Gambaran Infiltrasi Sel Inflamatori Paru dan Aktivitas Enzim Superoksida Dismutase (SOD) pada Hewan Model Tikus (Rattus norvegicus) Asma yang Terpapar Lipopolisakarida Lung Inflammatory Cells Infiltration and Superoxide Dismutase (SOD) Enzyme Activity in Asthma Rat (Rattus norvegicus) Model Exposed by Lypopolysaccharide Galuh P. Prameswari, Aulanni’am, Dyah K. Wuragil Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan, Universitas Brawijaya
[email protected],
[email protected] ABSTRAK Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui tingkat keparahan asma hewan model tikus (Rattus norvegicus) yang diinduksi lipopolisakarida (LPS) berdasar gambaran infiltrasi sel inflamatori histopatologi paru dan aktivitas enzim superoksida dismutase (SOD). Penelitian ini menggunakan tiga kelompok tikus, yang masing-masing terdiri dari 6 ekor tikus, yaitu kelompok kontrol, kelompok asma, dan kelompok asma yang terpapar LPS. Sensitisasi alergi dilakukan dengan injeksi intraperitonial OVA sebanyak 10 µg/ml yang diemulsi di dengan 1,5 mg AlOH 3, dilanjutkan dengan nebulasi 1 mg/ml OVA selama 20 menit. Paparan LPS dilakukan dengan cara menginjeksikan 1 µg/ml LPS bakteri Phorpyromonas ginggivalis pada sulkus gingiva tikus. Gambaran infiltrasi sel inflamatori pada histopatologi paru diamati secara kualitatif menggunakan mikroskop BX51 sedangkan aktivitas enzim SOD diukur menggunakan SOD Activity Assay Kit. Hasil penelitian menunjukkan terjadi peningkatan infiltrasi sel inflamatori secara kualitatif. Aktivitas enzim SOD menurun signifikan (p<0,05) pada kelompok asma yang terpapar LPS (98,17±0,48 U/ml) dan kelompok asma (100,74±1,06 U/ml), dibandingkan dengan kelompok normal (109,17±1,85 U/ml). Kesimpulan dari penelitian ini yaitu, paparan LPS secara intrasulkular mampu meningkatkan infiltrasi sel inflamatori dan menurunkan aktivitas SOD yang mengindikasikan adanya keparahan asma yang disebabkan oleh paparan LPS akibat interaksi molekul radikal bebas yang semakin reaktif.
Kata Kunci : Asma, LPS, SOD, infiltrasi sel inflamatori ABSTRACT This research was conducted to determine asthma severity in the rat model (Rattus norvegicus) which exposed by Lypopolysaccharide (LPS) in oral cavity based on inflammatory cells infiltration of airway histopathology and Superoxide Dismutase (SOD) enzyme activity. Three groups of rat (Rattus norvegicus), each groups contain six rats, were used in this research which were control group, asthma group, and exposed LPS asthma group. Allergy sensitization was conducted by intraperitonial injection of 10 μg/ml ovalbumin (OVA), emulsified in 1,5 mg AlOH3, followed by 20min 1mg/ml OVA by nebulizer. LPS exposure was conducted by injection of 1µg/ml Phorpyromonas ginggivalis LPS in rat’s gingival sulcus. Inflammatory cells infiltration was observed qualitatively by Olympus BX51 microscope and SOD activity was assessed by SOD Activity Assay Kit. The result showed, infiltration of inflammatory cells was increased qualitatively in LPS asthma group and asthma group. The activity of SOD enzyme was decreased significantly (p<0,05) in LPS asthma group (98,17±0,48 U/ml) and asthma group (100,74±1,06 U/ml), compared with normal group (109,17±1,85 U/ml). In conclusion, intrasulcullary LPS exposure increased inflammatory cells infiltration and decreased SOD activity, indicates that LPS exposure contributes in asthma severity because of free radical molecules interaction reactively. Keywords: Asthma, LPS, SOD, inflammatory cells infiltration 1
obstruksi saluran napas, inflamasi kronis saluran pernafasan yang ditandai dengan aktivasi dan degranulasi eosinofil, sel
