yang relatif lebih tinggi daripada isolat yang lain. Aktivitas CMC-ase A. niger dan A. ornatus optimum pada hari ke-3, CMC-ase Paecilomyces sp. optimum pada hari ke-5, sedangkan T. reesei QM6a optimum pada hari ke-2. Aktivitas CMC-ase, avisel-ase dan FP-ase tertinggi dimiliki oleh A. ornatus dengan nilai masing-masing yaitu 0.550 nkat/ml, 0.077 nkat/ml, dan 0.255 nkat/ml. Aktivitas CMC-ase A. ornatus mencapai optimum pada suhu 30 0C, sedangkan tingkat kemasaman optimumnya adalah pH 7. ABSTRACT MUCHAMMAD ZAINAL ARIEF. Cellulolytic Activity of Some Molds. Under supervisor GAYUH RAHAYU and ANJA MERYANDINI. Cellulose is the main component of cell wall of plants and it is the most abundant biopolymer on earth. Generally, cellulose is degraded by microorganisms-producing cellulase. The enzyme consists of endoglucanase, exoglucanase, and cellobiase. The aim of this research was to study the cellulolytic’s ability of some molds. Fourty two fungal isolates were first examined of their cellulolytic’s ability on CMC agar. T. reesei QM6a was used as comparison strain. Certain isolate of Aspergillus niger, Aspergillus ornatus, and Paecilomyces sp. have cellulolytic index that were higher than those of other isolates. The optimum activity for CMC-ase of A. niger and A. ornatus occurred on 3 days incubation, while those of Paecilomyces sp. and T. reesei QM6a was 5 days and 2 days incubation, respectively. Of those species, A ornatus showed the highest activity of CMC-ase (0.550 nkat/ml), avisel-ase (0.077 nkat/ml), and FP-ase (0.255 nkat/ml). The optimum temperature for CMC-ase activity of A. ornatus was 30 0C, while the optimum acidity was 7.
AKTIVITAS SELULOLITIK BEBERAPA KAPANG
MUCHAMMAD ZAINAL ARIEF
Skripsi sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Sains pada Departemen Biologi
DEPARTEMEN BIOLOGI FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM INSTITUT PERTANIAN BOGOR BOGOR 2009
Judul Nama NIM
: Aktivitas Selulolitik beberapa Kapang : Muchammad Zainal Arief : G34104047
Menyetujui:
Pembimbing I,
Pembimbing II,
Dr. Ir. Gayuh Rahayu NIP. 19580105 198303 2002
Dr. Anja Meryandini, MS NIP. 19620327 198703 2001
Mengetahui: Dekan Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam Institut Pertanian Bogor
Dr. Drh. Hasim, DEA NIP. 19610328 198601 1002
Tanggal lulus :
PRAKATA Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Allah SWT atas segala karunia-Nya sehingga penulis dapat menyeleseikan karya ilmiah yang berjudul Aktivitas Selulolitik beberapa Kapang. Karya ilmiah ini dilaksanakan sejak bulan Maret hingga Desember 2008, bertempat di Laboratorium Mikologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB. Terima kasih penulis ucapkan kepada Ibu Dr. Ir. Gayuh Rahayu dan Ibu Dr. Anja Meryandini MS yang telah membantu memberikan bimbingan, saran, motivasi, dan fasilitas selama penelitian dan penyusunan karya ilmiah ini. Ucapan terima kasih kepada Bapak Dr. Ir. Achmad Farajallah M.Si selaku dosen penguji yang telah memberikan saran dan kritik untuk perbaikan skripsi ini. Penulis juga mengucapkan terima kasih kepada staf Laboratorium Mikologi FMIPA IPB yang telah membantu penulis dalam melaksanakan penelitian ini. Ungkapan terima kasih juga penulis ucapkan kepada keluarga tercinta, Ibu, Bapak, Mas Mamat, Hepi, dan Imam atas segala doa, kasih sayang, dan motivasi yang diberikan. Terima kasih juga penulis ucapkan kepada Arif Pambudi, Syamsul Bahri, Andik Wijayanto, Kusnandar, Rina Puspitasari, Tahira, Ibu Asti, Nurul Hidayati, teman-teman seperjuangan di Laboratorium Mikologi, dan Wisma Delapan atas kerjasama, kebersamaan, kekompakan, dan kekeluargaannya. Semoga karya ilmiah ini bermanfaat.
Bogor, Juni 2009
Muchammad Zainal Arief
RIWAYAT HIDUP Penulis dilahirkan pada tanggal 14 Januari 1986 di Wonosobo, Jawa Tengah, putra dari Bapak Robikun dan Ibu Rodhiyah. Penulis merupakan anak kedua dari empat bersaudara. Tahun 1998 penulis lulus dari SDN Sambek 1, tahun 2001 lulus dari SMPN 2 Wonosobo, kemudian melanjutkan ke SMAN 1 Wonosobo. Tahun 2004 lulus dari SMAN 1 Wonosobo dan di tahun yang sama penulis diterima sebagai mahasiswa Departemen Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor melalui jalur Undangan Seleksi Masuk IPB (USMI). Selama mengikuti perkuliahan di IPB, penulis pernah menjadi asisten praktikum Fisiologi Tumbuhan Dasar, asisten praktikum Biologi Dasar, dan pengajar biologi di salah satu lembaga bimbingan belajar swasta di Bogor, serta pernah menjadi asisten Studi Lapangan di Situ Gunung, Sukabumi, Jawa Barat. Penulis juga aktif di Himpunan Mahasiswa Biologi (Himabio) sebagai ketua Wahana Muslim Himabio (WMH) tahun 2007/2008 dan anggota Divisi Jamur Bioworld 2006/2008.
