Terapi Ekstrak Air Buah Kesemek (Diospyros kaki L.f.) Pada Tikus (Rattus norvegicus) Artritis Terhadap Enzim Superoksida Dismutase (SOD) dan Gambaran Histopatologi Jaringan Sendi Therapeutic Effect of Persimmon (Diospyros kaki L.f.) Fruit Extracts on Arthritis Rats (Rattus norvegicus) on Superoxide Dismutase (SOD) Enzyme and Histopathology of Joint Tissue Bornea Pertiwi Putri*, Aulanni’am, Masdiana C. Padaga Program Studi Pendidikan Dokter Hewan, Program Kedokteran Hewan Universitas Brawijaya *Email :
[email protected] ABSTRAK Artritis rematoid adalah penyakit autoimun ditandai adanya inflamasi kronis pada persendian. Patomekanisme artritis rematoid masih belum diketahui secara pasti. Buah kesemek mengandung antioksidan seperti polifenol, tanin dan antiinflamasi. Pemanfaatan buah kesemek untuk terapi artritis rematoid belum banyak dilakukan. Tujuan penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh terapi ekstrak air buah kesemek pada tikus artritis hasil induksi complete freund’s adjuvant (CFA) terhadap enzim superoksida dismutase (SOD) dan gambaran histopatologi jaringan sendi. Tikus dibagi menjadi 4 perlakuan yaitu tikus kontrol, tikus artritis, tikus artritis yang mendapat terapi 750 mg/kg BB dan tikus artritis yang mendapat terapi 1000 mg/kg BB. Hasil penelitian menunjukkan bahwa terapi ekstrak air buah kesemek dosis 750 mg/kg BB dan dosis 1000 mg/kg BB dapat berpengaruh nyata pada aktivitas enzim SOD (p<0,05) dan memperbaiki kondisi struktural kartilago dan rongga sendi. Kesimpulan penelitian adalah terapi ekstrak air buah kesemek pada tikus artritis dapat meningkatkan aktivitas enzim SOD dan perbaikan gambaran histopatologi jaringan sendi. Kata Kunci: Artritis, Buah kesemek, Enzim SOD, Histopatologi jaringan sendi ABSTRACT Rheumatoid arthritis is an autoimmune disease with the sign of chronic inflammation in the joints. Pathomechanism of rheumatoid arthritis still not known. Persimmon fruit contains antioxidants such as polifenol, tannin and antiinflamatory. The utilization of persimmon fruit for the treatment of rheumatoid arthritis has not been much done. This study aims to determine therapeutic effect of persimmon fruit extracts on arthritis rats induced by complete freund’s adjuvant (CFA) on superoxide dismutase (SOD) enzyme and the histopathology of joint tissue. Rats were grouped into 4: control rats, arthritis rats, arthritis rats with therapy of 750 mg/kg BB and arthritis rats with therapy of 1000 mg/kg BB. The results showed that therapeutic effect of persimmon fruit extracts at doses 750 mg/kg BB and doses 1000 mg/kg BB significantly effect the SOD enzyme activity (p<0,05) and could repair cartilage structure and joint cavity based on histopathology examination. The conclusion are the therapeutic effect of persimmon fruit extracts on arthritis rats increased the SOD enzyme activity and repaired the histopathology of joint tissue. Keywords: arthritis, persimmon fruit, SOD enzyme, histopathogy of joint tissue
