A sikéralkotó fehérjék bioszintézise és a sikérkomplex reológiai sajátságai

BUDAPESTI MŰSZAKI ÉS GAZDASÁGTUDOMÁNYI EGYETEM VEGYÉSZMÉRNÖKI ÉS BIOMÉRNÖKI KAR OLÁH GYÖRGY DOKTORI ISKOLA

A sikéralkotó fehérjék bioszintézise és a sikérkomplex reológiai sajátságai c. PhD értekezés

Készítette:

Abonyi Tibor okleveles biomérnök

Témavezető:

Prof. Lásztity Radomir professor emeritius

Budapest • 2010

Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

Tartalomjegyzék 1

BEVEZETŐ........................................................................................................................................... 1

2

IRODALMI ÁTTEKINTÉS.................................................................................................................. 2 2.1

A SIKÉRHÁLÓZATOT ALKOTÓ POLIPEPTIDEK KÉMIAI ÖSSZETÉTELE ÉS A BÚZALISZTBŐL KÉSZÜLT SÜTŐIPARI TERMÉKEK MINŐSÉGE KÖZÖTTI ÖSSZEFÜGGÉS KUTATÁSA .............................................................. 2 2.1.1 2.1.2 2.1.3

A sikérhálózatot alkotó polipeptidek oldhatóságának vizsgalata és osztályozása.......................... 2 A monomer gliadin polipeptidek sütőipari minőséget befolyásoló szerepe ................................... 5 A polimer glutenin alegységeinek sütőipari minőséget befolyásoló szerepe.................................. 7

2.1.3.1 2.1.3.2

LMW glutenin alegységek ............................................................................................................... 7 HMW glutenin alegységek............................................................................................................... 9

2.1.4 A gliadin és glutenin tartalékfehérje frakciók arányának minőségmeghatározó szerepe ............. 13 2.2 A SIKÉRALKOTÓ TARTALÉKFEHÉRJÉK BIOSZINTÉZISÉNEK VIZSGÁLATA ........................................... 14 2.2.1 A makrojellemzők változása a szemfejlődés során..................................................................... 14 2.2.2 A sikérhálózatot alkotó polipeptidek bioszintézise és raktározása az endoszperm szövetekben.... 15 2.2.3 A sikérhálózatot alkotó polipeptidek polimerizációja ................................................................ 16 2.2.4 A monomer gliadinok és glutenin makropolimer kölcsönhatásai a sikérképzés során ................. 20 2.3 A SIKÉRHÁLÓZATOT ALKOTÓ POLIPEPTIDEK VIZSGÁLATÁNAK ANALITIKAI MÓDSZEREI .................... 22 2.3.1 A sikérfehérjék elektroforetikus elválasztása ............................................................................. 22 2.3.2 A sikérfehérjék kromatográfiás elválasztása ............................................................................. 24 2.3.2.1 2.3.2.2 2.3.2.3

RP-HPLC...................................................................................................................................... 24 SE-HPLC...................................................................................................................................... 25 Flow Field-Flow frakcionálás (FFF)............................................................................................... 26

2.4 A SIKÉRFEHÉRJÉK HIDRODINAMIKAI TULAJDONSÁGAINAK VIZSGÁLATA .......................................... 27 2.4.1 Makromolekula oldatok viszkozitásának vizsgálata................................................................... 27 2.4.1.1 2.4.1.2 2.4.1.3

A viszkozitás és mérése ................................................................................................................. 27 A fehérjeoldat viszkozitása és a fehérjemolekula mérete illetve alakja közötti összefüggés............... 28 A szárazsikéroldat viszkozitása a glutenin átlagos molekulatömegének függvényében ..................... 29

2.5 A SIKÉRFEHÉRJÉK KOMPLEX RENDSZEREKBEN................................................................................ 30 2.5.1 Pszeudocereáliák: amarantusz és quinoa.................................................................................. 30 2.5.2 Az amarantusz és quinoa tartalékfehérjék hatása a búzalisztből készült tészta reológiai tulajdonságaira ..................................................................................................................................... 31 3

CÉLKITŰZÉS..................................................................................................................................... 32

4

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK........................................................................................................... 33 4.1 ANYAGOK ..................................................................................................................................... 33 4.1.1 A búzaminták eredete és mintavétele......................................................................................... 33 4.1.2 Az amarantusz és quinoa minták eredete................................................................................... 33 4.2 MÓDSZEREK ................................................................................................................................. 34 4.2.1 A búza sikérképző fehérjék (gliadinok és gluteninek) bioszintézisének vizsgálata ....................... 34 4.2.1.1 4.2.1.2 4.2.1.3 4.2.1.4

4.2.2

A búzalisztből képzett sikérpolimer oldatainak vizsgálata az érési folyamat során ..................... 37

4.2.2.1 4.2.2.2 4.2.2.3

4.2.3

A sikér mennyiségi meghatározása................................................................................................. 37 Méretkizárásos- és fordított fázisú folyadékkromatográfia (SE-és RP-HPLC) .................................. 37 A szárazsikérből készült oldatok relatív viszkozitásának meghatározása.......................................... 38

A sikér- és amarantusz illetve quinoa fehérjék kölcsönhatása komplex rendszerben................... 39

4.2.3.1 4.2.3.2

5

Szemtömeg, nedvességtartalom meghatározása .............................................................................. 34 A teljes búzaszemek mintaelőkészítése RP-HPLC méréshez ........................................................... 34 Fordított fázisú folyadékkromatográfiás (RP-HPLC) módszer optimalizálása .................................. 35 Diagonális SDS-PAGE.................................................................................................................. 36

Fehérje izolálás amarantusz és quinoa magokból ............................................................................ 39 Reológiai tulajdonságok vizsgálata................................................................................................. 39

MÉRÉSI EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK ............................................................................... 40 5.1

A BÚZA SIKÉRALKOTÓ TARTALÉKFEHÉRJÉK (GLIADINOK ÉS GLUTENINEK) BIOSZINTÉZISÉNEK VIZSGÁLATA ............................................................................................................................................... 40 5.1.1 5.1.2 5.1.3 5.1.4 5.1.5 5.1.6 5.1.7 5.1.8

A mintavétel körülményei ......................................................................................................... 40 A búza szemkialakulási folyamatának követése ......................................................................... 42 A búzaszem lisztfrakciójának kinyerése..................................................................................... 48 A búzaszem lisztfrakció nyersfehérje mennyiségének meghatározása......................................... 50 A gliadin és glutenin tartalékfehérjék RP-HPLC-val történő elválasztásának optimalizálása ..... 51 A gliadin és glutenin tartalékfehérje alegységek RP-HPLC kromatogramjainak jellemzése........ 57 A gliadin és glutenin tartalékfehérjék és alegységeik bioszintézise............................................. 59 A gliadinok és a monomer glutenin alegységek elválasztása Diagonális SDS-PAGE-vel ............ 67


5.2 A BÚZALISZTBŐL KÉPZETT SZÁRAZSIKÉR OLDATAINAK VIZSGÁLATA A SZEMFEJLŐDÉS SORÁN ......... 69 5.2.1 Sikér- és sikérfehérje-mennyiség meghatározása....................................................................... 69 5.2.2 A sikérfehérjék oldhatóság, méreteloszlás és hidrofóbicitás szerinti vizsgálata .......................... 71 5.2.3 A sikérfehérjék hidrodinamikai vizsgálata................................................................................. 76 5.3 A SIKÉR- ÉS AMARANT ILLETVE QUINOA FEHÉRJÉK KÖLCSÖNHATÁSA KOMPLEX RENDSZERBEN ........ 80 6

ÖSSZEFOGLALÁS............................................................................................................................. 82

7

FELHASZNÁLT IRODALOM........................................................................................................... 85

KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS....................................................................................................................... 97 NYILATKOZAT .......................................................................................................................................... 98 KÖZLEMÉNYEK ........................................................................................................................................ 99


1 Bevezető A búza tartalékfehérjéinek egyedülálló biokémiai tulajdonságainak köszönhető, hogy a búzalisztből készült kenyér a legfontosabb táplálékforrásunkká vált. A hidratált fehérjegél (sikér) nyújthatósága és gázvisszatartása ugyanis, a búza endospermiumában található fehérjék szerkezetéből adódó sajátosságok és egyben a sütőipari tulajdonságok alapja (a liszt vízfelvevő képessége, a kenyérbél lyukacsossága, a kenyér alaktartósága).

A jó minőségű sütőipari termék előállításához a megfelelő sütőipari technológián túl, jó minőségű lisztre van szükség, ami pedig csak jó minőségű búzából készíthető. A búzával szemben támasztott minőségi követelmények a sokoldalú felhasználás miatt eltérőek, ráadásul nem szabad megfeledkezni a mennyiségi követelményekről sem. A végterméktől függően a minőség mást jelent a termelőnek, a molnárnak, a péknek és a fogyasztónak. Minden kategóriára érvényes általános szempont, hogy a minőségi búzatermesztés egyik alapeleme a fajta differenciált, felhasználástól függő megválasztása. A fajta genetikailag meghatározott minősége azonban csak lehetőséget biztosít a jó minőségű búza előállításához. Ugyanazon fajta minősége ugyanis jelentős ingadozást mutathat évjáratonként, míg a feldolgozók és a fogyasztók egyaránt a stabil minőségben érdekeltek.

A sikér kémiai összetételét, szintézisének genetikai hátterét, a potenciálisan jó minőséget biztosító polipeptidek viszonyát egyre jobban ismerjük. Ezeket az ismereteket a nemesítési gyakorlat nagyrészt eredményesen alkalmazza. Tekintve, hogy a minőség ingadozás elsősorban az időjárási viszonyok függvénye, (és a hosszú távú prognózisok a szélsőséges időjárás gyakoriságának növekedését jelzik előre) előtérbe kerülnek a sikérminőség környezetfüggő változásával kapcsolatos kutatások. Nem véletlen, hogy a búzával kapcsolatos EU programokban és az ehhez kapcsolódó hazai „Pannon búza” programban a stabil minőség követelménye az elsők között található.

1 Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

2

Irodalmi áttekintés

2.1 A sikérhálózatot alkotó polipeptidek kémiai összetétele és a búzalisztből

készült

sütőipari

termékek

minősége

közötti

összefüggés kutatása 1728-ban Beccari olasz kutató a búzalisztből készült tészta vízoldható részeinek és keményítő szemcséinek eltávolításával egy homogén kémiai összetételűnek vélt, jellegzetesen rugalmas, nyújtható anyagot fedezett fel (Zanotti & Beccari, 1745). Bő egy évszázaddal a fehérjeszerkezet 1838-as felfedezését megelőzően (Hartley, 1951) még nem is sejthette, hogy ez a nagyrészt tartalékfehérjék keverékéből felépülő komplex anyag 250 évvel a felfedezése után is a gabonakutatók, búzatermesztők, nemesítők, molnárok, pékek érdeklődésének középpontjában fog állni. A gabonanövények közül egyedül a búzában – és jóval kisebb mértékben a tritikáléban – találhatók olyan tartalékfehérjék, amelyek vizes közegben keverés hatására létrejövő kölcsönhatásaik révén rugalmas és nyújtható (viszkoelasztikus) hálózatot, az úgynevezett sikért képesek létrehozni. Ennek a sikérhálózatnak köszönhető, hogy a tésztaélesztést követően kialakulhat a kenyérre és egyéb kelesztett tésztafélékre jellemző minőségű sütőipari termék. A sütőipari minőség fogalma alatt az adott sütőipari termék technológiájának szempontjából meghatározó paraméterek megfelelő értékeit értjük. A búza tartalékfehérjeösszetétele és a sütőipari minőséget meghatározó tészta reológiai tulajdonságai közötti összefüggés széleskörűen kutatott témának számít mind a mai napig.

2.1.1 A sikérhálózatot alkotó polipeptidek oldhatóságának vizsgalata és osztályozása Az érett gabonaszem biológiai szempontból elsősorban tartalék tápanyagokat tartalmaz, amelyek az utódnövény későbbi fejlődésének kezdeti szakaszában szükségesek. Kémiai összetételére általában a nagy keményítőtartalom, jelentős fehérjetartalom, valamint alacsony lipidtartalom jellemző. A gabonafehérjék biokémiai szempontból két csoportra oszthatók: funkcionális-,

és

tartalékfehérjékre.

Az

első

csoportba

tartoznak

az

enzimeket,


sejtorganellumokat, és biológiai membránokat felépítő fehérjék. A tartalékfehérjékhez sorolandók az endoszperm, az aleuronréteg, valamint a csírarész eltérő oldhatóságú frakciói. A klasszikus gabonafehérje-kémia a búzamag endoszperm fehérjéket oldhatóságuk szerint vízoldható albuminokra, sóoldható globulinokra, alkohololdható gliadinra, és sav- illetve lúgoldható gluteninekre osztotta fel (Osborne, 1907), bár mint később kiderült, az egyes frakciók között jelentős átfedés figyelhető meg. A gliadin és a glutenin fehérjék tartalékfehérjék, míg az albuminok és globulinok metabolikusan aktív fehérjék. Biológiai szerepükből következően a tartalékfehérjék találhatók nagyobb mennyiségben a búza magjában (1. táblázat).

Fehérje frakciók

Simmonds

Konarev

Belitz és

Lásztity

(1978)

(1980)

Grosch (1987)

(1999)

Albuminok (%)

5-10

7-10

14.7

6.6-12.1

Globulinok (%)

5-10

4-6

7.0

4.2-7.1

Gliadinok (%)

40-50

40-45

32.6

30.6-56.3

Gluteninek (%)

30-40

40-55

45.3

28.8-56.3

1. táblázat. A búzaszem endoszperm fehérjéinek arányai (Lásztity, 1999)

Az

endoszperm

aminósavösszetétel

tartalékfehérjék szempontjából.

vízben

való

oldhatatlansága

Magas

glutamin

tartalommal

meglepőnek (30-55

tűnik

mol

%)

rendelkeznek, mely aminosavak hidrogénkötés kialakítására képesek vízmolekulákkal. Ennek a kölcsönhatásnak köszönhető, hogy az izolált sikérfehérjék saját tömegük kétszeresét képesek vízzel megkötni. Emellett nem túl magas a vízzel nem elegyedő, apoláris aminosavak (Phe, Leu, Ile, Val) aránya sem (pl. vízoldékony hemoglobin és ovalbumin fehérjékhez viszonyítva). Az oldhatósággal kapcsolatos

másik

fontos szempont

makromolekulák esetén a

méreteloszlásbeli különbség. E nézet szerint, annál kevésbé oldható egy polimer molekula, minél nagyobb a molekulatömege. Így a polimer szerkezettel rendelkező glutenin fehérjék oldhatósága

az

alegységek

polimerizációjával

egyre

korlátozottabbá

válik.

A

tartalékfehérjékre jellemző méreteloszlásbeli különbség magyarázza leginkább a monomer gliadinok és a polimer gluteninek közti oldhatóságbeli eltérést, valamint a sikérminőség kialakításban betöltött különböző szerepüket is.


Aminosav összetétel tekintetében a sikérfehérjék több mint fele glutamin és prolin (Charbonnier & Mosse, 1980), ami alapján Shewry és mtsai prolaminoknak nevezték el a sikéralkotó polipeptideket (Shewry et al., 1986). A prolaminokat a klasszikus Osborne-féle oldhatósági csoportosítás helyett– biológiai szerepüket meghatározónak tartott kéntartalmuk alapján – kénben szegény, kénben gazdag, és nagy molekulatömegű (high molecular weight, HMW) csoportokra osztották (1. ábra). A sikérfehérjék általános tulajdonságait tárgyaló újabb összefoglaló művek már ebben a felosztásban tárgyalják minőségbefolyásoló szerepüket (Gianibelli et al., 2001; Shewry et al., 2009a; Wrigley et al., 2006a).

1. ábra: A búza endoszperm tartalékfehérjéinek csoportosítása (Shewry et al., 1986)

A sikérminőséggel foglalkozó kezdeti kutatások a különböző oldószerekkel oldható tartalékfehérje

makrofrakciók

egymáshoz

viszonyított

arányát

vizsgálták.

Osborne,

szerkezetük és funkcionális tulajdonságaik ismerete nélkül is a gliadin és glutenin fehérjék kiegyensúlyozott arányát tartotta a legfontosabb sikérminőséget meghatározó tényezőnek (Osborne, 1907). A hagyományos Osborne frakciók mellett, a gyenge szerves oldószerekben (tejsav, ecetsav) oldódó fehérjék mennyiségét vizsgálták leginkább. Utóbbi megfigyelések szerint a szerves oldószerben könnyen oldódó fehérjék mennyisége negatívan befolyásolja a tészta és a sikér reológiai minőségét. A nem oldódó fehérjék arányának növekedése viszont javulást eredményez a reológiai tulajdonságokban. A kezdeti oldószeres vizsgálatokról összességében megállapítható, hogy fontos összefüggésekre mutattak rá az egyes frakciók mennyisége és a tészta sütőipari minősége között. Ezek a megállapítások olyannyira összhangban voltak a gyakorlati tapasztalatokkal, hogy több ma is használatos sikérminőség és sütési vizsgálat alapjául szolgálnak (alveográfos sikérduzzasztási vizsgálat, Zeleny-féle szedimentációs próba).


2.1.2 A monomer gliadin polipeptidek sütőipari minőséget befolyásoló szerepe A monomer gliadin polipeptidek natív állapotban 70%-os alkoholos oldószerben oldódnak. A gluteninekhez képest egyszerűbben és reprodukálhatóbban extrahálhatók a búzamagból valamint gélelekroforézisessel történő elválasztásuk is hatékonyabb. Ezeket a szempontokat figyelembe véve érthető, hogy a gliadin frakció előbb vált a kutatások célpontjává (Branlard & Dardevet, 1985; Damidaux et al., 1978; Lásztity et al., 1985; Marchylo et al., 1989; Örsi et al., 1985; Pogna et al., 1988; Sozinov, 1984). Savas poliakrilamid gélen történő elektroforetikus mobilitásuk alapján a monomer gliadinokat négy csoportra osztják: az ωgliadinok mozgékonysága a legkisebb, őket követik a γ-gliadinok, majd a β- és az α gliadinok (Giani: Sapirstein and Bushuk 1985). Később genetikai vizsgálatok (Payne et al., 1982) és az N-terminális vég aminosav szekvenciái alapján (Kasarda et al., 1983) három fő csoportot javasoltak, melyek az /-, - és -gliadinok. cDNS és genomi DNS vizsgálatok alapján a gliadinok körülbelül 300 aminosavból álló szerkezete három fő elemre osztható: egy rövid N-terminális doménre, egy középső repetitív doménre, és egy C-terminális doménre. Az α/β-gliadinok hat ciszteint tartalmaznak, melyek három intermolekuláris diszulfidkötést képeznek, míg a γ-gliadinokban nyolc cisztein aminosav négy intermolekuláris kötést alakít ki (2. ábra). Ezek a ciszteinek kivétel nélkül a Cterminális doménen találhatók (Tatham & Shewry, 1995). Az ω-gliadinok cisztein aminosavat nem tartalmaznak. Az ω-gliadinokban nagyrészt β-kanyar szerkezet fordul elő, az α/β- és γgliadinok α-hélix és β-redő konformációt tartalmaznak (Tatham et al., 1985b).

2. ábra. A cisztein aminosavak elhelyelyezkedéses az α-, és γ-gliadinokban. Az gliadinokban nem található cisztein. A kis téglalapok ismétlődő szekvenciaszakaszokat jelölnek.


A hexaploid búza (AABBDD) nulliszóm (2n-2) és tetraszóm (2n+2) sorozatainak segítségével lehetővé vált a gliadin polipeptideket kódoló kromoszómák (1A, 1B, 1D, 6A, 6B és 6D) meghatározása. Ezután következett a gliadinokért felelős kromoszóma lokációk (Gli lokuszok) azonosítása az 1-es (Gli-1) és 6-os (Gli-2) homeológ kromoszómák rövid végein. Az egyes lokuszokat Gli-A1, Gli-B1, Gli-D1, Gli-A2, Gli-B2, és Gli-D2 lokuszoknak nevezték el (Payne et al., 1982). A Gli-1 lokuszon található gének kódolják az összes -, a legtöbb gliadint, míg a Gli-2 gének kódolják az összes -, a legtöbb -, és valamennyi -gliadint. A gliadin polipeptidek egy része összekapcsolva, úgynevezett szakaszokban (blocks) öröklődik. Adott Gli lokuszok különböző szerkezeti változatai (allélek) határozzák meg a szakaszban megjelenő gliadin polipeptidek számát, elektroforetikus mozgékonyságát, festődését és molekulaméretét (Metakovsky et al., 1984a; Metakovsky et al., 1984b). A termesztett búza esetében több, minőséget közvetenül befolyásoló gliadin szakaszt találtak. Olasz búzaminták esetén összefüggést találtak néhány -gliadin elektroforetikus spektruma és a tésztaminőség között (Pogna et al., 1982), és beszámoltak a Gli-1 lokusz által kontrollált allélok és Mixográffal mért tésztaparaméterek közti kapcsolatról is (Lagudah et al., 1988). Sozinov (1984) 50.000 minta vizsgálatát követően rendezte rangsorba ezeket a változatokat a lisztminőségre gyakorolt hatásuk szerint (2. táblázat). Ebben a gliadinokat a kromoszóma számával és az elektroforetikus mozgékonysággal jellemzik (pl. a GLD 6A3 komponenst a 6A kromoszóma kódolja és elektroforetikus mozgékonysága a harmadik csoportba tartozik).

GLD 1A7> GLD1A4> GLD1A2> GLD1A5> GLD1A3> GLD1A1> GLD1A6 GLD 1B1> GLD1B2> GLD1B7> GLD1B5> GLD1B4> GLD1B3> GLD1B6 GLD 1D4> GLD1D6> GLD1D1> GLD1D2> GLD1D3 GLD 6A3> GLD6A1 GLD 6B2> GLD6B1 GLD 6D2> GLD6D1> GLD6D3 2. táblázat. A gliadin alegységek minőségre gyakorolt hatásának rangsora (Sozinov, 1984)

Az újabb keletű kutatások azonban a gliadinok másodlagos minőség meghatározó szerepét állapították meg. A Gli-1 allélok hatását – a minőséget közvetlenebbül meghatározó – a glutenin fehérje alegységek alléljeihez történő szoros genetikai kapcsolatukon keresztül magyarázzák. Ennek és a gliadin polipeptidek széleskörű genetikai polimorfizmusának is köszönhető, hogy ma inkább a glutenin alegységek kerültek a figyelem középpontjába.


2.1.3 A polimer glutenin alegységeinek sütőipari minőséget befolyásoló szerepe Számos hasonlóság figyelhető meg a gliadin és glutenin fehérjék kromoszómán történő elhelyezkedésében, aminosav összetételében és szerkezetében (Lindsay & Skerritt, 1999; Shewry et al., 2000). Másrészt viszont a glutenin alegységekre jellemző egyedi tulajdonság, hogy diszulfidkötéssel képesek egymáshoz kapcsolódni (Muller et al., 1998; Shewry et al., 1992; Shewry & Miflin, 1985; Shewry & Tatham, 1997). A glutenin polimer így elérheti a 20 millió daltont és a természetben előforduló legnyagyobb fehérjemolekulák közé tartozik. Az S-S kötések redukcióval történő bontása után a glutenin alegységek 4 csoportra oszthatók SDS-PAGE-en történő elektroforetikus mobilitásuk alapján (A-, B-, C- és D-csoport). Az Acsoport (80-120 kDa) tartalmazza a nagy molekulatömegű glutenin alegységeket (high molecular weight glutein subunits, HMW-GS). A B- (42-51 kDa) és C-csoport (30-40 kDa) kis molekulatömegű glutenin alegységeket (low molecular weight glutenin subunits, LMWGS), melyek molekulatömege és szerkezete is az α/β- és γ-gliadinokéra emlékeztet (Payne et al., 1985) (3. ábra). Végezetül a D-csoport szintén LMW glutenin alegységeket tartalmaz, és az -gliadinokkal mutatnak rokonságot (Masci et al., 1993).

3. ábra. Az α-, és γ-gliadinok cisztein aminosav elhelyelyezkedésének hasonlósága az m-, és s-típusú LMW glutenin alegységekéhez (Lindsay & Skerritt, 1999)

2.1.3.1 LMW glutenin alegységek Az LMW alegységek (B-, C és D-csoportok) jelentős részét képviselik a tartalékfehérjéknek (a teljes mennyiség kb. harmada és a gluteninek kb. 60%-a). Mégis sokáig kevesebb figyelem övezte ezt a polimer frakciót, aminek egyik oka a gliadinoktól történő gyenge elválasztás


SDS-PAGE elektroforézissel. Ma már azonban több összefoglaló közleményt is lehet találni a sikérpolimer ezen összetevőiről (D'Ovidio & Masci, 2004; Juhász & Gianibelli, 2006). Bár az általánosan elterjedt nevezéktanuk elsősorban az elektroforetikus mozgékonyságukon alapszik, pontosabb megkülönböztetést tesz lehetővé az aminosav szekvenciájuk alapján történő csoportosítás (Lew et al., 1992). Az N-terminálison található szekvencia alapján LMW-m és LMW-s csoportokra osztották őket, ahol a toldalék az első helyen álló metionin (m) és szerin (s) aminosavakat jelölik. Az LMW glutenin alegységek szerkezete a D-alegységek kivételével a S-gazdag gliadinokéra hasonlít (Dovidio et al., 1995; Tatham et al., 1987). 250-300 aminosavat tartalmaznak, magas prolin és glutamin aránnyal rendelkeznek. Szerkezetük alapvetően három részre osztható. Az első, N-terminális domén -kanyarokban és -hélixben gazdag. A -kanyarok feltehetően spirális, míg az -hélixek egy zártabb struktúrát alakítanak ki (Thomson et al., 1992). Ez a terminális rész egy cisztein aminosavat tartalmaz (Colot et al., 1989; Okita et al., 1985). Az N-terminálist követő repetitív szakasz merev szerkezete miatt viszont, a cisztein intramolekuláris kötések kialakításában erősen gátolt. A második, repetitív szakasz hossza valamivel rövidebb (30-50 mol%), mint ami a többi S-gazdag gliadinra és HMW glutenin alegységre jellemző. Az utolsó C-terminális doménen 7 cisztein található, melyek közül az egyik párosítatlan és így intermolekuláris kötés kialakítására alkalmas. A D-alegységek elektroforetikus mobilitás és az N-terminális domén szekvencia tekintetében is az S-szegény -gliadinokra hasonlítanak (Masci et al., 1993; Masci et al., 1991). Feltehetően az -gliadinok mutációja során beépült cisztein aminosavnak köszönhetően alakultak ki és lettek potenciális láncbefejező molekulák. Az LMW alegységek többsége az 1A, 1B és 1D kromoszómák azonos sorrendű Glu-A3, GluB3 és Glu-D3 lokuszain kódoltak (Gupta & Shepherd, 1990). Néhány LMW-GS gént találtak már a 6-os számú kromoszómák lokuszain is (Gupta & Shepherd, 1993). 32 ország 222 hexaploid búzafajtájának vizsgálata alapján 20 különböző LMW-GS allélt (elektroforetikus fehérjecsúcs mintázatot) találtak, melyek közül hat a Glu-A3, kilenc a Glu-B3, és öt a Glu-D3 lokuszokhoz tartozik. A gélelektroforézissel elkülönített allélek szám mégis jóval kisebb, mint az összes lehetséges véletlenszerű kombináció (kb. 1 millió). Feltételezik ezért, hogy a gliadinokhoz hasonlóan az LMW alegységeket kódoló gének is szorosan kapcsoltak. Az LMW alegységeket kódoló Glu-3 és a gliadinokért felelős Gli-1 lokuszok között már találtak kapcsolatot (Payne et al., 1984; Singh & Shepherd, 1988). Mivel a gliadin összetétel sokkal könnyebben azonosítható, ez a kapcsolat jól hasznosítható a nemesítés során az LMW


alegységek allél összetételének meghatározásakor. Korábbi vizsgálatok során a 45 és 42 gliadinok jelenléte jó markereknek bizonyultak a jó és a gyenge tésztaminőség tekintetében (Damidaux et al., 1978; Kosmolak et al., 1980). A gliadinok tésztaminőségre gyakorolt hatásáról később bizonyosodott be, hogy az LMW-alegységekhez való genetikai kötődésüknek köszönhető (Payne et al., 1984).

