AIDS. Retrovíry. 1. Objavenie vírusu

Branislav Chrenka skupina 2a

Vírusy – HIV

1

seminárna práca

HIV/AIDS Retrovíry Napriek tomu, že retrovírom sa venuje samostatná téma seminárnej práce s príslušným názvom – Retrovírusy, považujem za potrebné uviesť aspoň niekoľko počiatočných informácií, ktoré čitateľa uvedú do deja, nakoľko HIV spadá taxonomicky práve do čeľade retrovírusov. Čeľaď Retroviridae predstavuje rozsiahlu skupinu vírusov so zvláštnym replikačným cyklom, v rámci ktorého sú schopné zvrátiť prirodzený tok genetickej informácie a včleniť svoj genóm do genómu hostiteľskej bunky. V prírode sú veľmi rozšírené, prenášajú sa rôznymi spôsobmi a vyvolávajú celú škálu ochorení od infekcií bez zjavných patogénnych dôsledkov, cez rôzne neurodegeneratívne a imunologické poruchy, až po zhubné nádorové ochorenia. Retrovírusy prvýkrát upútali pozornosť vedcov na začiatku tohto storočia (Rous, 1911) ako filtrabilné agensy spôsobujúce nádory u kurčiat. Ich význam nebol spočiatku docenený, pretože kurčatá sa nepovažovali za príliš užitočné a relevantné modely pre štúdium ľudských ochorení. Impulzom pre rozvoj retrovirológie boli objavy vírusov zodpovedných za vznik mamárnych karcinómov a leukémií u myší. O niečo neskôr k nemu prispelo aj zavedenie techník bunkovej kultivácie a množenie vírusov in vitro. V 60. a 70. rokoch štúdium retrovírusov napredovalo míľovými krokmi, k čomu prispeli objavy reverznej transkripcie, provírusov a bunkových predchodcov retrovírusových onkogénov. HTLV-1 napádajúci T-lymfocyt V posledných rokoch sa toto napredovanie ešte urýchlilo objavom ľudských retrovírusov, ktoré spôsobujú leukémiu T-lymfocytov (HTLV - Human T-cell leukemie virus) a AIDS a identifikáciou onkogénov, ktoré sú aktívne v niektorých nádoroch. Spätosť retrovírusov so vznikom závažných ochorení poskytuje najsilnejšiu motiváciu pre prácu s nimi. Okrem toho disponujú jedinečnými črtami, ktoré ich uvádzajú do centra vedeckého záujmu nielen ako patogény, ale aj ako experimentálne objekty a vektory cudzorodých génov.

T-lymfocyt napadnutý HTLV-1

Vírus HIV (Human Imunodeficiency Virus) spadá ďalej do podčeľade cytopatogénnych vírusov Lentivirinae. Tieto vírusy boli najprv izolované zo zvierat a sú zodpovedné za pomalé (lat. lentus - pomalý), chronické ochorenia (imunodeficiencie, anémie, neurologické poruchy).

1. Objavenie vírusu 1.1. HIV-1 V júni 1981 Atlantská CDC (Center for disease control – Centrum pre kontrolu nákaz), ktorá centralizuje informácie o situácii infekčných chorôb oznamuje vo svojej týždennej správe, že lekári


Vírusy – HIV

2

seminárna práca

z Los Angeles, San Francisca a New Yorku zaznamenali zvýšenie počtu prípadov pneumónie zapríčinenej hubou Pneumocystis carinii a Kaposiho sarkómov, tieto dva symptómy sú často navzájom asociované. • Pneumónia zapríčinená Pneumocystis carinii (pneumocystóza) je zriedkavé postihnutie, doposiaľ známe ako oportúnna infekcia, ktorá postihovala prednostne pacientov s ťažkou imunodepresiou. • Kaposiho sarkóm je veľmi vzácne ochorenie postihujúce len starších ľudí alebo pacientov po transplantácii, ktorým bola indikovaná imunosupresívna liečba. Zvláštne je, že všetky hlásené prípady sú mladí muži, pred tým úplne zdraví a homosexuálne orientovaní. Začína sa teda hovoriť o tzv. gay-related immunodeficiency (GRID) – Gay syndróme (stigma). V nasledujúcich mesiacoch sa k skupine homosexuálov pridávajú ďalšie socio-ekonomické skupiny: toxikomani, Haiťania, prostitútky a nakoniec hemofilici... Laboratórne testy u všetkých preukázali zrútenie „bunkovej imunity“ charakterizovanej: •

• •

anergiou (stav organizmu, ktorý stratil schopnosť špecificky reagovať na antigén, na ktorý kedysi vykazoval citlivosť) kožných testov na antigény (tuberkulín) lymfopéniou nižšia než 500/mm3 významným znížením T-helperov (T CD4+) (viď 4.1.1)

