Egyetemi Doktori (Ph.D.) Értekezés
A NADPH-oxidáz szerepe neutrofil granulociták kalciumanyagcseréjében és baktériumölésében Rada Balázs
Témavezető: Dr. Ligeti Erzsébet
Semmelweis Egyetem, Élettani Intézet Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola Celluláris és Molekuláris Élettan Program Budapest, 2004 Szigorlati bizottság: Dr. Faragó Anna (elnök), Dr. Molnár Miklós és Dr. Szalay Katalin Hivatalos bírálók: Dr. Kőhidai László és Dr. Sipka Sándor
Tartalomjegyzék TARTALOMJEGYZÉK ...........................................................................................................................1 ÖSSZEFOGLALÓ .....................................................................................................................................2 ABSTRACT ................................................................................................................................................3 RÖVIDÍTÉSJEGYZÉK.............................................................................................................................4 IRODALMI HÁTTÉR...............................................................................................................................6 BEVEZETÉS ...............................................................................................................................................6 A FAGOCITA NADPH-OXIDÁZ .................................................................................................................8 KRÓNIKUS GRANULOMATÓZIS (CGD)....................................................................................................12 A FAGOSZÓMÁLIS KÖRNYEZET ÉS A BAKTÉRIUMÖLÉS MECHANIZMUSA .................................................14 GRANULOCITÁK KALCIUMFORGALMA ....................................................................................................22 CÉLKITŰZÉSEK ....................................................................................................................................25 MÓDSZEREK ..........................................................................................................................................26 EREDMÉNYEK.......................................................................................................................................31 A NADPH-OXIDÁZ SZEREPE A KAPACITATÍV CA2+-INFLUX SZABÁLYOZÁSÁBAN ..................................31 PLB-985 sejtek aktiválódásának jellemzése......................................................................................31 PLB- sejtek kapacitatív influxának vizsgálata Ca2+-mentes közegben..............................................34 PLB-985 sejtek kapacitatív influxának vizsgálata Mn2+-kioltással...................................................36 PLB-985 sejtek fMLP-indukálta Ca2+-szignáljai ..............................................................................38 A NADPH-oxidáz hatása a kalciumszignálra ...................................................................................39 A depolarizáció és nem a szuperoxid hat a kalciumszignálra..........................................................41 FAGOCITÁK PATOGÉNÖLŐ-KÉPESSÉGÉNEK MÉRÉSÉRE HASZNÁLT TESZTEK ...........................................44 Az új módszer háttere........................................................................................................................45 Az új módszer leírása ........................................................................................................................47 Az új módszer megbízhatóságát vizsgáló kisérletek..........................................................................48 Az új módszer összehasonlítása a higításos-szélesztéses módszerrel................................................48 A NADPH-OXIDÁZ KETTŐS SZEREPE A BAKTÉRIUMÖLÉSBEN ................................................................50 Az oxidázfunkciók DPI-függése ........................................................................................................50 DPI hatása neutrofilek PMA-indukálta K+-leadására......................................................................53 Szabadgyök-termelés baktériumölés alatt.........................................................................................54 A fagoszómamembrán potenciálváltozásaira vonatkozó meggondolások ........................................57 Humán neutrofilek baktériumölésének DPI-függése.........................................................................58 Cink hatása neutrofilek S. aureus-ölésére ........................................................................................61 MEGBESZÉLÉS ......................................................................................................................................64 KÖVETKEZTETÉSEK...........................................................................................................................69 IRODALOMJEGYZÉK ..........................................................................................................................73 KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS..................................................................................................................87 SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE................................................................................................88
1
A NADPH-oxidáz szerepe neutrofil granulociták Ca2+-anyagcseréjében és baktériumölésében Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola, Celluláris és Molekuláris Élettan Program Semmelweis Egyetem, Élettani Intézet, Budapest, 2004. Témavezető: Dr. Ligeti Erzsébet Rada Balázs
Összefoglaló A szervezet immunrendszerének fontos tagjai a neutrofil granulociták, melyek elsőként érkeznek a fertőzés helyére és vesznek részt a behatoló mikroorganizmusok elpusztításában. A folyamat kulcsfontosságú enzime a NADPH-oxidáz, mely a reaktív gyökök előanyagát, szuperoxid-anionokat termel. Az enzim elektrontranszportja miatt a membrán depolarizálódik, módosítva ezzel az ionokra ható elektromos grádienst. Értekezésemben a NADPH-oxidáz működését kisérő depolarizáció funkcionális következményeit tanulmányoztam. A membrándepolarizáció és a kalciumháztartás összefüggésének vizsgálatához modellként differenciáltatott, neutrofil granulocita-szerű mieloid sejteket használtam. Megállapítottam, hogy a vad típusú sejtek nagy mennyiségű szuperoxidot termelnek, membránjuk jelentős mértékben depolarizálódik és a kalciumbeáramlás gátlódik. Ezen jelenségek egyike sem figyelhető meg az oxidázhiányos, illetve működésképtelen oxidázt kifejező sejteken. A membrándepolarizáció és a kalciumbeáramlás gátlása újból megjelenik a működőképes oxidázzal visszatranszfektált sejtekben. A kemotaktikus peptiddel indukált kalciumszignál magasabb az oxidázhiányos modellsejtekben, illetve oxidázgátlószerrel (DPI) kezelt neutrofilekben, mint a vad típusú illetve kezeletlen sejtekben. Kisérleteinkben egyértelmű összefüggést kaptunk a NADPH-oxidáz indukálta depolarizáció és a sejtek kapacitatív kalciumbeáramlásának gátlása között. A baktériumölés klasszikus modellje szerint az oxidáz-termelte szabadgyökök felelősek a patogének lebontásáért. Újabb tanulmányok szerint azonban az oxidázkiváltotta depolarizáció káliumionokat hajt a fagoszómába, amelyek felszabadítják az addig inaktív proteázokat és azok fogják megtámadni a betolakodókat. Az oxidáz kiváltotta O2.--termelés illetve depolarizáció szerepének megértéséhez neutrofilek baktériumölését mértük különböző DPI-koncentrációk jelenlétében egy általunk beállított, ellenőrzött, félig-automatizált, validált, új módszerrel, 96-lyukú lemezen. A stimulált neutrofilek K+-leadása lineárisan, míg szabadgyök-termelése nem lineárisan függ a depolarizációtól. Alacsony gátlószer-koncentrációk esetén a O2.--termelés már csak 10-20 %-a, a depolarizáció viszont még 80 %-a a gátolatlan értéknek. Ekkor Staphylococcus aureus baktériumok ölése jelentősen károsodott, ami a szabadgyökök baktériumölésben betöltött, fontos szerepét jelzi. A legmagasabb gátlószerkoncentrációt elérve a O2.--termelés már csak néhány %-ot csökken, a depolarizáció viszont az eredeti felére süllyed. Staphylococcus aureus baktériumok ölése ezen a szakaszon is jelentősen károsodott, ami ezzel a membrándepolarizáció baktériumlésben játszott, jelentőségét hangsúlyozza. A protoncsatorna gátlószer, cink növeli és gyorsítja a membrándepolarizációt, csökkenti a szuperoxidtermelést; a baktériumölést ugyanakkor nem változtatja. A NADPH-oxidáz működését kisérő szabadgyöktermelés és membrándepolarizáció tehát egyaránt fontosak a bekebelezett mikróbák sikeres megölésében.
2
Role of the NADPH oxidase in calcium metabolism and bacterial killing of human neutrophils Molecular Medical Sciences Ph.D. School, Cellular and Molecular Physiology Program Semmelweis University, Department of Physiology, Budapest, 2004 Supervisor: Dr. Erzsébet Ligeti Balázs Rada
Abstract Important members of the body’s immune system are the neutrophilic granulocytes which arrive first at the sites of infection and participate in the destruction of invading microorganisms. An essential enzyme of this process is the NADPH oxidase which produces superoxide anions, the proforms of reactive oxygen radicals. The electron transport of the enzyme causes the membrane to depolarize, thereby altering the electric force for ions. During activation of the cells the membrane depolarization inhibits the calcium influx through the capacitative channels. In differentiated wild-type granulocyte-like cells a high level of superoxide production was associated with significant membrane depolarization and an inhibition of capacitative Ca2+ entry. These changes were not observed in cells lacking the oxidase or transfected with a non-functional mutant of the enzyme. Membrane depolarization and inhibition of the capacitative calcium influx reappeared in cells retransfected with a wild-type oxidase. The chemotactic peptide induced calcium signal was higher in model cells lacking the oxidase or in neutrophils treated with the oxidase inhibitor (DPI) as in the wild-type or untreated cells. Our experiments showed a clear correlation between the membrane depolarization induced by the NADPH oxidase and the inhibition of the capacitative calcium entry. According to the classical model of bacterial killing, the reactive oxygen species produced by the oxidase are responsible for the destruction of pathogens. Novel studies, however, say that the membrane depolarization induced by the NADPH oxidase drives K+ ions into the phagosome which release the inactive proteases and those attack the invaders. To understand the role of the oxidase induced superoxide production and depolarization deeper, we measured the effect of DPI on the killing of bacteria by neutrophils using a new, controlled, validated, semi-automated method developed by us for 96-well plates. The correlation between K+-release and membrane potential was linear, whereas that between the latter and superoxide production turned out to be nonlinear. At lower concentrations of DPI the superoxide production was only 10-20 %, but the extent of depolarization still 80% of the uninhibited. Under these conditions killing of Staphylococcus aureus impaired seriously which points to the important role of reactive oxygen species in the killing of bacteria. Reaching the highest concentration of DPI, superoxide production decreased only by some percent, but membrane depolarization was reduced to 50% of the uninhibited. The killing of S. aureus in this range was impaired significantly, as well, pointing to the relevant function of membrane potential changes in the process of bacterial killing. The proton channel inhibitor zinc increased and accelerated the depolarization, reduced the superoxide production, but the killing of bacteria remained unchanged. Thus, both the superoxide production and membrane depolarization accompanying the activation of the NADPH oxidase are important in the digestion of phagocytosed microbes.
3
Rövidítésjegyzék [ ]ic, ec, f ∆Ψ
sejten belüli, sejten kívüli, fagoszómális koncentrációk membránpotenciál-változás
A ARF ATP Ca2+ CB Cd2+ CGD CFU CIF CR DHP DiOC5(3) DMSO DPI E. coli EGTA ELISA FAD FCS fMLP FPR gp91phox H+ H2O2 HOCl IFN-γ IgG IL-6 IL-8 LAD LB M Mn2+ MP MPO mV n NADPH-oxidáz NBT
abszorbancia ADP-ribozilációs faktor adenozin-trifoszfát kalciumion citochalasin-B kadmiumion krónikus granulomatózis kolóniaképző egység kalcium influx faktor komplement-receptor dihidropiridin dipentiloxakarbocianin dimetil-szulfoxid difenil-iodónium, NADPH-oxidáz gátlószer Escherichia coli etilén-glikol-tetraacetát enzim-kapcsolt immunkötési esszé flavin-adenin-dinukleotid magzati borjúszérum formil-metil-leucil-fenilalanin formil-peptid receptor A fagocita oxidáz 91 kD molekulatömegű glikoproteinje hidorgénion hidrogén-peroxid hipoklórossav interferon-gamma immunglobulin G interleukin-6 interleukin-8, kemoattraktáns leukocita adhéziós hiánybetegség Luria-Bertani médium moláris koncentráció, mol/liter mangánion membránpotenciál mieloperoxidáz millivolt kisérleti elemszám nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát-oxidáz Nitroblue tetrazolium
4
NO O2.OD PAF PCR PKC PMA PMCA PMN Rb+ RLU ROS S. aureus S.E.M. SERCA SOD TG tinc TPP Trp WKYMVM Zn2+
nitrogén-monoxid szuperoxid-anion optikai denzitás vérlemezke aktiváló faktor polimeráz láncreakció protein-kináz C forbol-mirisztát-acetát, PKC aktivátor plazmamembrán kalciumpumpája polimorfonukleáris neutrofil rubídiumion viszonylagos lumineszcens egység reaktív oxigéngyökök Staphylococcus aureus átlagok szórása (standard error mean) szarko-/endoplazmatikus retikulum kalciumpumpája szuperoxid-diszmutáz thapsigargin, SERCA-gátlószer inkubációs időtartam tetrafenil-foszfónium átmeneti receptor potenciál hexapeptid: triptofán-lizin-tirozin-metionin-valin-metionin cinkion
5
Irodalmi háttér Bevezetés A neutrofil granulociták az emberi szervezet veleszületett immunrendszerének fontos tagjai. Nélkülözhetetlenek a bakteriális és gombás fertőzések leküzdésében. A csontvelőből kikerült, érett, szegmentált magvú falósejtek a véráramba kerülve a szervezet legtöbb helyére eljutnak. Átlagos tartózkodási idejük a keringésben 10-12 óra. A fertőzés helyének közelében az aktivált endotélsejtekhez L-szelektin molekuláikkal lazán kötődnek és továbbgördülve haladnak tovább (’rolling’) (1. ábra).
6
További aktiválódásuk folyamán felszíni integrinjeik közvetítésével kitapadnak az endotélsejtekhez, majd két hámsejt között átbújva hagyják el az érpályát (transzmigráció).
A gyulladásos endotélsejtek felszíni molekuláinak eloszlása
drasztikusan megváltozik, ami elősegíti a fehérvérsejt kijutását (93). Az interstíciumban aktív helyváltoztató mozgással haladnak a kórokozók irányába. Kemotaxisukat a fertőző ágensek egyes anyagcseretermékei (pl. formil-peptidek), komplementtermékek (C3a) illetve a már a helyszínen tartózkodó társaik jelzőmolekulái (pl. IL-8) irányítják. Ezen kemotaktikus vegyületek megkötésére a fagociták specifikus receptorral rendelkeznek (75). A fertőzés helyszínén fagocitálják a baktériumokat, majd megkezdik sejten belüli lebontásukat. A baktériumokat a neutrofil granulociták megköthetik lektin-receptoraik révén, amelyek a bakteriális sejtfal bizonyos cukoralkotórészeihez kötődnek, de a fagocitózis nagyságrendekkel meggyorsul, ha a baktériumokat immunglobulinok vagy komplementfragmentumok opszonizálják, és ekkor neutrofilekben FcγR- illetve C3Rokon keresztül indul be a fagocitózis. Folyamata során a sejtmembrán kétoldalról, szorosan ráfűződik a bekebelezendő mikróbára, annak kontúrját követve, majd a membránfúzió után a baktérium a fagoszóma külvilágtól elzárt terébe kerül (24). Ezek után a citoszkeleton és kalciumjel közvetítésével a neutrofilek granulumai fúzionálnak a fagoszómával, amely során emésztőenzimek sora ömlik az elpusztítandó mikróbára. A gyulladásos folyamat során a granulociták apoptotizálnak, majd makrofágok kebelezik be őket. A fagocitasejtek nélkülözhetetlenségét jelzi számos megbetegedés, melyekben a fenti funkciók valamelyikének genetikai hibája miatt a kórokozók elpusztításának mértéke csökken és a szervezetet súlyos fertőzések érik. Egyes sejtfelszíni molekulák örökletes meghibásodásakor alakul ki a leukocita adhéziós hiánybetegség (LAD), melyben a fehérvérsejtek kitapadása és fagocitózisa károsodik (28). Az egyik markáns, antibakteriális enzim, a NADPH-oxidáz hiányakor alakul ki a krónikus granulomatózis, melyet gyerekkorban visszatérő bakteriális és gombás fertőzések jellemeznek (107).
7
A fagocita NADPH-oxidáz A monocitákban / makrofágokban, eozinofil és neutrofil granulocitákban kifejeződő fagocita NADPH-oxidáz egy ötalegységes enzimkomplex (2. ábra). A sejt nyugalmi állapotában három alegység a citoplazmában helyezkedik el: p40 phox, p47phox és p67phox (a phox jelölés a 'fagocita oxidáz' angol nevéből származik: 'phagocyte oxidase'). Két további alegysége (a glikoprotein gp91phox és a p22phox) a specifikus granulumok, a szekretoros vezikulák membránjában és a plazmamembránban helyezkedik el, ahol heterodimert alkotva képezik a flavohemprotein, citokróm-b558-at. Az enzim aktiválódásakor a citoszólikus alegységek foszforilálódnak és áthelyeződnek a membránalegységekhez, illetve az addig RhoGDI-hez kötött Rac kis G-fehérje GTP-t köt és szintén kapcsolódik a komplexhez (54).
2. ábra A fagocita oxidáz szerkezete nyugalmi és aktivált állapotban Az enzimkomplex NADPH-t köt, amely NADP+-re, 2 elektronra és egy protonra disszociál (3. ábra). Az oxidált NADP+ újból NADPH-vá alakul a sejtben, nagyobbrészt a pentóz-foszfát út során (12), kisebbrészt két citoszólikus enzim (malát- és izocitrát-
8
dehidrogenáz) segítségével, mitokondriumokból származó szerves savak oxidációja, illetve NADH mitokondriumbeli transzhidrogénezése révén. Az elektronokat az oxidáz membránhoz kötött kétalegységes fehérjéje (citokróm b558) köti meg, mely 3 koenzimmel is rendelkezik. Eme rövid elektrontranszportlánc első tagjaként az elektronok FAD-ra kerülnek, onnan pedig két, egymást követő hemcsoportra. A legvégső elektronakceptor az oxigénmolekula, amiből így szuperoxidanion keletkezik. Az elektrontranszport következtében egy elektron (azaz egy negatív töltés) a membrán belső oldaláról a külső (extracelluláris ill. intrafagoszómális) oldalára kerül át, ami a membrán depolarizációját okozza (113). A keletkezett O2.--ion enyhe oxidáló- ill. redukálószer, kis biológiai hatással bír (104). Vastartalmú fehérjék redukálásával hidroxilgyök képződését teszi lehetővé; vas/kén-fehérjék inaktiválásában szerepel. Csak korlátozott mértékben membránpermeábilis. Szuperoxidanionokból nitrogén-monoxid felhasználásával peroxinitrit képződhet (4. ábra), amely nagyon rövid életű, instabil, erős oxidálószer. Aromás vegyületekkel és tiolokkal könnyen reagál. A NO és peroxinitrit jelentős szerepet töltenek be makrofágok ölési mechanizmusaiban rágcsálókban, de humán neutrofilekben játszott szerepük minimális.
3. ábra A fagocita NADPH-oxidáz által katalizált reakció A szuperoxidanionok nagy része hidrogén-peroxiddá alakul a szuperoxid-diszmutáz segítségével. A H2O2 membránpermeábilis oxidálószer, amely lassan reagál tiolokkal, redukált vas- és rézsókkal.
9
4. ábra Reaktív gyökök keletkezésének machanizmusa granulociták fagoszómájában (Készült a következő hivatkozási számmal rendelkező cikkek alapján: 47, 104, 107)
A O2.- és H2O2 baktériumölésben betöltött közvetlen szerepe nem értett még teljesen, ugyanis szuperoxidnak extracellulárisan nincs, és hidrogén-peroxidnak is csak nagy koncentrációban van in vitro baktériumölő hatása (105). A primer granulumokban található enzim, a mieloperoxidáz alakítja tovább a H2O2-ot hipoklórossavvá (47), mely biológiai anyagok egész sorával reagáló, erős oxidálószer. Fenolokat, aminokat és telítetlen
kötéseket
klorinál;
vascentrumokat
oxidál;
fehérjéket
keresztbeköt;
membránpermeábilis. A keletkezett kloraminok gyengébb és hosszabb életű oxidálószerek. Hidroxilgyökök keletkezhetnek hidrogén-peroxidból ill. HOCl-ból (4. ábra). Rendkívül reakcióképes gyökök, a legtöbb vegyülettel reagálnak. Nagyon rövidéletűek és ezáltal kis hatótávolságúak. A baktérium szerves anyagainak
10
megtámadásában játszott szerepe még kétséges, mert rövid hatósugara miatt valószínűleg
előbb
átalakul,
mintsem
hogy
a
kórokozó
felszínét
elérné.
Hipoklórossavból H2O2 közreműködésével gerjesztett állapotú oxigénmolekulák is létrejöhetnek (4. ábra), amelyek a legkülönfélébb vegyületeket támadhatják meg (pl. lipidoxidáció). A fagocita oxidáz elektrontranszportja töltésmegoszlás-változást hoz létre és a membrán depolarizálódik, ami a NADPH-oxidáz gátlószerével (DPI) gátolható (50, 113). Neutrofil granulociták nyugalmi membránpotenciálja -60 mV (60), míg az oxidáz teljes aktiválódása esetén +60 mV értékig nő meg (60). DeCoursey szerint (18) az oxidáz
elektronárama
negatív
membránpotenciál-értékeknél
nagyjából
azonos
nagyságú, független a membránpotenciáltól. Pozitívabb membránpotenciálok esetén azonban egyre csökken a nagysága és +190 mV-nál meg is szűnik. A túlzott mértékű depolarizáció tehát gátolja az oxidázt, és megakadályozza, hogy hosszabb ideig működjék. Az oxidáz elektrontranszportját kompenzáló töltésvándorlás követi. A kompenzáló töltésvándorlás nem teljes, csak részleges, ezért jön létre a depolarizáció a membrán két oldala között. Kompenzáló töltésként
a NADPH disszociációjából
származó hidrogénionok jöttek szóba, amelyek kijutása megakadályozza a túlzott mértékű membrándepolarizációt és intracelluláris savanyodást. A PKC-aktivátor forbolészter, PMA által stimulált neutrofilekben a pH-grádiens emelése csökkentette, míg a protoncsatorna-gátló nehézfémionok (Cd2+, Zn2+; hatásukat csiganeuronokban írták le legelőször (126))
alkalmazása növelte a NADPH-oxidáz által kiváltott
membrándepolarizáció mértékét és kialakulásának sebességét (50, 122). Protein-kináz C forbolészterrel
történő
aktiválása
humán
neutrofil
granulocitákban
a
protonkonduktancia növekedését vonja maga után (17,63, 94). A protonkonduktanciáért felelős transzportmolekula azonosítása még várat magára. Sok érvet hoztak fel a gp91phox mellett (52, 53) és ellen (18). Valószínűbbnek tűnik, hogy nem a gp91phox működik egyszersmind protoncsatornaként is, hanem egy másik molekuláról van szó.
11
Krónikus granulomatózis (CGD) A NADPH-oxidáz nem megfelelő működéséből származó elsődleges immunhiányos tünetegyüttest
hívjuk
krónikus
granulomatózisnak
vagy
krónikus
granulómás
betegségnek. A természetes immunrendszer fagocitasejtjeinek csökkent patogénölőképessége miatt jön létre és visszatérő, súlyos, bakteriális és gombás fertőzések jellemzik. A betegség már nagyon korán kialakul, akut vagy krónikus fertőzések formájában jelentkezik; a betegek mintegy kétharmadánál már a születés utáni első évben (106). Általánosan igaz, hogy azok a szervek, illetve a nyirokrendszer velük kapcsolatban levő részei érintettek, amelyek a szervezet számára a külvilággal történő érintkezési felületet képezik: tüdő, bőr, gyomor-bélrendszer. A CGD-s betegeket leggyakrabban olyan, kataláz-pozitív mikroorganizmusok fertőzik meg, amelyek nagymértékben ellenállnak a nemoxidatív ölőmechanizmusoknak (107). A kataláz hidrogén-peroxidot bont el vízre és oxigénre (4. ábra). A bakteriális kataláz fontosságának magyarázatául az szolgált, hogy a baktériumok anyagcseréje során mindig keletkezik valamennyi hidrogén-peroxid, amelyet az oxidáz-deficiens fehérvérsejtek képesek átalakítani további reaktív gyökökké és így a mikrobát – NADPH-oxidáz hiányában is – oxidatívan megtámadni (56, 99). Katalázzal rendelkező baktériumok azonnal semlegesítik a bennük keletkezett H2O2-ot, és így az előző folyamatot meggátolva fokozzák virulenciájukat (85). Ezen elmélet ellen szól azonban két tanulmány, amelyekben p47phox-hiányos (CGD-modell-)egereket fertőztek katalázpozitív és -negatív Staphylococcus aureus (89) illetve Aspergillus nidulans (14) törzsekkel, és semmilyen különbséget sem találtak az eltérő törzsek fertőzőképessége között. Krónikus granulomatózisban előforduló
leggyakoribb patogének: Staphylococcus
aureus, Aspergillus-fajok, Gram-negatív enterális baktériumok (pl. Serratia marcescens, Salmonella-fajok) és a Burkholderia cepacia (107). A legtöbbször előforduló tünetek (csökkenő gyakorisági sorrendben): tüdőgyulladás, bőrtályog, gennyes nyirokcsomógyulladás, májkörnyéki és májtályog, csontvelőgyulladás. Az előbbi, többnyire akut állapotok mellett az immunrendszer kórokozók ellen vívott,
krónikus küzdelme
jellemző a betegségre. Ennek eredményeképpen jönnek létre a granulómák, amelyek számos szervben megtalálhatók és krónikus gyulladásos sejtreakciók következtében
12
alakulnak ki. A betegség is róluk kapta a nevét. A granulómák jelenlétére azáltal derülhet fény, hogy vagy fájdalmat váltanak ki, vagy pedig a bél- illetve húgyutak beszűkülését/elzáródását okozzák. A krónikus granulomatózis ritka megbetegedés. Becsült előfordulási gyakorisága 1:250000-1:500000 (54). Minden etnikai csoportot azonos mértékben érint. A NADPHoxidáz-alegységek génjeinek jelenleg ismert 410 mutációja közül mindössze 19 esetben normális az enzim mennyisége, de az működésképtelen vagy csökkent mértékben működőképes (54). Ennek a tizenkilenc, funkcióvesztéses mutációnak a vizsgálata sokmindent elárult az oxidázról. A defektusok fennmaradó 95%-ánál a fehérje alig van vagy egyáltalán nincs jelen. Ennek vagy az az oka, hogy az érintett gén egésze illetve egy darabja hiányzik, vagy pedig az, hogy a keletkezett fehérjetermék/mRNS nem stabil. Krónikus granulomatózisban szenvedő betegek, illetve kisérleti állatok sokkal fogékonyabbak a fertőzésekre, mint a NADPH-oxidázzal rendelkező társaik (54, 89, 107). Neutrofil granulocitáikra is igaz, hogy in vitro az oxidázdefektes sejtek kisebb baktériumölő potenciállal rendelkeznek (36, 42, 92, 120). A CGD-s neutrofil granulociták legtöbbje egyáltalán nem képes szuperoxidtermelésre és elmarad az oxidázfüggő depolarizáció is (32, 104, 113, 135). A beteg sejtek kemotaxisa (36, 138), fagocitózisa (42, 89) és degranulációja (10) azonban nem károsodott.
13
A fagoszómális környezet és a baktériumölés mechanizmusa A gyulladás helyére érkezett neutrofil granulociták hozzáfognak a kórokozó mikroorganizmusok bekebelezéséhez és elpusztításához. A folyamat első lépéseként a fehérvérsejt kapcsolódik a patogén sejthez. Granulocitákon számos receptor ismert, amelyekkel vagy közvetlenül a mikróba felszíni struktúráit képesek felismerni, vagy pedig a már a kórokozót befedő opszoninokat (76). Opszoninként szolgálhatnak antitestek, illetve a komplementrendszer egyes elemei (pl. C3bi). Az antitestek konstans régióját felismerő, fontosabb receptorok neutrofileken: FcγRIIA, FcγRIIIb, FcγRI (76). Az
opszoninok
sokszorosára
fokozzák
a
fagocitózis
sebességét.
A
komplementreceptorok (CR3, CR4) az integrinek családjába tartoznak. Különbség van az immunglobulin- és a komplement-közvetítette fagocitózis között. Míg az előbbi aktív állábképzéssel zajlik, addig az utóbbinál a bekebelezendő sejt inkább besüllyed a gazdasejt membránjába (76). Más-más jelátviteli utak aktiválódnak a különböző jellegű fagocitózisok esetén. Legáltalánosabb esetben a membrán szorosan ráfűződik a mikróbára, annak kontúrját követve, majd kétoldalt összeolvadva lefűződik a fagoszóma. Ezután a fagoszóma egy érési folyamaton esik át, amely alatt különböző membránkompartmentumokkal történő fúziójának illetve belőle történő leválásának egymásutáni sorozatát értjük. Ennek eredményeképpen jelentősen megváltozik a fagoszómamembrán és -mátrix összetétele, és az eredeti sejthártya-vakuólából egy változatos összetételű, toxikus fagolizoszóma keletkezik, amely – a legtöbb esetben – képes a kórokozó elpusztítására és a keletkezett törmelékanyagok eltávolítására. A fagoszóma kialakulásához és lefűződéséhez a fehérvérsejt kortikális citoszkeletonjára van szükség. A fagoszóma és a granulumok mozgatását és fúzióját ezek után azonban már a mikrotubuláris hálózat végzi, és az aktinháló kimondott akadályát képezi (76). A fagoszóma érési folyamatának megértéséhez a továbbiakban szükséges az endocitózis menetének bizonyos szintű taglalása. Az endocitótikus út folyamán az endoszóma érését membránfúziók és -lefűződések sorozata jelenti. A receptor-ligand komplexet tartalmazó endoszóma először korai endoszómává alakul, amelyre enyhén savas pH (6.0-6.5) és bizonyos markerfehérjék jelenléte (Rab5, EEA1) jellemző (115). Itt a ligand gyakran ledisszociál receptoráról és továbbhalad a lebontás felé, míg a receptor visszakerül a plazmamembránba. A korai endoszóma reciklizálást elkerült
14
alkotórészei a kései endoszómába kerülnek, ahol megkezdődik degradációjuk (115). A késői endoszómák belső tere még savasabb (pH 5.5-6.0); intraluminális vezikulákat tartalmaznak és szintén rendelkeznek markerfehérjékkel (Rab7, Rab9, LAMPs). Végül a kései endoszóma tartalma a lizoszómába kerül, amely számos proteázt tartalmaz és belső tere nagyon savas kémhatású (pH < 5.0) (115) . A fagocita sejtek közül a makrofágokban a fent vázolt események zajlanak le fagocitózis alatt. Bennük a fagolizoszóma egy savas, sok hidrolázt tartalmazó kompartmentum, ahol a bekebelezett anyag lebontásának nagy része zajlik. Ezzel ellentétben neutrofil granulocitákban nem találjuk meg az imént említett, klasszikus képleteket. Helyettük szekretoros vezikulákkal és granulumokkal rendelkeznek (30). Ezek a vezikuláris kompartmentumok egymással nem, hanem csak a fagoszóma- illetve a plazmamembránnal fúzionálnak. A granulumok a fehérvérsejtek csontvelőbeli érése folyamán a transz-Golgi-hálózatról fűződnek le. Seregnyi, hatásos mikrobaölő peptidet és hidrolázt illetve olyan fehérjéket tartalmaznak, amelyek a patogének elpusztításához járulnak hozzá. Négy típusukat különböztetjük meg: primer, szekunder, tercier granulumok és szekretoros vezikulák (30). Ebben a sorrendben keletkeznek és ezzel fordított sorrendben fúzionálnak a fagoszómával. A
primer
(azurofil,
peroxidáz-pozitív)
granulumok
jellegzetes
enzime
a
mieloperoxidáz. Emellett – többek között – antibakteriális peptideket, szénhidrát- és fehérjebontó enzimeket, pórusképző fehérjéket tartalmaznak.
Szolubilis stimulusok
hatására tartalmuk csak kismértékben kerül exocitózisra. Szerepük az, hogy a fagoszómával egyesülve, anitmikrobiális fegyvereik segítségével
vegyenek részt a
kórokozók elpusztításában (30). A szekunder (vagy specifikus) granulumok markere a laktoferrin. Membránjuk számos receptort illetve a NADPH-oxidáz nagyobbik alegységét tartalmazza. Az antimikrobiális fehérjék mellett szintén itt található meg három metalloproteáz, amelyek a szövetek extracelluláris mátrixalkotórészeinek (kollagén, fibronektin, proteoglikán, zselatin) lebontását végzik. A szekunder granulumok főleg a mikróba megtámadásában vesznek részt azáltal, hogy a fagoszómával illetve a plazmamembránnal fúzionálva a mikroorganizmusra ürítik tartalmukat (30). A tercier granulumok – a specifikusokkal ellentétben – nagyon kevés antibiótikus anyagot, ugyanakkor sok membránreceptort és mátrixbontó enzimet tartalmaznak (30).
15
Ezért elsődleges jelentőségük abban rejlik, hogy a membránreceptorok és mátrixbontó enzimek raktáraként szolgálva a granulociták érpályából történő kijutását és szövetekben történő haladását teszik lehetővé (1. ábra). A szekretoros vezikulák a sejtmembrán lefűződéseiből jönnek létre, membránjuk főleg receptorokat,
míg
lumenük
szérumfehérjéket
tartalmaz.
Szerepük,
hogy
a
sejtmembránreceptorok raktáraként szolgálnak (30). A plazmamembránba történő beépülésük teszi lehetővé, hogy az érpályában az endotéllel laza kapcsolatban lévő, ’gördülő’ granulociták szorosabb kapcsolatot létesítve kitapadhassanak a hámsejtekre (1. ábra). A granulumok szekréciójához (79) illetve a fagoszómával történő fúziójához (59) a citoplazma kalciumionjaira van szükség. A különböző granulumoknak eltérő a kalciumérzékenysége; legalacsonyabb koncentráció-küszöbértékkel a szekretoros vezikulák rendelkeznek, míg a legmagasabbal a primer granulumok (118). Még nem ismert, hogy mi áll a kalciumérzékenység hátterében. Lehetőségként szóba jött a synaptotagmin II nevű fehérje, amely kalciumfüggő módon helyeződik ki a fagoszómához (80). A fagoszóma kialakulása után az őt körülvevő aktinháló lebomlik és a granulumok csak ezután képesek egyesülni vele. Az aktin-depolimerizációhoz pedig kalcium kell. Felmerült a kalmodulin illetve az általa szabályozott fehérjék szerepe is. Végül ismert, hogy az annexin I és III (kalciumkötő fehérjék) szintén kihelyeződnek a neutrofilek fagoszómáihoz, így szerepük lehet a kalciumhatás közvetítésében (108). Végső soron a granulumok és a fagoszóma összeolvadásából létrejön a fagolizoszóma, mely lumenében tartalmazza a bekebelezett kórokozót, antimikrobiális peptideket és enzimeket, míg membránjában az aktivált
NADPH-oxidázokat,
receptorokat, protonpumpákat és ioncsatornákat (5. ábra). A fagocitózis megkezdése után az oxidáz rögtön összeszerelődik a fagoszómamembránban. Aktiválódását nagymértékű oxigénfogyasztás kiséri, amit „légzési robbanásnak” neveznek. A neutrofilek ölőmechanizmusait a NADPH-oxidáz részvétele alapján klasszikusan szokás oxidatív és nemoxidatív folyamatokra osztani. Az oxidatív ölőmechanizmusok alatt a NADPH-oxidáz átlal termelt szuperoxid-anionokból keletkezett reaktív oxigéngyökök patogénkárosító hatásait értjük (MPO-HOCl-rendszer). A nemoxidatív folyamatok
16
pedig a többi antibakteriális fehérje és peptid toxikus, oxigéntől független, romboló hatását jelentik. Hosszú ideig az a nézet volt elfogadott, hogy a mikroorganizmusok elpusztításáért elsősorban
a
reaktív
oxigéngyökök
felelősek.
A
szabadgyökök
in
vitro
baktériumkárosító és -pusztító hatását már számos tanulmány igazolta (65-67).
Az oxidáz aktiválása során kialakuló reakcióképes gyökök és vegyületek közül az egyik
legfontosabb
a
hipoklórossav,
amely
hidrogén-peroxidból
mieloperoxidáz hatására (4. ábra). Az MPO-H2O2-HOCl
alakul
ki,
rendszer szerepe – a
hipoklórossav in vitro mutatott toxicitása ellenére – a mai napig vitatott. Tény, hogy a mieloperoxidáz örökletes hiányában szenvedő betegek nagy része tünetmentes, kisebb
17
részükre enyhébb fertőzések jellemzőek (főleg Candida). Eszerint az enzim baktériumölésben betöltött szerepe csekély vagy más mechanizmusok kompenzálhatják hiányát (72, 95). Ugyanakkor MPO-hiányos illetve aziddal (MPO-gátlószer) kezelt humán ill. egérneutrofilek kisebb hatékonysággal képesek elpusztítani Staphylococcus aureus és Candida albicans sejteket in vitro (2, 43), ami a folyamat szükségességét jelzi a baktérium- és gombaölésben. A HOCl baktériumkárosító hatását azzal magyarázzák, hogy a bakteriális fehérjéket klórozva változtatja meg működésüket. Érdekes módon azonban a HOCl által klórozott proteinek nagy része nem bakteriális, hanem granulocita-fehérje (15, 105), ami ellentmond az előbbi feltételezésnek. Érdekes megfigyelés az is, hogy in vitro a granulumfehérjék csökkentik a hidrogén-peroxid baktériumölő (S. aureus, E. coli) hatását (105). A szabadgyökök baktériumölésben betöltött kizárólagos szerepét kérdőjelezi meg néhány tanulmány, amelyek a fagoszómális pH-nak fontos szerepet tulajdonítanak (104, 116). Az aktiválódott NADPH-oxidáz nagy mennyiségű elektront transzportál a fagoszóma belső terébe, amit kompenzáló töltésként protonok illetve kisebb részben káliumionok kisérnek (5. ábra). Az oxidáz stimulálását követően aktiválódó protonáram azonban nemcsak töltésmegoszlás- hanem pH-változást is okoz; mind intracellulárisan, mind intrafagoszómálisan. A fagoszómális pH kialakításában számos tényező vesz részt. Makrofágokban az érésben lévő fagoszóma egyik jellegzetes tulajdonsága a folyamatos pH-csökkenés; akár pH=5.0 érték alá is. Ez a pH optimális a baktériumölésben résztvevő hidrolázok számára.
