A VESEÁTÜLTETÉST KÖVETİ CYTOMEGALOVÍRUSFERTİZÉS PROBLÉMÁJA, HLA-TÍPUS ÉS A CMV-FERTİZÉS IRÁNTI FOGÉKONYSÁG Doktori értekezés
Dr. VARGA MARINA Semmelweis Egyetem Klinikai Tudományok Doktori Iskola
Témavezetı:
Dr. Reusz György egyetemi tanár, az orvostudományok doktora
Hivatalos Bírálók:
Dr. Pusztai Rozália egyetemi tanár, az orvostudományok kandidátusa Dr. Mucsi István egyetemi docens, PhD
Szigorlati bizottság elnöke:
Dr. Kovalszky Ilona egyetemi tanár, DSc
Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Szınyi László egyetemi docens, PhD Pécsiné Dr. Barabás Éva laborvezetı, PhD Budapest 2009
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
5
1 BEVEZETÉS
7
2 IRODALMI HÁTTÉR
10
2.1
Történelmi bevezetés - transzplantáció és mikrobiológia 2.1.1 Nemzetközi áttekintés 2.1.2 Hazai áttekintés
10 10 16
2.2
A humán Cytomegalovírus 2.2.1 A Cytomegalovírus felfedezésének történelme 2.2.2 A Cytomegalovírus felépítése, replikációs ciklus, a célsejt fertızése 2.2.3 Epidemiológia 2.2.4 A Cytomegalovírus-fertızés tünettana 2.2.5 A Cytomegalovírus-fertızés diagnosztikája 2.2.6 A Cytomegalovírus-fertızés terápiája
17 17 19 22 25 26 31
2.3
Cytomegalovírus és az immunitás, CMV-fertızés immunszupprimált állapotban 32 2.3.1 Cytomegalovírus-fertızés és az immunítás 32 2.3.2 A CMV immunitás kijátszására, a túlélésre irányuló stratégiái 34 2.3.3 A Cytomegalovírus-fertızés rizikófaktorai 35 2.3.4 A Cytomegalovírus direkt és indirekt hatásai 36 2.3.5 Preventív lehetıségek 40 2.3.6 A Cytomegalovírus-fertızés kezelése 41 2.3.7 Immunszuppresszív szerek hatása a Cytomegalovírusra 43
2.4
HLA és a betegségek
47
3. CÉLKITŐZÉSEK
48
3.1
A magyar lakosság CMV-átfertızöttségének megállapítása, jellegzetességeinek meghatározása kor- és nemi megoszlás és vércsoport szerint 48
3.2
A CMV-fertızés kimutatás optimális módszereinek meghatározása transzplantált betegek részére; a kivizsgálás menetének kidolgozása 49 A rizikócsoportba tartozó recipiensek CMV-fertızésének megelızését szolgáló profilaktikus protokollok hatékonyságának összehasonlítása 50
3.3
2
3.4
A magas rizikójú vesetranszplantált betegek CMV-fertızése, a fertızés iránti fogékonyság vizsgálata, a HLA-típussal való összefüggés és a genetikai prediszpozició megállapítása 51
4. MÓDSZEREK
52
4.1
A CMV-átfertızöttség vizsgálatához használt donorjelentések adatai és a labordiagnosztikai, statisztikai módszerek 52
4.2
A CMV-fertızés transzplantált betegek körében és a fertızés kimutatásának módszerei 53 4.2.1 Vírus-ellenanyag kimutatása 54 4.2.2 CMV-antigén direkt kimutatása fehérvérsejtekbıl (antigenemia teszt) 54 4.2.3 „Gyorsított” vírusizolálás a beteg mintáiból 55 4.2.4 Vírus-nukleinsav kimutatása (PCR) 56
4.3
A CMV-fertızés kialakulása szeronegatív vesetranszplantált betegekben különbözı megelızési protokollok alkalmazása esetén, a tanulmány betegei és módszerei 57
4.4
A primer CMV-fertızés kialakulása szeronegatív recipiensek körében, a fertızés kimutatásánakés a HLA-típus meghatározásának módszerei 58
5. EREDMÉNYEK
61
5.1
A CMV-átfertızöttség meghatározása során kapott eredmények 61 5.1.1 Meghatározásra került a magyar populációt reprezentáló személyek nem- és kor szerinti CMV-átfertızöttsége 61 5.1.2 A CMV-átfertızöttség és a vércsoportok közötti összefüggés vizsgálata 62
5.2
A CMV-fertızés diagnosztikájában használt laboratóriumi módszerek összehasonlításának eredményei 63 5.2.1 Az antigenemia teszt, a vírusizolálás és a specifikus CMVellenes IgM teszt összehasonlítás – érzékenység, specificitás, a pozitív és negatív prediktív értékek 63 5.2.2 A CMV antigenemia teszt és a PCR összehasonlító vizsgálat eredményei 65
5.3
A vesetranszplantációt követı CMV-fertızés protokollok alkalmazása során kapott eredmények
5.4
A HLA-típus és a CMV-fertızés iránti fogékonyság összefüggésének vizsgálata során kapott eredmények 70
3
megelızési 67
6. MEGBESZÉLÉS 6.1 6.2 6.3 6.4
75
CMV szeroprevalencia Magyarországon 75 CMV kimutatási módszerek transzplantációt követıen 77 CMV-fertızés megelızése magas rizikójú transzplantáltak körében 82 HLA-DQ3 lehetséges CMV-fogékonysági rizikófaktor vesetranszplantáltak körében 85
7. KÖVETKEZTETÉSEK - TÉZISEK
87
7.1
A donorok és az idıskorú személyek CMV-átfertızöttségének vizsgálatából levonható következtetések 87
7.2
A szervtranszplantáltak CMV-fertızésének laboratóriumi diagnosztikai módszereinek összehasonlító vizsgálatából levonható következtetések 87
7.3
CMV-fertızés kivédésére alkalmazott preventív protokollok összehasonlításából származó eredmények alapján levonható következtetések, megállapítások 88
7.4
A HLA-típus és a CMV-fertızés iránti fogékonyság közti kapcsolat vizsgálatából levonható következtetés, megállapítás 89
8. ÖSSZEFOGLALÁS
90
9. SUMMARY
91
10. IRODALOMJEGYZÉK
92
11. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE 11.1 A Doktori értekezéshez kapcsolódó közlemények 11.2 A Doktori értekezéstıl független közlemények 11.3 Könyvfejezetek 11.4 Absztraktok
111 111 112 114 114
12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
117
4
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ADCC Ag ALG AMP ARDS ATG BKV CI CID CIITA CMV CsA CT CTL DNS D EBV EDTA ELISA ELFA EM FVS Gp HAG HBV HCV HE HHV-8 HIV HLA HPV IE IFN IgG IgM IL IMPDH Jak1 KKR KSHV Mc At MHC MEIA MMF mTOR NASBA NK OKI OKT3 ORF PBS PCR p.o.
Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity Antigén Anti-lymphocyta globulin Adenosin-3',5'-monophosphat
Acute respiratory distress szindróma Anti-thymocyta globulin BK vírus Konfidencia intervallum Cytomegáliás zárványtest betegség Komplex II Transaktivárot Cytomegalovírus Cyclosporin A Kompjútertomográf Cytotoxicus T-lymphocyta Dezoxiribonukleinsav Donor Epstein-Barr vírus Ethylen-diamin-tetraecetsav Enzimhez kapcsolt immunszorbens teszt Enzimhez kapcsolt fluoreszcens teszt Elektromikroszkóp fehérvérsejt Glikoprotein Haemagglitináció gátlás Hepatitisz B vírus Hepatitisz C vírus Haematoxilin Eosin Humán herpeszvírus-8 (KSHV) Human Immunodeficiencia vírus Humán leukocytaantigén Humán papilloma vírus Immediate-early Interferon Immunglobulin-G Immunglobulin-M Interleukin Inosine monophosphate dehydrogenase Janus kináz 1 Komplement kötési reakció Kaposi sarcoma herpeszvírus Monoklonális ellenanyag Major histocompatibility complex Microparticle Enzyme Immunoassay Mycophenolate mofetil Mammalian target of rapamycin Nucleic Acid Sequence Based Amplification Natural killer Országos Közegészségügyi Intézet (Országos Epidemiológiai Központ) Muromonab-CD3 (egér anti-humán CD3 monoklonális ellenanyag) Open reading frame Foszfát puffer oldat Polymerase chain reaction per os
5
PMN PTDM PTLD R RIA RNS TAP TBR TK TNF
polymorphonuclearis Poszttranszplantációs diabetes mellitus Posttransplant lymphoproliferative disorder/disease Recipiens Radio Immunoassay Ribonukleinsav Transzporter protein Total body radiation Timidinkináz Tumor Necrosis Factor
6
1. BEVEZETÉS A szervátültetés a XX. századi medicina egyik legnagyobb sikertörténete. A közel fél évszázaddal ezelıtt végzett elsı veseátültetés óta a transzplantáció folyamatosan növekvı teret nyer a végstádiumú szervelégtelenségek kezelésében. A várható túlélési arány egyre nı, és mind több szervtípust tudnak már transzplantálni. A kedvezı tendencia számos tényezı együttes hatásának köszönhetı. A szervdonorok kezelésének javulása, a szervkonzerválás és a sebészi technika finomodása, az alkalmas recipiensek kiválasztásának fejlıdı módszertana, a korszerő immunszuppresszív szerek alkalmazása mellett a siker további fontos meghatározói a transzplantációs szövıdmények modern diagnosztikája és hatékony kezelése. Az immunszuppresszió biztosítja az átültetett szerv (graft) tartós védelmét a kilökıdéssel szemben, alkalmazására a szervátültetést követıen folyamatosan szükség van, elhagyása a heveny kilökıdési reakció lehetıségét hordja magában, a graft károsodását eredményezheti. Az immunszuppresszió a szervátültetés olyan szükségszerő velejárója, amely nem kívánt, hátrányos következményekkel is járhat. A gyógyszeresen csökkentett mőködéső immunrendszer nem támadja meg a beültetett szervet, de ugyanakkor nem biztosít kellı védelmet a szervezet részére a fertızésekkel és onkológiai betegségekkel szemben. Már a szervátültetés történetének korai idıszakában észlelték, késıbb pedig egyértelmővé vált, hogy a súlyos és szokatlan formában zajló infekciók és a rosszindulatú daganatok a transzplantált betegek körében gyakoribbak, mint az ép immunitású személyekben. A megnövekedett fertızés- és daganatgyakoriságért alapvetıen a ledált celluláris immunrendszer antivirális és antitumorális szerepének károsodása a felelıs. A szervátültetést követı daganatos kockázat átlagosan 2-4-szeres a nem transzplantált populációhoz képest. A vesetranszplantált betegek mortalitásának okait elemzı vizsgálat adatai szerint a halálozás közvetlen oka 29%-ban infekció: ebbıl 35%-ban szepszis, 22%-ban bakteriális fertızés, 24 %-ban invazív virális infekció és 18%ban invazív gombainfekció (1). Az utóbbi 10 évben a fertızések - a korszerő antibakteriális, antivirális, gomba és protozoon ellenes gyógyszereknek köszönhetıen - egyre inkább sikerrel kezelhetık. De nem szabad megfeledkezni arról, hogy a gyógyszeripar eredményeit
7
csak abban az esetben tudjuk kihasználni, ha mindig gondolunk arra, hogy az immunszupprimált betegek panaszai mögött fertızés lappang, ha tisztában vagyunk azzal, milyen kórokozók lehetnek a tünetek hátterében – még akkor is, ha a szimptómák nem jellegzetesek –, ha idıben vesszük igénybe a modern diagnosztika nyújtotta lehetıségeket, és mielıbb megkezdjük az adekvát terápiát. Az immunszupprimált állapotban gyakran elıforduló jellegzetes fertızések kórokozói között kiemelt szerepe van a vírusoknak (2). A vírusokkal szembeni védelemben mind a celluláris, mind a humorális immunitás szerepe fontos. Az immunszuppresszív szerek jelentıs része befolyásolja a sejtes immunitás mőködését: gátolja a T-sejtek aktivációját, proliferációját és funkcióját, akadályozza a limfociták migrációját. A celluláris immunitásnak olyan vírusok elleni védelemben van nagy szerepe, amelyek a primer fertızést követıen nem tőnnek el a szervezetbıl, hanem – általában tünetmentesen – jelen vannak az egyén élete végéig. Ilyenek a Herpesviridae, Polyomaviridae, Papillomaviridae családba tartozó vírusok. Az immunszuppresszív szerek alkalmazásakor a celluláris immunrendszer nem képes az idınként a gazdasejtekbıl kiszabaduló vírusokat inaktiválni, és tünetekkel járó reaktiválódás (szekunder infekció) következik be. A súlyosabb tünetekkel járó primer infekció esetén a szeronegatív recipiens leggyakrabban szeropozitív donorból származó szervvel fertızıdik. Transzplantációt követıen a humán populációban elterjedt Herpesviridae családba tartozó vírusok közül a Cytomegalovírusnak (CMV) és az Epstein-Barr vírusnak (EBV) van kiemelt szerepe. A CMV-fertızés gyakori szövıdmény immunszupprimált állapotban, kezelés nélkül súlyos generalizált fertızés vagy szervi manifesztációjú betegség alakulhat ki. Az EBV korlátlan szaporodása poszttranszplantációs lymphoproliferatív betegséget okozhat. Az EBV által okozott súlyos kórkép igen ritkán alakul ki, elsısorban gyermekekben fordul elı abban az esetben, amikor a primer infekció már immunszupprimált állapotban éri a szervezetet. Az utóbbi két évtizedben jelentıs elırelépés történt a humán CMV-infekció és
betegség
pathogenezisének
megértésében
-
különös
tekintettel
a
szervtranszplantált betegekre. Az új antivirális szerek és a modern laboratóriumi diagnosztikai módszerek segítségével hatékony – a betegek életkilátásait pozitívan befolyásoló - terápiás és megelızési stratégiákra nyílt lehetıség. Jelenleg ritkán
8
találkozunk súlyos tünetekkel járó CMV-infekcióval, azonban bizonyítást nyert, hogy a hosszantartó vírushatás – még tünetmentes reaktiváció során is – károsítja a parenchymás szerveket és elsısorban a graft szövetet. Ezért nemcsak az a cél, hogy mielıbb meggyógyítsuk a CMV betegséget, hanem fontos megelızni a primer infekciót vagy a látens vírus reaktivációját. Meg kell határozni azon betegek körét, akinél nélkülözhetetlen a preventív eljárások alkalmazása, és fontos ismerni az eljárások hatékonyságát, és eszerint választani profilaxist. A fertızések legyızéséhez nagy segítséget nyújtanak a gyógyszeripar modern termékei, de az immunitás és a betegségek iránti fogékonyság molekuláris síkon történı kutatása is új lehetıségekkel kecsegtet. A modern genomika módszereivel a humán DNS-en – többek között az MHC (terméke a HLA) régióban - olyan területeket keresnek, amelyek befolyásolják az egyes kórokozókkal szembeni fogékonyságot. A további genomikai kísérletek tervezéséhez szükség van klinikai humán adatokra, amelyek a klinikumban dolgozók megfigyeléseibıl származhatnak. Magyarországon a szervátültetést követı CMV-fertızés problemakörével a 80-as évek elejétıl kezdtek érdemben foglalkozni. Abban az idıben fejlesztették ki azokat a diagnosztikai eljárásokat is, amelyekkel már megbízhatóan lehetett bizonyítani
a
fertızést.
A
szervátültetést
követı
CMV-fertızéssel
és
diagnosztikájával kapcsolatban jelentıs tapasztalatot szereztem a budapesti transzplantációs központban. Az infekcióra jellemzı sajátságok megismerésén és a betegellátást segítı következtetések megfogalmazásán túl, tudományos munkámban célom volt összefüggéseket keresni olyan kérdésben, mint a CMV-fertızés iránti fogékonyság és a genetikai prediszponáltság. A magyarországi populációt reprezentáló nagyszámú donor CMV-átfertızöttségét és annak jellegzetességeit is vizsgáltam. Célom volt még meghatározni a CMV-fertızés kimutatásának optimális módszereit transzplantált betegek részére, és összehasonlítani a preventív stratégiák hatékonyságát.
9
2. IRODALMI HÁTTÉR A szervátültetés több orvosi tudományág fejlıdésének köszönhetıen vált világszerte elterjedt eljárássá. Az immunológia, az intenzív terápia, a sebészet, a belgyógyászat és az infektológia területén dolgozó szakemberek felfedezései és újításai tették sikeressé a transzplantológiát. A szervátültetés mára mindennapi gyakorlattá vált. Hosszú és kudarcoktól sem mentes út vezetett idáig.
2.1
Történelmi bevezetés – transzplantáció és mikrobiológia
2.1.1
Nemzetközi áttekintés Az elsı szerv- és szövet-transzplantációról, misztikus történetekrıl szóló
feljegyzések a középkorból származnak. Az 1700-as évektıl valódi – zömében sikertelen és nemritkán tragikusan végzıdı - kísérletek folytak bır, fogak átültetésével, vértranszfúzióval (3). A siker váratott magára egészen a XX. századig, amikorra tisztázódott az olyan fontos tényezık szerepe, mint az aszepszis, az immunitás; kidolgozásra kerültek különleges sebészi és altatási technikák. A technológia fejlıdése nagy hatással volt a mőtéti eljárások tökéletesítésére, a gyógyszeripar vívmányaként pedig egyre szélesebb az immunszuppresszív és fertızés ellenes szerek palettája. Az elsı sikeres veseátültetésre egypetéjő ikerpár tagjai között 1954-ben, Bostonban került sor (Merrill, Murray, Harrison) (4). Az elsı májátültetést Starzl, az elsı tüdıátültetést Hardy és az elsı csontvelıtranszplantációt Mathé végezte 1963ban (5, 6). 1966-ban történt az elsı vese és hasnyálmirigy együttes átültetése (Kelly, Lillihei) és az elsı vékonybélátültetés is (7). Az elsı szívtranszplantációt Barnard végezte 1967-ben. Az elsı hasnyálmirigy-szigetsejt átültetés Najarian nevéhez főzıdik (1974) (3, 6, 8). A kezdeti, technikai és immunológiai okokra visszavezethetı nehézségek, sikertelenségek óta eltelt több mint ötven év munkájának eredményeként a szervátültetés életmentı vagy jelentıs állapotjavulást hozó rutineljárássá vált. Mára évente több ezer ilyen beavatkozás történik világszerte. A szervtranszplantáció sikerét és elterjedését a XX. század második felének immunológiai felfedezései alapozták meg. Medawar és Owen munkásságának (9,
10
10) folytatásaként 1952-ben Dausset írta le a 6. számú kromoszóma rövid karján található fı hisztokompatibilitási komplexhez (MHC) tartozó géneket, melyek a szöveti egyezés, illetve különbözıség alapjai (11). A hisztokompatibilitási gének termékei a sejtek felszínén található Humán Leukocita Antigének (HLA), óriási jelentıségük
van
a
fertızésekben,
daganatbiológiában
és
az
autoimmun
betegségekben. Az immunrendszer a HLA segítségével fejti ki alapvetı képességét: megkülönbözteti a szervezet saját antigénjeit az idegen antigénektıl, pl. a mikrobális fehérjéktıl. A beültetett szerv által kiváltott immunválasz jó példája az idegen antigénre adott reakciónak, amely a graft károsodásához, kilökıdéséhez vezet. Minél jobban különböznek a donor és a recipiens hisztokompatibilitási antigénjei, annál erısebb a kilökıdési reakció. Vesetranszplantáció esetén a HLA-rendszerbıl hat antigén, a HLA-A, -B, -DR antigén párok egyezısége vagy különbözısége határozza meg a donorvese iránti immunválasz erısségét. Ebbıl következik, hogy a rejekció kialakulása úgy kerülhetı el, hogy vesetranszplantáció tervezésénél minél nagyobb HLA egyezést kell elérni a donor és a recipiens között, és a vese- és egyéb szerv átültetéskor gyengíteni kell a recipiens idegensejt felismeréséért és elpusztításáért felelıs immunrendszert. Az elsı immunszuppressziós eljárás az egész test besugárzás volt (TBR). 1959-ben Murray és munkatársai ennek segítségével végeztek veseátültetést immunológiailag nem identikus iker testvérpár tagjai között (12). 1962-1963-ban egy-egy közlemény számol be a TBR eredményeként esetenként javuló betegtúlélésrıl, olykor azonban fatális kimenetelérıl. Az egész test besugárzása és az egyéb, az immunszuppressziót célzó beavatkozások, mint a thymus és a lép mőtéti eltávolítása, a ductus thoracicus drenázsa azonban nem váltották be a hozzájuk főzött reményeket (13, 14). Az immunszuppresszió kérdését végül a hatékony immunszuppresszív gyógyszerek felfedezésével, majd bevezetésével sikerült megoldani (15). Elsıként a 6-mercaptoputinról állatkísérletekben mutatták ki, hogy meghosszabbítja a beültetett vese túlélését, de a szer toxikusnak bizonyult (16). Calne kísérleteiben a kevésbé toxikus purin analóggal (azathioprine) azonos graftvédı hatást tapasztalt (17). A szer klinikai alkalmazása során azonban kiderült, hogy tartós eredményt önmagában nem vált ki (18). Az 1950-es években Küss kortikoszteroidok alkalmazásával
ért
el
immunszuppressziót
11
(19).
Az
azathioprine
és
a
kortikoszteroidok kombinálásával Starzl a hatvanas évek elején váltott ki hatékony gyógyszeres immunszuppressziót (20). A rákövetkezı 25 évben ez a kombináció – az 1967-tıl indukciós- és akut kilökıdés terápiájaként bevezetésre került antilimfocita globulinnal (ALG) együtt (21) - volt a vesetranszplantált betegek konvencionális terápiája. Ez a terápia sajnos nem volt elég hatékony a máj- és szívátültetés esetén. Az 1980-as években bevezetésre került az 1976-ban Borel (Sandoz) által kifejlesztett és Calne vezetésével tesztelt cyclosporine, amely áttörést hozott a máj-, a szív- és a tüdıtranszplantáció terén (15, 22). Ugyanabban az évtizedben az akut rejekció kezelésére bevezették az OKT3-t (muromonab-CD3) (23). A nyolcvanas évek végétıl az immunszuppresszív kezelés palettája bıvült a cyclosporine-nal azonos hatásmechanizmusú tacrolimus-szal (24). A 90-es években több különbözı farmakodinámiás tulajdonsággal rendelkezı gyógyszer jelent meg a piacon: a mycophenolate mofetil, az mTOR inhibitorok (sirolimus, everolimus) és a két anti-CD25 monoklonális ellenanyag (daclizumab és basiliximab) (15). A további kutatások és fejlesztések ma is folynak: újabb monoklonális ellenanyagok (alemtuzumab)
és
a
limfociták
proliferációját,
aktiválódását
különbözı
mechanizmussal befolyásoló molekulák (FK778, FTY720, LEA29Y). A cél olyan gyógyszer vagy kombináció létrehozása, amely - hatásos graft védelem mellett minimalizálja a mellékhatásokat és szelektív immunszuppresszív hatásának köszönhetıen nem fokozza a fertızések és malignomák kialakulásának veszélyét. A hatékony immunszuppresszív szerek alkalmazásának köszönhetıen a szervátültetés világszerte elfogadott sikeres eljárássá vált. A világon egyre többen élnek beültetett szervvel, javult a betegek és a graft túlélése, a vesetranszplantáltak egyéves túlélése meghaladja a 90%-ot, az ötéves túlélés pedig a 80%-ot (25). Az esetszámok gyarapodásával egyre több adat győlt össze az immunszuppresszív kezeléssel kapcsolatban. Az immunszuppresszió alkalmazásával ismertté vált számos, nem kívánt mellékhatás is. Egy részük a szerek közvetlen toxicitásából ered: nephrotoxicitás, neurotoxicitás, csontvelı károsító hatás; cukorbetegségre, elhízásra, csontritkulásra, szív- és érrendszer betegségeire való hajlamosítás (15). Az immunhiányos állapot két legfontosabb hátrányos következménye a betegek fertızésekkel szembeni fogékonysága, és a rosszindulatú daganatok kialakulásának növekvı kockázata (1, 26, 27).
12
A transzplantált betegek fertızésekkel szembeni fokozott fogékonysága szükségessé
tette
a
szoros
együttmőködést
az
infektológusokkal
és
a
mikrobiológusokkal. Az utóbbi évtizedek felfedezései a mikrobiológiai diagnosztika és a fertızés-ellenes farmakológia területén hozzájárultak a szervátültetések sikeréhez, megkönnyítették a transzplantált betegek utókezelését. A mikrobiológia - mint tudományág - Európában csak a 17. században indult fejlıdésnek, amikor Leeuwenhoek 1679-ben létrehozta a nagyító lencsék kombinációjából álló kezdeti mikroszkópot. A 18. században Jenner – empirikus alapon – sikeresen kísérletezett a himlı elleni oltással anélkül, hogy tisztában lett volna az eljárás biológiai alapjával. Feljegyzések szerint a vakcinációt (variolizációt) már a középkorban is alkalmazták Kínában és Egyiptomban (1. ábra). A mikroorganizmusok szerepét a természet egyensúlyának fenntartásában Lister ismerte fel. Az a felismerés pedig, hogy a fertızı betegségeket parányi élılények okozzák, és hogy a mikroorganizmusok sorsa a szervezetben az immunitással függ össze, Koch és Pasteur nevéhez főzıdik. A humorális immunitás kutatásában nagy szerepe volt Fodor Józsefnek, majd Ehrlichnek, a celluláris immunitás felismerıje és kutatója pedig egy orosz zoológus, Metchnikoff volt. A 20. század elején az immunitás szerepét az idegentest felismerésben s eliminálásban már ismerték.
1. ábra: Himlı-ellenes oltás Kínában Kr. elıtt 200 ével A kutatások 2 ágon folytak tovább: védelem a fertızı ágensek ellen és a malignus sejtek ellen. Ekkor kapcsolódtak a kutatásokba a transzplantációval foglalkozó – az idegen szövet kilökıdés okait kutató – szakemberek: Medawar, Gowan, Hamburger, Murray és Hume. Az antigén és az antitest fogalma és a kölcsönhatásuk felismerése
13
alapozta meg késıbbiekben a fertızések szerológiai kimutatási módszerek kidolgozását is (3). A vírusok felfedezése a XIX. század utolsó évtizedére esik, noha Pasteur már korábban a veszettséggel kapcsolatos megfigyeléseinél sejtette, az orosz Ivanovszkij pedig fertızött dohánypalántákkal végzett növénykórtani vizsgálatokkal bizonyította (1892), hogy kell lennie valami olyan betegséget elıidézı tényezınek, mely méretben kisebb, mint a baktériumok. 1896-ban Insel Riemsen elkészítette az elsı száj és körömfájás elleni védıoltást. A fertızı anyagot logikusan méregnek tartották és ezért adták neki a vírus (magyarul méreg) nevet. A víruskutatással kapcsolatban további fontos elképzelés 1917-ben Felix D'Herelle, francia bakteriológustól ered (28). İ a baktériumok betegségeit tanulmányozva feltételezte, hogy a baktériumoknak saját maguknak is vannak parazitái.
Az
általa
megfigyelt
hatás
alapján
a
feltételezett
parazitákat
bakteriofágnak (magyarul baktériumfaló) nevezte el. Úgy tőnt tehát, hogy a vírushatást még a baktériumoknál is kisebb élılények idézik elı. 1935-ben Stanley angol kutatónak sikerült a dohánylevél foltosodását elıidézı vírust (dohánymozaikvírus) kristályosan elıállítani. Az elektronmikroszkóp megalkotásával (Ardenne 1940-41) nemcsak
a
víruskristályok
finomszerkezetét,
hanem
az
egyedi
vírusrészecskéket is sikerült láthatóvá tenni. Jelentıs technológiai újítás volt az 1933-ban Goodpasteur és Burnet felfedezése, amely szerint a fejlıdı csirkeembrió alkalmas a vírusok egy részének tenyésztésére és szaporítására, többek között védıoltások készítésének céljára. Az 1950-1960 közötti idıszakban – amit az orvosi virológia aranykorának neveznek – számos, emberi szempontból fontos vírust izoláltak. Sok betegség esetén kiderült a vírusok etiológiai szerepe. Ezektıl az évektıl kezdıdıen a virológiai kutatások intenzitása megsokszorozódott. Az antibiotikumok segítségével alkalmazhatóvá váltak a szövettenyésztési módszerek, melyek forradalmasították a vírusizolálási, identifikálási módszereket; a sejt- és szövettenyészetek alkalmazása segítette az oltóanyag-kutatást és –termelést; a szövettenyészeteken jól tanulmányozható a vírus és a gazdasejt egymásra hatása. A 60-70-es években ismertté váltak a vírusok szaporodási ciklusának lépései. A 80-as évektıl megkezdıdött a molekuláris virológia térnyerése: a vírusok nemcsak mint speciális kórokozók fontosak, hanem jelentıségre tettek szert, mint genetikai
14
egységek: a sejt-vírus interakció tanulmányozása molekuláris szintre tevıdött át (29). Az I. világháborút követı években nagy lendületet kapott az addig igen szegényes eredményeket felmutató gyógyszeripar fejlesztése, ezen belül pedig a fertızés ellenes szerek kutatása. Elkezdték gyártani a sulfonamid származékokat, az antituberkulotikumokat, a tetanus toxoidot. Az 1929-ben Fleming által felfedezett penicillin csak a II. világháború ideje alatt kezdte meg hódító útját. További antibiotikumok
felfedezése
segítette
az
orvosok
munkáját:
streptomycin,
chloramphenicol, tetracycline. Az 1950-es években Abraham által bevezetésre került cephalosporinok különösen hatékonyak voltak az immunszupprimált betegek fertızéseinek gyógyításában (3). A virális infekciók terápiája sokáig megoldatlan volt, a megelızés a vaccinák segítségével történt (Jenner, Pasteur). 1950-es években dolgozták ki a polio vaccinát (Salk, Sabin), késıbb bevezették a többi fertızı gyermekbetegség elleni aktív immunizációt (morbilli, rubeola, mumps). Ma egy sor vírusfertızést megelızı oltóanyaggal rendelkezünk (hepatitis B, kullancs-encephalitis, bárányhimlı, influenza, sárgaláz). A vakcinák stabil vírusok esetében hatékonyak, de sajnos gyorsan mutáló vírusok (HIV, HCV) ellen nem vethetık be. Az elsı terápiásan alkalmazható vírusellenes (immunrendszert stimuláló) természetes eredető - anyag felfedezése Nagano és Kojima (30) nevéhez főzıdik (1954), Isaac és Lindemann azonos eredményeit 1957-ben publikálta, és az anyagot interferonnak nevezte el (31). Az 1960-as években kezdıdött az a kísérletes munka, amelynek a célja a herpeszellenes szerek fejlesztése volt. Még nem ismerték a vírusszaporodás részleteit, ezért a kutatás tervezése tapasztalati alapon történt: vírussal fertızött szöveteket kezeltek különbözı vegyszerekkel, és megfigyelték a vírusszaporodás esetleges csökkenését. Ezt az idıigényes és nem eléggé hatékony metodikát követték egészen a 80-as évekig, amikor fokozatosan ismertté váltak a legtöbb - emberre pathogén - vírus genomjának nukleotid-szekvenciája és a szaporodási ciklus részletei is. Az új ismereteket felhasználva az antivirális szerek fejlesztését már tudatosan a vírusciklushoz igazodva tervezték meg. A gyógyszerek a következı stádiumokban fejthetik ki vírusellenes hatásukat: 1. a vírus kapcsolódása a sejthez (entry blocker – rekombináns CD4 molekula) (32)
15
2. a virális gének kiszabadulása a sejtben, dekapszidáció (amantadine, rimantadine) (33) 3. a sejt szaporodási gépezet felhasználásával a virális komponensek replikációja (virális polimeráz vagy transzkriptáz gátló és lánctermináló nukleozid analógok – acyclovir, zidovudin, lamivudin; transzkripciós faktorok és a virális DNS kapcsolódásgátlók; antiszensz molekulák – fomivirsen; vírus nukleinsav összeépülését gátló szintetikus ribozidek - maribavir) (33, 34, 35) 4. a virális komponensek összeépülése komplett virionná (proteáz inhibitorok – saquinavir, amprenavir, darunavir) (36) 5. az érett virionok kiszabadulása a sejtbıl (neuraminidáz gátlók – zanamivir, oseltamivir) (37) Az Elion által felfedezett szelektív hatású és alacsony toxicitású nukleozid analóg (acyclovir) új korszak kezdetét jelentette. Ezért a felfedezésért 1988-ban Eliont Nobel-díjjal jutalmazták (38). Ezután egy sor hatékony nukleozid analógot fejlesztettek ki, közöttük a CMV-ellenes ganciclovirt (Ogilvie), amely különös fontosságú immunszupprimált betegek esetében (39). Nagy jelentıségő volt a vírusellenes gyógyszerek újabb csoportjának (proteáz inhibitorok) felfedezése: az elsı szer forgalmazását 1995-ben engedélyezte az FDA (saquinavir). A legutóbbi kutatások eredménye a vírus nukleinsav összeépülését gátló szintetikus ribozidek (maribavir) (35). 2.1.2
Hazai áttekintés A szervátültetés történelmében említésre méltó a magyar orvosok
munkássága is. A pécsi születéső Ulmann Imre (1861-1937) a transzplantáció egyik úttörıje
volt.
