APOPTOSIS
Réz Gábor
A programozott sejthalál mint életfolyamat A sejteknek, legyenek bár prokarióták vagy eukarióták, öröklött képességük van arra, hogy belső vagy külső jelek hatására beindítsák a programozott sejthalál folyamatát, vagyis aktívan, szabályozott körülmények között felszámolják magukat mint élő rendszert. A sejtek programozott halálukat nem elszenvedik, hanem sajátos életműködésként hajtják végre. Ennek érdekében – részben meglévő, részben viszont újonnan létrehozott fehérjemolekulákból álló – halálgépezetet képesek létrehozni, mely mechanizmus, ha ténylegesen beindul, vissza nem fordítható folyamatként halad előre egészen a rendszer teljes redukciójáig. Eközben és ennek eredményeként többsejtű szervezetekben biztosítja, hogy ne kapcsolódjon be a saját halódó sejt ellen az idegen sejtek elleni védekező immunreakció, valamint azt, hogy a halódó sejt anyagait a helyére lépő új vagy a túlélő sejtek táplálékként felhasználhassák.
A többsejtű élő szervezetek lehetnek korlátozott, illetve korlátlan növekedésűek. Az utóbbi elsősorban a növények körében fordul elő. Közismert, hogy igen sok évelő faj – például cserjék és fák – egyedei egész életükben növekednek, ami azt jelenti, hogy testi sejtjeiknek száma állandóan növekszik (annak ellenére, hogy fejlődésük során állandó természetes sejtpusztulás is jellemzi őket). Hasonló az eset a vegetatíve korlátlanul szaporodó, illetve szaporítható ún. klonális növényfajok esetében is. Az állatok növekedése azonban többnyire korlátozott, bár a gerincteleneknél (pl. rákok) és a gerinceseknél (pl. halak) is tudunk egész életükben növekvő fajokról. Noha a fajra jellemző testméret és ezzel együtt a testi sejtek száma nem minden egyednél azonos, mégis meghatározott: bizonyos határok között mozog, vagyis a test sejtszáma szabályozódik. Egyes kisméretű gerinctelenek kifejlett példányainak sejtszáma állandó. Például a Caenorhabditis elegans nevű talajlakó fonálféreg kifejlett formája genetikailag meghatározottan 959 testi sejtből áll. Ezen faj egyedfejlődése során összesen 1090 sejt keletkezik. A végleges, alacsonyabb sejtszám úgy alakul ki, hogy az embrionális és a lárvális fejlődési szakaszokban, genetikai program által meghatározott időpontokban összesen 131 sejt elpusztul. Más állatokban, pl. a gerincesekben, a felnőttkori sejtszám nem fajra jellemzően állandó, de az egyedekben a testméret és ezzel együtt a szervek sejtszáma bizonyos határok között mégiscsak szabályozódik,
mégpedig a sejtosztódások és a sejtpusztulások arányától függően. A szabályozott természetes sejthalál tehát alapvető életfolyamat. E tény megerősítését további példáinkból is látni fogjuk. Mint szinte minden alakváltozással járó sejtszintű folyamat tanulmányozása, a sejthalálé is morfológiai módszerekkel kezdődött. A kórszövettan, illetve a sejtkórtan már a 19. században osztályozta a sejtmagok fénymikroszkóppal észlehető olyan elváltozásait,melyek később az aktív sejthalált jellemző változásoknak bizonyultak. Lényegében ebben az időben is megkülönböztették ezeket a kórosnak tartott jeleket a nekrózis (görög; elhalás, pusztulás), vagyis a patológiás sejt- és szövetpusztulás jelenségétől. Mai szóhasználatunk szerint a sejtnekrózis sejten kívüli károsító tényezők (pl. súlyos mérgezés, nagy intenzitású besugárzások, teljes oxigénhiány, illetve sejtlégzésbénulás stb.) akut hatására bekövetkező olyan sejthalál, melyet a sejt nem képes szabályozni. A lényeg általában az, hogy a mitokondriumok sejtlégzési működéseinek közvetlen vagy következményes sérülése miatt az energiakonzerváló ATPmolekulák termelése csökken, ami a sejt és környezete közötti ozmotikus egyensúlyt fenntartó iontranszportokat gátolja. Ezért a sejt az ozmotikus vízfelvétel miatt duzzadni kezd. Tekintve, hogy a plazmamembrán (sejthártya) felülete csak mintegy 3-5 százalékkal nyújtható meg, rövidesen felszakad: a sejt mint integrált élő rendszer megszűnik. A sejtnekrózis – szöveti kiterjedtségétől függően – gyulladásos, tehát védekező reakciót vált ki a szervezetekben. A nekrózis elleni gyulladásos blokád fontossága azonnal érthetővé válik, ha számolunk azzal, hogy például a sejtből kiszabadult intracelluláris molekulák és membrántöredékek ellen az immunrendszer antitesteket termelhet, ami autoimmun-betegségekhez, bizonyos saját sejttípusok folyamatos pusztításához vezethet. A nekrózis fő morfológiai tünetei elektronmikroszkópos szinten: a sejthártya felszakadása, a sejtállomány hígulása (kivilágosodása) és a mitokondriumok duzzadása, membránjaik sérülése. Jóllehet, a patológiás nekrózissal szemben mindig feltételeztek fiziológiás (normális) sejthalált (nekrobiózis) is, ennek első pontos leírása csakis az elektronmikroszkóp csatasorba állításával vált lehetővé. A sejthalál vizsgálatának első tárgyai között magától értetődően ott voltak a rovarok lárvakori szervei, hiszen a 19. század óta köztudott volt, hogy a teljes átalakulással fejlődő rovarok bábjaiban a lárvakori szervek eltűnnek, „felszívódnak”, és új, a kifejlett rovarra (az imágóra) jellemző imaginális szerveik alakulnak ki. Ez a „felszívódás” szabályozott aktív sejthalálnak bizonyult különböző szervek, így például az e szempontból sokat vizsgált lárvális zsírtestek esetében is. A rovarok (és más gerinctelenek) növekedését és fejlődését döntően két hormon: a vedlési hormon (20-hidroxi-ekdiszteron), illetve a juvenilis hormon (farnezol) irányítja, a folyamatok intenzitását kettejüknek a vérnyirokban (hemolimfa) mérhető aránya 2
határozza meg. A növekedési, ill. vedlési ciklusok végén, még az utolsó lárvastádiumban, a vedlési hormon magas szintje váltja ki a bebábozódást és az átalakulást. A lárvális szervek sejtjeinek pusztulása, a sejthalál fázisai szigorú időbeliségben és sorrendben történnek. A fő lépések: lizoszómák (sejten belüli emésztőszervecskék) termelése; a citoplazma fokozatos felszámolása autofágia útján (vagyis az organellumok és az alapállomány bekebelezése a lizoszomális rendszerbe, amit enzimatikus lebontásuk követ); a sejt-sejt kapcsolatok megszűnése; a sejtméret csökkenése, és végül az összezsugorodott sejt felvétele és megemésztése speciális falósejtek (fagociták) által. Lényegében a vedlési hormon indítja be a sejthalál e programját, ezért a jelenségre a leírói a programozott sejthalál kifejezést vezették be. Már a korai kísérletek is igazolták azt, hogy ez a folyamat egy speciális genetikai program alapján történik, hiszen megfelelő időben alkalmazott RNS- vagy fehérjeszintézis-gátlókkal a folyamat leállítható, illetve megelőzhető. Ez azt jelenti, hogy az öngyilkos, helyesebben önfelszámoló folyamat sajátos géntermékek (végső soron fehérjék) megjelenését, szintézisét igényli. Ez utóbbi megfigyelés és néhány más sejtműködés szükségessége azt is jelentette, hogy a programozott sejthalált a sejt nem egyszerűen elszenvedi, hanem aktívan végrehajtja. Az egyedfejlődés során gerincesekben is alapvető jelenség a programozott sejthalál. E helyütt nem csupán a klasszikus példára, a békalárvák (ebihalak) farkának involúciójára (visszafejlődésére) kell gondolnunk, hanem arra is, hogy pl. a végtagfejlődés során a majdani ujjközökből programozottan kipusztul az embrionális kötőszövet (mesenchyma). Ennek a programozott sejtpusztulásnak a hiányában a szöveti differenciáció ujjaink között is eljuthatna a kötőszöveti, porc- vagy csontfejlődésig, és ezért az ujjak nem különülhetnének el. Mind az állatvilágban, mind az embernél ismeretesek ilyen genetikai mutánsok (pl. szündaktília: összenőtt ujjúság). A fejlődési programhoz tartozó aktív sejthalál