DAFTAR ISI DAFTAR TABEL .................................................................................................................. viii DAFTAR GAMBAR ............................................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................................................ viii PENDAHULUAN ....................................................................................................................... 1 Latar Belakang ........................................................................................................................ 1 Tujuan .................................................................................................................................... 1 Waktu dan Tempat .................................................................................................................. 1 BAHAN DAN METODE ............................................................................................................ 1 Bahan dan Alat........................................................................................................................ 1 Metode.................................................................................................................................... 1 HASIL ........................................................................................................................................ 2 Aktivitas selulase kualitatif beberapa isolat kapang .................................................................. 2 Periode inkubasi optimum produksi ......................................................................................... 2 Aktivitas CMC-ase , Avisel-ase, dan FP-ase. ........................................................................... 3 Suhu dan pH optimum aktivitas selulase Aspergillus ornatus dan Paecilomyces sp. .................. 3 Kadar protein dan aktivitas spesifik enzim ............................................................................... 3 PEMBAHASAN.......................................................................................................................... 5 SIMPULAN ................................................................................................................................ 6 SARAN ....................................................................................................................................... 6 DAFTAR PUSTAKA .................................................................................................................. 6 LAMPIRAN ................................................................................................................................ 8
DAFTAR TABEL Halaman 1 Nilai indeks zona bening isolat Aspergillus niger, Paecilomyces sp., Aspergillus ornatus dan T. reesei QM6a yang diikubasi pada media agar-agar CMC 1 % selama tiga hari ............. 4 2 Aktivitas CMC-ase, avisel-ase, dan FP-ase. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M). ............................................................................ 4 3 Pengaruh suhu pada aktivitas CMC-ase isolat Paecilomyces sp. dan Aspergillus ornatus yang ditumbuhkan di media cair CMC 1 %, pH 7 ............................................................................ 4 4 Pengaruh pH pada aktivitas CMC-ase isolat Paecilomyces sp. dan Aspergillus ornatus yang ditumbuhkan pada media cair CMC 1 % pada suhu 300 ........................................................... 4 5 Aktivitas spesifik CMC-ase pada periode optimum produksi.................................................... 4
DAFTAR GAMBAR Halaman 1 Kurva aktivitas selulase isolat T. reesei QM6a. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M) .................................................................................................... 3 2 Kurva aktivitas selulase isolat Aspergillus niger. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M). ................................................................................................... 3 3 Kurva aktivitas selulase isolat Aspergillus ornatus. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M). ........................................................................................... 3 4 Kurva aktivitas selulase isolat Paecilomyces sp. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M). ................................................................................................... 3
DAFTAR LAMPIRAN Halaman 1 Tabel nilai indeks selulolitik 43 isolat kapang ............................................................................ 9 2 Kurva standar protein pada panjang gelombang 595 nm........................................................... 10 3 Kurva standar glukosa pada panjang gelombang 540 nm.............................................................10 4 Komposisi media CMC 1% dan ADK dalam 1 liter akuades…………………………...………10 5 Komposisi DNS.…………………………………………………………………………………11 6 Komposisi bufer sitrat pH 3, 4, dan 5; 0.2M…………………………………………………….11 7 Komposisi bufer fosfat pH 6.0 dan 7.0; 0.2M…………………………………………………...11