2.1.3.2 HMW glutenin alegységek Az SDS-PAGE-en történő mobilitás szerinti legnagyobb molekulatömegű A-jelű glutenin csoport (80-120 kDa), a HMW glutenin alegységek csoportja. Bár a tartalékfehérje alegységek közül a legkisebb mennyiségben vannak jelen, a tészta rugalmas tulajdonságát mégis a HMW alegységek biztosítják leginkább (Tatham et al., 1985b). Ez elsősorban a polimerszerkezet kialakításához való jelentős hozzájárulásuknak köszönhető. Az egyes alegységek elnevezése eredetileg az SDS-PAGE-en történő mobilitásuk szerint történt. Az új alegységek felfedezésével azonban néhány elnevezés eltér a valódi sorrendtől. Elnevezéskor a mobilitási sorrend mellett jelölni szokás a gént tartalmazó genomot (A, B vagy D), valamint azt, hogy az elegység x- vagy y-típushoz tartozik-e (pl Ax1, Dy12). A hármas tagoltságú HMW glutenin alegységek szerkezete konzervatívan öröklődik . A kb. 480-680 aminosavat tartalmazó középső repetitív rész ismétlődó aminosavszekvenciákat tartalmaz. Ezek a rövid repetitív szakaszok képviselik a fehérjemolekula legnagyobb hányadát (kb. 85 mol %). A középső régió hidrofil karakterű, glutaminban, prolinban, glicinben gazdag és kéntartalmú aminosavban szegény (0 vagy 1 cisztein). A két nem repetitív terminális régió (N- és C-terminális) hidrofób, és ezek tartalmazzák a cisztein aminosavak döntő többségét (Shewry et al., 1989). Az N-terminális rész az x-típusú HMW glutenin alegységek esetében három ciszteint tartalmaz, míg az y-típusúaknál ötöt (4. ábra). A cisztein tartalom következtében alakulnak ki intermolekuláris diszulfid kötések a HMW- és LMW- glutenin alegységek között, amely több tíz millió dalton méretű polimer kialakulását is eredményezheti (MacRitchie, 1992; Shewry et al., 1992; Wrigley, 1996).


4. ábra: A cisztein aminosavak elhelyezkedése az x-, és y-típusú HMW-alegységekben (Shewry et al., 2003)

Ellentétben a középső repetitív doménnel, amely spirális -kanyar (-turn) szakaszokkal rendelkezik, mindkét terminális oldal periodikus -hélix konformációban gazdag (Shewry et al., 1992) (5. ábra). Tatham és mtsai az emlős szervezetekben található elasztin fehérjék analógiájára építve, a -kanyar szerkezetnek tulajdonították a tészta rugalmas tulajdonságát (Tatham et al., 1985a). Bár ez a nézet széles körben elfogadottá vált, Belton rámutatott arra, hogy a HMW alegységek vízzel való kölcsönhatásukat tekintve nem hasonlíthatók az elasztin fehérjékhez (Belton, 1999). A glutenin alegységekben glutaminsavak jelentős arányban fordulnak elő, ami intra- és intermolekuláris hidrogénkötések kialakulását eredményezi. Elmélete (loops and trains model) szerint, ezek a kölcsönhatások a tésztában húzóerő hatására felbomlanak (loops), majd megszüntével rugalmasan visszaalakulhatnak (trains).

5. ábra. A HMW glutein alegység feltételezett szerkezete, spektroszkópiai és hidrodinamikai vizsgálatok alapján (Shewry et al., 2000)


A HMW glutenin alegységeket a hexaploid búza A, B, és D genomján elhelyezkedő gének kódolják az 1-es számú kromoszómákon (Glu-A1, Glu-B1 és Glu-D1 lokuszok) (Bietz & Wall, 1975; Payne et al., 1987). Mindegyik lokusz két szorosan kapcsolt gént tartalmaz, melyek két különböző típusú (x- és y-) HMW glutenin alegységet kódolnak (Shewry et al., 1992). Az x-típusú alegységek molekulatömege általában nagyobb, mint az y-típusúaké. Elektroforetikus vizsgálatok alapján a Glu-1 lokusz jelentős polimorfizmusát figyelték meg (Lawrence & Shepherd, 1980; Payne et al., 1980). Három allélváltozatot találtak a Glu-A1-, tizenegyet a Glu-B1-, és 6 allélt a Glu-D1 lokuszokon Az allélváltozatokat Payne és Lawrence katalógusban foglalták össze (Payne & Lawrence, 1983). A hexaploid termesztett búza esetében hat különböző HMW glutenin alegység megjelenése lenne elméletileg várható, de nem minden gén fejeződik ki (silencing), aminek köszönhetően három-öt alegység jelenléte tapasztalható. Az A genom mindig csak x-típusú glutenin géneket hordoz, a D genomban mindkettő típus jelen van. A B genomban is jelen van mindkettő, de az y-típus nem fejeződik ki minden esetben. Az összes hexaploid búza tartalmaz tehát 1Bx, 1Dx, és 1Dy alegységeket, míg egy részük 1By és 1Ax alegységeket is tartalmaz. Az 1Ay mindig csendes (silent) marad. Összefüggést keresve a HMW alegységek előfordulása és a sütőipari minőség között, úgy találták, hogy egyes alegységek jelenléte a kedvező minőséggel párosul, míg más alegységek jelenléte a gyenge sütőipari minőségű búzákra jellemzők (Payne, 1987; Payne et al., 1981; Payne et al., 1987). Ezek alapján hozták létre az ún. „Glu-1 Score” indexet, amelyet a 3. táblázat értékei alapján számoltak.

Kromoszóma

Alegység

Pont

1 2 3 4 1 + 2 + 1B 17+18 + 7+8 + 13+16 + 7+9 + 7 + 6+8 + 20 + 1D 5+10 + 2+12 + 3+12 + 4+12 + 3. táblázat. A Glu-1 Score index által javasolt értékszámok az egyes HMW fehérjékre 1A


A Glu-1 indexről szóló publikáció megjelenését követően számos országban végeztek vizsgálatokat a rendelkezésre álló HMW fehérje alegységekre vonatkozó adatok alapján. Magyarországon és más országokban (Anglia, Olaszország, Németország, Ausztrália, stb.) termesztett búzafajták ilyen irányú vizsgálata sok esetben alátámasztotta az index gyakorlati jelentőségét (Gupta & Macritchie, 1994; Kárpáti et al., 1995; Khan et al., 1990; Kolster & Vereijken, 1993; Rathmell et al., 2001; Shewry et al., 2003; Soltes-Rak et al., 1991; Vapa et al., 1996). Ugyanakkor, több olyan eredmény és megfontolás is napvilágot látott, amelyek kétségessé tették az index használatának általános érvényességét. Az index alapján jósolt és a tapasztalt minőség között jelentős eltérés mutatkozik néhány búzafajta esetében. Például a magyar Bánkúti 1201 és az egyesült államokbeli HRS (HY 320) búzafajták lisztjében a minősítési rendszer szerint kedvezőtlen tulajdonságokért felelős 1Dx2+1Dy12 glutenin alegység kombináció nagy mennyiségben fordul elő, sütőipari tulajdonságuk mégis kiemelkedően jó a búzafajták között (Bedő et al., 1995; Juhász et al., 2000; Khan et al., 1990). Ez azért van, mert nem a Dx2+1Dy2 (vagy bármelyik másik glutenin allél) egyedül határozza meg a minőséget, hanem a hat glutenin allél együttesen. A hat allél egyedi hatás nem egyszerűen összeadódik, hanem szinergikus (és inhibitor) hatások érvényesülnek, tehát vannak kölcsönhatási tényezők. Az allél-allél kölcsönhatások mellett, egyéb genetikai és biokémiai szempontokat is figyelembe véve, Békés és mtsai publikáltak statisztikai alkalmazással egybekötött összefoglalást a búzaminőség előrejelzéssel kapcsolatban (Békés et al., 2006). A Bánkúti 1201 fajta esetében a Dx2+Dy12 mellett van egy új allél, a 1A2*B, amiben (hasonlóan a Dx5-höz) van egy extra cisztein. Ráadásul az 1B allél nem a szokásos Bx7+By8, mert ebben a 7-es alegység túltermelő, aminek fontossága miatt nem 1Bb hanem 1Bal jelölése van (Juhász et al., 2003b). Tehát a Glu-1 minőségosztályozás jó, de eredeti formájában elavult, mert 1) számos, a mai köztermesztésben lévő búzában található allélt nem tartalmazza 2) csak a HMW-GS alléleket veszi figyelembe és az LMW-GS-eket nem 3) az egyes allélek hatásat veszi csak (linearisan) figyelembe és nem számol a kölcsönhatásokkal 4) nem veszi figyelembe az egyes alegységek mennyiségi hatását, amiről a következő alfejezetben lesz szó.


2.1.4 A

gliadin

és

glutenin

tartalékfehérje

frakciók

arányának

minőségmeghatározó szerepe A Glu-1 index alapján történő minőség-előrejelzések számításakor, csak a HMW alegységek fajtára jellemző eloszlását veszik figyelembe. Az első bíráló jellegű észrevételek elméleti oldalról közelítették meg a HMW alegységek kizárólagos minőségmeghatározó szerepét (Huifen & Hoseney, 1990). Figyelembe véve többek között a teljes fehérjetartalom szerepét a sütési tulajdonságok kialakításában (pl. cipótérfogat), valószínűtlennek tartották, hogy a minőséget, a kis mennyiségben jelenlévő polipeptidek egy csoportja határozza meg. Ha ez valóban így volna, akkor ezen ‘kritikus’ fehérjék összetétele, erősen kapcsolódna a mintában lévő fehérjék teljes mennyiségéhez. Logikusnak tűnik azonban az a feltételezés, hogy összetételük mellett mennyiségük szintén befolyásolja a sikérhálózat kialakulását. Számos vizsgálati eredmény megerősíteni tűnik a mennyiségi nézet jelentőségét (Cornish et al., 2005; Grosch & Wieser, 1999; Gupta, 1993; Shewry et al., 1992). A kedvező vagy éppen kedvezőtlen sütőipari minőség nem köthető csupán egyik vagy másik HMW glutenin alegység jelenlétéhez. Meghatározó szerepe van a különböző tartalékfehérje frakciók kiegyensúlyozott arányának is. A kevésbé vizsgált LMW alegységek, illetve a gliadinok minőségi és mennyiségi összetétele egyaránt hozzájárulnak a minőségi tulajdonságok genetikai definiáltságához (Gupta, 1993; Keck et al., 1995; Masci et al., 1998; Masci et al., 2000; Rakszegi et al., 2000). Széleskörű biokémiai és genetikai vizsgálatok bizonyították, hogy a glutenin polimer natív molekulaméretét a környezeti paraméterek mellett, több genetikai tényező is befolyásolja (Lafiandra et al., 1999; MacRitchie, 1999). A genetikai tényezők közül a három legfontosabb: 1. Glu-1 és Glu-3 lokusz alléljainak illetve a hat Glu allél kombinációjának változékonysága; 2. polimerláncot befelyező alegységek aránya; 3. HMW- és LMW- glutenin alegységek aránya.

A fent elmondottak alapján az LMW fehérjék mennyiségét nem lehet figyelmen kívül hagyni a funkcionális paraméterek megítélése során. Az újabb kutatások eredményei alapján nagyon valószínű, hogy a gliadinok egyszerű térkitöltő és képlékenységet befolyásoló szerepére vonatkozó hipotézist is felül kell vizsgálni. Az LMW alegységek és a gliadinok szerepének


jobb megértése további kutatómunkát igényel. Felmerül azonban a kérdés, hogy elegendő-e a tartalékfehérjék biokémiai és genetikai potenciáljának megismerése ahhoz, hogy magyarázni tudjuk a búzafajták évről évre változó sütőipari minőségének okát. Ennek a kérdésnek az eldöntése érdekében vizsgálni kell a sikérhálózat kialakulásához vezető környezetfüggő kölcsönhatásokat is.

2.2 A sikéralkotó tartalékfehérjék bioszintézisének vizsgálata A tartalékfehérjék szintézisét követően a polipeptid molekulák eltérő reológiai tulajdonságú sikért hoznak létre az eltérő külső körülmények és így az eltérő kölcsönhatások hatására. A sikér redukálása után kapott polipeptidek keveréke a reoxidáció körülményeitől függően szintén különböző minőségű sikérhálózatot alakít ki (Lásztity, 1982). A kiindulási polipeptidek között kialakuló kölcsönhatások tehát döntően meghatározzák a sikérkomplex szerkezetét. E megfigyelés szerint nem elég a sikérhálózatot alkotó tartalékfehérje alegységek kémiai összetételét önmagában vizsgálni, ismerni kell a sikér kialakulásához vezető utat is, amely a sikéralkotó polipepteidek szintézisén és az ezt követő kölcsönhatásokon keresztül vezet (Lásztity et al., 1996). A sikérpolipeptidek bioszintézisének folyamata és a közöttük kialakuló kölcsönhatások a búza magjának érési folyamata során figyelhető meg.

2.2.1 A makrojellemzők változása a szemfejlődés során A szemfejlődés folyamata a virágzás napjától az aratásig tart, melynek során a szárazanyagés nitrogéntartalom szigmoid görbe szerint növekszik (Gooding et al., 2005). Fiziológiai szempontból a szemkialakulás három szakaszra osztható fel (Jenner et al., 1991). Az első szakaszban a sejtek osztódását és növekedését intenzív vízfelvétel kíséri (Pepler et al., 2006). Az endoszperm sejtmagok osztódása a megtermékenyítést követő órákban történik és az első sejtfalak kb. 3 nappal a virágzás után (days post anthesis, DPA) jelennek meg. A sejtosztódás a 10-15. DPA-ig tart egyre lassuló ütemben, az intenzív vízfelvétellel csaknem párhuzamosan. A fehérjék az endoplazmatikus retikulum felszínéhez kapcsolódó Golgi apparátus segítségével szintetizálódnak és az első membránnal körülvett fehérjetestecskék (0.5-1.5 m) kb. a 10. DPA után jelennek meg. A fejlődés második szakasza 10-15 DPA kezdődik és a hőmérséklettől függően 15-30 napig tart és a szemben található szárazanyag mennyiség közel lineárisan növekszik. Az egy szemre


eső nedvestömeg ebben a szakaszban alig változik (Pepler et al., 2006), mivel a leadott és felvett víz mennyisége kiegyenlítik egymást. A harmadik szakaszban a búzaszemek elérik maximális száraztömegüket, ami a fiziológiai értelemben vett érettség jele, de még nem jelenti az aratás kezdetét. A száraztömeg termelés leálláasa általában gyors vízveszteséggel jár együtt. A felvett nitrogén mennyiség 70-75%-a tartalékfehérjék formájában hasznosul a fejlődő búzaszemekben. Az aratáskor számított teljes nitrogénmennyiség 50-70%-a virágzás napjáig kötődik meg, a maradék 50-30%-ot a vizágzás után veszi fel a növény. A második nitrogénkötési szakaszt követően a búzaszemekbe jutó nitrogén megoszlási arány eléri a 90%ot (Gooding et al., 2005; Gooding et al., 2007). A nagy nitrogén hasznosítási arány szükséges a megfelelő fehérje koncentráció (N x 5.7) biztosításához, ami fontos minőségmeghatározó paraméter (Dimmock & Gooding, 2002).

2.2.2 A sikérhálózatot alkotó polipeptidek bioszintézise és raktározása az endoszperm szövetekben A molekuláris biológia centrális dogmája alapján a fehérjék tulajdonságait két alapvető tényező határozza meg. Az egyik, a búzára egyébként különösen jellemző genetikai polimorfizmusból adódó biodiverzitás. A másik, a gének expressziós szintjének változása, az adott expressziós folyamat érzékenységétől és a külső körülmények változékonyságától függően. A génkifejeződési mintázat változása különböző módszerekkel vizsgálható, melyek közül a transzkriptom (mRNS populáció) analízis a legelterjedtebb. Az adott szövet megfelelő mRNS vagy cDNS frakcióit blokkoló technikákkal (pl. DNS chip-ek) azonosítják és határozzák meg mennyiségüket (Leader, 2005). A génkifejeződési szint mellett a transzkripciós faktorok mennyisége is követhető a

szemfejlődés során (Laudencia-

Chingcuanco et al., 2006; Laudencia-Chingcuanco et al., 2007). mRNS molekulák már a megtermékenyítés után 5.-7. napon kimutathatók, és az egyes transzkripciós molekulák a 10. nap környékén érik el maximális mennyiségüket (Shewry et al., 2009b). A virágzás utáni 8-12 napok között végzett transzkriptom vizsgálatok alapján Clark és mtsai (Clarke et al., 2000) 4.500 és 8.000 közötti értékre becsülték a kifejeződő gének számát. Pontos érték azonban a búza genom teljes ismeretének hiányában nem lehetséges. Clark és mtsai (Clarke et al., 2000) a géntermékek számát az egyedi fehérjék elválasztása alapján is próbálták megbecsülni. 2 dimenziós elektroforézises technikával az érés 10. napján


1.700 tartalékfehérjét választottak el az endoszperm szövetből, ami legfeljebb 40%-át éri el a génexpresszió alapján becsült értéknek (4.500-8.000). Skylas és mtsai (Skylas et al., 2000) 1.300 fehérjét találtak az endoszperm szövetben a virágzás utáni 17. napon. Ezek közül 321 darabot blottoltak membránra N-terminális aminosavszekvencia meghatározás céljából. 177 fehérjét

azonosítottak sikeresen szekvecia egyezés alapján, ezek döntő többsége

tartalékfehérje volt. Nagyobb mennyiségben találtak még inter- és intramolekuláris diszulfidkötések kialakulásáért felelős fehérje diszulfid izomeráz (protein disulfide isomerase, PDI) enzimeket is. A szintetizált tartalékfehérjék az endoszperm szövetekben raktározódnak a szemfejlődés során. Bő negyven évvel ezelőtt kezdődtek el azok a vizsgálatok (Graham & Morton, 1963), melyeknek köszönhetően ma már részletes betekintést nyerhetünk az itt lejátszódó mikroszerkezeti változásokba. A következő évtizedekben számos kutatás megállapította, hogy raktározott fehérjék az endoplazmatikus retikulum membránjával körbevéve és a Golgi apparátusról származó vakólumokba ágyazva is megtalálhatók (Bechtel et al., 1988; Parker, 1981). A kialakuló fehérje testecskék egyre nagyobb száma, valamint a keményítő szemcsék egyidejű növekedése következtében a citoplazmában szerkezeti változások történnek a szemfejlődés során. A fehérjetestecskéket határoló membránok felszakadnak és folyamatos fehérjemátrix alakul ki a keményítő szemcsék közé ágyazódva. Az integritás elvesztése intenzív vízveszteséggel jár együtt (Bechtel et al., 1982), ami mesterséges szárítás következtében is megfigyelhető. Hasonló jelenség figyelhető meg a szemfejlődés során mesterséges szárítás következtében (Bechtel & Wilson, 2005). A fehérjetestek felszakadása után a dehidratációs körülmények között a szabadon maradt tiolcsoportok egy része oxidálódik (diszulfid kötések kialakításával), ami nagy molekulatömegű polimereket eredményez. A polimerizáció folyamata ebben a szakaszban válik a legaktívabbá (Carceller & Aussenac, 1999; Naeem & MacRitchie, 2005). Néhány tiolcsoport azonban még így is reagálatlan marad az érési folyamat során (Antes & Wieser, 2000).

2.2.3 A sikérhálózatot alkotó polipeptidek polimerizációja A polimerizáció döntő mértékben diszulfidkötéseken keresztül megy végbe, ezért nagyon fontos szerepet töltenek be a glutenin polimerméretének kialakításában (Wieser et al., 2006b).A szintetizálódott polipeptidek kb. 40-50 %-a marad monomer formában, mivel csak intramolekuláris diszulfid kötéseket tartalmaznak. Ezek a tartalékfehérjék a gliadinok. A


polipeptidek másik fele (LMW- és HMW glutenin alegységek), poszttranszlációs átalakítások során, intermolekuláris diszulfidkötésekkel gluteninné polimerizálódik (MacRitchie et al., 1990). A diszulfidkötések kiakulása már röviddel a fehérjeszintézist követően megkezdődik az endoplazmaitikus retikulum lumenben, elsősorban a konformáció szempontjából fontos intramolekuláris diszulfidkötések kialakításával (folding). A folyamatot a fehérje diszulfid izomeráz (PDI) enzimek segíthetik (Shewry, 1999) Mivel az összes cisztein nem tud intramolekuláris kötéssel kapcsolódni, egy részük szabad tiol formában marad és intermolekuláris kötések kialakulását teszik lehetővé a későbbiek során (Kasarda, 1989). A fehérjetestekben történő raktározást követően a tartalékfehérje alegységek redox változásokon mennek keresztül. A szabadon maradt tiol csoportok egy része oxidálódik, ami a polimer molekulaméret jelentős növekedésével jár együtt (Rhazi et al., 2003). A ciszteinek egy kis része azonban még a szemfejlődést követően is szabad tiol formában marad (Antes & Wieser, 2000). A diszulfidhíd kötések in vivo kialakulása az utóbbi években egyre inkább kutatott témává vált. A kutatások során általában kiemelik a polimerfrakció mennyiség gyors növekedésének jelenségét a szemfejlődés során, okáról azonban különböznek a vélemények. Többen az érés második felére jellemző gyors nedvességtartalom csökkenést vélik a változás elsődleges okának (Carceller & Aussenac, 1999; Daniel & Triboi, 2002). Mások a környezeti feltételek egyéb változása szerint keresik a megoldást (Naeem & MacRitchie, 2005). Végül vannak olyan eredmények is, ahol a tartalékfehérje alegységek bioszintézisének függvényében (HMW/LMW arány változása) magyarázzák a jelenséget (Carceller & Aussenac, 2001). Ezek mellett további kutatásokat igényel a búzaszemben található redoxi enzimek (pl.: PDI) és molekuláris chaperon fehérjék szerepe is a sikéralkotó polipeptidek közötti diszulfidkötések létrejöttének megértéséhez. 100 g érett lisztben kb. 2,5 g cisztein aminosav található, melynek döntő többsége (kb. 95%) a polimeralegységek közötti diszulfidkötések kialakításában vesz részt (Grosch & Wieser, 1999). A diszulfidkötés helyének pontos meghatározása a sok tartalékfehérje és a kötéseket képző cisztein aminosav miatt jelentős nehézségekbe ütközik. Ennek ellenére néhány kutatócsoport végzett ilyen irányú kutatásokat (Keck et al., 1995; Kohler et al., 1991; Kohler et al., 1993), melyekről összességében a következők mondhatók el. Az s-típusú LMW glutenin alegységek cisztein kötőhelyeit ma már ismerjük. Az eredmények szerint, a monomer /- és -gliadinokhoz hasonlóan hat cisztein vesz részt intramolekuláris kötések kialakításában. További kettő pedig intermolekuláris diszulfidkötésekért felelős. Ezek közül az egyik elsősorban y-HMW glutenin alegységekkel és láncbefelyező alegységekkel (pl. 17 Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

gliadinokkal) képez kapcsolatot. A gliadinok között nem alakul ki diszulfidkötés, és a gluteninekhez is csak másodlagos kötésekkel kapcsolódnak. A HMW glutenin alegységek diszulfid kötőhelyeiről a legújabb összefoglaló irodalmakat tekintve is jóval kevesebb információnk van (Khan & Shewry, 2009; Wrigley et al., 2006b). Köhler és mtsai Rektor búzafajtából (HMW-GS Dx5, Bx7, By9, Dy10) származó sikérfehérjék enzimatikus bontásával izolált ciszteint tartalmazó peptideket (Kohler et al., 1991; Kohler et al., 1993). Ezek segítségével határozták meg a következő diszulfidkötő helyeket: 1. Az 1Bx7 alegysége esetén egy intramolekuláris kötés található a 10-es és 17-es ciszteinek között 2. Intramolekuláris kapcsolat van az y-típusú HMW alegységek repetitív doménjén található cisztein és az LMW alegységek egy C-terminálison található páratlan cisztein között 3. Az 1By9 és 1Dy10 alegységek között és egymás között is két intermolekuláris kötés is kialakulhat, ami párhuzamosan tartja az alegységeket Tao és mtsai (Tao et al., 1992) SDS-oldhatatlan frakcióból származó az intakt HMW alegység molekulaméretéhez közeli peptidek vizsgálatával találtak még intermolekuláris kötést az 1Bx7 alegység C-terminális és az 1Dy10 alegység N-terminális része között, de cisztein egységek helyét nem sikerült meghatározni. Ahhoz, hogy lineáris kapcsolat jöhessen létre a polipeptidek között, monomerenként legalább két szabad tiolcsoportra van szükség. A HMW- és LMW alegységek rendszerint teljesítik ezt a követelményt és ezért lánchosszabító szerepet töltenek be (Kasarda, 1989). Azon ciszteinek, melyek intramolekuláris kötéssel kapcsolódnak egymáshoz, nem vehetnek részt a polimerizációs folyamatban. Három vagy több tiolcsoport jelenléte viszont megteremti az elágazó polimer láncok létrejöttének lehetőségét. Végül, pedig azok a módosult gliadinok és LMW alegységek, amelyek csak egy vagy páratlan számú ciszteinnel rendelkeznek láncbefejező szerepet láthatnak el (6. ábra). A lánchosszabító és láncterminátor szerepek cisztein

tartalomtól

való

függőségét

inkorporációs

technikával

bizonyították

a

sikérfehérjékkel rokon árpa hordein fehérjéken (Tamás et al., 2002).


6. ábra: Lehetséges diszulfid-kötéstípusok a polimerláncban. A fekete körök jelölik az LMW glutenin alegységeket, míg a téglalapok a HMW glutenin alegységeket (Dx5, Bx7, By9, Dy10). x = láncbefelyező (terminátor) (Wieser et al., 2006a)

A polimer összetételének és molekulaméretének változása a tészta sütőipari minőségét is megváltoztatja. A HMW alegységeket nem tartalmazó nulliszóm fajták LMW alegységei a HMW alegységeket tartalmazó fajtákhoz hasonló molekulamértetű polimereket hoznak létre, a nyújtással szembeni ellenállásuk mégis jóval gyengébbnek bizonyult (Gao & Bushuk, 1993).A polimerméret növekedése viszont erősebb tésztát eredményez, amelynek nagyobb a keveréssel szemben kialakuló ellenállása és stabilitása (Kasarda, 1999). Általánosságban fogalmazva a nagyobb mérerű polimerek a tészta erősségét és rugalmasságát, a kisebb méretű gliadinok inkább a tészta viszkozitását határozzák meg (Hamer & Vliet, 2000; Southan & MacRitchie, 1999). A legnagyobb méretű polimer fehérjék (glutenin makropolimer, GMP) vagy egy másik megközelítés szerint a nem oldodó polimerikus fehérjék (unsoluble polymer proteins, UPP) befolyásolják legerősebben a tészta viselkedését. A lisztben található mennyiségük (~20-40 mg-g) erős korrelációt mutat a tésztaerőséggel és a cipótérfogattal (Southan & MacRitchie, 1999; Weegels et al., 1996a).


2.2.4 A monomer gliadinok és glutenin makropolimer kölcsönhatásai a sikérképzés során A sikérből elkülönített gliadinok víz hozzáadás hatására viszkózus oldatot, míg a gluteninek a hidratációt követően egy erős, de rugalmas anyagot képeznek. E tapasztalat alapján általánosan elfogadottá vált, hogy a sikérből készült tészta erősségét a gluteninek, nyújthatóságát pedig a gliadinok határozzák meg. E két csoport sikérszerkezetet meghatározó tulajdonságai

aminosav

összetételüknek,

molekulaméretüknek

(molekulaméret

eloszlásuknak), és jellegzetes fehérjeszerkezetüknek köszönhető. A felsorolt tulajdonságok a molekulák közötti kötések kialakításában kapnak jelentőséget, mivel a fehérjék közötti kölcsönhatások

(gliadin-gliadin,

gliadin-glutenin,

glutenin-glutenin)

határozzák

meg

leginkább a tészta reológiai tulajdonságait. A polimerizáció során kialakuló kovalens diszulfidkötések mellett a kisebb kötési energiával rendelkező nemkovalens kölcsönhatások (hidrogénkötés, ionos kölcsönhatás, hidrofób kölcsönhatás) is fontos szerepet töltenek be a sikérpolimer feltételezett szerkezetének stabilizálásában.

