A természetes és adaptív immunitás egyes tényezőinek vizsgálata cöliákiában, 1-es típusú diabetes mellitusban és a két betegség társulásakor Doktori Értekezés
Dr. Dezsőfi Antal Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Arató András, egyetemi tanár
Hivatalos bírálók:
Dr. Micskey Éva, főorvos Dr. Juhász Márk, egyetemi adjunktus
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Papp János, egyetemi tanár Szigorlati bizottság tagjai: Dr. B.Kovács Judit, főorvos Dr. Miheller Pál egyetemi adjunktus
Budapest 2009
TARTALOMJEGYZÉK
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE........................................................................................ 4 BEVEZETÉS................................................................................................................ 6 Cöliákia ................................................................................................................ 6 A cöliákia és a HLA rendszer ................................................................................ 7 1-es típusú diabetes mellitus.................................................................................. 7 Genetikai faktorok szerepe az autoimmunitásban .................................................. 8 A diabetes mellitus és a HLA rendszer kapcsolata ................................................. 9 Diabetes és cöliákia ............................................................................................ 12 Toll like receptorok ............................................................................................. 14 Toll like receptor 2 .............................................................................................. 15 Toll like receptor 3 .............................................................................................. 16 Toll like receptor 4 .............................................................................................. 17 TNF- ................................................................................................................. 18 CD14 .................................................................................................................. 18 CÉLKITŰZÉSEK....................................................................................................... 23 BETEGANYAG ÉS MÓDSZEREK ........................................................................... 25 Betegek és kontrollok az egyes vizsgálati csoportokban...................................... 25 Alkalmazott módszerek ........................................................................................ 28 Cöliákia szűrése .................................................................................................. 28 TLR2, TLR3 és TLR4 expressziós vizsgálatok.................................................... 29 RNS izolálás .................................................................................... 29 Komplementer DNS szintézis .......................................................... 29 Szemikvantitatív PCR (humán GAPDH, TLR2, TLR3, TLR4)......... 29 A szemikvantitatív és real time RT-PCR mérések értékelése ............ 30 Western blot (TLR2, TLR3, TLR4, aktin) ........................................................... 31 Minta előkészítés ............................................................................. 31 Western blot kontrollok.................................................................... 31 Antitestek......................................................................................... 31 A Western blot-ok kiértékelése ........................................................ 31 SDS-PAGE ...................................................................................... 32 Blottolás .......................................................................................... 32 Immunoblotting ............................................................................... 32 Az immunoreaktív helyek detektálása .............................................. 33 PCR-restrikciós fragment hossz polimorfizmus (PCR-RFLP).............................. 33 DNS izolálás .................................................................................... 33 TNF- polimorfizmusainak vizsgálata ................................................................ 34 HLA-DQ meghatározás....................................................................................... 35 STATISZTIKAI MÓDSZEREK ................................................................................. 36 EREDMÉNYEK......................................................................................................... 38 CD előfordulási gyakorisága T1DM-s magyar gyermekekben ........................... 38 A természetes immunitás vizsgálata CD-ben. A TLR2, TLR3 és TLR4 expressziójának vizsgálata cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában ............................................................................................................................... 41 A TLR2, TLR3 és TLR4 mRNS expresszió változásai cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában .............................................................................. 41 A TLR2, TLR3 és TLR4 fehérje szintek változásai cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában ............................................................................................... 42 A természetes immunitást befolyásoló CD14 és TLR4 genetikai polimorfizmusának vizsgálata CD, T1DM és CD+T1DM-s betegekben............. 44 2
TNF-alfa polimorfizmus jelenléte és a cöliákia kialakulásának kockázata T1DMs betegekben .......................................................................................................... 46 A HLA DQ2 markerek vizsgálata T1DM, CD és CD+T1DM-s betegekben....... 48 MEGBESZÉLÉS ........................................................................................................ 50 CD előfordulási gyakorisága T1DM-s magyar gyermekekben ........................... 50 A természetes immunitás vizsgálata CD-ben. A TLR2, TLR3 és TLR4 expressziójának vizsgálata cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában ............................................................................................................................... 52 A természetes immunitást befolyásoló CD14 és TLR4 genetikai polimorfizmusának vizsgálata .............................................................................. 55 TNF-alfa polimorfizmus jelenléte és a cöliákia kialakulásának kockázata T1DMs betegekben .......................................................................................................... 56 A HLA DQ2 markerek vizsgálata T1DM, CD és CD+T1DM-s betegekben....... 57 KÖVETKEZTETÉSEK .............................................................................................. 58 ÖSSZEFOGLALÁS ................................................................................................... 60 SUMMARY ............................................................................................................... 61 SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE......................................................................... 78 Az értekezés témájában megjelent nemzetközi közlemények................................... 78 Az értekezés témájában megjelent magyar nyelvű közlemények ............................. 78 Az értekezés témájában megjelent nemzetközi absztraktok ..................................... 78 Más témában nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények............................... 79 Más témában nemzetközi folyóiratban megjelent absztraktok.................................. 80 Más témában megjelent magyar nyelvű közlemények ............................................. 82 Más témában magyar folyóiratban megjelent absztraktok........................................ 86 Könyvfejezetek ....................................................................................................... 87 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ..................................................................................... 89
3
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
APC
antigén prezentáló sejt
BMI
testtömeg index
CARD 15
caspase-recruitment domain 15
CD
cöliákia
CD14
Cluster of Differentiation-14
CMV
Cytomegalovirus
CTLA4
cytotoxic T-lymphocyte-associated protein-4
DC
dendritikus sejt
ds-RNS
dupla-szálú RNS
EMA
endomysium elleni antitest
ESPGHAN
Európai Gyermek Gasztroenterológiai Társaság
GAPDH
glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz
GPI
glikozil-foszfatidilinozitol
HbA1c
glikozilált hemoglobin A1
HLA
humán leukocita antigén
HSP 70
hősokk protein 70 (heat shock protein)
HSP60
hősokk protein 60 (heat shock protein)
IEC
intesztinális epiteliális sejt
IEL
intraepiteliális limfocita
IFN
interferon
IFN-
interferon-gamma
IgA
immunglobulin A
IL-15
interleukin 15
IL
interleukin
LBP
LPS kötő fehérje
LPS
lipopoliszaccharid
LRR
leucinban gazdag ismétlődés
MHC
major hisztokompatibilitási komplex
NK sejt
természetes ölő sejt
PAMP
patogén-asszociált molekuláris mintázat
PCR
polimeráz láncreakció
PGN
peptidoglikán
PTPN22
protein tyrosin phosphatase non-receptor 22 4
RNS
ribonukleinsav
RFLP
restrikciós fragment hosszúság polimorfizmus
SD
standard deviáció
SNP
egypontos nukleotid polimorfizmus
T1DM
1-es típusú diabetes mellitus
TLR
Toll like receptor
TNF-
tumor nekrózis faktor alfa
tTG
szöveti transzglutamináz
WHO
World Health Organisation
5
BEVEZETÉS
Cöliákia A cöliákia (CD) a vékonybél krónikus, malabszorpcióval járó betegsége, amelyet a búzában található gliadin, valamint az árpa, a rozs és a zab prolaminjai váltanak ki (1). A kórkép kialakulásáért többek között a gasztrointesztinális immunrendszer működési zavara is felelőssé tehető. Bizonyos gliadin peptidek, például a p57-p89, közvetlenül képesek aktiválni az adaptív immunrendszert. Ezen peptidek natív vagy szöveti transzglutamináz által dezaminált formái az antigén prezentáló sejtek (APC) HLA-DQ2 illetve HLA-DQ8 molekuláihoz kapcsolódva CD4+ T sejteket aktiválnak. Ezek a CD4+ T sejtek aktiválják a CD8+ T sejteket és a fibroblasztokat, fokozzák az enterociták apoptózisát, valamint elősegítik a B sejtek plazmasejtekké történő differenciálódását, melyek azután anti-gliadin és anti-transzglutamináz antitesteket termelnek (2). Érdekes módon más gliadin peptidek, például a p31-p43, természetes immunválaszt váltanak ki (3). Ezek a peptidek nem kötődnek az APC-k HLA-DQ2 illetve HLA-DQ8 molekuláihoz, így nem is stimulálják a CD4+ T sejteket. Az intesztinális monociták/makrofágok és dendritikus sejtek közvetlenül felismerhetik a p31-p43 gliadin peptidet a Toll like receptor (TLR) vagy más mintázat felismerő receptorokon keresztül, melynek hatására Interleukin-15 (IL-15) szabadul fel (4). Az IL-15 fokozza az intraepiteliális limfociták (IEL) migrációját és expanzióját, valamint védi a CD4+ T sejteket az apoptózistól, ami ezáltal az adaptív immunrendszer perzisztens aktivációját eredményezheti (5). A cöliákia patomechanizmusában bakteriális és virális peptidek is szerepet játszhatnak. Az enterális mikroflóra szerepe mellett szól az a vizsgálati eredmény, melyben kezeletlen és kezelt cöliákiás betegek jejunumából vett mintákban kimutatható volt egy pálca alakú baktérium, míg a kontrollokban nem (6, 7). A bakteriális produktumok adjuvánsként hathatnak a TLR-kon keresztül, így elősegíthetik a gliadin reaktív CD4+ T sejtek aktivációját a lamina propriában (7).
6
A cöliákia és a HLA rendszer A cöliákia egy olyan multifaktoriális betegség, amelyben a környezeti hatások (glutén bevitel) mellett egy adott genetikai háttér is szükséges a fogékonysághoz. A cöliákiás betegek családjában a betegség halmozottan fordul elő, elsőfokú rokonok között a prevalencia 1-18%, általában 10% körüli (8). A környezeti faktorok és genetikai háttér hatására utal, hogy monozigóta ikrekben a konkordancia 86%, míg dizigótákban csak 20% (9). A diszkordánsnak tűnő ikerpárok egy részében is igazolták, hogy az egészségesnek tűnő gyermekben a cöliákia csendes formában perzisztál. A cöliákia erős összefüggést mutat a HLA II. DR3-DQ2 vagy DR5/7-DQ2 haplotípussal. A DQ2 és/vagy DQ8 antigén gyakorlatilag minden cöliákiásban előfordul (10). A DQ2 molekula egy alfa/beta láncból álló heterodimer, mely az immunválaszban szerepet játszó sejtek felszínén helyezkedik el, és a DQA1 *0501 és DQB1 *02 allélok kódolják. Az allélok lehetnek cisz helyzetben, azaz ugyanazon a kromoszómán, vagy transz pozícióban, vagyis különböző kromoszómán. Az előbbi figyelhető meg a HLADR3 antigént hordozókban, az utóbbi pedig azokban, akik HLA-DR5/DR7 heterozigóták. A heterodimer szintetizálása szempontjából mindegy, hogy ezek az allélok cisz, vagy transz pozícióban helyezkednek el. A cöliákiás betegek 90%-a DQ2 pozitív és 10%-ban DQ8 pozitív (DR4 haplotípus). Azoknál, akiknél egyik allél sem mutatható ki nagyon kicsi az esély, hogy cöliákia kialakuljon. Azokban az országokban, ahol a DR3 génfrekvancia alacsony, mint Kína, Japán és a fekete afrikai országok, ott a cöliákia előfordulása is igen ritka.
1-es típusú diabetes mellitus Az 1-es típusú diabetes mellitus (T1DM) a pancreas β-sejtjeinek pusztulása miatt kialakult inzulinhiány következtében jön létre. A WHO felosztása szerint két alcsoportot különböztethetünk meg: autoimmun mechanizmussal kialakuló (1/a) és idiopathiás (1/b) formát (11). Az autoimmun mechanizmus során a β-sejtek pusztulását a genetikailag fogékony személyekben a környezeti faktorok hatására beinduló T-sejt mediált immunfolyamat idézi elő, míg az idiopathiás esetek heterogén csoportot alkotnak. A T1DM incidenciája világszerte emelkedik, a növekedés átlagosan évi 3% körüli, ami a betegség prevalenciájának jelentős növekedését eredményezi. 7
Az egyik legismertebb modell szerint az autoimmun folyamat első lépéseként közvetlenül a β-sejteket éri vírusfertőzés, míg a „molekuláris mimikri modell” szerint a β-sejt fehérjéivel homológ vírussal fertőzött sejt (tehát nem a β–sejt) ellen indul meg a primér immunválasz. A fertőzött sejt HLA I. osztályú molekulával komplexben virális antigéneket expresszál, melyeket a CD8+ T limfociták felismernek. Az elsődlegesen fertőzött vagy vírust fagocitált makrofágok HLA II. osztályú molekuláik révén virális fehérjéket prezentálnak a CD4+ T sejtek számára. A CD4+ helper T sejtek egyrészt elősegítik a CD8+ T limfociták citoxikus effektor sejtté válását, másrészt aktiválják az auto-antitesteket termelő β-sejteket. A szigetsejtek pusztulásának két feltételezett mechanizmusa ismert, a direkt és az indirekt út. A direkt β-sejt pusztulás során az antigén-specifikus CD8+ citotoxikus T sejtek felismerik a β-sejtek felszínén a HLA I. molekulával komplexben kötött, virális aminosav-szekvenciával rokon auto-antigéneket, melynek eredménye egyes kostimulátor molekulák (FAS/FASL) felszaporodása. A szignáltranszdukciós folyamat végeredményeként bekövetkezik a β-sejtek apoptózisa. Az indirekt útvonal szerint az APC-k (makrofágok, dendritikus sejtek) felszínén HLA II. osztályú molekulával komplexben autoantigének prezentálódnak, melyet az antigénspecifikus CD4+ T helper sejtek ismernek fel. Ennek következtében a ko-stimulátor molekulák (CD28/CD80) upregulálódnak, a T helper és az APC sejtekből pedig különféle citokinek (interferongamma, tumor nekrózis faktor alfa, nitrogén monoxid) szabadulnak fel, melyek a környező β-sejtek apoptózisát okozzák. A fent említett folyamatokat támasztja alá a T1DM kezdeti szakaszában észlelt insulitis, melynek során igazolták, hogy a pancreas Langerhans szigetekben CD8+ citotoxikus, CD4+ T helper sejtek, makrofágok és NK sejtek halmozódnak fel. A szigetsejtek pusztulását klinikailag az inzulintermelő kapacitás csökkenése, majd megszűnése jellemzi (12).
Genetikai faktorok szerepe az autoimmunitásban A T1DM előfordulása 10%-ban familiáris, 90%-ban sporadikus, de mindkét esetben alapvető szerepet játszik a genetikai fogékonyság. Az eddig azonosított, T1DM-re hajlamosító genetikai tényezők mindkét előfordulási formában jelentőséggel bírnak. A hajlamosító allélt hordozók csak kis hányadánál alakul ki a cukorbetegség, ami a betegségre hajlamosító allélok kismértékű penetranciájára utal. A T1DM pathomechanizmusának megismeréséhez elengedhetetlen a genetikai faktorok szerepének megismerése a β-sejt specifikus autoimmunitás megjelenésében. A 8
T1DM iránti genetikai fogékonyság poligénes öröklődésmenetet mutat, az eddigi vizsgálatok alapján több mint 25 génrégióval hozták összefüggésbe. Ezek közül 18-at számmal (IDDM 1-18) jelöltek és hét elnevezés nélküli lókusz. Összefoglaló áttekintés a T1Dbase (www.t1dbase.org) webhely alatt található meg. T1DM esetében négy genetikai lókusz szerepét igazolták. A HLA lókusz T1DM esetében a családi halmozódás 40-50 %-áért felelős. A minor hajlamosító gének közül az inzulingén, a CTLA4 és PTPN22 együttesen kb 15-20 %ban játszik szerepet a genetikai háttér kialakításában (13, 14).
A diabetes mellitus és a HLA rendszer kapcsolata A humán leukocita antigéneket a 6-os kromoszóma p21.3 régiója, az úgynevezett major hisztokompatibilitási komplex (MHC) kódolja. Ebben a régióban több mint 100 gén helyezkedik el, melyeket a kromoszómán való helyük és funkciójuk alapján több osztályba sorolnak. Az I. osztályba tartozó HLA antigének (HLA A, B, C) megtalálhatók minden magvas sejten és a trombocitákon. Ezek az antigének a CD8+ citotoxikus T limfocitákkal reagálnak, egy polipeptid láncból és egy beta2 –mikroglobulinból állnak és sejtfelszíni antigéneket kódolnak. A II. osztályú HLA antigének (HLA DR, DQ, DP) a B limfocitákon, az aktivált T sejteken, a monocitákon és a makrofágokon találhatók meg. Szerkezetileg 2 polipeptid láncból állnak és sejtfelszíni antigéneket kódolnak. A DQ molekulák heterodimerek, azaz a két polipeptid láncot különböző gének, a DQA1 és a DQB1 gének kódolják. A diabetes kialakulását a DQB1 allélek inkább befolyásolják, mivel fehérjetermékeik közvetlenül részt vesznek az antigénprezentációban és a T sejtek aktiválásában. A HLA molekulák szerkezeti különbségei határozzák meg a genetikai védő vagy hajlamosító tulajdonságot. E térszerkezeti különbségek hátterében a fehérjelánc aminosav sorrendbeli különbségek állnak. A pancreas szigetsejtek károsodásában főként a HLA DQ molekulák játszanak döntő szerepet. A HLA DR-DQ haplotípusok diabetesre hajlamosító effektusa jelentős etnikai és geográfiai eltéréseket mutat (15, 16, 17, 18). Ennek egyik oka lehet, hogy a különböző etnikai csoportokban az egyes hajlamosító vagy védő HLA haplotípusok eltérő gyakorisággal fordulnak elő a szelekció és genetikai sodródás („genetic drift”) miatt. A szelekciót befolyásoló környezeti hatások közé tartoznak a különböző fertőző betegségek vagy táplálék összetevők (pl. glutén). A másik tényező lehet, hogy a HLA haplotípusokon előforduló DRB1, DQA1 és DQB1 allélok kombinációi az egyes etnikai 9
csoportokban eltérőek és a különböző allélkombinációk pedig nem egyformán diabetogén hatásúak. Harmadrészt az eltérő incidenciát mutató népcsoportokban a diabetes kialakulásában szerepet játszó környezeti tényezők eltérő mértékben vannak jelen, ezért a betegség penetranciája variábilis. Erre utal az a tény is, hogy az etnikailag és genetikailag egymáshoz hasonló európai népcsoportokban a diabetes incidenciája széles tartományban mozog. Ezért van létjogosultsága a populáció specifikus diabetogén és védő HLA variánsok tanulmányozásának, melyek lehetőséget nyújtanak a patogenezis megismerésében, valamint a veszélyeztetett egyének azonosításában. Az T1DM kialakulásában az MHC II. régióban elhelyezkedő HLA-lókuszok, a DRB1 *03 és a DRB1 *04 (DR3, DR4) játszanak kulcsszerepet. A legnagyobb diabetes rizikóval a HLA DQA1 *0301-DQB1 *0302 (DQ8) és a HLA DQA1 *0501-DQB1 *0201 (DQ2) haplotípusok járnak. A DQ8-cal a DR4, a DQ2-vel a DR3 allél kapcsolódik
a
leggyakrabban.
A
DQ2-DR3/DQ2-DR4
heterozigóták
az
átlagnépességhez képest 24-szeres kockázatot hordoznak az T1DM kialakulása tekintetében (19). A magyar populációban a DRB1 *03-DQA1 *0501-DQB1 *0201 a leggyakoribb diabetogén haplotípus, mely a legnagyobb kockázatot jelenti a mediterrán országokban. A többi hajlamosító haplotípust megfigyelve kimutatták, hogy hazánkban a skandináv országokra jellemző DRB1 *04-DQA1 *0301-DQB1 *0302 haplotípus csoport nagyobb kockázatot jelent, mit a fent említett DR3 haplotípus. Fontos, hogy a DRB1 *04-DQA1 *0301-DQB1 *0302 haplotípuson észlelhető DRB1 allélek hajlamosító hatásában kifejezett földrajzi eltérések jellemzők. Észak Európában a DRB1 *0401 hatása a legerősebb, melyet a *0404 allél követ, de a görög és olasz népességben a *0405 és *0402 allélek diabetogén hatása még kifejezettebb (18, 19, 20). A HLA-rendszer azonban nemcsak az T1DM iránti genetikai fogékonyságot, hanem a betegséggel szembeni védelmet is meghatározza. Az asszociációs vizsgálatok tanulsága szerint a HLA DRB1 *1501 (DR2)-DQA1 *0102-DQB1 *0602 (DQ6) haplotípus jelenti a legkifejezettebb védelmet az T1DM kialakulásával szemben (19). Fontos megjegyezni, hogy a DRB1 *0403 és DQB1 *0302 által definiált haplotípus erősen protektív hatású, ellentétben a DQB1 *0302 más DRB1 *04 allélokkal alkotott kombinációival. A jelenség oka nem ismert, talán specifikus a DRB1 *0403 allélre vagy egy kapcsolt génre, a HLA 2. osztályú génrégiójában. A magyar populációban gyakori védő haplotípus csoport a DRB1 *11/12/13- DQA1 *05-DQB1 *0301, valamint a DRB1 *0701-DQA1 *0201-DQB1 *0201, DRB1 *130110
DQA1 *0103-DQB1 *0603 és a DRB1 *1401-DQA1 *0104- DQB1 *0503 kombinációk. Ezek a DQ6 haplotípushoz hasonlóan nagyrészt domináns módon örökítik át a protektív hatást. Említést érdemel, hogy a DRB1 *0701-DQA1 *0201-DQB1 *0303 haplotípus védő hatású, míg ugyanez a DQB1 allél a DR9 haplotípussal neutrális hatású. A T1DM iránti hajlam öröklésmenete nem követi a mendeli szabályokat, azonban általános elvként elfogadott, hogy a diabetesre hajlamosító HLA haplotípusok (DRB1 *04-DQA1 *0301-DQB1 *0302, DRB1 *03-DQA1 *0501-DQB1 *0201) hatása recesszív módon valósul meg, míg a kifejezetten védő hatású haplotípusok (DRB1 *1501-DQB1 *0602, DRB1 *1301-DQB1 *0603) domináns módon viselkednek (12). A fenti adatokat összefoglalva találhatjuk az 1. táblázatban.
11
1. táblázat: HLA II. osztályú DR-DQ kapcsoltsági minták és T1DM-re való hajlam a kaukázusi rasszban.
HLA-DR DQA1 DQB1 DRB1 Hajlam DR2
0102
0602
1501
Véd
DR2
0102
0502
1601
Hajlamosít
DR2
0103
0601
1502
Nincs hatása
DR3
0501
0201
0301
Erősen hajlamosít
DR4
0301
0302
0401
Erősen hajlamosít
DR4
0301
0302
0402
Hajlamosít
DR4
0301
0302
0403
Nincs hatása
DR4
0301
0302
0404
Hajlamosít
DR4
0301
0302
0405
Erősen hajlamosít
DR4
0301
0301
0401
Nincs hatása
DR4
0301
0303
0401
Nincs hatása
DR6
0101
0503
1401
Véd
DR7
0201
0303
0701
Véd
DR8
0401
0402
0801
Hajlamosít
Az 1. táblázatban foglaltuk össze az 1-es típusú diabetes mellitus és a HLA II. haplotípusok közötti összefüggéseket. Rövidítések: HLA= humán leukocita antigén
Diabetes és cöliákia Már régóta ismert az a tény, hogy a cöliákia előfordulása jóval gyakoribb 1-es típusú diabetesek körében, mint a normál populációban. Nemzetközi irodalmi adatok alapján az 1-es típusú diabetesben szenvedők között a cöliákia előfordulása 6-7 %-ra tehető (21, 22). Szűrővizsgálatok eredményei alapján a CD prevalenciája T1DM betegek között országonként igen különböző, 1,6-13,4% közötti (2. táblázat). Savilahti vizsgálatában 110 T1DM-s gyermeknél végzett jejunális biopsziát, és a betegek 7%-ban boholyatrofiát észlelt (23). A T1DM és CD gyakori együttes előfordulás hátterében a közös genetikai prediszpozíció állhat, melyre a HLA-DR3 gyakoribb előfordulása is utalhat (24). 12
Cöliákia kialakulására a legfontosabb tényező a DQA1 *0501-DQB1 *0201 heterodimer jelenléte, mely viszont T1DM-ben is rizikófaktor (25). Az esetek többségében a T1DM-ben kialakuló CD nem jelentkezik típusos klinikai tünetekkel a jelenlévő boholyatrófia ellenére. Az IgA alapú anti endomysium antitestek (EMA) használatával magas specificitású és szenzitivitású diagnosztikus eszköz áll rendelkezésünkre gluténszenzitív enteropathia esetén. Azonban többen beszámoltak arról, hogy magas a fals pozitív esetek aránya, ha diabeteses populációt szűrnek CD-re (26, 27, 28). Elképzelhető, hogy ezekben az esetekben a pozitív EMA látens cöliákiára utal. Azonban normális boholyszerkezet mellett is emelkedett a / T sejtek száma, mely lehetővé teszi a látens CD korai diagnózisát (29, 30). Az T1DM és CD ismert gyakori társulásának fényében nem meglepő, hogy a CD iránti örökletes fogékonyság ugyancsak a HLA I. és II. csoport alléljeihez kötődik. Szoros összefüggést mutattak ki a CD- és a DQ2-molekulát kódoló DQA1 *0501DQB1 *0201 között (31).