PENDAHULUAN Artritis rematoid (AR) merupakan penyakit autoimun ditandai inflamasi kronis pada persendian yang dapat menyerang hewan peliharaan seperti anjing. Artritis rematoid ini kurang mendapat perhatian seperti penyakit lainnya, namun kasus ini sering terjadi di anjing ras medium dan besar dengan tingkat prevalensi di Amerika menurut Klausner (2012) sekitar 38 % ditandai adanya sinovitis. Complete Freund’s Adjuvant (CFA) secara intradermal digunakan untuk induksi pada hewan model artritis (Prabowo, 2005). Hal ini dijelaskan induksi CFA secara intradermal dapat menimbulkan inflamasi dan memproduksi Reactive Oxygen Species (ROS) berlebih (Sahebari, et al., 2011; Aulanni’am et al., 2012). Kondisi ini memicu terjadinya stres oksidatif, yaitu ketidakseimbangan antara radikal bebas dengan antioksidan di dalam tubuh menyebabkan terjadinya perubahan histologi sendi dan penurunan aktivitas antioksidan endogen bersifat enzimatis seperti SOD. Namun, untuk mengantisipasi terjadinya penumpukan radikal bebas yang berlebih, maka perlu diberikan antioksidan eksogen dari sumber alami salah satunya adalah buah kesemek (Diospyros kaki L.f.) (Valko et al., 2007). Buah kesemek dipilih dalam penelitian ini karena memiliki kandungan antioksidan yaitu: tanin dan polifenol dan berperan juga sebagai antiinflamasi. Namun, sampai saat ini pemanfaatan buah kesemek untuk terapi artritis rematoid belum banyak dilakukan. Tujuan penelitian ini akan mempelajari terapi ekstrak air buah kesemek pada tikus artritis terhadap enzim SOD dan gambaran histopatologi jaringan sendi. MATERI DAN METODE Bahan tanaman yang digunakan pada penelitian ini adalah buah kesemek (Diospyros kaki L.f.) usia buah 60 hari diperoleh dari Desa Junggo kecamatan Bumiaji kota Batu-Malang. Determinasi tanaman dilakukan di Laboratorium Taksonomi Tumbuhan, Jurusan Biologi, FMIPA, Universitas Brawijaya. Hewan coba yang digunakan adalah tikus jantan (Rattus norvegicus) strain wistar usia 10-12 minggu,
berat badan 100-250 gram diperoleh dari Unit Pengembangan Hewan Percobaan (UPHP) UGM Yogyakarta. Peralatan yang digunakan antara lain: bak pemeliharaan tikus, seperangkat alat bedah, seperangkat alat gelas, termometer, tabung eppendrof, vacutainer, mikropipet, blue tip gavage, sentrifuge, inkubator, plate ELISA, ELISA reader, mikroskop cahaya Olympus BX51. Bahan kimia yang digunakan antara lain: Rat SOD ELISA Kit (Novanteinbio, nomer katalog: NB-E30267), akuades, CFA, Paraformaldehida (PFA) 4%, larutan xilol, parafin cair, etanol, hematoksilin, eosin, NaCl fisiologis 0,9%, alkohol. Preparasi Hewan Coba Tikus Tikus diadaptasi selama 7 hari di laboratorium diberikan pakan dan minum secara ad libitum. Tikus dibagi menjadi 4 kelompok yaitu: (A) Kelompok kontrol, (B) Kelompok artritis, (C) Kelompok artritis yang mendapat terapi 750 mg/kg BB, (D) Kelompok artritis yang mendapat terapi 1000 mg/kg BB. Pembuatan Hewan Model Artritis Hasil Induksi Complete Freund’s Adjuvant (CFA) (Prabowo, 2005) Kelompok (B), (C) dan (D) pada hari ke1 diinduksi CFA 0,1 mL secara intradermal dibagian coccygeal. Pada hari ke-8, diinduksi CFA kembali 0,05 mL secara intradermal dibagian metacarpophalangeal extremitas caudal dexter dan metacarpophalangeal extremitas caudal sinister. Pembuatan Ekstrak Air Buah Kesemek (Diospyros kaki L.f.) Buah kesemek dicuci, dikupas, diambil bagian daging buah, dipotong kecil dan tipis, o
kemudian dikeringkan di oven pada suhu 37 C selama 24 jam (Jan et al., 2011). Ekstrak untuk kelompok C yaitu buah kesemek kering 0,75 gram ditambahkan 50 mL akuades pada labu ukur. Kemudian dipanaskan diatas waterbath o
(70 C) hingga volume menjadi 10 mL, disaring dan didinginkan. Ekstrak untuk kelompok D yaitu buah kesemek kering 1 gram ditambahkan 50 mL akuades pada labu ukur. Kemudian
o
dipanaskan diatas waterbath (70 C) hingga volume menjadi 10 mL, disaring dan didinginkan (Zhou, 2011). Sediaan ekstrak air buah kesemek untuk kelompok C dan D dipersiapkan setiap hari.