tehát nélkülözhetetlen az alaki fejlődés (morfogenezis) szempontjából. A programozott sejthalált irányító, szabályozó gének megismerésében alapvető szerepe volt a már említett C. elegans fonálféreg tanulmányozásának. E kutatómunka eredményeiről és az érte 2002-ben kiadott Nobel-díj indoklásáról bőven olvashatnak a cikk végén megadott publikációkban. Meg kell említenünk, hogy az idők folyamán kiderült: a programozott (fejlődési) sejthalál nem minden formájában kap szerepet az autofágia. Ez már átvezet a fiziológiás sejthalál egy másik formájának felfedezéséhez, jellemzéséhez. Bár a látványosan és nagy sebességgel megújuló szövetek (pl. bélhám, többrétegű laphámok, csontvelő) szerkezetét és a megújulás módját régóta ismerték és leírták, továbbá ismeretes volt, hogy az emberi szervezetben naponta 1012 elhaló sejt cserélődik le, a sejthalál mint aktív biológiai folyamat jelentőségét csak az 1990es években ismerték fel igazán széles körökben, és azóta is egyre nő az érdeklődés iránta. 3
A szövetekben haldokló sejtek elektronmikroszkópos morfológiájának vizsgálata elsősorban J. E. Kerr ausztráliai kutató érdeme, aki a jelenséget, minthogy e sejtek citoplazmájának besűrűsödését (az elektronmikroszkópi képen sötétté válását) és térfogatcsökkenését észlelte, zsugorodásos nekrózisnak (1971) nevezte el (1. ábra). Ez ellentétes folyamat a nekrotizáló sejtek hígulásával, duzzadásával. Kutatásait rövidesen Nagy-Britanniában folytatta, ahol A. H. Wyllie és A. C. Currie együttműködésével (1972) kimutatták, hogy a jelenség alapvető biológiai folyamat, többek között a szövetek folyamatos megújulásában. Mindenekelőtt leírták a sejthalál e formáját jellemző morfológiai változásokat. A sejttenyészetekben (in vitro) és a szöveti kötelékben (in vivo) haldokló sejtek citoplazmája, mint említettük, rendszerint kondenzálódik és gyakori, hogy vezikulák nagy csoportjai jelennek meg benne (2. ábra). A legtöbb sejttípus esetében bekövetkezik az a változás, amelynek során a sejt plazmamembránnal határolt kisebb-nagyobb citoplazma bimbókat (angolul: bleb, 2. ábra) ad le. Ezek határoló membránja megakadályozza, hogy a halódó sejten belüli makromolekulák a sejtek közötti térbe jussanak és gyulladásos vagy immunreakciót váltsanak ki. Ebből a jelenségből származik a sejthalál e módjának elnevezése is. A fáma szerint a jelenség leírói – miután szerették volna vizsgálatuk tárgyát határozottan megkülönböztetni a nekrózistól – konzultáltak az egyetem klasszika-filológia professzorával és végül az apoptózis (görög; lombhullatás) kifejezés mellett döntöttek. A levált citoplazmacsomagok speciális membránösszetétele a környező sejtekben fagocitózistvált ki. Az ép sejtek, akár professzionális fagociták (makrofágok), akár az ilyen aktivitással egyébként nem jellemezhető szomszédos szöveti sejtek, felveszik és lizoszomális apparátusukban megemésztik őket. Ugyanez a sorsa a nagyobb, gyakran sejtmagtöredéket is tartalmazó, plazmamembránnal határolt maradvány sejtfragmentumoknak, az ún. apoptotikus testeknek is. Az apoptotikus sejtek magjában a kromoszómák anyaga, a kromatin (DNS+hisztonfehérjék) főképpen erősen festődő, kondenzált formában észlehető, elsősorban a maghártya belső felszíne mentén: a kromatin marginalizálódik (2. ábra). Később kiderült, hogy ezzel párhuzamosan a DNS/kromatin szálak rövidebb szakaszokra hasadnak, más szóval fragmentálódnak. A hasítást specifikus DNS-bontó enzimek, endonukleázok végzik. Ezután bekövetkezik a mag feltagolódása is több, rendszerint továbbra is a maghártyával határolt fragmentumra. Még a mag morfológiai változásai előtt speciális fehérjebontó enzimek, kaszpázok (caspase=cystein-aspartyl proteinase) jelennek meg, aktiválódnak és megkezdik a túléléshez szükséges különböző fehérjemolekulák lebontását.
