A veleszületett többszörös hypophysis hormonhiány genetikai okai. A PROP1 gén mutációk vizsgálata hazai betegekben

A veleszületett többszörös hypophysis hormonhiány genetikai okai. A PROP1 gén mutációk vizsgálata hazai betegekben

Doktori értekezés

Dr. Halász Zita Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr. Rácz Károly egyetemi tanár, MTA doktora Hivatalos bírálók: Dr. Sólyom Enikő osztályvezető főorvos, Ph.D. Dr. Barta Csaba egyetemi adjunktus, Ph.D. Szigorlati bizottság elnöke: Dr Siklósi György egyetemi tanár, MTA doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Péter Ferenc egyetemi tanár, MTA doktora Dr. Szabó András egyetemi tanár, MTA doktora

Budapest 2007

Oldal TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK

5

AMINOSAV KÓDOK ÉS TRIPLET KODONOK

7

I. BEVEZETÉS

8

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS II.1.

II.2.

10

A hypophysis transzkripciós faktorok szerepe az agyalapi mirigy fejlődésében

10

II.1.1.HESX1

12

II.1.2. PITX1 és PITX2

12

II.1.3. LHX3 és LHX4

13

II.1.4. PROP1

13

II.1.5. POU1F1

15

A hypophysis transzkripciós faktorok szerepe a szervezet strukturális és funkcionális aszimmetriájának kialakításában

16

II. 3. A többszörös hypophysis hormon-hiány általános klinikai jellemzői II.3.1. Etiológia, prevalencia

II.4.

.

18 18

II.3.2. Klinikai tünetek

20

II.3.3. Diagnosztika

21

II.3.4. Kezelés és prognózis

23

A hypophysis transzkripciós faktorok veleszületett genetikai zavarához társuló kórképek klinikai jellegzetességei

25

II.4.1. HESX1

26

II.4.2. LHX3 és LHX4

27

II.4.3. PITX2

28

II.4.4. PROP1

28

II.4.5. POU1F1

29

2

III.

CÉLKITŰZÉSEK

30

IV.

BETEGEK ÉS MÓDSZEREK

32

IV.1. Betegek

32

IV.1.1. Növekedési hormon kezelés hatékonyságának felmérése növekedési hormon-hiányos gyermekekben

32

IV.1.2. Hypophysis transzkripciós faktor gén mutáció vizsgálat többszörös hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

32

IV.1.3. Többszörös hypophysis hormon-hiány és situs inversus totalis társulása

33

IV.2. Klinikai vizsgálatok

34

IV.2.1. Anthropometriai vizsgálatok

34

IV.2.2. Hormonvizsgálatok és dinamikus tesztek

.

IV.2.3. Radiológiai vizsgálatok

34 35

IV.3. Immuncytokémiai vizsgálatok többszörös hypophysis hormon-hiánnyal társuló situs inversus totalis esetében IV.4. Molekuláris biológiai vizsgálatok

36 36

IV.4.1. PROP1 gén mutáció vizsgálat

36

IV.4.2. Egyéb hypophysis transzkripciós faktorokat kódoló gének mutáció vizsgálata

38

IV.5. Statisztikai módszerek

40

V.

EREDMÉNYEK

41

V.1.

Növekedési hormon-hiánnyal társuló hypophysis hormon elégtelenség kezelés eredményei

V.2.

41

PROP1 gén mutáció vizsgálat eredményei veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

V.3.

A klinikai fenotípus és a PROP1 genotípus közötti összefüggések vizsgálata veleszületett hypophysis hormonhiányban szenvedő betegekben

V.4.

42 46

A POU1F1 gén leggyakoribb mutációs helyén előforduló gén-eltérések vizsgálata veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

49

3

V.5. VI.

A PROP1, POU1F1 és PITX2 gén vizsgálata situs inversus totalissal társuló veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegben

49

MEGBESZÉLÉS

52

VI.1. Növekedési hormon-hiánnyal társuló hypophysis hormon elégtelenség kezelés eredményei

52

VI.2. PROP1 gén mutáció vizsgálat eredményei veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

54

VI.3. A klinikai fenotípus és a PROP1 genotípus közötti összefüggések vizsgálata veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

57

VI.4. A POU1F1 gén leggyakoribb mutációs helyén előforduló gén-eltérések vizsgálata veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

60

VI.5. A PROP1, POU1F1 és PITX2 gén vizsgálata situs inversus totalissal társuló veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegben

61

KÖVETKEZTETÉSEK

64

VIII. IRODALOMJEGYZÉK

67

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS

80

MAGYAR NYELVŰ ÖSSZEFOGLALÓ

81

ANGOL NYELVŰ ÖSSZEFOGLALÓ

82

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

83

EGYÉB PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE

84

VII.

4

RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK ACTH

adrenocorticotrop hormon

BMP2, BMP4

bone morphogenetic protein 2,4

DAX1

dosage-sensitive sex reversal

DNAI1

dynein, axonemal, intermediate chain 1 gene

DNAH5

dynein, axonemal, heavy chain 5 gene

DNAH9

dynein, axonemal, heavy chain 9 gene

FGF8

fibroblast growth factor 8

FSH

folliculus stimuláló hormon

fT4

szabad thyroxin

GATA2

GATA-binding protein 2

GH

növekedési hormon

Hesx1

homeodomain transcription factor 1

Lhx3

LIM homeobox transzkripciós faktor 3

Lhx4

LIM homeobox transzkripciós faktor 4

LH

luteinizáló hormon

MPHD

multiple pituitary hormone deficiency

MRI

magnetic resonance imaging

NeuroD1

neurogenic differentiation 1

PCR

polymerase chain reaction

Pitx1, Pitx2

paired like homeodomain transzkripciós faktor 1, 2

POU1F1

POU domain, class 1, transzkripciós faktor 1

Prl

prolactin

Prop1

prophet of Pit1 transzkripciós faktor

RIA

radioimmunoassay

SF1

steroidogenesis factor1

Six3

sine oculis homeobox /Drosophila/ homologue 3

SOD

septo-opticus dysplasia

TTC8

tetratricopeptide repeat domain 8 gene

TGF-β

transforming growth factor-beta

Tpit

T-box transcription factor

5

TSH

thyreotrop hormon

WNT4

wingless-type MMTV integration site family, 4

ZIC3

Zic family member 3 heterotaxy 1 gene

6

Aminosav kódok és triplet kodonok Szimbólum

Kód

Aminosav

Kodon

A

Ala

Alanin

GCT,GCC,GCA,GCG

B

Asp,Asn

Aszpartát, GAT,GAC,AAT,AAC Aszparaginsav C

Cys

Cisztein

TGT, TGC

D

Asp

Aszpartát

GAT, GAC

E

Glu

Glutamát, Glutaminsav

GAA, GAG

F

Phe

Fenilalanin

TTT, TTC

G

Gly

Glicin

GGT, GGC, GGA, GGG

H

His

Hisztidin

CAT, CAC

I

Ile

Izoleucin

ATT, ATC, ATA

K

Lys

Lizin

AAA, AAG

L

Leu

Leucin

TTG, TTA, CTT, CTC, CTA, CTG

M

Met

Metionin

ATG

N

Asn

Aszparagin

AAT, AAC

P

Pro

Prolin

CCT, CCC, CCA, CCG

Q

Glu

Glutamin

CAA, CAG

R

Arg

Arginin

CGT, CGC, CGA, CGG, AGA, AGC

S

Ser

Szerin

TCT, TCC, TCA, TCG, AGT, AGC

T

Thr

Treonin

ACT, ACC, ACA, ACG

V

Val

Valin

GTT, GTC, GTA, GTG

W

Trp

Triptofán

TGG

X

Xxx

Ismeretlen

-

Y

Tyr

Tirozin

TAT, TAC

Glutamát, Glutaminsav

GAA, GAG,CAA, CAG

Stop

TAA, TAG, TGA

Glu, Z Gln

·

Stop

7

I. BEVEZETÉS A veleszületett többszörös hypophysis hormon-hiány leggyakoribb (és az esetek többségében legfeltűnőbb) klinikai tünete a növekedési hormon elégtelen szekréciója miatt kialakuló alacsonynövés, amelyhez a hypopituitarismus egyéb tünetei társulnak. A betegek kezelésére hazánkban 1977 óta állnak rendelkezésre országosan szervezett keretek között humán növekedési hormon készítmények, amelyek a társuló hypophysis hormon-hiánynak

megfelelő

hormonpótló

kezeléssel

kiegészítve

hatékonyan

alkalmazhatók a betegség tüneteinek megszűntetésére vagy enyhítésére. A hypophysis fejlődésével és a különböző hypophysis hormonokat termelő sejtek differenciálódásával foglalkozó alapkutatások az elmúlt mintegy 10 évben olyan új sejtszintű szabályozó folyamatokat tártak fel, amelyek veleszületett zavara közvetlen oki tényezőt jelent a veleszületett többszörös hypophysis hormon-hiány kialakulásában. A kutatásokkal egyértelműen bizonyították, hogy a hypophysis organogenezis különböző szakaszait és a különböző hormontermelő képességű sejtvonalak differenciálódását különböző hypophysis transzkripciós faktorok szabályozzák, és ezeket a szabályozó fehérjéket kódoló gének csírasejtes defektusa az adott gén működés-kiesését tükröző fenotípussal járó többszörös hypophysis hormon-hiányt okoz. A betegség-okozó gén mutációkkal kapcsolatos klinikai megfigyelések ugyanakkor rávilágítottak arra is, hogy a hypophysis transzkripciós faktorok egy részének defektusa a hypophysisen kívül más szervek fejlődésének és működésének zavarával járhat. Ennek egyik különösen érdekes aspektusa a test bal/jobb aszimmetriájának szabályozása, amelyben – állatmodelleken szerzett megfigyelések alapján – egy hypophysis transzkripciós faktornak, a ”paired like homeodomain transzkripciós faktor 2”-nek is szerepe lehet. Munkám első részében növekedési hormon-hiányban szenvedő gyermekekben a hazánkban elsőként rendelkezésre álló humán növekedési hormon készítmény alkalmazásával nyert hosszútávú eredményeket elemzem. Ezt követően beszámolok azokról a vizsgálatokról, amelyek az európai népességben leggyakoribb, de a különböző európai országokban jelentősen eltérő két hypophysis transzkripciós faktort kódoló gén mutációinak elemzésével foglalkoznak (”prophet of Pit1” transzkripciós faktor gén

8

összes kódoló exonja és a ”POU domain, class 1, transzkripciós faktor 1” génen a mutációs ”hot spot”-ot tartalmazó 6. exon). Végül ismertetem egy többszörös hypophysis hormon-hiányban és situs inversus totalisban szenvedő betegben a ”prophet of Pit1” transzkripciós faktor, a ”POU domain, class 1, transzkripciós faktor 1” és a ”paired like homeodomain transzkripciós faktor 2” gének összes kódoló exonjának mutáció-analízisével nyert eredményeket, mely géneket situs inversus totálissal társuló többszörös hypophysis hormon-hiányos betegben a nemzetközi irodalomban korábban még nem vizsgálták. A hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegek klinikai, hormonlaboratóriumi és egyéb adatainak feldolgozását önállóan végeztem. A molekuláris biológiai vizsgálatok alap módszereit a II sz. Belgyógyászati Klinika molekuláris biológiai laboratóriumában sajátítottam el. A vizsgált gének mutációelemzését a II. sz. Belgyógyászati Klinika molekuláris biológiai laboratóriumában dolgozó munkatársak közreműködésével, segítő irányításával végeztem.

9

II. IRODALMI ÁTTEKINTÉS Gerincesekben a hypophysis organogenezis és a hormon-termelő sejtek differenciálódásának folyamata bonyolult, egymást követő lépésekben zajlik. Az agyalapi mirigy fejlődését exogén és endogén jelek irányítják és a sejtek végső differenciálódása számos transzkripciós faktor időben rendezett hatásának eredménye (Cohan és Radovick 2002, Zhu és mtsai 2005). II.1.

A hypophysis transzkripciós faktorok szerepe az agyalapi mirigy fejlődésében

Az agyalapi mirigy mellső és középső lebenye az orális ektoderma, a hátsó lebeny a neurális ektoderma képződménye. Az orális ektoderma invaginációja révén jön létre a Rathke tasak, amely emberben a 4-6. embrionális héttől alakul ki. A betüremkedett ektoderma fejlődését a ventrális diencephalonból származó BMP4 (bone morphogenetic protein 4) és FGF8 (fibroblast growth factor 8) faktor indukálja. A ventrális ektoderma által termelt BMP2 és WNT4 (wingless-type MMTV integration site family, member 4) a járulékos Rathke tasak kifejlődését váltja ki. A sejtproliferáció és differenciálódás, az érett Rathke tasak képződésének ismert többi szabályozói a Six3 (sine oculis homeobox /Drosophila/ homologue 3), a PITX1 és PITX2 (paired like homeodomain transcription factor 1, 2) és a HESX1 (homeodomain transcription factor 1). A progenitor sejtvonal differenciálódását specifikus transzkripciós faktorok szabályozzák (LHX3, LHX4, PROP1, POU1F1, GATA2, SF1). E folyamatok eredményeként az adenohypophysisben növekedési hormont (GH), prolactint (Prl), thyreotrop hormont (TSH), adrenocorticotrop hormont (ACTH), folliculus stimuláló hormont (FSH) és luteinizáló hormont (LH) termelő differenciált sejtek alakulnak ki. Az emberi agyalapi mirigy fejlődését és a hormon-termelő sejtek differenciálódási folyamatának vázlatát az 1. ábra mutatja be. A PROP1 (prophet of pit1) transzkripciós faktor hatására pre-somato-lactothyreotrop prekurzor képződik, amelyből GH-t, Prl-t és TSH-t termelő sejtvonalak differenciálódnak a POU1F1 (POU domain, class 1, transcription factor1, Pit1), a GATA2 (GATA-binding protein 2) és egyéb faktorok közvetítésével. A pre-corticotrop

10

sejtek a Tpit (T-box transcription factor) és a NeuroD1 (neurogenic differentiation 1) szabályozásával differenciált corticotrop sejtekké, a pregonadotrop sejtek az SF1 (steroidogenesis factor1), GATA2 és DAX1 (dosage-sensitive sex reversal) hatása alatt pedig gonadotrop sejtekké differenciálódnak.

MSH ACTH FSH,LH Neurális ektoderma TSH GH Progenitor sejtvonal

Orális ektoderma

Prl

Rathke tasak Kezdeti lépés

Proliferáció

Hormon-termelő sejtek differenciálódása

1. ábra. Az agyalapi mirigy fejlődésének vázlata emberben Savage és mtsai ábrája alapján (2003). BMP2: bone morphogenetic protein 2; WNT4: wingless-type MMTV integration site family; member 4, BMP4: bone morphogenetic protein 4; FGF8: fibroblast growth factor 8; Six3: sine oculis homeobox /Drosophila/ homologue 3; Pitx1, 2: paired-like homeodomain transcription factor 1, 2; Hesx1: homeodomain transcription factor 1; LHX3,4: LIM homeobox transzkripciós faktor 3,4; PROP1: prophet of Pit1 transzkripciós faktor; Pit1 (POU1F1): POU domain, class 1, transcription factor 1; GATA2: (GATA-binding protein 2); Tpit: T-box transcription factor; NeuroD1: neurogenic differentiation 1; SF1: steroidogenesis factor1; DAX1: dosage-sensitive sex reversal; Az alábbiakban a szervi lateralizációban és a hypophysis fejlődésében egyaránt szerepet játszó PITX2 és a humán agyalapi mirigy kialakulásában résztvevő transzkripciós faktorok és kódoló gének közül azokkal foglalkozom, amelyek zavara GH-hiánnyal járó többszörös hypophysis hormon-hiányt okoz. A kódoló gének adatait a

11

4. táblázat tartalmazza. A HESX1, PITX2, LHX3, LHX4, PROP1 és POU1F1 gén defektusok klinikai jelentőségét az utóbbi évek vizsgálatai egyértelműen igazolták. II.1.1. HESX1 A HESX1 transzkripciós faktort kódoló HESX1 gén (homeodomain transcription factor 1, homeobox gene expressed in ES cells, HESX homeobox 1, RPX, Rathke pouch homebox gene) a hypophysis fejlődésében és a differenciálódás korai szakaszában játszik fontos szerepet. A gén a 3p21.1-3p21.2 kromoszóma szakaszon helyezkedik el, 4 exont és 3 intront tartalmaz. A HESX1 szabályozza a PROP1 transzkripciós faktort kódoló gén expresszióját. Mantovani és munkatársai 2006-ban a HESX1 gén expresszió felnőttkorig tartó fennmaradását mutatták ki. Ennek alapján valószínű, hogy a gén által kódolt transzkripciós faktornak szerepe van a hypophysis mellső lebeny hormontermelő sejtjeinek fennmaradásában és működésük fenntartásában. Dattani és mtsai 1998-ban septo-opticus dysplasiás (SOD) betegekben a HESX1 gén homozygota missense mutációját igazolták. Később betegség-okozó heterozygota inzerciós és missense mutációkat is kimutattak. II.1.2. PITX1 és PITX2 A PITX1 (paired-like homeodomain transcription factor 1, Paired-like homeodomain transcription factor 2, Rieg transcription factor).transzkripciós faktort kódoló gén a 5. kromoszóma q31. régióban helyezkedik el. A PITX1 gén expresszió nélkülözhetetlen az LHX3 gén expresszió fenntartásában. A gén expressziója az érett hypophysisben is kimutatható. A gén által kódolt fehérje a hypophysis mellső lebeny valamennyi sejtvonalának fejlődését befolyásolja. Jelentős szerepet játszik a corticotrop sejtek integrációjában. Az SF1 transzkripciós faktorral szinergizmusban elősegíti a gonadotrop sejtek differenciálódását. Quentien és mtsai 2002-ben közölt vizsgálatai alapján a PITX1 fehérje a

POU1F1 transzkripciós faktorral kölcsönhatásban biztosítja a

somatotrop és lactotrop sejtvonalakon a GH és Prl promoter szakaszok aktiválódását. PITX1 gén mutációt emberben még nem mutattak ki.

12

A PITX2 gén a 4. kromoszóma q25-26 szakaszán helyezkedik el. A gén 4 exont és 3 intront tartalmaz.. Az agyalapi mirigyben a fejlődés korai szakaszától folyamatosan expresszálódik. A mutációk többségét a homeodomain szakaszon találták II.1.3. LHX3 és LHX4 Az LHX3 (LIM homeobox transcription factor 3) transzkripciós faktort kódoló gén a 9. kromoszóma q34.3 szakaszán, az LHX4 (LIM homeobox transcription factor 4, GHGH fusion factor) transzkripciós faktort kódoló gén az 1. kromoszóma q25 szakaszán található. A két gén szerkezete hasonló, mindkét gén 7 exont és 6 intront tartalmaz. Mindkét gén terméke LIM-tipusú homeodomain fehérje, amely két LIM domaint és egy LIM homeodomaint tartalmaz. Az LHX3 fehérjének három eltérő DNS-kötő képességű izoformája van (LHX3a, LHX3b és M2-LHX3). A LIM domainek számos szabályozó mechanizmusban játszanak szerepet. Az LHX3 és LHX4 részt vesz a hypophysis organogenezisében és az agyalapi mirigy integritásának fenntartásában (Mullen és mtsai 2007). Az LHX3 gén expresszió a központi idegrendszerben és a Rathke tasakban a fejlődés korai szakaszától kezdődik és az egész élet során fennmarad. Önállóan és más transzkripciós faktorokkal együttműködve elősegíti az agyalapi mirigy fejlődésében szerepet játszó transzkripciós faktor gének transzaktiválódását. A Prl és a TSHbeta promoterek aktiválásában a POU1F1 transzkripciós faktorral szinergista hatást fejt ki. Az LHX3 expressziója nélkülözhetetlen a POU1F1 gén expressziójához. Az LHX3 transzkripciós faktor hatásának hiánya a POU1F1 hatására differenciálódó somatolacto-thyrotrop sejtvonal differenciálódási zavarán kívül a gonadotrop sejtvonal differenciálódási zavarát okozza. Az LHX4 transzkripciós faktor hatása az agyalapi mirigy fejlődésének egy adott szakaszára korlátozódik. Hiánya a corticotrop sejtvonal kivételével az agyalapi mirigy valamennyi sejtvonalának differenciálódási zavarát váltja ki. II.1.4. PROP1 A PROP1 (prophet of pit1) transzkripciós faktort kódoló gén az 5. kromoszóma hosszú karján, a 35.3 régióban helyezkedik el, a gén 3 kódoló exont tartalmaz (Duquesnoy és

13

mtsai 1998) (2. ábra). A gén egy paired-like homeobox gén, amelynek fehérje terméke 226 aminósavból áll. A gén expresszió hatására pre-somato-lacto-thyreotrop prekurzor képződik, amelyből GH-t, Prl-t és TSH-t termelő sejtvonalak differenciálódnak A PROP1 jelenléte nélkülözhetetlen az adenohypophysis somato-lacto-thyreotrop és gonadotrop sejtjeinek differenciálódásához. Állatmodellekben a PROP1 transzkripciós faktor gátolja a HESX1 gén expresszióját (Gage és Brinkmeier 1996). A Prop1 gén mutációját elsőként Sornson és mtsai 1996-ban mutatták ki a természetben előforduló hypopituiter Ames egerekben. Ezen egerek testhossza az átlagegér egyharmadáé. Élettartamuk szignifikánsan hosszabb, mint a Prop1 gén mutációt nem hordozó társaiké. Ezen állatokban a hypophysis hormon-hiány megnyilvánulása enyhébb, mint a PROP1 gén mutációt hordozó emberekben. Emberben Wu és mtsai 1998-ban közölték elsőként a PROP1 gén mutációját többszörös hypophysis hormon-hiányos betegekben. A későbbi vizsgálatok szerint a 2. és 3. exon missense, frameshift és splice site mutációja, deléciója és inzerciója, az 1. exon T2C pontmutációja és egy legújabb, 2006-ban közzétett vizsgálat szerint a gén teljes deléciója fordulhat elő (Lemos és mtsai 2006, Abrāo és mtsai 2006). Ezek közül a 2. exon 296-302 nukleotidok GA-dinukleotid tandem ismétlődése a leggyakoribb mutációs hely (mutációs hot spot) (Cogan és mtsai 1998, Deladoёy és mtsai 1998) (2. ábra). A gén mutációk a kódolt fehérje DNS-kötő képességének és transzkripciós aktivitásának csökkenését okozzák.