Bécsben
1902-ben
elsıként
hajtott
végre
állaton
sikeres
szervátültetést: egy kutya nyaki ereire ültette át a vesét. Magyarországon az elsı veseátültetést Németh András hajtotta végre 1962-ben. Ekkor Európában ez volt a 30., Közép-Kelet Európában pedig az elsı szervátültetés. Pintér József 1973-ban végzett néhány veseátültetést Miskolcon. A szervezett program keretein belül zajló rendszeres vesetranszplantáció pedig 1973-ban Perner Ferenc vezetésével indult meg a budapesti SOTE I. sz. Sebészeti Klinikán. 1979-ben szegedi, 1991-ben debreceni és 1993-ban pécsi teamek csatlakoztak a programhoz. Az elsı hazai májátültetés 1983-ban (Szécsény Andor), az elsı szívátültetés 1992-ben (Szabó
16
Zoltán), az elsı vese-hasnyálmirigy együttes átültetés 1998-ban (Kalmár Nagy Károly), az elsı hasnyálmirigy-szigetsejt átültetés 2004-ben Budapesten történt. 1995-tıl zajlik rendszeres májtranszplantáció, 2002-tıl pedig vese- és hasnyálmirigy egyidejő átültetése Budapesten. A hazai transzplantáció immár több mint 30 éves múlttal rendelkezik. A beültetett szervvel élı betegek száma megközelíti a 3 ezret, számukra a transzplantáció új életet jelent. A mikrobiológiai területén is büszkélkedhetünk magyar tudósokkal. Takátsy Gyula és Farkas Elek együttmőködve kidolgoztak egy eredeti Rickettsia prowaczeki vaccinát, amely a kiütéses tífusz Magyarországi felszámolását eredményezte. Takátsy Gyula 1949-ben alakította ki a mikrobiológiai vizsgálatokat forradalmasító mikro-titrátort. Ez lehetıvé tette a szerológiai munka megújulását, mely késıbb a laboratóriumi mikromódszerek alapjául szolgált szerte a világon. Valamennyi reagens készlet az általa bevezetett mérető és alakú mikrolemezek (ELISA!) különbözı változatait alkalmazza (40). A magyarországi poliomyelitis vaccináció megszervezése Dömök István nevéhez főzıdik (41). A Cytomegalovírus, amelyrıl régen úgy gondolták, hogy elsısorban a magzatok fertızésében játszik jelentıs szerepet, különös veszélyt jelent az immunszupprimált egyének részére. Ezzel kapcsolatos adatokról és kutatásokról legkorábban az 1970-es években számoltak be, különös hangsúlyt fektetve a diagnosztikai és terápiás lehetıségekre (42). Magyarországon a CMV kutatásával és a kimutatási módszereinek fejlesztésével Koller Miklós foglalkozott. Az általa vezetett csoport fejlesztette ki Magyarországon a direkt immunfluoreszcens izolálási módszerhez (gyorsított IF) szükséges monoklonális ellenanyagokat, és 1992-ben bevezette a ma is alkalmazott CMV-fertızés kimutatására alkalmas módszert: a CMV antigenemia tesztet (43, 44).
2.2 2.2.1
A humán Cytomegalovírus A Cytomegalovírus felfedezésének történelme A széles körben elterjedt Cytomegalovírus már az ókorban is gyakori fertızı
ágens volt. A fertızés jeleit a brazíliai tiriyo indiánok mumifikálódott szöveteibıl is kimutatták, ellentétben a morbilli vagy influenza vírusokkal. A CMV által kiváltott
17
citopátiás hatás – a „nagy zárványokat tartalmazó sejtek” - elsı leírása 1881-ben Ribberttıl származik. Sokáig úgy gondolták, hogy az elváltozás amıbás eredető, és „protozoon-szerőnek” írták le (45). Goodpasture összehasonlító vizsgálataiban 1921-ben arra következtetett, hogy az említett elváltozások („cytomegalia”) hasonlítanak
a
Tyzzer
által
leírt
varicella
eredető
mikroszkopikus
bırelváltozásokhoz, és hogy a kórokozó is hasonló lehet (46). Lipschutz pedig 1921-ben már vírus eredetrıl írt (47). Az 1920-as és 1930-as években a fertızés által okozott elváltozásokat továbbra is patológusok tanulmányozták, de már tünetleírásokat is kapcsoltak a leletekhez. Farber és Wolbach hemorrhágiás diathesis, erythroblastosis és pneumonia tüneteit mutató elhunyt csecsemık boncolásánál észleltek jellegzetes zárványtesteket a nyálmirigy és a viscerális szervek szöveteiben. A két patológus elsıként a tünetegyüttest és a szövettani elváltozást „nyálmirigy vírusbetegségének” nevezte el (48). 1950-ben Smith és Vellios
a
betegséget
„generalizált
nyálmirigy
vírusfertızésnek”,
illetve
„cytomegáliás zárványtest betegségnek - CID” nevezték el, és úgy gondolták, hogy a zárványtest tartalmú sejtek pathognomikus jelei a vírus eredető fertızésnek, amely in utero vagy az újszülött korban következik be (49). 1953-ban Minder elektromikroszkóppal vizsgálta egy CID-ben elhunyt újszülött hasnyálmirigysejtjeit, és felvételeket készített a sejtek magjában és cytoplazmájában található vírusszerő képletekrıl. 1954-1957 között több kutató (Smith, Rowe, Weller) a CID-ben szenvedı csecsemık mintáit és szöveteit ráoltotta fogékony humán szövetre. Megfigyelték a citopátiás hatás kialakulását, és izolálták a vírustörzseket: AD-169, Davis, Kerr (50). Weller 1960-ban javasolta a „cytomegalovírus” név használatát a „nyálmirigy vírus” helyett (51). A CMV szöveten történı tenyésztésének lehetısége a
szerológiai
kimutatási
módszerek
kifejlesztését
tette
lehetıvé.
Ennek
köszönhetıen az 1960-as és 70-es években sok klinikai és epidemiológiai következtetésre jutottak (52). Demmler kimutatta, hogy a congenitalis betegség, a perinatális fertızés és a mononucleosis szindróma (a kifejezés Kaariainentıl származik) mellett a CMV – elsısorban immunszupprimált állapotú betegekben egyéb klinikai entitás hátterében is állhat: interstitiális pneumonia, retinitis, hepatitis, gastrointestinális betegségek, pancreatitis, myocarditis (53, 54). Az utóbbi két évtizedben jelentıs elırelépést értek el a CMV molekuláris biológiájával, immunológiájával és a terápiás eljárásokkal kapcsolatban, de még sok
18
megválaszolatlan kérdés van a specifikus virális gének szerepérıl és a pathogenézissel összefüggésben (55). Még várat magára a hatékony vaccina kifejlesztésének megoldása is (56). 2.2.2
A Cytomegalovírus felépítése, a célsejt fertızése és a szaporodás A humán Cytomegalovírus a Herpesviridae családba tartozik. Tagjai
duplaszálú
DNS-sel
rendelkezı
core-ból,
ikozahedrális
szimmetriájú
162
kapszomert tartalmazó kapszidból, egy vékony réteg proteinbıl (mátrix vagy tegument) és glikoproteineket tartalmazó burokból állnak (2. ábra). A Herpesviridae család emberre pathogén tagjai az 1. táblázatban kerültek összefoglalásra (57). A család vírusai fajspecifikusak, a humán pathogén vírusok mellett ismertek a tengeri malac, patkány, marha, ló és egyéb fajra patogén típusok is.
2. ábra: a Cytomegalovírus felépítése
A CMV genomja a legnagyobb a herpeszvírusok között: 240 kilobázispárból áll, a potenciális proteinkódoló tartalma több mint 200 open reading frame (ORF) (58).
19
1. sz. táblázat: A Herpesviridae család emberre pathogén vírusai Hivatalos név
Használt név
Alcsalád/virinae –
a
gazdasejt típusa és a replikációs
Leggyakoribb betegségek
ciklus
jellemzıi alapján
Human Herpesvirus 1
Herpes simplex vírus 1 (labialis)
alfa
Human Herpesvirus 2
Herpes simplex vírus 2 (genitalis)
alfa
Human Herpesvirus 3
Varicella-zoster vírus
alfa
Epstein-Barr vírus
gamma
Humán cytomegalovírus
béta
Human Herpesvirus 4
Human Herpesvirus 5
Human Herpesvirus 6
béta
Human Herpesvirus 7
béta
Human Herpesvirus 8
Kaposi associált vírus
sarcomaherpes
gamma
Labiális kiütés, keratoconjuctivitis, encephalitis Genitális kiütés, perinatális herpeszbetegség Bárányhimlı, övsömör, magzati károsodás Mononucleosis infectiosa, Burkitt lymphoma, nasopharingeális cc Mononucleosis, hepatitis, pneumonia, gastroenteritis, retinitis, encephalitis, magzati károsodás Exanthema subitum, pneumonia, magzati károsodás Pytiriasis rosea, pneumonia, magzati károsodás Kaposi sarcoma ?, Castellman betegség
A célsejt fertızése A CMV behatolása a fogékony sejtbe a vírusburok és a sejtmembrán pHindependens fúziójával indul. Ezután a vírus tartalma (nukleokapszid, mátrixproteinek) bekerül a citoplazmába, a virális DNS már nukleokapszid nélkül hatol be a sejtmagba, és megkezdıdik a vírus replikációs ciklusa. A behatolás folyamatában a vírus oldaláról a glikoprotein komplex gC-II tagjai, gB és gH; a sejt oldaláról pedig a legtöbb szövet sejtjein megtalálható heparan-szulfát proteoglikánok és a 30-
20
34 kDa, 92,5 kDa sejtfelszíni fehérjék vesznek részt (59). Grundy kutatásai szerint a CMV kötıdik a majdnem minden sejten megtalálható MHC I molekulához is. A behatoláshoz a fibroblast-, a monocyta-, a granulocyta-, az endothel sejtfelszínén található CD13 molekulára is szükség van (60). Nem elhanyagolható a herpeszvírusoknak az a tulajdonsága sem, hogy képesek közvetlen „cell-to-cell” transzmisszióra (61). Replikációs ciklus A CMV a fogékony sejtben történı replikációs ciklusa 3 fázisból áll: azonnali korai, korai és késıi (62). Az elsı - transzkripciós – „azonnali korai (immediate early)” fázis közvetlenül a behatolás után következik, és 2-4 óráig tart. Ebben a fázisban történik az „immediate early” gének transzkripciója, amelyhez nincs szükség elızetes virális proteinek szintéziséhez, csak néhány celluláris faktorra. Az immediate korai gének termékei a szabályzó fehérjék, amelyek nem részei a virusnak (nem strukturális fehérjék). Fontos szerepük van a „korai replikációs fázis” elindításában a korai gének promotereinek transzaktiválása útján. A másodikban, a korai fázisban történik a vírusgenom 75%-ának a transzkripciója, eredményképpen olyan fehérjék keletkeznek (ORF UL57, ORF UL54, ORF UL44), amelyek jelenléte szükséges a sejtfertızést 24 órával követı virális DNS szintéziséhez. Végül a DNS replikáció után indul a harmadik, a késıi fázis. Ekkor történik a késıi virális proteinek szintézise, amelyek már a strukturális fehérjék közé tartoznak (pl. kapszid-, matrix proteinek és a burok glikoproteinjei [gp]). Néhány strukturális fehérje transzkripciója azonban már a DNS replikációja elıtt elkezdıdik. Ezek az un. „késleltetett-korai” gének termékei. Közéjük tartozik a mátrix-foszfoprotein pp65 (ORF UL83), amelynek kimutatása a késıbb tárgyalásra kerülı diagnosztikai eljárás a CMV antigenemia alapját képezi (63). A késıi fázisban a CMV genom 90 %-a transzkripcióra kerül. Ezután még a sejtmagban következik be a virionok összeépülése. A virionok a magmembránon áthaladva kapják meg a burkot, és végül az endoplazmatikus retikulum mentén „budding” mechanizmussal kiszabadulnak a célsejtbıl. A késıi gének mőködése függ a virális DNS replikációjától. A DNS polimeráz blokkolása (pl. ganciclovirral) leállítja az új virionok képzıdését.
21
2.2.3.
Epidemiológia A Cytomegalovírus jellemzıi meghatározzák a járványtani jellegzetességeit.
A fertızés gyakran fordul elı a humán populációban, de a tünetekkel járó betegség viszonylag ritkán alakul ki. A tünetekkel járó CMV-infekció változatos formában zajlik mind gyermekekben, mind felnıttekben. CMV a többi herpesz vírushoz hasonlóan rendelkezik azzal a tulajdonsággal, hogy az akut fertızést követıen látens formában - episzoma alakban - képes megmaradni a szervezet sejtjeiben. Ugyanakkor eltérıen a többi herpesz vírustól, amelyek affinitása meghatározott szövetekhez kötött (pl. a Varicella-zoster vírus latenciája az idegszöveti ganglionokhoz kötıdik), a CMV megtalálható a test különbözı területein és szövetein belül (epitheliális sejtek, fehérvérsejtek, fibroblastok, simaizomsejtek, endothelsejtek, macrophagok). Ezekbıl a sejtekbıl a vírus kimutatható az aktív fázisban, de a latencia is ezekhez a sejtekhez kötött. A CMV szeroprevalenciája különbözı területeken változó: 30%-100%. Szoros összefüggés található a CMV-átfertızöttség és a populáció szocioekonómiai helyzete között (64). Az áfertızöttség alapján az országok vagy régiók 3 csoportba oszthatók: 1. Alacsony átfertızöttségő területek (szeroprevalencia: 30-60%). A CMVprevalenciája Nyugat-Európában, Ausztráliában és Észak-Amerika egyes területein viszonylag alacsony. Németországban a lakosság 42%-a, Svájcban 45%-a, Írországban 30%-a, Melbourne-ban 54%-a felnıtt korra átesik a fertızésen (65, 66, 67). Franciaországban az ıslakosság körében 42%-os, a bevándorlók között pedig 94,5%-os a szeropozitivitás (68). Az Egyesült Államokban végzett tanulmányban a fehérek, a szinesbırőek és a mexicói bevándorlók CMV-szeroprevalenciáját a végzettség, a családi állapot, a lakhely földrajzi adatai és a család nagysága szerint hasonlították össze (69). A fehérek között 51,2%-os, a szinesbırőek között 75,8%os és a mexicói bevándorlók között 81,7%-os átfertızöttséget találtak; a déli államok lakói között a prevalencia magasabb volt, mint az északi területeken élıké: 66,2% versus 50,3%. Japánban - a megfelelı oktatásnak és az életszínvonal növekedésnek köszönhetıen - a szülıképes nık átfertızöttsége harmadával csökkent 17 év alatt: 1980-ban – 93,2%, 1997-ben pedig – 66,7% volt (70).
22
2. Közepes átfertızöttségő területek (szeroprevalencia: 61-80%). Közép- és DélEurópában az átfertızöttség magasabb, mint Európa északi országaiban: Olaszországban 71,8%-os (71), Spanyolországban pedig 75,6%-os (72). 3. Magas átfertızöttségő területek (szeroprevalencia: 81-100%). Afrika, DélAmerika és Dél-Kelet Ázsia fejlıdı országainak lakossága 90-100 %-ban fiatal felnıtt korra már hordozza a CMV-t. Például Manilában és Ugandában 100%-os átfertızöttséget találtak (65). A fejlett országokban a felnıtt lakosság alacsony átfertızöttségének nagy jelentısége van, mivel ezekben az országokban magas a fogékony fiatal nık aránya; ha terhességük alatt primeren fertızıdnek, a magzatuknál nagy a rizikója a súlyos congenitális tünetekkel járó CMV-infekció kialakulásának. A CMV-fertızés klasszikus epidemiológiája. Horizontális terjedési mód A fertızıdés elsısorban fertızött váladékokkal történı érintkezés útján következik be. Az átfertızöttség és a kor összefüggéseire vonatkozó tanulmányok szerint az élet folyamán két olyan idıszak van, amikor gyakrabban fordul elı fertızés. Az elsı a perinatális és a kisgyermekkor: a fertızés bekövetkezhet a fertızött méhnyakon való áthaladás során születéskor, de fertızı forrás lehet az anyatej vagy a többi gyerek a bölcsödében és a családban. Fertızött gyermekekben a vírus sokáig megtalálható a felsı légúti nyálkahártyákon és a vizeletben (az elsı életévben a viruria elıfordulása 36-56%) (73). Szoros kontaktus révén a gyermekek leggyakrabban nyállal fertızik egymást vagy a szeronegatív felnıtteket. Bölcsödében az ellátó személyzet a higiéniai szabályok be nem tartásával (kézmosás mellızése) – pl. pelenkázáskor vizelettel – fertızheti a gyermekeket. A második korszak a korai felnıttkor, amikor – elsısorban azokban az országokban, ahol az átfertızöttség alacsony, és sok a fogékony felnıtt – a primer fertızés sexuális úton (hővelyváladékban, spermában kimutatható a vírus) jön létre (74). Egészséges immunitású szeropozitív felnıttek nyállal és vizelettel ritkán ürítenek vírust, ezért mindennapi kapcsolatok útján elıforduló fertızıdés elenyészıen ritka (65).
23
A CMV- fertızés speciális eseteinek epidemiológiája. Az újszülöttek CMV fertızıdése – vertikális terjedési mód Általánosan az újszülöttek 1 %-a fertızıdik transplacentárisan. A tünetekkel járó fertızés (CMV betegség) azonban ritkán fordul elı. A legnagyobb rizikójú csoportban, amikor az anya a terhessége alatt kapja meg a primer fertızést, annak a valószínősége, hogy az újszülöttjénél kialakul a CMV betegség, közel 50%. Egyes szerzık szerint azonban csak 20%. Egyértelmő, hogy a tünetes congenitális CMV betegség kialakulásának valószínősége két tényezıtıl függ: 1). az immunrendszer általános fejlettlensége (a CMV betegség majdnem mindig az in utero fertızıdés során és nem a születés alatt bekövetkezett infekció következtében alakul ki); 2). a specifikus immunitás hiánya (a meglévı anyai CMV-ellenes védettség nem feltétlenül védi meg a magzatot a fertızıdéstıl, de a betegség kialakulásától igen) (75). Az elızı két kitétel együttes elıfordulása teszi az amúgy egészséges immunitású egyének részére nem túlzottan veszélyes kórokózónak tartott CMV-t különösen kártékonynak a szeronegatív anyák magzatai és a szervtranszplantáltak részére. A szervtranszplantált egyének CMV-fertızése Transzplantációt követıen a CMV-infekció lényegesen gyakrabban fordul elı és súlyosabb tünetekkel jár, mint az egészséges személyek esetében. A transzplantált
betegek
25-92%-ában
(attól
függıen,
fenáll-e
valamilyen
rizikótényezı) a szervátültetést követıen kialakul az infekció. Ilyenkor a CMV forrása a beültetett szerv, vagy a fertızés a recipiens saját látens vírusának a reaktivációjából származik (64, 76). (Bıvebben a következı fejezetben még lesz errıl szó.) AIDS-ben szenvedı betegek CMV-fertızése A transzplantált betegekhez hasonlóan a csökkent mőködéső celluláris immunrendszer miatt az AIDS kialakulása után gyakrabban fordul elı CMV betegség, mint az egészséges felnıttek esetében. Az AIDS-ben szenvedı betegeknél a CMV betegség kialakulásának mechanizmusa kissé eltér: körükben lényegesen többször alakul ki CMV-retinitis és intestinitis, mint szervátültetés után (65).
24
CMV fertızıdés vértranszfúzió útján CMV-szeronegatív felnıttek esetében az 1 egység vér transzfúziója 2-3%nyi fertızıdés rizikóval jár. Valószínőleg a polymorphonuclearis fehérvérsejtek a CMV forrásai, ugyanis ezek a sejtek a víruslatencia helyéül szolgálnak. Természetesen az infekció kialakulásának az esélye függ a vérkészítmény elıkezelésétıl, a donor és a recipiens immunrendszerének állapotától is (77, 78). A koraszülöttek, a CMV-szeronegatív terhesek és a szervtranszplantáltak részére – transzfúzió alkalmával - a CMV-szeronegatív donortól származó vérkészítmény adását vagy a szőrı alkalmazását javasolják (79). 2.2.4
A CMV-fertızés tünettana A fertızés tünetei vagy tünetmentessége függ attól, hogy járványtanilag
milyen kategóriába sorolható a megfertızött személy. 1. Congenitális CMV-fertızés alatt a transzplacentárisan bekövetkezett magzati infekciót értjük. A betegség súlyossága függ az anyai specifikus CMV-ellenes immunitás meglététıl. A védett (szeropozitív) anyák esetében a magzat fertızıdésének valószínősége 1 %. Születéskor nagyon ritkán észlelhetık tünetek. Ritkán - hónapokkal késıbb - a gyermekek fejlıdésben elmaradhatnak az egészséges kortársakhoz képest, esetleg idegrendszeri érintettség észlelhetı (hallászavar) (80). Ha a fertızés fogékony anyánál a terhesség alatt következi be, a transzmisszió rizikója 40 %. A fertızött újszülöttek közel fele mutatja a CMVinfekció tüneteit. A legsúlyosabb forma a Cytomegáliás zárványbetegség (CID), amely a következı tünetekkel jár: intrauterin retardáció, hepatosplenomegália,
thrombocytopenia,
bırtünetek
(petechia, purpura), de a legjelentısebb az idegrendszer érintettsége
(microcephalia,
chorioretinitis,
halláskárosodás) (81). A 3. ábrán egy szimptomás congenitális CMV-fertızéssel született gyermek koponya CT felvételén jól látható a periventricularis calcificatio és a ventriculomegalia.
3. ábra: Szimptomás congenitális CMV-fertızéssel született gyermek koponya CT felvétele (Hervey D.)
25
2.
A
szerzett
CMV-infekció
egészséges
immunitásúaknál
leggyakrabban
tünetmentesen zajlik, vagy enyhe mononucleosis infectiosa jellegő tünetekkel jár. -
Perinatalis infekció: ritkán - elsısorban koraszülött, fejlettlen újszülöttek esetében – a fertızés tünetekkel járhat: lymphadenopathia, hepatitis, pneumonia.
-
CMV mononucleosis: jellegzetesen a fiatal felnıttek betegsége, ritkán transzfúzió-, de leggyakrabban közvetlen kontaktus útján jön létre a fertızıdés. A mononucleosis lázzal, rossz közérzettel, atípusos limfocitózissal (4. ábra) és májenzim
emelkedéssel
járhat.
Az
Epstein-Barr
vírus-indukálta
mononucleosissal ellentétben nem alakul ki pharingitis és splenomegalia. Szövıdmények egészséges immunitású egyének esetében nagyon ritkán fordulnak elı: jóindulatú pneumonia, hepatitis, Guillain-Barré szindróma, meningoencephalitis, myocarditis, hemolítikus anaemia, maculopapulosus bırjelenségek (82).
4. sz. ábra: Mononucleosis – aktivált limfociták (Hoffbrand) -
Az immunszupprimált betegek CMV-fertızése változatos tünetekkel jár, és az infekció súlyossága széles skálán mozog. A fertızés befolyásolhatja mind a graft, mind a beteg túlélést (83). (A szervtranszplantált immunszupprimált betegek CMV-fertızés tünettanával részletesen a következı fejezetben foglalkozom.)
2.2.5
A CMV-fertızés laboratóriumi diagnosztikája A CMV-fertızés diagnózisa – klinikai tünetek észlelése mellett -
laboratóriumi eredményeken alapszik, de nagy szerepe van a biopsziák szövettani vizsgálatának (szervi manifesztáció esetén) és a radiológiai eredményeknek is (CT – CID-ben; tüdı RTG és CT – CMV pneumoniában) (84).
26
Laboratóriumi diagnózis a következı módszerekkel lehetséges: I. Direkt kimutatási módszerek: 1. Vírus-okozta cytopathiás hatás vizsgálata fogékony szöveten 2. Vírusizolálás 3. Virális antigének kimutatása 4. Vírális nukleotid-szekvenciák kimutatása 5. Elektromikroszkópos vizsgálat II. Indirekt kimutatási módszerek: 1. Humorális immunválasz vizsgálata 2. Celluláris immunválasz vizsgálata I/1.
A vírustenyésztés fogékony szöveten - vírushatás kimutatása – ”arany
standard” módszer: a mintát fogékony szövetre (leggyakrabban human embrionális fibroblastra) oltják, az inkubációs idı lejárta után pedig a vírus-okozta jellegzetes cytopathiás hatást vizsgálják (syncytium képzıdés) (5. ábra). Hátránya: nem specifikus, idıigényes (az inkubáció 2-6 hét), szövetlabor mőködtetése szükséges. Elınyei: a víruskimutatás lehetséges bármely - emberi szervezetbıl származó mintából (vérbıl, vizeletbıl, bronchoalveoláris lavage-ból, nyálból, liquorból stb.); a vírus izolálható, szaporítható; gyógyszer-rezisztencia vizsgálható.
5. ábra: CMV cytopathiás hatás szöveten – saját felvétel
I/2. Vírusizolálás mintával fertızött szöveten, gyorsított „shell vial módszer” – a hagyományos vírustenyésztés módszernek továbbfejlesztett formája (85, 86) . A hagyományos módszer hátrányait (hosszú inkubációs idı, alacsony specificitás)
27
különbözı technikákkal próbálják elkerülni: a mintát rácentrifugálják a szövetre (a vírus szövet-adszorpciója nı); immunfluorescens módszerrel jelölik a CMV antigéneket (pl. pp72) specifikus monoclonális ellenanyaggal (Mc At) – így már 3-4 nap múlva az eredmény leolvasható és a specificitás is nı (6. ábra).
6. ábra: Vírusizolálás ( IF festés) - saját felvétel I/3. Virális antigének kimutatása – minden olyan szövet vagy sejt vizsgálatnál lehetséges, amely tartalmazza a CMV antigéneket. -
Szövettani vizsgálat – klasszikus diagnosztikai módszer. A felfújt 35 µ átmérıjő sejtek magon belüli zárványokkal („bagolyszem”) jellegzetes jelei a disszeminált aktív CMV-fertızésnek (7. ábra). A módszer nem eléggé érzékeny, de az érzékenységet növelni lehet immunhisztokémiai festés segítségével (specifikus monoclonális ellenanyag - Mc At - felhasználásával), ami egyben a specificitást is növeli (8. ábra) (87).
7. sz. ábra: Klasszikus intranukleáris zárványok, HE festés (Nadel)
8. sz. ábra: „Bagolyszem” szövettani képe, immunhisztokémiai festés (Marco Tolo)
28
-
CMV antigenemia teszt: a szaporodó vírusra jellemzı pp65 Ag (mátrixban elhelyezkedı korai fehérje, a fertızés után 4 órával már megjelenik) kimutatása vérbıl polymorphonuclearis sejtekbıl immuncytokémiai vizsgálattal (9. ábra) (88, 89). A módszer specificitása és érzékenysége magas; a vizsgálat kvantitatív eredményt ad (a kezelés követésére alkalmas), 4-5 óra alatt elvégezhetı (90). Hátránya, hogy a leolvasás szubjektív értékeléssel történik, és a minta mielıbbi feldolgozását igényli.
9. sz. ábra: CMV antigenemia (peroxidáz és amino-etil-karbazol jelölés) – saját felvétel I/4. Molekuláris diagnosztikai módszerek a vírális nukleotid-szekvenciák kimutatására irányulnak. Több technika létezik: - a legérzékenyebb a CMV DNS kimutatása polimeráz láncreakcióval (PCR [91, 92] – qualitatív, quantitatív - real time, nested, branched, touchdown stb.) - a CMV mRNS pp67 kimutatására irányuló „nucleic acid sequence-based amplification” (NASBA) (93, 94) kevésbé érzékeny - biopsziával nyert anyagból végezhetı a magas érzékenységő, de alacsony specificitású qualitatív in situ hybridizáció (95) A PCR-t Mullis fejlesztette ki 1985-ben. Lényege egy olyan láncreakció, melynek során a templát DNS egy célszekvenciáját sokszorosíthatjuk (amplifikáltatjuk) enzimatikus úton. A reakcióhoz a célszervezetbıl megfelelı minıségben és mennyiségben DNS-t kell kivonni. A láncreakció egy erre a célra kifejlesztett PCR készülékben (thermocycler) megy végbe lánckezdı oligonukleotidok (primerek) jelenlétében, hıstabil DNS polimeráz enzim (Taq polimeráz) segítségével (91). A molekuláris módszerek elınye, hogy a mintában még a kis mennyiségben található vírus detektálása is lehetségessé válik. A módszerek rendkívül érzékenyek,
29
kvantitatív eredményt nyújtanak. Hátrányuk az, hogy munka-, eszközigényesek, és hitelesített standardizált gyári kitek alkalmazása esetén drágák. I/5. Elektronmikroszkópos (EM) (10. ábra) vizsgálatnak vitathatatlanul nagy szerepe volt a virológia fejlıdésében, de alkalmazása a mindennapi rutinban korlátozott (a készülék és az üzemeltetése drága, a pozitív eredmény csak nagy mennyiségő víruspartikula esetén várható). Ma - az egyéb érzékeny módszerek elterjedésével – az igény az EM vizsgálat iránt csökkent. Elsısorban a tudományos kutatások területén vagy differenciál diagnosztikai kérdések esetén alkalmazzák.
10. ábra: CMV EM képe (Koller) II/1. Humorális immunválasz vizsgálata – a szerológiai vizsgálatok segítségével a szervezetnek a vírusfertızésre adott humorális válaszát vizsgálják. A fertızıdéstıl számítva minimum 2-4 hétre van szükség a specifikus ellenanyagok (IgM) megjelenéséig. Ezután 16-20 hétig még kimutathatók a vérben. A késıi kimutathatóság ellenére a rutin diagnosztika alapját még mindig a szerológiai vizsgálatok képezik. Több metodika létezik: komplement kötési reakció (KKR), hemagglutináció gátlás (HAG), latex agglutináció (LA), vírusneutralizáció, különbözı jelöléső immunoassay-k (enzimhez-kapcsolt immunosorbent assay – ELISA [indirekt, szendvics, kompetitív], enzimhez-kapcsolt fluoreszcens assay ELFA, radioimmunoassay – RIA, western blot). A módszerek egy része együttesen, az összes típusú ellenanyagot mutatja ki (KKR, HAG): a specifikus ellenanyagok megjelenése (szerokonverzió) vagy a titer négyszeres emelkedése jelzi az aktív fertızést. A többi módszerrel (ELISA, ELFA, RIA) az egy osztályhoz tartozó ellenanyagokat mutatjuk ki: CMV-ellenes IgM, IgA-t (akut infectio jelei) vagy IgGt, ami a védettséget jelenti. A neutralizáló ellenanyagok nagy része a burok
30
glikoproteinjei (gB) ellen képzıdik, de a mátrixban található foszfoproteinek (pp150, pp28, pp65) is erıs ellenanyag választ váltanak ki. A kismamák CMV-fertızésétek diagnosztikájában fontos a primer és szekunder CMV-fertızés differenciálása. Ehhez a CMV IgG aviditási tesztet alkalmazzák. A módszer alapja az, hogy minél régebben következett be a fertızés, annál erısebben kötıdik a specifikus IgG a CMV-antigénhez (magas aviditás). Amennyiben alacsony aviditást mérnek, nagy a valószínősége annak, hogy a primer infekció 6 hónapon belül zajlott (96). A szerológiai kivizsgálás nem alkalmazható járványügyi tanulmányok egy részében, az antivirális terápia monitorozására (97) és – ahogy a saját vizsgálatunkban is kimutattuk - az immunszupprimált betegek aktív CMVfertızésének kimutatására. II/2. Celluláris immunválasz vizsgálata - CMV specifikus CD8+ T-lymphocyták (CTL) kimutatása. CMV-aktiváció esetén nagy számban jelennek meg a CTL-k, melyeknek
fontos
szerepük
van
a
CMV-reaktiváció
és
a
betegség
visszaszorításában. A válasz 70-90%-ban a pp65, pp50, gB antigének ellen irányul (98). A módszer kivitelezése nem egyszerő: a HLA molekulákat és az említett virális
peptideket
tartalmazó
komplexumot
(MHC
tetramer)
konjugálják
fluorokrómokkal, így láthatóvá teszik a tetramérhez kötıdı, antigén-specifikus receptort hordozó T-sejteket, amelyek mérése flow cytometriával történik. CMVinfekció esetén a CTL-k aránya akár ötszörösére is nıhet (99). A vizsgálatot befolyásolja a beteg immunrendszerének kapacitása és a transzplantált betegeknél az esetleges rejectio-ellenes kezelés (szteroid) (100). 2.2.6
A Cytomegalovírus-fertızés terápiája Egészséges immunitású egyének CMV-fertızésének kezelésére ritkán van
szükség. Az infekció általában enyhe tünetekkel jár, és szövıdménymentesen gyógyul. Természetesen elıfordulhat, hogy sor kerül a ritkán elıforduló szövıdmények kezelésére is. Gyógyszeres terápiát elsısorban immunszupprimált betegek igényelnek. A szervtranszplantáció elterjedésének köszönhetıen intenzív kutatások irányultak a hatékony CMV-ellenes szerek fejlesztésére. Ennek eredményeképpen több gyógyszer került forgalomba. (A CMV-fertızés kezelésének lehetıségeit a következı fejezetben részletezem.)