PENDAHULUAN Latar Belakang Selulosa adalah komponen utama penyusun dinding sel tumbuhan dan merupakan biopolimer yang jumlahnya paling melimpah di alam. Selulosa merupakan polimer glukosa tak bercabang yang terdiri atas unit-unit D-glukosa yang dihubungkan oleh ikatan β-1,4-glikosidik membentuk molekul selobiosa. Molekul ini membentuk selulosa dalam rantai panjang. Tiap rantai dihubungkan oleh ikatan hidrogen dan van der waals (Perez et al. 2002). Selulosa di alam biasa didegradasi oleh serangga, cacing tanah, cendawan dan bakteri. Akan tetapi, cendawan merupakan dekomposer selulosa yang umum ditemukan. Cendawan yang mampu menguraikan selulosa berasal dari kelompok Ascomycota, Basidiomycota, Zigomycota, dan Deuteromycota (Moore-Landecker 1996). Mikroorganisme mendegradasi selulosa menjadi monomernya dengan memproduksi enzim ekstraselular yaitu selulase. Enzim selulase terdiri atas endoglukanase atau endo-β-1,4-glukanase (EC 3.2.1.4), eksoglukanase atau ekso-β-1,4-glukanase (EC 3.2.1.74), dan selobiase atau -β-1,4glukosidase (EC 3.2.1.91) (Saczi et al. 1986; Lynd et al. 2002; Perez et al. 2002). Sistem enzim tersebut bekerja pada substrat yang spesifik. Enzim endoglukanase memotong secara acak ikatan internal selulosa amorf sedangkan enzim eksoglukanase bekerja pada ujung tereduksi dan tak tereduksi dari rantai selulosa sehingga menghasilkan molekul selobiosa yang akan dihidrolisis oleh enzim selobiase menjadi monomernya yaitu glukosa. Selulosa dapat dikelompokkan berdasarkan sifat ikatan glukosa penyusunnya. Carboxymetilcellulose (CMC) dan Avisel merupakan selulosa semisintetik komersial yang mampu menginduksi selulase. CMC merupakan selulosa amorf sehingga dapat larut dalam air sedangkan avisel merupakan tepung selulosa mikrokristalin. Kertas saring Whattman merupakan substrat majemuk yang memiliki bagian amorf dan kristalin dari struktur selulosa (Maheshwari 2005). Limbah lignoselulosa tumbuhan dengan komponen utamanya selulosa jumlahnya sangat melimpah. Limbah tersebut dapat
dimanfaatkan sebagai kompos dan sumber energi terbarukan yang ramah lingkungan. Di Indonesia, selulosa sebagai sumber energi terbarukan baru sampai tahap penelitian. Potensinya yang besar mendorong pemanfaatan selulosa sebagai sumber energi masa depan menggantikan sumber bahan bakar fosil. Langkah awal dari pemanfaatan itu membutuhkan enzim perombak selulosa. Oleh karena itu, penelitian tentang mikroorganisme yang mampu mendegradasi selulosa perlu dilakukan. Tujuan Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kemampuan selulolitik beberapa isolat kapang. Waktu dan Tempat Penelitian ini dilaksanakan pada bulan Maret hingga Desember 2008, bertempat di Laboratorium Mikologi Departemen Biologi, FMIPA, IPB.
BAHAN DAN METODE Bahan dan Alat Alat yang digunakan adalah penangas air, erlenmeyer, autoklaf, cawan petri, inkubator, dan peralatan umum laboratorium Mikologi. Bahan yang digunakan adalah 42 isolat kapang koleksi IPBCC, dan isolat Trichoderma reesei QM6a (IPBCC 93.260) sebagai isolat pembanding (Lampiran 1), media agar-agar dekstrosa kentang (ADK), media carboxymetilcellulose (CMC), avisel, kertas saring atau filter paper (FP) Whatman no. 1, pereaksi 3,5-asam dinitro salisilat (DNS), glukosa, dan Bovin Serum Albumin (BSA). Metode Persiapan inokulum. Inokulum diperoleh dari peremajaan biakan kapang. Biakan ditumbuhkan dalam media CMC dan digunakan sebagai sumber inokulan. Aktivitas selulase secara kualitatif. Inokulum berdiameter 0.5 cm ditanam pada media agar-agar CMC 1 % dan diinkubasi pada suhu ruang selama empat hari. Setelah masa inkubasi berakhir, pewarnaan merah kongo 0.1 % dilakukan untuk menampakkan zona bening yang terbentuk. Aktivitas selulolitik ditetapkan sebagai indeks selulolitik yaitu diameter zona bening dikurangi diameter koloni kemudian
2
hasilnya dibagi dengan diameter koloni. Tiga isolat yang memiliki aktivitas selulolitik tertinggi diuji aktivitas selulolitiknya secara kuantitatif. Aktivitas selulase secara kuantitatif. Sebelum aktivitas selulase kuantitatif pada berbagai sumber selulosa (CMC, avisel, dan FP Whatman no. 1) dari isolat-isolat terpilih ditetapkan, masa inkubasi optimum untuk produksi enzim ditetapkan terlebih dahulu pada medium cair CMC dengan mengamati aktivitas selulase harian. Sebanyak lima potong inokulum (diameter 5 mm) berumur empat hari yang berasal dari isolat terpilih dimasukkan ke dalam 100 ml media cair CMC 1 % dan diinkubasi pada mesin penggoyang. Kemudian sebanyak 4 ml filtrat diambil setiap hari untuk diambil ekstrak kasar enzimnya. Ekstrak kasar enzim diperoleh dengan mensentrifugasi filtrat hasil kultur pada kecepatan 4000 g selama 10 menit pada suhu 4 0C. Aktivitas selulase harian ditetapkan berdasarkan metode Miller (1959) dengan cara mencampurkan 1 ml ekstrak kasar enzim dalam 1 ml CMC cair pada bufer fosfat 0.2 M pH 7 dan diinkubasi pada suhu ruang selama 60 menit. Kemudian ke dalam campuran tersebut ditambahkan 2 ml DNS, diinkubasi pada suhu 100 0C selama 15 menit, dan diukur absorbansinya pada panjang gelombang 540 nm. Produksi optimum enzim ditetapkan berdasarkan aktivitas selulase tertinggi pada periode inkubasi. Masa produksi optimum akan digunakan untuk penetapan aktivitas enzim pada berbagai sumber selulosa. Aktivitas enzim dinyatakan dalam nkat/ml. Perhitungan aktivitas enzim selulase dinyatakan dalam nkat/ml. Satu unit aktivitas selulase didefinisikan sebagai jumlah enzim yang dibutuhkan untuk menghasilkan 1 μmol glukosa dalam satu menit dan satu unit aktivitas enzim setara dengan 16.67 nkat/ml (Dybkaer 2001). Uji aktivitas selulase pada substrat avisel dilakukan dengan menambahkan sebanyak 2 ml ekstrak kasar enzim ditambahkan 2 ml avisel kemudian disentrifugasi pada 3500 g selama 15 menit pada kondisi uji. Sebanyak 2 ml supernatan diambil dan ditambahkan 2 ml DNS kemudian absorbansinya diukur pada panjang gelombang 540 nm. Untuk substrat FP, 2.5 potong substrat FP berukuran 1 x 6 cm2 dimasukkan kedalam 2.5 ml bufer dan 5 ml enzim ekstrak kasar. Campuran enzim ekstrak kasar dan substrat FP diinkubasi pada kondisi uji.