Počítačová simulácia HIV viriónu

Z čoho vyplýva pomenovanie syndrómu: Syndróm získanej imunodeficiencie alebo AIDS (Acquired immune deficiency syndrome). 1.1.1. Agens syndrómu ? „Prenos AIDS“ sexuálnou cestou (v prípade homosexuálov a Haiťanov) a krvnou cestou (v prípade toxikomanov a hemofilikov) je analogický k prenosu hepatitídy B a vysunul do popredia teóriu o virálnom pôvode choroby. Spočiatku sa predpokladalo, že chorobu zapríčiňujú známe vírusy: cytomegalovírusy (CMV), vírus Epstein-Barrovej (EBV) alebo vírus hepatitídy B (HBV). Ale všetky tieto vírusy sú v podstate zodpovedné za oportúnne nákazy, ktoré sú dôsledkom a nie príčinou imunodeficiencie. Následne • Robert Gallo, ktorý v roku 1980 objavil prvý ľudský retrovírus, považuje za príčinu AIDS vírus spôsobujúci leukémiu T-lymfocytov (HTLV-1). • Luc Montagnier, špecialista na Oncornavírusy (jedna z podčeľadí Retrovírusov) sa snažil dokázať prítomnosť retrotranskriptázy (reverznej transkriptázy) v napadnutom tkanive: V januári 1983 bola v Parížskej l’hôpital de la Pitié odobratá krčná uzlina od 33ročného muža, ktorý javil menšie, ale dostatočne jasné príznaky AIDS (lymfadenopatia je predčasným symptómom AIDS).

3


Vírusy – HIV seminárna práca

Lymfocyty boli in vitro kultivované spolu s IL-2 Na pätnásty deň bola spozorovaná aktivita retrotranskriptázy. Ale kultúra bola „vyčerpaná“, vírus bol teda prenesený na kultúru neinfikovaných T-lymfocytov. Znova bola zaznamenaná enzymatická aktivita, spočiatku stúpala, neskôr klesla. 1.1.2. Izolovaný vírus nemôže byť vírus HTLV-1: • •

in vitro, HTLV-1 podnecuje T lymfocyty k deleniu a zvyšuje tým produkciu retrotranskriptázy. Hypotetický vírus sa správa inak: neaktivuje T lymfocyty, zabíja ich. vírus bol identifikovaný pod elektrónovým mikroskopom a nepodobá sa na HTLV-1

Montagnier informuje Galla o svojich výsledkoch, nato mu Gallo posiela protilátky anti-HTLV, ktoré s izolovaným retrovírom nereagujú. Montagnier následné zisťuje prítomnosť rovnakého vírusu u chorých postihnutých najrôznejšími formami AIDS. Francúzski vedci dokazujú, že vírus útočí na T4-lymfocyty, ale miesto toho, aby ich imortalizoval ako to robí HTLV-1, tento ich ničí. Nemôže sa teda jednať o Oncornavírus ale o Lentivírus. Po svojom objave vírus niesol rôzne mená. V roku 1986 sa vedci napokon ujednotili a nazvali ho vírusom ľudskej imunodeficiencie (HIV). HIV-1 zaznamenáva celosvetový „rozptyl“, prechádzajúci do pandemickej nákazy. 1.2. HIV-2 HIV-2 bol izolovaný Montagnierom v roku 1985: • séra Portugalčanov (oddelene žijúcich v západoafrických portugalských kolóniách) napadnutých AIDS-om a testované detekčnými testmi HIV-1 sa javili ako séronegatívne. HIV-2 antigénovo odlišný od HIV-1 je rovnako aj menej patogénny. HIV-2 ma momentálne obmedzený „rozptyl“ v západnej Afrike.

2. Štruktúra HIV 2.1. Morfológia Morfológia a štruktúra HIV-1 a HIV-2 sú skoro totožné. Dospelé virálne častice sú sférické, majú priemer 80-100 nm. Virióny majú hustotu 1,16-1,18 g.cm-3 a sú citlivé na zvýšenú teplotu, detergenty a formaldehyd a sú relatívne rezistentné proti UV žiareniu- Na virióne rozlišujeme: ¾ obal je tvorený lipidickou dvojvrstvou pochádzajúcou z cytoplazmatickej Stavba viriónu HIV membrány hostiteľskej bunky a obsahuje výbežky, ktoré pozostávajú z povrchového glykoproteínu tvoreného dvomi podjednotkami: o gp120 sa fixuje na bunkový receptor (SU gp120: SU ako surface) a zároveň je dominantným antigénom, ktorý indukuje (vyvoláva) tvorbu neutralizačných protilátok.


4


gp41, je asociovaný na gp120 a zodpovedá za fúziu (splynutie) obalu s bunkovou membránou tým, že ukotvuje glykoproteín k membráne (TM gp41: TM ako transmembránový). Vnútornú časť vírusového obalu lemuje matrixový proteín (MA p17). o

¾ nukleokapsid (kapsida) uzavretý v jadre viriónu má kónický (kužeľovitý) tvar a tvorí ho kapsidový proteín CA p24 (CA ako capside a p ako protein). Kapsida obsahuje virálny genóm a enzýmy: o genóm genóm je diploidný, pozostáva z dvoch identických, nekovalentne viazaných molekúl ssRNA („ss“ ako single-strand), pozitívnej polarity (čiže sa nedá použiť priamo ako mRNA) s veľkosťou 10 kb tieto RNA sú úzko spojené s NC proteínmi (NC ako nucleocapsid), ktoré RNA držia pohromade a chránia pred aktivitou bunkových enzýmov 3’ koniec genómu je polyadenylovaný a 5’koniec má čiapočku genómová RNA je asociovaná so špecifickou t-RNA, ktorá má kľúčovú úlohu v replikácii ako primer pre reverznú transkripciu. o enzýmy retrotranskriptáza (reverzná transkriptáza) integráza proteáza V každom virióne sa nachádza zhruba 50 molekúl každého enzýmu.