2. ábra. A PROP1 gén szerkezete és a betegség-okozó mutációk lokalizációja (Mehta és Dattani 2005 munkája alapján) A téglalapok a 3 kódoló exont, míg a szürke szín a ”paired-like homeodomain” szakaszt szemlélteti.

14

II.1.5. POU1F1 A POU1F1 (POU domain, class 1, transcription factor 1; Pit1, Pituitary-specific transcription factor 1, GHF1-Growth hormone factor 1) transzkripciós faktort kódoló POU1F1 gén a 3. kromoszóma 3p11 szakaszán helyezkedik el, a gén 6 exont tartalmaz (3. ábra). A 291 aminosavból álló POU1F1 fehérje transzaktivációs domaint, POUspecifikus és POU homeodomaint tartalmaz. A POU1F1 fehérje nélkülözhetetlen a somato-lacto-thyrotrop sejtek végső differenciálódásához. A POU-specifikus és POU homeodomain a GH és Prl promoter régió nagy affinitású DNS kötődéséhez szükséges. Más transzkripciós faktorokkal együtt (PITX1 és PITX2) részt vesz a lactotrop sejtek differenciálódásában és a prolactin gén szabályozásában. A gén expressziója az egész élet során fennmarad. A POU1F1 gént a hypophysis fejlődését szabályozó transzkripciós faktorok közül elsőként ismerték meg. A természetben előforduló Snell és Jackson törpe egerek a gén spontán mutációját hordozzák (pont és null mutáció). Az egerek élettartama szintén hosszabb. A hypophysis hormon-hiány spektruma megegyezik a POU1F1 gén mutációt hordozó emberekben észleltekkel. Emberben az első betegség-okozó POU1F1 gén mutációt 1993-ban Tatsumi és mtsai közölték (homozygota, nonsense mutáció). Azóta több, mint 15 mutáció vált ismertté, amelyek közül a R271W mutáció a leggyakoribb (Tatsumi és mtsai 1992). A POU1F1 gén mutációk következ-ményeként eltérő hatású fehérjék keletkezhetnek, amelyek a gén-transzkripció domináns gátlását (R271W), a DNS-kötő képesség csökkenését (R143Q, E174G, W193R, 747delA) vagy a fehérjefehérje kölcsönhatás zavarát okozzák (A158P, P239S, F135C).

3. ábra. A POU1F1 gén szerkezete és a betegség-okozó mutációk lokalizációja (Mehta és Dattani 2005 munkája alapján) A POU-specifikus szakaszt fekete, a POU homeodomaint szürke szín jelzi.

15

II.2.

A hypophysis transzkripciós faktorok szerepe a szervezet strukturális és funkcionális aszimmetriájának kialakításában

Az embrionális fejlődés korai szakaszában a primitív csomó területén a nodális csillók mozgását mutatták ki. A csillómozgás az óramutató járásával megegyező irányú és áramlást idéz elő a csillókat körülvevő folyadékban. Ennek tulajdonítják, hogy a szervek organogeneziséért felelős transzkripciós faktorokat kódoló gének egy része a nodális csomó bal oldalára kerül. Feltételezik, hogy ezek a ”nodal” vagy ”lefty” faktorok okozzák a szervek fejlődéséért felelős transzkripciós faktorokat kódoló gének aszimmetrikus expresszióját. A test bal/jobb aszimmetriája is ennek a folyamatnak a következménye lehet. Az utóbbi években a szervi lateralizációban szerepet játszó gének nagy száma vált ismertté, amelyek defektusa állatmodellekben a test bal/jobb aszimmetriájának egy vagy több szervre lokalizálódó zavarát válthatja ki (Capdevila és Belmonte 2000, Levin 2005, Barth és mtsai 2005, McManus 2005). Megfigyelték, hogy e gének szimmetrikus vagy aszimmetrikus expressziója meghatározó jelentőségű a szervi lateralizáció kialakulásában. Különösen érdekes megfigyelés, hogy a test bal/jobb aszimmetriáját azok a gének is befolyásolhatják, amelyek a hypophysis organogenezisben és sejtdifferenciálódásban is szereppel bírnak. Állatmodellekben kimutatták, hogy a baloldali laterális mesodermális lemez aszimmetrikus pitx2 gén expressziójának alapvető mediátor szerepe lehet a test bal/jobb aszimmetriájának kialakulásában (Logan és mtsai 1998, Piedra és mtsai 1998, Ryan és mtsai 1998). Kitamura és mtsai (1999) súlyos fejlődési rendellenességhez társuló lateralizációs zavar egérmodelljében a pitx2 gén ”loss-of function” mutációját mutatták ki. Lin és mtsai (1999) a szervi lateralizáció zavar és az agyalapi mirigy fejlődési rendellenessége közötti kapcsolatot pitx2-/egerekben vizsgálták. Kimutatták, hogy pitx2-/- egerekben súlyos és az esetek 1/3-ában a korai életszakaszban letális kimenetelű fejlődési rendellenesség fordul elő. A mellkasfal és hasfal záródási rendellenessége miatt a mellkasi és hasi szervek kívülre kerülnek és ezek a rendellenességek a szív, a tüdő és a belek lateralizációs zavarával társulnak. Az agyalapi mirigy fejlődését illetően a Rathke tasak invaginációja, az orális és neurális ectoderma közötti kapcsolat kialakulása és ezt követően az lhx3, six-1, rpx/hesx1 és pitx1 gének expressziója zavartalan volt. A további fejlődési folyamat

16

során a hypophysis állományának destrukciója alakult ki és a GATA2, prop1 és lhx3 transzkripciós faktorok mennyisége gyorsan csökkent. A hypophysisben a károsodás miatt a POMC sejtvonal kivételével az összes sejtvonal eltűnt és a későbbiekben csak néhány periluminalis sejt maradt fenn. A szervek lateralizáció szabályozása és a folyamatban résztvevő gének szerepe a különböző fajokban jelentősen eltérhet. Csirke embrióban a lateralizációs folyamat szabályozásában résztvevő faktorok közül a TGF-β (transforming growth factor-beta) családba tartozó activin-βB, nodal, IIA típusú activin receptor és sonic hedgehog gének bal/jobb tengelyre vonatkozó aszimmetrikus expresszióját mutatták ki (Levin és mtsai 1995, Stern és mtsai 1995). Emberben a szervi lateralizációt szabályozó folyamatokról kevés ismerettel rendelkezünk (Peeters és Devriendt 2006). Az izolált heterotaxiás esetek 3%-ában Nodal szignal gén mutációt mutatták ki (Kosaki R és mtsai 1999, Kosaki K mtsai 1999). A situs inversus totalis (a belső szervek tükörképszerű elhelyezkedése) becsült újszülöttkori előfordulási gyakorisága 1:6000-8000. Egyes szervek izolált lateralizációs zavarával szemben a situs inversus totális nem társul szervi funkciózavarral. A situs inversus totalis esetek mintegy fele a Kartagener szindróma részjelensége, amelyben a belső szervek tükörképszerű lokalizációja primer ciliáris dyskinesiával társul (OMIM 244400) (Kartagener és Horlacher, 1936, Afzelius 1976). A primer ciliaris dyskinesia (PCD, OMIM 242650) a csillók működészavara miatt változó súlyosságú ismétlődő felső- és alsó-légúti fertőzésekkel jár együtt. A szindróma genetikailag heterogén; a csillók strukturális és funkcionális rendellenességének hátterében a dynein kart felépítő fehérjék (DNAH5, DNAI1, DNAH9) szerkezeti rendellenessége mutatható ki. A szindrómában a DNAI1 ( dynein, axonemal, intermediate chain 1, génlókusz: 9p13p21), a DNAH5 (dynein, axonemal, heavy chain 5, génlókusz: 5p15.2) és a DNAH9 (dynein, axonemal, heavy chain 9, génlókusz 17p12) gének receszív mutációit találták (Fliegauf és mtsai 2005). A situs inversus ritkán egyéb örökletes szindrómákhoz társul. A Bardet-Biedl szindróma TTC8 gén (tetratricopeptide repeat domain 8) mutáció okozta formájában, az infantilis nephronophtisissel és vese cystákkal járó inverzin gén defektusában situs inversus fordulhat elő. Az X-kromoszómáhaz kötötten öröklődő situs inversust urogenitális malformáció és imperforált anus jellemzi, a kórképben a ZIC3gén

17

(Zic family member 3 heterotaxy 1 ) mutációját igazolták (Gebbia és mtsai 1997Ansley és mtsai 2003, Otto és mtsai 2003). Tubbs és mtsai (2003) situs inversus totális esetében a vizsgált domináns agyi struktúrák megváltozott lateralizációjáról számoltak be. A visceralis, neuroanatómiai és funkcionális lateralizáció egyes eleme közötti összefüggéseket állatmodellekben is kimutatták (Barth és mtsai 2005). Situs inversusos egyének klinikai vizsgálatai azonban nem bizonyították az agyi kognitiv funkciók megváltozott lateralizációját (változatlan jobb/bal kezesség dominancia). Ezért egyes vizsgálók feltételezik, hogy az agy és a belső szervek lateralizációjának kialakulását eltérő mechanizmusok szabályozzák (Kennedy és mtsai 1999). Az agy strukturális és funkcionális lateralizációjának klinikai vizsgálata azonban még a mai korszerű technikai lehetőségekkel, mint a funkcionális mágneses rezonancia (funkcionális MRI) sem tekinthető teljesen megoldottnak, ezért e terület pontosabb megismerése az eljövendő kutatások feladata lehet. II. 3. A többszörös hypophysis hormon-hiány általános klinikai jellemzői A

többszörös hypophysis hormon-hiányt (multiple pituitary hormone deficiency,

MPHD), más néven kombinált hypophysis hormon-hiányt (combined pituitary hormone deficiency, CPHD) az agyalapi mirigy által termelt hormonok (GH, Prl, TSH, LH, FSH, ACTH) közül legalább két hormon csökkent szekréciója jellemzi.

II.3.1. Etiológia, prevalencia Az MPHD kialakulásában szerzett és örökletes tényezők egyaránt szerepet játszhatnak. MPHD-t okozhat például a magzati hypoxia, asphyxia és szülési sérülés. A központi idegrendszer középvonalbeli fejlődési rendellenességei (pl. corpus callosum agenesia) gyakran társulnak hypophysis elégtelenséggel. Nyúlajak esetén hypopituitarismus 4%ban fordul elő, amennyiben a fejlődési rendellenesség növekedésbeli elmaradottsággal is társul, a GH-hiány gyakorisága 32% (DiGeorge,1992). Felnőttekben a szerzett hypophysis elégtelenség leggyakoribb oka az agyalapi mirigy jóindulatú daganata.

18

Az MPHD kialakulásához vezető leggyakoribb okokat az 1. táblázat sorolja fel (Rácz 2007). 1. táblázat. A többszörös hypophysis hormon-hiány leggyakoribb veleszületett és szerzett okai Hypophysis fejlődési rendellenesség •

Hypophysis aplasia, dysplasia

•

Primer empty sella

•

Transzkripciós faktorok elégtelen hatása

Vascularis •

Postpartum hypophysis necrosis

•

Hypophysis apoplexia

Daganat •

Hypophysis adenoma

•

Sella tájéki daganat

•

Rathke tasak cysta

•

Daganat-metasztázis

•

Lymphoma

•

Hypothalamus hamartoma

Trauma/mechanicus laesio • • •

Gyulladás és infiltratív betegség •

Histiocytosis X

•

Granulomatosus hypophysitis

•

Bakteriális meningitis, abscessus

Aneurysma, subarachnoidealis vérzés

Sugárkezelés

Lymphocytás hypophysitis

•

Hypophysis és sella-tájéki műtét Koponyatrauma

•

Sella-tájéki daganatok

•

Fej-nyak daganatok

Az MPHD esetek többsége sporadikus, 5-20%-a családi halmozódású. Az örökletes MPHD gyakorisága 1:8000 (Parks és mtsai 1999). Egy 2001-ben közölt spanyol vizsgálat szerint (Regal és mtsai 2001) a hypopituitarismus prevalenciája 45,5/100000, incidenciája 4,2/100000/év és gyakorisága az életkor előrehaladásával növekszik.

19

II.3.2. Klinikai tünetek Az MPHD esetek jelentős részében csökkent GH termelés mutatható ki, amelyhez csökkent TSH, Prl, LH, FSH és ACTH termelés társulhat. A betegség szerzett formáiban a hormonhiány klinikai tüneteinek és kórjeleinek megjelenését és jellegét döntően befolyásolja a károsító hatás időpontja. Az MPHD örökletes formáiban a hormon-termelés zavar különböző életkorban jelentkezhet. A hypophysis elégtelenség

jelei egyes esetekben már újszülött vagy

csecsemőkorban megfigyelhetőek (pl. POU1F1, LHX4 gén defektus), más esetekben későbbi életkorban jelentkezhetnek (pl. PROP1 gén defektus). Az esetek egy részében a különböző hypophysis hormonok hiánya egyidőben jelentkezik, de az egyes hormonok hiánya egymást követően is kialakulhat. Az MPHD klinikai képét a hormon-hatás hiányával összefüggő tünetegyüttese jellemzi. Újszülöttkorban kialakuló GH-hiány hypoglycaemiát, a gyermekkori GH és TSH hiány elsődlegesen a csontérés zavarát és a szomatikus fejlődés retardációját okozza, amelyhez TSH-hiány esetén mentális fejlődési zavar társulhat. Fiú újszülöttekben elégtelen gonadotropin szekrécióra utalhat a micropenis és/vagy a cryptorchismus. A pubertás idején fennálló FSH és LH hiány elégtelen serdülést, pubertás tardát, leányokban primer amenorrhoeát okoz. Felnőttekben a gonadotrop hormonok hiánya centrális hypogonadismust, nőkben menstruációs ciklus rendellenességet, szekunder amenorrhoeát vált ki. Az ACTH hiány miatt kialakuló centrális hypadrenia megfelelő hormonszubsztitúció hiányában életet veszélyeztető krízis-állapothoz vezethet. Elégtelen prolactin szekréció esetén szülés után nem alakul ki laktáció (Sheehan szindróma). MPHD-ben az adenohypophysis hormon-termelési zavarához ritkán a hátsó lebenyből felszabaduló vasopressin (antidiuretikus hormon, ADH) hiánya társul (diabetes insipidus). Az adenohypophysis elégtelen hormon termelésével összefüggő legfontosabb klinikai tüneteket a 2. táblázat foglalja össze.

20

2. táblázat. Az adenohypophysis elégtelen hormontermelésével összefüggő legfontosabb klinikai tünetek Hormonhiány

Tünet hypoglycaemia (újszülöttkor) szomatikus retardáció (gyermekkor) csontritkulás lipidanyagcsere zavar szomatikus retardáció (gyermekkor) gyengeség hányinger, hányás hasi panasz, fejfájás

GH

ACTH

TSH

FSH/LH

MPHD

szomatikus retardáció (gyermekkor) mentális fejlődési zavar (gyermekkor) száraz bőr bradycardia fáradékonyság Micropenis, cryptorchismus (újszülöttkor) pubertas tarda primer/szekunder amenorrhoea, dysmenorrhoea libidó csökkenés, impotencia, gyér szőrzet gyér szőrzet, elvékonyodott, sápadt hypopigmentált bőr lassúbb mentális működés hangulatromlás, depresszió anaemia fokozott inzulin érzékenység hyponatraemia, kóros lipid profil

II.3.3. Diagnosztika A hypophysis működése és a hormon-hiányos állapot pontos megítélése dinamikus tesztekkel lehetséges. Az MPHD diagnózisára alkalmazott teszteket a 3. táblázat foglalja össze.

21

3. táblázat. Az MPHD diagnózisára leggyakrabban alkalmazott dinamikus tesztek Hormon

Teszt neve

Normális válasz

ACTH

Inzulin tolerancia teszt

0.05-0.15 E/kg inzulin iv adása után szérum kortizol >20 µg/dl

CRH teszt

1 µg/kg CRH iv adása után a plazma ACTH 2-4-szeresre nő, szérum kortizol >20 µg/dl

Metopyron teszt

30 mg/kg metopyron éjféli p os adása után a reggeli szérum kortizol <4 µg/dl, 11-deoxikortizol >7.5 µg/dl, ACTH >75 pg/ml

TSH, Prl

TRH teszt

200 µg TRH iv adása után a szérum TSH >5 mU/l-rel, a szérum prolactin >20 ng/ml-rel nő

LH, FSH

GnRH teszt

100 µg GnRH iv adása után pubertaskorban a szérum LH csúcsérték 3-10-szeresre, az FSH csúcsérték 2-3-szorosra nő. Felnőttekben a szérum LH 10 IU/l-rel és a szérum FSH 2 IU/l-rel nő

GH

Inzulin tolerancia teszt

0.05-0.15 E/kg inzulin iv adása után a szérum

GH >7 ng/ml (gyermek) >3 ng/ml (felnőtt) L-Arginin teszt

l-arginin 0,5 g/kg (max. 30g) iv infúzió után a szérum GH >7 (gyermek) >3 ng/ml (felnőtt)

Glukagon teszt

1 mg glukagon sc adása után a szérum GH >7

(gyermek) >3 ng/ml (felnőtt) Levodopa teszt

125-500 mg L-3,4-dihydroxy-phenylalanin p os adása után a szérum GH >7 (gyermek) >3

ng/ml (felnőtt) Clonidin teszt

0,15 mg/m2 clonidin p os adása után a szérum

GH >7 (gyermek) >3 ng/ml (felnőtt)

22

MPHD-ra csökkent szérum thyroxin (T4), kortizol és szexual szteroid szintek mellett alacsony, vagy a normális tartomány alsó határán lévő szérum TSH, ACTH, LH és FSH szintek jellemzők. A szérum GH és inzulin-szerű növekedési faktor-1 (IGF-1) szintek is csökkennek, de a GH-hiány pontos felmérése csak dinamikus tesztekkel lehetséges. A prolactin szint változása sok esetben nem kórjelző, bár egyes veleszületett kórképekben

jellegzetesen alacsony, más esetekben a normálisnál nagyobb (pl. a

hypophysis nyél sérülésével vagy kompressziójával járó folyamatokban) szérum prolactin szintek észlelhetők.

II.3.4. Kezelés és prognózis GH-pótló kezelésre jelenleg szintetikus, rekombináns géntechnológiával előállított, a szervezetben termelödő természetes GH-val azonos aminosav tartalmú készítmények állnak rendelkezésre. A jelenleg forgalomban levő készítmények methioninnal nem derivált somatropint tartalmaznak. A készítmények 1 mg-ja a WHO referencia szerint 3 NE-nek felel meg. Gyermekkorban az epiphysis fúgák záródását megelőzően naponkénti adagolása javasolt az esti órákban. Felnőttkorban a GH készítményeket szintén napi egy alkalommal adagolják, a gyermekkori kezeléshez hasonlóan az esti órákban sc injekció formájában. Tartós hatású (depot) GH-készítményekkel jelenleg folynak klinikai vizsgálatok. Napjainkban a kezdő GH adag

pubertás előtti

gyermekeknél 0,5 NE/tsúlykg/hét (25 µg/kg/nap). a serdülés klinikai jeleinek megjelenését követőt 1 NE/kg/hét (50 µg/kg/nap). Az epiphysis fúgák záródását követően az ajánlott napi GH adag 3-4 NE. A kezelés hatékonyságát az epiphysis fúgák záródását megelőzően a növekedési ráta (kor és nem specifikus növekedési ráta percentilis érték), a kéz rtg vizsgálata alapján megállapított csontkor-változás és a kezelés alatt a szérum IGF-1 szint tükrözi (az életkornak megfelelő normális értékekhez viszonyítva értékelik). Felnőttkorban a GH-pótló kezelés adagja a gyermekkorban alkalmazott dózisokhoz képest lényegesen kisebb (átlagos fenntartó adag: 0,9-2,0 NE). A gyermekekhez hasonlóan felnőttekben is szérum IGF-1 vizsgálat a kezelés ellenőrzésének legfontosabb eszköze. A gonadotropinok elégtelen szekréciója esetén a másodlagos nemi jelleg kialakítására

leányokban

fokozatosan

23

növekvő

adagban

orális

ösztrogén

készítményeket, majd kb. 2 éves kezelést követően kombinált ösztrogén és progeszteron készítményeket alkalmaznak. Fiúkban a hypogonadismus kezelésére hazánkban leggyakrabban tesztoszteron im injekciós készítményeket adagolnak (kezdő adag: 25-50 mg tesztoszteron enanthat im injectio 3-4 hetente). A kezelés hatékonyságát a pubertas folyamatának alakulása jelzi. Felnőtt férfiakban az átlagos fenntartó adag 250 mg tesztoszteron enanthat im injekció 2-4 hetente (újabban 1000 mg depot im injekció 3 havonta). Férfiakban (különösen idősebb korban) a kezelés előtt prosztata vizsgálat és szérum PSA vizsgálat javasolt. A kezelés optimális adagjának beállításához a klinikai tünetek alakulásán kívül a szérum tesztoszteron vizsgálat nyújthat támpontot. Férfiak hypogonadotrop hypogonadismusa esetén a terápia kezdetekor az endogén tesztoszteron szekréció növelésére humán choriogonadotropin készítmények adhatók, azonban ezek tartós adagolása – a biológiai ineffektivitást okozó antitest képződés miatt – nem ajánlott. Szintetikus FSH tartalmú készítményeket nagy költségük miatt tartós kezelésre ritkán alkalmaznak; használatuk rendszerint az infertilitás kezelésére korlátozódik. A TSH csökkent szekréciója következtében kifejlődő centrális hypothyreosis szubsztitúciós kezelésére orális levothyroxin-natrium készítményeket alkalmaznak. Átlagos napi adagjuk 75-150 µg (reggel, étkezés előtt fél órával). A kezelés a szérum szabad T4 vizsgálattal ellenőrizhető. Az ACTH szekréció csökkenése centrális hypadreniát okoz. Az akut hypadeniás krízis életet veszélyeztető állapot, a krízis állapot kezelésére nagy adag hydrocortison csepp-infúzió adására van szükség egyéb szupportiv kezelés mellett. A hypadrenia krónikus kezelésére a hydrocortison napi adagja felnőttekben 20-25 mg p os (két vagy három részre elosztva). Gyermekekben a GH és ACTH hiány együttes fennállásakor glukokortikoid készítményeket rendszerint csak akkor alkalmaznak, ha a centrális hypadrenia súlyos és klinikai tünetekkel jár, ugyanis a glukokortikoidok ronthatják a GH-kezelés hatékonyságát. Stressz-szituációk esetén azonban ilyen esetekben is szükség van a glukokortikoid pótlásra. A gyógyszeres kezelés megfelelő adagjának beállítását a klinikai tünetek alakulása és laboratóriumi vizsgálatok segíthetik (vérnyomás, testsúly, ionogram, vércukor). MPHD esetén a centrális hypothyreosist a GH-kezelés megkezdése előtt megfelelő pajzsmirigy hormon pótlással rendezni kell és a GH-kezelést az euthyreoticus