Hasil pengamatan preparat histopatologi jaringan sendi menggunakan mikroskop cahaya Olympus BX51 pembesaran (100x) dan (400x). Perubahan yang diamati adalah kartilago dan rongga sendi.
Terapi Ekstrak Air Buah Kesemek (Diospyros kaki L.f.) (Bekow and Baumans, 2003) Volume pemberian terapi kelompok C dan D = 2 mL secara per oral selama 2 minggu berturut-turut.
Analisa Data Penelitian ini mengunakan Rancangan acak lengkap (RAL). Analisis SOD mengunakan uji ANOVA dan dilanjutkan dengan uji Tukey nilai p-value (p<0,05), mengunakan SPSS 16,0 for Windows, analisis gambaran histopatologi dilakukan secara kualitatif.
Pengambilan Serum dan Organ Extremitas Caudal Dexter (Sirois, 2005) Tikus dieutanasia dengan cara dislokasi leher, diletakkan posisi ventrodorsal, kemudian dilakukan pengambilan darah 3 mL secara intracardiac. Kemudian darah tersebut dimasukkan vacutainer diletakkan posisi miring 45oC dan dibiarkan mengendap pada suhu kamar. Selanjutnya dilakukan sentrifuge untuk mendapatkan serum, dimasukkan tabung eppendrof dan disimpan di refrigator. Selain itu juga, dilakukan pemotongan organ extremitas caudal dexter. Organ yang diambil dilakukan pengelupasan kulit kemudian dicuci NaCl fisiologis 0,9% dan direndam larutan PFA 4% untuk preparat HE dan disimpan pada freezer. Pengukuran Aktivitas Superoksida Dismutase (SOD) (Rifa’I dan Djati, 2009) Masukkan 50 µL sample diluent ke dalam well sample diluent (dibuat duplo), Masukkan 50 µL prediluted standard (S1-S6) ke dalam well prediluted standard, Masukkan 50 µL sampel serum ke dalam well sampel, Tambahkan 100 µL HRP-Conjugate reagent ke dalam masing-masing well, Plate di mix well kemudian di inkubasi (37oC) selama 1 jam, Tambahkan Wash solution pada masing-masing well. Dilakukan pencucian 5 kali, Tambahkan 50 µL Chromagen A ke dalam masing-masing well, Tambahkan 50 µL Chromagen B ke dalam masing-masing well, Plate diinkubasi (20-25oC). Kemudian dibaca absorbansi pada 450 nm menggunakan microplate reader. Pengamatan Histopatologi Jaringan sendi tikus dibuat preparat dengan metode pewarnaan HE (Jusuf, 2009).
HASIL DAN PEMBAHASAN Hasil penelitian pengaruh terapi ekstrak air buah kesemek pada tikus artritis terhadap enzim SOD berdasarkan hasil uji ANOVA menunjukkan terdapat perbedaan nyata antar perlakuan (p<0.05). Tabel 1. Rata-rata aktivitas enzim SOD pada masing-masing kelompok perlakuan Kelompok Perlakuan Tikus kontrol (A) Tikus artritis (B) Tikus artritis+terapi 750 mg/kg BB (C) Tikus artritis+terapi 1000 mg/kg BB (D)
Rata-rata nilai enzim SOD (U/mL) 273,40 ± 18.1d 80,66 ± 3.6a 127,50 ± 10.9b 211,50 ± 12.1c
Kelompok A merupakan tikus kontrol memiliki aktivitas enzim SOD paling tinggi (273,40±18,1 U/mL) dan berbeda nyata dengan kelompok lainnya. Aktivitas enzim SOD kelompok A digunakan sebagai standar tikus dalam kondisi keadaan normal untuk menentukan adanya peningkatan atau penurunan yang terjadi karena pengaruh perlakuan. Kelompok B merupakan tikus artritis memiliki aktivitas enzim SOD paling rendah (80,66±3,6 U/mL) dan berbeda nyata dengan kelompok lainnya. Hasil penelitian kelompok B mengalami penurunan akibat pemberian induksi CFA menimbulkan inflamasi sehingga terjadi penumpukkan radikal bebas berlebih tanpa diimbangi dengan antioksidan menyebabkan terjadinya stres oksidatif berupa inaktivasi SOD ditunjukkan tabel 1. Keadaan tersebut sesuai penelitian Sahebari et al. (2011) dan Afonso et al. (2007) akibat aktivasi makrofag dalam