13
2. táblázat: A cöliákia előfordulási gyakorisága T1DM-ben a különböző országokban
Ország
Prevalencia (%) (95% CI)
Ref.
Algéria
16,4 (9.77-23,03)
(32)
Ausztria
3,0 (1,33-4,67)
(33)
Ausztrália
1,8 (0,27-3,33)
(34)
Kanada
5,1 (2,29-7,91)
(27)
Csehország
4,1 (2,01-6,19)
(35)
Finnország
2,4 (1,32-3,48)
(36)
Németország
1,3 (0,61-1,99)
(37)
Olaszország
5,7 (3,65-7,75)
(38)
Svédország
6,0 (1,66-10,34)
(39)
Egyesült Királyság
2,0 (1,01-2,99)
(40)
USA
4,1 (1,47-6,73)
(41)
A 2. táblázatban a T1DM és a cöliákia előfordulási gyakoriságát láthatjuk különböző országokban Toll like receptorok Az emlősökben megtalálható Toll like receptor család mai tudásunk szerint 11 tagból áll. Ezek olyan I-es típusú transzmembrán receptorok, melyek különböző mikroorganizmusok konzervatív mintázatait [(baktérium sejtfalának lipopoliszaccharid (LPS) összetevője, bakteriális DNS és virális dupla-szálú RNS (ds-RNS), patogénasszociált molekuláris mintázat, PAMP)] ismerik fel (42) (1. ábra). A Toll like receptorok az immunsejtek -, szívizom sejtek -, légúti epitel sejtek - és a vérben keringő sejtes elemek felszínén találhatók (43). A TLR stimulációjával elindított folyamat a proinflammatorikus citokinek szekréciójához vezet. Az elsőként felfedezett humán TLR a TLR4 volt, ami elsősorban a Gram negatív baktériumok LPS-ját felismerő receptor, de vírusok elleni immunitásban is kimutatták szerepét (44). A TLR2-t elsődlegesen a Gram-pozítív baktériumok produktumai, a TLR3-at pedig vírusok dupla szálú RNS-ei aktiválják (45, 46).
14
1. ábra: A Toll like receptor család (Cario E nyomán 47)
ss RNS ds RNS Lipoprotein
LPS
CpG DNS Uropatogén ligand
Flagellin
ke ceptor 2 Az 1. ábrán a Toll like receptor (TLR) család sematikus ábrázolását láthatjuk. A humán TLR-k felépítése evolúciós szempontból konzervatív és a pathogén mikróbák konzervatív építőelemeit ismeri fel: baktériumok sejtfalának lipopoliszaccharid (LPS) összetevőit, bakteriális DNS-t, virális szimpla-szálú (ss RNS) és dupla-szálú RNS-t (ds RNS), metilált DNS-t (CpG DNS). A TLR stimulációjával elindított folyamat a proinflammatorikus citokinek szekréciójához vezet.
Toll like receptor 2 A TLR2 egy 784 aminosavból álló és kb. 90 kDa molekulatömegű transzmembrán protein, extracelluláris doménje 18-20 LRR (leucinban gazdag ismétlődés) területet tartalmaz (48). A TLR2 kódoló TLR2 gén a 4-es kromoszóma hosszú karján (4q32) helyezkedik le, 2 exonja van, de a teljes kódoló szekvenciát a 2-es exon tartalmazza (1). A TLR2 főleg monocitákon/makrofágokon, mieloid dendritikus sejteken (DC), B sejteken, kisebb mértékben hízósejteken, epiteliális sejteken, keratinocitákon, endotel sejteken, NK (természetes ölő) sejteken, neutrofil granulocitákon, és néhány egyéb sejten (pl. mikroglia sejteken) expresszálódik (49-54). A TLR2 különféle mikroorganizmus egyes komponenseit ismeri fel: Gram-negatív baktériumok, a Mycoplasma és a Spirochaeták lipoproteinjeit, Gram pozitív baktériumok
peptidoglikánját
(PGN)
és
lipoteikolsavát,
a
Mycobacteriumok
lipoarabinomannánját, a Trypanosoma Cruzi glikozil-foszfatidilinozitolját (GPI), a Staphylococcus epidermidis fenol oldékony modulinját, élesztők zimozánját, a 15
Treponema maltophilum glikolipidjeit, a Neisseria porinjait, valamint a Legionella, Leptospira interrogans, és a Porphyromonas gingivalis lipopoliszacharidját (42). A TLR2 a gyulladás során termelődő endogén szubsztrátok, így a HSP60 (55) és HSP70 (56) hősokk fehérjék felismerésében is fontos szereppel bír. Ozinsky és munkatársai írták le, hogy a TLR2 a TLR1-el vagy TLR6-al heterodimert képezve ismeri fel ligandumait (57). A TLR1 és TLR6 szerkezete nagyon hasonló, ezért a TLR1 hiányában a TLR6 kompenzálhatja a triacilált lipoproteinek felismerése során (42). A TLR2 direkt tud kapcsolódni a PGN-hoz (58). A TLR2 extracelluláris doménjén egy 25 aminosavból álló szekvencia (Ser40-Ile64) található, mely szerepet játszik a PGN kiváltott sejt aktivációért és valószínűleg a PGN kötéséért is (59). A CD14 elősegíti a PGN és egyéb bakteriális komponensek által indított TLR2 jelátvitelt, de hiánya nem zárja ki a folyamatot (60, 61).
Toll like receptor 3 A TLR3 szintén I-es típusú transzmembrán fehérje, mely 904 aminosavból áll, kb. 125 kDa molekulatömegű, extracelluláris doménje 23 LRR területet tartalmaz. A TLR3 gén kódolja, amely a 4-es kromoszóma hosszú karján (4q25) található (62). A TLR3 fontos szerepet játszik a vírusok elleni immunválasz kialakulásában, bár szerepe több vírusfertőzés (pl. rágcsáló citomegalovírus, reovírus) esetében is vitatott (63). Ligandumként vírusok dsRNS-ét, valamint annak szintetikus analógját, a poli (I:C)-t (poliinozin-policitozin sav) ismeri fel (45). Egyes vélemények szerint az rRNS és tRNS is kiválthat TLR3 közvetített jelátvitelt akár fiziológiás körülmények között is, ami patológiás esetekben autoimmun betegség kialakulásához vezethet (64). A TLR3 elsődlegesen a mieloid DC-k - emberekben a monocita eredetű DC-k és CD11+ DC-k, egerekben a CD8α+ DC-k- valamelyik intracelluláris vezikuláris kompartmentjében fejeződik ki, mely feltehetően endoszómális elhelyezkedésű, mivel az endoszóma savasodásának gátlása a poli (I:C) kiváltott jelátvitel megszűnéséhez vezethet (65). A TLR3 természetes ölő sejteken is expresszálódik (66), melynek különösen azoknál a vírusfertőzéseknél van jelentősége, amelyek az NK sejtek ölő képességét kiváltják, például a rágcsálók CMV fertőzése (67). Egyes adatok szerint a TLR3 konstitutív vagy indukálható formában expresszálódik humán fibroblasztokban (65, 68), epiteliális sejtekben (51, 69), asztrocitákban és glioblasztoma sejtvonalakban (70), endoteliális sejtekben (71) és T sejtekben (72) is. Tissari és mtsai igazolták, hogy a TLR3 gén 16
promóter régiójában egy interferon (INF) érzékeny elem található (ISRE), ezért feltételezhető, hogy az I-es típusú interferonok fokozhatják a TLR3 expresszióját DCkben, illetve epiteliális és endoteliális sejtekben (71, 73).
Toll like receptor 4 A TLR4 génje a 9q32-q33 kromoszóma szakaszon helyezkedik el. A896G polimorfizmusa a fehérje Asp299Gly cseréjét eredményezi, ami a receptor extracelluláris szerkezetének megváltozásán keresztül a TLR4 által közvetített jelátvitelt blokkolja. Kiechl és mtsai (74) a mutáns allélt hordozókban a keringő gyulladásos citokinek koncentrációját alacsonyabbnak találták, ami együtt járt a súlyos fertőzések gyakoribb előfordulásával, ugyanakkor csökkentette az ateroszklerózis kockázatát. A TLR4 a LPS aktiváció fő receptora, de működéséhez további fehérjék jelenléte (MD-2, CD14, LPS-kötő fehérje) is szükséges. A PAMP felismerésében fontos szerepet tölt be a caspase-recruitment domain 15 (CARD15) is. A PAMP felismerésekor a TLR jelátvitelt indít, melynek hatására több transzkripciós faktor is aktiválódik, köztük a nukleáris faktor κB. A TLR-ok szignáljának hatására a major hisztokompatibilitási komplex (MHC) és ko-stimulátor molekulák expressziója-, valamint a gyulladásos citokinek (IL-1, IL-6, TNF-α) és kemokinek (IL-8) termelése fokozódik (42). A TLR-kat a gasztrointesztinális traktus számos sejttípusa – epitel sejtek, a lamina propria intesztinális monocitái/makrofágjai és dendritikus sejtjei, miofibroblasztok, endotel sejtek és a szubmukóza adipocitái - expresszálja indukálható vagy konstitutív formában (75, 76). Az egészséges bél IEC-in a TLR2 és TLR4 csak kis mennyiségben fejeződik ki, ezáltal a luminalis baktériumok felismerése kevésbé hatékony (76). Ugyanakkor fokozott TLR2 és TLR4 expresszió figyelhető meg aktív colitis ulcerosás és Crohn betegek vastagbelében (51, 75). Egyes TLR4 A+896G, C+1196T polimorfizmusok, illetve a CARD15 G+2722C, C+2104T, 3020insC polimorfizmusok esetén a természetes immunválasz csökkenése figyelhető meg (77, 78), ami szerepet játszhat egyes betegségek kialakulásának fokozott kockázatában, mint pl. a CARD 15 polimorfizmusok esetén nő a Crohn betegség kialakulásának a gyakorisága. Ezeket a polimorfizmusokat is vizsgálták nekrotizáló enterocolitisben szenvedő csecsemőkben, de eltérést náluk a referencia populációhoz viszonyítva nem találtak (79). A T1DM kialakulásában a kutatók jelentős szerepet tulajdonítanak a vírus okozta fertőzéseknek (80). A vírusok a TLR-khoz való kötődés révén hozzájárulhatnak a 17
proinflammatorikus citokinek
szekréciójához és
így
a gyulladásos
folyamat
elindításához/fenntartásához.
TNF- Az irodalomból ismert, hogy a multifunkcionális citokin, a tumor nekrózis faktor alfa (TNF-α) kulcsszerepet tölt be a gyulladásos, autoimmun és daganatos megbetegedések kialakulásában. A citokint elsősorban makrofágok termelik. Az immunregulációs folyamatok és ezek anyagcsere hatásainak egyik legfontosabb mediátora; proinflammatorikus és citotoxikus hatása révén pedig számos betegség patogenezisében meghatározó szerepet játszik. Kis koncentrációban aktiválja a védekező gyulladásos reakciókat, az ér endotel sejtjeiben adhéziós molekulák elválasztását serkenti, ezáltal neutrofilek, monociták és limfociták
megtapadását
segíti
elő.
Részt
vesz
a
specifikus
immunválasz
koordinálásában is, hatására fokozódik a B limfociták immunglobulin termelése. A TNF- génje a 6-os kromoszóma rövid karján, a 21:3 lokuszon lokalizálódik (81), az MHC III. osztályú régiójában. Több DNS szintű polimorfizmusa ismert. A promoter régió 308-as helyén leírt G/A polimorfizmus (G-308 A) befolyásolja a különböző hatásokra - termelődő TNF-α mennyiségét. Az A allélt hordozó (-308GA) sejtek 20-40%-kal több TNF-α-t termelnek, mint a -308GG genotípusúak (82, 83). Több tanulmány talált összefüggést a TNF-α gén promoter régió 238-as helyén található G/A polimorfizmus (G-238A) és autoimmun (84-86) -, illetve gyulladásos betegségek között (87, 88, 89), bár a polimorfizmus TNF-α elválasztásban betöltött szerepe vitatott (86, 90). A spontán kifejlődő diabetes két állatmodeljének (NOD) egér (91) és biobreeding (BB) patkány (92) szigetsejtjeiben a TNF- jelenléte a β-sejtek pusztulásához vezető insulitis kialakulásával összefüggést mutatott. Izolált human βsejtekre pedig in vitro toxikusnak bizonyult. Pociot (93), Cox (94) és Deng (95) a T1DM-ben szenvedő betegeknél a
-308
A allél gyakoribb előfordulását írták le, amit
többnyire a polimorfizmus HLA-DR3-mal való kapcsolt öröklődésének tulajdonítottak.
CD14 A CD14 molekula a természetes immunrendszer egyik központi mintázatfelismerő receptora, az egyik legerőteljesebb LPS kötésre képes fehérje. A CD14 egy 356 aminosavból álló és egy 19 aminosav hosszúságú N-terminális leader peptidből álló glikoprotein, szerkezetében 10 LRR terület található, kódoló génje az 5-ös kromoszóma 18
hosszú karján (5q 23-31) helyezkedik el (96). Az mCD14 esetében a C terminális 28-30 aminosava a transzlációt követően lehasad és GPI horgonyra cserélődik ki. Tehát a CD14 nem transzmembrán fehérje, hanem egy GPI kötés által a membránhoz kapcsolt glikoprotein (2. ábra). A CD14 membránhoz kapcsolt (mCD14) és szolubilis (sCD14) formában található meg (97). Az mCD14 mieloid differenciálódási marker, nagy mennyiségben monociták, makrofágok, és Langerhans sejtek, kisebb mennyiségben granulociták, és néhány nem mieloid sejtvonal eredetű sejt felszínén jelenik meg (98, 99). Az sCD14-nek két különböző molekulatömegű formáját ismerjük, melyek között eddigi ismereteink alapján nincs biológiai különbség. Az 55-56 kDa-os forma C terminális leader szekvenciája nem cserélődik ki GPI horgonyra, ezért nem képes a sejtmembránhoz kötődni (100). A kisebb, 48-49 kDa-os forma különböző bakteriális stimulusok következtében, szerin proteáz (pl. leukocita elasztáz) hasítással válik szabaddá a sejtmembránból (101). A sCD14 a szérumban, a gerincvelői folyadékban, valamint egy rövidebb (trunkált) formája a proteinuriás betegek vizeletében található meg nagyobb mennyiségben (102, 103). A mCD14 és sCD14 expressziója bakteriális stimulusok (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, LPS, lipoteikolsav, formilpeptidek), INF-γ, TNF-α hatására fokozódik, és Th2 típusú citokinek, mint az IL-4, IL-10 hatására csökken (104, 105).
19
2. ábra. A membránhoz kapcsolt CD14 (mCD14) szerkezete
SEJTMEMBRÁN
GPI horgony MyD88
A 2. ábrán a membránhoz kapcsolt CD14 (mCD14) szerkezete látható. A CD14 egy GPI (glikozil-foszfatidilinozitol) rész által kapcsolódik a sejtmembránhoz. Mint makrofág ko-receptor szoros funkcionális egységet alkot a lipopoliszacchariddal (LPS) és az LPS kötő fehérjével (LBP). Rövidítések: CD14= Cluster of Differentiation-14, MD-2= myeloid differenciálódási fehérje-2, IRAK= Interleukin-1-receptorhoz kapcsolt kináz, MyD88= myeloid differenciálódási 88. faktor
A CD14, mint LRR-eket tartalmazó mintázatfelismerő receptor jelentős szerepet tölt be a kórokozókkal szembeni védekezésben, a TLR4-el és MD2-vel alkotott komplexben elsősorban a Gram negatív baktériumok LPS-ét köti meg (106). Az LPS-en kívül azonban számos egyéb szintetikus és más mikrobiális makrofág aktivátort is felismer, így a Gram pozitív, Gram negatív baktériumokból származó konzervatív struktúrát, illetve annak PGN komponensét képes felismerni. Ilyen molekulák pl. Gram pozitív baktériumok lipoteikolsava, a Mycobacteriumok lipoarabinomannánja, a Borrelia burgdorferi és a Treponema pallidum lipoproteinje, szintetikus lipopeptidek, a Gram negatív baktériumok poli β (1-4)-D-mannuronsava, Streptococcus sejtfalak ramnóz-glükóz polimerje, baktériumok és élesztők poliuronsava (60, 107). Mikrobiális ligandokon kívül foszfolipidek és apoptotikus emlős sejtek megkötésére is képes (108). Mivel a CD14-nek nincs intracelluláris doménje, nem indíthat el önmagában jelátviteli folyamatokat, ehhez ko-stimulátor molekulák 20
közreműködésére van szüksége (109). Bár a mCD14 közvetlenül is tud kötődni az LPSel, a szérumban jelen lévő LPS kötő fehérje (LBP) 100-1000-szeresére képes fokozni ezt a kölcsönhatást (110). Az LBP egy 60 kDa-os akut fázis glikoprotein, amely főként a májban és a tüdőben termelődik és alapvető fontosságú a kis mennyiségű LPS- vagy Gram-negatív baktériumok által kiváltott gyulladásos válasz gyors kialakulásában, így a bakteriális fertőzések gyors leküzdésében (111). A LBP szerepe, hogy a vizes fázisban képződő, néhány száz LPS-ből álló aggregátumból, LPS monomerek transzferét katalizálja a CD14-re, így a CD14-el együtt egy hármas komplex alakulhat ki (112). Érdekes, hogy a PGN indukálta CD14 közvetített sejtaktivációt a LBP nem fokozza, ezért a PGN-ból LPS-nál nagyobb koncentráció szükséges a sejtek aktiválásához. A sCD14 az egészséges humán szérumban 1-5 g/ml koncentrációban található, de akut gyulladás esetén 3-4-szeresére emelkedik meg a szintje. A sCD14 molekula LBP jelenlétében alacsony koncentrációjú LPS kötésére is képes. Az így kialakuló sCD14/LPS komplexek aktiválják a mCD14-el nem rendelkező sejteket, így a vaszkuláris endoteliális sejteket, epiteliális sejteket, vaszkuláris simaizom sejteket, fibroblasztokat és asztrocitákat (113, 114). Ezzel ellentétben a sCD14 és PGN komplexek nem aktiválják az említett sejteket (115). A sCD14 fokozhatja a mCD14-el rendelkező sejtek LPS és PGN indukálta immunválaszát (116), azonban ha túl nagy mennyiségben van jelen, akkor kompetícióba lép a mCD14-el a LPS-ért, így nagy koncentrációban az LPS biológiai hatását neutralizálni tudja in vitro és in vivo (117, 118). Végezetül a LBP-hez hasonlóan a sCD14 is elősegíti a LPS transzferét a nagy denzitású lipoproteinre (HDL), ezáltal elősegíti az endotoxinok detoxifikálását és eliminációját (107). A CD14 legfontosabb ko-receptora a TLR4. A LPS indukált mCD14/TLR közvetített jelátvitel TNF-α, IL-6, IL-8, prosztaglandin, szuperoxid és szöveti faktor szintézist indukál monocitákban. A mCD14 ezen kívül részt vesz a polimorfonukleáris leukociták fibrinogénhez való, integrin függő adhéziójában és a Gram-negatív baktériumok, valamint az apoptotikus sejtek komplement független fagocitózisában (105). Ha a sCD14 kis koncentrációban van jelen, akkor a sCD14/TLR4 közvetített jelátvitel fokozza a citotoxicitást, IL-6, IL-8 termelést, valamint az adhéziós molekulák kifejeződését (105). A CD14 génkiütött egerek rezisztensek a Gram-negatív baktériumok vagy LPS által kiváltott sokkra, habár a nagyon magas koncentrációjú LPS-el szemben még kialakul
21
bennük immunválasz (119). Tehát a CD14 mintegy sokszorozza, felerősíti az LPS kiváltott választ.
22
CÉLKITŰZÉSEK
Vizsgálataim során 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő gyermekeknél kívántam felmérni a cöliákia előfordulásának gyakoriságát, valamint a két betegség együttes fennállása esetén vizsgáltam a természetes és adaptív immunitás egyes tényezőit. A természetes immunitás faktorai közül a TLR2, TLR3, TLR4 expresszióját, a TLR4 és CD14 és TNF- polimorfizmusát kutattuk. Az adaptív immunitásra jellemző HLA DQ markereket vizsgáltuk a két betegség egyidejű előfordulása esetén. Fontosabb kérdéseim, célkitűzéseim a következők voltak:
I. CD előfordulása T1DM-s magyar gyermekekben a. A cöliákia előfordulási gyakorisága 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő magyar gyermekekben b. A gluténmentes diéta hatása a szénhidrát-anyagcsere kontrollra
II. A természetes immunitás vizsgálata CD-ben. A TLR2, TLR3 és TLR4 expressziójának vizsgálata cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában a. Hogyan változik a TLR2, TLR3 és TLR4 mRNS expresszió, valamint fehérje szint cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában nem cöliákiás kontrollokhoz képest? b. Megfigyelhető-e különbség a kezeletlen (gluténmentes diétát még nem tartó), illetve kezelt (gluténmentes diétát tartó) cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájának TLR2, TLR3 és TLR4 mRNS expressziójában, valamint fehérje szintjeiben?
III.
A
természetes
immunitást
befolyásoló
CD14
és
TLR4
genetikai
polimorfizmusának vizsgálata CD, T1DM és CD+T1DM-s betegekben a. Kimutatható-e eltérés a CD14 polimorfizmusában a 3 betegcsoport között? b. Van-e eltérés a TLR4 polimorfizmusában a vizsgált betegcsoportok között?
IV. TNF-alfa polimorfizmus jelenléte és a cöliákia kialakulásának kockázata T1DM-s betegekben a. Fokozott kockázatot jelent-e a TNF- genetikai polimorfizmusa cöliákia kialakulására T1DM-es gyermekekben? 23
b. TNF- polimorfizmus jelentőségének vizsgálata a fenti populációban
V. A HLA DQ2 markerek vizsgálata T1DM, CD és CD+T1DM-s betegekben a. Mely HLA DQ mintázat jellemző a cöliákiás, az 1-es típusú diabetes mellitusos gyermekekre? b. Van-e jellegzetes HLA DQ mintázat a két betegség együttes előfordulása esetén?