24

állapot elérése után kell elkezdeni. A GH-kezelés alatt, különösen a kezelés első évében, a szabad fT4 szint rendszeres ellenőrzése ajánlott, ugyanis a GH-kezelés bevezetését átmeneti hypothyreosis kisérheti. A pajzsmirigy hormonpótló kezelés során figyelmet kell fordítani arra, hogy a thyroxin-kezelés serkentheti a glukokortikoidok metabolizmusát. Gyermekekben a hormonpótló kezelés megfelelő hatékonyságát a növekedési ráta és a csontérés kedvező alakulása tükrözi. A felnőttkori MPHD a szomatikus tüneteken és kórjeleken kívül súlyos neuropszichiátriai tünetekkel járhat (demencia, delirium, apathia, depresszió) (Aszalós, 2007). Megfelelő hormonpótló kezeléssel a tünetek megelőzhetők, illetve enyhíthetők. Hypopituitarismusban szenvedő betegek mortalitása nagyobb az átlagos populáció mortalitásához viszonyítva (Rosén és Bengtsson, 1990). A vizsgálatok szerint a betegek vasculáris károsodásból eredő halálozása az átlagos populációhoz képest kétszer gyakoribb és a nagyobb mortalitás független a hypopituitarismus etiológiájától és a hormon-hiány súlyosságától. A vascularis halálozás kiemelt kockázati tényezői a GH-hiány következményeként megváltozott carotis arteria intima-media falvastagság arány, a szimpatikus vasoconstrictio növekedése, az endothel funkció zavar, a megnövekedett szérum interleukin 6 szint, a kóros lipid profil (megnövekedett összes és LDL-koleszterin, csökkent HDL-koleszterin szint) és az alvadási paraméterekben megfigyelhető változások. A felnőttkori GH-pótló kezelés ezeket a kóros eltéréseket javíthatja, bár a GH-kezelésnek a vasculáris mortalitásra gyakorolt hatásának pontos felméréséhez még további hosszútávú követéses vizsgálatokra van szükség. Hypopituitarismusban

a

megfelelő

hormon-pótló

kezelés

a

csontok

ásványianyag tartalmának tekintetében is kiemelt jelentőségű. A csontanyagcsere az osteodensitometriás vizsgálaton kívül a csont turnover biokémai markereinek vizsgálatával követhető (Shalet és Shavrikova 2003). II.4.

A hypophysis transzkripciós faktorok veleszületett zavarához társuló kórképek klinikai jellegzetességei

genetikai

Az agyalapi mirigy fejlődését és a hormon-termelő sejtek differenciálódását szabályozó transzkripciós faktorok zavara az esetek egy részében az agyalapi mirigy működésének izolált zavarát okozza (pl. PROP1, POU1F1 gén defektus), más esetekben a MPHD-hez a hypophysisen kívül más szervek fejlődési rendellenessége is társul (pl. HESX1, LHX3,

25

LHX4 gén defektus) (Reynaud és mtsai 2004). Az alábbiakban a hypophysis fejlődési folyamatát követve tárgyalom az MPHD-t okozó transzkripciós faktor gén defektusokhoz társuló kórképek klinikai jellegzetességeit. A transzkripciós faktorokat kódoló gének mutációi következtében kialakuló fenotipust a gének expressziós mintázata, kölcsönhatásai és a cél gén(ek) funkciója határozza meg. Ez magyarázatot adhat a klinikai kép változékonyságára, amely izolált vagy többszörös hormon-hiány, vagy komplex klinikai fenotípus (pl. septo-opticus dysplasia) formájában nyilvánulhat meg (Scully és Rosenfeld 2002, Kelberman és Dattani 2006, Quentien és mtsai 2006). A GH-hiánnyal társult MPHD-t okozó géndefektusok legfontosabb klinikai jellemzőit a 4. táblázat foglalja össze (Halász és mtsai 2007). 4. táblázat. Többszörös hypophysis hormon-hiánnyal összefüggő gének és a génmutációk következtében kialakuló kórképek klinikai jellegzetességei Gén

Lókusz

HESX1 3p21.1-3p21.2

Hormon-hiány

Egyéb eltérés

izolált/MPHD*

septo-opticus dysplasia

Öröklésmenet AR/AD

MPHD* rövid, rigid nyaki csigolyák, (GH, TSH, Prl, beszűkült nyaki rotáció AR LH, FSH) LHX4 1q25 MPHD* Arnold-Chiari malformáció (GH, TSH, ACTH AD vagy GH, TSH, Prl, LH, FSH, ACTH) PROP1 5q35.3 MPHD (GH, TSH, Prl, LH, AR FSH) (ACTH?) POU1F1 3p11 MPHD* AR/AD (GH, TSH, Prl) AR: autoszomális recesszív öröklésmenet; AD: autoszomális domináns öröklésmenet; *: korai életkorban jelentkező hormon-hiány LHX3

9q34.3

II.4.1. HESX1 A septo-opticus dysplasia klinikai megjelenése változatos (Thomas és mtsai 2001, Birkebaek és mtsai 2003). A kórkép jellemzői a nervus opticus hypoplasia (egy- vagy kétoldali), az agy középvonali struktúráinak fejlődési rendellenessége (corpus callosum agenézia vagy hypoplasia, septum pellucidum hiány),a hypophysis hypoplasia, melyhez

26

izolált (általában GH) vagy többszörös hypophysis hormon-hiány társulhat (diabetes insipidussal vagy anélkül). A kórkép többnyire sporadikus, de családi halmozódás is ismert (Wales és Quarrell 1996). A septo-opticus dysplasia kialakulását számos exogén és endogén tényező befolyásolja. HESX1 gén defektus az esetek kis százalékában igazolható. Septo-opticus dysplasiás (SOD) betegekben a HESX1 gén homozygota missense mutációját elsőként Dattani és mtsai 1998-ban mutatták ki. Később betegség-okozó heterozygota inzerciós és missense mutációkat is találtak. A HESX1 gén defektust inkomplett penetrancia jellemzi. Genotipus-fenotipus összefüggést eddig nem találtak. Carvalho és mtsai 2003ban septo-opticus dysplasia nélküli MPHD esetében is észleltek betegség-okozó HESX1 gén mutációt.

II.4.2. LHX3 és LHX4 Az LHX3 gén mutációi a PROP1 gén mutációkhoz hasonlóan MPHD-t okozhatnak (GH, TSH, Prl, FSH és LH hiány, az ACTH termelés normális). Hypoplasiás, normális vagy hyperplasiás hypophysis egyaránt előfordulhat. A betegek egy részében az MPHD klinikai képéhez a nyaki csigolyák fejlődési rendellenessége, beszűkült nyaki rotációs képesség társul (75-85º, normális: 160-180º). Ezekben az esetekben az LHX3 gén mutáció az LHX3 fehérje amino- és carboxy-terminálisának módosulását okozta. Az LHX3 gén 3 autoszomális recesszív mutációja ismert. A heterozygota mutációt hordozó családtagok tünetmentesek. MPHD izolált eseteiben Pfaeffle 2007ben az LHX3 fehérje amino-terminális és HD szakaszát kódoló LHX3 gén régióban mutatott ki mutációkat (LHX3a W224Ter). Az LHX4 gén mutációja MPHD-t okoz, amelyhez a sella és a kisagyi tonsillák fejlődési rendellenessége társul. Újszülöttkorban a klinikai képet kritikusan súlyos állapot, légzészavar és hypoglycaemia jellemzi (Tajima és mtsai 2007). A kórkép autoszomális domináns öröklődésű (Machinis és mtsai 2001). A 6. exon P366T heterozygota missense mutációja korai gyermekkorban az adenohypophysis valamennyi sejtvonalának (GH, Prl, TSH, LH, FSH, ACTH) elégtelen működését okozhatja, amelynek hátterében a hormon-termelő sejtek fokozott apoptosisa valószínűsíthető.

27

II.4.3. PITX2 A Rieger szindróma változatos fenotípussal járó tünetegyüttes, melynek genetikai háttere heterogén. A szindrómát (OMIM: 601542) az elülső szemcsarnok anomáliája, fog hypoplasia, enyhe craniofacialis dysmorphia és köldökcsonk rendellenesség (protrusio) jellemzi, melyekhez esetenként a szív, a végtagok és az agyalapi mirigy fejlődési rendellenességgel társul. Öröklődése autoszomális domináns. Rieger szindrómás betegek egy csoportjában a PITX2 gén mutációját igazolták Semina és mtsai (1996). A PITX2 domináns és ”loss of function” mutációi ismertek. Nagyér transzpozicióban szenvedő betegekben is kimutattak PITX2 gén mutációt (Muncke és mtsai 2005).

II.4.4. PROP1 A kórképet elégtelen GH, TSH, Prl, LH és FSH képzés jellemzi. Bár a PROP1 gén defektusra MPHD kialakulása jellemző, Reynaud és mtsai egy családon belül izolált hypogonadotrop hypogonadismusban szenvedő 3 férfiban a PROP1 gén homozygota W194X mutációját mutatták ki (Reynaud és mtsai 2005). Az ACTH termelés zavara a PROP1 gén defektus nem szükségszerű velejárója, kialakulásában elsősorban a sejtek közötti együttműködés hiányának, illetve az átmeneti hypophysis hyperplasia sejtkárosító hatásának tulajdonítanak szerepet (Ward és mtsai 2005). Átmeneti hypophysis mellső lebeny hyperplasiát a PROP1 gén defektusos betegek egy részében mutattak ki, a betegek másik részében radiológiai képalkotó vizsgálatokkal hypoplasiás agyalapi mirigyet találtak (Mendoca és mtsai 1999, Voutetakis és mtsai 2004). A PROP1 gén mutációja a POU1F1 gén mutációval együtt a veleszületett MPHD leggyakoribb genetikai oka. A gén defektus vérrokon szülők utódaiban és családi halmozódást mutató MPHD-ben szenvedő betegekben gyakrabban fordul elő. Egy 29 tagú tunéziai család 13 tagjánál igazolódott hypopituitarismus. Tíz betegben került sor a PROP1 gén szekvencia analizisére, melynek kapcsán valamennyi betegben homozygota Arg73Cys mutáció igazolódott (Reynaud és mtsai 2004). A felnőttkorig nem diagnosztizált és nem szubsztituált betegek adatainak elemzése is a PROP1 gén defektus okozta MPHD változatos klinikai megnyilvánulását igazolja (Viera és mtsai

28

2006) A betegség öröklődése autoszomális receszív. A PROP1 gén mutáció különösen a kaukázusi populációban tűnik gyakorinak, előfordulása etnikai különbözőséget mutat.

II.4.5. POU1F1 A POU1F1 gén mutációhoz társuló esetek jelentős részében a súlyos GH és Prl hiány már kora gyermekkorban kimutatható. A betegekben általában a TSH szekréció zavar enyhe és a későbbi életkorban menifesztálódik, azonban korai gyermekkorban megnyilvánuló, súlyos centrális hypothyreosis kialakulása is ismert (Pfaeffle és mtsai 1992). A POU1F1 gén defektus nem okoz agy fejlődési rendellenességet, a hypophysis normális nagyságú vagy hypoplasiás, az infundibulum és a hátsó lebeny helyzete és szerkezete normális. A mutációk jelentős része a

POU-specifikus és a POU

homeodomainben fordul elő. Ezen mutációk autoszomális recesszív öröklődésmenetet mutatnak, míg a gén más szakaszait érintő mutációk öröklődésmenete autoszomális domináns.

29

III. CÉLKITŰZÉSEK Munkámban

veleszületett

hypophysis

hormonhiányban

szenvedő

betegek

anthropometriai és hormonlaboratóriumi vizsgálatainak eredményeit dolgoztam fel és molekuláris genetikai vizsgálatokkal tanulmányoztam a betegség hátterében álló genetikai eltéréseket. A molekuláris biológiai vizsgálatok keretében a hypophysis hormon-termelő sejtjeinek fejlődésében és működésében kiemelkedő szerepet játszó három hypophysis transzkripciós faktor gén mutációit vizsgáltam (PROP1, POU1F1 és PITX2). Célkitűzéseimet az alábbi 5 pontban fogalmaztam meg: 1. Növekedési hormon-hiányban szenvedő gyermekek kezelésére hazánkban 1977 óta állnak rendelkezésre országosan szervezett keretek között humán növekedési hormon készítmények. A kezelés kezdeti tapasztalatainak felmérésére célul tűztem ki idiopathiás növekedési hormon-hiányban szenvedő gyermekekben az elsőként

rendelkezésre

álló

növekedési

hormon

készítmény

(Grorm)

alkalmazásával nyert eredmények elemzését. 2. Veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben a PROP1 gén mutációk betegség-okozó szerepéről az első nemzetközi közlemény 1998-ban jelent meg, a génmutációk gyakoriságát felmérő későbbi vizsgálatok azonban jelentősen különböző gyakoriságot jeleztek. Ezért munkámban célul tűztem ki veleszületett többszörös hypophysis hormon-hiányos hazai betegek körében a PROP1 gén mutációk gyakoriságának és spektrumának meghatározását 3. Veleszületett

többszörös

hypophysis

hormon-hiányos

betegek

klinikai,

hormon-laboratóriumi és genetikai vizsgálatok eredményeinek elemzésével választ kívántam nyerni arra a kérdésre, hogy a betegség-okozó PROP1 gén mutációt hordozó hypophysis hormonhiányos betegek klinikai és/vagy hormon-laboratóriumi paraméterei különböznek-e a PROP1 gén mutációt nem hordozó

hypophysis

hormon-hiányos

30

betegek

paramétereitől. Célul

tűztem ki továbbá betegség-okozó PROP1 gén hypophysis és/vagy

hormon-hiányos

betegekben

mutációt hordozó többszörös a mutációk típusa és a klinikai

hormon-laboratóriuni eltérések közötti lehetséges összefüggések

elemzését. 4. Nemzetközi irodalmi adatok szerint veleszületett hypophysis hormonhiányos betegekben a PROP1 gén mutációknál lényegesen ritkább POU1F1 gén mutációk a gén meghatározott szakaszán (mutációs ”hot spot”) találhatók. Munkámban választ kívántam nyerni arra a kérdésre, hogy többszörös hypophysis hormon-hiányos hazai betegekben a POU1F1 gén leggyakoribb mutációs helyén előfordulnak-e betegség-okozó mutációk. 5. A PITX2 gén a hypophysis hormon-termelő sejtjeinek fejlődésén és működésén kívül állatmodellekben a szervezet bal/jobb aszimmetriájának kialakításában is szerepet játszik. Munkámban egy veleszületett többszörös hypophysis hormon-hiányban és situs inversus totalisban szenvedő betegben a PROP1,

POU1F1 és PITX2 gének vizsgálatával a veleszületett többszörös

hypophysis hormon-hiány és a situs inversus totalis közös genetikai hátterének lehetőségét kívántam tanulmányozni.

31

IV. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK IV.1. Betegek IV.1.1. Növekedési hormon kezelés hatékonyságának felmérése növekedési hormon-hiányos gyermekekben GH-hiányos gyermekekben az epiphysis fúgák záródását megelőzően alkalmazott tartós GH-kezelés hatékonyságának felmérésére három hazai gyermekendokrinológiai centrum résztvételével retrospektív felmérést végeztem. A vizsgálatban 14 GH-pótló kezelésben részesülő hypopituiter beteg adatát dolgoztam fel (Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekklinika 8 beteg, Budai Gyermekkórház 2 beteg, Pécsi Orvostudományi Egyetem 4 beteg). 14 beteg közül 5 betegben izolált GH-hiányt, 2 betegben GH és TSH hiányt, 7 betegben pedig az összes hypophysis hormon hiányát (panhypopituitarismus) találtam. A betegek 7 évnél hosszabb ideig részesültek Grorm kezelésben (emberi hypophysisből extrahált növekedési hormon készítmény, Serono). Az adatok feldolgozásakor a betegek már nem kaptak Grorm kezelést, a GH-kezelés az epiphysis fúgák zárodását, illetve a kívánt testmagasság elérését követően befejeződött. A kezelés megkezdésekor a betegek átlagos életkora 8 év volt, a Grorm kezelés átlagos időtartama 9,2 év volt.

IV.1.2. Hypophysis transzkripciós faktor gén mutáció vizsgálat többszörös hypophysis hormon hiányban szenvedő betegekben A hypophysis transzkripciós faktorokat kódoló gének mutációanalízisét MPHD-ban szenvedő

betegekben

végeztem.

A

betegeket

hét

gyermek-,

illetve

felnőtt

endokrinológiai centrum közreműködésével 3 év alatt vontam be a vizsgálatba. A betegek vizsgálatba bevonását előre rögzített feltételekhez kötöttem, amelyek az alábbiak voltak: (1) endokrinológiai vizsgálatokkal egyértelműen igazolt GH-hiány, amelyhez legalább még egy hypophysis mellső lebeny hormon hiánya társult; (2) az MPHD gyermekkorban kezdődött és (3) hátterében ismert okot (szülési sérülés perinatális hypoxiával; koponyatrauma; intracranialis tumor, sella-tájéki és/vagy hypothalamus tumor) nem lehetett igazolni. A betegek szülei között vérrokonság nem fordult elő.

32

A családi anamnézis alapján familiaris MPHD-t 3 családban találtam. Összesen 32 családból 35 MPHD beteget (13 lány/nő; 22 fiú/férfi) vizsgáltam. (Három családban 2-2 MPHD beteg gyermek került vizsgálatra. A testvérpároknak több testvére egyik családban sem volt). A betegek anamnézisében kromoszóma rendellenesség, krónikus betegség, agydaganat,

idegsebészeti beavatkozás, fej-nyak tájéki besugárzás nem

fordult elő. A GH-hiány diagnózisának megállapításakor, illetve a GH-pótló kezelés kezdetekor a betegek átlagos életkora 7,7±3,6 év volt. A molekuláris biológiai vizsgálatok végzésekor a betegek átlagos életkora 21,8±9,3 év volt.

IV.1.3. Többszörös hypophysis hormon-hiány és situs inversus totalis társulása A molekuláris biológiai vizsgálatokba bevont 35 MPHD beteg közül egy betegben a klinikai vizsgálatok situs inversus totalist igazoltak. A vizsgálat idején 52 éves férfi szülei harmadik gyermekeként született, szülei között vérrokonsági kapcsolat nem volt. A szülők első gyermeke 11 hónapos korában ismeretlen eredetű súlyos fertőzés következtében elhúnyt. A beteg szövődménymentes terhességből a 40. gesztációs héten per vias naturales született. Születési súlya 3500 gramm volt, a születési hosszra vonatkozóan pontos adat nem állt rendelkezésre. Három éves korban készült mellkas röntgen felvételen dextrocardia igazolódott, a további klinikai vizsgálatok situs inversus totalist mutattak ki. Tíz éves koráig ismételten kezelték súlyos légúti betegségek, pneumonia miatt. Általános iskolai tanulmányai megkezdésekor már ismert volt súlyos növekedésbeli elmaradottsága, a pubertas korban a másodlagos nemi jelleg kifejlődése is elmaradt. A beteget először 25 éves korában vizsgálták hypophysis hormon-hiány gyanúja miatt. Ekkor testmagassága 140 cm volt (-5,2 SDS), az alacsonynövéshez hypopituitarismus jellegzetes klinikai tünetei társultak. A hormonvizsgálatok súlyos GH-hiányon kívül ACTH, TSH, Prl, LH és FSH hiányt igazoltak. A beteg levothyroxin, hydrocortison, tesztoszteron és GH-pótló kezelésben részesült. A GH-kezelés 3 év után megszakadt, a beteg testmagassága ekkor 160 cm volt. A tesztoszteron-pótló kezelés a beteg 40 éves korában – hepatitis C vírusfertőzést követően – szintén megszakadt. A perifériás vér cytogenetikai vizsgálat 46,XY karyotípust mutatott ki.

33

IV.2. Klinikai vizsgálatok

IV.2.1. Anthropometriai vizsgálatok A születési súly és hossz, a perinatális anamnézis és a szülők testmagasságának adatait a rendelkezésre álló orvosi dokumentációból gyűjtöttem össze. A betegek testmagasságát az endokrinológiai centrumok dokumentációjából rögzítettem. A testmagasság adatokat a kor- és nem-specifikus magyarországi referencia adatok alapján értékeltem, az eltérést standard deviációs értékben fejeztem ki (Eiben és mtsai 1991). A hosszkor a hazai referencia adatok alapján számított átlagos testmagasságot alapul véve adja meg az aktuális testmagasságnak megfelelő életkort. A csontkor meghatározása a nem domináns oldali csukló/kéz rtg felvétel alapján történt. A felvételeket radiológus szakorvos értékelte Greulich-Pyle módszerrel, összehasonlító atlasz segítségével (Greulich és Pyle 1959).