31
2.3
Cytomegalovírus és az immunitás, CMV-fertızés immunszupprimált állapotban A CMV-fertızés különbözı manifesztációja nem függ attól, hogy melyik
törzs okozza a fertızést, vagy az, hogy milyen a gazdaszövet vírus-affinitása. Ezért már a transzplantáció elterjedése elıtt is gyanították, hogy a CMV-betegség kialakulásának fı meghatározója a fertızött szervezet immunrendszerének állapota. 2.3.1
Cytomegalovírus-ferızés és az immunitás
A CMV-fertızés transzplantált betegekben a következı úton jöhet létre (64): - szeropozitív donorból származó - látensen fertızött sejteket tartalmazó szervvel - szeropozitív vérdonorból származó, fehérvérsejteket tartalmazó vérkészítménnyel - aktív vírust exkretáló egyénektıl - közeli kontaktus révén - endogén vírus reaktiváció eredményeképpen Szervtranszplantáltaknál ezek a fertızési utak sajátos epidemiológiai fogalmakat határoznak meg: 1. Primer infekció: amennyiben a recipiens transzplantáció elıtt még nem találkozott a vírussal (CMV-szeronegatív: R-), az infekció a mőtét után alakul ki. Ilyenkor a CMV leggyakrabban a beültetett szervbıl származik (a donor CMVszeropozitív: D+). Ritkán a szeronegatív beteg transzfúzió során vagy a környezetébıl is fertızıdhet. 2. A CMV-szeropozitív recipiensben transzplantáció után kialakult infekciót rekurrens fertızésnek hívjuk. a). Ha a proinflammatorikus hatások következtében aktiválódik a beteg sejtjeiben látensen megbújó vírus, reaktivációról beszélünk. b). Amennyiben a szeropozitív recipiens felülfertızıdik egy újabb, sajátjától eltérı CMV törzzsel, reinfekcióról van szó (101). A fertızés elsı kritikus lépése – akár primer fertızésrıl (vírusforrás a graft), akár reaktivációról van szó – a vírus aktivációja, kikerülése a latenciából. A CMV latencia egy stabil állapot. A látens állapot megszőnéséhez, vagyis a reaktivációhoz speciális ingerekre van szükség: a fı kiváltó ok a gyulladásos környezetben magas mennyiségben termelıdı Tumor Necrosis Faktor (TNF-α). A keringésben
32
felszaporodó TNF-α kötıdik a CMV-hordozó sejtek TNF-receptoraihoz. Ezzel aktiválja a proteinkináz C-t és a nukleáris transzkripciós faktort (NF-κB), ennek eredményeképpen egy aktivált heterodimer termék bekerül a magba, kötıdik a CMV azonnali-korai enhancer génrégióhoz, és elindítja a virális replikációt. Másik vonalon a stressz katekolaminok - adrenalin és noradrenalin - megemelik az intracelluláris ciklikus AMP (cAMP) szintjét, amely szintén stimulálja a virális azonnali-korai enhancer/promóter régiót. A cAMP-n keresztül hatnak a gyulladásos folyamatokban termelıdı proinflammatorikus prosztaglandinok is (102). Ezek a reaktiváló mechanizmusok magyarázatot adnak arra a megfigyelésre, hogy a CMVinfekció
szervtranszplantáltaknál
különbözı
folyamatokhoz
kapcsolódik:
szepszishez, allograft rejekcióhoz, májelégtelenséghez, antithymocyta globulin (ATG) és OKT3 adásához. A felsorolt folyamatok mind rendelkeznek TNF-α szintemelı hatással. Érthetıvé válik a „második hullám fenomén” is: fertızéses eredető gyulladások (urosepsis, Streptococcus pneumoniae eredető tüdıgyulladás, peritonitis) után 2-3 héttel megemelkedik a CMV replikációs rátája (103). A természetes ölısejtek és - szeropozitív recipiensek esetében - a keringı specifikus ellenanyagok (glycoprotein B a fı stimulus) azonnali védelmet nyújtanak, de kulcsszerep a replikálódó vírus elleni védelemben a cytotoxikus (CTL) rendszeré, amely leginkább érintett immunszuppresszív kezelés alatt. A Tsejtek receptoraik (TCR) segítségével kapcsolódnak a fertızött célsejt felszínén található - a virális peptidet reprezentáló – MHC I. molekulákhoz, és egyéb kofaktorok segítségével (perforin, Fas ligand) lizálják, illetve apoptózisra serkentik a fertızött sejteket még mielıtt a vírusszaporodás elindul. Az immunszuppresszív szerek által gátolt CTL funkció miatt ez a folyamat nem mehet végbe. A vírusspecifikus, MHC II. függı CD4+ T-helper sejt eredető immunválasznak fontos szerepe van a krónikus, illetve a látens vírusinfekció elleni védelemben. Valószínőleg nincs közvetlen protektív védı hatása, de nélkülözhetetlen feltétele a CTL válasz kialakulásának. Kimutatták, hogy a specifikus CD4+ T-sejtek által termelt citokinek a CD8+ limfociták elsıdleges aktiválói, és CD4+-sejtek hiányában nem alakul ki CD8+-sejtválasz sem, és feltartózhatatlanul emelkedik a víruskópiaszám. CD4+-limfociták nélkül a B-limfociták aktiválódása is elmarad (104).
33
A különbözı gyulladásos folyamatok kiváltják a CMV reaktivációját, ugyanakkor a szaporodó CMV által kiváltott immunválasz tovább erısíti a gyulladásos folyamatot. A virális replikáció eredményeképpen nagy mennyiségő citokin, kemokin és növekedési faktor termelıdik, amelyek aktiválják az endothel sejteket, és a simaizomsejtek proliferációját eredményezik (105, 106). A CMV fokozza a vasculáris simaizom sejtek növekedését azáltal, hogy befolyásolja a p53 tumor-szuppresszor faktor hatását. A p53-aktivitás csökkenése a simaizom proliferációjához, az intima megvastogodásához vezet (107). A vírus egyik génterméke (US 28) kemokin receptorként mőködik, és kemotaxis útján vonzza a gyulladást elısegítı molekulákat és a fehérvérsejteket a fertızött vasculáris simaizom sejtekhez (108, 109). A gyulladás miatt létrejövı neutrofil sejt és endotel sejt közötti kapcsolat a vírus közvetlen átjutást is eredményezi (110). CMV úgy is elısegítheti az érfalgyulladás kialakulását, hogy indukálja a reaktív oxigén szabadgyökök (ROIs) képzıdését, amelyek provokálják a vasculáris simaizom sejtekben a gyulladásban és az immunválaszban résztvevı gének expresszióját (111). A CMV a citokinek által kiváltott érgyulladáson kívől közvetlenül is képes fertızni az ér-endothelsejteket. Az endotheliális sejtek lítikus fertızését „virális vasculitis”-nek tekinthetjük. Az allograftban elıforduló progresszív vasculopathia nem ritka következménye a CMV-fertızésnek (112). A CMV közvetett és közvetlen érfalgyulladást kiváltó hatása végeredményben a graft krónikus károsodásához vezet. 2.3.2
A CMV immunitás kijátszására és a túlélésre irányuló stratégiái A CMV a host-immunitás ellen immunmoduláló proteinek szintézisével
védekezik, segítségükkel emeli az infekció hatékonyságát, fokozza a disszeminációt, a reaktivációt, és fenntartja a perzisztens állapotot (113). Az US2, US3, US6 és US11 gének által termelt virális glikoproteinek a sejt újonnan képzıdött MHC I. molekulákat visszatartják a citosolban; az US3 protein blokkolja a transporter (TAP) mőködését. A CMV IE proteinjei – az interferon-γ által stimulált jelátvitel (Jak1 és CIITA) megakadályozása útján - gátolják az endotel sejteken indukálható MHC II. expressziót. Ezek a folyamatok gátolják az antigén prezentációt, és a fertızött sejt elkerüli a CD8+ ás CD4+-lymfociták általi pusztulást (114, 115). Az US28 gén olyan receptorokat kódol, amelyek a legtöbb humán
34
kemokint megkötik, ezzel felerısíti a virális disszeminációt, és krónikus vasculáris betegséghez vezet (116). Az UL69, UL82 és IE2579aa gének termékei a p53 gén kiiktatása útján befolyásolják a sejtciklust és az apoptózist. A p53 fehérje fontos szerepet játszik a kóros sejtek apoptózisának kiváltásában, hiányában a fertızött sejt elkerüli a p53 által kiváltott programmozott halált. Az UL18 protein kötıdik a b2mikroglobulinhoz és MHC I. homológként mőködve lefoglalja a Natural Killer (NK sejtek) receptorait. Ez védelmet nyújt az NK sejtekkel szemben (117). A CMV metabolikus defektust generál a monocitákban, ez befolyásolja a citokin termelıdés folyamatatát, a citokinek által kiváltott hatást, és ennek eredményképpen csökken a CTL aktivitás (116). A CMV Fc-receptor termelıdést indukál, a sejt felszínén megjelenı Fc-receptorok megkötik a CMV ellenes IgG-t, ezzel gátolják az ellenanyag-mediált immunválaszt. A CMV fent említett immunmoduláló hatásai az egyéb kórokozók iránti fogékonyságot is növelik. 2.3.3 Cytomegalovírus-fertızés rizikófaktorai A transzplantált beteg veszélyeztetettségét a CMV-fertızés kialakulása szempontjából több tényezı befolyásolja. 1. Immunszupprimált állapotban kialakult primer fertızés általában súlyosabb tünetekkel jár, mint a rekurrens infekció. Ezért az egyik legsúlyosabb rizikótényezı a CMV szerostátusz különbözıség: R-/D+. Ha a szeronegatív recipiens szeropozitív donortól kapta a szervet, 60-80 %-ban alakul ki primer CMV-infekció, és 10-15 %ban fejlıdik ki szövetinvazív CMV betegség (118). 2. A beültetett szerv típusa fontos rizikótényezı. Preventív intézkedések nélkül leggyakrabban a tüdıtranszplantált betegeknél alakul ki súlyos CMV-infekció (119). Tapasztalatok alapján a veszélyeztetettség a következı sorrendben csökken: tüdı, bél-, szív-, hasnyálmirigy-, máj- és vesetranszplantáció (120, 121). 3. Az immunszuppresszív kezelés minısége is befolyásolja a CMV-infekció kialakulását. Indukciós kezelésként vagy szteroid-rezisztens graftkilökıdés miatt alkalmazott
monoklonális-
(OKT3)
vagy
poliklonális
anti-T-lymphocyta
ellenanyagok (ATG, ALG) négyszeresére emelik az infekció kialakulásának veszélyét (122).
35
4. A graftkilökıdés immunmoduláló hatása és a rejekció kezeléseként alkalmazott fokozott immunszuppresszió elısegíti a reaktiválódott CMV szaporodását. Ugyanakkor a CMV-fertızés is provokálhatja a rejekció kialakulását (123). A CMV-infekció kialakulását az alábbi faktorok is befolyásolják, bár - az irodalom szerint - kisebb mértékben, mint a fent említettek (122, 124, 125, 126): -
a donor és recipiens „HLA-missmatch” (2 allél mismatch esetén 88%-ban alakul ki CMV-infekció, 1 mismatch esetén – 61 %, 0 mismatch esetén pedig – 16 %)
-
a recipiens egyes HLA-típusai: HLA-A2, HLA-DR6, HLA-DR7
-
a recipiens életkora (az átfertızöttség a korral nı, így fiatal recipiensek között gyakrabban fordul elı CMV szeronegativitás, ami elırevetíti a primer infekció kialakulásának nagyobb kockázatát immunszupprimált állapotban)
-
vesetranszplantált betegeknél az alacsony kreatinin clearence (<40 ml/min)
-
retranszplantáció
2.3.4
A Cytomegalovírus direkt és indirekt hatásai (11. ábra)
A vírus direkt hatásai a fertızés tüneteiben nyilvánulnak meg. Ljungman 2002-ben határozta meg a transzplantáltak CMV-fertızésével és betegségével kapcsolatos fogalmakat. Azóta a legtöbb közlemény – némi kiegészítéssel – Ljungman besorolása
szerint
származhatnak
osztályozza
lokális
az
infekció
CMV-infekcióból,
megnyilvánulásait,
viraemiával
járó
amelyek
fertızésbıl
és
szövetinvazív vírusszaporodásból (127): -
CMV-infekció: a CMV izolálása, vagy a vírusfehérjék vagy a nukleinsav kimutatása bármely váladékból (plazma, savó, perifériás fehérvérsejtek, liquor, vizelet, BAL) vagy szövetmintából. Amennyiben a vírusszaporodásnak csak laboratóriumi jelei vannak, de jellegzetes tünetek nem észlelhetık, tünetmentes infekcióról van szó
-
CMV szindróma – a következı tünetek közül legalább egyet észlelni kell: láz (>38°C), gyengeség, izom-izületi fájdalom, leukopenia (2.000-3.000/mm3), thrombocytopenia
(30.000-60.000/mm3),
májenzimek
legalább
kétszeres
emelkedése (nem májtranszplantált betegek esetében) és CMV pozitív vérvizsgálati teszt (CMV antigenemia vagy PCR teszt) -
CMV betegség (szervi érintettséggel): CMV pozitív vizsgálati teszttel, lehetıleg szövettani vizsgálattal bizonyított szervinvazív infekció a szerv érintettségére
36
utaló tünetekkel - pneumonia, gastrointestinalis betegség, hepatitis, nephritis, myocarditis, pancreatitis, retinitis, idegrenszeri betegség
Prezervációs, mőtéti graftkárosodás, Sebészi beavatkozás, Graftkilökıdés, Anti-lymphocyta ellenanyagok alkalmazása
Proinflammatorikus citokin környezet (TNFα, növekedési faktorok), Monocyta differenciálódása macrophággá, Stresszhatás (katekolaminok)
Latens CMV reaktiváció
Direkt hatások CMV syndroma hepatitis myocarditis pneumonia pancreatitis gastritis-colitis nephritis retinitis
Aktív CMV- infekció
y Primer CMV-fertızés graftból, transzfúzióból szárm. vírus
Indirekt hatások
Celluláris hatás
akut rejekció
Immunszuppresszió
krónikus graftkárosodás atherosclerosis epeút-vesztı syndroma bronchiolitis obliterans
bakteriális-, autoimmun bet., virális-, tumor kofaktor protozoon-, gombainfekciók; PTLD
11.ábra: A látens CMV reaktivációjának menete és az aktív fertızés hatásai immunszupprimált állapotban (készült Preiksaitis [121] által készített ábra felhasználásával)
37
A szövetinvazív CMV gastrointestinális betegség járhat mind funkcionális (pseudoobstrukció,
fájdalom),
mind
anatómiai
(gyulladás,
vérzı
fekély,
pseudomembranosus colitis) elváltozásokkal (12. ábra). Közben hiányozhatnak a CMV-fertızés jellegzetes tünetei: a láz és a leukopenia. Mivel a vérvizsgálati tesztek is gyakran negatívak, az infekciót elsısorban a hisztológiai eredmény bizonyítja.
12. ábra: Vérzı fekély CMV-eredető gastritisben Vesetranszplantáltak körében az infekció különbözı vese- és urológiai elváltozást okozhat:
tubulointerstitiális
nephritis,
ureterális
gyulladás/necrosis,
glomerulonephritis, veseartéria trombózisa (128). Ritkábban elıforduló CMV által kiváltott klinikai betegségek: encephalitis, epididymitis, cutan-vasculitis (129, 130). Különbözı szervek transzplantációja esetén a CMV-fertızés egyforma tünetekkel jár, azzal az észrevétellel, hogy a beültetett szerv gyakran jobban érintett, mint a natív szervek. CMV hepatitis jellegzetesen májátültetés, CMV myocarditis szívtranszplantáció, CMV pneumonia leggyakrabban tüdıátültetés után alakul ki. Antivirális profilaxis nélkül a CMV-fertızés leggyakrabban a poszttranszplantációs 2.-3. hónapban fordul elı. A lázas fertızések kétharmada ebben az idıszakban CMV eredető (103). A CMV direkt hatásai mellett jelentıs szerepe van a vírus indirekt hatásainak akkor is, ha a fertızés tünetmentesen zajlik (131, 132). A vírusreplikáció és a szöveti invázió az elızı fejezetben leírt gyulladásos folyamathoz vezet (nagy mennyiségő citokin, kemokin és növekedési faktor kiáramlása), amely a CMV-fertızés indirekt hatásaiban nyilvánul meg: -
Az infekció okozta celluláris hatások (antigén- és citokin expresszió) akut rejekciót okozhatnak, de krónikus graftkárosodáshoz is vezethetnek (123).
38
Tüdı-transzplantáció után az indirekt hatás eredményeképpen bronchiolitis obliterans- (133), szívtranszplantáltaknál atherosclerosis és coronariabetegség(134), májtranszplantációt követıen pedig epeút-vesztı szindróma (135) alakulhat ki - Minden típusú graftban egyértelmően kimutatható az elızıekben már tárgyalt – a CMV által kiváltott érfalgyulladás alapján kialakuló - vasculáris károsodás -
Az elızı fejezetben leírtaknak megfelelıen, a CMV genom kódol olyan immunmoduláló fehérjéket, amelyek befolyásolják a sejtciklus szabályozását: az apoptózist, a sejtmigrációt, az angiogenezist és a sejtdifferenciálódás szabályozását. Ennek a folyamatnak az elsıdleges célja az infekció fokozása és a látens állapot fenntartása, de egyéb hatása is van a szervezetre: ezzel tumor növekedést - (oncomoduláció és nem oncogenezis!) és autoimmun betegségek (Crohn betegség) kialakulását is segíti (136)
- A CMV-infekció – a T-helper/T-supressor arány- és az interferon-termelıdés csökkentı hatása révén – következményes immunszuppresszióhoz vezet, amely további bakteriális (Streptococcus pneumoniae, Gram negatív baktériumok), virális (EBV, HHV6, HHV7), gomba (Pneumocystis jirovecii, Aspergillus speciesek) és protozoonok által okozott fertızésekhez és akár EBV-eredető poszt-transzplantációs lymphoproliferatív betegséghez (PTLD) is vezethet (133, 137). - Mind a tünetekkel járó, mind a tünetmentes CMV-infekciót követıen gyakrabban alakul ki poszt-transzplantációs diabetes mellitus (PTDM). Megfigyelések alapján az aszimptomatikus CMV viraemia mellett – a hasnyálmirigy érintettségével kapcsolatos csökkent insulin felszabadulás miatt - négyszer magasabb a diabetes mellitus kialakulásának a veszélye (138). A CMV graftra és beteg szervezetére gyakorolt hatása mellett nem elhanyagolható a CMV-infekcióval kapcsolatos költségek megítélése sem. Függetlenül a graft típusától, a recipiens szerostátuszától a transzpantációt követı elsı évben kialakult CMV-fertızés legalább 40 %-kal emeli a direkt egészségügyi kiadásokat az alapköltségekhez képest (139). Az indirekt hatásokat most kezdjük megismerni, így az általuk generált pontos költségek még nem ismertek, de valószínőleg meghaladják az elıbb említett direkt kiadásokat (140). Ennek pontosítására további precíz költség-hatékonysági vizsgálatokra van szükség.
39
Régebben a CMV-sal kapcsolatos problémák megoldásában a direkt hatások megelızésére vagy kezelésére törekedtünk. Egyre több adat bizonyítja, hogy a direkt hatások mellett a CMV indirekt hatásai is befolyásolhatják mind a graft-, mind a betegtúlélést. Ezért nem elég elkerülni a CMV-betegséget, fontos meghatározni azokat az intézkedéseket is, amelyek segítségével a CMV primer fertızés vagy a látens vírus reaktivációja megelızhetı. 2.3.5
Preventív lehetıségek
1. CMV-szeronegatív recipiensek részére a szeronegatív donorokból származó graft a megfelelı. Sajnos a közismert szervhiány miatt nincs lehetıség CMV szerostátusz alapján választani szervdonort. Mivel a magyar populációban magas a CMV-átfertızöttség, kicsi a valószínősége annak, hogy az egyébként immunológiailag megfelelı szerv CMV-szeronegatív donortól származzon (141). 2. CMV-szeronegatív
recipiensek
esetében
a
CMV-szeronegatív,
szőrt
vérkészítmények alkalmazására kell törekedni (79). Bár az ablakperiódus miatt van, aki nem javasolja a szeronegatív donorvér transzfúzióját sem az aktív CMV-infekció és a viraemia lehetısége miatt (142). 3. Az aktív immunizálás (vaccinatio) jelenleg még nem megoldott (56). A nem eléggé patogén Towne CMV törzs felhasználásával készült vaccinák nem hozták
meg
a
várt
eredményt:
csak
mitigálják
a
CMV-betegséget
immunszupprimált egyéneknél. A vírusellenes védettség kialakulásához mind a neutralizáló ellenanyagokra, mind a specifikus cytotoxikus T-lymphocytákra szükség van (143). Ez az eredmény várható a rekombináns DNS technológiával készült oltóanyagtól: a bivalens DNS vaccina tartalmazza a foszfoprotein 65 (pp65)- és a glycoprotein B (gB) géneket. A pp65 indukálja a celluláris immunválaszt, a gB speciális adjuvánsokkal együtt pedig a humorális választ. A virális gének vektor (canarypox vírus) segítségével kerülnek be a gazdasejtbe. Ezen vírusfehérjéket a gazdaszervezet sejtjei „gyártják”, majd a sejtfelszínre került virális proteinek váltják ki a szervezet immunválaszát (144). 4. A passzív immunizálást gammaglobulinnal vagy hyperimmun gammaglobulinnal elsısorban tüdı- és szívtranszplantált recipienseknél alkalmazzák az antivirális gyógyszeres prevenció kiegészítésére.
40
5. A CMV-infekció megelızése antivirális szerekkel is végezhetı. Ez a stratégia tőnik leghatékonyabbnak és legkönnyebben kivitelezhetınek. Gyógyszeres profilaxisra a következı nucleozid-analógok alkalmasak: valganciclovir, ganciclovir p.o. vagy intravénásan. Kevésbé hatékony, de magas dózisban alkalmazható a valacyclovir p.o. vesetranszplantáltak részére. A jövıben ez a paletta várhatóan szélesedik: az oldat formában gyártott valganciclovir megkönnyíti a gyermekek kezelését; a DNS elongációt és a virális kapszidnak a fertızött sejt nukleoluszából történı kijutását akadályozó ribozidokhoz nagy reményeket főznek; a rheumatoid arthritis kezelésére bejegyzett leflunomide immunszuppresszív hatása mellett anti-CMV hatással is rendelkezik: gátolja a virion morfogenezisét (145). A gyógyszeres preventív metodikák közül a transzplantáló teamek két lehetıség - profilaxis és pre-emptív terápia - között választhatnak. 2.3.6 Cytomegalovírus-fertızés kezelése 25 évvel ezelıtt az immunszupprimáltak CMV-fertızése egyike volt legveszélyesebb virális infekcióknak. A CMV pneumonia nem ritkán halálhoz vezetett. Azóta a CMV-ellenes szerek megjelenésének köszönhetıen a CMVbetegség kezelhetı, sıt az infekció megelızhetı. Ma a transzplantált betegek kezelésére több CMV-ellenes gyógyszer áll rendelkezésre, de a 80-as évek végén Ogilvie által kifejlesztett ganciclovir még ma is a leghatékonyabb szer. Ganciclovirt megelızıen acyclovirt alkalmaztak, amely nukleozid (guanin) analóg – a természetes nukleozid cukorgyőrője helyett egy nyitott láncot tartalmaz. Az acyclovir trifoszfát (acyclo-GTP) formában válik aktívvá. A virális timidinkináz (vTK) acyclo-GMP molekulává konvertálja. A további foszforiláció már a sejt eredető timidinkinázzal történik. A keletkezett acyclo-GTP hatékony DNSpolimerázgátló, 100-szor erısebben kötıdik a virális polimerázhoz. Ezzel magyarázható a szer kis toxicitása. Az acyclo-GTP beépül a virális DNS-be, ami a lánc elongációjának a leállását eredményezi (146). Az acyclovir elsısorban herpes simplex és varicella zoster fertızésekben hatékony, CMV- és EBV-infekció esetében csak magas dózisban van némi hatása.
41
Az acylovir CMV-ellenes hatásának növelését egy carbinol csoport hozzáadásával érték el (13. ábra) (34). Az új szintetikus nukleozid analóg – a ganciclovir – hatásfoka CMV-sal fertızött sejtekben 100-szorosa a nem fertızött sejthez képest (147). CMV-fertızéskor a monofoszfát forma a virális eredető UL97 gén által kódolt foszfotranszferáz segítségével alakul ki. A további foszforilációt celluláris enzimek végzik. Az aktív ganciclovir-trifoszfát napokig perzisztál a fertızött sejtben. A ganciclovir a következı módon fejti ki virosztatikus hatását: gátolja a virális DNS-polimerázt (UL 54), és beépülve a vírus DNS-be terminálja a lánc további épülését.
13. ábra: A ganciclovir kémiai képlete
CMV-fertızéskor ma is a ganciclovir az elsı választandó szer, elsısorban immunszupprimált betegek esetében, amikor számíthatunk a súlyos tünetek kialakulásával. Congenitális CMV-fertızéskor érdemes az újszülöttet kezelni ganciclovirral, a meglévı tünetek kezelése mellett a szer hatékony lehet a késıbbi károsodások (pl. hallászavar, süketség) kialakulásának megakadályozásában is. A ganciclovir megfelelı terápiás hatását intravénás alkalmazásnál fejti ki. Az orális ganciclovir biohaszonulása csak 6-7%. A ganciclovir valin észtere – a valganciclovir – jól felszívódik a gastrointestinális traktusból (ganciclovirral összehasonlítva a biohaszonulása 10-szeres), ezért jól alkalmazható per os. Elsısorban a rizikócsoportba tartozó betegek CMV-infekció profilaxisára használják
(103).
A
ganciklovirral
szemben
kialakult
rezisztencia
oka
leggyakrabban a virális UL 54 és UL 97 génszakaszokon bekövetkezett mutáció. Foscarnet (trinátrium foszfonoformat) szintén hatásos CMV-fertızés kezelésére. Ez a szer a pirofoszfát strukturális analógja, szelektíven gátolja a virális DNS-polimeráz pirofoszfát-kötı helyét. Nem igényel TK általi foszforilációt, ezért hatékony
lehet
olyan
vírusokkal
szemben,
42
amelyek
rezisztenssé
váltak
ganciclovirral szemben (148). Foscarnet nefrotoxikus, hatással van az elektrolit háztartásra, ezért vesetranszplantált betegek esetében alkalmazása korlátozott. A prágai Biokémiai Intézetben Holy által kifejlesztett cidofovir (aciklikus nukleozid-foszfonát) szelektíven gátolja a vírus DNS-szintézist, nem igényel foszforilációt (149). Elsısorban CMV retinitis kezelésére alkalmazzák, de kutatják a BKV, adenovírus és a HPV-ellenes hatását. Foscarnethez hasonlóan nefrotoxikus. A maribavir fázis III. stádium kivizsgálás alatt álló hatékony orális CMVellenes szer, amely a vírusellenes szerek új csoportjába, a benzimidazol ribozidok közé tartozik. Az egyéb CMV-ellenes gyógyszerektıl, amelyek a virális DNSpolimeráz gátlásán keresztül fejtik ki hatásukat, a ribozidok a virális proteinkináz gátlása révén megakadályozzák a vírus DNS összeépülését, és a kapszid kiszabadulását a nukleoluszból (35). A maribavir nem mutat keresztrezisztenciát a többi CMV-ellenes szerrel (150).
2.3.7
Immunszuppresszív szerek hatása a Cytomegalovírusra Az immunszuppresszív terápia alkalmazásakor erısen csökken az immunitás
mőködése, elsısorban a virális infekciók visszaszorításában is oly fontos T-sejtmediált immunitásé. A CMV-reaktivációt közvetlenül azok az immunszuppresszív szerek váltják ki, amelyek erısen befolyásolják a citokin-felszabadulást (citokin storm). A többi immunszuppresszív szernek kevés közvetlen hatása van a CMV reaktivációjára, de ha citokin kiáramlást okozó egyéb folyamat miatt (pl. a graft mőtéttechnikai okból származó szövetkárosodása vagy a rejekció – 11.ábra) már jelen van a replikálódó vírus, az elégtelen funkciójú immunitás nem tudja visszaszorítani a vírus korlátlan szaporodását. Ez végeredményben a CMV-betegség kialakulásához vezet. Ezt a folyamatot „in vivo PCR hatásnak” is hívják és a gyógyszerek - dózis-függı cytotoxikus T-sejt (CTL) választ csökkentı hatásának az eredménye. Ezzel magyarázható az antivirális kezeléssel megszüntetett infekció 2-3 héttel a „gyógyulás” után bekövetkezı kiújulása is: az antivirális terápia befejezése után a még jelenlévı kis mennyiségő replikálódó vírus az immunszuppresszív szerek hatása miatt újra amplifikálódik (103). A
szervátültetés
kapcsán
használt
immunszuppresszív
vegyületeket
hatásmechanizmusuk alapján 4 csoportba oszthatjuk: 1. kortikoszteroidok, 2.
43
calcineurin gátló szerek, 3. lymphocyta proliferációt gátló szerek, 4. mono-és poliklonális lymphocyta ellenes ellenanyagok. Az egyes csoportokba tartozó gyógyszereket egymással kombinálva, 2 vagy 3 szert együtt adva alkalmazzuk. A különbözı hatásmechanizmus miatt változó a vírus reaktivációjára gyakorolt hatásuk is (116). 1. Kortikoszteroidok (prednisolone, prednisone, methyl-prednisolone) Összetett, gyulladáscsökkentı és immunmoduláló hatásukat citoplazmatikus receptorukhoz
kötıdve,
majd
a
sejtmagba
jutva,
a
gén
transzkripció
befolyásolásával fejtik ki. Hatásukra csökken az interleukin (IL)-1, IL-2, IL-6, az interferon (IFN)-γ és a tumor necrosis factor (TNF)-α szintézise, de csökkentik a prostaglandinok képzését, a histamin és a bradykinin felszabadulást is. Gátolják a monocyta, macrophag funkciót, csökkentik a keringı CD4+ T-lymphocyták számát. A kortikoszteroid az immunszuppressziós gyógyszerkombinációk egyik alapvetı összetevıje (15). Minimális közvetlen hatással vannak a CMV reaktivációjára 2. Calcineurin gátló szerek/inhibitorok (cyclosporine, tacrolimus) Gátolják az antigén indukálta T-lymphocyta aktivációt és proliferációt, ezzel megakadályozzák az immunválasz kialakulását. Normális körülmények között a Tsejt receptor és a donor MHC (major histocompatibility complex) antigén kötıdés kalcium-függı jelátviteli utat, a calcineurint, egy kalcium/kalmodulin-függı foszfatázt aktivál. Az aktivált calcineurin defoszforilálja az nukleáris transzkripciós faktor-t (NF-κB), mely a sejtmagba jutva fokozza bizonyos citokinek (IL-2, IL-3, IL-4, IFN-γ, TNF-α) genetikai átírását. Az IL-2-nek fontos szerepe van az antigén kiváltotta immunválasz elindításában. A cyclosporine a cyclophilinhez, a tacrolimus az FKBP-12 fehérjéhez (12 kDA FK506-binding protein) kötıdik a citoplazmában. Az így létrejött komplexek gátolják a calcineurint, az antigén kiváltotta jelátvitelt, a citokinek, így elsısorban az IL-2 szintézisét, ezzel a T-lymphocyták aktiválódását, proliferációját és az immunválasz kialakulását (15). Minimális közvetlen hatással vannak a CMV reaktivációjára. 3. Lymphocyta proliferációt gátló szerek Azathioprine Antimetabolit, mely a szervezetben 6-mercaptopurinná, majd több lépésen keresztül 6-thioguaninná alakul, végül ez épül be a replikálódó DNS molekulába, megállítva
44
ezzel a DNS további replikációját, és a sejtproliferációt. Gátolja a “de novo” purin nukleotid szintézist is. Hatása tehát több ponton érvényesül (15). Minimális hatással van a CMV-reaktivációra. Mycophenolic acid / mycophenolsav A mycophenolsav szintén antimetabolit vegyület, számos Penicillium species fermentációs terméke. Hatását a lymphocyták „de novo” guanin nukleotid szintézisének gátlásával fejti ki. Célenzimje az inozin 5′-monofoszfát dehidrogenáz (IMPDH), melyet nem kompetitív, szelektív, reverzibilis módon tud blokkolni (151). Emeli a ganciclovir antivirális hatását (152). Ugyanakkor alkalmazása során gyakoribb CMV-eredető gastrointestinitist írtak le. Mammalian target of rapamycin (mTOR) inhibitorok (sirolimus, everolimus) A sirolimus és az everolimus a mammalian target of rapamycin-t (mTOR) gátló vegyületek közé tartoznak. A sirolimus és az everolimus is az FKBP12 fehérjéhez kötıdik a sejtben, de - szemben a tacrolimus-szal - nem gátolják a calcineurint. Gátolják viszont az mTOR-t. Az mTOR egy szerin/treonin kináz, számos növekedési faktor és citokin jelátviteli útvonalának fontos fehérjéje, a sejtciklus szabályozásában játszik szerepet. Gátlására a sejtciklus megáll a G1/S fázis átmenetben, ami a T-sejtek aktivációjának és proliferációjának gátlását eredményezi (153). Nem fokozza a CMV-reaktivációt. 4. Mono- és poliklonális lymphocyta ellenes ellenanyagok A különbözı lymphocyta antigének ellen állatban termeltetett ellenanyagok alkalmazásának indikációja kettıs: 1. a szervátültetés utáni közvetlen, indukciós terápia, 2. szteroid kezelésre rezisztens akut rejekció kezelése. Monoklonális ellenanyagok a./ OKT3 (muromonab-CD3) Az OKT3 a T-lymphocyták CD3 antigénjéhez kötıdik, hatására a sejtek lízisének eredményeként a T-lymphocyták perceken belül eltőnnek a keringésbıl. A sejtszétesés jelentıs citokin kiáramlással (leginkább TNF-α), következményes tünetekkel, lázzal, légzési nehézséggel, tüdıödémával, ARDS-szerő (acut respiratory distress) képpel járhat. A „cytokine release syndrome (cytokine storm)” megelızése érdekében a betegek az OKT3 alkalmazása elıtt szteroid és antihisztamin gyógyszeres elıkészítésben részesülnek. Az OKT3 adását követıen
45
három, öt nappal, a T lymphocyták ismét megjelennek a vérkeringésben, de nem expresszálják a CD3 antigént, immunológiailag inkompetensek (154). Közvetlenül reaktiválja a látens CMV-t. b./ Basiliximab, daclizumab (anti-CD25 monoklonális ellenanyag) A CD25 az aktivált T-lymphocyták által expresszált IL-2 receptor alpha lánca. E gyógyszerek hatásukat a receptorhoz kötıdve, kompetitív antagonistaként fejtik ki, megakadályozva ezzel a T-lymphocyták aktiválódását. Citokin kiáramlási reakcióval alkalmazásuk nem jár. Egyetlen adag ellenanyag heteken át kimutatható a vérkeringésben. Szteroid és cyclosporine adása mellett hatástartamuk kb.7 hét (155). Nincsenek közvetlen hatással a CMV reaktivációra (156). c./ Rituximab (anti-CD20 monoklonális ellenanyag), alemtuzumab (anti-CD52 monoklonális ellenanyag) Az elsı szer a B-limfociták felszínén található CD20-at támadja, ezzel jó hatással van a B-sejtes lymfómák és az ellenanyag-mediálta rejekció kezelésében. Az alemtuzumab hatása a B- és T-limfociták, monociták, makrofágok és az NK-sejtek felszínén expresszálódó CD52 ellen irányul, ezzel ezen sejtek lízisét eredményezi. Ez a szer is jól alkalmazható a lymphomák és leukaemia kezelésében, de alkalmazzák vesetranszplantáltak indukciós terapeutikumként is. Nincsenek közvetlen hatással a CMV-reaktivációra. Poliklonális ellenanyagok Anti-thymocyta globulin (ATG), anti-lymphocyta globulin (ALG) Humán thymocytákkal vagy lymphocytákkal beoltott nyúlban vagy lóban termeltetett, IgG típusú ellenanyagok, melyek a T-és B-lymphocyták, NK sejtek, macrophagok különbözı sejtfelszíni receptoraihoz kötıdnek. Hatásukra az OKT3hoz hasonló limfocita depléció következik be. A komplement mediált citolízis, citokin felszabadulás lázat, bırpírt, viszketést, ritkán anafilaxiás sokkot okozhat („first dose reaction”). A mellékhatások a betegek kötelezı gyógyszeres elıkészítésével mérsékelhetık (157). Közvetlenül reaktiválják a látens CMV-t.