24
BETEGANYAG ÉS MÓDSZEREK
Betegek és kontrollok az egyes vizsgálati csoportokban
I. CD előfordulása T1DM-s magyar gyermekekben 205 véletlenszerűen kiválasztott 1-típusú diabetes mellitusban szenvedő gyermeket szűrtünk szérum antiendomysium antitest kimutatásával. A vizsgálatba 88 lányt és 117 fiút vontunk be, átlagos életkoruk 11,3 év (2-17) volt a vizsgálatkor, a diabetes fennállásának átlagos ideje 4,4 év (0,16-15) volt. A vizsgálatkor CD-re utaló klinikai tünetet egyetlen gyermeknél sem észleltünk. II. TLR2, TLR3 és TLR4 expressziójának vizsgálata cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában 16 kezeletlen cöliákiás gyermek [6 fiú, 10 leány, életkor: medián (tartomány): 9 (415) év], 9 kezelt [4 fiú, 5 leány, életkor: medián (tartomány): 6 (3-14) év] cöliákiás gyermek és 10 kontroll [4 fiú, 6 leány, életkor: medián (tartomány): 10 (4-15) év] duodenumából biopsziás mintákat vettünk. A minták egyik részéből rutin hisztológiai feldolgozás történt, a másik részüket pedig molekuláris biológiai vizsgálatokhoz használtuk. A kezeletlen cöliákiás gyermekek duodenum biopsziáit a diagnózis felállításának időpontjában, a gluténmentes diéta megkezdése előtt vettük. A diagnózis felállítása ESPGHAN kritériumok alapján történt (120). A cöliákiás gyermekek széruma EMA pozitív volt, a szövettani kép részleges, vagy teljes boholyatrófiát mutatott (Marsh III.b vagy III.c). A gluténmentes diétát tartó gyermekek esetében teljes klinikai remisszió következett be, szérumuk EMA negatív volt, valamint normál bélboholy szerkezet volt megfigyelhető. A kontrollok esetében a biopszia elvégzése súly- és/vagy hosszfejlődésbeli elmaradás, illetve krónikus hasmenés miatt vált szükségessé, de a szövettani kép mindegyik esetben normális volt. A vizsgálatok megkezdése előtt a gyermekek hozzátartozóinak írásbeli hozzájárulását kértük, a molekuláris biológiai vizsgálatok a TUKEB: 73/2003-as etikai engedéllyel történtek.
III. A természetes immunitást befolyásoló CD14 és TLR4 genetikai polimorfizmusának vizsgálata Vizsgálatainkba 47 cöliákiában és 1-es típusú diabetesben egyaránt szenvedő, 80 csak 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő és 100 cöliákiás gyermeket vontunk be (3. táblázat). Kontroll csoportnak 146 egészséges érett újszülött anyagcsere 25
szűrővizsgálathoz levett szűrőpapírra cseppentett vérmintája szolgált, melyből a szülők beleegyezésével, a TUKEB 16/2003-as etikai engedéllyel történtek a genetikai vizsgálatok (4. táblázat).
3. táblázat: A HLA DQ meghatározásba, valamint a CD14 és TLR4 genetikai polimorfizmusának vizsgálatába bevont betegek legfontosabb jellemzői
T1DM
CD
CD+T1DM
80
100
47
41/39
47/53
21/26
Életkor medián (tartomány) (év)
15 (4-22)
16 (3-40)
14 (3-20)
A diabetes fennállásának átlagos ideje (tartomány) (év)
9 (2-20)
-
8 (1-16)
Átlagos életkor a T1DM kezdetekor (tartomány) (év)
6 (1-15)
-
6 (1-14)
Átlagos életkor a CD diagnózisakor (tartomány) (év)
-
6 (0,5-43)
8 (1-18)
8,13
-
8,14
N Nem (Fiú/Lány)
HbA1c (átlag, %)
A 3. táblázatban foglaltuk össze a HLA DQ meghatározásba, valamint a CD14 és TLR4 genetikai polimorfizmus meghatározásba bevont 1-es típusú diabetes mellitusos, cöliákiás, valamint mindkét betegségben szenvedő gyermekek legfontosabb klinikai adatait. A vizsgált betegcsoportok között nem volt érdemi eltérés életkor, a diabetes kezdete és fennállásának ideje, HbA1c szint tekintetében. Rövidítések: CD= cöliákia, T1DM= 1-es típusú diabetes mellitus, HbA1c= glikozilált hemoglobin A1
26
4. táblázat: A CD14 C-260T, a TLR4 A+896G genetikai polimorfizmusainak vizsgálatába kontrollként bevont 146 egészséges újszülött klinikai adatai.
Klinikai adatok
Egészséges újszülöttek (n=146)
Születési súly (gramm) Gesztációs hét Fiú/lány
3450 (2730-4450) 40 (38-42) 72/74
A 4. táblázat a CD14 C-260T, a TLR4 A+896G genetikai polimorfizmusainak vizsgálatába kontrollként bevont 146 egészséges újszülött klinikai adatait tartalmazza. A születési súly-, gesztációs hét adatait átlag (tartomány) formájában adtuk meg. IV. TNF-alfa polimorfizmus jelenléte és a cöliákia kialakulásának kockázata T1DM-s betegekben A Semmelweis Egyetem I.sz Gyermekklinikáján kezelt 301 T1DM-s gyermeket (medián kor:14 év) vontunk be a vizsgálatba, 154 volt fiú és 147 lány. A gyermekek életkora a T1DM kezdetekor medián 7 év volt (0,9-18 év). A diabetes fennállásának ideje a vizsgálatkor medián 5 év (0,1-17 év) volt. A kontroll csoportot 248 egészséges, tünetmentes személy képezte (életkor: 35-73 év). A vizsgálatot az Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta, valamint a résztvevők írásos beleegyezésüket adták.
V. A HLA DQ2 markerek vizsgálata T1DM, CD és CD+T1DM-s betegekben Vizsgálatainkba 47 cöliákiában és 1-es típusú diabetesben egyaránt szenvedő, 80 csak 1-es típusú diabetes mellitusban szenvedő és 100 cöliákiás gyermeket vontunk be. Kontroll csoportnak 2080 szervdonáció miatt HLA tipizált magyar felnőtt mintáit használtuk (Dr.Rajczy Katalin). A vizsgált betegcsoportok között kor, nem és az egyéb vizsgált paraméterek tekintetében nem volt érdemi eltérés, legfontosabb adataikat a 3. táblázatban foglaltuk össze (ld. III. pont alatt). 27
Alkalmazott módszerek
Cöliákia szűrése A szérum mintákat közvetlenül a levételt követően lefagyasztottuk és –70o C-on tároltuk a feldolgozásig. Az EMA meghatározást indirekt immunoflurescensz eljárással végeztük Kolho szerint (121). Humán köldökzsinórból 5 m vastagságú metszeteket készítettünk cryostattal, majd hideg acetonban fixáltuk. Ezt követően a metszeteket a beteg 1:5 arányban hígított szérumával
inkubáltuk,
majd
foszfátpufferrel
való
mosás
után
fluoresceinisothiocyanate-tal (FITC) konjugált humán IgA ellenes kecske antiszérum segítségével mutattuk ki az antitesteket. (Jackson Immunoresearch Laboratories, West Grove, PA, USA). Ezt követően a metszeteket fluorescensz mikroszkóp segítségével értékeltük ki. Minden esetben történt szérum IgA meghatározás, hogy IgA hiány (szérum IgA szint 0,2 g/l alatt) esetén a fals negatív eseteket elkerülhessük Minden EMA pozitív gyermeknél vékonybél biopsziát végeztünk Crosby kapszula segítségével vagy gastroduodenoscopos vizsgálat során vettünk vékonybél biopsziát. A biopsziás mintát két részre osztottuk, egyik részből rutin szövettani vizsgálat, míg a másikból immunhisztokémiai eljárás készült a korábban leírtak szerint (122). A / T sejtek kimutatására TCR1 monoklonális antitestet (T Cell Diagnostics Inc., Woburn, MA) alkalmaztunk 1:100-as hígításban. Az antitesttel végzett inkubációt követően a mintákat 30 percig 0,5% peroxiddal kezeltük, hogy az endogén peroxidáz aktivitást gátoljuk. A bekötött monoklonális antitesteket a Vectastain Elite ABC kit (PK-6102; Vector Labs, Burlinghame, CA) segítségével mutattuk ki fénymikroszkóp segítségével 1000x nagyítás mellett. A bolyhok felszíni epiteliumban elhelyezkedő / T sejteket 30-40 látótérben számoltuk le, és a sejtek sűrűségét sejt/mm-ben adtuk meg. Korábbi vizsgálatainknak megfelelően emelkedettnek tekintettük az intrepiteliális / T sejtszámot ha nagyobb volt mint 7 sejt/mm (átlag + 2 SD kontroll) (122). A glikozilált hemoglobin A1 (HbA1c) mennyiségét immunofluorescensz eljárással IMx Glycated Hemoglobin teszt (Abbott Laboratories, Abbott Park, IL, USA) segítségével határoztuk meg. Egészséges gyermekek normál tartományának 4-5% HbA1c-t vettük. Minden betegben meghatároztuk a testtömeg indexet (BMI) és az inzulinigényt (E/kg/nap) a gluténmentes diéta megkezdése előtt, illetve azt követően 3 hónappal. 28
A vizsgálatot a Semmelweis Egyetem Etikai Bizottsága jóváhagyta, a gyermekek szülei részletes felvilágosítást követően írásos beleegyezésüket adták.
TLR2, TLR3 és TLR4 expressziós vizsgálatok RNS izolálás A bélbiopsziákat feldolgozásig -80°C-on, lízispufferben tároltuk. Az RNS-t a Qiagen protokollja alapján az RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Németország) segítségével izoláltuk. A kinyert RNS mennyiségét és minőségét fotometrálással határoztuk meg. Az RNS mintákat felhasználásig -80°C-on tároltuk.
Komplementer DNS szintézis A reverz transzkripció (RT) során 1 g RNS-t konvertáltunk komplementer DNS-sé (cDNS) 20 l reakció végtérfogatban, 200 U SuperScript II RNase H- reverz transzkriptáz, 40 U RNaseOUT inhibítor és 0,5 g oligo dT12-18 primer jelenlétében (Gibco/BRL, Eggenstein, Németország). A reakcióelegyet 20°C-on 10 percig, majd 42°C-on 45 percig és végül 99°C-on 5 percig inkubáltuk, majd 4°C-ra lehűtöttük és felhasználásig -20°C-on tároltuk. Szemikvantitatív PCR (humán GAPDH, TLR2, TLR3, TLR4) A szemikvantitatív PCR-eket 50 l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dezoxi-nukleozid-trifoszfát (dNTP), 0,5 µM szensz és antiszensz primerek, 1,5 U rekombináns Taq polimeráz (Invitrogen, Kalifornia, USA)] reakcióelegyben végeztük 1 l cDNS felhasználásával. A humán TLR2, TLR3 és TLR4 specifikus primereket Hausmann és munkatársaitól (75), a glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz (GAPDH) specifikus primert Strehlau J és munkatársaitól (123) vettük át. A PCR-ek során alkalmazott primerek szekvenciáit, illetve a PCR-ek körülményeit az 5. táblázatban foglaltuk össze.
29
5. táblázat: A szemikvantitatív PCR-ek során használt primerek szekvenciái, illetve a PCR reakciók körülményei.
Gén
Primer szekvencia
Anellációs
Ciklusszám
Termékhossz
61 °C
31
598 bp
61°C
33
623 bp
59 °C
35
680 bp
56 °C
28
496 bp
hőmérséklet TLR2
S: 5’-AGTTGATGACTCTACCAGATG-3’ AS: 5’-GTCAATGATCCACTTGCCAG-3’
TLR3
S: 5’-ACACACTTCCAGCATCTGTC-3’ AS: 5’-TGCTGTTAACAATTGCTTCTAG-3’
TLR4
S: 5’-CTTATAAGTGTCTGAACTCCC-3’ AS: 5’-TACCAGCACGACTGCTCAG-3’
GAPDH
S: 5’-GGTGAAGGTCGGAGTCAACG-3’ AS: 5’-CAAAGTTGTCATGGATGACC-3’
Az 5. táblázat a szemikvantitatív PCR során alkalmazott primerszekvenciákat, az anellációs hőmérsékletet, a ciklusszámokat, valamint a PCR során képződő termékek hosszadatait mutatja be. Rövidítések: S= szensz, AS= antiszensz, TLR2= Toll like receptor 2, TLR3= Toll like receptor 3, TLR4= Toll like receptor 4, GAPDH= glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz.
A PCR-eket a primerekre jellemző anellációs hőmérséklet, illetve a ciklusszámok kivételével azonos körülmények között vittük véghez. A kezdeti 5 perces 94°C-on végzett denaturáció után a cDNS templátok megfelelő génszakaszait 31 (TLR2), 33 (TLR3), 35 (TLR4) és 28 (GAPDH) cikluson [94°C, 30 mp (denaturáció), 56oC (GAPDH) 15 mp-, 61°C (TLR2 és TLR3) 30 mp-, 59oC (TLR4) 20 mp (anelláció), 72°C 1 perc (extenzió)] keresztül szaporítottuk fel, végül egy 7 percig tartó 72°C-on történő inkubáció során tettük teljessé az extenziót. A keletkezett PCR terméket 2,5%-os, 0,4 mg/l etídium-bromiddal festett agaróz gélben elektroforetizáltuk, majd UV fénnyel tettük láthatóvá. A PCR vizsgálatokat minden esetben duplikátumban, pozitív és negatív kontrollok felhasználásával végeztük. A termékek várt hosszait 100 bp DNS marker (Ready-Load, Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) felhasználásával ellenőriztük.
A szemikvantitatív és real time RT-PCR mérések értékelése A szemikvantitatív PCR-ek eredményeit a Gel-Pro™ szoftver 3.1-es verziója (Media Cybernetics, Inc., MD, USA) segítségével denzitometráltuk és értékeltük. A real time PCR-ek eredményeit a LightCycler szoftver 3.5.3-as verziójának (Roche Diagnostics GmbH, Penzberg, Németország) segítségével értékeltük ki. 30
Western blot (TLR2, TLR3, TLR4, aktin) Minta előkészítés A vizsgált biopsziás mintákat lizáló pufferben (10 µg/ml leupeptin, 10 µg/ml aprotinin, 1% Triton-X 100, 0,1 M Tris-HCl (pH=8), 1 mM EGTA, 5 mM NaF, 1 mM PMSF, és 10 mM Na3VO4, Sigma, USA) homogenizáltuk (FastPrep FP120, Qbiogene Inc, Cedex, Franciaország), majd a homogenizátumot centrifugáltuk (10000g, 5 perc, 4 °C). A felülúszó összfehérje koncentrációját spektrofotometriás módszerrel, Bradford reagenssel határoztuk meg. A minták fehérje-koncentrációját 1- (TLR2, TLR4), illetve 2 mg/ml-re (TLR3) állítottuk be. A mintákat felhasználásig -80°C-on tároltuk.
Western blot kontrollok Pozitív kontrollként a TLR2 és TLR4 Western blotok esetében teljes vérből izolált perifériális limfocita (PBL)-, a TLR3 western blot esetében COLO320DM (kolorektális adenokarcinóma) sejtlizátumot használtunk. (sc-2226, Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA).
Antitestek Elsődleges humán TLR2, TLR3, TLR4 és aktin specifikus ellenanyagokként antihumán kecske poliklonális IgG antitesteket használtunk. A primer antitestek a TLR2 és TLR3 [TLR2 (N-17) és TLR3 (Q-18) Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA] esetében a fehérjék N terminális végét, a TLR4 és aktin [TLR4 (C-18) és aktin (C-11) Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA] esetében pedig a fehérjék C terminális végét ismerték fel. Másodlagos antitestként torma-peroxidázzal (HRP) konjugált egér anti-kecske IgG antitestet (Santa Cruz Biothechnology Inc., CA, USA) használtunk.
A Western blot-ok kiértékelése A Western blot-ok eredményeit a Gel-Pro™ szoftverrel (Media Cybernetics, Inc., MD, USA) denzitometráltuk és értékeltük ki.
31
SDS-PAGE A mintákhoz treatment puffert [30% glicerol, 20% merkapto-etanol, 0,7 M SDS, 0,25 M Tris-HCl pH=6,8] adtunk, majd a mintákat TLR3 és TLR4 esetében 37 C°-on, 30 perc-, TLR2 esetében 60C°-on 15 perc-, valamint az aktin esetében 100 °C-on 5 perc inkubálással denaturáltuk. A 10 %-os SDS-poliakrilamid gél zsebeibe denaturált, 20 (TLR2), 100 (TLR3), illetve 60 (TLR4) g összfehérjének megfelelő mennyiségeket vittünk fel. Koncentráló gélként 4%-os SDS-poliakrilamidot használtunk. Mintáink mellé molekulasúly markert (BenchMarkTM, Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) és pozitív kontrollt vittünk fel. Az elektroforézist hűtött rendszerben (PenguinTM Dual-Gel Water Cooled Systems, Owl, NH, USA), 1,5 órán keresztül, 120 V-on 20 mA-rel végeztem 25 mM Tris-, 192 mM glicin, 0,1% SDS tartalmú futtató pufferben.
Blottolás A szeparált fehérjéket az SDS-poliakrilamid gélről nitrocellulóz membránra (HybondTM ECLTM, AP Biotech, Buckinghamshire,UK) blottoltuk. A blottolást hűtött rendszerben (MiniTankTM Electroblotter, Owl, NH, USA), 2 órán keresztül, 70 V-on, 220 mA-el végeztük, 25 mM Tris-, 170 mM glicin és 20 % metanol tartalmú transzfer pufferben. A fehérjetranszfer sikerességét 1% Ponceau S (Sigma Chemical Co., MO, USA) és 25% ecetsav (Reanal, Budapest, Magyarország) tartalmú festékkel ellenőriztük.
Immunoblotting Az immunoblottinghoz szükséges ellenanyag koncentrációkat előzetesen dot-blot technikával határoztuk meg. A blotmembránokat szobahőmérsékleten, 2 órán keresztül, óvatos rázatás mellett blokkoló oldatban (5% zsírmentes tejpor, 10% PBS puffer) inkubáltuk, hogy a nem specifikus kölcsönhatások kialakulását gátoljuk a membránok és az antitest fehérjék között. A mosási lépéseket, valamint az antitestekkel történő inkubálást is folyamatos, de óvatos rázatás mellett végeztük. Blokkolást követően a membránokat az elsődleges, TLR2 (1 g/ml koncentrációban), TLR3 (2 g/ml koncentrációban) és TLR4 (2 g/ml koncentrációban) specifikus ellenanyagokkal inkubáltuk, szobahőmérsékleten, 1 órán keresztül, mosó oldatban (1% zsírmentes tejpor, 0,1% Tween™20 detergens, 10% PBS puffer). Annak céljából, hogy ellenőrizzük, vajon az SDS-poliakrilamid gélek zsebeibe 32
egyforma mennyiséget vittünk-e fel az egyes mintákból, elsődleges, aktin (1 g/ml koncentrációban) specifikus ellenanyaggal inkubáltuk a membránokat, az előzőekben leírt körülményeknek megfelelően. Mosások után (szobahőmérsékleten, 3 x 10 perc) a másodlagos, HRP konjugált ellenanyaggal, 0,16 g/ml koncentrációt alkalmazva szobahőmérsékleten, 30 percig inkubáltuk a blotmembránokat, majd további mosásokkal (3 x 20 perc) távolítottuk el az ellenanyag feleslegét.
Az immunoreaktív helyek detektálása Az immunoreaktiv helyek kemilumineszcens szignálját Amersham Pharmacia protokoll
szerint
ECLplus
reagenssel,
Hyperfilm
ECL™-en
(AP
Biotech,
Buckinghamshire, UK) detektáltuk.
CD14 és TLR4 polimorfizmus vizsgálatok PCR-restrikciós fragment hossz polimorfizmus (PCR-RFLP) DNS izolálás A DNS izolálás a betegeknél teljes vérből történt, míg a kontroll mintáknál szűrőpapírra cseppentett szárított vérből. DNS izolálás teljes vérből a korábban leírt módszereknek megfelelően történt. A feldolgozás során a szűrőpapírból kivágott, mintegy 10 mm2 felületű mintára 200 l 5%-os Chelex 100-at mértünk. Ezután a mintákat előbb 90 percig 56˚C-on, majd 10 percig 100˚C-on inkubáltuk. Az így előkészített mintákat szobahőmérsékletre hűtöttük, majd megkevertük. Végül 10000 rpm-en 2 percig centrifugáltuk a mintáinkat. A további vizsgálatokig a felülúszót -20˚C-on tároltuk. A CD14 C-260T, TLR4 A+896G SNP-k meghatározását PCR-RFLP technikával végeztük. Elsőként a Chelex 100-al izolált DNS minták megfelelő génszakaszait PCR reakcióval felszaporítottuk. A PCR-eket 50 l végtérfogatú [10% 10x PCR puffer, 2 mM MgCl2, 0,2 mM dNTP, 0,5 M az egyes szensz és antiszensz primerekből, 1,5 U rekombináns Taq polimeráz (Invitrogen, Kalifornia, USA)] reakcióelegyben végeztük 2 l DNS felhasználásával. A PCR-RFLP-k során használt primerek szekvenciáit, valamint a PCR-RFLP-k körülményeit a 6. táblázatban foglaltam össze. A TLR4 A+896G SNP specifikus primert Lorenz E és munkatársaitól (124), a CD14 C-260T SNP specifikus primert Eng HL és munkatársaitól (125) vettük át. 33
A DNS templátokat a kezdeti 5 perces 94°C-on végzett denaturáció után 40 cikluson [94°C 30 mp (denaturáció), 56 °C (TLR4 A+896G), 58 °C (CD14 C-260T), 60 mp (anelláció), 72 °C 60 mp (extenzió)] keresztül szaporítottuk fel, végül egy 7 percig tartó 72°C-on történő inkubáció során tettük teljessé az extenziót. A PCR reakciókat pozitív és negatív kontrollok felhasználásával végeztük. A kapott PCR termékeket a megfelelő restrikciós endonukleázok (New England Biolabs, Beverly, MD, USA) 10 U mennyiségével emésztettük (6. táblázat). Az emésztett PCR termékeket 3,5%-os, 0,4 mg/l etídium bromiddal festett agaróz gélben elektroforetizáltuk, majd UV fénnyel tettük láthatóvá. A termékek várt hosszát 100 bp DNS marker (Ready-Load, Gibco/BRL, Eggenstein, Németország) felhasználásával ellenőriztük. 6. táblázat: A PCR-RFLP-k során használt primerek szekvenciái, valamint a PCRRFLP-k körülményei.
A vizsgált
Primer szekvencia
SNP
Anellációs
Restrikciós
Restrikciós fragmentumok
hőmérséklet
enzim
hossza (bp)
(°C) CD14
S: 5’-atcatccttttcccacacc-3’
C allél (vad típus): 155+140 58
C-260T
AS: 5’-aactcttcggctgcctct-3’
TLR4
S: 5’-gattagcatacttagactactacctccatg-3’
T allél (variáns): 295 A allél (vad típus): 249 56
A+896G
HaeIII
AS: 5’-gatcaacttctgaaaaagcattcccac-3’
NcoI G allél (variáns): 226+23
A 6. táblázat a PCR-RFLP reakció során alkalmazott primerszekvenciákat, anellációs hőmérsékletet, az alkalmazott restrikciós endonukleázokat és a restrikciós fragmentumok hosszadatait mutatja be. Rövidítések: SNP: egy nukleotid cserével járó polimorfizmus, TLR4: Toll like receptor 4, S: szensz, AS: antiszensz. TNF- polimorfizmusainak vizsgálata A vérminták fehérvérsejtjeiből a DNS-t Miller és mtsai (126) szerint vontuk ki. A vizsgálandó génszakaszt PCR segítségével amplifikáltuk. Az amplifikációt 50μl végtérfogattal végeztük el, ami 3 μl DNS-t, 25 pmol primert, 0,2 mmol/L-t minden dNTP-ből, 1,5 mmol/l MgCl2-t, 2 U Promega Taq polymerase-t és a hozzá való puffert tartalmazta. A kapott terméket restrikciós endonukleázzal emésztettük az enzim működéséhez optimális hőmérsékleten, megfelelő ideig. Az így keletkezett terméket 0,4 mg/L ethidium bromiddal megjelölve agaróz gélen futtattuk meg és UV fény alatt értékeltük. A különböző vizsgálat körülményeit a 7. táblázatban foglaltuk össze.
34
7. táblázat: A vizsgált TNF- polimorfizmusok PCR-RFLP körülményeinek jellemzői Vizsgált gén Polimorfizmus
G
TNF-α A és G-238A
-308
5’-ATCTGGAGGAAGCGGTAGTG-3’ 5’-AGAAGACCCCCCTCGGAACC-3’ 5’-AATAGGTTTTGAGGGCCATG-3’
Alkalmazott primerek PCR körülmények Ciklusszám Denaturáció Annealing Extenzió Emésztés
35 94˚C-10 mp 55˚C-60 mp 72˚C-30 mp, NcoI és MspI
A 7. táblázatban a TNF- polimorfizmus vizsgálatok körülményeit összegeztük. Láthatjuk a PCR-RFLP vizsgálatok során alkalmazott primereket, a ciklusszámot, a denaturáció, annealing és az extenzió körülményeit. Rövidítések: PCR= polimeráz láncreakció, TNF-= tumor nekrózis faktor alfa, RFLP= restrikciós fragment hossz polimorfizmus HLA-DQ meghatározás A HLA-DQ haplotípusok DNS szintű meghatározását szekvencia-specifikus primerek segítségével (Olerup-SSP) alacsony felbontású kittel (DQ Low resolution bulk, Genovision, Norway), PCR technikával végeztük. Azokban az esetekben, ahol az eredmény ezen vizsgálat alapján nem volt egyértelmű, a mintát DQB1* 02 illetve DQB1*03 szubtipizálásnak vetettük alá, vagy szükség esetén az alfa láncot is megvizsgáltuk.