IV.2.2. Hormonvizsgálatok és dinamikus tesztek A hypophysis mellső lebeny működését bazális szérum hormonszintek és standard dinamikus tesztek eredményei alapján értékeltem. A hormonvizsgálatokra a vérvétel éhgyomorra, reggel 8,00-09,00 óra között történt. A hormonszinteket minden esetben hagyományos immunoassay kit-ekkel határozták meg. A bazális és stimulált hormonkoncentrációk normális értékeit a 3. táblázat mutatja be. Gyermekkorban a GH-termelő kapacitás meghatározása két különböző standard dinamikus (stimulációs) teszt eredményére alapult. A nemzetközi ajánlásoknak megfelelően a GH-hiány diagnózisát akkor állapították meg, ha a stimuláció utáni szérum GH koncentrációk mindkét teszt alatt a normális stimulált GH-válasznak megfelelő érték alatt maradtak (szérum GH <7 ng/ml). A gyermekkori kezdetű GHhiányos betegek egy része a növekedés befejezése után folytatta, illetve újrakezdte a GH-kezelést; ezeknél a betegeknél a felnőttkori GH-kezelés szakmai protokollja szerint a kezelés megkezdése előtt a felnőttkori GH-hiány fennállásának bizonyítására egy GHstimulációs tesztet végeztek (GH-hiány esetén stimulált szérum GH <3 ng/ml). A hypophysis-pajzsmirigy tengely működés felmérésére bazális és dinamikus hormonvizsgálatokat végeztek. A centrális hypothyreosis diagnózisát a normálisnál

34

alacsonyabb szérum T4, illetve szabad T4 értékek mellett alacsony vagy normális szérum TSH szintek alapján állapították meg. A betegek többségénél a TSH és Prl szekréciós kapacitás felmérésére TRH-tesztet is végeztek. A vizsgálatokat minden esetben a pajzsmirigy hormonpótló kezelés megkezdése előtt, illetve újrafelmérés szükségessége esetén a hormonpótló kezelés megfelelő idejű felfüggesztése után végezték. A gonadotropin-hiány igazolása a pubertás körüli években történt a pubertás klinikai jeleinek, illetve a szérum szexuál szteroid (fiúkban szérum tesztoszteron, leányokban szérum ösztradiol) és a szérum LH és FSH koncentrációk együttes értékelése alapján. A betegek nagy részénél GnRH tesztet is végeztek; a teszt elvégzésére minden esetben a szexuál szteroid pótló kezelés bevezetése előtt került sor. A hypophysis mellékvesekéreg tengely működését a bazális (reggeli) szérum kortizol értékek és az inzulin tolerancia teszt során mért szérum kortizol értékek alapján mérték fel. A vizsgálatokat minden esetben a glukokortikoid hormonpótló kezelés megkezdése előtt, illetve újrafelmérés szükségessége esetén a hormonpótló kezelés megfelelő idejű felfüggesztése után végezték.

IV.2.3. Radiológiai vizsgálatok A hypothalamus-hypophysis régió morfológiájára vonatkozó adatokat a betegek sellatájéki régiójáról készült rtg, komputer tomográfia (CT) és mágneses rezonancia (MRI) vizsgálatoktól rögzített radiológiai vélemény alapján retrospektív módon elemeztem. A sella rtg. felvételen a sella alakját, nagyságát (normális, kicsiny vagy tág sella) és a sella csontos falának épségét értékelték. Az sella-tájéki MRI vizsgálat során natív és kontrasztanyag (Gadolonium) adását követően sagittalis és coronalis síkú T1 súlyozott felvételek és coronális T2 súlyozott felvételek készültek. A radiológiai lelet tartalmazta a középvonali struktúrák leírását, az intracraniális, illetve intraselláris térfoglaló folyamatra utaló jeleket, a hypophysis

hypoplasia

hypophysis állományának méretét, homogenitását, a

vagy

hyperplasia

jelenlétét

és

a

neurohypophysis

elhelyezkedését (normális vagy ectopiás neurohypophysis). A situs inversus totalissal társult MPHD-ban szenvedő betegnél anatómiai és funkcionális MRI vizsgálat elvégzésére is sor került (Szentágothai János Tudásközpont, MR Kutatóközpont, 3.0-Tesla Philips Achieva scanner, Philips, Netherlands).

35

IV.3. Immuncytokémiai vizsgálatok többszörös hypophysis hormonhiánnyal társuló situs inversus totalis esetében A situs inversus totalishoz társult MPHD-ban szenvedő betegnél transznasalis kefebiopsziával a nasopharynx területéről epithel sejteket nyertünk. Az epithelsejtek csillóinak

motilitását

fénymikroszkóp

segítségével

vizsgáltuk.

Az

eltávolított

epithelsejteket sejtmédiumban mostuk, majd tárgylemezen levegőn megszárítottuk. A mintát -80 ºC-on tároltuk. Az epithelsejtek DNAH5 külső dynein fehérje vizsgálatát indirekt immuncitokémiai módszerrel, nyúlban előállított DNAH5-ellenes antitest felhasználásával Dr. Heymut Omran kutatólaboratóriumában (Freiburg) végezték. IV.4. Molekuláris biológiai vizsgálatok A hypophysis transzkripciós faktorokat kódoló gének (PROP1, POU1F1, PITX2) mutáció analízise a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Genetikai Laboratóriumában történt.

IV.4.1. PROP1 gén mutáció vizsgálata A vizsgálatokhoz a betegek és szüleik írásos beleegyezésüket adták. A betegektől két, egyenként 9 ml-es EDTA-val alvadásgátolt vérvételi csőbe perifériás vérmintát vettünk. A fehérvérsejtekből kereskedelmi forgalomban kapható standard kit-ek segítségével (Boehringer Mannheim Corporation, Indianapolis, IN, USA, illetve QIAamp DNA Blood MiniKit, Qiagen, CA, USA) genomikus DNS-t izoláltunk. A DNS mintákat a felhasználásig –80º-on tároltuk. A PROP1 gén mutáció analíziséhez a gén három kódoló exonját polimeráz láncreakcióval (PCR) amplifikáltuk. A PCR amplifikáláshoz az irodalomban közölt nukleotid szekvenciájú oligonukleotid primer-párokat (Deladoey et al., 1999) (5. táblázat), vagy a szekvenáláshoz használt készüléktől függően M13véggel kiegészített primer-párokat használtunk (lásd később). A primer-párokat úgy tervezték, hogy azok alkalmasak legyenek a vizsgált exonon kívül az exon közeli intronikus szakaszokon előforduló mutációk detektálására. A PCR amplifikációt követő szekvenálásra használt készülék típusától függően az

amplifikáláshoz

kétféle (eredeti vagy M13 véggel módosított)

36

primer-párt

használtunk. Az irodalomban közölt eredeti primer-párokat (5. táblázat) alkalmaztuk azokban a vizsgálatokban, amelyekben a szekvenálást ABI Prism 310 kapilláris DNS szekvenáló készüléken végeztük, míg a LiCOR IR2 DNS-szekvenáló készülékkel végzett szekvenálás esetén a primereket M13-véggel módosítottuk. A módosított primerek nukleotid szekvenciája forward primer esetében 5’-3’ irányban ”CAC GAC GTT GTA AAA CGA C” szakasszal, a reverse primerek esetében pedig 5’-3’ irányban ”GGA TAA CAA TTT CAC ACAGG” szakasszal bővült. A módosított primerek biztosították, hogy a szekvenálási reakcióban használt fluoreszcens festéket (IRD800) tartalmazó univerzális primer felismerje a PCR terméket. A reakcióelegy összetétele az alábbi volt: 50 µl végtérfogatban 100-200 ng DNS, 25-25 pmol forward és reverse oligonukleotid primer pár, 25 µl Immomix 2x (Bioline GmBH, Luckerwalde, Németország) reagens, amelynek összetevői: IMMOLASE™ DNS polimeráz, 32 mM (NH4)2SO4, 134 mM Tris-HCl (pH 8,3 25°C-on), 0,02% Tween 20, 2 mM dNTP, stabilizátor, 3 mM MgCl2. A PCR reakció az alábbi lépéseket tartalmazta: kezdeti denaturáció 95 ˚C-on 7 percig, amelyet 95 ˚C-on 1 perc denaturáció, 63 ˚C-on (1. és 3. exon esetében), illetve 55 ˚C-on (2. exon esetében) 1 perc betapadás és 72 ˚C-on 0,5 perc elongáció követett 35 ciklusban. A végső extenzió 72 ˚C-on 10 percig tartott. A PCR termékeket alkoholos oszlopos átmosással tisztítottam (High Pure PCR product, Roche Diagnostics, Mannheim, Németország). A reakciótermék tisztítása után ABI Prism 310 kapilláris DNS szekvenáló készülékkel történő szekvenálás esetén a szekvenálási reakcióhoz ”BigDye Terminator Cycle Sequencing” kit-et (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) használtunk és a reakcióterméket kapilláris elven működő ABI Prism 310 DNS szekvenáló készüléken (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) analizáltuk. Azoknál a mintáknál, amelyeket a LiCOR IR2 DNS-szekvenáló készüléket használtuk, a szekvenálási reakciót standard infravörös festékkel (IRD800) jelölt M13-as primerekkel, ”Cyclesequencing

kit

with

7-deaza”

(Pharmacia

Biotech,

Uppsala,

Svédország)

felhasználásával végeztük. A keletkezett termékeket poliakrilamid gélen automata LiCOR IR2 DNS-szekvenáló készüléken (Li-COR Inc., Lincoln, USA) elemeztük. Mindkét szekvenálási módszerrel a nukleotid szekvenciákat mind forward, mind reverse

37

irányból meghatároztuk. A reakcióelegyek összeállítása és a szekvenálási folyamat mindkét esetben a gyártók ajánlása szerint történt. A kapilláris elven működő ABI Prism 310 DNS szekvenáló készüléken elemzett minták vizsgálatához a Semmelweis Egyetem

Bőrklinika

laboratóriumában

rendelkezésünkre

bocsájtott

készüléket

használtuk.

IV.4.2. Egyéb hypophysis transzkripciós faktorokat kódoló gének mutáció vizsgálata A POU1F1 gén leggyakoribb mutációs helyének, a 6. exon analíziséhez a PROP1 gén mutációvizsgálathoz hasonlóan PCR reakciót követően szekvenálást végeztünk. A PCR reakcióhoz a nemzetközi irodalomban leírt primereket (Malvagia et al., 2003) (5. táblázat) M13 véggel egészítettük ki (lásd a PROP1 gén mutációk vizsgálatának leírását). A primer-párt úgy tervezték, hogy alkalmas legyen a 6. exonon kívül az exon közeli intronikus szakaszokon előforduló mutációk detektálására. A PCR elegy 100-200 ng DNS-t, 25-25 pmol M13 véget tartalmazó forward és reverse oligonukleotid primer párt, 25 µl Immomix 2x oldatot (Bioline GmBH) tartalmazott 50 µl végtérfogatban. A PCR reakció az alábbi lépéseket tartalmazta: kezdeti denaturáció 95 ˚C-on 7 percig, amelyet 95 ˚C-on 1 perc denaturáció, 60 ˚C-on 1 perc betapadás és 72 ˚C-on 0,5 perc elongáció követett 37 ciklusban. A végső extenzió 72 ˚C-on 10 percig tartott. A PCR termék tisztítását követően a szekvenálási reakciót standard infravörös festékkel (IRD800) jelölt M13-as primerekkel, ”Cycle-sequencing kit with 7-deaza” (Pharmacia Biotech) felhasználásával végeztük és a mintákat LiCOR IR2 DNS-szekvenáló készüléken (Li-COR Inc.) analizáltuk. A nukleotid szekvenciákat mind forward, mind reverse irányból meghatároztuk. A reakcióelegy összeállítása és a szekvenálási folyamat a gyártó ajánlása szerint történt. A situs inversus totalissal társult MPHD-ban szenvedő betegnél a PROP1 és POU1F1 gének teljes kódoló szakaszainak (1-6 exonok) vizsgálatán kívül a PITX2 gén összes kódoló exonjának (4-7 exonok) mutációanalízisét is elvégeztük. A POU1F1 gén 1-6 exonjait PCR reakcióval amplifikáltuk, a nemzetközi irodalomban leírt primerpárok felhasználásával (Malvagia et al., 2003) (5. táblázat). A PITX2 gén vizsgálatához a primereket Primer3 programmal terveztük (Skaletsky, 2000) (5. táblázat).

38

5. táblázat. A PROP1, POU1F1 és PITX2 gén kódoló exonjainak mutáció analíziséhez használt oligonukleotid primerek* Gén/Exon

Primer-Forward

Primer-Reverz

PROP1 gén 5’-TTCAGAGACAGAGTCCCAGA-3’ 5’-CTCCTAACCTTCTTCATGGA-3’ 1. exon PROP1 gén 5’-GACAGGCACATGTGGTCCA-3’ 5’-AGGCCTGTGTCTGGTGACCA-3’ 2. exon PROP1 gén 5’-TCTGGCCATGCTGGAGAAG-3’ 5’-TTCTAGTCGCTGAGCTGAC-3’ 3. exon POU1F1 gén 5’-CTCAGAGCCTTCCTGATGTATA-3’ 5’-TCAAGATTCAAAGCATTCATTCTG-3’ 1. exon 5’-CGAATGTGTCTTGAATCCTTATACPOU1F1 gén 5’-GAGCAGGAAACAAGAAGTGGTG-3’ 3’ 2 exon POU1F1 gén 5’-AACTACGTCCACAGTAGAGATG-3’ 5’-GCTCTGGAGAAGGTAGAAGACA–3 3. exon POU1F1 gén 5’-GTGTGTAATAGTTGACAAAGATAC–3’ 5’-CATCTCAAAGAGAAAAGGCGG-3’ 4. exon POU1F1 gén 5’-CTGCGTTGAGATTTTTCTCTAAGG5’-GACTGGTCTCGAGCTCCTGAC-3’ 3’ 5. exon POU1F1 gén 5’-CCGTGACTCTCGTGTAACTCT-3’ 5’-AAAATAGATAATGTGGCTTCTGAG-3’ 6. exon PITX2 gén 5’-AGTCTCATCTGAGCCCTGCT-3’ 5’-CTGGCGATTTGGTTCTGATT-3’ 4. exon PITX2 gén 5’-GCTCTTTGTCCCTCTTTCTCC-3’ 5’-CTCGCCTTCTTGCGCTTC-3’ 5. exon 5’-TGACGGGAAAGTGTGTGTGT-3’ 5’-CCTCGGAGAGGGAACTGTAA-3’ PITX2 gén 6. exon 5’-AAAGCTGGCCCTGGTATCTT-3’ 5’-GCCCACGACCTTCTAGCATA-3’ PITX2 gén 7. exon *LiCOR IR2 DNS-szekvenáló készülékkel végzett szekvenálás esetén a primereket M13-véggel egészítettük ki. A POU1F1 és PITX2 gének vizsgálatához használt primerek a vizsgált exonon kívül az exon közeli intronikus szakaszokon előforduló mutációk detektálására is alkalmasak voltak. Az oligonukleotid primer-párokat kivéve a PCR reakció összetétele, a PCR reakció idő- és hőmérséklet paraméterei megegyeztek a POU1F1 gén 6. exon mutációvizsgálatnál leírtakkal. A reakciótermék tisztítása után a szekvenálási reakcióhoz ”BigDye Terminator Cycle Sequencing” kit-et (Applied Biosystems) használtam és a reakcióterméket kapilláris elven működő ABI Prism 310 DNS szekvenáló készüléken (Applied Biosystems) analizáltuk. A nukleotid szekvenciákat

39

mind forward, mind reverse irányból meghatároztuk. A reakcióelegy összeállítása és a szekvenálási folyamat a gyártó ajánlása szerint történt. IV.5. Statisztikai módszerek A számadatokat normális eloszlás esetén átlag és standard deviáció (átlag ± SD) értékekben fejeztem ki. A klinikai jellemzők és a hormonszintek összehasonlításához kétmintás Student-féle t-próbát használtam. Statisztikailag szignifikánsnak a 0,05-nél kisebb p értéket tekintettem. A számításokhoz SPSS v13.0 szoftver program csomagot használtam (SPSS Inc., Chicago, IL, USA).

40

V. EREDMÉNYEK V.1.

Növekedési hormon-hiánnyal társuló hypophysis hormon elégtelenség kezelésének eredményei

GH-hiányos gyermekekben az epiphysis fúgák záródását megelőzően alkalmazott tartós GH-kezelés hatékonyságának felmérésére 14 beteg adatait dolgoztam fel A GHszekréció megítélésére minden betegben az inzulin tolerancia teszten kívül még egy GH-stimulációs próbát végeztek (levodopa, L-arginin vagy clonidin teszt). A betegekben a stimulációs próbák alatt a GH csúcsérték nem haladta meg a 7 ng/ml értéket. A 14 beteg közül 5 betegben izolált GH-hiányt találtam, ezekben a betegekben a GH-hiány mellett egyéb adenohypophysis hormon zavart a GH-pótló kezelés alatt sem észleltem. Két betegben a GH-hiány TSH hiánnyal, 7 betegben TSH, LH, FSH és ACTH hiánnyal társult. A centrális hypothyreosis diagnózisának megállapításakor minden esetben sor került a pajzsmirigy hormon szubsztitúció bevezetésére, a nemi hormon és glucocorticoid pótlás megkezdése a kedvezőbb végmagasság elérésének reményében 3 beteg kivételével a GH-kezelés befejezésének időpontjára halasztódott. A betegek heti 3-4 alkalommal, 6-18 NE/hét adagban intramuscularis injekció formájában kapták a GH készítményt. Az emberi hypophysisből extrahált GH-készítménnyel (Grorm inj.) a kezelés megkezdésekor a betegek átlagéletkora 8,0 év (szélső értékek 4,2-12,1 év), a kezelés befejezésekor 17,8 év (szélső értékek 14-21,2 év) volt. A kezelés megkezdésekor a növekedési retardáció átlaga -3,85 SDS volt (egyes esetekben a növekedés lemaradás igen kifejezett, a legsúlyosabb esetben -7,5 SDS volt). A hosszkor lemaradás a csontkorhoz képest átlagosan -1,5 év volt. A Grorm kezelés átlagos időtartama 9,2 év volt. A betegek egy részében a GH-pótló kezelés még az epiphysisfúgák záródását megelőzően, a kezelési protokolnak megfelelő kívánt testmagasság (leányokban 150 cm, fiúkban 165 cm) elérésekor befejeződött. Ezért a Grorm kezelés befejezésekor megadott testmagasság adatok nem jelzik a végmagasságot. A GH-pótló kezelés megkezdésekor és befejezésekor a betegek testmagasság, testmagasság SDS, hosszkor és csontkor adatait a 6. táblázatban foglaltam össze.(Halász és mtsai 1994). A 14 év feletti csontkor adatokra vonatkozóan pontos adat nem állt rendelkezésre.

41

6. táblázat. Növekedési hormon hiányos betegek klinikai paraméterei a növekedési hormon kezelés előtt és a kezelés befejezésekor (n=14) Grorm-kezelés megkezdésekor átlag

szélső

befejezésekor

átlag

szélső értékek

értékek életkor (év)

8,0

4,2-12,1

17,8

14-21,2

testmagasság (cm)

102

80,8-119,6

157,3

141,1-177,3

testmagasság SDS

-3,85

-7,5-(-3)

-1

-2,9-+2

hosszkor (év)

4,2

< 3-6,5

13,5

11,5-18,5

csontkor (év)

5,6

1,5-9,6

> 14

nem adható meg

V.2.

PROP1 gén mutáció vizsgálat eredményei veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

A GH-szekréció megítélésére az összes vizsgált MPHD betegnél (n=35) két dinamikus (stimulációs) tesztet végeztünk. Az egyik dinamikus teszt minden betegben az inzulin teszt volt, a másik dinamikus teszt az arginin teszt (25 betegben), levodopa teszt (9 betegben) vagy clonidin teszt (1 betegben) volt. A GH-hiány diagnózisát akkor tekintettem bizonyítottnak, ha a vizsgált betegben mindkét dinamikus teszt során a maximum szérum GH-szint 7 ng/ml alatt volt. A 35 betegből 32 esetben súlyos GHhiányt észleltem (a dinamikus tesztek alatt a maximum szérum GH szint <2 ng/ml). A genetikai vizsgálat időpontjában 22 beteg volt 18 évnél idősebb, ezeknél a betegeknél a GH-hiány felnőttkori fennmaradását újabb dinamikus teszttel igazoltuk (valamennyi betegben súlyos GH-hiányt találtunk, a maximum szérum GH szint <3 ng/ml volt). A vizsgált 35 MPHD beteg közül 15 betegben (43%) találtam betegség-okozó PROP1 gén mutációt. A 15 betegből 10 betegben a mutáció homozygota formában fordult elő; négy betegben a 2. exon 301-302delGA mutációját, ugyancsak négy betegben a 2. exon 150delA mutációját, egy betegben a 2. exon Arg73Cys (217C>T)

42

mutációját, egy betegben a 3. exon Phe117Ile (349T>A) mutációját észleltem. További 5 betegben a PROP1 gén szekvencia analizise során két, egymástól eltérő mutációt igazoltam. Ezekben az esetekben a szülői vérmintákból is elvégeztem a PROP1 gén kódoló exonjainak molekuláris genetikai vizsgálatát annak tisztázására, hogy a két különböző mutáció ugyanazon allélen, vagy a két allélen külön-külön fordul-e elő. Az eredmények mind az 5 betegben a PROP1 gén compound heterozygota mutációját bizonyították; 3 betegben 150delA és 301-302delGA mutációt, egy betegben 150delA és Phe117Ile (349T>A) mutációt és egy betegben Arg99Stop (296C>T/301-302delGA mutációt találtam (7. táblázat). A különböző mutációk gyakoriságának összesítése alapján a vizsgált betegekben a mutáns allélok 80%-át a 150delA és 301-302delGA mutációkat tartalmazó allélek tették ki. Ezek az eredmények a korábbi irodalmi adatokkal megegyezően a PROP1 gén 2. exon 296-302 nukleotidok GA dinukleotid tandem ismétlődésének helyén mutációs ”hot spot”-ot jeleznek. A PROP1 gén 2. és 3. kódoló exonjának DNS szekvencia analizise kapcsán igazolt homozygota és heterozygota mutációkból néhányat a 4-7. ábrán mutatok be.

↓

↓

4. ábra. A PROP1 gén 2. exon forward irányú szekvencia részlete. Normális nukleotid szekvencia (felül), 150delA heterozygota (középen) és homozygota (alul) mutációk. (A vizsgálatot LiCOR IR2 DNS-szekvenáló készülékkel végeztem.)