4
Az apoptózis klasszikus (zsugorodásos) formájára az jellemző, hogy a sejtben újonnan szintetizálódó fehérjemódosító enzimek, úgynevezett „szöveti” transzglutaminázok jelennek meg, melyek a fehérjék glutamin- és lizinoldalláncai között izopeptid kötést hoznak létre. Ezzel a keresztkötéssel többek között a túléléshez szükséges fehérjéket is térhálós polimerbe zárják, működésüket gátolják. A transzglutaminázok jelentőségének felismerésében meghatározó szerepet játszott Fésüs László, a Debreceni Orvostudományi Egyetem tanára. Az említett endonukleázok, kaszpázok és transzglutaminázok olyan megfordíthatatlan változásokat okoznak a sejtben, ami előfeltétele az élő rendszer szabályozott pusztulásának. Az apoptotikus sejthalált, amelyet röviden csak apoptózisnak neveznek, jó néhány évig megkülönböztették a fejlődési sejthaláltól, és sok kutató igyekezett az eredeti programozott sejthalál kifejezést az utóbbi jelenségre korlátozni. A vitát végül is az döntötte el, hogy kiderült: ha egy sejt külső vagy belső késztetésre elkötelezetté vált az apoptózisra, akkor ezt az önfelszámoló aktív életjelenséget olyan genetikai program szerint hajtja végre, amelynek lényegi történései többségükben azonosak a fejlődési sejthaláléval. Sőt! Ebből a szempontból igen figyelemreméltó, hogy mind állati, mind növényi szervezetekben jellemzően előfordul az, hogy egy-egy fejlődési, sejtdifferenciációs program végcélja nem más, mint a programozott sejthalál eredményeképpen kialakult szöveti szerkezetek létrehozása. A magasabb rendű gerinces szervezetekben ilyen differenciációs folyamatban alakul ki például a bőr többrétegű laphámjának elhalt sejtekből felépült szarurétege és egyéb szaruképletei (pikkelyek, szőrök, tollak, körmök, karmok, tülkök). A többrétegű laphámnak az irhához tapadt alulsó (vagy belső) sejtrétege folyamatos osztódásban van. Az utódsejtek közül a felső, nem osztódó rétegbe kerülők indulnak differenciálódásnak, miközben követik őket az új és újabb sejtgenerációk. Amikorra a folyamat végén a felszíni rétegbe kerülnek, szaruanyag halmozódik fel bennük, amivel párhuzamosan lezajlik programozott elhalásuk is. A hajtásos növények vízszállító elemeit, a különböző faelemekket többnyire már csak az élettelen sejtfal alkotja, ugyanis a sejtdifferenciálódás végső aktusaként a szállító-szövetnyalábok farészének sejtjei programozott sejthalál útján kipusztulnak a sejtfaluk által határolt üregből. Az aktív sejthalál többféleségén, mondhatjuk sokféleségén belül tehát a közös jellemző az, hogy hasonló, illetve részben azonos genetikai program szerint történnek. Ezért azután mára az apoptózist és a programozott sejthalált a kutatók többsége szinonimaként használja. A sejthalál apoptotikus, programozott formája nem csupán a szervezet életfolyamatainak velejárójaként, hanem külső káros hatások eredményeképpen is megindulhat. Ezért beszélhetünk természetes (fiziológiás) és kóros (patológiás) programozott sejthalálról is. Az apoptózis tehát széleskörűen előforduló, változatos jelenség, melynek kiváltó okai is különbözőek lehetnek. Ezen okokat sok esetben inkább csak a jelenség szintjén ismerjük, a 5
molekuláris mechanizmusok még nagyrészt felderítésre várnak. Általában elmondhatjuk, hogy a szövet, a szerv vagy a szervrendszer szintjén, de még az elkülönítetten (in vitro) tartott, növesztett sejttenyészetekben is a munkaterhelés az, melynek növekedése, csökkenése, megléte vagy hiánya alapvetően befolyásolja a működő elemek (első közelítésben a sejtek) méreteit és számát, mely utóbbi az apoptózisba lépő, illetve a túlélő sejtek számától függ. A munkaterhelés csökkenése az apoptózisok, míg a munkaterhelés bizonyos határok közötti növekedése a túlélő sejtek számát növeli a sejtpopulációban. Ha például fekvőbetegség, vagy űrutazók esetében a súlytalanság akadályozza a vázizom-rendszer normális terhelését, akkor az izomzat tömege csökken, szélső esetben sorvadás indulhat meg, ami „tornával, edzéssel”, vagyis munkaterheléssel ellensúlyozható. A szövetek, szervek működését serkentő tényezők általában ún. túlélési faktorok is, a sejteken belül a túlélési jelek intenzitását növelik és az esetleges apoptotikus jelek hatékonyságát csökkentik. Ha az izom a mozgató idegsejtek kóros pusztulása miatt egyáltalán nem kap mozgatóingert, azaz munkaterhelést, akkor a