ABSTRAK PEMBERIAN VITAMIN C PADA FRAKTUR FEMUR TIKUS PUTIH YANG TERPAPAR ALKOHOL MEMILIKI DIAMETER KALUS LEBIH TEBAL SERTA JUMLAH OSTEOBLAS DAN EKSPRESI OSTEOCALCIN LEBIH BANYAK DIBANDINGKAN TANPA PEMBERIAN VITAMIN C Penyembuhan fraktur yang terpapar alkohol secara akut menyebabkan terhambatnya proliferasi dan diferensiasi osteoblas akibat penekanan pada jalur signal wnt/β catenin. Vitamin C memiliki efek merangsang proliferasi dan diferensiasi osteoblas dengan menginduksi ekspresi EB1 untuk menstabilisasi jalur signal wnt/β catenin. Pemberian vitamin C pada fraktur femur yang terpapar alkohol diharapkan dapat meningkatkan penyembuhan fraktur yang ditandai dengan diameter kalus yang lebih besar serta jumlah osteoblas dan ekspresi osteocalcin yang lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian vitamin C. Penelitian eksperimental randomized post-test only group design dengan sampel 32 ekor tikus jantan jenis Wistar. Semua tikus terpapar alkohol selama 3 hari sebelum frakturisasi dengan dosis 2 gr/kg bb, kemudian dibagi menjadi 2 kelompok. Kelompok pertama tidak diberikan vitamin C, kelompok kedua diberikan viamin C 200 mg/kg bb setiap 2 hari selama 2 minggu. Pada akhir minggu kedua dilakukan sakrifasi untuk menilai efek perlakuan dengan pemerikasaan histopatologi diameter kalus, jumlah osteoblas dan pemeriksaan imunohistokimia ekspresi osteocalcin pada daerah fraktur. Analisis statistik didapatkan rerata diameter kalus (µm) pada tikus dengan pemberian vitamin C (3200,845 ± 1149,272) lebih tebal dibandingkan tanpa pemberian vitamin C (2369,807 ± 550,756). Jumlah rerata osteoblas pada tikus dengan pemberian vitamin C (484,000 ± 19,782) lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian vitamin C (468,250 ± 17,280). Ekspresi osteocalcin pada tikus dengan pemberian vitamin C (20,562 ± 3,540) lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian vitamin C (10,625 ± 1,784), pada uji independent t-test didapatkan perbedaan yang signifikan antara kedua kelompok dengan diameter kalus p = 0,014 (p < 0,05), jumlah osteoblas p = 0,023 (p< 0,05) dan ekspresi osteocalcin p = 0,000 (p < 0,05). Pemberian vitamin C pada fraktur femur tikus putih yang terpapar alkohol memiliki diameter kalus yang lebih tebal, jumlah osteoblas dan ekspresi osteocalcin yang lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian vitamin C.
Kata kunci: Penyembuhan Fraktur, Alkohol, Vitamin C, Diameter Kalus, Osteoblas, Osteocalcin
i
ABSTRACT ASCORBIC ACID ADMINISTRATION ON FEMORAL FRACTURED RAT WITH ALCOHOL EXPOSURE HAVE HIGHER CALLUS DIAMETER, OSTEOBLAST AND OSTEOCALCIN EXPRESION COMPARED WITHOUT ASCORBIC ACID ADMINISTRATION Fracture healing with acute alcohol exposure can lead to delayed bone healing. Depression of wnt/β catenin signaling pathway that was caused by alcohol result in decreased of proliferation and differentiation in osteoblast. Ascorbic acid has the ability to promote proliferation and differentiation in osteoblast with induced EB1 for stabilization of wnt/β catenin signaling pathway. Ascorbic acid administration was hoped to increase fracture healing time with increase callus diameter, increase number of osteoblast and increase in number of osteocalcin expression compared to those without ascorbic acid administration. The research was an experimental study with randomized post-test only group design that was consists of 32 male Wistar rat as subject. All of rat were exposed by alcohol with dossage 2 gr/kb bw for 3 days and divided into 2 groups. The first group was without ascorbic acid administration and the second group with ascorbic acid administration at a dosage of 200 mg/kg bw every 2 day for 2 weeks. At the end of the second week callus diameter, osteoblast and osteocalcin expression on fracture area was measured. Statistical analysis showed that was higher callus diameter (µm) with ascorbic acid administration (3200,845 ± 1149,272) compared with the group without ascorbic acid administration (2369,807 ± 550,756). Osteoblast count was higher with ascorbic acid administration (484,000 ± 19,782) compared with the group without ascorbic acid administration (468,250 ± 17,280) and osteocalcin expression count was higher with ascorbic acid administration (20,562 ± 3,540) compared with the group without ascorbic acid administration (10,625 ± 1,784). Independent t-test analysis showed that the difference was significant, with callus diameter p=0,014 (p< 0,05), osteoblast number p=0,023 (p< 0,05) and osteocalcin expression p=0,000 (p < 0,05). Ascorbic acid administration on femoral fractured rat with alcohol exposure have higher callus diameter, osteoblast and osteocalcin expression compared with group without ascorbic acid administration.