43

↓

↓

5. ábra. A PROP1 gén 2. exon forward (bal oldal) és reverz (jobb oldal) irányú szekvencia részlete. Normális nukleotid szekvencia (felső képek), 301-302delGA homozygota (bal alsó kép) és heterozygota (jobb alsó kép) mutációk. A vizsgálatot LiCOR IR2 DNS-szekvenáló készülékkel végeztem.

C T

6. ábra. A PROP1 gén 2. exon forward irányú szekvencia részlete. Normális nukleotid szekvencia (felső kép) és a 296. nukleotid heterozygota C>T mutációja (alsó kép). A vizsgálatot LiCOR IR2 DNS-szekvenáló készülékkel végeztem.

44

G

T

C

T

G

G

T

T

C

C

A

G

G

T

C

T

G

G

T A

T

C

C

A

G

↓

7. ábra. A PROP1 gén 3. exon forward irányú szekvencia részlete. Normális nukleotid szekvencia (felső kép) és a 349. nukleotid T→A heterozygota mutációja (alső kép). A vizsgálatot ABI Prism 310 kapilláris DNS-szekvenáló készülékkel végeztem.

7. táblázat. PROP1 gén-mutációk és polimorfizmusok, valamint ezek allél-gyakorisága többszörös hypophysis hormon-hiányban szenvedő 35 betegben Mutáció

allél-gyakoriság

Polimorfizmus

1. exon

1.exon

nem volt

Ala9Ala (27T>C)

2. exon

14/70

2.exon

150delA

12/70

296-302delGA

12/70

Arg73Cys (217C>T)

2/70

Arg99Stop ( 296C>T)

1/70

nem volt

3. exon Phe117Ile ( 349T>A)

allél-gyakoriság

3. exon 3/70

Ala142Thr (424G>A)

45

10/70

A PROP1 gén mutációkon kívül az 1 exonon 6 betegben heterozygota és 4 betegben homozygota aminosav cserével nem járó Ala9Ala (27T> >C) polimorfizmust mutattam ki. A 2. exonon nem találtam polimorfizmust. A 3. exonon egy betegben homozygota, 8 betegben pedig heterozygota formában észleltem Ala142Thr (424G>A) polimorfizmust (7. táblázat). V.3.

A klinikai fenotípus és a PROP1 genotípus közötti összefüggések vizsgálata veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

A vizsgálatban résztvevő valamennyi MPHD beteg születési súlya és születési hossza a gesztációs kornak megfelelő volt (az adatokat nem ismertetem részletesen). Nyolc beteg anamnézisben farfekvés és újszülöttkori distressz szerepelt. Mind az apai, mind az anyai testmagasság a magyarországi referencia adatok szerinti átlag ± 1 SDS értéken belül volt (8. táblázat, Halász és mtsai 2006). Az összes betegben a GH-szekréció zavart gyermekkorban állapították meg. A GH-hiány diagnózisának időpontjában az átlagos életkor 7,7±3,6 év volt és valamennyi betegben jelentős szomatikus retardáció állt fenn (testmagasság SDS: -3,8±0,8; csontkor kronológiai korhoz viszonyított elmaradottsága -3,7±2,0 év). A PROP1 gén molekuláris genetikai vizsgálatának eredménye alapján a betegeket két csoportba osztottam. Az egyik csoportba azok a betegek tartoztak, akiknél a PROP1 gén betegség-okozó homozygota vagy compound heterozygota mutációját találtam (15 beteg), a másik csoportba pedig azok, akiknél nem találtam PROP1 gén mutációt

(20

beteg).

A

két

csoport

klinikai

adatainak

összehasonlításakor

megállapítottam, hogy a PROP1 gén mutációt hordozó betegekben a GH-szekréció zavarát korábbi életkorban diagnosztizálták, mint a mutációt nem hordozó betegekben. (6,3±1,6 és 8,9±4,4 év, p<0,05) (8. táblázat). A GH-hiány diagnózisának megállapításakor a növekedés elmaradás mértékében a két csoport között nem volt szignifikáns különbség (8. táblázat). A GH-hiányhoz társuló TSH, LH, FSH és ACTH hiány megjelenésének időpontjában sem találtam szignifikáns különbséget a két betegcsoport között.. A PROP1 gén mutációt hordozó csoportban 3 betegben (életkoruk 9,3 ± 3,2 év), a mutációt nem hordozó csoportban 6 betegben (életkoruk 16,5 ± 5,4 év) a GH-hiányhoz ACTH-hiány is társult, a két csoport között a különbség nem volt

46

szignifikáns (9 táblázat, Halász és mtsai 2006). Felnőtt korban jelentkező hypadreniás krízis egy beteg kórtörténetében szerepelt. A TSH-hiány mindkét csoportban már korai életkorban jelentkezett; a PROP1 gén mutációt hordozó betegek mindegyikénél, míg a mutációt nem hordozó csoportban a betegek többségénél a TSH-hiányt már a GH-hiány diagnózisának időpontjában kimutatták. A PROP1 gén mutációval rendelkező betegekben a kombinált GH- és TSH-hiány már 10 éves életkor előtt kialakult. Az LHés FSH- hiányt mindkét csoportban a várható pubertáskor után igazolták (az LH és FSH-hiány megállapítása a serdülőkor előtt diagnosztikai tesztekkel nem lehetséges). A vizsgálat időpontjában a két csoportból egyaránt 11 beteg tartozott a pubertas utáni életkorba és ezek közül a betegek közül egyetlen betegben sem jelentkezett spontán pubertas (8. táblázat). A bazális szérum prolaktin egy betegben sem haladta meg a normális referencia tartomány felső határát ( a részletes adatokat a táblázatban nem tüntettem fel). 8. táblázat. A szülői testmagasság, a betegek életkora, életkorhoz viszonyított csontkor lemaradása és testmagassága a GH-hiány diagnózisának időpontjában GH-hiány diagnózisának Anyai tm (SDS) Összes beteg

PROP1 gén mutációt hordozó betegek PROP1 gén mutációt nem hordozó betegek

időpontjában

Apai tm (SDS)

Életkor

Csontkor-

Tm

(év)

életkor (év)

(SDS)

0,2±1,2

-0,1±0,9

7,7±3,6

-3,7±2,0

-3,8±0,8

(n=23)

(n=23)

(n=34)

(n=25)

(n=26)

0,7±0,9

0,1±0,8

6,3±1,6*

-3,3±1,8

-3,8±0,7

(n=15)

(n=15)

(n=15)

(n=14)

(n=15)

-0,8±1,0

-0,6±0,9

8,9±4,4

-4,1±2,2

-3,9± 0,9

(n=8)

(n=8)

(n=19)

(n=11)

(n=11)

Tm: testmagasság; *p<0,05 a PROP1 gén mutációt nem hordozó betegekhez képest; SDS: standard deviácios score

47

9. táblázat. A betegek életkora (év) a hypophysis hormon-hiány diagnózisának megállapításakor (átlag±SD) TSH

LH, FSH

ACTH

7,7± 3,4

17,8±2,9

14,1±5,8

(n=35)

(n=22)

(n=9)

PROP1 gén mutációt

6,7± 1,2

17,9±3,4

9,3±3,2

hordozó betegek

(n=15)

(n=11)

(n=3)

PROP1 gén mutációt nem

8,6± 4,5

17,8±2,6

16,5±5,4

hordozó betegek

(n=20)

(n=11)

(n=6)

Összes beteg

A 35 betegből 3 betegben nem végeztek radiológiai vizsgálatot a sella-tájékról, illetve a hypophysisről és 3 további betegben sella rtg vizsgálaton kívül egyéb radiológiai vizsgálat nem történt. Hét betegben koponya CT, 22 betegben MRI vizsgálatot végeztek. Az MRI vizsgálatok eredményét a 10. táblázatban foglaltam össze (Halász és mtsai 2006). A PROP1 gén-mutációt hordozó és nem hordozó betegek vizsgálatának eredményeit külön értékeltem. Egy betegben, akinél betegség-okozó PROP1 gén mutációt igazoltunk, a vizsgálat az adenohypophysis megnagyobbodását jelezte, azonban ezt az eltérést a kontroll vizsgálat már nem mutatta ki. A többi PROP1 génmutációt hordozó és nem hordozó betegben az agyalapi mirigy morfológiailag épnek vagy hypoplasiásnak bizonyult. PROP1 gén-mutációt hordozó betegben a hypophysis hátsó lebeny lokalizációja minden esetben normális volt, míg a mutációt nem hordozó betegek közül 7 betegben ectopias hátsó lebeny ábrázolódott (10. táblázat).

48

10. táblázat. Többszörös hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegek sella MRI vizsgálatának eredménye Adenohypophysis Neuro-hypophysis Hypoplasia Összes beteg (n=22)

Normál 10

Eutopia

Ectopia

1*

15

7

PROP1 mutációt 0 6 1* hordozó beteg (n=7) PROP1 mutációt nem 11 4 0 hordozó beteg (n=15) * Hat hónappal későbbi kontroll vizsgálat nem mutatta ki.

7

0

V.4.

11

Hyperplasia

8

7

A POU1F1 gén leggyakoribb mutációs helyén előforduló géneltérések vizsgálata veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben

A vizsgálatba bevont 35 beteg közül 15 betegben, akiknél a PROP1 gén három kódoló exonjának DNS analízise során betegséget okozó mutációt igazolni nem tudtam, a molekuláris genetikai vizsgálatokat a POU1F1 gén 6. exonjának DNS analízisével egészítettem ki. A vizsgálattal egyetlen esetben sem tudtam betegséget okozó mutációt kimutatni. A vizsgált exonon polimorfizmust sem találtam. V.5.

PROP1, POU1F1 és PITX2 gén vizsgálata situs inversus totalissal társuló veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegben

Az MPHD-ban és situs inversus totalisban szenvedő betegben a nem kielégítően kezelt hypophysis elégtelenség jellegzetes képét észleltem. Dysmorphiás jeleket nem találtam. A fizikális vizsgálat, elektrokardiogram, echokardiografiás vizsgálat, mellkas röntgen (8. ábra), hasi ultrahang, bárium kontrasztanyagos enterográfia és gasztroszkópia a situs inversus totalis diagnózisát megerősítette. A fundus és komputeres látótér vizsgálatot is magába foglaló szemészeti vizsgálat kóros eltérést nem igazolt. A betegnél hallászavart, kóros idegrendszeri eltérést nem találtam. A beteg jobbkezes volt.

49

8. ábra. Dextrocardiát igazoló antero-posterior írányú mellkas röntgen felvétel. (Semmelweis Egyetem, II. sz. Belgyógyászati Klinika)

9. ábra. Sagittalis irányú natív koponya MRI felvételen hypoplasiás adenohypophysis és ectopiás neurohypophysis (Szentágothai János Tudásközpont, MR Kutatóközpont, dr. Rudas Gábor)

50

A koponya MRI vizsgálat hypophysis mellső lebeny hypoplasiát és ectopiás hátső lebenyt mutatott ki, egyéb agyi strukturális eltérést nem talált (9. ábra). A funkcionális MRI vizsgálat a beszéd és beszédértés során a bal oldali agyfélteke aktiválódását igazolta. A transznasalis kefebiopsziával nyert nasalis epithel sejtek csillóinak fénymikroszkópos vizsgálata megfelelő csillómozgást igazolt. A DNAH5 antitesttel végzett immunhisztokémiai vizsgálat az epithel sejtek csillóiban DNAH5 fehérje jelenlétét mutatta ki. A PROP1 gén 3 kódoló exonjának analizise során az 1. exonon aminosavcserét nem okozó heterozygota 27T> >C polimorfizmust (Ala9Ala) találtam, de betegség-okozó mutációt nem tudtam kimutatni. A POU1F1 gén 1-6 exonjának és a PITX2 gén 4-7 exonjának

nukleotid-szekvencia

analízisével

polimorfizmus jelenlétét nem tudtam igazolni.

51

betegség-okozó

mutáció,

vagy

VI. MEGBESZÉLÉS VI.1. Növekedési hormon-hiánnyal társuló hypophysis hormon elégtelenség kezelésének eredményei Kezelés nélkül a GH-hiányban szenvedő betegek végmagassága körülbelül -5 SDS-el marad el az átlagtól. Raben 1958-ban közzétett klasszikus megfigyelése óta ismert, hogy hypopyhsis elégtelenséggel összefüggő alacsonynövés esetén az epiphysis fúgák záródását megelőzően alkalmazott humán GH készítmény kedvező hatást fejt ki a növekedésre. E felismerést követő években és évtizedekben világszerte átfogó munkával cadaverekből gyűjtötték az agyalapi mirigyeket és az ezekből kivont humán GH-készítményekkel végezték a kezelést. Világszerte több mint 27 000 gyermeket kezeltek

cadaver

hypophysisből

kivont

GH-készítménnyel

(Fraiser

1983).

Magyarországon 1977-től a gyermekkori GH-hiányban szenvedő betegek GH-kezelését országos hatáskörű szakmai bizottság irányította. A diagnózis és kezelés irányelveit módszertani levélben foglalták össze (Módszertani levél a növekedési zavarok kivizsgálásáról és kezeléséről, 1982). Az 1980-as évek végéig más országokhoz hasonlóan hazánkban is humán hypophysisből nyert GH-készítmény állt rendelkezésre a GH-hiányos gyermekek kezelésére. Péter és mtsai 1970-ben, Gács 1975-ben, Péter 1981-ben a rövid ideig alkamazott Grorm kezelés hazai tapasztalatait összegezték (Péter, 1981). Gács 1984-ben közölt megfigyelései szerint a hosszabb, 2-7 évig tartó Grorm kezelés során a testmagasság lemaradás átlagosan -4 SDS-ről -2,5 SDS-re csökkent (Gács, 1984). Munkámban egy 1994-ben lezárt vizsgálat kapcsán 14 GH-hiányos gyermek tartós, 7 évnél hosszabb GH-kezelésének eredményeit értékeltem. Valamennyi beteget humán hypophysisből kivont GH-készítménnyel kezelték (Grorm). A GH-kezelés megkezdésekor a betegek átlagos életkora megegyezett a nemzetközi irodalomban közölt adatokkal és a klinikai paraméterek jelentős testmagasság, hosszkor és csontkor lemaradást jeleztek. A GH-készítményt az 1975-1985. közötti ajánlásoknak megfelelően alkalmazták. Kimutattam, hogy a tartós, 7 évnél hosszabb Grorm kezelés hatására a betegek

átlagos testmagassága a hazai kor és nem specifikus adatok szerinti normális

52

tartományba került (-1 SDS). Ez a kedvező hatás megegyezik a nemzetközi irodalomban közölt adatokkal (Burns és mtsai 1981, Joss és mtsai 1983). A GH-kezelés eredményeinek értékelésekor figyelmet fordítottam a kezelés során észlelt mellékhatásokra is. A betegek dokumentációinak elemzésekor a kezeléssel összefüggésben mellékhatást nem találtam. 1985-ben számoltak be elsőként arról, hogy human hypophysisből származó GH-készítménnyel kezelt betegekben évekkel a kezelés befejezése után a kezeléssel összefüggésbe hozható Creutzfeldt-Jakob betegség alakult ki, amelyet a nem megfelelően tisztított GH-készítménnyel átvitt lassú-virus fertőzés okozott (Brown és mtsai 1985, Powell-Jackson és mtsai 1985). Ezért a humán hypophysisből kivont GHkészítmények forgalmazását rövid időn belül világszerte, így hazánkban is megszűntették és ezek helyét az ekkorra már rendelkezésre álló rekombináns géntechnológiai eljárással készült szintetikus GH-készítmények foglalták el. Hazánkban agyalapi mirigyből származó humán GH-készítménnyel összefüggésbe hozható Creutzfeldt-Jakob betegség nem ismert. A rekombináns humán GH (rhGH)-készítmények térhódítása ellenére a hypophysisből nyert humán GH-készítménnyel szerzett hosszútávú tapasztalatok értékelése nem érdektelen, hiszen az rhGH-kezelés stratégiája és gyakorlata a hypophysisből nyert GH-készítményekkel szerzett megfigyelésekre alapozódtak. A hypophysisből nyert GH-készítmények bizonyították a GH-pótló kezelés racionalitását és hatékonyságát, a kezelés optimalizálását és a kezelési indikációk bővítését, azonban a gyakorlatilag korlátlan mennyiségben előállítható rhGH-készítmények tették lehetővé. A korábbi, hetente 3-4 alkalommal az epiphysis fúgák záródásáig alkalmazott GHkezelés helyett jelenleg naponta adagoljuk az rhGH-készítményeket. Nagyfokú növekedés elmaradottság esetén (testmagasság SDS <-3,5, növekedési ráta <3 pc) az rhGH-kezelés akkor is megkezdhető, ha a dinamikus stimulációs tesztek során mért szérum GH koncentráció csúcsértéke 7-10 ng/ml között van. A kezdeti gyakorlathoz képest jelentős előrelépést jelent az is, hogy mintegy 10 éve hazánkban is lehetővé vált a gyermekkorban kezdődő és a felnőttkorba való átmenet időszakában (18-25 év) dinamikus GH-stimulációs teszttel újraigazolt GH-hiányos betegek a felnőttkorban is folytassák az rhGH-kezelést. A felnőttkori GH-kezelés hazai tapasztalatairól a felnőtt

53

GH-hiányos betegek kezelését irányító centrumok egy közelmúltban megjelent közleményben számoltak be (Hubina és mtsai 2006). VI.2. PROP1 gén mutáció vizsgálat eredményei veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben MPHD-ben szenvedő betegekben a PROP1 gén mutációk gyakoriságára vonatkozó nemzetközi irodalmi adatok ellentmondóak. Azok a vizsgálatok, amelyeket a kaukázusi népességben végeztek viszonylag nagy gyakorisággal mutattak ki MPHD-s betegekben PROP1 gén defektust (Fofanova és mtsai 1998, Deladoёy és mtsai 1999, Mody és mtsai 2002, Lebl és mtsai 2005, Reynaud és mtsai 2006). E vizsgálatok azt is jelezték, hogy a betegség-okozó mutációk többsége a PROP1 gén mutációs”hot spot”-nak megfelelő gén-szakaszon fordul elő. Valette-Kasic és mtsai (2001) 23 hypophysis elégtelenségben szenvedő beteget vizsgált, akik közül 9 betegben talált betegség-okozó PROP1 gén defektust. Utóbbiak közül 8 betegben homozygota mutációt (301-302delAG mutáció 5 betegben, Arg73Cys mutáció 2 betegben és Arg73His mutáció egy betegben), egy betegben pedig compound heterozygota mutációt (Arg73Cys/Arg99Xxx) észlelt. A PROP1 gén mutációk viszonylag nagy gyakoriságról beszámoló közlésekkel ellentétben McLennan és mtsai 2003-ban, Tatsumi és mtsai 2004-ben és Rainbow és mtsai 2005ben publikált adatai MPHD-s betegek körében a PROP1 gén mutációk ritka előfordulását jelezték, vagy nem találtak PROP1 gén mutációt. A PROP1 gén mutációk gyakoriságára vonatkozó néhány irodalmi adatot és a hazai betegek körében végzett vizsgálataim eredményeit a 11. táblázatban foglaltam össze. MPHD-s betegekben a PROP1 gén mutációk gyakoriságára vonatkozó jelentős különbségek oka nem ismert. Felvetették, hogy a különböző vizsgálatokban észlelt jelentős eltéréseket a leggyakoribb PROP1 gén mutációk előfordulásának etnikai különbözősége okozza (Tatsumi és mtsai 2004). Ez ún. ”founder” hatás lehetőségét veti fel, bár az sem zárható ki, hogy a mutációs ”hot spot” egyéb genetikai jelenséggel, mint pl. ennek a gén-szakasznak mutációk iránti esendőségével (ún. ”recurrent” mutációk) áll összefüggésben. Mindezeken kívül a különböző vizsgálatokban a PROP1 gén mutációk eltérő gyakoriságát egyéb okok is magyarázhatják, mint pl. azok a feltételek, amelyek alapján az

MPHD-s betegeket a

molekuláris genetikai vizsgálatokba bevonták. A

54

vizsgálatba bevont betegek kiválasztását a különböző vizsgálatokban gyakran különböző feltételekhez kötötték, ami nem meglepő, hiszen a PROP1 gén mutációvizsgálat indikációira vonatkozó általánosan elfogadott ajánlás még nem áll rendelkezésre. Végül lehetséges az is, hogy a különböző vizsgálatokban a PROP1 gén mutáció-analízis eltérő eredményeit részben a sporadikus és familiáris MPHD-s betegek eltérő aránya okozta. Reynaud és mtsai sporadikus MPHD-s betegekben kisebb (13,2%), míg familiáris MPHD-s betegekben nagyobb gyakorisággal (44%) mutatott ki PROP1 gén mutációt (Reynaud és mtsai 2006). 11. táblázat. PROP1 gén mutációk gyakorisága többszörös hypophysis hormon-hiányos betegekben. Nemzetközi irodalmi és saját adatok.

Ország

Vizsgált MPHD-s betegek száma

Homozygota vagy compound heterozygota mutációt hordozó betegek száma

Mutációt hordozó betegek százalékos gyakorisága

Irodalom

Ausztrália

33

0

0%

McLennan és mtsai 2003

Egyesült Királyság

27

0

0%

Rainbow és mtsai (2005)

Cseh Köztársaság

74

18

24,3 %

Lebl és mtsai (2005)

Portugália

46

19

41,3 %

Lemos és mtsai (2006)

Több ország*

109

20

18,,3 %

Reynaud és mtsai (2006)

43 %

Halász és mtsai (2006)

Magyarország

35

15

*Argentína,Belgium, Egyiptom, Franciaország, Libanon, Svájc, Törökország, Tunézia

55

Az első PROP1 gén mutáció okozta hazai MPHD-s esetet 2005-ben ismertették (Juhász és mtsai). A növekedésében 5 éves korában jelentősen elmaradott (testmagasság SDS -4) kisfiúnál elégtelen GH-szekréciós kapacitást (szérum GH csúcsérték 0,2 ng/ml) és centrális hypothyreosist mutattak ki. A hypothalamus-hypophysis régió MRI vizsgálata ép morfológiát jelzett. A PROP1 gén nukleotid-szekvencia analízisét a Semmelweis

Egyetem

II.

sz.