vázizomzat sorvadása (disztrófia) indul be: a folyamatok az apoptózis, a sejtpusztulás irányába tolódnak el. A most említett motorneuronbetegség (amiotróp laterális szklerózis) és az általa okozott izomsorvadás mellett további többtucatnyi, úgynevezett sejtvesztéses betegség végső kórokainak és a gyógyítás lehetőségeinek kutatása világszerte folyik, meglehetősen nagy erőkkel. Az apoptóziskutatás egy további fontos, a gyakorlat által motivált területe a programozott sejthalál daganatsejtekre irányított előidézését, serkentését célozza. A tumorokra nézve is igaz, hogy növekedésük mértékét a sejtosztódások és az apoptózisok aránya szabja meg. Igazolódott, hogy a programozott sejthalál széleskörűen ismertté válása előtt már alkalmazott rákellenes gyógyszerek (citoszatikumok) zömének hatásmódja az, hogy bizonyos sejtfunkciók (pl. DNS-szintézis, sejtosztódás) gátlásán keresztül végül is apoptózist váltanak ki. A sejtnek programozott önpusztításra való képességét igen ősi jelenségnek tarthatjuk, hiszen az utóbbi tíz évben bebizonyosodott, hogy a baktériumokban is megtalálhatjuk az eukarióta (sejtmagvas) szervezetekre jellemző egyes sejthalálgének primitívebb változatait, amelyek környezeti változásra, a táplálékhiányra aktivizálódnak. Eukariótákban az apoptózis programjának beindítása történhet sejten belüli és sejten kívüli szabályozómolekulák közvetítésével. Ezeket a szabályozófolyamatokat legrészletesebben a gerinces állatok szervezetében és sejtjeiben ismerjük. A szervezetnek a testi sejtek genetikai mutációi (a szomatikus mutáció) elleni védekezésében két fő lehetősége van. A mutáció során valamely külső mutagén hatásra (pl. besugárzások, kémiai mutagenezis) a DNS sérülése következik be. Ennek eredményeképpen a DNS-lánc a mutáció helyén megszakad, szabad végek jelennek meg. A lánc újraösszekötése a javító folyamatok (reparáció) feladata. A DNS-sérülést speciális 6
szenzormolekulák érzékelik (4. ábra). Ezek a szenzormolekulák – mai ismereteink szerint – proteinkinázok, olyan enzimek, amelyek más fehérjéket foszforilálnak, vagyis ATP felhasználása mellett foszfátészterkötéseket hoznak létre célfehérjéjük hidroxil-csoportjain. Az így kialakult foszfoprotein-molekulák ettől a változástól vagy aktiválódnak, vagy inaktiválódnak. Az említett szenzorproteinkinázok indítják be a javítási folyamatokat, valamint kezdeményezik a sejt osztódási/növekedési ciklusának ideiglenes leállítását. A reparáció bizonyos esetekben nem lehetséges. Ilyenkor a sejtciklus leállítása véglegessé válik: a sejt többé nem osztódhat, nem küldheti tovább utódaiba a sérült DNS-t. A szenzorprotein- kinázok a ciklus leállítását egy 53 kilodalton molekulatömegű sejtmagfehérje, a P53 foszforilálásán keresztül érik el. Ha ezen a molekulán minden ebből a szempontból jelentős foszforilációs helyhez foszfát kötődik, akkor a P53 elengedi eleddig hozzá kötődő gátlófehérjéjét (egérbenMDM 2, emberbenHDM 2), tetramerizálódik, és meghatározott célgének speciális transzkripciós faktoraihoz (STF-hoz) kötődve beindítja a gén átírását, vagyis a hírvivő (messenger) RNS szintézisét (4. ábra). A folyamat végén a speciális mRNS-molekulák által hozott információ alapján sejtszámnövekedést (proliferációt) gátló, valamint programozott sejthalált előidéző proapoptotikus fehérjék szintetizálódnak a citoplazmában. Ez a mutációk elleni védővonal, melynek a P53 a központi szabályozómolekulája, egyben a sejtek rosszindulatú átalakulása (malignus transzformációja), vagyis a daganatképződés elleni védővonal szerepét is betölti, hiszen a rákos daganat meghatározott mutációt szenvedett géneket (ún. aktivált onkogéneket) hordozó sejt utódaiból alakul ki. Ezért nevezik a P53-fehérje génjét, a TP53-at tumorszupresszor génnek. Az e szempontból legintenzívebben tanulmányozott emlősök szervezetében léteznek olyan sejten kívüli molekulák (ligandumok), amelyek a plazmamembránban található sejtfelszíni receptoraikhoz kötődve, utóbbiak közvetítésével beindíthatják a programozott sejthalált, az úgynevezett 1. típusú apoptózist. A történet csírájában még a 19. században indult, amikor megfigyelték, hogy bizonyos, rendszerint magas lázzal is járó fertőzőbetegségeken áteső betegek daganatai „nekrotizálnak” és visszahúzódnak. Ezt a jelenséget művi fertőzés előidézésével meg is kísérelték felhasználni mint