Keywords: fracture healing, alcohol, ascorbic acid, callus diameter, osteoblast, osteocalcin
ii
DAFTAR ISI SAMPUL DALAM .................................................................................................. i PRASYARAT GELAR ........................................................................................... ii LEMBAR PENGESAHAN ................................................................................... iii PENETAPAN PANITIA PENGUJI ...................................................................... iv SURAT PERNYATAAN BEBAS PLAGIAT........................................................ v UCAPAN TERIMA KASIH .................................................................................. vi ABSTRAK ........................................................................................................... vii ABSTRACT ......................................................................................................... viii DAFTAR ISI ........................................................................................................ iiix ABSTRAK .............................................................................................................. i ABSTRACT ............................................................................................................ ii DAFTAR ISI .......................................................................................................... iii DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. vi DAFTAR TABEL DAN SKEMA ........................................................................ vii DAFTAR SINGKATAN ..................................................................................... viii DAFTAR LAMPIRAN .......................................................................................... ix BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1 1.1 Latar Belakang ...................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah ................................................................................. 6 1.3 Tujuan Penelitian .................................................................................. 6 1.3.1 Tujuan Umum ................................................................................ 6 1.3.2 Tujuan Khusus ............................................................................... 7 1.4 Manfaat Penelitian ................................................................................ 7
iii
1.4.1 Manfaat akademis .......................................................................... 7 1.4.2 Manfaat praktis .............................................................................. 7 BAB II KAJIAN PUSTAKA .................................................................................. 8 2.1 Anatomi dan Histologi Tulang .............................................................. 8 2.2 Proses Penyembuhan Pada Fraktur ..................................................... 13 2.3 Regulasi molekular osteoblas .............................................................. 17 2.4 Nutrisi yang Mempengaruhi Penyembuhan Fraktur ........................... 19 2.5 Alkohol ................................................................................................ 20 2.6 Vitamin C ............................................................................................ 25 2.7. Perlakuan Hewan Coba ...................................................................... 28 BAB III KERANGKA BERPIKIR, KONSEP DAN HIPOTESIS ....................... 30 3.1 Kerangka Berpikir ............................................................................... 30 3.2 Kerangka Konsep Penelitian ............................................................... 32 3.3 Hipotesis Penelitian ............................................................................. 33 BAB IV METODELOGI PENELITIAN .............................................................. 34 4.1 Rancangan Penelitian .......................................................................... 34 4.2 Tempat dan Waktu Penelitian ............................................................. 35 4.3 Populasi dan Sampel ........................................................................... 36 4.3.1 Populasi ....................................................................................... 36 4.3.2 Kriteria Subjek............................................................................. 36 4.3.3 Besar Sampel ............................................................................... 36 4.3.4 Teknik penentuan sampel ............................................................ 38 4.4 Variabel Penelitian .............................................................................. 38 4.4.1 Klasifikasi variabel ...................................................................... 38 4.4.2 Definisi operasional variabel ....................................................... 38