PENDAHULUAN Asma merupakan sindrom pernapasan yang kompleks yang ditandai dengan mast, dan limfosit, serta diikuti dengan hiperesponsivitas, hipersekresi mukus, edema dinding saluran pernapasan, deskuamasi epitel, dan remodelling dari saluran pernafasan (Busse & Lemanske, 2001; Barnes et al., 2003; National Heart, Lung, Blood Institute, 2007). Beberapa data terbaru dari hasil studi epidemiologi menyebutkan bahwa lipopolisakarida (LPS) dari bakteri Gram negatif merupakan faktor resiko yang menyebabkan keparahan asma dan peningkatan jumlah LPS pada lingkungan memiliki korelasi positif dengan peningkatan kejadian dan keparahan asma (Strohmier et al., 2001). Utomo (2006), salah satu sumber LPS yang dapat menginduksi respon imun sistemik adalah dari bakteri Phorpyromonas ginggivalis penyebab periodontitis, namun hubungan infeksi mulut dan asma belum banyak dibahas. Paparan LPS pada penderita asma akan mengakibatkan peningkatan respon imun tubuh berupa peningkatan aktivasi produksi sel dan mediator inflamasi, diikuti dengan pembentukan molekul radikal bebas. Aktivitas molekul radikal bebas yang semakin reaktif menyebabkan kondisi tubuh mengalami kondisi stres oksidatif, ditandai dengan inaktivasi enzim antioksidan seperti enzim superoksida dismutase (SOD). Perubahan struktur saluran pernapasan, seperti infiltrasi sel inflamatori pada saluran pernapasan juga mempengaruhi inaktivasi enzim SOD (Caramori & Papi, 2004; Comhair et al., 2005). Oleh karena itu, pada penelitian ini dipelajari mekanisme keparahan asma berdasarkan aktivitas antioksidan enzimatis yaitu SOD dalam fungsinya sebagai scavenger radikal bebas dan keparahan jaringan paru akibat proses inflamasi berdasarkan gambaran infiltrasi sel inflamatori pada histopatologi paru tikus (Rattus norvegicus) model asma.
MATERI DAN METODE Perlakuan Hewan Coba Hewan model asma yang digunakan adalah tikus (Rattus norvegicus) jantan strain Wistar yang diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta dengan umur 8-12 minggu dan berat badan antara 150-250 gram serta sudah mendapatkan sertifikat laik etik dari Komisi Etik Penelitian Universitas Brawijaya No. 77-KEP-UB. Tatalaksana Sensitisasi Alergi Sensitisasi alergi pada tikus dilakukan pada hari ke-1 dan ke-14 dengan injeksi ovalbumin (Sigma-Aldrich, Nomer Katalog: A5503) 10 μg/ml secara intraperitoneal dalam AlOH3 dalam PBS (phosphate buffer saline). Inhalasi tikus dilakukan pada hari ke-21 dalam tabung transparan yang dihubungkan dengan Nebulizer. Perlakuan pemicu asma dilakukan dengan nebulasi OVA dalam NaCl steril dengan dosis dari 1 mg/ml selama 20 menit. Tatalaksana Injeksi Lipopolisakarida (LPS) Injeksi LPS intrasulkuler dilakukan pada hari ke-10 dan ke-11 dengan dosis 1 μg/ml pada sulkus gingiva molar rahang atas kiri tikus. LPS yang digunakan adalah LPS1435/1449 dari Porphyromonas gingivalis (Astarte Biologics, Nomer Katalog: 7010) yang berfungsi sebagai agen infeksi rongga mulut dan memodulasi respon imun. Pengukuran Aktivitas Superoksida Dismutase (SOD) Pengukuran aktivitas SOD menggunakan Superoxide Dismutase Assay Kit (Bio Vision, Nomer Katalog: K335-100) dan dihitung dengan rumus berikut : 2
Aktivitas SOD =
(Ablank1-Ablank3) – (Asampel-Ablank2) x 100 (Ablank1-Ablank3)
eosin (HE). Gambaran infiltrasi sel inflamatori diamati secara kualitatif menggunakan mikroskop Olympus BX51 dengan perbesaran lemah (100x) hingga perbesaran kuat (400x).
Pengamatan Gambaran Infiltrasi Sel Inflamatori Organ paru tikus diambil untuk dibuat preparat dengan metode parafin dan menggunakan pewarnaan hematoksilin HASIL DAN PEMBAHASAN
Keterangan. Struktur Histologi bronkiolus tikus (200x); kontrol negatif asma (a); asma tanpa paparan LPS (b), dan asma dengan paparan LPS (c); daerah infiltrasi sel inflamatori (tanda panah merah), insert (b’ dan c’) infiltrasi inflamatori (tanda panah hitam) (400x); bar 50μm.