Neutrofil granulocitákban a fagoszómára nem jellemző, a makrofágoknál
tipikus, extrém mértékű savanyodás. pH-érzékeny, fluoreszcens festékkel jelölt, elölt Staphylococcus aureus (116) illetve Candida albicans (26) sejtek fagocitózisa folyamán normál neutrofilekben egy gyors, néhány percig tartó pH-növekedést (7,6-7,8) tapasztaltak, amit egy fokozatos, kismértékű savanyodás követett (15 percen belül pH=6,9-7,0-ig). Jelölt, opszonizált zimozánnal végzett mérésekben a pH végig 7,4 körüli értéken maradt (61). A kis eltérések ellenére abban mindhárom tanulmány egyezik, hogy neutrofil granulocitákban a fagoszóma lumene semleges, illetve enyhén savas, de semmiképpen sem lesz nagyon savanyú. A fagoszómális pH kialakításában fontos szerep jut a NADPH-oxidáznak, ugyanis CGD-s illetve DPI-kezelt neutrofilekben elmarad a kezdeti lúgosodás, és azonnali,
18
gyors savanyodás indul be: 2 percen belül pH=5,8-6,5, majd 15 percnél pH=5,5-6,0 értékeket ér el (1, 104, 116). Az oxidáz működése tehát egyértelműen lúgosítja a lument, mégpedig azáltal, hogy a szuperoxidanionokból keletkező reaktív gyökök kialakulása folyamán proton használódik el, illetve OH- -ionok jelennek meg (4. ábra). A
fagoszómába
ömlött
granulumfehérjék
rendelkeznek
ugyan
egy
adott
pufferkapacitással, de az oxidáz aktiválódása olyan erős, hogy a pH-t csökkentő mechanizmusok nélkül a fagoszóma lumene erősen lúgosodna. A fagoszómán belüli savanyodáshoz járul hozzá a granulumok lumenének alacsony pH-ja (5.ábra). A legfontosabb savanyító transzporter a vakuoláris protonpumpa (V-ATP-áz), amely főleg a szekretoros vezikulák, az elsődleges és harmadlagos (de nem a másodlagos) granulumok membránjában található meg. A fagoszóma-granulum fúzió során kerül a fagoszómamembránba és lát hozzá a közeg savanyításához (115). Az oxidáz aktiválódását követően megjelenő protonkonduktancia egyrészt a töltéskompenzálást, másrészt a fagoszómális lumen savanyodását szolgálja. A membránon keresztüli pHgrádienstől függ, hogy az oxidáz elektronáramának töltéskompenzációjában milyen arányban
vesznek
plazmamembránjában
részt
protonok
található
illetve
K+-ionok
Na+/H+-antiporternek
(104).
nem
A
neutrofilek
tulajdonítanak
sok
jelentőséget az intrafagoszómális lumen protonkoncentrációjának szabályozásában (40). A fagoszómális pH baktériumölésben betöltött fontos szerepére utalnak a következő megfigyelések. CGD-s neutrofilek metilaminnal történt kezelése (amely semleges pH biztosításával megakadályozza a CGD-s sejtekre jellemző fagoszómális savanyodást) növelte a baktériumok lebontásának mértékét (61). Két fontos granulumproteáz, az elasztáz és a catepsin G pH-optimuma 7,5 körül van, és a pH-csökkentésével jelentősen csökken aktivitásuk; pH=6,5-nél már csak 20%-a a maximálisnak (104). A fenti ellentmondások feloldására A.W. Segal 2002-ben új hipotézist alkotott, amely szerint
az
oxidáz
elektrogén
működése
következtében
fellépő,
nagy
membrándepolarizáció káliumionokat hajt a citoplazmából az intrafagoszómális térbe (5.ábra). Az így odakerült, nagy mennyiségű pozitív töltés felszabadítja
az addig
inaktív, negatív töltésű mátrixfehérjékhez kötött emésztőenzimeket, amelyek ezáltal aktiválódva támadják meg a patogént. A megnövekedett ionerő miatt átmenetileg hiperozmótikus környezet alakul ki a fagoszómában. A baktérium bekebelezésekor a fagoszóma nagyjából akkora, mint a fagocitált mikróba maga, mert a fagocitózis
19
folyamán a neutrofilek sejtmembránja két oldalról, szorosan fűződött rájuk. Utána viszont a fagoszóma térfogata jelentős mértékben megnő. A térfogatnövekedéshez a fúzionált granulumok is hozzájárulnak, de döntően azáltal jön létre, mert a fagoszóma lumenében az ozmótikus koncentráció hirtelen megugrik, ez pedig vizet von magával. Az ozmótikus koncentráció eleinte valószínűleg a bejutott ionok miatt (K+, H+), majd aztán az emésztés következtében a baktérium makromolekuláinak kisebb alkotórészeire történő szétesése miatt nő meg. CGD-s sejtekben mindkét előbbi folyamat nagy mértékben gátlódott, és ezért elmarad a fagolizoszóma méretének növekedése (104, 116). Elektronmikroszkópos képeiken a fagolizoszómában a granulumtartalom diffúz eloszlást mutat normál neutrofilekben, míg CGD-s sejtekben ehelyett összecsomósodott eloszlást tapasztaltak. Kimutatták, hogy a granulumok kationos fehérjéi képesek proteoglikán mátrixhoz kötődni, és hogy néhány fehérje granulummátrixról történő leoldódásának mértéke arányos a K+-koncentrációval, és nem függ a pH-tól. Kisérleteikben a granulumok önmagukban nem voltak toxikusak Staphylococcus aureus baktériumokra, míg növekvő K+-koncentráció mellett egyre erősebben öltek, ami proteázgátlókkal részben vagy teljesen kivédhető volt (104). Az új elmélet nagyon vonzó, azonban néhány része nem egyeztethető össze több, friss és korábbi megfigyeléssel. Hipotézisük szerint ugyanis a NADPH-oxidáz enzim kizárólagos szerepe a káliummozgáshoz szükséges elektromos hajtóerő biztosítása, a keletkezett oxigéntermékek a baktériumölésben nem vesznek részt. Továbbá, az alkalmazott K+ionofór (valinomycin) hatása sem teljesen egyértelmű. Reeves és mtsi azt találták, hogy valinomycin gátolta a neutrofilek baktériumölő képességét és megakadályozta a fagoszóma duzzadását (104). Ezt azzal indokolták, hogy az ionofór kioltotta a fagoszómamembránon keresztül létrejött káliumgrádienst, ezáltal a káliumionok nem maradtak a fagoszómában. Vitatható, hogy az ionofór alkalmazása hogyan befolyásolta a fagoszóma [K+]-ját. Erre vonatkozóan nincsen egyértelmű mérési adat. A fagocitózis megindulását követően a fagoszóma térfogata néhány percig nem változik; csak a O2.- termelés leállása után indul el a duzzadás. A fagoszómamembrán vízre végig áteresztő, ezért a duzzadás késéséért más mechanizmus a felelős. Azzal magyarázzák, hogy a fagoszómát először egy citoszkeletáris váz veszi körül, amely nem engedi a fagoszómát növekedni. Ezáltal a fagszómában ideiglenesen hiperozmótikus környezet alakul ki,
20
majd a sejtváz fokozatos leépülésével indul el a térfogatnövekedés. Kérdéses azonban, hogy egy aktinhálóval körülvett fagoszómával hogyan képesek a granulumok egyesülni. Tehát az új hipotézis még számos ponton bizonyításra szorul, azonban hozzájárult ahhoz, hogy felülvizsgáltuk a NADPH-oxidáz-termelte szabadgyökök illetve az ionmozgás-változások baktériumölésben betöltött szerepéről kialakított elképzeléseket.
21
Granulociták kalciumforgalma
Neutrofil granulociták számos receptoron keresztüli stimulálása az intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedését váltja ki, mely a sejtek aktiválódásához vezet. Kalciumszignál kialakulása szükséges neutrofilek spontán (74) és a következő kemoattraktánsok átlal kiváltott kemotaxisához, illetve gyulladási mediátorok szintéziséhez: IL-8 (112), fMLP (58, 97), PAF (48), IL-6 (11), IFN-γ (73). A sejtek formil-peptid indukálta szuperoxidtermelése is kalciumfüggő; mind az intra-, mind az extracelluláris raktárakból jöhetnek a kalciumionok, és csak ha egyik forrás sem áll rendelkezésre, csökken a válasz (5, 33). A kemotaktikus receptorokon keresztüli stimuláció tipikus, kétfázisú jelet hoz létre. Először egy gyors csúcs alakul ki, ami hamar lecseng, de van fenntartott fázis, ami kalciumbeáramlás-függő. Az intracelluláris kalciumkoncentráció emelkedése nemcsak szolubilis stimulusok esetén jön létre, hanem nagyobb méretű részecskék bekebelezésekor is. IgG-vel opszonizált élesztősejtek (125) és vörösvértestek (64); szérummal opszonizált zimosanszemcsék (23, 111, 114) és baktériumok (133) fagocitózisát is az intracelluláris Ca2+-koncentráció emelkedése követi. A citoszólikus Ca2+-koncentráció emelkedése szükséges Staphylococcus aureus baktériumok elpusztításához és a fagoszóma-lizoszóma fúzióhoz (8, 59, 84) neutrofilekben. Érdekes módon, sok más sejttípussal ellentétben a sejten belüli Ca2+koncentráció emelkedése fehérvérsejtekben késlelteti az apoptózist (82, 132). Granulocitákon nincsenek feszültségfüggő kalciumcsatornák (21). Bennük a kalciumszignál létrejöttének fő mechanizmusa a kapacitatív vagy raktár-irányította kalciumbeáramlás (21, 101). A folyamat első fázisa során a receptorokhoz kötött agonista a sejten belüli kalciumraktárakból kalciumot szabadít fel, majd a második szakaszban a raktárak kiürülése a sejtmembránban helyet foglaló kapacitatív csatornák kinyitását eredményezi, és kalciumionok áramlanak be az extracelluláris térből (101). Még nem tisztázott, hogyan szabályozza a kalciumraktárak teltségi állapota a kapacitatív csatornák működését, de néhány modell már született a jelenség magyarázatára. Az egyik elmélet egy vízoldékony hírvivőmolekula (CIF = calcium influx factor) létezését feltételezi (101). Az „exocitózis”-modell szerint a csatornák intracelluláris vezikulák membránjában raktározódnak és a raktár ürülésének jelére
22
exocitózissal kerülnek a sejtmembránba, ahol aktiválódnak (129).
Egy további
2+
elképzelés szerint a csatornákat közvetlen környezetük Ca -koncentrációja befolyásolja (129). Az a tény ugyanis régóta ismert, hogy a kapacitatív csatornákat maguk a kalciumionok gátolják (9). Feltehető, hogy a raktár és a csatornák térbeli közelsége esetén a csatornák közelében a raktárürülés miatt jelentkező, lokális [Ca2+]-csökkenés aktiválná a csatornákat (129). A ma legvalószínűbbnek tartott mechanizmus, a „konformációs kapcsolat” ötlete szerint a kalciumraktárak kalciumcsatornái és a plazmamembrán kapacitatív csatornái fehérje-fehérje kapcsolat révén kommunikálnak; a harántcsíkolt izomrostokból megismert DHP-receptor és rianodinreceptor kettőséhez hasonlóan (139). Csak itt fordított sorrendben aktiválnák egymást: a raktárfehérje konformációváltozása nyitná a membrán csatornáit (129). A kapacitatív csatornák molekuláris szerkezete ma még nem ismert. Az emlős Trp-fehérjék (trp= transient receptor potential) az elsődleges gyanusítottak (101). A Trp-fehérjék olyan Drosophila fotoreceptor mutánsok, amelyek képtelenek fenntartani a fényinger esetén kialakult receptorpotenciált, és kismértékű homológiát mutatnak emlős feszültségfüggő kalciumcsatornákkal (46). Neutrofil granulcitákban a család hat fehérjéjét azonosították eddig (49). Elektrofiziológiai jellemzői alapján csak egy, a TRPM2 jött szóba, mint a kapacitatív kalciumcsatorna lehetséges alegysége (49). Granulocitákban a citoplazma kalciumionjainak eltávolításáért a Na+/Ca2+-antiporter, az endoplazmatikus retikulum (SERCA) és a plazmamembrán (PMCA) kalciumpumpája felelős. Neutrofil granulocitákban kevés adat áll rendelkezésünkre a kapacitatív csatornák szabályozásáról. Korábbi megfigyelés, hogy fMLP és a PKC-aktivátor forbolészter, PMA gátolja neutrofilek kapacitatív kalciumbeáramlását (90). Kutatócsoportunk korábbi eredményei irányították a figyelmet a depolarizáció és a hajtóerő lehetséges szerepére: a fenti stimulusok (fMLP, PMA) a NADPH-oxidáz aktiválásán keresztül gátolták a kapacitatív kalciumbeáramlást (32). Már más sejttípusokban is leírták, hogy a membrándepolarizáció gátolja a kapacitatív kalciumbeáramlást (110). Oxidázhiányos neutrofilek tapsigarginnal (SERCA kalciumpumpa gátlószere) aktivált
kapacitatív
kalciumbeáramlását PMA nem gátolta (32). Ugyanakkor felmerült a β-PKC enzim közvetlen
foszforiláción
keresztüli
szabályozásának
lehetősége
is
(69).
Foszfatázgátlókkal a kalciumbeáramlás gátlása még tovább növelhető volt, tovább erősítve a foszforiláció lehetséges szerepét a folyamatban (91). Más sejttípusokban is
23
leírták már a fehérjefoszforiláció kapacitatív utat szabályozó szerepét (25, 137). További probléma, hogy korábbi, Quin-2 festékkel végzett kisérleti eredmények (77) és kutatócsoportunk egy CGD-s betegen végzett vizsgálatának eredménye szerint (32) azonban egészséges és CGD-s betegek fMLP-re adott kalciumszignáljai hasonlóak. Ezek az eredmények azonban felülvizsgálatra szorulnak, mert az első tanulmány esetében egy régebbi típusú kalciumérzékeny festéket használtak, amely nem képes két excitációs hullámhosszal dolgozni, és erős kalciumpufferoló hatása van; az utóbbi munka esetében pedig mindössze egyetlen egy beteg sejtjein sikerült a mérést elvégezni. A kalciumbeáramlás gátlásának meg kellene jelennie az fMLP-re adott kalciumjelben is; amire pedig nem történt vizsgálat. Ezért mi az oxidázaktivitás és a kapacitatív kalciumbeáramlás összefüggését vizsgáltuk meg modellsejtek segítségével.
24
Célkitűzések ● a NADPH-oxidáz szerepének vizsgálata neutrofil granulociták kalciummozgásainak szabályozásában, ● a NADPH-oxidáz termelte reaktív oxigéngyökök illetve az általa létrehozott membránpotenciál baktériumölésben betöltött szerepének pontosabb megértése farmakológiai módszerekkel.
25
Módszerek A neutrofil granulociták preparálása Önkéntes, egészséges donorok citráttal alvadásgátolt véréből 30 perces, dextrános ülepítéssel a vörövértestek nagy részét elválasztottuk a fehérvérsejtektől. Ezután Percoll illetve Ficoll grádienscentrifugálással izoláltuk a neutrofil granulocitákat a többi fehérvérsejttől. A megmaradt vörösvértest-szennyezéstől 30 másodpercig tartó hipotóniás kezeléssel szabadultunk meg. A preparátumok
95%-nál több neutrofil
granulocitát tartalmaztak, amit Giemsa-festéssel határoztunk meg. A sejteket eritrozinB-vel festve 95%-nál nagyobb életképességet kaptunk. A granulociták preparálása vagy steril, pirogénmentes oldatokkal történt, 4 ºC-on vagy nem steril oldatokkal, szobahőmérsékleten. A nem steril preparálás folyamán a sejtek bizonyos mértékig előaktiválódtak, míg steril körülmények között ez elkerülhető volt. Nem steril preparálásra célzottan fMLP, mint stimulus alkalmazásakor volt szükség, ugyanis a sterilen preparált sejtek egyáltalán nem reagáltak rá, valószínűleg a receptor felszíni hiányának következtében. A baktériumöléses méréseknél mindig steril preparálást alkalmaztunk, mert a sejtek így még nem aktiválódtak, granulumaik teljes arzenálját megőrizték még és nagyobb hatásfokkal öltek, mint a nem sterilen preparáltak. Azokban a mérésekben is sterilen nyertük ki a sejteket, amelyeknél a mérés különösebben nem indokolta ugyan a steril izolálás szükségességét, de ugyanolyan körülményekre volt szükségünk, mint a baktériumöléskor.
PLB-985 sejtek tenyésztése és preparálása A dolgozatban alkalmazott négy PLB-985 sejtvonal közül a vad típus és a CGDmodell
(PLB-985
X-CGD)
sejtvonalak
M.
Dinauer
(Indianapolis,
USA)
kutatócsoportjának ajándékai. A működésképtelen, de expresszálódó fehérjével visszatranszfektált, X-CGD vonal (PLB-985 M1) Dirk Roos (CLB, Amszterdam, Hollandia) munkacsoportjának ajándéka; míg a vad típusú fehérjével visszatranszfektált
26
X-CGD vonal (PLB-985 S1) Dr. Német Katalin (Országos Hematológiai és Immunológiai Intézet, Budapest) munkája. A különböző típusú PLB-985 sejteket RPMI-1640 médiumban, szuszpenziós kultúrában tartottuk fent, heti kétszeri 1:3 arányú passzálással, 5%-os CO2-termosztátban. A médium tartalmazott mindegyik vonal esetén 10% FCS-t és 1% penicillin-streptomycint. A pH-t 0,2%-os NaHCO3-oldattal 7,4-re állítottuk be. A médiumban időnként az L-glutamin utólagos pótlására volt szükség. A PLB-985 X-CGD sejtek médiumába a szelekció fenntartásáért 350 µg/ml hygromycint adtunk. A PLB-985 sejtek 0,5% dimetil-formamid jelenlétében granulocita-szerű sejtekké differenciálódnak. A differenciálódás megtörténtét a CD11b (neutrofil differenciációs marker) sejtfelszíni expressziója (áramlási citométer) és NBT-teszt alapján ellenőriztük. Csak olyan PLB-985 vad típusú és S1 típusú sejtpreparátumokkal dolgoztunk,
ahol
a
differenciáltatott
sejtek
több
mint
80%-a
képes
volt
szuperoxidtermelésre, és így egy közel egységes populációt képező modellként szolgált.
Intracelluláris Ca2+-koncentráció mérése A sejteket 107/ml koncentrációban inkubáltuk 1 µM FURA-2-AM jelenlétében 37 ºCon, H-médiumban (összetétele: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,8 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 5 mM glükóz, pH 7,4). A külső festéket kétszeri, PBS-sel történt mosással távolítottuk el, a sejteket H-médiumban vettük fel és fénytől védve, szobahőmérsékleten tároltuk a felhasználásig (maximum 3 órán át). 3 millió FURA-2vel töltött sejtet szuszpendáltunk 3 ml Ca2+-tartalmú vagy Ca2+-mentes H-médiumban, metilakrilát-küvettában és 4-5 percig inkubáltuk őket, erős keverés mellett. A FURA-2 fluoreszcenciájának változásait Deltascan kétfényutas fluoriméterben mértük (Photon Technology International, South Brunswick, NJ, USA) 340 nm és 380 nm excitációs, és 510 nm emissziós hullámhosszokon. 2 mérés/másodperces sebességgel követtük az eseményeket. A két excitációs hullámhosszon kapott fluoreszcenciák hányadosát (F340/F380) Grynkiewicz és mtsi (41) módszerével kalibráltuk át [Ca2+]ic értékekké, a háttérértékek levonása után.
27
Mn2+-beáramlás mérése 3 millió FURA-2-töltött sejtet szuszpendáltunk 3 ml Ca2+-mentes, 100 µM EGTA-t tartalmazó H-médiumban, metilakrilát-küvettában és 4-5 percig inkubáltuk őket, erős kevertetés mellett. A FURA-2 fluoreszcenciájának csökkenését a kalciumméréshez használt Deltascan kétfényutas fluoriméterben mértük
(Photon Technology
International, South Brunswick, NJ, USA) 360 nm excitációs és 510 nm emissziós hullámhosszokon.
Membránpotenciál mérése 1 millió sejtet szuszpendáltunk 3 ml
Ca2+-tartalmú H-médiumban, metilakrilát-
küvettában és 4-5 percig inkubáltuk őket, erős kevertetés mellett. A sejtekhez ezek után 100 nM DiOC5(3), membránpotenciál-érzékeny fluoreszcens festéket adtunk, majd újabb 4-5 percig vártunk, míg a fluoreszcens jel stabilizálódott. A festék fluoreszcenciájának változásait a kalciumméréshez használt Deltascan kétfényutas fluoriméterben mértük (Photon Technology International, South Brunswick, NJ, USA) 484 nm excitációs és 505 nm emissziós hullámhosszokon. A kapott fluoreszcencia értékeket egy olyan kalibráló sor segítségével számoltuk át membránpotenciál-értékekre (mV), amelyben különböző mennyiségű extracelluláris K+-ot tartalmazó H-médiumban, 2 µg/ml valinomycin jelenlétében kapott fluoreszcencia értékeket feleltettünk meg a Nernst-egyenlet alapján számolt egyensúlyi potenciálokkal.
Szabadgyök-termelés mérése A sejtek extracelluláris szuperoxidtermelését a szuperoxid-diszmutázzal (12,5µg/ml) gátolható ferricitokróm-c redukció alapján mértük többutas fotométerben, 550 nm hullámhosszon, 106/ml koncentrációban, 100 µM citokróm-c jelenlétében, 37 ºC-on, Hmédiumban. A háttérértékek levonása után a kapott extinkcióértékeket a citokróm-c abszorpciós koefficiense segítségével (21 mM-1cm-1) számoltuk át szuperoxidtermelési értékekre.
28
Neutrofil granulociták teljes (intracelluláris+extracelluláris) szabadgyök-termelését lucigenin-alapú ([Lucigenin] = 51 µg/ml) kemilumineszcenciával mértük (16), amely során a nem lumineszcens lucigenin a szabadgyökökkel reakcióba lépve lumineszkál. A lumineszcens jelet egy Fluoroskan Ascent Fl (ThermoLabsystems) fluoriluminométerrel mértük, 96-os lemezen, 37 ºC-on, rázatással. A lumineszcens jelek kvantifikációja a görbe alatti terület kiszámításával történt. Egyedi sejtek szuperoxidtermelő-képességét NBT-teszttel mértük. Zsírtalanított tárgylemezen 37 ºC-on, 30 percig inkubáltunk 2*105 sejtet 625 µg/ml Nitrobluetertazolium jelenlétében. Szuperoxid anionok hatására a színtelen reagens szürkéskék csapadékot képez. Az inkubálás után a letapadt sejteket metanollal fixáltuk és fénymikroszkóp alatt határoztuk meg a kékes csapadékot tartalmazó, szuperoxidtermelő sejtek százalékos arányát a populációban (mintánként legalább 100 sejt megszámolásával).
Baktériumok tenyésztése és preparálása Az Escherichia coli ML-35 törzs Dirk Roos (CLB, Amszterdam, Hollandia) munkacsoportjának ajándéka, míg az apatogén Staphylococcus aureus törzs
Dr.
Kristóf Katalin (SE, Orvosi Mikrobiológia Tanszék) ajándéka. A baktériumokat 30% glicerin/70% LB-médium fagyasztó elegyben -80 ºC-on tároltuk, 1 ml-ként kiporciózva. Minden mérésnél egy cső tartalmát engedtük fel és 30 ml LB-be oltva 3 órán át, 37 ºCon, erős kevertetés mellett növesztettük, majd kétszer hideg PBS-ben mostuk. A végén H-médiumban vettük fel a baktériumsejteket és az optikai denzitást (650 nm-en) 1.0-ra állítottuk, ami körülbelül 109/ml kolóniaképző egységnek (CFU) felel meg (higításosszélesztéses méréssel megerősítve). A baktériumölés követésére kifejlesztett új módszerünket az Eredmények fejezetben részletezem.
29
Neutrofil granulociták
86
Rb+-leadásának mérése
Neutrofil granulocitákat töményen (5-10x107/ml) inkubáltunk
86
Rb+ izotóp (0,25 µCi)
jelenlétében 20-30 percig, majd kétszeri mosással távolítottuk el a sejten kívüli izotópot, és izotópmentes H-médiumban vettük fel a sejteket, 107/ml koncentrációban. 200 µl-es térfogatokra szétosztva stimuláltuk őket 5 percig 37 ºC-on, majd azonnali fugálással (500 x g, 4 perc, szobahő) választottuk el az intra- és extracelluláris radioaktivitást. A felülúszó 100 µl-es térfogatában, automata gamma-számlálóval (Wallac, 1470 Wizard TM) mértük meg a radioaktivitást. A stimulált minták értékeiből mindig levontuk a stimulálatlan minták izotópleadását. Az DPI-vel kezelt minták izotópleadását a csak PMA-val (100 nM) stimulált minták százalékában adtuk meg.
Statisztikai analízis Az értekezésben bemutatott reprezentatív ábrák olyan kisérletekből származnak, amelyeket legalább három különböző, más-más donorból származó preparátumon végeztünk el. A több mérés átlagát bemutató ábrákon az átlag szórását (± S.E.M.), valamint az elemszámot (n) is feltüntettük. A statisztikai szignifikanciát t-próbával ellenőriztük.
30
Eredmények A NADPH-oxidáz szerepe a kapacitatív Ca2+-influx szabályozásában Az oxidáz szerepének tanulmányozásában fontos vizsgálati objektumok az oxidázdeficiens sejtek. Ilyen humán sejtek (CGD-s betegekéi) azonban csak nagyon korlátozott
mértékben
elérhetők,
ezért
az
oxidáz
és
a
kalciumbeáramlás
összefüggésének vizsgálatát granulocita-szerű modellsejteken végeztük. Modellnek a PLB-985 nevű, mielomonoblaszt leukémiás sejtvonalat választottuk, melynek állandóan osztódó sejtjei neutrofil granulocitákká illetve monocitákká differenciáltathatóak (128). A differenciálatlan sejtek 6-7 napos, 0,5% dimetilformamidos kezelés következtében granulocita-fenotípust mutató sejtekké érnek. A sejtek morfológiailag neutrofilekre hasonlítanak, számos neutrofil differenciációs markerrel rendelkeznek, azonban csak primer granulumaik vannak (98). A differenciálatlan sejtek nem termelnek szuperoxidot, de a differenciáltatottakban már megjelenik az oxidáz és a granulocitákkal összemérhető szuerpoxidtermelést produkálnak. A PLB-985 sejtekben kiváltható a kapacitatív kalciumbeáramlás. A vad típusú sejtek mellett vizsgáltunk oxidázhiányos, PLB-985 X-CGD sejteket (136); valamint az oxidáz egy expresszálódó, de működésképtelen mutánsával (PLB-985 M1, Prof. Dirk Roos), illetve a vad típusú, működő oxidázzal (PLB-985 S1, Német Katalin) visszatranszfektált
sejteket
is.
A
modellsejtek
differenciálódását
(a
CD11b
differenciációs marker sejtfelszíni jelenléte alapján) és az oxidáz expresszióját áramlási citométerrel ellenőriztük.
PLB-985 sejtek aktiválódásának jellemzése Forbolészterrel (100 nM) stimulált, differenciáltatott, vad típusú PLB-985 sejtek ugyanolyan mértékben (22,7±2,1 nmol O2.-/10 perc/106 sejt) termeltek szuperoxidot, mint neutrofilek (21,9±1,5 nmol O2.-/10 perc/106 sejt) és az oxidáz hatására jelentős
31
mértékű membrándepolarizáció jelentkezett (6. ábra). Az oxidázhiányos PLB-sejtek (XCGD) és a működésképtelen mutánssal visszatranszfektáltak (M1) egyáltalán nem termeltek szuperoxidot és membránpotenciáljuk sem változott (6. ábra). Ez is alátámasztja, hogy a PMA-kiváltotta membrándepolarizációért az oxidáz működése a felelős. A vad típusú oxidázzal transzfektált CGD-s sejtek (S1) szuperoxidtermelése (4,3±0,8
nmol O2.-/10 perc/106 sejt) csak mintegy negyede-ötöde volt a vad
típusúakénak, ami valószínűleg az oxidáz kisebb mennyisége miatt következett be. A modellsejtvonalak
szuperoxid-termelés
szempontjából
homogén
populációnak
bizonyultak, amit NBT-teszttel ellenőriztünk: a PLB-985 vad típusú sejtek 94,2 ± 7,4 %-a (n=6); a PLB-985 S1 sejtek 81,8 ± 7,8 %-a (n=5) válaszolt szuperoxidtermeléssel 100 nM PMA hatására (átlag ± S.E.M.; normál neutrofilek mindig 100%-osan).
-40 membránpotenciál (mV)
O2.- (nmol/10 perc/106 sejt
30 25 20 15 10
-50
-60
-70
5 -80
0 PMN
w.t.
X-CGD
S1
0
M1
50
100 150 idő (mp)
200
250
6. ábra Differenciáltatott PLB-985 sejtek PMA-indukálta szuperoxidtermelése (A) és membrándepolarizációja (B). (A) Az adatok 8 mérés átlagát mutatják. (B) A bemutatott görbék három mérés egy reprezentatív kisérletének eredményei. (v.t.= vad típus; PMN=polimorfonukleáris neutrofil; S1= vad típusú oxidázzal transzfektált PLB X-CGD sejtek; M1=működésképtelen, Thr341Lys mutációt hordozó oxidázmutánssal transzfektált PLB X-CGD sejtek).
32
A sejtvonal jellemzése céljából megvizsgáltuk a kemotaktikus ingerekre adott reakciókat is. A működőképes NADPH-oxidázzal visszatranszfektált PLB-985 X-CGD sejtek (PLB-985 S1) 0,97 ± 0,2 nmol/106 sejt/10 perc (átlag±S.E.M.; n=6) O2.- termeléssel válaszoltak 1 µM fMLP stimulusra. Az S1 sejtek rendelkeznek mindkét, a neutrofileken is előforduló formil-peptid receptorral (FPR és FPRL1), és mindkét receptoron keresztül kiváltható bennük kalciumszignál: a kizárólag az FPRL1 receptoron ható peptid, WKYMVM és a mindkét receptort aktiváló fMLP adását is az [Ca2+]ic nagymértékű emelkedése követte (7. ábra). Mindezek alapján megállapítottuk, hogy a NADPH-oxidáz kapacitatív kalciumbeáramlásra kifejtett hatásának a vizsgálatára az PLB-985 S1 sejtek megfelelő modellnek tekinthetők.
fMLP
WKYMVM
6 Fura2 ratio (340/380:505 nm)
Fura2 ratio (340/380:505 nm)
5 4 3 2 1
5 4 3 2 1 0
0 0
100 idő (mp)
200
0
100 idő (mp)
7. ábra Differenciáltatott PLB-985 S1 sejtek kalciumszignáljai Fura-2-vel töltött, PLB-985 S1 sejteket stimuláltunk 500 nM fMLP-vel (A) illetve 100 nM peptiddel (WKYMVM) (B), és az [Ca2+]ic változásait követtük nyomon. Az ábra négy mérés egy reprezentatív eredményét ábrázolja.
33
200
PLB- sejtek kapacitatív influxának vizsgálata Ca2+-mentes közegben Granulociták aktiválódása folyamán a kapacitatív kalciumbeáramlás számos más biokémiai és sejtbiológiai folyamattal párhuzamosan zajlik le, ezért fiziológiás stimulusok
adásával
izolált
vizsgálata
nem
lehetséges.
A
raktár-irányította
kalciumbeáramlás szelektív kiváltására elterjedten használják az endoplazmás retikulum kalciumpumpájának gátlószerét, a tapsigargint (123, 124). Ez a szer a plazmamembrán kalciumpumpájára nem, csak a belső raktárakéra hat, ezáltal gátolja a kalcium visszavételét a raktárakba. Az állandóan meglévő, raktárból történő kalciumszivárgás következtében a citoplazma kalciumszintje megemelkedik, a kalciumraktárak kiürülnek. Ez a sejtmembrán kapacitatív csatornáinak nyitásához vezet és kalciumbeáramlást indukál a külső térből, ami hozzájárul az intracelluláris kalciumjel kialakulásához. Ha FURA-2, kalciumérzékeny festékkel töltött PLB-985 sejteket kalciummentes közegben inkubálunk tapsigargin jelenlétében, akkor a sejtek aktiválása nélkül üríthetjük ki a kalciumraktárakat, miközben a kapacitatív csatornákat aktiváltuk. Minthogy a külső közegben ebben az esetben nincsen kalcium, ezért tapsigargin adását követően a belső raktárakból felszabaduló ionok átmenetileg megemelik a citoplazma kalciumszintjét, azonban a plazmamembrán eltávolító fehérjéi miatt hamarosan a sejtek raktárai és citoplazmája is elszegényedik kalciumban, és a citoplazmatikus koncentráció a kezdeti érték körülire esik vissza (8. ábra). Ekkor kalciumot adva a külső térbe a nyitott kapacitatív csatornákon keresztül kalcium áramlik be a citoplazmába. A citoplazmatikus kalciumkoncentráció növekedésének üteme ekkor a kapacitatív csatornákon keresztüli kalciumbeáramlás mértékét jelzi (8. ábra, világoskék, TG jelzésű görbék). A kalciumbeáramlás
sebessége
citoplazmában
különböző
a
mindegyikükben
működik,
és
az
PLB
elért
maximális
sejtvonalakban
méghozzá
hasonló
kalciumkoncentráció
hasonló; mértékben
jelezvén, a
a
hogy
kapacitatív
kalciumbeáramlás. Az oxidáz kalciumbeáramlásra gyakorolt hatását úgy vizsgáltuk, hogy a kalciumvisszaadás előtt 2 perccel forbolészterrel aktiváltuk az oxidázt (a 8. ábra piros, TG+PMA jelzésű görbéi). A kalciumvisszaadás időpontjára az oxidáz már aktiválódott, mind a szuperoxidtermelés beindult, mind pedig a membrándepolarizáció létrejött (6. ábra).
34
PLB-985 vad típus
PLB-985 X-CGD
800
800
[Ca2+]ic (nM)
1000
[Ca2+]ic (nM)
1000
600 400 200
400 200
0
0 0
200
400 600 idő (mp)
800
0
PLB-985 S1
1000 800 600 400
200
400 600 idő (mp)
800
PLB-985 M1
1000 [Ca2+]ic (nM)
[Ca2+]ic (nM)
600
800 600 400 200
200 0
0 200
400 600 idő (mp)
PMA-indukálta gátlás %-ban
0
800
0
200
S1
M1
400 idő (mp)
600
800
100% 80% 60% 40% 20% 0% -20%
wild type
X-CGD
8. ábra PMA hatása differenciáltatott PLB-985 sejtek kapacitatív kalciuminfluxára Ca2+-mentes H-médiumban szuszpendált PLB-985 sejtekben a mérés 2. percében 100 nM tapsigargin adásával (TG) indukáltuk a kapacitatív utat, majd 10 perccel később 1 mM CaCl2-ot adtunk (Ca2+) (világoskék görbék). Némely mintában a Ca2+-visszaadás előtt 2 perccel 100 nM PMA-val (PMA) stimuláltuk a sejteket (piros görbék: TG+PMA). A kontroll mintákban (zöld görbék) tapsigargin helyett DMSO-t adtunk. (E) PMA által kifejtett százalékos gátlások statisztikai elemzése, amit a Ca2+-visszaadás utáni 30 másodpercben kapott i.c. [Ca2+]-emelkedésekből számoltuk. Az ábrázolt értékek 5 (vad típus és X-CGD) illetve 3 (S1) mérés átlagai±S.E.M., míg az M1 sejtek esetében két mérés átlaga látható.
35
Vad típusú sejtekben a gátlás nagy mértékű (77,1%) volt (8. ábra A,E). A PLB-985 S1 sejtekben kisebb gátlást tapasztaltunk (45,9%; 8. ábra C, E), ami egybecseng azzal, hogy itt az oxidáz aktivitása kisebb, mint a vad típusúakban. PLB-985 X-CGD és M1 sejtekben
PMA
semmilyen
hatással
sem
volt
a
tapsigargin
kiváltotta
kalciumbeáramlásra (8. ábra B,D,E); jelezvén, hogy egy működőképes NADPH-oxidáz kell a PMA-kifejtette gátlás létrejöttéhez, és hogy a PMA az oxidázon keresztül, és nem más módon hat a kapacitatív útra. Tapsigargin adása nélkül a kapacitatív csatornák nem nyíltak ki (a 8. ábra zöld, kontrollgörbéi).
PLB-985 sejtek kapacitatív influxának vizsgálata Mn2+-kioltással A kapacitatív kalciumbeáramlás vizsgálatának egy másik módszere, hogy FURA-2 festékkel töltött sejteket kalciummentes közegben inkubálunk, majd a csatornák nyitását követően MnCl2-ot adunk a médiumba. A mangánionok ugyanúgy átjutnak a kalciumcsatornákon, mint a kalciumionok, a pumpák azonban nem kötik őket, ezért közvetlenebb
információt
kaphatunk
a
kalciumbeáramlás
sebességéről
és
kiküszöbölhetjük a kalciumpumpák okozta változásokat. A mangánionok a FURA-2 festék fluoreszcenciáját oltják ki, ezért a festék izozbesztikus (Ca2+-tól független) pontján
(360
nm)
mért
fluoreszcencia-csökkenésből
következtethetünk
a
kalciumbeáramlás sebességére. A sejtekben a kapacitatív influxot ismét 100 nM tapsigarginnal váltottuk ki, majd 10 perccel később 100 µM MnCl2 adásával vizsgáltuk a kalciumbeáramlás sebességét (világoskék, TG jelzésű görbék). A 9. ábra négy paneljének adatain jól látható, hogy a mangánbeadás mindegyik sejtvonalban ugyanakkora fluoreszcencia-csökkenést váltott ki; ismét mutatva, hogy a kapacitatív kalciumbeáramlás ugyanolyan mértékű mindegyik sejtvonalban. PMA adásával (piros, TG+PMA jelzésű görbék) vad típusú sejtekben a kalciumbeáramlás szinte teljes mértékű gátlását lehetett elérni (9. ábra A). A szuperoxidot kisebb intenzitással termelő PLB-985 S1 sejtekben csak kismértékű gátlást tapasztalhattunk (9. ábra C), míg a működő oxidázt nélkülöző vonalakban (X-CGD, M1) PMA nem befolyásolta a kapacitatív beáramlást (9. ábra B, D). Ebben a mérésben ismét párhuzamot tapasztaltunk a szuperoxid-termelési képesség valamint a kalciumbeáramlás gátlása között, ami alátámasztja, hogy a forbolészter a fagocita-oxidáz aktiválásán keresztül gátolta a kapacitatív kalciuminfluxot. A mérés
36
ideje alatt nem kezelt, csak a kalciummentes médiumban inkubált sejtekben mangán adására kismértékű fluoreszcencia csökkenést tapasztaltunk, ami származhat egyrészt kismértékű beáramlásból, másrészt a külső médiumba került festékkel történt reagálásból (9. ábra, zöld kontrollgörbék).