Stavba a morfológia viriónu HIV

2.2. Analýza genómu HIV Genóm je usporiadaný tak, že nekódujúce sekvencie, ktoré obsahujú signály pre jeho replikáciu, transkripciu a maturáciu viriónov, sú sústredené v terminálnych oblastiach a gény kódujúce proteínové produkty ležia medzi nimi. 2.2.1. Analýza kódujúcich úsekov V smere 5’→3’ nachádzame: • nekódujúci 5’ úsek (gag ako group specific antigens) kóduje polyproteín, z ktorého • gag gén posttranslačným zostrihom vzniknú kapsidové proteíny, tzv. skupinovošpecifické antigény MA,CA a NC. • pol gén (pol ako polymerase) kóduje tri enzýmy: retrotranskriptázu, integrázu a proteázu (env ako envelope) kóduje prekurzorový proteín, ktorý sa po glykozylácii • env gén


• • • • • •

5


(gp160) rozštiepi na TM gp41 a SU gp120, tieto zostanú asociované a vytvoria glykoproteínové výbežky. Z oboch strán env génu sa nachádzajú regulačné úseky vif (virion infectivity factor) regulačný proteín zvyšuje infekčnosť nových v viriónov vpr a vpu (viral protein r and viral protein u) pravdepodobne sa zúčastňujú na morfogenéze a uvoľňovaní zrelých viriónov z bunky. tat (transactivator of transcription), pomocou interakcie so špecifickou sekvenciou na 5’ konci transkriptov zvyšuje účinnosť trasnkripcie až 1000 krát rev (regulation of expression of viral proteins), inhibuje syntézu regulačných mRNA a aktivuje transkripciu mRNA pre štruktúrne vírusové proteíny. nef (negative regulatory factor) favorizuje replikáciu vírusov nekódujúci 3’ úsek

2.2.2. Analýza nekódujúcich úsekov Nekódujúce úseky sú pre vírus strategicky dôležité. Nachádzajú sa tu regulačné signály transkripcie (do RNA) a translácie, sekvencie pre spustenie replikácie, integračné a enkapsidačné signály: • • • • • • • • •

čiapočka R

5’ koniec obsahuje na začiatku čiapočku, podobne ako mRNA dlhý niekoľko sto nukleotidov (R ako repeat pretože tento R región sa opakuje v 3’ nekódujúcom úseku). Zohráva úlohu pri reverznej transkripcii pri prenose rastúceho vlákna DNA z jedného konca matrice na druhý. U5 (unique in 5’) unikátna sekvencia esenciálna pre iniciáciu reverznej transkripcie. PB (primer binding site) 18 nukleotidov dlhý úsek, na ktorý sa viaže primer reverznej transkripcie (ktorým je tRNA). L (leader) obsahuje donorové miesto pre zostrih subgenómových mRNA a signál pre zabalenie genómu do viriónu. PP (poly-purine) polypurínový trakt obsahujúci iniciačné miesto pre syntézu pozitívneho vlákna provírusovej DNA U3 (unique in 3’) unikátna oblasť, ktorá obsahuje regulačné elementy pre replikáciu, integráciu a polyadenyláciu DNA. LTR (long terminal repetitions) dlhé koncové repetície zložené z U3, R a U5, ktoré vznikajú pri reverznej transkripcii zdvojením unikátnych koncových sekvencií. Poly(A) sekvencia

6



3. Rozmnožovací cyklus 3.1. Od RNA vírusu k provírusu (DNA) 1) fixácia pomocou gp120 Gp120 sa fixuje na virálny receptor na T4lymfocyte, ktorým je molekula imunoglobulínového typu CD4. (Tento proteín sa rovnako nachádza na makrofágoch, dendritických bunkách lymfatických uzlín a slizničných bunkách (Langerhansove bunky) a na mikrogliálnych bunkách mozgu (čo sú vlastne rezidentné makrofágy CNS). Všetky tieto bunky sú vírom aj napádané. 2) penetrácia fúziou Po fixácii na CD4, sa gp120 musí asociovať aj na druhý bunkový receptor, tzv. koreceptor CCR5, vzniká tak trimérový komplex CD4-gp120-koreceptor. Tento koreceptor zohráva v úspešnosti penetrácie kľúčovú úlohu, pretože umožňuje glykoproteínu gp41 spustiť svoju fúzovaciu aktivitu. 3) dekapsidácia Nastáva v cytoplazme, kapsida sa rozruší a uvoľní genóm.