Gambar 1. Gambar infiltrasi sel inflamatori pada histopatologi paru tikus Gambar 1.a merupakan gambaran bronkiolus tikus normal yang terdiri atas gambaran normal lapisan epitel semu silindris bersilia, lamina propria tipis, dan selapis otot polos. Gambar 1. juga menunjukkan adanya perbedaan gambaran histopatologi tikus asma tanpa paparan LPS (b) dan tikus asma yang terpapar LPS (c). Kelompok tikus asma tanpa paparan LPS menunjukkan adanya infiltrasi sel inflamatori di area parenkima peribronkial. Sel inflamatori tersebut diduga adalah eosinofil yang terlihat berbentuk bulatan
dengan sitoplasma berwarna merah muda dan inti berwana ungu kebiruan. Inti sel terlihat memiliki dua lobi yang dipisahkan oleh bahan inti sebagai benang seperti yang terlihat pada gambar insert (gambar 1. b’ dan c’). Hal tersebut sesuai dengan penelitian Palmans et al. (2002) yang menyebutkan bahwa tikus yang disensitisasi dengan cara injeksi dan inhalasi ovalbumin mengalami peningkatan jumlah eosinofil di peribronchial dan perubahan struktur seperti hiperplasia sel goblet dan deposisi 3
febronektin. Filipović & Cekić (2001) menambahkan bahwa peningkatan eosinofil sudah dapat terlihat 7 jam setelah paparan alergen. Eosinofil teraktivasi yang bermigrasi ke saluran pernapasan, seperti yang terlihat pada gambaran histopatologi bronkiolus tikus (Gambar 1.b) mengandung protein sitotoksik, sitokin, mediator lipid, dan molekul oksigen reaktif. Gambaran tersebut sesuai dengan hasil penelitian Infiltrasi eosinofil tersebut akan terlihat semakin banyak pada gambaran bronkiolus tikus asma yang terpapar LPS (Gambar 1.c), sesuai dengan gambaran histopatologi yang dikemukakan oleh Yong et al. (2006) bahwa terjadi peningkatan infiltrasi eosinofil pada mencit asma yang dipapar LPS. Paparan LPS pada tikus asma akan direspon oleh Toll-Like Receptor-4 (TLR4) dan protein ekstraseluler, yaitu LPS Binding Protein (LBP), CD-14, dan Myeloid Differentiation Protein (MD-2). Interaksi tersebut akan mengakibatkan teraktivasinya faktor transkripsi dan sinyal transduksi yang akan merangsang ekspresi sel dan mediator inflamatori. Sel inflamatori teraktivasi akan memasuki saluran pernapasan melalui migrasi yang dinisiasi oleh faktor kemoatraktan serta melalui mekanisme seluler yang spesifik
dan terkoordinasi di setiap tahapan ekstravasasi termasuk adesi, kemotaksis, dan aktivasi. Sel inflamatori, khususnya eosinofil, akan melepaskan molekul radikal bebas eosinofil peroksidase (EPO) dan myeloperoksidase (MPO) dan protein toksik yaitu major basic protein (MBP) eosinophil cationic protein (ECP), eosinophil-derived neurotoxin (EDN), dan eosinophil peroxidase (EPO), LTC 4, dan platelete activating factor (PAF) sehingga terjadi kerusakan epitel saluran napas serta degranulasi basofil dan sel mast. Radikal bebas tersebut akan berinteraksi dengan molekul radikal bebas yang terbentuk saat proses inflamasi akibat pemberian OVA. Interaksi antar molekul radikal bebas menimbulkan molekul radikal bebas yang semakin reaktif, seperti nitrogen dioksida dan peroksinitrit sehingga menyebabkan saluran pernapasan mengalami kondisi stres oksidatif. Kondisi stres oksidatif merupakan manifestasi dari tidak seimbangnya molekul radikal bebas dan enzim antioksidan karena enzim antioksidan mengalami inaktivasi. Berdasarkan hasil penelitian ini, inaktivasi enzim antioksidan khususnya enzim SOD dapat terlihat dari menurunnya aktivitas enzim SOD seperti yang terlihat pada gambar dibawah ini:
b
c
a
Gambar 2. Perbandingan rata-rata nilai aktivitas SOD (U/ml) pada kelompok tikus percobaan 4