PLB-985 vad típus
PLB-985 X-CGD
120 Fluoreszcencia %
Fluoreszcencia %
120 100
100
80 60 40
80 60 40
0
20
40 60 idő (mp)
80
100
0
40 60 idő (mp)
80
100
80
100
PLB-985 M1
PLB-985 S1 120
120 Fluoreszcencia %
Fluoreszcencia %
20
100 80 60 40
100 80 60 40
0
20
40 60 idő (mp)
80
100
0
20
40 60 idő (mp)
9. ábra PMA hatása differenciáltatott PLB-985 sejtek tapsigargin-indukált Mn2+-influxára Ca2+-mentes H-médiumban szuszpendált PLB-985 sejtekben a mérés 2. percében 100 nM tapsigargin adásával (TG) indukáltuk a kapacitatív utat, majd 10 perccel később 100 µM MnCl2-ot adtunk (Mn2+) (világoskék görbék), és 360 nm-en követtük a fluoreszcencia változásait. Némely mintában a Mn2+-adás előtt 2 perccel 100 nM PMA-val (PMA) stimuláltuk a sejteket (piros görbék: TG+PMA). A kontroll mintákban (zöld görbék) tapsigargin helyett DMSO-t adtunk. A bemutatott görbék legalább négy mérésből kiválasztott, reprezentatív kisérleti eredmények.
37
PLB-985 sejtek fMLP-indukálta Ca2+-szignáljai Eddig a kapacitatív Ca2+-beáramlást a többi sejtfolyamattól izoláltan, tapsigarginnal kiváltva vizsgáltuk. Az oxidáz-kiváltotta gátlásnak azonban olyan fiziológiás stimulusok esetén is jelentkeznie kellene, amikor a NADPH-oxidáz és a kapacitatív út egyszerre aktiválódnak. Kisérletünkben a működőképes oxidázzal rendelkező, PLB-985 S1
sejtek
formilpeptiddel
kiváltott
kalciumszignálját
hasonlítottuk
össze
az
oxidázdeficiens, PLB-985 X-CGD sejtekével.
Ca 2+ -tartalmú médium
700
[Ca ]ic (nM)
400
400 300
2+
[Ca2+]ic (nM)
600 500
Ca 2+ -mentes médium
500
300 200
200 100
100 0
0
0
100
200 300 idő (mp)
400
500
0
100
200 300 idő (mp)
400
10. ábra Differenciáltatott PLB-985 X-CGD és S1 sejtek fMLP-indukálta kalciumjeleinek összehasonlítása Ca2+-tartalmú (A) és Ca2+-mentes (B) médiumokban FURA 2 festékkel töltött PLB-985 sejteket Ca2+-tartalmú illetve Ca2+-mentes közegben inkubáltunk, majd 1 µM fMLP-vel stimuláltuk őket (fehér nyilak). A bemutatott görbék négy kisérlet egy-egy reprezentatív eredményei.
Kalciumtartalmú médiumban a két sejtvonal fMLP-indukálta kalciumszignáljának csúcsa ugyanakkora értéket (600 nM) ért el, azonban a második fázisban az 1 µM fMLP-re oxidázaktivitással válaszoló PLB-985 S1 sejtekben a [Ca2+]ic mindig alacsonyabb maradt, mint az oxidázdeficiens sejtekben (10. ábra A). A különbség a
38
500
kalciumbeáramlás módosulásából származott, ugyanis kalciummentes közegben a két sejttípus kalciumszignálja teljesen azonos volt (10. ábra B), vagyis nem a belső raktárakból történt felszabadulás miatt különböztek. Az oxidázműködés tehát befolyásolja granulocita-szerű sejtek fiziológiás stimulusokra adott kalciumválaszait.
A NADPH-oxidáz hatása a kalciumszignálra A fenti kisérletek bizonyítják, hogy a modellként használt PLB-985 sejtvonalon a NADPH-oxidáz gátolja a kapacitatív kalciuminfluxot. Kutatócsoportunk korábbi eredményei ugyanezt az összefüggést mutatták ki humán neutrofilek tapsigarginkiváltotta kalciumbeáramlása és az oxidázműködés között. Ez alapján feltételezhető lenne, hogy humán neutrofilek olyan fiziológiás stimulusokra kapott kalciumjeleiben is különbség van oxidázzal rendelkező és deficiens sejtek között, amelyek egyszerre indukálnak szuperoxidtermelést és nyitják a kapacitatív csatornákat. Krónikus granulomatózisban szenvedő betegek sejtjeihez továbbra sem sikerült hozzájutnunk, ezért egészéges neutrofilek oxidáz-gátlószerrel (difenil-jodónium, DPI) kezelt és gátlószermentes kalciumjeleit hasonlítottuk össze (11. ábra). A NADPHoxidáz gátlószer DPI alkalmazott 5 µM-os koncentrációban 97-98 %-osan gátolja a O2.-termelést, míg csak mindössze 50%-ban az oxidáz-kiváltotta membrándepolarizációt. fMLP, mint stimulus esetén párhuzamosan aktiválódik az oxidáz és nyílnak meg a raktár-vezérelt kalciumcsatornák, ezért az fMLP-re kapott kalciumjelben már jelentkezik az oxidáz gátló hatása. Ha az oxidáz kiváltotta membrándepolarizációt DPIvel a felére csökkentjük (B), akkor a kalciumbeáramlás megszabadul a gátlás egy része alól és ez várhatóan nagyobb Ca2+-koncentrációkat eredményez a második fázisban (A). Méréseink alapján (n=10) az fMLP adását követő 2. percben, ahol a legmarkánsabb volt a DPI adására történt kalciumszint-emelkedés, a gátlószerrel kezelt mintákban az intracelluláris kalciumion-koncentráció másfélszerese volt a DPI-mentes mintákénak. Az fMLP-vel szemben egy olyan stimulus alkalmazásakor (ATP), amely kifejezett kalciumjelet vált ki ugyan, de nem aktiválja az oxidázt, nem volt különbség a DPI-vel kezelt és kezeletlen minták membránpotenciálváltozása és kalciumszignálja között.
39
membránpotenciál (mV)
800
[Ca2+]ic (nM)
700 600 500 400 300 200 100 0
-10 -20 -30 -40 -50 -60 -70 -80
0
100
200 300 idő (mp)
400
500
400
0
100
0
100
200 300 idő (mp)
400
500
membránpotenciál (mV)
0
350 [Ca2+]ic (nM)
0
300 250 200 150 100 50
-10 -20 -30 -40 -50 -60 -70 -80
0 0
100
200 300 idő (mp)
400
500
200 300 idő (mp)
400
500
11. ábra DPI hatása humán neutrofilek fMLP- és ATP-indukálta kalciumszignáljára és membrándepolarizációjára Az 5 µM DPI adását a fehér nyilak, az 1 µM fMLP (A,B) illetve 10 µM ATP (C,D) adásának időpontját a fekete nyilak jelzik. A bemutatott görbék tizenegy (A), öt (B) illetve három (C, D) mérés reprezentatív eredményei.
40
A depolarizáció és nem a szuperoxid hat a kalciumszignálra Az eddigi kisérletekben mind a modellsejteken, mind neutrofil granulocitákban bizonyítottuk, hogy egy működőképes NADPH-oxidáz szükséges a kapacitatív kalciuminflux gátlásához. Azt azonban nem tudtuk szeparálni, hogy az oxidáz által termelt szuperoxidanionok, vagy a következményes depolarizáció okozza-e a kalciumbeáramlást gátló hatást. Ennek megvizsgálására egymástól elválasztani igyekeztünk a két oxidázfunkciót. Ha a szuszpenzióban levő sejtek mellé szuperoxiddiszmutázt adtunk, akkor az extracelluláris szuperoxidtermelés teljesen megszűnt (n=4). A szuperoxidanionok ilyenkor hidrogén-peroxiddá alakulnak át. Viszont a kiváltott depolarizáció
sértetlen
marad
(n=5),
jelezve,
hogy
az
oxidáz
katalizálta
elektrontranszportot nem befolyásolta az enzim adása (12. ábra B). Ilyen körülmények között az fMLP-vel indukált kalciumszignál sem változott (n=3), jelezvén, hogy a szuperoxidgyökök nem befolyásolják a kapacitatív csatornák nyitottsági/zártsági állapotát (12. ábra A).
12. ábra Szuperoxid-diszmutáz hatása humán neutrofilek fMLP-indukálta kalciumjelére (A) és membrándepolarizációjára (B) A 12,5 µg/ml SOD adásának időpontját a fekete nyilak, az 1 µM fMLP adásának időpontját a fehér nyilak jelzik. A bemutatott görbék négy mérés egyik reprezentatív kisérletének eredményei.
Az imént
a szuperoxidanionokat semlegesítettük és a depolarizációt hagytuk
érintetlenül, a következő kisérletben viszont a K+-ionofór valinomycin adásával a
41
fentiekkel ellentétes változásokat hozunk létre, azaz a szuperoxidtermelés befolyásolása nélkül csökkentjük a depolarizáció mértékét. 2 perccel fMLP után valinomycint adva nem változott neutrofilek O2.--termelése (13. ábra B, n=3), az fMLP-indukálta depolarizáció viszont csökkent (13. ábra C, n=5): hiperpolarizálta a sejteket, és így megnövelte a Ca2+-ok befelé irányuló hajtóerejét. Ennek megfelelően valinomycin adása után 30 másodperccel az [Ca2+]ic
156.0 ±16,7%-a volt a csak fMLP-vel
O2 (nmol/10 PMN/10 perc)
stimuláltaknak (13. ábra A, n=5).
8
0
6
0
6
800
10
[Ca2+]ic (nM)
500
100
200
-10
2
.-
600
4
0 0
1
2
3 4 idő (perc)
400 300 200 100
5
6
membránpotenciál (mV)
700
300 400 idő (mp)
-20 -30 -40 -50 -60
0 0
100
200 300 idő (mp)
400
500
13. ábra Valinomycin hatása humán neutrofilek fMLP-indukálta kalciumszignáljára (A), szuperoxidtermelésére (B) és membrándepolarizációjára (C) A 3 µg/ml valinomycin adásának időpontját a fekete nyilak, az 1 µM fMLP adásának időpontját a fehér nyilak jelzik. A bemutatott három mérés reprezentatív eredményei.
A dolgozatban bemutatott kisérletek alapján nem zárható ki, hogy a kapacitatív kalcium-beáramlás gátlásáért nem a membrándepolarizáció, hanem az oxidáz valamely egyéb működése (pH, oxigénfogyás) a felelős. Az irodalomban nem ismert olyan közlemény, amely az oxigénnek közvetlen hatását mutatná ki a kapacitatív kalciumbeáramlásra, illetve amely neutrofil granulocitákban a pH és a kapacitatív kalciumbeáramlás összefüggését vizsgálná. Ugyanakkor más sejttípusokon kimutatták, hogy a sejten belüli savanyodás gátolja a kapacitatív utat ( pl. érfal simaizom: 130, illetve
42
vérlemezkék: 35). Ha ez igaz neutrofilekben is, akkor a PMA adása utáni átmeneti intracelluláris pH-csökkenés gátolhatja a thapsigarginnal kiváltott kapacitatív utat. Valinomycin hatására a PMA-kiváltotta intracelluláris savanyodás erősödik (51). Ennek mechanizmusaként
ma
azt
feltételezzük,
hogy
az
oxidáz
elektronáramának
kompenzálásában valinomycin adása miatt több káliumion és kevesebb hidrogénion hagyja el a sejtet. Ez viszont azt jelentené, hogy a nagyobb mértékű savanyodásnak gátolnia kellene –a fentiek szerint– a kapacitatív kalciumbeáramlást, és nem aktiválnia, mint ahogyan a kisérletek mutatják. Ezért nem valószínű, hogy a valinomycin a pHváltozáson keresztül fejti ki hatását a Ca2+-influxra. Az oxidáz Ca2+-beáramlást gátló hatása nemcsak szolubilis, hanem kolloid méretű stimulusok esetén is jelen lehet (78). Baktériumok felvételét a fagoszómába a fagoszóma körüli citoplazmarégió [Ca2+]-jának emelkedése követi. Ennek forrásai lehetnek a szintén a fagoszómák köré rendeződő kalciumraktárak (121), de az intrafagoszómális tér kalciumionjai is (83). Az oxidáz kalciumbeáramlást visszatartó hatásának a hiánya baktériumok felvételének vagy megemésztésének a zavaraihoz vezethet és ezáltal a krónikus granulomatózis tüneteihez járulhat hozzá.
43
Fagociták patogénölő-képességének mérésére használt tesztek A továbbiakban a NADPH-oidáz enzim baktériumölésben betöltött szerepét vizsgáltuk. Fehérvérsejtek mikrobapusztító képességének tesztelésére már számos in vitro esszét kifejlesztettek (45). Nagy változatosságuk ellenére mindegyik közös sajátsága, hogy az elölt és az élő baktériumokat igyekszik megkülönböztetni egymástól valamilyen módszerrel. Az elkülönítés ritkább esetekben szerkezeti, legtöbbször metabolikus különbségeken alapszik. Egyes tesztekben például a baktériumok 3Htimidin-felvételét mérve következtetnek az életképességükre (39), míg másokban az akridinnarancs nevű, fluoreszcens festék emissziós mintázatának a megváltozásából (37); fluoreszcens (119) vagy
látható fényben (42) mérhető anyagcseretermékek
keletkezéséből. A legadekvátabb mérések azonban - egyben a legközvetlenebbek is mégis a mikrobiológiai tesztek, amelyek közvetlenül a túlélő baktériumok számát határozzák meg. Ennek hagyományos módja, hogy neutrofilek és baktériumok szuszpenzióiból mintákat véve a fehérvérsejteket feloldják, a mintákat kihigítják, majd adott térfogatot kennek ki agar-tartalmú baktériumtáptalajra és megszámolják a kinőtt telepek számát. Feltételezik, hogy a szilárd táptalajon kinőtt telepek egy-egy baktériumsejt
osztódásaiból
származnak.
Ennek
bizonyossága
azonban
megkérdőjelezhető, ezért közelebb áll a valósághoz, ha nem sejtszámot, hanem kolóniaképző egységek (angol neve után: CFU) számát adjuk meg. Ennek a hagyományos higításos és szélesztéses módszernek azonban komoly hátrányai, hogy
rendkívül nagy a munka-, idő-
és anyagigénye; a nagymértékű
higítások miatt sokszor magasak a szórások; és a telepek kinövésére – baktériumfajtól és táptalajtól függően legalább fél-egy napot várni kell. Mindezek a kellemetlenségek kiküszöbölhetők, illetve mérsékelhetők, ha szilárd táptalaj helyett folyékony médiumban növesztjük a baktériumokat. Folyékony médiumban növesztve a sejteket gyorsan, kis térfogatokkal, kevés anyaggal és sok párhuzamossal tudunk dolgozni, ugyanakkor az eredmény is órákon belül megvan. Egy ilyen esszét fejlesztettünk ki.
44
Az új módszer háttere A teszt alapja, hogy egy minta kezdeti baktériumkoncentrációja fordítottan arányos azzal az időtartammal, ami alatt - optimális körülmények között növesztve a baktériumsejteket - a koncentráció elér egy kiválasztott értéket. Így minden mintát egy adott időtartammal (inkubációs idő, tinc) tudunk jellemezni, amely időérték ismert baktériumkoncentrációkat tartalmazó mintákból kapott kalibrációs görbe segítségével átszámolható baktériumkoncentráció-értékekre. Ugyanezen az elven működik a realtime PCR is, ahol baktériumok osztódása helyett a nukleinsavak duplikációját nyomon követve lehet meghatározni egy adott minta nukleinsav-mennyiségét. A teszt működésének alapfeltétele, hogy a vizsgált időtartam alatt a baktériumok osztódási sebessége egyenletes maradjon, azaz az exponenciálisan szaporodó fázisban legyenek. A baktériumkoncentráció nyomonkövetésének régóta ismert módja a szuszpenzió abszorbanciaváltozásainak a mérése 550-650 nm-es tartományban. Hullámhossznak 650 nanométert, határértéknek pedig A=0,2-t választottuk, ahol még az exponenciálisan növekvő szakaszban vannak a baktériumok, de ugyanakkor a jel már elég nagy ahhoz, hogy egyértelműen látható és értékelhető legyen. Ha a baktériumölési tesztben alkalmazni
kívánt
108/ml-es
baktériumszuszpenzióból
(Escherichia
coli
vagy
Staphylococcus aureus) 1:2 arányú higítási sort készítünk (1:1-től 1:512-ig), majd mindegyiket folyékony LB-médiumban 1:500-szorosára higítva több párhuzamosban, 200 µl-ként 96-lyukú fotométeres lemezre pipettázzuk, és 4-8 órán keresztül 37ºC-on rázatva követjük nyomon az abszorbanciaváltozásokat, akkor a 14. ábra A és C paneljében látható görbéket kapjuk. Ha a kapott inkubációs idők függvényében ábrázoljuk az ismert baktériumkoncentráció értékek tizes alapú logaritmusait (14. ábra B, D), akkor lineáris összefüggést kapunk. A kapott szórások nagyon kicsik, vagyis a párhuzamos minták adatai nagyon kevéssel térnek el egymástól és a növesztés megbízható eredményeket ad. A logaritmikusan ábrázolt adatokra illesztett egyenesek paraméteres képlete: [baktérium]= f* eg *tinc
(1)
, ahol tinc az inkubációs idő; e a természetes logaritmus alapja ≈ 2,71828; g az egyenes meredeksége, ami a baktériumok osztódási ütemével arányos; illetve f egy szorzófaktor.
45
14. ábra Escherichia coli (A,B) és Staphylococcus aureus (C,D) baktériumok növekedésének nyomonkövetése és a kapott adatok ábrázolása A bemutatott kisérlet esetében az egyenletek: [E. coli]= 2220,6* e-0,0365*tinc * 106/ml
(2)
illetve [S. aureus]= 4217,5* e-0,0231*tinc * 106/ml.
(3)
A függvény linearitása azt jelenti, hogy a baktériumok osztódási ideje ugyanakkora a vizsgált tartományban, és a meredekségből a baktériumok osztódásának ideje is kiszámolható a következőképpen: osztódási idő (perc) = -1 * ln(2) / g
46
(4)
Kisérleteink adataiból a következő átlagos osztódási időket számoltuk ki a két baktériumfajra: E. coli: 17,6 ± 0,32 perc (átlag ± S.E.M.; n=33); S. aureus : 28,4 ± 0,95 perc (átlag ±S.E.M.; n=68). A szinte mindig azonos osztódási ráták a kisérletek reprodukálhatóságát jelzik.
Az új módszer leírása Sterilen preparált humán neutrofil granulocitákat (107/ml, 900 µl) inkubáltunk (100 µl, 9 x 108/ml) opszonizált baktériumokkal (az opszonizálás 37ºC-on történt 5 percig, kevert humán szérummal), 37ºC-on, erős keverés mellett, rázó vízfürdőben, 30 percig. A teszt megkezdése előtt és alatt különböző időpontokban 100 µl-es mintákat vettünk 900 µl, jéghideg, saponint (1,0 mg/ml) tartalmazó H-médiumba. Az alacsony hőmérséklet a reakció leállításához kell. A saponin a baktériumokra ártalmatlan, a fehérvérsejteket azonban feloldja. Ismert baktériumkoncentrációkat tartalmazó, a kalibrációhóz szükséges mintákat is mindig készítettünk, amelyeket az ismeretlenekkel együtt, teljesen egyformán kezeltünk. Mérésenként általában 4-5 kalibrációs ponttal dolgoztunk. Staphylococcus aureus esetén az összegyűlt mintákat 20 percre lefagyasztottuk, majd felolvasztottuk, mert a saponinos kezelés önmagában nem bizonyult elegendőnek a fehérvérsejtek teljes feltárásához. Ezt követően 1:50-szeres arányban higítottuk tovább a mintákat folyékony LB-médiumban, majd alapos vortexelés után, 4-8 párhuzamossal dolgozva mintánként 200 µl-es porciókat pipettáztunk 96-lyukú lemezre. A sejteket 4-8 órán át fűthető, rázó ELISA-leolvasóban inkubáltuk, és az abszorbanciaváltozásokat 650 nm-nél,
percenkét mérve követtük
nyomon a baktériumok osztódását. A lemezen mindig inkubáltunk baktérium nélküli, csak a felhasznált oldatokat tartalmazó mintákat is annak kizárására, hogy a táptalajban felnőtt mikroorganizmusok nem szennyeződésből származnak. Az inkubációs idő leteltével a lemez egyes lyukaihoz tartozó inkubációs időket meghatároztuk és a kapott, belső kalibrációs görbe segítségével számoltuk át baktériumkoncentrációkra. A mérések végeredményeként mindig a kezdeti baktériumszám százalékos változásait (túlélő aránya) adtuk meg az időben. Bizonyos esetekben, ha a neutrofilek ölése nagyon károsodott, akkor a 30. percben kapott baktériumszám akár több mint kétszerese is
47
lehetett a kezdetinek, ugyanis a túlélő baktériumok számát nem kizárólag a neutrofilek általi ölés határozza meg, hanem az előbbinek és a baktériumok szaporodásának egyensúlyaként alakul ki.
Az új módszer megbízhatóságát vizsgáló kisérletek A teszt alapja, hogy a baktériumok az egyes mintákban azonos sebességgel osztódnak és így a minták inkubációs idejei közötti különbségek a kezdeti koncentrációk közötti különbségekből adódnak, és nem az eltérő osztódási sebességek miatt. Fontos volt azoknak a felmerült tényezőknek a vizsgálata, amelyek befolyással lehettek a baktériumok osztódásának ütemére. A 96-lyukú lemezen a minták elhelyezése nem befolyásolta a növekedés ütemét (n=3), mindenütt azonos módon fűtötte a mérőműszer a lemezt. Az LB-médium tápanyagban gazdag közeg a baktériumok számára, de kérdéses volt, hogy ha további tápanyagok jutnak az oldatba, azok nem gyorsítják vagy éppen lassítják-e a sejtek osztódását. Saponinnal feloldott neutrofilek (n=3) illetve fagyasztással szétroncsolt E. coli baktériumok (n=3) különböző higításai nem befolyásolták a baktériumok növekedési sebességét.
Saponin, az opszonizáláshoz
használt szérum, a gyakran oldószerként alkalmazott DMSO nem voltak semmilyen hatással rájuk (n=3). Minden farmakológiás kisérletnél fontos volt olyan, csak a baktériumokat és a gátlószer alkalmazott koncentrációját tartalmazó minták futtatása, amelyekkel a gátlószer baktériumokra kifejtett direkt hatását lehetett tanulmányozni. Számos szer (TPP, monenzin, kadmium) baktériumölésre gyakorolt hatását azért nem sikerült megmérnünk, mert a granulocitákra hatásos koncentrációban toxikusak voltak a baktériumokra.
Az
oxidázgáltószer
difenil-iodónium
Staphylococcus
aureus
baktériumokra hatástalan volt, viszont E. coli baktériumok növekedését gátolta. Ezt a problémát úgy küszöböltük ki, hogy
százszor nagyobb higítást alkamaztunk a
mintavételkor, mint máskor; így a baktériumok nagyon csekély
[DPI] (1 nM)
jelenlétében nőttek, ami már nem gátolta őket (n=3).
Az új módszer összehasonlítása a higításos-szélesztéses módszerrel Az új módszer megbízhatóságának a bizonyítására az ugyanabból a neutrofilEscherichia coli szuszpenzióból vett mintákban mindkét módszerrel meghatároztuk a
48
baktériumkoncentráció százalékos változásait. A higításos-szélesztéses módszer esetén a hideg, saponintartalmú H-médiumba vett mintákból H-médiumban további 1:2500szoros higításokat készítettünk, 3 lépésben, majd a kapott oldatokból 100-100 µl-es térfogatokat szélesztettünk LB-agart tartalmazó Petri-csészékre, mintánként 3 párhuzamossal. A telepek félnapos inkubáció után jelentek meg. Megszámolva és az alkalmazott higítás fokával visszaszorozva őket kaptuk meg az eredeti CFU-értékeket. Amint a 15. ábrán látható, ugyanazt az eredményt kaptuk, függetlenül az alkamazott módszertől. Cytochalasin-B (CB) lebontja a sejtvázat, nagymértékben gátolja a fagocitózist és ezáltal az ölést is. A CB ölésgátló hatása is ugyanakkora volt mindkét teszt esetén (15. ábra).
15. ábra Neutrofilek Escherichia coli-ölésének összehasonlítása két módszerrel Az ábra négy mérés egy reprezentatív eredményét mutatja. CB=cytochalasin-B (10 µM).
Sikerült tehát egy gyors, kevés időt és munkaráfordítást igénylő, félig automatizált módszert
kidolgozni,
amely
megbízhatóan
képes
fehérvérsejtek
baktericid
tevékenységét mérni. A NADPH-oxidáz neutrofil granulociták baktériumölésében betöltött szerepének vizsgálatához ezt a módszert alkalmaztuk a továbbiakban.
49
A NADPH-oxidáz kettős szerepe a baktériumölésben A fagocita oxidáz baktériumölésben betöltött jelentőségét egyértelműen jelzi az a tény, hogy az oxidázhiányos betegek gyerekkoruktól kezdve visszatérő bakteriális és gombás fertőzésekkel küszködnek. Az oxidáz-kiváltotta membrándepolarizáció és szabadgyök-termelés baktériumölésben betöltött szerepét kisérleteinkben egyrészt az oxidázműködés DPI-függésének vizsgálatával, másrészt farmakológiai kisérletekkel próbáltuk pontosabban megérteni.
Az oxidázfunkciók DPI-függése Elsőként azt vizsgáltuk,
hogyan változik a membrándepolarizáció illetve
szuperoxidtermelés a NADPH-oxidáz fokozatos (egyre nagyobb töménységű DPI-vel történő) gátlásával. Két oldékony stimulusra (PMA és fMLP) adott válaszokat mértünk: citokróm-c redukciót illetve a DiOC5(3) festék fluoreszcencia-változásait. Mind a forbolészter PMA (16. ábra), mind pedig fMLP (17. ábra) alkalmazásakor igaz volt, hogy a gátlószer (DPI) nem ugyanolyan mértékben gátolta a két oxidázparamétert. Kismértékű gátláskor (<500 nM DPI) a membrándepolarizáció alig, míg a szuperoxidtermelés jelentősen csökkent: 500 nM DPI esetén a membrándepolarizáció az eredeti 75-80%-a volt, míg a szuperoxidtermelés a gátolatlan érték 10-20%-ára esett vissza
(16.,17.ábra).
A
gátlószer
koncentrációját
tovább
emelve
a
szuperoxidtermelésben már csak kismértékű csökkenést tapasztaltunk, míg a depolarizáció további 25-30%-kal csökkent. Az alkalmazott legnagyobb [DPI] (5µM) használatakor
a
szuperoxidtermelés
97-99
%-ban
gátlódott,
ugyanakkor
a
membrándepolarizációnak mintegy a fele még megmaradt (16. ,17. ábra). A használt legtöményebb [DPI] (5 µM) esetén a membránpotenciál-méréshez használt DiOC5(3) festék fluoreszcenciája – a vártnak megfelelően – káliumionofór adására nőtt. A káliumionofór valinomycin hatására a sejtekből káliumionok áramlanak a külső térbe, velük pozitív töltések hagyják el a sejtet, így a membrán hiperpolarizálódik, amit a megnövekedett fluoreszcens értékek jeleztek.
50
16. ábra DPI hatása a PMA-indukálta O2.--termelésre (A) és membrándepolarizációra (B) 100 nM PMA adásának időpontját a fekete nyilak jelzik. Az alkalmazott DPI-koncentrációk az A és B paneleken, a görbék mellett láthatók. Az A és B paneleken az elvégzett öt kisérlet egy-egy reprezentatív eredménye, míg a C panelen statisztikai feldolgozásuk (átlag ± S.E.M) látható. ns= nem stimulált.
17. ábra DPI hatása az fMLP-indukálta O2.--termelésre (A) és membrándepolarizációra (B) 1 µM fMLP adásának időpontját a fekete nyilak jelzik. Az alkalmazott DPI-koncentrációk az A és B paneleken, a görbék mellett láthatók. Az A és B paneleken az elvégzett három kisérlet egy-egy reprezentatív eredménye, míg a C panelen statisztikai feldolgozásuk (átlag ± S.E.M) látható. ns = nem stimulált.
Nem stimulált, egészséges neutrofilek (16. és 17. ábra) és stimulált CGD-s neutrofilek (32) membránpotenciálja a két fenti stimulus (fMLP, PMA) esetén gyakorlatilag változatlan maradt. Az előző két megállapítás alátámasztja, hogy a legtöményebb [DPI]
51
alkalmazásakor a festék membránpotenciál-érzékeny maradt és hogy valóban nagymértékben depolarizálódott sejteket jelzett. A NADPH-oxidáz működésének gátlásával tehát a szuperoxidtermelés és a membrándepolarizáció nem egyformán változik. A 18. ábra mutatja be a membrándepolarizáció mértékének függését a szuperoxidtermeléstől. A görbék a 16. és 17. ábrák adatai alapján lettek kiszámolva. Minden egyes adatpont egy adott [DPI]-hoz tartozó értéket jelent. Az inger kémiai természetétől és hatásmechanizmusától függetlenül a két oxidázfunkció között ugyanazt az összefüggést kaptuk a két stimulus esetén.
A két paraméter közötti összefüggés nem lineáris, már 15-20%-os
oxidázaktivitás közel maximális mértékű depolarizációt vált ki. Ezek alapján a két oxidázparaméter nem teljes-, de nagymértékű elkülönítése lehetséges. Ha valamely neutrofilfunkció vizsgálatakor az alacsonyabb [DPI]-tartományban tapasztalunk változást, abban a NADPH-oxidáz szabadgyöktermelésének van döntő szerepe; míg a magasabb [DPI]-tartományban észlelt történésekért nagyobbrészt az oxidáz elektrogén működése felelős.
Membrándepolarizáció
100% 80% 60% PMA
40%
fMLP
20% 0% 0%
20% 40% 60% 80% Szuperoxidtermelés
100%
18. ábra A membrándepolarizáció és szuperoxidtermelés kapcsolata fMLP- vagy PMAstimulált neutrofilekben A 16. és 17. ábrák C paneljeiben kapott adatok alapján ábrázoltuk az oxidáz-indukálta membrándepolarizáció mértékét a szuperoxidtermelés függvényében úgy, hogy az adatpontok ugyanannál a [DPI]-nál mért értékeket jelentenek.
52
Az, hogy nagyon kis mértékű ionmozgás (itt: szuperoxidtermelés) is már közel maximális depolarizációt hoz létre, nem meglepő, hiszen ingerelhető sejtekben is csak az ionok törtrészének szükséges a membránon átjutni akciós potenciál létrehozásához. A 18. ábra grafikonjának az origója a CGD-s sejteknek felel meg, amelyeken a fenti stimulusok sem szuperoxidtermelést, sem membrándepolarizációt nem képesek kiváltani (32).
DPI hatása neutrofilek PMA-indukálta K+-leadására A
Segal-munkacsoport
hipotézise
alapján
az
oxidáz
által
létrehozott
membrándepolarizáció hajtja ki a káliumionokat a citoplazmából. Következő kisérleteinkben annak jártunk utána, hogy a K+-kiáramlás nagysága arányos-e a membrándepolarizáció mértékével. A K+-leadás méréséhez neutrofileket
különböző
[DPI]-k
extracelluláris térbe leadott
86
mellett
PMA-val
86
Rb-izotóppal töltött
stimuláltunk,
mértük
az
Rb-mennyiséget, majd a százalékos (DPI-menteshez
viszonyított) értékeket ábrázoltuk (19. ábra A). A
86
Rb-leadást a szuperoxidtermelés
függvényében ábrázolva (19. ábra B) nem lineáris összefüggést kapunk, a 18. ábrához hasonlóan. A káliumleadás DPI-függése nagyon hasonlít a membrándepolarizációéhoz: már 20-25%-os oxidázaktivitást a leadás
értékeket
a
86
megfelelő
Rb-leadás 70%-a kiséri. Ha a százalékos DPI-koncentrációkhoz
tartozó
86
Rb+-
százalékos
membrándepolarizáció értékek függvényében ábrázoljuk, akkor a két paraméter között lineáris összefüggést kapunk (19. ábra C). A 19. ábra eredményei alapján a káliumkiáramlás mértéke az oxidáz által létrehozott depolarizáció mértékével arányos.
53
19. ábra DPI hatása humán neutrofilek PMA-indukálta 86Rb+-leadására Az egyes százalékos 86Rb-leadási értékek a DPI-koncentrációk (A), illetve a hozzájuk tartozó, százalékos szuperoxidtermelés- (B) illetve membrándepolarizáció-értékek (C) függvényében ábrázolva.
Szabadgyök-termelés baktériumölés alatt Az
eddigiekben
szolubilis
stimulusok
alkalmazásával
plazmamembránon
keresztüli
szuperoxid-termelést,
vizsgáltuk
a
teljes
membrándepolarizációt
és
káliumleadást. A továbbiakban az oxidázfunkciókat bakteriális stimulusok (Escherichia coli és Staphylococcus aureus) esetén vizsgáltuk. A baktériumsejtek bekebelezésekor a NADPH-oxidáz nem a teljes sejtfelületen aktiválódik, hanem csak a lefűződő fagoszómák membránjában, ahol a fenti paraméterek mérése sokkal problematikusabb, mint extracellulárisan. A baktériumölés alatti szabadgyök-termelés mérésére a citokróm-c esszé nem alkalmas, mert azzal csak a sejten kívüli térbe termelt szabadgyököket mérjük, a fagoszómába leadottakat nem (citokróm-c-vel csak egy minimális jelet kapunk baktériumok
esetén,
amit
feltehetően
a
lefűződő
fagoszómából
kiszabadult
szabadgyökök okoznak). Ezért a baktériumölés alatti gyöktermelés nyomonkövetésére egy másik módszert alkalmaztunk, amely az intra- és extracelluláris termelést egyaránt méri. A lucigenin nevű festék átdiffundál a sejtmembránokon és reakcióba lép a keletkezett szabadgyökökkel. Ennek hatására fotonokat bocsát ki, amit regisztrálni tudunk. Így az időegység alatt kapott kemilumineszcens jel arányos a szabadgyök-
54
termelés sebességével (szemben a citokróm-c mérés elvével, ahol az eredmény egy kumulatív görbe). Ha az új baktériumölés-esszé körülményei között, 51 µg/ml lucigenin jelenlétében stimuláltunk neutrophileket baktériumokkal, a fagocitákban szinte azonnal aktiválódott a NADPH-oxidáz, és a mérés 30 perces időtartama alatt végig működött (20. ábra).
0,16
0,25
0,14
0,20
0,10
RLU
RLU
0,12 0,08
0,15 0,10
0,06 0,04
0,05
0,02 0,00
0,00 0
10 20 idő (perc)
30
0
10 20 idő (perc)
30
20. ábra Humán neutrofilek baktériumölés alatti szabadgyök-termelése 107/ml neutrofil granulocitát 1:10 arányban (PMN:baktérium) stimuláltunk opszonizált Staphylococcus aureus (A) illetve Escherichia coli (B) baktériumokkal. A szabadgyöktermelést lucigenin-alapú kemilumineszcenciával mértük és az adatokat relatív lumineszcens egységben (RLU) adtuk meg. A baktériumok adásának időpontját a fehér nyilak jelzik. A bemutatott görbék öt (S.aureus) illetve három (E.coli) mérés reprezentatív eredményei. A továbbiakban szükségünk volt azonban arra, hogy a baktériumölés alatti szabadgyöktermelésről pontos számértékeket kapjunk. A kemilumineszcens jel közvetlenül csupán időegység alatt becsapódott fotonszámból származtatott relatív lumineszcens értékeket szolgáltat, amelyeket relatív lumineszcens egységben (angol neve után: RLU) adunk meg. Ezért szükségünk volt a kemilumineszcens jel
55
kalibrálására. Erre a célra a citokróm-c redukciós esszét használtuk fel, ugyanis annak eredményei jól kvantifikálhatók a citokróm-c abszorpciós koefficiensének a segítségével (21 mM-1*cm-1). Ha mindkét módszerrel megmérjük különböző oxidázaktivitású mintákban a szabadgyöktermelést, akkor a számértékek segítségével egy kalibrációs görbét kapunk, amely segítségével a relatív lumineszcens értékeket pontos, anyagmennyiség/időegység értékekké számolhatjuk át. A kalibráláshoz PMAval stimulált neutrofilek SOD-gátolható szabadgyöktermelését (extracelluláris) mértük, különböző [DPI]-k mellett. Az elvégzett hat mérés mindegyikében szép, egyértelműen lineáris összefüggést kaptunk a vizsgált tartományban a két módszerrel mért értékek között (21. ábra). A különböző preparátumokon elvégzett mérések eredményei nagy variabilitást mutattak, ezért minden egyes méréshez aznapi, aktuális kalibrációt végeztünk.
10 5 0
0 50 100 200 500 1000 NoStim
0,14 0,12 0,10
25 20
6
0,16
0,08
15 10 5
.-
15
SOD-gátolható ROS-termelés (RLU)
O2.-- (nmol/106 PMN)
20
0,18
O2 (nmol/10perc/10 PMN)
0 50 100 200 500 1000 NoStim
25
0,06
0 0,0
0,04 0,02 0,00
0
2
4 6 idő (perc)
8
10
0
2
4 6 idő (perc)
8
10
0,2 0,4 0,6 0,8 Szabadgyök-termelés 6 (RLU/10perc/10 PMN))
1,0
Kalibráló egyenlet : O2.- (nmol) = 22,303 * ROS-termelés ( /10 perc/ 106 neutrofil)
21. ábra A kemilumineszcens jel kalibrálása 106/ml neutrofil-szuszpenzióban mértük PMA-stimulált neutrofilek extracelluláris szabadgyöktermelését, különböző [DPI]-k jelenlétében, citokróm-c redukcióval (A) és lucigenin-alapú kemilumineszcenciával (B). A számok az alkalmazott [DPI]-t jelentik nM-ban. A 100 nM PMA adásának időpontját a fehér nyilak jelzik. Az A ás B panel adatai alapján kapott lineáris összefüggést és a kalibrációs egyenes egyenletét mutatja a C panel. Az itt bemutatott eredmények 6 mérés reprezentatív görbéi. (NoStim= nem stimulált minták; ROS=reaktív szabadgyök; RLU=relatív lumineszcens egység; SOD= szuperoxid-diszmutáz)
56
Az előzőek alapján a baktériumok-indukálta szabadgyöktermelés értékei: S. aureus: 2,83 ± 1,1 nmol/10 perc/106 PMN (n=4; átlag ± S.E.M.) E. coli: 3,42 ± 0,93 nmol/10 perc/106 PMN (n=4; átlag ± S.E.M.) Ezek az értékek jól egyeznek a baktériumölés alatti oxidázaktivitás mérésére alkalmas másik módszerrel, az oxigénfogyasztás-méréssel kapott adatainkkal: E. coli: 3,7 ± 2,6 nmol O2/10 perc/106 PMN (n=3; átlag ± S.E.M.) (S. aureus baktériumokkal nem végeztünk ilyen méréseket.)