7


4) replikácia Prvý krok v replikácii je prepis genómovej ssRNA do dsDNA vírusovou reverznou transkriptázou. Odohráva sa v cytoplazme infikovanej bunky vo vnútri štruktúry derivovanej z kapsidu. Syntéza DNA sa začína v mieste PB, kde je naviazaná tRNA, ktorá sa využíva ako primer. Najprv sa prepíšu sekvencie R a U5, čím vznikne krátke negatívne vlákno DNA. Toto vlákno sa prenesie na 3’ koniec matrice RNA, pričom sa využíva komplementarita v oblasti R a syntéza aktívneho vlákna pokračuje až k miestu PB. Pomocou aktivity RNázy H, ktorú obsahuje reverzná transkriptáza, sa štiepi matricová RNA. Produkty štiepenia slúžia ako primery pre syntézu krátkeho pozitívneho vlákna DNA, ktoré sa opäť prenesie na opačný koniec matrice, v tomto prípade negatívneho vlákna DNA, odkiaľ syntéza pozitívneho vlákna DNA pokračuje. Zároveň RNáza H úplne degraduje zvyšky genómovej RNA a odstráni primer tRNA z negatívneho vlákna DNA. Výsledkom tohto procesu je lineárna dsDNA s dlhými terminálnymi repetíciami (LTR) na oboch koncoch. Reverzná transkripcia sa vyznačuje vysokou frekvenciou rekombinácií, ktoré vznikajú pri preskokoch reverznej transkriptázy z jednej molekuly diploidného templátu na druhú. 5) integrácia Ďalším nevyhnutným krokom v životnom cykle retrovírusov je vznik provírusu, t.j. včlenenie sa transkribovanej vírusovej dsDNA do chromozomálnej DNA hostiteľskej bunky. Po dokončení reverznej transkripcie nukleoproteínový komplex aktívne vstúpi do jadra bunky a dsDNA sa cirkularizuje. Ligáciou koncov vznikajú kovalentne uzavreté cirkulárne molekuly s dvoma LTR. Homológnou rekombináciou cez sekvencie LTR sa vytvárajú cirkulárne molekuly s jedným LTR. Vírusová integráza odštiepi z 3’ koncov vírusovej DNA dve bázy, tak že zanechá voľné 3’-OH konce. Cieľová bunková sekvencia sa rozštiepi, pričom vzniknú 5’ prečnievajúce fosforylované konce tvorené 4 - 6 nt. Energia rozštiepených väzieb sa použije na tvorbu nových väzieb medzi koncami vírusovej a hostiteľskej DNA. Bunkový reparačný systém potom zaplní medzeru vo vzniknutej molekule, čím sa vytvorí charakteristická duplikácia bunkovej DNA pri koncoch provírusu. Konce integrovanej vírusovej DNA sú vždy 5’TG………….CA-3’. Vírusová DNA sa môže včleniť do bunkového genómu na rôznych miestach s tendenciou integrovať sa v transkripčne aktívnych oblastiach. Integrovaný provírus je relatívne stabilný, k jeho strate môže dôjsť náhodnými deléciami a rekombináciami v rámci bunkovej DNA. 3.2. Transkripcia Pri procese transkripcie do mRNA a do genómovej RNA vírusu je provírus úplne závislý na bunkovej

8



RNA-polymeráze. Zároveň regulácia expresie vírusových génov záleží jednak od aktivity virálnych regulačných proteínov, jednak od kooperácie bunkových faktorov expresie. Na počiatku expresie provírusu sa exprimujú len regulačné gény, neskôr regulačné proteíny, ako výsledok exprimácie regulačných génov a bunkové faktory orientujú aktivitu RNA-polymerázy II k transkripcii génov kódujúcich štruktúrne proteíny vírusu a enzýmy na úkor regulačných proteínov. Signály pre iniciáciu transkripcie sa nachádzajú v LTR, najmä v oblasti U3 a podobajú sa na bunkové regulačné elementy (boxy TATA, CCAAT a enhancery). Jeden primárny transkript RNA môže slúžiť ako: • mRNA pre všetky vírusové proteíny po tom, ako podstúpila posttranskripčné úpravy • genómová RNA 3.3. Translácia - Primárny nezostrihaný transkript umožňuje syntézu kapsidových proteínov a enzýmov potrebných k replikácii vírusu, ktoré sú integrované do viriónov. Translácia na voľných ribozómoch vedie k vzniku dvoch polyproteínov: polyproteín Gag Pr p55 (z 90%) (Pr=prekurzor) a polyproteín Pol Pr p180 (z 10%). Polyproteíny migrujú k cytoplazmatickej membráne, kde sú „rozstrihané“ na funkčné produkty prostredníctvom vírusovej proteázy. - Zostrihaný primárny transkript umožňuje syntézu obalových glykoproteínov. Translácia prebieha na ribozómoch asociovaných s EPR, táto vedie ku vzniku polyproteínu, ktorý je v Golgiho aparáte následne glykozylovaný za vzniku prekurzorového glykoproteínu Pr gp160, ktorý sa zostrihá prostredníctvom bunkovej proteázy za vzniku gp120 a gp41.

3.3. Enkapsidácia, morfogenéza a exit z bunky Pod bunkovou membránou sa nazhromaždia všetky štruktúrne proteíny a genómová RNA, následne sa spustí signál pre enkapsidáciu genómu, ktorý sa nachádza v L oblasti medzi U5 a gag. Glykoproteíny sa inkorporujú do formujúcej sa vírusovej obalovej membrány. Bunková tRNA sa fixuje na PB úsek vďaka proteínu p15. Pučaním sa z bunky začínajú uvoľňovať nové nedospelé virióny, ktoré dospievajú prostredníctvom aktivity vírusovej proteázy. Zhromažďovanie štruktúr

Exit z bunky


9


4. Pôsobenie vírusu 4.1. Cieľové bunky vírusu Cieľovými bunkami vírusu sú výlučne bunky predstavujúce na svojom povrchu proteín CD4, ktorý je receptorom vírusu. Ako už bolo spomenuté, sú to prevažne bunky imunitného systému: TH lymfocyty a makrofágy. Všetky tieto bunky sú sústredené v periférnych lymfatických gangliách, práve v týchto orgánoch je koncentrácia vírusu najvyššia. (Pozn. Periférna krv obsahuje len asi 2% z celkového počtu lymfocytov.) 4.1.1. Hierarchická štruktúra imunitného systému Ako všetky krvné bunky, lymfocyty a makrofágy tiež pochádzajú z kostnej drene. Rozlišujeme dve triedy lymfocytov: niektoré sa v kostnej dreni diferencujú z pluripotentných kmeňových buniek na B-lymfocyty, ktoré sa po Vírus HIV napádajúci hostiteľskú bunku aktivácii spôsobenej kontaktom s antigénnym determinantom transformujú na plazmocyty a iné pokračujú vo svojej púti do týmusu, kde sa diferencujú na Tlymfocyty, z ktorých rozlišujeme 2 populácie podľa prítomnosti špecifických receptorov inkorporovaných v ich plazmatickej membráne: •