daganatellenes terápiát. Mivel azonban az idő tájt az antibiotikumokat még nem ismerték, a fertőzés kimenetelét nem lehetett konrollálni, gyakran a fertőző betegség vált fatálissá a beteg számára. A „tumornekrózist” kiváltó tényező kutatása azonban nem szünetelt, és baktériumkivonatok (pl. az ún. Coley-toxin), valamint a legyengített fertőzőképességű baktériumtörzsek (pl. a BCG = Bacille Calmette–Guérin, amit végső fokon általános antibakteriális immunizálásra is felhasználtak, illetve alkalmaznak) hatásmódját vizsgálva bakteriális sejtfalból elkülönítettek egy lipopoliszacharidot (LPS), amely állatnak beadva tumornekrózist okozott, sejtenyészethez adva azonban hatástalannak bizonyult. Kiderült, 7
hogy a lipopoliszacharid egyes sejttípusokat (pl. makrofágokat) aktiválva egy, a citokinek szupercsaládjába tartozó, sejthalált is okozni képes szabályozómolekula termelését váltja ki. Ezt a fehérjemolekulát izolálása és jellemzése után tumornekrózisfaktor-alfának (TNFα) nevezték el. Hatására azok a sejtek válaszolnak, melyeknek plazmamembránjában sejtfelszíni TNFreceptormolekulák (TNFR–1) vannak, melyeknek specifikus liganduma (megkötendő molekulája) a TNFα. A TNF receptorcsalád több mint húsz tagot számlál, és majdnem ugyanennyi hozzájuk tartozó ligandumot ismerünk. Utóbbiakra általánosan jellemző, hogy eredetileg az őket termelő sejt plazmamembránjának sejtfelszíni fehérjéi, melyeket specifikus fehérjebontó enzimek hasítanak le a molekula membránba merülő részéről. A TNFR család tagjai között jelenleg hét olyan receptort ismerünk, melyek a ligandumuk által átadott halálszignál plazmamembránon történő átvezetésére képesek. Ezek a halálreceptorok, ligandumaik pedig a halálligandumok (5. ábra). A tipikus halálreceptor plazmamembránon áthúzódó transzmembránfehérje, melynek sejten kívüli és belüli doménjei (domain: „tartomány”) is vannak. Az intracelluláris domének között jelen van egy speciális haláldomén (death domain: DD), mellyel a halálszignál sejten belüli továbbvezetését végző fehérjék haláldoménjeihez kötődhetnek. A ligandum kötődése után a haláldomének közvetítésével ilyen adaptorfehérjék (5., 7. ábra) toborzódnak és kötődnek a receptor körül kialakuló apoptózist kezdeményező jelkomplexbe (death initiation signal complex: DISC), mely azután az apoptotikus folyamatot beindító enzimet köt meg és aktivál. Ilyenek az iniciátorkaszpázok (kaszpáz–2, –8, –9, –10), bizonyos stresszaktiválta proteinkinázok és speciális lipidbontó szfingomielinázok. A komplexbe kötött prokaszpázok a már említett módon autoaktiválódnak és a végrehajtó (effektor-) kaszpázok proteolitikus aktiválásával a folyamatot visszafordíthatatlanná teszik. Léteznek azonban receptor, illetve jelkomplex- és effektoraktivitást gátló fehérjék is, melyek támadáspontját igen, működésük szabályozását azonban még nem ismerjük kielégítően. Mindenesetre világossá vált az, hogy a halálligandum megkötődése receptorán nem vezet kényszerpályán az apoptózishoz, hanem a sejt erre adott válaszai a hatást módosíthatják és a sejt ilyen esetben is túlélhet. A sejten kívüli halálligandumok által hozott halálszignálokon kívül számos más eredetű jelátviteli útvonalat ismertünk meg az utóbbi két-három évben. Már tíz évvel ezelőtt is voltak olyan megfigyelések, amelyek azt sugallták, hogy a sejtlégzés energiakonzerváló (ATPszintetizáló) szervecskéjének, a mitokondriumnak szerepe lehet vagy van a programozott sejthalál beindításában, és ez nem a sérült mitokondrium ATP-termelésének csökkenésével vagy megszűnésével kapcsolatos, miként azt a nekrózis esetében tapasztaltuk. Ezt a véleményt megerősítette egy antiapoptotikus mitokondriális fehérje (BCL–2) és családjának felfedezése. Ennek a famíliának legalább 17 tagja ismeretes. Közülük 9 antiapoptotikus, 8 pedig 8