A fagoszómamembrán potenciálváltozásaira vonatkozó meggondolások A baktériumölés alatti szabadgyök-termeléssel szemben a fagoszómamembrán membránpotenciál-változásainak közvetlen megmérésére nem volt módunk. A teljes sejten történő membrándepolarizáció vizsgálatához sikeresen használt DiOC5(3) festék nem bizonyult alkalmasnak a fenti cél megmérésére. Közvetett megfigyeléseinkkel azonban növeljük a valószínűségét annak, hogy a fagoszóma speciális környezetében is igazak az oxidázra a plazmamembránban tett megfigyelések (18. és 19. ábrák). A fagoszómamembrán a plazmamembránból fűződik le, így – legalábbis eleinte – ioncsatorna- és transzporter-összetétele megegyezik a sejthártyáéval. Az fMLP-stimulálta szuperoxidtermelés neutrofilekben (3,1 ± 0,05 nmol O2.-/10 perc/106 neutrofil; n=3) mintegy ötöde-hatoda a PMA-indukálta szuperoxidtermelésnek (18,05 ± 0,77 nmol O2.-/10 perc/106 PMN; n=81), de a depolarizáció és szuperoxidtermelés közötti összefüggés nagyon hasonló (18. ábra). A baktériumok pedig az fMLP-vel nagyságrendileg azonos szuperoxidtermelést (ld. fent) indukálnak neutrofilekben.
57
Összehasonlítottuk forbolészter illetve baktériumok, mint stimulusok esetében az egységnyi membránfelületre vonatkoztatott szabadgyök-termelést. 100 nM PMA esetében a teljes membránfelületen aktiválódik a NADPH-oxidáz, és a szabadgyöktermelés mintegy 85-90%-a extracelluláris. A szabadgyök-termelés értékeit elosztva a neutrofilek összfelületével (egy neutrofil sejt felületét 450 µm2-nek vettük) kapjuk meg, hogy a forbolészter 17,4 ± 6,8 O2.- pmol/10 perc/µm2 oxidázaktivitást váltott ki egységnyi membránfelületen. Baktériumok esetén az aktív membránfelületet egy részecske átlagos felületének és a fagocitált részecskék számának a szorzataként számoltuk ki. Staphylococcus aureus baktériumok esetén 4,0 µm2-t, míg E. coli-nál 10 µm2-t vettünk átlagos felületnek baktériumonként. A fagoszóma kezdetben szorosan ráfűződik a baktériumra, annak kontúrját követve, így az aktív membránfelület kezdetben valóban a bekebelzendő részecske nagyságával azonos; később azonban a granulumfúzió miatt megnő (104). A bekebelezett részecskék számát úgy határoztuk meg, hogy a kezdeti, ismert koncentrációjukból kivontuk a nem fagocitáltakét. A fagocitálatlan baktériumok számának meghatározásához differenciál centrifugálással különítettük el a fehérvérsejteket a baktériumoktól, majd a felülúszóból vett mintákat növesztettük, kalibráló minták jelenlétében az új baktériumnövesztési tesztünk segítségével. Egy neutrofil átlagosan 9,2 ± 0,4 darab (n=4) E. coli-t és 9,2 ± 0,5 darab S. aureus baktériumot (n=3) fagocitált 30 perc leforgása alatt. A PMA-kiváltotta felületegységnyi oxidázaktivitásnak 130,9 ± 66,7%-át (n=3) indukálták Escherichia coli baktériumok, míg 202,6 ± 15,4 %-át (n=3) Staphylococcus aureus baktériumok. Beleszámítva azt, hogy a fagoszómamembrán felülete nő a granulumok fúziója nyomán, a baktériumok- és a forbolészter-stimulálta felületegységre számított oxidázaktivitás nagyon hasonló mértékűnek adódik.
Humán neutrofilek baktériumölésének DPI-függése Az előzőekben a membránpotenciál és a szuperoxidtermelés között sajátos összefüggést
bizonyítottunk
be
szolubilis
stimulusok
esetén,
amely
nagy
valószínűséggel baktériumok fagocitózisakor is fennáll. Ezek alapján vizsgáltuk a következőkben a fehérvérsejtek baktériumölését, különböző [DPI]-k mellett (22. ábra). Az új, baktériumöléses teszt beállításainak megfelelően inkubáltunk neutrofileket
58
tízszeres
feleslegben
adott
Escherichia
coli
vagy
Staphylococcus
aureus
baktériumokkal, különböző mennyiségű DPI jelenlétében, és a 30 perces inkubáció után életben maradt baktériumkoncentrációkat adtuk meg a kiindulási érték százalékában. DPI nem befolyásolta Staphylococcus aureus baktériumok életképességét. Escherichia coli baktériumok növekedésére gátlólag hatott, amit a higítás fokának százszorosra növelésével sikerült kiküszöbölni, ugyanis az ekkor kapott végkoncentrációkban (<5 nM) már nem volt szignifikáns hatása a baktériumok növekedésére. A NADPH-oxidáz indukálta szuperoxidtermelés és membrándepolarizáció közötti, a 18. ábrán bemutatott öszefüggés alapján a baktériumölés DPI-függésének a mérésével a két oxidázparaméter baktériumölésben betöltött szerepéről nyerhetünk információkat. Amint a 22. ábrán látható,
DPI
mindkét
baktériumfaj
által
indukált
szabadgyök-termelést
koncentrációfüggően gátolta – hasonló mértékben, mint a szolubilis stimulusok esetén (16. és 17. ábra).
100%
80%
80%
60%
60%
40%
40%
20%
20%
0% 1
10
100
1000
100%
200%
80%
160%
60%
120%
40%
80%
20%
40%
Szuperoxid-termelés
100%
0% 10000
0% 1
[DPI] (nM)
10
100 1000 [DPI] (nM)
Baktériumok túlélése
Staphylococcus aureus
Baktériumok túlélése
Szuperoxid-termelés
E. coli
0% 10000
22. ábra DPI hatása neutrofilek baktériumölésére Neutrofil granulocitákat inkubáltunk opszonizált baktériumokkal az új, baktériumölési teszt körülményeinek megfelelően, különböző [DPI]-k mellett. A grafikonok baloldali ordinátáin a baktériumölés alatti szabadgyök-termelés van megadva a DPI-mentes érték százalékában. A jobboldali ordinátákon a túlélő baktériumok koncentrációi láthatók a kezdeti százalékában. Az elvégzett kisérletek n=3 (E. coli O2.-); n=5 (E. coli-ölés és S. aureus O2.-) illetve n=10 (S. aures-ölés) mérés átlagai ± S.E.M.
59
Staphylococcus aureus baktériumok túlélése nagymértékben függ
az oxidáz
aktivitásától (22. és 23. ábra). Teljes mértékű NADPH-oxidáz működés mellett a kezdeti baktériumszámnak átlagosan csak a 6,7%-a marad meg a 30 perces inkubáció végére. 500 nM DPI jelenlétében a membrándepolarizáció még közel változatlan (az eredeti mintegy 80%-a: 16. és 17. ábrák), ugyanakkor a szabadgyök-termelés már csak a gátolatlan érték 10-20%-a (16. és 17. ábrák). Ilyen körülmények között
a túlélő
Staphylococcus baktériumok száma már 89,4%-a a kezdetinek a teszt végére (22. ábra). A baktériumölésnek ez a nagymértékű károsodása a reaktív gyököknek, mint kémiai anyagoknak a Staphylococcus baktériumok elpusztításában betöltött fontos szerepére utal.
Baktériumok túlélése
200% Staph. aureus
160%
Escherichia coli 120% 80% 40% 0% 0%
20%
40%
60%
80% 100%
Szabadgyök-termelés
23. ábra E. coli és S. aureus baktériumok túlélése a szuperoxidtermelés függvényében A grafikon a 20. ábra mérési eredményei alapján készült. Az adatpontok egy adott [DPI]-nál mért értékeket jelentenek és a túlélő baktériumok értékeit ábrázoltuk a hozzájuk tartozó szabadgyök-termelési adatok függvényében. Az ordinátán a baktériumölési teszt 30. percében élve maradt baktériumkoncentrációk vannak megadva a kiindulási értékek százalékában. Az abszcisszán a 30 perces teszt alatt a baktériumok által indukált szabadgyök-termelési értékek láthatók, a DPI-mentes adathoz viszonyítva.
60
Az oxidázműködés további gátlásával az alkalmazott legmagasabb DPI-koncentráció jelenlétében (5 µM) a szabadgyök-termelés – csak kismértékben ugyan – az eredeti érték néhány százalékára csökkent, a membrándepolarizáció viszont mintegy 30 %-os csökkenéssel a DPI-mentes érték felére zuhant (18. ábra). Ilyen körülmények között a Staphylococcus baktériumok száma a teszt 30 perce alatt megduplázódott; jelezvén, hogy a baktériumölés ezen a szakaszon is tovább károsodott (22. ábra). Minthogy a szuperoxidtermelés ezen a szakaszon alig változott, a depolarizáció ellenben jelentősen csökkent, ezért a baktériumölésnek az itt kapott károsodása a membránpotenciálváltozások fontosságát hangsúlyozza a folyamatban. Escherichia coli baktériumok elpusztítása minimális mértékben volt érzékeny DPI-re (22. és 23. ábra). Bizonyos baktériumok (S. aureus) sikeres elpusztításában az oxidáz mindkét funkciójának fontos szerepe van, ugyanakkor más fajoknál egyik sem játszik döntő szerepet (E. coli, 22. ábra).
Cink hatása neutrofilek S. aureus-ölésére Az oxidázindukálta szuperoxidtermelés és depolarizáció baktériumölésben betöltött szerepének
megértésébe
enged
bepillantást,
ha
a
sejtek
baktériumölését
a
protoncsatorna-gátlószer cink jelenlétében vizsgáljuk. Túlzott mértékű depolarizáció gátolja az oxidázműködést (18). Zn2+ adásakor gátoljuk a protonáramot, és ezáltal lassítjuk az oxidáz töltéskompenzációját, ami gyorsabb és nagyobb depolarizációt okoz (24. ábra A). A gyorsabb és nagyobb mértékű membrándepolarizáció ugyanakkor gátolja az oxidáz szuperoxidtermelését (24. ábra B). Így egy gátlószer adásával a két oxidázparaméter ellentétes irányú változásait idézhetjük elő: csökkenthetjük a szuperoxidtermelést és növelhetjük a membránpotenciál-változásokat; és ilyen körülmények között vizsgálhatjuk a baktériumölésre kifejtett hatását. Kisérletünkben 10 µM
cinket
alkalmaztuk,
amely
már
jelentős
változást
membrándepolarizációban illetve a szuperoxidtermelésben.
61
idézett
elő
a
80 100
40
200
300
400
500
600
idő (mp)
20 membránpotenciál (mV)
9
O2.- (nmol/10 perc/106 PMN)
60
10 0
0 -20 -40
8 7 6 5 4 3 2 1 0
-60
0
3
6
-80
9 idő (perc)
12
15
24. ábra Zn2+ hatása neutrofil granulociták PMA-indukálta membrándepolarizációjára (A) és szuperoxidtermelésére (B) (A) és (B): 4-4 mérés reprezentatív görbéi láthatók. 100 nM PMA adását fehér nyilak, 10 µM ZnSO4 adását fekete nyilak jelzik.
Magasabb cinkkoncentrációk toxikusak a baktériumokra, ezért nem tudtuk volna megmérni hatásukat a baktériumölésben. A 25. ábrán látható kisérletben kezeletlen, 5 nM
DPI-vel
illetve
10
µM
Zn2+-kel
kezelt
neutrofilek
PMA-kiváltotta
membrándepolarizációját, valamint Staphylococcusok-indukálta szuperoxidtermelését illetve Staphylococcus-ölését hasonlítottuk össze. DPI kismértékben (19,6%) gátolta a szuperoxidtermelést, nem változtatott jelentősen a membrándepolarizáció mértékén (a PMA-s érték 95,9%-a) és gátolta a baktériumölést (a kezdeti 21,3%-a). 10 µM ZnSO4 adásakor a szuperoxidtermelés gátlása egy kicsivel nagyobb volt (30,8%), mint a DPInél.
Befolyásolatlan
szuperoxidtermelés
membrándepolarizáció
hasonló
mértékű
gátlása
mellett hasonló
azt
várnánk,
csökkenést
hogy
a
okozna
a
baktériumölésben. Zn2+ azonban gyorsította a membrándepolarizáció sebességét és növelte amplitúdóját (a PMA-s 131,7%-a), ugynakkor – a csökkent szuperoxidtermelés ellenére – egyáltalán nem gátolta, sőt nagyon kis mértékben ugyan, de szignifikánsan javította a baktériumok eliminációját (a kezdeti 3,5%-a) (25. ábra).
62
5 nM DPI
10 uM Zn
140% [S. aureus] (a kezdeti %-ában)
A csak PMA-val stimulált %-ában
kontroll 120% 100% 80% 60% 40% 20% 0% membrándepolarizáció
szuperoxidtermelés
40% 30% 20% 10% 0% Baktériumok túlélése
25. ábra Zn2+ és DPI hatásai neutrofilek membrándepolarizációjára, szuperoxidtermelésére és Staphylococcus aureus ölésére A) Humán neutrofileket 2 percig előinkubáltunk 5 nM DPI illetve 10 µM ZnSO4 jelenlétében, majd 100 nM PMA adását követően mértük az 5 perc alatti O2.--termelést (citokróm-c esszé) illetve a potenciálváltozás nagyságát. B) Neutrofil granulocitákat inkubáltunk Staphylococcus aureus baktériumokkal az új, ölési teszt körülményeinek megfelelően, és a 30. perc végén életben maradt baktériumsejtek számát a kezdeti koncentráció százalékában ábrázoltuk. Az ábrán a ’kontroll’ kifejezés a csak PMA-val (A), illetve csak baktériumokkal (B) stimulált mintákat jelenti. [Zn2+]: 10 µM; [DPI]: 5 nM. A bemutatott eredmények 3 kisérlet átlagai ± S.E.M.
Megnövelt membrándepolarizáció, változatlan szuperoxidtermelés mellett javítja a fehérvérsejtek baktériumölésének hatékonyságát. Ez a megfigyelés újfent
az
elektrofiziológiai változások baktériumölésben betöltött fontos szerepére utal. Zn2+ a membrándepolarizáció növelésén keresztül gyorsítja a sejtek 86Rb-leadását is (1).
63
Megbeszélés Eredményeink szerint a O2.-- termelés indukálása jelentős mértékű depolarizációt vált ki vad típusú PLB-985 sejtekben, neutrofil granulocitákhoz hasonlóan. Ezzel szemben a NADPH-oxidázt aktiváló stimulusok semmilyen hatással sincsenek a PLB-985 X-CGD sejtek membránpotenciáljára. Így a PLB-sejtek megfelelő modellnek bizonyulnak a NADPH-oxidáz aktiválódását kisérő elektrofiziológiai változások tanulmányozására. Dolgozatom első részének eredményei alapján egyértelmű összefüggést mutattunk ki a kapacitatív kalciumbeáramlás és a O2.- -termelés illetve membrándepolarizáció között. A Ca2+-beáramlás csökkent a vad típusú illetve a vad típusú gp91phox-szal transzfektált PLB-985 X-CGD sejtekben (S1 sejtvonal). A kalcium- illetve mangánbeáramlás viszont egyáltalán nem gátlódott a gp91phox hiányában (X-CGD vonal) illetve egy olyan mutáns gp91phox jelenlétében, amely képtelen volt elektrontranszportra (M1 vonal). Neutrofil granulocita-szerű sejtekben tehát a kapacitatív kalciumbeáramlás gátlásához szükséges egy működőképes NADPH-oxidáz. Ezek a kisérleti eredmények összhangban vannak korábbi, gátlószerekkel végzett eredményeinkkel (32), amelyek egyértelműen mutatják, hogy a NADPH-oxidáz elektrogén működése csökkenti a kalciumionok elektrokémiai grádiensét, és ez okozza a Ca2+-beáramlás gátlását. Működőképes oxidáz hiányában a protein-kináz C aktivátor PMA nincsen hatással a kalciumbeáramlásra, ezért valószínűtlen, hogy a protein-kináz C közvetlenül befolyásolná a kapacitatív csatornákat. Adataink ezért eltérnek azoktól az eredményektől, amelyek a PKC közvetlen hatását mutatták ki a kapacitatív kalciumcsatornákra keratinocitákban és mezangiális sejtekben (38, 87, 88). Lehetséges, hogy a kapacitatív út szabályozása a különböző sejttípusokban eltérő módon történik. A korábbi publikációk egyikében sem mértek membránpotenciált, holott O2.--termelés mezangiális sejtekben is detektálható (4). Az eddigi adatok arra utalnak, hogy CGD-s neutrofilekben a kalciumforgalom jelentősen módosul. Azontúl, hogy a tapsigarginnal kiváltott raktárürülést követő kalciumbeáramlásban
észleltünk
különbségeket,
az
fMLP-vel
kiváltott
kalciumszignálok is különböztek egymástól. A fenntartott fázisban az intracellulráis kalciumkoncentráció magasabb volt mind az oxidázhiányos CGD-sejtekben, mind a
64
DPI-vel erősen gátolt elektrontranszoprttal rendelkező neutrofilekben, mint a gátolatlan, vad típusú sejtekben. A hatás csak az oxidázt aktiváló stimulusokra jellemző, mert a szuperoxidtermelést nem indukáló ATP esetén nem tapasztaltunk különbséget vad típusú illetve oxidázhiányos PLB-sejtek kalciumszignáljai között. Kisérleteinkben 100 nM-os koncentrációkülönbséget mértünk vad típusú és CGD-s sejtek [Ca2+]ic-i között. Ennek a különbségnek a biológiai jelentőségét latolgatva két dolgot érdemes figyelembe venni. 1. DPI legmagasabb koncentrációja a O2.--termelést 98%-ban, míg a membrándepolarizációt csak 50%-osan gátolta. CGD-s sejtekben (a gp91phox teljes hiányában) az oxidázt stimuláló ágensek nem voltak hatással a mebránpotenciálra (32. hivatkozás, 3. ábra). Ezért a CGD-s sejtek kalciumjelének változását valószínűleg alulbecsültük a mi modellünkben. 2. A mi, sejtszuszpenziókon végzett méréseink a citoszólikus tér átlagos [Ca2+]-ját regisztrálták. Bizonyos sejten belüli területeken azonban (mint például a plazmamembrán alatti régió) a helyi [Ca2+] az átlagosnál jóval magasabb lehet (86). A normálistól eltérő kalciumbeáramlásnak számos funkcionális következménye lehet CGD-s neutrofil granulocitákban. Mind a spontán, mind a stimulált apoptózis CGD-s betegek neutrofiljeiben lassabb, mint az egészségesekéiben (62). Számos sejttípusban a kalciumionok apoptózist serkentő hatással rendelkeznek. Neutrofil granulocitákban ezzel szemben az [Ca2+]ic emelkedése gátolja az apoptózist (132). Lehet, hogy a CGD-s sejtekben megfigyelt késleltetett apoptózis a megnövekedett kalciumbeáramlás következménye. A megemelkedett [Ca2+]ic aktiválja a foszfolipáz A2-t (127) és növeli számos citokin de novo szintézisét. Az intracelluláris Ca2+-koncentráció 50-100 nM-os megemelkedését az IL-8 kemotaktikus vegyület szintézisének és szekréciójának jelentős megnövekedése követi (71). Így lehetséges, hogy a késleltetett apopotózis és az IL-8 megemelkedett szekréciója
hozzájárul
a
krónikus
granulomatózisra
jellemző
granulómák
kialakulásához. A dolgozat második felében a NADPH-oxidáz baktériumölésben betöltött szerepét vizsgáltuk meg közelebbről. Kisérleteink eredményei alapján nemlineáris összefüggést állapítottunk meg egyrészt a O2.- -termelés, másrészt a membrándepolarizáció, a K+leadás és a baktériumölés között. Igen kis mértékű O2.--teremlést már jelentős
65
depolarizáció és K+-leadás kisér: a maximális K+-leadás 38%-a zajlik már amikor a O2.-teremlés még a maximális érték 5%-nál kisebb. Minthogy a káliumionok
a
töltéskompenzálás mindössze 5-6 %-áért felelősek, kiszámítható, hogy ebben a kezdeti fázisban az elektronkiáramlás mintegy felét káliumionok kompenzálják. Kisérleteinkben -60 mV nyugalmi membránpotenciált mértünk neutrofilekben, ami jól egyezik korábbi adatokkal (19). A nyugalmi membránpotenciál közelsége a kálium egyensúlyi potenciáljához
(-80
mV)
jelzi,
hogy
nyugalmi
körülmények
között
a
káliumkonduktancia dominál. Ezt a következtetést megerősíti az a megfigyelés is, hogy 5 µM DPI jelenlétében a protontranszoprtot gátló cink nincs hatással a membránpotenciálra. A neutrofilek nyugalmi, viszonylag magas K+-konduktanciája azonban még mindig korlátozza a káliumionok mozgását, és a membránpotenciál hirtelen megváltozását eredményezi, ha a NADPH-oxidáz aktiválódik. Kisérleteink szerint a maximális depolarizáció mintegy 50%-a (30-50 mV nagyságúra becsüljük) ebben a fázisban történik. A baktériumok elpusztítása komoly mértékben károsodik ilyen kis mértékű O2.- -teremlés mellett, amint ezt a Staphylococcusok 200%-os túlélése is mutatja. Mérsékelt mennyiségű O2.--teremlés mellett (a maximális 5-20%-a között) a membrándepolarizáció és a káliumleadás már csak kis mértékben változik. Az elektrogén protonkivezető utak működése membránpotenciál-függő és -a pontos kisérleti körülményektől függően- 20-40 mV-tal a sejtek nyugalmi membránpotenciálja feletti küszöbértékkel rendelkeznek. Minthogy a csatornák nyitódásai valószínűségi események, a O2.--teremlésnek
ebben a tartományában a protonvezető csatornák
valószínűleg fokozatosan nyílnak ki, és az elektrontranszport töltéskompenzációját egyre inkább a protonok látják el. A neutrofilek baktériumölő képessége jelentősen növekszik, amit a Staphylococcus baktériumok túlélésének drasztikus, 200%-ról 90%-ra történő csökkenése is jelez.
Feltételezve, hogy az oxidázmolekulák és az
iontranszporterek aránya nem különbözik jelentősen a plazmamembránban és a lefűződő fagoszóma membránjában, a baktériumölés és a membránpotenciál-változás illetve káliumleadás kapcsolatát vizsgáltuk. Mindkét összefüggés lineáris volt, ami az elektrogén oxidáz indukálta depolarizáció és káliumleadás meghatározó szerepét jelzi a baktériumölés folyamatában. Érdemes megjegyezni, hogy a membránpotenciál és a káliumleadás között lineáris összefüggést kaptunk, ami a membránpotenciál mért
66
tartományában (-20 és + 60 mV között) állandó káliumkonduktanciát feltételez. Ez az utóbbi megfigyelés egybecseng egy nemrég megjelent közlemény adataival, amely PMA-aktivált neutrofilekben -30 mV membránpotenciálnál egy kifelé irányuló áram megjelenéséről tudósított (1). Ennek a kisérletnek azonban számos részlete vitatott (20). Végül, amikor a O2.--teremlés
a maximális érték 20%-ánál magasabb, a
membránpotenciál-változás alig módosul már és a káliumleadás is már csak az elektronkiáramlás 1-2%-át kompenzálja. Aktivált eozinofilekben, ’current-clamp’ körülmények között, a membránpotenciál értéke a proton equilibrium-potenciálját követte, függetlenül attól, hogy káliumionok voltak-e vagy sem a pipettaoldatban (3). Ezek az eredmények jelzik, hogy egy teljes mértékben aktivált oxidáz esetében a protonkonduktancia jóval meghaladja más ionok vezetőképességét. Ezért nagymértékű O2.--teremlés esetén a protonok a domináns töltéskompenzáló ionok. Stabil membránpotenciál esetén nincs lényeges változás az ionokra ható hajtóerőben, ezért nem valószínű, hogy a fagoszóma ionösszetétele jelentős mértékben változna; kivéve a szuperoxidot és a protonokat. Ugyanakkor Staphylococcus baktériumok túlélése 90%ról 5%-ra csökken (azaz neutrofilek baktériumölő-képessége jelentősen javul), miközben a O2.--teremlés a teljes mérték 20%-áról tovább nő és maximális lesz. A fagoszóma látszólag stabil elektrofiziológiai körülményei között a baktériumölés nagymértékű, a [O2.-]f és [H+]f növekedésével párhuzamos javulása a H+, O2.- és származékai kémiai hatásának tudható be. Kisérleteinkben a változtatott paraméter a O2.--teremlés volt, amit az oxidáz gátlószerének egyre növekvő koncentrációban történt alkalmazásával változtattunk. Az előzőekben részletezett megfigyelések a O2.--teremlés beindulásának és növekedésének felelhetnek meg fagocitózs alatt, partikuláris stimulus alkalmazása esetén. Szerintünk a fagocitózis kezdetén a káliumkiáramlás dominál, ami káliumionok feldúsulását és a fagoszómális pH átmeneti megemelkedését teszi lehetővé (1, 116). A folyamat előrehaladtával a protonkiáramlás fog dominálni és a fagoszóma savanyodni fog (1, 116). A magas DPI-koncentráció jelenlétében végzett kisérlet olyan pathológiai szituációk szempontjából fontos, amikor a neutrofilek alacsony oxigén tenzió jelenlétében aktiválódnak, mint például tályogok belsejében vagy csekély mértékben perfundált területeken. Amikor az oxigén hozzáférhetősége korlátozza a NADPH-
67
oxidáz elektrontranszportját, akkor a membrándepolarizáció és az ezt követő ionmozgások válhatnak kritikussá a patogének ellen vívott harcban. Az eddig elmondottakat összegezve elmondhatjuk, hogy a bemutatott adatok kisérleti bizonyítékokat szolgáltatnak arra, hogy a depolarizáció és a másodlagos ionmozgások, valamint a termelt O2.--anionok és származékai egyaránt fontos szerepet játszanak bizonyos baktériumok sikeres elpusztításában. A kétféle mechanizmus hozzájárulása a sikeres baktériumöléshez függhet a pontos körülményektől illetve a szóbanforgó baktériumfajtól. A protoncsatorna-gátlószer, cink jelenlétében végzett mérések eredményei arra utalnak, hogy a membrándepolarizáció növelése korrigálhatja a szabadgyök-termelés baktériumölés
javítása
csökkenése
következtében
ioncsatornák
működésének
romlott
baktériumölést.
módosításán
alapvetően új koncepció lenne a fertőző betegségek elleni terápiában.
68
keresztül
A egy
Következtetések Doktori
munkámban
a
fagocita
NADPH-oxidáz
elektrogén
működésének
következményeit két szempontból vizsgáltam: 1) a sejtek kalciumforgalmára gyakorolt hatást, valamint 2) a baktériumölésben betöltött szerepet. Ez utóbbi kérdés vizsgálatához beállítottam egy új baktériumölési tesztet. 1) Kutatócsoportunk korábbi eredményei (32, 34) kimutatták, hogy a NADPH-oxidáz aktiválása neutrofilekben gátolja a kapacitatív kalciumbeáramlást, a lehetséges mechanizmus azonban kérdéses maradt. Doktori munkámban az oxidáz és a kapacitatív út viszonyának részletesebb megértéséhez
PLB-985 modellsejteken végeztem
kisérleteket. Rendelkezésemre állt a vad típusú sejtvonal (a neutrofilekkel összehasonlítható
mértékű
szuperoxidtermeléssel
és
kifejezett
membrán-
depolarizációval); az oxidázhiányos CGD-modell vonal, illetve egy működésképtelen oxidázt kifejező vonal (M1), amelyekben mindkét vizsgált oxidázfunkció teljes mértékben károsodott. Valamint az az eredetileg oxidázhiányos vonal, amelybe visszajuttatták a működő NADPH-oxidázt (S1); ezek a sejtek a vad típusú sejtek szuperoxidtermelésének és membrándepolarizációjának csak mintegy egynegyedét produkálták. PLB-sejtek és neutrofilek Ca2+-beáramlásán végzett mérések eredményei a következők: ●
mindegyik PLB-985 sejtvonalban tapsigarginnal kiváltható a kapacitatív kalciumbeáramlás,
●
a tapsigarginnal kiváltott kapacitatív úton keresztüli kalciumbeáramlás és mangánbeáramlás a NADPH-oxidáz aktivitásával arányos mértékben gátlódott,
●
az oxidázfüggő influxgátlás megmutatkozott PLB-985 X-CGD és S1 sejtek fMLPindukálta kalciumszignáljai között is,
●
az oxidáz-gátlószer DPI
megemelte egészséges neutrofil granulociták fMLP-
kiváltotta kalciumjelének platófázisát; míg a kalciumjelet kiváltó, de az oxidázt nem aktiváló ATP esetében hatástalan volt rá,
69
a szuperoxidanionokat hidrogén-peroxiddá alakító szueroxid-diszmutáz nem volt
●
hatással sem az fMLP-indukálta membrándepolarizációra, sem a kalciumjelre; így nem a szuperoxidanionok hatnak közvetlenül a kalciminfluxra, fMLP után valinomycint adva nem változik a szuperoxidtermelés, ugyanakkor a
●
membrán hiperpolarizálódik és fokozódik a kalciumbeáramlás a sejtekbe. A
kisérletekből
következik,
hogy
nem
a
szuperoxidanionok,
hanem
a
membrándepolarizáció felelős az oxidáz kalciumbeáramlást gátló hatásáért. Ezzel egyértelmű kisérleti alátámasztást nyert az a korábbi megfigyelés, miszerint az oxidázkiváltotta membránpotenciál-változások befolyásolják a sejtek kalciumanyagcseréjét. Minthogy a kalciumionok számos sejtfunkcióban központi szerepet töltenek be, az oxidáz hiánya a megnövekedett kalciumbeáramláson keresztül CGD-s neutrofilek egyéb ionáramait befolyásolhatja (34), hiperaktivációját idézheti elő (127), vagy apoptózisukat késleltetheti (82, 132), és ezáltal akár a csökkent mértékű ölőképességhez is hozzájárulhat. 2) A dolgozat második részében az oxidáz működését kisérő elektrofiziológiai változásoknak a baktériumölésben játszott szerepét vizsgáltam. Ennek méréséhez azonban először egy új, a baktériumölés mérésére alkalmas esszét fejlesztettem ki, amellyel a jelenleg használt tesztek hátrányait küszöböltük ki. Az új esszé előnyei: ●
kis térfogatokkal dolgozik 96-lyukú lemezen, nem igényel sok sejtet, vegyszert és táptalajt, kicsi a munkaigénye,
●
számos minta vizsgálható egyidejűleg,
●
sok párhuzamossal dolgozva pontos eredményeket kapunk, kis szórásokkal,
●
a baktériumok növesztése több órán át ELISA-leolvasóban történik, így a módszer félig automatizált, és a hagyományos higításos-szélesztéses módszerhez viszonyítva gyorsan megvan az eredmény. Az esszé megbízhatóságának megállapítására számos kontrollmérést végeztünk,
amelyekben ellenőriztük, hogy a baktériumok növekedési sebességét nem befolyásolta DMSO, saponin, szérum; a minták elhelyezkedése a lemezen; elölt neutrofilek vagy baktériumok
szerves
anyagainak
jelenléte.
70
A
módszert
összehasonlítottuk
a
hagyományos, higításos-szélesztéses módszerrel és azonos eredményt kaptuk, az alkalmazott módszertől függetlenül. A már beállított és ellenőrzött teszttel vizsgáltuk a NADPH-oxidáz baktériumölésben betöltött szerepét. Az oxidáz két funkcióját szerettük volna egymástól minél jobban izolálni és ilyen körülmények között vizsgálni a baktériumölést. Az fMLP- illetve PMA-stimulálta szuperoxidtermelésnek és membrándepolarizációnak a DPI-függését megmérve azt kaptuk, hogy már igen kis mennyiségű szuperoxidtermelés (a maximális néhány százaléka) is közel maximális depolarizációt vált ki. A szuperoxidtermelés növelésekor a membrándepolarizáció mértéke már csak kissé változik. Az oxidázkiváltotta membrándepolarizáció káliumkiáramlást indukál a sejtekből (105). Méréseink szerint a káliumleadás és a membrándepolarizáció között lineáris összefüggés áll fent. A két oxidázparaméter DPI-függése egymással nem párhuzamosan változik, így a baktériumölés DPI-függésének a méréséből következtethetünk az egyik vagy másik funkció fontosságára. A Staphylococcus aureus sejtek döntően a neutrofilek oxidatív mechanizmusaira érzékenyek (57, 70), míg a Gram-negatív enterobacilusok (pl. Escherichia coli)
nagymértékben az oxidáztól függetlenül ölődnek (6, 7, 131).
Méréseink szerint E. coli túlélése lényegében független volt az alkalmazott [DPI]-tól. Staphylococcus túlélése ellenben erős DPI-függést mutatott. 500 nM-nál kisebb gátlószer-koncentrációk esetén a membrándepolarizáció közel változatlan maradt, ugyanakkor a szuperoxidtermelés a maximális 15-20 százalékára esett le. Ekkor neutrofilek Staphylococcus-ölése erősen károsodott, mutatván, hogy a reaktív gyököknek, mint kémiai anyagoknak igenis van szerepe a baktériumok sikeres elölésében. 500 nM feletti DPI-koncentrációk esetében a szuperoxidtermelés már alig csökkent, ugyanakkor a membrándepolarizáció (és a káliumleadás) mértéke a maximális 50 %-ára esett le. Ebben a fázisban a Staphylococcusok túlélése hirtelen megnőtt, ami a membrándepolarizáció baktériumölésben betöltött fontos funkcióját sejteti. A protoncsatorna-gátlószer cink 10 µM-os koncentrációban a PMA- és fMLPindukálta
membrándepolarizációt
növelte,
ugyanakkor
a
szuperoxidtermelést
kismértékben gátolta. A O2.--termelés ennél valamivel kisebb gátlását kaptuk 5 nM DPI adásakor, a membrándepolarizáció mértékén azonban nem változtatott. Tehát ugyanolyan mértékű szuperoxidtermelés mellett DPI gátolta, Zn2+ azonban nem a
71
Staphylococcus-ölést. Úgy tűnik, hogy a megnövekedett membrándepolarizáció kompenzálta a csökkent szuperoxidtermelés hátrányát. Eredményeink tehát –teljesen más kísérletes megközelítés alapján- alátámasztják a Segal-munkacsoport elképzeléseit. Összefoglalva, kisérleteink alapján azt állítjuk, hogy a NADPH-oxidáz működését kisérő szabadgyöktermelés és membrándepolarizáció egyaránt fontosak a bekebelezett mikróbák sikeres megölésében. Elsőként bizonyítottuk kisérletesen az oxidáz kettős szerepét - szemben az eddigi, vagy csak az egyik, vagy csak a másik funkciót fontosnak tartó elméletekkel szemben.
72
Irodalomjegyzék 1. Ahluwalia J, Tinker A, Clapp LH, Duchen MR, Abramov AY, Pope S, Nobles M and Segal AW: The large-conductance Ca2+-activated K+ channel is essential for innate immunity. Nature 2004, Vol. 427: 853-858. 2. Aratani Y, Koyama H, Nyui SI, Suzuki K, Kura F and Maeda N: Severe impairment in early host defense against Candida albicans in mice deficient in myeloperoxidase. Infection and Immunity 1999, Vol. 67: 1828-1836. 3. Bánfi B, Schrenzel J, Nüsse O et al: A novel H+ conductance in eosinophils? unique characteristics and absence in chronic granulomatous disease. J. Exp. Medicine 1999, Vol. 190: 183-194. 4. Baud L, Hagege J, Sraer J, Rondeau E, Perez J, Ardaillou R: Reactive oxygen production by cultured rat glomerular mesangial cells during phagocytosis is associated with stimulation of lipoxygenase activity. J. Exp. Med. 1983, Vol. 158: 1836-52. 5. Bei L, Hu Tianhui, Qian ZM, Shen X: Extracellular Ca2+ regulates he respiratory burst of human neutrophils. Biochimica and Biophysica Acta 1998, Vol. 1404: 475-483. 6. Belaaouaj A, Kim KS and Shapiro SD: Degradation of outer membrane protein A in Escherichia coli killing by neutrophil elastase. Science 2000, Vol. 289: 1185-1187. 7. Belaaouaj A: Neutrophil elastase-mediated killing of bacteria: lessons from targeted mutagenesis. Microbes and infection 2002, Vol. 4: 1259-1264. 8. Bengtsson T, Jaconi ME, Gustafsson M, Magnusson KE, Theler JM, Lew DP and Stendahl O: Actin dynamics in human neutrophils during adhesion and phagocytosis is controlled by changes in intracellular free calcium. Eur. Journal of Cell Biology 1993, Vol. 62: 49-58. 9. Berridge MJ: Capacitative calcium entry. Biochemical Journal 1995, Vol. 312: 1-11.
73
10. Betz SJ, Henson PM: Production and release of platelet-activating factor (PAF); dissociation from degranulation and superoxide production in the human neutrophil. J. Immunol. 1980, Vol. 125: 2756-63. 11. Biffl, WL, Moore, EE, Moore, FA, Barnett, CC Jr, Silliman, CC and Peterson, VM: Interleukin-6 stimulates neutrophil production of plateletactivating factor. Journal of Leukocyte Biology 1996, Vol. 59: 569-573. 12. Borregaard N, Schwartz JH and Tauber AI: Proton secretion by stimulated neutrophils: Significance of hexose monophosphate shunt activity as source of electrons and protons for the respiratory burst. J. Clin .Invest. 1984, Vol . 74: 455-459. 13. Borregaard N and Cowland JB: Granules of the human neutrophilic polymorphonuclear leukocyte. Blood 1997, 89: 3503-3521. 14. Chang YC, Segal BH, Holland SM, Miller GF and Kwon-Chung KJ: Virulence of catalase-deficient Aspergillus nidulans in p47phox-/- mice. J. Clin. Invest. 1998, Vol. 101:1843-1850. 15. Chapman LPA, Hampton MB, Senthilmohan R, Winterbourn C and Kettle AJ: Chlorination of bacterial and neutrophil proteins during phagocytosis and killing of Staphylococcus aureus. JBC 2002, Vol. 277: 9757-9762. 16. Dahlgren C and Karlsson A: Respiratory burst in human neutrophils. Journal of Immunological Methods 1999, Vol. 232: 3-14. 17. DeCoursey TE, Cherny VV, Zou W and Thomas LL: Simultaneous activation of NADPH oxidase-related proton and electron currents in human eosinophils. PNAS 2000, Vol. 97: 6885-6889. 18. DeCoursey TE, Morgan D and Cherny VV (A): The voltage-dependence of NADPH oxidase reveals why phagocytes need proton channels. Nature 2003, Vol. 422: 531-534. 19. DeCoursey TE (B): Voltage-gated proton channels and other proton transfer pathways. Physiol. Rev. 2003, Vol. 83: 475-579. 20. DeCoursey TE: During the respiratory burst do phagocytes need proton channels or potassium channels, or both? Science STKE 2004, Vol. 233: 21.