•

TH lymfocyty (H-helper) Sú charakteristické prítomnosťou proteínu CD4 (niekedy preto aj lymfocyty CD4+ alebo T4). Nanešťastie majú veľmi významnú strategickú a riadiacu úlohu pri celom procese imunitnej odpovede, nakoľko ju celú koordinujú prostredníctvom tzv. „chemických messengerov“ (interleukíny, MAF (Macrophage activating factor)). Pri ich redukcii dochádza k stavu označovanému ako imunodeficiencia.

TC lymfocyty (C-cytotoxic) Sú charakterizované prítomnosťou proteínu CD8 (niekedy teda aj lymfocyty CD8+ alebo T8). Sú zodpovednými aktérmi v bunkovej imunite, dokážu špecificky rozpoznávať vírusom infikované bunky vlastného tela a zničiť ich pred tým, než dokážu uvoľniť nové virióny. Rovnako dokážu rozpoznať bunky zvrhnuté v rakovinové bujnenia a zničiť ich. Preto dostal názov cytotoxický T-lymfocyt. 4.2. Odpoveď organizmu


•

10


humorálna Začína objavením sa protilátok anti-HIV, medzi ktorými dominujú protilátky anti-gp120, tieto sa fixujú na glykoproteínové výbežky a zabraňujú spojeniu vírusu s cieľovou bunkou.

•

bunková Začína sa objavením cytotoxických T-lymfocytov, ktoré rozpoznávajú infikované bunky (obzvlášť T4-lymfocyty) a ničia ich pred tým, než stihnú vyrobiť nové vírusové častice. !!!Ale nakoľko k aktivácii týchto buniek (T8) sú nevyhnutné lymfocyty T4, ich ničenie oslabuje postupne účinnosť imunitnej odpovede!!!

4.3. Mutagenéza Ako všetky genómy, aj genóm HIV je podrobený na prvý pohľad protichodným požiadavkám: • •

musí zabezpečiť dlhodobú schopnosť uchovať genetickú informáciu, inými slovami zabezpečiť produkciu verných kópií samého seba zároveň musí byť schopný odpovedať na rôzne okolité „hrozby“, čiže viac či menej modifikovať svoju štruktúru

Odpoveď vírusu na zmeny svojho okolia, ktorá je potrebná k jeho prežitiu sa odohráva v dvoch rovinách: • •

prvou rovinou je rovina diverzity, čiže generovanie rôznorodosti viriónov na úrovni genómu, táto diverzita vzniká náhodne, bez nejakého predom premysleného mechanizmu druhou rovinou je rovina selekcie, inými slovami, prežijú len tie najlepšie druhy, prenášajúc svoje zmeny na potomstvo. Druhy nesúce nepriaznivé zmeny genómu zaniknú, pretože tieto variácie im neumožnia ďalej sa množiť.

Toto náhodné generovanie heterogenity predpokladá obrovské „mrhanie“ početných viriónov, ktorých zasiahla nepriaznivá variácia. No toto mrhanie je smiešne zanedbateľné pri porovnaní s rýchlosťou množenia vírusu: priemerne rýchly vírus vyprodukuje za deň 10.000 „potomkov“. Ak je v prvý deň infekcie v organizme len jediný vírus, na druhý deň ich bude 10.000, na tretí 10.000 krát 10.000 (sto miliónov), 10.000 krát 10.000 krát 10.000 na štvrtý (tisíc miliárd), atď. 4.3.1. Podstata variácií Variácie, ako už bolo spomenuté, sa odohrávajú na úrovni génov, počas replikácie genómu, každá chyba alebo mutácia, zodpovedá takejto variácii. V prípade HIV retrotranskriptáza nemá opravné mechanizmy, a teda spätne „nečíta“ priradené bázy (pri prepise RNA→ssDNA a ssDNA→dsDNA). Pri tomto prepise sa v priemere pomýli pri jednom nukleotide z 10.000:

nakoľko HIV vírus obsahuje zhruba 10.000 nukleotidov je teda pravdepodobné, že medzi dvoma viriónmi pochádzajúcimi z jednej bunky bude minimálne jeden rozdiel v poradí báz.

Ale spomínaná selekcia zabraňuje nepriaznivým zmenám a uchováva len tie najživotaschopnejšie: • nepriaznivá mutácia potláča napríklad aktivitu enzýmu potrebného k rozmnožovaniu vírusu: mutant, ktorý taký enzým nesie zanikne stratiac svoju reprodukčnú schopnosť • priaznivá mutácia je napríklad taká, ktorá podmieni vznik odlišného receptorového glykoproteínu, pretože mutant, ktorý taký proteín nesie dokáže na čas uniknúť aktivite imunitného systému.