proapoptotikus szerepet játszik különböző haláljelátviteli folyamatokban. Az apotózist gátló antiapoptotikus fehérjék képesek megkötni a proapoptotikus fehérjéket, és velük heterodimereket alkotni. A család tagjainak többsége a mitokondriumok külső membránjának, a maghártya külső membránjának, valamint az endoplazmatikus hálózat membránjának citoplazma-alapállomány felőli lemezében található membránfehérje. Ezek adott jelre többnyire képesek elhagyni a membránt, és a citoplazma-alapállományban csatlakozni más fehérjékhez, azaz komplexet alkotni. Néhány családtag viszont inaktív állapotában a citoplazma alapállományában mutatható ki, ahonnan csak külön hatásra (jelre) reagálva képes bekötődni, rendszerint a mitokondrium külső membránjába. A mitokodriumok tartalmaznak e családon kívüli apoptotikus fehérjéket is, mint például az egyébként a légzési elektrontranszportlánc tagjaként ismert citokróm–C-t. Az egyes adott halál- és túlélési szignálok különböző citoplazmatikus, vagy membránban található pro- és antiapoptotikus fehérjéket aktiválnak, és végső fokon ezek membránba kötődésén, vagy mitokondriumba kerülésén keresztül születik meg egy mitochondriális szintű döntés a halálról vagy a túlélésről. Ezért szokás a mitokondriumot az apoptotikus jelek integrátorának nevezni. Az apoptózis ezen mitokondriális útja, az úgynevezett 2. típusú apoptózis akkor következik be, ha a proapoptotikus hatások összegződése a mitokondrium membránjainak permeabilitásnövekedéséhez vezet, és ezáltal a mitokondriális proapoptotikus molekulák kiszabadulnak a citoplazma alapállományába. A membránok áteresztőképessége növekedhet az ún. átmeneti permeabilitási póruskomplex (permeability transitory pore complex, PCPT) megnyílása révén, de feltételezések szerint más módon is. A mitokondriumban integrálódó proapoptotikus jelek egy részét, leegyszerűsítve a 6. ábrán mutatjuk be. A proapoptotikus molekulák közül sajátos szerepe van a citokróm–C-nek (7. ábra). Ezt a molekulát évtizedekkel ezelőtt ismertük meg, mint a mitokondriális sejtlégzés elektronszállító láncának mozgékony (nem membránfehérje-komplexhez kötött) tagját. Molekulái a belső membránból alakuló mitochondriális válaszfalak (kriszták) által határolt interkrisztális térben, valamint a külső és belső membrán által határolt külső kamrában találhatóak. A két molekulapopuláció elektronszállító szerepében különbség van. A külső kamrai citokróm–C apoptotikus jelre történő kiáramlása ezért nem befolyásolja a krisztamembrán oxidatív folyamatait és a hozzá kapcsolt protontranszportot, vagyis a belső membrán energizáltságát. Mint azt már említettük, az apoptotikus automatizmus beindításának legfontosabb mozzanata a kaszpázok, és ezen belül is az iniciátorkaszpázok (2. 8. 9. 10.) aktiválása. A citoplazmaalapállományba jutott citokróm–C a prokaszpáz–9 aktiválásában vesz részt, mely azután egy végrehajtó (effektor-) kaszpázt, ismereteink szerint a kaszpáz–3-at aktiválja. Ugyanezt a kaszpázt 9
a halálreceptorok által toborzott halálfehérjekomplexről, a jelkomplexről induló jel által aktivált kaszpáz-8 is képes aktiválni (7. ábra). Adott esetben ez a két jelátviteli útvonal egymást erősítheti (szinergizmus). A citoplazmamátrixban a citokróm–C az úgynevezett apoptózisaktiváló faktorhoz (APAF-1) kötődik, melynek aktiválásához még, sajátos módon, dezoxi-ATP (ennek molekulájában ribóz helyett dezoxiribóz van) kötődése is szükséges. Az aktivált apoptózisaktiváló faktor megköti és aktiválja a prokaszpáz–9-et. Ezt a komplexet apoptoszómának nevezik. Működését antiapoptotikus hatású fehérjék képesek gátolni. A 2. típusú apoptózis jelentős tényezője a mitokondriális kalcium-anyagcsere is. A mitokondrium jelentős kalciumion-raktár, melybe több különböző ionpumpa működésével történik a kalcium és más kétértékű kationok felvétele. Ha erőteljes külső hatásokra túlzottan megemelkedik benne a kalciumszint, akkor az a permeabilitási pórus megnyílásához és a Caionok kiáramlásához vezet. Krónikus esetben megindulhat a citokróm-C kiáramlása is, ami beindíthatja az apoptózist. Az aktív sejthalál tehát igen bonyolult, soktényezős folyamat, melynek módjait, molekuláris mechanizmusait, a sejten kívüli és belső tényezők által beindított jelátvivői folyamatait gyakorlatilag sejttípusonként részleteiben kell vizsgálni. A sejttípusok igen nagy száma miatt azonban ezek az eredmények már nem mutathatók be hatékonyan a nem molekuláris sejtbiológiai érdeklődésű olvasóknak. Aki viszont részletesebben is szeretne megismerkedni ezzel a fontos és érdekfeszítő tudományterülettel, annak szívből ajánlhatom az e témában a közelmúltban megjelent magyar nyelvű szakkönyvet is. Irodalom Kopper, L. – Fésüs, L. (2002) Apoptózis. Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest, pp 1–474.
10
1.
ábra.
Apoptotikus
szövettenyészeti
sejt
pásztázó
elektronmikroszkópi
képe.