A

glutamin

a

legnagyobb

mennyiségben

található

aminosav

a

sikérfehérjékben. Jelentős szerepük van az inter- és intramolekuláris hidrogénkötések létrehozásában és ezáltal az összetartó tésztaszerkezet kialakításában. Spektroszkópiai vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy a HMW alegységek megfelelő részei között kialakuló, és húzóerő hatására helyváltoztatásra képes hidrogénkötések felelősek a sikér rugalmasságáért (loop and train model) (Belton, 1999). A hidrogénkötések sikérben való létezését bizonyítják a hidrogénkötéseket bontó anyagok (pl. urea) sikérszerkezetet gyengítő hatása, valamint a normál csapvíz keményvízzel történő helyettesítésének erősítő hatása. A deutériumkötések ugyanis jóval nagyobb energiával rendelkeznek a hidrogénkötéseknél. Az ionizálható oldallánccal rendelkező aminosavak (lizin, hisztidin, arginin, aszparaginsav, tirozin) kis száma ellenére az ionos kölcsönhatások jelentős szerepet töltenek be a sikérfehérjék esetében. A NaCl köztudottan sikérerősítő hatású, ami a gluteninek, gliadinok és lipidek között kialakuló kölcsönhatások megváltoztatásának lehet a következménye (Kasarda, 1989). A hidrofób kölcsönhatások szintén befolyásolják a sikérpolimer szerkezetét. A hidrofób kölcsönhatások eltérnek az előző kölcsönhatásoktól olyan tekintetben, hogy hőmérséklet növelés hatására emelkedik a kölcsönhatás energiája is. Ez a hatás eredményezi, hogy a tészta többlet stabilitási energiával rendelkezik a sütési szakaszban (Bushuk, 1998).


Bár a tartalékfehérjék sikérminőséget meghatározó központi szerepéhez aligha férhet kétség, nem szabad megfeledkezni arról, hogy a fehérjék nem az egyetlen és nem a legnagyobb mennyiségben jelenlévő kémiai összetevők a búzalisztben (7. ábra). A nem-fehérje komponensek sikérminőséget befolyásoló szerepének tárgyalása azonban meghaladja ennek a dolgozatnak a kereteit.

7. ábra: A sikérfehérjék (gliadinok és gluteninek) eloszlása az endoszperm keményítőszemcsék között, szkenning elektronmikroszkópos felvétel alapján. A rövidítések a fehérje mátrixot (P), a kis- (SA), és nagy- (SB) keményítőszemcséket jelölik. A bal alsó sarokban lévő vonal 5 m-nek felel meg (Mills et al., 2005)


2.3 A sikérhálózatot alkotó polipeptidek vizsgálatának analitikai módszerei A sikérfehérjék vízben nem oldódnak. Más oldószerekkel történő vizsgálataik során natív szerkezetük megtartása fontos szempont. A natív szerkezetnek azonban még a pontos meghatározása is nehéz feladat a sikér esetében, mivel nem rendelkeznek olyan jól definiálható funkcióval, mint például az enzimek. Kovalens diszulfidkötéseken keresztül a polipeptid

alegységek

nagy

molekulatömegű

polimer

komplexet

képeznek,

ami

oldhatatlanságuk elsődleges oka. Emellett a tartalékfehérjék nagy része nem kovalens kölcsönhatásba is lép egymással (hidrogénhidas, hidrofób kapcsolat), valalmint az őket körülvevő lipidekkel és keményítő szemcsékkel. Aminosav összetételüknek köszönhetően (magas a glutamin, a prolin, és a hidrofób aminosavak aránya, míg a savas és bázikus összetevők ritkák) oldhatóságuk eltér a legtöbb növényi és állati eredetű fehérjétől. A felsorolt nehézségek miatt a legtöbb analitikai módszer csak a nem natív (legtöbbször redukált, detergensekkel módosított, másodlagos kötésektől mentesített, mechanikusan összetört) tartalékfehérjék vizsgálatát teszi lehetővé. A sikérfehérjék esetén alkalmazott analitikai módszerekkel kapcsolatban Shewry és Lookhart jelentettek meg összefoglaló könyvet (Shewry & Lookhart, 2003). A következő fejezetek a leggyakrabban alkalmazott elektroforetikus és kromatográfiás módszerekkel foglalkoznak.

2.3.1 A sikérfehérjék elektroforetikus elválasztása Először 1959-ben Jones és mtsainak sikerült a különböző molekulatömeggel és töltéssel rendelkező sikéralkotó tartalékfehérjéket elválasztani elektromos erőtér hatására (Jones et al., 1959). Ezután kezdték el fejleszteni a tartalékfehérje elválasztásra alkalmas különböző géleken (pl. keményítő, poliakrilamid, agaróz) történő elektroforetikus módszereket (Bietz, 1979; Wrigley, 1977; Wrigley et al., 1982a). A savas gélelektroforézist (A-PAGE), kifejlesztését követően (Jones et al., 1959) elsősorban a monomer tartalékfehérjék elválasztására használták (Khan et al., 1982) és a mai napig ez a módszer a monomer tartalékfehérjék nevezéktanának alapja. Általában alumínium laktáttal savanyítják a gél pH-ját, néhány esetben ecetsav – glicin rendszert alkalmaznak. A savas gél törékenyebb, mint a későbbiek során kifejlesztett SDS-PAGE esetében és így könnyebben


szakad, ami nagyobb figyelmet igényel a mérések során. A monomer sikérfehérjék mellett albuminok és globulinok elválasztására is alkalmas ez a módszer. A búzaminőség vizsgálatok szempontjából a mai napig meghatározónak tekinthető a nátriumdodecil-szulfát – poliakrilamid-gél-elektroforézis (SDS-PAGE). Az SDS-PAGE technika kifejlesztése Laemmli nevéhez kötődik (Laemmli, 1970). A poliakrilamid gél porózus mátrixot képez, aminek segítségével töltésük és/vagy mértetük alapján választhatók el a fehérjék. A pórusok mérete az akrilamiddal keresztkötéseket kialakító biszakrilamid arányával csökkenthető. Az akrilamid koncentráció mellett különböző pufferrendszerek és adalék anyagok (detergensek, redukálószerek) alkalmazásával lehet optimalizálni az elválasztás körülményeit. Az SDS egy anionos karakterű detergens molekula, ami hatékonyan képez komplex kapcsolatot fehérjékkel, bontja a hidrogén kötéseket, gátolja a hidrofób kölcsönhatásokat, valamint körbeveszi a fehérje molekulák felszínét és negatív töltéssel borítja be őket. Ennek következtében a fehérjék töltéskülönbségük szerint nem, csak méretük alapján vállnak el frakciókra az akrilamid mátrix pórusaiban. Az SDS-PAGE elválasztásnak több speciális alkalmazása is ismert. A többrétegű (multi stacking, MS-) SDS-PAGE technika (Khan & Huckle, 1992) nagyméretű polimer fehérjék elválasztására alkalmas. Ennek során az élesen különböző koncentrációjú akrilamid sávokat több egymást követő rétegben helyezik el. A polimerikus fehérjék az egyes rétegek határán rekednek meg, mivel a pórusok átmérője itt jelentősen változik. Amfoter karakterű biomolekulák esetén az izoelektromos fókuszálás (IEF) gyakran alkalmazott módszernek számít. A fehérjék például izoelektromos tartományaik alapján eredményesen elválaszthatók elektromos előtérben. Ezt a technikát az SDS-PAGE elválasztással kombinálva egy nagyon hatékony 2 dimenziós (2D) elektroforetikus módszerhez jutott O’Ferrell a 70’-es évek közepén (Ofarrell et al., 1977), amit ma is nagyon eredményesen alkalmaznak például a proteomika területén. A kétféle elválasztási módszer kombinálásának köszönhetően 1000-nél is több tartelékfehérje elválasztás lehetséges (Clarke et al., 2000). Az egyes fehérje sávok (pöttyök) blottolás után, megfelelő immunodetektálási, tömegspektrometriás vagy Nterminális aminosavszekvencia analízist követően azonosíthatók. Monomer és polimer fehérjék elválasztására lehet használni az úgynevezett diagonális SDSPAGE-t (Gupta et al., 1995). Lényegében ez is egy speciális 2 D technika, melynek során a fehérjéket előszőr natív alakban, majd redukálás után is megfuttatják. A monomer fehérjék molekulatömege a redukálás után nem változik, ezért a 2D gél átlójában maradnak. A polimer fehérjék elektroforetikus mozgékonysága a redukálást követően felgyorsul. Ezért a második elválasztás után a monomer fehérjék által képzett átló alatt fognak elhelyezkedni. 23 Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

2.3.2 A sikérfehérjék kromatográfiás elválasztása Az 1980-as évek elején a 300 Ǻ vagy nagyobb pórusátmérőjű, úgynevezett „wide-pore” töltetek első megjelenése nyitott utat a több száz kDa molekulatömeggel rendelkező polipeptidek HPLC-vel történő vizsgálata előtt (Regnier & Gooding, 1980). A kromatográfiás elválasztás jelentős technikai fejlődését ezután elsősorban a műszerezettség és a kromatográfiás oszlop tekintetében érte el. A porózus szerkezetet biztosító szilikagél szemcsék egyenletes eloszlása, kis mérete és stabil töltése elérhetővé tette a gyors, érzékeny, jó felbontású és reprodukálható elválasztást. Ennek köszönhetően kiemelkedően fontos szerephez jutott a sikéralkotó polipeptidek elválasztásában. A tartalékfehérjék elválasztásában elsősorban a porózus szerkezetű szilikakagéllel töltött oszlopok terjedtek el. A szilikagél alapú állófázisok különböző szilanizálási reakcióval fordított fázisú (reverse phase, RP-), ionkizárásos (ion-ecchange, IE ), és méret-kizárásos (size-exclusion, SE-) HPLC-ás töltetekké módosíthatók.

2.3.2.1 RP-HPLC Amikor 1983-ban elérhetővé váltak a megfelelő visszanyeréssel működő, nem irreverzibilis kötéseket létrehozó kolonnák, Bietz elsőként publikálta az endoszperm tartalékfehérjék RPHPLC-vel történő elválasztását (Bietz, 1983). Az RP-HPLC technika első gabonakémiai alkalmazása során kiderült, hogy a tartalékfehérjék redukálását és alkilezését követően a különböző frakciók meghatározott sorrendben hagyják el a kromatográfiás oszlopot.: 1) gliadinok, 2) HMW glutein alegységek, 3) - és -gliadinok, 4) LMW glutenin alegységek, 5) -gliadinok (Bietz & Burnouf, 1985). Ezzel lehetővé vált a búza tartalékfehérjék RP-HPLC-s elúciós sorrendje alapján történő karakterizálása és a különböző búzafajták tartalékfehérje frakcióinak minőségi és mennyiségi összehasonlítása. Bietz RP-HPLC-s módszerét ezután számos alkalommal finomították, optimalizálták. Vizsgálták a szilikagélen kötött szénlánc hosszának (C3, C4, C8, C18), az oszlopok hosszának, valamint a töltetek és pórusátmérők változtatásának hatását az elválasztás hatékonyságára nézve (Bietz & Cobb, 1985; Burnouf & Bietz, 1984; Chen & Horváth, 1995; Huebner & Bietz, 1987; Kruger & Marchylo, 1985; Marchylo et al., 1992a; Marchylo & Kruger, 1988; Marchylo et al., 1989; Wieser et al., 1998). A gliadin fehérje frakciók és a glutenin alegységek elválasztására is alkalmas egyszerűsített ejárást Larroque és mtsai dolgozták ki ausztráliában (Larroque et al., 2000) Marchylo és mtsainak módszere alapján (Marchylo et al., 1989). A sikért alkotó glutenin polipeptidek 24 Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

elválasztási hatékonyságának fejlődése jelentősen bővítette a sikérkomplexről alkotott korábbi ismereteket (Lookhart et al., 2003; Wieser et al., 1998; Wright et al., 2000). Bár az RP-HPLC fajtaazonosításban betöltött szerepe kezdetben meglehetősen hangsúlyos volt (Bietz & Cobb, 1985; Marchylo et al., 1988; Scanlon et al., 1989), ma már fontosabb, hogy az RP-HPLC technika a glutenin alegységek vizsgálatán keresztül jól használható minőségi paraméterek becslésére (Bushuk et al., 1997; Huebner & Bietz, 1985; Jia et al., 1996; Kruger & Marchylo, 1990; Lafiandra et al., 1993; Larre et al., 1997; Marchylo et al., 1989; Marchylo et al., 1992b; Sivri et al., 1999; Skerritt et al., 1999; Triboi et al., 2000). A hexaploid búza kromoszómális vizsgálatai alapján megállapították, hogy az RP-HPLC kromatogram elején található első négy csúcs az 1D és 1B kromoszómák hosszú karján kódolt fehérje alegységei. SDS-PAGE alapján kiderült, hogy ezek az alegységek HMW glutenin alegységek, melyek a sütőipari minőség kialakításáért nagyrészt felelősek. A HMW alegységek mellett az RP-HPLC kromatogram végén található gliadin fehérjék is összefüggésbe hozhatók a búza sütőipari minőségével.

2.3.2.2 SE-HPLC Az SE-HPLC az elválasztáshoz alkalmazott oszlopok nagy pórusátmérőjének (450, 240, 130 A) köszönhetően megfelelő lehetőséget nyújthat az 500 és 1 millió Da közötti molekulasúly viszonylag gyors és pontos vizsgálatához (Alfredson et al., 1982). A fajták azonosítása és minőségi értékének meghatározása végett is fontos volna a tartalékfehérjék méretének ismerete. Ennek azonban van egy nagyon jelentős méréstechnikai akadálya. A természetben előforduló natív sikér molekulasúlya meghaladhatja a 10 millió Daltont (Huebner & Wall, 1976) és molekulaszerkezet felbomlása nélkül nem vihető oldatba. SEHPLC-vel tehát a könnyen oldódó kisebb molekulatömegű sikérfehérjék, illetve a nagy molekulatömegű fehérjék bontása (redukálás vagy szonikálás) során keletkező HMW-, és LMW-alegységek választhatók el. A mai napig megoldhatatlan gond – ahogy azt a 70-es években Orth és Bushuk elöszőr leírta – hogy a sütőipari minőséggel legjobban a sikérpolimer nagy molekulatömegű glutenin frakcióinak mennyisége korrelál, ami a legnehezebben extrahálható illetve oldható (Shewry et al., 2009a). A monomer és polimer sikérfehérjék aránya illetve az aggregáció mértékének egy bizonyos kritikus határ feletti értéke (hívták már oldhatatlan glutenineknek (Orth & Bushuk, 1972; Sapirstein & Fu, 1998), glutenin macropolymernek (Weegels et al., 1996b) és nem extrahálható polimerikus fehérjéknek is (Gupta, 1993)) 25 Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

egyértelműen összefügg a búza funkcionális tulajdonságaival. A nem extrahálható polimerikus fehérjék (unextractable polymeric protein, UPP) mennyiségi mérésének van egy nagyon fontos sajátossága, ami kiemeli a többi kromatográfiás módszer közül. Annak ellenére, hogy az SE-HPLC technikában ma nem létezik olyan oszlop, amelyiknél a glutenin polimer ne az elúciós térfogatnál eluálódna, kétlépéses extrakció segítségével (szonikációval és szonikáció meghatározható

(Gupta,

1993).

A

nélkül)

szonikálás

az UPP

nélkül

mennyisége pontosan

kapott

polimerikus

frakció

mennyiségének és a szonikálással valamint a nélkül is kapott polimerfrakciók összegének százalékban kifejezett hányadosa eredményezi az UPP értéket. A UPP mennyiség tehát egy olyan molekulaméret-eloszlásra jellemző érték, amely még mechanikai roncsolás (szonikálás) előtt jellemzi a sikérpolimer méreteloszlását.

2.3.2.3 Flow Field-Flow frakcionálás (FFF) A sikérpolimer-fehérjék elválasztásának területén egy viszonylag új technika a Field-flow fractionation (FFF) (Stevenson & Preston, 1996; Stevenson et al., 2003), amelyet speciális fényszórásos detektor segítségével már direkt molekulaméret meghatározásra is használtak (Arfvidsson et al., 2004). Az FFF technika elméleti alapjait Giddings és Myers foglalták össze (Giddings, 1993; Myers, 1997). A módszer keskeny és nyitott rétegben áramoltatva választja el makromolekula oldatok és kolloidok frakcióit diffúziós együtthatójuknak megfelelően. Mivel szemcsés töltet nélkül történik az elválasztás, nincs felső molekulatömeg-határa a módszernek. Így olyan makromolekulák elválasztására is alkalmas, amelyekre a hagyományos elválasztási technikák nem adnak megfelelő visszatartást.


2.4 A sikérfehérjék hidrodinamikai tulajdonságainak vizsgálata A sikér a glutenin alegységeinek összekapcsolódásával jön létre, ezért polimernek is nevezi a szakirodalom. Általánosan elfogadott az a megállapítás, hogy a sikér rugalmas tulajdonságai a gluteninnel függenek össze (Anderssen, 1999; Lindsay & Skerritt, 1999; MacRitchie, 1992; Shewry & Halford, 2002; Shewry et al., 2000; Wieser, 2007). Az újabb kutatások kiemelik, hogy a sikér minősége szempontjából fontos szerepe van a glutenin polimerizációs fokának, vagyis a glutenin molekulák nagyságának. A búzaminőség évjáratonkénti ingadozásának tanulmányozása során kapott új eredmények azt mutatják, hogy a nagy polimerizációs fokú glutenin molekulák nagyobb aránya a sikérben a kedvezőbb sütőipari minőség jele. A nagy polimerizációs fokú glutenin elválasztása és molekula tömegének (molekulatömeg eloszlásának) a meghatározása bonyolult elválasztási műveleteket és méréseket igényel.

2.4.1 Makromolekula oldatok viszkozitásának vizsgálata 2.4.1.1 A viszkozitás és mérése Definíció szerint a viszkozitás avagy a belső súrlódás alatt a folyadék (oldat) azon tulajdonságát

értjük,

hogy a szomszédos

folyadékrétegek egymáshoz viszonyított

elmozdulásával szemben ellenállást fejt ki. A viszkozitás értelmezését elsőként Newton adta meg, aki feltételezte, hogy a rétegek egyenletes és párhuzamos áramlás esetén az elmozdulás irányával ellentétes irányú súrlódó erő egyenesen arányos a súrlódó felületek nagyságával és a sebesség gradienssel. Az arányossági tényező az adott folyadék anyagi minőségére jellemző állandó, a dinamikai viszkozitás (η). A kinematikai viszkozitás alatt a dinamikus viszkozitás és a folyadék sűrűségének a hányadosát értjük. Használatos a relatív viszkozitás, amely dimenzió nélküli szám, és azt fejezi ki, hogy a vizsgált anyag viszkozitása hányszor nagyobb vagy kisebb egy vonatkozási alapként választott anyag (általában a desztillált víz) viszkozitásánál. Oldatok vizsgálatánál számítják a fajlagos vagy specifikus viszkozitást, amely az oldószer és az oldat relatív viszkozitásának a különbsége (ηsp= ηrel-1). Végül a jellemző viszkozitást (angolul: intrinsic viscosity) [η], amelyet határ viszkozitásnak vagy Staudinger indexnek is


neveznek, és amelyet a redukált viszkozitásnak zérus koncentrációra való extrapolálással nyernek: [η]=(ηsp/c)c=0, ahol c az oldott anyag (molekula) koncentrációja. A sokféle viszkozitás mérő készülék közül saját vizsgálatainknál a kapilláris viszkozimétert választottuk. A kapillárisban kialakuló áramlási viszonyok a legvilágosabbak, és így a legpontosabb vizsgálati körülmények kialakítására is itt nyílik lehetőség. A kapilláris viszkoziméterek alkalmazását egyszerűségük és olcsóságuk mellett nagyfokú pontosságuk is indokolja.

2.4.1.2 A fehérjeoldat viszkozitása és a fehérjemolekula mérete illetve alakja közötti összefüggés Einstein vizsgálatai mutattak rá, hogy a gömb alakú, tömör szerkezetű molekulák oldatának viszkozitása arányban áll az általuk elfoglalt térfogattal, amit az alábbi egyenlettel fejezett ki: η= η0(1+2,5φ) ahol η0 az oldószer viszkozitása, φ az oldott molekula térfogataránya. Ha a molekula nem gömb alakú, pl. elnyúlt ellipszoid, és lazább a szerkezete, akkor nagyobb felületen érintkezik az oldószerrel, nagyobb térfogatarányt foglal el, jobban fékezi a folyadékrétegek egymás melletti elmozdulását, s így nagyobb lesz a viszkozitása. Az előbbi egyenletben a 2,5 helyébe egy nagyobb szám kerül. Még nagyobb a viszkozitás, ha hosszabb rúd alakú molekuláról van szó ugyanazon okok miatt, mint amelyeket az előzőekben fejtettünk ki. A sikért alkotó gliadinokkal végzett mérések azt mutatták, hogy ezek a molekulák erősen megnyúlt alakúak, a hosszúság-szélesség arány a 10-et is meghaladhatja. A glutenint felépítő alegységek esetében a hosszabb rúdalakot lehetett megállapítani (Field et al., 1987; Purcell et al., 1988; Tatham et al., 1990). A szakirodalomban a molekula alak és méret jellemzésére szokás a jellemző viszkozitás értéket kiszámítani (Tatham et al., 1990a). A tökéletes gömbalak esetében a jellemző viszkozitás értéke 2,5 ml/g. A 3-4 értékek általában ellipszoid alakú molekulákra utalnak. Erősen nyújtott vagy rúd alakú fehérje molekuláknál a számított jellemző viszkozitás meghaladhatja a 10 ml/g-ot is.


2.4.1.3 A szárazsikéroldat viszkozitása a glutenin átlagos molekulatömegének függvényében A polimer makromolekulák méreteloszlás-vizsgálatának kezdete konkrét időponthoz köthető. Herman Staudinger 1953-ban kémiai Nobel díjjal elismert hipotézise szerint a polimerben található kisebb molekulák nem csak a szerves kolloid fázisokra jellemző fizikai kapcsolatokkal rendeződnek, hanem kémia kötéseken keresztül alkotnak láncszerű struktúrát (Staudinger, 1920; Staudinger, 1932). Valamint: a) előállíthatók olyan molekulák, amelyek magasabb polimerizációs fokú halózatot hoznak létre; b) a létrejövő makromolekulák kémiai módosítás hatására is megtartják tulajdonságaikat; c) az ilyen hálózatok viszkozitását a legnagyob molekulaméretű komponens határozza meg. A kutatások eredményként Staudinger megállapította, hogy lineáris struktúra esetében az ilyen makromolekulák oldatainak a viszkozitása arányos a molekula nagyságával, azaz a polimerizációs fokkal. a

[η]= kM

ahol M- a molekula tömeg (vagy a polimerizációs fok) míg a k és az a állandók, amelyek az adott oldószer-fehérje párra jellemzőek.


2.5 A sikérfehérjék komplex rendszerekben A táplálkozás-egészség kapcsolatkörben végzett újabb kutatások hatására jelentős változások következtek be a sütőipari gyártás és gyártmányfejlesztésben. A gyakorlati fejlesztés egyik gyakori iránya a sütőipari termékek táplálkozási értékének növelése olyan más növényi fehérjékkel, amelyek biológiai értéke kedvezőbb a búza fehérjéinél. Az előbbiekben említett növényi fehérjék közül jelentősen megnőtt az érdeklődés egyes pszeudo-cereáliák (fehérje koncentrátumok és izolátumok) sütőipari alkalmazása iránt. Ez az alkalmazás szükségessé teszi az új fehérjék és a sikérfehérjék közötti kölcsönhatás vizsgálatát.

2.5.1 Pszeudocereáliák: amarantusz és quinoa A Földünkön található mintegy 350 000 növényfajból csupán 150 fajt termesztenek aktívan, közvetlenül az emberi táplálkozás számára, vagy állati takarmányként, s ezek közül 30 faj termeli meg az ember számára szükséges kalóriák és proteinek 95%-át (Menini, 1999). Élelmiszereink kb. felét csupán a következő négy növényfaj szolgáltatja: rízs, kukorica, búza és burgonya. Hogy a Föld népességének folyamatos növekedése mellett az élelmiszeripari felhasználásra kerülő növények esetleges diverzitásnövelésében a genetikai módosítással megerősített molekuláris biológia, vagy a jelenleg kevéssé hasznosított termények hasznosítása kap hangsúlyt, azt valószínűleg a gazdasági, élelmiszerbiztonsági és az életminőség javítását célző tényezők együttes hatása fogja eldönteni. Az amarantusz (Amaranthus sp.) és a quinoa (Chenopodium quinoa) régi szemtermények, melyek iránt az utóbbi időkben fokozottabb érdeklődés mutatkozik a növénytermelés diverzifikálása területén (Belton & Taylor, 2002; Breene, 1991; Saunders & Becker, 1984). Ennek oka, hogy a magtermések nagy mennyiségben tartalmaznak táplálkozás-élettanilag fontos, jól emészthető anyagokat. A gabonáknál nagyobb, és jobb minőségű a fehérjetartalmuk, melynek lizinben gazdag része vízben oldódó albumin és sóoldható globulin. A keményítő jobb emészthetősége, a nagyobb lipidtartalom és a kalcium koncentráció szintje lehetőséget nyújt az amarantusz és quinoa magok és őrlési termékeik élelmiszeripari felhasználására főleg a gabonafeldolgozási termékek területén. Bár a nagy hozamok elérésére irányuló modern termesztési rendszerekbe néhány hátrányos agronómiai tulajdonságaik miatt (talaj cserepedésével szembeni érzékenység, túlzott elágazási hajlam,


magszóródás, késői érés) csak nehezen illeszthetők be, új fajták előállításával és a megfelelő piac megteremtésével mindkét faj hozzájárulhat az élelmiszernövények választékának bővítéséhez.

2.5.2 Az amarantusz és quinoa tartalékfehérjék hatása a búzalisztből készült tészta reológiai tulajdonságaira A kenyérsütésre alkalmas liszt jellemzése a sikérmennyiség és -minőség, és a végtermék minőségének vizsgálatával történik. A sikér minőségét a belőle dagasztott tészta reológiai tulajdonságai (erőssége, nyújthatósága, stabilitása) és a sikér proteolites állapota (sikérterülés) határozza meg. A sikér reológiai tulajdonságainak mérésére alkalmas berendezések két fő típusra oszthatók: a tészta dagasztásán és nyújtásán alapuló készülékekre. A dagasztáson alapuló készülékek a tészta dagasztásához szükséges erőt illetve a tészta stabilitását mérik. Az ebbe a csoportba tartozó készülékek további két csoportja: az erőátvitel történhet tűs (Mixográf) ill. Z-alakú (Brabender Farinográf, Valirográf) dagasztókarral. A tészta nyújthatóságának és ellenállásának vizsgálatára alkalmas készülékek a Brabender Extenzográf és a Chopin Alveográf. Az amarantusz és quinoa termések élelmiszeripari felhasznásának számos lehetősége ismert, akár a teljes szemet tekintve, akár kiegészítő összetevőként a különböző sütőipari-, extrudáltés pattogatott termékekben, valamint süteményekben (Breene, 1991; Escudero et al., 2004; Kovács et al., 2001; Saunders & Becker, 1984). A fehérje készítmények területén (koncentrátumok, izolátumok, hidrolizátumok) is egyre növekvő igény jelentkezik az alternatív növényi fehérjeforrások iránt. Felhasználásuk célját tekintve az élelmiszerek táp- és biológiai

értékének

növelése,

valamint

azok

szerkezetének

javítása

egyaránt

a

pszeudocereáliák előnyös tulajdonsága lehet (Bajkai et al., 1996; Tömösközi et al., 1996; Tömösközi et al., 1994). Bár az amarantusz és quinoa növényekről egyre gazdagabb a tudományos irodalom, technológiai tulajdonságaikról és fehérje készítményeik funkcionális viselkedéséről még viszonylag keveset tudunk (Bejosano & Corke, 1998; Marcone & Kakuda, 1999; Silva-Sanchez et al., 2004). A nem gabonafélékhez tartozó, mégis hozzájuk hasonló lisztes magvú pszeudocereáliák élelmezésben betöltött szerepe tehát elsősorban magas táplálkozási értéküknek köszönhető. Elterjedésük a sütőiparban viszont csak akkor lehetséges, ha előnyös tulajdonságaik nem rontják számottevően a sikértartalmú termékek reológiai és egyéb minőségi tulajdonságait.


3 Célkitűzés

Egy adott búzafajta sütőipari minősége évről-évre változhat, mely jelenség rámutat arra, hogy a búzafajtákban rejlő genetikai lehetőség a külső (időjárási és ökológiai) hatások eredményeként romolhat. A végtermék minőségét alapvetően a sikérpolimer határozza meg. Ennek kialakulásával kapcsolatban elmondható, hogy a szemkialakulásra jellemző fizikai változások (szemtömeg, nedvességtartalom, száraztömeg), a sikéralkotó polipeptidek bioszintézise, valamint az érés különböző szakaszaiból származó búzalisztből kapott sikérfehérjék polimerizációja közötti összefüggések tisztázása további kutatómunkát igényel, melynek eredményi hozzájárulhatnak a genetikai potenciál jobb kihasználásához.