46
2.4
HLA és a betegségek Közismert, hogy a genetikai variabilitás befolyásolja a különbözı
betegségek iránti fogékonyságot. Bizonyos betegségekre vonatkozólag kapcsolat áll fenn a HLA fenotípus és a klinikai betegség elıfordulása között: spondilitis ancylopoetica (B27), rheumatoid arthritis (DR4), coeliakia (DR3, DQB1), insulindependens diabetes mellitus (DR4, B8, DQ8), sclerosis multiplex (DR15, DQ6), Goodpasteur szindroma (DR15, DQ6), narkolepsia (DR2), Chagas betegség, alopecia, tuberculosis stb. (158, 159, 160, 161). Egyes HLA-típusok viszont védıhatással rendelkeznek egyes betegségek ellen: bırcarcinoma, Kaposi sarcoma (mindkét esetben bizonyított a virális eredet!) (162). A HLA-B*5701 allélt hordozó HIV-fertızött betegek lényegesen jobban reagálnak az antiretrovirális kezelésre (163). Az egyes betegségek szempontjából veszélyeztetett személyek azonosítására végzett HLA vizsgálat értékelése általában statisztikai összefüggéseken alapszik, kivéve a közvetlenül a HLA-hoz kapcsolódó gének által okozott monogenikus betegségeket: a 21-hidroxiláz hiány (B47), az idiopátiás hemokromatózis (A3) és a C2 vagy C4 hiány. Az utóbbi 2 évtizedben több – a HLA-típus és a CMV-fertızés összefüggésével kapcsolatos – vizsgálat eredményei jelentek meg. A szerzık 15 HLA-típust vizsgáltak: közülük 3 (HLA-Cw7, -B16, -B55) protektívnak bizonyult CMV-infekció ellen (164, 165, 166), a többi típus (HLA- A2, -A24, -A32, -B52, Bw4, -DR6, -DR11, -DR15 és a donor eredető HLA-B7) emeli a CMV-fertızés kialakulásának rizikóját (164, 167, 168, 169). A HLA-DR7, HLA-A11 és HLAB51-rıl szóló közlemények ellentmondásos eredményekrıl számoltak be (168, 170, 171, 172).
47
3. CÉLKITŐZÉSEK A kutatói munka fı témájául a szervátültetést követı CMV-fertızés problémáját választottam. A bevezetésben és az irodalmi háttér fejezetben részletesen összefoglaltam a téma klinikai jelentıségét. Munkám célkitőzései: 3.1 A magyar lakosság Cytomegalovírus-átfertızöttségének megállapítása, jellegzetességeinek meghatározása kor- és nemi megoszlás és vércsoport szerint. A mindennapi munka során a budapesti Transzplantációs és Sebészeti Klinikán gyakran találkozunk CMV-infekcióval kapcsolatos kórképekkel. Ahhoz, hogy a súlyos betegség elkerülése érdekében tudjuk megfelelı módon tervezni a recipiensek prevencióját (szeropozitív, szeronegatív donorok és recipiensek aránya), a tünetes fertızés kialakulása esetén ahhoz, hogy a diagnosztikai eredményekre támaszkodva hatékonyan tudjuk kezelni a betegeket - az irodalmi adatokon túl ismernünk kell a hazai CMV–átfertızöttséget is, a magyar populáció CMVfertızéssel kapcsolatos kor- és nemi megoszlását és egyéb jellegzetességeit. A magyar
populáció
CMV-szeroprevalenciáját
eddig
kevesen
vizsgálták.
A
dokumentált felmérések kis létszámú vizsgálati csoportokra és szők korosztályra vonatkoztak, pontos – az egész populációra vonatkoztatott - adattal nem rendelkeztünk. Ezért saját lehetıségeinknek megfelelıen a magyarországi populációt reprezentáló, nagy létszámú csoport átfertızöttségét vizsgáltuk. Kormegoszlás szerint ellenıriztük a szervdonorok CMV szeropozitivitását, amibıl következtetni lehetett arra, hogy Magyarországon milyen a szeroprevalencia, és mely korcsoportban következik be leggyakrabban a primer CMV-fertızés. Vizsgáltuk ezenkívül a nemi megoszlást és a vércsoporttal való összefüggést is. A kapott eredmények jól használhatók egy másik veszélyeztetett csoport - a terhes anyák és magzataik – CMV-fertızésének modellezésében. A CMV szeroprevalencia adataira támaszkodva járványtani és statisztikai módszerrekkel kalkulálható a magzatok fertızésének valószínősége.
48
3.2 Az aktív Cytomegalovírus-fertızés kimutatás optimális módszereinek meghatározása transzplantált betegek részére: a szerológiai vizsgálat, a CMV antigenemia teszt, a vírusizolálás és a PCR vizsgálat módszertani paraméterek és az alkalmazhatóság szerinti összehasonlítása; a kivizsgálás menetének kidolgozása A CMV-fertızés diagnosztikájában már a 70-es, 80-as években megfelelı módszerekkel rendelkeztek az egészséges immunitású egyének eseteire. A kimutatás rutin módszerei a következık voltak: a szerológia és a vírusizolálás. A szerológiai módszerrel történı kivizsgálás a fertızıdéstıl számítva legkorábban 2-4 hét múlva válik értékelhetıvé, a vírusizolálás pedig önmagában többnapos eljárás (minimum 3-4 nap). Ezért ezekkel a módszerekkel késın lehet pontos diagnózist adni. Ez nem okoz problémát, mivel az egészséges immunitású egyének esetében a vizsgálatoknak elsısorban differenciál diagnosztikai jelentısége van (ritkán szükséges antivirális kezelés). Az említett módszerek – elsısorban a szerológiai eljárások - alacsony ár és viszonylagos egyszerő kivitelezés miatt még ma is jól alkalmazhatók. Az immunszupprimált betegek esetében azonban nélkülözhetetlen a CMVfertızés gyors diagnosztizálása, és pozitív eredmény esetén a hatékony kezelés mielıbbi megkezdése. A 90-es évek elejétıl az Országos Epidemiológiai Központban (korábban Országos Közegészségügyi Intézet) Koller Miklós és Berencsi György irányítása alatt – Magyarországon elsıként - bevezettük a speciálisan immunszupprimált betegek részére kifejlesztett diagnosztikai módszer – a CMV antigenemia teszt - rutinszerő alkalmazását. A bevezetés után módunk volt az elızıleg alkalmazott módszerek és az új eljárás párhuzamos tesztelésére. Az összegyőjtött eredmények alapján az általunk vizsgált 3 diagnosztikai módszer (szerológiai, „gyorsított” vírusizolálás és az antigenemia teszt) összehasonlító elemzését végeztük el. A késıbbiekben a Transzplantációs és Sebészeti Klinikán pedig az antigenemia tesztet és a PCR vizsgálatot hasonlítottuk össze. Meghatároztuk az eljárások specificitását, érzékenységét, a prediktív értékeket, és megállapítottuk az éppen aktuális célnak megfelelı alkalmazhatóságot is. Az eredmények alapján kidolgoztuk - a klinikusok munkáját is segítı - az immunszupprimált betegek részére használható kivizsgálási algoritmust.
49
3.3
A rizikócsoportba tartozó recipiensek Cytomegalovírus-fertızésének
megelızését
szolgáló
profilaktikus
protokollok
hatékonyságának
összehasonlítása A CMV-infekció profilaxis azért nagy jelentıségő a transzplantált betegek körében, mert alkalmazásával nemcsak a beteg életét veszélyeztetı tüneteket, hanem a CMV celluláris (indirekt) graftkárosító hatásokat is elkerülhetjük a korai poszttranszplantációs idıszakban (173). A fertızés megelızésére alkalmazott módszerek sokaságáról számoltak be a világ különbözı transzplantáló központjaiból. Az utóbbi 15 évben a diagnosztikai lehetıségek és a gyógyszeripari termékek folyamatos fejlıdésének köszönhetıen a preventív lehetıségek palettája is fokozatosan alakult: a 90-es évek elején az acylovir és a hyperimmun gammaglobulin adagolással, késıbb a per os alkalmazható ganciclovir megjelenésétıl a megelızés ganciclovirral, illetve valganciclovirral történik. 1997-tıl mostanáig a Transzplantációs és Sebészeti Klinikán 3 különbözı protokollt alkalmaztunk: 1. hyperimmun gammaglobulin monoprofilaxist 2. hyperimmun gammaglobulin és orális ganciclovir kombinált profilaxist 3. ganciclovir (2004-tıl valganciclovir) monoprofilaxist Elképzelésünk szerint a kombinált profilaxis esetében kellene leghatékonyabban érvényesülni a preventív hatásnak, mivel így érvényesül a magas titerő immunglobulin általi védelem az extracellulárisan megjelenı vírusok ellen vagy az ellenanyag függı sejt-mediálta cytotoxicitás (ADCC) útján (116), és a vírusok intracelluláris szintézise is gátolt az antivirális gyógyszernek köszönhetıen. A megfelelı prevenciós protokoll kiválasztása érdekében az említett 3 profilaxis-csoportba tartozó vesetranszplantáltak adatait hasonlítottuk össze: vizsgáltuk a fertızés elıfordulásának gyakoriságát, a CMV betegség tüneteinek súlyosságát, a fertızés elıfordulásának a transzplantációtól számított idejét, a rejekció és a CMV-infekció összefüggését.
50
3.4
A magas rizikójú vesetranszplantált betegek CMV-fertızése; a fertızés
iránti fogékonyság vizsgálata, a HLA-típussal való összefüggés és a genetikai prediszpozició megállapítása Amellett, hogy a mai tapasztalatok alapján bebizonyosodott, hogy a CMV fertızés kimenetele függ a gazdaszervezet aktuális immunstátuszától, úgy tőnik, mind az immunszupprimált transzplantáltak, mind az egészséges immunitású személyek esetében a fogékonyságot és a fertızés súlyosságát befolyásolják a genetikai adottságok is. Magas
rizikójú
(R-/D+)
vesetranszplantált
betegeinket
vizsgálva
észrevettük, hogy még azonos feltételek mellett is volt olyan beteg, akinél kialakult az aktív CMV-infekció (tünetes vagy tünetmentes) a korai poszttranszplantációs idıszakban (4 hónapon belül) vagy késıbb, de voltak olyan esetek, amikor a beteg annak ellenére, hogy a szervet szeropozitív donortól kapta, a transzplantációt követıen CMV-mentes maradt, vagyis a fertızés nem fogant meg. Ezt a tényt sok faktor magyarázhatja. A vizsgált betegeink sok szempontból homogén
csoportba
tartoztak:
azonos
szerostátusz
(R-/D+),
azonos
immunszuppresszív terápia és CMV profilaxis, ezért azt feltételeztük, hogy az ilyen mértékő fogékonyságbeli különbségeket a genetikai prediszpozició is elıidézheti, és összefügghet a HLA-diverzitással. Retrospektív tanulmányunkban a CMV-szeronegatív vesetranszplantált betegek CMV-fertızésének elıfordulását, az infekció súlyosságát és az egyes HLA-típusok közti lehetséges összefüggést vizsgáltuk. A CMV-fertızés iránti fogékonyságot növelı HLA-típusok ismerete segítheti a magas rizikójú betegek követését, a profilaxis és kezelés tervezését.
51
4. MÓDSZEREK 4.1
A
Cytomegalovírus-átfertızöttség
vizsgálatához
használt
donorjelentések adatai és labordiagnosztikai módszerek Kadáver szervek beültetésénél elvégeztetjük a donorok HBV, HCV, HIV szőrését, és ellenırizzük a donorok CMV szerostátuszát. A HBsAg, anti-HCV és anti-HIV pozitivitás esetén a donorszerv nem fogadható el. A CMV szeropozitivitás (anti-CMV IgG jelenléte) nem befolyásolja a donorszervek elfogadását. De negatív CMV szerostátuszú donor esetén a szerveket lehetıleg azonos szerostátuszú (CMV szeronegatív) recipiensbe kell beültetni. Betegek: 1998 és 2007 között eltelt 10 év alatt 2070 donor - 1278 férfi (62%) és 792 nı (38%) - adatait dolgoztuk fel. A szervdonorok átlagéletkora 44,6 (2-70) év volt. Ezenkívül 200 idıskorú személyt is vizsgáltunk CMV-átfertızöttséget illetıen. İk egy régebbi – idısek otthonában végzett – szőrıvizsgálat résztvevıi voltak. A vizsgáltak életkora 71-tıl 92 évesig terjedt. A CMV-átfertızöttséget tehát összesen 2270 személyben 2 évestıl 92 éves korig vizsgáltuk. A vizsgáltakat 4 korcsoportba osztottuk: 2-20, 21-50, 51-70 (donorok) és 70-92 évesek (nem donorok). Módszerek: A szervdonorok mintáinak (natív vér) anti-CMV IgG vizsgálata az Országos Vérellátó Szolgálat (OVSZ) Budai-, Szegedi- és Pécsi Regionális Vérellátó
Központi
Intézeteinek
Vírusszerológiai
laboratóriumaiban
MEIA
(Microparticle Enzyme Immunoassay – Abbott Axsym) módszerrel történt. Az OVSZ Debreceni Regionális Vérellátó Központi Intézetének Vírusszerológiai laboratóriumában a vizsgálatok ELISA (Abbott) módszerrel történtek. Az idıskorúak vizsgálatait az Országos Közegészségügyi Intézet Virológiai osztályán (Berencsi György, Jankovits István) végeztük ELISA (anti IgG - Behring) módszerrel. A donorok klasszikus laboratóriumi jobb- és baloldali ABO vércsoportmeghatározása oszlopagglutinációs módszerrel (ScanGel – Bio-Rad) az OVSZ intézeteiben történt. A vizsgáltak CMV-átfertızöttségi adatai a következı szempontok alapján kerültek feldolgozásra: kor szerint, nem szerint, vércsoport szerint.
52
4.2
A Cytomegalovírus-fertızés transzplantált betegek körében és a
fertızés kimutatásának módszerei A legmegfelelıbb diagnosztikai módszer kiválasztásához tudni kell, hogy milyen célból történik a vizsgálat: átfertızöttség igazolása vagy aktív infekció diagnosztizálása. Az sem közömbös, hogy milyen beteg részére történik a kivizsgálás: immunszupprimált vagy egészséges immunitású egyén, esetleg kismama vagy újszülött részére. A jelenleg is rutinban alkalmazott CMV-fertızés diagnosztikai módszertana immunszupprimált betegek részére a kilencvenes években alakult ki. Az optimális metodika több lehetséges eljárás összehasonlítási vizsgálataiban kristályosodott ki. Betegek: A vizsgálatokat 80 különbözı típusú transzplantált (csontvelı, vese, szív) aktív CMV-infekció kimutatására irányultak és a CMV-fertızés gyanúja esetén (tünetek: láz, leukopenia, izületi-izom fájdalom, elesettség, graftmőködés romlása) klinikusok kérésére történtek. A 24 csontvelı-, 50 vese- és 6 szívtranszplantált részére összesen 215 vizsgálatot (mindegyik alkalommal 3 különbözı módszerrel) végeztünk. Azon betegek esetében, akiknél bizonyítani lehetett a CMV-infekciót, a laboratóriumi követés hetente egyszer a betegek gyógyulásáig, illetve egy esetben a beteg haláláig tartott. A SOTE I.sz. Sebészeti Klinika, az Ér- és Szívsebészeti Klinika, az Országos Haematológiai, Vértranszfúziós és Immunológiai Intézet és a Szt. László Kórház transzplantációs osztályain kezelt betegeket vizsgáltuk. A 80 transzplantáltból 7 recipiens volt CMV-szeronegatív a transzplantáció idıpontjában, közülük 2 recipiens donorja volt CMV-szeropozitív, CMV profilaxisban nem részesültek. A CMV-fertızés diagnózis elfogadásának kritériuma a következı volt: klinikai tünetek közül legalább egynek az észlelése plusz az elvégzett laboratóriumi vizsgálatok közül legalább egynek a pozitivitása, egyéb – a tüneteket magyarázó (graftrejekció, bakteriális infekció) – ok kizárása. A diagnózist alátámasztotta az antivirális (ganciclovir) kezelés hatására bekövetkezett gyógyulás. A transzplantált betegek mellett 10 egészséges felnıtt mintáit is vizsgáltuk a betegek laboratóriumi vizsgálataival azonos módon. İk képezték a kontroll csoportot a specificitás és a prediktív értékek kiszámításához. Módszerek: Munkacsoportunk 3 módszert hasonlított össze: a vírus-ellenanyag (IgM, IgG) meghatározást, az antigenemia tesztet és a vírusizolálást.
53
4.2.1 Vírus-ellenanyag kimutatása A CMV ellenes IgM- és IgG-ellenanyagok kimutatása ELISA módszerrel történt (Behring és Gull) az eredeti gyári leírásoknak megfelelıen. Aktív fertızés jeléül a specifikus vírusellenes IgM megjelenését vagy jelenlétét fogadtuk el. Az anti-CMVIgG titeremelkedését – tekintettel a gyakori fiziológiás titeringadozásra - nem tartottuk infekcióra utaló markernek. 4.2.2 CMV antigén (korai mátrixprotein - pp65) direkt kimutatása fehérvérsejtekbıl (antigenemia teszt) (174) Az eljárás 4 fázisból áll: a/. Fehérvérsejt (fvs) szuszpenzió készítése: Alvadásgátlóként EDTA-t tartalmazó friss vérben a polimorfonukleáris (PMN) fvseket dextrán (Serva) és PBS (phosphate-buffered saline) 1:4 hígítású oldat hozzáadásával, 37°C-n történı ülepítéssel különítöttük el. A felülúszót +4°C-os NH4Cl-oldat segítségével megtisztítottuk a vörösvérsejtektıl. PBS-ben történı mosás után következett a b/. Citológiai készítmény elıállítása: A kapott fvs-szuszpenzióból citocentrifugával citológiai készítményt állítottunk elı úgy, hogy egy tárgylemezre sejtszámlálást követıen 50 000 PMN fvs került. A 10 percig 2000 g-vel történı centrifugálás hatására a sejtek kiterültek a lemezen. Szárítás és acetonos fixálás után következett a c/. Festés: Az esetleg jelenlevı CMV-antigént egérben termelt monoklonális ellenanyag készítménnyel (Clonab CMV, Biotest) szobahın 60 percig kezeltük, majd
a
pozitív
sejteket
peroxidázzal
jelzett
anti-egér
immunoglobulin
konjugátummal (Dako P260) szobahın 30 percig tartó inkubálással tettük láthatóvá. A peroxidáz enzim szubsztrátja a 3% hidrogén-peroxidot (Reanal) tartalmazó 3amino-etil-karbazol (Organica) oldat (az inkubálás szobahın 15 percig tartott). A kontrasztfestés Mayer-féle hematoxilinnal, a készítmény fedése glicerinzselatinnal történt. d/. Értékelés: A festett készítményeket fénymikroszkóppal (Axioplan) - 100-szoros nagyítással - vizsgáltuk. A pozitív – CMV antigént tartalmazó – sejtek vörös-barna festıdést mutatnak a magokban vagy perinukleárisan. A pozitív sejtek (virális eredető korai antigén megjelenése a fvs magjaiban) jelenléte a ciyospin készítményben bizonyítja a CMV aktív infekció diagnózisát.
54
Az eredeti leírásban a vizsgálat 6 órát vett igénybe. Munkafolyamat módosítással (elıkészített reagensek alkalmazása) és automatizálással (sejtszámláláshoz jelenleg haematológiai automatát használunk) ezt az idıt 4 órára sikerült lecsökkentenünk. 4.2.3 „Gyorsított” vírusizolálás a beteg mintáiból A CMV izolálási kísérleteket elsısorban a betegek vérmintáiból végeztük (175). a/. A vizsgálati anyagot mikroszkóp-fedılemezen tenyésztett saját gyártású humán embrió fibroblaszt sejtkultúrára centrifugáltuk (a vérmintát 10 percig 200 g-vel), az így beoltott tenyészeteket 3-4 napig 37°C-on inkubáltuk. A humán embrió fibroblaszt sejttenyészet elıállítása a következı módon történt: A 7-12 hetes humán embrióból nyert izomszövetet mechanikus aprítást követıen tripszin (Difco) és EDTA 0,1 %-os oldatban 37°C-on 30 percig folyamatos keverés közben emésztettük. A keletkezett sejtszuszpenziót 200 g-vel 10 percig centrifugáltuk, a felülúszót elöntve a sejtüledéket 10%-os fötális borjúsavó (Sebak) tartalmú
Parker
199
médiumban
(Serva)
felszuszpendáltuk,
és
steril
tenyásztıedényekbe osztottuk (Greiner). b/. A fertızött sejteket a korai CMV-antigén ellenes specifikus monoklonális ellenanyagokkal (Dako CMV DDG9 CCH2 és saját készítéső 5D12 jelzéső [176]) 37°C-on 60 percig inkubáltuk. Ezután következett a FITC-el jelzett anti egérimmunglobulin konjugátummal (Dako F261) történı 30 perces inkubálás. Az értékelés fluoreszcens mikroszkóppal történt. A tenyésztett szövetsejtekben látható fluoreszkáló magzárványok a mintából származó vírus jelenlétére utalnak, és bizonyítják a beteg CMV-fertızését (viraemia). A három módszer értékelése: A módszerek összehasonlító vizsgálat eredményeinek feldolgozása a következı paraméterek
segítségével
történt:
szenzitivitás
(érzékenység),
specificitás
(fajlagosság), pozitív és negatív prediktív értékek (177). Szenzitivitás: azoknak a betegeknek százalékaránya, akiknek a tesztje pozitív, szenzitivitás = valódi pozitív/(valódi pozitív+álnegatív)x100. Specificitás: azoknak a nem betegeknek a százalékaránya, akiknek a tesztje negatív, specificitás = valódi negatív/(valódi negatív+álpozitív)x100.
55
Pozitív prediktív érték: ha az adott teszt pozitív, akkor mennyi annak az esélye, hogy a vizsgált egyén beteg? Pozitív prediktív érték=valódi pozitív/(valódi pozitív+álpozitív)x100. Negatív prediktív érték: ha az adott teszt negatív, akkor mennyi annak az esélye, hogy a vizsgált egyén nem beteg? Negatív prediktív érték=valódi negatív/(valódi negatív+álnegatív)x100. 4.2.4
Vírus-nukleinsav kimutatása (PCR)
A késıbbiekben a Transzplantációs és Sebészeti Klinikán egy CMV antigenemia teszt és CMV PCR összehasonlító, prospektív vizsgálatot is végeztünk, amelyben 15 vesetranszplantált beteget (13 férfi és 2 nı, átlag életkor: 54 év) folyamatosan követtünk az átültetés idıpontjától számítva 6 hónapon keresztül. A betegek kiválasztása random módon történt 2002 októberétıl 2003 februárjáig. Mindkét laboratóriumi vizsgálatot a transzplantáció idıpontjától számítva 6 alkalommal végeztük: a 7., 14., 28., 54., 91. és 183. napon (összesen 90 vizsgálat 2 módszerrel), amennyiben nem volt jele az aktív CMV-fertızésnek. A beteg-compliance szempontjából ezek a behívási idıpontok tőntek kivitelezhetınek. A tünetek megjelenése esetén a kijelölt napokon kívül is történt laboratóriumi vizsgálat. A CMV antigenemia teszt az elızı részben leírt módon, a CMV quantitatív PCR vizsgálat pedig gyári kittel (Cobas Amplicor, Roche) a - gyári leírás szerint - történt. A betegek között csak egy volt CMV-szeronegatív, a donorja is szeronegatív volt, ebbıl a szempontból tehát nem tartozott a rizikó csoportba, nem kapott profilaxist. Ezzel a vizsgálattal az volt a célunk, hogy kimutassuk, a transzplantációt követı korai idıszakban (elsı 6 hónap) az egyébként világszerte sok szerzı által (86, 177, 178) aktív infekció kimutatására alkalmasnak tartott két diagnosztikai módszer közül melyik jelzi elıbb a látens CMV reaktivációját vagy a primer CMV-fertızést. Ezenkívül
összehasonlítottuk
az
eljárások
technikai
kivitelezését
alkalmazhatóságot a saját lehetıségeinknek megfelelıen. A két módszer érzékenysége és specificitása is meghatározásra került.
56
és
az
4.3
A Cytomegalovírus-fertızés kialakulása szeronegatív vesetranszplantált
betegekben különbözı megelızési protokollok alkalmazása esetén, a tanulmány betegei és módszerei Betegek: 1997 januárjától 2004 decemberéig 1137 de novo kadaver vesetranszplantáció történt a budapesti klinikán, 606 nı (53%) és 531 férfi (47%) kapta meg a szervet. A recipiensek átlagéletkora 48 év volt (4-66 évesig). A recipiensek a következı immunszuppresszív kezelést kapták: CsA mikroemulzió + kortikoszteroidok (316 beteg); CsA + MMF + kortikoszteroidok (546 beteg); tacrolimus + MMF + kortikoszteroidok (275 beteg). A
transzplantáció
idıpontjában
1137
recipiensbıl
166
bizonyult
CMV-
szeronegatívnak (15%). 125 szeronegatív recipiens CMV-szeropozitív donoroktól kapta a szervet (R-/D+). Ezen betegek 3 különbözı protokoll szerint kapták a CMVfertızés elleni profilaxist. A IV. csoportba tartozó 22 vesetranszplantált beteg nem kapott profilaxist. İk még 1997 januárja elıtt – a profilaxis bevezetése elıtt – részesültek veseátültetésben (2. táblázat). Profilaxis protokoll és a R-/D+ betegek száma Összesen 147 beteg I. csoport: 53 beteg CMV hyperimmun gammaglobulin (Cytotect-Biotest) II. csoport (kombinált profilaxis): 30 beteg CMV hyperimmun gammaglobulin (Cytotect) + ganciclovir (Cymevene)
A profilaxis összetétele és a dózisok
III. csoport: 42 beteg Ganciclovir (Cymevene)
3 g/nap a 14. naptól, 3 hónapig, per os (a vesefunkciónak és a testsúlynak megfelelıen) -
IV. csoport (kontroll csoport): 22 beteg Profilaxis nélkül
6 dózis a 0., 14., 35., 56., 77. és 98.napon 1 ml/kg iv. Cytotect – 2 dózis a 0. és 14. napon 1 ml/kg iv. Cymevene 1,5 g/nap a 14. naptól, 3 hónapig, per os
Immunszuppresszív regimen CsA és kortikoszteroid CsA, MMF és kortikoszteroid
Tacrolimus, MMF és kortikoszteroid CsA és kortikoszteroid
2. táblázat: A 4 betegcsoportban alkalmazott profilaxis protokollok és immunszuppresszív kezelés Módszerek:
57
CMV-szerostátusz meghatározásának és a CMV- fertızés kimutatásának módszerei: A recipiensek és a donorok CMV szerostátuszának meghatározása ELISA módszerrel (IgG - DiaSorin) történt. A CMV antigenemia teszt kivitelezése az elızı fejezetben ismertetett módon immuncitologiai módszerrel történt. A betegeket 4 hónapon
keresztül
minden
kontroll
alkalmával
vizsgáltuk
CMV-fertızés
diagnosztizálása céljából (CMV antigenemia- és szerológiai teszt). Ezt követıen a vizsgálatokat havonta végeztük a poszttranszplant 12 hónapig. Az antigenemia teszttel kimutatott pozitív sejtek megjelenése ganciklovirral történı kezelést vont maga után mindegyik csoportban. A kezelést a tünetek megszőnéséig és az antigenemia teszt negatívvá válásig folytattuk. A kezelés alatt és a szerokonverzió bekövetkezése után a profilaxist leállítottuk, mivel a betegek kikerültek a magas rizikójú csoportból. A CMV-fertızés tünetei Ljungman szerint kerültek csoportosításra (ld. 38. oldal- [127]). Vizsgálatunkban a CMV-fertızés elıfordulását két idıszak szerint elemeztük: a profilaxis alkalmazása alatt - korai poszttranszplantációs idıszak (elsı 4 hónap) és a poszttranszplant 4. hónaptól 12. hónapig terjedıen. Az akut rejekció diagnózisa és kezelése: A követési idı alatt azon betegeknél végeztek vesebiopsziát, akinél felmerült a rejekció klinikai gyanúja (több mint 25 %-os kreatinin szérumszint emelkedés). A hisztológiai eredmények Banff (1997)-szerint kerültek besorolásra (179). A szervkilökıdés kezelése magas dózisú szteroiddal történt, szteroid rezisztens rejekció esetén monoklonális ellenanyaggal folytatódott.
4.4
A primer Cytomegalovírus-fertızés kialakulása szeronegatív recipiensek
körében, a fertızés kimutatásának- és a HLA-típus meghatározásának módszerei Betegek: 1999 januárjától 2006 decemberéig 1213 primer kadaver vesetranszplantáción átesett beteg adatait vizsgáltuk. 1213-ból 163 (13%) recipiens CMV-szeronegatív volt a mőtét idıpontjában, közülük 129-en CMV-szeropozitív donortól kapták a szervet. Ezen 129 magas rizikócsoportba tartozó beteg adatait tanulmányoztuk a vizsgálatunk során.
58
Immunszuppresszív terápia: A betegek immunszuppressziója calcineurin inhibitor (cyclosporin – 756 beteg vagy tacrolimus – 457 beteg), MMF és kortokoszteroid alkalmazásából állt. Az akut vagy hiperakut kilökıdés szempontból magas rizikó csoportba tartozó betegek (panel reactive antibody szint >85%) 10 napig thymoglobulinnal történı indukciós terápiában részesültek. CMV-fertızés profilaxis: Összesen 129 beteg részesült profilaxisban: 2003-ig per os alkalmazott ganciclovirt kaptak (Cymevene, Roche) (elıírásszerően
3g/nap 3 hónapig),
2004-tıl
valganciclovirt (Valcyte, Roche) (450mg vagy 900mg/nap 100 napig) – a dózis a vesefunkciónak és a súlynak megfelelıen került megállapításra - a gyártó ajánlása szerint. CMV monitorozás módszerei: A recipiensek és a donorok CMV szerostátuszának meghatározása ELISA módszerrel (IgG) történt (DiaSorin). A szerokonverziót transzplantált betegekben anti-CMV IgG, illetve anti-CMV IgM megjelenésével ELISA módszerrel (DiaSorin) bizonyítottuk. A CMV antigenemia teszt kivitelezése 4.2.2 pontnak megfelelıen immuncitologiai módszerrel történt. A betegeket 12 hónapon keresztül rendszeresen – minden kontroll alkalmával - vizsgáltuk CMV-fertızés szempontból. CMV-infekció esetén az antigenemia vizsgálatot addig végeztünk, amig az eredmény negatívvá nem vált, a szerológiai vizsgálatot a szerokonverzió bekövetkezéséig hetente egyszer végeztük. Az antigenemia teszttel kimutatott pozitív sejtek megjelenése ganciklovirral történı kezelést vont maga után. A kezelést az antigenemia teszt negatívvá válásig folytattuk. A CMV-fertızés tünetei Ljungman szerint kerültek csoportosításra (ld. 38. oldal). A CMV-fertızés súlyossága a tünetek megléte vagy hiánya, és, amennyiben a tünetek megjelentek, a súlyosság mértéke a Ljungman-féle klasszifikáció szerint történt. A CMV betegséget (szervi érintettséggel) tartottuk a legsúlyosabb megjelenési formának. HLA tipizálás: Ahhoz, hogy megállapítsuk, van-e összefüggés a CMV-fertızés kialakulása és az egyes HLA-típusok között, kikerestük a betegek listára helyezéskor meghatározott
59
HLA-típusait. A recipiensek és a donorok HLA-típusának meghatározása az Európai Immungenetikai Federáció és az Eurotranszplant útmutatóinak megfelelıen rutinszerően történik abból a célból, hogy minél jobb HLA egyezıséget érjenek el a transzplantáció során, ezzel is csökkentsék a rejekció kialakulásának veszélyét. A kadaver donorok HLA-tipizálása közvetlenül az átültetés elıtt valósul meg. A vizsgálatunkban a leggyakrabban elıforduló HLA-típusokat ellenıriztük ahhoz, hogy statisztikailag releváns esetszámot lehessen vizsgálni. Ezek a következı típusok voltak: HLA-A2, HLA-B12, HLA-Cw7, HLA-DR6 és HLA-DQ3. Mivel ismert a HLA-DQ3 és a HLA-DR11 közötti linkage disequilibrium, ezt a két HLAtípust együtt is vizsgáltuk. A HLA-A, -B és –C tipizálás a standardizált mikro-limfocitotoxicitás módszerrel (NIH) történt (180). 2006 elıtt a HLA-DR és –DQ antigének meghatározása hosszú inkubációs idejő citotoxicitás teszttel perifériás vérbıl szeparált B-dúsított limfocita szuszpenzión történt (181), a DNS-alapú tipizálást csak kétes esetekben végeztek. Jelenleg a HLA-DR és -DQ antigének meghatározásához DNS-alapú PCR-SSP módszert alkalmaznak (182). Az akut rejekció diagnózisa és kezelése: A 4.3 fejezetben leírtakkal megegyezı módon történt.