Suhu dan pH optimum aktivitas enzim. Suhu optimum aktivitas selulase diukur dengan cara menginkubasi ekstrak kasar enzim pada substrat CMC 1 % pada suhu 30 0C, 40 0C, 50 0C, 60 0C, dan 70 0C, sedangkan pH optimum ditetapkan dengan cara menginkubasi ekstrak kasar enzim pada substrat CMC 1 % pada pH 3, 4, 5, 6, dan 7. Kadar protein dan aktivitas spesifik enzim. Kadar protein diukur berdasarkan metode Bradford (1976). Sebanyak 400 μl enzim ekstrak kasar dengan 4 ml reagen Bradford, dikocok dengan vorteks, diukur pada panjang gelombang 595 nm. Standar protein yang digunakan ialah bovin serum albumin (BSA). Aktivitas spesifik enzim dinyatakan dalam nkat per mg protein (nkat/mg).
HASIL Aktivitas selulase kualitatif beberapa isolat kapang Semua isolat yang ditumbuhkan pada media agar-agar CMC 1 % membentuk zona bening setelah diwarnai dengan pewarna merah kongo 0.1 % (Lampiran 1). Sebanyak 39 isolat dari 42 isolat yang diuji memiliki nilai indeks selulolitik yang lebih tinggi dari daripada isolat pembanding. Dari 39 isolat ini dipilih tiga isolat dengan nilai indeks selulolitik tertinggi dengan tingkat kecerahan agar yang lebih baik. Tiga isolat tersebut yaitu Aspergillus niger IPBCC 88.140, A. ornatus IPBCC 07.554 dan Paecilomyces sp. IPBCC 07. 550. Nilai indeks selulolitik ketiga isolat tersebut yaitu 1.80, 1.24, dan 1.50, sedangkan indeks selulolitik isolat T. reesei QM6a yaitu 1.00 (Tabel 1). Ketiga isolat tersebut dipilih untuk uji kuantitatif. Periode inkubasi optimum produksi Periode inkubasi optimum bagi produksi selulase bervariasi tergantung pada jenis kapangnya. Aktivitas selulolitik isolat T. reesei QM6a mencapai optimum pada hari ke-2 dengan nilai aktivitas 0.121 nkat/ml kemudian terus turun sampai hari ke-6 (Gambar 1). Aktivitas selulolitik isolat A. niger dan A, ornatus berturut-turut mencapai optimum pada hari ke-3 dengan nilai aktivitas berturut-turut 0.342 nkat/ml dan 0.550 nkat/ml (Gambar 2 & Gambar 3). Aktivitas selulase isolat Paecilomyces sp. mencapai optimum pada hari ke-5 dengan nilai aktivitas 0.406 nkat/ml (Gambar 4).
3
0,45
aktivitas selulase (nkat/ml)
aktivitas selulase (nkat/ml)
0,14 0,12 0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 2
4
6
0,1 0,05
0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 1
2
3
4
5
6
7
waktu (hari)
aktivitas selulase isolat Gambar 2 Kurva A. niger. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu pH 7 (larutan penyangga 300 C, fosfat 0.2 M). 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1
2
3
4
2
3
4
5
6
7
waktu (hari)
Gambar 1 Kurva aktivitas selulase isolat T. reesei QM6a. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (larutan penyangga fosfat 0.2 M)
0
1
8
Waktu (hari)
aktivitas selulase (nkat/ml)
0,2 0,15
0
0
aktivitas selulase (nkat/ml)
0,3 0,25
0
0
0
0,4 0,35
5
6
aktivitas selulase isolat Gambar 4 Kurva Paecilomyces sp. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (larutan penyangga fosfat 0.2 M).