Belgyógyászati

Klinika

molekuláris

genetikai

laboratóriumában végeztük. A vizsgálat a PROP1 gén 2. exon 301-302delGA homozygota mutációját igazolta. Saját vizsgálataimban, amely hazai 35 MPHD-s beteget foglalt magába, a PROP1 gén homozygota vagy compound heterozygota mutációinak gyakori (43%-os) előfordulását találtam. Ez a gyakoriság közel azonos Lemos és mtsai portugál betegekben talált adataival (Lemos és mtsa, 2006). Valamennyi általam igazolt mutációt a nemzetközi irodalom betegség-okozó mutációként tartja számon, ezért az észlelt mutációknak az MPHD-val való összefüggése bizonyosnak tekinthető. Új, a nemzetközi irodalomban még nem közölt PROP1 gén mutációt a vizsgált betegek körében nem találtam. Saját vizsgálataim hazai MPHD-s betegekben megerősítik a PROP1 gén 2. exonján a mutációs ”hot spot” jelenlétét és ennek jelentőségét a betegség kialakulásában. A mutációs ”hot spot”-on azonos gyakorisággal találtam 150delA és 301-302delGA mutációkat (mindkét mutáció esetében 12/70 allél), amelyek az összes talált mutáció mintegy 80%-át tették ki. Saját vizsgálataimban és a nemzetközi vizsgálatokban talált mutációk spektrumának összehasonlítását a 12. táblázatban foglaltam össze. A táblázat jól szemlélteti, hogy a hazai betegekben végzett saját vizsgálathoz hasonlóan a 301-302delAG mutáció a nemzetközi vizsgálatokban is az összes PROP1 gén mutáció jelentős részét tette ki, míg a 150delA mutáció az irodalomban közölt vizsgálatokban az összes mutáción belül eltérő gyakorisággal, vagy egyes vizsgálatokban nem fordult elő. Vizsgálataim eredményei azt jelzik, hogy az általam alkalmazott feltételek alapján genetikai vizsgálatra kiválasztott MPHD-ban szenvedő hazai betegek körében a PROP1 gén mutáció-vizsgálata hatékony eszköz az MPHD hátterében álló genetikai ok kimutatására.

56

12. táblázat. PROP1 gén mutációk spektruma és allél gyakorisága többszörös hormon-hiányos betegekben. Nemzetközi irodalmi és saját adatok. Ország Portugália

Cseh Köztársaság

Több ország*

Magyarország

PROP1 gén mutációk 301-302delAG Arg120Cys 2T>C 301-302delGA 150delA 349T>A Arg73Cys 301-302delGA Arg73His 150delA Trp194 Arg99Stop 629delC

AllélIrodalom gyakoriság 28/92 (30%) Lemos és mtsai 6/92 (7%) (2006) 4/92(4,3%) 26/148 (17,6%) Lebl és mtsai 9/148 (6,1%) (2005) 1/148 (0,06%) 18/218 (8,2%) 11/218 (5%) 4/218 (1, 8%) Reynaud és mtsai 3/218 (1,3%) (2006) 2/218 (1%) 1/218 (0,5%) 1/218 (0,5%)

301-302delGA 150delA Phe117Ile Arg73Cys Arg99Stop

12/70 (17,1%) 12/70 (17,1%) 3/70 (4,3%) 2/70 (2,9%) 1/70 (1,4%)

Halász és mtsai (2006)

*Argentína, Belgium, Egyiptom, Franciaország, Libanon, Svájc, Törökország, Tunézia VI.3. A klinikai fenotípus és a PROP1 genotípus közötti összefüggések vizsgálata veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben A

PROP1 gén defektus okozta klinikai kép változatos (Flück és mtsai 1998,

Rosenbloom és mtsai 1999). Ugyanazon mutációt hordozó betegekben az elégtelen hormon szekrécióval összefüggő klinikai tünetek megjelenésének időpontja, sőt a hypophysis mellső lebeny hormon-hiány kialakulásának sorrendje is eltérő lehet. Leggyakrabban GH-szekréció zavar jelentkezik, amely mérsékelt vagy ritkábban nagyfokú növekedés elmaradást okoz. Megfigyelték, hogy csecsemő és kisded korban a PROP1 gén mutációkkal összefüggő növekedés elmaradottság kisebb fokú, mint a hypophysis transzkripciós faktorokat kódoló más gének defektus esetén. Mody és mtsai

57

2002-ben közölt adatai szerint 1 éves korban az átlagos testmagasság PROP1 gén mutációt hordozó betegekben 67 cm, míg POU1F1 gén mutációt hordozó betegekben 61,5 cm. A PROP1 gén defektus okozta GH-hiány ritkán már csecsemőkorban jelentkezik. PROP1 gén mutációt hordozó gyermekekben a GH-hiány diagnózisának megállapításakor az átlagos életkor Deladoey és mtsai (1999) által vizsgált 35 betegben 6 év, Parks és mtsai (1999) által vizsgált 37 betegben 8 év volt. Saját vizsgálataim eredményei szerint PROP1 gén mutációt hordozó betegekben a GH-szekréció zavarát szignifikánsan fiatalabb életkorban állapították meg, mint a mutációt nem hordozó betegekben, bár a GH-hiány diagnózisának megállapításakor a növekedés elmaradás mértékében a két csoport között nem volt szignifikáns különbség. A PROP1 gén mutációt hordozó betegek GH szekréciós kapacitásának fokozatos beszűkülését korábbi longitudinális vizsgálatokkal mutatták ki. Fluck és mtsai (1998) Arg120Gly homozygota mutációt hordozó betegben GH-stimulációs teszttel egy éves korban 10 ng/ml, 2 éves korban 8 ng/ml, 4 éves korban 6 ng/ml és 6 éves korban 2 ng/ml alatti szérum GH csúcsot talált. A betegség-okozó PROP1 gén mutációt hordozó betegek korábbi longitudinális vizsgálatával azt is igazolták, hogy a GH-szekréció zavarhoz TSH-, FSH- és LHszekréció zavar, sőt az esetek egy részében ACTH-szekréció zavar is társul (Böttner és mtsai 2004). A progresszíven kialakuló hormon-hiány időbeli alakulását Deladoey és mtsai (1999) PROP1 gén mutációt hordozó 35 MPHD-s betegen végzett vizsgálatai is igazolták. A TSH szekréciós kapacitás fokozatos beszűkülését PROP1 gén mutációt hordozó betegekben Fluck és mtsai (1998) ismételten elvégzett TRH-teszttel bizonyították. Irodalmi adatok szerint a TSH-hiány 20 éves életkor előtt alakul ki, saját vizsgálataimban a PROP1 gén mutációt hordozó betegekben a TSH-hiány már 10 éves életkor előtt jelentkezett. Korábbi megfigyelésk szerint a PROP1 gén mutációhoz társuló FSH és LH szekréció zavar miatt rendszerint elmarad a spontán serdülés, azonban néhány PROP1 gén mutáció esetében (pl. Arg120Cys és 150delA homozygota mutációk)

spontán

lezajló

pubertast

és

ezt

követően

jelentkező

centrális

hypogonadismust is megfigyeltek (Fluck és mtsai, 1998; Deladoey és mtsai 1999; Krzisnik és mtsai, 1999). Saját vizsgálatomban 4 betegben találtam homozygota

58

150delA mutációt, azonban a többi PROP1 gén mutációt hordozó beteghez hasonlóan egyetlen esetben sem észleltem spontán pubertast (a centrális hypogonadismus jelenlétét vagy hiányát a 15 PROP1 gén mutációt hordozó beteg közül 4 esetben nem lehetett megállapítani a pubertas előtti életkor miatt). Irodalmi adatok szerint a PROP1 génnek nincs közvetlen szerepe az ACTHtermelő corticotroph sejtek differenciálódásában (Ward és mtsai, 2005), korábbi klinikai megfigyelések szerint a PROP1 gén mutációkhoz mégis társulhat ACTH-hiány, amelyet sejtek közötti együttműködés zavar, vagy az átmeneti hypophysis hyperplasia sejtkárosító hatása magyarázhat. Saját eredményeim, amelyek a PROP1 gén mutációt hordozó 15 beteg közül 3 betegben igazoltak ACTH-hiányt ezeket a korábbi klinikai megfigyeléseket erősítik. A PROP1 gén mutációt hordozó MPHD-s betegekben végzett korábbi radiológiai vizsgálatok a hypophysis hypoplasia gyakori előfordulásáról számoltak be. Ezzel a megfigyeléssel ellentétben Mendonca és mtsai egy PROP1 gén-mutációt hordozó MPHD-s beteg esetét ismertették, akinél 8,8 éves korban a hypophysis mellső lebenyének megnagyobbodását észlelték, majd az elváltozás a beteg 15 éves korára megszűnt. Vizsgálataim során a PROP1 gén mutációt hordozó betegek körében nem észleltem hypophysis hyperplasiát, azonban egy betegben MRI-vizsgálattal kimutatott hypophysis mellső lebeny megnagyobbodást találtam, amit 6 hónappal később már nem lehett kimutatni. Voutetakis és mtsai (2004) véleménye szerint PROP1 gén mutációt hordozó

MPHD-s

betegekben

az

MRI

vizsgálattal

kimutatott

hypophysis

megnagyobbodást a hypophysis középső lebenyének megnagyobbodása okozhatja. Állatmodellekben végzett vizsgálatok eredményei ugyanakkor a progenitor sejtek migrációs zavarának szerepére utalnak (Ward és mtsai 2005). Simon és mtsai 60 GH-hiányos betegben (30 izolált GH-hiány és 30 MPHD) a klinikai eltérések és a hypothalamus-hypophysis régió MRI vizsgálattal kimutatható morfológiai elváltozásai között kerestek összefüggéseket (Simon és mtsai 2006). Munkájukban szoros kapcsolatot mutattak ki a hypophysis hátsó lebeny ektopiás elhelyezkedése és más fejlődési rendellenességek (szem, agyi strukturák) között, de a betegekben a hypophysis transzkripciós faktor gén mutációkat nem vizsgálták. Saját vizsgálataimban a PROP1 gén-mutációt hordozó betegben a hypophysis hátsó lebeny

lokalizációja minden esetben normális volt, míg a mutációt nem hordozó betegek mintegy felében ectopias hátsó lebeny ábrázolódott. Ezek a megfigyelések néhány korábbi irodalmi adattal együtt (Sloop és mtsai 2000) arra utalnak, hogy a PROP1 gén mutációknak nincs szerepe a hypophysis hátsó lebeny ectopia patomehanizmusában. VI.4. A POU1F1 gén leggyakoribb mutációs helyén előforduló géneltérések vizsgálata veleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegekben. A POU1F1 gén a hypophysis fejlődésében szerepet játszó transzkripciós faktorokat kódoló gének közül elsőként vált ismertté. A gén betegség okozó-mutációit MPHD-ben szenvedő betegekben több tanulmányban vizsgálták. A nemzetközi GENHYPOPIT vizsgálatban 195 MPHD-s betegben végezték el a klinikai kép alapján meghatározott feltételektől függően a HESX1, LHX3, LHX4, PROP1 és/vagy a POU1F1 gén vizsgálatát (30 familiaris és 165 sporadikus eset). A POU1F1 gén vizsgálatba bevont 17 beteg közül – akiknél a GH-hiányhoz TSH-hiány társult, hypophysis nyél-sérülés és septo-opticus dysplasia nélkül – egy betegben a 3. exonon Gly89Arg aminosav-cserét okozó heterozygota mutáció igazolódott (Reynaud és mtsai 2006). Az Egyesült Királyságban 26 családba tartozó 27 beteg vizsgálata során a 6. exonon mutattak ki mutációkat (két betegben homozygota Phe233Leu mutáció és a mutációs ”hot spot”-nak megfelelő Arg271Trp heterozygota mutáció) (Rainbow és mtsai 2005). Turton és mtsai (2005) 24 nemzeti és 48 nemzetközi endokrin központ közreműködésével 129 hypothalamus-hypophysis betegségben szenvedő beteg közül 10 betegben találtak betegség-okozó mutációt, amelyek döntő többsége a 6. exon mutációs ”hot spot”-nak megfelelő gén-szakaszon fordult elő. Néhány nemzetközi vizsgálat eredményét a 13. táblázatban foglaltam össze. Saját vizsgálataimban a POU1F1 gén mutációs ”hot spot”-jának 6. exon mutáció-analízisét azoknál az MPHD-s betegeknél végeztem el, akiknél a PROP1 gén vizsgálattal nem találtam mutációt. A POU1F1 gén 6. exonján kívül a közeli intronikus nukleotid-szekvenciák vizsgálatára is alkalmas módszerrel a vizsgált 15 betegben nem találtam heterozygota vagy homozygota mutációt. Ezek a megfigyeléseim nem támasztják alá azt a lehetőséget, hogy hazai MPHD-s betegekben a POU1F1 gén

60

mutációs ”hot-spot”-jának betegség-okozó szerepe lenne, bár a gén többi, általam nem vizsgált exonján mutációk jelenléte nem zátható ki. 13. táblázat. POU1F1 gén mutációk spektruma és allél gyakorisága többszörös hormon-hiányos betegekben. Nemzetközi adatok. POU1F1 gén

Allél

mutációk

gyakoriság

Arg271Trp

2/66 (3%)

McLennan

Arg143Leu

1/66 (1,5%)

(2003)

Leu194Gln

1/66 (1,5%)

Egyesült

Phe233Leu

4/54 (7,4%)

Rainbow és

Királyság

Arg271Trp

1/54 (1,9%)

mtsai (2005)

Több ország*

Gly89Arg

1/34 (3%)

Glu230Lys

7/258 (2,7%)

Arg271Trp

5/258 (1,9%)

Turton és mtsai

Arg172Gln

2/258 (0,8%)

(2005)

insA778

1/258 (0,4%)

Ország Ausztrália

Több ország**

Irodalom

Reynaud és mtsai (2006)

*Argentína, Belgium, Egyiptom, Franciaország, Libanon, Svájc, Törökország, Tunézia ** 9 ország

VI.5. A PROP1, POU1F1 és PITX2 gén vizsgálata situs inversus totalissal társulóveleszületett hypophysis hormon-hiányban szenvedő betegben Korábbi megfigyelések szerint az agyalapi mirigy organogenezisben szerepet játszó PITX2 gén-defektusnak kóroki szerepe lehet a részleges szervi lateralizációs zavarok egyes formáinak, mint pl. a nagyér transzpozició kialakulásában (Muncke és mtsai 2005). Pitx2 transzkripciós faktor-hiányos egérben az emberben megfigyelhető heterotaxiának megfelelő szív-érrendszer topográfia fejlődik (Franco és mtsai 2000). Situs inversus és hypophysis elégtelenség együttes előfordulásáról azonban kevés adat ismert.

61

Kortoglu és Atabek 2003-ban egy 6 éves situs inversusos leánygyermek esetét ismertette, akiben a lateralizáció zavarához brachydactylia, hypertrichosis és elégtelen GH-szekréció társult. Egy másik közleményben a szerzők egy 39. gesztációs hétre született és 5 napos korban elhunyt újszülött esetéről számoltak be, akiben situs inversus, hypoglossia és agyalapi mirigy aplasia együttes előfordulását észlelték. A kórkép kialakulásában az anyai hyperthermia kóroki szerepét valószínűsítik (Chabrolle és mtsai 1998). Giacchino és mtsai egy veleszületett toxoplasma fertőzésben szenvedő 11 éves gyermekben situs inversus, vese fejlődési rendellenesség és GH-szekréció zavarral járó hypopituitarismus társulásáról számoltak be (Giacchino és mtsai, 1977). Munkámban egy 52 éves férfi beteg esetét ismertettem, akinél a situs inversus totalis veleszületett MPHD-vel társult. Az immuncytokémiai vizsgálat eredménye a Kartagener szindróma fennállását nem támasztotta alá. A jobbkezesség és a funkcionális MRI vizsgálat bal agyfélteki dominanciára utalt. Utóbbi megfigyelésem azt jelezte, hogy a betegben a szomatikus lateralizációs zavar nem járt együtt az agyi funkcionális lateralizáció megváltozásával. Ennek alapján feltételezhető, hogy az agy és a szomatikus lateralizáció kialakításában egymástól független folyamatok játszanak szerepet. Ezt a feltételezést korábban már mások is felvetették (Kennedy és mtsai, 1999). Situs inversus totálishoz társuló MPHD-ban a hypophysis fejlődésében és a lateralizációs zavarokban egyaránt jelentőséggel bírő PITX2 gén mutáció lehetséges szerepét a nemzetközi irodalomban még nem vizsgálták. E gén vizsgálatát különösen fontossá tette, hogy a betegben a PROP1 gén kódoló régiójában nem találtam betegségokozó mutációt és a POU1F1 gén gyakori mutációs helyét tartalmazó 6. exon vizsgálata sem mutatott ki normálistól eltérő nukleotid-szekvenciát. A POU1F1 gén ritka mutációinak kizárására elvégeztem a gén összes többi kódoló exonjának nukleotidszekvencia analízisét, azonban ezeken a génszakaszokon sem találtam eltérést. Ezek az eredmények arra utaltak, hogy az MPHD kialakulásában a nemzetközi irodalom alapján leggyakoribb hypophysis transzkripciós faktor mutációknak nincs szerepe a betegnél a kórkép kialakulásában. Ezért munkámban kidolgoztam a PITX2 gén kódoló exonjainak nukleotid-szekvencia vizsgálatára alkalmas módszert, amely alkalmas a gén kódoló exonjain

kívül az

exon-közeli intronikus

62

szakaszokon

előforduló

mutációk

kimutatására. Az általám kidolgozott módszert sikeresen alkalmaztam a PITX2 gén kódoló exonjainak vizsgálatára, azonban a szekvencia-analízissel nem sikerült eltérést kimutatnom. Ennek alapján a PROP1 és POU1F1 gének vizsgálatához hasonlóan a PITX2 gén esetében sem bizonyítható, hogy a betegnél ezeknek a hypophysis transzkripciós faktoroknak szerepe lehet a situs invesus totalissal társuló MPHD kialakulásában.

63

VII.

KÖVETKEZTETÉSEK

Hypophysis hormonhiányban szenvedő betegek klinikai adatainak elemzésével és a betegek vérmintáiban három hypophysis transzkripciós faktor gén (PROP1, POU1F1 és PITX2) mutációinak vizsgálatával foglalkozó munkám legjelentősebb megállapításait és az eredményekből levonható legfontosabb következtetéseket az alábbi pontok foglalják össze. 1.

Megállapítottam, hogy a GH-hiányban szenvedő gyermekek kezelésére országosan szervezett keretek között elsőként rendelkezésre álló humán GHkészítmény (Grorm) tartós, 7 évnél hosszabb alkalmazását követően a betegek átlagos testmagassága a hazai kor és nem specifikus adatok szerinti normális

tartományba

került.

A

készítményt

később

rekombináns

géntechnológiával előállított humán GH-készítmények váltották fel, amelyek alkalmazásakor az elsőként bevezetett humán GH-készítménnyel szerzett hosszútávú tapasztalatokat használták fel. 2.

Veleszületett MPHD-ban szenvedő betegekben a betegség-okozó PROP1 gén mutációk szűrésére klinikai feltételrendszert dolgoztam ki, amelynek alapján 7 gyermek-, illetve felnőtt endokrinológiai centrum közreműködésével 3 év alatt 32 családból 35 veleszületett MPHD-s beteget vontam be a vizsgálatba. Megállapítottam, hogy az általam kidolgozott feltételrendszer alkalmazása esetén a PROP1 gén kódoló exonjainak mutáció-vizsgálata hazai MPHD betegekben kiemelkedően hatékony módszer az MPHD örökletes formáinak kimutatására. A vizsgált 35 MPHD-s beteg közül 15 betegben (43%) észlelt mutációkat (10 homozygota és 5 compound heterozygota) a nemzetközi irodalomban betegség-okozó mutációként tartják számon, a szakirodalomban nem közölt új mutációt nem találtam. Megállapítottam, hogy a mutáns allélok több, mint 80 %-át a 150delA és 301-302delGA mutációkat tartalmazó allélek tették ki. Ezek az eredmények hazai MPHD-s betegekben a PROP1 gén mutációs ”hot spot”-jának kiemelkedő jelentőségét bizonyítják és egyben

64

lehetőséget nyújtanak az érintett betegekben a PROP1 gén mutáció-szűrés racionális és költség-hatékony stratégiájának kidolgozására. Eredményeim alapján hazai MPHD-s betegekben a PROP1 gén kódoló exonjainak mutációanalize során elsőként a 150delA és 301-302delGA mutációs helyeket tartalmazó génszakaszok vizsgálatát javaslom. 3.

PROP1 gén mutációt hordozó és nem hordozó veleszületett MPHD-ban szenvedő beteg-csoportok klinikai és hormon-laboratóriumi adatainak összehasonlításával megállapítottam, hogy a PROP1 gén mutációt hordozó betegekben a GH-szekréció zavarát szignifikánsan korábbi életkorban diagnosztizálták, mint a mutációt nem hordozó betegekben, azonban a GHhiány diagnózisának megállapításakor a növekedés elmaradás mértékében, vagy a GH-hiányhoz társuló TSH, LH, FSH és ACTH hiány megjelenésének időpontjában sem találtam szignifikáns különbséget a két betegcsoport között. Ezeknek a megfigyeléseimnek alapján valószínűnek tartom, hogy a PROP1 gén mutáció következményeként kialakuló növekedéslemaradás korábbi életkorban válik feltűnővé, mint a PROP1 gén mutációt nem hordozó esetekben. Eredményeim alapján a PROP1 gén mutáció vizsgálatot különösen indokoltnak tartom azoknál a gyermekeknél, akiknél a GH-hiányt fiatalabb életkorban állapítják meg.

4.

PROP1 gén mutációt nem hordozó 15 veleszületett MPHD-s betegben a POU1F1 gén mutációs ”hot spot”-ját tartalmazó 6. exon mutáció-analízisével nem

találtam

heterozygota

vagy

homozygota

mutációt.

Ezek

a

megfigyeléseim nem támasztják alá azt a lehetőséget, hogy hazai MPHD-s betegekben a POU1F1 gén mutációs ”hot-spot”-jának betegség-okozó szerepe lenne, bár a gén többi, általam nem vizsgált exonján mutációk jelenléte nem zárható ki. 5.