Ennek érdekében a következő konkrét lépéseket határoztuk meg:

 A búza szemkialakulási folyamatának követése és jellemzése a mintavételek napján meghatározható szemtömeg és nedvességtartalom változások alapján.  A monomer és polimer tartalékfehérje típusok bioszintézisének vizsgálatára alkalmas mintaelőkészítés kidolgozása és nemzetközi irodalom alapján választott RP-HPLC módszer optimalizálása.  Az egyes tartalékfehérje típusok és alegységeik szemtömegre vonatkoztatott mennyiségi változásának vizsgálata a kidolgozott RP-HPLC módszer segítségével.  A szemfejlődés különböző szakaszaiból származó sikérhálózat fehérje összetételének vizsgálata különböző kromatográfiás technikák (SE- és RP-HPLC) segítségével és következtetések levonása a fehérjék között kialakuló kölcsönhatásokról, különös tekintettel a nagy molekulatömegű polimer glutenin kialakulására.  A szemfejlődés kimosható sikért tartalmazó szakaszától kezdve, a sikérből készített oldat relatív viszkozitás változásának követése és lehetséges összefüggés keresése a polimer glutenin molekulatömegével kapcsolatban.  Egyes pszeudo-cereáliák sikérfehérjékkel való kölcsönhatásának vizsgálata


4 Anyagok és módszerek 4.1 Anyagok 4.1.1 A búzaminták eredete és mintavétele A tartalékfehérje alegységek bioszintézisének vizsgálatához magyarországi köztermesztésben elterjedt búzafajtákat (Gk-Öthalom, Mv-Palotás, Mv-Ködmön, Balada és Gk-Csongrád) használtam. A 2005 évi, hasonlóan korai érésű őszi búzamintákat az Országos Mezőgazdasági Minősítő Intézet (OMMI), illetve a MTA Martonvásári Mezőgazdasági Kutató Intézete bocsátotta

rendelkezésünkre.

A

búzákat

középkötött

vályogtalajon

termesztették,

hagyományos módon. A szükséges nitrogén műtrágya kétharmadát az őszi mélyszántáskor, egyharmadát a tél végén fejtrágyázással juttatták ki. Csapadék tekintetében a 2005. év az átlagosnál csapadékosabb volt. A búzanövények virágzása, majd megtermékenyülése után kb. a 12. napon kezdtem a mintavételt, amit 2-3 naponként folytattam az 53. napig (táblázat). 1010 kalászt gyűjtöttem és a kalászok közepéből vettem szemeket. 2006 évben az előző eljárás szerinti mintavételt megismételtük két új búzafajta (MV Magdaléna és Bánkúti 1201) vizsgálatával. A mintaszedés a MTA Mezőgazdasági Kutatóintézet Martonvásári telepéről történt a virágzástól számított kb. 10. naptól kezdve. A sikérpolimer in vivo kialakulásának 2006. évi vizsgálatához, az eddigiekhez képest jóval nagyobb mennyiségű mintára volt szükség. Mintavételi pontonként 90-120 kalász összes szemtermését (kb. 1000-1500 db/mintavétel) használtam fel a mérésekhez. Ekkora mintamennyiség beszerzésére a Mezőterm Bt. (Lórév) telepén termesztett Ukrainka búzafajta esetén (HMW-GS összetétel-1, 7+8, 5+10) volt lehetőség. A búzaminták az érés 6 különböző időpontjából származtak a virágzás utáni 12. naptól az 51. napig.

4.1.2 Az amarantusz és quinoa minták eredete A három amarantusz fajta közül a két Amaranthus cruentus fajtát (EDIT és AMAR) az MTA Ökológiai és Botanikai Kutatóintézete (Vácrátóti Botanikus Kert), míg az Amaranthus hypochondriacus fajtát (PO22) a Klorofill Bt., Kecskemét biztosította a liszt és fehérje izolátum vizsgálatokhoz. A quinoa vizsgálatok egy mexikói eredetű, hazai kereskedelmi forgalomban található fajtával történtek.


4.2 Módszerek 4.2.1 A búza sikérképző fehérjék (gliadinok és gluteninek) bioszintézisének vizsgálata A búza szemfejlődésének követését a mintavétel mindkét évében (2005 és 2006) a szemek tömegének és nedvességtartalmának (valamint az ezekből számolt száraztömeg) mennyisége alapján végeztük. A 2005. évi minták szolgáltak a mintaelőkészítés módszerkidolgozásának és az RP-HPLC módszer adaptálásának alapjául. Ezen módszerek segítségével történtek a 2006. évi minták bioszintézis vizsgálatai.

4.2.1.1 Szemtömeg, nedvességtartalom meghatározása A két évjáratból (2005 és 2006) származó búzaminták szemtömeg és nedvességtartalom meghatározása a mintavétel napján történt. A búzaszemekről leválasztottam a toklászt illetve a terméshéjat. A korai, lágy minták néhány esetben sérülést szenvedtek felületükön, ami a nedvesség és nitrogéntartalom mérését feltehetőleg nem befolyásolta. A megtisztított búzaszemeket megszámoltam és tömegüket analitikai mérlegen megmértem. Az össztömeg és a magok száma alapján számítottam a magok átlagos szemtömegét. A búzamagok nedvességtartalmát az MSZ szabványnak megfelelően határoztam meg (MSZ63-67-3, 1983). Az adott fajta mintáiból 3 párhuzamos mérést végeztem. 1-1 g mintát mértem ki analitikai mérlegen, majd szárítottam 4 órán keresztül 105 ± 2

0

C-os

szárítószekrényben. Min. 20 perces exszikkátorban való hűtést követően visszamértem a minták tömegét. Az átlagolt nedvestömeg és nedvességtartalom adatokból számítottam a szemek száraztömegét.

4.2.1.2 A teljes búzaszemek mintaelőkészítése RP-HPLC méréshez Az előző mérések során fel nem használt búzamintákból származó magvakat (érési mintánként 40 db mag) 6 napig légszárítottam. Ezután tömegmérést végeztem a lisztkihozatal meghatározása céljából, majd dörzsmozsárban összetörtem (homogenizáltam) a mintákat. A lisztminta szemcseméret szerinti frakcionálását a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Élelmiszertudományi és Alkalmazott Biotechnológia Tanszék munkatársainak


segítségével kis mintamennyiségek kezelésére kifejlesztett laboratóriumi mikroszita segítségével végeztem (Metefém, Hungary). 250 µm lyukátmérőjű szitát használtam, mert Magyarországon a 250 µm szemcseméret alatti liszt használható fel malmi, illetve sütőipari feldolgozásra. A frakcióknak külön-külön is lemértem a tömegét és a lisztet, valamint a korpát légmentesen záródó zacskókba raktam a későbbi nitrogéntartalom és HPLC vizsgálatokhoz. A nitrogén- (nyersfehérje-) tartalom meghatározás a lisztfrakció egy kis részéből (25 mg) történt. A méréshez egy automatikus nitrogén/fehérje analizátort használtam (LECO FP-528 Nitrogen/Protein Determinator, LECO Corp., USA). A Dumas-Pergl-féle égetéses eljáráson alapuló módszerrel kapott teljes redukált nitrogéntartalmat 5,7-es faktorral szorozva számoltam a fehérjetartalmat.

4.2.1.3 Fordított

fázisú

folyadékkromatográfiás

(RP-HPLC)

módszer

optimalizálása A gliadin fehérjék és a glutenin alegységek elválasztásához Larroque és mtsainak módszerét vettem alapul (Larroque et al., 2000). 50mg búzaliszt gliadin tartalmának kinyeréséhez 1ml 200µl/l mennyiségű propiofenon retenciós standardot tartalmazó 70%-os etanol oldatot adtam. A mintákat 30 percig 2000 rpm-en rázattam rázógépen (Vibrax VXR basic, IKA, Brasil) és 0,45m-es PVDF szűrőn (Millipore, USA) szűrtem. Az elsősorban gliadinokat tartalmazó szűrletet közvetlenül injektáltam az RP-HPLC készülékbe. A gliadin tartalomtól nagyrészt mentesített extrakciós maradékot kétszer 1ml 50%-os propanollal tovább mostam. A mosások során a mintákat fél-fél óráig rázattam, majd centrifugáltam (17000g, 5 perc) az esetleges gliadin maradványok eltávolítása végett. A maradék gliadinokat tartalmazó felülúszót elöntöttem és a gluteninben gazdag extrakciós maradékhoz 1ml redukáló puffert (50% propanol, 2M karbamid, 0,2M Tris, pH=6,6, frissen 1v/v% DTT) adtam. A reakcióelegyet vortex keverővel rázattam, majd 1 óráig 60 oC-os vízfürdőben tartottam, miközben legalább kétszer újra átkevertem a mintákat. Ezután az alkilezés 10µl 4-vinilpiridin hozzáadásával 60oC-on további 15 percen át történt. A lecentrifugált (17000g, 5 perc) felülúszót 0,45µm-es pórusátmérőjű PVDF szűrőn át mintatartó edénybe szűrtem. A szűrlet a redukált és alkilált polimer frakciót tartalmazta, amit közvetlenül injektáltam a kromatográfba. Az analitikai elválasztást egy automata mintavevővel és diódasoros detektorral felszerelt HPLC készülékkel végeztem (Series 200 HPLC System, Perkin Elmer, USA), valamint


TotalChrom kromatográfiás szoftver segítségével értékeltem. A gliadin és glutenin mintákat 250 mm hosszú és 4,6 mm átmérőjű, 10 µm pórusátmérőjű, fordított fázisú C18-as oszlopra (Vydac C18 218TP104) injektáltam. A gliadinok elválasztásához 0,3 v/v% trifluor-ecetsavat (TFA) tartalmazó víz-acetonitril eluenspárt használtam. A gradiens elució során az acetonitril koncentráció 65 0C-os oszloptér hőmérsékleten 59 perc alatt 25%-ról 50%-ra növekedett (gradiens elúció: 0,5 perc, 25%; 7 perc, 31%, 9 perc, 34%, 5 perc, 36%; 15 perc, 40%; 5 perc, 42%; 18 perc, 50%) és 10 perc alatt állt vissza 25%-ra. A glutenineket 50 0C-on választottam el ugyanezzel az eluenspárral, de a TFA koncentrációt 0,1 v/v%-ra csökkentve (gradiens elúció: 0,5 perc, 24% acetonitril; 17 perc, 30%; 20 perc, 35%; 23 perc, 60%; 5 perc 24%). A detektálás mindkét esetben 210 nm-en történt. A fehérje frakciók relatív mennyiségét az RPHPLC kromatogramok alapján számított csúcs alatti területekből számoltam. A kromatográfiás rendszer alkalmasságának és változatlan elválasztási hatékonyságának ellenőrzés céljából minden hatodik minta után referencia mintát (Chinese Spring) futtattam. A független rendszeralkalmassági párhuzamos vizsgálatok mérési eredményeinek statisztikai elemzését t-próba végzésével vetettem össze. A kapott eredmények szerint a párhuzamos kromatogramok csúcs alatti területei között 95%-os konfidencia szinten szignifikáns eltérést nem tapasztaltam. A retenciós idők ismételhetősége a viszonylag hosszú elúciós idő ellenére minden kiválasztott komponens esetén 5% relatív különbségen belül maradt. Az injektálás szórásából származó mennyiségi különbségek elkerülése végett a mintákhoz propiofenon retenciós standardot adtam.

4.2.1.4 Diagonális SDS-PAGE A diagonális SDS-PAGE módszert Gupta és mtsai fejlesztették ki, aminek segítségével a redukálható polimer fehérjék mennyiségét vizsgálták (Gupta et al., 1995). A tartalékfehérjék bioszintézis vizsgálalatianak kiegészítéseként, ezt a módszert oxidatív körülmények között adaptáltam. Első lépésben az érés különböző fázisaiból származó lisztmintákból (50 mg) extraháltam a 70%-os etenolban (500 l) oldható monomer tartalékfehérjéket. Ezt a frakciót a hagyományos Laemmli-féle SDS-PAGE módszerrel választottam el (Laemmli, 1970). 50 l extraktumhoz ugyan ekkora mennyiségű minta puffert adtam (Tris/HC1, pH 6.8, glicerin és brómfenolkék). Mintánként 2 párhuzamost futtattam (4% akrilamid „stacking” gél, 12% akrilamid szeparáló gél, 100V elválasztási feszültség, 70 perc futtatás). A minták egyik felét Coomassie Briliant Blue R-250 festékkel festettem. A párhuzamosan futtatott minták másik felét vízzel


kimosható Ponceau Red festékkel való jelzés után kivágtam a gélből. A kivágott gélcsíkot ezután vízzel mostam és a vízhez 0.1% (m/m) KIO3-at adagoltam oxidáció céljából. Az oxidációt 1 órán keresztűl végeztem. Az gélcsíkot ezután két üveglep közé szorítottam és ráöntöttem először a stacking, majd a szeparáló gélt. A második futtatást az első futtátásnak megfelelően végeztem (70 perc, 100V). A második dimenzióban történő elválasztás után a mintákat Coomassie Briliant Blue-val festettem.

4.2.2 A búzalisztből képzett sikérpolimer oldatainak vizsgálata az érési folyamat során 4.2.2.1 A sikér mennyiségi meghatározása A 2006 évi Lórév telepről származó búzamagokat 6 napig légszárítottam. A mintákat az FQC109 laboratóriumi malom (Metefém, Hungary) segítségével őröltem. Az őrlést követően 250 µm lyukátmérőjű analitikai rázató szitával (AS-200 basic, Retsch, Germany) választottam el a lisztfrakciót a héjrésztől. Bár a nedves sikér kézzel történő meghatározását ma már új MSZ szabvány írja le (MSZ-ENISO:21415-1, 2007; MSZ-EN-ISO:21415-3, 2007) a mintaszedés évében a hagyományos eljárást alkalmaztam. A sikérmennyiség meghatározásához 5 g lisztből és a liszttömeg 60%ának megfelelő 2%-os sóoldattal készítettem tésztát, melyből 30 perc pihentetés után vizes mosással távolítottam el a szilárd és vízoldható lisztalkotókat. A visszamaradt anyag a nedves sikér, amit a további vizsgálatokhoz fagyasztva szárítottam (Freeze Dryer Alpha-1-4, Martin Christ GmbH, Germany). A fagyasztva szárított sikér egy részéből fehérjetartalmat mértem automatikus nitrogén/fehérje analizátor segítségével (LECO FP-528 Nitrogen/Protein Determinator, LECO Corp., USA). A maradék sikér- és lisztmintákat a sikérvizsgálatok megkezdéséig szobahőmérsékleten tároltam.

4.2.2.2 Méretkizárásos- és fordított fázisú folyadékkromatográfia (SE-és RPHPLC) A szárított sikér minták molekulaméret szerinti eloszlásának vizsgálatát az MTA Mezőgazdasági Kutatóintézet (Martonvásár) laboratóriumában végeztem. Az analízis Batey és mtsai (Batey et al., 1991), illetve Gupta és mtsai (Gupta et al., 1993) által kidolgozott


módszer alapján történt. A mintaelőkészítés során kétféle extrakciót végeztem a liszt és a sikér mintákon. Az első lépésben 10 mg liszthez, illetve 4 mg szárított sikérhez 1 ml pH=6,9es foszfát-puffert adtam, majd az oldatokat 30 percig rázattam és centrifugáltam (10 perc, 12000 g). A felülúszókat 0,45µm-es pórusátmérőjű PVDF szűrőn át mintatartó edénybe szűrtem („oldható” frakció). Második lépésben a visszamaradt csapadékokat 1 ml pufferben 30

másodpercig

50%-os

amplitudóval,

szobahőmérsékleten

szonikáltam,

majd

a

fehérjeoldatokat centrifugáltam (10 perc, 12000 g) és szűrtem („oldhatatlan” frakció). Az így kinyert fehérjéket Alliance, Waters 2695 típusú HPLC készüléken méretkizárásos HPLC (Phenomenex BioSep-SEC-S4000, 300 x 7, 80 mm, 5 micron clone) oszlopon választottam el. A mintákat 50% acetonitril és 50% desztillált víz keverékében eluáltam, melyhez 0,1% TFA-t adtam. Az analízis ideje 10 perc volt. A kapott kromatogramok értékelése EZChrom Elite szoftver segítségével történt. A szárított sikér minták glutenin tartalmának RP-HPLC-s elválasztását a 3.2.1.3 alfejezetben leírt módon végeztem.

4.2.2.3 A szárazsikérből készült oldatok relatív viszkozitásának meghatározása A 4.2.2.2 fejezetben leírt szárított sikér minták karbamidos oldatának viszkozitását módosított Ostwald viszkoziméterrel (Cannon-Fenske, 0,1 cm belső átmérő, 20 cm hosszú) mértem. A viszkoziméter nagyméretű szobahőmérsékletű desztillált vízzel töltött termosztátban volt elhelyezve. Az oldat készítéséhez 0,12 g szárított sikért mértem be 3 tizedesjegy pontossággal. A bemért sikérmintát 6 ml pH=9,01-es Sörrensen pufferben oldottam 10 M-os, nemkovalens kötéseket (elsősorban hidrogénkötéseket) bontó hatású karbamid hozzáadásával. A makromolekulák oldódását 12 órán keresztül, a viszkozitás mérése előtti napon végeztem. A homogenizált oldatot a lebegő szemcsék eltávolítása céljából centrifugáltam, majd 0,45µmes pórusátmérőjű PVDF szűrőn át szűrtem. Az így megszűrt oldatból 5 cm3-t használtam a méréshez. A különböző érési idejű minták mérése előtt desztillált víz átfolyási sebességének mérésével ellenőriztem a viszkoziméter tisztaságát. A Hagen-Poiseuille-törvény alapján az adott folyadék viszkozitása a mért adatokból elméletileg kiszámítható. De mivel az abszolút méréshez a készülék méreteinek pontos ismerete szükséges, ezért összehasonlító méréseket végeztem ismert sűrűségű és viszkozitású desztillált vízre vonatkoztatva az eredményeket.


4.2.3 A sikér- és amarantusz illetve quinoa fehérjék kölcsönhatása komplex rendszerben Az amarantusz és quinoa magok laboratóriumi malom segítségével lettek őrölve (Chemotec, LabMill, Tecator AB, Sweden) 1 mm-nél kisebb szemcseátmérőt eredményezve az őrleményben. Az őrlemény zsírtalanítása az adott mintamennyiségnek megfelelő háromszoros térfogatmennyiségű hexán hozzáadásával, majd 3 órás rázatással történt. A hexán eltávolítása után (vákuumos bepárlás) a zsírtalan liszteket szűrőpapíron szétterítve elszívófülkében szárítottam. A zsírtalanítást 1% zsírtartalom eléréséig ismételtem.

4.2.3.1 Fehérje izolálás amarantusz és quinoa magokból A zsírtalanított alapanyagot 10-szeres mennyiségű desztillált vízben szuszpendáltam. Mágneses keverőn történő keverés mellett a szuszpenzió pH-ját 1M-os NaOH-val 9,5-re állítottam és 60 percig folytattam az extrakciót. Ezután a szuszpenziót lecentrifugáltam (4400g, 20 perc), a kapott felülúszót hűtőben tároltam. Az extrakciót újra elvégeztem a centrifugacsövekben maradt csapadékkal. A felülúszók összeöntése után izoelektromos kicsapással (1M HCl, pH=4,5) kinyertem a fehérjéket. A lecentrifugált csapadékot (4400g, 30 perc) alumínium tálcára mostam és liofilizáltam.

4.2.3.2 Reológiai tulajdonságok vizsgálata A különböző kísérleti tészták reológiai tulajdonságainak vizsgálatát mikrovalorigráffal (Metefém, Magyarország) végeztem. A készülék 2 grammos minták vizsgálatát teszi lehetővé. A következő jellemző adatokat határoztam meg:  vízfelvevőképesség

(az

optimális

tésztakonzisztencia

eléréséhez

szükséges

vízmennyiség, a liszt százalékában kifejezve)  tésztakialakulási idő (a maximális konzisztencia eléréséhez szükséges idő percekben)  tésztastabilitás (a tésztakialakulástól a tészta ellágyulásának kezdetéig eltelt idő percekben)  a tészta ellágyulás (relaxáció) mértéke valorigráfos egységekben kifejezve


5 Mérési eredmények és értékelésük 5.1 A búza sikéralkotó tartalékfehérjék (gliadinok és gluteninek) bioszintézisének vizsgálata 5.1.1 A mintavétel körülményei A búza tartalékfehérjék (gliadinok és glutenin alegységek) bioszintézisének vizsgálatát először 2005. évben termesztett, azonos termőhelyről származó (Országos Mezőgazdasági Minősítő Intézet, OMMI) 5 őszi búzafajta mintán (MV Palotás, MV Ködmön, Balada, GK Csongrád, GK Öthalom) végeztük (4. táblázat). Az őszi búza virágzásának jellemző időszaka május utolsó hetétől június első két hetéig terjed (05.25.-06.15.). Az általunk kiválasztott fajták ennek megfelelően virágoztak. A megtermékenyülést és a szemképzést megelőző virágzás időpontjában pár nap eltérést tapaszaltunk egy adott búzafajta mintán belül. A betakarítás, a virágzás utáni napokat (days post anthesis, DPA) tekintve az 50. nap környékén történt, amikor a szemek nedvességtartalma 20-10% közé csökkent. A mintavételt az aratás előtti napig (07.20.) folytattuk.

Minta 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. Aratás

Virágzás napja Mintaszedés dátuma 06.13. 06.15 06.17. 06.20. 06.22. 06.24. 06.27. 06.30. 07.04. 07.06. 07.07. 07.12. 07.14. 07.15. 07.18. 07.20. 07.21.

MV Palotás

MV Ködmön

Balada

GK Csongrád

GK Öthalom

05.30.

05.30.

06.04.

05.27.

06.01.

Virágzás utáni napok száma (days post anthesis, DPA) 14 16 18 21 23 25 28 31 35 37 38 43 45 46 49 51 52

14 16 18 21 23 25 28 31 35 37 38 43 45 46 49 51 52

9 11 13 16 18 20 23 26 30 32 33 38 40 41 44 46 47

17 19 21 24 26 28 31 34 38 40 41 46 48 49 52 54 55

12 14 16 19 21 23 26 29 33 35 36 41 43 44 47 49 50

4. táblázat: A 2005. évi mintavétel fontosabb adatai a búzafajták érése során


2006-ban a mintavételt 2 új búzafajta (MV Magdaléna, Bánkúti 1201) bevonásával megismételtük. A mintákat ezúttal a MTA Martonvásári Mezőgazdasági Kutató Intézete biztosította számunkra. A mintavétel és a virágzás körülményei az előző évihez hasonlóan alakultak (5. táblázat).

Virágzás napja Minta 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. Aratás

MV Magdaléna

Bánkúti 1201

05.26.

05.23.

Mintaszedés

Virágzás utáni napok száma

dátuma

(days post anthesis, DPA)

06.07. 06.09. 06.12. 06.14. 06.16. 06.19. 06.21. 06.23. 06.26. 06.28. 06.30. 07.03. 07.05. 07.07. 07.10. 07.11.

12 14 17 19 21 24 26 28 31 33 35 38 40 42 45 46

15 17 20 22 24 27 29 31 34 36 38 41 43 45 48 49

5. táblázat: A 2006. évi mintavétel fontosabb adatai

Az MV Magdaléna fajta választásával az eddigiektől eltérően egy közép-késői érési csoportba tartozó fajtát is vizsgálni tudtunk, míg a Bánkúti 1201 fajta különleges allélösszetétele és minősége miatt tart nemzetközi tudományos érdeklődésre is számot, ami megkönnyíti a más eredményekkel történő összehasónlíthatóságot. Az eredmények következő alfejezetekben történő ismertetését az újabb, 2006-os 2 búzafajtán kezdem. A levont következtetéseket ezután a nagyobb elemszámú (n=5) 2005-ös mintahalmazon is ellenőrzöm. A mérési eredményeket 400-600 búzaszem adataiból átlagoltam.


5.1.2 A búza szemkialakulási folyamatának követése A búzaszemben található tartalékfehérjék mellett egyéb szárazanyag összetevők (keményítő szemcsék, lipidek, rostanyagok) is szintetizálódnak az érési folyamat során. A tartalékfehérjék bioszintézisét érdemes a teljes szárazanyag-tartalom változással párhuzamosan vizsgálni az általános fiziológiai folyamatok megismerése érdekében. A búzaszem szárazanyagtartalmának

változását

a

búzaszemtömeg

és

a

búzaszem

nedvességtartalmának

különbségeként lehet követni. A szemtömeg változását ábrázolva haranggörbe típusú változás figyelhető meg (8. ábra). Az érési szakasz elején (12-26 DPA) a szemtömeg egyenletes növekedése jellemző. Az érési folyamat középső periódusában (26-36 DPA) a búzaminták szemtömegei közel állandóak. Az érési folyamat vége felé közeledve (36-43 DPA) a szemtömegek csökkennek. Végül az aratást közvetlenül megelőző pár napban (43-48 DPA) a búzaszemek elérik végleges szárazanyag- és nedvességtartalmukat, így szemtömegük már nem változik jelentős mértékben. A kb. jelet () azért használom a virágzás utáni napok száma (days post anthesis, DPA) előtt, mert a búzafajták virágzása még adott fajtán belül sem esik ponotosan egy napra. A 2006. évben mért 2 búzafajta között 3 nap különbség van a virágzás napját tekintve. A nagyobb mintaszámú (n=5) 2005. évi fajták esetében a virágzások napja között még nagyobb különbség tapasztalható (4. táblázat). Az elsőként virágzó GK Csongrád és az utolsóként virágzó Balada között 8 nap a különbség. A kb. 45 napos érési folyamathoz képest a 8 nap különbség jelentősnek mondható, ennek ellenére a mintaszedés ideje szerinti változások mindkét évjáratban jelentős átfedést mutatnak (9. és 10. ábrák).


Szemtömeg (mg/szem)

80 70 60 50 40 30 20 10 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA Mv Magdaléna

Bánkúti 1201

8. ábra A 2006. évi MV Magdaléna és Bánkúti 1201 búzaszemek átlagos szemtömeg változása a virágzás utáni 12. illetve 15. naptól kezdve az aratásig


80 70 60 50 40 30 20 10 6. 2.

6. 7.

6. 12.

6. 17.

6. 22.

6. 27.

7. 2.

7. 7.

7. 12.

Mintaszedés dátuma MV Magdaléna

Bánkúti 1201

9. ábra: A 2 vizsgált búzafajta átlagos szemtömegének változása a mintaszedés dátuma szerint ábrázolva átfedésbe kerül



70 60 50 40 30 20 10 0 6. 13.

6. 18.

6. 23.

6. 28.

7. 3.

7. 8.

7. 13.

7. 18.

Mintaszedés dátuma MV Palotás

MV Ködmön

Balada

GK Csongrád

GK Öthalom

10. ábra: A 2005-ben vizsgált 5 búzafajta átlagos szemtömegének változása a mintaszedés dátuma szerint ábrázolva

A minták nedvességtartartalma az érés során folyamatosan csökken (11. ábra). Azonban a csökkenés mértékében jelentős különbségek tapasztalhatók. Az érés elején (13-18 DPA) a csökkenés alig érzékelhető. Később, az érés kb. 21. napjától kezdve (21-38 DPA) a csökkenés jelentős és egyenletes sebességgel folyik. Az érés végén már egészen intenzív (38-43 DPA), egészen addig amíg az aratást megelőző pár napban a nedvességtartalom 10% körüli minimális értéken állandósul (43-48 DPA). A különböző fajták nedvességtartalmában végbemenő változások a mintaszedés időpontja szerint ábrázolva ismét szinte teljesen átfedésbe kerülnek. A nedvességtartalomban bekövetkező változások a 2005. évjáratban hasonló tendenciákat követnek (12. ábra).


Nedvességtartalom (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA Mv Magdaléna

Bánkúti 1201

11. ábra: Az MV Magdaléna és Bánkúti 1201 búzaszemek átlagos nedvességtaralmának csökkenése a szemfejlődés során

Nedvességtartalom (%)

80 70 60 50 40 30 20 10 0 6. 13.

6. 18.

6. 23.

6. 28.

7. 3.

7. 8.

7. 13.

7. 18.