iv
4.5 Alat dan Bahan Penelitian ................................................................... 40 4.6 Prosedur Penelitian .............................................................................. 42 4.6.1 Hewan coba ................................................................................. 42 4.6.2 Cara kerja..................................................................................... 42 4.6.3 Pembuatan Sediaan Histopatologis dan Imunohistokimia .......... 45 4.7 Alur Penelitian..................................................................................... 47 4.8 Analisis Data ....................................................................................... 48 BAB V HASIL PENELITIAN............................................................................. 49 5.1 Analisis Sampel ................................................................................... 49 5.1.1 Analisis deskriptif ........................................................................ 49 5.2 Analisis Inferensial .............................................................................. 50 5.2.1 Uji normalitas dan homogenitas .................................................. 51 5.2.2 Uji Independent T-Test................................................................ 52 BAB VI PEMBAHASAN HASIL PENELITIAN ................................................ 54 6.1 Subjek Penelitian................................................................................. 54 6.2 Hubungan Pemberian Vitamin C dengan Diameter Kalus Pada Fraktur Femur Tikus Yang Terpapar Alkohol. ................................................ 55 6.3 Hubungan Pemberian Vitamin C dengan Jumlah Osteoblas Pada Fraktur Femur Tikus Yang Terpapar Alkohol. ................................................ 56 6.4 Hubungan Pemberian Vitamin C dengan Ekspresi Osteocalcin Pada raktur Femur Tikus Yang Terpapar Alkohol. .................................... 57 BAB VII SIMPULAN DAN SARAN .................................................................. 59 7.1 Simpulan ............................................................................................. 59 7.2 Saran.................................................................................................... 59 DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 60
v
DAFTAR GAMBAR
Gambar 2.1 Anatomi tulang panjang ...................................................................... 9 Gambar 2.2 Gambaran Histologi Osteoblas.......................................................... 11 Gambar 2.3 Gambaran Histologi Osteosit ............................................................ 12 Gambar 2.4 Gambaran Histologi Osteoklas.......................................................... 12 Gambar 2.5 Fase Penyembuhan Fraktur Tulang Panjang pada Manusia .............. 13 Gambar 2.6 Tahap Penyembuhan Fraktur pada Tikus .......................................... 15 Gambar 2.7 Faktor transkripsi dan faktor pertumbuhan yang merangsang proliferasi osteoblas di setiap stadium yang berbeda ....................... 17 Gambar 2.8 Intracellular Signaling Pathways dalam regulasi pembentukan osteoblas........................................................................................... 18 Gambar 2.9 Asam askorbat (Asc) memfasilitasi diferensiasi osteogenik dengan meningkatkan sekresi kolagen tipe 1 ............................................... 27 Gambar 2.10 Mekanisme pengaruh EB1-β catenin pada diferensiasi osteoblas yang diinduksi oleh asam askorbat .................................................. 28
vi
DAFTAR TABEL DAN SKEMA
Skema 3.1 Kerangka Berpikir Penelitian .............................................................. 31 Skema 3.2 Kerangka Konsep Penelitian ............................................................... 32 Skema 4.1 Rancangan Penelitian…........................................................................34 Skema 4. 2 Alur Penelitian.................................................................................... 47 Tabel 5.1 Distribusi frekuensi subjek penelitian masing-masing kelompok…......49 Tabel 5. 2 Rerata diameter kalus, jumlah osteoblas dan ekspresi osteocalcin
pada