74
21. Demaurex N, Monod A, Lew DP, Krause KH: Characterization of receptormediated and store-regulated Ca2+-influx in human neutrophils. Biochemical Journal 1994, Vol. 297: 595-601. 22. Deurs B van, Holm PK and Sandvig K: Inhibition of the vacuolar H(+)ATPase with bafilomycin reduces delivery of internalized molecules from mature multivesicular endosomes to lysosomes in Hep-2 cell. Eur. J. Cell. Biol. 1996, Vol. 69: 343-350. 23. Dewitt S, Hallett MB: Cytosolic free Ca2+ changes and calpain activation are required for β integrin-accelerated phagocytosis by human neutrophils. The Journal of Cell Biology 2002, Vol. 159: 181-189. 24. Djaldetti M, Salman H, Bergman M, Djaldetti R, Bessler H: Phagocytosis the mighty weapon of the silent warriors. Microsc. Res. Tech. 2002, Vol. 57 : 421-31. 25. Dorval V, Dufour M, Leclerc P: Role of protein tyrosine phosphorylation in the thapsigargin-induced intracellular Ca(2+) store depletion during human sperm acrosome reaction. Mol. Hum. Reprod. 2003, Vol. 9: 125-31. 26. Dri P, Presani G, Perticarari S, Alberi L, Prodan M and Decleva E: Measurement of phagosomal pH of normal and CGD-like human neutrophils by dual fluorescence flow cytometry. Cytometry 2002, Vol. 48: 159-166. 27. Ellison RT, Giehl TJ: Killing of gram-negative bacteria by lactoferrin and lysozyme. J. Clin. Invest. 1991, Vol. 88: 1080-1091. 28. Etzioni A, Tonetti M: Leukocyte adhesion deficiency II-from A to almost Z. Immunol Rev. 2000, Vol. 178: 138-47. 29. Fadeel B, Ahlin A, Henter JI, Orrenius S and Hampton MB: Involvement of caspases in neutrophil apoptosis: regulation by reactive oxygen species. Blood 1998, Vol. 92: 4808-18. 30. Faurschou M, Borregaard N: Neutrophil granules and secretory vesicles in inflammation. Microbes and infection 2003, Vol. 5: 1317-1327. 31. Gabay JE, Almeida RP: Antibiotic peptides and serine protease homologs in human polymorphonuclear leukocytes: defensins and azurocidin. Curr. Opin. Immunol. 1993, Vol. 5: 97-102.
75
32. Geiszt M,
Kapus A, Német K, Farkas L and Ligeti E: Regulation of
capacitative calcium influx in human neutrophil granulocytes. JBC 1997, Vol. 272: 26471-26478. 33. Geiszt M, Szeberényi JB, Káldi K, Liget E: Role of different Ca2+ sources in the superoxide production of human neutrophil granulocytes. Free radical Biology and Medicine 1999, Vol. 26: 1092-1099. 34. Geiszt M, Kapus A and Ligeti E: Chronic granulomatous disease: more than the lack of superoxide? J. of Leukocyte Biology 2001, Vol. 69: 191-196. 35. Gende OA: Capacitative calcium influx and intracellular pH cross-talk in human platelets. Platelets. 2003, Vol. 14: 9-14. 36. Gerber CE, Bruchelt G, Falk UB, Hauschild O, Bächi T, Niethammer D and Schubert R: Reconstitution of bactericidal activity in chronic granulomatous disease cells by glucose-oxidase-containing liposomes. Blood 2001, Vol. 98: 3097-3105. 37. Goldner M, Farkas-Himsley H, Kormendy A, Skinner M: Bacterial phagocytosis monitored by fluorescence and extracellular quenching: ingestion and intracellular killing. Lab. Med. 1983, Vol. 14: 291-294. 38. Gonczi M, Papp H, Biro T, Kovacs L, Csernoch L: Effect of protein kinase C on transmembrane calcium fluxes in HaCaT keratinocytes. Exp. Dermatology 2002, Vol. 11: 25-33. 39. Goodman H, Pollock JJ, Katona LI, Iacono VJ, Cho MI and Thomas E: Lysis of Streptococcus mutans by hen egg white lysozyme and inorganic sodium salts.
J. Bacteriol. 1981, Vol. 146: 764-74.
40. Grinstein S and Furuya W: Assessment of Na+-H+ exchange activity in phagosomal membranes of human neutrophils. Am. J. Physiol. 1988, Vol. 254: C272-285. 41. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY: A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. JBC 1985, 260: 3440-50. 42. Hamers MN, Bot AAM, Weening RS, Sips HJ and Roos D: Kinetics and mechanism of the bactericidal action of human neutrophils against Escherichia coli. Blood 1984, Vol. 64: 635-641.
76
43. Hampton MB, Kettle AJ and Winterbourn C: Involvement of superoxide and myeloperoxidase in oxygen-dependent killing of Staphylococcus aureus by neutrophils. Infection and Immunity 1996, Vol. 3512-3517. 44. Hampton MB, Kettle AJ and Winterbourn C: Inside the Neutrophil Phagosome: Oxidants, Myeloperoxidase and Bacterial Killing. Review Article, Blood 1998, Vol. 92: 3007-3017. 45. Hampton MB and Winterbourn CC: Methods for quantifying phagocytosis and bacterial killing by human neutrophils. Journal of Immunological Methods. 1999, Vol. 232: 15-22. 46. Hardie RC, Minke B: The trp gene is essential for light activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron 1992, Vol. 8: 643-651. 47. Harrison RE, Touret N and Grinstein S: Microbial Killing: Oxidants, Proteases and Ions. Current Biology 2002, Vol. 12: R357-359. 48. Hauser CJ, Fekete Z, Adams JM, Garced M, Livingston DH, Deitch EA: PAF-mediated Ca2+ influx in human neutrophils occurs via store-operated mechanisms. Journal of Leukocyte Biology 2001, Vol. 69: 63-68. 49. Heiner I, Eisfeld J, Luckhoff A: Role and regulation of TRP channels in neutrophil granulocytes. Cell Calcium 2003, Vol. 33: 533-40. 50. Henderson LM, Chappell JB and Jones OTG: The superoxide-generating NADPH oxidase of human neutrophils is electrogenic and associated with a H+ channel. Biochem. J. 1987, Vol.246: 325-329. 51. Henderson LM, Chappell JB, Jones OT: Internal pH changes associated with the activity of NADPH oxidase of human neutrophils. Further evidence for the presence of an H+ conducting channel. Biochem J. 1988, Vol. 251: 563-7. 52. Henderson LM, Banting G and Chappell JB: The arachidonate-activable, NADPH oxidase-associated H+ channel. Evidence that gp91-phox functions as an essential part of the channel. JBC 1995, Vol. 270: 5909-5916. 53. Henderson LM and Meech RW: Evidence that the product of the human Xlinked CGD gene, gp91-phox, is a voltage-gated H+ pathway. J. Gen. Physiol. 1999, Vol. 114: 771-785. 54. Heyworth PG, Cross AR and Curnutte JT: Chronic granulomatous disease. Current Opinion in Immunology 2003, Vol. 15: 578-584.
77
55. Hiraoka W, Vazquez N, Nieves-Neira W, Chanock SJ, Pommier Y: Role of the radicals generated by NADPH oxidase in apoptosis induced in human leukemia cells. J. Clin. Inv. 1998, Vol. 102: 1961-8. 56. Holmes B, Good RA: Laboratory models of chronic granulomatous disease. Journ. Reticuloendothel Soc. 1972, Vol. 12: 216-37. 57. Humphreys JM, Davies B, Hart CA and Edwards SW: Role of myeloperoxidase in the killing of Staphylococcus aureus by human neutrophils: studies with the myeloperoxidase inhibitor salicylhydroxamic acid. J. Gen. Microbiol. 1989, Vol. 135: 1187-93. 58. Jaconi ME, Rivest RW, Schlegel W, Wollheim CB, Pittet D, Lew DP: Spontaneous and chemoattractant-induced oscillations of cytosolic free calcium in single adherent human neutrophils. JBC 1988, Vol. 263: 1055710560. 59. Jaconi ME, Lew DP, Carpentier JL, Magnusson KE, Sjörgen M and Stendahl O: Cytosolic free calcium elevation mediates the phagosomelysosome fusion during phagocytosis in human neutrophils. The Journal of Cell Biology 1990, Vol. 110: 1555-1564. 60. Jankowski A and Grinstein S: A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidaseinduced depolarization in activated neutrophils. JBC 1999, Vol. 274: 2609826104. 61. Jankowski A, Scott CC and Grinstein S: Determinants of the phagosomal pH in neutrophils. JBC 2002, Vol. 277: 6059-6066. 62. Kasahara Y, Iwai K, Yachie A et al: Involvement of reactive oxygen intermediates in spontaneous and CD95 (Fas/APO-1)-mediated apoptosis of neutrophils. Blood 1997, Vol. 89: 1748-53. 63. Kapus A, Suszták K, Ligeti E: Regulation of the electrogenic H+ channel in the plasma membrane of neutrophils: possible role of phospholipase A2, internal and external protons. Biochem J. 1993, Vol. 292: 445-50. 64. Kindzelskii AL and Petty HR: Intracellular calcium waves accompany neutrophil polarization, formylmethionylleucylphenylalanine stimulation and
78
phagocytosis: a high speed microscopy study. The Journal of Immunology 2003, Vol. 170: 64-72. 65. Klebanoff SJ: Iodination of bacteria: a bactericidal mechanism. J Exp. Medicine 1967, Vol. 126: 1063-1078. 66. Klebanoff SJ: Myeloperoxidase-halide-hydrogen peroxide antibacterial system. J. Bacter. 1968, Vol. 95: 2131-2138. 67. Klebanoff SJ, Shepard CC: Toxic effect of the peroxidase-hydrogen peroxidehalide antimicrobial system on Mycobacterium leprae. Infect. Immun. 1984, Vol. 44: 534-536. 68. Kobayashi SD, Oyich JM, Braughton KR, Whitney AR, Nauseef WM, Malech HL and DeLeo FR: Gene expression profiling provides insight into the pathophysiology of chronic granulomatous disease. The Journal of Immunology 2004, Vol. 172: 636-643. 69. Korchak HM, Corkey BE, Yaney GC, Kilpatrick LE.: Negative regulation of ligand-initiated Ca(2+) uptake by PKC-beta II in differentiated HL60 cells. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2001, Vol. 281: C514-23. 70. Kowanko IC, Ferrante A, Clemente G, Kumaratilake LM: Tumor necrosis factor primes neutrophils to kill Staphylococcus by an oxygen-dependent mechanism
and
Plasmodium
falciparum
by
an
oxygen-independent
mechanism. Infection and Immunity 1996, Vol. 64: 3435-3437. 71. Kuhns DB, Young HA, Gallin EK, Gallin JI: Ca2+-dependent production and release of IL-8 in human neutrophils. J. Immunol. 1998, Vol. 161: 4332-9. 72. Lanza F: Clinical manifestation of myeloperoxidase deficiency. J. Molecular Medicine 1998, Vol. 76: 676-681. 73. Larsen AV, Iversen JG: IFN-gamma induces calcium transients and increases the capacitative calcium entry in human neutrophils. Cell Signal 1999, Vol. 11: 101-10. 74. Lawson MA, Maxfield FR: Ca2+- and calcineurin-dependent recycling of an integrin to the front of migrating neutrophils. Nature 1995, Vol. 377: 75-79. 75. Le Y, Yang Y, Cui Y, Yazawa H, Gong W, Qiu C, Wang JM.: Receptors for chemotactic
formyl
peptides
as
Immunopharmacol. 2002 , Vol. 2: 1-13.
79
pharmacological
targets.
Int.
76. Lee WL, Harrison RE and Grinstein S: Phagocytosis by neutrophils. Microbes and infection 2003, Vol.5: 1299-1306. 77. Lew DP, Wollheim C, Seger RA and Pozzan T: Cytosolic free calcium changes induced by chemotactic peptide in neutrophils from patients with chronic granulomatous disease. Blood. 1984, Vol. 63: 231-3. 78. Lew DP, Andersson T, Hed J, Virgilio FD, Pozzan T and Stendahl O: Ca2+dependent and Ca2+-independent phagocytosis in human neutrophils. Nature 1985, Vol. 315: 509-511. 79. Lew DP , Monod A, Waldvogel FA, Dewald B, Baggiolini M and Pozzan T: Quantitative analysis of the cytosolic free calcium dependency of exocytosis from three subcellular compartments in intact human neutrophils. J. Cell. Biol 1986, Vol. 102: 2197-2204. 80. Lindmark IM, Karlsson A, Serrander L, Francois P, Lew D, Rasmusson B, Stendhal O and Nüsse O: Synaptotagmin II could confer Ca2+ sensitivity to phagocytosis in human neutrophils. Biochim. Biophys. Acta 2002, Vol. 1590: 159-166. 81. Locksley RM, Jacobs RF, Wilson CB, Weaver WM, Klebanoff SJ: Susceptibility of Legionella pneumophila to oxygen-dependent microbicidal systems. The Journal of Immunology 1982, Vol. 129: 2192-2197. 82. Lucas M, Diaz P: Thapsigargin-induced calcium entry and apoptotic death of neutrophils are blocked by activation of protein kinase C. Pharmacology 2001, Vol. 63: 191-196. 83. Lundquist-Gustafsson H, Gustafsson M and Dahlgren C: Dynamic Ca2+ changes in neutrophil phagosomes. A source for intracellular Ca2+ during phagolysosome formation? Cell Calcium 2000, Vol. 27: 353-362. 84. Maher RJ, Cao D, Boxer LA and Petty HR: Simultaneous calcium-dependent delivery of neutrophil lactoferrin and reactive oxygen metabolites to erythrocyte targets: evidence supporting granule-dependent triggering of superoxide deposition. Journal of Cellular Physiology 1993, Vol. 156: 226234.
80
85. Mandell GL: Catalase, superoxide dismutase, and virulence of Staphylococcus aureus. In vitro and in vivo studies with emphasis on staphylococcal-leukocyte interaction. J. Clin. Invest. 1975 Vol. 55: 561-6. 86. Marsault R, Murgia M, Pozzan T, Rizzuto R: Domains of high Ca2+ beneath the plasma membrane of living A7r5 cells. EMBO J. 1997, Vol. 16: 1575-81. 87. Mene P, Pugliese F, Cinotti GA: Regulation of capacitative calcium influx in cultured human mesangial cells: roles of protein kinase C and calmodulin. J. Am. Soc. Nephrol. 1996, Vol. 7: 983-990. 88. Mene P, Pugliese G, Pricci F, Di Mario U, Cinotti GA, Pugliese F: High glucose level inhibits Ca2+ influx in cultured rat mesangial cells by a protein kinase C-dependent mechanism. Diabetologia 1997, Vol. 40: 521-7. 89. Messina CGM, Reeves EP, Roes J, Segal AW: Catalase negative Staphylococcus aureus retain virulence in mouse model of chronic granulomatous disease. FEBS Letters 2002, Vol. 518: 107-110. 90. Montero M , Garcia-Sancho J and Alvarez J: Transient inhibition by chemotactic peptide of a store-operated Ca2+ entry pathway in human neutrophils. J. Biol . Chem. 1993, Vol. 268: 13055-13061. 91. Montero M, Garcia-Sancho J and Alvarez J: Phosphorylation down-regulates the store-operated Ca2+ entry pathway of human neutrophils. J. Biol. Chem. 1994, Vol. 269: 3963-3967. 92. Morgenstern DE, Gifford MA, Li LL, Doerschuk CM and Dinauer MC: Absence of respiratory burst in X-linked chronic granulomatous disease mice leads to abnormalities in both host fedense and inflammatory response to Aspergillus fumigatus. J. Exp. Med. 1997, Vol. 185: 207-218. 93. Muller WA: Leukocyte-endothelial-cell interactions in leukocyte transmigration and the inflammatory response. Trends in Immunology 2003, 24: 326-333. 94. Nanda A and Grinstein S: Protein kinase C activates an H+ (equivalent) conductance in the plasma membrane of human neutrophils. PNAS 1991, Vol. 88: 10816-10820. 95. Nauseef WM: Insights into myeloperoxidase biosynthesis from its inherited deficiency. J. Mol. Medicine 1998, Vol. 76: 661-668.
81
96. Ottonello L, Frumento G, Arduino N, Dapino P, Tortolina G and Dallegri F: Immune complex stimulation of neutrophil apoptosis: investigating the involvement of oxidative and nonoxidative pathways. Free Radic Biol Med. 2001, Vol. 30: 161-9. 97. Partida-Sanchez S, Iribarren P, Moreno-Garcia ME, Gao JL, Murphy PM, Oppenheimer N, Wang JM and Lund FE: Chemotaxis and calcium responses of phagocytes to formyl peptide receptor ligands is differentially regulated by cyclic ADP ribose. The Journal of Immunology 2004, Vol. 172: 1896-1906. 98. Pedruzzi E, Fay M, Elbim C, Gaudry M and Gouferot-Pocidalo MA: Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to Nformyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocytemacrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology 2002, Vol. 117: 719-726. 99. Pitt J, Bernheimer HP: Role of peroxide in phagocytic killing of pneumococci. Infect Immun. 1974 Vol. 9: 48-52. 100. Pricop L, Gokhale J, Redecha P, Ng SC and Salmon JE: Reactive oxygen intermediates enhance Fcγ receptor signaling and amplify phagocytic capacity. The Journal of Immunology 1999, Vol. 162: 7041-8. 101. Putney JW Jr: Capacitative calcium entry revisited. Cell Calcium 1990, Vol. 11: 611-624. 102. Putney JW Jr: TRP, inositol 1,4,5-trisphosphate receptors and capacitative calcium entry. PNAS 1999, Vol. 96: 14669-14671. 103. Putney JW Jr, Broad LM, Braun FJ, Lievremont JP and Bird GJ: Mechanisms of capacitative calcium entry. Journal of Cell Science 2001, Vol. 114: 2223-2229. 104. Reeves EP, Lu H, Jacobs HL, Messina CGM, Bolsover S, Gabella G, Potma EO, Roes J and Segal AW: Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature 2002, Vol. 416: 291-297. 105. Reeves EP, Nagl M, Godovac-Zimmermann J and Segal AW: Reassessment of the microbial activity of reactive oxygen species and hypochlorus acid with
82
reference to the phagocytic vacuole of the neutrophil granulocyte. J. Medical Microbiology 2003, Vol. 52: 643-651. 106. Roos D, Curnutte JT: Chronic granulomatous disease, in: H.D.Ochs, C.I.E. Smith, J.M. Puck (Eds.): Primary immunodeficiency diseases. A molecular and genetic approach. Oxford University Press, New York, Oxford 1999: 353374. 107. Roos D, Bruggen R van, Meischl Ch: Oxidative killing of microbes by neutrophils. Microbes and Infection 2003 Nov, Vol. 5: 1307-315. 108. Rosales JL,
Ernst JD: Calcium-dependent neutrophil secretion:
characterization and regulation by annexins. The Journal of Immunology 1997, Vol. 159: 6195-6202. 109. Rosen H, Michel BR: Redundant contribution of myeloperoxidase-dependent systems to neutrophil-mediated killing of Escherichia coli. Inf. Immun. 1997, Vol. 65: 4173-4178. 110. Rossato M, Di Virgilio F, Rizzuto R, Galeazzi C, Foresta C: Intracellular calcium store depletion and acrosome reaction in human spermatozoa: role of calcium and plasma membrane potential. Mol. Hum. Reprod. 2001, Vol. 7: 119-28. 111. Sawyer DW, Sullivan JA and Mandell GL: Intracellular free calcium localization in neutrophils during phagocytosis. Science 1985, Vol. 23: 663665. 112. Schorr W, Swandulla D and Zellhofer HU: Mechanisms of IL-8-induced Ca2+ signaling in human neutrophil granulocytes. Eur. Jorunal of Immunolgy 1999, Vol. 29: 897-904. 113. Schrenzel J, Serrander I, Bánfi B, Nüsse O, Fouyouzi R, Lew DP, Demaurex N and Krause KH: Electron currents generated by the human phagocyte NADPH oxidase. Nature 1998, Vol. 392: 734-737. 114. Schwab JC, Leong DA and Mandell GL: A wave of elevated intracellular free calcium spreads through human neutrophils during phagocytosis of zymosan. Journal of Leukocyte Biology 1992, Vol. 51: 437-443. 115. Scott CC, Botelho RJ and Grinstein S: Phagosome maturation: A few bugs in the system. J. Membrane Biol. 2003, Vol. 193: 137-152.
83
116. Segal AW, Geisow M, Garcia R, Harper A and Miller R: The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature 1981, Vol. 290: 406-409. 117. Selsted ME, Martinez RJ: Lysozyme: primary bactericidin in human plasma serum active against Bacillus subtilis. Infect. Immun. 1978, Vol. 20: 782-791. 118. Sengelov H, Kjeldsen L, Borregaard N: Control of exocytosis in early neutrophil activation. J. Immunol. 1993, Vol. 150: 1535-1543. 119. Shilouh MU, Ruan J and Nathan C: Evaluation of bacterial survival and phagocyte function with a fluorescence-based microplate assay. Infection and Immunity 1997, Vol. 65: 3193-3198. 120. Staudinger BJ, Oberdoerster MA, Lewis PJ, Rosen H: mRNA expression profiles for Escherichia coli ingested by normal and phagocyte oxidasedeficient human neutrophils. J. Clin. Invest. 2002, Vol. 110: 1151-63. 121. Stendahl O, Krause KH, Krischer J, Jerström P, Theler JM, Clark RA, Carpentier JL, Lew DP: Redistribution of intracellular Ca2+ stores during phagocytosis in human neutrophils. Science 1994, Vol. 265: 1439-1441. 122. Suszták K, Mócsai A, Ligeti E, Kapus A: Electrogenic H+ pathway contributes to stimulus-induced changes of internal pH and membrane potential in intact neutrophils: role of cytoplasmic phospholipase A2. Biochem J. 1997 Vol. 325: 501-10. 123. Thastrup O, Cullen PJ, Drobak BK, Hanley MR and Dawson AP: Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase. PNAS 1990, Vol. 87: 2466-2470. 124. Thastrup O, Dawson AP, Scharff O, Foder B, Cullen PJ, Drobak BK, Bjerrum PJ, Christiensen SB and Hanley MR: Thapsigargin, a novel molecular probe for studying intracellular calcium release and storage. Agents Actions. 1994, Vol. 43: 187-93. 125. Theler JM, Lew DP, Jaconi ME, Krause KH, Wollheim CB and Schlegel W: Intracellular pattern of cytosolic Ca2+ changes during adhesion and multiple phagocytosis in human neutrophils. Dynamics of intracellular Ca2+ stores. Blood 1995, Vol. 85: 2194-2201.
84
126. Thomas RC, Meech RW: Hydrogen ion currents and intracellular pH in depolarized voltage-clamped snail neurones. Nature 1982, Vol. 299: 826-828. 127. Tintinger GR, Theron AJ, Steel HC and Anderson R.: Accelerated calcium influx and hyperactivation of neutrophils in chronic granulomatous disease. Clin. Exp. Immunol. 2001, Vol. 123: 254-63. 128. Tucker KA, Lilly MB, Heck L Jr and Rado TA: Characterization of a new human diploid myeloid leukemia cell line (PLB-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity. Blood. 1987, Vol. 70(2): 372-8. 129. Venkatachalam K, Rossum van DB, Patterson RL, Ma HT and Gill DL: The cellular and molecular basis of store-operated calcium entry. Nature Cell Biology 2002, Vol. 4: 263-272. 130. Wakabayashi I, Marumo M, Sotoda Y: Intracellular alkalinization augments capacitative Ca2+ entry in vascular smooth muscle cells. J. Cardiovasc. Pharmacol. 2003, Vol. 41: 903-7. 131. Weinrauch Y, Drujan D, Shapiro SD, Weiss J and Zychilinsky A: Neutrophil elastase targets virulence factors of enterobacteria. Nature 2002, Vol. 417: 91-94. 132. Whyte MKB, Hardwick SJ, Meagher LC, Savill JS and Haslett C: Transient elevations of cytosolic free calcium retard subsequent apoptosis in neutrophils in vitro. J. Clin. Inv. 1993, Vol. 92: 446-455. 133. Wilsson A, Lundquist H, Gustafsson M and Stendahl O: Killing of phagocytosed Staphylococcus aureus by human neutrophils requires intracellular free calcium. Journal of Leukocyte Biology 1996, Vol. 59: 902907. 134. Yamamoto A, Taniuchi S. Tsuji S, Hasui M and Kobayashi Y: Role of reactive oxygen species in neutrophil apoptosis following ingestion of heatkilled Staphylococcus aureus. Clin. Exp. Immunol. 2002, Vol. 129: 479-84. 135. Yu L, Cross AR, Then L and Dinauer MC: Functional analysis of NADPH oxidase in granulocytic cells expressing a ∆488-497 gp91phox mutant. Blood 1999, Vol. 94: 24 136. Zhen L, King AA, Xiao Y, Chanock SJ, Orkin SH and Dinauer MC: Gene targeting of X chromosome-linked chronic granulomatous disease locus in a
85
human myeloid leukemia cell line and rescue by expression of recombinant gp91phox. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 1993, Vol. 90: 9832-6. 137. Zhou WL, Sugioka M, Sakaki Y, Yamashita M: Regulation of capacitative Ca2+ entry by tyrosine phosphorylation in the neural retina of chick embryo. Neurosci Lett. 1999, Vol. 272: 123-6. 138. Zicha D, Dunn GA, Segal AW: Deficiency of p67phox, p47phox or gp91phox in chronic granulomatous disease does not impair leucocyte chemotaxis or motility. Br. J. Haematol. 1997, Vol. 96: 543-50. 139. Zitt C, Halaszovich CR, Lückhoff A: The TRP family of cation channels: probing and advancing the concepts on receptor-activated calcium entry. Progress in Neurobiology 2002, Vol. 66: 243-264.
86
Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt témavezetőmnek, Dr. Ligeti Erzsébetnek szeretnék köszönetet mondani, aki laboratóriumába fogadott, elindított és vezetett eddigi tudományos pályámon. Munkám alatt mindig számíthattam segítségére és támogatására. Köszönettel tartozom Dr. Spät Andrásnak, hogy intézetvezetőként lehetővé tette tudományos tevékenységemet. Hálával tartozom Geiszt Miklósnak azért, mert az évek alatt végig követte munkámat, számos ötlettel látott el és állandóan lelkesedéssel töltött fel a tudomány iránt; Dr. Káldi Krisztinának szintén az inspiráló ötletekért és támogatásáért; Dr. Német Katalinnak a hatékony együttműködésért; Prof. Dirk Roos-nak és Prof. William Nauseef-nek pedig azért, mert a laboratóriumaikban eltöltött hónapok alatt sok újat tanultam és mindig számíthattam a segítségükre. Szeretném megköszönni Fedina Editnek segítőkészségét, Sütő Krisztinának a sejttenyésztésben nyújtott nagy segítségét és Horváthné Seres Erzsébetnek az évek alatti, többszáz neutrofil preparálást. Köszönet illeti tudományos diákkörös hallgatóimat, Pelcz Dominikát, Radovits Tamást és Timár Csabát az izgalmas, közös munkákért, valamint kollegáimat a laborban, Mócsai Attilát, Molnár Gergelyt, Patryk Moskwát, Sirokmány Gábort és Jakus Zoltánt, segítő jelenlétükért és azért a vidám légkörért, amelyben az évek alatt velük együtt dolgozhattam. Köszönettel tartozom továbbá az Élettani Intézet valamennyi dolgozójának. Végül, de egyáltalán nem utolsó sorban szeretetükért mély hálával tartozom imádott családomnak és barátaimnak, akikkel mindig megoszthattam sikereimet és gondjaimat.
87
Saját közlemények jegyzéke A tézisek alapjául szolgáló publikációk I. Balázs K. Rada, M. Geiszt, R. van Bruggen, K. Német, D. Roos and E. Ligeti Calcium signalling is altered in myeloid cells with a deficiency in NADPH oxidase activity. Clinical and Experimental Immunology, 2003; 132: 53-60. if: 2,347 II. Balázs K. Rada, Csaba Timár, Krisztina Káldi, Miklós Geiszt and Erzsébet Ligeti Dual role of the phagocytic NADPH oxidase in bacterial killing. Blood First Edition Paper, elektronikus formában publikálva 2004. július 13-án. DOI 10.1182/blood-2004-03-1005 if: 10,12
III. Káldi K, Kalocsai A, Rada BK, Mezo G, Molnar GZ, Bathori G, Ligeti E Degranulation and superoxide production depend on cholesterol in PLB-985 cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003; 310: 1241-6. if: 2,836 IV. Káldi K, Szeberényi J, Balázs K. Rada, Kovács P, Geiszt M, Mócsai A and Ligeti E: Contribution of phospholipase D and a brefeldin A sensitive ARF to chemoattractant induced superoxide production and secretion of human neutrophils. Journal of Leukocyte Biology 2002, 71: 695-700. if: 4,132
Egyéb publikációk V. Rada Balázs: Baktériumokra vadászó fehérvérsejtek Természet Világa 2003. március, 121-124. VI. Rada Balázs: A legionáriusbetegség. Természet Világa 2003. október, 444-447.
88
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények különlenyomatai
1. közlemény
Blackwell Science, LtdOxford, UKCEIClinical and Experimental Immunology1365-2249Blackwell Publishing Ltd, 2003 132 5360 Original Article Calcium signalling in CGDB. K. Rada et al.
Clin Exp Immunol 2003; 132:53–60
Calcium signalling is altered in myeloid cells with a deficiency in NADPH oxidase activity B. K. RADA*, M. GEISZT*, R. VAN BRUGGEN†, K. NÉMET‡, D. ROOS† & E. LIGETI* *Department of Physiology, Semmelweis University, Budapest, Hungary, †Sanguin Research at CLB, and Landsteiner Laboratory of the Academic Centre, University of Amsterdam, Amsterdam, the Netherlands, and ‡National Medical Center, Budapest, Hungary
(Accepted for publication 5 February 2003)
SUMMARY .-
2+
The relation of O2 -production and Ca homeostasis was investigated in PLB-985 cell lines and neutrophilic granulocytes from peripheral blood. In differentiated wild-type PLB-985 cells, a high level of O2.--production was associated with a significant decrease in the membrane potential and the inhibition of capacitative Ca2+ entry. These correlations were not observed in gp91 phox –/– cells or in cells transfected with a non-functional mutant of gp91 phox (Thr341Lys). Membrane depolarization and inhibition of Ca 2+ entry reappeared in cells transfected with wild-type gp91 phox. These experiments demonstrate that inhibition of Ca2+ entry depends on the presence of a functional NADPH oxidase. The Ca2+ signal induced by stimulation of chemotactic receptors also showed remarkable differences: [Ca2+]ic in the sustained phase was higher in gp91phox–/– than in wild-type cells. Alteration of the Ca2+ signal was reproduced by treating peripheral blood neutrophils with the NADPH oxidase inhibitor diphenylene-iodonium. It is concluded that the deficiency in O2.--production is accompanied by significant alterations of Ca2+ homeostasis in myeloid cells. Keywords channel
immunodeficiency diseases
neutrophils
INTRODUCTION Stimulation of chemotactic receptors of neutrophilic granulocytes initiates an increase in intracellular Ca 2+ concentration. The Ca2+ signal in neutrophils consists of two components: Ca2+ release from intracellular stores and subsequent Ca 2+ entry by a capacitative mechanism, i.e. via store-operated calcium channels (SOC) [1,2]. This Ca2+ signal is a key element in the organization of various effector responses of the cell, such as superoxide (O2.-) production, exocytosis of proteins from various granules, cell shape changes and chemotaxis [3]. Interestingly, both the chemotactic agent N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) and phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA), which are effective stimuli of superoxide production, have been shown to inhibit capacitative Ca2+ entry in neutrophilic granulocytes [4,5]. The O2.--producing NADPH oxidase enzyme of phagocytic cells transfers electrons from intracellular NADPH to extracellular O2, thus removing in each cycle one negative charge from the
Correspondence: Erzsébet Ligeti MD, PhD, Department of Physiology, Semmelweis University, H-1444 Budapest, PO Box259, Hungary. E-mail:
[email protected] © 2003 Blackwell Publishing Ltd
signal transduction
store-operated calcium
cell. This electrogenic process results in a dramatic change in the membrane potential: from approx. - 60 mV in resting cells up to + 30 to + 50 mV in stimulated cells [6–8]. In a previous study, carried out on blood neutrophils, we demonstrated a close relationship between O2.--production and inhibition of Ca2+ entry [9]. The extensive depolarization of the plasma membrane that is associated with O2.--production reduces significantly the driving force for Ca2+ entry. However, the possible role of additional regulatory mechanisms directly affecting Ca 2+ entry pathway(s) such as phosphorylation by protein kinase C has been raised repeatedly [5,10–14]. The effect of the depolarization due to O 2.--production is certainly not limited to Ca2+ entry, because it alters the driving force for all ionic components, such as Na+, K+ and Cl–. We suggested an additional role for all these electrophysiological alterations in the pathological state developing in cases of chronic granulomatous disease (CGD) [15]. Most recently, Segal and co-workers presented experimental evidence for the critical role of depolarization-induced K+ efflux in bacterial killing [16]. An alteration of Ca2+ metabolism and [Ca2+]ic could have important secondary effects on the movement of all major ions by modulation of plasma membrane transporters such as Ca 2+ activated K+ channels, Ca2+ activated Cl– channels or the Na+/Ca2+ exchanger.
53
54
B. K. Rada et al. Cell lines Wild-type and gp91phox deficient PLB-985 cell lines were a kind gift from Dr M. Dinauer, Indianapolis, IN, USA. Thr341Lys mutant of gp91phox was obtained by site-directed mutagenesis using the Quickchange site-directed mutagenesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) according to the manufacturer’s instructions. cDNA constructs encoding the wild-type (referred to hereafter as S1 cells) or mutant gp91phox (referred to hereafter as M1 cells) were cloned into pLZRS. pLZRS constructs were expressed into a retroviral packaging cell line (fnx-a). After puromycin selection, virus was harvested and used for retroviral transduction of PLB-985 X-CGD cells (using 10 mg/ml of Dotap (Roche, Basel, Switzerland)). Transduced cells were stained with 7D5 (kind gift from Dr M. Nakamura, Nagasaki, Japan) and phycoerythrinlabelled Fab2 fragments of goat-antimouse-Ig, and sorted by means of a FacsStar (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) cell sorter. Differentiation into neutrophilic granulocytes was carried out in the presence of 0·5% dimethyl-formamide. Wild-type, PLB-985 X-CGD and M1 cell lines were differentiated for 6–7 days, and the PLB-985 S1 cells for 5 days. Differentiation was controlled on the basis of CD11b expression, using phycoerythrin-labelled antiCD11b antibodies. Analysis of the appearance of the differentiation marker CD11b and gp91phox on the cell surface of the different cell lines used in this study is summarized in Fig. 1.
Taken together, these findings warrant a detailed investigation of the mechanisms involved in the regulation of Ca 2+ entry into O2.--producing phagocytic cells and the possible alterations of these processes in CGD cells. The limited availability of cells from CGD patients prompted us to search for a suitable model cell line. PLB-985 cells are human promyelocytic leukaemia cells which, in differentiated form, are able to produce O2.- [17]. Zhen et al. [18] developed a cell line from PLB-985 cells in which the gene for gp91phox was disrupted by homologous recombination (CGD PLB-985 cells). In the present study, we performed a detailed comparison of calcium movements in normal and CGD PLB-985 cells and found that both Ca 2+ entry and the sustained phase of the calcium signal are significantly elevated in cells deficient in O2.- -production. We also demonstrate that introduction of the gp91phox gene into CGD cells partially corrects alterations of the calcium homeostasis.
MATERIALS AND METHODS Materials FURA-2/AM was obtained from Calbiochem (San Diego, CA, USA); Percoll from Pharmacia (Peapack, NJ, USA); fetal bovine serum from Agrobio Gmk (Gödöll o≤ , Hungary); di-O-C5(3) from Molecular Probes (Eugene, OR, USA); valinomycin from Fluka (Buchs, Switzerland); hygromycin from Invitrogen (Grand Island, NY, USA); L-glutamine, dimethyl-formamide, penicillin–streptomycin, NaHCO3, RPMI-1640 medium, thapsigargin, cytochromec, nitroblue tetrazolium (NBT), diphenylene iodonium (DPI) and ionomycin from Sigma (St Louis, MO, USA). All other reagents were of research grade. The extracellular medium (called Hmedium) contained: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0,8 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 5 mM glucose, pH = 7·4. The Ca2+ free H-medium had the same composition except that 1 mM NaEGTA was substituted for CaCl2.