MV Ködmön

Balada

GK Csongrád

GK Öthalom

12. ábra: 2005. évjáratból származó búzafajta szemek átlagos nedvességtaralom változása az érés során

A búzaszemek száraztömegének változása az előző két paraméterből (nedvességtartalom és szemtömeg) számított érték. Ez a változó fontos információkat nyújt a sejt fiziológiai 45 Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

folyamataival kapcsolatban (13. ábra). A száraztömeg az érés első szakaszában kb. a virágzás utáni 21. napig lassan nő (13-21 DPA). Ez idő alatt a nedvességtartalom teljes szemtömeghez viszonyított mennyisége alig csökken a szemekben. A kezdeti gyors szemtömegnövekedés valószínűleg az intenzív vízfelvétel és a szárazanyag tartalom lassú növekedésének együttes eredménye. A következő érési szakaszban (21-38 DPA) csak a száraztömeg növekszik intenzíven a nedvességtartalom jelentős csökkenése mellett. A teljes szemtömegre vonatkozó súlyállandóság a száradás okozta súlycsökkenés és a szárazanyag tartalom növekedésének eredője Az érés végső, harmadik szakaszában (38-48 DPA) pedig a szemek a maximális tömegüket elérve megállnak a száraztömeg növekedésben. A teljes szemtömegben bekövetkező változás tisztán a nedvességtartalomban megfigyelhető csökkenés eredménye. A szárazanyagtartalom bioszintézisére alapvetően két különböző érési szakasz jellemző. Az érési folyamat kb. első kétharmadát teszi ki a szigmoid jellegű növekedési szakasz. Ennek során a szárazanyagtartalom eleinte lassan, majd gyorsabban nő. Az érés kb. harmadik harmadában jelentkezik a száradási szakasz, melynek során a szemek hirtelen elvesztik a nedvességtartalmuk jelentős részét, és leállnak a száraztömeg növekedésben.

Száraztömeg (mg/szem)

50 40 30

I.

II.

20 10 0 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA Mv Magdaléna

Bánkúti 1201

13. ábra A 2006. évi MV Magdaléna és Bánkúti 1201 búzaszemek átlagos száraztömeg szintézisének két fő szakasza: I.: Szigmoid növekedés a szemfejlődés első két harmadában (13-38 DPA) II.: Maximális érték állandósulása az aratás megkezdéséig (38-48 DPA)


A száraztömeg változásra jellemző 2 fő szakasz a 2005. évi mintákon is megfigyelhető (14. ábra). Az érési folyamat végén kialakuló fajták közötti száraztömeg-különbség, eltérő szintézis- és száradási sebességekre utal.

Száraztömeg (mg/szem)

45 40 35 30

I.

25

II.

20 15 10 5 0 6. 13.

6. 18.

6. 23.

6. 28.

7. 3.

7. 8.

7. 13.

7. 18.


MV Ködmön

Balada

GK Csongrád

GK Öthalom

14. ábra: 2005. évjáratból származó 5 búzafajta átlagos száraztömeg változásának két fő szakasza: I.: Szigmoid növekedési szakasz (6.13-7.7.) II.: Maximális állandó érték elérése (7.7.-7.21.)

A búzaszem makrofrakciók bioszintézisével kapcsolatban a 2 évjárat búzamintáinak vizsgálatai alapján általános következtetések vonhatók le (6. táblázat). A szemtömeg, nedvességtartalom és száraztömeg változásokat a mintaszedés időpontja szerint értékelve és a mennyiségi változásokat egy búzaszemre vonatkoztatva, két fő részre lehet osztani. Az első szakaszban a nedvességtartalom lassabb csökkenésének és a szemtömeg gyorsabb növekedésének eredőjeként a száraztömeg szigmoid növekszik a búzaszemekben. A száraztömeg-növekedés szigmoid jellege összhangban van a nemzetközi irodalomban – a szemtömeg és a nedvességtartalom mérésektől függetlenül – kapott eredményekkel (Dupont & Altenbach, 2003; Triboi et al., 2003). A száraztömeg növekedése az azonos termőhelyről származó búzafajták esetén összehangoltan és azonos ideig történik. Az érési folyamat második felében a nedvességtartalom gyors csökkenésével a szemtömeg is csökken, így a búzaszem száraztömege közel állandó marad. Az érés második felében száraztömeg tekintetében a búzafajták közötti eltérés láthatóan megnő. Ez arra utal, hogy a különböző fajtákban lejátszödó szintézisfolyamatok eltérő hatékonysággal történnek.


Változás jellege

Változás ideje (nap)

Bioszintézis

Szemtömeg

Nedvességtartalom

Száraztömeg

2005

2006

I. szakasz

gyorsan nő

csökken

szigmoid nő

24

23

gyorsan csökken

közel állandó

14

10

II. szakasz

gyorsan csökken

6. táblázat: A makrofrakciók bioszintézisének összehasonlítása két évjárat búzamintái alapján

5.1.3 A búzaszem lisztfrakciójának kinyerése A teljes búzaszem tartalékfehérjéinek kinyerése érdekében az endoszperm (liszt) frakciót el kell választani a tartalékfehérjéket nem tartalmazó korparésztől. A búzamag lisztfrakciója a magok őrlésével, majd a kapott őrlemény méret szerinti elválasztásával (szitálásával) nyerhető ki. Az őrlést általában 14-15% nedvességtartalomra beállított (kondicionált) magokkal végzik az egyenletes, jó minőségű lisztkihozatal céljából. A kondicionálás az aratáskor betakarított 14%

nedvességtartalom

alatti

szemek

mért

szárazanyagtartalmának

ismeretében

vízhozzáadással történik. Esetünkben a kondicionálásnak fizikai akadálya volt az éretlen szemek magas nedvességtartalma, mivel a búzaszemek csak az érési folyamat utolsó napjaiban érik el a 14% alatti nedvességtartalmat (11.-12. ábra). Ezért az érési folyamat elejétől 800C-on tároltuk a magokat (érési mintánként 40 db-ot) és az érés végén a mintákat egyszerre légszárítottuk a közel egyenletes nedvességtartalom elérése érdekében. A légszáraz minták nedvességtartalma 6 nap után 10-20% között szórt. A későbbi számításoknál 15% átlagos nedvességtartalommal számoltam. A légszárított minták tömegét megmértük az őrlést követő lisztkihozatal számításának céljából (15. ábra).


Légszáraz szemtömeg (g)

2,5

2,0

1,5 Bánkúti 1201 MV Magdaléna

1,0

0,5

45

40

35

30

25

20

15

10

0,0

DPA

15. ábra: 40 db búzaszem (MV Magdaléna és Bánkúti 1201, 2006. év) légszáraz tömegének változása a -80oC-on történt tárolás után az érés előrehaladtával

A légszárított minták homogenizálása (őrlése) dörzsmozsár segítségével történt, mivel a kipróbált laboratóriumi malmok a szemek optimálisnál nagyobb nedvességtartalma miatt túl nagy anyagveszteséget okoztak a kitapadás következtében. A dörzsmozsárral kapott teljes őrleményt 50%-os lisztkihozatalig szitáltuk. Az így kapott liszttömeg változásokat a 16. ábra mutatja a mintaszedés dátuma szerint. Mindkét vizsgált búzafajta követte a száraztömeg bioszintézis esetén tapasztalt irányzatokat. A virágzás utáni 38. napig (13-38 DPA) tart a liszttömeg szigmoid növekedése. A növekedés az érés második szakaszában leáll, a liszttömeg állandósul (38-48 DPA). A 2005. évi búzafajták esetén a búzamag minták endoszperm fehérje tartalmának vizsgálatait nem előzte meg a teljes magok őrlése és szitálása, ezért a további eredményeket a homogénebb 2006. évi mintákon (MV Magdaléna és Bánkúti 1201) mutatom be.


Liszttömeg (mg/szem)

30 25 20 15

I.

II.

10 5 0 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA Mv Magdaléna

Bánkúti 1201

16. ábra: A 2006. évi MV Magdaléna és Bánkúti 1201 búzaminták liszttömeg változásának két szakasza: I.: Szigmoid növekedési szakasza (13-38 DPA) II.: Liszttömeg állandó értéken maradása (38-48 DPA)

5.1.4 A búzaszem lisztfrakció nyersfehérje mennyiségének meghatározása A nyersfehérje tartalom alatt értjük a termények összes fehérje és nem-fehérje eredetű nitrogén tartalmának 6,25-szörösét. Ez igaz minden olyan anyag esetében, amelynek fehérjéjében a nitrogén részaránya 16% (100/16=6,25). Azonban a búza fehérjeösszetétele eltér etttől az átlagos aránytól, így a búza nyersfehérje tartalmának meghatározásához használt szorzószám 5,7. A búza nitrogén tartalmú vegyületei a gliadin és glutenin frakciókon kívül tartalmaznak egyéb endoszperm tartalék- (albumin, globulin) és összetett fehérjéket (nukleoproteidek).

Utóbbiak

főleg

a

csírarészben

találhatók.

A

nitrogéntartalom

meghatározását ezért a búzaszem endoszperm lisztfrakciójából végeztem. A nyersfehérjetartalmat a nitrogéntartalom és az irodalomban elfogadott 5,7-es ún. Kjeldahl-faktor szorzataként kaptam meg. A lisztfrakció nyersfehérje-tartalom növekedésére jellemző két szakasz a 17. ábrán látható. A Bánkúti 1201 minták második szakaszában mért értékeinél az adatok az eddigiekhez képest valamivel nagyobb szórása tapasztalható.


Lisztfehérje mennyiség (mg/szem)

5 4 3

I.

II.

2 1 0 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA Mv Magdaléna

Bánkúti 1201

17. ábra: Az MV Magdaléna és Bánkúti 1201 búzaminták lisztfehérje mennyiségének változása az érés során

5.1.5 A gliadin és glutenin tartalékfehérjék RP-HPLC-val történő elválasztásának optimalizálása A búza endoszpermfehérjéi vízoldható albuminokra, sóoldható globulinokra, alkohololdható gliadinokra és sav-, illetve lúgoldható gluteninekre oszthatók fel. Az albuminok és globulinok biológiai szempontból metabolikusan aktív fehérjék, míg a gliadinok és gluteninek tartalékfehérjék. A tartalékfehérjéket kódoló gének kötegei (lokuszok) a búza genom 12 különböző pontján találhatók. Sorozatos mutációk eredményeként alakult ki a rájuk jellemző genetikai polimorfizmus. Összetételük ennek

megfelelően meglehetősen heterogén.

Oldhatóságuk szintén eltér a legtöbb növényi és állati eredetű fehérjétől, ami szokatlan aminosav összetételüknek köszönhető. Mindennek köszönhetően a sikér tartalékfehérjék analitikai vizsgálata összetett feladat. A gliadin és glutenin tartalékfehérje alegységek RP-HPLC-val történő elválasztását először Bietz és munkatársai publikálták (Bietz, 1984; Burnouf & Bietz, 1984). Kb. egy érett búzaszem tömegének megfelelő, 50 mg liszt 8,18-13,6 % közötti átlagos fehérjetartalmával már jól vizsgálható ezzel az érzékeny elválasztási rendszerrel. A gliadinok lisztfrakcióiból történő egylépéses extrakciója esetén a 70%-os etanol és 55%-os 2-propanol oldószerek


megfelelően hatékonynak bizonyultak. A gliadinok kinyerését követő glutenin extrakció egy redukáló, majd az ezt követő alkilező lépésekből áll. A redukálásra a glutenin fehérjék nagy mérete miatt van szükség. A glutenin fehérjék között kialakuló kovalens kötések (diszulfid hidak) ugyanis sztérikusan gátolják az oldószer molekulákat a szolvatáció során. A redukálással felbontott kötéseket alkilezéssel akadályozzuk meg a reoxidációban. A Bietz és mtsai által eredetileg kifejlesztett módszert többen változtatták, egyszerűsítették (Larroque et al., 2000; Marchylo et al., 1989), melyek közül a Larroque és mtsai módszerét választottuk kiindulásként. Az extrahált tartalékfehérje minták RP-HPLC készülékbe történő injektálása előtt fontos, hogy a mintákban esetlegesen előforduló szilárd szennyeződésektől fehérjeveszteség nélkül megszabaduljunk. Ennek érdekében 0,45µm-es pórusátmérőjű, hidrofil polivinilidén-fluorid anyagú (PVDF) membránszűrőt használtunk. Az analitikai kolonnán történő fehérje elválasztáshoz acetonitril-víz keveréket használtunk, ami a legelterjedtebben használt mozgófázis pár RP-HPLC esetén. Az acetonitril nagyon jó oldószere a tartalékfehérje alegységeknek, és megfelelően hidrofób ahhoz, hogy az állófázisról eluálni tudja a különböző erősséggel kötődő fehérjéket. Ráadásul az acetonitril viszkozitása alacsonyabb, mint az RP-HPLC-s elválasztásban elterjedt többi szerves oldószeré (metanol, 2-propanol). Ez a tulajdonság a kromatográfiás oszlopon tapasztalható nyomásesés szempontjából előnyös. 15-80% acetonitril koncentráció között minden tartalékfehérje lemosható a kromatográfiás oszlopról. Az eluenspár változó összetételű (gradiens) keverését tiszta vizet és tiszta acetonitrilt tartalmazó oldószerekből végeztem. A víz-acetonitril keverék ugyanis

az

acetonitril

gyorsabb

párolgása

miatt

folyamatosan

változik,

így

a

reprodukálhatóság romlásához vezethet. A gliadinok elválasztását Bánkúti 1201 búzafajtával teszteltem. A módszerrel azonban az irodalmi hivatkozásban szereplővel ellentétben csak a komponensek gyenge elválasztását tapasztaltam (18. ábra).


18. ábra: Bánkúti 1201 búzafajta gliadin tartalékfehérje frakciójának RP-HPLC kromatogramja a kiindulási módszerrel

A módszer hatákonyságának javítása érdekében a következő paramétereket változtattam:  az ionpárképzőként és szelektivitás javítóként elterjedt trifluor-ecetsavat (TFA) 0,3 v/v%ban kevertem mindkét eluenshez. Az ennél nagyobb koncentráció már az alapvonal emelkedés

következtében

a

detektálhatóság

romlásához

vezet

és

a

fehérjék

deamidálódásának veszélye is megnőhet.  a kromatográfiás oszlop hőmérsékletét emeltem, amely a reprodukálhatóságot és a tartalékfehérje csúcsok elválasztásának hatékonyságát egyaránt javítja. Gliadinok esetében 65 0C-ra, a kevesebb csúcsot tartalmazó glutenineknél 50 0C-ra emeltem az oszloptér hőmérsékletét.  a szerves oldószer arányát változtattam az elválasztás során az 7. táblázatban leírt gradiens szerint a gliadincsúcsok jobb elválasztása érdekében. Az eljárás kiindulási és optimalizált paraméter beállításait a 7. táblázat tartalmazza. A módszerfejlesztési eredményeknek köszönhetően közel háromszor annyi fehérje komponenst sikerült elválasztani, mint a kiindulási módszerrel (18. és 19. ábrák).


19. ábra:Bánkúti1201 búzafajta gliadin tartalékfehérjéinek optimalizált kromatogrammja

A mérések között Chinese Spring liszt belső standard mintát futtattam az eredmények ellenőrzése céljából. Ezek a standardok mindig frissen készültek a mérendő minták előkészítésével párhuzamosan. Az elúciós időben jelentkező csúszások a pumpa működésének hibájára, tömítések menti szivárgásra utalhatnak, míg a visszatartásban tapasztalható eltérések szennyeződésre, vagy a kromatográfiás oszlop öregedését jelzik. A standard minták használatának egy másik típusa, amikor a tartalékfehérjékhez hasonló, nagy molekulatömegű alkil-fenon komponenseket használunk. Ezek hidrofóbicitása az alkil lánc hosszúságától függően változik. Az ilyen komponens mintaoldathoz való hozzáadásával korrigálni lehet az elúciós időben bekövetkező változásokat, az oszlop öregedéséből származó eltéréseket, valamint az injektálás hibájából eredő mennyiségi különbségeket. A gliadinok elválasztásánál propiofenon belső standardot alkalmaztunk.


Kiindulási módszer Berendezés

Optimalizált módszer

Perkin-Elmer Series 200 HPLC Perkin-Elmer Series 200 HPLC Vydac C18 (típusa: 218TP104) Vydac C18 (típus: 218TP104)

Analitikai oszlop

250mm x 4,6mm, 10m

250mm x 4,6mm, 10m

Áramlási sebesség

1 ml/perc

0,75 ml/perc

Injektált

20 l

20 l

Termosztálás

szobahőmérséklet

65 oC

Belső standard

propiofenon, 250 l/l

propiofenon, 200 l/l

A: 0,07 v/v% TFA vízben

A: 0,3v/v% TFA vízben

B: 0,05 v/v% TFA AcN-ben

B: 0,3v/v% TFA AcN-ben

0: 0,5 perc; 25,0% B

0: 0,5 perc; 25,0% B

1: 1 perc; 25,0% B

1: 7 perc; 31% B

2: 45 perc; 50,0% B

2: 9 perc; 34% B

3: 5 perc; 50,0% B

3: 5 perc; 36,0% B

4: 1 perc; 25,0% B

4: 15 perc; 40,0% B

5: 10 perc; 25,0% B

5: 5 perc; 42,0% B

6: 8 perc; 25,0% B

6: 2 perc; 44,0% B

mintamennyiség

Eluensek

Gradiens

7: 21 perc; 49% B 8: 10 perc; 80% B 9: 10 perc; 25% B Analízisidő

70 perc

84 perc

Detektálás

UV, 214nm

UV, 214nm

7. táblázat: A gliadin fehérjék elválasztására alkalmazott RP-HPLC eljárás kiindulási és optimalizált paraméterbeállításai


A gluteninek elválasztása a kiindulási módszerhez (Marchylo et al., 1989) hasonlóan megfelelően hatákonynak bizonyult, így ebben az esetben csak az áramlási sebesség, a szerves oldószer mennyiség, az oszloptér hőmérsékletének és a detektálás hullámhosszának kisebb változtatására volt szükség az elválasztás során (8. táblázat).

Áramlási sebesség Injektált

Kiindulási módszer

Optimalizált módszer

1 ml/perc

0,75 ml/perc

20l

20l

szobahőmérséklet A: 0,1v/v% TFA vízben

50oC A: 0,1v/v% TFA vízben



0: 0,5 perc; 24,0% B

0: 0,5 perc; 24,0% B

1: 17 perc; 30,0% B

1: 13 perc; 30% B

2: 20 perc; 35,0% B

2: 3 perc; 32% B

3: 23 perc; 60,0% B

3: 13 perc; 33,0% B

4: 5 perc; 24,0% B

4: 20 perc; 60,0% B

mintamennyiség Termosztálás Eluensek

Gradiens

5: 3 perc; 24,0% B Analízisidő

60 perc

52 perc

Detektálás

UV, 210nm

UV, 214nm

8. táblázat: A glutenin fehérjék elválasztására alkalmazott RP-HPLC eljárás kiindulási és optimalizált paraméterbeállításai


5.1.6 A

gliadin

és

glutenin

tartalékfehérje

alegységek

RP-HPLC

kromatogramjainak jellemzése A különböző elektroforetikus és kromatográfiás fehérje elválasztási technikákat gyakran hasonlítják össze az általuk elválasztott gliadin csúcsok száma alapján. Az MV Magdaléna és Bánkúti 1201 fajták esetében kapott kb. 30 gliadin csúcs (20. ábra) megfelel az átlagos irodalmi adatoknak. Az RP-HPLC-vel elválasztott csúcsok száma általában több, mint az 1 dimenziós gélelektroforézises módszerek esetén kapott 20-30 csúcs (Autran et al., 1979; Bushuk & Zillman, 1978; Metakovsky et al., 1984b; Wrigley et al., 1982b). Az elméleti gliadin csúcsok száma azonban még így is nagyobb, mint ami RP-HPLC elválasztással elérhető. Például az izoelektromos fókuszálással kombinált 2 dimenziós elektroforézis elválasztóképessége eléri az 50 csúcsot is (Payne et al., 1982; Wrigley, 1970).

20. ábra: Bánkúti1201 búzafajta gliadin tartalékfehérjéire jellemző kromatográfiás csúcsok és a 3 gliadin frakció (-gliadinok) jellemző retenciós ideje

A gliadin csúcsok retenciós idejük alapján - és -gliadinokra oszthatók fel (20. ábra). Molekulatömeg azonosítása alapján a frakciók RP-HPLC-val kapott retenciós sorrendje is meghatározható (Qian et al., 2008). Először a legnagyobb molekulatömegű -gliadinok (Rt<22 perc), majd az -gliadinok (22 perc44


perc) hagyják el az RP-HPLC oszlopot (Larroque et al., 2000). Az egyes gliadin frakciókat elválasztó retenciós határ és a frakciók közötti átfedések mértéke jelenleg még nem egyértelműen határozható meg. Ennek alapvető feltétele lenne a búza genetikai térképének teljes ismerete, ami alapján kromatográfiásan elválasztott fehérje alegységek szekvenciája és tömege azonosítható lenne. A glutenin fehérjék esetében jóval kevesebb csúcs fordul elő egy kromatogramon. A glutenin HMW alegységek (15 perc
21. ábra: MV Magdaléna búzafajta HMW- és LMW glutenin alegységeinek kromatogramja az 5 jellemző HMW alegység (Dy, By, Dx, Bx, Ax) feltüntetésével


5.1.7 A gliadin és glutenin tartalékfehérjék és alegységeik bioszintézise Visszatérve a búzaszem érési folyamatára, a búzaminták lisztfrakcióinak RP-HPLC kromatogramjai alapján követhető a gliadin és glutein tartalékfehérjék, valamint azok alegységeinek (- és -gliadinok és HMW-LMW glutenin alegységek) mennyiségi változása a bioszintézis során. Az egyes tartalékfehérjék búzaszemre számolt átlagos koncentrációját az RP-HPLC kromatogramok csúcs alatti területe alapján jellemezhetjük. A 22. ábrán a gliadinfehérjék mennyiségi változását lehet követni a virágzás utáni napok szerint ábrázolva.

22. ábra: Bánkúti 1201 búzafajta gliadin kromatogramjainak együttes ábrázolása az érési napok sorrendjében


A 22. ábrán látható gliadinkromatogramok csúcs alatti területeinek alapján számolt egy szemre vonatkoztatott koncentrációja jó közelítéssel a szokásos szigmoid görbe szerint alakul (23. ábra). Az érés második szakaszában (38-48 DPA) a gliadinok mennyisége gyakorlatilag nem változik, vagy kis mértékben nő.

Gliadin fehérjék koncentrációja (csúcsterület)

60 50 40 30

I.

20

II.

10 0 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA Mv Magdaléna

Bánkúti 1201

23. ábra: Bánkúti 1201 és MV Magdaléna búzafajták egy szemre vonatkoztatott gliadin koncentráció változása a szemfejlődés során

Ami az egyes gliadin polipeptid típusokat illeti, azokat az RP-HPLC elúciós diagram figyelembevételével három csoportba soroltuk, amelyek közelítőleg az -, -, és gliadinoknak felelnek meg (20. ábra). A nagyobb molekulatömegű -gliadinok aránya a legkisebb. Az egyes polipeptid csoportok egy szemre vonatkoztatott tömege ez esetben is szigmoid görbét eredményez a szemfejlődés során (24-25. ábrák). A gliadin típusú polipeptidek szintézise közel szinkronban folyik.


Gliadin alfrakciók koncentrációja (csúcsterület)

25

I.

20

II. 

15

 10



5 0 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA

24. ábra: MV Magdaléna búzafajta gliadin fehérje frakcióinak () egy szemre

Gliadin alfrakciók koncentrációja (csúcsterület)

vonatkoztatott koncentráció változása a bioszintézis 2 fő szakaszában

20

I.

II.

15

 10

 

5

0 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA

25. ábra: Bánkúti 1201 búzafajta gliadin fehérje frakcióinak () egy szemre vonatkoztatott koncentráció változása a bioszintézis 2 fő szakaszában


A Bánkúti 1201 kiemelkedő minőséggel rendelkező búzafajtánk. Ennek köszönhetően számos hazai kutatás foglalkozik ezzen mintapopuláció tartalékfehérjéivel (Juhász et al., 2003b; Juhász et al., 2001; Nagy et al., 2003). A tartalékfehérjék gliadin összetételnek közismerten jelentős hatása van a tészta sütőipari minőségére. Juhász és mtsai a gliadin frakciókat további alfrakciókra osztották (). Statisztikai vizsgálatok alapján azt tapasztalták, hogy a gliadin polipeptidek közül csak bizonyos alfrakciók () korrelálnak szignifikánsan a sütőipari minőséggel (p=0,1%)(Juhász et al., 2003a). Az általam vizsgált Bánkúti 1201 fajta esetén, ezért az alfrakciók mennyiségi változását is értékeltem. Mivel az elválasztás során hasonló kísérleti és elválasztási paramátereket használtam, az egyes alfrakciókat retenciós idő és mintázat alapján azonosítottam (26. ábra)

26. ábra: Bánkúti 1201 búzafajta gliadin alfrakciói Juhász A. és mtsai. (2003a) vizsgálatai alapján

Az egyes alfrakciók csúcsterületeit az érés időpöntja szerint rendezve látható (9. táblázat), hogy a minőséget leginkább meghatározó alfrakciók közül  szintézise indul meg a legkorábban, míg a későn megjelenő alfrakciókhoz tartozik (a minőségi szempontból szintén meghatározó  csoport a belső standard fedése miatt nem látható). Az eredmények alapján azonban az is szembetűnő, hogy az  csoport szintézise az érés elején nagyon nagy léptékben növekszik, így pontos időpontot a szintézis első napjaira vonatkozóan nem lehet


megállapítani ezen adatok alapján. Érdekes még, hogy  és 2 alfrakciók az MV Magdaléna esetében szinte teljesen hasonló mintázatot mutatnak a Bánkúti 1201 fajtához. Nagyobb változékonyság inkább az - és -alfrakcióknál fordulnak elő (erről ábra nem látható).

Alfrakció t ret (min) DPA 17 20 22 24 27 29 31 34 36 38 41 43 45 48

 7-15 1865224 2 607 170 4 860 716 4 766 221 5 365 492 5 959 668 5 394 569 6 025 880 5 441 530 5 441 530 5 217 800 5 567 333 6 475 463 7 413 641

 17-23

 23-25

0 654 373 1 081 272 2 124 456 3 711 518 4 470 729 4 020 968 6 252 061 5 083 113 5 083 113 4 748 537 5 067 901 5 761 391 6 199 051

0 0 2 449 738 2 709 343 2 429 063 8 784 896 8 523 720 10 031 898 9 711 266 9 711 266 9 197 632 9 609 557 11 051 908 10 801 949

 25-43 0 0 0 10 076 058 15 205 944 20 353 538 20 206 842 21 896 506 22 395 276 22 395 276 24 819 324 21 211 455 24 164 671 23 096 088

 43-50 0 0 3 066 405 11 810 843 19 797 441 18 098 300 19 767 575 17 308 896 18 371 756 18 371 756 19 223 211 21 348 130 19 534 947 17 488 279

 50-58 0 0 0 3 860 480 7 789 308 8 544 710 9 794 660 10 098 220 9 405 795 9 405 795 8 994 494 8 570 028 11 762 239 11 475 684

9. táblázat: Bánkúti 1201 búzafajta gliadin tartalékfehérje alfrakcióinak mennyiségi változása a szemfejlődés során

A HMW és LMW glutenin fehérjék koncentrációja a növekedési szakaszban az eddigi szigmoid jelleg szerint változik. Az érés második szakaszában a Bánkúti 1201 minta esetében tapasztalható az eddigi legnagyobb eltérés a szokásos tendenciáktól. Ebben a szakaszban közel állandó érték körül szoktak szórni az adatok. A Bánkúti 1201 HMW és LMW fehérjék azonban egyértelmű növekedést mutatnak, bár az utolsó mintavétel esetén már csökkenést tapasztaltunk (27. ábra). A jelenség azért lehet érdekes, mert ez a búzafajta különleges allélösszetételének és sütőipari tulajdonságának köszönhetően számos vizsgálat tárgyát képezte a hazai és nemzetközi szakirodalomnak melyek alapján kiderült, hogy extra ciszteinnel rendelkezik valamint Bx7 túltermelő. A görbék lefutása e kivételtől eltekintve jó közelítéssel az összes többi általunk vizsgált szárazanyagfrakcióhoz hasonlóan szigmoid jellegű kezdeti (13-38 DPA), és közel állandó végső (38-48 DPA) szakaszokkal jellemezhető (28. ábra). A HMW és LMW glutenin fehérjék szintézise a gliadin fehérjékkel szinte teljesen szinkronban folyik.