masing-masing kelompok ..................................................................... 50 Tabel 5.3 Uji normalitas data variabel penelitian dengan Shapiro-Wilk .............. 51 Tabel 5.4 Uji homogenitas varian data variabel penelitian dengan Levene's test . 51 Tabel 5.5 Hasil uji komparabilitas data post-test variabel penelitian untuk kelompok perlakuan dan kontrol ........................................................................... 52
vii
DAFTAR SINGKATAN
AA
: Asam Askorbat/Vitamin C
AP-1
: activator protein-1
BMD
: Bone Marrow Density
BMU
: Basic multicellular units
BMP-2
: bone morphogenic protein 2
BRU
: Bone remodeling units
Cox-2
: cyclo-oxygenase-2
CREB
: cAMP responsive element binding protein
CTX
: C-terminal telopeptide
DPD
: deoxypyridinoline
ER-α
: estrogen receptor-α
GSK-3β
: glikogen sintase kinase-3β
HYP
: hydroxyproline
IGF-1
: Insulin Growth Factor-1
MAPK
: mitogen-activated protein kinase
MSC
: Mesenchymal stem cell
NF-B
: nuclear factor-B
NTX
: N-terminal telopeptide
OPG
: Osteoprotegerin
PYD
: pyridinoline
PKA
: protein kinase-A
PLC
: Phospholipase-C
RANKL
: Receptor activator of nuclear factor kappa-B ligand
SMADs
: mothers against decapentaplegic homolog
TCF/LEF
: T-cell factor/lymphoid enhancer factor
TGF-β
: Transforming Growth Factor-β
TRAP
: tantrate-resistant acid phospatase
viii
DAFTAR LAMPIRAN
Lampiran 1. Surat Keterangan Kelaikan Etik Lampiran 2. Surat Keterangan Selesai Melakukan Penelitian Lampiran 3. Surat Keterangan Hasil Pemeriksaan Histopatologi dan Imunohistokimia Lampiran 4. Data Analisis SPSS Lampiran 5. Hasil Pemeriksaan Histopatologis dan Imunohistokimia Lampiran 6. Foto Dokumentasi Penelitian
ix
BAB I PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang Alkohol merupakan faktor risiko untuk kerusakan tulang dan penyembuhan fraktur. Konsumsi alkohol yang berlebihan menyebabkan terhambatnya penyembuhan fraktur. Penyembuhan fraktur yang terhambat menyebabkan morbiditas dan pembiayaan yang tinggi pada penanganannya, oleh karena itu perlu dilakukan bagaimana cara memperbaiki penyembuhan fraktur yang terhambat pada penderita dengan konsumsi alkohol yang berlebihan. Konsumsi alkohol yang berlebihan merupakan salah satu faktor yang menghambat penyembuhan fraktur selain faktor usia, komorbiditas dan obatobatan. Peningkatan usia merupakan faktor dalam penghambatan penyembuhan fraktur. Studi klinis telah menunjukkan pasien dengan komorbid diabetes mellitus memiliki insiden nonunion, delayed union mencapai dua kali lipat dibandingkan dengan pasien non diabetes. Pasien dengan fraktur harus memiliki status gizi yang baik terutama kalsium, fosfor, protein, vitamin C dan D yang merupakan faktor yang mempengaruhi penyembuhan patah tulang (Gaston & Simpson 2007). Faktor yang mempengaruhi penyembuhan patah tulang yaitu faktor lokal dan sistemik, dimana faktor lokal meliputi infeksi, tumor/keganasan, radioterapi, jaringan lunak yang cedera, derajat bone loss, reduksi fraktur, Cedera neurovaskular, tempat cedera pada tulang (daerah diafisis lebih lambat dari metafisis), interposisi jaringan lunak pada tempat fraktur, fiksasi fraktur yang
1
2
digunakan. Konsumsi alkohol, merokok, diabetes mellitus, nutrisi, umur, obatobatan, dan hormon merupakan contoh faktor sistemik yang menyebabkan penghambatan penyembuhan fraktur (Little et al. 2011). Faktor sistemik seperti pemberian kortikosteroid yang berkepanjangan menyebabkan osteoporosis dan peningkatan risiko fraktur sebagai akibat dari efek penghambatan pada produksi IGF-1 (Insulin Growth Factor 1) dan TGF-β (Tumor Growth Factor β). Faktor sistemik yang lain yaitu konsumsi alkohol meningkatkan insiden terhambatnya penyembuhan fraktur dibandingkan dengan pasien tanpa alcohol. Alkohol menyebabkan osteopenia karena penurunan pembentukan tulang dan peningkatan penyerapan tulang (Gaston & Simpson 2007). Tingkat fraktur antara pecandu alkohol hingga empat kali lebih tinggi dibandingkan dengan non-pecandu alkohol dimana sering datang dengan osteopenia atau osteoporosis. Selain itu, keracunan alkohol akut ditunjukkan dalam 25-40% dari pasien dengan trauma orthopaedi. Penyembuhan fraktur memerlukan mobilisasi dan diferensiasi sel-sel mesenchymal dan prekursor osteoblas dari tempat cedera (Lauing et al. 2013). Konsumsi alkohol jangka panjang dapat mengganggu pertumbuhan dan penggantian jaringan tulang (bone remodeling) yang mengakibatkan kepadatan tulang menurun dan peningkatan risiko fraktur. Secara histologis penurunan pembentukan tulang ditandai dengan berkurangnya serum osteocalcin, protein yang disekresikan oleh osteoblas. Penurunan tingkat osteocalcin setelah asupan alkohol menunjukkan bahwa alkohol memiliki efek toksik pada aktivitas dan proliferasi osteoblast (Elmali et al. 2002).