STATISZTIKAI MÓDSZEREK A kategorikus adatok feldolgozása χ2 (2 by 2 és 2 by k) analízissel, Fisher’s exact és Kruskal-Wallis non-parametrikus tesztekkel történt. A 0.05 alatti P értékeket fogadtuk
el
szignifikánsnak.
A
kvantitatív
non-parametrikus
változók
összehasonlításához a Mann-Whitney U-tesztet használtuk. A HLA-típus és a CMV-fertızés iránti fogékonyság közti összefüggés vizsgálata során a kumulatív incidencia Kaplan-Meier módszer segítségével került meghatározásra.
A
CMV
primer
fertızés
independens
prediktorainak
meghatározásához a Cox proporcionális kockázat modellt alkalmaztuk, a következı változókkal: indukciós terápia, HLA-missmatchek száma, graft kilökıdés és kezelése, HLA-típus és életkor. A betegek homogén csoportot alkottak a többi befolyásoló tényezıket illetıen (CMV-szerostátusz, immunszuppresszió összetétele, CMV profilaxis), ezeket a tényezıket nem vettük figyelembe a statisztikai analízis során. Univariáns és multivariáns Cox regressziós analízist végeztünk. A P-értékek
60
kétoldalasan kerültek kiszámításra, a szignifikancia szintet Bonferroni korrekció alkalmazásával állapítottuk meg, abból a célból, hogy az általunk sorozatban elvégzett statisztikai próbák mellett felhalmozódó hiba-kockázatot leszorítsuk. Mivel 6 próbát végeztünk, a 0.0083-nél (0.05/6=0.0083) kisebb értékeket fogadtuk el statisztikailag szignifikánsnak. A számításokat StatsDirect program (I. Buchan, Cambridge, UK) és a SPSS program segítségével végeztük el.
5. EREDMÉNYEK 5.1 A CMV-átfertızöttség meghatározása során kapott eredmények 5.1.1
Meghatározásra került a magyar populációt reprezentáló személyek
nem- és kor szerinti CMV-átfertızöttsége A vizsgált 2070 szervdonorból 1761 (85%) bizonyult CMV-szeropozitívnak (antiCMV IgG+) és 309 (15%) szeronegatívnak (anti-CMV IgG-). A vizsgált 1278 férfibıl 1060-an estek át CMV-fertızésen (83%). A nıknél ez az arány 89%-nak felelt meg: 792 nıbıl 701 volt szeropozitív (3. táblázat). A nemek között az átfertızöttség mértékében szignifikáns különbséget találtunk P=0.0006 (P<0.05), a nık körében az átfertızöttség magasabb volt.
3. táblázat: CMV-szeropozitívak aránya nemek szerint Nem
Férfi
Nı
Össz
1060 (83%)
701 (89%)
1761 (85%)
CMVszeronegatívak
218 (17%)
91 (11%)
309 (15%)
Összesen
1278
792
2070
Kockázati arány (95%CI) P érték
0,63 (reciprocal 1,58) (0,48-0,83) P=0.0006
CMV szerostátus CMVszeropozitívak
A CMV fiatal felnıttkori terjedésének megfelelıen a különbség valószínőleg a nemi élet megkezdésével kapcsolatos. Ezt a feltételezést úgy ellenıriztük, hogy 86 olyan gyermek (2-tıl 15 évesig) CMV-átfertızöttségét vizsgáltuk, amelyek mintáit szőrés
61
céljából vagy infekcióra utaló tünetek miatt küldték laboratóriumunkba. Az aktív CMV-fertızés kizárása után a gyermekek CMV-szerostátuszát a nemi megoszlással együtt elemeztük. 52 fiúból 34-en és 34 leányból 16-an voltak szeropozitívak. Az átlagos átfertızöttség: 58 % volt. A nemek közti különbség nem bizonyult szignifikánsnak (P=0.12), tehát az elıbbiekben megfogalmazott feltételezés megállja a helyét. A CMV-átfertızöttségre vonatkozó korcsoport szerinti megoszlás eredményei a 4. táblázatban láthatók. 4. táblázat: CMV-szeropozitivitás kormegoszlás szerint Össz
Korcsoportok
CMVszeropozitívak
2-20 évesek 266 (72%)
CMVszeronegatívak Összesen (100%)
CMVszerostátus
21-50 évesek 51-70 évesek 71-92 évesek 900 (86%)
595 (90%)
198 (99%)
1959 (86%)
102 (28%)
141 (14%)
66 (10%)
2 (1%)
311 (14%)
368
1041
661
200
2270
Összeségében a donorok és a legidısebb korcsoport eredményeit elemezve átlagosan 86%-os CMV-átfertızöttséget találtunk. 5.1.2. A CMV-átfertızöttség és a vércsoportok közötti összefüggés vizsgálata A donorok adatainak feldolgozása során azt vizsgáltuk, hogy van-e különbség a különbözı vércsoportú szemályek CMV-szeroprevalenciájában, vagyis a
vércsoport
befolyásolja-e
a
CMV-fertızés
iránti
fogékonyságot
nem
immunszupprimált betegek körében. 1124 szervdonor CMV-szerostátuszra és vércsoportra vonatkozó adatait dolgoztuk fel (5. táblázat). A betegek között 478-an bizonyultak „A” vercsopotúaknak, közülük 85% volt CMV-szeropozitív; 209-en „B” vércsoportúaknak, közülük 89% volt
CMV-
szeropozitív; 80-an „AB” vércsoportúaknak, közülük 85% volt CMV-szeropozitív és 357-en „0” vércsoportúaknak, közülük 83% volt CMV-szeropozitív. Egyik vércsoportban sem találunk szignifikáns különbséget a CMV-szeroprevalenciát illetıen (összesített P=0.39).
62
5. táblázat: CMV-szeroprevalencia különbözı vércsoportú donoroknál
Vércsoport
CMV-szerostátus CMVszeropozitív CMVszeronegatív Össz
5.2
A eset/ százalékos arány
B eset/ százalékos arány
AB eset/ százalékos arány
Össz 0 eset/ százalékos arány
404(85%)
185(89%)
68(85%)
297(83%)
954 (85%)
74(15%)
24(11%)
12(15%)
60(17%)
170 (15%)
478(43%)
209(19%)
80(7%)
357(32%)
1124
A CMV-fertızés diagnosztikájában használt laboratóriumi módszerek
összehasonlításának eredményei 5.2.1
A CMV antigenemia teszt, a „gyorsított” vírusizolálás és az anti-CMV
specifikus IgM vizsgálat összehasonlítása – érzékenység, specificitás, prediktív értékek Az OEK (korábban OKI) Virológiai osztályán 80 transzplantált beteg CMVfertızés meghatározására irányuló vizsgálatatát végeztük. 17-nél diagnosztizáltunk aktív infekciót (6. táblázat), tehát a betegek több, mint ötödénél (21%) bizonyítható volt a fertızés. A diagnózis felállítását követıen a megkezdett antivirális terápia eredményeképpen 16 beteg állapota javult. Egy beteg esetében a késıi diagnózis és terápia miatt a kialakult súlyos pneumonia halálhoz vezetett. Feltünı a szívátültetés utáni fertızések elıfordulásának nagyobb aránya annak ellenére, hogy a szívtranszplantáltak között nem volt CMV-szeronegatív recipiens. 6. táblázat: A vizsgált betegek, a CMV-fertızések száma és aránya transzplantált szerv szerint
Betegek száma CMV-fertızések száma Pozitívak aránya (%)
Transzplantált szerv csontvelı vese 24 50
szív 6
80
6
7
4
17
25 %
14 %
67 %
21 %
63
Össz.
A CMV-fertızésben szenvedı betegek laboratóriumi vizsgálatainak eredményeit a 7. táblázatban foglaltuk össze.
7. sz. táblázat: A CMV antigenemia teszt, a „gyorsított” vírusizolálás és a szerológiai tesztek eredményei (a R-/D+ konstelláció külön kiemelve, a többiek R+/D+ csoportba tartoztak) Transzplantáció típusa és a beteg száma
Csontvelı Tx 1. R-/D+ 2. 3. 4. 5. 6. Vese Tx 1. 2. 3. 4. 5. 6. R-/D+ 7. Szív Tx 1. 2. 3. 4. Nem volt jele a fertızésnek
CMV antigenemia
VírusSzerológiai kimutatás izolálás a-CMV IgG a-CMV vérbıl megjelenése IgM (viraemia) v. titeremelk. pozitivitás A pozitivitás poszttranszplantációs elsı és utólsó napja (idıtartam-nap) 29.-43. (14) 32.-40.(7) Negatív Negatív 63.-88. (25) 51.-62. (11) 42. (egyszer) 35.-48. (13) 44.-55. (11) 55.-72. (17) 56.-65. (9) 28.-31. (3) 30. (egyszer) 43. (egyszer) 29.-62.(33)
67.(egyszer) 55.-62. (7) Negatív 39.-47 (8) Negatív 66.-73. (7) 60.(egyszer) Negatív Negatív Negatív 33.-40.(6)
Nincs titer↑ Nincs titer↑ Nem vizsg. Nem vizsg. 68. 65. 65. 38. Nincs titer↑ 48. 49.
Negatív Negatív Nem vizsg. Nem vizsg. Negatív 65. 60. 38. Negatív 43. 45.
Negatív 32.-42.+(>11) 60.-180.(120) 38.-54. (16) 38.-55. (17) 1/17
48. (egyszer) 36.-39.(3) 161.-164.(3) 42.-48.(6) Negatív 6/17
Nincs titer↑ Nincs titer↑ 62. 48. Nincs titer↑ 7/15
58. Negatív 119. 54. 60. 6/15
Az antigenemia teszt 17 fertızött betegbıl 16 esetében (94%-ban) pozitívnak-, 1 esetben pedig negatívnak bizonyult. Az infekció elıfordulását legkorábban az antigenemia teszt jelezte. A vizsgálatra legtöbb betegnél a tünetek megjelenése után 1 nappal került sor (kivéve a pneumoniával járó esetet). Ilyenkor az antigenemia teszt már pozitív volt, tehát az antigén-pozitív sejtek megjelenése a klinikai tünetekkel közel egyidejőleg, vagy még elıbb következett be. A pozitív sejtek maximális száma a legsúlyosabb klinikai manifesztáció idıszakára esett. A klinikai javulás alatt a pozitív sejtek száma viszont csökkent.
64
„Gyorsított” vírusizolálással szintén hamar kimutatható volt a fertızés (az antigenemia teszt pozitívvá válása után minimálisan 3 nappal), de a viraemia – az antigenemiától eltérıen – legfeljebb csak egy hétig volt kórjelzı. A 17 fertızött beteg közül 6-nál (35%) nem sikerült vírusizolálással bizonyítani az infekciót. A szerológiai vizsgálatokkal csak késve és nem minden alkalommal tudtuk igazolni a biztosan pozitív eseteket: 15-bıl 6 esetben (40%) a követési idıszakban nem volt szerológiai jele (IgM pozitivitás) a fertızésnek. Az egészséges - tünet- és panaszmentes - egyének mintáinak vizsgálatánál antigenemia teszttel egynél sem találtunk poztitivitást. Vírusizolálással 2 esetben (20%) láttunk – aszpecifikusnak mondható – fluoreszcenciát, amely értékelési nehézséget jelentett. Szerológiai tesztekkel 10-bıl 1 személynél találtunk IgM pozitivitást és 1-nél kétes eredményt. A CMV antigenemia teszt érzékenysége, specificitása és prediktív értékei (>75 %) megfelelnek a gyors és megbízható vizsgálatokkal szemben megfogalmazott igényeknek (8. táblázat). A vírusizolálás és a szerológiai vizsgálat (IgM) 75% alatti értékei nem fogadhatók el. 8. táblázat: Az aktív CMV–fertızés kimutatási módszereinek érzékenysége, specificitása, pozitív és negatív prediktív értékek Módszer
Antigenemia
Vírusizolálás
a-CMV IgM
Érzékenység
94%
65%
60%
Specificitás
100%
80%
80%
Pozitív prediktív érték
100%
85%
82%
Negatív prediktív érték
91%
57%
57%
5.2.2. A CMV antigenemia teszt és a PCR összehasonlító vizsgálat eredményei A vizsgált idıszakban 15 betegbıl 4-nél észleltünk CMV antigenemia teszt pozitivitást, közülük háromnál a PCR vizsgálat is pozitívnak bizonyult, egynél pedig negatív maradt (9. táblázat). 3 beteg tünetmentes volt, és a pozitív sejtek száma esetükben 5/100 000 fvs alatt volt. Közülük kettınél észleltünk alacsony titerő PCR pozitivitást (<500 DNS kópia/ml). Ezeket a laboratóriumi eredményeket nem tartottuk szignifikánsnak. Egyetlen betegnél - az aktív CMV-fertızés jellegzetes tünetei mellett (láz, elesettség) - a poszttranszplantációs 59. napon az antigenemia teszttel pozitív
65
eredményt kaptunk (a CMV-antigén pozitív sejtek száma 268/100 000 fvs). Az antivirális kezelés után – a tünetmentesség elérése mellett - a betegség 21. napján a teszt negatívvá vált. Ennél a betegnél a PCR teszt az antigenemia vizsgálattal egy idıben vált pozitívvá (6,24x104 DNS kópia/ml), és a pozitivitás – csökkenı tendencia mellett - 32 napig tartott. A betegség (és a laboratóriumi eredmények diagnosztikai értékő pozitivitása) két tervezett vizsgálati nap (54.- és 91. nap) között alakult ki. 9. táblázat: A pozitív laboratóriumi eredmények adatai, a módszerek érzékenysége és specificitása PCR (DNS kópiaszám/ml)
Jellegzetes tünet
A tesztek értékelése
Betegek 1. beteg
CMV antigenemia Poz.sejt szám/100E (a vizsgálat poszttranszplant.napja) 4poz.sejt (91.nap)
1,2x102
Nincs
2. beteg
1poz.sejt (28.nap)
4,22x102
Nincs
3. beteg
1poz.sejt (91. nap)
negatív
Nincs
4. beteg
pozitív 6,24x104 3,42x 104 1,12x103 negatív 100%
Van Van Nincs Nincs Nincs
Érzékenység
268 (59. nap) 96 (63.nap) 18 (77. nap) negatív (80. nap) negatív (91. nap) 100%
Nem szignifikáns Nem szignifikáns Nem szignifikáns Szignifikáns
Specificitás
79%
86%
Labor.teszt
Mind a két módszer érzékenysége és specificitása megfelelı és az értékek közel azonosak. Azt, hogy melyiket válasszuk a betegeink vizsgálatára, a módszerek alkalmazhatósága és a helyi lehetıségek határozzák meg. Több szempontból elınyösebbnek találtuk az antigenemia teszt alkalmazását: - az általunk alklamazott antigenemia teszt és a gyári készítéső PCR módszer költségeit összehasonlítva, azt tapasztaltuk, hogy a PCR reagensek ára tízszerese az antigenemia teszt reagenseihez képest, és ebbe nem számoltuk az igen költséges PCR automata árát - a PCR vizsgálat határértéket nem tudtuk egyértelmően megállapítani (mi az a DNS kópiaszám, amely aktív fertızésre utalhat, és kezelést von maga után), annál is inkább mivel az irodalomban sem egyértelmőek az erre vonatkozó ajánlások
66
- az antigenemia teszt kivitelezése labortechnikailag egyszerőbbnek bizonyult Megemlíteném, hogy az antigenemia teszt eredménye a vizsgáló szakember szubjektív értékelésén alapszik, és a leolvasás tapasztalat megszerzését igényel. 5.3
A vesetranszplantációt követı CMV-fertızés megelızési protokollok
alkalmazása során kapott eredmények A CMV profilaxisban részesült 125 magas rizikójú (R-/D+) recipiens közül 63 betegnél (50%) alakult ki CMV-infekció az elsı poszttranszplant 12 hónapban. 22 recipiensbıl, akik nem részesültek CMV-fertızés megelızésben (kontroll csoport), mindegyiknél (100%) kialakult az infekció a korai poszttranszplantációs idıszakban. CMV-infekció a profilaxis alkalmazása alatt – az elsı 4 poszttranszplantációs hónapban (10. táblázat)
10. táblázat: CMV-infekciók a profilaxis alkalmazása alatt (4 hónap) és a profilaktikus kezelés befejezése után a poszttranszplant 12 hónapig terjedı idıszakban - az alkalmazott profilaxis csoportoknak megfelelıen I. csoport
II. csoport
III. csoport
IV.csoport
(53 beteg)
(30 beteg)
(42 beteg)
(22 beteg)
12 (22.5%)
21 (70%)
29 (69%)
0
Betegek CMV-
31 (59%)
7 (23%)
9 (21%)
22 (100%)
fertızéssel a profilaxis
(22 szimptómás)
(4 szimptómás)
(3 szimptómás)
(15 szimpt.)
Betegek CMV-
10 (19%)
2 (7%)
4 (9%)
0
fertızéssel profilaxis
(10 szimptómás)
(2 szimptómás)
(2 szimptómás)
9 (30%) – 6 szimptómás fertızés
13 (31%) – 5 szimptómás fertızés
Betegek CMV-fertızés nélkül (12 hónapig)
ideje alatt (4 hó)
befejezése után Betegek CMV41 (77.5%) – fertızéssel összesen a 12 32 szimptómás hónap alatt fertızés I. csoport:
22 (100%) 15 szimpt. fertızés
53 recipiens hyperimmun gammaglobulint (Cytotect, Biotest Pharma Gmbh) kapott CMV profilaxis céljából. 31 betegnél (59%) alakult ki CMV-infekció az elsı 4 hónapban, közülük 9-nél az infekció tünetmentesen és 22-nél tünetekkel zajlott (a fertızés átlagosan a 7,7. héten alakult ki, range: 6-10).
67
II. csoport: 30 recipiens kombinált profilaxisban részesült: hyperimmun gammaglobulin + ganciclovir. 30-ból 7- betegnél (23%) alakult ki a CMV-infekció az elsı 4 hónapban, amely átlagosan a 8,7. héten alakult ki (range: 8-10), 3 esetben a fertızés tünetmentesen zajlott, 4 esetben tünetekkel járt. III.csoport: 42 recipiens csak p.o. ganciclovirt kapott profilaxisként. 9 (21%) betegnél átlagosan a 8,6. héten (range:7-10) alakult ki a CMV-fertızés, amely 6 esetben tünetmentesen zajlott és 3 betegnél tünetekkel járt. IV. (kontroll) csoport A kontroll csoportban (profilaxis nélkül) mind a 22 recipiensnél kialakult a fertızés (100%) a korai poszttranszplantációs idıszakban - átlagosan a 6,6. héten (range: 5-7), 4 betegnél CMV szindróma, 10-nél szervi érintettség és egy beteg CMV pneumonia következtében exitált. 7 beteg esetében az infekció tünetmentesen zajlott. Mindegyik beteg szerokonvertált. A korai poszttranszplantációs idıszakban a CMV-fertızéssel kapcsolatban szignifikáns különbséget találtunk a profilaktikusan kezelt betegek (I.-III. csoport) és a nem kezelt betegek csoportja között (összesített P<0.0001, individuális P<0.0001). A profilaxisban részesült betegek csoportjaiban a CMVinfekció átlagosan 2 héttel késıbb alakult ki, mint a kontroll csoportban (8.3 hét versus 6.6 hét). A profilaktikus csoportok között az I. csoportban szignifikánsan több fertızés fordult elı a korai szakban (P=0.0027 és P=0.00035), és a fertızés átlagosan 1 héttel elıbb alakult ki, mint a II. és III. csoportban. Összehasonlítva a II. és III. csoportokat nem találtunk szignifikáns különbséget. CMV-infekció a profilaxis befejezése után (5.-12. hónapig) (10. táblázat) Az
I.
csoportban
31
betegnél
alakult
ki
primer
fertızés
a
korai
poszttranszplantációs idıszakban (4 hónap) még a profilaxis alatt. Közülük 8 beteg szeronegatív maradt, 2 betegnél a késıbbiekben enyhe tünetekkel járó reaktiváció alakult ki, náluk bekövetkezett a szerokonverzió. Az I. csoport 53 páciense közül 10 betegnél (19%) a fertızés a profilaxis befejezése után alakult ki (4-10 hónapos idıszakban), az infekció enyhe tünetekkel járt. 53-ból 12 betegnél (22,5%) nem alakult ki infekció az elsı 12 hónapban.
68
A II. csoportban 7 betegnél alakult ki primer infekció a korai szakban, közülük 2 szeronegatív maradt. 30-ból 2 betegnél (7%) a primer infekció a 10. hónapban alakult ki. Mindkét esetben a fertızés enyhe tünetekkel járt. 30-ból 21-en (70%) CMV-mentesek maradtak a vizsgálati idıszak végéig. A III. csoportban 9 betegbıl a korai idıszakban kialakult fertızés után egynél nem alakult ki szerológiai válasz, nála késıbbiekben nem észleltünk reaktivációt. 42-bıl 4 betegnél (10%) a primer fertızés a profilaxis befejezése után - az 5. hónaptól a 10. hónapig terjedı idıszakban – alakult ki, amely 2 esetben tünetmentesen- és másik 2 esetben enyhe tünetekkel zajlott. 29 páciens (69%) esetében az egész vizsgálati idıszakban nem alakult ki diagnosztizálható infekció. A 12 hónapos követési idıszakában - a vizsgált csoportokban - a CMV-fertızésre vonatkozó
adatok
(elıfordulás,
tünetes
és
tünetmentes
esetek
aránya)
szignifikancia értékekkel együttesen a 14. ábrán láthatók. 100
100 90
%
80
P=0.006 77,5 68
70 60
60 50
P=0.54
40
31
30
30
20
20
12
10 0
I.Cytotect
II.kom binált
III.ganciclovir
IV.profilaxis nélkül
P=0.006 CMV-fertızés elıfordulása (%) Tünetes esetek százalékos aránya a csoporton belüli összes beteghez képest 14.ábra: CMV-fertızés elıfordulása, súlyossága (százalékos arány) a különbözı vizsgált csoportokban I.-IV. (1 éves követés)
69
12 hónap alatt 125 profilaxisban részesülı betegbıl 63-nál (50%) alakult ki primer CMV-infekció, közülük 9-nél nem következett be szerokonverzió (14%). Az infekciók negyede (63 ból 16 eset: 25,4%) a profilaxis abbahagyása után a poszttranszplantációs 5-10. hónapban alakult ki (late-onset infekció). Szervkilökıdés és CMV-fertızés Az elsı 12 hónapban a 147 (R-/D+) beteg közül 85-nél (58%) alakult ki primer CMV-infekció. A 147 betegbıl 43-nál észleltünk rejekciót. 25 betegnél biopsziával igazolt rejekció és CMV-fertızése is volt. 85 fertızésbıl 20 esetben (24%) az infekció a szervkilökıdést követıen – átlagosan 45 nap múlva (22-122 nap) - alakult ki. 43 rejekciós epizódból csak 5 (12%) fordult elı a CMVinfekciót követıen. A fertızés és a kilökıdés közti idıtartam 50 nap (40-70 nap) volt. 5.4
A HLA-típus és a CMV-fertızés iránti fogékonyság összefüggésének
vizsgálata során kapott eredmények CMV-fertızés és demográfiai adatok Az 1213 vesetranszplantált beteg közül 630 nı (52%) és 583 (48%) férfi adatait dolgoztuk fel. A transzplantáció idıpontjában az átlag életkor 47,3 év volt (range: 3-72 év). 163 CMV-szeronegatív recipienbıl a nemi megoszlás a következı volt: 54 (33%) nı és 109 (67%) férfi; az átlag életkor 37,6 év. 129 szeronegatív beteg közül, akik a szervet szeropozitív donortól kapták (R-/D+) 41 (31%) nı és 88 (69%) férfi; az átlag életkor 39,6 év (range: 4-72 év). A szeronegatív donorokkal rendelkezı 34 szeronegatív recipiens átlag életkora alacsonyabb: 33,5 év (range:3-57). Annak ellenére, hogy a nemi megoszlás az összes 1213 vesetranszplantált beteg között egyenletes: 630 (52%) nı - 583 (48%) férfi, ez a különbség a CMVszeronegatív recipiensek között erısen szignifikáns: 54 (33%) nı – 109 (67%) férfi (P<0.001). Azt vártuk, hogy a szeronegatív betegek között több nı lesz, mivel a nık átlag életkora (35,6 év) alacsonyabb a férfiak átlag életkoránál (41,5) ebben a csoportban, és jól ismert tény, hogy a CMV szeroprevalenciája a korral nı. Az elızıekben a nıi donorok között kimutatott magasabb CMV-
70
átfertızöttséggel összhangban van az a tény, hogy vizsgálatunkban a szeronegatív recipiensek között szignifikánsan kevesebb volt a nı. A CMV-szeronegatív recipiensek átlag életkora alacsonyabb volt, mint az összes 1213 vizsgált recipiensé (37,6 versus 47,3 év); a különbség erısen szignifikáns: P<0.0001. A CMV-fertızés elıfordulása 129 CMV-szeronegatív recipiensbıl, akik a szervet szeropozitív donoroktól kapták, 49-nél (38%) alakult ki aktív primer CMV-infekció a poszttranszplant 12 hónapban (átlagosan a 101,6. napon). 34 szeronegatív recipiens közül, akik a szervet szeronegatív donortól kapták, egynél alakult ki enyhe tünetekkel járó fertızés a 124. napon. Ahhoz, hogy megállapítsuk, van-e összefüggés egyes HLA-típusok és a CMVfertızés iránti fogékonyság között, a fertızés kialakulását a HLA-A2, HLA-B12, HLA-Cw7 és HLA-DR6, HLA-DR11, HLA-DQ3-típusokkal összefüggésben analizáltuk (11. táblázat).
11. táblázat: A CMV-fertızés és az. I. és II. osztályú HLA-típusok; az univariáns és multivariáns Cox-féle proporcionális kockázati analízis eredményei HLA-típusok
Aktív CMV-infekció/ egyes HLA-típusok hordozói, ill. nem hordozói (%=betegek aránya, akiknél kialakult a CMVinfekció)
I. osztály HLA-A2+ HLA-A2-
27/63 22/66
(43 %) (33%)
HLA-B12+ HLA-B12-
14/43 35/86
(33 %) (41 %)
HLA-Cw7+ HLA-Cw7-
21/60 (35 %) 28/69 (41 %)
II. osztály HLA-DR6+ HLA-DR6-
18/41 31/88
(44 %) (35 %)
71
Kockázati arány
Kockázati arány
(95%CI)
(95%CI)
P érték Univariáns
P érték Multivariáns
1.39 (0.79-2.43) P=0.26 1.32 (0.72–0.43) P=0.37 0.93 (0.51–0.72) P=0.83
1.53 (0.86-2.72) P=0.15 1.40 (0.75-2.61) P=0.29 0.99 (0.53-1.83) P=0.97
1.69 (0.96–0.99) P=0.07
1.61 (0.896-2.880) P=0.11
HLA-DR11+ HLA-DR11-
13/29 (45%) 36/100 (36%)
HLA-DQ3+ HLA-DQ3-
32/68 (47 %) 17/61 (28 %)
1.34 (0.71-2.52) P=0.37 3.40 (1.59-7.31) P=0.002
1.33 (0.70-2.59) P=0.38 3.61 (1.66-7.85) P=0.001
A HLA-A2, HLA-DR6, HLA-DR11 típussal rendelkezı betegek körében magasabb, míg a HLA-B12 és HLA-Cw7 típussal rendelkezık között alacsonyabb arányban fordult elı a CMV-infekció, de a különbségek nem voltak szignifikánsak. Azonban univariáns analízisben szignifikáns különbséget találtunk HLA-DQ3 hordozók és nem hordozók között: 68 DQ3 pozitív beteg közül 32-nél, míg a 61 DQ3 negatív beteg közül 17-nél alakult ki primer CMV-fertızés. A fertızés szignifikánsan többször alakult ki a HLA-DQ3-t hordozó betegeknél (P=0.002). Ahhoz, hogy megállapítsuk, hogy ezeket az eredményeket befolyásolták-e egyéb rizikófaktorok,
multivariáns
Cox
regressziós
analízist
végeztünk,
amely
bebizonyította, hogy a HLA-DQ3 pozitivitás independens prediktora a CMVfertızésnek R-/D+ betegek között (12. táblázat)
12.sz. táblázat: Multivariáns Cox regressziós analízis eredményei
HLA-DQ3
Hazard Ratio
95%CI - Exp(B)
Signifikancia
3.61
1.66-7.85
0.001
0,65-10,48
0,30
0.28-1.20
0.14
0,38 Magas HLAmissmatch-ek száma 0.58 Rejekció Indukciós kezelés
1.28
0.54-3.02
0.58
Életkor
1.00
0.99-1.02
0.69
A Kaplan-Meier módszerrel elıállított kumulatív elıfordulási görbék jól mutatják, hogy a HLA-DQ3 pozitív betegek (lila vonal) között magasabb a fertızés elıfordulása, mint a DQ3 negatív betegek (zöld vonal) között (15. ábra).
72
DQ3+
DQ3-
15. ábra: A HLA-DQ3+ (lila vonal) és HLA-DQ3- (zöld vonal) betegek CMVfertızés kumulatív elıfordulása A HLA-DR11 típust a HLA-DQ3 típussal összefüggésben vizsgáltuk, mivel a két típus között ismert az erıs linkage disequilibrium (együttes elıfordulás). 129 recipiensbıl 29-en DR11-pozitívak és közülük 25-en DQ3-al is rendelkeznek. A 29 DR11 hordozóból 13 betegnél, a 25 DR11+DQ3+ recipiensbıl pedig 11-nél alakult ki a CMV-fertızés. A DR11+ és a DR11- betegek közti különbség ugyanúgy, mint a DR11+DQ3+ és a DR11-DQ3+ betegek közti különbség nem bizonyult szignifikánsnak (P=0.37, P=0.50). Nem találtunk összefüggést a DR11 antigén és a CMV-fertızés iránti fogékonyság között. A HLA-DQ3 hordozók CMV-fertızése elıbb fordult elı, mint a nem-hordozók között: 78,7 poszttranszplant nap versus 96,9 nap (összesített P=0.46). Az infekció korábban alakult ki a HLA-A2, HLA-B12, HLA-DR6 és HLA-DR11 hordozók között (78.-79. nap, 84.-86. nap, 88.-102. nap, 80.-96. nap), és késıbb a HLA-Cw7 hordozók között (89.-83. nap), mint a nem-hordozók között. A CMV-fertızés súlyossága A 68 HLA-DQ3 pozitív páciens között 32-nél alakult ki primer infekció (47%): 24 szimptomatikus (75%) és 8 tünetmentes fertızés (25%). A 61 HLA-DQ3- beteg közül 17-nél (28%) diagnosztizáltuk a fertızést: 9 tünetes (53%) és 8-nál
73
tünetmentes infekció (47%). A HLA-DQ3 hordozók körében a fertızés súlyosabb tünetekkel zajlott (13. táblázat). A többi vizsgált HLA-típus (A2, B12, Cw7, DR6 és DR11) hordozói és a nemhordozók körében elıfordult CMV-infekció súlyosságára vonatkozó adatokat a 13. táblázatban foglaltuk össze. 13. táblázat: A CMV-fertızés súlyossága különbözı HLA-típusokban HLA típus/ Betegek száma
Összes CMVfert.
CMV syndrom
CMV betegség szervi érintettség
Tünetmentes fertızés
Kockázati arány (95%CI) P érték
A2+/ 63 A2-/ 66
27 22
14 12
3 3
10 7
B12+/ 43 B12-/ 86
14 35
9 18
1 4
4 13
Cw7+/ 60 Cw7-/ 69
21 28
10 19
3 6
8 3
DR6+/ 41 DR6-/ 88
18 31
10 17
3 5
5 9
DR11+/29 DR11-100
13 36
7 20
2 5
4 11
DQ3+/ 68 DQ3-/ 61
32 17
16 8
8 1
8 8
0.79 (0.20-0.02) P=0.77 1.47 (0.33-7.74) P=0.74 0.35 (0.08-1.56) P=0.19 1.43 (0.35-6.48) P=0.75 0.99 (0.21-5.37) P=1.0 2.67 (0.64-10.9) P=0.19
Akut graftkilökıdés/ kezelése A 129 (R-/D+) betegbıl 31-nél (24%) alakult ki akut rejekció az elsı poszttranszplant 12 hónapban. A rejekciós epizódok kezelése magas dózisú i.v. methylprednisolonnal történt. A 68 HLA-DQ3 pozitív recipiensek közül 20-nál (29%) alakult ki szervkilökıdés, amelyet 6 esetben 6 héten belül aktív CMVfertızés követett. A 61 HLA-DQ3 negatív betegbıl 11-nél (18%) fejlıdött ki rejekció, amelyet 8 esetben 6 héten belül követte a CMV-infekció. Az elvégzett Cox regressziós analízis szerint a rejekció és/vagy kezelése nem fordult elı arányosan többször a HLA-DQ3-t hordozó betegek, mint a negatívak között. Így a rejectio és/vagy kezelése nem befolyásolhatta a CMV-fertızés nagyobb arányú elıfordulását a HLA-DQ3+ betegek között (12. táblázat).