Glutenin fehérjék koncentrárciója (csúcsterület)

6

I.

II.

5

4

HMW

3

LMW

2

1

0 10

15

20

25

30

35

40

45

DPA

27. ábra: Bánkúti 1201 búzafajta glutenin fehérjéinek (HMW és LMW gluteninek)

Glutenin fehérjék koncentrációja (csúcsterület)

bioszintézise

5

I.

II.

4 3

HMW LMW

2 1 0 10

15

20

25

30

35

40

45

50

DPA

28. ábra: MV Magdaléna búzafajta glutenin fehérjéinek (HMW és LMW gluteninek) bioszintézise


A 29-30. ábrák az egyes HMW alegységek szárazanyagra vonatkoztatott koncentrációját szemlélteti. A glutenin alegységek már a szemfejlődés korai szakaszában kimutathatók. Egyes esetekben változás történik az alegységek sorrendjében (a fajták görbéi keresztezhetik egymást), ami a szintézis sebességekben mutatkozó különbségek következménye. Megfigyelhető, hogy jelentős az alegységek közötti mennyiségi különbség. Az Akromoszómán kódolt alegység (Ax) igen kis mennyiségben van jelen, ami alátámasztja azt a megfigyelést, hogy ez a típusú alegység jut a legkisebb szerephez a sikérsajátságok kialakításában.

HMW glutenin alegységek koncentrációja (csúcsterület)

1,5

I.

II.

1,25

Dy

1

By Dx

0,75

Bx 0,5

Ax

0,25

0 10

15

20

25

30

35

40

45

DPA

29. ábra: MV Magdaléna búzafajta HMW glutenin alegységeinek (Dy, By, Dx, Bx, Ax) koncentráció változása az érés során


HMW glutenin alegységek koncentrációja (csúcsterület)

1

I.

II.

Dy

0,75

By Dx

0,5

Bx Ax

0,25

0 10

15

20

25

30

35

40

45

DPA

30. ábra: Bánkúti 1201 búzafajta HMW glutenin alegységeinek (Dy, By, Dx, Bx, Ax) koncentráció változása az érés során

A 2005. és 2006. évben folytatott bioszintézis vizsgálatokról összességében elmondható, hogy a száraztömeg-növekedésre jellemző szigmoid és közel állandó szakaszok (I és II. érési szakaszok) hossza közel megegyezik, valamint a változások jellege a lisztmennyiség, az endoszperm tartalékfehérje és a tartalékfehérje alegységek szintjén is megjelenenik. Az eredmények összhangban vannak a kis számú eddigi irodalmi tapasztalattal (Dupont & Altenbach, 2003; DuPont et al., 2006; Shewry et al., 2009b).


5.1.8 A gliadinok és a monomer glutenin alegységek elválasztása Diagonális SDS-PAGE-vel A szemtelítődés során termelődő glutenin alegységek egy része monomer állapotban marad, így az alkohol oldható monomer (gliadin) frakció HPLC-s vizsgálata során szennyezésként fordulhatnak elő. A polimer fehérjék monomerektől történő elválasztására fejlesztettek módszert Gupta és mtsai Diagonális SDS-PAGE néven (Gupta et al., 1995). Az első dimenzióban elválasztott fehérjék gélszakaszát kivágva redukálást végeznek. A redukált gélszakaszt ortogonálisan futtatják a szeparáló gélre ráfektetve. A redukálás után a polimer alegységek mérete csökken és elektroforetikus mobilitásuk nő, a monomer fehérjék mérete és mobilitása viszont nem változik. Ennek köszönhetően egy jellegzetes átlós (diagonális) fehérjemintázathoz jutunk. Az átlóban a mobilitásukat redukálás hatására nem változtató monomer fehérjék találhatók, az átlótól eltávolodva pedig a redukált polimer alegységek. Az általam vizsgált érési minták esetén gliadinokkal együtt extrahálódó, még nem oxidálódott, de oxidálható glutenin szennyeződések esetleges jelenlétét vizsgáltam. Ehhez egy oxidációs lépésr beiktatására volt szükség a két elektroforetikus futtatás között. Az oxidálást vizes kálium jodát oldattal (1% KIO3) végeztem, mivel a KIO3 a sütőiparban lisztjavító adalékanyagként elterjedt oxidálószer. A mérésekhez az érési folyamat elejéről (16. DPA) és végéről (46. DPA) származó mintákat használtam (31. ábra). Az 1D elválasztás esetén (a-val jelölt gélcsík) kisebb molekulatömegeloszlás beli különbség figyelhető meg a 2 minta között az 10-15 kDa közötti tartományban. A 2D elválasztásnál mindkét esetben kirajzolódik egy-egy átló, amelynek mentén azok a tartalékfehérjék találhatók, melyek molekulamérete nem változik az oxidáció hatására. Átlón kívűl helyezkedő fehérjék az éretlen minták esetén nagyon gyengén láthatók (karikázott rész). Az oxidálást és a 2D elektroforézist követően az éretlenebb minták fehérjéinek egy része a gélben kötve maradt (b-vel jelölt gélcsíkon karikával jelölve), felthetőleg az oxidáció során fellépő molekulatömeg növekedésnek köszönhetően. A monomer (gliadin) frakcióban található oxidálatlan LMW és HMW glutenin alegységek mennyiségére vonatkozóan további optimalizált mérések szükségesek.


16. DPA

46. DPA

31. ábra: 16. és 46. DPA lisztminták Diagonális SDS-PAGE gélképei (felül). Alul a gélképek kontrasztosított felvételei láthatók. MS=molekulatömeg standardok (250-10 kDa); a= az 1Dban elválasztott gélcsík; b=az oxidációt és a 2D elválasztást követő gélcsík maradéka.


5.2 A búzalisztből képzett szárazsikér oldatainak vizsgálata a szemfejlődés során A búza endoszperm tartalékfehérjék (gliadinok és gluteninek) bioszintézisének vizsgálata során az egyes frakciók mennyiségi változását követtük. Ezeknek a tartalékfehérjéknek azonban az élettani (raktározó) szerepük mellett van egy másik, gabonafehérjék között is egyedi tulajdonságuk. A vízzel történő kölcsönhatásuk eredményeként (sikérpolimer képzés) kulcsszerepet töltenek be a búzaliszt sütőipari minőségének kialakításában. Ennek köszönhető, hogy a búza sütőipari minőségével kapcsolatos kutatások fontos részét képzik a gliadinok és gluteninek (sikérfehérjék) kémiai és fizikai tulajdonságainak tanulmányozása. Ezen sütőipari minőséget meghatározó kémiai és fizikai tulajdonságokat a bioszintéziskor képződött sikérfehérje alegységek között kialakuló polimerizációs folyamat jelentősen befolyásolja. A polimerizáció folyamatának megismerése érdekében a szemfejlődés 6 időpontjából származó

Ukrainka

búzaminták

lisztfrakciójából képzett

sikérpolimer

mennyiségi, oldhatósági, méret-eloszlási és hidrodinamikai tulajdonságait követtük. A mintavétel fontosabb adatait a 10. táblázat tartalmazza.

Minta

Mintaszedés

Virágzás utáni

Átlagos

dátuma

napok száma

szemtömeg

(DPA)

(mg/szem)

1. 06.16. 12 21,2 2. 06.23. 19 35,8 3. 06.28. 24 49,3 4. 07.03. 29 58,1 5. 07.11. 37 52,8 6. 07.25. 51 42,9 10. táblázat: A 2006. évi Ukrainka búzafajta mintavételének adatai

5.2.1 Sikér- és sikérfehérje-mennyiség meghatározása A bioszintézis vizsgálatokhoz hasonlóan a búzamagokat 6 napig légszárítottam az őrlés előtt. Az őrlést laboratóriumi malommal végeztem. Az első mintasorozat malmi őrlése a kitapadás okozta nagy anyagveszteség miatt nem volt lehetséges, ezért ezek a minták a későbbi vizsgálatokból kiestek. A többi minta esetében megfelelő őrleményeket kaptam és 250m lyukátmérőjű rázatószitával választottam el a lisztfrakciót a héjrésztől. 5g búzaliszthez 60% 69 Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

vízet adagolva a hagyományos sikérmosási módszert alkalmaztam az érési mintánkon. Ennek eredményeként az érési folyamat korai fázisában (19. DPA) összetapadó nedvessikér még nem alakult ki. A virágzást követő 24. naptól már összefüggő masszát alkotó nedves sikér jött létre. A nedves sikér 5g kiindulási liszttömeghez viszonyított mennyisége nem változott az érés során (38-39%). Nem változott jelentősen a szárazsikér mennyiség sem (12-14%), ami azt mutatja, hogy a nedvessikér vízmegkötő képességben sem mutatkozott szignifikáns eltérés. A nedves- és szárazsikér pontos arányát valamint az egy szemre jutó mennyiségük változását a 11. táblázat mutatja.

Virágzás Nedves Száraz Nedves Száraz Lisztmennyiség utáni nap sikér sikér sikér sikér (mg/szem) (DPA) (%) (%) (mg/szem) (mg/szem) 12 nem őrölhető 19 13,1 nem tapad 13,6 nem tapad 1,8 24 20,5 38,4 12,9 7,9 2,6 29 31,6 39,0 13,0 12,3 4,1 37 32,4 39,4 12,6 12,8 4,1 51 29,8 38,6 13,0 11,5 3,9 11. táblázat: A nedves és száraz sikér mennyiségének változása a szemfejlődés során

A száraz sikér minták fehérjetartalmát automata fehérjeanalizátorral mértem. A Dumas-Perglféle égetéses eljáráson alapuló módszerrel kapott teljes redukált nitrogéntartalmat 5,7-es faktorral szorozva jutottam a fehérjetartalom mennyiséghez. A száraz sikér fehérjetartalma az érés során folyamatosan nő (12. táblázat). Ez azt mutatja, hogy főleg az érés elején, nem fehérje eredetű összetevők (valószínűleg többségében keményítő szemcsék) jelentős mértékben tapadnak a nedves sikérben.

Virágzás Száraz Száraz sikér Száraz sikér utáni nap sikér fehérjetartalma fehérjetartalma (DPA) (mg/szem) (%) (mg/szem) 12 19 1,8 52,8 0,97 24 2,6 61,5 1,63 29 4,1 71,0 2,80 37 4,1 76,0 3,10 51 3,9 79,1 3,05 12. táblázat: A szárazsikér fehérjetartalmának és egy szemre eső mennyiségének változása az érés során


A sikérfehérjék egy búzaszemre jutó mennyiségi meghatározásához mértük az átlagos szemtömeget, liszttömeget, a nedves- és a szárazsikérmennyiséget. A szárazsikér fehérjetartalmát tekintve azt találtuk, hogy arányuk az érés során fokozatosan nő. Mielőtt áttérnénk a tisztított sikérfehérjék méreteloszlás és hidrofóbicitás szerinti vizsgálatára, a 32. ábra összefoglalja az eddig mért frakciók érés során bekövetkező mennyiségi változását a búzaszemben. Látható, hogy a szemtömeg változás követi a bioszintézés vizsgálatoknál is tapasztalt folyamatokat. A kezdeti száraztömeg-növekedés után a száradási folyamat következtében csökkenés tapasztalható. A liszt-, nedvessikér-, szárazsikér mennyiségek pedig a kezdeti növekedés után közel állandó értéken maradnak az érés végéig. A búzamagok az érés korai szakaszában (kb. 12. DPA) nem voltak őrölhetők, és a nedves sikér az érés viszonylag későbbi szakaszában (kb. 24. DPA) jelenik meg összefüggő, tapadós formában.

Mennyiség (mg/szem)

70 60 50

Szemtömeg

40

Lisztmennyiség

30

Nedvessikér Szárazsikér

20 10 0 10

20

30

40

50

DPA

32. ábra: A teljes szemtömeg, a lisztmennyiség és a sikérfehérjék mennyiségének változása az érés során

5.2.2 A sikérfehérjék oldhatóság, méreteloszlás és hidrofóbicitás szerinti vizsgálata A szárazsikérben a sikérfehérjék nem tisztán önmagukban vannak jelen, arányuk az érés során fokozatosan nő. Tisztán a sikérfehérjék vizsgálatához olyan analitikai módszert kell alkalmazni, amely lehetővé teszi a fehérjék elválasztását a mátrix egyéb összetevőitől. Ilyen


módszer többek között a molekulaméret szerint szelektáló SE-HPLC és a hidrofóbicitás alapján elválasztó RP-HPLC. Az SE-HPLC kromatogram alapján búza lisztfehérjék 3 részre oszthatók. Ezek a részek a kromatogramon való megjelenés sorrendjében a polimerikus fehérjéknek, gliadinoknak, és a vízoldható albumin/globulinoknak felelnek meg. A gliadin és albumin/globulin frakciók (P2 és P3 területek) monomer fehérjék. A 33. ábrán az Ukrainka búzafajta lisztmintájának fehérjefrakciói láthatók az érés középső szakaszából (24. DPA).

33. ábra: Ukrainka búzafajta (24. DPA) lisztmintájának SE-HPLC kromatogramja alapján elválasztott polimerikus (P1) és monomer (P2 és P3) fehérjéi

A vizsgálandó szárazsikér mintákat az SE-HPLC elválasztás előtt oldatba kell vinni. A sikérfehérjék SDS-foszfát pufferben való oldhatóságuk szerint oldható és oldhatatlan frakciókra oszthatók fel. Az oldhatatlan frakció fizikai vagy kémiai redukció után vihető csak oldatba. Esetünkben ezt szonikálással végeztük. Az SDS-foszfát pufferben oldható és oldhatatlan (szonikálás után oldható) részek jellegzetes SE-HPLC kromatogramját mutatja be a 34. ábra az érés középső szakaszából származó (24. DPA) szárazsikér mintán.


34. ábra: Ukrainka búzafajta szárazsikér mintájának (24. DPA) SDS-foszfát pufferben oldható (felső) és oldhatatlan (alsó) fehérjefrakcióinak SE-HPLC kromatogramjai

A tényleges (natív) molekulaméretre vonatkozó mérést nem lehet véghezvinni, mivel a sikérpolimer mérete az elválasztáshoz szükséges szonikálás (fizikai bontás) során szükségszerűen változik. Ráadásul az SE-HPLC technikában ma nem létezik olyan oszlop, amelyiknél a valóban nagy glutenin polimer ne az elúciós térfogatnál eluálódna. Bár ezekből következően a molekulamérettel nem tudunk foglalkozni, de a polimer méreteloszlási görbéjének egy pontját, pontosabban egy méret – az első lépésnél kiextrahált fehérje maximális mérete – feletti és alatti polimerek mennyiségének arányát pontosan meg lehet határozni. Ez a szám az úgynevezett nem extrahálható polimerikus fehérje mennyiség (unextractable polymeric protein, UPP). A polimerikus gluteninek molekulaméret eloszlására jellemző UPP mennyiség az érés elején nőtt, majd később közel állandó értéket vett fel (13.táblázat).

Sikérfehérje mennyiség a búzaszemben (mg/szem) Virágzás utáni P1 P1 P1 UPP nap (DPA) (nem oldható) (oldható) (összesen) 19 0,22 0,32 0,54 0,41 24 0,44 0,36 0,8 0,55 29 0,88 0,4 1,28 0,69 37 0,80 0,48 1,28 0,63 51 0,82 0,43 1,25 0,66 13. táblázat: Az érés különböző szakaszaiból származó szárazsikér UPP mennyiségének meghatározása a szonikálás előtti és utáni oldatok SE-HPLC kromatogramjai alapján (Ukrainka)


Az alapvetően rosszul oldódó glutenin polimerekről tudjuk, hogy kis- és nagy molekulatömegű (LMW és HMW) alegységekből épülnek fel. Az alegységek közötti másodlagos (főleg diszulfid-híd) kötések redukálószerrel felbonthatók és így az alegységek már oldatba vihetők. A kapott HMW-, LMW alegységek felületi hidrofóbicitásuk szerint RPHPLC technikával elválaszthatók és mennyiségük meghatározható. Így vizsgálhatóvá válik a polimer glutenin alegységek összetételének változása az érés során (35. ábra). A virágzás utáni 19. napon a glutenin HMW- és LMW alegységek mennyisége még minimális. Az 5 HMW alegység közül 1 alegység van jelen detektálható mennyiségben. A virágzás utáni 29. napig jelentős növekedés történik, amikor mind a HMW-, mind az LMW alegységek mennyisége eléri a maximális szintet (14. táblázat). A teljes alegységmennyiség meglétének következménye, hogy a 29. DPA után új diszulfidhidak már nem tudnak létrejönni. Ezzel ellentétben az érés korábbi szakaszában az intermolekuláris diszulfidkötések kialakulásának még nincs a kötőhelyek fizikai hiányából fakadó akadálya. Ez a magyarázata a 13. táblázatban látható UPP frakció mennyiségi változására az érés során.

Sikérfehérje mennyiség a búzaszemben (mg/szem) Glutenin alegység 19. DPA 29. DPA 37. DPA 51. DPA HMW 0,08 0,26 0.30 0,31 LMW 0,43 1,03 0,98 0,95 HMW/LMW 0,19 0,26 0,32 0,32 14. táblázat A HMW és LMW alegységek mennyiségének változása a búzaszem érése során A HMW/LMW arányt gyakran használják a sütőipari minőséget jellemző paraméterek között. Az általunk tapasztalt arány az érés elején alacsony, majd a HMW frakció aránya növekszik az érés 29. napjáig. Az érés második felében, amikor mind a HMW alegységek, mind az LMW alegységek mennyisége kialakult, a két alegység egymáshoz viszonyított aránya is állandó marad (14. táblázat). Ez a változás teljesen összhangban van a nemzetközi irodalomban leírt eredményekkel, ahol szintén növekvő HMW/LMW arányról számoltak be az érés során (Carceller & Aussenac, 2001).


35. ábra: A polimerikus glutenin fehérjék HMW- és LMW alegység összetételének változása az érés során (Ukrainka)


5.2.3 A sikérfehérjék hidrodinamikai vizsgálata A polimer glutenin fehérjék mennyisége és a sikéroldat viszkozitása közötti összefüggés érvényességét tudtuk bizonyítani egy olyan kísérlettel, amelyben a sikér oldathoz redukálószert (2-merkaptoetanol) adtunk. Ennek hatására a polimer glutenin molekulák molekulatömege csökkent, mivel az alegységeket összekötő diszulfidkötések felbomlottak. A kémiai bontási folyamatot jól lehet követni az oldat kapilláris viszkoziméterrel mért relatív viszkozitásának csökkenésével (36. ábra). A relatív eredményeket a legkisebb koncentrációjú sikéroldathoz viszonyítottuk. Összehasonlítás végett kazeinfehérje oldatokkal is elvégeztük a kísérletet. A kazein egy globuláris szerkezetű fehérje, harmadlagos szerkezetét stabilizáló kölcsönhatások (pl.: diszulfidkötések) nem jellemzik. Ebből adódóan a kazeinoldat

Sikér oldat relatív viszkozitás

viszkozitását nem befolyásolta a redukció.

4 3 2 1 0 0

10

20

30

40

50

60

70

Sikér oldat koncentráció (g/l) Sikér redukálás előtt

Sikér redukálás után

Kazein

36. ábra Különböző koncentrációjú szárazsikér oldatok relatív viszkozitásának változása redukálás előtt és redukálás után

A lineáris szerkezetű polimer makromolekulák (ezek közé sorolhatjuk a glutenint is) oldatainak viszkozitása arányos a molekula nagyságával, azaz a polimerizációs fokkal (η=kMa, ahol M a molekulatömeg, míg a k és az a állandók, melyek az adott oldószer-fehérje párra jellemzőek). A sikérfehérjék polimerizáltsági fok változásának követése érdekében meghatároztuk a szárazsikér azonos koncentrációjú oldatainak viszkozitását a búzaszem érése során. A viszkozitás mérések azt igazolták, hogy a szárazsikérből készült oldatok relatív


viszkozitás értékei az eddigiekhez hasonló tendencia szerint nőnek az érés végét megelőző utolsó periódusig (37. DPA) (15. táblázat).

Virágzás utáni nap Relatív viszkozitás (DPA) 19 1,00 24 1,14 29 1,29 37 1,43 51 1,41 15. táblázat: Azonos koncentrációjú sikéroldatok relatív viszkozitása a szemfejlődés során

A gliadinok mérete és alakja alaposan kutatott téma (Purcell et al., 1988; Tatham et al., 1990; Tatham et al., 1990a; Wieser et al., 1998), amiből tudjuk, hogy alakjuk lehet globuláris és hosszúkás (ω-gliadinok) is. Feltételezve, hogy a monomer gliadin fehérjék alakja és mérete nem változik jelentősen az érés során a sikéroldat viszkozitását sem változtatják. A szárazsikér oldatok relatív viszkozitásának növekedése (37. ábra), tehát a nagyméretű polimer glutenin molekulák mennyiségi arányának növekedésével magyarázható.

Relatív viszkozitás

1,5 1,4 1,3 1,2 1,1 1 0,9 10

20

30

40

50

60

Virágzás utáni napok száma (DPA)

37. ábra: Sikéroldat relatív viszkozitásának változása az érés során

Az SE-HPLC méréssel kapott nem extrahálható polimerikus fehérjetartalmáról tudjuk, hogy az érés során egy állandó értékig nőtt. Az UPP értékeket összehasonlítva a viszkozitás értékekkel hasonló lefutást tapasztalunk (16. táblázat), ami megerősíti, hogy a polimer molekulák méretével arányos eredményeket kaptunk. Meg kell jegyezni azonban, hogy az


UPP eredmények az érés korábbi szakaszában kezdenek el csökkenni, mint a viszkozitás értékek.

Virágzás utáni nap UPP Relatív viszkozitás (DPA) 19 0,41 1,00 24 0,55 1,14 29 0,69 1,29 37 0,63 1,43 51 0,66 1,41 16. táblázat: Az SE-HPLC-vel mért legnagyobb méretű polimer gluteninek (UPP) mennyisége és a relatív vizskozitás értékek közti összefüggés az érés különböző fázisaiból származó szarazsikérből készült oldatok esetén (Ukrainka).

A tartalékfehérje bioszintézis és a sikérpolimer reológiai vizsgálatok eredményeit a 17. táblázat foglalja össze, amiből a következő általános tapasztalatok vonhatók le:  A különböző tartalékfehérjék (gliadinok, gluteninek, és alegységeik) bioszintézisének sebessége együtt változik és a makrofrakciók (szemtömeg, nedvességtartalom, száraztömeg) szintjén tapasztalható változásokhoz igazodik.  A búzaszemek érési folyamatának elején (19. DPA) a mag liszttartalmából nem nyerhető ki összetapadó, homogén szerkezetű sikér. A nedves sikér kialakulása a 24. DPA-nál kezdődik és legnagyobb fehérjetartalmát a 29. DPA környékén éri el.  A glutenin alegységek RP-HPLC vizsgálatai megmutatták, hogy a polimer glutenin alegységek mennyisége 29. DPA-nál alakul ki majdnem teljesen. Az alegységek számának növekedése lehetővé teszi azok nagyarányú összekapcsolódását. Ezután (29. DPA) az SEHPLC-val mért UPP arány sem növekszik tovább, mivel újabb alegységek (potenciális diszulfidkötő-helyek) nem alakulnak ki megfelelő mennyiségben.  A szárazsikéroldatban lévő polimerfehérjék mennyiségének növekedését kapilláris viszkoziméter segítségével bizonyítottuk, amit az UPP változással mutatott szoros összefüggés is alátámasztott.


Vizsgált folyamat

Vizsgált frakciók változásának jellege az érés során

Vizsgált frakcók 12. DPA

19. DPA

24. DPA

29. DPA

37. DPA

51. DPA

Szemtömeg Gyorsan nő Gyorsan csökken mennyiség (mg/szem) Nedvességtartalom Tartalékfehérje Csökken Gyorsan csökken (%) alegységek Száraztömeg bioszintézise Szigmoid növekedési szakasz Közel állandó (mg/szem) Gliadinok és Szigmoid növekedési szakasz Közel állandó Gluteninek Nedvessikér Nem tapad Növekedés Közel állandó mennyiség (mg/szem) Sikér Szárazsikér Növekedés Közel állandó kialakulása mennyiség (mg/szem) Szárazsikér-fehérje Növekedés Közel állandó mennyiség (mg/szem) Glutenin alegységek Növekedés Közel állandó HMW/LMW Sikérfehérjék Glutenin polimer Növekedés Közel állandó polimerizációja UPP Sikéroldat relatív Növekedés Közel állandó viszkozitása 17. táblázat: A tartalékfehérje alegységekből kialakuló sikérpolimer oldatok vizsgálatainak és azok eredményeinek összefoglalása


5.3 A sikér- és amarant illetve quinoa fehérjék kölcsönhatása komplex rendszerben A Tanszéken nemzetközi együttműködésben folyó pszeudocereáliákkal kapcsolatos kutatások lehetővé tették, hogy ezekhez kapcsolódva vizsgálatokat végezzünk amarant és quinoa fehérje izolátumok felhasználásával. A sütőipari termékek választékának bővítése, a termékek táplálkozási értéknek növelése érdekében egy sor új nyersanyag felhasználása vált gyakorivá a sütőiparban. Az új nyersanyagok közül az amarant illetve a quinoa felhaználása elsősorban a táplálkozási érték növelését célozza. Számos kutatás (Mlakar et al., 2009; Sindhuja et al., 2005; Tosi et al., 2002) azt mutatja, hogy az amarant vagy quinoa liszt arányának 20% fölé emelése a termékek minőségének jelentős csökkenésével jár együtt, bár kétségtelenül javítja a termék fehérje tartalmát és annak biológiai érékét. Előbbiek vetették fel azt a kérdést, hogy fehérje izolátumok adagolásával elérhető-e a táplálkozási érték javítása minőségi hátrányok nélkül. Kísérleteink során tanulmányoztuk, amarant és quinoa fehérje izolátumok hatását a búzalisztből készült tészta farinográfos illetve mikrovalorigráfos tulajdonságaira reológiai tulajdonságaira (Haraszi et al., 2004). A kapott valorigrammok azt mutattak, hogy az 1%-ot meghaladó fehérje izolátum adagolás nem rontja a tészta reológiai sajátságait.(19. táblázat). Ezek az eredmények azt bizonyítják, hogy a sikérváz fehérjéi kölcsönhatásba lépnek az adagolt pszeudo cereális fehérje izolátummal és erősítik a térhálót, ugyanakkor nem lép fel a szerkezeti inkompatibilitás jelensége. A jelenség termodinamikailag akkor indokolt, ha nagy a különbség a sikérkomponensek egymás közötti kölcsönhatásának erőssége és a “vendég” molekulák közötti kölcsönhatások erőssége között. Utóbbi gyakori a hústermékekhez adagolt növényi fehérjéknél, amikor a megfelelő kölcsönhatás hiánya miatt, az adagolt fehérje töltöanyagként működik, ami – például a párizsi esetében – lágy, nehezen szeletelhető konzisztenciát eredményez.


Paraméter

Az adagolt izolátum mennyisége (g/100g liszt) 0 1 2 3 Vízfelvevőképesség (%) 61,2 61,8 62,3 62,4 Tésztakialakulási idő (perc) 2,0 2,1 2,5 2,8 Stabilitás (perc) 4,8 4,8 4,9 5,2 Ellágyulás (FE) 80 75 78 84 19. táblázat: Az amarant fehérje izolátum hatása a búzaliszt farinográfos paramétereire

Eredményeink bizonyos fokig igazolják a búza és a pszeudo cereáliák fehérjéi közötti “rokonságot”. Oszvald és munkatársai (2009) nemrégen megjelent közleményükben az amarant albumin és a sikér közötti kölcsönhatásról számolnak be és feltételezik új diszulfid kötések létrejöttét a kétféle típusú fehérje között. Előbbiek alapján úgy tűnik, hogy amennyiben a cél csak a táplálkozási érték növelése, célszerűbb a pszeudocereália lisztje helyett az izolátumok használata.