Preparation of neutrophil granulocytes from human blood Venous blood was drawn from healthy volunteers who gave written consent following the presciptions of the Ethical Committee of the Semmelweis University (permission no. 40/1998). Dextran sedimentation was followed by Ficoll-Paque gradient centrifugation according to the procedure described in [19]. Contaminating red cells were removed by hypotonic lysis. Cells were finally resuspended in H-medium and kept at room temperature until use. Preparations contained more than 95%
CD11b
PLB-985 S1
100
PLB-985 wild-type
Counts 104
100
101 102 103 7D5+GAM PE
100
Counts 0 20 40 60 80 100
101 102 103 CD11b PE
104
100
PLB-985 S1
0 20 40 60 80 100
101 102 103 7D5+GAM PE
104
PLB-985 X-CGD
Counts 0 20 40 60 80 100 100
101 102 103 CD11b PE
104
100
101
102 103 CD11b PE
104
PLB-985M1 Counts 0 20 40 60 80 100
phox
104
Counts 0 20 40 60 80 100
gp91
101 102 103 CD11b PE
Counts
Counts 0 20 40 60 80 100
Counts 0 20 40 60 80 100 100
PLB-985 M1
0 20 40 60 80 100
PLB-985 X-CGD
PLB-985 wild-type
101 102 103 7D5+GAM PE
104
100
101 102 103 7D5+GAM PE
104
Fig. 1. Differentiation and expression of gp91phox in different PLB-985 cell lines. Surface expression of the neutrophil differentiation marker CD11b (upper panels; ···, isotype control; —, anti-CD11b) and the larger membrane-bound subunit of the NADPH oxidase complex, gp91phox recognized by antibody 7D5 (lower panels; ···, isotype control; , —7D5) on differentiated, unstimulated cells of four different PLB985 cell lines was assessed by flow cytometry as described in Materials and methods. © 2003 Blackwell Publishing Ltd, Clinical and Experimental Immunology, 132:53–60
Calcium signalling in CGD neutrophils, viability as determined by erythrosin B dye exclusion exceeded 95%.
Measurement of Ca 2+ entry The cells were loaded with 4 mM FURA-2/AM at a concentration of 5 ¥ 107/ml for 30 min at 37∞C in the dark. Thereafter, the cells were washed twice with H-medium (500 g, 10 min, 25∞C) to remove the extracellular dye. The washed cells were resuspended in H-medium at a density of 5 ¥ 107/ml and stored at room temperature until use. For measurement of calcium entry 3 ¥ 106 of FURA-2-loaded cells were resuspended in 3 ml of Ca2+ free H-medium in a methylacrylate-cuvette and incubated at 37 ∞C for 4–5 min under stirring conditions. Changes of FURA-2 fluorescence were monitored in a Deltascan dual-wavelength spectrofluorimeter (Photon Technology International, South Brunswick, NJ, USA) using wavelengths 340 nm and 380 nm for excitation and 505 nm for emission. The speed of data collection was two measurements/ s. [Ca2+]ic was calculated from the ratio of the fluorescent data at 340 and 380 nm (after the subtraction of the background values) with the use of the method described in [20]. Data were analysed with the Felix software (PTI). Measurement of Mn 2+ entry Mn2+ influx measurements were made under the same conditions as the calcium measurements except that the excitation wavelength was 360 nm, at which the fluorescence of FURA-2 is not influenced by the calcium-binding state of the dye. Mn2+ ions entering the cells quench the fluorescence of the dye and thereby cause a decrease in the fluorescence. In the protocol, the cells were suspended in Ca2+ free H-medium and the capacitative calcium entry pathway was activated by the addition of 100 nM thapsigargin. Eight minutes after thapsigargin, 100 nM PMA or its solvent DMSO (as control) was added, and 10 min after thapsigargin 1 mM MnCl2 was introduced into the cuvette. Measurement of O 2.--production Superoxide production of the cells was tested with the superoxide dismutase-inhibitable cytochrome-c reduction. To measure superoxide production in the extracellular medium, cells (106/ml) were suspended in H-medium containing 100 mM cytochrome-c. Control probes contained 12·5 mg/ml superoxide-dismutase. Aliquots (200 ml) of the suspension were added into wells of a 96-well plate and prewarmed at 37∞C for 5 min in a shaking ELISA-reader (Labsystems iEMS Reader MF). The cells were activated with the requisite stimuli by the addition of 5 ml of the stimulus solution. The changes in absorption at 550 nm were recorded for 10 min with two measurements/min at 37∞C with gentle shaking. After subtracting the background values superoxide production was calculated with the use of an absorption coefficient of 21 mM-1cm-1 for cytochrome-c. Measurement of membrane potential changes Changes in the membrane potential were followed by the potential-sensitive fluorescent dye 3–3¢-dipentyloxacarbocyanine, di-OC5(3) as described in [21]. Cells, 106, were suspended in 3 ml of Hmedium in a stirred cuvette at 37∞C and the changes in fluorescence were followed in the spectrofluorimeter used for calcium measurements with 484 nm as excitation and 510 nm as emission wavelengths. The cells were preincubated for 5 min. Subsequently, 100 nM di-O-C5(3) was added, then the dye was allowed
55
to equilibrate for 6–7 min until baseline fluorescence values were stable. Thereafter, the cells were exposed to various stimuli (fMLP, PMA, ATP) and the changes in fluorescence were recorded. The fluorescence data obtained were converted to membrane potential values (mV) by a calibration curve generated by the application of 2 mg/ml valinomycin to cells suspended in medium containing a series of different external K +concentrations as described in [9].
Statistical analysis Data are presented either as representative traces of the indicated number of experiments or as the mean ± s.e.m. of the number of determinations indicated (n).
RESULTS .-
Comparison of O 2 -production and accompanying membrane potential changes in the different PLB-985 cell lines Superoxide production was measured by cytochrome-c reduction upon stimulation with 100 nM PMA (Fig. 2a). Wild-type PLB-985 cells produced 22·7 ± 2·07 nmol O2.-/106 cell/10 min (n = 12), which is comparable to the PMA-induced O 2.--production of peripheral blood neutrophils. S1 cells with transfected wild-type gp91phox generated five times less O2.- (4·32 ± 0·6 nmol O2.-/106 cell/10 min, n = 17). As expected, neither the CGD-PLB model cell line nor M1 cells containing the non-functional mutant gp91phox produced detectable amounts of O 2.-. Relative changes of the plasma membrane potential were followed by means of di-O-C5(3) fluorescent dye (Fig. 2b). Addition of PMA to wild-type PLB-985 cells was followed by a lag-phase of approx. 30 s, corresponding to the typical lag-phase of PMAinduced O2.--production. Thereafter, continuous depolarization ensued for over 200 s. In case of CGD-PLB cells, addition of PMA did not cause any detectable change in the membrane potential. Stimulation of S1 cells with PMA induced clearly detectable depolarization that was significantly smaller than in the wild-type cells. Similarly to CGD-PLB cells, no change of the membrane potential was detected in M1 cells. Comparison of the effect of phorbol ester on capacitative Ca 2+ entry in the different PLB-985 cell lines To investigate Ca2+ entry via store-operated channels in the plasma membrane, cells were suspended in a Ca2+ free medium and treated with thapsigargin (TG). This drug is a potent inhibitor of the SERCA type Ca2+ ATPase of the microsomal membranes, thus preventing the reuptake of Ca 2+ ions leaking continuously from intracellular stores [22]. The Ca2+ releasing effect of TG is indicated clearly by the transient increase in intracellular [Ca 2+] following TG treatment at 120 s (indicated by * in Fig. 3a,b,c,d). Addition of Ca2+ at t = 720 s to resting cells caused a small increase in the fluorescent signal, due probably to reaction with extracellular dye (marked ‘C’ in Fig. 3). In contrast, addition of Ca2+ to TG-pretreated cells induced a rapid rise in [Ca 2+]ic from approx. 100 nM up to the mM range (curves ‘T’ in Fig. 3). This increase in the [Ca2+]ic indicates rapid Ca2+ influx in the cells via transport pathways opened by store depletion, called capacitative Ca2+ entry channels. When the phorbol ester PMA was added (indicated by ‘+’ in Fig. 3) to the TG-pretreated wild-type PLB985 cells 30 s prior to Ca2+, the rise in [Ca2+]ic was significantly smaller (curve ‘PT’ in Fig. 3a). In the experiments carried out on wild-type PLB-985 cells, PMA brought about a significant
© 2003 Blackwell Publishing Ltd, Clinical and Experimental Immunology, 132:53–60
56
B. K. Rada et al. (a)
(b) –40 membrane potential (mV)
O2.– (nmol/10 min/106 cells)
30 25 20 15 10 5
Wild-type –50 S1
–60
–70 X-CGD, M1 –80
0 PMN
Wild-type X-CGD
S1
M1
0
50
100 150 200 Time (s)
250
Fig. 2. Superoxide production (a) and membrane potential changes (b) in differentiated PLB-985 cells. (a) 106 cells/ml were suspended in H-medium and the SOD-inhibitable cytochrome-c reduction was measured for 10 min at 37∞C after stimulation with 100 nM PMA. The results are the mean ± s.e.m. of at least eight different experiments. (b) 3·3 ¥ 105 cells/ml were suspended in H-medium, 100 nM di-O-C5(3) was added, the cells were stimulated with 100 nM PMA and the changes in fluorescence were measured and calibrated into membrane potential values. The results are representative of three independent experiments. X-CGD cells were transfected with wild-type gp91phox (S1 cells) or the non-functional Thr341Lys mutant of gp91phox (M1 cells).
inhibition of capacitative Ca2+ entry. In four separate cell preparations, an average of 77·1 ± 5·4% inhibition of Ca2+ influx was attained during the first 30 s (Fig. 3e). Under identical experimental conditions, no inhibitory effect of PMA was detected upon capacitative Ca 2+ entry into CGDPLB cells (Fig. 3b). In cells transfected with wild-type gp91 phox (S1 cells), the inhibitory effect of PMA on Ca 2+ entry reappeared (Fig. 3c). However, the inhibition observed in S1 cells was weaker than in the wild-type cells, with an average of 45·9 ± 0. 12·1% (Fig. 3e). This difference in the inhibition of Ca 2+ entry corresponds to the lower rate of O2.--production and the moderate change of the membrane potential observed in S1 cells (Fig. 2). In cells expressing the non-functional mutant of gp91 phox, no inhibitory action of PMA was detected (Fig. 3d). Monitoring of the quenching effect of Mn 2+ is another, widely applied method for investigation of the capacitative Ca 2+ transport pathway. Manganese enters the cells via the same ion channels as Ca2+, but it is not a substrate for Ca2+ pumps. Reaction of Mn2+ with fura-2 quenches the fluorescence of the dye, thus the rate of fluorescence decrease measured at the isosbestic point represents the influx of manganese. The rapid drop in the fluorescence signal upon addition of Mn 2+ represents the reaction with extracellular dye. In untreated cells there was no change of the fluorescence level after this initial drop (Fig. 4, curves ‘C’) whereas a gradual decrease of fluorescence occurred in thapsigargin-treated cells (Fig. 4, curves ‘T’). Addition to thapsigargintreated cells of PMA 120 s prior to Mn 2+ resulted in strong inhibition of fluorescence quenching in case of the wild-type cells (Fig. 4a, curve ‘PT’), whereas no change was observed in CGDPLB cells (Fig. 4b). PMA also inhibited Mn2+ entry into S1 cells (Fig. 4c) but similarly to Ca2+ entry this effect was weaker than in wild-type cells. Similar to CGD-PLB cells, PMA was without any effect in M1 cells.
Dependence of the chemoattractant-induced Ca 2+ signal on O2.--production in the different PLB-985 cell lines Ligand binding to the various chemoattractant receptors induces a Ca2+ signal both in neutrophils and in promyelocytic cell lines.
Comparison of the transient change of [Ca 2+]ic in the presence and absence of extracellular Ca2+ allows a clear distinction of two different phases: a first, rapid phase representing release from internal stores and a second, prolonged phase dependent on Ca 2+ entry. Our experiments indicate that O2.--production inhibits Ca2+ entry. Thus, the Ca2+ signal evoked by O2.--producing chemoattractants is expected to depend on the ability of the cell to generate superoxide. Following this rationale, we compared the Ca2+ signal initiated by the chemotactic peptide fMLP in two cell lines, one capable, the other not capable of O2.--production. FMLPstimulated O2.--production attained an average of 0·97 nmol/ 10 min/106 cells in nine separate measurements in S1 cells, whereas it was not detectable in CGD-PLB cells. Comparison of the fMLP-initiated Ca 2+ signal in S1 and CGD-PLB cells is shown in Fig. 5. In the presence of extracellular Ca2+, the decline of the Ca2+ signal was significantly slower in the CGD-PLB cells, in which a clear sustained phase appeared (Fig. 5a). The difference in [Ca2+]ic was greatest approx. 120 s after addition of fMLP, when it reached 133 ± 13 nM (n = 4). In the absence of extracellular Ca2+, there was no detectable difference between the two cell types in the decline of the Ca 2+ signal (Fig. 5b), suggesting that release of Ca2+ from intracellular stores did not depend on the ability to generate O 2.-. The amplitude of the Ca2+ signal showed no consistent difference between the two cell types, either in the presence or in the absence of extracellular Ca2+.
Dependence of the chemoattractant-induced Ca 2+ signal on the ability of O2.--production in neutrophilic granulocytes Our studies on the promyelocytic cell line showed that the chemoattractant-induced Ca2+ signal depends on O2.--production, raising the possibility that Ca2+ homeostasis may be altered in neutrophils of CGD patients. In earlier studies the fMLP-induced Ca2+ signal was investigated in normal and CGD neutrophils, and no difference could be detected [23]. However, those measurements were carried out with the fluorescent dye Quin 2, which has a lower affinity for Ca2+ and therefore causes a serious perturbation of intracellular Ca2+ handling.
© 2003 Blackwell Publishing Ltd, Clinical and Experimental Immunology, 132:53–60
Calcium signalling in CGD (a)
(b) PLB-985 wild type
PLB-985 X-CGD
1000
1000
[Ca2+]ic (nM)
600 400
+
*
200 0
V PT C
200
400 600 Time (s)
[Ca2+]ic (nM)
T
800
0
800
T
600
PT
400
V C
0
800
0
200
(d)
PLB-985 S1
400 600 Time (s)
800
PLB-985 M1
1000
1000 T
800 600 400
+
*
PT
V
[Ca2+]ic (nM)
[Ca2+]ic (nM)
+
*
200
(c)
800
T PT
600 400
+ V
* 200
200 C
0 0
% inhibition by PMA
57
200
400 600 Time (s)
C
0 0
800
200
400 600 Time (s)
800
(e) 100% 80% 60% 40% 20% 0% –20% Wild-type X-CGD
S1
M1
Fig. 3. Effect of PMA on the thapsigargin-induced capacitative calcium entry in differentiated PLB-985 cells. FURA-2-loaded cells (106/ ml) were allowed to equilibrate for 4–5 min in Ca2+ free medium (a–d). Capacitative calcium entry was initiated by addition of 100 nM thapsigargin (marked by *) (T and PT) and 10 min later 1 mM CaCl2 was added (marked by v) to the extracellular medium. Where indicated, cells have been stimulated by 100 nM PMA 2 min (marked by +) before addition of CaCl2 (PT). In control experiments (c) basic calcium influx was measured in the presence of DMSO only. (e) Statistical analysis of the inhibitory effect of PMA on capacitative calcium entry in different PLB cells. Inhibition was calculated on the basis of fluorescence change in the initial 30 s after calcium addition. Mean ± s.e.m. of five (wild-type and X-CGD cells) or three (S1) independent experiments is represented, whereas in the case of the M1 cells the average of two measurements is presented.
In our experiments, which were carried out on neutrophilic granulocytes prepared from the peripheral blood of healthy volunteers, we abrogated O2.--production by DPI. When applied in a concentration of 5 mM, DPI inhibited O2.--production by 98%. Interestingly, the reduction in the depolarization of the plasma membrane was less intense. In typical experiments such as the one shown in Fig. 6b, even in the presence of 5 mM DPI, 20–30 mV depolarization occurred upon fMLP treatment. (In five experiments, 5 mM DPI inhibited plasma membrane depolarization by 53·2 ± 3·2%.) However, a clear alteration in the Ca2+ signal was detected: in the presence of DPI the [Ca2+]ic in the sustained phase was elevated (Fig. 6a). Measured 120 s after addition of fMLP, the amplitude of the Ca2+ signal in the DPI-treated cells was 148·5 ± 5·9% (n = 10) of the value detected in the nontreated cells. Neither plasma membrane depolarization nor Ca 2+ signal induced
by fMLP were influenced by addition of superoxide dismutase to the extracellular medium (data not shown). Thus, generated O2.per se cannot be responsible for the observed difference in the Ca2+ signal. In neutrophilic granulocytes, a typical Ca2+ signal can be also evoked by ATP. However, this agent does not initiate O2.-generation and does not induce any change in the plasma membrane potential (Fig. 6d). The ATP-stimulated Ca2+ signal was not influenced by treatment of the cells by DPI (Fig. 6c).
DISCUSSION Our data show that initiation of O 2.- production results in a significant depolarization in differentiated wild-type PLB cells similar to peripheral neutrophilic granulocytes. In contrast, stimulants of the respiratory burst have no effect on the membrane
© 2003 Blackwell Publishing Ltd, Clinical and Experimental Immunology, 132:53–60
58
B. K. Rada et al.
100 C PT
80 60
T 40
0
20
Relative fluorescence %
(c)
60 40 Time (s)
C
80 PT
60
T
40 20
60 40 Time (s)
100 C
80 60
PT T
40
0
20
(d)
100
0
PLB-985 X-CGD
120
100
80
PLB-985 S1
120
Relative fluorescence %
(b) PLB-985 wild-type
Relative fluorescence %
Relative fluorescence %
(a) 120
120
100
100 C
80 60
PT T
40
100
80
60 40 80 Time (s) PLB-985 M1
0
20
60 40 Time (s)
80
100
Fig. 4. Effect of PMA on the thapsigargin-induced Mn2+ entry in the PLB-985 cells. FURA-2-loaded PLB-985 cells were suspended in Ca2+ free H-medium (106/ml) and allowed to equilibrate for 4–5 min. Capacitative calcium influx was induced by the addition of 100 nM thapsigargin (T, PT), whereas in the control experiment DMSO was added (c). Ten minutes after thapsigargin, 1 mM MnCl2 was introduced into the extracellular medium (marked by the arrow) and the quenching of the fluorescence was followed in time. Where indicated, 100 nM PMA (PT) was added to the cells 2 min before MnCl2. The results are representative for five (wild-type and X-CGD) or four (S1) independent experiments.
(a) 700
(b)
Ca2+-containing medium
600
400
500 400 300
X-CGD
200
[Ca2+]ic (nM)
[Ca2+]ic (nM)
Ca2+-free medium
500
300 200 X-CGD S1
100
100
S1
0
0 0
100 200 300 400 500 Time (s)
0
100
200 300 Time (s)
400
500
Fig. 5. Comparison of the fMLP-induced calcium signals in PLB-985 X-CGD and S1 cells in Ca2+ containing and Ca2+ free medium. FURA2-loaded, differentiated cells (106/ml) were suspended in Ca2+ containing medium (a) or in Ca2+ free medium (b). The cells were allowed to equilibrate for 4–5 min and then stimulated by 1 mM fMLP (indicated by the arrow). The curves are representative for three independent experiments.
potential in the CGD-PLB cell line. Thus, PLB cells provide a useful cell line for studying the electrophysiological changes accompanying activation of the NADPH oxidase. In the present study, inhibition of Ca2+ entry showed a clear correlation with the capability of O 2.--production and membrane depolarization. Ca2+ influx was decreased in the wild-type cells and in CGD cells after transfection with the wild-type gp91 phox. No inhibition of Ca2+ (or Mn2+) entry was detected either in the absence of any gp91phox molecule (CGD-PLB cells) or in the
presence of a mutant gp91phox unable to transfer electrons (M1 cell line). Thus, in neutrophilic granulocytes, inhibition of Ca2+ entry by phorbol ester requires a functional oxidase. The present experiments carried out on genetically modified cell lines are in good agreement with our previous experiments based on inhibitor substances and indicate clearly that the decrease in Ca 2+ influx is the consequence of the drop in the driving force due to the electrogenic nature of the oxidase [9]. In the absence of a functional oxidase, treatment with the PKC activator PMA had no effect at
© 2003 Blackwell Publishing Ltd, Clinical and Experimental Immunology, 132:53–60
(a) 800 700 600 500 400 300 200 100 0 0
DPI+fMLP
fMLP
DPI+fMLP
0
ATP
100 200 300 400 500 Time (s)
Membrane potential (mV)
[Ca2+]ic (nM)
fMLP
100
200 300 Time (s)
400
500
(d)
DPI+ATP
0
0 –10 –20 –30 –40 –50 –60 –70 –80
100 200 300 400 500 Time (s)
(c) 400 350 300 250 200 150 100 50 0
59
(b) Membrane potential (mV)
[Ca2+]ic (nM)
Calcium signalling in CGD
0 –10 –20 –30 –40 –50 –60 –70 –80
DPI+ATP ATP 0
100
200 300 Time (s)
400
500
Fig. 6. Stimulus-induced calcium signals and membrane potential changes in fMLP- and ATP-treated human neutrophils. Calcium signals (a, c) and membrane potential changes (b, d) of human neutrophils stimulated with 1 mM fMLP or 10 mM ATP were compared. Where indicated, DPI was added in a concentration of 5 mM, 2 min prior to fMLP or ATP (addition of DPI is indicated by the open arrows, that of fMLP and ATP by the black arrows). The results presented are representative of 11 (a), five (b) or three (c, d) independent experiments.
all. Thus, any direct action of PKC on the Ca 2+ entry pathway(s) of neutrophilic granulocytes seems improbable. Our data are at variance with results described in other cell types such as mesangial cells and keratinocytes, where PKC was suggested to be involved directly in the regulation of store-operated calcium channels [12– 14]. It is possible that in different cell types regulation of the capacitative influx pathway(s) involves different mechanisms. However, in none of the previous reports has the membrane potential been measured, although O2.--production was also shown in mesangial cells [24]. All data summarized in the present paper suggest that there are significant alterations in the Ca2+ homeostasis of CGD neutrophils. In addition to differences in Ca2+ entry following thapsigargin-induced store depletion (Figs 3 and 4), the Ca2+ signal initiated by ligand binding to the fMLP receptor was also different (Figs 5 and 6). In the sustained phase, [Ca2+]ic was higher both in the absence of a functional gp91 phox in the CGD-PLB cells (Fig. 5) and when electron transfer was largely inhibited by DPI in peripheral blood neutrophils (Fig. 6). The effect is specific for oxidase-activating agonists, because ATP did not induce any O2.-production and no difference was observed in the ATP-induced Ca2+ signal of wild-type and CGD cells. Our experiments indicate a difference of approx. 100 nM in [Ca2+]ic between normal and CGD cells. In evaluating the biological significance of this difference, two conditions have to be considered. (1) The maximally effective concentration of DPI inhibited O2.--production by 98% but membrane depolarization was reduced to only approx. 50%. In CGD cells, in the complete absence of gp91phox, no change in membrane potential could be
observed at all (Fig. 3 in [9]). Thus the true alteration in the Ca 2+ signal is probably underestimated in our model experiments. (2) Our Ca2+ measurements carried out on cell suspensions provide a value of [Ca2+]ic averaged for the entire cytosolic space. However, at certain intracellular locations, such as the subplasmalemmal space, [Ca2+] is significantly higher than the averaged value [25]. Abnormal Ca2+ influx might have several important consequences in the functioning of CGD neutrophilic granulocytes. Both spontaneous and induced apoptosis was shown to be significantly slower in CGD neutrophils than in cells from healthy individuals [26]. In several cell types calcium has a central, triggering role in the apoptotic response. Interestingly, apoptosis in neutrophils reacts opposite to other cell types: elevation of [Ca2+]ic prevents apoptosis [27]. Delayed apoptosis observed in CGD neutrophils may be due to the abnormally increased influx of Ca2+. Elevated [Ca2+]ic has also been shown to trigger the activation of phospholipase A2 [28] and the de novo synthesis of several cytokines. In case of the chemotactic agent IL-8 it has been reported that a rise of 50–100 nM in [Ca2+]ic is able to induce a significant increase in the synthesis and secretion of this peptide [29]. It is thus possible that retarded apoptosis and increased chemotactic attraction via elevated IL-8 secretion may participate in the formation of granulomas typical for CGD.
ACKNOWLEDGEMENTS The authors are indebted to Dr M. Dinauer for the gp91phox deficient PLB985 cells, Dr M. Nakamura for the 7D5 antibodies and to Ms Erzsébet
© 2003 Blackwell Publishing Ltd, Clinical and Experimental Immunology, 132:53–60
60
B. K. Rada et al.
Seres-Horváth, Edit Fedina and Krisztina Sütõ for excellent and devoted technical assistance. Experimental work was financially supported by grants from the Hungarian Health Council (ETT316/2000), Hungarian Research Fund (T037755, Ts040865) and FKFP (0156/2001).
14
15
REFERENCES
16
1 Krause KH, Schlegel W, Wollheim CB, Andersson T, Waldvogel FA, Lew PD. Chemotactic peptide activation of human neutrophils and HL-60 cells. Pertussis toxin reveals correlation between inositol trisphosphate generation, calcium ion transients, and cellular activation. J Clin Invest 1985; 76:1348–54. 2 Demaurex N, Schlegel W, Varnai P, Mayr G, Lew DP, Krause KH. Regulation of Ca2+ influx in myeloid cells. Role of plasma membrane potential, inositol phosphates, cytosolic free [Ca2+], and filling state of intracellular Ca2+ stores. J Clin Invest 1992; 90:830–9. 3 Scharff O, Foder B. Regulation of cytosolic calcium in blood cells. Physiol Rev 1993; 73:547–82. 4 Montero M, Garcia-Sancho J, Alvarez J. Transient inhibition by chemotactic peptide of a store-operated Ca2+ entry pathway in human neutrophils. J Biol Chem 1993; 268:13055–61. 5 Montero M, Garcia-Sancho J, Alvarez J. Inhibition of the calcium store-operated calcium entry pathway by chemotactic peptide and by phorbol ester develops gradually and independently along differentiation of HL60 cells. J Biol Chem 1993; 268:26911–9. 6 Henderson LM, Chappell JB, Jones OT. The superoxide-generating NADPH oxidase of human neutrophils is electrogenic and associated with an H+ channel. Biochem J 1987; 246:325–9. 7 Schrenzel J, Serrander L, Banfi B et al. Electron currents generated by the human phagocyte NADPH oxidase. Nature 1998; 392:734–7. 8 Jankowski A, Grinstein S. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. J Biol Chem 1999; 274:26098–104. 9 Geiszt M, Kapus A, Nemet K, Farkas L, Ligeti E. Regulation of capacitative Ca2+ influx in human neutrophil granulocytes. Alterations in chronic granulomatous disease. J Biol Chem 1997; 272:26471–8. 10 Korchak HM, Kilpatrick LE. Roles for beta II-protein kinase C and RACK1 in positive and negative signaling for superoxide anion generation in differentiated HL60 cells. J Biol Chem 2001; 276:8910–7. 11 Korchak HM, Corkey BE, Yaney GC, Kilpatrick LE. Negative regulation of ligand-initiated Ca (2+) uptake by PKC-beta II in differentiated HL60 cells. Am J Physiol Cell Physiol 2001; 281:C514– 23. 12 Mene P, Pugliese F, Cinotti GA. Regulation of capacitative calcium influx in cultured human mesangial cells: roles of protein kinase C and calmodulin. J Am Soc Nephrol 1996; 7:983–90. 13 Mene P, Pugliese G, Pricci F, Di Mario U, Cinotti GA, Pugliese F. High glucose level inhibits capacitative Ca2+ influx in cultured rat
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
29
mesangial cells by a protein kinase C-dependent mechanism. Diabetologia 1997; 40:521–7. Gonczi M, Papp H, Biro T, Kovacs L, Csernoch L. Effect of protein kinase C on transmembrane calcium fluxes in HaCaT keratinocytes. Exp Dermatol 2002; 11:25–33. Geiszt M, Kapus A, Ligeti E. Chronic granulomatous disease: more than the lack of superoxide? J Leukoc Biol 2001; 69:191–6. Reeves EP, Lu H, Jacobs HL et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature 2002; 416:291–7. Tucker KA, Lilly MB, Heck L Jr, Rado TA. Characterization of a new human diploid myeloid leukemia cell line (PLB-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity. Blood 1987; 70:372–8. Zhen L, King AA, Xiao Y, Chanock SJ, Orkin SH, Dinauer MC. Gene targeting of X chromosome-linked chronic granulomatous disease locus in a human myeloid leukemia cell line and rescue by expression of recombinant gp91phox. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90:9832–6. Hjorth R, Jonsson AK, Vretblad P. A rapid method for purification of human granulocytes using Percoll. A comparison with dextran sedimentation. J Immunol Meth 1981; 43:95–101. Grynkiewicz G, Poenie M, Tsien RY. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem 1985; 260:3440–50. Seligmann BE, Gallin JI. Use of lipophilic probes of membrane potential to assess human neutrophil activation. Abnormality in chronic granulomatous disease. J Clin Invest 1980; 66:493–503. Foder B, Scharff O, Thastrup O. Ca2+ transients and Mn2+ entry in human neutrophils induced by thapsigargin. Cell Calcium 1989; 10:477–90. Lew PD, Wollheim C, Seger RA, Pozzan T. Cytosolic free calcium changes induced by chemotactic peptide in neutrophils from patients with chronic granulomatous disease. Blood 1984; 63:231–3. Baud L, Hagege J, Sraer J, Rondeau E, Perez J, Ardaillou R. Reactive oxygen production by cultured rat glomerular mesangial cells during phagocytosis is associated with stimulation of lipoxygenase activity. J Exp Med 1983; 158:1836–52. Marsault R, Murgia M, Pozzan T, Rizzuto R. Domains of high Ca2+ beneath the plasma membrane of living A7r5 cells. EMBO J 1997; 16:1575–81. Kasahara Y, Iwai K, Yachie A et al. Involvement of reactive oxygen intermediates in spontaneous and CD95 (Fas/APO-1)-mediated apoptosis of neutrophils. Blood 1997; 89:1748–53. Whyte MK, Hardwick SJ, Meagher LC, Savill JS, Haslett C. Transient elevations of cytosolic free calcium retard subsequent apoptosis in neutrophils in vitro. J Clin Invest 1993; 92:446–55. Tintinger GR, Theron AJ, Steel HC, Anderson R. Accelerated calcium influx and hyperactivation of neutrophils in chronic granulomatous disease. Clin Exp Immunol 2001; 123:254–63. Kuhns DB, Young HA, Gallin EK, Gallin JI. Ca2+-dependent production and release of IL-8 in human neutrophils. J Immunol 1998; 161:4332–9.
© 2003 Blackwell Publishing Ltd, Clinical and Experimental Immunology, 132:53–60
2. közlemény
Blood First Edition Paper, prepublished online July 13, 2004; DOI 10.1182/blood-2004-03-1005
DUAL ROLE OF PHAGOCYTIC NADPH OXIDASE IN BACTERIAL KILLING Balázs K. Rada, Miklós Geiszt, Krisztina Káldi, Csaba Tímár and Erzsébet Ligeti Department of Physiology, Semmelweis University, Budapest, Hungary
Short title: Dual role of NADPH oxidase in bacterial killing Experimental work was financially supported by grants from the Hungarian Research Fund (OTKA T037755, Ts040865, M036310), the Hungarian Ministry of Health (ETT 041/2003) and FIRCA (1 R03 TW006421-01A1).
Corresponding author: Erzsébet Ligeti M.D., Ph.D. Department of Physiology, Semmelweis University H-1444 Budapest, P.O.Box 259, Hungary phone: 361 266 7426, fax: 361 266 6504 email:
[email protected]
Word count: text: 4712 abstract: 189 Heading: Phagocytes
Copyright (c) 2004 American Society of Hematology
ABSTRACT The classical model of bacterial killing by phagocytic cells has been recently challenged by questioning the toxic effect of oxygen products and attributing fundamental role to K+ ions in releasing antimicrobial proteins within the phagosome. In the present study we followed O2.--production, changes of membrane potential, K+ efflux and bacterial killing in the presence of increasing concentrations of the NADPH oxidase inhibitor diphenylene iodonium. Efficiency of bacterial killing was assessed on the basis of bacterial survival measured by a new semi-automated method. Very low rates of O2.--production were accompanied by significant membrane depolarization and K+-release and parallel improvement of bacterial killing. When O2.--production exceeded 20% of its maximal capacity, no further change was detected in the membrane potential and only minimal further K+ efflux occurred, yet bacterial survival decreased parallel to the increase of O2.--production. The presented results indicate that both electrophysiological changes (depolarization and consequent ion movements) and chemical effect of reactive oxygen species play significant role in the killing of certain pathogens. The observation that an increase of membrane depolarization can compensate for decreased O2.--production may be important for potential therapeutic applications. INTRODUCTION Phagocytic cells play a fundamental role in the antimicrobial defense by engulfing and killing various potentially pathogenic microorganisms. Patients with chronic granulomatous disease (CGD) suffer repeated, often fatal infections due to severe impairment of the antimicrobial defense mechanisms1. The discovery that CGD is the consequence of a genetic defect in one of the essential subunits of the O2.--producing NADPH oxidase, provided strong support for the role of O2.- and other reactive oxygen species (ROS) in the mechanism of bacterial killing2. When activated, NADPH oxidase transfers electrons from intracellular NADPH to extracellular (or intraphagosomal) O2 forming O2.- anions. The enzyme carries out an electrogenic function, i.e. with each turn one negative charge is removed from the cell3. This charge movement is reflected in depolarization of the plasma membrane that was shown to accompany O2.--production. In fact, intensive O2.--generation is able to reverse the polarity of the plasma membrane: in resting PMN values around -60 mV have been measured4 whereas upon PMA-stimulation the membrane potential approached +60 mV5. The electronmotive force of the enzyme is similar to that of mitochondrial cytochromes: electron current via the phagocytic NADPH oxidase ceases only around +200 mV6. Decrease or reversal of the plasma membrane potential alters the driving force for all other charged particles, favoring outward movement of cations and inward movement of anions. Indeed, compensating H+-efflux has been demonstrated by many laboratories7-12 although the underlying transport pathway(s) are still subject of intensive investigations4. More recently K+-efflux has also been reported from activated PMN13,14. On the other hand, plasma membrane depolarization impedes Ca2+ influx induced either by store depletion or by stimulation of chemotactic receptors15,16. In view of all these ion movements initiated by the charge separation via the NADPH oxidase, we had proposed that alteration of the ionic composition of the intraphagosomal space may contribute to the impairment of bacterial killing in CGD17. Recently Reeves and coworkers questioned the toxic effect of various ROS under the conditions of the
phagosome18. Instead, they suggested a specific role for K+ ions enriched in the intraphagosomal space, in the release of granule enzymes from their polyanionic support and thereby in their activation. In fact, this hypothesis reduces the role of O2.--generation to providing driving force for K+ movement into the phagosomes13,14. The aim of the present study was to gain insight into the relative importance in bacterial killing of i) O2.- as a reactive molecule and ii) membrane potential changes initiated by electron transfer via the O2.--generating NADPH oxidase. Our approach consisted of stepwise decrease of the rate of O2.--production by applying increasing concentrations of the inhibitor diphenylene iodonium (DPI) and relating O2.--generation to changes of the plasma membrane potential, K+ release and bacterial killing. Our quantitative analysis provides experimental support that both O2.- and ion movements contribute to the killing of some microorganisms (e.g. Staphylococcus aureus) whereas in other cases (e.g. E.coli) none of them seem to be decisive. METHODS Materials Ficoll was from Pharmacia (Peapack, NJ); di-O-C5(3) from Molecular Probes (Eugene, OR); saponin from Calbiochem (Darmstadt, Germany); valinomycin, cytochrome c, lucigenin, cytochalasin-B, phorbol-miristate-acetate (PMA), formyl-methionyl-leucylphenylalanine (fMLP), DPI from Sigma (St. Louis, MO). 86RbCl was purchased from the Izotóp Intézet Kft (Budapest, Hungary). All other reagents were of research grade. The extracellular medium (called H-medium) contained: 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 0.8 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 5 mM glucose, pH=7.4. The Luria-Bertani (LB) medium contained: 10 g/l tryptone, 5 g/l yeast extract, 80 mM NaCl, 1 mM NaOH. Preparation of neutrophil granulocytes from human blood Human neutrophils were obtained from blood of healthy volunteers by dextran sedimentation followed by Ficoll-Paque gradient centrifugation using endotoxin-free solutions and sterile conditions at 4°C to prevent premature activation of the cells. Contaminating red blood cells were removed by hypotonic lysis. Cells were finally resuspended in sterile endotoxin-free H-medium and kept on ice until use. Preparations contained more than 95% neutrophils, their viability, as determined by erythrosin B dye exclusion, exceeded 95%. Measurement of O2.- -production Superoxide production of the cells was tested with the superoxide dismutaseinhibitable cytochrome c reduction or the lucigenin-based chemiluminescence. To measure superoxide production in the extracellular medium with cytochrome c, cells (106/ml) were suspended in H-medium containing 100 µM cytochrome c. Control samples contained 12.5 µg/ml superoxide dismutase. Aliquots (200 µl) of the suspension were added into wells of a 96-well plate and prewarmed at 37°C for 5 minutes in a shaking ELISA-reader (Labsystems iEMS Reader MF). The cells were stimulated with the appropriate stimuli by the addition of 5 µl of the stimulus solution. The changes in the absorption were recorded at 550 nm for 10 minutes with 2 measurements/min at 37°C with gentle shaking. After subtracting the background values, superoxide production was calculated with the use of an absorption coefficient of 21 mM-1cm-1 for cytochrome c. To measure reactive oxygen species production with lucigenin-based chemiluminescence the cells (107/ml) were suspended in H-medium containing 5.1 mg/ml lucigenin (dissolved in DMSO). Aliquots (200 µl) of the suspension were added into wells of
a 96-well plate and prewarmed at 37°C for 5 minutes in a shaking Fluoroskan Ascent FI luminometer (Labsystems). Cells were stimulated with the appropriate stimuli by the addition of 5 µl of the stimulus solution. Changes in the luminescence were recorded for 20 min at 37°C with gentle shaking. In 6 independent experiments linear correlation was obtained between values of cytochrome c reduction and chemiluminescence, thus relative fluorescence units (RLU) were converted to nmol superoxide on the basis of parallel measurement of PMA-stimulated O2.--production by cytochrome c reduction. Measurement of membrane potential changes Changes in the membrane potential were followed by the potential-sensitive fluorescent dye 3-3’-dipentyloxacarbocyanine, di-O-C5(3) as described in19. Cells (106/ml) were suspended in H-medium in a stirred cuvette at 37°C and the changes in fluorescence were followed in a Deltascan dual-wavelength spectrofluorimeter (Photon Technology International, South Brunswick, NJ) with 484 nm as excitation and 510 nm as emission wavelengths. The cells were preincubated for 5 minutes, before 100 nM di-O-C5(3) was added. Fluorescence reached a constant value in 6 to 7 min. Thereafter, the cells were stimulated with different stimuli (fMLP, PMA) and the changes in the fluorescence were monitored. The obtained fluorescence data were calibrated to membrane potential values (mV) using 2 µg/ml valinomycin in a suspension of cells with different external K+concentrations as described in15. The values attained at 1 or 2 min after stimulation with fMLP or PMA, respectively were used for further calculations. Measurement of the 86Rb-release from neutrophils Neutrophils (107/ml) were incubated in H-medium with 86RbCl (0.25 µCi) for 30 minutes at 37 ºC, washed twice in cold PBS and resuspended in H-medium at the density of the killing assay (107/ml). After incubation w/wo stimuli at 37 ºC for 5 minutes, the cells were immediately centrifuged (4 min, 500 x g). Radioactivity was determined in an aliquot (100 µl) of the cell-free supernatant using an Automatic Gamma Counter (Wallac, 1470 Wizrad TM). The 86Rb-efflux detected in the unstimulated samples was subtracted from the values of the stimulated ones. The 86Rb-release of the PMA-stimulated, DPI-free sample was taken as 100%. DPI by itself did not induce any 86Rb-efflux from the cells. Measurement of bacterial survival Bacteria (9x108 cells in 900 µl LB medium) were opsonized with 100 µl mixed human blood serum of at least 5 different donors for 5 min at 37 ˚C. PMN (9x 106 in 900 µl Hmedium) were then incubated with 100 µl (108/ml) opsonized bacteria for 30 min at 37 ˚C. Samples (100 µl) were taken at indicated timepoints and lysed in 900 µl ice-cold H-medium containing 1 mg/ml saponin. In the case of Staphylococcus aureus additional treatment at -80 ˚C for 20 minutes was applied. Freezing did not impair subsequent growth of S. aureus. Bacterial growth was followed in a plate reader (Labsystems iEMS Reader MF) on the basis of changes in optical density, taking into account that in the exponential phase of bacterial growth their division time is constant. For calculations we applied the principles of real-time PCR, thus we characterize the samples containing unknown amount of living bacteria with an incubation time (tinc) the length of which is only dependent on the initial bacterial concentration. Specifically, lysed PMN samples were diluted in LB to decrease the initial OD (typically a 5-fold dilution to a final volume of 200 µl/well was applied). A parallel series of 1:2 dilutions from the stock bacterial suspension (108/ml) was also prepared in LB. Then bacteria were grown in a shaking plate reader at 37 ˚C for 5 to 8 hours and the OD was followed continuously at 650 nm. Samples were run in 4 to 8 parallells. The data obtained in a
typical experiment are shown in Fig. 1A. The time required for achieving a certain OD value (in most experiments 0.2 was chosen) was determined for each dilution and plotted as initial bacterial count vs incubation time (tinc). A straight line was fitted on the experimental points (Fig. 1B) and the number of survived bacteria was calculated with the following formula: [E. coli or S. aureus] = f * e -g * tinc
(Eq. 1)
where tinc indicates the incubation time required to reach the threshold OD value, f is a numerial factor and g is the slope of the line, indicating the rate of bacterial reproduction. This calibration was then used to determine the number of viable bacteria in the lysed samples taken in the killing assay. Each experiment was calculated on the basis of its own calibration curve. The slope of the curve shown in Fig. 1B allows the determination of the average division time of the investigated microorganism. Summarizing all experiments, 17.1 ± 1.91 min (SEM, n=29) and 28.6 ± 1.1 min (SEM, n=63) was obtained as division time for E.coli and S. aureus, respectively. Thus, experiments carried out on different days showed high reproducibility. Killing activity of neutrophils was assessed on the basis of the changes in the number of viable bacteria. As the 30 min incubation time with PMN exceeded the division time of both bacteria, under some experimental conditions, the final bacterial count was higher than the initial one. In the figures "bacterial survival" is represented as the final bacterial count expressed as % of the initial count. Experiments carried out to control the semi-automated bacterial growth assay Bacterial growth in the central or peripheral wells of the plate differed by less than 2% and it was not influenced by the presence of non-viable bacteria or saponin-treated PMN. The utilized concentration of saponin and dilutions of DMSO or the opsonizing serum had no effect on the growth of bacteria. DPI (0-5000 nM) was without effect on the viability and rate of reproduction of S. aureus, but inhibited E. coli. Therefore the lysed samples of the E.coli killing assays using DPI were diluted 1:500 instead of 1:5. In this dilution DPI had no inhibitory effect on E. coli cells, even in the case of 5000 nM in the killing suspension. Varying the ratio of bacteria to PMN between 1 and 10 had no significant influence on the killing efficiency in the presence of various DPI concentrations. Fig. 1. summarizes the results of a typical experiment where bacterial survival was compared by the semi-automated plate reader assay (Fig. 1C) and conventional counting of colony forming units on LB-agar plates (Fig. 1D). In the latter experiments, the lysed samples have been diluted further 1:2500 in cold H-medium and 100 µl was smeared on Petri dishes containing LB-agar and cultured overnight at 37ºC. The CFUs have been counted and presented as the percentage of the initial CFU number. Disruption of the microfilament structure by cytochalasin B is known to block phagocytosis and hence killing. In a concentration of 10 µM, cytochalasin B inhibited bacterial killing to similar extent, independent of the applied method. Statistical analysis Data are presented either as representative traces of the indicated number of experiments or as the mean ± SEM of the number of determinations indicated (n).