jumlah besar dapat meningkatkan produksi radikal bebas dibandingkan dengan jumlah enzim SOD endogen menyebabkan terjadinya penurunan kerja enzim SOD endogen berfungsi scavenger tidak bisa menangkap kelebihan radikal bebas. Kelompok C dan D merupakan tikus artritis yang mendapat terapi ekstrak air buah kesemek. Perbedaan pemberian dosis terapi berpengaruh dalam meningkatkan aktivitas enzim SOD. Kelompok D memiliki aktivitas enzim SOD tertinggi kedua setelah kelompok A dan berbeda nyata dengan kelompok lainnya dan juga termasuk dosis terapi efektif yaitu 1000 mg/kg BB memiliki daya antioksidan lebih tinggi dalam meningkatkan aktivitas enzim SOD mendekati kelompok A dibandingkan kelompok C yaitu 750 mg/kg BB. Hasil penelitian menunjukkan bahwa peningkatan aktivitas enzim SOD pada kelompok D dan C disebabkan karena buah kesemek memiliki antioksidan non enzimatis seperti polifenol dan tanin berfungsi sebagai scavenger radikal bebas mampu meningkatkan enzim SOD. Antioksidan ekstrak air buah kesemek bekerja melalui penghambatan reaksi autooksidasi lipid. Komponen polifenol dan tanin akan menyumbangkan atom hidrogen untuk mengikat dan menetralkan radikal bebas sehingga mengendalikan dan mengurangi reaksi autooksidasi lipid dengan cara melindungi membran sel tubuh dalam mengurangi inflamasi. Hal ini sesuai dengan penelitian Confroti et al. (2009) dan Zhou (2011) polifenol dan tanin dan berperan sebagai scavenger radikal bebas dapat menghambat produksi radikal bebas O2* dan mengubahnya menjadi produk stabil sehingga dapat meningkatkan aktivas enzim SOD. Hasil penelitian terapi ekstrak air buah kesemek pada tikus artritis terhadap gambaran histopatologi jaringan sendi yang menunjukan kondisi kartilago disajikan pada Gambar 1. Hasil preparat Gambar 1.A menunjukkan bentuk kondisi normal kartilago dan rongga sendi. Sedangkan preparat Gambar 1.B menunjukkan degradasi kartilago ditandai adanya erosi dan dilatasi rongga sendi. Kerusakan ini mengindikasikan telah terjadi inflamasi pada kartilago akibat induksi CFA. Respon inflamasi
yang terjadi di kartilago melibatkan faktor vaskuler dan seluler menyebabkan penumpukan radikal bebas. Menurut Subramanian (2009) dan Geboes et al. (2007) pemberian CFA dapat menimbulkan inflamasi akibat dari penumpukkan radikal bebas berlebih dengan cara memodifikasi agregrat protein dan merusak membran lipid melalui jalur siklooksigenase dalam menekan sintesis proteglikan kartilago sehingga meningkatkan permeabilitas vaskular dengan menarik lebih banyak sel PMN dan monosit pada komponen kartilago akan berdifusi dalam rongga sendi. Pengamatan sel kondrosit dan komponen matriks pada bagian kartilago tersusun atas lapisan superficial, transisional dan radial mengalami destruksi sel kondrosit dan terjadi difusi komponen matriks ke dalam rongga sendi (Gambar 1.B). Perubahan jaringan kartilago ini sesuai dengan pendapat Cooles and Isaacs (2011) daerah perbatasan lapisan kartilago sendi dan panus terdapatnya sel inflamasi seperti sel mononuklear dan dijumpai destruksi jaringan kolagen dan proteoglikan hingga terjadi erosi kartilago. Aktivitas enzim SOD kelompok B mengalami penurunan enzim SOD sebesar 80,66±3.6 U/mL, data ini memperkuat terjadinya destruksi kartilago karena turunannya aktivitas enzim SOD menyebabkan terjadinya penumpukan radikal bebas akibat