35
STATISZTIKAI MÓDSZEREK
I. CD előfordulási gyakorisága T1DM-s magyar gyermekekben
Mivel a vizsgált paraméterek a normál eloszlást követték statisztikai analízisre egy és kétmintás t-próbát használtunk. Szignifikancia szintnek p<0,05 tekintettük.
II. A természetes immunitás vizsgálata CD-ben. A TLR2, TLR3 és TLR4 expressziójának vizsgálata cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában
A szemikvantitatív és real-time RT-PCR-ek, valamint a Western blotok eredményeinek statisztikai analíziséhez Mann-Whitney U tesztet használtunk (Statistica, StatSoft, OK, USA). Szignifikáns eltérésnek azt tekintettük, ahol p≤0,05.
III. A természetes immunitást befolyásoló CD14 és TLR4 genetikai polimorfizmusának vizsgálata Az allél és genotípus frekvenciák összehasonlítását a vizsgált betegcsoportok és kontrollok között χ2 próbával végeztük. A p értékek összehasonlításánál alfa-korrekciót alkalmaztunk. Szignifikáns eltérésnek azt tekintettük, ahol p≤0,05. A vizsgálat statisztikai power értéke 80% volt. A statisztikai számításokhoz a SAS 8.2 software-t alkalmaztuk. A Hardy-Weinberg szabály teljesülésének ellenőrzésére, illetve a vizsgált SNP-k
közötti
kapcsoltság
számítására
ArlequinTM
szoftvert
(http://lgb.unige.ch/arlequin, Swiss National Science Foundation) alkalmaztunk. IV. TNF-alfa polimorfizmus jelenléte és a cöliákia kialakulásának kockázata T1DM-s betegekben A statisztikai számításokat SPSS softwearrel (Chicago, IL, USA, version 11.5) végeztük. A folyamatos változók (életkor, diabetes kezdetekor életkor, diabetes tartama) összehasonlítása a CD és nem CD csoport közt Mann-Whitney teszttel történt. Az allélfrekvenciák összehasonlítása Fisher-féle exact teszttel vagy χ2 próbával történt. Az allél hordozási frekvenciákat χ2 próbával vetettük össze. Szignifikancia szintnek p<0,05 tekintettük.
36
V. A HLA DQ2 markerek vizsgálata T1DM, CD és CD+T1DM-s betegekben Az allél és genotípus frekvenciák összehasonlítását a vizsgált betegcsoportok és kontrollok között χ2 próbával végeztük. A p értékek összehasonlításánál alfa-korrekciót alkalmaztunk. Szignifikáns eltérésnek azt tekintettük, ahol p≤0,05. A vizsgálat statisztikai power értéke 80% volt. A statisztikai számításokhoz a SAS 8.2 software-t alkalmaztuk.
37
EREDMÉNYEK
CD előfordulási gyakorisága T1DM-s magyar gyermekekben A 3. ábra tartalmazza a szűrési eredményeket. A vizsgált gyermekek között egynél sem észleltünk IgA hiányt. A vizsgált 205 T1DM-es gyermek közül EMA pozitivitást 24 esetben (11,7%) találtunk [11 fiú, 13 lány, átlagos életkor 8,7 év (4,7-13,5)]. A T1DM diagnózisának felállítása óta átlagosan eltelt idő 3,0 év (0,16-9,9) volt. Minden EMA pozitív gyermekben elvégeztük a vékonybél biopsziát, mely 17 esetben (7 fiú, 10 lány) subtotalis boholyatrófiát igazolt. Ezek alapján a CD prevalenciája T1DM-s gyerekekben 8,3% (95%-os confidencia intervallummal: 4,52-12,08). Tizenegy gyermeknek „silent” cöliákiája volt, mivel egyáltalán nem volt a CD-re jellegzetes klinikai tünete, a többi 6 boholyatrófiát mutató esetben enyhe gasztrointesztinális tünetekre (hasmenés, haspuffadás, visszatérő hasfájás) derült fény az utólagos rákérdezés során. Minden CD+T1DM-es gyermek magassága a normál tartományban volt [átlagos percentilis: 36,8% (3-65)]. A maradék 7 esetben a szövettani vizsgálat szabályos nyálkahártya szerkezetet igazolt. Az intraepitelialis T sejtek száma emelkedett volt az IgA-EMA pozitív gyermekekben: 7,5 (4-22) sejt/mm felszíni epitelium (medián, tartomány). Nem volt szignifikáns különbség az EMA pozitív boholyatrófiát mutató és nem mutató esetek között: 7,5 (4-22,1) vs. 7,6 (4,5-12) (3. ábra).
38
3. ábra: A vizsgált betegek EMA és biopsziás eredményei.
T1DM betegek n=205
EMA pozitív n=24
EMA negatív n=181
Biopszia n=24
Boholyatrófia n=17
Emelkedett / T sejtszám n=5
Normál nyálkahártya n=7
Normális / T sejszám n=2
A 3. ábrán a 205 szűrt T1DM-s beteg megoszlását látjuk A 24 EMA pozitív gyermeknél vékonybél biopsziát végeztünk, mely 17 esetben igazolt boholyatrófiát. A 7 normális bélnyálkahártyájú beteg közül 5 esetben emelkedett / T sejtszámot észleltünk. Rövidítés: T1DM= 1-es típusú diabetes mellitus, EMA= endomysium elleni antitest
4. ábra: Az intraepiteliális / T sejtek száma az EMA pozitív diabeteses gyermekeknél.
Sejt/mm boholyatrófia
normál nyh.
A 4. ábrán az intraepiteliális / T sejtek száma van feltüntetve az EMA pozitív T1DMs gyermekeknél. Megfigyelhető, hogy a boholyatrófiát mutató betegeknél a / T sejtszám magasabb, mint a normál nyálkahártyát mutató betegek között. A kontroll csoport átlag + 2 SD értékét horizontális vonal jelzi.
39
A 7 EMA pozitív, de boholyatrófiát nem mutató eset közül ötnél (2,4%) emelkedett epitelialis T sejtszámot észleltünk, így ezek valószínűleg látens cöliákiások. Minden CD+T1DM-es gyermeknél gluténmentes diétát indítottunk. A CD+T1DM-es gyermekek BMI értéke szignifikánsan alacsonyabb volt a csak T1DM-es gyermekekhez viszonyítva: medián 14,2 kg/m2 (tartomány:11,4–17,6) vs. medián 16,3 kg/m2 (tartomány: 13,6–19,4), p<0,05. A CD+T1DM-s gyerekek BMI értéke szignifikánsan emelkedett 3 hónapos gluténmentes diétát követően: 16,8 kg/m2, (tartomány 14,2–16,5 kg/m2) p<0,05. A 6 betegnél észlelt enyhe gasztrointesztinális tünet a gluténmentes diéta mellet megszűnt, mely a gluténbevitel oki szerepét támasztja alá. A gluténmentes diéta mellett megfigyelhető volt az inzulinigény emelkedése is diéta után 0,64 E/kg/nap (tartomány: 0,41–1,0 E/kg/nap vs. diéta előtt 0,48 E/kg/nap (tartomány: 0,39–0,69 E/kg/nap) p<0,05). A glikozilált hemoglobin A1 értéke nem változott a gluténmentes diéta hatására [7,82% (4,9%–9,2%) versus 7,67% (5,1%–9,4%)] Az egy T1DM-es és valószínűleg látens CD-s gyermeknél gluténmentes diétát indítottunk, mert BMI értéke a 3 percentilis alatt (13,7 kg/m2) volt és szénhidrát anyagcseréje nehezen volt kontrollálható. A 3 hónapos gluténmentes diéta hatására BMI értéke 14,3 kg/m2-ra emelkedett és szénhidrát anyagcsere kontrollja is javult. A többi négy T1DM-es és látens CD-s gyermeknél, akiknél nem kezdtünk gluténmentes diétát a BMI értékek érdemben nem változtak a 3 hónapos megfigyelési időt követően 16,1 kg/m2, (14,9–16,9) versus 15,2 kg/m2(14,7–16,3).
40
A természetes immunitás vizsgálata CD-ben. A TLR2, TLR3 és TLR4 expressziójának vizsgálata cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában A TLR2, TLR3 és TLR4 mRNS expresszió változásai cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában
A Toll like receptor 2, TLR3 és TLR4 mRNS expressziót szemikvantitatív RTPCR-rel határoztuk meg a kontrollok, a kezeletlen cöliákiás gyermekek és a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum biopsziás mintáiban. A TLR2 és TLR 4 mRNS expresszió (5. ábra) szignifikánsan fokozódott mind a kezeletlen cöliákiás-, mind a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában a kontrollokhoz képest (mindkét esetben p<0,001). A kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában még kifejezettebb TLR2 és TLR4 mRNS expressziót észleltünk, mint a kezeletlenek duodenum nyálkahártyájában (p<0,001). A TLR3 mRNS expresszió a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában szignifikánsan fokozódott (p<0,001 vs. kezeletlen cöliákia, illetve kontroll), míg a kezeletlen cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában változatlan maradt a kontrollokhoz képest (p=NS).
41
5. ábra: A TLR2, TLR3 és TLR4 mRNS expresszió változását mutatja a kontrollok, a kezeletlen cöliákiás gyermekek-, illetve a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában.
TLR2, TLR3, TLR4 mRNS expresszió
TLR/GAP DH relatív egységek
25
#$
20
#$
15
TLR2 TLR3
* 10
#$
TLR4
*
5 0 Kontroll
Kezeletlen CD
Kezelt CD
Az 5. ábra a TLR2, TLR3 és TLR4 mRNS expressziójának változását mutatja a kontrollok, a kezeletlen cöliákiás gyermekek-, illetve a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában. A TLR2, TLR4 mRNS expresszió szignifikánsan fokozódott mind a kezeletlen cöliákiás, mind a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában a kontrollokhoz képest. A kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában még fokozottabb volt a TLR2 és TLR4 mRNS expresszió, mint a kezeletlen cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában. A TLR3 mRNS expresszió szignifikánsan fokozódott a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában, míg a kezeletlen cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában változatlan maradt a kontrollokhoz képest. Az ábrán az átlag és szórás értékeket szerepelnek. *p<0,001 vs. kontroll, #p<0,001 vs. kezeletlen CD, $ p<0,001 vs. kontroll. Rövidítések: CD= cöliákia, TLR2= Toll like receptor 2, TLR3= Toll like receptor 3, TLR4= Toll like receptor 4, GAPDH= glicerinaldehid3-foszfát dehidrogenáz
A TLR2, TLR3 és TLR4 fehérje szintek változásai cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában
TLR2 fehérje a kontrollok duodenum nyálkahártyájában csak minimális mennyiségben volt kimutatható. A TLR2 fehérje szint a kezeletlen cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában kétszeresére emelkedett a kontrollokhoz képest (p<0,05). A kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában, a TLR2 fehérje szint négyszerese volt a kezeletlen cöliákiásokban mért értéknek (p<0,001) (6. ábra). 42
TLR3 fehérjét (7. ábra) csak a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában tudtunk kimutatni. A TLR2-höz hasonlóan, TLR4 fehérjét is csak minimális mennyiségben tudtunk kimutatni a kontrollok duodenum nyálkahártyájában (6. ábra). A TLR4 fehérje szint a kezeletlen
cöliákiás
gyermekek
duodenum
nyálkahártyájában
háromszorosára
emelkedett a kontrollokhoz képest (p<0,01). A kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában, a TLR4 fehérje szint háromszorosa volt a kezeletlen cöliákiásokban mért értéknek (p<0,001).
6. ábra: A TLR2 és TLR 4 fehérje szint változása kontrollok, kezeletlen cöliákiás gyermekek-, illetve kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában.
TLR2 és TLR4 fehérje szintek
TLR relatív fehérje egységek
1400
#$
1200
#$
1000 800
TLR2
**
600
TLR4
*
400 200 0 Kontroll
Kezeletlen CD
Kezelt CD
A 6. ábra a TLR2 és TLR4 fehérje szintjének változását mutatja kontrollok, kezeletlen cöliákiás gyermekek-, illetve kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában (Western blot). A kezeletlen cöliákiás gyermekek duodenális nyálkahártyájában a TLR2 fehérje szint kétszeresére nőtt a kontrollokhoz képest, míg a kezelt cöliákiás gyermekeknél négyszeresre a kezeletlen cöliákiásokban mért értékhez képest. A TLR4 fehérje szint háromszorosára nőtt a kezeletlen cöliákiás gyermekek duodenális nyálkahártyájában a kontrollokhoz képest. A kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában, a TLR4 fehérje szint háromszorosa volt a kezeletlen cöliákiásokban mért értéknek. Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. *p<0,05 vs. kontroll, **p<0,01 vs. kontroll, #p<0,001 vs. kezeletlen CD, $p<0,001 vs. kontroll. Rövidítések: CD= cöliákia, TLR2= Toll like receptor 2, TLR4= Toll like receptor 4
43
7. ábra: A TLR3 fehérje szint változása kontrollok, kezeletlen cöliákiás gyermekek-, illetve kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában.
TLR3 fehérje szint
TLR3 relatív fehérje egységek
3 2,5 2 1,5
TLR3
1 0,5 0 Kontroll
Kezeletlen CD
Kezelt CD
A 7. ábra a TLR3 fehérje szintjének változását mutatja a kontrollok, a kezeletlen cöliákiás gyermekek-, illetve kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában (Western blot). TLR3-at, fehérje szinten csak a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában tudtunk kimutatni. Az adatokat átlag ± szórás formájában adtuk meg. Rövidítések: CD= cöliákia, TLR3= Toll like receptor 3
A természetes immunitást befolyásoló CD14 és TLR4 genetikai polimorfizmusának vizsgálata CD, T1DM és CD+T1DM-s betegekben A 8. táblázatban foglaltuk össze a CD14 C-260T polimorfizmus prevalencia eredményeit. A két mutáns allélt tartalmazó genotípus előfordulása szignifikánsan alacsonyabb volt a T1DM-es csoportban a kontrollokhoz viszonyítva (p=0,0081), de maga a C-260T allél előfordulása nem volt alacsonyabb (T1DM: 41,9%, vs. Kontroll: 54,8%, CD: 54%, és CD+T1DM: 50%)
44
8. táblázat: CD14 C-260T genotípus frekvencia T1DM, CD, CD+T1DM gyermekek és a kontrollok között (%) T1DM *
CD
CD + T1DM
Kontroll
CC
36,3
19
26
17,8
CT
43,7
54
48
54,8
TT
20,0
27
26
27,4
CD14 C-260T
A 8. táblázatban láthatjuk a CD14 polimorfizmus vizsgálat eredményét. T1DM-ben a homozigóta TT genotípus előfordulása szignifikánsan alacsonyabb volt a kontroll populációban észlelthez képest. * p0,0081 vs. kontroll Rövidítések: CD= cöliákia, T1DM= 1-es típusú diabetes mellitus A TLR4 A+896G SNP genotípus eloszlásában nem találtunk eltérést a vizsgált csoportokban a kontrollhoz viszonyítva. Az eredményeket a 9. táblázatban összesítettük. A mutáns G allél frekvenciája 2,9% volt T1DM-ben, 4% CD-ben és 4% CD+T1DMben, míg a kontrollokban 6,5%. 9. táblázat: TLR4 A+896G genotípus frekvencia T1DM, CD, CD+ T1DM-es gyermekek és a kontrollok között (%) TLR4 A+896G
T1DM
CD
CD + T1DM
Kontroll
AA
94,3
92
91,9
87
AG
5,7
8
8,1
13
GG
0
0
0
0
A 9.táblázat a TLR4 A+896G polimorfizmus vizsgálat eredményeit részletezi. A vizsgált betegcsoportok nem különböztek sem egymástól, sem a kontroll populációtól. Rövidítések: CD= cöliákia, TLR4= Toll like receptor 4, T1DM= 1-es típusú diabetes mellitus
45
TNF-alfa polimorfizmus jelenléte és a cöliákia kialakulásának kockázata T1DM-s betegekben
EMA pozitivitást a vizsgált 301 T1DM-s gyermek közül 23 esetben észleltünk. Egy gyermeknek már a T1DM kialakulása előtt ismert volt a cöliákiája. A 23 EMA pozitív esetből a vékonybél biopszia 18 esetben (7 fiú, 11 lány) igazolta a CD fennállását. Ez a 18+1 gyermek képezte a továbbiakban a CD-s csoportot. Az öt EMA pozitív, de a vékonybélbiopszia során normál szövettant mutató gyermeket a további vizsgálatba nem vontuk be, de adataik szerepelnek a 10. és 11. táblázatban.
10. táblázat: A vizsgált betegek klinikai jellemzői szerostátuszuk alapján EMA negatív Klinikai adatok
Nem (F/N)
EMA pozitív
Nem CD
CD
Normális biopszia
n=277
n=19
n=5
144/133
8/11
2/3
14 (3-18)
14 (4-18)
8 (6-15)
5 (0-17)
6 (2-14)
6 (2-7)
8 (0.9-18)
5 (1-14)
2 (1-8)
Medián kor (tartomány) (év)
A diabetes fennállásának medián ideje (tartomány) (év)
Medián kor a T1DM kezdetekor (tartomány) (év)
A 10. táblázatban foglaltuk össze a vizsgálatba bevont gyermekek legfontosabb adatait. Kor, nem, a diabetes fennállásának ideje, és a diabetes jelentkezésekori életkor szempontjából nem volt különbség a CD és nem CD csoport között. Rövidítések: T1DM= 1-es típusú diabetes mellitus, EMA= endomysium ellenes antitest, CD= cöliákia 46
A 11. táblázat foglalja össze a genotipizálás eredményét.
11. táblázat: A TNF-α genotipizálás eredménye EMA-negatív
EMA pozitív esetek
Esetek Genetikai variáns Nem CD
CD
Normális biopszia
N=277 (100%)
n=19 (100%)
n=5
TNF-α promoter gén -308 polimorfizmus -308
GG
148 (53,4)
8 (42,1)
3
-308
GA
118 (42,6)
9 (47,4)
2
-308
AA
11 (4)
2 (10,5)
0
TNF-α promoter gén -238 polimorfizmus -238
GG
260 (93,9)
15 (79)
5
-238
GA*
16 (5,7)
4 (21)
0
-238
AA*
1 (0,4)
0
0
A 11. táblázat tartalmazza a TNF-α -308 és -238 promoter polimorfizmus genotípus meghatározás eredményeit. A -238A allél hordozása a cöliákiás csoportban szignifikánsan gyakoribb volt, mint a nem CD csoportban (*p=0,036). Rövidítések: TNF-α= tumor nekrózis faktor alfa, EMA= endomysium ellenes antitest, CD= cöliákia A TNF-
–308
A allél prevalenciája magasabb volt a CD (34%), mint a nem CD
csoportban (25%), de a különbség statisztikailag nem bizonyult szignifikánsnak (OR: 1,57, 95% CI: 0,61-4,04; p=0,32). A
–308
A allél prevalenciája magasabb volt, mint a
magyar egészséges populáció referencia értéke (0,34 és 0,25 vs 0,14, p<0,05 és p<0,001) (127). A TNF-
–308
A allél hordozása 2,42-szeres kockázati tényezőt (95% CI: 1,68-3,48;
p<0,001) jelent T1DM kialakulására, az ezt az allélt nem hordozókhoz képest. A TNF-
–238
A allél prevalenciája magasabb volt a CD-s csoportban, mint a nem
cöliákiás diabetesesek között.
47
A TNF-
–238
A allél hordozása 4,07-szeres rizikót (95% CI: 1,22-13,63; p<0,05) jelent
CD kialakulására a T1DM-es gyermekek körében, mint akik nem hordozzák a TNF- – 238
A allélt.
Összesítve a
–238
A allél prevalenciája nem különbözött szignifikánsan a cöliákiás és a
nem cöliákiás T1DM-es gyermekeknél az egészséges magyar referencia populációhoz viszonyítva (0.11 és 0.03 vs 0.046) (127). Se a
–238
A, se a
–308
A allél jelenléte nem
mutatott összefüggést a CD kialakulásának időpontjával. Nemi különbségeket nem tudtunk kimutatni a különböző polimorfizmusok jelenlétével kapcsolatban.
A HLA DQ2 markerek vizsgálata T1DM, CD és CD+T1DM-s betegekben A 12. táblázatban foglaltuk össze a HLA-DQ genotípusok megoszlását a vizsgált betegcsoportokban és kontrollokban, a 13. táblázat pedig a statisztikai eredményeket összesíti. Mint az várható volt, T1DM-ben a homozigóta HLA-DQ8 genotípus szignifikánsan magasabb volt, mint CD-ben, míg a homozigóta vagy heterozigóta HLA-DQ2 genotípus DQ8 jelenléte nélkül nem különbözött a kontrollokétól. CD-ben mind a homozigóta, mind a heterozigóta HLA-DQ2 (DQ8-) genotípus szignifikánsan gyakrabban fordult elő, mint a T1DM vagy a kontroll csoporthoz viszonyítva, de a HLA-DQ8 (DQ2-) genotípus emelkedését nem észleltük. T1DM-ben, valamint CD és T1DM együttes előfordulása esetén a HLA-DQ2/8 heterozigóta genotípust szignifikánsan gyakrabban észleltük a csak CD-s, és kontroll gyermekpopulációhoz viszonyítva.
48
12. táblázat: A HLA DQ genotípusok megoszlása a különböző csoportokban DQ genotípus #
T1DM n=80 % 20 25 3 3,8 10 12,5 2 2,5 29 36,3 16 20 80 100,1
CD n=100 61 25 4 0 10 0 100
% 61 25 4 0 10 0 100
CD+T1DM n=47 % 10 21,3 12 25,5 3 6,4 0 0 20 42,6 2 4,2 47 100
DQ2 /X (DQ8-) DQ2/2 DQ8/X (DQ2-) DQ8/8 DQ2/8 DQX/X (DQ2-,DQ8-) Összesen # HLA-DQB1*0201, vagy *0202 HLA DQA1*05 transz pozicióval kapcsolva
Populációs kontroll n=2080 % 452 21,7 85 4,1 173 8,3 0 0 28 1,4 1342 64,5 2080 100
A 12. táblázatban összegeztük a HLA DQ genotípusok megoszlását a vizsgált populációkban. T1DM-ben a homozigóta HLA-DQ8 genotípus szignifikánsan magasabb volt, mint CD-ben, míg a homozigóta vagy heterozigóta HLA-DQ2 genotípus DQ8 jelenléte nélkül nem különbözött a kontrollokétól. CD-ben mind a homozigóta, mind a heterozigóta HLA-DQ2 (DQ8-) genotípus szignifikánsan gyakrabban fordult elő, mint a T1DM vagy a kontroll csoporthoz viszonyítva, de a HLA-DQ8 (DQ2-) genotípus emelkedését nem észleltük. Rövidítések: CD= cöliákia, T1DM= 1-es típusú diabetes mellitus
13. táblázat: A vizsgált csoportok statisztikai összehasonlítása
T1DM CD CD+T1DM Populációs kontroll
T1DM <0.0001 0.0014 <0.0001
CD
CD+T1DM
Kontroll
<0.0001 <0.0001
<0.0001
-
A 13. táblázat a vizsgált csoportok közötti szignifikancia szinteket ábrázolja. Rövidítések: CD= cöliákia, T1DM= 1-es típusú diabetes mellitus
49
MEGBESZÉLÉS
Vizsgálatainkban a természetes és az adaptív immunitás egyes jellemzőit vizsgáltuk 1es típusú diabeteses, cöliákiás és mindkét betegségben szenvedő gyermekeknél. Mindenekelőtt fontosnak tartottuk tisztázni, hogy mennyire gyakori a cöliákia előfordulása 1-típusú diabetesben, hiszen erre vonatkozó nagyszámú beteganyagon alapuló vizsgálat még nem állt rendelkezésre Magyarországon.