RESULTS Relation of O2.--production and membrane potential change
Neutrophilic granulocytes were stimulated either with phorbol myristate acetate (PMA), an activator of protein kinase C (Fig. 2A-C) or with the chemotactic peptide formylmethionyl-leucyl-phenylalanine, fMLP (Fig. 2D-F). Changes of membrane potential and O2.-production were measured in parallel samples. O2.--production induced by PMA (Fig. 2A) was detectably inhibited by 50 nM DPI and the inhibition was almost complete in the presence of 5 µM DPI. In contrast to O2.--production, membrane depolarization following PMA-stimulation was not influenced by 50 nM DPI and even in the presence of 5 µM inhibitor, there was only 50% decrease in PMA-induced depolarization (Fig. 2B). Data of 11 experiments are summarized in Fig. 2C, where both measured parameters are expressed in percentage of the values obtained in the absence of any inhibitor. The discrepancy in the sensitivity of O2.--production and membrane depolarization towards DPI is remarkable. In the case of fMLP stimulation, both the onset, the extent and duration of O2.--production and also the kinetics of membrane depolarization are different from that evoked by PMA (Fig. 2D,E). Nevertheless, fMLP-initiated O2.--generation was also inhibited at a significantly lower DPI concentration than the accompanying membrane potential change (Fig. 2F). DPI did not interfere with accumulation of the potential-sensitive fluorescent dye in the cells or alter the linearity of the calibration curve obtained in solutions of different K+ concentrations. The H+ ionophore CCCP completely prevented depolarization when it was added before the stimulus and reversed the fluorescence signal when it was applied after the stimulus-induced depolarization has taken place (data not shown). It should also be noted that the same fluorescent dye was applied in our previous experiments, where we have shown that neither PMA nor fMLP induced any detectable change in the membrane potential of neutrophil granulocytes from CGD patients15 or in gp91phox-/- PLB-985 cell lines16. Thus, we interprete the fluorescence signal detected in the presence of 5 µM DPI as depolarization induced by the remaining low rate of O2.--production. In a few experiments PMA- or fMLP-induced increase of O2 consumption has also been measured. The inhibitory effect of 5 µM DPI was similar to that determined by the cytochrome c assay (data not shown). Further analysis of the data summarized in Fig. 2 emphasizes the non-linear relation between the rate of O2.--production and the change in the membrane potential induced thereby. As shown in Fig. 3, less than 5 % of the maximal O2.--generating capacity is sufficient to induce 50 % of the maximal depolarization. On the other hand, near-maximal depolarization is attained at 20 % of the maximal O2.--producing capacity and further increase of the rate of O2.--production does not initiate significant changes in the membrane potential. The rather stable membrane potential prevailing under conditions when the rate of O2.-production increases from 20 % to 100 % maximal capacity indicates that in this phase electron transport via the NADPH oxidase is fully compensated by movement of other ion(s). Relation of O2.--production and K+ release from granulocytes In previous investigations H+ and K+ were suggested as cations potentially compensating for the electron efflux via the oxidase. In the last decade ample information has been gained on the H+ conductance of phagocytic cells under resting and activated conditions7,10-12,20 whereas the importance of K+ movements has been emphasized recently13,14. In order to gain further insight into the relation of O2.--generation and K+ release, we measured the effect of DPI upon PMA-induced efflux of 86Rb, the tracer generally used for assessing K+ movements13,14. As shown in Fig. 4A, at a concentration of 50 nM, DPI had no measurable effect on 86Rb release and even in the presence of 5 µM DPI it decreased only to 38%. Relating 86Rb efflux to parallelly measured O2.--production (Fig. 4B) revealed that less than 5% of O2.--production is accompanied by the release of 38% of the mobilized K+ and only 30% of K+ movement takes place in the phase where the rate of O2.--generation increases
from 20% to 100% of maximal capacity. The relation is very similar to that obtained between O2.--production and membrane potential changes (compare fig. 4B to 3). In fact plotting 86Rb efflux against membrane potential changes revealed a nearly linear relationship (Fig. 4C) confirming the data obtained by the fluorescent technique. Relation of O2.--production and bacterial survival In the next experiments bacterial survival was measured by a new, highly effective semi-automated method using microtiter plate reader (see Methods). Intracellular ROS production occurring during bacterial phagocytosis and killing was followed in parallel by the lucigenin-based chemiluminescence method in a luminescent plate reader. DPI inhibited the chemiluminescence signal induced by either E. coli (Fig. 5A) or S. aureus (Fig. 5B) with similar efficiency as observed in the cases of O2.--production induced by soluble stimulants. Killing of E. coli was only weakly dependent on O2.--production. In the absence of DPI 14.5 ± 3.8 % of the bacteria survived the 30 min incubation with PMN, and this value increased to 26.1 ± 7.2 % in the presence of 5 µM DPI. In contrast, survival of S. aureus depended significantly on the rate of O2.--generation. In the presence of 5 nM DPI, when O2.--production was still at 80% of the maximal capacity, bacterial survival was already increased threefold. Most significantly, when 5 µM DPI was present during the 30 min incubation with PMN, instead of decreasing, the bacterial count was doubled (Fig. 5B). Other studies indicated that 5 µM DPI does not decrease the number of engulfed bacteria (W. Nauseef, personal communication). Thus, the increase in survival has to be interpreted as impairment of the killing process. Analysing the survival of S. aureus in the function of the rate of O2.--generation (Fig. 6) reveals a multi-phase relation. Decreasing the rate of O2.--production to 20 % of the maximal capacity results in 90% bacterial survival. (As bacteria multiply during the assay, this value still indicates elimination of bacteria by neutrophils, but evidently the killing function is seriously impaired.) It should be recalled that between 20% and 100% of maximal O2.--generating capacity the membrane potential is stable and only minor K+ efflux takes place. Thus, impairment of bacterial killing occurs under conditions where electron flow via the assembled NADPH oxidase is completely compensated (mostly by H+ ions), consequently the driving force for other ion movements remains unchanged. We interpret the parallel increase in killing efficiency and rate of O2.--production in the presence of a stable membrane potential as an indication for the chemical effect of O2.- and the products formed thereof. Fig. 3 revealed a very sharp relation between membrane potential change and O2.-production when the latter fell below 20% of the maximal capacity. This relation is reflected in the survival of S. aureus, too (Fig. 6). Decreasing the O2.--generation from 20% to approx. 5 % of the maximal capacity results in an increase of bacterial survival from 90% to 140%. Finally a decrease of O2.--production by only 2 % (from 5% to 3%) leads to further increase in bacterial survival (from 140% to 200%). Effect of Zn2+ on the membrane potential, O2.--production and bacterial survival To investigate further the importance of depolarization vs. O2.- in killing of S. aureus by neutrophils, we tried to uncouple O2.--generation and membrane potential change. Unfortunately, all the agents generally used for depolarizing cells, such as Na+ ionophores or lipophilic cations, are toxic for bacteria. Zn2+ ions were shown to inhibit the electrogenic H+ pathway already at low concentration21, and in our pilot experiments they did not impede bacterial growth. Similar to previous findings6,20, Zn2+ increased the membrane depolarization by 35 ± % and decreased the rate of O2.--generation detected upon stimulation of
neutrophilic granulocytes by 30 ± %. The rate of O2.--production was slightly lower in the presence of 10 µM ZnSO4 than in the presence of 5 nM DPI (80% vs 73 % of the control value). However, unlike DPI, Zn2+ did not impair bacterial killing. In fact, bacterial survival was slightly but consistently lower than the control value: in the absence of any inhibitor 5 ....%, in the presence of 5 nM DPI 20 ... % whereas in the presence of 10 µM ZnSO4 3 ... % S. aureus survived. Apparently, differences in the extent of membrane depolarization (i.e.in the driving force for K+ efflux) are able to modify the efficiency of bacterial killing independent of the rate of O2.--generation. DISCUSSION Our experiments revealed a non-linear relation between O2.--production on one hand and membrane potential change or K+ release or bacterial killing on the other hand. At very low intensity, O2.--generation is accompanied by significant depolarization and K+ efflux: 38% of total K+ release takes place when O2.--production proceeds at less than 5% of its maximal capacity. As K+ movement accounts only for 5 to 6 % of total charge compensation13, it can be calculated that in this initial phase roughly half of the electron efflux is compensated by parallel K+ efflux. Our experiments indicated -60 mV as the membrane potential in resting neutrophils (Fig. 2) and this value corresponds well to earlier findings4. The closeness of the resting membrane potential to the calculatable equilibrium potential for K+ (-80 mV) indicates that under resting conditions K+ conductance dominates. This conclusion is further supported by our observation that in the presence of 5 µM DPI, the H+-transport inhibitor Zn2+ had no detectable influence on the membrane potential (data not shown). However, the relatively high K+ conductance of the plasma membrane of neutrophilic granulocytes prevailing at rest is still limiting the rate of K+ movements and results in the abrupt change of the membrane potential upon initiation of O2.--production. In our experiments (Fig. 3) approx. 50% of the maximal depolarization occurs in this phase, thus a change by 30 to 50 mV can be estimated. Elimination of bacteria is severely impeded at this low rate of O2.--production, as survival of S. aureus attained 200%. At moderate rate of O2.--production (between 5 and 20 % of the maximal capacity) both the membrane potential change and K+ release are attenuated. Electrogenic H+ efflux pathways were shown to be potential-sensitive and exhibit a threshold for opening that is, depending on the exact conditions, 20 to 40 mV more positive than the resting membrane potential10-12. Channel opening processes being statistical events, probably in this range of O2.-generation H+ conducting pathways open gradually and charge compensation for electron transfer is taken over more and more by H+ efflux. Bacterial killing capacity is significantly increased as indicated by the drastic fall of survival of S. aureus from 200% to 90%. Assuming that the proportion of oxidase molecules to ion transporters does not basically differ between the plasma and the issueing phagosomal membrane, we related bacterial survival to the membrane potential change and to K+ efflux. Both relations resulted in a straight line (data not shown), supporting the concept that depolarization and ion movements initiated by the electrogenic oxidase may have a decisive role in the killing process. It should also be noted that membrane potential and K+ efflux exhibited a linear relationship (Fig. 5C), indicating constant K+ conductance in the measured range of membrane potential (approx. between -20 and + 60 mV). This observation can be accorded with the recent report on the appearance of an outward current at -30 mV in PMA-activated neutrophils14, although many details of these latter experiments have been criticized22. Finally, when O2.--production exceeds 20% of the maximal capacity, alteration of the membrane potential becomes minimal and the remaining K+ efflux accounts only for approx.
1 to 2% of the electron efflux. In activated eosinophils, under current-clamped conditions it was shown that the value of the membrane potential followed the equilibrium potential of H+ ions, both in the absence and in the presence of K+ in the pipette solution20. These findings indicate that in the case of fully activated oxidase, the conductance for protons largely exceeds the conductance of any other ions. Thus, at high rate of O2.--generation protons serve as dominant charge compensating ions. At the stable membrane potential no dramatic change occurs in the driving force for any other mobile ion, thus no serious change in the ion composition of the phagosome can be expected except for an increase of O2.- itself and of the compensating H+ ions. On the other hand, survival of S. aureus diminishes from 90% to 5 % as O2.--generation increases from 20% to 100% capacity, indicating a significant increase in the bacterial killing activity of neutrophils. Under the apparently stable electrophysiological conditions of the phagosome an enhancement of the killing capacity developing parallel to the increase in [O2.-] and [H+] has to be ascribed to the chemical effect of these products (plus their derivatives). In our experiments the variable parameter was the rate of O2.--production gradually decreased by increasing doses of the inhibitor DPI. During phagocytosis, the observations detailed above may correspond to different phases following the onset of O2.--production initiated by particular stimuli. We suggest that at the beginning of the process K+ efflux dominates, causing a rapid increase in [K+] inside the phagosome and allowing for the temporary alkalinization of the intraphagosomal space14,23. As the process progresses, H+ efflux takes over and contributes to the acidification of the phagosomal milieu observed in earlier experiments14,23. Furthermore, the experimental condition in the presence of high DPI concentration is relevant to the pathological situation when neutrophils become activated in an environment of very low oxygen tension, such as inside of abcesses or in poorly perfused regions. When the availability of oxygen limits the rate of electron transfer via the NADPH oxidase, membrane depolarization and consequent ion movements may become critical in the battle with the invading pathogen. Taken together, the presented data provide experimental support for our earlier hypothesis17 that both depolarization and secondary ion movements initiated by electron transfer via the NADPH oxidase, and the produced O2.- and its derivatives as chemical compounds participate in the killing of certain bacteria. The significance and contribution of the two mechanisms to the entire killing process may depend on the exact conditions, such as availability of oxygen or the species of the invading microorganism. The experiments carried out in the presence of the H+-channel inhibitor Zn2+ suggest that an increase of the membrane potential change may compensate for a decrease of O2.--production. Improvement of bacterial killing by modification of ion channel activity would be a basically new concept in the therapy of infectious diseases. ACKNOWLEDGEMENTS The authors are indebted to Profs. D. Roos and P. Enyedi and Dr. A. Mócsai for critical reading of the manuscript and to Ms. Erzsébet Seres-Horváth, Edit Fedina and Krisztina Süt for expert and devoted technical assistance.
REFERENCES
1. Segal BH, Leto TL, Gallin JI, Malech HL, Holland SM. Genetic, biochemical, and clinical features of chronic granulomatous disease. Medicine. 2000;79:170-200. 2. Klebanoff SJ. (1999) Oxygen metabolites from phagocytes. In: Gallin JI, Snyderman R, eds. Inflammation, Basic Principles and Clinical Correlates. Philadelphia, PA: Lippincott Willams & Wilkins; 1999:721-768. 3. Schrenzel J, Serrander L, Banfi B, et al. Electron currents generated by the human phagocyte NADPH oxidase. Nature. 1998;392:734-737. 4. Decoursey TE. Voltage-gated proton channels and other proton transfer pathways. Physiol Rev. 2003;83:475-579. 5. Jankowski A, Grinstein S. A noninvasive fluorimetric procedure for measurement of membrane potential. Quantification of the NADPH oxidase-induced depolarization in activated neutrophils. J Biol Chem. 1999;274:26098-26104. 6. DeCoursey TE, Morgan D, Cherny VV. The voltage dependence of NADPH oxidase reveals why phagocytes need proton channels. Nature. 2003;422:531-4. 7. Henderson LM, Chappell JB, Jones OT. The superoxide-generating NADPH oxidase of human neutrophils is electrogenic and associated with an H+ channel. Biochem J. 1987;246:325-329. 8. Kapus A, Szászi K, Ligeti E. Phorbol 12-myristate 13-acetate activates an electrogenic H+conducting pathway in the membrane of neutrophils. Biochem J. 1992;281:697-701. 9. Kapus A, Suszták K, Ligeti E. Regulation of the electrogenic H+-channel in the plasma membrane of neutrophil granulocytes. Biochem J.1993;292:445-450. 10. Kapus A, Romanek R, Qu AY, Rotstein OD, Grinstein S. A pH-sensitive and voltagedependent proton conductance in the plasma membrane of macrophages. J Gen Physiol. 1993;102:729-760. 11. Demaurex N, Grinstein S, Jaconi M, Schlegel W, Lew DP, Krause KH. Proton currents in human granulocytes: regulation by membrane potential and intracellular pH. J Physiol. 1993;466:329-344. 12. DeCoursey TE, Cherny VV. Potential, pH, and arachidonate gate hydrogen ion currents in human neutrophils. Biophys J. 1993;65:1590-1598. 13. Reeves EP, Lu H, Jacobs HL, et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 2002; 416:291-297. 14. Ahluwalia J, Tinker A, Clapp LH, et al. The large-conductance Ca2+-activated K+ channel is essential for innate immunity. Nature. 2004;427:853-858. 15. Geiszt M, Kapus A, Nemet K, Farkas L, Ligeti E. Regulation of capacitative Ca2+ influx in human neutrophil granulocytes. Alterations in chronic granulomatous disease. J Biol Chem 1997; 272:26471-26478. 16. Rada BK, Geiszt M, van Bruggen R, Német K, Roos D, Ligeti E. Calcium signaling is altered in myeloid cells with a deficiency in NADPH oxidase activity. Clin Exp Immun. 2003;132:53-60. 17. Geiszt M, Kapus A, Ligeti E. Chronic granulomatous disease: more than the lack of superoxide? J Leukoc Biol 2001; 69:191-196. 18. Reeves EP, Nagl M, Godovac-Zimmermann J, Segal AW. Reassessment of the microbicidal activity of reactive oxygen species and hypochlorous acid with reference to the phagocytic vacuole of the neutrophil granulocyte. J Med Microbiol. 2003;52:643-51. 19. Seligmann BE, Gallin JI. Use of lipophilic probes of membrane potential to assess human neutrophil activation. Abnormality in chronic granulomatous disease. J Clin Invest 1980; 66:493-503 20. Bánfi B, Schrenzel J, Nüsse O, et al. A novel H+ conductance in eosinophils: unique characteristics and absence in chronic granulomatous disease. J Exp Med. 1999;190:183194.
21. Káldi K, Szászi K, Suszták K, Kapus A, Ligeti E. Lymphocytes possess an electrogenic H+transporting pathway in their plasma membrane Biochem J. 1994;301:329-334. 22. DeCoursey TE. During the respiratory burst do phagocytes need proton channels or potassium channels, or both? Science STKE 2004; pe21 23. Segal AW, Geisow M, Garcia R, Harper A, Miller R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 1981;290: 406-409.
LEGENDS TO FIGURES Fig. 1. Determination of bacterial concentrations in the semi-automated killing assay and comparison to conventional plating. Serial dilution of the E.coli suspension was prepared and bacteria were grown on a 96-well plate as described in Matherial and Methods. A. Changes in absorbtion at 650 nm were followed in time. B. Initial concentration of bacteria was plotted against the obtained incubation time values (tinc). Error bars represent S.D. of four parallel samples. Fitting a straight line on the experimental data resulted in the following calibration equation: [E.coli] = 2.220,6 x e -0.0365 x tinc x 106 /ml. The results of one representative experiment out of 29 similar ones are shown. C. Time-course of the decrease in surviving bacteria followed by the semi-automated assay. D. Time-course of the decrease in surviving bacteria determined by conventional plating. Where indicted, cytochalasin B (CB) was present at a concentration of 10 µM. The results shown are representative of 4 similar experiments. Fig. 2. Effect of DPI on superoxide production (A,D) and membrane depolarization (B,E) in human neutrophils stimulated with PMA (A-C) or fMLP (D-F). Neutrophils were pretreated with the indicated concentration of DPI for 3 min and subsequently stimulated with 100 nM PMA or 1 µM fMLP. Superoxide production was measured by cytochrome c reduction. Membrane potential of non-stimulated cells is indicated by "ns". In C and F data are expressed as percentage of the value obtained in the DPI-free samples. In C the mean ± SEM of 11 (superoxide production) and 5 (membrane depolarization) independent experiments are summarized whereas F represents the data of 3 independent experiments. Fig. 3. Relation of membrane depolarization to superoxide production in fMLP- or PMA-activated human neutrophils. Data presented in Fig. 2C and 2F are replotted so that each point represents values obtained at the same DPI concentrations. Fig. 4. Effect of DPI on PMA-induced 86Rb-efflux from human neutrophils. A. Human neutrophils were loaded with 86Rb and pretreated with the indicated concentration of DPI for 3 min. 86Rb-efflux was subsequently initiated with 100 nM PMA. Data are expressed as percentage of the value obtained in the absence of DPI. B. 86Rb-release was related to superoxide production detected in the presence of the same DPI concentration. C. 86Rbrelease was related to the extent of membrane depolarization obtained in the presence of the same DPI concentration. Fig. 5. Effect of DPI on bacterial survival and bacteria-induced ROS generation in human neutrophils stimulated with either opsonized Escherichia coli (A) or Staphylococcus aureus (B). Superoxide (ROS) production was measured by
chemiluminescence and expressed as percentage of the maximal value obtained in the absence of DPI. Bacterial survival numbers represent the ratio of survived CFU/initial CFU. Mean ± SEM of 5 (survival of E.coli), 3 (E.coli-induced ROS-production), 10 (survival of S.aureus) and 5 (S.aureus-induced ROS-production) independent experiments are presented. 100% ROS production corresponds in the case of E. coli and S. aureus to 3.52 and 4.46 nmol O2.- per 10 min per 106 PMN, respectively. Fig. 6. Relation of bacterial survival to superoxide (ROS) generation. Data presented in Fig. 5A and 5B are replotted so that each point represents values obtained at the same DPI concentrations.
3. közlemény
BBRC Biochemical and Biophysical Research Communications 310 (2003) 1241–1246 www.elsevier.com/locate/ybbrc
Degranulation and superoxide production depend on cholesterol in PLB-985 cellsq gnes Kalocsai,a Bal Krisztina K aldi,a A azs K. Rada,a G abor Mez} o,b Gergely Z. Molnar,a a a,* €rgy B Gyo athori, and Erzsebet Ligeti b
a Department of Physiology, Semmelweis University, Budapest, POB 259, H-1444, Hungary Research Group of Peptide Chemistry, E€ otv€ os L. University, Hungarian Academy of Sciences, Budapest 112, POB 32, H-1518, Hungary
Received 16 September 2003
Abstract The effect of agents disrupting cholesterol-rich microdomains of the cell membrane was studied on the chemoattractant receptor (FPR and FRPL1) coupled effector responses of promyelocytic PLB-985 cells. Both methyl-b-cyclodextrin (MbCD) and filipin III inhibited exocytosis of primary granules and O 2 -production induced by stimulation of either chemotactic receptor. Alteration of calcium homeostasis of MbCD-treated cells does not account for the impairment of the effector responses. Disruption of microfilaments by cytochalasin B (CB) partially reverses the inhibitory effect of cholesterol depletion. Our results provide functional support for the involvement of cholesterol-rich membrane domains in the signaling of chemotactic receptors and call the attention to the possible role of microfilaments in the organization of lipid microdomains. Ó 2003 Elsevier Inc. All rights reserved. Keywords: Lipid rafts; FPR; FPRL1; Ca2þ -signal; Neutrophils; Degranulation; O 2 -production; NADPH oxidase; Chemotactic receptors
Neutrophils constitute the primary defense system of host organisms against bacterial and fungal infections. Following endocytosis, foreign particles become destroyed and degraded in the phagosomes of neutrophils by the action of different reactive oxygen intermediates and lytic enzymes supplied by specialized intracellular compartments of these cells. Recent studies suggest that glycolipid- and cholesterol-rich membrane microdomains, called also lipid rafts or detergent-resistant membranes (DRMs), play an important role in the mediation of effector responses of neutrophils. Phagocytosis of Mycobacterium kansasii by human neutrophils under nonopsonic conditions was reduced by agents sequestering cholesterol, whereas phagocytosis of opsonized particles seemed to be independent of the cholesterol content of the membrane [1]. On the other hand, in HLq Abbreviations: DRM, detergent-resistant membrane; fMLP, formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine; MCD, methyl-b-cyclodextrin; CB, cytochalasin B; PMA, phorbol myristate acetate; b-GU, b-glucuronidase; CTAB, cetyltrimethylammonium bromide. * Corresponding author. Fax: +36-1-266-6504. E-mail address:
[email protected] (E. Ligeti).
0006-291X/$ - see front matter Ó 2003 Elsevier Inc. All rights reserved. doi:10.1016/j.bbrc.2003.09.150
60 cells FccRII was found to be recruited to the DRM fraction following cross-linking, suggesting a role of lipid rafts also in the mediation of neutrophil activation under opsonic conditions [2]. Parallel with the translocation of FccRII, tyrosine-phosphorylated proteins became associated with DRMs showing the importance of rafts in the signaling events coupled to FccRII [2]. Also in human blood neutrophils FccRIIA was found to translocate to DRMs after activation and subsequent degradation of the receptor seemed to be dependent on membrane cholesterol [3]. Activation of neutrophils by the chemoattractant tripeptide formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine (fMLP) is also modulated by cholesterol perturbing agents: both methyl-b-cyclodextrin (MbCD) and filipin III were reported to inhibit fMLP-induced Ca2þ influx into neutrophils [4]. In a recent study Shao et al. [5] showed that upon FccR activation components of the NADPH oxidase become localized to DRMs. They suggest that lipid rafts mediate the efficiency of oxidase coupling to the FccR. The major aim of the present study was to assess whether chemoattractant-induced degranulation and
1242
K. Kaldi et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 310 (2003) 1241–1246
O 2 -generation depend on the intactness of membrane lipid organization. Recent studies showed that neutrophils possess two different chemotactic receptors both reacting with the bacterial product fMLP. In low concentration (100–500 nM) fMLP stimulates preferentially the high-affinity formyl-peptide receptor (FPR), whereas in the micromolar range also FPRL1 becomes activated. In order to more precisely characterize the role of DRMs in the signaling events following chemotactic stimulation we distinguished between responses triggered by FPR or FPRL1. Here we show that both FPR and FPRL1 triggered degranulation and O 2 -generation can be inhibited by cholesterol perturbing substances, suggesting important role of DRMs in the mediation of chemoattractant-induced effector reactions. We found that the inhibitory effect of cholesterol scavenging on the degranulation is at least partially independent of the Ca2þ homeostasis and our observations suggest that the interaction between lipid rafts and the activatory system of the NADPH oxidase is regulated by the microfilamentous system.
Materials and methods Materials. fMLP, cytochalasin B (CB), MbCD, and filipin III were obtained from Sigma. Incubation media were prepared using sterile and endotoxin-free water. H-WKYMVM-OH hexapeptide, a specific activator of FPRL1 [6,7], was prepared by Fmoc based solid phase peptide synthesis on Wang resin. Single coupling was effective in all cases according to the ninhydrin assay. The cleavage of the peptide from the resin with TFA in the presence of appropriate scavenger mixture resulted in a fairly pure crude product. Side products mainly corresponding to methionine sulfoxide derivatives were removed by RP-HPLC purification. The pure peptide was characterized by amino acid analysis, mass spectrometry, and analytical RP-HPLC. These data suggested over 95% purity of the hexapeptide with the appropriate amino acid composition and mass value. Differentiation of PLB-985 cells. Differentiation of PLB-985 cells into neutrophilic granulocytes was carried out in the presence of 0.5% dimethylformamide. Differentiation was controlled on the basis of CD11b expression, using phycoerythrin-labeled anti-CD11b antibodies [8]. Monitoring intracellular Ca2þ concentration. Cells were loaded with 4 lM FURA-2-AM at a concentration of 5 107 /ml for 30 min at 37 °C in dark. Thereafter, the cells were washed twice with H-medium (500g, 10 min, 25 °C) to remove the extracellular dye. The washed cells were resuspended in H-medium at a density of 5 107 /ml and stored at room temperature until use. For measurement of calcium entry 3 106 FURA-2-loaded cells were resuspended in 3 ml H-medium (containing 1 mM Ca2þ ) in a methylacrylate cuvette and incubated at 37 °C for 4–5 min under stirring conditions. Changes of FURA-2 fluorescence were monitored in a Deltascan dual-wavelength spectrofluorimeter (Photon Technology International, South Brunswick, NJ) using wavelengths 340 and 380 nm for excitation and 505 nm for emission. The speed of data collection was 2 measurements/s [8]. Data were analyzed with the Felix software (PTI) and fluorescence ratio proportional to [Ca2þ ]ic is shown in Fig. 3. Following degranulation of the cells. PLB-985 cells at 106 /ml were incubated in HBSS with or without the indicated inhibitors and/or
10 lM cytochalasin B for 10 min on ice and for a further 10 min at 37 °C. The cells were then stimulated for 10 min with fMLP or WKYMVM. The reaction was stopped by cooling and the suspension was centrifuged for 10 min at 2000g at 4 °C. The extent of degranulation was determined by measuring the activity of b-glucuronidase (b-GU) by a fluorimetric assay described previously [9]. Total cellular b-GU-activity was also measured, using suspensions treated with 0.02% cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) as detergent. Measurement of O 2 production. O2 production of PLB-985 cells was determined by the superoxide dismutase inhibitable reduction of ferricytochrome c as described [9]. Absorption of unstimulated samples was subtracted and O 2 production was calculated using an absorption coefficient of 21.1 mM1 cm1 . Presentation of data and statistical analysis. Assays were performed in triplicate or quadriplicate. In case of stimulation in the presence of CB, non-stimulated cells were also pretreated with CB. Non-stimulated values were subtracted from the stimulated ones and in some cases the obtained data were expressed in percent of similarly calculated values in the absence of inhibitors (control). Mean SEM of these values from the indicated number of parallel measurements or experiments are provided.
Results Stimulation of FPRL1 induces effector responses in PLB985 cells Our goal was to study the role of cholesterol depletion in the regulation of effector responses triggered by the chemotactic receptors FPR and FPRL1. Existence of FPRL1 receptor has previously not been shown on PLB-985 cells. Therefore we first investigated the effect of the FPRL1 specific peptide WKYMVM on effector responses of differentiated PLB-985 cells. O 2 generation was stimulated by the peptide in a concentration dependent way and could be effectively inhibited by diphenyliodonium, a potent blocker of the NADPH oxidase (Fig. 1). Both the kinetics and intensity of O 2 production were similar to the effect of fMLP on neutrophils and PLB-985 cells. WKYMVM stimulated also degranulation of the PLB-985 cells, 100 nM peptide induced the exocytosis of 30.0 4.57% ðn ¼ 4Þ of the CTAB releasable pool of b-GU. Under comparable conditions fMLP induced the release of 35 5% of b-GU from peripheral human neutrophils [10]. Our experiments indicate that differentiated PLB-985 cells possess both types of receptors responding to fMLP and that this cell line seems to be suitable for the investigation of the role of cholesterol-rich microdomains in both FPR and FPRL1 receptor mediated responses. MbCD and filipin III inhibit degranulation of PLB-985 cells In order to disrupt lipid raft composition, CB primed PLB-985 cells were preincubated with the cholesterolremoving compound MbCD before stimulation with receptor agonists. MbCD inhibited both the fMLP and
K. Kaldi et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 310 (2003) 1241–1246
1243
Fig. 1. DPI-sensitive stimulation of O 2 -production by WKYMVM in PLB-985 cells. Cells were preincubated at 37 °C with 10 lM CB for 10 min in the presence or absence of 1 lM DPI followed by stimulation with the indicated concentrations of WKYMVM for 10 min. Data are means SEM of three parallel measurements and representative of three similar experiments performed on separate PLB-985 preparations.
the WKYMVM induced release of b-GU (Fig. 2A). In the experiments summarized in this figure cells were stimulated with 500 nM of fMLP, an amount that was found to activate mostly the high-affinity formyl-peptide receptors FPR [6,7]. Thus, signaling of both FPR and FPRL1 was impaired by cholesterol depletion. To confirm that the inhibitory effect of MbCD can be attributed to the modification of cholesterol composition of the membrane, the effect of filipin III was also investigated. MbCD and filipin III have a significantly different structure, but they share the ability to effectively interact with membrane cholesterol. Filipin III, similar to MbCD, reduced the chemoattractant stimulated mobilization of primary granules (Fig. 2B). Pretreatment with both MbCD and filipin III was reported to inhibit store operated Ca2þ influx in neutrophils [4]. Thus inhibition of degranulation observed in our experiments could be due to an altered Ca2þ influx into the PLB-985 cells. To investigate this possibility, we pretreated the cells with ionomycin before stimulation with the chemoattractants. At an external Ca2þ concentration of 1 mM this pretreatment results in elevated cytoplasmic Ca2þ concentration but does not affect the b-GU pool of the cells. In this way induction of degranulation by the chemoattractants can be uncoupled from the Ca2þ signal. Stimulation of the release of primary granules both by fMLP and by WKYMVM can be observed even after ionomycin pretreatment and can effectively be inhibited by MbCD (Figs. 3A and B). These results indicate that the blocking effect of cholesterol-scavenging on the degranulation is at least partially independent of the Ca2þ homeostasis of the cells. In the next experiments we monitored the effect of cholesterol scavenging on the chemoattractant-induced
Fig. 2. Inhibition of the chemoattractant-induced degranulation of PLB-985 cells by MbCD or filipin III. PLB-985 cells were preincubated at 37 °C with or without 10 lg/ml MbCD (A) or 2 lg/ml filipin III (B) in the presence of 10 lM CB followed by stimulation with 500 nM fMLP or 100 nM WKYMVM for 10 min. Data represent means SEM of results from three experiments each performed in triplicate.