Kelompok tikus asma yang terpapar LPS memiliki aktivitas SOD lebih rendah (98,17±0,48 U/ml) daripada kelompok tikus asma yang tidak terpapar LPS (100,74±1,06 U/ml), sedangkan kedua kelompok memiliki nilai aktivitas SOD lebih rendah dibandingkan kelompok kontrol (109,17±1,85 U/ml). Hasil uji statistik (One-Way ANOVA) (Lampiran 9) menggunakan SPSS 16.0 for Windows nilai p-value (P<0,05) sebesar 0,000 menunjukkan adanya perbedaan yang nyata antara kelompok kontrol dengan kedua kelompok. Hal tersebut menunjukkan bahwa paparan LPS pada tikus asma dapat memperparah keadaan asma yang ditandai dengan menurunnya aktivitas SOD. Berdasarkan data hasil penelitian ini pemberian OVA sebanyak 10µg/ml dengan ajuvan AlOH3 sebanyak 1,5 mg secara intraperitonial yang dilanjutkan secara inhalasi sebanyak 1 mg/ml akan menghasilkan tikus asma dengan aktivitas enzim SOD sebesar 100, 74 U/ml. Aktivitas enzim SOD tersebut memiliki nilai yang lebih rendah daripada kelompok tikus kontrol yang tidak diberikan alergen apa-apa yaitu sebesar 109, 17 U/ml. Penurunan aktivitas enzim SOD tersebut merupakan akibat dari inflamasi yang ditimbulkan oleh pemberian OVA. Keadaan tersebut sesuai dengan pernyataan (Rifa’i, 2011) yang menyebutkan bahwa OVA merupakan protein yang berfungsi sebagai alergen yang mampu mengaktifkan sitokin Th2 dan berikatan dengan MHC kelas II. Selain itu, menurut Oosterhout et al.. (1998) sitokin Th2 akan meningkat aktivasinya apabila ditambahkan dengan ajuvan AlOH3. Paparan LPS Porphyromonas ginggivalis diberikan secara intrasulkular pada sulkus gingiva molar rahang tikus adalah untuk membuat keadaan infeksi pada rongga mulut tikus sesuai dengan penelitian Utomo (2006) yang membuktikan adanya keparahan asma
pada pasien penderita periodontitis. Keparahan tersebut diyakini berkaitan dengan mekanisme penggantian neurogenic (neurogenic switching mechanism) yang dikemukakan oleh Meggs yaitu mekanisme yang saling mempengaruhi antara inflamasi imunogenik dan neurogenik sehingga rangsangan inflamasi pada jaringan tertentu akan mengakibatkan inflamasi pada jaringan lainnya (Utomo, 2006). Hasil penghitungan aktivitas enzim SOD pada kelompok tikus asma yang terpapar LPS menunjukkan nilai yang lebih rendah dari kelompok tikus asma (100,74 U/ml) dan kelompok tikus kontrol (109,17 U/ml), yaitu sebesar 98,17 U/ml. Hal tersebut membuktikan pemberian LPS bakteri gram negatif dengan dosis 1 μg/ml terbukti dapat memperparah keadaan asma ditandai dengan menurunnya aktivitas SOD. Hal tersebut didukung oleh pernyataan Yoon et al. (2007) dan Eisenbarth et al. (2002) dalam penelitiannya yang membuktikan bahwa pada hewan coba yang sudah diinduksi alergen, paparan LPS dosis rendah (0,1 μg dan1 μg) akan memperparah asma tipe 2 yang ditandai dengan aktivasi sitokin Th2, hiperesponsivitas saluran pernapasan, inflamasi eosinofil, dan peningkatan regulasi IgE spesifik alergen. Penurunan SOD pada kelompok tikus asma terpapar LPS terjadi karena LPS mengaktivasi makrofag, neutrofil, fibroblast, sel mast yang selanjutnya akan melepaskan beberapa senyawa sitokin yaitu tumor necrosis factor (TNF-α), interleukin-1 (IL-1), IL-5, IL-8, αinterferon dan prostaglandin. LPS juga merupakan senyawa sitotoksik dan memiliki potensi sebagai stimulator produksi radikal bebas, diantaranya adalah nitrat oksida (NO) yang selanjutnya bereaksi dengan molekul radikal bebas lainnya membentuk molekul radikal bebas yang semakin reaktif, yaitu peroksinitrit. Reaksi molekul radikal bebas yang semakin reaktif menimbulkan keadaan 5
stres oksidatif pada sel sehingga akan merusak sel epitel pada saluran pernapasan, membentuk respon proinflamatori, dan menurunkan aktivitas antioksidan. Hal tersebut terjadi karena kecepatan reaksi nitrit oxide dan superoksida lebih besar dibandingkan reaksi pembentukan H2O2 yang dikatalis oleh SOD (Bowler & Crapo, 2002; Kinnula & Crapo, 2003) sehingga SOD kekurangan substrat dan menjadi inaktif.