Aktivitas CMC-ase , Avisel-ase, dan FPase. Aktivitas selulase (CMC-ase, avisel-ase, dan FP-ase) dari tiga isolat terpilih bervariasi tetapi relatif lebih tinggi dari isolat pembanding. Diantara ketiga isolat terpilih, A. ornatus memiliki aktivitas selulase tertinggi. Aktivitas CMC-ase, avisel-ase, dan FP-ase A. ornatus berturutturut sebesar 0.550 nkat/ml, 0.077 nkat/ml, dan 0.255 nkat/ml (Tabel 2). Dua isolat dengan aktivitas selulase yang relatif tinggi yaitu A. ornatus dan Paecilomyces sp. dipilih untuk karakterisasi suhu dan pH. Suhu dan pH optimum aktivitas selulase A. ornatus dan Paecilomyces sp. Aktivitas selulase Paecilomyces sp. dan A. ornatus optimum pada suhu 30 0C dengan nilai aktivitas masing-masing yaitu 0.406 nkat/ml dan 0.550 nkat/ml (Tabel 3) kemudian aktivitasnya menurun seiring dengan kenaikan suhu. Aktivitas selulase Paecilomyces sp. optimum pada pH 4 sedangkan A. ornatus optimum pada pH 7 (Tabel 4).
7
waktu (hari)
aktivitas selulase isolat Gambar 3 Kurva A. ornatus. Aktivitas enzim diuji pada substrat cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (larutan penyangga fosfat 0.2 M).
Kadar protein dan aktivitas spesifik enzim. Kadar protein keempat isolat yang diuji relatif sama, namun aktivitas spesifik tertinggi dimiliki oleh isolat A. ornatus yaitu 5.612 (nkat/mg) sedangkan aktivitas spesifik terendah dimiliki oleh isolat T. reesei QM6a yaitu 1.287 (nkat/mg) (Tabel 5)
4
Tabel 1 Nilai indeks zona bening isolat A. niger, Paecilomyces sp, A. ornatus, dan T. reesei QM6a yang diinkubasi pada media agar-agar CMC 1% selama tiga hari No
Nama isolat
Nomor aksesi
Indeks zona bening
1 2
A. niger Paecylomyces sp.
IPBCC 88.140 IPBCC 07. 550
1.80 1.50
3
A. ornatus
IPBCC 07. 554
1.24
4
T. reesei QM6a
IPBCC 93. 260
1.00
Tabel 2 Aktivitas CMC-ase, avisel-ase, dan FP-ase. Aktivitas enzim diuji pada media cair CMC 1 % pada suhu 300 C, pH 7 (bufer fosfat 0.2 M). CMC-ase Avisel-ase FP-ase Nama isolat Nomor aksesi (nkat/ml) (nkat/ml) (nkat/ml) A. niger Paecylomyces sp.
IPBCC 88. 140
0.342
0.009
0.074
IPBCC 07. 550
0.406
0.034
0.020
A. ornatus
IPBCC 07. 554
0.550
0.077
0.255
T. reesei QM6a
IPBCC 93. 260
0.121
0.032
0.068
Tabel 3 Pengaruh suhu pada aktivitas CMC-ase isolat Paecilomyces sp. dan A. ornatus yang ditumbuhkan di media cair CMC 1 %, pH 7 Isolat
30
40
suhu (0C) 50 60
Paecilomyces sp. (nkat/ml) A. ornatus (nkat/ml)
0.406 0.550
0.285 0.113
0.134 0.188
0.099 0.191
70 0.000 0.000
Tabel 4 Pengaruh pH pada aktivitas CMC-ase isolat Paecilomyces sp. dan Aspergillus ornatus yang ditumbuhkan pada media cair CMC 1 % pada suhu 300 pH Isolat 3 4 5 6 7 Paecilomyces sp. (nkat/ml) 0.125 0.457 0.307 0.206 0.406 0.034 0.198 0.431 0.398 0.550 A. ornatus (nkat/ml) Tabel 5 Aktivitas spesifik CMC-ase pada periode optimum produksi Kadar protein Aktivitas spesifik Nama isolat Nomor aksesi (mg/ml) (nkat/mg) A. niger IPB CC 88.140 0.101 3.386 IPBCC 07. 550 0.099 4.101 Paecylomyces sp. A. ornatus IPBCC 07. 554 0.098 5.612 T. reesei QM6a IPBCC 93. 260 0.094 1.287
PEMBAHASAN Semua isolat kapang yang diuji secara kualitatif memiliki kemampuan untuk menguraikan substrat CMC. Hal ini dapat dilihat dari terbentuknya zona bening setelah koloni cendawan ditetesi pewarna merah kongo 0.1 %. Pewarna merah kongo memiliki interaksi yang kuat dengan polisakarida-polisakarida yang mengandung ikatan β-1,4-glikosidik dan β-1,3-glikosidik (Teather & Wood 1982). Zona bening yang
terbentuk disekitar koloni cendawan menunjukkan bahwa selulosa di zona tersebut sudah terurai menjadi unit-unit yang lebih sederhana. Isolat A. niger, A. ornatus, dan Paecilomyces sp. dipilih karena memiliki nilai indeks selulolitik yang relatif lebih tinggi dan tingkat kecerahan warna agaragar yang lebih baik. Warna agar yang semakin cerah menunjukkan tingginya aktivitas enzim endoglukanase. Enzim ini bekerja secara acak pada ikatan internal