74
6.
Megbeszélés A korszerő immunszuppressziónak köszönhetıen a szervátültés eredményei javulnak, a recipiensek túlélési ideje növekszik, a transzplantáltak köre egyre nagyobb. A farmakológia fejlıdésének köszönhetıen pedig egyre több gyógyszer áll rendelkezésre az immunszupprimált betegeket fenyegetı infekciók kezelésére. A fertızés okozta veszélyeket azonban még ma sem szabad alábecsülni. Az irodalmi áttekintésbıl jól látható, hogy a Cytomegalovírus problematikája még most sem vesztett aktualitásából.
6.1
Cytomegalovírus szeroprevalencia Magyarországon A transzplantált betegek sorsát befolyásolhatja az, hogy kialakul-e CMV-
fertızés, az infekció mennyire súlyos, a fertızést követıen kialakul-e specifikus immunitás, az átültetést követıen milyen idıszakban fejlıdik ki a fertızés. A CMVinfekció súlyosságát és hatásait befolyásoló – jól ismert – tényezıje a recipiens és a donor CMV szerostátusz különbözısége (R-/D+). Ahhoz, hogy a súlyos betegség elkerülése érdekében megfelelı módon tervezzük a recipiensek prevencióját (szeropozitív, szeronegatív donorok és recipiensek aránya), vagy a tünetes fertızés kialakulása esetén - a diagnosztikai eredményekre támaszkodva - hatékonyan tudjuk kezelni a betegeket, az irodalmi adatokon túl ismernünk kell a hazai CMV– átfertızöttség pontos adatait, továbbá a magyar populáció CMV-fertızéssel kapcsolatos kor- és nemi megoszlást és egyéb jellegzetességeket is (183). A CMV – a többi herpeszvírushoz hasonlóan – szélesen elterjedt a humán populációban. A CMV-szeroprevalencia a higiénés viszonyoktól, a népsőrőségtıl, a bölcsıdei és óvodai kihasználtságtól, a csecsemıtáplálási szokásoktól és a végzettségtıl is függ (184). Az átfertızıttség mértéke a társadalmi-gazdasági fejlettséggel fordított arányban áll (185). A szervdonorok adatainak feldolgozásával kapott eredményeink részben megfelelnek a korábban végzett magyarországi felméréséknek. Pethı és Geiger 875 személyt vizsgáltak szőkebb kormegoszlásban (10-tıl 50 éves korig). Adataik szerint a 38 évesek fertızöttségi aránya 90%-os volt (186). Ettıl eltérıen a mi eredményeink szerint ez az arány az idısebb (51-70 éves) korcsoportban található. Ez a különbség esetleg magyarázható azzal, hogy a mi adataink egy évtizeddel késıbbi idıszakból származnak (javuló szociális-higiénés és gazdasági viszonyok?).
75
Pethı – ezen kívül - nem talált jelentıs különbséget a nemek között. Adataink szerint a különbség a nemek között szignifikáns (nıknél az átfertızöttség magasabb) volt (P=0.0006). A gyermekek CMV átfertızöttség vizsgálatában a nemi megoszlásban nem találtunk különbséget. Ez igazolja azt a feltételezésünket, hogy a felnıtteknél a CMV átfertızöttség nemi megoszlásában talált jelentıs különbség a nemi élettel kapcsolatos, és valószínőleg a sexuális higiénés szokásokkal és a genitáliák anatómiai adottságaival magyarázható. A legfiatalabb korcsoportban (2-20 év) 72 %-os átfertızöttséget találtunk, tehát Magyarországon a lakosság nagy része már gyermek-, illetve fiatal felnıttkorban átesik a fertızésen. A kor elırehaladtával a CMV-szeropozitivitás tovább nı, és az idıskorúak körében már 99 %-os. Összefoglalva az általunk kapott 86%-os átlagos CMV-átfertızöttség magasnak minısíthetı. A vizsgált – széles kormegoszlású és nagy létszámú -
csoport
reprezentálja a hazai populációt: a korcsoport arányok megfelelnek KSH által 2004ben megjelent adatoknak (187). Így elmondható, hogy ez az arány a magyarországi CMV-átfertızöttségnek tekinthetı. Magas CMV-szeroprevalenciájú populációkban - így Magyarországon is kevés fogékony (a-CMV IgG negatív) felnıtt korú személy található. Esetükben, ha immunszuppresszióra kerül sor (pl. szervtranszplantációt követı terápia), a nagy valószínőséggel bekövetkezı primer fertızés súlyos következményekkel járhat. Ez elkerülhetı lenne, ha a szeronegatív recipiens szeronegatív donortól származó szervet kapna. Kisebb átfertızöttségő populációkban ez a probléma könnyebben megoldható, mint nálunk, ahol a szeronegatív donor ritka. Jelenleg annak valószínősége, hogy szeronegatív recipiens szeronegatív donortól kapja a szervet – amennyiben szeronegatív donorjelentésnél nem részesítjük elınyben a szeronegatív recipienseket - statisztikailag közel 2% (14. táblázat). Remélhetıleg, a szociális és gazdasági viszonyok, az egészségügyi kultúra (oktatás) javulásával a CMVátfertızöttség Magyarországon is csökken, ezzel növekedne a szeronegatív recipiensek esélye arra, hogy azonos szerostátuszú donortól kapják a szervet, és csökkenne a primer infekció kialakulásának veszélye.
76
14. táblázat.
CMV-szeronegatív
és
szeropozitív
recipiensek
és
donorok
párosításának statisztikai valószínősége. Donor CMV szeronegatív
Donor CMV szeropozitív
Recipiens szeronegatív
1, 96%
12,04%
Recipiens szeropozitív
12,04%
73,96%
Néhány fertızı betegség elıfordulása összefüggésben van a vércsoporttal: malária, pestis (188). Freeman a CMV-viraemia és CMV-betegség rizikófaktorait vizsgálva azt mutatta ki, hogy az „A” vércsoportú transzplantáltaknál kétszer gyakrabban fordul elı tünetes CMV-fertızés, mint „0” vércsoportúaknál (124). Tanulmányunkban
ellenıriztük
a
szervdonorok
CMV-átfertızöttségét,
és
összevetettük a vércsoport adatokkal. Azt szerettük volna kimutatni, hogy a vércsoport befolyásolja-e a CMV-fertızés iránti fogékonyságot. Vizsgálatunkban a különbözı vércsoportú donorok átfertızöttségi adatai nem mutattak szignifikáns eltérést.
6.2
Cytomegalovírus kimutatási módszerek a transzplantációt követıen A hatékony CMV-ellenes gyógyszerek profilaktikus alkalmazásának
köszönhetıen
csökkent
a
súlyos
CMV-infekció
elıfordulása
a
korai
poszttranszplantációs idıszakban. CMV-betegség azonban nem ritkán fejlıdik ki a profilaxis befejezése után („late-onset” fertızés) – saját adataink szerint 25,4 %-ban (189). A rizikócsoportba nem tartozó (R+/D+) és emiatt profilaxisban nem részesülı vesetranszplantáltak
között
sem
ritka
a
CMV-fertızés
kialakulása.
A
poszttranszplantációs 1. évben - adataink szerint - az infekció a betegek 24%-ában alakul ki (141). A CMV-infekció kezelésének sikere részben függ a megfelelı laboratóriumi diagnosztikai eljárás alkalmazásától. Az érzékeny, specifikus és megbízható módszerek kiválasztása nélkülözhetetlen. A kvantitatív eljárások bevezetése tovább növelte a diagnosztikai virológia klinikai alkalmazhatóságát. A jó módszerrel szemben támasztott követelmények: magas érzékenység és specificitás, a gyors kivitelezhetıség (a gyors diagnózis a mielıbbi kezelés megkezdését eredményezi), feleljen meg a laboratórium (vagy intézet) tárgyi és anyagi feltételeinek (86).
77
A kilencvenes évekig a CMV diagnosztika alapját a vírusizolálás- és a szerológiai módszerek képezték. Ezen módszerek azonban - sok elınyük mellett nem feleltek meg az immunszupprimált betegek igényeinek. 1992-ben az OKI-ban elsıként bevezettük a transzplantált betegek részére kifejlesztett CMV antigenemia vizsgálatot. A három módszer összehasonlító vizsgálatában megállapítottuk az eljárások érzékenységét, specificitását és prediktív értékeket. A 90-es évek elején kevés ilyen jellegő tanulmányról számoltak be. Késıbb, amikor lehetıség nyílt PCR vizsgálatok elvégzésére, a két kvantitatív módszer (CMV antigenemia teszt és kvantitatív PCR vizsgálat) összehasonlítását is elvégeztük. A transzplantációs területen a CMV szerológia nem alkalmazható a CMVfertızés diagnosztizálásában, mivel az aktív infekció markere - a specifikus IgM immunszupprimált betegekben késve vagy egyáltalán nem jelenik meg; a késıi megjelenés után pedig hónapokig kimutatható. Ugyanakkor a szeropozitív egyénekben néha elıforduló kismértékő reaktiváció, amely még nem igényel kezelést, szintén az IgM megjelenésével jár (190). Ezt a megállapítást vizsgálatunk is alátámasztotta: az IgM kimutatás érzékenysége 60%, a pozitív prediktív értéke 82%, negatív prediktív érték: 57%. Bár a szerológiai diagnosztika nem alkalmazható az aktív CMV-fertızés kimutatására, ezen vizsgálatok továbbra is fı eszközei a transzplantációt megelızı recipiens és donor kivizsgálásnak. A szervátültetés elıtt ismernünk kell a recipiens és a donor CMV szerostátuszát annak érdekében, hogy elkerülhessük a CMV szeromismatch-et (R-/D+), vagy preventíve kezelhessük az ilyen módon transzplantált recipienseket. A szerológiai módszerek ezenkívül jól alklmazhatók a vérkészítmények szőrésére és immunszupprimált betegek esetében, ha a primer CMV-infekció tünetmentes lezajlása után bekövetkezik a szerokonverzió (ez néha megtörténik a CMV profilaxisban részesülı R-/D+ recipiensek körében); amennyiben megjelenik a specifikus IgG, nincs szükség a további profilaxisra (120). Transzplantációt követıen a CMV-fertızés a látens vírus reaktivációval indul (saját szövetekbıl vagy donorszervbıl). A fokozódó vírusreplikációt a véráram útján bekövetkezı vírusdisszemináció követi. Így kerül el a vírus a szervezet különbözı szerveihez. A CMV-t vagy az összetevıinek kimutatására irányuló eljárások a vérbıl vagy a célszervekbıl történı izolálásra vagy detektálásra
78
irányulnak: vírusizolálás, antigenemia teszt és molekuláris módszerek (PCR, hibridizáció). A CMV viraemia biztos jele az infekciónak. A viraemia kimutatására irányuló vírusizolálás (gyakorlatunkban gyorsíott shell vial technika) 20 éven keresztül a CMV-fertızés diagnosztika standard módszere volt (191). A vírusizolálás pozitív eredménye jól korrelál az aktív infekcióval, de az általunk kimutatott alacsony érzékenység (65%) és negatív prediktív érték (57%) csökkenti a módszer alkalmazhatóságát mind az aktív fertızés kimutatása terén, mind az érzékeny laboratóriumi követést igénylı pre-emptív terápiás eljárások során. A módszer kivitelezése 2-4 napot vesz igénybe, ami szintén nem elfogadható, amikor sürgıs diagnózis felállítására van szükség. Az alacsony érzékenység azzal magyarázható, hogy a viraemia idıszaka felnıttekben általában nem tart hosszú ideig (néhány nap). A vírusizolálás hátrányainak ellenére, ez a módszer alkalmazható olyan laboratóriumokban, ahol nincs lehetıség egyéb vizsgálatra, és ahol rendelkezésre áll a szövettani háttér. Ezenkívől a szövetkultúra alapú eljárások segítségével tanulmányozhatók a fenotípusos antivirális érzékenység és a virális mutációk (192). A polimorfonukleáris leukocitákban található pp65 (UL83) a CMV mátrix proteint monoklonális ellenanyag segítségével direkt immunfestéssel detektáló antigenemia teszt egy gyors kvantitatív módszer. Érzékenyebb eljárás (saját eredményeink szerint: 94-100% versus 65%), mint a konvencionális (pl. vírusizolálás - shell vial) módszerek. A számszerő eredmény jól korrelál az aktív betegség tüneteivel. Alkalmazásával jól követhetı a betegség alakulása és a terápia hatékonysága. Az egyik vizsgálatunkban mutatkozott alacsonyabb specificitás (79%) és a többéves mindennapi tapasztalatainknak megfelelıen az antigenemia teszt pozitivitásának határértékét 5 pozitív sejt/100000 fvs-ben állapítottuk meg A határérték természetesen a beteg klinikai állapotával együttesen értékelendı. Ez az eljárás gyorsan kivitelezhetı, kisebb laboratóriumokban is elvégezhetı, nem igényel drága eszközöket. A módszer hátrányai: a szubjektív értékelés, viszonylag gyors mintafeldolgozást igényel, alacsony fehérvérsejt szám esetén (<0,5 x 109/l) nem kivitelezhetı. A molekuláris módszerek közé tartozó PCR technológia a virális nukleinsav kimutatásán alapszik. Sok laboratóriumban az úgynevezett „home-brew” eljárást alkalmazzák, amely magas érzékenységő, de a munka- és idıigényessége, továbbá
79
az alacsony prediktív értékek és az eljárások sokszínősége (az eljárás nincs standardizálva, különbözı laboratóriumok eredményei nem reprodukálhatók) miatt eredményei csak feltételesen fogadhatók el (92, 193). A „home-brew” PCR hátrányai részben kivédhetık a PCR automaták alkalmazásával: standardizált körülmények, rövidebb kivitelezés, egyszerre nagyszámú minta feldolgozása. A vírus „load” meghatározása segíti a CMV-betegség követését, de a kezelést indikáló határértéket még csak hozzávetılegesen állapították meg (szervtranszplantáltak esetén 1000-5000 kópia/ml, csontvelı transzplantáltak részére 400 kópia/ml), és sok tényezıtıl függ (194). A standardizálás ellenére a PCR érzékenységével, specificitással, prediktív értékekkel kapcsolatos saját és más közlemények eredményei erısen szórnak: érzékenység – 68-100%, specificitás - 72-93%, pozitív prediktív érték -70-91%, negatív prediktív érték – 74 -100% (177, 190, 195). Vizsgálatunkban, ahol 6 hónapig CMV antigenemia teszt és PCR segítségével követtük a betegeket, a két módszer érzékenysége és specificitása közel azonosnak bizonyult. Az eljárások alkalmazhatóságának összehasonlításával a következıket tapasztaltuk: –
Magyarországon a gyári PCR reagensek költsége tízszerese az antigenemia teszthez képest
–
a PCR vizsgálatot összegyőjtve központi laboratóriumokban érdemes végezni (az ebbıl eredı nehézségeket figyelembe kell venni)
–
a PCR vizsgálat határértéke aktív CMV-fertızésben nem egyértelmő, ezért elsısorban DNS kópiaszámának a változását érdemes követni (annak megfelelıen érdemes a terápiát alakítani)
–
az antigenemia teszt kivitelezése labortechnikailag egyszerőbbnek bizonyult
A transzplantált betegek aktív CMV-fertızés kimutatására és követésére eredményeink alapján - az antigenemia teszt és a gyári kivitelezéső kvantitatív PCR teszt tőnik a legmegfelelıbbnek. A két módszer elınyeit és hátrányait mérlegelve – a saját és közölt adatok alapján - vese- és májtranszplantáltak részére, a hazai körülmények között rutin eljárásnak elsınek választandó módszernek az olcsóbb és kevésbé eszközigényes CMV antigenemia tesztet javasoljuk. A PCR vizsgálatot kétes antigenemia teszt eredmény, alacsony fvs szám vagy vértıl eltérı vizsgálati minta (pl. bronchoalveoláris lavage - BAL) esetén érdemes végezni (86, 97, 153, 178, 196).
80
Amennyiben ezekkel a módszerekkel szándékozunk végezni pre-emptív terápiás követést, az elsı poszttranszplantációs félévben nem elégséges havonta behívni a betegeket vizsgálatra (saját vizsgálatunkban a CMV-infekció a tervezett kontroll napok közé esett). A nehezen kivitelezhetı 1 vagy 2 hetenkénti kontroll lenne az optimális. Az összehasonlító vizsgálatok eredményeképpen kidolgoztuk - az itthon jól alkalmazható - transzplantált betegek aktív CMV-infekció kimutatásának és követésének folyamatábráját (16. ábra), amely az Infektológiai Útmutatóban (Klinikai Irányelvek Kézikönyve) is megjelent (197). _________________________________________________________________ I. Transzplantáció elıtt: A recipiens (R), donor (D) CMV-szerostátusz meghatározása (szerológia - IgG) _________________________________________________________________ II. Transzplantációt követıen: 0.-6. hónapig:
R-/D- és R+/D+ tünet esetén (CMV-antigenemia teszt (Ae), szerológia - IgM) R-/D+ rendszeres kontroll profilaxis befejezése után még 2-3 hónapig! (CMV-Ae, szerológia – IgM, IgG)
6.-hónaptól
tünetes esetekben (CMV-Ae, szerológia)
III. A vizsgálatok értékelése: Ae negatív, IgM negatív: nincs teendı Ae negatív, de IgM pozitív: R-/D+, R-/DR+/D+
PCR; tünet esetén kezelés megfigyelés
Ae pozitív, szerológiától függetlenül: R-/D+, R-/Dkezelés R+/D+ a tünetek súlyosságától és a sejtszámtól függıen kezelés vagy megfigyelés _________________________________________________________________ 16.ábra: CMV-kivizsgálás algoritmusa transzplantáció elıtt és után
81
Összefoglalva, ha összehasonlítjuk a CMV-fertızés kimutatási módszereit le kell szögezni, hogy a diagnosztikai vizsgálat kiválasztásnál figyelembe kell venni a módszer érzékenységét, specificitását, kivitelezésének idıtartamát, munka- és eszközigényét, valamint a laboratórium lehetıségeit is. Fontos, hogy milyen betegpopulációról van szó: más módszereket alkalmazunk egészséges immunitású és immunszupprimált betegek esetében.
6.3
CMV-fertızés megelızése magas rizikójú transzplantáltak körében A CMV-fertızés direkt és indirekt hatásainak csökkentésére kell törekedni.
Ezzel befolyásolható mind a graft, mind a páciens túlélése (120, 198). Ezt a célt szolgálják a különbözı transzplantáló csoportok által kidolgozott CMV-infekciót megelızı eljárások is. Az utóbbi idıben két stratégia kristályosodott ki: a profilaxis és a pre-emptív terápia: a/.
Profilaxis
- Univerzális proflaxis: a transzplantációval egy idıben vagy a mőtét után 14 napon belül megkezdik az antivirális kezelést, amely meghatározott ideig tart. Meghatározott csoportba tartozó betegek kapják (pl. R-/D+, R+/D+). Így a korai poszttranszplantációs idıszakban, amikor az immunszuppresszió a legerısebb, és a graft legsérülékenyebb, csökken az esetleges aktív CMV-fertızés kialakulásának és az általa okozott szövetkárosodás valószínősége. - Szelektív profilaxis: szteroid rezisztens graftkilökıdés kezelésére vagy indukcióra használt anti-lymphocyta globulinok alkalmazását követıen 4-8 hétig fontos gondoskodni a CMV-infekció megelızésérıl. A transzplantált beteg csak ATG/ALG/OKT3 adása esetén kap antivirális profilaxist. b/. Pre-emptív terápia alkalmazásakor a betegeket meghatározott idınként ellenırzik keresve olyan laboratóriumi jeleket, amelyek bizonyítják a CMV korai replikációját még a tünetek megjelenése elıtt. Pozitív lelet esetén a beteget mielıbb elkezdik kezelni antivirális szerrel. Szigorúan véve a pre-emptív terápia nem nevezhetı megelızésnek, hiszen a replikálódó vírus már a fertızés jele. Mégis a gyakorlatban a megelızés fogalmához soroljuk.
82
Mindkét lehetıség alkalmazásának vannak elınyei és hátrányai, amelyek ismeretében és a helyi lehetıségek függvényében érdemes választani megelızési stratégiát (121, 137, 173). A két preventív stratégia költség-hatékonyság vizsgálatát Pescovitz végezte el, összehasonlította a gyógyszerek, a laboratóriumi vizsgálatok, az esetleges hospitalizáció és a szövıdmények kezelésének költségeit. A szerzı azt találta, hogy összességében a költségek közel azonosak. Pescovitz az univerzális profilaxis alkalmazását javasolja, mivel emellett érhetı el a prevenció legfontosabb célja, miszerint lényegesen kisebb az indirekt hatások érvényesülése, de további randomizált összehasonlító vizsgálatokat javasol (199). Jelenleg a legtöbb
transzplantációs
központban
a 2004-ben
a
Kanadai
Transzplantációs Társaság és az Amerikai Transzplantációs Társaság által elfogadott irányelveket alkalmazzák (15. táblázat) (121).
15. táblázat: A CMV-infekció megelızésére irányuló útmutató Rizikócsoport
Graft/ Terápia
D/R Szerostátusz
Megelızés/ lehetséges szerek
Magas
Vese, máj, pancreas, szív
R-/D+
Tüdı
R-/D+ és R+/D+
Univerzális profilaxis: Valganciclovir p.o.900 mg/nap, vagy Ganciclovir p.o. 3 g/nap, vagy Ganciclovir iv. 5 mg/ttkg/nap; Tüdı Tx esetén +CMV IG, Vese Tx esetén: Valacyclovir magas dózisban (8g/nap)
ATG/ALG/OKT3 terápia, indukció Közepes
Vese, máj, pancreas, szív
R+/D+ R+/D-
Univerzális profilaxis vagy preemptive kezelés
Alacsony
Vese, máj, pancreas, szív
D-/R-
Centrum dönti el a profilaxis szükségességét
A klinikánkon 1997-ben vezettük be a CMV profilaxist, amelyet a magas rizikójú betegeknél (R-/D+) alkalmaztunk transzplantáció utáni elsı 3 és fél hónapban.
1999-ig
a
CMV-infekció
megelızésére
csak
hyperimmun
gammaglobult, majd az ezt követı 2 év során pedig kombinált profilaxist alkalmaztunk: Cytotect + p.o. ganciclovir. 2001-tıl áttértünk monoprofilaxisra,
83
amely p.o. ganciclovirral, majd 2003-tól valganciclovirral (Valcyte, Roche) történt. Összehasonlítva az 1997 elıtt (profilaxis nélkül) elıfordult CMVfertızések gyakoriságát, súlyosságát és a különbözı – általunk alkalmazott – profilaktikus
protokollok
eredményeit,
kimutattuk,
hogy
szignifikánsan
kevesebb CMV-infekció fordult elı profilaxisban részesült betegek körében: (50% versus 100%, P<0.006). Bár a megelızés mind a 3 profilaktikus csoportban megvédte a betegeket a súlyos CMV-infekció kialakulásától, különbséget találtunk a különbözı megelızési protokollok hatékonyságában: a kombinált profilaxis és a ganciclovir monoprofilaxis szignifikánsan hatékonyabb volt a hyperimmun gammaglobulin prevenciónál a fertızés kivédésében (30% versus 77,5%, P=0.006 – 10. táblázat, 14. ábra) (189). Várakozásunkkal ellentétben nem találtunk szignifikáns különbséget a kombinált profilaxis és a ganciclovir monoprofilaxis hatékonyságában (30% versus 31%, P=0.54), de ezekben a csoportokban a fertızéses esetek alacsony száma limitálja az analízis értékét. A hypeimmun gammaglobulin alkalmazása a kombinált profilaxisban nagy mértékben emelte a megelızés költségét, ezért a két utóbbi protokoll közül a hatékony és költségkímélıbb ganciclovir monoprofilaxist minısítettük a legalkalmasabbnak. A magas rizikójú recipiensek ganciclovirral (valganciclovirral) történı profilaxis szükségességén túl az összehasonlító vizsgálatunk a profilaxis befejezése után nem ritkán kialakuló un. „late-onset” (késıi) aktív CMVfertızésre (24,5%) is felhívta a figyelmet. A 1997 és 2004 közötti vizsgálatunkban a profilaxisban részesült magas rizikójú veserecipiensek 1 éves követésében a betegek felében kialakult tünetmentes vagy enyhe tünetekkel járó CMV-fertızés. Késıbbiekben vizsgáltuk az 1999 és 2007 közötti transzplantáltak adatait, ebben az idıszakban a prevenció már csak ganciclovirral történt, az infekció 38%-ban fordult elı (141). A fertızés kialakulásának csökkenése a megfelelı profilaxisnak és az immunszuppressziós protokollok kedvezı alakulásának (specifikusabb monoklonális ellenanyagok, rapamycin alkalmazása) lehet az eredménye. Annak a kérdésnek az eldöntéséhez, hogy a profilaxis és a pre-emptív terápia között melyiket válasszuk, több tényezıt kell figyelembe venni: a nagy beteganyag, a szoros monitorozás nehézségei és a költséges laboratóriumi vizsgálatok miatt,
84
továbbá a CMV-fertızés indirekt hatásainak kiküszöbölése érdekében a profilaxist érdemes választani (132, 137). Könnyebben követhetı kisszámú betegcsoportok részére a pre-emptív terápia tőnik a megfelelı megelızési stratégiának (200).
6.4
HLA-DQ3
lehetséges
CMV-fertızés
fogékonysági
rizikó-faktor
a
vesetranszplantáltak körében A CMV-fertızés rizikó-faktorainak ismerete immunszupprimált állapotban megkönnyíti a betegek további követését és kezelését. A jól ismert veszélyeztetı tényezıkın túl egyre több adat utal arra, hogy a személyek veleszületett genetikai adottságai is befolyásolják a CMV-fertızés iránti fogékonyságot: ilyen a HLAtípus. Jól ismet, hogy a HLA rendszer hatással van néhány betegségre irányuló fogékonyságra (158-162, 201). Az utóbbi 2 évtizedben több – a HLA-típus és a CMV-fertızés összefüggésével kapcsolatos – vizsgálat eredményei jelentek meg (164-172 – ld.a 48. oldalt). Az összes vizsgálat a CMV-fertızés elıfordulását elemezte és nem a fogékonyságot. Csak két vizsgálatban végeztek multivariáns statisztikai elemzést. A HLA-A2, HLA-DR6 és a HLA-DR11 típusokat mi is vizsgáltuk a tanulmányunkban. A többi szerzıtıl eltérıen mi nem találtunk összefüggést ezen típusok és a CMV-fertızés elıfordulása és súlyossága között, bár a HLA-DR6 antigénnel rendelkezık és nem rendelkezık között a különbség megközelítette a szignifikancia szintet az univariáns analízisben (P=0.07) a mi vizsgálatunkban is. A közleményekkel megegyezıen kimutattuk, hogy a HLA-Cw7 pozitív személyekben a CMV-fertızés ritkábban és késıbb fordult elı (védı hatás), mint a negatívakban, de ez a különbség nem volt szignifikáns (165). A külföldi szerzık eredményeiben talált különbségek magyarázhatók az ismert humán CMV-szubtípus különbségekkel. Magyarországon az I. gB szubtípus a domináns (202). A más országokban elterjedt CMV szubtípusok determinálása szükséges ahhoz, hogy elemezhessük a különbözı szerzık eredményeit. Ezenkívül a legtöbb külföldi vizsgálatban nem végeztek multivariáns analízist. Elképzelhetı, hogy az eredményeiket az általuk figyelembe nem vett CMV-fertızést elısegítı faktorok is befolyásolták.
85
Az elızıleg még nem vizsgált HLA-DQ3-t találtuk independens CMVfertızés prediktornak szeronegatív vesetranszplantált betegek körében. Az elvégzett multivariáns Cox regressziós analízis kimutatta, hogy a HLA-DQ3 pozitív és -negatív betegek CMV-fertızés iránti fogékonyságában talált különbséget nem befolyásolták olyan jól ismert rizikótényezık, mint az indukciós terápia, a HLA missmatch-ek száma, a rejekció és/vagy kezelése, továbbá az életkor (203). A
vizsgálatunkban
elemzett
HLA-típusok
kimutatása
rutinszerően
megtörténik a vesetranszplantáció elıtt annak érdekében, hogy minél jobb HLA egyezést érjünk el a donor és a recipiens között. Tehét a HLA-DQ3 hordozásra vonatkozó információ a mőtét elıtt már rendelkezésre áll. Amennyiben a recipiens HLA-DQ3 hordozónak bizonyul, több figyelmet kell fordítani a CMV követésére. Ismerve a HLA-DQ3 CMV-fertızés iránti fogékonyságot fokozó szerepét, elıre tervezhetık a szőrésre, a vizsgálatok gyakoriságára, a célzott profilaxisra irányuló eljárások a beteg követése során (pl. a pre-emptív terápia helyett érdemesebb a profilaxist választani). Mind az I., mind a II. osztályba tartozó MHC molekulák fontos szerepet játszanak a vírusantigén felvételében, feldolgozásában és prezentációjában. Egyes HLA-alléleknek a CMV-fertızéssel való összefüggése magyarázható a CMV peptidek (gB és IE antigének) különbözı mértékő prezentációjával vagy a host CD8+ és CD4+ T limfociták gyengébb HLA-molekula+antigén komplexfelismerı képességével (125, 164). Japán kutatók szerint, egyes HLA-típusok jelenlétében a CMV-ellenes
neutralizációs
ellenanyagok
deficiens
szintézise
fokozott
fogékonysághoz vezet (204). Elképzelhetı az is, hogy egyes HLA-típusok fokozzák a TNF-α szintézisét és ezzel fokozzák a CMV szaporodását (169). A CMV az immunitás elkerülésére olyan glikoproteineket termel, amelyek a sejt újonnan képzıdött HLA-molekulákat visszatartják a citosolban, ezzel megakadályozzák a virális antigének prezentációját az effektor sejtek részére. Másik elmélet szerint a CMV IE proteinjei – az interferon-γ által stimulált jelátvitel (Janus kináz1-Stat1alfaComplexII transaktivátor) megakadályozása útján - gátolják az endothel sejteken indukálható MHC II. expressziót (205, 206). Ezek a folyamatok gátolják az antigén prezentációt, és a fertızött sejt elkerüli a CD8+ ás CD4+-lymfociták általi pusztulást. Feltételezzük, hogy ezek a folyamatok a HLA-DQ3 esetében fokozottan érvényesülnek.
86
További tanulmányok szükségesek ahhoz, hogy megértsük a HLAmolekulák és a CMV-fertızés iránti fogékonyság közti összefüggést. Molekuláris szinten a kutatások a modern genomika eszközeivel folytatódhatnak (207). A mi eredményeink biztosíthatják a genomikai kísérletek tervezéséhez szükséges klinikai humán adatokat.
7.
KÖVETKEZTETÉSEK
7.1 A donorok és az idıskorú személyek CMV-átfertızöttségének vizsgálatából levonható következtetések 1.) Megállapítottuk, hogy a magyar lakosság CMV-szeroprevalenciája 86%-os, ami magas CMV-átfertızöttségnek tekinthetı. A legfiatalabb korcsoportban (2-20 év) 72 %-os átfertızöttséget találtunk, tehát Magyarországon a lakosság nagy része már gyermek-, vagy fiatal felnıttkorban átesik a fertızésen.
2). Elsıként igazoltuk és közöltük, hogy a nıi nem rizikótényezınek tekinthetı a CMV-fertızés szempontjából. A nık körében az átlagos CMV-szeroprevalencia szignifikánsan magasabbnak bizonyult, mint férfiak között. Transzplantált betegek követésénél és a kezelés tervezésénél ezt figyelembe kell venni.
3). Megállapítottuk, hogy a nemek CMV-szeroprevalenciájában talált különbség felnıtt korban jelentkezik, és valószínőleg a nemi élet megkezdésével kapcsolatos, és a genitáliák anatómiai adottságaiból és a sexuális higiénés szokásokból adódhat.
7.2 A szervtranszplantáltak CMV-fertızésének laboratóriumi diagnosztikai módszereinek összehasonlító vizsgálatából levonható következtetések, a kivizsgálás folyamatábrája 1). Magyarországon elsıként bevezettük a transzplantált betegek aktív CMVinfekció kimutatására alkalmas CMV antigenemia tesztet. Összehasonlító vizsgálatunkban bebizonyítottuk, hogy a magas érzékenységő és specificitású antigenemia teszt jobban alkalmazható a transzplantáltak CMV-fertızésének kimutatására, mint a hagyományos módszerek.
87
2). Az antigenemia teszt pozitivitásának határértékét 5 pozitív sejt/100000 fvs-ben állapítottuk meg, ami természetesen a beteg klinikai állapotával együttesen értékelendı. Az antigenemia teszt kivitelezésének technikai módosításával és automatizálásával a vizsgálat idejét 6-ról 4 órára sikerült csökkentenünk.