inflamasi. Gambar 1.C menunjukkan perbaikan struktural kartilago dan pengurangan dilatasi rongga sendi dibandingkan Gambar 1.B. Gambar 2.C menunjukkan lapisan kartilago yaitu superficial, transisional dan radial tidak teratur kondisi bentuk dan ukuran sel kondrosit dibandingkan Gambar 1.B. Sedangkan Gambar 1.D menunjukkan perbaikan struktural kartilago berupa keteraturan matriks ekstraseluler tipe II dan rongga antar sendi menyempit mendekati Gambar 1.A. Gambar 2.D susunan sel kondrositnya mengalami keteraturan lapisan kartilago bagian supercial, transisional dan radial dan kondisi bentuk dan ukuran sel kondrosit mendekati kelompok A. Perbaikan jaringan sendi Gambar 1.C dan Gambar 1.D karena adanya efek scavenger ekstrak buah kesemek. Perbaikan tersebut dapat menghambat reaksi autooksidasi lipid. Dengan
demikian, produksi radikal bebas O2-* dan radikal turunannya menjadi berkurang sehingga terjadi upaya pemeliharaan integritas membran sel dan kartilago. Penurunan radikal bebas tersebut juga dapat mengurangi faktor pemicu aktivitas makrofag dalam mensekresi enzim degradasi kartilago yaitu cathepsin-D dan matriks metaloproteinase dengan menghambat aktivasi jalur siklooksigenase yaitu depolimerasi asam arakidonat sehingga meningkatkan produksi proteoglikan dan visikotas rongga sendi. Menurut Chen et al. (2012) dan Lee and Lee (2008) Polifenol dan tanin akan
mengendalikan reaksi autooksidasi sehingga tidak mampu merusak rantai asam lemak dalam menurunkan produksi radikal bebas dan menghambat terjadinya jalur siklooksigenase, sehingga akan mengurangi respon inflamasi kemudian akan membentuk jaringan semula pada permukaan kartilago.
rs
k rs
k B
A
rs k rs C
k
D
Gambar 1. Preparat histopatologi jaringan sendi tikus. Keterangan: A (kontrol): kondisi normal (k) dan (rs); B (artritis): degradasi struktural (k) dan dilatasi (rs) ditandai erosi (tanda panah merah); C (artritis+ terapi dosis 750 mg/kg BB): perbaikan struktural (k) dan pengurangan dilatasi (rs); dan D (artritis+terapi dosis 1000 mg/kg BB: perbaikan struktural (k) dan (rs) menyempit. Pewarnaan HE, Pembesaran 100x. kartilago (k), rongga sendi (rs).
A
B
1 2
1
3
2
3 C
D
1 1
2 3
2 3
Gambar 2. Preparat histopatologi sel kondrosit dan matriks ekstraseluler tipe II Keterangan: A (kontrol): lapisan 1, 2 dan 3 bentuk (sk) dan (me) tipe II kondisi normal; B (artritis): lapisan 1, 2 dan 3 mengalami destruksi (sk) dan komponen (me) tipe II berdifusi ke (rs); C (artritis+terapi dosis 750 mg/kg BB): lapisan 1, 2 dan 3 tidak teratur susunan dan ukuran (sk) dibandingkan kelompok B; dan D (artritis+terapi dosis 1000 mg/kg BB) lapisan 1 tampak simetris dan lebih rata, mengalami keteraturan susunan dan ukuran (sk) lapisan 1, 2 dan 3 mendekati kelompok A. Pewarnaan HE, pembesaran 400x. 1 (superficial), 2 (transisional), 3 (radial). Sel kondrosit (sk), matriks ekstraseluler (me), rs (rongga sendi).
KESIMPULAN Pemberian terapi ekstrak air buah kesemek pada tikus artritis dapat meningkatkan enzim SOD dan memperbaiki gambaran histopatologi jaringan sendi.
Patient in Indonesia Based on Autoimmune Marker Matrix Metalloproteinase-3 (MMP-3). Journal of Applied Sciences Research, 8 (9): 47954801.
UCAPAN TERIMA KASIH Peneliti mengucapkan terimakasih kepada staf Laboratorium Fisiologi Hewan dan Laboratorium Biokimia dan Molekuler, FMIPA, Universitas Brawijaya telah membantu dalam penelitian ini.