J. Respir. Crit. Care Med. 166: S38-S43. Caramori, G., & A. Papi. 2004. Oxidants and Asthma. Thorax 59 (2): 170173. Comhair, S.A. XuW, S. Ghosh, F.B. Thunnissen, A. Almasan, W.J. Calhoun, A.J. Janocha, L. Zheng, S.L. Hazen, & S.C. Erzurum. 2005b. Superoxide Dismutase Inactivation in Pathophysiology of Asthmatic Airway Remodeling and Reactivity. Am. J. Pathol. 166: 663–674. Eisenbarth, S.C., D.A. Piggott, J.W. Huleatt, I. Visintin, C.A. Herrick, & K. Bottomly. 2002. Lipopolysaccharide-enhanced, Toll-like Receptor 4–dependent T Helper Cell Type 2 Responses to Inhaled Antigen. J. Exp. Med. 196 (12): 1645-1651. Filipović, M. & S. Cekić. 2001. The Role of Eosinophils in Asthma. Medicine and Biology (8): 6-10. Kinnula, V.L. & J.D. Crapo. 2003. Superoxide Dismutases in the Lung and Human Lung Diseases. Am J Respir Crit Care Med Vol 167. pp 1600–1619 National Heart, Lung, Blood, Institute (NHLBI). 2007. National Asthma Education and Prevention Program. Expert Panel Report 3: Guidelines for The Diagnosis and Management of Asthma. Full Report. Oosterhout, A.J., B.V. Esch, G. Hofman, C.L. Hofstra, I.V. Ark, F.P. Nijkamp, M.L. Kapsenberg, H.F.J. Savelkoul, & F.R. Weller. 1998. Allergen Immunotherapy Inhibits Airway Eosinophilia and Hyperresponsiveness Associated with Decreased IL-4 Production by Lymphocytes in a Murine Model of Allergic Asthma. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 19: 622– 628.
KESIMPULAN Terjadi peningkatan infiltrasi sel inflamatori pada gambaran histopatologi paru dan peningkatan aktivitas enzim SOD pada hewan model tikus (Rattus norvegicus) asma yang terpapar LPS. Hal tersebut membuktikan bahwa paparan LPS dapat memperparah keadaan asma. UCAPAN TERIMAKASIH Terimakasih kepada Direktorat Jendral Pendidikan Tinggi (DIKTI) yang telah mendanai penelitian ini sehingga penelitian ini dapat selesai sesuai dengan yang diharapkan. Terimakasih kepada Prof. Dr. Aulanni’am, drh., DES dan Ibu Dyah Kinasih Wuragil, S,Si., M.P., M.Sc, Mas Hilman Fuadil Amin, serta staf Laboratorium Biokimia dan Laboratorium Fisiologi Hewan Fakultas MIPA, Universitas Brawijaya atas dukungan, bantuan, dan kerjasama yang luar biasa untuk penyelesaian penelitian ini. DAFTAR PUSTAKA Barnes, P.J., K.F. Chung, & C.P. Page. 1998. Inflammatory Mediators of Asthma: An Update. Pharmacological Reviews 50(4) : 515 – 596. Busse, W.W., & R.F. Lemanske, Jr. 2001. Asthma. The New England Journal of Medicine 344(5) : 350362. Bowler, R.P., & J.D. Crapo. 2002. Oxidative Stress in Airways. Am. 6
Palmans, E., N.J. Vanacker, R.A. Pauwels, & J.C. Kips. 2002. Effect of Age on Allergen Induced Structural Airway Changes in Brown Norway Rats. Am. J. Respir. Crit. Care Med. 165: 1280–1284 Rifa’i, M. 2011. Alergi dan Hipersensitif. Jurusan Biologi, Fakultas Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam, Universitas Braijaya, Malang. Strohmeier, G.R., J.H. Walsh, E.S. Kling, H.W. Farber, W.W. Cruikshank, D.M. Center, M.J. Fenton. 2001. Lipopolysaccharide Binding Protein Potentiates Airway Reactivity in a Murine Model of Allergic Asthma. J. Immunol. 166 : 2063-2070 Utomo, H. 2006. Management of Oral Focal Infection in Patients with Asthmatic Symptoms. Dent. J. 39(3): 120–125. Yoon, K.K., Y.O. Sun, G.J. Seong, W.P. Heung, Y.L. Soo, Y.C. Eun, B. Boram, S.L. Hyun, H.O. Min, S.K. You, H.K. Jong, S.G. Yong, H.C. Sang, U.M. Kyung, Y.K. You, Z. Zhu. 2007. Airway Exposure Levels of Lipopolysaccharide Determine Type 1 versus Type 2 Experimental Asthma. The Journal of Immunology 178: 5375-5382.
7