3). Bizonyítottuk, hogy a transzplantált betegek aktív CMV-fertızés kimutatása és követése a kvantitatív eredményt nyújtó módszerekkel lehetséges: az antigenemia teszttel és a gyári kivitelezéső kvantitatív PCR vizsgálattal. Mérlegelve a két módszer elınyeit és hátrányait, magyar viszonyok mellett vesetranszplantáltak részére jelenleg az olcsóbb és kevésbé eszközigényes CMV antigenemia tesztet javasoljuk.
4). Kidolgoztuk az Infektológiai Útmutatóban is közölt, az immunszupprimált betegek CMV-fertızésének kimutatását segítı folyamatábrát: ”CMV-kivizsgálás algoritmusa transzplantáció elıtt és után”.
5). Akár antigenemia teszttel, akár PCR vizsgálattalal követjük a rizikócsoportba tartozó transzplantált recipiens pre-emptív terápiáját, a beteg laboratóriumi CMVfertızés kontrollját lehetıleg egy-kéthetente javasoljuk elvégezni az elsı 3-6 hónapban.
7.3
A
CMV-fertızés
kivédésére
alkalmazott
preventív
protokollok
összehasonlításából származó eredmények alapján levonható következtetések, megállapítások 1).
A rizikócsoportba tartozó veserecipiensek részére a CMV-fertızés profilaxisa
nélkülözhetetlen a korai poszttranszplantációs idıszakban (3 hó). Bizonyítottuk, hogy az általunk vizsgált profilaktikus protokollok közül bármelyik alkalmazása elınyösebb, mint a profilaxismentes gondozás.
2). Bizonyítottuk, hogy a per os alkalmazott ganciclovirral vagy valganciclovirral történı megelızés a vizsgált preventív protokollok közül a leghatékonyabb és a legköltségkímélıbb.
88
3). Amennyiben az immunszupprimált állapotban bekövetkezett primer CMVinfekciót követıen nem alakul ki védettség, a betegek továbbra is a magas rizikócsoportba tartoznak, további szoros követést javaslunk.
7.4 A HLA-típus és a CMV-fertızés iránti fogékonyság közti kapcsolat vizsgálatából levonható következtetések 1). Elsıként igazoltuk és közöltük, hogy a HLA-DQ3-hordozás rizikótényezınek tekinthetı CMV-fertızés szempontjából. Statisztikai analízissel bizonyítottuk, hogy a HLA-DQ3 independens prediktora a CMV-fertızés kialakulásának magas rizikójú transzplantáltak esetében. Transzplantált betegek követésénél és a kezelés tervezésénél ezt figyelembe kell venni.
2).
Eredményeink
biztosítják
a
molekuláris
tervezéséhez szükséges klinikai humán adatokat.
89
szintő
genomikai
kísérletek
8.
ÖSSZEFOGLALÁS
A Cytomegalovírus által okozott infekció egyike a leggyakrabban elıforduló, szervátültetést követı fertızéseknek, amely befolyásolja a transzplantált szerv és a beteg túlélését is. Akkor tudunk hatékonyan szembeszállni ezzel a problémával, ha ismerjük a kórokozó hatásait, figyelembe vesszük a rizikófaktorokat, és ha megtaláljuk azt az érzékeny és megbízható diagnosztikai módszert, amellyel a diagnózis idıben felállítható. Ahhoz, hogy a súlyos betegség elkerülése érdekében megfelelı módon tudjuk tervezni a recipiensek prevencióját, ismernünk kell a hazai CMV–átfertızöttséget. Munkánk során megállapítottuk, hogy a magyar lakosság CMV-átfertızöttsége magas: 86%-os. Annak a valószínősége, hogy CMVszeronegatív recipiens szeronegatív donortól kapja a szervet csak 2%, ezért ezen betegek elınyt élveznek szeronegatív donorjelentés esetén. Amennyiben a CMVszerostátusz matching nem kivitelezhetı, figyelembe kell venni, hogy a szerostátusz mismatch egyike a legsúlyosabb rizikó-tényezıknek. Ezekben az esetben univerzális profilaxis szükséges, amely - eredményeink alapján – a ganciclovir alkalmazásával a leghatékonyabb. Különös figyelmet kell fordítani a profilaxis befejezése után bekövetkezı „late-onset” CMV-infekcióra, amely adataink szerint a fertızések negyedét teszi ki, és arra a tényre, hogy az immunszupprimált állapotban bekövetkezı primer CMV-fertızés után az esetek 14 %-ában nem jön létre szerokonverzió. Az immunszupprimált betegek aktív CMV-fertızés diagnosztikájában a diagnózis mielıbbi fellálítása és a kvantitatív eredmény egyaránt fontos. Vizsgálatainkban összehasonlítottuk a konvencionális kimutatási módszereket, az antigenemia tesztet és a PCR vizsgálatot. Ez utóbbi két módszer felel meg leginkább a transzplantált betegek CMV-fertızésének diagnosztizálására. A két módszer elınyeit és hátrányait mérlegelve, a vesetranszplantáltak részére, elsınek választandó módszernek az olcsóbb és kevésbé eszközigényes CMV antigenemia tesztet javasoljuk, a hazai körülmények között. A genetikai adottságok befolyásolják a fogékonyságot és a fertızés kimenetelét. Adataink alapján a recipiensek HLA-típusa befolyásolja a CMV-fertızés iránti fogékonyságot. Vizsgálatunkban kimutattuk, hogy a HLA-DQ3 hordozó CMV-szeronegatív veserecipienseknél, akik szeropozitív donortól kapták a szervet, gyakrabban és korábban alakult ki aktív CMV-infekció, mint HLA-DQ3 negatív recipiensek esetében. Statisztikai analízissel bizonyítottuk, hogy a HLA-DQ3 independens prediktora a CMV-fertızés kialakulásának.
90
9. SUMMARY Cytomegalovirus infection is a major infectious complication of transplant recipients, causing significant morbidity and mortality. We can treat this infection effectively only if we know the direct and indirect effects of it, if taking into account the risk-factors, and using sensitive and reliable diagnostic methods for early establishment of diagnosis. In order to avoid severe CMV-infection, profilactic therapy can be introduced. For profilaxis planning it is important to know the CMV seroprevalence of Hungarian population and its specialties. According to our results, the seroprevalence of Hungarian population is high: 86%. CMV seronegative recipients should be transplanted using organs of seronegative donors, however, the chance obtaining the graft from a CMV seronegative donor was shown to be 2 % only. In case the seromatching is not feasible, we have to know that the constellation of negative recipient and positive donor is the highest risk-factor. In these cases CMV-infection prophylaxis is essential. In our investigation prophylaxis with ganciclovir is the most effective. It is important to take into consideration that according to our results - in prophylactic groups the „late-onset” CMV-infection occurs in ¼ of all cases of CMV-infection, and that there were no signs of seroconversion after the primary CMV-infection in 14% of the patients. Immunocompromised patients require quick diagnosis of acute CMV-infection, the results must be quantitative for monitoring of the antiviral treatment. In our study we have compared conventional methodology (serology and virusisolation-shell vial technique of virusisolation), CMV antigenemia test and quantitative PCR. The last two procedures were found to be the best for the diagnosis of acute CMV-infection in transplanted patients. Considering the advantages and disadvantages of CMV antigenemia test and PCR, we recommend the use of cheaper and less laborintensive antigenemia test for kidney transplant patients under the Hungarian circumstances. Genetic variability influences susceptibility to infectious diseases and HLA-molecules are critical for viral antigen uptaking, processing and presenting. Our data suggest that recipients positive for HLA-DQ3 are more susceptible to CMV-infection than a comparable group of patients negative for this HLA-type. The multivariate analysis showed that the HLA-DQ3 positivity is an independent predictor of primary CMV-infection in CMV seronegative recipients with seropositive donor grafts.
91
10.
IRODALOMJEGYZÉK
1. Linares L, Cofán F, Cervera C, Ricart MJ, Oppenheimer F, Campistol JM, Moreno A. Infection related mortality in a large cohort of renal transplant recipients. Transplant Proc, 2007, 39(7): 2225-2227. 2. Varga M, Járay J, Xie J, Szesztay Á, Berencsi Gy. A tartósan immunkárosodott betegek vírus eredető fertızései és diagnosztikai problémái. Egészségtudomány, 1997, 41: 310-323. 3. Tilney NL. Transplantation from myth to reality. Yale University Press, New Haven and London, 2003, 1-36. 4. Merrill JP, Murray JE, Harrison JH, Guild WR. Successful homotransplantation of the human kidney between identical twins. J Am Med Assoc, 1956, 160: 277282. 5. Starzl TE. History of clinical transplantation. World J Surg, 2000, 24: 759-782. 6. Starzl TE. The birth of clinical organ transplantation. J AM Coll Surg, 2001, 192: 431-446. 7. Kelly WD, Lillihei RC, Merkel FK. Allotransplantation of the pancreas and duodenum along with the kidney in diabetic nephropathy. Surgery, 1967, 61: 827835. 8. Najarian JS, Sutherland DER, Matas AJ, Steffes MW, Simmons RL, Goetz FC. Human islet transplantation: A preliminary experience. Transplant Proc, 1977, 9: 233-236. 9. Owen R. Immunogenetic consequences of vascular anastomoses between bovine twins. Science, 1945, 102: 400-401. 10. Medawar PB. The behaviour and fate of skin autografts and skin homografts in rabbits. J Anat, 1944, 78: 176-199. 11. Dausset J. Iso-leuco anticorps. Acta Haematol, 1958, 20: 156-166. 12. Merrill JP, Murray JE, Harrison JH, Friedman EA, Dealy JB, Dammin GJ. Successful homotransplantation of the kidney between nonidentical twins. N Eng J Med, 1960, 262: 1251. 13. Hamburger J, Vaysse J, Crosnier J, Auvert J, Dormont J. Kidney homotransplantation in man. Ann N Y Acad Sci, 1962, 99: 808-820.
92
14. Shackman R, Dempster WJ, Wrong OM. Kidney homotransplantation in the human. Br J Urol, 1963, 35: 222-255. 15. Taylor AL, Watson CJE, Bradley JA. Immunosuppressive agents in solid organ transplantation: mechanisms of action and therapeutic efficacy. Crit Rev Oncol Hematol, 2005, 56: 23-46. 16. Calne RY. The rejection of renal homografts: inhibition in dogs by 6mercaptopurine. Lancet, 1960, 1: 417-418. 17. Calne RY. Inhibition of the rejection of renal homografts in dogs by purine analogues. Transplant Bull, 1961, 28: 445-461. 18. Murray JE, Merril JP, Harrison JH, Wilson RE, Dammin GJ. Prolonged survival of human-kidney homografts by immunosuppressive drug therapy. N Engl J Med, 1963, 268: 1315-1323. 19. Küss R. Fifty years of retroperitoneal placement of renal transplants. Transplant Proceedings, 2002, 34 (8): 3019 - 3025. 20. Starzl TE, Marchioro TL, Waddel WR. The reversal of rejection in human renal homografts with subsequent development of homograft tolerance. Surg Gynecol Obstet, 1963, 117: 385-395. 21. Starzl TE, Marchioro TL, Hutchinson DE, Porter KA, Cerilli GJ, Brettschneider L. The clinical use of antilymphocyte globulin in renal transplantation. Transplantation, 1967, 5: 1100-1105. 22. Calne RY, White DJG. Cyclosporin A – a powerful immunosuppressant in dogs with renal allografts. IRCS Med Sci, 1977, 5: 595-599. 23. Cosimi AB, Burton RC, Colvin RB, Goldstein G, Delmonico FL, LaQuaglia MP, Tolkoff-Rubin N, Rubin RH, Herrin JT, Russell PS. Treatment of acute renal allograft rejection with OKT3 monoclonal antibody. Transplantation, 1981, 32: 535539. 24. Sarzl TE, Todo S, Fung J, Demetris AJ, Venkataramman R, Jain A. FK 506 for liver, kidney, and pancreas transplantation. Lancet, 1989, 2(8670):1000-1004. 25. Perner F. A transzplantáció sebészete. Sebészet, Medicina, Budapest, 1997, 268279. 26. Reis MA, Costa RS, Ferraz AS: Patient death after renal transplantation-an analysis of its role in graft outcome. Transplantation, 1996, 61(10):1479-1483.
93
27. Scroggs MW, Wolfe JA, Bollinger RR, Sanfilippo F. Causes of death in renal transplant recipients. A review of autopsy findings from 1966 through 1985. Arch Pathol Lab Med, 1987, 111(10): 983-987. 28. D'Herelle F. On an invisible microbe antagonistic toward dysenteric bacilli: brief note by Mr. F. D'Herelle, presented by Mr. Roux. 1917. Res Microbiol, 2007, 158(7): 553-554. 29. Ádám Éva: A virológia fejlıdése történeti áttekintése, a molekuláris virológia kialakulása. Orvosi Mikrobiológia, Gergely L., Semmelweis Kiadó, 1999: 257-260. 30. Nagano Y, KojimaY. Pouvoir immunisant du virus vaccinal inactivé par des rayons ultraviolets. C.R. Seances Soc. Biol. Fil, 1954, 148:1700-1702. 31. Isaac A, Lindenmann J. Virus Interference. I. The interferon. Proc. Roy. Soc. Lond. B Biol. Sci., 1957, 147:258-267. 32. Starr-Spires LD, Collman RG. HIV-1 entry and entry inhibitors as therapeutic agents. Clin Lab Med. 2002 Sep;22(3):681-701. 33. Deeter RG, Khanderia U. Recent advances in antiviral therapy. Clin Pharm. 1986 Dec;5(12):961-76. 34. Matthews T, Boehme R. Antiviral activity and mechanism of action of ganciclovir. Rev Infect Dis, 1988, 10(3): 490-494. 35. Lu H, Thomas S. Maribavir. Curr Opin Investig Drugs, 2004, 5: 898-906. 36. Rebiere H, Mazel B, Civade C, Bonnet PA. Determination of 19 antiretroviral agents in pharmaceuticals or suspected products with two methods using highperformance liquid chromatography. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007 May 1;850(1-2):376-83. 37. McNicholl IR, McNicholl JJ. Neuraminidase inhibitors: zanamivir and oseltamivir. Ann Pharmacother. 2001, 35(1):57-70. 38. Elion GB. Acyclovir: discovery, mechanism of action, and selectivity. J Med Virol, 1993, Suppl 1: 2-6. 39. Hermans PE, Cockerill FR. Antiviral agents. Mayo Clin Proc, 1987, 62(12):1108-1115. 40. Takátsy Gy. Purified precipitated virus obtained by a new simple method. Acta Medica, 1952, 2: 185-189.
94
41. Dömök I. Experiences associated with the use of live poliovirus vaccine in Hungary, 1959-1982. Rev Infect Dis, 1984, 6 Suppl 2: 413-418. 42. Simmons RL, Lopez C, Balfour H Jr, Kalis J, Rattazzi LC, Najarian JS. Cytomegalovírus: Clinical virological correlations in renal transplant recipients. Ann Surg, 1974,180(4): 623-634. 43. Koller M, Geder L, Lehel F, Gönczöl E, Kiss J. Column chromatography on DEAE cellulose column of Herpes simpex virus and Cytomegalovírus. Acta Microbiol Acad Sci Hung, 1964-1965, 11: 369-374. 44. Varga M, Koller M, Visontai I, Berencsi Gy, Bánrévi A. Human cytomegalovírus, its significance in immune deficiency states, laboratory diagnosis, therapeutic possibilities. Orv Hetil, 1993, 134(45):2467-2472. 45. Hanshaw JB, Dudgeon JA, Marshall WG. Viral diseases of the fetus and newborn. 1985, Philadelphia, WB Saunders Co, 2nd Ed. 46. Goodpasture EW, Talbot FB. Concerning the nature of „protozoan-like” cells in certain lesions of infancy. Am J Dis Child, 1921, 21, 415-425. 47. Lipschutz B. Untersuchungen über die Aetiologie der krankheiten d. herpes genitalis, etc. Arch Dermatol Syphilol, 1921, 136: 428-482. 48. Farber S, Wolbach SB. Intranuclear and cytoplasmic inclusions int he salivary glands and other organs of infants. Am J Pathol, 1932, 8: 123-135. 49. Smith MG, Vellios F. Inclusion disease or generalized salivary gland virus infection Arch Pathol, 1950, 36: 271-294. 50. Rowe WP, Hartley JW, Waterman S. Cytopathogenic agent resembling salivary gland virus recovered from tissue cultures of human adenoids. Proc Soc Exp Biol Med, 1956, 92: 418-424. 51. Weller TH, Hanshaw JB, Scott DE. Serological differentiation of viruses responsible for cytomegalic inclision disease. Virology, 1960, 12, 130-132. 52. Weller TH, Hanshaw JB. Virological and clinical observation of cytomegalic inclusion disease. N Engl J Med. 1962; 266: 1233-1237. 53. Kaariainen L, Klemola E, Paloheimo J. Rise of cytomegalovírus antibodies in an infectious-mononucleosis-like syndrome after transfusion. BMJ, 1966, 1: 12701272.
95
54. Demmler GJ. Acquired cytomegalovírus infections. Textbook of Pediatric Infectious Disease. Feigin RD, Cherry JD (eds.) Philadelphia, WB Saunders Co, 3rd Ed, Vol2, 1992, 1532-1547. 55. Harris D, Riley JR. History of the Cytomegalovírus. Southern Med J, 90(2), 184-190. 56. Cui X, Meza BP, Adler SP, McVoy MA. Cytomegalovirus vaccines fail to induce epithelial entry neutralizing antibodies comparable to natural infection. Vaccine, 2008, 26: 5760-5766. 57. Bısze P., Ongrádi J. Az emberi vírusok neveinek összeállítása víruscsaládok, alcsaládok, nemzetségek, fajok stb. szerinti bontásban. Magyar Orv Nyelv, 2004, 2: 34-52. 58. Emery VC, Griffith PD. Current status review: Molecular biology of cytomegalovírus. Int J Exp Path., 1990, 71: 905-918. 59. Compton T, Nowlin DM, Cooper NR. Initiation of human cytomegalovírus infection requires initial interaction with cell surface heparan sulfate. Virology, 1993, 193: 834-841. 60. Söderberg C, Giugni TD, Zaia JA, Larsson S, Wahlberg JM és Möller S. CD13 (human aminopeptidase N) mediates human cytomegalovirus infection. J Virol, 1993, 67 (11): 6576-6585. 61. Grefte A. Dissemination of human cytomegalovírus, role of leukocytes and endothelial cells. Drukkerij van Denderen BV, Groningen, 1994: 12-17. 62. Chee MS, Bankier AT, Beck ES. Analysis of the protein coding content of the sequence of human cytomegalovírus strain AD169. Curr Top Microbiol Immunol, 1990, 154: 125-169. 63. Depto AS, Stenberg RM. Regulated expression of the human cytomegalovírus pp65 gene: octamer sequence in the promotor is required for activation by viral gene products. J Virol, 1989, 63: 1232-1238. 64. Paya CV, Razonable PR. Cytomegalovírus infection after organ transplantation. Transplant Infections. Bowden R.A., Ljungman P., Paya C.V. eds., Lippencott, Williams and Wikins, 2003: 298-325. 65. Ho M. Epidemiology of cytomegalovírus infections. Rev Infect Dis, 1990, 12 (7), 701- 710.
96
66. Hecker M, Qui D, Marquardt K, Bein G, Hackstein H. Continuous cytomegalovirus seroconversion in a large group of healthy blood donors. Vox Sang. 2004, 86: 41-44. 67. Knowles SJ, Grundy K, Cahill i, Cafferkey MT, Geary M. Low cytomegalovirus sero-prevalence in irish pregnant women. Ir Med J. 2005, 98(7): 210-212. 68. Gratacap-Cavalier B, Bosson JL, Morand P. Cytomegalovirus seroprevalence in french pregnant women: parity and place of birth as major predictive factors. J Epidemiology. 1998, 14: 147-152. 69. Staras SAS, Dollard SC, Radford KW, Flander WD, Pass RF. Seroprevalence of Cytomegalovirus infection in the United States, 1988-1994. Clin Inf Dis, 2006, 43: 1143-1151. 70. Hoshiba T, Asamoto A, Yabuki Y. Decreasing seropositivity of cytomegalovirus of pregnant woman in Japan. Jap J Clin, Medicine, 1998, 56: 193-196. 71. Natali A, Valcavi P, Medici M. Cytomegalovirus infection in the italian population. New microbiologica, 1997, 20.123-133. 72. de Ory F, Castaneda R, Ramirez R. Seroepidemiologic study of cytomegalovirus in childbearing age women in the community of Madrid. Medicina Clin, 1998, 111: 290-291. 73. Pass RF, Hutto C Group day care and cytomegalovírus infection of mothers and children. Rev Infect Dis. 1986, 8, 599-605. 74. Handsfield HH, Chandler SH, Caine VA, Meyers JD, Corey L, Medeiros E, McDougall JK. Cytomegalovírus infection in sex partners: evidence for sexual transmission. J Infect Dis, 1985, 151: 344-348. 75. Stagno S, Pass RF, Cloud G, Britt WJ, Henderson RE, Walton PD, Veren DA, Page F, Alford CA. Primary cytomegalovírus infection in pregnancy. Incidence, transmission to fetus, and clinical outcome. JAMA 1986, 256: 1904-1908. 76. Ho M. Infection and organ transplantation. Gelman S ed. Anesthesia and organ transplantation. Philadelphia. W.B. Saunders, 1987: 49-60. 77. Preiksaitis JK, Brown L, Mc Kenzie M. The risk of cytomegalovírus infection in seronegative transfusion recipients not receiving exogenous immunosuppression. J Infect Dis, 1988, 157: 523-529.
97
78. Mynster T, Dybkjaer E, Reimert CM, Pedersen AN, Ostergaard K, Vangsgaard K, Nielsen HJ. Prestorage leukofiltration of whole blood and SAGM blood prevents extracellular bioactive substance accumulation. Inflamm Res. 1999, 48(7): 363-368. 79. Vörösvértest-készítmények: új lehetıségek a vérkészítmény-elıállításában. Kórház, 2005, 6: 50-53. 80. Fowler KB, Dahle AJ, Boppana SB, Pass RF. Newborn hearing screening: will children with hearing loss caused by congenital cytomegalovírus infection be missed?. J Pediatr. 1999, 135: 60-64. 81. Schleiss MR, McVoy MA. Overview of congenitally and perinatally acquired cytomegalovírus infections: recent advances in antiviral therapy. Expert Rev Anti Infect Ther. 2004, 2(3):389-403. 82. Petrovicz E. Cytomegalovirus-mononucleosis. LAM, 2000, 10(6-8): 585-591. 83. Betjes MGH, Litjens NHR, Zietse R. Seropositivity for cytomegalovírus in patients with end-stage renal disease is strongly associated with atherosclerotic disease. Nephrol Dial Transplant. 2007, 22: 3298-3303. 84. Kylat RI, Kelly EN, Ford-Jones EL. Clinical findings and adverse outcome in neonates with symptomatic congenital cytomegalovirus (SCCMV) infection. Eur J Pediatr, 2006, 165(11): 773-778. 85. Galiano MC, Videla CM, Sánchez Puch S, Carballal G. Cytomegalovírus isolation by conventional cell culture and shell vial assay. Medicina, 2001, 61: 825-829. 86. Pancholi P, Wu F, Della-Latta P. Rapid detection of cytomegalovírus infection in transplant patients. Expert Rev Mol Diagn, 2004, 4(2): 231-242. 87. Hackman RC, Myerson D, Meyers JD, Shulman HM, Sale GE Goldstein LC. Rapid diagnosis of cytomegaloviral pneumonia by tissue immunofluorescence with a murine monoclonal antibody. J Infect Dis. 1985, 151, 325-330. 88. Schrim J, Timmerje W, van der Bij W, The TH, Wilterdink JB, Tegzess AM, van Son WJ, Schröder FP. Rapid detection of infectious cytomegalovírus in blood with the aid of monoclonal antibodies. J Med Virol, 1987, 23: 31-40. 89. The TH, Van der Bij W, Van der Berg AP, van der Giessen M, Weits J, Sprenger HG, van Son WJ. Cytomegalovírus antigenemia. Reviews Inf Dis, 1990, 12(7): 737-744.
98
90. The TH, Van der Ploeg M, van der Berg AP, Vlieger AM, van der Giessen M, van Son WJ. Direct detection of cytomegalovírus in peripherial blood leukocytes – a review of the antigenemia assay and polymerase chain reaction. Transplantation. 1992, 54, 193-198. 91. Mullis KB, Faloona FA. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerasecatalyzed chain reaction. Methods Enzymol, 1987,155: 335-350. 92. Razonable RR, Paya CV, Smith TF. Role of the Laboratory in Diagnosis and Management of Cytomegalovirus Infection in Hematopoietic Stem Cell and SolidOrgan Transplant Recipients. J Clin Microbiol, 2002, 40: 746-752. 93. Pellegrin I, Garrigue I, Ekouevi D, Couzi L, Merville P, Merel P, Chene G, Schrive MH, Trimoulet P, Lafon ME, Fleury H. New molecular assays to predict occurrence of cytomegalovirus disease in renal transplant recipients. 2000, J Infect Dis, 182: 36-42. 94. Keightley MC, Rinaldo C, Bullotta A, Dauber J, St George K. Clinical utility of CMV early and late transcript detection with NASBA in bronchoalveolar lavages. J Clin Virol, 2006, 37(4): 258-264. 95. Mazzulli T, Drew LW, Yen-Lieberman B, Jekic-McMullen D, Kohn DJ, Isada C, Moussa G, Chua R, Walmsley S. Multicenter comparison of the digene hybrid capture CMV DNA assay (version 2.0), the pp65 antigenemia assay, and cell culture for detection of cytomegalovirus viremia. J Clin Microbiol, 1999, 37: 958-963. 96. Baccardi-Longere M. Multicenter evaluation of a rapid and convenient method for determination of cytomegalovirus immunoglobulin G avidity. Clin Diagn Lab Immunol, 2001, 8: 429-431. 97. Naumnik B, Małyszko J, Chyczewski L, Kovalchuk O, Małyszko J, Myśliwiec M. Comparison of serology assays and polymerase chain reaction for the monitoring of active cytomegalovírus infection in renal transplant recipients. Transplant Proc, 2007, 39(9): 2748-2750. 98. Wills MR, Carmichael AJ, Mynard K, Jin X, Weekes MP, Plachter B, Sissons JG. The human cytotoxic T-lymphocyte (CTL) response to cytomegalovírus is dominated by structural protein pp65: frequency, specificity, and T-cell receptor usage of pp-65-specific CTL. J Virol, 1996, 70: 7569-7579.
99
99. Engstrand M, Tournay C, Peyrat MA, Eriksson BM, Wadström J, Wirgart BZ, Romagné F, Bonneville M, Tötterman TH, Korsgren O. Characterization of CMVpp65-specific CD8+ T lymphocytes using MHC tetramers in kidney transplant patients and healthy participants. Transplantation, 2000, 69(11): 2243-2250 100. Westall GP, Mifsud NA, Kotsimbos T. Linking CMV serostatus to episodes of CMV reactivation following lung transplantation by measuring CMV-specific CD8+ T-cell immunity. Am J Transplant, 2008, 8(8):1749-1754. 101. Grundy JE, Lui SF, Super M. Symptomatic cytomegalovirus infection in seropositive kidney recipients: reinfection with donor virus rather than reactivation of recipient virus. Lancet, 1988, 2: 132-135. 102. Reinke P, Prosch S, Kern F. Mechanism of human cytomegalovirus (HCMV) (re)activation and its impact on organ transplant patients. Transpl Infect Dis, 1999, 1: 157-164. 103. Rubin RH, Reusser P. Pocket Pharma: Valganciclovir and cytomegalovirus infection. Science Press. London, 2002, 5-10, 39. 104. Matloubian M, Concepcion RJ, Ahmed R. CD4+ T cells are required to sustain CD8+ cytotoxic T-cell responses during chronic viral infection. J Virol, 1994, 68: 8056-8063). 105. Streblow DN, Vomaske J, Smith P, Melnychuk R, Hall L, Pancheva D, Smit M, Casarosa P, Schlaepfer DD, Nelson JA.Human cytomegalovirus chemokine receptor US28-induced smooth muscle cell migration is mediated by focal adhesion kinase and Src. J Biol Chem, 2003, 278(50): 50456-50465. 106. Cervera C, Filelia X, Linares L, Pineda M, Esteva C, Anton Á, Marcos MA, Cofán F, Navasa M, Pérez-Villa F, Pumarola T, Moreno A. TH1/TH2 cytokine release pattern during in vivo cytomegalovirus disease in solid organ transplantation. Transplant Proc, 2007, 39(7):2233-2235 107. Speir E, Modali R, Huang ES. Potential role of human cytomegalovirus and p53 interaction in coronary restenosis. Science, 1994, 265: 391-394. 108. Gredmark S, Strååt K, Homman-Loudiyi M. Human cytomegalovirus downregulates expression of receptors for platelet-derived growth factor by smooth muscle cells. J Virol, 2007, 8: 5112-5120.
100
109. Valantine HA. The role of viruses in cardiac allograft vasculopathy. Am. J. Transplant, 2004, 4: 169-177. 110. Grundy JE, Lawson KM, MacCormac LP, Fletcher JM, Yong KL. Cytomegalovirus-infected endothelial cells recruit neutrophils by the secretion of CX-C chemokines and transmit virus by direct neutrophil-endothelial cell contact and during neutrophil transendothelial migration. J Infect Dis, 1998, 177(6): 1465-1474. 111. Speir E. Cytomegalovirus gene regulation by reactive oxygen species: agents in atherosclerosis. Ann. NY Acad. Sci. 2000, 899: 363-374. 112. Grefte A, van der Giessen M, van Son W. Circulating cytomegalovirus (CMV)-infected endothelial cells in patients with an active CMV infection. J Infect Dis. 1993, 167: 270-277. 113. Mocarski ES Jr. Immunomodulation by cytomegaloviruses: manipulative strategies beyond evasion. Trends Microbiol, 2002, 10(7): 332-339. 114. Barnes PD, Grundy JE. Down-regulation of the class I HLA heterodimer and beta 2-microglobulin on the surface of cells infected with cytomegalovirus. J Gen Virol, 1992, 73(9): 2395-2403. 115. Gewurz BE, Gaudet R, Tortorella D, Wang EW, Ploegh HL. Virus subversion of immunnity: a structural perspective. Curr Opin Immunol. 2001, 18: 861-926. 116. Addo MM, Rosenberg ES: Cellular immun responses in transplantationassociated chronic viral infections. Transplant Infect Dis, 2002, 4: 31-40. 117. Kubota A, Kubota S, Farrel HE, Davis-Pointer N, Takei F. Inhibition of NK cells by murine CMV-encoded class I MHC homologue m144. Cell Immunol. 1999, 191: 145-151. 118. Castens J, Andersen HK, Spencer E. Cytomegalovirus infection in renal transplant recipients. Transpl. Infect. Dis, 2006, 8: 203-212. 119. Czebe K, Antus B, Varga M és Csiszér E. Tüdıtranszplantált betegek pumonális infekciói. Orv Hetil, 2008, 149: 99-109. 120. Humar A, Mazzulli T, Moussa G. Clinical utility of cytomegalovirus (CMV) serology testing in high-risk CMV D+/R- transplant recipients. Am. J. Transplant. 2005, 5: 1065-1070.
101
121. Preiksaitis JK, Brennan DC, Fishman J. Canadian society of transplantation consensus workshop on cytomegalovirus management in solid organ transplantation final report. Am. J. Transplant, 2005, 5: 218-227. 122. Blackwell Munksgaard. Cytomegalovirus. Am. J. Transplant, 2004, 4: 51-58. 123. Reischig T, Jindra P, Mares J. Valacyclovir for Cytomegalovirus prophylaxis reduces the risk of acute renal allograft rejection. Transplantation, 2005, 79: 317324. 124. Freeman RB, Paya C, Pescovitz MD. Risk factors for cytomegalovirus viremia and disease developing after prophylaxis in high-risk solid-organ transplant recipients. Transplantation, 2004, 78: 1765-1773. 125. Fan J, Meng XQ, Yang MF. Association of cytomegalovirus infection with human leukocyte antigen
genotypes in recipients after allogeneic liver
transplantation. Hepatobiliary Pancreat. Dis. Int, 2006, 5: 34-38. 126. Chen Y, Rocha V, Bittencourt H. Relationship between HLA alleles and cytomegalovirus infection after allogenic hematopoietic stem cell transplant. Blood, 2001, 96: 500-501. 127. Ljungman P, Griffith P, Paya C. Definitions of cytomegalovirus infection and disease in transplant recipients. Clin. Infect. Dis, 2002, 34: 1094-1097. 128. Ozdemir BH, Sar A, Uyar P, Suren D, Demirhan B, Haberal M. Posttransplant tubulointerstitial nephritis: clinicopathological correlation. Transplant Proc. 2006, 38(2): 466-469. 129. Maschke M, Kastrup O, Diener HC. CNS manifestations of cytomegalovirus infections: diagnosis and treatment. CNS Drugs, 2002,16(5):,303-315. 130. Magro CM, Crowson AN, Ferri C. Cytomegalovirus-associated cutaneous vasculopathy and scleroderma sans inclusion body change. Hum Pathol, 2007, 38(1): 42-49. 131. Emery V. Facing the facts: the indirect effects of Cytomegalovirus. Transplantation, 2007, 84: 7-10. 132. Sagedal S, Hartmann A, Nordal KP. Impact of early cytomegalovirus infection and disease on long-term recipient and kidney graft survival. Kidney Int, 2004, 66: 329-337.