selulosa sehingga menghasilkan lebih sedikit residu polisakarida yang mengandung ikatan β-1,4-glikosidik. Produksi selulase isolat T. reesei QM6a pada media CMC optimum pada hari ke-2. Shanti (1993) melaporkan bahwa, T. reesei QM6a optimum pada hari ke-7 dengan aktivitas CMC-ase sebesar 0.178 U/ ml yang setara dengan 2.967 nkat/ml. Penurunan aktivitas ini mungkin disebabkan oleh penyimpanan isolat dalam waktu yang lama pada media ADK. Produksi CMC-ase isolat A. niger dan A. ornatus mencapai optimum pada hari ke-3, sedangkan isolat Paecilomyces sp. mencapai optimum pada hari ke-5. Ketiga isolat tersebut mengalami penurunan produksi selulase setelah waktu optimum produksi tercapai. Hal ini mungkin disebabkan oleh keberadaan glukosa dalam jumlah tertentu sebagai produk akhir pemecahan selulosa yang dapat menjadi inhibitor alosterik bagi enzim (Lehninger 1994). Selain itu, ketersediaan substrat yang semakin berkurang ikut berperan dalam menurunkan produksi selulase. Ketiga isolat terpilih dan satu isolat pembanding yaitu T. reesei QM6a menunjukkan nilai aktivitas selulase yang berbeda ketika diuji pada substrat CMC, avisel, dan FP. Keempat isolat tersebut memiliki nilai aktivitas selulase optimum pada substrat CMC. CMC diketahui merupakan substrat yang efektif untuk produksi enzim endoglukanase (Lynd et al. 2002). Nilai aktivitas CMC-ase tertinggi ditunjukkan oleh isolat A. ornatus. Nilai tersebut relatif sama dengan aktivitas CMCase isolat bakteri KBM-4 pada kondisi uji yang sama yaitu sebesar 0.566 nkat/ml (Maranatha 2008). Nilai aktivitas avisel-ase keempat isolat relatif lebih rendah daripada ketika diuji pada substrat CMC. Hal ini menunjukkan bahwa CMC-ase merupakan enzim selulase yang paling banyak diproduksi oleh keempat isolat tersebut. Produksi avisel-ase tertinggi ditunjukkan oleh isolat A. ornatus, namun produksi avisel-ase tersebut masih lebih rendah dari aktivitas avisel-ase isolat bakteri KBM 2-6 sebesar 0.167 nkat/ml (Sari 2008). Produksi avisel-ase terendah ditunjukkan oleh isolat A. niger. Avisel merupakan selulosa murni kristalin yang menjadi daerah pemotongan enzim eksoglukanase sehingga aktivitas enzim pada substrat avicel merupakan kerja dari enzim eksoglukanase (Perez et al. 2001). Endoglukanase juga dapat menghidrolisis bagian kristalin dari rantai
selulosa tetapi tidak begitu aktif dan cenderung memilih bagian amorf. Pada substrat FP, produksi selulase tertinggi ditunjukkan oleh isolat A. ornatus dengan nilai aktivitas sebesar 0.255 nkat/ml. Pada kondisi uji yang sama nilai FP-ase isolat A. ornatus lebih rendah dari isolat bakteri KBM 2-6 yaitu sebesar 0.505 nkat/ml (Sari 2008). Aktivitas enzim pada substrat FP menunjukkan sinergi antara enzim endoglukanase dan eksoglukanase karena FP tersusun dari selulosa kristalin dan amorf (Perez et al. 2001). Sinergi ini penting karena selulosa di alam tidak hanya dihidrolisis oleh satu macam enzim melainkan dihidrolisis oleh sistem enzim selulase termasuk eksoglukanase dan endoglukanase. Aktivitas CMC-ase semakin rendah seiring dengan kenaikan suhu dan aktivitas CMC-ase tidak terdeteksi pada suhu 70 0C (Tabel 3). Isolat A. ornatus dan Paecilomyces sp. tidak memiliki suhu optimum diatas 30 0C. Suhu optimum untuk produksi CMC-ase Aspergillus sp. adalah 28-30 0C (Mendels & Reese 1957; Devanathan et al. 1992), suhu yang semakin tinggi dapat menghambat aktivitas CMC-ase melalui proses denaturasi protein enzim. Selain suhu, aktivitas enzim juga sangat dipengaruhi oleh pH. Bagian dari enzim yang mudah terpengaruh oleh perubahan pH atau pH yang tidak sesuai adalah gugus karboksil dan gugus amino (Girindra 1993). Isolat A. ornatus mencapai optimum pada pH 7 Menurut Devanathan et al, (2007), CMC-ase Aspergillus sp. optimum pada pH 6.5. pH yang terlalu tinggi atau terlalu rendah dapat menghambat kerja enzim selulase. Aktivitas CMC-ase isolat Paecilomyces sp. mencapai optimum pada pH 4 dan pH 7. Hal ini menunjukkan bahwa terdapat dua macam enzim selulase yang aktivitasnya optimum pada pH 4 atau pH 7. Perolehan ini menunjukkan bahwa Paecilomyces sp. mensekresikan enzim yang aktif pada substrat CMC dan avisel. Kadar protein keempat isolat terpilih relatif sama. Aktivitas spesifik terendah ditunjukkan oleh isolat T. reesei QM6a. Hasil ini lebih rendah dari hasil penelitian Lelana (2009 yang melaporkan bahwa aktivitas spesifik T. reesei QM6a berada pada kisaran +3.01 U/mg yang setara dengan 50.18 nkat/mg. Aktivitas spesifik tertinggi dimiliki oleh isolat A. ornatus. yaitu sebesar 5.612 nkat/ml. Nilai tersebut masih dibawah aktivitas spesifik dari beberapa A. niger dan
yang diteliti oleh Lelana Trichoderma (2009) dan dari bakteri C11-1 (12.241 nkat/mg) dengan kadar protein sebesar 0.042 mg/ml (Lema 2008). Aktivitas spesifik suatu enzim menunjukkan jumlah substrat yang diubah atau jumlah gula yang diproduksi oleh 1 mg protein enzim. Kadar protein A. ornatus relatif tinggi jika dibandingkan dengan kadar protein isolat bakteri C11-1 namun memiliki nilai aktivitas spesifik yang lebih rendah. Hal ini menunjukkan bahwa protein enzim A. ornatus kurang efektif dalam menguraikan substrat selulosa jika dibandingkan dengan isolat bakteri C11-1.