Megfigyelhető, hogy az egyébként amőboid formájú fehérvérsejt ovális formát öltött. A tojásalakzat nagykiterjedésű simább és vastagabb felszíne a sejt belsejében erre a pólusra húzódott sejtmagot takarja, míg a másik , vékonyabb végen egy simafelszínű bimbó (bleb) képződik
11
2. ábra. Apoptotikus hasnyálmirigy-sejt metszetének átnézeti elektronmikroszkópos képe. Az apoptózist a mikrotubuláris sejtváz elleni alkaloidakezeléssel indukáltuk. A sejtmagban (SM) megfigyelhető az erősen kontrasztos (fekete színben megjelenő) kromatin szélekre húzódása, valamint a magvacska maradványa. A citoplazmában számos autofág vakuóla (*) észlelhető, többségükben az endoplazmatikus retikulum (ER) struktúrái emésztődnek. Ennek következtében az endoplazmatikus hálózat erősen redukálódott. Az úgynevezett apoptotikus vezikulák (A) valószínűleg a dezintegrálódott Golgi-komplex maradványai, a sejthalálban játszott esetleges szerepük nem ismert kielégítően. A kerek, sötét struktúrák váladékszemcsék.
12
3. ábra. Egymás melletti normális és apoptotikus hasnyálmirigysejtek metszetének elektronmikroszkópos képe. A citoplazma ennek a sejthaláltípusnak az esetében nem besötétedik, inkább kivilágosodik a normális sejthez képest. Jelölések mint a 2. ábrán. A mitokondriumok (M) szerkezeti integritása megmaradt, a normálishoz képest besötétedtek. Ez mutatja, hogy nem duzzadtak. A szomszédos normális szerkezetű sejtben látható, két membránnal határolt nagyméretű test (B) az apoptotikus sejtről levált, a normális sejt által már fagocitózissal felvett bimbó (bleb).
13
4. ábra. A P53 fehérje hatásmódja és szabályozása
14
5. ábra. A halálreceptorok jelátviteli útvonalainak sémás ábrázolása
15
6. ábra. A mitokondriumokat megcélzó proapoptotikus jelek 1. Besugárzások és egyéb stresszhatások aktiválhatják a stressz aktiválta proteinkinázt (SAPK), ami egy antiapoptotikus fehérje (BCL–XL) inaktiválásán keresztül végülis proapoptotikus hatásokhoz vezethet. Hasonló a hatásmódjuk más jelátviteli útvonalak proteinkinázainak is. 2. A DNS-sérülés hatására aktiválódó P53 fehérje bejut a mitokondriumba és növeli a membrán áteresztőképességét. Ez a P53 úgynevezett közvetett apoptotikus hatása. 3. A kaszpáz-8 két, a BCL–2 családba tartozó proapoptotikus fehérje (BID és BAX) közvetítésével növeli a membránok permeabilitását. A stimulusra megnyílik az átmeneti permeabilitási póruskomplex (PTPC). 4. A mikrotubuláris sejtváz sérülésekor (mikrotubulus-depolimerizáció) egy proapoptotikus fehérje (BIM) szabadul fel a mikrotubulusokról, mely antiapoptotikus fehérjét inaktivál. 5-Egy proapoptotikus fehérje (BAX) aktiválódik alkilálás, dimerizáció, vagy a szfingomielinázenzim egyik termékének, a ceramidnak a hatására, majd a membránhoz kötődve kiváltja a permeabilitási póruskomplex megnyílását, és megkezdődik a proapoptotikus fehérjék, köztük a citokróm–C kiáramlása. 6. Az antiapoptotikus jelek többnyire proteinkinázok hatásán keresztül gátolják egy proapoptotikus fehérje (BAD) antiapoptotikus fehérjét (BCL-XL) inaktiváló hatását. Adott esetben az ilyen hatások aránya, hatékonysága olyan lehet, hogy kivédi a proapoptotikus hatásokat: a sejt túlél.
16
7. ábra. A citokróm–C szerepe az apoptózis beindításában. A citokróm-C leggyakrabban a dimerizált BAX proapoptotikus fehérjének a mitokondrium külső membránhoz csatlakozása, vagy túlzott belső Ca-ionkoncentráció következtében megnyíló átmeneti permeabilitási póruskomplexen keresztül szabadul fel. Kötődik a dezoxi-ATP-t megkötött apoptózisaktiváló faktorhoz (APAF–1), melyhez ezután csatlakozik az iniciátor prokaszpáz–9. Ha ez utóbbit nem inaktiválja egy antiapoptotikus fehérje (XIAP) mivelhogy őt magát gátolja egy, a mitokondriumból kiszabaduló proapoptotikus fehérje (DIABLO), akkor megtörténik a végrehajtó kaszpáz–3 proteolitikus aktiválása, ami a sejthalál gépezetét beindítja. A kaszpáz–3-at aktiválhatja a kaszpáz–8 is, melyet viszont valamely halálreceptor halálfehérjekomplexe (DISC) aktivált. A mitokondriális és a halálreceptor-hatás tehát összeadódhat.
17