102
133. Boeckh M, Nichols WG. Immunsuppressive effects of beta-herpesviruses. Herpes, 2003, 10: 12-16. 134. Grattan MT, Moreno-Cabral CE, Starnes VA. Cytomegalovirus infection is associated with cardiac allograft rejection and athrosclerosis. JAMA, 1989, 261: 3561-3566. 135. Martelius T, Krogerus L, Hockerstedt K. Cytomegalovirus infection is associated with increased inflammation and severe bile duct damage in rat liver allografts. Hepatology, 1998, 27: 996-1002. 136. Söderberg-Nauclér C. Does cytomegalovirus play a causative role in the development of various inflammatory diseases and cancer? J Intern Med, 2006, 259: 219-246. 137. Fishman JA, Emery V, Freeman R, Pascual M, Rostaing L, Schlitt HJ, Sgarabotto D, Torre-Cisneros J, Uknis ME. Cytomegalovirus in transplantation challenging the status quo. Clin Transplant. 2007 Mar-Apr;21(2):149-58. 138. Hjelmesaeth J, Sagedal S, Hartmann A. Asymptomatic cytomegalovirus infection is associated with increased risk of new-onset diabetes mellitus and impaired release after renal transplantation. Diabetologia, 2004, 47: 1550-1556. 139. Schnitzler MA. Costs and consequences of cytomegalovirus disease. Am. J. Health. Syst. Pharm, 2003, 60: 5-8. 140. Schnitzler MA, Lowell JA, Hardinger KL. The association of cytomegalovirus sero-pairung with outcomes and costs following cadaveric renal transplantation prior to the introduction of oral ganciclovir CMV prophylaxis. Am. J. Transplant, 2003, 3: 445-451. 141. Varga M, Remport Á, Czebe K., Péter A., Toronyi É., Sárváry E., Fehérvári I., Sulyok B., Járay J. Cytomegalovirus fertızés rizikó-faktorai, hatásai és a megelızés lehetıségei transzplantációt követıen. Orv Hetil, 2008, 12: 549-556. 142. Ziemann M, Krueger S, Maier AB, Unmack A, Goerg S, Hennig H. High prevalence of cytomegalovirus DNA in plasma samples of blood donors in connection with seroconversion. Transfusion, 2007, 47(11): 1972-1983. 143. Paston SJ, Dodi IA, Madrigal JA. Progress made towards the development of a CMV peptide vaccine. Human Immunology, 2004, 65: 544-549.
103
144. Gönczöl É, Plotkin S. Development of a cytomegalovirus vaccine: Lessons from recent clinical trials. Expert. Opin. Biol. Ther, 2001, 1: 401-412. 145. Sudarsanam TD, Sahni RD, John GT. Leflunomide: a possible alternative for ganciclovir sensitive and resistant cytomegalovirus infections. Postgrad Med J, 2006, 82: 313-314. 146. O'Brien JJ, Campoli-Richards DM. Acyclovir. An updated review of its antiviral activity, pharmacokinetic properties and therapeutic efficacy. Drugs, 1989, 37(3): 233-309. 147. Biron KK, Stanat SC, Sorrell JB, Fyfe JA, Keller PM, Lambe CU, Nelson DJ. Metabolic
activation
of
the
nucleoside
analog
9-[(
2-hydroxy-1-
(hydroxymethyl)ethoxy]methyl)guanine in human diploid fibroblasts infected with human cytomegalovírus. Proc Natl Acad Sci USA, 1985, 82(8): 2473-2477. 148. Mousavi-Jazi M, Schloss L, Drew WL, Linde A, Miner RC, Harmenberg J, Wahren B, Brytting M. Variations in the cytomegalovírus DNA polymerase and phosphotransferase genes in relation to foscarnet and ganciclovir sensitivity. J Clin Virol, 2001, 23(1-2): 1-15. 149. Holy A. Phosphonomethoxyalkyl analogs of nucleotides. Curr Pharm Des, 2003, 9(31): 2567-2592. 150. Drew WL, Miner RC, Marousek GI, Chou S. Maribavir sensitivity of cytomegalovírus isolates resistant to ganciclovir, cidofovir or foscarnet. J Clin Virol, 2006, 37 (2): 24-27. 151. Franchetti P, Grifantini M. Nucleoside and non-nucleoside IMP dehydrogenase inhibitors as antitumor and antiviral agents. Curr Med Chem, 1999, 6: 599-614. 152. Neyts J, Andrei G, DeClerq E. The novel immunosuppressive agent mycophenolate mofetil markedly potentiates zhe antiherpesvirus activities of acyclovir, ganciclovir and penciclovir in vitro and in vivo. Antimicrob Agents chemother, 1998, 43: 216-222. 153. Mita MM, Mita A, Rowinsky EK. The molecular target of rapamycin (mTOR) as a therapeutic target against cancer. Cancer Biol Ther, 2003, 2: 169-177. 154. Hong JC, Kahan BD. Immunosuppressive agents in organ transplantation: past, present, and future. Semin Nephrol, 2000, 20: 108-125.
104
155. Kovarik JM, Kahan BD, Rajagopalan PR, Bennett W, Mulloy LL, Gerbeau C, Hall ML. Population pharmacokinetics and exposure-respons relationships for basiliximab in kidney transplantation. The U.S. Simulect Renal Transplant Study group. Transplantation, 1999, 68: 1288-1294. 156. Abou-Ayache R, Büchler M, Lepogamp P, Westeel PF, Le Meur Y, Etienne I, Lobbedez T, Toupance O, Caillard S, Goujon JM, Bergougnoux L, Touchard G. CMV infections after two doses of daclizumab versus thymoglobulin in renal transplant patients receiving mycophenolate mofetil, steroids and delayed cyclosporine A Nephrol Dial Transplant, 2008, 23(6): 2024-2032. 157. Bourdage JS, Hamlin DM. Comparative polyclonal antithymocyte globulin and antilymphocyte/antilymphoblast globulin anti-CD antigen analysis by flow cytometry. Transplantation, 1995, 59: 1194-1200. 158. Weber U, Pfirrmann CW, Kissling RO, Mackenzie CR, Khan MA. Early spondyloarthritis in an HLA-B27-positive monozygotic twin pair: A highly concordant onset, sites of involvement, and disease course. J Rheumatol, 2008, 35(7): 1464-1466. 159. Jores RD, Frau F, Cucca F, Grazia Clemente M, Orrù S, Rais M, De Virgiliis S, Congia M.HLA-DQB1*0201 homozygosis predisposes to severe intestinal damage in celiac disease. Scand J Gastroenterol. 2007 Jan;42(1):48-53. 160. Morran MP, Omenn GS, Pietropaolo M. Immunology and genetics of type 1 diabetes. Mt Sinai J Med. 2008, 75(4): 314-327. 161. Cruz-Robles D, Reyes PA, Monteon-Padilla VM, Ortiz-Muniz AR, VargasAlarcon G. MHC class I and class II genes in Mexican patients with Chagas disease. Hum Immunol, 2004, 65(1): 60-65. 162. Winchester R, Charron D, Louie L. The role of HLA in influencing the time of development of a particular outcome of HIV-1 infection. Genetic diversity of HLA functional and medical implication. Paris, France, Charron D. EDK Publisher, 1997: 423-428. 163. Goldstein DB. Genomics and biology come together to fight HIV. 2008, PLoS Biol, 6(3): 76. 164. Retiere C, Lesimple B, Lepelletier D, Bignon JD, Hallet MM, Imbert-Mercille BM. Association of glycoprotein B and immediate early-1 genotypes with human
105
leukocyte antigen alleles in renal transplant recipients with cytomegalovirus infection. Transplantation, 2003, 75(1): 161-164. 165. Hodge WG, Boivin JE, Shapiro SH, Lalonde RG, Shah KC, Murphy BD, DiazMitoma F. Laboratory-based risk factors for cytomegalovirus retinitis. Can J Ophtalmol, 2004, 39: 733-745. 166. Fan J, Meng XQ, Yang MF, Chen XM, HU MJ, Fan WW, Ma WH, Li LJ. Association of cytomegalovirus infection with human leukocyte antigen genotypes in recipients after allogeneic liver transplantation. Hepatobiliary Pancreat Dis Int, 2006, 5: 34-38. 167. Roenhorst HW, Tegzess AM, Beelen JM, Middeldorp JM, The T. HLA-DRw6 as a risk factor for active cytomegalovirus but not for herpes simplex virus infection after renal allograft transplantation. BMJ, 1985, 291: 619-621. 168. Boland GJ, Hene RJ, Ververs C, de Haan MA, de Gast GC. Factors influencing the occurrence of active CMV infection after organ transplantation. Clin. Exp. Immunol, 1993; 94: 306-312. 169. Yamada S, Takatsuka H, Takemoto Y, Okamoto T, Fujimori Y, Tamura S, Wada H, Okada M, Kanamaru A, Kakisita E. Association of cytomegalovirus interstitial pneumonitis with HLA-type following allogeneic bone marrow transplantation. Bone Marrow Transplantation 2000, 25: 861-865. 170. Gomez E, Aguado S, Melon S, Gonzales E, Alvarez-Grande J. Absence of association between HLA-DR7 and cytomegalovirus infection in renal transplant patients. The Lancet, 1993, 341: 1480-1481. 171. Kraat YJ, Christiaans MH, Nieman FH et al. Risk factors for cytomegalovirus infection and disease in renal transplant recipients: HLA-DR7 and triple therapy. Transplant International, 1994; 7: 362-367. 172. Chen Y, Rocha V, Bittencourt H et al. Relationship between HLA alleles and cytomegalovirus infection after allogenic hematopoietic stem cell transplant. Blood, 2001, 96 (2): 500-501. 173. Baillie GM. Prevention of cytomegalovirus disease in solid organ transplant patients: Prophylactic versus preemptive therapy Am. J. Health-Syst. Pharm, 2006, 63: 10-18.
106
174. Van der Bij W. Cytomegalovirus-antigenemia: a new marker of active cytomegalovirus infection. Drukkerij Van Denderen BV, Groningen, 1989. 175. Schrim J, Timmerje W, Van der Bij W. Rapid detection of infectious cytomegalovirus in blood with the aid of monoclonal antibodies. J Med Virol, 1987, 23: 31-34. 176. Koller M. Production and characterization of CMV-specific monoclonal antibodies. European Society against Virus Diseases and European group for Rapid Viral Diagnosis. The Joint meeting in Davos, 1978. 177. Gentile G, Picardi A, Capobianchi A, Spagnoli A, Cudillo L, Dentamaro T, Tendas A, Cupelli L, Ciotti M, Volpi A, Amadori S, Martino P, de Fabritiis P. A prospective study comparing quantitative Cytomegalovirus (CMV) polymerase chain reaction in plasma and pp65 antigenemia assay in monitoring patients after allogeneic stem cell transplantation. BMC Infect Dis, 2006, 21: 167-173. 178. Ksouri H, Eljed H, Greco A, Lakhal A, Torjman L, Abdelkefi A, Ben Othmen T, Ladeb S, Slim A, Zouari B, Abdeladhim A, Ben Hassen A. Analysis of cytomegalovirus (CMV) viremia using the pp65 antigenemia assay, the amplicor CMV test, and a semi-quantitative polymerase chain reaction test after allogeneic marrow transplantation. Transpl Infect Dis, 2007, 9(1): 16-21. 179. Racusen LC, Solez K, Colvin RB. The Banff 97 working classification of renal allograft pathology. Kidney Int, 1999, 55: 713-723. 180. Staff I. NIH lymphocyte microcytotoxicity technique. Manual of Tissue Typing Technique. Bethesda, 1976, 22-24. 181. Van Rood JJ, van Leeuwen A, Keuning JJ, Blusse van Oud AA. The serological recognition of the human MLC determinants using a modified cytotoxicity technique. Tissue Antigens 1975. 5: 73-79. 182. Olerup O, Zetterquist H. HLA-DR typing by PCR amplification with sequence-specific primers (PCR-SSP) in two hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor-recipient matching in cadaveric transplantations. Tissue Antigens, 1992, 39: 225-232. 183. Varga M., Görög D., Kári D., Fazakas J, Sárváry E., Sulyok B. és Perner F. Szervdonorok virológiai szőrése és a hazai lakosság átfertızöttsége humán cytomegalovírussal. Orv Heti Lap, 2001, 47: 2631-2633.
107
184. Staras SAS, Dollard SC, Radford KW, Flander WD, Pass RF. Seroprevalence of Cytomegalovirus infection int he United States, 1988-1994. Clin Inf Dis, 2006, 43: 1143-1151. 185. Burián K, Endrész V, Gönczöl É. Cytomegalovirus–fertızések jelentısége Magyaroszágon. Transzfúzió, 1997, 30: 159-65. 186. Pethı E, Geiger J. Adatok a lakosság Cytomegalo-, Epstein Barr vírus és Toxoplasma fertızöttségéhez. Transzfúzió, 1996, 29: 5-7. 187. Bácskay A, Bukodi E, Dóra I, Falussy B, Hablicsek L, Kapitány G, Keszthelyiné RM, Lakatos M, Paksy A, Salmin P, Vavró I: Idıskoruak Magyarországon. KSH, Giczi Johanna szerk., 2004, 28. 188. Kwiatkowski DP. How malaria has affected the human genome and what human genetics can teach us about malaria. Am J Hum Genet, 2005, 77(2): 171-192. 189. Varga M, Remport Á, Hídvég M, Péter A, Kóbori L, Telkes G, Fazakas J, Gerlei Zs, Sárváry E, Sulyok B, Járay J: Comparing cytomegalovirus prophylaxis in renal transplantation: single centre experience. Transpl. Infect. Dis, 2005, 7: 63-67. 190. Bhatia J, Shah BV, Mehta AP, Deshmukh M, Sirsat RA, Rodriges C. Comparing serology, antigenemia assay and polymerase chain reaction for the diagnosis of cytomegalovírus infection in renal transplant patients. JAPI, 2004, 52: 297-300. 191. Paya CV, Wold AD, Smith TF. Detection of cytomegalovirus infections in specimens other than urine by the shell vial assay and conventional tube cell cultures. J Clin Microbiol, 1987, 25: 755-757. 192. Sia IG, Wilson JA, Groettum CM, Espy MJ, Smith TF, Paya CV. Cytomegalovirus (CMV) DNA load predicts relapsing CMV infection after solid organ transplantation. J Infect Dis, 2000, 181: 717-720. 193. Mendez JC, Espy MJ, Smith TF, Wilson JA, Paya CV. Evaluation of PCR primers for early diagnosis of cytomegalovirus infection following liver transplantation. J Clin Microbiol, 1998, 36: 526-530. 194. Griffith PD, Whitley RJ (ed.). Recommendations from the IHMF Management Strategies Workshop and 8th Annual Meeting of the IHMF. The challenge of CMV infection and disease in transplantation. 2000, Cambridge Medical Publications, Worthing, United Kingdom.
108
195. Allice T, Cerutti F, Pittaluga F, Varetto S, Franchello A, Salizzoni M, Ghisetti V. Evaluation of a novel real-time PCR system for cytomegalovirus DNA quantitation on whole blood and correlation with pp65-antigen test in guiding preemptive antiviral treatment. J Virol Methods, 2008,148(1-2): 9-16. 196. Fica A, Cervera C, Pérez N, Marcos MA, Ramirez J, Linares L, Soto G, Navasa M, Cofan F, Ricart MJ. Immunohistochemically proven cytomegalovirus end-organ disease in solid organ transplant patients: clinical features and usefulness of conventional diagnostic tests. Transpl Infect Dis, 2007, 9(3): 203-210. 197. Ludwig E. Klinikai Irányelvek Kézikönyve, Diagnosztikai és terápiás ajánlások az infektológia területérıl. Infektológiai Útmutató, 2005, 21-22. 198. Sagedal S, Rollag H, Hartmann A. Cytomegalovirus infection in renal transplant recipients is associated with impaired survival irrespective of expected mortality risk. Clin. Transplant, 2007, 21: 309-313. 199. Pescovitz MD. A cost too high to bear? Prophylaxis versus preemptive therapy to prevent post-transplantation cytomegalovirus. Kidney Int, 2007, 72: 912-913. 200. Humar A. Cytomegalovirus prevention: prophylaxis and pre-emptive therapy. Transplantation, 2007, 84, 11-14. 201. Brown JJ, Ollier W, Thomson W, Bayat A. Positive association of HLADRB1*15 with Dupuytren's disease in Caucasians. Tissue Antigens, 2008, 72(2): 166-70. 202. Lukacsi A, Tarodi B, Endreffy E, Babinszki A, Pal A, Pusztai R. Human cytomegalovirus gB genotype 1 is dominant in congenital infections in South Hungary. J Med Virol, 2001, 65(3): 537-542. 203. Varga M, Rajczy K, Telkes G, Hídvégi M, Péter A, Remport A, Korbonits M, Fazakas J, Toronyi E, Sárváry E, Kóbori L, Járay J. HLA-DQ3 is a probable risk factor for CMV infection in high-risk kidney transplant patients. Nephrol Dial Transplant, 2008, 23(8): 2673-2678. 204. Wada K, Mizuno S, Ohta H, Nishiyama Y. Immune response to neutralizing epitope on human cytomegalovirus glycoprotein B in Japanise: correlation of serologic response with HLA-type. Microbiol Immunol, 1997, 41(10): 841-845. 205. Miller DM, Rahill BM, Boss JM, Lairmore MD, Durbin JE, Waldman WJ, Sedmak DD. Human Cytomegalovirus inhibits major Histocompatibilits Complex
109
Class II expression by disruption of the Jak/STAT pathway. J Exp Med., 1998, 187: 675-683. 206. Michelson S. Human Cytomegalovirus escape from immune detection. Intervirology, 1999, 42: 301-307. 207. Telenti A, Goldstein DB. Genomics meets HIV-1. Nat Rev Microbiol, 2006, 4(11): 865-873.
110
11.
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE
11.1 A Doktori értekezéshez kapcsolódó közlemények 1. Péter A, Telkes G, Varga M, Járay J. A gastrointestinális traktus cytomegalovirus-fertızése szervtranszplantált betegeken. Orv Hetil, 2008, 149(52): 2475-2482. 2. Varga M, Remport Á, Czebe K, Péter A, Toronyi É, Sárváry E, Fehérvári I, Sulyok B, Járay J. Cytomegalovirus infection after solid-organ transplantation, its risk factors, direct and indirect effects and prevention strategies. Orv Hetil. 2008, 149(12): 551-558. 3.
Telkes G, Rajczy K, Varga M, Péter A, Tulassay Zs. Seroprevalence of
Helicobacter pylori in Central-European uraemic patients and its possible association with presence of HLA-DR12 allele. Eu J Gastroent and Hep, 2008, 20(9): 906-911. IF: 1.830 4. Varga M, Rajczy K, Telkes G, Hídvégi M, Péter A, Remport A, Korbonits M, Fazakas J, Toronyi E, Sárváry E, Kóbori L, Járay. J. HLA-DQ3 is a probable risk factor for CMV infection in high-risk kidney transplant patients. Nephrol Dial Transplant, 2008, 23(8): 2673-2678. IF: 3.167 5. Czebe K, Antus B, Varga M, Csiszér E. Pulmonary infections after lung transplantation. Orv Hetil. 2008, 20,149(3):99-109. 6. Varga M, Remport A, Hidvegi M, Peter A, Kobori L, Telkes G, Fazakas J, Gerlei Z, Sarvary E, Sulyok B, Jaray J. Comparing cytomegalovirus prophylaxis in renal transplantation: single center experience. Transpl Infect Dis, 2005, 7(2):63-67. 7. Gerlei Zs, Gálffy Zs, Varga M, Doros A, Remport Á, Fazakas J, Ther G, Járay J. A SE Transzplantációs és Sebészeti Klinikán 2003-ban területen szerzett pneumonia miatt vesetranszplantált betegek retrospectiv vizsgálata. Klinikai mikrobiológia és infektológia, 2005, 13-16. 8. Peter A, Telkes G, Varga M, Sarvary E, Kovalszky I. Endoscopic diagnosis of cytomegalovirus infection of upper gastrointestinal tract in solid organ transplant recipients: Hungarian single-center experience. Clin Transplant. 2004, 18(5): 580584.
111
IF: 1.923 9. Fazakas J, Gondos T, Varga M, Sarvary E, Horovitz P, Perner F. Analysis of systemic and regional procalcitonin serum levels during liver transplantation. Transpl Int. 2003, 16(7): 465-470. IF: 1.204 10. Varga M, Görög D, Kari D, Fazekas J, Sarvary E, Sulyok B, Perner F. Viral screening of organ donors and human cytomegalovirus seroprevalence in the Hungarian population. Orv Hetil, 2001, 142(47): 2631-2633. 11. Fazakas J, Varga M, Horovitz P, Sárváry E, Gondos T. Procalcitonin – mint diagnosztikai marker – jelentısége a transzplantációs medicinában. Focus medicinae, 2001,1: 17-21. 12. Varga M, Járay Jenı, Xie Jiuru, Szasztay Ágnes, Berencsi Gy. A tartósan immunkárosodott betegek vírus eredető fertızései, és a diagnosztika problémái. Egészségtudomány, 1997, 4: 310-324. 13. Jákics
J,
Gálffy
Zs,
Varga
M.
Az
infektológia
szerepe
a
szervtranszplantációkban. Magyar Sebészet, 1997: 50, 309-312. 14. Varga M, Koller M, Visontai I, Berencsi Gy, Bánrévi A. Human cytomegalovírus, its significance in immune deficiency states, laboratory diagnosis, therapeutic possibilities. Orv Hetil, 1993, 134(45): 2467-2472. 11.2 A Doktori értekezéstıl független közlemények 1. Kolozsi T, Mihály I, Molnár P, Lukács A, Németh Cs, Varga M. Az immunfluorescens jelzéső direkt víruskimutatás lehetıségei és jelentısége a klinikai virológiában. Klinikai mikrobiológia és infektológia, 2008, 1: 19-23. 2. Sárváry E, Nemes B, Gerlei Z, Gaál I, Blázovics A, Görög D, Czabai G, Dinya E, Máthé Z, Varga M, Fehérvári I, Perner F, Sulyok B, Pallai Z, Járay J. Investigation of redox homeostasis in liver and renal transplant recipients. Orv Hetil. 2008, 149: 509-15. 3.
Fehérvári I, Görög D, Kóbori L, Varga M, Sárvári E, Gerlei Z, Nemes B.
Hepatitis B and liver transplantation. Orv Hetil, 2007, 148(28): 3-7. 4. Nemes B, Sarvary E, Kobori L, Gerlei Z, Fehervari I, Gorog D, Perner F, Ther G, Varga M, Szonyi L, Telegdy L, Schuller J, Weszelits V, Jaray J. The demographic,
112
perioperative and mortality characteristics of the Hungarian. Orv Hetil. 2005, 146(27): 1423-32. 5.
Sarvary E, Nagy P, Benjamin A, Szoke M, Remport A, Jansen J, Nemes B,
KoboriL, Fehervari I, Sulyok B, Perner F, Varga M, Fazakas J, Lakatos M, Szabo M, Toth A, Jaray J. Mutation scanning of the p53 tumor suppressor gene in renal and liver transplant patients in Hungary. Transplant Proc. 2005, 37(2): 969-972. IF: 0.799 6. Lengyel G, Kóbori L, Fehérvári I, Nemes B, Görög D, Patonai A, Sárváry E, Varga M, Hagymási K, Perner F, Fehér J, Tulassay Zs. Combined interferon-alpha2b and ribavirin therapy in patients with recurring chronic hepatitis C (genotype 1) following transplantation in Hungary. Arch Med Sci, 2005, 1: 8-12. 7. Kóbori L, Szınyi L, Gerlei Zs, Sárváry E, Varga M, Görög D, Fehérvári I, Nemes B, Szabó J. Májátültetés gyermekkorban Magyarországon. Sebészeti vonatkozásaok. Gyermekgyógyászat, 2004, 5: 574-577. 8.
Lengyel G, Kobori L, Fehervari I, Nemes B, Gorog D, Patonai A, Sarvary E,
Varga M, Perner F, Feher J. Kombinált interferon-alfa-2b és ribavirin terápia májtranszplantációt követı krónikus C-hepatitisben. Orv Hetil, 2003, 144(48): 2367-2370. 9. Dénes Z, Varga M. Poliomyelitis and the post-polio syndrome. Orv Hetil. 2001, 15, 142(28): 1493-1496. 10. Sarvary E, Varga M, Nemes B, Kobori L, Zalka A, Sulyok B, Gorog D, Fehervari I, Jaray J, Halmos O, Alfoldy F, Toth A, Lakatos M, Perner F. Qualitative and quantitative detection of hepatitis C virus RNA by PCR technique. Monitoring of viral copies after liver transplantation. Orv Hetil, 2001, 142(18): 939-942. 11. Sarvary E, Nemes B, Jaray J, Dinya E, Borka P, Varga M, Sulyok B, Remport A, Toth A, Perner F. Prediction of early renal graft function by the measurement of donor urinary glutathione S-transferases. Transplantation. 2000, 69(7): 1397-1402. IF: 4.035 12. Sarvary E, Blazovics A, Varga M, Sulyok B, Jaray J, Lakatos M, Perner F. Diagnostic value of glutathione-S-transferase. Orv Hetil, 1998, 21, 139(25): 15311537.
113
13. Nemes L, Cegledi A, Szabo G, Varga M, Sas G. Clinical evaluation of factors VIII and IX manufactured in Hungary, based on results of the first half year. Orv Hetil, 1998, 139(13): 749-752. 14. Varga M, Sarvary E, Sulyok B, Perner F. Follow-up on alpha-glutathione-Stransferase serum level following liver transplantation. Orv Hetil, 1997, 16, 138(7): 413-416. 15. Berencsi G., Brojnás J, Ferenczi E, Jankovics I, Mezey I, Varga M. Miben tud segíteni a virológus a családorvosnak?. Háziorvos Továbbképzı Szemle, 1996, 1: 421-422.
11.3 Könyvfejezetek 1. Berencsi Gy. Orvosi Molekuláris Virológia. Az immunhiányos egyének és betegek virológiai problémái. Convention Budapest Kft, Budapest, 2004, 343-349. 2.
Ludwig E. Infektológiai Útmutató 2005, Klinikai Irányelvek Kézikönyve,
Medition Kiadó, Budapest, 2005, 21.
11.4 Folyóiratokban megjelent absztraktok 1. Nemes B, Nagy P, Lengyel G, Sárváry E, Gerlei Zs, Varga M és mtsai. Cholestatikus típusú C vírus kiújulás májátültetés után. A differenciáldiagnózis nehézségei. Folia Hepatologica, 2008, 12 (S.1), 20. 2. Sárváry E, Gerlei Zs, Nemes B, Gaál I, Varga M és mtsai. Antivirális kezelés hatása a májtranszplantált betegek redox homeosztázis egyensúlyára. Folia Hepatologica, 2008, 12 (S.1), 24. 3. Sárváry E, Nemes B, Gerlei Zs, Czabai G, Monostoty K, Fazakas J, Doros A, Pallai G, Varga M, Járay J. Assessment of free radical production int he perioperative phase of liver transplantation. Transplant Int. 2007, 20, Suppl.2, 299. IF: 2,300 4. Toronyi E, Remport A, Földes K, Chmel R, Török Sz, Dallos G, Varga M, Végsı Gy, Jansen J, Rusz A, Járay J. The role and clinical significance of the prostate specific antigen in kidney transplanted patients. Transplant Int. 2007, 20, Suppl.2, 195. IF: 2,300
114
5. Telkes G, Rajczy K, M.Varga, A.Péter. HLA DR12 and HLA DR16 are risk factors of Helicobacter pylori infection for kidney recipients in Middle-Europe. Transplant Int. 2007, 20, Suppl.2, 151. IF: 2,300 6. Toronyi É, Remport Á, Földes K, Chmel R, Török Sz, Dallos G, Jansen J, Varga M, Végsı Gy, Járay J. Clinical course of de novo malignancies of kidney transplanted patients treated with sirolimus. Transplant Int. 2007, 20, Suppl.2, 132. IF: 2,300 7. Varga M, Kóbori L, Görög D, Gerlei Zs, Fehérvári I, Nemes B, Sárváry E, Járay J. CMV-infekció profilaxis májtranszplantációt követıen. Folia Hepatologica, 2006. 8. Varga M, Rajczy K, Sulyok B, Sárváry E, Járay J: CMV infection in high-risk kidney transplant patients in association with HLA-type. Transplant Int. 2005, 18, Supp.1, 142. IF: 1,797 9. Sárváry E, Remport Á, Jansen J, Varga M., Kóbori L, Nemes B, Sulyok B, Perner F, Chmel R, Lakatos M, Járay J. Comperative measurements between the HCV-carrier and virus-free seropositive patients. Transplant Int. 2005, 18, Supp.1, 147. IF:1,797 10. Remport A, Toronyi E, Földes K, Nagy K, Jansen J, Chmel R, Varga M, Sárváry E, Járay J. Efficacy of erythropoietin therapy in the treatment of anaemia of the kidney transplanted patients. Transplant Int. 2005, 18, Supp.1, 149. IF: 1,797 11. Sárváry E, Nemes B, Fazakas J, Kurucz T, Kóbori L, Gerlei Zs, Blazovich A, Sulyok B, Varga M, Görög D, Perner F. Assessment of liver graft recovery by monitoring the free radicals int he perioperative session. Transplant Int. 2005, 18, Supp.1, 201. IF: 1,797 12. Fazakas J, Ther G, Varga M, Sárváry E, Járay J. Graft flushing techniques and the procalcitonin level changes after liver transplantation. Transplant Int. 2005, 18, Supp.1, 226. IF: 1,797 13. Fazakas J., Tóth Sz., Varga M., Sárvári E., Kóbori L. The procalcitonin level changes after liver transplantation according to the graft flushing technique used. Liver transplantation, 12:5, 2006 May, C12. IF: 4,447
115
14. Fazakas J., Tóth Sz., Kóbori l., Varga M., Sárvári E, Járay J.: Liver flushing techniques and procalcitonin level changes during and after liver transplantation. Infection, 33, 2005, (S1), 17. IF: 1,854 15. Fazakas J., Dinya E., Gondos E., Varga M., Sárváry E., Járay J.: The importance of procalcitonin serum level declining kinetics after liver transplantation. Intensive Care Medicine. 2003, 38 (S92). IF: 4,500 16. Telkes G, Varga M Péter A, Gálffy Zs. Helicobacter pylori seroprevalence in haemodial ysis patients before transplantation. Budapest experiences. Helicobacter, 2003, 8: 395-6. IF: 2,624 17. Telkes G, Péter A, Remport Á, Varga M: Helicobacter pylori infection of organ transplanted patients, Budapest experiences. Gut, 2002, A38. IF: 6,323 18. Fazakas J., Gondos T., Varga M., Sárvári E., Horovitz P.: The systemic and regional procalcitonin serum level changes during and after liver transplantation. Biomedical Papers, 2002, 146: 1, 44. 19. Varga M., Péter A., Kovalszky I., Sulyok B., Sárváry E.: Cytomegalovirus infection of the upper gastrointestinal tract following liver and kidney transplantation. Journal of Clin. Virol. 2000, 18: 98. IF: 1,744
116
12.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Köszönetemet fejezem ki témavezetımnek, dr. Reusz György professzor Úrnak, amiért a Doktori Iskolában hallgatójának elfogadott, kutatói munkámat nyomon követte és azt hasznos tanácsaival, véleményével segítette. Támogatása nélkül e munka nem valósulhatott volna meg. Köszönettel tartozom a HLA-tipizáló laboratórium vezetıjének dr. Rajczy Katalinnak, aki a vizsgálataimhoz szükséges adatokat saját adatbázisából biztosította, az adatok feldolgozását tanácsaival, tudásával segítette. Biztatása nélkül a kutatói munka eredményei nem születhettek volna meg. Köszönetemet fejezem ki dr. Perner Ferenc, dr. Alföldy Ferenc és dr. Járay Jenı professzor Uraknak, akik a Semmelweis Egyetem Transzplantációs és Sebészeti Klinikájának igazgatóiként engedélyezték és támogatták a Doktori Iskolában végzett kutatói munkámat. İszinte hálával tartozom dr. Berencsi Györgynek és dr. Koller Miklósnak, amiért elsı tanáraimként megszeretteték velem a virológiát, segítettek mind a mindennapi diagnosztikai, mind a kutatói munkámban. Bevezetettek a kutatói munka rejtelmeibe, megtanítottak az alapvetı technikákra, metodikákra, a sejttenyésztéstıl az immunhisztokémiai vizsgálatokon át a molekuláris módszerek végzéséig. Köszönettel tartozom a Semmelweis Egyetem Transzplantációs és Sebészeti Klinika laborvezetıjének Sulyok Beátának, amiért segítette labordiagnosztikai tanulmányaimat, és támogatta és lehetıvé tette kutató munkámat. Hálával tartozom közvetlen munkatársaimnak dr. Sárváry Enikınek, dr. Gálffy Zsuzsának és Szabó Évának a mindennapi munkámban nyújtott segítségért. Köszönetemet fejezem ki és hálával tartozom az Országos Epidemiológiai Központ és a Semmelweis Egyetem Transzplantációs és Sebészeti Klinika laboratóriumi asszisztenseinek, amiért munkámban önzetlenül, legjobb tudásuk szerint, barátsággal és türelemmel segítettek. A transzplantációs regiszterbıl származó adatokért dr. Hídvégi Mártának tartozom köszönettel, a statisztikai számításokban pedig Vargha Péter volt segítségemre, köszönöm Nekik.
117
Köszönettel tartozom dr. Remport Ádámnak, dr. Berencsi Györgynek, dr. Sárváry Enikınek, dr. Toronyi Évának, dr. Görög Dénesnek, Kocsisné Környei Emıkének, dr. Fazekas Jánosnak a dolgozat elkészítéséhez nyújtott segítségért, tanácsaikért. Végül, köszönöm családtagjaimnak, hogy kitartásra és türelemre bíztattak, támogattak célom elérése érdekében.
118