SIMPULAN Semua isolat yang diujikan mampu mendegradasi substrat selulosa sintetik. Tiga isolat kapang yaitu A. niger IPBCC 88.140, A. ornatus IPBCC 07.554 dan Paecylomyces sp. IPBCC 07.550 memiliki indeks selulolitik lebih tinggi dari pembanding T. reesei QM6a IPBCC 93.260. Periode optimum untuk produksi selulase pada media CMC isolat A. ornatus dan A. niger adalah tiga hari. Periode inkubasi optimum bagi Paecilomyces sp. adalah lima hari dan T. reesei QM6a dua hari. Di antara ketiga isolat terpilih, A. ornatus memiliki nilai aktivitas selulase (CMC-ase, avisel-ase dan FP-ase) tertinggi diikuti dengan Paecylomyces sp. Aktivitas CMC-ase A. ornatus dan Paecilomyces sp. mencapai optimum pada suhu 30 0C. pH optimum yaitu pH 7 untuk A. ornatus dan pH 4 untuk Paecilomyces sp.
SARAN Tiga isolat yang diuji aktivitas selulase secara kuantitatif memiliki nilai aktivitas CMC-ase yang dominan, sehingga penelitian selanjutnya lebih baik difokuskan pada aktivitas enzim CMC-ase. Selain itu, Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut tentang kemampuan selulolitik isolat terpilih pada substrat selulosa yang alami seperti jerami, tongkol jagung, dan sabut kelapa.
DAFTAR PUSTAKA Bradford MM. 1976. A rapid and sensitif methode for the quantition of
microorganism quantities of protein utilizing the principle of protein binding. Anal. Biochem. 72: 248254. Devanathan G, Shanmugam A, Balasubramanian T, Manivannan S. 2007. Cellulase production by Aspergillus sp. isolated from coastal mangrove debris. Trends. in Appl. Sci. Res. 2: 23-27. Dybkaer R. 2001. Unit katal for catalytic activity. Pure. Appl. Chem. 73: 927-931. Girindra A.1993. Biokimia I. Jakarta: PT. Gramedia Pustaka. Lehninger A. L, 1994. Dasar-dasar Biokimia Jilid 1. Maggy Thenawijdaya, penerjemah. Jakarta: Erlangga. Terjemahan dari Principle of Biochemistry. Lelana NE, 2009. Seleksi cendawan potensial penghasil enzim endoglukanase (karboksimetil selulase) dan isolasi gen penyandinya [Tesis] Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Lema ATH, 2008. Viabilitas isolat-isolat bakteri selulolitik pada bahan pembawa gambut [Skripsi] Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Lynd LR., Paul JW., Willem H. van Zyl, Isak S. P. 2002. Microbial cellulose utillization: Fundamental and biotechnology. Microbiol. and Mol. Biol. Rev. 66: 506-577. Maheshwari R, 2005. Fungi Experimental Methods in Biology. New York : Taylor and Friancis. Maranatha B. 2008. Aktivitas enzim selulase isolat asal Indonesia pada berbagai substrat limbah pertanian [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Mendels M dan Reese ET. 1957. Induction of cellulose in T. viride as influenced by carbon source and metals. J. Bacteriol. 73: 269. Miller GL.1959. Use of dinitrosalicyclyc acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem. 31: 426-428.
7
Moore-Landecker E .1996. Fundamentals of Fungi. Ed. Ke-4. New Jersey: Prentice-Hall. Perez J, Munoz-Dorado J, Rubia T, Martinez J. 2002. Biodegradation and biological treatments of cellulose, hemicellulose, and lignin. J. Int. Microbiol. 5:53-63. Saczi A, Radford A, Erenler K. 1986. Detection of cellulolytic fungi by using Congo red as an indicator: a comparative study with the dinitrosalicyclic acid. Appl. Bacteriol. 61:559-562 Sari W. 2008. Karakterisasi bakteri asal tanah pertanian Jawa Tengah dan Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Teather RM, Wood PJ
Jawa Barat [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Shanti LP. 1993. Aktivitas selulase sejumlah isolat kapang [Skripsi]. Bogor: Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Institut Pertanian Bogor. Teather RM, Wood PJ. 1982. Use of congo red-polysaccharide interactions in enumeration and characterization of celluloiytic bacteria from the bovine rumen. Appl. Environ. Microbiol. 43: 777-780.