Vírusy – HIV

11


seminárna práca

A pretože v prípade HIV vírusu, kde je miera mutácií dosť vysoká, schopnosť selekcie nepostačuje k udržaniu identickosti populácie, táto zostáva heterogénna. Takúto populáciu nazývame kvázispecies. 4.3.2. Variabilita glykoproteínu gp120 Komparatívna analýza glykoproteínov gp120 izolovaných z mnohých vzoriek vírusov umožnila definovať konštantné regióny (C) a variabilné regióny (V). Kódujúci gén gp120 teda niekedy mutuje a výsledné glykoproteíny predstavujú určité odchýlky vzhľadom na infikujúci vírus. Konštantné úseky sú zachované, pretože sú kľúčové pre prežitie vírusu: Keď je v géne kódujúcom molekulu gp120 zmenené miesto zodpovedajúce za väzbu medzi gp120 a CD4 vírus sa viac nemôže fixovať na cieľovú bunku a zaniká, pretože stratil svoj virulentný potenciál: hovoríme, že podstúpil letálnu mutáciu. Podľa sekvencie variabilného regiónu gp120, V3 slučky (ktorá nesie hlavný antigénny determinant imunitnej odpovede) bolo identifikovaných 8 podtypov HIV-1 (A-H), ktoré sú združené do M skupiny (major), pretože mimo túto skupinu sú si vírusy dosť podobné. Tieto varianty môžu spôsobovať nemalé problémy aj pri sérodiagnostike HIV infekcie. V roku 1989 boli v Kamerune izolované HIV-1 vírusy, ktorých gp120 vykazovalo slabú homologickosť so známymi podtypmi, preto boli zaradené do novej O skupiny HIV-1 (outlier). Každý z podtypov má špecifickú geografickú distribúciu: SKUPINA M A B C D E F G

Západná Európa

skupina O H

+

Francúzsko +

Rusko

+

Rumunsko Afrika

+ + + + + + + +

USA

+

Južná Amerika

+ +

+

Ázia : Čína India Thajsko Taiwan

+ + +

+

+

4.4. Dopad infekcie Dlhú dobu sa verilo, že krátko po infekcii prechádza vírus do latencie, čoho dôkazom bola aj dlhá fáza klinickej latencie, na druhej strane to nevysvetľovalo neprestajný úbytok T4 v krvi. V podstate HIV vyvoláva chronickú infekciu: neprestáva sa reprodukovať.

+


12


Od primo-infekcie (viď str. 13) prebieha intenzívna multiplikácia vírusu: každý deň sa v krvi postihnutého objaví 108 - 109 nových vírusov, zatiaľ čo je zničených a nahradených niekoľko stoviek miliónov T4! Po niekoľkých týždňoch od primo-infekcie pozorujeme postupný úbytok vírusov, ktorý však nikdy nie je úplný. Tento fakt je spojený s procesmi imunitnej odpovede: • lymfocyty T8 zabíjajú napadnuté T4 lymfocyty, pred tým, než stihnú uvoľniť nové

vírusy • neutralizujúce protilátky zabraňujú infekcii ďalších T4 uvoľnenými viriónmi. Hoci sa javí ako v krvi neprítomný, vírus sa aktívne množí v lymfatickom tkanive (uzliny a slezina). Dendritické bunky tohto tkaniva sa správajú ako vírusový rezervoár a sú schopné permanentne infikovať T4 lymfocyty, ktoré v tkanive prebývajú. Po celú dobu klinickej latencie sa objavujú mutantné vírusy, ktoré na čas unikajú imunitnej odpovedi a množia sa: imunitný systém rozpozná nové kmene a špecificky proti nim zakročí produkciou nových T8 lymfocytov a nových protilátok. Ale mutanti sa objavujú permanentne a spomedzi nich stále niektoré kmene na čas uniknú pozornosti imunitného systému. Imunitný systém ich znova musí rozpoznať a následne eliminovať. Toto sa opakuje stále dookola a kruh sa uzatvára. Preto vravíme o chronickej infekcii: eradikácia vírusu nie je možná! Každý nový mutant spôsobuje deštrukciu T4 lymfocytov, ktorých počet v krvi neustále klesá. Po niekoľkých rokoch, v dôsledku neustálych mutácií dochádza k vyčerpaniu imunitného systému, čoho dôsledkom je nekontrolovaná replikácia vírusu a totálne vymiznutie T4 lymfocytov.

Dlhé obdobie klinickej latencie ukrýva permanentný boj organizmu s vírusom. Objavenie AIDS je dôsledkom deštrukcie imunitného systému vírusom.

Zdá sa, že produkcia vírusu je ovplyvňovaná mnohými faktormi: • cytotoxické T-lymfocyty sa stavajú do opozície multiplikácii víru zatiaľ čo: • aktivácia imunitného systému prítomnosťou antigénnych determinantov vírusu zvyšuje jeho multiplikáciu v T4 lymfocytoch a makrofágoch (nakoľko stúpa ich produkcia kostnou dreňou) • počas AIDS sú kontraindikované niektoré očkovacie vakcíny • niektoré infekčné agensy podporujú vírusovú replikáciu

4. Prenos vírusu Vírus môže byť izolovaný z väčšiny biologických tekutín: krv, sperma, vaginálne sekréty, materské mlieko, sliny, slzy, moč, cerebro-spinálny mok. Ale enkapsidovaný HIV vírus je veľmi fragilný, môže sa teda prenášať len pri príležitosti „úzkeho“ medziľudského styku. Cesty prenosu sú z toho dôvodu nasledovné: •

predovšetkým sexuálnym stykom sexuálny prenos je najčastejšou príčinou nákazy. Uskutočňuje sa počas homosexuálneho alebo heterosexuálneho styku. Najriskantnejšie je preto viesť uvoľnený sexuálny život s častým striedaním partnerov. Vstupnou bránou je rektálna alebo genitálna sliznica. Genitálne sekréty (sperma, hlien) sú infikované voľnými vírusmi, ale predovšetkým infikovanými bunkami: T4 lymfocytmi a makrofágmi.