6 Összefoglalás Bár a sikért alkotó fehérjék bioszintézisével kapcsolatos kutatások közel 40 éves múltra tekintenek vissza és intenzívebbé is váltak az utóbbi években, egy sor felvetett kérdésre még nem sikerült egyértelmű választ adni. Főleg a glutenin alegységek (HMW-, LMW-GS) különböző allélkobinációjára építve jelentős előrelépés történt a sütőipari minőségelőrejelzésében. Ugyanakkor ez nem mondható el az adott fajták minőségingadozásának terén, pedig az egyenletes minőség a feldolgozók egyik legfontosabb igénye. Előbbi problémák megoldása az eddiginél részletesebb kutatások igényét vetette fel. Saját kutatásunk három, nem eléggé tisztázott, sokszor ellentmondásos területen kívánnak hozzájárulni ismereteink bővítéséhez. Ezek a következők voltak: -

a tartalékfehérje monomerek (gliadinok, glutenin alegyégek) bioszintézisének dinamikája és a glutenin alegységek polimerizációja

-

a sikérkialakulás dinamikája és a sikérfehérjék méret szerinti eloszlásának változása

-

sikérfehérjék kölcsönhatása más fehérjékkel

A tartalékfehérjék bioszintézisét öt 2005. évi (GK Öthalom, Balada, MV Palotás, MV Ködmön és GK Csongrád), és két 2006. évi (MV Magdaléna és Bánkúti 1201) őszi búzafajta mintákon követtem. A sikérpolimer oldatainak vizsgálatát 2006. évi Ukrainka fajtán vizsgáltam, míg a sikér-pszeudocereália kölcsönhatás tanulmányozásánál a Tanszéken folyó pszeudocereália kutatás révén kapott izolátumokat használtam.

A minták szemtömeg és nedvestömeg mennyiségét a MSZ-nak megfelelően határoztam meg. A nitrogén (nyersfehérje) tartalom meghatározáshoz automata nitrogén analizátort használtam (Dumas-Pregl

módszer).

folyadékkromatográfiával

A

tartalékfehérje

(RP-HPLC)

választottam

alegységeket el.

A

fordított

fázisú

búzalisztből

történő

sikérmeghatározás során ismét az MSZ szerint jártam el. A sikérpolimer oldatokat méretkizárásos-, és fordított fázisú folyadékkromatográfiával (SE- és RP-HPLC) valamint módosított Ostwald viszkoziméterrel (Cannon-Fenske) vizsgáltam.


A

tartalékfehérje

monomerek

bioszintézisének

és

a

glutenin

alegységek

polimerizációjának vizsgálata A búzaszem érése során követtük a teljes fehérjemennyiség és az egyes tartalékfehérje alegységek mennyiségének változását és a következő megállapításokat tettük: 1. A különböző fajták érése során a magban szintetizálódó fehérjék mennyiségi változása hasonló dinamikát mutatott. A felhalmozódás sebessége és a virágzástól eltelt idő közötti összefüggés leginkább szigmoid görbével jellemezhető. A teljes fehérje/mag mennyiség már a virágzást követő 12. napon nőni kezd, az érés folyamán felgyorsul, majd az érés végéhez közeledve csökken, és leáll a növekedés üteme. Az azonos termesztési helyről származó különböző

búzafajták

fehérjemennyiségének

változása

az

érés

időpontja

szerint

összehangoltan a genetikailag meghatározott virágzási napok eltérő időpontjától függetlenül. 2. Sikerült az egyes gliadin típusok (-gliadinok) szintézisdinamikáját is követni. Az RP-HPLC technikával már jól mérhető gliadin mennyiség a virágzás utáni 15-16. nap után jelent meg. Az intenzív érési periódus az érési folyamat 20-26. napján kezdődött el. A teljes érés szakaszában stagnálás, sőt kisebb csökkenés fordulhat elő a száradás és kölcsönhatás változásokból eredő hatások eredményeként. Az egyes gliadin komponensek szintézise szinkronban folyik. 3. A glutenin frakció szintézisének vizsgálatán túl megoldottuk az egyes glutenin alegységek bioszintézisének követését is. A HMW és LMW gluteinin alegységek már az érés korai szakaszában kimutathatók és szintézisük az eddigi tendenciákhoz hasonlóan ezután következik be és a teljes érés előtt befejeződik (kisebb eltérést csak a kimagaslóan jó sütőipari minőséggel rendelkező Bánkúti 1201 fajta LMW alegységeinek szintézise során tapasztaltunk). A HMW alegységek (Dy, By, Dx, Bx, Ax) egyidejűleg szintetizálódnak és mennyiségi szempontból a B és a D kromoszómán kódolt alegységek szintézise a domináns.

A sikérkialakulás dinamikája és a sikérfehérjék méret szerinti eloszlásának változása a búzamag érése során A lisztből kimosható sikér vizsgálatainak köszönhetően, lehetővé vált a sikérpolimert alkotó tartalékfehérje frakciók abszolút mennyiségének meghatározása az érés során, melynek eredményeként a következő megállapításokat tettük: 1. A sikérpolimer kialakulásának dinamikáját követve megállapítottuk, hogy a virágzás utáni 24. napig nem alakult ki a lisztmintákból kimosható, összetapadó nedves sikér, annak ellenére, hogy a tartalékfehérjék szintézise már a 12. DPA környékén megkezdődik. Feltételezzük, hogy a kis mennyiségben szintetizálódott glutenin alegységek nem érik el a 83 Created with novaPDF Printer (www.novaPDF.com). Please register to remove this message.

hálózat kialakulásához szükséges kritikus koncentrációt és polimerizáltsági fokot. A kritikus 12-24. napokon a HMW és LMW alegységek egy szemre jutó mennyisége 0,3-0,5 mg között mozog. A kritikus polimerizáltsági fok megállapításához további kutatások szükségesek. 2. A kapott RP-HPLC kromatogramok alapján a 12. DPA környékén megjelenő nagy és kis molekulatömegű glutenin alegységek (HMW és LMW alegységek) a 29. DPA érik el végleges mennyiségük majdnem teljes részét. A virágzás utáni 29. napig növekvő HMW/LMW arány az alegységek szintézisének leállásával állandósul. Ezzel egyidőben változás

történik

az

SE-HPLC-val

mért

nagymolekulatömegű

polimerfehérjék

polimerizációjában is. Az UPP frakció aránya a 29. DPA-ig növekszik, utána feltehetően az új diszulfidkötő-helyek hiányában állandó marad. 3. A HMW és LMW glutein alegységeket összekötő diszulfid kötések kémiai bontását jól lehet követni az oldat viszkozitásának csökkenésével. Ebből a megfigyelésből kiindulva vizsgáltuk a búzaszem fejlődése közben vett mintákból nyerhető sikérek oldatainak viszkozitását. A mérések azt igazolták, hogy a viszkozitás növekedése következett be az UPP frakció növekedésével csaknem párhuzamosan. Bizonyítottuk, hogy a viszkozitás mérésével – alapozva a polimerekre vonatkozó Staudinger szám alakulására – követhető a glutenin alegységek polimerizációja a szemfejlődés során. Hogy az eredeti és a redukált glutenin viszkozitása közötti különbség mérése alkalmas lehet-e következtetések levonására sütőipari minőség vonatkozásában, azt további részletes kutatásoknak kell eldönteni.

A sikér- és amarant illetve quinoa fehérjék kölcsönhatása: 1. Az amarant és quinoa fehérje izolátumok adagolása a tészta reológiai sajátságainak javulását eredményezi, ami annak a jele, hogy a fehérjék között nem áll fenn a szerkezeti inkompatibilitás jelensége.

A PhD dolgozat tehát, a tartalékfehérjék és a sikérfehérjék bioszintézisét és a polimerképzéshez vezető kölcsönhatásokat többféle rendszeren keresztül megközelítve, új viszkozimetriás módszer alapjait teremtette meg, amely eredményesen egészítheti ki az eddigi reológiai vizsgálatokat. Hogy a bioszintézis során tapasztalható viszkozitás növekedés, valamint az eredeti és a redukált glutenin viszkozitása közötti különbség mérése alkalmas lehet-e következtetések levonására sütőipari minőség vonatkozásában, azt további részletes kutatásoknak kell eldönteni.


7 Felhasznált irodalom Alfredson, T.V., Wehr, C.T., Tallman, L. & Klink, F. (1982). Evaluation of New Microparticulate Packings for Aqueous Steric Exclusion Chromatography. Journal of Liquid Chromatography, 5, 489-524. Anderssen, R.S. (1999). The pragmatics of solving industrial (real-world) inverse problems with exemplification based on the molecular weight distribution problem. Inverse Problems, 15, R1-R40. Antes, S. & Wieser, H. (2000). Quantitative determination and localisation of thiol groups in wheat flour. Pages 211-214. In Wheat Gluten. Proc. 7th Int. Workshop on Gluten, Shewry, P.R. & Tatham, A.S. (eds). Royal Society of Chemistry: Cambridge. Arfvidsson, C., Wahlund, K.G. & Eliasson, A.C. (2004). Direct molecular weight determination in the evaluation of dissolution methods for unreduced glutenin. Journal of Cereal Science, 39, 1-8. Autran, J.C., Lew, E.J.L., Nimmo, C.C. & Kasarda, D.D. (1979). N-Terminal Amino-Acid Sequencing of Prolamins from Wheat and Related Species. Nature, 282, 527-529. Bajkai, T., Popineau, Y., Tömösközi, S. & Daniel, A. (1996). Determination of emulsifying properties by conductometric methods: Comparasion and evaluation. In Abstracts of 75 years of Cereal Chemistry and Food Quality Control, Jubilee Symposium of Dept. of Biochem. and Food Techn., Technical University of Budapest, June 17-18, 1996, Lásztity, R., Salgó, A. & Tömösközi, S. (eds): Budapest, Hungary. Batey, I.L., Gupta, R.B. & Macritchie, F. (1991). Use of Size-Exclusion High-Performance Liquid-Chromatography in the Study of Wheat-Flour Proteins - an Improved Chromatographic Procedure. Cereal Chemistry, 68, 207-209. Bechtel, D.B., Frend, A., Kaleikau, L.A., Wilson, J.D. & Shewry, P.R. (1988). Mechanisms of Storage Protein Deposition in Wheat Endosperm. Cereal Foods World, 33, 664665. Bechtel, D.B., Gaines, R.L. & Pomeranz, Y. (1982). Protein Secretion in Wheat Endosperm Formation of the Matrix Protein. Cereal Chemistry, 59, 336-343. Bechtel, D.B. & Wilson, J.D. (2005). Endosperm structural changes in wheat during drying of maturing caryopses. Cereal Chemistry, 82, 385-389. Bedő, Z., Kárpáti, M., Vida, G., Kramarikkissimon, J. & Láng, L. (1995). Good Breadmaking Quality Wheat (Triticum-Aestivum L) Genotypes with 2+12-Subunit Composition at the Glu-D1 Locus. Cereal Research Communications, 23, 283-289. Bejosano, F.P. & Corke, H. (1998). Effect of Amaranthus and buckwheat proteins on wheat dough properties and noodle quality. Cereal Chemistry, 75, 171-176. Békés, F., Kemény, S. & Morell, M. (2006). An integrated approach to predicting end-product quality of wheat. European Journal of Agronomy, 25, 155-162. Belitz, H.D. & Grosch, W. (1987). Lehrbruch der Lebensmittelchemie. Springer Verlag: Berlin. Belton, P.S. (1999). On the elasticity of wheat gluten. Journal of Cereal Science, 29, 103-107. Belton, P.S. & Taylor, J.R.N. (2002). Pseudocereals and less common cereals. Springer: Berlin. Bietz, J.A. (1979). Recent Advances in the Isolation and Characterization of Cereal Proteins. Cereal Foods World, 24, 199-&. Bietz, J.A. (1983). Separation of Cereal Proteins by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography. Journal of Chromatography, 255, 219-238.


Bietz, J.A. (1984). Analysis of Wheat Gluten Proteins by High-Performance LiquidChromatography .1. Bakers Digest, 58, 15-&. Bietz, J.A. & Burnouf, T. (1985). Chromosomal Control of Wheat Gliadin - Analysis by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography. Theoretical and Applied Genetics, 70, 599-609. Bietz, J.A. & Cobb, L.A. (1985). Improved Procedures for Rapid Wheat Varietal Identification by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography of Gliadin. Cereal Chemistry, 62, 332-339. Bietz, J.A. & Wall, J.S. (1975). Effect of Various Extractants on Subunit Composition and Associations of Wheat Glutenin. Cereal Chemistry, 52, 145-155. Branlard, G. & Dardevet, M. (1985). Diversity of Grain Protein and Bread Wheat Quality .2. Correlation between High Molecular-Weight Subunits of Glutenin and Flour Quality Characteristics. Journal of Cereal Science, 3, 345-354. Breene, W.M. (1991). Food Uses of Grain Amaranth. Cereal Foods World, 36, 426-430. Burnouf, T. & Bietz, J.A. (1984). Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography of Reduced Glutenin, a Disulfide-Bonded Protein of Wheat Endosperm. Journal of Chromatography, 299, 185-199. Bushuk, W. (1998). Interactions in wheat doughs. In Interactions: The Keys to Cereal Quality, R.J., H. & Hoseney, R.C. (eds) pp. 1-16. AACC: St.Paul, MN. Bushuk, W., Hay, R.L., Larsen, N.G., Sara, R.G., Simmons, L.D. & Sutton, K.H. (1997). Effect of mechanical dough development on the extractability of wheat storage proteins from bread dough. Cereal Chemistry, 74, 389-395. Bushuk, W. & Zillman, R.R. (1978). Wheat Cultivar Identification by Gliadin Electrophoregrams .1. Apparatus, Method and Nomenclature. Canadian Journal of Plant Science, 58, 505-515. Carceller, J.L. & Aussenac, T. (1999). Accumulation and changes in molecular size distribution of polymeric proteins in developing grains of hexaploid wheats: role of the desiccation phase. Australian Journal of Plant Physiology, 26, 301-310. Carceller, J.L. & Aussenac, T. (2001). SDS-insoluble glutenin polymer formation in developing grains of hexaploid wheat: the role of the ratio of high to low molecular weight glutenin subunits and drying rate during ripening. Australian Journal of Plant Physiology, 28, 193-201. Charbonnier, L. & Mosse, J. (1980). Large-Scale Isolation of Gliadin Fractions. Journal of the Science of Food and Agriculture, 31, 54-61. Chen, H. & Horváth, C. (1995). High-Speed High-Performance Liquid-Chromatography of Peptides and Proteins. Journal of Chromatography A, 705, 3-20. Clarke, B.C., Hobbs, M., Skylas, D. & Appels, R. (2000). Genes active in developing wheat endosperm. Funct Integr Genomics, 44-55. Colot, V., Bartels, D., Thompson, R. & Flavell, R. (1989). Molecular Characterization of an Active Wheat Lmw Glutenin Gene and Its Relation to Other Wheat and Barley Prolamin Genes. Molecular & General Genetics, 216, 81-90. Cornish, G.B., Vawser, M.-J. & Tonkin, R.E. (2005). Extra-strong dough properties associated with over-expression of HMW glutenin subunit GLU-B1 7X. Using Cereal Science and Technology for the Benefit of Consumers. CRC Press: Cambridge. D'Ovidio, R. & Masci, S. (2004). The low-molecular-weight glutenin subunits of wheat gluten. Journal of Cereal Science, 39, 321-339. Damidaux, R., Autran, J.C., Grignac, P. & Feillet, P. (1978). Relationships between Gliadin Electrophoretic Patterns and Viscoelastic Properties of Triticum-Durum Desf Gluten as an Aid in Breeding. Comptes Rendus Hebdomadaires Des Seances De L Academie Des Sciences Serie D, 287, 701-704.


Daniel, C. & Triboi, E. (2002). Changes in wheat protein aggregation during grain development: effects of temperatures and water stress. European Journal of Agronomy, 16, 1-12. Dimmock, J. & Gooding, M.J. (2002). The influence of foliar diseases, and their control by fungicides, on the protein concentration in wheat grain: a review. Journal of Agricultural Science, 138, 349-366. Dovidio, R., Masci, S. & Porceddu, E. (1995). Development of a Set of Oligonucleotide Primers Specific for Genes at the Glu-1 Complex Loci of Wheat. Theoretical and Applied Genetics, 91, 189-194. Dupont, F.M. & Altenbach, S.B. (2003). Molecular and biochemical impacts of environmental factors on wheat grain development and protein syntesis. Journal of Cereal Science, 133-146. DuPont, F.M., Hurkman, W.J., Vensel, W.H., Chan, R., Lopez, R., Tanaka, C.K. & Altenbach, S.B. (2006). Differential accumulation of sulfur-rich and sulfur-poor wheat flour proteins is affected by temperature and mineral nutrition during grain development. Journal of Cereal Science, 44, 101-112. Escudero, N.L., De Arellano, M.L., Luco, J.M., Gimenez, M.S. & Mucciarelli, S.I. (2004). Comparison of the chemical composition and nutritional value of Amaranthus cruentus flour and its protein concentrate. Plant Foods for Human Nutrition, 59, 1521. Field, J.M., Tatham, A.S. & Shewry, P.R. (1987). The Structure of a High-Mr Subunit of Durum-Wheat (Triticum-Durum) Gluten. Biochemical Journal, 247, 215-221. Gao, L. & Bushuk, W. (1993). Polymeric Glutenin of Wheat Lines with Varying Number of High-Molecular-Weight Glutenin Subunits. Cereal Chemistry, 70, 475-480. Gianibelli, M.C., Larroque, O.R., MacRitchie, F. & Wrigley, C.W. (2001). Biochemical, genetic, and molecular characterization of wheat glutenin and its component subunits Cereal Chemistry (Online fuller version at AACC website), 78, 635-646. Giddings, J.C. (1993). Field-Flow Fractionation - Analysis of Macromolecular, Colloidal, and Particulate Materials. Science, 260, 1456-1465. Gooding, M.J., Gregory, P.J., Ford, K.E. & Pepler, S. (2005). Fungicide and cultivar affect post-anthesis patterns of nitrogen uptake, remobilization and utilization efficiency in wheat. Journal of Agricultural Science, 143, 503-518. Gooding, M.J., Gregory, P.J., Ford, K.E. & Ruske, R.E. (2007). Recovery of nitrogen from different sources following applications to winter wheat at and after anthesis. Field Crops Research, 100, 143-154. Graham, J.S.D. & Morton, R.K. (1963). Studies of protein in developng wheat endosperm. Separation by starch gel electrophoresis and incorporation of 35-S-sulphate. Australian.Journal of Biological Science, 357-365. Grosch, W. & Wieser, H. (1999). Redox reactions in wheat dough as affected by ascorbic acid. Journal of Cereal Science, 29, 1-16. Gupta, R.B. (1993). Qualitative and Quantitative Variation in LMW and HMW Glutenin Subunits: Their Effect on Molecular Size of Proteins and Dough Properties. Gluten Proteins. ACR: Detmold. Gupta, R.B., Khan, K. & Macritchie, F. (1993). Biochemical Basis of Flour Properties in Bread Wheats .1. Effects of Variation in the Quantity and Size Distribution of Polymeric Protein. Journal of Cereal Science, 18, 23-41. Gupta, R.B. & Macritchie, F. (1994). Allelic Variation at Glutenin Subunit and Gliadin Loci, Glu-1, Glu-3 and Gli-1 of Common Wheats .2. Biochemical Basis of the Allelic Effects on Dough Properties. Journal of Cereal Science, 19, 19-29.


Gupta, R.B., Popineau, Y., Lefebvre, J., Cornec, M., Lawrence, G.J. & Macritchie, F. (1995). Biochemical Basis of Flour Properties in Bread Wheats .2. Changes in Polymeric Protein-Formation and Dough/Gluten Properties Associated with the Loss of Low M(R) or High M(R) Glutenin Subunits. Journal of Cereal Science, 21, 103-116. Gupta, R.B. & Shepherd, K.W. (1990). 2-Step One-Dimensional Sds-Page Analysis of Lmw Subunits of Glutelin .1. Variation and Genetic-Control of the Subunits in Hexaploid Wheats. Theoretical and Applied Genetics, 80, 65-74. Gupta, R.B. & Shepherd, K.W. (1993). Production of Multiple Wheat-Rye 1rs Translocation Stocks and Genetic-Analysis of Lmw Subunits of Glutenin and Gliadins in Wheats Using These Stocks. Theoretical and Applied Genetics, 85, 719-728. Hamer, R.J. & Vliet, T. (2000). Understanding the structure and properties of gluten: An overview. In Wheat Gluten, Shewry, P.R. & Tatham, A.S. (eds) pp. 125-131. RSC: Cambridge, UK. Haraszi, R., Gras, P.W., Tömösközi, S., Salgó, A. & Békés, F. (2004). Application of a micro Z-arm mixer to characterize mixing properties and water absorption of wheat flour. Cereal Chemistry, 81, 555-560. Hartley, H. (1951). Origin of the Word 'Protein'. Nature, 168, 244. Huebner, F.R. & Bietz, J.A. (1985). Detection of Quality Differences among Wheats by HighPerformance Liquid-Chromatography. Journal of Chromatography, 327, 333-342. Huebner, F.R. & Bietz, J.A. (1987). Improvements in Wheat-Protein Analysis and Quality Prediction by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography. Cereal Chemistry, 64, 15-20. Huebner, F.R. & Wall, J.S. (1976). Fractionation and Quantitative Differences of Glutenin from Wheat Varieties Varying in Baking Quality. Cereal Chemistry, 53, 258-269. Huifen, H.E. & Hoseney, R.C. (1990). Gluten – a Theory of How it Controls Bread-Making Quality. Gluten Proteins. AACC: St. Paul. Jenner, C.F., Ugalde, T.D. & Aspinall, D. (1991). The Physiology of Starch and Protein Deposition in the Endosperm of Wheat. Australian Journal of Plant Physiology, 18, 211-226. Jia, Y.Q., Masbou, V., Aussenac, T., Fabre, J.L. & Debaeke, P. (1996). Effects of nitrogen fertilization and maturation conditions on protein aggregates and on the breadmaking quality of Soissons, a common wheat cultivar. Cereal Chemistry, 73, 123-130. Jones, R.W., Taylor, N.W. & Senti, F.R. (1959). Electrophoresis and fractionation of wheat gluten Archives of Biochemistry and Biophysics, 84, 363-376. Juhász, A., Békés, F., Vida, G., Láng, L., Tamás, L. & Bedő, Z. (2000). Quantitative analysis of storage proteins of an old Hungarian wheat population using the SE-HPLC method. Gluten Proteins. RSC: Cambridge. Juhász, A. & Gianibelli, M.C. (2006). Low-Molecular-Weight Glutenin Subunits: Insights into this Abundant Subunit Group Present in Glutenin Polymers. In Gliadin and Glutenin, Wrigley, C., Békés, F. & Bushuk, W. (eds). AACC: St. Paul, Minnesota. Juhász, A., Haraszi, R., Larroque, O.R., Gianibelli, M.C., Békés, F. & Bedő, Z. (2003a). Qualitative and quantitative analysis of gliadin composition in an old hungarian wheat population. In 8th Gluten Workshop, Lafiandra, D., Masci, S. & Dovidio, R. (eds) pp. 140-143. RSC: Viterbo, Italy. Juhász, A., Larroque, O.R., Tamás, L., Hsam, S.L.K., Zeller, F.J., Békés, F. & Bedő, Z. (2003b). Bankuti 1201 - an old Hungarian wheat variety with special storage protein composition. Theoretical and Applied Genetics, 107, 697-704.


Juhász, A., Tamás, L., Karsai, I., Vida, G., Láng, L. & Bedő, Z. (2001). Identification, cloning and characterisation of a HMW-glutenin gene from an old Hungarian wheat variety, Bankuti 1201. Euphytica, 119, 75-79. Kárpáti, M., Brieber, K., Kuroczi, L.G., Czirák, L. & Lásztity, R. (1995). Relationship between High-Molecular-Weight Subunits of Glutenin and Breadmaking Quality of Hungarian Grown Wheats. Acta Alimentaria, 24, 47-54. Kasarda, D.D. (1989). Glutenin structure in relation to wheat quality. In Wheat is Unique, Pomeranz, Y. (ed) pp. 277-302. AACC: St. Paul, MN. Kasarda, D.D. (1999). Glutenin polymers: The in vitro to in vivo transition. Cereal Foods World, 44, 566-571. Kasarda, D.D., Autran, J.C., Lew, E.J.L., Nimmo, C.C. & Shewry, P.R. (1983). N-Terminal Amino-Acid-Sequences of Omega-Gliadins and Omega-Secalins - Implications for the Evolution of Prolamin Genes. Biochimica Et Biophysica Acta, 747, 138-150. Keck, B., Kohler, P. & Wieser, H. (1995). Disulfide Bonds in Wheat Gluten - Cystine Peptides Derived from Gluten Proteins Following Peptic and Thermolytic Digestion. Zeitschrift Fur Lebensmittel-Untersuchung Und-Forschung, 200, 432-439. Khan, K., Figueroi, J. & Chakraborty, K. (1990). Relationship of Gluten Protein Composition to Bread-Making Quality of HRS Wheat Grown in North Dakota. Gluten Proteins. AACC: St. Paul. Khan, K. & Huckle, L. (1992). Use of Multistacking Gels in Sodium Dodecyl SulfatePolyacrylamide Gel-Electrophoresis to Reveal Polydispersity, Aggregation, and Disaggregation of the Glutenin Protein-Fraction. Cereal Chemistry, 69, 686-688. Khan, K., McDonald, C. & Banasik, O. (1982). Polyacrilamide Gel Electrophoresis of Wheat Gluten Proteins. Bakers Digest, 56, 14-19. Khan, K. & Shewry, P.R. (2009). Wheat Chemistry and Technology - Wheat grain proteins, 8. fejezet. St. Paul, Minnesota, AACC. Kohler, P., Belitz, H.D. & Wieser, H. (1991). Disulfide Bonds in Wheat Gluten - Isolation of a Cystine Peptide from Glutenin. Zeitschrift Fur Lebensmittel-Untersuchung UndForschung, 192, 234-239. Kohler, P., Belitz, H.D. & Wieser, H. (1993). Disulfide Bonds in Wheat Gluten - Further Cystine Peptides from High-Molecular-Weight (Hmw) and Low-Molecular-Weight (Lmw) Subunits of Glutenin and from Gamma-Gliadins. Zeitschrift Fur LebensmittelUntersuchung Und-Forschung, 196, 239-247. Kolster, P. & Vereijken, J.M. (1993). Evaluating Hmw Glutenin Subunits to Improve BreadMaking Quality of Wheat. Cereal Foods World, 38, 76-&. Konarev, V.G. (1980). Wheat proteins (in Russian). Kolos Publ.: Moscow. Kosmolak, F.G., Dexter, J.E., Matsuo, R.R., Leisle, D. & Marchylo, B.A. (1980). A Relationship between Durum-Wheat Quality and Gliadin Electrophoregrams. Canadian Journal of Plant Science, 60, 427-432. Kovács, E.T., Maraz-Szabó, L. & Varga, J. (2001). Examination of the protein-emulsifiercarbohydrate interactions in amaranth based pasta products. Acta Alimentaria, 30, 173-187. Kruger, J.E. & Marchylo, B.A. (1985). Selection of Column and Operating-Conditions for Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography of Proteins in Canadian Wheat. Canadian Journal of Plant Science, 65, 285-298. Kruger, J.E. & Marchylo, B.A. (1990). Analysis by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography of Changes in High-Molecular-Weight Subunit Composition of Wheat Storage Proteins During Germination. Cereal Chemistry, 67, 141-147. Laemmli, U.K. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature, 680-685.