Bekow, C.A and V. Baumans. 2003. Common Non Surgical Techniques and Procedures. In Hau J and Van Housier GL, editors Handbook of Laboratory Animal Science. CRC Press. 351-390.
DAFTAR PUSTAKA Afonso, V., R. Champy, D. Mitrovic, P. Collin and A. Lomri. 2007. Reactive Oxygen Species and Superoxide Dismutases: Role in Joint Diseases. Joint Bone Spine. 74: 324-329. Aulanni’am, Z.S.B. Ulhaq, A.P.W. Marhendra, D.K. Wuragil, R. Hermawan and W. Riawan. 2012. Immunodot Technique for Early Detection Rheumatoid Arthritis
Chen, X.N., W.S. Hu, Y.H. Xie, Y.H. li, L.B. Bo and W.B. Jin. 2012. Antioxidant Research of Persimmon Extraction in Ionizing Radiatio Mice. J Advanced Materials Research. Vol. 343 - 344. Cooles F.A.H and J.D. Isaacs. 2011. Pathophysiology of rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol. 23:233-240.
Conforti, F, S. Sosa, M. Marrelli, F. Menichini, G.A. Statti, D. Uzunov, A. Tubaro and F. Menichin. 2009. The protective ability of Mediterranean dietary plants against the oxidative damage: The role of radical oxygen species in inflammation and the polyphenol, flavonoid and sterol content. J. Food Chemistry. Vol. 112 : 587-594. Geboes, L., B.D. Klerck, M. Balen, H. Kelchtermans, T. Mitera, L. Boon, C.D. Wolf-Peeters and P. Matthys. 2007. Freund’s Complete Adjuvant Induces Arthritis in Mice Lacking a Functional Interferon-Receptor by Triggering Tumor Necrosis Factor-α Driven Osteoclastogenesis. J. American College of Rheumatology. Vol. 56 (8): 2595-2607. Jan, I.C., E.K. Jo, M.S. Bae, H.J Lee, G.I Jeon, E. Park2, H.G. Yuk, G.H. Ahn and S.C. Lee. 2010. Antioxidant and Antigenotoxic Activities of Different Parts of Persimmon (Diospyros kaki cv. Fuyu) Fruit. Journal of Medicinal Plants Research. Vol. 4 (2): 155-160. Klausner, J. 2012. State of Pet Health 2012 Report. Banfield Pet Hospital. Lee, H.C. and H.S. Lee. 2008. Acaricidal Activity and Function of Mite Indicator Using Plumbagin and Its Derivates Isolated from Diospyros Kaki Thunb.roots (ebenaceae). J. Microbiol. Biotechnol. 18 (2): 189- 193.
Prabowo, S. 2005. Pengaruh Stresor Dingin Terhadap Proses Keradangan Pada Artritis Ajuvan: Penelitian Eksperimental pada Arthritis ajuvan (Model Hewan untuk Arthritis Reumatoid). [Disertasi]. Program pascasarjana Universitas Airlangga. Rifa’i, M dan M, Djati. 2009. Terapi Autoimun Rheumatoid Arthritis dengan Sel T regulator CD4+CD25+. Laporan Penelitian Hibah Penelitian Strategis Nasional. Universitas Brawijaya.Malang. Sahebari, M., Z. Mahmoudi, S.Z.T. Rabe, D. Haghmorad, M.B. Mahmoudi, H. Hosseinzadeh, N. Tabasi and M. Mahmoudi. 2011. Inhibitory Effect of Aqueous Extract of Saffron (Crocus sativus L.) on Adjuvant Induced Arthritis in Wistar Rat. Pharmacologyonline. 3: 802-808. Sirois, M. 2005. Laboratory Animal Medicine: Principle and Procedures. USA. Elsevier Inc. Valko, M., D. Leibfrtiz, J. Moncol, M.T.D. Cronin, M. Mazur and J. Telser. 2007. Free radicals and Antioxidants in Normal Physiological Functions and Human Disease. The International Journal of Biochemistry & Cell Biology. 39: 44–84. Zhou, C., D. Zhao, Y. Sheng, J. Tao and Y. Yang. 2011. Carotenoids in Fruits of Different Persimmon Cultivars. J. Molecules. 16: 624-636.