•

krvná: toxikománia v Európe kvôli toxikománii, kontaminácia stále stúpa a predstavuje 40% všetkých prípadov infekcie krvná transfúzia

13



pri súčasnej kontrole darovanej krvi predstavuje minimálne, avšak stále prítomné riziko pracovné nehody s krvnými produktmi alebo kontaminovanými objektmi (riziko kontaminácie zapríčinenej pichnutím sa je okolo 0,4%) •

z matky na plod výskyt prenosu vírusu z infikovanej matky na dieťa je celosvetovo odhadovaný na 20%. Závisí predovšetkým od množstva vírusu prítomného v krvi matky: čím vyššie je toto číslo, tým vyššie je riziko prenosu. Tento prenos môže nastať v 35% prípadov in utero, v posledných dvoch mesiacoch tehotenstva, ale hlavne počas pôrodu (65%). Rovnako je možný prenos počas dojčenia. N.B.: 90% infikovaných žien žije v rozvojových krajinách. V Ugande je séropozitívnych 14% tehotných žien.

5. Priebeh infekcie a AIDS Pred nástupom kompletného zlyhania imunitného systému a nástupu AIDS prebieha infekcia v nasledujúcich štádiách: 1° štádium primo-infekcie Môže byť symptomatické alebo asymptomatické, čiže bez klinických prejavov. V prípade symptomatickej primo-infekcie (50% prípadov) sa prejavujú len málo špecifické príznaky: cervikálna adenopatia (choroba miazgových uzlín), horúčka, pharyngitída s dysfágiou (zápal hltanu s ťažkosťami pri prehĺtaní, únava, vyčerpanosť, makulopapulózne vyrážky, myalgia (bolesť svalov). Nakoľko sa tieto príznaky podobajú mnohým akútnym vírusovým infekciám (infekčná mononukleóza napr.) existuje riziko, že primo-infekcia prejde do druhého štádia úplne nepovšimnutá.

Prvé príznaky primo-infekcie sa objavia zhruba na 20. deň od nakazenia. Primo-infekcia trvá 1-3 týždne. Táto fáza zodpovedá intenzívnemu množeniu vírusu a jeho diseminácii. •

vývoj v AIDS prebieha pri symptomatickej primo-infekcii rýchlejšie (vírusová záťaž je relatívne vysoká počas už krátko po nakazení). Imunitný systém na infekciu reaguje a po niekoľkých týždňoch od nákazy sa objavujú prvé anti-HIV protilátky v sére, tento jav sa nazýva sérokonverzia: infikovaná osoba sa stala séropozitívna. 2° asymptomatické štádium Druhá fáza je asymptomatická a môže trvať aj 10-15 rokov. Vírus sa nepretržito replikuje v orgánoch lymfatického systému: T4 lymfocyty pomaly ale neúprosne ubúdajú. 3° klinická fáza Jednoducho povedané, klinická fáza je AIDS: keď počet T4 lymfocytov klesne pod 200/mm3 hovoríme o objavení syndrómu imunodeficiencie. Najčastejším sprievodným znakom je objavenie sa oportúnnych nákaz: oportúnna nákaza je ťažká infekcia vyvolaná

zvyčajne nepatogénnym agensom, s ktorým si zdravá imunita hravo poradí, tento agens však profituje z príležitosti (oportunity), ktorá sa mu ponúka v podobe imunodeficiencie.

Hlavné oportúnne mikroorganizmy sú:

skupina 2a

parazity

Vírusy – HIV

14

Branislav Chrenka

seminárna práca

Toxoplazma

baktérie

Mycobacterium tuberculosis

Cryptosporidium

Mycobacterium avium

Microsporidium

Salmonella

Leishmania huby

Pneumocystis carinii

vírusy

Herpes simplex (HSV)

Cryptococcus neoformans

Cytomegalovirus (CMV)

Candida

Vírus varicella-zoster (VVZ)

Histoplasma capsulatum

Imunodepresia je takisto zodpovedná za vznik rakoviny: • lymfómy • Kaposiho sarkóm: predpokladá sa, že kofaktorom alebo priamo pôvodcom je vírus HHV-8 (human herpervirus) z čeľade Herpesviridae

Dlhodobí nonprogresori Vo väčšine prípadov sa klinické príznaky imunodeficiencie objavia počas desiatich rokov od sérokonverzie. Napriek tomu úzka skupina subjektov (5-10%) sa javí ako klinicky zdravá a imunologicky v norme aj po desiatich rokoch, takéto subjekty sa nazývajú „dlhodobí nonprogresori (nevyvíjači)“ choroby. Kritériá pre zaradenie do skupiny dlhodobých nonprogresorov: • min. 8 rokov trvajúca séropozitivita • asymptomatický klinický stav • stabilná hladina T4 > 500/mm3 • žiadna indikovaná retrovirálna liečba U týchto subjektov je plazmatická vírusová záťaž (plasmatic viral charge) veľmi nízka, skoro až nedetegovateľná, ale pretrváva. Táto skupina subjektov je skutočne heterogénna, zatiaľčo niektorí sú skutočne dlhodobými nonprogresormi, u iných len prebieha rúcanie imunity veľmi pomaly. Rezistencia voči HIV