CD előfordulási gyakorisága T1DM-s magyar gyermekekben Megállapítottuk, hogy a 205 vizsgált gyermek között 24 esetben (11,7%-ban) találtunk EMA pozitivitást. A továbbiakban vékonybélbiopszia elvégzésével igazoltuk a cöliákia
fennállását,
ezzel
17
vizsgált
betegnél
észleltünk
subtotalis/totalis
boholyatrófiát, így T1DM-es gyermekek körében a CD prevalenciáját 8,3%-nak találtuk. Ez az érték korrelál más országok adataival, bár inkább azok felsőbb tartományába esik. Az eredményeket nagyban befolyásolja, hogy mennyi az eltelt idő a diabetes kezdete és a szűrés között. Vizsgálatunkban relatíve hosszabb idő telt el a diabetes kezdete és a szűrés között, de adataink összehasonlítása nehézkes más vizsgálatokkal, mert sokszor ez az adat nem hozzáférhető. Egészséges populációban a CD előfordulása 0,33-1,3% közé tehető (128-130), így a „csendes” cöliákia előfordulása a diabeteses populációban közel hatszorosa az egészségesekhez képest. A 17 egyértelműen cöliákiás beteg közül 11-nek egyáltalán nem volt gasztrointesztinális, illetve extra-intesztinális tünete. Ez összhangban áll korábbi vizsgálati eredményekkel (23, 24, 27, 131), és felhívja a figyelmet arra, hogy ebben a betegcsoportban a cöliákia nem jár a jellegzetes malabszorptiós tünetekkel, hanem gyakran csendes, „silent” formában jelentkezik. Vizsgált betegeink körében egy kismértékben csökkent BMI mégis megfigyelhető volt. A 7 EMA pozitív, de boholyatrófiát nem mutató eset közül ötnél (2,4%) emelkedett epitelialis T sejtszámot észleltünk, így ezek valószínűleg látens cöliákiások. A glutén intolerancia nem csak egyértelmű boholyatrófia formájában jelentkezhet. Látens cöliakiáról akkor beszélünk, ha a betegnek a gluténtartalmú étrend mellett normális szöveti szerkezetű a boholystruktúrája, de idővel a boholykárosodás kialakul. Nagy multicentrikus vizsgálat eredményei alapján látens cöliakiában nincs kimutatható eltérés a rutin hisztológiai vizsgálatok során (132). De ezekben az esetekben is van lehetőség 50
cöliákiára specifikus immunológiai eltérések kimutatására. Diagnosztikus jelentőséggel bírnak az intraepitelialis T sejtek (29, 133, 134). A T sejtek képesek reagálni a sérült epitelialis sejtek által expresszált stressz fehérjékkel, ami a sérült sejtek eltávolításában betöltött szerepükre utal. Kisebb mértékben ugyan, de megfigyelték az IE T sejtek számának emelkedését ételallergiában is (135). A epitelialis T sejtek vizsgálatával lehetőség nyílik azonosítani azokat az eseteket, ahol az EMA pozitivitás ellenére a duodenalis nyálkahártya szövettani vizsgálata nem igazolja a boholyatrófiát, hiszen a T sejtek száma egyaránt emelkedett volt a boholyatrófiát mutató és boholyatrófiát nem mutató EMA pozitív T1DM-es gyermekek körében. A boholyatrófiát nem mutató gyermekeknél a jelenlegi protokoll szerint nem indokolt a gluténmentes diéta bevezetése, de szoros kontroll alatt kell tartani őket, és a cöliákiára jellemző gasztrointesztinális vagy extra-intesztinális tünetek jelentkezésekor indokolt az ismételt vékonybél biopszia elvégzése. Megállapítottuk, hogy a gluténmentes diéta bevezetésével kedvezően alakul a gyermekek tápláltsági állapota, hiszen BMI értékük szignifikáns emelkedést mutatott a 3 hónapos diétát követően. Más vizsgálatok szerint is a kiszűrt cöliákiás betegeknél bevezetett gluténmentes diéta hatására javult a hossznövekedés, és a HgbA1c érték is kedvezően változott (136). A tapasztalatok alapján a már manifeszt 1-es típusú diabeteses csoportban, évekkel a diabetes kialakulása után jelenik meg cöliákia. Az esetek többségében ez látens formában jelentkezik, a klasszikus malabszorpciós megjelenési forma ritka. Igaz, a diabetesesek között rendszeresen végzett szerológiai szűrővizsgálatok miatt gyakran nincs is idő a klinikai tünetek megjelenésére. Nincs arra adat, hogy amennyiben először a cöliákia jelenik meg, mekkora az esélye, hogy a későbbiekben 1-es típusú diabetes alakuljon ki, azonban úgy tűnik, ha a cöliákiát diagnosztizálják először, akkor a diabetes viharos kezdettel, gyakoribb ketoacidózissal fog járni (137). Összehasonlítva a diabeteses és a diabeteses és ”silent” cöliákiás betegeket megállapítható, hogy az inzulinigény, a hipoglicaemiák és ketoacidózisok számában nincs szignifikáns különbség, de a cöliákiás csoport súlygyarapodása rosszabb (138). Jelen vizsgálatunkban a gluténmentes diéta bevezetését követően megfigyeltük az inzulinigény emelkedését, melynek háttere a boholyatrófia gyógyulásával kialakuló jobb felszívódással magyarázható. Ugyanakkor az anyagcsere kontroll nem romlott, mivel a glikozilált hemoglobin A1 értéke nem változott a gluténmentes diéta hatására. A gluténmentes diéta bevezetése előtt is csak kismértékben volt emelkedett a HgbA1c érték, ami a rosszabb szénhidrát felszívódásra utal. Ezt több korábbi vizsgálat is 51
megerősítette (139, 140, 141), azonban más adatok szerint a gluténmentes diéta bevezetésével nem nőtt az inzulinigény.
A természetes immunitás vizsgálata CD-ben. A TLR2, TLR3 és TLR4 expressziójának vizsgálata cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában
Az adaptív immunrendszer szerepét a cöliákia patogenezisében már számos közleményben igazolták, ugyanakkor egyre több adat utal a természetes immunrendszer jelentőségére is (3-6). Az adaptív és a természetes immunválasz és a cöliákia kapcsolatát a 8. ábrán szemléltetjük. Vizsgálatainkkal arra szerettünk volna választ kapni, hogy különbözik-e a TLR2, TLR3 és TLR4 expresszió mRNS és fehérje szinten kezeletlen- és kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában, a kontrollokhoz viszonyítva. Méréseinkkel igazoltuk, hogy a TLR2 és TLR4 mRNS expresszió szignifikánsan emelkedett a kezeletlen- és a diétázó cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában a kontrollokhoz képest. Továbbá, a TLR2 és TLR4 mRNS expresszió a diétázó cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában még kifejezettebb volt, mint a nem diétázó gyermekekben. A TLR2 és TLR4 fehérje szintek alig voltak detektálhatóak a kontrollok duodenum nyálkahártyájában, míg kezeletlen- és kezelt cöliákiás gyermekekben szignifikánsan megemelkedett a szintjük. A gluténmentes diétát tartó cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában még magasabb volt a TLR2 és TLR4 fehérje szint, mint a diétát nem tartó gyermekekben. A TLR3 mRNS expresszió szignifikánsan fokozódott a diétázó cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában, a kezeletlen cöliákiás gyermekekhez és a kontrollokhoz képest. TLR3 fehérjét csak a diétázó cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában tudtunk kimutatni.
52
8. ábra: Az adaptív és a természetes immunitás kapcsolata (1)
Természetes immunválasz
Adaptív immunválasz
Makrofág/DC
Glutén és tTG ellenes antitestek
B sejt
A 8. ábra a természetes és az adaptív immunitás kapcsolatát szemlélteti cöliákia vonatkozásában. A cöliákia patogenezisének hipotetikus folyamata. Az ábra bal oldalán látható az adaptív immunitás részvétele, melyet a lamina propria CD4+ T sejtjei irányítanak. A gliadin kefeszegélyben és intraluminalisan zajló proteolízise során olyan immunstimuláns peptidek szabadulnak fel, mint pl. a Shan és mtsai által leírt 33 aminosavból álló polipeptid (33mer) (142). Az epiteliális feldolgozást kikerülő T sejt epitópok a szöveti transzglutamináz által deamidálódnak és hozzákötődnek az APC-k HLA DQ2/8 molekulákhoz, és így tudnak prezentálódni a CD4+ T sejteknek a lamina propriában. Ezek az aktivált T sejtek serkentik a B sejtek gliadin és tTG2 elleni antitest termelését, valamint nagy mennyiségben IFN--t termelnek. Az IFN-fokozza az epitelialis károsodást direkt sejthalál, illetve makrofág aktiváció révén. A CD8 IEL aktivációja is bekövetkezhet egyes gliadin peptidek MHC Ia-val történő keresztprezentációja révén. Az ábra jobb oldala a természetes immunitás részvételét írja le, melynek kulcsa az IL-15. A lamina propria makrofágjai által termelt IL-15 serkenti a dendritikus sejtek antigénprezentációs képességét és így az adaptív immunválaszt. Az enterociták által termelt IL-15 serkenti az IEL-k túlélését, citotoxicitását, expanzióját és IFN- termelését, valamint egyes természetes receptorok expresszióját. Ezeknek a receptoroknak atipusos MHC Ib ligandjaik vannak és az epitel sejteket érő stressz vagy gyulladás indukálja őket. Ez az interakció tovább fokozza az IEL aktivációját. A refrakter cöliákiás sprue-ban kialakuló perzisztens intraepiteliális IL-15 termelés klonális intraepiteliális proliferációhoz vezethet. Intesztinális fertőzés esetén az IL-15 szintje gyorsan emelkedik, beindítva az adaptív és természetes immunválaszokat. Így az intesztinális fertőzés az IL-15-n keresztül trigger faktora lehet CD kialakulásának. Ezen túlmenően CD-ben a p31-p49 peptidek a makrofágok IL-15 termelődését okozzák. Rövidítések: IL-15= interleukin-15, tTG= szöveti transzglutamináz, IFN=interferon, DC= dendritikus sejt, APC= antigén prezentáló sejt, IEL= intraepiteliális limfocita 53
Egyes vélemények szerint a különböző bakteriális produktumok is TLR-eken keresztül szenzitizálhatják a CD4+ T sejteket gliadinnal szemben (7). Egyes gliadin peptidek is képesek (pl. p31-p43) TLR-eken vagy más mintázatfelismerő receptorokon keresztül aktiválni a természetes immunrendszert, ami az IL-15 szintjének emelkedését okozza (3, 4, 143). Az intesztinális mikroflóra által indukált TLR4 mediált jelátvitel gátolja az ételallergénekkel szembeni reakciót. Feltételezhető, hogy a cöliákiában megfigyelhető fokozott TLR2 és TLR4 expresszió megakadályozza a gliadin indukálta Th2 típusú gyulladást, a Th1 immunválasz TLR4-en keresztüli fokozásával. Ezt a feltételezést támasztja alá az is, hogy a TLR4 mutáns vagy génkiütött egerekben gyakrabban lép fel ételallergia, ami összefügg a Th2-es citokinek (IL-4, IL-13) magas szintjével (144). Selby WS és mtsai igazolták, hogy az IEL-k tartós proliferációja és a lamina propria limfocitáinak perzisztens aktivációja akkor is fennállhat, ha a cöliákiás beteg tartja a gluténmentes diétát (145). Az IEL-ek ugyanolyan potens INF-γ termelő sejtek, mint a lamina propria CD4+ T sejtjei, ezért az IE INF-γ termelés a gluténmentes diéta esetén is fennmarad (146). LPS hatására az IEC-k IL-15-öt termelnek, ami TCR αβ+ CD8 αα intesztinális IEL-ek képződéséhez vezet (147). A TLR4 mutáns C3H/HeJ, BALB/lps(d) és C57BL/10ScCr egértörzsek IEC-i nem expresszálnak IL-15-öt és a TCR αβ+ CD8 αα intesztinális IEL-ek képződése is szignifikánsan csökken a vad típusú egértörzsekhez képest. Az IEL-ek, gluténmentes diéta mellett is fennálló perzisztens aktivációja nagy valószínűséggel az epitelium elsődleges vagy másodlagos működési zavarával hozható összefüggésbe. Ezek a megfigyelések arra utalnak, hogy a fokozott TLR expresszió érzékenyítheti az epiteliális/szubepiteliális sejteket gluténnel vagy más külső faktorokkal (pl. mikroorganizmusok) szemben, ami az IL-15 túlprodukciójához és perzisztens IEL aktivációhoz vezet CD-ben. Savilahti E és munkatársai korábbi eredményei, miszerint az intraepiteliális T sejtek száma gluténmentes diéta mellett is emelkedett, megegyezik a diétázó cöliákiásokban mért emelkedett TLR2 és TLR4 expresszióval (134). Több közlemény is alátámasztja, hogy a T sejtek alapvető szerepet játszanak a természetes immunválasz kialakulásában, és aktiválódásukhoz a TLR-okra is szükség van (148, 149). A cöliákia patogenezisében a vírusfertőzések szerepe ellentmondásos. Kagnoff és munkatársai leírták, hogy az Adenovírus 12 fertőzés elősegítheti a cöliákia kialakulását (150). Mahon és munkatársai azonban úgy találták, hogy az Adenovírus 12 fertőzés hatására CD nem fordult elő gyakrabban a kontrollokhoz képest (151). Eredményeink miszerint a TLR3 mRNS expresszió csak a kezelt cöliákiás gyermekek duodenális nyálkahártyájában fokozódott a kontrollokhoz képest, és TLR3 fehérjét csak a kezelt 54
cöliákiásoknál tudtunk kimutatni -szintén arra utalnak, hogy TLR3 mediált vírusfertőzés nem játszik központi szerepet a cöliákia patogenezisében.
A természetes immunitást befolyásoló CD14 és TLR4 genetikai polimorfizmusának vizsgálata
A monociták és a makrofágok felszínén megtalálható CD14 és TLR4 kulcsszerepet tölt be a sejtaktivációs mechanizmusban. A Gram negatív baktériumok felszínén megtalálható LPS fenti receptorokon keresztül képes aktiválni a sejteket. A CD14 (C260
T) és a TLR4 (A+896G) funkcionális polimorfizmusai befolyásolják a bakteriális
antigénekre kialakuló mukozális természetes immunválaszt. (77, 152). A CD14 (C-260T) SNP hatására fokozódik a CD14 expressziója, ez TLR4 aktiválódásához vezet, aminek az eredménye egy bakteriális antigénekre adott kifejezettebb reakció (119). A kialakuló gyulladásos folyamat károsítja a jejunum intesztinális barrier funkcióját, ami a lamina propria fokozott glutén terhelését eredményezi. A lamina propriában helyezkedik el a legtöbb glutén reaktív limfocita. A folyamat eredménye a cöliákia kialakulásának fokozott kockázata lehet. Klöting és mtsai NOD egérmodellben igazolták, hogy a CD14 hiányos NOD egerekben a diabetes előfordulása szignifikánsan alacsonyabb, mint a CD14-t tartalmazó állatokban (153). Ezek alapján feltételezhető volt, hogy T1DM-s betegekben a CD14 (C-260T) SNP előfordulása, - mely a CD14 fokozott expressziójával jár-, gyakoribb lesz. Meglepő módon azt észleltük, hogy a CD14 TT genotípus a T1DM-s gyermekekben ritkább, mint a cöliákiás vagy a kontroll populációban, és a mutáns allél előfordulása nem különbözött a vizsgált csoportokban. Ez a váratlan eredmény részben azzal magyarázható, hogy a CD14 szerepet játszik az apoptosis regulációjában is. Közelmúltban végzett vizsgálatok igazolták, hogy a CD14 nemcsak immun-receptorként képes reagálni bakteriális komponensekkel (pl. LPS), de felismeri és megköti a saját szervezetből származó különböző apoptotikus sejt származékokat (Pl. az apoptotikus leukocitákon lévő intercelluláris adhéziós molekula3-t) (154-157). A CD14 főleg fagociták felszínén expresszálódik, melyek tolerogén (toleranciát indukáló módon) módon képesek apoptotikus sejtmaradványokat prezentálni a T sejteknek, így az autoreaktív T sejtek funkcionális inaktivációja jön létre (158, 159). Feltételezhetően a csökkent CD14 expresszió megzavarja ezt a folyamatot, mely autoimmun folyamat beindulásához és T1DM kialakulásához vezethet. Másrészről 55
CD14 (C-260T) polimorfizmust hordozóknál a szolubilis CD14 szintje alacsonyabb. A szolubilis CD14 képes az aktivált autoreaktív T sejtekhez kötődni és azokat inaktiválni, így alacsonyabb szolubilis CD14 szint esetén ez a folyamat elégtelen (160). Érdekes módon a mind CD, mind T1DM-ben szenvedő gyermekeknél a CD14 homozigóta mutáns TT genotípus előfordulása nem volt csökkent. Ez azt jelentheti, hogy ezen allél jelenléte T1DM-s gyermekekben fokozhatja a CD kialakulásának kockázatát. Feltételezhetően a receptor normális expressziója fogékonnyá teszi a diabeteses egyént cöliákia kialakulására, mert jelentős szerepet játszik a gyulladásos folyamat szabályozásában a nyálkahártyában (161).
TNF-alfa polimorfizmus jelenléte és a cöliákia kialakulásának kockázata T1DM-s betegekben
Ebben a vizsgált diabeteses populációban a CD előfordulási gyakoriságát 6,3%-nak mértük. Ez valamivel magasabb, mint amiről más közlemények beszámolnak (162), de alacsonyabb, mint korábbi vizsgálatunkban tapasztaltuk. A –308 A allél előfordulási gyakorisága magasabb volt cöliákiásokban (34%), mint a nem CD csoportban (25%), bár a különbség nem érte el a szignifikanciát. A
–308
A allél
prevalenciája magasabb volt a vizsgált betegcsoportban, mint az egészséges magyar kontrollcsoportban, függetlenül CD jelenlététől (127). Korábbi, eltérő etnikai összetételű populációs vizsgálatok szintén a T1DM-ben (94). A
–308
–308
A allél gyakoribb előfordulását írták le
A allél gyakoribb előfordulását CD-ben is leírták, T1DM
megléte nélkül (163). Saját vizsgálatunkban azonban nem tudtuk igazolni, hogy a
–308
A allél hordozása
fokozná a CD kialakulásának kockázatát T1DM-ben. A szövettanilag igazolt CD-s betegek közt a
–238
A allél hordozása szignifikánsabban gyakoribb volt, mint a nem
cöliákiás csoportban. Ennek az eltérésnek a jelentősége azonban ma még nem világos. A G-238A polimorfizmus funkcionális jelentősége nem ismert, de egyes adatok alapján jelenléte befolyásolja autoimmun-, és egyes fertőző betegségek kialakulását (164-166). Vizsgálataink alapján megállapíthatjuk, hogy a TNF-
–308
A allél előfordulása
gyakoribb T1DM előfordulása esetén, de nem hajlamosít CD kialakulására ebben a populációban. A
–238
A allél szignifikánsan gyakoribb a két betegség együttes
előfordulása esetén, de ennek klinikai jelentősége még nem tisztázott.
56
A HLA DQ2 markerek vizsgálata T1DM, CD és CD+T1DM-s betegekben Mind a cöliákia, mind az 1-es típusú diabetes mellitus kialakulása összefüggésben van a DQ2 (DQA1*05/DQB1*02) és DQ8 (DQA1*03/DQB1*0302) jelenlétével (167). Eredményeink megerősítik, hogy a magyar lakosság körében a CD kialakulására a fő fogékonysági tényező a DQ2, míg T1DM-ben a DQ8. Koeleman és mtsai vizsgálataival megegyezően megállapíthatjuk, hogy a DQ2/DQ8 heterozigótaság jelenléte T1DM kialakulására hajlamosít (168). Sumnik és mtsai egyértelműen igazolták, hogy diabetesesek körében a CD kialakulását a HLA-DQB1*02-DQA1*05 jelenléte egyértelműen befolyásolja (169). Először Saukkonen és mtsai írták le 1996-ban, hogy a DQB1*02 CD-s és T1DM-s gyermekek körében gyakrabban fordul elő (36). Egy későbbi vizsgálat megállapította, hogy HLA DQB1*0201-DQA1*05 esetén CD kialakulására négyszeres a kockázat (35). Ezt az összefüggést más vizsgálók megerősíteni nem tudták, és populációs specifikus jelenségnek tartják. Az Olaszországból származó vizsgálatban a DQB1*0201-DQA1*05 frekvencia 68% volt a CD+T1DM csoportban és 62% a diabeteses csoportban. Ennek oka a DQB1*0201-DQA1*05 gyakori előfordulása lehet az olasz diabeteses populációban (170). Doolan és mtsai vizsgálatukban emelkedett (77%) DQB1*0201-DQA1*05 frekvenciát mutattak ki T1DM+CD-s betegekben, szemben a csak diabetesesek 59%-val, de a különbség a betegek alacsony száma miatt nem érte el a szignifikanciát (171). Nagyobb betegszámon végeztek vizsgálatot Bao és mtsai. Felmérésükben nagyobb arányú szöveti transzglutamináz pozitivitást észleltek azon diabeteseseknél, akiknél HLA DQ2 vagy DQ8 jelen volt, illetve különösen DQ2 homozigótaság esetén (172).