Módszert dolgoztam ki a hypophysis fejlődésében és a lateralizációs zavarokban egyaránt jelentőséggel bírő PITX2 gén kódoló exonjain és exon-

65

közeli intronikus szakaszain előforduló mutációk kimutatására. A módszert sikeresen alkalmaztam egy situs inversus totálishoz társuló MPHD-s betegben a gén nukleotid-szekvenciájának vizsgálatára, amellyel azonban nem sikerült mutáció jelenlétét bizonyítanom. A betegnél a situs inversus totalis hátterében Kartagener szindróma lehetőségét nem valoszínűsítettem, és a PROP1 és POU1F1 gének összes kódoló exonjainak analízisével nem találtam betegségokozó mutációt. A PROP1, POU1F1 és PITX2 gének mutációit situs inversussal társuló MPHD-ban a nemzetközi irodalomban még nem vizsgálták. Eredményeim nem bizonyítják hogy e gének mutációinak szerepe lehet a situs invesus totalissal társuló MPHD kialakulásában.

66

IRODALOMJEGYZÉK Abrão MG, Leite MV, Carvalho LR, Billerbeck AEC, Nishi MY, Barbosa AS, Martin RM, Arnhold IJP, Mendonca BB. (2006) Combined pituitary hormone deficiency (CPHD) due to complete PROP1 deletion. Clin Endocrinol, 65: 294-300. Afzelius BA. (1976) A human syndrome caused by immobile cilia. Science, 193: 317319. Ansley SJ, Badano JL, Blacque OE, Josephine Hill, Hoskins BE, Leitch CC, Kim JC, Ross AJ, Eichers ER, Teslovich TM, Mah AK, Johnsen RC, Cavender JC, Lewis RA, Leroux MR, Beales PL, Katsanis N. (2003) Basal body dysfunction is a likely cause of pleiotropic Bardet-Biedl syndrome. Nature, 425: 628-33. Arlt W, Allolio B. (2003) Adrenal insufficiency. Lancet, 361: 1881-1893. Aszalós Zs. (2007) Néhány endokrin betegség neurológiai és pszichiátriai vonatkozása: hypothalamus-hypophysis rendszer. Orvosi Hetilap, 16: 723-730. Barth KA, Miklosi A, Watkins J, Bianco IH, Wilson SW, Adrew RJ. (2005) Fsi zebrafish show concordant reversal of laterality of viscera, neuroanatomy, and a subset of behavioral responses. Curr Biol, 15: 844-50. Birkebaek NH, Patel L, Wright NB, Grigg JR, Sinha S, Hall CM, Price DA, Lloyd IC, Clayton PE. (2003) Endocrine status in patients with optic nerve hypoplasia: relationship to midline central nervous system abnormalities and appearance of the hypothalamic-pituitary axis on magnetic resonance imaging. J Clin Endocr Metab, 88: 5281-5286. Böttner A, Keller E, Kratzsch J, Stobbe H, Weigel JFW, Keller A, Hirsch W, Kiess W, Blum WF, Pfäffle RW. (2004) PROP1 Mutations cause progressive deterioration of anterior pituitary function including adrenal insufficiency: A longitudinal analysis.

5256-5265.

67

J Clin Endocr Metab, 89:

Brown P, Gajdusek DC, Gibbs CJ, Asher DM. (1985) Potential epidemic of Creutzfeldt-Jakob disease from human growth hormone therapy. New Engl J Med, 313: 728-731. Burns EC, Tanner JM, Preece MA, Cameron N (1981) Final height and pubertal development in 55 children with idiopathic growth hormone deficiency, treated for between 2-15 years with human growth hormone. Eur J Pediatr 137:155-164. Carvalho LR, Woods KS, Mendonca BB, Marcal N, Zamparini AL, Stifani S, Brickman JM, Arnhold IJP, Dattani MT. (2003) A homozygous mutation in HESX1 is associated with evolving hypopituitarism due to impaired repressor-corepressor interaction. J Clin Invest, 112: 1192-1201. Capdevila J, Belmonte JCI. (2000) Knowing left from right: the molecular bases in lateral disorders. Mol Med Today, 6: 112-118. Chabrolle JP, Labenne M, Cailliez D, Poinsot J, Bruel H, Vercoustre L. (1998) Hypoglossia, situs inversus and absence of the pituitary in the neonate: teratogenic effect of maternal hyperthermia? Arch Pediatr, 5: 163-166. Cogan JD, Wu W, Phillips III JA, Arnhold IJ, Agapito A, Fofanova OV, Osorio MG, Bircan I, Moreno A, Mendonca BB. (1998) The PROP1 2-base pair deletion is a common cause of combined pituitary hormone deficiency. J Clin Endocr Metab, 83: 3346-3349. Cohen LE, Radovick S. (2000) Molecular bases of combined pituitary hormone deficiencies. Endocr Rev, 23: 431-442. Dattani MT, Martinez-Barbera JP, Thomas PQ, Brickman JM, Gupta R, Martensson IL, Toresson H, Fox M, Wales JKH, Hindmarsh PC, Krauss S, Beddington RSP, Robinson ICAF. (1998) Mutations in the homeobox gene HESX1/Hesx1 associated with septo-optic dysplasia in human and mouse. Nat Genet, 19: 125-133.

68

Deladoёy J, Flück C, Büyükgebiz A, Kuhlmann BV, Eblé A, Hindmarsh PC, Wu W, Mullis PE. (1999) ”Hot spot” in the PROP1 gene responsible for combined pituitary hormone deficiency. J Clin Endocr Metab, 84: 1645-1650. Duquesnoy P, Roy A, Dastot F, Ghali I, Teinturier C, Netchine I, Cacheux V, Hafez M, Salah N, Chaussian JL, Goossens M, Bougnères P, Amselem S. (1998) Human Prop-1: cloning, mapping, genomic structure. Mutations in familial combined pituitary hormone deficiency. FEBS Lett, 437: 216-220. Eiben OG, Barabás A, Pantó E. (1991) The Hungarian national growth study I. Humánbiológia budapestinensis, 21: 1-123. Fliegauf M, Olbrich H, Horváth J, Wildhaber JH, Zariwala MA, Kennedy M, Knowles MR, Omran H. (2005) Mislocalization of DNAH5 and DNAH9 in respiratory cells from patients with primary ciliary dyskinesia. Am J Resp Crit Care Med, 171: 1343-1349. Flück C, Deladoey J, Rutishauser K, Eblé A, Marti U, Wu W, Mullis PE. (1998) Phenotypic variability in familial combined pPituitary hormone deficiency caused by a PROP1 gene mutation resulting in the substitution of Arg Cys at Codon 120 (R120C).

J Clin Endocr Metab,

83: 3727-3734. Fofanova O, Takamura N, Kinoshita E, Parks JS, Brown MR, Peterkova VA, Evgrafov OV, Goncharov NP, Bulatov AA, Dedov II, Yamashita S. (1998) Compound heterozygous deletion of the PROP-1 gene in children with combined pituitary hormone deficiency.

J Clin Endocr

Metab, 83: 2601-2603. Franco D, Campione M, Kelly R, Zammit PS, Buckingham M, Lamers WH, Moorman AFM. (2000) Multiple transcriptional domains, with distinct left and right components, in the atrial chambers of the developing heart. Circ Res, 87: 984-991. Frasier SD (1983) Human pituitary growth hormone (hGH) therapy in growth hormone deficiency. Endocr Rev 4: 155-170. Gács G. (1975) Hypopituitarismus okozta törpenövés. Orvosi Hetilap, 116: 1038-1043.

69

Gács G. A kóros növekedés és serdülés. Endokrin kórképek. In: Gács G. (szerk.), Növekedés és serdülés. Medicina, Budapest, 1984: 96-102. Gage PJ, Brinkmeier ML, Scarlett LM, Knapp LT, Camper SA, Mahon KA. (1996) The Ames dwarf gene, df, is required early in pituitary ontogeny for the extinction of Rpx transcriptionand initiation of lineage-specific cell proliferation. Mol. Endocrinol, 10: 1570-1581. Gebbia M, Ferrero GB, Pilia G, Bassi MT, Aylsworth AS, Penman-Splitt M, Bird LM, Bamforth JS, Burn J, Schlessinger D, Nelson DL, Casey B.

(1997) X-linked situs

abnormalities result from mutations in ZIC3. Nat Genet, 17: 305-308. Giacchino M, Toso P, Buzzi M, Nigro N, Benso L. (1977) Su di una rarissima associazione di processi morbosi. Min Ped, 29: 1879-88. Greulich WW, Pyle SI. Radiographic Atlas of Skeletal Development of the Hand and Wrist. 2nd edition. Stanford University Press, Stanford, USA, 1959. Halász Z, Gács G, Sólyom J, Péter F, Muzsnai Á, Kozári A, Soltész Gy. (1994) Hypopituiter nanosom betegek gyermekkori tartós Grorm-kezelésének értékelése az elért testmagasság tükrében. Gyermekgyógyászat, 5: 432-434. Halász Z, Tőke J, Patócs A, Bertalan R, Tömböl Z, Sallai A, Hosszú É, Muzsnai Á, Kovács L, Sólyom J, Fekete Gy, Rácz K. (2006) High prevalence of PROP1 gene mutations in Hungarian patients with childhood-onset combined anterior pituitary hormone deficiency. Endocrine, 30: 255-260. Halász Z, Bertalan R, Tőke J, Tömböl Zs, Losonczi L, Patócs A, Sólyom J, Fekete Gy, Rácz K. (2007) A többszörös hypophysis hormon-hiány genetikai okai. A hypophysis transzkripciós faktorok szerepe. Magy Belorv Arch, 60:129-134. Hubina E, Czirják S, Görömbey Z, Julesz J, Kovács GL, Kovács L, Laczi F, Magony S, Mezősi E, Nemes O, Rácz K, Szabolcs I, Szigeti-Csúcs N, Szücs N, Tóth M, Góth M.

70

(2006) A felnőttkori növekedésihormon-pótló kezelés 10 éves hazai tapasztalatai. Magy Belorv Arch , 60: 71-82. Joss E, Zuppinger K, Schwarz HP, Roten H. (1983) Final height of patients with pituitary growth failure and changes in growth variables after long-term hormonal therapy. Pediatr Res, 17:676-679. Kartagener M, Horlacher A. (1936) Situs viscerum inversus und polyposis nasi in einem Falle Familiaerer Bronchiektasien. Beitr Klin Tuberk, 87: 331-333. Kelberman D, Dattani MT. (2006) The role of transcription factors implicated in the anterior pituitary development in the aetiology of congenital hypopituitarism. Ann Med, 38: 560-577. Kennedy DN, O’Craven KM, Ticho BS, Goldstein AM, Makris N, Henson JW. (1999) Structural and functional brain asymmetries in human situs inversus totalis. Neurology, 53: 1260-1265. Kitamura K, Miura H, Miyagawa-Tomita S, Yanazawa M, Katoh-Fukui Y, Suzuki R, Ohuchi H, Suehiro A, Motegi Y, Nakahara Y, Kondo S, Yokoyama M. (1999) Mouse PITX2 deficiency leads to anomalies of the ventral body wall, heart, extra-and periocular mesoderm and right pulmonary isomerism. Development, 126: 5749-5758. Kosaki R, Gebbia M, Kosaki K, Lewin M, Bowers P, Towbin JA, Casey B. (1999) Left-right axis malformations associated with mutations in ACVR2B, the gene for human activin receptor type IIB. Am J Med Genet, 82: 70-76. Kosaki K, Bassi MT, Kosaki R, Lewin M, Belmont J, Schauer G, Casey B. (1999) Characterization and mutation analysis of human LEFTY A and LEFTY B, homologues of murine genes implicated in left-right axis development. Am J Hum Genet, 64: 712721. Kurtoglu S, Atabek ME. (2003) Growth hormone deficiency, situs inversus, hypertrichosis and brachydactyly. J Pediatr Endocr Metab, 16: 795-798.

71

Lebl J, Vosáhlo J, Pfäffle RW, Stobbe H, Cerná J, Novotná D, Zapletalová J, Kalvachová B, Hána V, Weiss V, Blum WF. (2005) Auxological and endocrine phenotype in a population-based cohort of patients with PROP1 gene defects. Eur J Endocrinol, 153: 389-396. Lemos MC, Gomes L, Bastos M, Leite V, Limbert E, Carvalho D, Bacelar C, Monteiro M, Fonseca F, Agapito A, Castro JJ, Regateiro FJ, Carvalheiro M. (2006) PROP1 gene analysis in Portuguese patients with combined pituitary hormone deficiency. Clin Endocrinol, 65: 479-485. Levin M, Johnson RL, Stern CD, Kuehn M, Tabin C. (1995) A molecular pathway determining left-right asymmetry in chick embryogenesis. Cell, 82: 803-814. Levin M. (2005) Left-right asymmetry in embryonic development: a comprehensive review. Mech Develop, 122: 3-25. Lin CR, Kioussi C, O’Connell S, Briata P, Szeto D, Liu F, Izpisua-Belmonte JC, Rosenfeld MG (1999)

Pitx2 regulates lung asymmetry, cardiac positioning and

pituitary and tooth morphogenesis. Nature, 401: 279-282. Logan M,

Pagán-Westphal SM, Smith DM, Paganessi L, Tabin CJ. (1998) The

transcription factor Pitx2 mediates situs-specific morphogenesis in response to left-right asymmetric signals. Cell, 94: 307-317. Machinis K, Pantel J, Netchine, I, Leger J, Camand OJA, Sobrier ML, Dastot-Le Moal F, Duquesnoy P, Abitbol M, Czernichow P, Amselem S. (2001) Syndromic short stature in patients with a germline mutation in the LIM homeobox LHX4. Am J Hum Genet, 69: 961-968. Mantovani G, Asteria C, Pellegrini C, Bosari S, Alberti L, Bondioni S, Peverelli E, Spada A, Beck-Peccoz P. (2006) HESX1 expression in human normal pituitaries and pituitary adenomas. Mol Cell Endocrinol, 247: 135-139.

72

McLennan K, Jeske Y, Cotterill A, Cowley D, Penfold J, Jones T, Howard N, Thomsett M, Choong C. (2003) Combined pituitary hormone deficiency in Australian children: clinical and genetic correlates. Clin Endocrinol, 58: 785-794. McManus C. (2005) Reversed bodies, reversed brains, and (some) reversed behaviours of zebrafish and men. Dev Cell, 8: 796-797. Mehta A, Dattani MT Congenital disorders of the hypothalamic-pituitary axis. In: Brook CGD, Clayton PE, Brown RS (szerk.), Clinical pediatric endocrinology. Blackwell Publishing Ltd, UK, 2005: 67-89. Mendoca BB, Osorio MGF, Latronico, AC, Estefan V, Lo LSS, Arnhold IJP. (1999) Longitudinal hormonal and pituitary imaging changes in two females with combined pituitary hormone deficiency due to deletion of A301,G302 in the PROP1 gene. J Clin Endocr Metab, 84: 942-945. Mody S, Brown MR, Parks JS. (2002) The spectrum of hypopituitarism caused by PROP1 mutations. Best Pract Res Clin Endocr Metab, 16: 421-431. Mullen RD, Colvin SC, Hunter CH, Savage JJ, Walvoord EC, Bhangoo APS, Ten S, Weigel J, Pfäffle RW, Rhodes SJ. (2007) Roles of the LHX3 and LHX4 LIMhomeodomain factors in pituitary development. Mol Cell Endocrinol, 265-266: 190195. Muncke N, Niesler B, Roeth R, Schön K, Rüdiger H-J, Goldmuntz E, Goodship J, Rappold G.

(2005) Mutational analysis of the PITX2 coding region revealed no

common cause for transposition of the great arteries (dTGA). BMC Med Genet, 6: 20. Otto EA, Schermer B, Obara T, O'Toole JF, Hiller KS, Mueller AM, Ruf RG, Hoefele J, Beekmann F, Landau D, Foreman JW, Goodship JA, Strachan T, Kispert A, T Wolf MT, Gagnadoux MF, Nivet H, Antignac C, Walz G, Drummond IA, Benzing T, Hildebrandt F. (2003) Mutations in INVS encoding inversin cause nephronophthisis type 2, linking renal cystic disease to the function of primary cilia and left-right axis determination. Nat Genet, 34: 413-420.

73

Parks JS, Brown MR, Hurley DL, Phelps CJ, Wajnrajch MP. (1999) Heritable disorders of pituitary development. J Clin Endocr Metab, 84: 4362-4370. Peeters H, Devriendt K. (2006) Human laterality disorders. Eur J Med Genet, 49: 349362. Péter F, Kovács I, Szabó B. (1970) Emberi növekedési hormonnal szerzett diagnosztikai és therápiás tapasztalataink. Gyermekgyógyászat, 21: 86-93. Péter F. Gyermekgyógyászati endocrinologia. In: Gláz E (szerk.), Klinikai endocrinologia. Medicina, Budapest, 1981: 961-998. Pfaeffle RW, DiMattia GE, Parks JS, Brown MR, Wit JM, Jansen M, Van der Nat H, Van den Brande JL, Rosenfeld MG, Ingraham HA (1992) Mutation of the POU-specific domain of Pit-1 and hypopituitarism without pituitary hypoplasia. Science, 257:11181121. Pfaeffle RW, Savage JJ, Hunter CH, Palme C, Ahlmann M, Kumar P, Bellone J, Schoenau E, Korsch E, Bramswig JH, Stobbe HM, Blum WF, Rhodes SJ. (2007) Four novel mutations of the LHX3 gene cause combined pituitary hormone deficiencies with or without limited neck rotation. J Clin Endocr Metab, 92: 1909-1919. Piedra ME, Icardo JM, Albajar M., Rodriguez-Rey JC, Ros MA. (1998) Pitx2 participates in the late phase of the pathway controlling left-right asymmetry. Cell, 94: 319-324. Powell-Jackson J, Kennedy P, Withcombe EM, Welker RO, Preece MA, Neusom-Davis J. (1985) Creutzfeldt-Jakob disease after administration of human growth hormone. Lancet, 326: 244-246. Quentien MH, Manfroid I, Moncet D, Gunz G, Muller M, Grino M, Enjalbert A, Pellegrini I (2002) Pitx factors are involved in basal and hormone-regulated activity of the human prolactin promoter. J Biol Chem, 277: 44408-44416.

74

Quentien MH, Barlier A, Franc JL, Pellegrini I, Brue T, Enjalbert A. (2006) Pituitary transcription factors: from congenital deficiencies to gene therapy. J Neuroendocrinol, 18: 633-642. Raben MS. (1958) Treatment of a pituitary dwarf with human growth hormone. J Clin Endocr, 18: 901-903. Rácz K (2007) Az endokrin rendszer betegségei. A hypothalamus és hypophysis betegségei. In: Tulassay Zs (szerk.), A belgyógyászat alapjai. Medicina Könyvkiadó ZRT, Budapest, 1364-1395. Rainbow L. Rees SA, Shaikh MG, Shaw NJ, Cole T, Barrett TG, Kirk JMW. (2005) Mutation analysis of POU1F1, PROP-1 and HESX-1 show low frequency of mutations in children with sporadic forms of combined pituitary hormone deficiency and septooptic dysplasia. Clin Endocrinol, 62: 163-168. Regal M, Paramo C, Sierra SM, Garcia-Mayor RV. (2001) Prevalence and incidence of hypopituitarism in an adult caucasian

population in northwestern

Spain Clin

Endocrinol (Oxf), 55: 735-740. Reynaud, R, Barlier A, Vallette-Kasic S, Saveanu A, Guillet M.P, Simonin G, Enjalbert A, Valensi P, Brue T. (2005) An uncommon phenotype with familial central hypogonadism caused by a novel PROP1 gene mutant truncated in the transactivation domain. J Clin Endocr Metab, 90: 4880-4887. Reynaud R, Chadli-Chaieb M, Vallette-Kasic S, Barlier A, Sarles J, Pellegrini-Bouiller Enjalbert A, Chaieb L, Brue T. (2004) A familial form of congenital hypopituitarism due to a Prop1 mutation in a large kindred: phenotypic and in vitro functional studies. J Clin Endocr Metab, 89: 5779-5786. Reynaud R, Gueydan M, Saveanu A, Vallette-Kasic S, Enjalbert A, Brue T, Barlier A. (2006) Genetic screening of combined pituitary hormone deficiency: experience in 195 patients. J Clin Endocr Metab, 91: 3329-3336.

75

Reynaud R, Saveanu A, Barlier A, Enjalbert A, Brue T. (2004) Pituitary hormone deficiencies due to transcription factor gene alterations. Growth Horm IGF Res, 14: 442-448. Rosenbloom AL, Almonte AS, Brown MR, Fisher DA, Baumbach L, Parks JS. (1999) Clinical and biochemical phenotype of familial anterior hypopituitarism from mutation of the PROP1 gene.

J Clin Endocr Metab, 84: 50-57.

Rosenfeld MG, Izpisúa-Belmonte JC. (1998) Pitx2 determines left-right asymmetry of internal organs in vertebrates. Nature, 394: 545-551. Ryan AK, Blumberg B, Rodriguez-Esteban C, Yonei-Tamura S, Tamura K, Tsukui T, de la Peña J, Sabbagh W, Greenwald J, Choe S, Norris DP, Robertson EJ, Evans RM, Rosén T, Bengtsson BA. (1990) Premature mortality due to cardiovascular disease in hypopituitarism. Lancet, 336: 285-288. Savage JJ, Yaden BC, Kiratipranon P, Rhodes SJ. (2003) Transciptional control during mammalian anterior pituitary development. Gene, 319: 1-19. Scully KM, Rosenfeld MG. (2002) Regulatory codes in mammalian organogenesis. Science, 295: 2231-2235. Semina EV, Reiter R, Leysens NJ, Alward LM, Small KW, Datson NA, Siegel-Bartelt J, Bierke-Nelson D, Bitoun P, Zabel BU, Carey JC, Murray JC.