Lafiandra, D., Dovidio, R., Porceddu, E., Margiotta, B. & Colaprico, G. (1993). New Data Supporting High M(R) Glutenin Subunit-5 as the Determinant of Quality Differences among the Pairs 5+10 Vs 2+12. Journal of Cereal Science, 18, 197-205. Lafiandra, D., Masci, S., Blumenthal, C. & Wrigley, C.W. (1999). The formation of glutenin polymer in practice. Cereal Foods World, 44, 572-+. Lagudah, E.S., Obrien, L. & Halloran, G.M. (1988). Influence of Gliadin Composition and High Molecular-Weight Subunits of Glutenin on Dough Properties in an F3 Population of a Bread Wheat Cross. Journal of Cereal Science, 7, 33-42. Larre, C., Nicolas, Y., Desserme, C., Courcoux, C. & Popineau, Y. (1997). Preparative separation of high and low molecular weight subunits of glutenin from wheat. Journal of Cereal Science, 25, 143-150. Larroque, O.R., Bekes, F., Wrigley, C.W. & Rathmell, W.G. (2000). Analysis of gluten proteins in grain and flour blends by RP-HPLC. Wheat Gluten, 136-139. Lásztity, R. (1982). Periodica Polytechnica Chem. Eng. (Budapest), 24, 1-25. Lásztity, R. (1999). Cereal Chemistry. Akadémiai Kiadó: Budapest. Lásztity, R., Békés, F., Örsi, F., Smied, I. & Kárpáti, M. (1996). Protein-lipid and proteincarbohydrate interactions in the gluten complex. Periodica Polytechnica. Chem. Eng., 40, 29-40. Lásztity, R., Varga, J., Szabó, M., S-né, K., Huszár, M. & Örsi, F. (1985). Magyarországon termesztett búzafajták gélelektroforézises azonosításának katalógusa. Statisztikai Kiadó. Laudencia-Chingcuanco, D.L., Stamova, B.S., Lazo, G.R., Cui, X.Q. & Anderson, O.D. (2006). Analysis of the wheat endosperm transcriptome. Journal of Applied Genetics, 47, 287-302. Laudencia-Chingcuanco, D.L., Stamova, B.S., You, F.M., Lazo, G.R., Beckles, D.M. & Anderson, O.D. (2007). Transcriptional profiling of wheat caryopsis development using cDNA microarrays. Plant Molecular Biology, 63, 651-668. Lawrence, G.J. & Shepherd, K.W. (1980). Variation in Glutenin Protein Subunits of Wheat. Australian Journal of Biological Sciences, 33, 221-233. Leader, D.J. (2005). Transcriptional analysis and functional genomics in wheat. Journal of Cereal Science, 41, 149-163. Lew, E.J.L., Kuzmicky, D.D. & Kasarda, D.D. (1992). Characterization of Low-MolecularWeight Glutenin Subunits by Reversed-Phase High-Performance LiquidChromatography, Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel-Electrophoresis, and N-Terminal Amino-Acid Sequencing. Cereal Chemistry, 69, 508-515. Lindsay, M.P. & Skerritt, J.H. (1999). The glutenin macropolymer of wheat flour doughs: structure-function perspectives. Trends in Food Science & Technology, 10, 247-253. Lookhart, G.L., Bean, S.R. & Bietz, J.A. (2003). Reversed-phase high-performance liquid chromatography in grain applications. Cereal Foods World, 48, 9-16. MacRitchie, F. (1992). Physicochemical properties of wheat proteins in relation to functionality. Advances in Food and Nutrition Research, 36, 36, 1-87. MacRitchie, F. (1999). Wheat Proteins: Characterization and role in flour functionality. Cereal Foods World, 188-193. MacRitchie, F., Cros, D.L.D. & Wrigley, C.W. (1990). Flour polypeptides related to wheat quality. Vol. 10. Advances in Cereal Science and Technology. AACC. Marchylo, B.A., Hatcher, D.W. & Kruger, J.E. (1988). Identification of Wheat Cultivars by Reversed-Phase High-Performance Liquid-Chromatography of Storage Proteins. Cereal Chemistry, 65, 28-40.


Marchylo, B.A., Hatcher, D.W., Kruger, J.E. & Kirkland, J.J. (1992a). Reversed-Phase HighPerformance Liquid-Chromatographic Analysis of Wheat Proteins Using a New, Highly Stable Column. Cereal Chemistry, 69, 371-378. Marchylo, B.A. & Kruger, J.E. (1988). The Effect of Injection Volume on the QuantitativeAnalysis of Wheat Storage Proteins by Reversed-Phase High-Performance LiquidChromatography. Cereal Chemistry, 65, 192-198. Marchylo, B.A., Kruger, J.E. & Hatcher, D.W. (1989). Quantitative Reversed-Phase HighPerformance Liquid-Chromatographic Analysis of Wheat Storage Proteins as a Potential Quality Prediction Tool. Journal of Cereal Science, 9, 113-130. Marchylo, B.A., Lukow, O.M. & Kruger, J.E. (1992b). Quantitative Variation in HighMolecular-Weight Glutenin Subunit-7 in Some Canadian Wheats. Journal of Cereal Science, 15, 29-37. Marcone, M.F. & Kakuda, Y. (1999). A comparative study of the functional properties of amaranth and soybean globulin isolates. Nahrung, 43, 368-373. Masci, S., D'Ovidio, R., Lafiandra, D. & Kasarda, D.D. (1998). Characterization of a lowmolecular-weight glutenin subunit gene from bread wheat and the corresponding protein that represents a major subunit of the glutenin polymer. Plant Physiology, 118, 1147-1158. Masci, S., Lafiandra, D., Porceddu, E., Lew, E.J.L., Tao, H.P. & Kasarda, D.D. (1993). DGlutenin Subunits - N-Terminal Sequences and Evidence for the Presence of Cysteine. Cereal Chemistry, 70, 581-585. Masci, S., Porceddu, E. & Lafiandra, D. (1991). 2-Dimensional Electrophoresis of 1dEncoded B-Glutenin and D-Glutenin Subunits in Common Wheats with Similar Omega-Gliadins. Biochemical Genetics, 29, 403-413. Masci, S., Rovelli, L., Monari, A.M., Pogna, N.E., Boggini, G. & Lafiandra, D. (2000). Charcterization of a LMW-2 type durum wheat cultivar with poor technological peoperties. Wheat Gluten. RSC: Cambridge. Menini, U.G. (1999). Policy issues for the conservation and utilisation of horticultural genetic resources for food and agriculture. World Conference on Horticultural Research, 211232. Metakovsky, E.V., Novoselskaya, A.Y., Kopus, M.M., Sobko, T.A. & Sozinov, A.A. (1984a). Blocks of Gliadin Components in Winter-Wheat Detected by One-Dimensional Polyacrylamide-Gel Electrophoresis. Theoretical and Applied Genetics, 67, 559-568. Metakovsky, E.V., Novoselskaya, A.Y. & Sozinov, A.A. (1984b). Genetic-Analysis of Gliadin Components in Winter-Wheat Using Two-Dimensional Polyacrylamide-Gel Electrophoresis. Theoretical and Applied Genetics, 69, 31-37. Mills, E.N.C., Parker, M.L., Wellner, N., Toole, G., Feeney, K. & Shewry, P.R. (2005). Chemical imaging: the distribution of ions and molecules in developing and mature wheat grain. Journal of Cereal Science, 41, 193-201. Mlakar, S.G., Bavec, M., Turinek, M. & Bavec, F. (2009). Rheological Properties of Dough Made from Grain Amaranth-Cereal Composite Flours Based on Wheat and Spelt. Czech Journal of Food Sciences, 27, 309-319. MSZ63-67-3. (1983). Magyar Szabványügyi Testület: Élelmezési, takarmányozási, ipari magvak és hántolt termények vizsgálata. Nedvességtartalom meghatározása. MSZ-EN-ISO:21415-1. (2007). Magyar Szabványügyi Testület: Búza és búzaliszt. Sikértartalom. 1. rész: A nedves sikér meghatározása kézi módszerrel (ISO 214151:2006) MSZ-EN-ISO:21415-3. (2007). Magyar Szabványügyi Testület: Búza és búzaliszt. Sikértartalom. 3. rész: A száraz sikér meghatározása nedves sikérből szárítószekrényes módszerrel (ISO 21415-3:2006)


Muller, S., Vensel, W.H., Kasarda, D.D., Kohler, P. & Wieser, H. (1998). Disulphide bonds of adjacent cysteine residues in low molecular weight subunits of wheat glutenin. Journal of Cereal Science, 27, 109-116. Myers, M.N. (1997). Overview of field-flow fractionation. Journal of Microcolumn Separations, 9, 151-162. Naeem, H.A. & MacRitchie, F. (2005). Polymerization of glutenin during grain development in near-isogenic wheat lines differing at Glu-D1 and Glu-B1 in greenhouse and field. Journal of Cereal Science, 41, 7-12. Nagy, I.J., Takács, I., Tamás, L. & Bedő, Z. (2003). Molecular cloning and characterization of low-molecular-weight glutenin sequences from an old Hungarian wheat variety, Bankuti 1201. Cereal Research Communications, 31, 25-31. Ofarrell, P.Z., Goodman, H.M. & Ofarrell, P.H. (1977). High-Resolution 2-Dimensional Electrophoresis of Basic as Well as Acidic Proteins. Cell, 12, 1133-1141. Okita, T.W., Cheesbrough, V. & Reeves, C.D. (1985). Evolution and Heterogeneity of the Alpha-Type Beta-Type and Gamma-Type Gliadin DNA-Sequences. Journal of Biological Chemistry, 260, 8203-8213. Orth, R.A. & Bushuk, W. (1972). A comparative study of the proteins of wheats of diverse baking qualities. Cereal Chemistry, 49. Osborne, T.B. (1907). The Proteins of the Wheat Kernel. Carnegie Institution of Washington: Washington D.C. Oszvald, M., Tamás, C., Rakszegi, M., Tömösközi, S., Békés, F. & Tamás, L. (2009). Effects of incorporated amaranth albumins on the functional properties of wheat dough. Journal of the Science of Food and Agriculture, 89, 882-889. Örsi, F., Pallagibankfalvi, E. & Lásztity, R. (1985). Analysis of Dependence between Flour Quality and Electrophoretic Protein Spectrum. Acta Alimentaria, 14, 49-57. Parker, M.L. (1981). Storage Protein Deposition in Developing Wheat Endosperm. Micron, 12, 187-188. Payne, P.I. (1987). Genetics of Wheat Storage Proteins and the Effect of Allelic Variation on Bread-Making Quality. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 38, 141-153. Payne, P.I., Corfield, K.G., Holt, L.M. & Blackman, J.A. (1981). Correlations between the Inheritance of Certain High-Molecular Weight Subunits of Glutenin and BreadMaking Quality in Progenies of 6 Crosses of Bread Wheat. Journal of the Science of Food and Agriculture, 32, 51-60. Payne, P.I., Holt, L.M., Jarvis, M.G. & Jackson, E.A. (1985). Two-Dimensional Fractionation of the Endosperm Proteins of Bread Wheat (Triticum-Aestivum) - Biochemical and Genetic-Studies. Cereal Chemistry, 62, 319-326. Payne, P.I., Holt, L.M., Lawrence, G.J. & Law, C.N. (1982). The Genetics of Gliadin and Glutenin, the Major Storage Proteins of the Wheat Endosperm. Qualitas PlantarumPlant Foods for Human Nutrition, 31, 229-241. Payne, P.I., Jackson, E.A. & Holt, L.M. (1984). The Association between Gamma-Gliadin-45 and Gluten Strength in Durum-Wheat Varieties - a Direct Causal Effect or the Result of Genetic-Linkage. Journal of Cereal Science, 2, 73-81. Payne, P.I., Law, C.N. & Mudd, E.E. (1980). Control by Homoeologous Group-1 Chromosomes of the High-Molecular-Weight Subunits of Glutenin, a Major Protein of Wheat Endosperm. Theoretical and Applied Genetics, 58, 113-120. Payne, P.I. & Lawrence, G.J. (1983). Catalog of alleles of the complex gene loci Glu-A1, Glu-B1 and Glu-D1 which code for high molecular weight subunits of glutenin in hexaploid wheat. Cereal Research Communications, 11, 29-35.


Payne, P.I., Nightingale, M.A., Krattiger, A.F. & Holt, L.M. (1987). The Relationship between Hmw Glutenin Subunit Composition and the Bread-Making Quality of British-Grown Wheat-Varieties. Journal of the Science of Food and Agriculture, 40, 51-65. Pepler, S., Gooding, M.J. & Ellis, R.H. (2006). Modelling simultaneously water content and dry matter dynamics of wheat grains. Field Crops Research, 95, 49-63. Pogna, N., Lafiandra, D., Feillet, P. & Autran, J.C. (1988). Evidence for a Direct Causal Effect of Low-Molecular Weight Subunits of Glutenins on Gluten Viscoelasticity in Durum Wheats. Journal of Cereal Science, 7, 211-214. Pogna, N.E., Boggini, G., Corbellini, M., Cattaneo, M. & Peruffo, A.D. (1982). Association between Gliadin Electrophoretic Bands and Quality in Common Wheat. Canadian Journal of Plant Science, 62, 913-918. Purcell, J.M., Kasarda, D.D. & Wu, C.S.C. (1988). Secondary Structures of Wheat AlphaGliadin and Omega-Gliadin Proteins - Fourier-Transform Infrared-Spectroscopy. Journal of Cereal Science, 7, 21-32. Qian, Y.W., Preston, K., Krokhin, O., Mellish, J. & Ens, W. (2008). Characterization of Wheat Gluten Proteins by HPLC and MALDI TOF Mass Spectrometry. Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 19, 1542-1550. Rakszegi, M., Scholz, E., Kárpáti, M., Ganzler, K., Lásztity, R. & Bedő, Z. (2000). Study of the LMW glutenin composition of some old Hungarian wheat cultivars using capillary electrophoresis. Cereal Research Communications, 28, 417-424. Rathmell, W.G., Wrigley, C.W., Batey, I.L., Howes, N., J, S.P. & Kilian, A. (2001). Selection of breeders lines for wheat Quality: Australian innovations. Using Cereal Science and Technology for the Benefit of Consumer. Woodhead Publ.Ltd: Cambridge. Regnier, F.E. & Gooding, K.M. (1980). High-Performance Liquid-Chromatography of Proteins. Analytical Biochemistry, 103, 1-25. Rhazi, L., Cazalis, R. & Aussenac, T. (2003). Sulfhydryl-disulfide changes in storage proteins of developing wheat grain: influence on the SDS-unextractable glutenin polymer formation. Journal of Cereal Science, 38, 3-13. Sapirstein, H.D. & Fu, B.X. (1998). Intercultivar variation in the quantity of monomeric proteins, soluble and insoluble glutenin, and residue protein in wheat flour and relationships to breadmaking quality. Cereal Chemistry, 75, 500-507. Saunders, R.M. & Becker, R. (1984). Amaranthus: a potential food and feed resource. Advances in Cereal Science and Technology, 6, 6, 357-396. Scanlon, M.G., Sapirstein, H.D. & Bushuk, W. (1989). Computerized Wheat Varietal Identification by High-Performance Liquid-Chromatography. Cereal Chemistry, 66, 439-443. Shewry, P.R. (1999). The synthesis, processing, and deposition of gluten proteins in the developing wheat grain. Cereal Foods World, 44, 587-589. Shewry, P.R., D'ovidio, R., Jenkins, J.A., Mills, E.N.C. & Békés, F. (2009a). Wheat Grain Proteins. In Wheat: Chemisty and Technology, Fourth Edition, Khan, K. & Shewry, P.R. (eds) pp. 223-298. APS Press: St. Paul, MN. Shewry, P.R. & Halford, N.G. (2002). Cereal seed storage proteins: structures, properties and role in grain utilization. Journal of Experimental Botany, 53, 947-958. Shewry, P.R., Halford, N.G. & Tatham, A.S. (1989). The high molecular weight subunits of wheat, barley, and rye: Genetics, molacular biology, chemistry, and role in wheat gluten structure and functionality. Vol. 6. Oxford Surveys of Plant and Molecular Cell Biology Oxford University Press: London. Shewry, P.R., Halford, N.G. & Tatham, A.S. (1992). High-Molecular-Weight Subunits of Wheat Glutenin. Journal of Cereal Science, 15, 105-120.


Shewry, P.R., Halford, N.G., Tatham, A.S., Popineau, Y., Lafiandra, D. & Belton, P. (2003). The high molecular weight subunits of wheat glutenin and their role in determining wheat processing properties. Advances in Food and Nutrition Research 45, 219-302. Shewry, P.R. & Lookhart, G.L. (2003). Wheat gluten protein analysis. AACC: St Paul, Minnesota. Shewry, P.R. & Miflin, B.J. (1985). Seed storage proteins of economically important cereals. Vol. 7. Advances in cereal science and technology. AACC: St. Paul. Shewry, P.R., Popineau, Y., Lafiandra, D. & Belton, P. (2000). Wheat glutenin subunits and dough elasticity: findings of the EUROWHEAT project. Trends in Food Science & Technology, 11, 433-441. Shewry, P.R. & Tatham, A.S. (1997). Disulphide bonds in wheat gluten proteins. Journal of Cereal Science, 25, 207-227. Shewry, P.R., Tatham, A.S., Forde, J., Kreis, M. & Miflin, B.J. (1986). The Classification and Nomenclature of Wheat Gluten Proteins - a Reassessment. Journal of Cereal Science, 4, 97-106. Shewry, P.R., Underwood, C., Wan, Y.F., Lovegrove, A., Bhandari, D., Toole, G., Mills, E.N.C., Denyer, K. & Mitchell, R.A.C. (2009b). Storage product synthesis and accumulation in developing grains of wheat. Journal of Cereal Science, 50, 106-112. Silva-Sanchez, C., Gonzalez-Castaneda, J., De Leon-Rodriguez, A. & De La Rosa, A.P.B. (2004). Functional and rheological properties of amaranth albumins extracted from two Mexican varieties. Plant Foods for Human Nutrition, 59, 169-174. Simmonds, D.H. (1978). Structure, Composition, and Biochemistry of Cereal Grains. In Cereals '78: Better Nutrition for the World's Millions, Pomeranz, Y. (ed) pp. 105. AACC, St. Paul. Sindhuja, A., Sudha, M.L. & Rahim, A. (2005). Effect of incorporation of amaranth flour on the quality of cookies. European Food Research and Technology, 221, 597-601. Singh, N.K. & Shepherd, K.W. (1988). Linkage Mapping of Genes-Controlling Endosperm Storage Proteins in Wheat .1. Genes on the Short Arms of Group-1 Chromosomes. Theoretical and Applied Genetics, 75, 628-641. Sivri, D., Sapirstein, H.D., Koksel, H. & Bushuk, W. (1999). Effects of wheat bug (Eurygaster maura) protease on glutenin proteins. Cereal Chemistry, 76, 816-820. Skerritt, J.H., Hac, L. & Bekes, F. (1999). Depolymerization of the glutenin macropolymer during dough mixing: I. Changes in levels, molecular weight distribution, and overall composition. Cereal Chemistry, 76, 395-401. Skylas, D.J., Mackintosh, J.A., Cordwell, S.J., Basseal, D.J., Walsh, B.J., Harry, J., Blumenthal, C., Copeland, L., Wrigley, C.W. & Rathmell, W. (2000). Proteome approach to the characterisation of protein composition in the developing and mature wheat-grain endosperm. Journal of Cereal Science, 32, 169-188. Soltes-Rak, E., Kevresan, S., Rajcan-Separovic, E. & Vapa, L. (1991). Relationship between the RFLP pattern at the Glu-1 loci and the bread-making quality of the Yugoslav wheat cultivars. Periodicum Biologorum 93, 373-375. Southan, M. & MacRitchie, F. (1999). Molecular weight distribution of wheat proteins. Cereal Chemistry, 76, 827-836. Sozinov, A.A. (1984). Blocks of cereal storage protein as genetic markers. Gluten proteins. TNO: Wagwningen. Staudinger, H. (1920). Über Polymerisationen. Ber. Deutsch. Chem. Ges 1073-1085. Staudinger, H. (1932). Die Hochmolekularen Organischen Verbindungen. Springer: Berlin. Stevenson, S.G. & Preston, K.R. (1996). Flow field-flow fractionation of wheat proteins. Journal of Cereal Science, 23, 121-131.


Stevenson, S.G., You, S., Izydorczyk, M.S. & Preston, K.R. (2003). Characterization of polymeric wheat proteins by flow field-flow fractionation/MALLS. Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies, 26, 2771-2781. Tamás, L., Gras, P.W., Solomon, R.G., Morell, M.K., Appels, R. & Békés, F. (2002). Chain extension and termination as a function of cysteine content and the length of the central repetitive domain in storage proteins. Journal of Cereal Science, 36, 313-325. Tao, H.P., Adalsteins, A.E. & Kasarda, D.D. (1992). Intermolecular Disulfide Bonds Link Specific High-Molecular-Weight Glutenin Subunits in Wheat Endosperm. Biochimica Et Biophysica Acta, 1159, 13-21. Tatham, A.S., Drake, A.F. & Shewry, P.R. (1985a). A Conformational Study of a GlutamineRich and Proline-Rich Cereal Seed Protein, C-Hordein. Biochemical Journal, 226, 557-562. Tatham, A.S., Field, J.M., Smith, S.J. & Shewry, P.R. (1987). The Conformations of Wheat Gluten Proteins .2. Aggregated Gliadins and Low-Molecular-Weight Subunits of Glutenin. Journal of Cereal Science, 5, 203-214. Tatham, A.S., Miflin, B.J. & Shewry, P.R. (1985b). The Beta-Turn Conformation in Wheat Gluten Proteins - Relationship to Gluten Elasticity. Cereal Chemistry, 62, 405-412. Tatham, A.S. & Shewry, P.R. (1995). The S-Poor Prolamins of Wheat, Barley and Rye. Journal of Cereal Science, 22, 1-16. Tatham, A.S., Shewry, P.R. & Belton, P.S. (1990). Structural studies of cereal prolamins, including gluten. Vol. 10. Advances in Cereal Science and Technology. AACC. Vol 10, 1-78: St Paul. Tatham, A.S., Shewry, P.R. & Field, J.M. (1990a). Conformational studies of the repetitive domains of the cereal proteins. Gluten Proteins. AACC. 376-388: St Paul. Thomson, N.H., Miles, M.J., Tatham, A.S. & Shewry, P.R. (1992). Molecular Images of Cereal Proteins by Stm. Ultramicroscopy, 42, 1204-1213. Tosi, E.A., Re, E.D., Masciarelli, R., Sanchez, H., Osella, C. & de la Torre, M.A. (2002). Whole and defatted hyperproteic amaranth flours tested as wheat flour supplementation in mold breads. Lebensmittel-Wissenschaft Und-Technologie-Food Science and Technology, 35, 472-475. Tömösközi, S., Bajkai, T., Süle, E., Nagy, J., Popineau, Y. & Lásztity, R. (1996). Functional properties of plant protein isolates - A comparative study. In Conference on Plant Proteins from European Crops, Nov 25-27: Nantes, France. Tömösközi, S., Popineau, Y., Bajkai, T. & Lásztity, R. (1994). Determination of Foaming Properties pf Food Proteins by Conductometric Methods - A comperetative study. In 1.st Int. Conference on Food Physics pp. 99-102. Journal of Food Physics Supplement. Triboi, E., Abad, A., Michelena, A., Lloveras, J., Ollier, J.L. & Daniel, C. (2000). Environmental effects on the quality of two wheat genotypes: 1. quantitative and qualitative variation of storage proteins. European Journal of Agronomy, 13, 47-64. Triboi, E., Martre, P. & Triboi-Blondel, A.M. (2003). Environmentally-induced changes in protein composition in developing grains of wheat are related to changes in total protein content. Journal of Experimental Botany, 54, 1731-1742. Vapa, L.J., Dencic, S., Soltes-Rak, E. & Kevresan, S. (1996). Genetic variation in Glu-1 loci breadmaking quality in wheat. Cereal Res. Commun., 23, 361-364. Weegels, P.L., Hamer, R.J. & Schofield, J.D. (1996a). Functional properties of wheat glutenin. Journal of Cereal Science, 23, 1-18. Weegels, P.L., vandePijpekamp, A.M., Graveland, A., Hamer, R.J. & Schofield, J.D. (1996b). Depolymerisation and re-polymerisation of wheat glutenin during dough processing


.1. Relationships between glutenin macropolymer content and quality parameters. Journal of Cereal Science, 23, 103-111. Wieser, H. (2007). Chemistry of gluten proteins. Food Microbiology, 24, 115-119. Wieser, H., Antes, S. & Seilmeier, W. (1998). Quantitative determination of gluten protein types in wheat flour by reversed-phase high-performance liquid chromatography. Cereal Chemistry, 75, 644-650. Wieser, H., Bushuk, W. & MacRitchie, F. (2006a). The Polimeric Glutenins. In Gliadin and Glutenin, Wrigley, C., Békés, F. & Bushuk, W. (eds). AACC: St. Paul, Minnesota. Wieser, H., Bushuk, W. & MacRitchie, F. (2006b). The Polymeric Glutenins. In Gliadin and Glutenin, Wrigley, C., Békés, F. & Bushuk, W. (eds). AACC: St. Paul, MN. Wright, R.J., Larroque, O.R., Békés, F., Wellner, N., Tatham, A.S. & Shewry, P.R. (2000). Analysis of the gluten proteins in developing spring wheat. Gluten proteins. RSC: Cambridge. Wrigley, C., Békés, F. & Bushuk, W. (2006a). GLIADIN AND GLUTENIN. AACC International: St. Paul, Minnesota. Wrigley, C., Békés, F. & Bushuk, W. (2006b). GLIADIN AND GLUTENIN, Polymeric glutenins, 7. fejezet. St Paul, Minnesota, AACC International. Wrigley, C.W. (1970). Protein mapping by combined gel electrofocusing and electrophoresis: Application to the srudy of genotypic variations in wheat gliadins. Biochemical Genetics, 509-516. Wrigley, C.W. (1977). Characterisation and analysis of cereal products in food by protein electrophoresis. Food Technol. Aust. , 17-20. Wrigley, C.W. (1996). Biopolymers - Giant proteins with flour power. Nature, 381, 738-739. Wrigley, C.W., Autran, J.C. & Bushuk, W. (1982a). Identification of cereal varietes by gel electrophoresis of the grain proteins. Vol. 5. Advances in Cereal Science and Technology. AACC: St. Paul. Wrigley, C.W., Lawrence, G.J. & Shepherd, K.W. (1982b). Association of Glutenin Subunits with Gliadin Composition and Grain Quality in Wheat. Australian Journal of Plant Physiology, 9, 15-30. Zanotti, F.M. & Beccari, J.B. (1745). De frumento. De Bononiensi Scientiarum et Artum Instiuto atque Academia Commentarii, 2, 122-127.


Köszönetnyilvánítás Ezúton is szeretném megköszönni Dr. Lásztity Radomir témavezetőmnek azt a nélkülözhetetlen szakmai irányítást és emberi segítséget, amivel megalapozta és jelentősen hozzájárult dolgozatom elkészüléséhez. Dr Salgó András tanszékvezetőnek köszönöm, hogy lehetővé tette kutatói munkám a Budapesti Műszaki és Gazdaságtudományi Egyetem Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszékén. Továbbá Dr. Baticz Orsolyának, Dr. Király Istvánnak, Dr. Tömösközi Sándornak és Dr Békés Ferencnek azt, hogy szakmai tudásukkal segítették tanulmányaim előrehaladását. Dr. Guóth Adrienn munkatársam a kezdetektől baráti és szakmai támogatásával, együttműködésével segített és részese ennek a dolgozatnak. Köszönettel tartozom a BME Alkalmazott Biotechnológia és Élelmiszer-tudományi Tanszék és az ELTE Növényélettani Tanszék minden dolgozójának az elmúlt évek során nyújtott segítségéért. Munkatársaim a SOLVO Biotechnológiai Zrt.-ben nagyban segítették dolgozatom befejezését szakmai tanácsaikkal, kritikai észrevételeikkel és a kiegészítő mérések során nyújtott segítségükkel.

Szeretném megköszöni Kropog Erzsébetnek, volt osztályfőnökömnek, az ELTE Radnóti Miklós Gyakorló Gimnázium tanárának, hogy gimnáziumi tanulmányaim befejezése után elindított a biomérnöki pályán.

Végül szeretném megköszönni szüleimnek, páromnak és legjobb barátomnak ezen a téren is kitartó támogatásukat, amellyel végigkísérték és segítették a dolgozat elkészülését.


Nyilatkozat Alulírott Abonyi Tibor kijelentem, hogy ezt a doktori értekezést magam készítettem és abban csak a megadott forrásokat használtam fel. Minden olyan részt, amelyet szó szerint, vagy azonos tartalomban, de átfogalmazva más forrásból átvettem, egyértelmően, a forrás megadásával megjelöltem.

Budapest, 2010. szeptember 12. ....................................................... aláírás


Közlemények Az értekezés témakörében megjelent idegen nyelvű folyóiratcikkek:

1.

Abonyi T., Király I., Tömösközi S., Baticz O., Guóth A., Gergely Sz., Scholz É., Lásztity D., Lásztity R.: Synthesis of gluten-forming polypeptides. 1. Biosynthesis of gliadins and glutenin subunits. J. Agric. Food Chem. 55(9), 3655–3660 (2007).

2.

Lásztity R., Abonyi T.: Predicton of wheat quality- A new strategy is needed (minireview). International Food Reviews 25(2), 126 – 141 (2009).

3.

Abonyi T., Tömösközi S., Budai M., Gergely Sz., Scholz É., Lásztity D., Lásztity R.: Gluten formation from flour of kernels is developing wheat grains. Cereal Research Communication 38(1), pp. 90–100 (2010).

4.

Tömösközi S., Lilla Gy., Pelcéder Á., Abonyi T., Lásztity R.: The effect of flour and protein praparations from amaranth and quinoa seeds on the rheological properties of wheath flour dough and bread crumbs Czech Journal of Food Sciences (In Press).


A sikéralkotó fehérjék bioszintézise és a sikérkomplex reológiai sajátságai

Recommend Documents