LAMPIRAN
9
Lampiran 1 Nilai indeks selulolitik 43 isolat kapang No 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43
Nama isolat Acremonium sp. Aspergillus niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. niger A. ochraceus A. ornatus A. tamari A. teraceus A. vercicolor Fusarium sp. Glioladium sp. Gongronella sp. Paecylomyces sp. Paecylomyces sp. Penicillium herquei Penicillium janthinellum Penicillium miczynskii Penicillium notatum Penicillium velutinu Penicillium sp. Penicillium sp. Penicillium sp. Penicillium sp. Trichoderma harzianum T. harzianum T. harzianum T. koningii T. longii T. viride T. reesei QM6a
Nomor aksesi
Nisbah
IPBCC 07.548 IPB CC 88.099 IPB CC 88.100 IPB CC 88.102 IPB CC 88.138 IPB CC 88.140 IPB CC 88.141 IPB CC 88.143 IPB CC 88.145 IPB CC 90.243 IPB CC 93.265 IPBCC 07.440 IPBCC 07.455 IPBCC 07.467 IPBCC 07.473 IPBCC 07.477 IPBCC 07.495 IPBCC 88.033 IPBCC 07.554 IPBCC 88.066 IPBCC 88.067 IPBCC 88.068 IPBCC 07.540 IPBCC 07.543 IPBCC 07.553 IPBCC 07.549 IPBCC 07.550 IPBCC 07.557 IPBCC 07.542 IPBCC 07.541 IPBCC 07.555 IPBCC 07.535 IPBCC 07.536 IPBCC 07.537 IPBCC 07.538 IPBCC 07.539 IPBCC 07.545 IPBCC 07.546 IPBCC 07.547 IPBCC 07.552 IPBCC 07.556 IPBCC 07.551 IPBCC 93.260
1.1 1.1 1.1 1.07 1.2 1.8 1.11 1.09 1.14 1.08 1.48 1.25 1.2 1.2 1.08 1.24 1.08 1.3 1.24 1.2 1.18 1.23 1.1 1.02 1.05 1.2 1.5 1.2 1.1 1.1 1.28 1.1 1.2 1.1 1.1 1.1 1.08 1.01 1 1.04 1 1 1
10
Lampiran 2 Kurva standar protein pada panjang gelombang 595 nm 0,3 y = 2,745x - 0,0081 R2 = 0,999
absorban (nm)
0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 0
0,05
0,1
0,15
Konsentrasi (mg/ml)
absorban (540 nm)
Lampiran 3 Kurva standar glukosa pada panjang gelombang 540 nm 0,6 y = 2.1742x + 0.0115 R2 = 0.9887
0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
konsentrasi glukosa (mg/ml)
Lampiran 4 Komposisi media CMC 1% dan ADK dalam 1 liter akuades Komposisi gram/liter 1. Media CMC 1%: CMC 10 MgSO4.7H2O 0.2 KNO3 0.75 K2HPO4 0.5 FeSO4.7H2O 0.02 CaCl2.2H2O 0.04 Agar-agar 15 Glukosa 1 Antibiotik 0.25 2. Media ADK: Kentang Glukosa Agar-agar Antibiotik
200 20 20 0.25
11
Lampiran 5 Komposisi DNS dalam 1 liter akuades Komposisi gram/liter NaOH 10 KNA Tartrat 182 Na2SO3 0.5 DNS 10
Lampiran 6 Komposisi bufer sitrat pH 3, 4, dan 5; 0.2M pH 3.0: 79.6ml asam sitrat 0.2M (19.21 gram dalam 1000ml akuades) 20.4ml Na2HPO4.2H2O 0.2M (35.6 gram dalam 1000ml akuades) pH 4.0: 61.4ml asam sitrat 0.2M (19.21 gram dalam 1000ml akuades) 38.6ml Na2HPO4.2H2O 0.2M (35.6 gram dalam 1000ml akuades) pH 5.0: 48.6ml asam sitrat 0.2M (19.21 gram dalam 1000ml akuades) 51.4ml Na2HPO4.2H2O 0.2M (35.6 gram dalam 1000ml akuades) Lampiran 7 Komposisi bufer fosfat pH 6.0 dan 7.0; 0.2M pH 6.0: 87.7ml NaHPO4. H2O 0.2M (27.8 gram dalam 1000ml akuades) 12.3ml Na2HPO4 .2H2O 0.2M (35.6 gram dalam 1000ml akuades) pH 7.0: 39ml NaHPO4. H2O 0.2M (27.8 gram dalam 1000ml akuades) 61ml Na2 HPO4 .2H2O 0.2M (35.6 gram dalam 1000ml akuades)