(1996) Cloning and

characterization of a novel bicoid-related homeobox transcription factor gene, RIEG, involved in Rieger syndrome. Nat Genet, 14: 392-399. Shalet SM, Shavrikova E. (2003) Effect of growth hormone (GH) treatment in postpubertal GH-deficiency. J Clin Endocr Metab, 88: 4124-4129. Simon D, Hadjiathanasiou C, Garel C, Czernichow P, Léger J. (2006) Phenotypic variability in children with growth hormone deficiency associated with posterior pituitary ectopia. Clin Endocrinol, 64: 416-422.

76

Sloop KW, Walvoord EC, Showalter AD, Pescovitz OH, Rhodes SJ. (2000) Molecular analysis of LHX-3 and PROP-1 in pituitary hormone deficiency patients with posterior pituitary actopia. J Clin Endocr Metab, 85: 2701-2708. Stern CD, Yu RT, Kakizuka A, Kintner CR, Mathews LS, Vale WW, Evans RM, Umesono K. (1995) Activin and its receptors during gastrulation and the later phases of mesoderm development in the chick embryo. Dev Biol, 172: 192-205. Sornson MW, Wu W, Dasen JS, Flynn SE, Norman DJ, O’Connell, SM, Gukovsky I, Carriére C, Ryan AK, Miller AP, Zuo L, Gleiberman AS, Andersen B, Beamer WG, Rosenfeld MG. (1996) Pituitary lineage determination by the Prophet of Pit-1 homeodomain factor defective in Ames dwarfism. Nature, 384: 327-333. Tajima T, Hattori T, Nakajima T, Okuhara K, Tsubaki J, Fujeda K. (2007) A novel missense mutation (P366T) of the LHX4 gene causes severe combined pituitary hormone deficiency with pituitary hypoplasia, ectopic posterior lobe and a poorly developed sella turcica. Endocr J, 54: 637-641. Tatsumi K, Kikuchi K, Tsumura K, Amino N. (2004) A novel PROP1 gene mutation (157delA) in Japanese siblings with combined anterior pituitary hormone deficiency. Clin Endocrinol, 61: 635-640. Tatsumi K, Miyai K, Notomi T, Kaibe K, Amino N, Mizuno Y, Kohno H. (1992) Cretinism with combined hormone deficiency caused by mutation in the PIT1 gene. Nat Genet, 1: 56-58. Ten S, New M, Maclaren N. ( 2001) Addison’s disease 2001. J Clin Endocr Metab, 86: 2909-2922. Thomas PQ, Dattani MT, Brickman JM, McNay D, Warne G, Zacharin M, Cameron F, Hurst J, Woods K, Dunger D, Stanhope R, Forrest S, Robinson ICAF, Beddington RSP. (2001) Heterozygous HESX1 mutations associated with isolated congenital pituitary hypoplasia and septo-optic dysplasia. Hum Mol Genet, 10: 39-45.

77

Tubbs ES, Wellons III JC, Salter G, Blount JP, Oakes WJ. (2003) Intracranial anatomic asymmetry in situs inversus totalis. Anat Embryol, 206: 199-202. Turton JPG, Reynaud R, Mehta A, Torpiano J, Saveanu A, Woods KS, Tiulpakov A, Zdravkovic V, Hamilton J, Attard-Montalto S, Parascandalo R, Vella C, Clayton E, Shalet S, Barton J, Brue T, Dattani MT. (2005) Novel Mutations within the POU1F1 Gene Associated with variable Combined Pituitary Hormone Deficiency. J Clin Endocrinol Metab, 90: 4762-4770. Vallette-Kasic S, Barlier A, Teinturier C, Diaz A, Manavela M, Berthezène F, Bouchard P, J. Chaussain L, Brauner R, Pellegrini-Bouiller I, Jaquet P, Enjalbert A, Brue T. (2001) Prop1 gene screening in patients with multiple pituitary hormone deficiency reveals two sits of hypermutability and a high incidence of corticotroph deficiency. J Clin Endocr Metab, 86: 4529-4535. Viera TC, Dias da Sila MR, Abucham J. (2006) The natural history of the R120C PROP1 mutation reveals a wide phenotypic variability in two untreated adult brothers with combined pituitary hormone deficiency. Endocrine, 30:365-369. Voutetakis A, Argyropoulou M, Sertedaki A, Livadas S, Xekouki P, Maniati-Christidi M, Bossis I, Thalassinos N, Patronas N, Dacou-Voutetakis C. (2004) Pituitary magnetic resonance imaging in 15 patients with Prop1 gene mutations: pituitary enlargement may originate from the intermediate lobe. J Clin Endocr Metab, 89: 2200-2206. Wales JKH, Quarrell OWJ. (1996) Evidence for possible Mendelian inheritance of septo-optic dysplasia. Acta Paediatr, 85: 391-392. Ward RD, Raetzman LT, Suh H, Stone BM, Nasonkin IO, Camper SA. (2005) Role of PROP1 in the pituitary gland growth. Mol Endocrinol, 19: 698-710. Wu W, Cogan JD, Pfaffle RW, Dasen JS, Frisch H, O'Connell SM, Flynn SE, Brown MR, Mullis PE, Parks JS, Phillips JA III, Rosenfeld MG. (1998) Mutations in PROP1 cause familial combined pituitary hormone deficiency. Nat Genet, 18: 147-149.

78

Zhu X, Lin CR, Prefontaine GG, Tollkuhn J, Rosenfeld MG. (2005) Genetic control of pituitary development and hypopituitarism. Curr Opin Genet Dev, 15: 332-340.

79

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetemet fejezem ki Prof. Dr. Tulassay Zsoltnak, a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika igazgatójának, aki programvezetőként lehetővé tette számomra az értekezés megírását. Köszönöm Prof. Dr. Fekete Györgynek, a Semmelweis Egyetem II. sz. Gyermekgyógyászati Klinika igazgatójának, hogy munkámban mindvégig támogatott és segítséget nyújtott. Hálás köszönetemet fejezem ki témavezetőmnek, Prof. Dr. Rácz Károlynak azért a rendkívül sok segítségért, bíztatásért, mellyel a munkámat végig támogatta és külön köszönet határozott számonkéréseiért, mellyel a Ph.D értekezésem megírását elérte. Köszönöm

a

Semmelweis

Egyetem

Molekuláris

Biológiai

Laboratóriumában

dolgozóknak, különösképpen Dr. Tőke Juditnak, Dr. Bertalan Ritának, Dr. Gergics Péternek, dr. Patócs Attilának és Krauszné Vaczula Máriának azt a leírhatatlan sok segítséget, mellyel a molekuláris genetikai

vizsgálatokkal töltött időben tanítottak,

munkámat segítették és kellemessé varázsolták. Köszönetemet fejezem ki Gláz Edit Professzor Asszonynak eddigi pályám során mindvégig érzett kedves támogatásáért. Köszönöm Prof. Dr. Péter Ferencnek, a Budai Gyermekkórház volt főigazgatójának, hogy a gyermekendokrinológia felé irányította utamat, megtanított az alapokra és segített a klinikusi szemlélet elsajátításában. Köszönöm a Budai Gyermekkórházban dolgozó volt munkatársaimnak, elsősorban Dr. Blatniczky László Főorvosnak, Dr. Tar Attila Főorvosnak és Dr. Muzsnai Ágota Főorvosnőnek barátságukat és azt a sok segítséget, amit a „ BUDAI-s” évek alatt kaptam Tőlük. Hálával tartozom Prof. Dr. Schuler Dezsőnek, hogy lehetővé tette, hogy a Semmelweis Egyetem II. Gyermekgyógyászati Klinikáján dolgozhassak, figyelmére és támogatására mindig számíthattam.. Köszönöm Prof. Dr. Sólyom Jánosnak, az endokrinológiai munkacsoport volt vezetőjének tanításait és bíztatásait, Dr. Hosszú Évának, Dr. Luczay Andreának, Dr. Sallai Ágnesnek, Kirchknopfné Gudrunnak, Bukor Évának, Füredi Miklósnénak, a munkacsoport és az Endokrinológiai Osztály minden tagjának a felejthetetlen közös munkát . Köszönetemet fejezem ki családomnak azért a megértésért, türelemért és támogatásért, mellyel munkámat elviselték és segítették. Hálásan köszönöm drága szüleim odaadó szeretetét.

80

ÖSSZEFOGLALÓ Munkámban veleszületett hypophysis hormon-hiányban (MPHD) szenvedő betegekben a növekedési hormon (GH) pótló kezelés eredményeit elemeztem és az MPHD hátterében álló betegség-okozó hypophysis transzkripciós faktor gén mutációkat vizsgáltam. Megállapítottam, hogy a GH-hiányban szenvedő gyermekek kezelésére szervezett keretek között elsőként rendelkezésre álló humán GH-készítmény 7 évnél hosszabb alkalmazása után a betegek átlagos testmagassága a hazai kor és nem specifikus adatok szerinti normális tartományba került. Klinikai feltételrendszert dolgoztam ki a PROP1 gén mutációk szűrésére és 35 MPHD-s betegben elvégeztem a gén összes kódoló exonjának mutáció-analízisét. A vizsgált 35 beteg közül 15 betegben (43%) találtam betegség-okozó mutációkat. Megállapítottam, hogy a mutáns allélok több, mint 80 %-át a 150delA és 301-302delGA mutációkat tartalmazó allélek tették ki. Ezek az eredmények hazai MPHD-s betegekben a PROP1 gén mutációs ”hot spot”-jának kiemelkedő jelentőségét bizonyítják és egyben lehetőséget nyújtanak a PROP1 gén mutációszűrés racionális és költség-hatékony stratégiájának kidolgozására. PROP1 gén mutációt hordozó és nem hordozó veleszületett MPHD-s betegek klinikai- és hormon- adatainak összehasonlításával megállapítottam, hogy a PROP1 gén mutációt hordozó betegekben a GHszekréció zavarát szignifikánsan korábbi életkorban diagnosztizálták, mint a mutációt nem hordozó betegekben, azonban a GH-hiány diagnózisának megállapításakor a növekedés elmaradás mértékében, vagy a GH-hiányhoz társuló TSH, LH, FSH és ACTH hiány megjelenésének időpontjában nem találtam különbséget a két csoport között. PROP1 gén mutációt nem hordozó 15 veleszületett MPHD-s betegben a POU1F1 gén mutációs ”hot spot”ját tartalmazó 6. exon analízisével nem találtam heterozygota vagy homozygota mutációt. Ezek az eredmények nem támasztják alá azt a lehetőséget, hogy hazai MPHD-s betegekben a POU1F1 gén mutációs ”hot-spot”-jának betegség-okozó szerepe lenne. Módszert dolgoztam ki a hypophysis fejlődésében és a lateralizációs zavarokban egyaránt jelentőséggel bíró PITX2 gén mutációk kimutatására. A módszert sikeresen alkalmaztam egy situs inversus totálishoz társuló MPHD-s betegben a gén nukleotid-szekvenciájának vizsgálatára, azonban nem sikerült mutáció jelenlétét bizonyítanom. Eredményeim nem bizonyítják hogy a PITX2 gén mutációinak szerepe lehet a situs inversus totalissal társuló MPHD kialakulásában.

81

SUMMARY In this work I analysed the outcome of growth hormone (GH) replacement treatment in patients with inherited form of multiple pituitary hormone deficiency (MPHD) and examined diseasecausing mutations of pituitary transcription factor genes which may underlie MPHD. The results showed that after treatment for a longer than 7-yr period with a GH-preparation available under well-controlled distribution, the mean height of children with GH-deficiency reached the normal national reference range adjusted for age and sex. After establishment of clinical criteria for screening PROP1 gene mutations, I performed mutational analysis of all coding exons of this gene in 35 patients with MPHD. With these studies, diseases-causing PROP1 gene mutations were detected in 15 of the 35 patients (43%). It was also found that more than 80% of mutant alleles were accounted for by those containing the 150delA and 301-302delGA mutations of the PROP1 gene. Importantly, these findings indicated a high relevance of mutational ”hot spots” of the PROP1 gene in Hungarian patients with MPHD and they also offered an opportunity for the development of rational and cost-effective screening strategy. When clinical and hormonal findings of MPHD patients with and without PROP1 gene mutations were compared, the results showed that GH-deficiency was diagnosed at earlier age of life in patients with PROP1 gene mutations, but the severity of growth retardation at the time of diagnosis of GH-deficiency or the age of patients at the time of manifestation of other pituitary hormone deficiencies (TSH, LH, FSH and ACTH) were similar in the two groups of patients. In 15 MPHD patients without PROP1 gene mutations, the exon 6 of the POU1F1 gene containing a mutational ”hot spot” was also examined but no mutations were found. Thus, these results do not support a significant role of the mutational ”hot spot” of the POU1F1 gene in Hungarian MPHD patients. Finally, I introduced a method for the detection of mutations of the PITX2 gene, a pituitary transcription factor that plays a role not only in pituitary development and differentiation but also in the lateralization of organs. With the use of this method, I performed mutational analysis of all coding exons of this gene in an exceptionally unique patient who had both situs inversus totalis and MPHD, but no mutation was found. Thus, the findings in this patient failed to indicate that mutation of the PITX2 gene is involved in the pathomechanism of situs inversus totalis associated with MPHD.

82

AZ ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Cikk: Halász Z, Gács G, Sólyom J, Péter F, Muzsnai Á, Kozári A, Soltész Gy. (1994) Hypopituiter nanosom betegek gyermekkori tartós Grorm-kezelésének értékelése az elért testmagasság tükrében. Gyermekgyógyászat, 5: 432-434. Halász Z, Tőke J, Patócs A, Bertalan R, Tömböl Z, Sallai A, Hosszú É, Muzsnai Á, Kovács L, Sólyom J, Fekete Gy, Rácz K. (2006) High prevalence of PROP1 gene mutations in Hungarian patients with childhood-onset combined anterior pituitary hormone deficiency. Endocrine, 30: 255-260. Halász Z, Bertalan R, Tőke J, Tömböl Zs, Losonczi L, Patócs A, Sólyom J, Fekete Gy, Rácz K. (2007) A többszörös hypophysis hormon-hiány genetikai okai. A hypophysis transzkripciós faktorok szerepe. Magy Belorv Arch, 60: 419-424. Halász Z, Bertalan R, Tőke J, Patócs A, Tóth M, Fekete Gy, Gláz E, Rácz K. (2007) Laterality disturbance and hypopituitarism. A case report of co-existing situs inversus totalis and combined pituitary hormone deficiency. J Endocrinol Invest (megjelenés alatt ) Könyvfejezet: Halász Z, Hosszú É, Sallai Á. (2000) Elégtelen hormontermelés, hormonpótló kezelés. In: Fekete Gy. (szerk), Tabulatorium paediatriae. Melania Kft, Budapest, 2000: 93-103. Halász Z, Sólyom J. Az endokrin betegségek farmakoterápiája. In: Fekete F és Gyurkovits K (szerk), Gyermekgyógyászati farmakoterápia. B+V Lap- és Könyvkiadó Kft, Gyoma, 2006: 386-418. Idézhető absztrakt: Sallai Á, Tőke J, Bertalan R, Tömböl Zs, Halász Z, Sólyom J. (2005) Clinical and hormonal phenotype and PROP1 genotype in a short girl –case report. DMEV S2: 8

83

(MESPE, Mikulov) Halász Z, Majnik J, Tőke J, Tömböl Zs, Hosszú É, Muzsnai Á, Sallai Á, Juhász É, Kozári A, Bertalan R, Tóth M, Sólyom J, Rácz K. (2005) Combined pituitary hormone deficiency. Mutation analysis of PROP-1 gene and clinical characteristics. Horm Res 64. S1: 224. (ESPE, 2005. Lyon) Halász Z, Majnik J, Tőke J, Bertalan R, Tömböl Zs, Balogh K, Patócs A, Tóth M, Rácz K. (2006)

A hypophysis transzkripciós faktorokat kódoló gének hazai vizsgálati

eredményei veleszületett kombinált hipofízishormon-elégtelenségben. Magy Belorv Arch S1:39. (MEAT, 2006. Debrecen) Halász Z, Tőke J, Patócs A, Bertalan R, Tömböl Zs, Sallai Á, Hosszú É, Muzsnai Á, Kovács L, Sólyom J, Fekete Gy, Rácz K. (2007) Genetic analysis of PROP1 gene in patients with childhood-onset combined pituitary hormone deficiency (CPHD). Endocrine Abstracts 14: P585 (ECE, 2007. Budapest)

EGYÉB PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Cikk: Blatniczky L, Áprili Z, Halász Z, Kovács Zs, Péter F. (1989) Budapesti általános iskolás korú gyermekek testi fejlettségének vizsgálata, különös tekintettel a testtömegre. Gyermekgyógyászat, 40: 415-424. Blatniczky L, Halász Z. (1989) Elhízott gyermekek inzulin anyagcseréjének vizsgálata per os és intravénás glukóz terhelés kapcsán. Orvosi Hetilap, 130:2357-2361. Laczi F, Julesz J, Vecsernyés M., Halász Z., Márk G., Óvári Z., Szarvas F. (1992) Two families with hereditary diabetes insipidus not due to osmoreceptor failure. Horm Metab Res, 24:70-72.

84

Muzsnai Á, Halász Z, Péter F. (1992) Sex hormone binding globulin (SHBG) vérszint alakulása veleszületett hypothyreosisban, kezelés előtt és alatt. Gyermekgyógyászat; 43: 357-360. Péter F, Halász Z, Muzsnai Á, Nagy A. (1992) Gonadotropin Releasing Hormone (GnRH) pulzatil alkalmazásával szerzett tapasztalataink.Gyermekgyógyászat, 43. 299304. Sólyom J, Halász Z, Hosszú É, Gláz E, Vihko R, Orava M, Homoki J, Wudy SA, Teller WM. (1995) Serum and urinary steroids in girls with precocious pubarche and/or hirsutism due to mild 3-beta-hydroxysteroid dehydrogenase deficiency. Horm Res 44:133-141. Sólyom J, Halász Z, Hosszú É, György I, Niederland T, Vihko R, Homoki J. (1995) A congenitalis adrenalis hyperplasia gyakoribb nem klasszikus formáinak diagnosztikája. Orvosi Hetilap, 136: 2837-2841. Tóth M, Rácz K, Halász Z, Gláz E. (1996) Adrenal tumour associated with silent 21hydroxylase deficiency in a male or with a classic form of 21-hydroxylase defect in a female? (Letter to the Editors) Clin Endocrinol, 45: 369-370. Sólyom J, Hosszú É, Hargitai G, Halász Z.(1997) Serum Level of IGF-I and Osteocalcin in Congenital Adrenal Hyperplasia. Horm Res 48:97- 98. Cihakova D, Trabusak K, Heino M, Fadeyev V, Tiulpakov A, Battelino T, Tar A, Halász Z, Blumel P, Tawfik S, Krohn K, Lebl J, Peterson P.(2001)

Novel Aire

Mutations and P450 Cytochrome Autoantibodies in Central and Eastern European Patients With APECED. Hum Mutat, 18: 225-232. Halász Z. (2002) Autoimmun polyendocrinopathia szindróma. Focus medicinae, 4:3033.

85

Halász Z. (2003) Endokrin elváltozásokkal járó familiáris tumor-szindrómák. Gyermekgyógyászat, 54:467-471. Scheiber D, Barta Cs, Halász Z, Sallai Á, Rácz K, Ságodi L, Fekete Gy, Hiort O, Sólyom J. (2003) Mutational Analyasis of Hungarian Patients with Androgen Insensitivity Syndrome. J Pediatr Endocrinol Metab,16:367-373. Török D, Halász Z, Garami M, Homoki J, Fekete Gy, Sólyom J. (2003) Limited Value of Serum Steroid Measurements in Identification of Mild Form of 21-Hydroxylase Deficiency. Exp Clin Endocrinol Diab 111: 27-32. Halász Z. (2006) Endokrinológiai feladatok gyermekkori daganatos megbetegedések miatt kezeltek utógondozásában. Gyermekgyógyászati Továbbképző előadások. Tiszaparti Esték 2005-2006.(szerk: Túri Sándor) 267-270. Sallai Á, Ugocsai P, Halász Z, Hosszú É, Ságodi L, Erhardt É, Kozári Á, Niederland T, Szabó J, Sólyom J, Dobos M, Fekete Gy. (2006) Y-kromoszóma DNS-szekvenciáinak Szűrése Turner-szindrómában. Gyermekgyógyászat, 57:409-417. Halász Z. (2006) Endokrinológiai feladatok a gyermekkori onkohematológiai betegségben szenvedők gondozásában. Gyermekkori malignus megbetegedések kezelésének késői endokrinológiai következményei. Gyermekgyógyászat 57: 401-408 Könyvfejezet: Halász Z. A hypothalamus betegségek: veleszületett és szerzett kórképek. In: Leövey A (szerk.), A klinikai endokrinológia és anyagcsere-betegségek kézikönyve. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2001:157-159. Halász

Z.

Endokrin

tumorok

a

gyermekkorban.

In:

Oláh

É

(szerk.),

Gyermekgyógyásza-ti kézikönyv. Medicina Könyvkiadó, Budapest, 2004; 497-504. Idézhető absztrakt:

86

Blatniczky L, Péter F, Halász Z. (1989) Examination of insulin metabolism in obese children during p. o. and i.v. glucose tolerance test. Int J Obes¸ 13. Suppl 1: 41. Halász Z, Sólyom J. (1995)

„Idiopathic” gynecomastia-partial deficiency of 17-

ketosteroid reductase? Pädiatrie und Padologie, 30:106. Halász Z, Tomsits E, Sólyom J. (1998) Autoimmun polyglandular syndrome Type 1. Endocrine Regulations, 32: 206. Halász Z, Garami M, Hajmássy Zs, Kovács V. (2002) Metastatic adrenocortical carcinoma: History of the first year of life. Endocrine Regulations, 36:184. Bertalan R, Halász Z, Csabay L, Rigó J, Tőke J, Boyle B, Rácz K.(2006) Absence of virilization in a female infant born to a mother with severe hyperandrogenism during the entire tenure of pregnancy. Horm Res, 65(S4):139. Sallai Á, Ugocsai P, Halász Z, Hosszú É, Luczay A, Ságodi L, Niederland T, Erhardt É, Kozári A, Szabó J, Dobos M, Sólyom J, Fekete Gy.(2006) Screening of Y-specific sequences in 124 Hungarian patients with Turner syndrome. Horm Res, 65(S4):187.

87