Eredményeink megerősítik, hogy T1DM-ben a HLA-DQ8, míg cöliákiában a HLADQ2 előfordulása a gyakoribb. Megállapítható az is, hogy a két betegség együttes előfordulása esetén a DQ2 előfordulása szignifikánsan gyakoribb, mint a csak T1DMben szenvedő betegekben. CD+T1DM előfordulásakor viszont a DQ8 előfordulása szignifikánsan alacsonyabb, mint a csak diabetesben szenvedőkben. A DQ2 és DQ8 allélok együttes előfordulása mind CD+T1DM-ben, mind T1DM-ben gyakoribb, mint a csak cöliákiásokban, de gyakoriságuk a két diabeteses csoportban egymással lényegében megegyezik. Vizsgálataink alapján úgy tűnik, hogy T1DM-ben a HLA-DQ allélok meghatározása segítségre lehet a cöliákia kialakulása valószínűségnek a megítélésére. 57
KÖVETKEZTETÉSEK Vizsgálataink alapján az alábbi megállapításokat fogalmazhatjuk meg:
1. T1DM-ben a cöliákia előfordulása 8,3%-os, mely jóval magasabb a kontroll populációban észlelthez képest. 5,3 %-ban „silent” cöliákia volt igazolható, mivel a gyerekeknek nem volt a CD-re jellegzetes klinikai tünete. A gluténmentes diéta bevezetésével kedvezően alakult a gyermekek tápláltsági állapota, BMI értékük szignifikáns emelkedést mutatott, inzulinigényük szignifikánsan emelkedett. 2. Fokozott TLR2 és TLR4 mRNS expressziót, valamint emelkedett fehérje szint mutattunk ki mind a kezeletlen-, mind a kezelt cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában a kontrollokhoz viszonyítva. A gluténmentes diéta mellett, normális bélboholy struktúra esetén is fokozódott TLR2 és TLR4 expresszió arra utal, hogy a megemelkedett TLR2 és TLR4 expressziónak fontos szerepe lehet a cöliákia patogenezisében. A megnövekedett TLR2 és TLR4 expresszió fokozott proinflammatorikus és kemotaktikus citokin felszabaduláshoz-, ezáltal a glutén reaktív CD4+ T sejtek aktivációs küszöbének csökkenéséhez vezethet, így elősegítheti a glutén specifikus immunválasz kialakulását. Megállapítottuk, hogy a kezelt cöliákiás gyermekek duodenális biopsziáiban még fokozottabb TLR2 és TLR4 mRNS expresszió, valamint magasabb fehérje szint figyelhető meg, mint a kezeletlen cöliákiás gyermekekben. Feltételezhető, hogy ez a fokozott TLR2 és TLR4 expresszió lehet felelős a kezelt cöliákiásokban is megfigyelhető intraepiteliális T sejt szám emelkedésért. 3. Igazoltuk, hogy a TLR3 mRNS expresszió a kezeletlen cöliákiás gyermekek duodenális nyálkahártyájában nem változik a kontrollokhoz képest, valamint a TLR3 fehérje szinten nem detektálható. Ezek alapján feltételezhetjük, hogy a TLR3 közvetített vírusfertőzés nem játszik elsődleges szerepet a cöliákia patogenezisében. Megállapítottuk, hogy a kontrollok duodenum nyálkahártyájában a TLR2 és TLR4 fehérjék alig kimutatható mennyiségben vannak jelen, míg kezeletlen- és kezelt cöliákiás gyermekekben megemelkedik a szintjük. Eredményeink arra utalnak, hogy a TLR2 és TLR4 a duodenumban a disztális béltraktushoz hasonló módon expresszálódik, mind fiziológiás körülmények között, mind gyulladás esetén. 4. A két mutáns allélt tartalmazó (CD14 TT) genotípus előfordulása szignifikánsan alacsonyabb volt a T1DM-es csoportban a kontrollokhoz viszonyítva (p=0.0081), de 58
maga a C-260T allél előfordulása nem volt alacsonyabb. A TLR4 A+896G SNP genotípus eloszlásában nem találtunk eltérést a vizsgált csoportokban a kontrollokhoz viszonyítva. 5. A TNF- –308A allél prevalenciája nem különbözött a CD és nem CD csoport között, de magasabb volt, mint a magyar egészséges populáció referencia értéke. A TNF- –308
A allél hordozása 2.42-szeres kockázati tényezőt jelent T1DM kialakulására, az
ezt az allélt nem hordozókhoz képest. 6. A TNF-
–238
A allél prevalenciája magasabb volt a CD-s csoportban, mint a nem
cöliákiás diabetesesek között. A TNF-
–238
A allél hordozása 4.07-szeres rizikót
jelent CD kialakulására a T1DM-es gyermekek körében, mint akik nem hordozzák a TNF- –238A allélt. 7. T1DM-ben a homozigóta HLA-DQ8 genotípus szignifikánsan gyakoribb volt, mint CD-ben, míg a homozigóta (DQ2/2) vagy heterozigóta HLA-DQ2/X (DQ8-) genotípus nem különbözött a kontrollokétól. CD-ben mind a homozigóta, mind a heterozigóta HLA-DQ2 (DQ8-) genotípus szignifikánsan gyakrabban fordult elő, mint a T1DM vagy a kontroll csoporthoz viszonyítva, de a HLA-DQ8 (DQ2-) genotípus emelkedését nem észleltük. T1DM-ben, valamint CD és T1DM együttes előfordulása
esetén a
HLA-DQ2/8
heterozigóta genotípust
szignifikánsan
gyakrabban észleltük a csak CD-s, és kontroll populációhoz viszonyítva.
59
ÖSSZEFOGLALÁS Munkánk során az 1-es típusú diabetes mellitusban (T1DM) szenvedő gyermekeknél kívántuk felmérni a cöliákia (CD) előfordulásának gyakoriságát, valamint a két betegség együttes fennállása esetén vizsgáltuk a természetes és adaptív immunitás egyes tényezőit. A természetes immunitás faktorai közül a TLR2, TLR3, TLR4
expresszióját
vizsgáltuk
cöliákiásokban,
a
TLR4,
CD14
és
TNF-
polimorfizmusát, valamint az adaptív immunitásra jellemző HLA DQ markereket a két betegség egyidejű előfordulása esetén. Megállapítottuk, hogy a CD előfordulási gyakorisága jóval nagyobb T1DM-s gyermekekben, mint a kontroll populációban. T1DM esetén gyakran klinikai tünetek nélkül jelentkezik a CD. Gluténmentes diéta hatására az inzulinigény szignifikánsan emelkedett, a betegek szomatikus fejlettsége javult, BMI értékük normalizálódott. Méréseinkkel igazoltuk, hogy a TLR2 és TLR4 mRNS expresszió és fehérje szintek szignifikánsan emelkedettek a kezeletlen és a diétázó cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában a kontrollokhoz képest. Továbbá a TLR2 és TLR4 mRNS expresszió és fehérje szint a diétázó cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában még kifejezettebb volt, mint a nem diétázó gyermekekben. A TLR3 mRNS expresszió szignifikánsan fokozódott a diétázó cöliákiás gyermekek duodenum nyálkahártyájában a kezeletlen cöliákiás gyermekekhez és a kontrollokhoz képest. TLR3 fehérjét csak a diétázó cöliákiás gyermekeknél tudtunk kimutatni. Miután kezelt cöliákiásokban normális bélboholy struktúra mellett is fokozott TLR2 és TLR4 expressziót mutattunk ki, feltételezhető, hogy a fokozott TLR2 és TLR4 expressziónak szerepe lehet a cöliákia patogenezisében. Megállapítottuk, hogy a CD14 TT genotípus jelenléte fokozhatja a cöliákia kialakulásának kockázatát T1DM-s gyermekekben. Vizsgálataink alapján megállapíthatjuk, hogy a TNF-
–308
A allél előfordulása
gyakoribb T1DM előfordulása esetén, mint a normális populációban, de jelenléte nem hajlamosít CD kialakulására. A TNF-
–238
A allél szignifikánsan gyakoribb a két
betegség együttes előfordulása esetén, de ennek klinikai jelentősége még nem tisztázott. Igazoltuk, hogy a DQ2/DQ8 heterozigóta állapot fokozza a két betegség együttes előfordulását, valamint, hogy T1DM-ben a HLA-DQ allélok meghatározása segítségre lehet a cöliákia kialakulás valószínűségének megítélésére.
60
SUMMARY „Examination of individual components of innate and adaptive immunity in coeliac disease, type-1 diabetes, and the combination of the two diseases" In our study we screened the prevalence of coeliac disease (CD) in children with type-1 diabetes mellitus (T1DM) and investigated the adaptive and innate immune system in both disorders. We determined Toll like receptor 2 (TLR), TLR3, TLR4 expression in coeliac patients, TLR4, CD14 and TNF- polymorphisms and HLA-DQ alleles in combination of the two diseases. According to our results, the frequency of CD in Hungarian children with T1DM is higher than in the control population. We found that coeliac patients detected by screening in a T1DM population had few or no characteristic symptoms at all for this disease. The introduction of gluten free diet improved the somatic development of these children, the need of insuline increased significantly. We found higher TLR2 and TLR4 mRNA expression and protein levels in the duodenal mucosa of children with treated CD and untreated CD compared with controls. TLR2 and TLR4 mRNA expression and protein levels were even higher in the duodenal mucosa of children with treated CD than in untreated CD. TLR3 mRNA expression was increased in the duodenal mucosa of children with treated CD compared with untreated CD and controls. We were able to detect TLR3 protein only in the biopsy specimens of treated patients with CD. Our finding of elevated TLR2 and TLR4 expression even in treated CD patients with normal villous structure may indicate their potential pathogenetic role in CD. Our results suggest that in patients with T1DM the CD14
-260
TT homozygous
genotype increases the risk for the development of CD. Our study indicated that the prevalence of TNF-
-308
A allele is higher in T1DM
than in the healthy population but does not seem to influence the risk of CD in this population. The prevalence of TNF-
-238
A allele is higher in T1DM children with CD,
but the importance of this finding is still unclear. The distribution of HLA-DQ genotype is different in children with CD and T1DM. In patients with T1DM and those with CD and T1DM, the occurrence of HLA-DQ2/8 heterozygosity was significantly higher than in children with CD only and in control children. Determination of the HLA-DQ genotype in children with T1DM may help in estimating the risk for the development of CD.
61
IRODALOMJEGYZÉK
1.
Cerf-Bensussan N, Cellier C, Heyman M, Brousse N, Schmitz J. Coeliac disease: an update on facts and questions based on the 10th International Symposium on Coeliac Disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2003;37: 412421.
2.
Sollid LM. Molecular basis of celiac disease. Annu Rev Immunol. 2000;18: 5381.
3.
Maiuri L, Ciacci C, Ricciardelli I, Vacca L, Raia V, Auricchio S, Picard J, Osman M, Quaratino S, Londei M. Association between innate response to gliadin and activation of pathogenic T cells in coeliac disease. Lancet. 2003;362: 30-37.
4.
Schuppan D, Esslinger B, Dieteric W: Innate immunity and coeliac disease. Lancet. 2003;362: 3-4.
5.
Londei M, Ciacci C, Ricciardelli I, Vacca L, Quaratino S, Maiuri L. Gliadin as a stimulator of innate responses in celiac disease. Mol Immunol. 2005;42: 913918.
6.
Forsberg G, Fahlgren A, Horstedt P, Hammarstrom S, Hernell O, Hammarstrom ML. Presence of bacteria and innate immunity of intestinal epithelium in childhood celiac disease. Am J Gastroenterol. 2004;99: 894-904.
7.
Sollid LM, Gray GM. A role for bacteria in celiac disease? Am J Gastroenterol. 2004;99: 905-906.
8.
Mäki M, Holm K, Lipsanen V, Hällström O, Viander M, Collin P, Savilahti E, Koskimies S. Serological markers and HLA genes among healthy first-degree relatives of patients with coeliac disease. Lancet 1991;338: 1350–3.
9.
Greco L, Romino R, Coto I, Di Cosmo N, Percopo S, Maglio M, Paparo F, Gasperi V, Limongelli MG, Cotichini R, D'Agate C, Tinto N, Sacchetti L, Tosi R, Stazi MA. The first large population based twin study of coeliac disease. Gut 2002;50: 624–8.
10.
Endreffy E, Várkonyi Á, Kaiser GI, Raskó I. Association of altered RFLP with coeliac disease among Hungarian families. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1992;14: 118-9.
11.
Alberti KG, Zimmet P. Definition, diagnosis and classification of diabetes mellitus and its complications. Part 1: diagnosis and classification of diabetes
62
mellitus provisional report of a WHO consultation. Diabet Med. 1998;15: 539553. 12.
Lukács K, Hermann R. Az 1-es típusú diabetes mellitus genetikai háttere, patogenezise és a legújabb prevenciós kutatások helyzete. Gyermekgyógyászati Továbbképző Szemle, 2007;2: 51-62.
13.
Redondo MJ, Eisenbarth GS. Genetic control of autoimmunity in type I diabetes and associated disorders. Diabetologia. 2002;45: 605-22.
14.
Hermann R, Laine AP, Veijola R, Vahlberg T, Simell S, Lahde J, Simell O, Knip M, Ilonen J. The effect of HLA class II, insulin and CTLA4 gene regions on the development of humoral beta cell autoimmunity. Diabetologia. 2005;48: 1766-1775.
15.
Hermann R, Bartsocas CS, Soltész G, Vazeou A, Paschou P, Bozas E, Malamitsi-Puchner A, Simell O, Knip M, Ilonen J. Genetic screening for individuals at high risk for type 1 diabetes in the general population using HLA class II alleles as disease markers. A comparison between three European populations with variable rates of disease incidence. Diabetes Metab Res Rev. 2004;20: 322-29.
16.
Hermann R, Mijovic CH, Rayner M, Croft N, Kelly MA, Jenkins D, Soltész G, Barnett AH. HLA alleles and IDDM in children in Hungary: a comparison with Finland. Hum Imunol. 2001;62: 391-398.
17.
Zavattari P, Lampis R, Mulargia A, Loddo M, Angius E, Todd JA, Cucca F. Confirmation of the DRB1-DQB1 loci as the major component of IDDM1 in the isolated founder population of sardinia. Hum Mol Genet. 2000;9: 2967-2972.
18.
Hermann R, Turpeinen H, Laine AP, Veijola R, Knip M, Simell O, Sipilä I, Akerblom HK, Ilonen J. HLA DR-DQ encoded genetic determinants of childhood-onset type 1 diabetes in Finland: An analysis of 622 nuclear families. Tissue Antigens. 2003;62: 162-169.
19.
Korányi L, Pánczél P. A diabetes mellitus genetikája. LAM, 2004;14: 495–505.
20.
Cucca F, Lampis R, Frau F, Macis D, Angius E, Masile P, Chessa M, Frongia P, Silvetti M, Cao A, De Virgiliis S, Cngia M. The distribution of DR4 haplotypes in Sardinia suggests a primary association of type I diabetes with DRB1 and DQB1 loci. Hum Immunol. 1995;43: 301-308.
21.
Güvenç S, Kaymakoğlu S, Gürel N, Karşidağ K, Demir K, Dinçer D, Kekik C, Salman S, Yilmaz T, Beşişik F, Cakaloğlu Y. The prevalence of manifest and
63
latent celiac disease in type 1 diabetes mellitus. Turk J Gastroenterol. 2002;13: 103-107. 22.
Mahmud FH, Murray JA, Kudva YC, Zinsmeister AR, Dierkhising RA, Lahr BD, Dyck PJ, Kyle RA, El-Youssef M, Burgart LJ, Van Dyke CT, Brogan DL, Melton LJ 3rd.. Celiac disease in type 1 diabetes mellitus in a North American community: prevalence, serologic screening, and clinical features. Mayo Clin Proc. 2005;80: 1429-34.
23.
Savilahti E, Simell O, Koskimies S, Rilva A, Akerblom HK. CD in insulindependent diabetes mellitus. J Pediatr 1986;108: 690-693.
24.
Cronin CC, Feighery A, Ferriss JB, Liddy C, Shanahan F, Feighery C. High prevalence of coeliac disease among patients with insulin dependent (type I) diabetes mellitus. Am J Gastroenterol 1997;92: 2210-2212.
25.
Houlston RS, Ford D. Genetics of coeliac disease. Q J Med 1996;89: 737-743.
26.
De Vitis I, Ghilranda G, Gasbarrini G. Prevalence of coeliac disease in type I diabetes: a multicentre study. Acta Paediatr 1996;Suppl 412: 56-57.
27.
Fraser-Reynolds KA, Butzner JD, Stephure DK, Trussel RA, Scott RB. Use of immunoglobulin A-antiendomysial antibody to screen for CD in North American children with type 1 diabetes. Diabetes Care 1998;21: 1985-1989.
28.
Schober E, Bittmann B, Granditsch G, Huber WD, Huppe A, Jager A, Oberhuber G, Rami B, Reichel G. Screening by anti-endomysium antibody for CD in diabetic children and adolescents in Austria. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2000;30: 391-396.
29.
Ferguson A, Arranz E, O’Mahony S. Clinical and pathological spectrum of coeliac disease – active, silent, latent, potential. Gut 1993;34: 150.
30.
Maki M, Huupponen T, Holm K, Hallström O. Seroconversion of reticulin autoantibodies predicts coeliac disease in 1. Type diabetes mellitus. Gut 1995;36: 239-242.
31.
Sollid L, Thorsby E. HLA susceptibility genes in celiac disease: genetic mapping and role in pathogenesis. Gastroenterology 1993;105: 910–922.
32.
Boudraa G, Hachelaf W, Benbouabdellah M, Belkadi M, Benmansour FZ, Touhami M. Prevalence of coeliac disease in diabetic children and their firstdegree relatives in west Algeria: screening with serological markers. Acta Paediatr Suppl. 1996;412: 58-60.
33.
Schober E, Bittmann B, Granditsch G, Huber WD, Huppe A, Jager A, Oberhuber G, Rami B, Reichel G. Screening by anti-endomysium antibody for 64
CD in diabetic children and adolescents in Austria. J Pediatr Gastroenterol Nutr 2000;30: 391-396. 34.
Verge CF, Howard NJ, Rowley MJ, Mackay IR, Zimmet PZ, Egan M,. Hulinska H, Hulinsky I, Silvestrini RA, Kamath S. Anti-glutamate decarboxylase and other antibodies at the onset of childhood 1TDM: a population-based study. Diabetologia 1994;37: 1113-1120.
35.
Sumnik Z, Kolouskova S, Cinek O, Kotalova R, Vavrinec J, Snajderova M. HLA –DQA1*05-DQB1*0201 positivity predisposes to coeliac disease in Czech diabetic children. Acta Paediatr 2000; 89: 1426-1430.
36.
Saukkonen T, Savilahti E, Reijonen H, Ilonen J, Tuomilehto-Wolf E, Akerblom HK. Coeliac disease: frequent occurrence after clinical onset of insulindependent diabetes mellitus. Childhood Diabetes in Finland Study Group. Diab Med 1996;13: 464-470.
37.
Koletzko S, Burgin-Wolff A, Koletzko B, Knapp M, Burger W, Gruneklee D, Herz G, Ruch W, Thon A, Wendel U. Prevalence of coeliac disease in diabetic children and adolescents: a multicentre study. Eur J Pediatr 1988;148: 113-117.
38.
Not T, Tommasini A, Tonini G, Buratti E, Pocecco M, Tortul C, Valussi M, Crichiutti G, Berti I, Trevisiol C, Azzoni E, Neri E, Torre G, Martelossi S, Soban M, Lenhardt A, Cattin L, Ventura A. Undiagnosed coeliac disease and risk of autoimmune disorders in subjects with type I diabetes mellitus. Diabetologia 2001;44: 151-155.
39.
Carlsson AK, Axelsson IE, Borulf SK, Bredberg AC, Lindberg BA, Sjoberg KG, Ivarsson SA. Prevalence of IgA-antiendomysium and IgA-antigliadin autoantibodies at diagnosis of insulin-dependent diabetes mellitus in Swedish children and adolescents. Pediatrics 1999;103: 1248-1252.
40.
Page SR, Lloyd CA, Hill PG, Peacocc I, Holmes GK. The prevalence of coeliac disease in adult diabetes mellitus. Q J Med. 1994;87: 631-637.
41.
Aktay AN, Lee PC, Kumar V, Parton E, Wyatt DT, Werlin SL. The prevalence and clinical characteristics of CD in juvenile diabetes in Wisconsin. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001;33: 462-465.
42.
Takeda K, Kaisho T, Akira S. Toll-like receptors. Annu Rev Immunol. 2003;21: 335-376.
43.
Underhill DM, Ozinsky A. Toll-like receptors: key mediators of microbe detection. Curr Opin Immunol 2002;14: 103-10.
65
44.
Haynes LM, Moore DD, Kurt-Jones EA, Finberg EW, Anderson LJ, Tripp RA. Involvement of Toll-Like Receptor 4 in Innate Immunity to Respiratory Syncytial Virus. Journal of Virology 2001;75: 10730-7.
45.
Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. Recognition of doublestranded RNA and activation of NF-kappaB by Toll-like receptor 3. Nature. 2001;413: 732-738.
46.
Wang T, Town T, Alexopoulou L, Anderson JF, Fikrig E, Flavell, RA. Toll-like receptor 3 mediates West Nile virus entry into the brain causing lethal encephalitis. Nat Med. 2004;10: 1366-1373.
47.
Cario E. Bacterial interactions with cells of the intestinal mucosa: toll-like receptors and NOD2. Gut. 2005;54: 1182-1193.
48.
Kirschning CJ, Schumann RR. TLR2: cellular sensor for microbial and endogenous molecular patterns. Curr Top Microbiol Immunol. 2002;270: 121144.
49.
Muzio M, Bosisio D, Polentarutti N, D'amico G, Stoppacciaro A, Mancinelli R, van't Veer C, Penton-Rol G, Ruco LP, Allavena P, Mantovani A. Differential expression and regulation of Toll-like receptors (TLR) in human leukocytes: selective expression of TLR3 in dendritic cells. J Immunol. 2000;164: 59986004.
50.
McCurdy JD, Olynych TJ, Maher LH, Marshall JS. Cutting edge: distinct Tolllike receptor 2 activators selectively induce different classes of mediator production from human mast cells. J Immunol. 2003;170: 1625-1629.
51.
Cario E, Podolsky DK. Differential alteration in intestinal epithelial cell expression of Toll-like receptor 3 (TLR3) and TLR4 in inflammatory bowel disease. Infect Immun. 2000;68: 7010-7017.
52.
Pivarcsi A, Bodai L, Rethi B, Kenderessy-Szabo A, Koreck A, Szell M, Beer Z, Bata-Csorgoo Z, Magocsi M, Rajnavolgyi E, Dobozy A, Kemeny L. Expression and function of Toll-like receptors 2 and 4 in human keratinocytes. Int Immunol. 2003;15: 721-730.
53.
Faure E, Thomas L, Xu H, Medvedev A, Equils O, Arditi M. Bacterial lipopolysaccharide and IFN-gamma induce Toll-like receptor 2 and Toll-like receptor 4 expression in human endothelial cells: role of NF-kappa B activation. J Immunol. 2001;166: 2018-2024.
66
54.
Kielian T, Mayes P, Kielian M. Characterization of microglial responses to Staphylococcus aureus: effects on cytokine, costimulatory molecule, and Tolllike receptor expression. J Neuroimmunol. 2002;130: 86-99.
55.
Vabulas RM, Ahmad-Nejad P, da Costa C, Miethke T, Kirschning CJ, Hacker H, Wagner H. Endocytosed HSP60s use Toll-like receptor 2 (TLR2) and TLR4 to activate the toll/interleukin-1 receptor signaling pathway in innate immune cells. J Biol Chem. 2001;276: 31332-31339.
56.
Asea A, Rehli M, Kabingu E, Boch JA, Bare O, Auron PE, Stevenson MA, Calderwood SK. Novel signal transduction pathway utilized by extracellular HSP70: role of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4. J Biol Chem. 2002;277: 15028-15034.
57.
Ozinsky A, Underhill DM, Fontenot JD, Hajjar AM, Smith KD, Wilson CB, Schroeder L, Aderem A. The repertoire for pattern recognition of pathogens by the innate immune system is defined by cooperation between Toll-like receptors. Proc Natl Acad Sci U S A. 2000;97: 13766-13771.
58.
Iwaki D, Mitsuzawa H, Murakami S, Sano H, Konishi M, Akino T, Kuroki Y. The extracellular Toll-like receptor 2 domain directly binds peptidoglycan derived from Staphylococcus aureus. J Biol Chem. 2002.;277: 24315-24320.
59.
Mitsuzawa H, Wada I, Sano H, Iwaki D, Murakami S, Himi T, Matsushima N, Kuroki Y. Extracellular Toll-like receptor 2 region containing Ser40-Ile64 but not Cys30-Ser39 is critical for the recognition of Staphylococcus aureus peptidoglycan. J Biol Chem. 2001;276: 41350-41356.
60.
Dziarski R. Recognition of bacterial peptidoglycan by the innate immune system. Cell Mol Life Sci. 2003;60: 1793-1804.
61.
Wetzler LM. The role of Toll-like receptor 2 in microbial disease and immunity. Vaccine. 2003;2: S55-S60.
62.
Rock FL, Hardiman G, Timans JC, Kastelein RA, Bazan JF. A family of human receptors structurally related to Drosophila Toll. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95: 588-593.
63.
Edelmann KH, Richardson-Burns S, Alexopoulou L, Tyler KL, Flavell RA, Oldstone MB. Does Toll-like receptor 3 play a biological role in virus infections? Virology. 2004;322: 231-238.
64.
Sen GC, Sarkar SN. Transcriptional signaling by double-stranded RNA: role of TLR3. Cytokine Growth Factor Rev. 2005;16: 1-14.
67
65.
Matsumoto M, Funami K, Tanabe M, Oshiumi H, Shingai M, Seto Y, Yamamoto A, Seya T. Subcellular localization of Toll-like receptor 3 in human dendritic cells. J Immunol. 2003;171: 3154-3162.
66.
Sivori S, Falco M, Della Chiesa M, Carlomagno S, Vitale M, Moretta L, Moretta A. CpG and double-stranded RNA trigger human NK cells by Toll-like receptors: induction of cytokine release and cytotoxicity against tumors and dendritic cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 2004;101: 10116-10121.
67.
Tabeta K, Georgel P, Janssen E, Du X, Hoebe K, Crozat K, Mudd S, Shamel L, Sovath S, Goode J, Alexopoulou L, Flavell RA, Beutler B. Toll-like receptors 9 and 3 as essential components of innate immune defense against mouse cytomegalovirus infection. Proc Natl Acad Sci USA. 2004;101: 3516-3521.
68.
Rudd BD, Burstein E, Duckett CS, Li X, Lukacs NW. Differential role for TLR3 in respiratory syncytial virus-induced chemokine expression. J Virol. 2005;79: 3350-3357.