3
Konsumsi alkohol kronis dikaitkan dengan peningkatan risiko fraktur dan kejadian osteoporosis. Dalam studi in vitro yang menyelidiki efek alkohol pada tulang telah menunjukkan berkurangnya jumlah dan fungsi osteoblas dan juga menunjukkan kemungkinan peningkatan jumlah osteoklas yang mengakibatkan peningkatan resorpsi tulang (Dyer et al. 1998). Pada studi in vitro menunjukkan bahwa paparan etanol menghambat proliferasi sel osteoblas. Analisis histomorfometrik pada tulang manusia menunjukkan penurunan volume tulang trabekular, penurunan jumlah osteoblas, penurunan tingkat aposisi mineral tulang, dan penurunan tingkat pembentukan tulang dengan peningkatan waktu mineralisasi tulang serta terjadi peningkatan resorpsi tulang, yang menunjukkan gangguan pembentukan dan mineralisasi tulang (Dyer et al. 1998). Pada studi in vivo, alkohol menyebabkan penekanan fungsi dan jumlah osteoblas, sedangkan pada penelitian in vitro menunjukkan dampak langsung alkohol pada diferensiasi osteoblas. Pada sumsum tulang manusia terdapat mesenchymal stem cell (MSC), yang merupakan cikal bakal dari adiposit, osteoblas dan kondrosit, dimana pada penelitian in vitro paparan alkohol menyebabkan induksi osteogenik yang menurunkan ekspresi kolagen tipe I, yang merupakan 90 % dari matriks tulang. Selain itu, paparan alkohol menekan marker osteogenesis pada MSC pada saat pembentukan osteoblas (Wezeman & Gong 2004). Pada penelitian hewan coba pada tikus dimana alkohol diberi secara peroral yang mengandung 35 % etanol selama 6 minggu. Pada pemeriksaan histopatologi tulang tibia menunjukkan penurunan jumlah permukaan tulang yang
4
mengandung osteoblas aktif dan penurunan ketebalan dinding tulang secara signifikan (Dyer et al. 1998). Pada studi Eksperimental lain yaitu penyembuhan fraktur tibia pada tikus yang diberi diet cair yang mengandung 7,2 % etanol selama 8 minggu kemudian dilakukan studi histologis dan osteodensitometrik menunjukkan bahwa tikus yang diberi diet yang dicampur dengan etanol secara histologis terjadi penyembuhan fraktur yang tertunda. Selain efek negatif etanol pada metabolisme tulang, juga mengganggu proses penyembuhan fraktur (Elmali et al. 2002). Pada percobaan hewan coba pada tikus yang diberi alkohol jenis etanol 20% dengan cara injeksi intraperitoneal dengan dosis 2 g/kg berat badan perhari selama 3 hari berturut-turut kemudian dilakukan frakturisasi tibia dan difiksasi intramedulary wire. Pada hari ke-14 post fraktur didapatkan penurunan volume kalus fraktur, diameter, dan kekuatan biomekanik tulang. Secara histologi menunjukkan penurunan pembentukaan tulang dan tulang rawan pada daerah fraktur, dan alkohol yang menghambat maturasi tulang rawan (Lauing et al. 2013). Vitamin C atau asam askorbat (AA) adalah vitamin yang larut dalam air yang penting untuk pembentukan kolagen, kulit, tendon, ligamen, dan pembuluh darah serta penyembuhan luka dan pemeliharaan tulang rawan, tulang, dan gigi. Asam askorbat merupakan antioksidan yang berguna untuk menekan radikal bebas yang dapat merusak organ-organ, jaringan, dan sel (Hon 2013). Vitamin C menunjukkan dapat menginduksi mesechymal stem cell untuk berubah menjadi osteoblas. Mekanisme vitamin C yang menginduksi proliferasi osteoblas dimediasi melalui sintesis kolagen tipe I, interaksi antara alpha2- dan beta1-integrin, aktivasi
5