15


Vo vysokorizikových skupinách (homosexuáli, ktorých partneri zomreli na AIDS, hemofilici, ktorí obdržali infikovanú krv,...) boli objavení jedinci, ktorí nejavili klinické príznaky. Po vyšetrení sa zistilo, že nie sú vírusom vôbec infikovaní. Títo jedinci sú homozygoti nesúci mutáciu na géne kódujúcom koreceptor CCR5: zmutovaný proteín stratil transmembránovú oblasť. Nenachádza sa na membráne a nemôže teda zohrávať svoju úlohu koreceptora pri penetrácii HIV. Táto anomália postihuje okolo 1% bielej populácie.

6. Liečba Základom liečby je silná kombinovaná protivírusová liečba. Cieľom je spomaliť množenie víru a predísť tak zrúteniu imunitného systému. Liečba sa prejaví v zlepšení klinického stavu a predĺžením života, má však i nežiaduce vedľajšie účinky. U tehotných žien výrazne znižuje prenos infekcie na dieťa. 6.1. Čo je to HAART? HAART (Highly Active Antiretroviral Therapy) je termín, ktoré sa používa na označenie troj- alebo viackombinácie antiretrovirálnych liekov alebo kombinovanej terapie. HIV totiž neprestajne vytvára nové mutácie a niektoré verzie získavajú odolnosť voči liekom. Pravdepodobnosť, že sa vírus podarí udržať pod kontrolou sa preto zvyšuje súčasným užívaním viacerých liekov. V súčasnosti už dochádza k infikácii populáciou vírusu, ktorá je voči určitým liekom rezistentná. 6.2.Skupiny antiretroviretík Existujú štyri hlavné skupiny antiretroviretík. Každá z týchto skupín atakuje HIV v rôznych fázach jeho životného cyklu: 6.2.1. Inhibítory fúzie a penetrácie Prvou skupinou sú antiretroviretiká nazývané inhibítory fúzie a penetrácie. Tieto lieky sú ešte len v klinickej testovacej fáze vývoja v UK a USA. Lieky blokujú naviazanie gp41 a gp120 na cieľovú bunku, čím sa výrazne zníži reprodukcia vírusu. Napríklad inhibítor fúzie T-20 sa fixuje na gp41, na rozdiel od ostatných antiretroviretík sa musí podávať intravenózne, nakoľko sa jedná o proteín, ktorý by bol po perorálnom požití strávený v žalúdku. 6.2.2. Nukleozidové inhibítory reverznej transkriptázy Druhou skupinou sú antiretrovírusové lieky nazývané nukleozidové inhibítory reverznej transkriptázy (NRTI- Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors). Boli prvým typom liekov dostupných na liečbu HIV infekcie v roku 1987, viac známe sú pod názvom nukleozid analogické (nucleoside analogues) alebo nukes. Ako už bolo písané, HIV potrebuje pre svoju reprodukciu reverznú transkriptázu. Ako hovorí samotný názov


16


liekov, NRTI tento enzým inhibujú, spomaľujú produkciu retrotranskriptázy a znemožňujú HIV infikovať bunky a množiť sa v nich. 6.2.3. Nenukleozidové inhibítory reverznej transkriptázy Treťou skupinou antiretroviretík sú nenukleozidové inhibítory reverznej transkriptázy (NNRTI Non-Nucleoside Reverse Transcriptase Inhibitors). Tieto lieky sa začali testovať v roku 1997 a všeobecne sa označujú ako nenukleozidové (non-nucleosides) alebo non-nukes. Táto skupina liekov tiež blokuje infikovanie buniek vírusom pôsobením na retrotranskriptázu. Nenukleozidové lieky však pôsobia trochu iným spôsobom než nukleozid analogické, rozdiel tkvie v mechanizme blokácie enzýmu. Tým pádom nenukleozidové lieky blokujú duplikáciu a šírenie HIV vírusu. 6.2.4. Inhibítory proteázy Poslednou skupinou sú antiretrovirálne lieky tzv. inhibítory proteázy (PI - Protease Inhibitor). Po prvý krát boli testované v roku 1995. Ako už meno napovedá tieto lieky inhibujú účinky proteázy, ktorú obsahuje skoro každá živá bunka. Jedná sa o tráviaci enzým štiepiaci proteíny a je jedným z mnohých enzýmov, ktoré HIV používa k svojej reprodukcii. HIV proteáza atakuje dlhé zdravé reťazce enzýmov a proteínov v bunkách a „strihá” ich na krátke úseky. Tieto infikované krátke úseky proteínov a enzýmov potom napádajú ďalšie bunky. Inhibítory proteázy blokujú funkciu HIV proteázy ešte pred tým, než začne strihať okolité proteíny. Vďaka tomu tieto lieky výrazne spomaľujú duplikáciu vírusu a predchádzajú tým infikovaniu ďalších buniek. NRTI a NNRTI pôsobia len na novoinfikované bunky. Inhibítory proteázy sú schopné spomaliť proces dospievania nedospelého a nevirulentného vírusu vo vírus dospelý a virulentný. Lieky účinkujú aj v prípade dávnejšie napadnutých buniek spomalením reprodukcie vírusu.

AIDS. Retrovíry. 1. Objavenie vírusu

Recommend Documents