69.
Guillot L, Le Goffic R, Bloch S, Escriou N, Akira S, Chignard M, Si-Tahar M. Involvement of Toll-like receptor 3 in the immune response of lung epithelial cells to double-stranded RNA and influenza A virus. J Biol Chem. 2005;280: 5571-5580.
70.
Yang E, Shin JS, Kim H, Park HW, Kim MH, Kim SJ, Choi IH. Cloning of TLR3 isoform. Yonsei Med J. 2004;45: 359-361.
71.
Tissari J, Siren J, Meri S, Julkunen I, Matikainen S. IFN-alpha enhances TLR3mediated antiviral cytokine expression in human endothelial and epithelial cells by up-regulating TLR3 expression. J Immunol. 2005;174: 4289-4294.
72.
Wesch D, Beetz S, Oberg HH, Marget M, Krengel K, Kabelitz D. Direct costimulatory effect of TLR3 ligand poly (I:C) on human gamma delta T lymphocytes. J Immunol. 2006;176: 1348-1354.
73.
Tanabe M, Kurita-Taniguchi M, Takeuchi K, Takeda M, Ayata M, Ogura H, Matsumoto M, Seya T Mechanism of up-regulation of human Toll-like receptor 3 secondary to infection of measles virus-attenuated strains. Biochem Biophys Res Commun. 2003;311: 39-48.
74.
Kiechl S, Lorenz E, Reindl M, Wiedermann CJ, Oberhollenzer F, Bonora E, et al. Toll-like Receptor 4 Polymorphisms and Atherogenesis N Engl J Med 2002;347: 185-92.
75.
Hausmann M, Kiessling S, Mestermann S, Webb G, Spottl T, Andus T, Scholmerich J, Herfarth H, Ray K, Falk W, Rogler G. Toll-like receptors 2 and 4 68
are up-regulated during intestinal inflammation. Gastroenterology 2002;122: 1987-2000. 76.
Cario E. Bacterial interactions with cells of the intestinal mucosa: toll-like receptors and NOD2. Gut. 2005;54: 1182-1193.
77.
Arbour NC, Lorenz E, Schutte BC, Zabner J, Kline JN, Nones M, Frees K, Watt JL,
Schwartz
DA.
TLR4
mutations
are
associated
with
endotoxin
hyporesponsiveness in humans. Nat. Genet. 2000;25: 187-191. 78.
Bonen DK, Ogura Y, Nicolae DL, Inohara N, Saab L, Tanabe T, Chen FF, Foster SJ, Duerr RH, Brant SR, Cho JH, Nunez G. Crohn’s disease-associated NOD2 variants share a signalling defect in response to lipoplysaccharide and peptidoglycan. Gastroenterology 2003;124: 140-146.
79.
Szebeni B, Szekeres R, Rusai K, Vannay Á, Veres G, Treszl A, Arató A, Tulassay T, Vásárhelyi B. Genetic Polymorphisms of CD14, toll-like receptor 4, and caspase-recruitment domain 15 are not associated with necrotizing enterocolitis in very low birth weight infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2006;42: 27-31.
80.
Jaeckel E, Manns M, Von Herrath M. Viruses and diabetes. Ann N Y Acad Sci 2002;958: 7-25.
81.
Old LJ. Tumor necrosis factor (TNF). Science 1985;230(4726): 630-2.
82.
Wilson AG, Symons JA, McDowell TL, McDevitt HO, Duff GW. Effects of a polymorphism in the human tumor necrosis factor promoter on transcriptional activation. Proc Natl Acad Sci USA 1997;94: 3195-9.
83.
Bouma G, Crusius JB, Oudkerk Pool M, Kolkman JJ, von Blomberg BM, Kostense PJ, et al. Secretion of tumour necrosis factor and lymphotoxin in relation to polymorphisms in the TNF genes and HLA-DR alleles: relevance for inflammatory bowel disease Scand J Immunol 1996;43: 456-63.
84.
Brinkman BM, Huizinga TW, Kurban SS, van der Velde EA, Schreuder GM, Hazes JM, et al. Tumour necrosis factor alpha gene polymorphisms in rheumatoid arthritis: association with susceptibility to, or severity of, disease? Br J Rheumatol 1997;36: 516-21.
85.
Fabris M, Di PE, D'Elia A, Damante G, Sinigaglia L, Ferraccioli G. Tumor necrosis factor-alpha gene polymorphism in severe and mild-moderate rheumatoid arthritis. J Rheumatol 2002;29: 29-33.
86.
Huizinga TW, Westendorp RG, Bollen EL, Keijsers V, Brinkman BM, Langermans JA, et al. TNF-alpha promoter polymorphisms, production and 69
susceptibility to multiple sclerosis in different groups of patients. J Neuroimmunol 1997;72: 149-53. 87.
Vinasco J, Beraun Y, Nieto A, Fraile A, Mataran L, Pareja E, et al. Polymorphism at the TNF loci in rheumatoid arthritis. Tissue Antigens 1997;49: 74-8.
88.
Hohler T, Kruger A, Gerken G, Schneider PM, Meyer zum Buschenefelde KH, Rittner C. A tumor necrosis factor-alpha (TNF-alpha) promoter polymorphism is associated with chronic hepatitis B infection. Clin Exp Immunol 1998;111: 57982.
89.
Hohler T, Kruger A, Gerken G, Schneider PM, Meyer zum Buschenfelde KH, Rittner C. Tumor necrosis factor alpha promoter polymorphism at position -238 is associated with chronic active hepatitis C infection. J Med Virol 1998;54: 173-7.
90.
Pociot F, D'Alfonso S, Compasso S, Scorza R, Richiardi PM. Functional analysis of a new polymorphism in the human TNF alpha gene promoter. Scand J Immunol 1995;42: 501-4.
91.
Kataoka S, Satoh J, Fujiya H, Toyota T, Suzuki R, Itoh K, Kumagai K. Immunologic aspects of the nonobese diabetic (NOD) mouse. Abnormalities of cellular immunity. Diabetes 1983;32: 247-53.
92.
Nakhooda AF, Like AA, Chappel CI, Wei CN, Marliss EB. The spontaneously diabetic Wistar rat (the "BB" rat). Studies prior to and during development of the overt syndrome. Diabetologia 1978;14: 199-207.
93.
Pociot F, Wilson AG, Nerup J, Duff GW. No independent association between a tumor necrosis factor-alpha promotor region polymorphism and insulindependent diabetes mellitus. Eur J Immunol 1993;23: 3050-3.
94.
Cox A, Gonzalez AM, Wilson AG, Wilson RM, Ward JD, Artlett CM, Welsh K, Duff GW. Comparative analysis of the genetic associations of HLA-DR3 and tumour necrosis factor alpha with human IDDM. Diabetologia 1994;37: 500-3.
95.
Deng GY, Maclaren NK, Huang HS, Zhang LP, She JX. No primary association between the 308 polymorphism in the tumor necrosis factor alpha promoter region and insulin-dependent diabetes mellitus. Hum Immunol 1996;45:137-42.
96.
Ferrero E, Hsieh CL, Francke U, Goyert SM. CD14 is a member of the family of leucine-rich proteins and is encoded by a gene syntenic with multiple receptor genes. J Immunol. 1990;145: 331-336.
70
97.
Haziot A, Chen S, Ferrero E, Low MG, Silber R, Goyert SM. The monocyte differentiation antigen, CD14, is anchored to the cell membrane by a phosphatidylinositol linkage. J Immunol. 1988;141: 547-552.
98.
Ziegler-Heitbrock HW, Ulevitch RJ. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 1993;14: 121-125.
99.
Jersmann HP. Time to abandon dogma: CD14 is expressed by non-myeloid lineage cells. Immunol Cell Biol. 2005;83: 462-467.
100.
Labeta MO, Durieux JJ, Fernandez N, Herrmann R, Ferrara P. Release from a human monocyte-like cell line of two different soluble forms of the lipopolysaccharide receptor, CD14. Eur J Immunol. 1993;23: 2144-2151.
101.
Le-Barillec K, Si-Tahar M, Balloy V, Chignard M. Proteolysis of monocyte CD14 by human leukocyte elastase inhibits lipopolysaccharide-mediated cell activation. J Clin Invest. 1999;103: 1039-1046.
102.
Bazil V, Baudys M, Hilgert I, Stefanova I, Low MG, Zbrozek J, Horejsi V. Structural relationship between the soluble and membrane-bound forms of human monocyte surface glycoprotein CD14. Mol Immunol. 1989;26: 657-662.
103.
Cauwels A, Frei K, Sansano S, Fearns C, Ulevitch R, Zimmerli W, Landmann R. The origin and function of soluble CD14 in experimental bacterial meningitis. J Immunol. 1999;162: 4762-4772.
104.
Landmann R, Ludwig C, Obrist R, Obrecht JP. Effect of cytokines and lipopolysaccharide on CD14 antigen expression in human monocytes and macrophages. Cell Biochem. 1991;47: 317-329.
105.
Landmann R, Muller B, Zimmerli W. CD14, new aspects of ligand and signal diversity. Microbes Infect. 2000;2: 295-304.
106.
Wright SD, Ramos RA, Tobias PS, Ulevitch RJ, Mathison JC. CD14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein. Science. 1990;249: 1431-1433.
107.
Heumann D, Roger T. Initial responses to endotoxins and Gram-negative bacteria. Clin Chim Acta. 2002;323: 59-72.
108.
Dziarski R, Ulmer AJ, Gupta D. Interactions of CD14 with components of grampositive bacteria. Chem Immunol. 2000;74: 83-107.
109.
Lee JD, Kravchenko V, Kirkland TN, Han J, Mackman N, Moriarty A, Leturcq D, Tobias PS, Ulevitch RJ. Glycosyl-phosphatidylinositol-anchored or integral membrane forms of CD14 mediate identical cellular responses to endotoxin. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90: 9930-9934. 71
110.
Hailman E, Lichenstein HS, Wurfel MM, Miller DS, Johnson DA, Kelley M, Busse LA, Zukowski MM, Wright SD. Lipopolysaccharide (LPS)-binding protein accelerates the binding of LPS to CD14. J Exp Med. 1994;179: 269-277.
111.
Lamping N, Dettmer R, Schroder NW, Pfeil D, Hallatschek W, Burger R, Schumann RR. LPS-binding protein protects mice from septic shock caused by LPS or gram-negative bacteria. J Clin Invest. 1998;101: 2065-2071.
112.
Tobias PS, Soldau K, Gegner JA, Mintz D, Ulevitch RJ. Lipopolysaccharide binding protein-mediated complexation of lipopolysaccharide with soluble CD14. J Biol Chem. 1995;270: 10482-10488.
113.
Frey EA, Miller DS, Jahr TG, Sundan A, Bazil V, Espevik T, Finlay BB, Wright SD. Soluble CD14 participates in the response of cells to lipopolysaccharide. J Exp Med. 1992;176: 1665-1671.
114.
Pugin J, Schurer-Maly CC, Leturcq D, Moriarty A, Ulevitch RJ, Tobias PS. Lipopolysaccharide activation of human endothelial and epithelial cells is mediated by lipopolysaccharide-binding protein and soluble CD14. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993;90: 2744-2748.
115.
Jin Y, Gupta D, Dziarski R. Endothelial and epithelial cells do not respond to complexes of peptidoglycan with soluble CD14 but are activated indirectly by peptidoglycan-induced tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1 from monocytes. J Infect Dis. 1998;177: 1629-1638.
116.
Dziarski R, Viriyakosol S, Kirkland TN, Gupta D. Soluble CD14 enhances membrane CD14-mediated responses to peptidoglycan: structural requirements differ from those for responses to lipopolysaccharide. Infect Immun. 2000;68: 5254-5260.
117.
Haziot A, Rong GW, Lin XY, Silver J, Goyert SM. Recombinant soluble CD14 prevents mortality in mice treated with endotoxin (lipopolysaccharide). J Immunol. 1995;154: 6529-6532.
118.
Haziot A, Rong GW, Bazil V, Silver J, Goyert SM. Recombinant soluble CD14 inhibits LPS-induced tumor necrosis factor-alpha production by cells in whole blood. J Immunol. 1994;152: 5868-5876.
119.
Haziot A, Ferrero E, Kontgen F, Hijiya N, Yamamoto S, Silver J, Stewart CL, Goyert SM. Resistance to endotoxin shock and reduced dissemination of gramnegative bacteria in CD14-deficient mice. Immunity. 1996;4: 407-414.
120.
Walker-Smith JA, Guandalini S, Schmitz J, Schmerling D, Visakorpi JK. Revised criteria for diagnosis of coeliac disease. Report of Working Group of 72
European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition. Arch Dis Child. 1990;65: 909-911. 121.
Kolho KL, Savilahti E. IgA endomysium antibodies on human umbilical cord: an excellent diagnostic tool for CD in childhood. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1997;24: 563-567.
122.
Savilahti E, Örmala T, Arató A, Hacsek G, Holm K, Klemola T, Nemeth A, Maki M, Reunala T. Density of gamma/delta T cells in the jejunal epithelium of patients with coeliac disease and dermatitis herpetiformis is increased with age. Clin Exp Immunol 1997,109: 464-467.
123.
Strehlau J, Pavlakis M, Lipman M, Shapiro M, Vasconcellos L, Harmon W, Strom TB. Quantitative detection of immune activation transcripts as a diagnostic tool in kidney transplantation. Proc Nat Acad Sci USA. 94: 1997; 695-700.
124.
Lorenz E, Frees KL, Schwartz DA. Determination of the TLR4 genotype using allele-specific PCR. Biotechniques. 2001;31: 22-24.
125.
Eng HL, Wang CH, Chen CH, Chou MH, Cheng CT, Lin TM. A CD14 promoter polymorphism is associated with CD14 expression and Chlamydiastimulated TNF alpha production. Genes Immun. 2004;5: 426-430.
126.
Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 1988;16: 1215.
127.
Szalai C, Füst G, Duba J. Association of polymorphism and allelic combinations in the tumour necrosis factor--complement MHC region with coronary artery disease. J Med genet 2002:39; 46-51.
128.
Carlsson AK, Axelsson IE, Borulf SK, Bredbert AC, Ivarsson SA. Serological screening for celiac disease in healthy 2.5- year-old children in Sweden. Pediatrics 2001;107: 42–45.
129.
Catassi C, Ratsch IM, Fabiani E, Rossini M, Bordicchia F, Candela F, Coppa GV, Giorgi PL. Coeliac disease in the year 2000: exploring the iceberg. Lancet 1994;343: 200–203.
130.
Korponay-Szabo IR, Kovacs JB, Czinner A, Goracz G, Vamos A, Szabo T High prevalence of silent celiac disease in preschool children screened with IgA/IgG antiendomysium antibodies. J Pediatr Gastroenterol Nutr 1999;28: 26– 30.
73
131.
Sigurs N, Johansson C, Elfstrand PO, Viander M, Lanner A. Prevalence of coeliac disease in diabetic children and adolescents in Sweden. Acta Paediatr 1993;82: 748–75l.
132.
Troncone R, Greco L, Mayer M, Paparo F, Caputo N, Micillo M, Mugione P, Auricchio S. Latent and potential coeliac disease. Acta Paediatr Suppl 1996;412: 1–4.
133.
Maki M, Holm K, Collin P, Savilahti E. Increase in gamma/delta T cell receptor bearing lymphocytes in normal small bowel mucosa in latent coeliac disease. Gut 1991;32: 1412–1414.
134.
Savilahti E, Arato A, Verkasalo M. Intestinal gamma/delta bearing T lymphocytes in coeliac disease and inflammatory bowel disease in children. Constant increase in coeliac disease. Pediatr Res 1990;28: 579–581.
135.
Kokkonen J, Holm K, Karttunen TJ, Maki M. Children with untreated food allergy express a relative increment in the density of duodenal gammadelta+ T cells. Scand J Gastroenterol 2000;35: 1137–1142.
136.
Sanchez-Albisua I, Wolf J, Neu A, Geiger H, Wäscher I, Stern M. Coeliac disease in children with Type 1 diabetes mellitus: the effect of the gluten-free diet. Diabet Med. 2005;22: 1079-82.
137.
Valerio G, Maiuri L, Troncone R, Buono P, Lombardi F, Palmieri R, Franzese A. Severe clinical onset of diabetes and increased prevalence of other autoimmune diseases in children with coeliac disease diagnosed before diabetes mellitus. Diabetologia. 2002;45: 1719-22.
138.
Rami B, Sumnik Z, Schober E, Waldhör T, Battelino T, Bratanic N, Kürti K, Lebl J, Limbert C, Madacsy L, Odink RJ, Paskova M, Soltesz G. Screening detected celiac disease in children with type 1 diabetes mellitus: effect on the clinical course (a case control study). J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2005;41: 317-21.
139.
Sategna-Guidetti C, Grosso S, Pulitano R, Benaduce E, Dani F, Carta Q. Celiac disease and insulin-dependent diabetes mellitus. Screening in an adult population. Dig Dis Sci 1994;39: 1633–1637.
140.
Shanahan F, Mckenna R, McCarthy CF, Drury MI. Coeliac disease and diabetes mellitus: a study of 24 patients with HLA typing. Q J Med 1982;51: 329–335.
141.
Walsh CH, Cooper BT, Wright AD, Malins JM, Cooke WT. Diabetes mellitus and coeliac disease: a clinical study. Q J Med 1978;47: 89–100.
74
142.
Shan L, Molberg O, Parrot I, Hausch F, Filiz F, Gray GM, Sollid LM, Khosla C. Structural basis for gluten intolerance in celiac sprue. Science 2002;297: 221820.
143.
Fehniger TA, Caligiuri MA. Interleukine 15: biology and relevance to human disease. Blood. 2001;97: 14-32.
144.
Bashir ME, Louie S, Shi HN, Nagler-Anderson C. Toll-like receptor 4 signaling by intestinal microbes influences susceptibility to food allergy. J Immunol. 2004;172: 6978-6987.
145.
Selby WS, Painter D, Collins A, Faulkner-Hogg KB, Loblay RH. Persistent mucosal abnormalities in coeliac disease are not related to the ingestion of trace amounts of gluten. Scand J Gastroenterol. 1999;34: 909-914.
146.
Olaussen RW, Johansen FE, Lundin KE, Jahnsen J, Brandtzaeg P, Farstad IN. Interferon-gamma-secreting T cells localize to the epithelium in coeliac disease. Scand J Immunol. 2002;56: 652-664.
147.
Kaneko M, Mizunuma T, Takimoto H, Kumazawa Y. Development of TCR alpha beta CD8 alpha alpha intestinal intraepithelial lymphocytes is promoted by interleukin-15-producing epithelial cells constitutively stimulated by gramnegative bacteria via TLR4. Biol Pharm Bull. 2004;27: 883-889.
148.
Wesch D, Beetz S, Oberg HH, Marget M, Krengel K, Kabelitz D. Direct costimulatory effect of TLR3 ligand poly (I:C) on human gamma delta T lymphocytes. J Immunol. 2006;176: 1348-1354.
149.
Shrestha N, Ida JA, Lubinski AS, Pallin M, Kaplan G, Haslett PA. Regulation of acquired immunity by gamma delta T-cell/dendritic-cell interactions. Ann N Y Acad Sci. 2005;1062: 79-94.
150.
Kagnoff MF, Paterson YJ, Kumar PJ, Kasarda DD, Carbone FR, Unsworth DJ, Austin RK. Evidence for the role of a human intestinal adenovirus in the pathogenesis of coeliac disease. Gut. 1987;28: 995-1001
151.
Mahon J, Blair GE, Wood GM, Scott BB, Losowsky MS, Howdle PD. Is persistent adenovirus 12 infection involved in coeliac disease? A search for viral DNA using the polymerase chain reaction. Gut. 1991;10: 1114-1116.
152.
Hubacek JA, Rothe G, Pit'ha J, Skodová Z, Stanĕk V, Poledne R, Schmitz G. C260
T polymorphism in the promoter of the CD14 monocyte receptor gene as a
risk factor for myocardial infarction. Circulation 1999;99: 3218-3220. 153.
Klöting N, Klöting I, Jack RS. CD14 triggers autoimmune type 1 diabetes in the NOD mouse. Diabetologia 2004;47: 151-152. 75
154.
Devitt A, Moffatt OD, Raykundalia C, Capra JD, Simmons DL, Gregory CD. Human CD14 mediates recognition and phagocytosis of apoptotic cells. Nature 1998;392:505–9.
155.
Schlegel RA, Krahling S, Callahan MK, Williamson P. CD14 is a component of multiple recognition systems used by macrophages to phagocytose apoptotic lymphocytes. Cell Death Differ. 1999;6:583–92.
156.
Fadok VA, Warner ML, Bratton DL, Henson PM. CD36 is required for phagocytosis of apoptotic cells by human macrophages that use either a phosphatidylserine receptor or the vitronectin receptor (alpha v beta 3). J Immunol 1998;161:6250–7.
157.
Moffatt OD, Devitt A, Bell ED, Simmons DL, Gregory CD. Macrophage recognition of ICAM-3 on apoptotic leukocytes. J Immunol 1999;162:6800–10.
158.
Albert ML, Sauter B, Bhardwaj N. Dendritic cells acquire antigen from apoptotic cells and induce class I-restricted CTLs. Nature 1998;392:86–9.
159.
Ronchetti A, Rovere P, Iezzi G, Galati G, Heltai S, Protti MP, Garancini MP, Manfredi AA, Rugarli C, Bellone M. Immunogenicity of apoptotic cells in vivo: role of antigen load, antigen-presenting cells and cytokines. J Immunol 1999;163:130–6.
160.
Rey Nores JE, Bensussan A, Vita N, Stelter F, Arias MA, Jones M, Lefort S, Borysiewicz LK, Ferrara P, Labéta MO. Soluble CD14 acts as a negative regulator of human T cell activation and function. Eur J Immunol 1999;29:265– 76.
161.
O'Neill LAJ, Dinarello CA. The IL-1 receptor / toll-like receptor superfamily: crucial receptors for inflammation and host defence. Immunol Today 2000;21:206-209.
162.
Holmes GKT. Coeliac disease and type 1 diabetes mellitus – the case for screening. Diabetes 2001;18:169–177.
163.
de la Concha EG, Fernández-Arquero M, Vigil P, Rubio A, Maluenda C, Polanco I, Fernandez C, Figueredo MA. Coeliac disease and TNF promoter polymorphisms.Hum Immunol 2000;61: 513–517.
164.
Kaijzel EL, van Krugten MV, Brinkman BM, Huizinga TW, van der Straaten T, Hazes JM, Ziegler-Heitbrock HW, Nedospasov SA, Breedveld FC, Verweij CL. Functional analysis of a human tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) promoter polymorphism related to joint damage in rheumatoid arthritis. Mol Med 1998;4: 724–733. 76
165.
Höhler T, Kruger A, Gerken G, Schneider PM, Meyer zum Büschenefelde KH, Rittner C. A tumour necrosis factor-alpha (TNF-alpha) promoter polymorphism is associated with chronic hepatitis B infection. Clin Exp Immunol 1998;111:579–582.
166.
Höhler T, Kruger A, Gerken G, Schneider PM, Meyer zum Büschenefelde KH, Rittner C. Tumour necrosis factor-alpha promoter polymorphism at position 2238 is associated with chronic active hepatitis C infection. J Med Virol 1998;54: 173–177.
167.
Thorsby E. Invited anniversary review: HLA associated diseases. Hum Immunol 1997;53:1–11.
168.
Koeleman BPC, Lie BA, Undlien DE, Dudbridge F, Thorsby E, de Vries RR, Cucca F, Roep BO, Giphart MJ, Todd JA. Genotype effects and epistasis in type 1 diabetes and HLA-DQ trans dimer associations with disease. Genes Immun 2004;5:381–388.
169.
Sumnik Z, Cinek O, Bratanic N, Kordonouri O, Kulich M, Roszai B, Arato A, Lebl J, Soltesz G, Danne T, Battelino T, Schober E. Risk of celiac disease in children with type 1 diabetes is modified by positivity for HLA-DQB1*02DQA1*05 and TNF -308A. Diabetes Care. 2006;29(4):858-63.
170.
Contreas G, Valletta E, Ulmi D, Cantoni S, Pinelli L. Screening of coeliac disease in north Italian children with type 1 diabetes: limited usefulness of HLADQ typing. Acta Paediatr. 2004;93(5):628-32.