dari mitogen-activated protein kinase pathway, dan fosforilasi osteoblast-specific transcription factors (Carinci et al. 2005). Proses penyembuhan fraktur memerlukan nutrisi untuk sistem skeletal lebih banyak daripada normal (Brown 1999). Nutrisi yang diperlukan dapat berupa bahan yang bersifat antioksidant seperti vitamin E, Vitamin C, atau alpha-lipoic acid, serta beberapa mineral penting dalam bone turnover seperti kalsium, fosfor, atau zinc. Protein dalam bentuk asam amino juga dibutuhkan untuk pembentukan produk kolagen tipe-I sebagai bahan matriks tulang (Brown 1999; Sousa et al. 2015). Pada percobaan hewan coba pada tikus dimana diberi vitamin C dengan cara injeksi intraperitoneal dengan dosis 200 mg/kg berat badan perhari selama 3 hari berturut-turut sebelum dilakukan fraktur dan fiksasi pada tulang tibia dan dilanjutkan pemberian 3 kali seminggu selama 3 minggu, menunjukkan pada minggu kedua dan ketiga kalus pada tikus yang diberi vitamin C lebih tinggi secara radiologis dan histologis dibandingkan dengan kalus pada tikus tanpa pemberian vitamin C (Sarisözen et al. 2002). Mekanisme penyembuhan fraktur yang terhambat akibat terpapar alkohol disebabkan karena penekanan terhadap aktivitas dan proliferasi osteoblas. Jika aktivitas dan proliferasi osteoblas dapat diperbaiki maka penyembuhan fraktur yang terhambat akibat terpapar alkohol dapat ditanggulangi. Vitamin C memiliki efek menginduksi proliferasi osteoblas, maka perlu dilakukan penelitian efek vitamin C pada penyembuhan fraktur yang terpapar alkohol.
6
1.2 Rumusan Masalah Berdasarkan uraian dalam latar belakang masalah di atas, dapat dirumuskan pertanyaan penelitian sebagai berikut: 1. Apakah pemberian vitamin C pada fraktur tulang femur tikus putih yang terpapar alkohol menunjukkan diameter kalus yang lebih
tebal
dibandingkan tanpa pemberian vitamin C 2. Apakah pemberian vitamin C pada fraktur tulang femur tikus putih yang terpapar alkohol menunjukkan jumlah osteoblas yang lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian vitamin C 3. Apakah pemberian vitamin C pada fraktur tulang femur tikus putih yang terpapar alkohol menunjukkan ekspresi osteocalcin yang lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian vitamin C
1.3 Tujuan Penelitian 1.3.1
Tujuan Umum Membuktikan pemberian vitamin C pada fraktur femur tikus putih yang terpapar alkohol menunjukkan penyembuhan fraktur yang lebih baik dibandingkan tanpa pemberian vitamin C.
7
1.3.2
Tujuan Khusus
1. Membuktikan pemberian vitamin C pada fraktur tulang femur tikus putih yang terpapar alkohol menunjukkan diameter kalus yang lebih tebal dibandingkan tanpa pemberian vitamin C 2. Membuktikan pemberian vitamin C pada fraktur tulang femur tikus putih yang terpapar alkohol menunjukkan jumlah osteoblas yang lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian vitamin C. 3. Membuktikan pemberian vitamin C pada fraktur tulang femur tikus putih yang terpapar alkohol menunjukkan ekspresi osteocalcin yang lebih banyak dibandingkan tanpa pemberian vitamin C.
1.4 Manfaat Penelitian 1.4.1
Manfaat akademis Menambah wawasan ilmu pengetahuan tentang pengaruh vitamin C mempercepat penyembuhan fraktur yang terpapar alkohol.
1.4.2
Manfaat praktis Bila hasil penelitian vitamin C terbukti dapat mempercepat penyembuhan fraktur yang terpapar alkohol, maka vitamin C dapat digunakan sebagai salah satu alternatif untuk mempercepat penyembuhan fraktur yang terpapar alkohol