171.
Doolan A, Donaghue K, Fairchild J, Wong M, Williams AJ. Use of HLA typing in diagnosing celiac disease in patients with type 1 diabetes. Diabetes Care. 2005;28(4):806-9.
172.
Bao F, Yu L, Babu S. One third of HLA DQ2 homozygous patients with type 1 diabetes express celiac disease-associated transglutaminase autoantibodies. J Autoimmun. 1999;13(1):143-8.
77
SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE Az értekezés témájában megjelent nemzetközi közlemények 1. Dezsőfi A, Szebeni B, Hermann CS, Kapitány A, Veres G, Sipka S, Körner A, Madácsy L, Korponay-Szabó I, Rajczy K, Arató A. Frequencies of genetic polymorphisms of TLR4 and CD14 and of HLA-DQ genotypes in children with celiac disease, type 1 diabetes mellitus, or both. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2008;47(3):283-7 IF: 2.102
2. Arató A, Körner A, Veres G, Dezsőfi A, Ujpál I, Madácsy L.: Frequency of coeliac disease in Hungarian children with type 1 diabetes mellitus. Eur J Pediatr. 2003;162, 1-5. IF: 1,157
3. Szebeni B, Veres G, Dezsőfi A, Rusai K, Vannay Á, Bokodi G, Vásárhelyi B, Korponay-Szabó IR, Tulassay T, Arató A. Increased mucosal expression of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 in coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2007;45(2):187-93. IF: 2.102
4. Hermann Cs, Krikovszky D, Vásárhelyi B, Dezsőfi A, Madácsy L. Polymorphisms of the TNF-a gene and risk of celiac disease in T1DM children. Pediatric Diabetes 2007;8:138-141. IF:2,314
Az értekezés témájában megjelent magyar nyelvű közlemények
1. Szebeni B, Dezsőfi A, Veres G, Rusai K, Vannay Á, Bokodi G, Arató A. Tollszerű receptor 2 (TLR2)-, TLR3- és TLR4-expresszió cöliákiás gyermekek vékonybél-nyálkahártyájában. Gyermekgyógyászat. 2006;57: 299-306.
2. Dezsőfi A, Krikovszky D, Kapitány A, Szebeni B, Veres G, Sipka S, Körner A, Madácsy L, Korponay-Szabó I, Arató A. Az egyes HLA-DQ allélok gyakorisága 1-es
típusú
diabetesben
és
coeliakiában
Gyermekgyógyászat. 2006;57: 287-291.
Az értekezés témájában megjelent nemzetközi absztraktok 78
szenvedő
gyermekekben.
1. Arató A, Krikovszky D, Dezsőfi A, Veres G, Treszl A, Vásárhelyi B, Madácsy L. Tumor necrosis factor alpha gene G-308A and G-238A polymorphism and risk of celiac disease in type 1 diabetic children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2003;36: 6.
2. Dezsőfi A, Szebeni B, Krikovszky D, Veres G, Körner A, Kapitány A, Korponay-Szabó I, Arató A. Genetic characteristics of innate and adaptive immunity in coeliac disease. Z Gastroenterol. 2006;43: 417.
3. Dezsőfi A, Szebeni B, Krikovszky D, Veres G, Körner A, Kapitány A, Korponay-Szabó I, Arató A. Studying of genetic polymorphisms of TLR4 and CD14 and the frequencies of different HLA-DQ alleles in children with coeliac disease, type 1 diabetes and with the coexistance of both disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2006;42: E15.
4. Szebeni B, Veres G, Dezsőfi A, Vannay Á, Rusai K, Szőnyi L, Vásárhelyi B, Arató A. Mucosal expression of Toll-like receptors (TLR2, TLR3 and TLR4) in children with coeliac disease. Z Gastroenterol. 2005;43: 514.
5. Szebeni B, Veres G, Dezsőfi A, Vannay Á, Rusai K, Szőnyi L, Vásárhelyi B, Arató A. Increased toll-like receptor (TLR2 and TLR4) expression in the small intestinal mucosa of children with coeliac disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2005;40: 633.
6. Szebeni B, Veres G, Dezsőfi A, Vannay Á, Vásárhelyi B, Korponay-Szabó I, AratóA. Increased mucosal expression of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 in treated coeliac disease. Z Gastroenterol 2007;44: 446.
Más témában nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények
1. Szebeni B, Veres G, Dezsőfi A, Rusai K, Vannay A, Mraz M, Majorova E,
Arató A. Increased expression of Toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4 in the colonic mucosa of children with inflammatory bowel disease. Clin Exp Immunol. 2008;151(1):34-41. IF: 2.599
79
2. Bontemps P, Devaster JM, Corvaglia L, Dezsőfi A, van den Borre C, Goutier S, Butzler JP, Cadranel S.: Twelve year observation of primary and secondary antibiotic resistant Helicobacter pylori strains in children. Pediatr Infect Dis J. 2001;11:1033-1038. IF: 2.289
Más témában nemzetközi folyóiratban megjelent absztraktok
1. Dezsőfi A, Bontems P, Devaster JM, Cadranel S. Acquired resistance of Helicobacter pylori strains. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 1999;28(5):552.
2. Rákóczy Gy, Dezsőfi A, Tóth T. Possibility of transmissible infection of Helicobacter pylori during endoscopy. Z Gastroenterol. 1999;37: 403-458.
3. Dezsőfi A, Bontems P, Devaster JM, Cadranel S. Acquired resistance of Helicobacter pylori strains. Z Gastroenterol. 1999;37: 403-458.
4. Veres G, Kokkonen J, Dezsőfi A, Arató A, Savilahti E. Expression of cytokines and adhesion molecules in duodenal mucosa of children with foodhypersensitivity. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2001;32: 377. 5. Veres G, Kokkonen J, Dezsõfi A, Arató A, Savilahti E. Increased expression of interferon-gamma in duodenal mucosa of children with food hypersensitivity. Z Gastroenterol. 2001;39: 429.
6. Veres G, Héninger E, Dezsőfi A, Lázár-Molnár E, Dérfalvi B, Tulassay T, Arató A. The effect of histamine for production of IL-18 and TNF alpha on ex vivo peripherial blood mononuclear cell cultures derived from pediatric patients with Crohn’s disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2003;36: 146.
7. Dezsőfi A, Ruzsovics A, Molnar B, Veres G, Tulassay T, Tulassay Z. Characteristics of proliferative and apoptotic activity in the antral mucosa of children with Helicobacter pylori infection. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2003;36: 30.
80
8. Veres G, Reusz Gy, Sallay P, Dezsőfi A, Szőnyi L, Varga T, Arató A, Tulassay T. Increased expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1) and Ki67 proliferation marker in the antral mucosa of children with Helicobacter pylori infection after kidney transplantation. Nephr Dial Transplant. 2003;18: Suppl 4, W871.
9. Veres G, Dezsőfi A, Szőnyi L, Sallay P, Reusz Gy, Varga T, Arató A. Expression of ICAM-1 and Ki-67 proliferation marker in the antral mucosa of children with Helicobacter pylori infection after kidney transplantation. Z Gastroenterol. 2003;5: 465.
10. Szebeni B, Treszl A, Rusai K, Veres G, Dezsőfi A, Vásárhelyi B, Arató A. Genetic polymorphisms of toll-like receptor 4 in very low birth weight infants with necrotizing enterocolitis. Z Gastroenterol. 2004;42: 441.
11. Arató A, Dezsőfi A, Bodánszky H, Veres G, Kocsis I, Szönyi L, Vásárhelyi B.: H+/K+-ATPase and Na+/K+-ATPase enzyme activities of gastric mucosa in children with epigastric pain caused by helicobacter pylori infection and reflux oesophagitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2004;(39) Suppl 1: S85-S86.
12. Veres G, Dezsőfi A, Bodanszky H, Szonyi L, Reusz G, Sallay P, Arato A.: How does helicobacter pylori infection is influenced by immunosuppressive therapy? J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2004;(39)Suppl 1:S162-S163.
13. Veres G, Dezsőfi A, Bodánszky H, Szőnyi L, Arató A. How can autism be cured with diet? Z Gastroenterol. 2004;42 :178.
14. Szebeni B, Veres G, Dezsőfi A, Rusai K, Vannay A, Treszl A, Vasarhelyi B, Arato A.: Genetic polymorphisms of TLR4 and CARD15 are not associated with necrotising enterocolitis in very low birth weight infants. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2005;40(5):654.
15. Szebeni B, Mraz M, Veres G, Dezsőfi A, Vannay Á, Vásárhelyi B, Majorova E, Arató A. Increased expression of toll-like receptor (TLR) 2 and TLR4
81
expression in the colonic mucosa of children with active inflammatory bowel disease. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2006;42: E29.
16. Szebeni B, Mraz M, Veres G, Dezsőfi A, Vannay Á, Vásárhelyi B, Majorova E, Arató A. Toll-like receptor (TLR) 2, TLR3 and TLR4 expression in active IBD. Z Gastroenterol. 2006;44: 446.
17. Veres G, Szebeni B, Mraz M, Dezsőfi A, Vannay A , Vásárhelyi B, Majorova E, Arató A. Expression of mRNA and Protein of Toll-like Receptors 2 and 4 Are Upregulated in Children with IBD.
J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2006;43
Suppl 2:S14.
18. Dezsőfi A, Görög D, Kóbori L, Veres G, Bodánszky H, Arató A, Szőnyi L. Treatment of esophageal varices in childhood. Z Gastroenterol. 2007;44, 426.
19. Veres G, Karóckay I, Majorosi A, Magyarosi A, Dezsőfi A, Bodánszky H, Szőnyi L, Arató A. Helicobacter pylori infection in children with idiopathic thrombocytopenic purpura. Helicobacter 2007;4:460.
20. Veres G, Győrffy H, Nagy Szakáll D, Szabó E, Dezsőfi A, Molnár K, Szőnyi L, Bodánszky H, Arató A. Claudins expression in the proximal and distal parts of duodenum in patients with celiac disease. Z Gastroenterol. 2007;44: 450.
21. Veres G, Papp M, Lakatos PL, Arato A, Molnár K, Tornai I, Dezsőfi A, Szőnyi L. Haptoglobin polymorphism in primary sclerosing cholangitis. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 2007;44, suppl 1.
22. Kovács M, Szőnyi L, Dezsőfi A, Davidovics S, Rácz I. Bile duct diseases in infancy and children. Z Gastroenterol. 2008;46: 499, A46.
Más témában megjelent magyar nyelvű közlemények
1. Dezsőfi A, Bókay J, Szőnyi L, Arató A. Májelégtelenség képében jelentkező légzésilánc-betegség. Gyermekgyógyászat. 1997;48 (3): 322-326.
82
2. Dezsőfi A, Szolnoki J, Bánki A, Szőnyi L, Szabó A, Arató A.: Karbamilfoszfát szintetáz defektus szokatlan megjelenési formája. Gyermekgyógyászat. 1999;50 (3): 256-261.
3. Dezsőfi A, Veres G, Bodánszky H, Szőnyi L, Arató A. Fokozott epithelialis sejtproliferáció
Helicobacter
pylori
fertőzött
gyermekekben.
Gyermekgyógyászat. 2002;53 (3): 311-315.
4. Dezsőfi A: Gasztrointesztinális vérzések. Gyermekorvos Továbbképzés 2006;5 (3): 56-62.
5. Dezsőfi A, Veres G, Bodánszky H, Arató A, Szőnyi L. A granulocyta kolóniastimuláló faktor kezelés buktatói I/b típusú glykogenosis betegünkben. Gyermekgyógyászat 2007;58 (5): 417-420.
6. Dezsőfi A, Arató A. Gasztroduodenális megbetegedések gyermekkorban. European Journal of Gastroenterology and Hepatology 2007;11(5): 161-165.
7. Bókay J, Dezsőfi A, Büky B, Csanádi K. Electrogastrographiás vizsgálatok érett újszülöttekben és koraszülöttekben. Gyermekgyógyászat 1998;49 (3): 240-243.
8. Bókay J, Dezsőfi A, Rákóczi Gy, Verebély T. A gyomor myoelektromos tevékenységének változása oesophagus atresia műtéti megoldása után. Gyermekgyógyászat 1999;50 (3): 284-287.
9. Veres G, Dezsőfi A, Kokkonen J, Savilahti E, Arató A. Limfociták “hazatérőhoming” receptorának (alfa4béta7) expressziója ételallergiás felnőttek és gyermekek
duodenum
nyálkahártyájában.
Allergológia
és
Klinikai
Immunológia. 2004;7:161-5.
10. Veres G, Arató A, Dezsőfi A, Bodánszky H, Szőnyi L. Sclerotisalo cholangitis és colitis ulcerosa együttes előfordulása 10 gyermekben. Gyermekgyógyászat 2004;55(4):467-72.
83
11. Veres G, Bodánszky H, Dezsőfi A, Szőnyi L, Nagy G, Arató A. Átmeneti fehérjevesztő enteropathia és Epstein-Barr vírusfertőzés együttes előfordulása egy immunkompetens gyermekben. Orv Hetil. 2004;145(11),579-81.
12. Szőnyi L, Héninger E, Dobos M, Holics K, Újhelyi R, Bodánszky H, Dezsőfi A, Veres G, Vásárhelyi B, Arató A: Az alfa-1-antitripszin fenotípusa nem befolyásolja a mucoviscidozisban kialakuló májbetegséget. Gyermekgyógyászat 2004;55 (5): 578-582.
13. Szőnyi L, Kóbori L, Görög D, Fehérvári I, Balogh L, Arató A, Dezsőfi A, Veres G, Perner F, Járay J, Tulassay T.: Gyermekkori májátültetés Magyarországon 2004-ben. Gyermekgyógyászat 2004;55 (5): 521-525.
14. Vojnisek Zs, Arató A, Bodánszky H, Dezsőfi A, Veres G, Borka K, Glasz T, Nyitrai A, Kis É, Verebély T, Kálmán A, Kiss I, Szőnyi L. Cholangitis sclerotisans és haemobilia együttes előfordulása. Gyermekgyógyászat 2005;56 (5): 275-283.
15. Vojnisek Zs, Arató A, Verebély T, Balogh L, Dezsőfi A, Veres G, Bodánszky H, Szőnyi L. Terápiás eredmények progresszív familiáris intrahepaticus cholestasisban. Gyermekgyógyászat 2006;57 (3): 313-319.
16. Gárdos L, Dezsőfi A, Rubecz I.: Enterális táplálás Crohn–betegségben esetismertetés és irodalmi összefoglaló. Gyermekgyógyászat 2006;57 (3): 326327.
17. Arató A, Veres G, Dezsőfi A. Gastrointestinalis vérzések csecsemő- és gyermekkorban – A Csecsemő- és Gyermekgyógyászati Szakmai Kollégium ajánlása LAM. 2006;16 (4): 345-351.
18. Kovács M, Veres G, Szőnyi L, Dezsőfi A, Bodánszky H, Illyés G, Schaff Z, Arató A. Viscerális myopathia következtében kialakult chronicus intestinalis pseudoobstructio. Orv Hetil. 2007 Jul 15;148 (28):1329-34.
84
19. Veres G, Maka E, Domsa P, Glasz T, Szabó T, Szőnyi L, Dezsőfi A, Bodánszky H, Vojnisek K, Kovács L, Farkas V, Arató A. Gyermekkori antralis és duodenális
fekély
eddig
ismeretlen
oka:
plazminogén-I
hiány.
Gyermekgyógyászat 2007;58 (5): 45-48.
20. Vojnisek Zs, Szőnyi L, Balogh L, Dezsőfi A, Arató A, Burdelski M: Nem minden
az,
aminek
látszik
–
a
familiáris
cholestasisok
genetikája.
Gyermekgyógyászat 2007;58 (5): 314-317.
21. Páli A, Arató A, Dezsőfi A, Cseh Á, Treszl A, Veres G, Szőnyi L. Wilson kór vagy epeúti elzáródás? Gyermekgyógyászat 2007;58 (5): 350-354.
22. Müller K, Arató A, Szőnyi L, Verebély T, Dezsőfi A, Bodánszky H, Horváth Á, Veres G. Recidiváló helicobacter pylori infekció és sebészeti teendőt nem igénylő szabad hasi levegő. Gyermekgyógyászat 2007;58 (5): 367-372.
23. Kovács M, Szabó M, Balogh L, Dezsőfi A, Tóth-Heyn P, Rudas G, Balázs Gy, Várkonyi I, D Bröring, Szőnyi L. Élődonor májtranszplantáció neonatalis haemochromatosisban. Gyermekgyógyászat 2007;58 (5): 345-349.
24. Kovács M, Reusz Gy, Szabó A, Dezsőfi A, Gyűrűs P, Jánoki M, Rácz I. Endoszkópos
vizsgálatokkal
észlelt
vascularis
malformációk
Klippel-
Trenaunay-szindrómában. LAM 2007;17, 419
25. Körner A, Tóth-Heyn P, Dezsőfi A, Veres G, Madácsy L, Arató A. Incidence of thyroid autoimmunity in children with type 1 diabetes mellitus. Orv Hetil. 2008;149(9):401-6.
26. Müller KE, Müller K, Dezsőfi A, Kis E, Máttyus I, Veres G, Arató A, Szőnyi L. Vena portae obstruction as a cause of portal hypertension in a child with Turner syndrome. Orv Hetil. 2008 Jun 8;149(23):1079-84.
27. Nagy Szakál D, Győrffy H, Tőkés AM, Arató A, Dezsőfi A, Veres G. Claudin 2, 3 és 4 expressziója coeliakiás gyermekek proximális és disztális duodenumában. Gyermekgyógyászat 2008;59(5):272-276. 85
28. Molnár K, Papp M, Szőnyi L, Lakatos PL, Tornai I, Földi I, Arató A, Dezsőfi A, Veres G. Haptoglobin polimorfizmus vizsgálata gyermekkori és felnőttkori primer szklerotizáló cholangitisban. Gyermekgyógyászat 2008;59(5):277-281.
29. Veres G és a Magyar Gyermek IBD-regiszter részvevői. A magyarországi gyermekkori gyulladásos bélbetegségek (IBD) regiszterének első éves (2007) elemzése. Gyermekgyógyászat 2008;59(5):282-287.
30. Micskey É, Dezsőfi A, Kalmár Á, Hargitai B. Az eosinophil oesophagitis diagnosztikus és terápiás kihívásai. Gyermekgyógyászat 2008;59(5):288-290.
31. Pintér VP, Győrffy H, Arató A, Dezsőfi A, Molnár K, Veres G. Eosinophil- és allergiás colitises csecsemők laboratóriumi és kolonoszkópiás jellemzői. Gyermekgyógyászat 2008;59(5):291-295. 32. Kovács L, Dezsőfi A, Rusai K, Ferenczi D, Verebély T. Gége-cleft műtéti megoldása. Tüdőgyógyászat 2008;2(11):24-26 33. Szebeni B, Sziksz E, Prókai Á, Gál K, Vannay Á, Cseh Á, Veres G, Dezsőfi A, Korponay-Szabó I, Bodánszky H, Arató A. Fokozott szérum és glükokortikoid regulélt kináz-1 expresszió gyermekkori cöliákiában. Gyermekgyógyászat 2009;60 (1):67-73. 34. Turmezeiné Horváth Judit, Dezsőfi A. Kombinált táplálási terápia alkalmazása az I.sz Gyermekklinikán. Gyermekgyógyászat 2009;60 (1):87-90. 35. Szőnyi L, Dezsőfi A, Balogh L, Fazekas J, Kóbori L. Gyermekkori májátültetés hazai eredményei. Gyermekgyógyászat 2009;60 (1):80-82.
Más témában magyar folyóiratban megjelent absztraktok
1. Veres G, Kokkonen J, Dezsőfi A, Arató A, Savilahti E. Citokinek és adhéziós molekulák expressziója ételallergiás gyermekek duodenális mukózájában. Gyermekgyógyászat 2002;55: suppl.70. 86
2. Veres G, Bodánszky H, Dezsőfi A, Szőnyi L, Nagy G, Arató A. Átmeneti fehérjevesztő enteropátia és Epstein-Barr vírusfertőzés együttes előfordulása egy immunkompetens gyermekben. Gyermekgyógyászat 2002;55: suppl.69.
3. Veres G, Dezsőfi A, Savilahti E, Kokkonen J, Arató A. Limfociták “hazatérőhoming” receptorának (alfa4béta7) expressziója ételallergiás felnőttek és gyermekek
duodenum
nyálkahártyájában.
Allergológiai
és
Klinikai
Immunológia 2003;6(3):121.
4. Dezsőfi A, Heninger E, Veres G, Bodánszky H, Arató A, Szőnyi L. Az alfa 1 antitripszinhiány gyermekkori májbetegségekben. Gyermekgyógyászat. 2003;54: suppl.94.
5. Veres G, Taskinen M, Savilahti E, Dezsőfi A, Bodánszky H, Szőnyi L, Arató A. Hogyan
változik
a
duodenum
immunpatológiája
gyermekkori
immuntranszplantációt követően? Gyermekgyógyászat. 2004;55: 2 suppl.114
6. Vojnisek Zs, Arató A, Bodánszky H, Dezsőfi A, Veres G, Glasz T, Nyitrai A, Verebély T, Szőnyi L. Primer szklerotizáló cholangitis és haemobilia együttes előfordulása. Gyermekgyógyászat. 2006;57: 1 suppl, 80.
Könyvfejezetek
1. Dezsőfi
A.
Gastritisek.
In:
Arató
A,
Szőnyi
L
(szerk.):
Gyermekgasztroenterológia. Medicina, Budapest, 2003; 153-157. 2. Dezsőfi A. A gyomor daganatos megbetegedései. In: Arató A, Szőnyi L (szerk.): Gyermekgasztroenterológia. Medicina, Budapest, 2003; 173-175.
3. Arató A, Veres G, Dezsőfi A. Gastrointestinalis vérzések. In: Tulassay T, Arató A.(szerk): Gyermekgyógyászati Útmutató. Medition Kiadó, 2006; 89-98.
87
4. Szőnyi L, Dezsőfi A. Hyperammonaemia. In: Tulassay T, Szabó A. (szerk.): Gyermekgyógyászati sürgősségi protokollok 1. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2008; 39-40.
5. Arató A, Dezsőfi A. Gastrointestinalis vérzések. In: Tulassay T, Szabó A (szerk.): Gyermekgyógyászati sürgősségi protokollok 1. Semmelweis Kiadó, Budapest, 2008; 45-49.
88
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Elsősorban szeretnék köszönetet mondani Prof. Tulassay Tivadarnak, aki 14 évvel ezelőtt felvett az I.sz Gyermekklinikára, ahol azóta is dolgozom. Nemcsak gyakorló orvosi pályámat támogatta, hanem megteremtette azt a szellemi műhelyt, ahol ez a munka létrejöhetett. Hálás vagyok Prof. Arató Andrásnak, aki pályám eleje óta pártfogásába vett és érdeklődésemet a Gasztroenterológia irányába terelte. Az ő folyamatos segítsége és támogatása volt az alapja, hogy ez a disszertáció megszülethessen. Köszönettel tartozom Dr.Szebeni Beátának, aki a laboratóriumi mérések nagy részét végezte, Dr.Krikovszky Dórának, Dr.Körner Annának, Dr.Hermann Csabának a diebeteses gyermekeknél végzett vizsgálatokban nyújtott segítségért. Nagyon sok hasznos segítséget kaptam Dr. Korponay-Szabó Ilmától, aki a cöliákiás betegek összegyűjtésében, valamint a HLA-DQ vizsgálatok elvégzésében segített. A kontroll minták összegyűjtésében Dr. Rajczy Katalin állt rendelkezésemre, köszönet érte. Köszönöm szépen Dr. Dinya Eleknek és Dr. Bokodi Gézának, hogy segítségemre voltak a statisztikai számítások elvégzésében. Köszönöm a Kutatólabor valamennyi dolgozójának, különösképpen Bernát Máriának a mérések kivitelezésében nyújtott segítségüket. Köszönöm Dr. Szőnyi Lászlónak és Dr. Veres Gábornak baráti támogatásukat és biztatásukat. Végül, de nem utolsósorban hálás vagyok feleségemnek, szüleimnek, gyermekeimnek, nővéremnek, hogy mindvégig támogattak és bátorítottak munkám során.
89