Ca2þ signal. Under our experimental conditions MbCD significantly dampened the elevation in the cytoplasmic Ca2þ concentration induced by fMLP (Fig. 3C). The FPRL1 specific peptide, WKYMVM, generated a Ca2þ signal which was kinetically similar to that induced by fMLP, but interestingly, this signal was poorly affected by the cholesterol removing agent MbCD (Fig. 3D). Thus, in case of FPRL1 stimulation inhibition of degranulation by cholesterol sequestration is independent of the cytoplasmic Ca2þ homeostasis. Effect of lipid raft disrupting agents on the O 2 production of PLB-985 cells In neutrophil granulocytes degranulation and O 2 production directed to the phagosomal space become activated in a synchronized manner. Our observations indicated that lipid raft disruption inhibits chemoattractant-induced granule release from PLB-985 cells. Thus in our next experiments we tested how cholesterol depletion influences O 2 generation coupled to FPR or FPRL1 stimulation. Fig. 4A shows that O 2 production
1244
K. Kaldi et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 310 (2003) 1241–1246
Fig. 3. Effect of MbCD on the chemoattractant-induced degranulation (A,B) and Ca2þ signal (C,D) of PLB-985 cells. PLB-985 cells were preincubated at 37 °C with or without 10 lg/ml MbCD in the presence of 10 lM CB for 15 min followed by stimulation with 100 nM WKYMVM or 500 nM fMLP for 10 min. Where indicated, 1 lM ionomycin was added 3 min before the stimulation. In A and B data are means SEM of three parallel measurements and representative of three similar experiments performed on separate cell preparations, in C and D data are representative for four similar experiments performed on separate cell preparations.
induced by the FPRL1 specific peptide was significantly reduced by both MbCD and filipin III (Fig. 4A). Under these conditions similar inhibitory effect of MbCD was detected also on the NADPH oxidase activity stimulated by 100 nM fMLP (Fig. 4B) showing that the O 2 production coupled to FPR stimulation is also sensitive to cholesterol depletion. In contrast, when PLB-985 cells were activated by PMA, thus by direct stimulation of PKC, the O 2 production was not influenced by MbCD (Fig. 4C). In the above experiments, similar to the conditions applied for measuring degranulation, PLB-985 cells were primed with CB. Both in neutrophils and in promyelocytic cell lines chemoattractant-induced NADPH oxidase activity is enhanced if cells are pretreated with microfilament disrupting agents like CB [10]. To investigate whether this pretreatment influences the effect of raft disruption on the oxidase activity we performed our measurements also in the absence of CB. Fig. 5A shows the kinetics of the fMLP induced O 2 generation and its dependence on CB and MbCD. Interestingly, MbCD exerts a much stronger blocking effect on the O 2 production in the absence than in the presence of CB. Similar phenomenon could be observed in the case of
application of the FPRL1 specific peptide WKYMVM (compare Figs. 4A and 5B) and surprisingly, without CB pretreatment also the PMA induced response proved to be significantly inhibitable by cholesterol-scavenging (Fig. 5C). Thus in the absence of CB the inhibitory effect of cholesterol-removing is not restricted to the chemoattractant evoked response.
Discussion The experiments summarized above indicate that cholesterol sequestering agents have multiple effects at different stages in the organization of the effector responses of differentiated promyelocytic cells. 1. Both MbCD and filipin III inhibited degranulation and O 2 -production initiated by stimulation of chemotactic receptors. Inhibition of chemotactic peptide(fMLP or WKYMVM) induced O 2 -generation and degranulation occurred at a similar concentration of MbCD and achieved similar extent. Thus, we propose that signal transduction from chemotactic receptors depends on intact raft structure. Our observations about the inhibitory effect of cholesterol removing on the
K. Kaldi et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 310 (2003) 1241–1246
Fig. 4. Effect of MbCD and filipin III on the O 2 -production of PLB985 cells. PLB-985 cells were preincubated with or without the raft disrupting agents (10 lg/ml MbCD or filipin III) in the presence of 10 lM CB for 10 min followed by stimulation with 100 nM WKYMVM (A), 100 nM fMLP (B) or 100 nM PMA (C). Data are means SEM of three parallel measurements and representative of three similar experiments each performed in triplicate on separate cell preparations.
fMLP induced O 2 -production are in contrast with data reported on human neutrophils by others [2,4]. Under our experimental conditions, treatment of peripheral blood neutrophils with MbCD or filipin III caused release of the content of specific granules and secretory vesicles (data not shown), thus significantly altering cell surface compositions (e.g., receptor level, NADPH oxidase). We propose that the priming effect of these agents masks any potential inhibitory effect on processes initiated from plasma membrane receptors of mature neutrophilic granulocytes. In case of the promyelocytic PLB-985 cells absence of the early mobilizable granule types [11] may allow the application of the cholesterol affecting substances without preactivation of the cells. 2. Stimulation of chemotactic receptors triggers an intracellular Ca2þ signal that requires Ca2þ entry from the extracellular space. Earlier reports demonstrated that MbCD and filipin III inhibit Ca2þ -influx in neutrophils [4]. Interference with the Ca2þ signal could explain the observed inhibition of both degranulation and
1245
Fig. 5. Effect of MbCD and filipin III on O 2 -production of PLB-985 cells in the absence of CB. PLB-985 cells were preincubated with or without 10 lg/ml MbCD in the presence (A) or absence (A–C) of 10 lM CB for 10 min followed by stimulation with 100 nM fMLP (A), 100 nM WKYMVM (B) or 100 nM PMA (C). Data are means SEM of three parallel measurements and representative of three similar experiments each performed in triplicate on separate cell preparations.
O 2 -production. However, inhibition of degranulation could be observed also after pretreatment with ionomycin, i.e., when Ca2þ entry occurred via the ionophore. In addition, direct measurement of the intracellular Ca2þ level showed that only the fMLP induced (possibly FPR triggered) Ca2þ -signal is influenced by MbCD but the FPRL1 specific response is not affected by this treatment. Thus at least in this latter case signaling events other than Ca2þ entry are also influenced by the cholesterol perturbing agents. It is also noteworthy that the different sensitivity to MbCD of the FPR and FPRL1 coupled Ca2þ -signal is the first observation suggesting that signaling steps triggered by these receptors are not fully identical. 3. Significant difference was observed in the effectiveness of MbCD depending on the microfilament disrupting agent cytochalasin B. In the presence of CB, inhibition of chemotactic peptide-induced O 2 -production by MbCD was partial and the PMA-initiated response was not influenced (Fig. 4). In contrast, in the absence of CB, cholesterol depletion by MbCD resulted in complete blocking of chemoattractant-induced
1246
K. Kaldi et al. / Biochemical and Biophysical Research Communications 310 (2003) 1241–1246
O 2 -production and in strong inhibition of the PMAstimulated O 2 -generation (Fig. 5). Activation of the O 2 -producing NADPH oxidase requires translocation of several subunits to the plasma membrane where the assembly of the active enzyme complex takes place [12]. The observed inhibition of O 2 -production indicates that efficient assembly of the enzyme also requires specialized lipid microdomains. Similar results have been presented recently for O 2 -generation initiated by stimulation of Fcc receptors [5]. The difference obtained in the presence or absence of CB directs the attention to the possible role of microfilaments in controlling the separated lipid microdomains. Due to the microfilament disruption a raft dependent step of the oxidase assembly may be bypassed. Evidences for the role of the microfilamentous system in controlling the lipid microdomains were already found in other systems [13–15]. A recent proteomics study demonstrated the association of Gai and cytoskeletal proteins with lipid rafts in neutrophils and speculated on their possible involvement in chemoreceptor signaling [16]. Our experiments carried out on PLB-985 cells provide functional data supporting the fact that chemoattractant stimulated degranulation and O 2 -production are strictly dependent on the intactness of plasma membrane cholesterol organization stabilized by the cytoskeleton. Acknowledgments The authors are indebted to Drs. Mary Dinauer and Katalin Nemet for access to the PLB-985 cells and to Erzsebet Seres-Horvath, Edit Fedina, and Krisztina S€ ut} o for excellent and devoted technical assistance. Experimental work was financially supported by grants from the Hungarian Research Fund (OTKA F 034204, T037755, Ts040865, and M036310) and from the Hungarian Ministry of Education (FKFP 0156/2001).
References [1] P. Peyron, C. Bordier, E.N. N’Diaye, I. Maridonneau-Parini, Nonopsonic phagocytosis of Mycobacterium kansasii by human neutrophils depends on cholesterol and is mediated by CR3 associated with glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins, J. Immunol. 165 (2000) 5186–5191. [2] O. Katsumata, M. Hara-Yokoyama, C. Sautes-Fridman, Y. Nagatsuka, T. Katada, Y. Hirabayashi, K. Shimizu, J. FujitaYoshigaki, H. Sugiya, S. Furuyama, Association of FcgammaRII with low-density detergent-resistant membranes is important for cross-linking-dependent initiation of the tyrosine phosphorylation pathway and superoxide generation, J. Immunol. 167 (2001) 5814– 5823.
[3] F. Barabe, E. Rollet-Labelle, C. Gilbert, M.J. Fernandes, S.N. Naccache, P.H. Naccache, Early events in the activation of Fc gamma RIIA in human neutrophils: stimulated insolubilization, translocation to detergent-resistant domains, and degradation of Fc gamma RIIA, J. Immunol. 168 (2002) 4042–4049. [4] F. Barabe, G. Pare, M.J. Fernandes, S.G. Bourgoin, P.H. Naccache, Cholesterol-modulating agents selectively inhibit calcium influx induced by chemoattractants in human neutrophils, J. Biol. Chem. 277 (2002) 13473–13478. [5] D. Shao, A.W. Segal, L.V. Dekker, Lipid rafts determine efficiency of NADPH oxidase activation in neutrophils, FEBS Lett. 550 (2003) 101–106. [6] T. Christophe, A. Karlsson, C. Dugave, M.J. Rabiet, F. Boulay, C. Dahlgren, The synthetic peptide Trp–Lys–Tyr–Met–Val–Met– NH2 specifically activates neutrophils through FPRL1/lipoxin A4 receptors and is an agonist for the orphan monocyte-expressed chemoattractant receptor FPRL2, J. Biol. Chem. 276 (2001) 21585–21593. [7] J.L. Gao, E.L. Becker, R.J. Freer, N. Muthukumaraswamy, P.M. Murphy, A high potency nonformylated peptide agonist for the phagocyte N-formylpeptide chemotactic receptor, J. Exp. Med. 180 (1994) 2191–2197. [8] B.K. Rada, M. Geiszt, R. Bruggen, K. Nemet, D. Roos, E. Ligeti, Calcium signaling is altered in myeloid cells with a deficiency in NADPH oxidase activity, Clin. Exp. Immunol. 132 (2003) 53–60. [9] A. M ocsai, B. Banfi, A. Kapus, G. Farkas, M. Geiszt, L. Buday, A. Farag o, E. Ligeti, Differential effects of tyrosine kinase inhibitors and inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade on the degranulation and superoxide production of human neutrophil granulocytes, Biochem. Pharmacol. 54 (1997) 781–789. [10] K. Kaldi, J. Szeberenyi, B.K. Rada, P. Kovacs, M. Geiszt, A. M ocsai, E. Ligeti, Contribution of phospholipase D and a brefeldin A-sensitive ARF to chemoattractant-induced superoxide production and secretion of human neutrophils, J. Leukoc. Biol. 71 (2002) 695–700. [11] K.A. Tucker, M.B. Lilly, L. Heck Jr., T.A. Rado, Characterization of a new human diploid myeloid leukemia cell line (PLB-985) with granulocytic and monocytic differentiating capacity, Blood 70 (1987) 372–378. [12] P.V. Vignais, The superoxide-generating NADPH oxidase: structural aspects and activation mechanism, Cell. Mol. Life Sci. 59 (2002) 1428–1459. [13] K. Simons, D. Toomre, Lipid rafts and signal transduction, Nat. Rev. 1 (2000) 31–39. [14] M. Simpson-Holley, D. Ellis, D. Fisher, D. Elton, J. McCauley, P. Digard, A functional link between the actin cytoskeleton and lipid rafts during budding of filamentous influenza virions, Virology 301 (2002) 212–225. [15] T. Harder, K. Simons, Clusters of glycolipid and glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins in lymphoid cells: accumulation of actin regulated by local tyrosine phosphorylation, Eur. J. Immunol. 29 (1999) 556–562. [16] T. Nebl, K.N. Pestonjamasp, J.D. Leszyk, J.L. Crowley, S.W. Oh, E.J. Luna, Proteomic analysis of a detergent-resistant membrane skeleton from neutrophil plasma membranes, J. Biol. Chem. 277 (2002) 43399–43409.
4. közlemény
Contribution of phopholipase D and a brefeldin A-sensitive ARF to chemoattractant-induced superoxide production and secretion of human neutrophils Krisztina Ka´ldi,* Ju´lia Szebere´nyi,* Bala´zs K. Rada,* Pe´ter Kova´cs,† Miklo´s Geiszt,* Attila Mo´csai,* and Erzse´bet Ligeti* Departments of *Physiology, and †Genetics, Cell and Immunobiology, Semmelweis University, Budapest, Hungary
Abstract: We show that blockers of phospholipase D (PLD) reduce fMLP-triggered exocytosis of secretory vesicles effectively. In accordance with this, the PLD product phosphatidic acid (PA) was able to induce mobilization of secretory vesicles. Although PLD seems to play a role in the release of all neutrophil granule types, exogenous PA alone was not sufficient to activate the exocytosis of primary and secondary granules, suggesting that in the case of these granules, additional signaling factors are required to initiate the secretory responses. The ADP-ribosylation factor (ARF)inhibitor brefeldin A (BFA) inhibited the fMLPstimulated O2䡠 ⴚ production strongly, whereas it did not influence any of the exocytic responses, and no significant effect of BFA was detected on the O2䡠 ⴚ generation induced by other stimuli. On the basis of these results, we propose that upon chemoattractant stimulation, PLD activity is involved in induction of degranulation and O2䡠 ⴚ production, but a BFA-sensitive ARF is only required to the activation of the NADPH oxidase. This ARF action seems to participate exclusively in the signaling pathway between the fMLP receptor and the oxidase. J. Leukoc. Biol. 71: 695–700; 2002. Key Words: phagocytes 䡠 NADPH oxidase 䡠 fMLP receptor 䡠 secretory vesicles
INTRODUCTION Stimulation of neutrophil granulocytes by chemotactic agents leads to the induction of multiple microbicidal reactions including the generation of reactive oxygen intermediates and the secretion of granule constituents. Among the mobilizable intracellular membrane compartments of neutrophils secretory vesicles become released most rapidly following activation by inflammatory stimuli. Exocytosis of secretory-vesicle membrane content, including integrins, different chemotactic receptors, and the cytochrome component of the O2䡠 ⫺-producing reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH) oxidase, strongly augments the responsiveness of neutrophils at all stages of their microbicidal action [1]. Al-
though the contribution of secretory-vesicle release to the neutrophil-effector reactions was indicated in many cases (e.g., refs. [2– 4]; for review, see ref. [1]), very little is known about the signaling pathways regulating the process. It is important that although chelation of intracellular calcium [5], inhibition of phosphatidylinositol-3-kinases [6], or pretreatment with broad-spectrum or Src-family tyrosine-kinase inhibitors or with inhibitors of the p38 mitogen-activated protein kinase pathway [7] strongly inhibit the O2䡠 ⫺ production and exocytosis of primary and secondary granules, none of these interventions causes any significant inhibition of the formyl-Met-Leu-Phe (fMLP)-induced release of secretory vesicles. A role for phospholipase D (PLD) was suggested in the signal transduction from the chemotactic receptor to a variety of responses. PLD catalyzes the hydrolysis of phosphatidylcholine to produce phosphatidic acid (PA), which is converted into diradylglycerol subsequently. Ethanol, an inhibitor of PA formation, and propranolol, a blocker of diradylglycerol production, were shown to reduce fMLP-induced NADPH oxidase activation [8, 9] and exocytosis of specific granules in human neutrophils [9]. Ethanol also inhibits secretion of primary granule constituents in fMLP-stimulated HL60 cells and rabbit neutrophils [10, 11], but propranolol has no influence on this process, indicating that PA is a more important regulator of this secretory function than diradylglycerol [11]. As shown in different cell types, PLD may be a downstream effector of the small GTPase adenosine 5⬘-diphosphate (ADP)ribosylation factor (ARF; e.g., refs. [12, 13]). In neutrophils and neutrophil-like HL60 cells, ARF1 was suggested to control PLD activity. In HL60 cells depleted of freely diffusible cytosolic proteins, recombinant ARF1 was shown to restore guanosine 5⬘-triphosphate (GTP)␥S-stimulated PLD activity and the secretion of primary granules [14]. In cytosol-depleted human neutrophils, the ability of fMLP to stimulate PLD was dependent on the readdition of ARF1 to the cells [15]. In the same study, fMLP-induced translocation of endogenous ARF to membranes was demonstrated. In a recent study performed on
Correspondence: Dr. Erzse´bet Ligeti, Department of Physiology, Semmelweis University, Puskin u.9., H-1088 Budapest, Hungary. E-mail: ligeti @puskin.sote.hu Received July 16, 2001; revised November 8, 2001; accepted November 29, 2001.
Journal of Leukocyte Biology Volume 71, April 2002 695
neutrophil-like PLB-985 cells, a regulatory role for ARF6 in the fMLP-induced stimulation of the NADPH oxidase was proposed [16]. Unfortunately, only the effect of the overexpression of ARF1 and ARF6 mutants was investigated in this paper, and influence of deletion of the endogenous ARFs was not shown. Although many data support the view that ARF proteins contribute to the PLD activity in phagocytes, our knowledge about the functional role of the putative ARF-PLD pathway in the mediation of the neutrophil-effector reactions is poor. The aim of the present study was to analyze the participation of ARF and PLD in the chemoattractant-induced activation of neutrophils. By using different inhibitors, we show that exocytosis of secretory vesicles following chemotactic stimulus depends on PLD activity. In contrast to the release of other neutrophil granule types, the PLD product PA is sufficient to induce this secretory response. Brefeldin A (BFA), a specific blocker of ARF action (e.g., refs. [17–19]), inhibits fMLPstimulated O2䡠 ⫺ production effectively, but it has no, or minor, influence on the degranulation and O2䡠 ⫺ production induced by other stimuli. Our results suggest that upon activation of the fMLP receptor, partially different signaling events lead to the stimulation of the various effector reactions. Although PLD is involved in the induction of O2䡠 ⫺ production and degranulation, a BFA-sensitive ARF-guanine nucleotide-exchange factor (GEF) complex regulates the NADPH oxidase exclusively.
MATERIALS AND METHODS Materials Dextran T-500 and Ficoll-Paque were obtained from Pharmacia (Uppsala, Sweden). fMLP, cytochalasin B (CB), 4-methylumbelliferyl--D-glucuronide, L-␣-phosphatidylserine, and BFA were from Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). Human lactoferrin (Lfr), human serum albumin (HSA), anti-human Lfr (rabbit), and anti-HSA (goat) antibodies were from Sigma Chemical Co. Horseradish peroxidase-labeled antibodies were obtained from Nordic Immunological Laboratories (Tilburg, The Netherlands). 1-O-[3H]Octadecyl lyso plateletactivating factor (PAF) was purchased from Amersham Pharmacia Biotech (Little Chalfont, UK). Incubation media were prepared using sterile and endotoxin-free water. For preparation of the stock solution, L-␣-phosphatidic acid (1,2-diacyl-sn-glycero-3-phosphate; Sigma Chemical Co.) was solved in chloroform (25 mg/ml), added to Hanks’ balanced saline solution (HBSS; 5 mg/ml), and sonicated.
Preparation of human neutrophils Venous blood was drawn from healthy volunteers who gave written, informed consent and were treated according to the prescriptions of the Journal of Physiology and the Ethical Committee of the Semmelweis University (Budapest, Hungary). After dextran sedimentation at room temperature, neutrophils were obtained by centrifugation at 4°C through Ficoll-Paque followed by hypotonic lysis of erythrocytes [7]. Cells were resuspended in ice-cold HBSS and kept on ice until use. The preparations usually contained ⬎98% polymorphonuclear cells; the viability, as determined by the erythrosin B dyeexclusion test, was ⬎98%. Preparation was carried out under sterile conditions by using media prepared with endotoxin-free water. Where indicated, nonsterile cells were used, which were prepared in a similar way but without using endotoxin-free water. Viability of the cells was also controlled following alcohol treatment and incubation with fMLP. Primary alcohols did not influence the ability of the cells to exclude erythrosin B significantly (unpublished results).
696
Journal of Leukocyte Biology Volume 71, April 2002
Degranulation of human neutrophils Human neutrophils at 106/ml were incubated in HBSS with or without the indicated inhibitors and/or 10 M CB for 10 min on ice and for a further 10 min at 37°C. The cells were then stimulated for 10 min with 500 nM fMLP or 50 nM phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA). The reaction was stopped by cooling, and the suspension was centrifuged for 10 min at 2000 g at 4°C. The extent of degranulation was determined by measuring the concentration of the different granule markers in the supernatant. Controls were carried out with the same amount of the solvents of inhibitors and stimulators. The activity of the primary granule marker -glucuronidase (-GU) was determined by a fluorimetric assay as described previously [20]. Total cellular -GU activity was also measured, using suspensions treated with 0.02% cetyl-trimethyl-ammonium bromide as detergent. Concentration of the secondary granule marker Lfr [1] and of HSA, a marker of secretory vesicles [21], was determined by enzyme-linked immunosorbent assay as described in [7]. Formation of PA from 1-O-[;3H]octadecyl lyso PAF under conditions of the degranulation assay was monitored according to ref. [15].
Measurement of O2䡠 ⫺ production O2䡠 ⫺ production of human neutrophil granulocytes was determined by the superoxide-dismutase-inhibitable reduction of ferricytochrome c as described [20]. Absorption of unstimulated samples was substracted, and O2䡠 ⫺ production was calculated using an absorption coefficient of 21.1 mM⫺1 䡠 cm⫺1. Alternatively, O2 consumption in response to opsonized Escherichia coli (ML-35) was measured under similar conditions with a Clark-type oxygen electrode [22, 23]. O2䡠 ⫺ production in the cell-free system was determined by combining neutrophil cytosol and membrane fractions in the presence of arachidonic acid as described [24].
Presentation of data and statistical analysis Assays were performed in triplicates or quadriplicates. In case of stimulation in the presence of CB, nonstimulated cells were also pretreated with CB. Nonstimulated values were subtracted from the stimulated ones, and in some cases, the obtained data were expressed in percent of similarly calculated values in the absence of inhibitors (control). Mean ⫾ SE of these values from the indicated number of parallel measurements or experiments is provided.
RESULTS Conditions of preparation determine responsiveness of human neutrophils to fMLP In human neutrophil granulocytes prepared under nonsterile conditions, only a negligible amount of secretory-vesicle content HSA can be detected (unpublished results), indicating that these cells lose their secretory vesicles during the preparation process. To avoid this spontaneous release of secretory vesicles and possible priming of the cells, degranulation experiments were carried out with human neutrophils prepared under sterile and pyrogen-free conditions [7]. However, chemoattractantinduced O2䡠 ⫺ production of these cells was only about 20% of that measured on nonsterile cells, whereas upon PMA stimulation or after pretreatment with CB, the differently prepared cells produced a comparable amount of O2䡠 ⫺ (Table 1). Apparently, activation of NADPH oxidase initiated by ligand binding to the fMLP receptors requires priming effects and/or translocation of elements from primary or secondary granules mobilized by CB. This is in accordance with the previous observation that no fMLP-activated exocytosis of primary granules and only minimal mobilization of secondary granules could be detected in the absence of CB [7]. Thus, throughout
http://www.jleukbio.org
TABLE 1. Influence of Conditions of Preparation on the O2䡠 ⫺ Production of Neutrophils
Conditions of the preparation Sterile Nonsterile
O2䡠 ⫺ Production induced by (nmol/10 min/106 cells) fMLP
PMA
fMLP (⫹CB)
3.02 ⫾ 1.34 (n ⫽ 4) 13.42 ⫾ 1.44 (n ⫽ 7)
37.85 ⫾ 3.18 (n ⫽ 3) 53.55 ⫾ 2.60 (n ⫽ 3)
14.65 ⫾ 2.42 (n ⫽ 7) 19.99 ⫾ 0.99 (n ⫽ 3)
Human neutrophils prepared under sterile or nonsterile conditions were preincubated for 10 min with or without 10 M CB, as indicated. After this pretreatment, cells were stimulated with 500 nM fMLP or 50 nM PMA for 10 min. Results are mean ⫾ SE of results from the indicated numbers of experiments performed on separate cell preparations.
this paper, O2䡠 ⫺ production and release of primary and secondary granules of cells are shown, which were prepared under sterile conditions and pretreated with CB. None of these responses were activated by CB alone.
PLD blockers inhibit chemoattractant-induced release of secretory vesicles PLD activity is increased after chemotactic stimulation, and PLD was shown to mediate the effect of fMLP on the release of primary and secondary granules and superoxide production [8, 9, 11]. To determine the involvement of PLD in the activation of the release of secretory vesicles, we applied different primary alcohols to reduce PA production by PLD. The PLD blocker, ethanol, inhibited the fMLP-induced release of the secretory vesicle marker, HSA (Fig. 1A), whereas it had weak influence on the PMA-activated response.The experiments summarized in Figure 1A were carried out in the presence of the microfilament-disrupting agent CB, but identical results were obtained in the absence of CB (unpublished results). Surprisingly, ethanol was found by other authors (unpublished results mentioned in ref. [25]) not to inhibit the fMLP-stimulated mobilization of secretory vesicles. To confirm that the action of ethanol in our experiments can be attributed to the
inhibition of PLD, we tested the effect of 1-butanol, which also serves as a substrate for PLD, leading to the formation of phosphatidylbutanol instead of PA [16]. As a control, we used tert-butanol, which is not a substrate, and thus not a competitive inhibitor of PLD. We compared the effect of both butanol forms on the HSA release to that on the exocytosis of the primary and secondary granule markers, -GU and Lfr. 1-Butanol, added in a relatively low concentration (0.2%), reduced the fMLP-stimulated exocytosis of all three granule markers, whereas tert-butanol had little effect on these processes (Fig. 1B). In a PLD assay, the same amount of 1-butanol suppressed the fMLP-induced PA formation by about 90%. These findings suggest that similar to the release of other granule types, PA formation is important for the fMLP-dependent stimulation of the release of secretory vesicles.
Exogenous PA can induce the release of secretory vesicles and O2䡠 ⫺ production To further analyze the role of PA in the mediation of neutrophil-effector reactions, we added exogenous PA to the cells, which stimulated the exocytosis of the secretory-vesicle marker HSA in a dose-dependent manner (Fig. 2). As Table 2 shows, 45 g/ml PA and 500 nM fMLP released comparable amounts of HSA from the cells. The ability of PA to induce the exocytosis of secretory-vesicle content was independent of the presence of CB. Similar to the release of HSA and in accordance with the results of Tokumura et al. [26], the same amount of exogenous PA activated the O2䡠 ⫺ production (up to 15 nmol O2䡠 ⫺/10 min/106 cells). In contrast to this, under the same experimental conditions, PA did not induce significant release of the markers of primary and secondary granules (Table 2), pointing to differential requirements for the release of the three compartments and also indicating that the effect of PA on HSA release was not a result of nonspecific lysis of the cells. To further confirm the specificity of the action of PA on the exocytosis of secretory vesicles, the effect of other lipids was also tested. Applied in comparable concentrations, linolenic acid stimulated no measurable HSA release. Treatment of the cells with the same amount of phosphatidylserine, which sim-
Fig. 1. Effect of PLD inhibitors on the fMLP (A and B) and PMA (A)-induced release of -GU (B), Lfr (B), and HSA (A and B) from human neutrophils. CB-treated cells were preincubated with or without 1% ethanol (A), 0.2% 1-butanol (B), or 0.2% tert-butanol (B), followed by stimulation for 10 min with 500 nM fMLP or 50 nM PMA, respectively. (A) Results are mean ⫾ SE of three parallels and are representative of three similar experiments, each performed in triplicates. (B) Data represent the mean ⫾ SE of results from three experiments, each performed in quadriplicates. Control values (100%) corresponded to 35 ⫾ 5% of the total cellular -GU content in the case of primary granules, 4.93 ⫾ 1.0 g Lfr/106 cells in the case of secondary granules, and 65 ⫾ 10 ng HSA/106 cells in the case of secretory vesicles (n⫽3).
Ka´ldi et al. Regulation of human neutrophils by PLD and ARF
697
Fig. 2. Stimulation of HSA secretion by exogenous PA. Human neutrophils were preincubated with 10 M CB and were stimulated with the indicated concentrations of PA for 10 min. Maximum corresponded to the amount of HSA released by 100 g/ml PA. Data are mean ⫾ SE of three parallel measurements and representative of three similar experiments performed on separate neutrophil preparations.
ilar to PA, contains a negatively charged head, resulted in only 25.2 ⫾ 2.7% (n⫽3) of the PA-induced response.
BFA blocks fMLP-induced O2䡠 ⫺ production Because data from our above experiments and from others suggest that PLD plays a central role in the mediation of chemoattractant-dependent activation of neutrophils [8 –11] and because ARF was shown to control fMLP-induced PLD stimulation in these cells [14, 15], we investigated the possible involvement of ARF in the regulation of O2䡠 ⫺ production and secretion of fMLP-stimulated neutrophils. For blocking ARF, BFA was used, which interacts with several ARF-GEF complexes directly [18, 19]. BFA, applied in similar amounts, which were found to block ARF action specifically in different systems [27–29], inhibited the fMLP-induced O2䡠 ⫺ production effectively and in a concentration-dependent manner (Fig. 3). BFA (60 g/ml) reduced the O2䡠 ⫺ formation to 12.4 ⫾ 5.45% (n⫽4) of the control. In the next experiments, we investigated the effect of BFA on other signaling routes activating the NADPH oxidase. As shown in Figure 3B, BFA had hardly any effect on the O2䡠 ⫺ production stimulated by PMA or opsonized bacteria. Because PA was shown to activate the NADPH oxidase under in vitro conditions [30], we also tested the action of BFA in a cell-free activation system. Preincubation of the reaction mixture with BFA did not significantly alter the O2䡠 ⫺ generation induced by arachidonic acid as amphiphil (unpublished results). Because fMLP-stimulated exocytosis of all three granule types was found to be PLD-dependent, the effect of ARF inhibition on the chemoattractant-activated degranulation was also investigated. BFA, applied in a concentration inhibiting the fMLP-induced O2䡠 ⫺ production almost completely, did not influence the release of primary and secondary granules and secretory vesicles (Fig. 4).
DISCUSSION Although secretory vesicles were described as intracellular compartments that become mobilized upon chemoattractant
698
Journal of Leukocyte Biology Volume 71, April 2002
stimulation of the cells [31], information is still lacking about the signal-transducing steps leading from the chemotactic receptors to the exocytosis of these vesicles. In fact, a number of inhibitors targeting different intracellular signaling pathways had been shown to have no, or negligible, effects on the chemoattractant-induced release of secretory vesicles [5–7]. In this study, we show that primary alcohols, inhibitors of PLD, block the fMLP receptor-mediated release of secretory vesicles effectively in human neutrophils. Capability of exogenous PA to induce HSA secretion supports the suggestion that PLD participates in the regulation of this secretory response. Taken together, these findings suggest that the PLD-generated PA plays a central role in signaling the release of secretory vesicles, being necessary and sufficient for this response. To our knowledge, the PLD signaling pathway is the first to be likely to participate in the fMLP-induced exocytosis of secretory vesicles. Although inhibitors of the PLD pathway also reduced the exocytosis of primary and secondary granules, exogenously added PA alone did not induce any release of these compartments, indicating that in contrast to the secretory vesicles, formation of PA by PLD must be supplemented by other signaling events to cause release of primary and secondary granules. We found that the ARF blocker BFA very effectively inhibited the O2䡠 ⫺ generation stimulated by the chemoattractant. In contrast to PLD, which seems to be involved in most responses initiated by ligand binding to the chemoattractant receptor, a BFA-sensitive ARF-GEF interaction seems to mediate only the fMLP-induced activation of the NADPH oxidase but not the degranulation response. O2䡠 ⫺ production induced by PMA or opsonized bacteria was influenced only marginally by BFA, indicating that a significant part of the signaling pathways leading from PKC or the opsonin receptors to NADPH oxidase bypasses the BFA-sensitive ARF-GEF complex. The finding that BFA did not influence O2䡠 ⫺ generation in the in vitro activation system also suggests that the BFA-inhibitable ARF mediates the signal transduction related specifically to the fMLP receptor. This is the first presentation of the fact that a microbicidal reaction of neutrophils is mediated by a pathway containing a BFA-sensitive step. The ARF action demonstrated in our experiments is probably different from that described by Dana et al. [16], because TABLE 2.
Effect of PA on the Degranulation of Neutrophils PA-induced release
Granule marker HSA Lfr -GU
Released amount 28.3 ⫾ 12.1 ng/106 cells 20.6 ⫾ 8.5 ng/106 cells ⫺0.1 ⫾ 0.25% of the amount releasable by CTAB
Percentage of the fMLP-induced release 41 ⫾ 10.4% 0.6 ⫾ 0.2% ⫺0.28 ⫾ 0.69%
Human neutrophils were preincubated at 37°C for 10 min in the presence of 10 M CB followed by stimulation with 45 g/ml PA or 500 nM fMLP for 10 min. Values are mean ⫾ SE of three independent experiments each performed in triplicates. CTAB, cetyl-tnmethyl-ammonium bromide (detergent)
http://www.jleukbio.org
Fig. 3. Effect of BFA on the O2䡠 ⫺ production of human neutrophils. Human neutrophils were preincubated with or without BFA at the indicated concentrations followed by stimulation with 500 nM fMLP (A and B), 50 nM PMA (B), or 10 opsonized E. coli /cell (B). Cells were treated with 10 M CB before stimulation with fMLP or PMA. (A) Data are mean ⫾ SE of three parallel measurements and representative of three similar experiments, each performed in triplicates on separate neutrophil preparations. (B) Data represent the mean ⫾ SE of results from the indicated number of experiments, each performed in quadriplicates. Control values (100%) corresponded to 8.89 ⫾ 3.48 nmol O2䡠 ⫺/10 min/106 cells (n⫽5) in the case of fMLP stimulation, 25.58 ⫾ 8.14 nmol O2䡠 ⫺/10 min/106 cells (n⫽3) in the case of PMA stimulation, and 3.7 ⫾ 2.6 nmol O2/10 min/106 cells (n⫽3) in the case of bacterial stimulation.
ARF6, which they proposed to enhance NADPH oxidase activity in PLB-985 cells, is considered to be controlled by BFA-insensitive GEFs [32, 33]. BFA-sensitive PLD activation was described in several systems and was suggested to be mediated by class I ARFs, such as ARF1 and -3 (e.g., refs. [28, 29, 34]). Mitchell et al. [28] showed that upon binding of agonists, a subgroup of rhodopsin-family receptors forms BFAsensitive, functional complexes with ARF and Rho. Interaction of the receptor with the small GTPases was suggested to be dependent on the presence of a NPXXY motif in the seventh transmembrane domain of the receptor. The fMLP receptor also carries this amino acid sequence, thus its similar interaction with a BFA-sensitive ARF can be assumed. Whether the PLD involved in the fMLP-activated O2䡠 ⫺ production is coupled to the BFA-inhibitable ARF remains to be determined. Concentration dependence of the BFA sensitivity of receptor-mediated PLD activation [28, 29] corresponded to that found for the fMLP-stimulated O2䡠 ⫺ production (Fig. 3A). However, in HL60 cells, fMLP-dependent PLD activity was shown to be BFA-
insensitive [35]. This discrepancy may result from the fact that whole-cell measurement of PLD activity does not necessarily reflect local activities, which may also regulate important cellular functions, in this case, O2䡠 ⫺ production. Alternatively, BFA-sensitive ARF may act independently of PLD. Recent data indicate that binding ARF proteins and Rac to Arfaptin is mutually exclusive, and it has been suggested that activation of ARF leads to its binding to Arfaptin and releasing of Rac for signaling activity [36]. In neutrophils, the released Rac could react subsequently with the oxidase and in this way, contribute to the stimulation of O2䡠 ⫺ generation. Activation of NADPH oxidase by this mechanism may represent a new example of cross-talk between different subfamilies of the small GTPase superfamily. In conclusion, we suggest that upon activation of the fMLP receptor, the signaling pathway diverges at a certain level: A BFA-sensitive ARF action is involved in the stimulation of the O2䡠 ⫺ production, whereas this small G protein does not seem to participate in inducing exocytosis.
Fig. 4. Influence of BFA on the chemoattractant-induced degranulation. Human neutrophils were preincubated with or without 60 g/ml BFA in the presence of 10 M CB, followed by stimulation with 500 nM fMLP for 10 min. Data are mean ⫾ SE of four parallel measurements and representative of six similar experiments performed on separate neutrophil preparations in triplicates.
Ka´ ldi et al. Regulation of human neutrophils by PLD and ARF
699
ACKNOWLEDGMENTS This work was supported by the Hungarian National Scientific Research Fund (OTKA, T 025078 and F 034204), the Hungarian Ministry of Education (0156/2001), and the Hungarian Ministry of Health (316/2000). K. K. was supported by a postdoctoral fellowship (Bolyai) of the Hungarian Academy of Sciences. We thank Erzse´ bet Seres-Horva´ th and Edit Fedina for expert technical assistance.
REFERENCES 1. Borregaard, N., Lollike, K., Kjeldsen, L., Sengelov, H., Bastholm, L., Nielsen, M. H., Bainton, D. F. (1993) Human neutrophil granules and secretory vesicles. Eur. J. Haematol. 51, 187–198. 2. Dahlgren, C., Karlsson, A., Sendo, F. (2001) Neutrophil secretory vesicles are the intracellular reservoir for GPI-80, a protein with adhesion-regulating potential. J. Leukoc. Biol. 69, 57– 62. 3. Sengelov, H., Boulay, F., Kjeldsen, L., Borregaard, N. (1994) Subcellular localization and translocation of the receptor for N-formylmethionylleucyl-phenylalanine in human neutrophils. Biochem. J. 299, 473– 479. 4. Plesner, T., Ploug, M., Ellis, V., Ronne, E., Hoyer-Hansen, G., Wittrup, M., Pedersen, T. L., Tscherning, T., Dano, K., Hansen, N. E. (1994) The receptor for urokinase-type plasminogen activator and urokinase is translocated from two distinct intracellular compartments to the plasma membrane on stimulation of human neutrophils. Blood 83, 808 – 815. 5. Sengelov, H., Kjeldsen, L., Borregaard, N. (1993) Control of exocytosis in early neutrophil activation. J. Immunol. 150, 1535–1543. 6. Capodici, C., Hanft, S., Feoktistov, M., Pillinger, M. H. (1998) Phosphatidylinositol 3-kinase mediates chemoattractant-stimulated, CD11b/ CD18-dependent cell-cell adhesion of human neutrophils: evidence for an ERK-independent pathway. J. Immunol. 160, 1901–1909. 7. Mo´ csai, A., Jakus, Z., Va´ ntus, T., Berton, G., Lowell, C. A., Ligeti, E. (2000) Kinase pathways in chemoattractant-induced degranulation of neutrophils. The role of p38 MAP kinase activated by Src family kinases. J. Immunol. 164, 4321– 4331. 8. Agwu, D. E., McPhail, L. C., Sozzani, S., Bass, D. A., McCall, C. E. (1991) Phosphatidic acid as a second messenger in human polymorphonuclear leukocytes. Effects on activation of NADPH oxidase. J. Clin. Investig. 88, 531–539. 9. Suchard, S. J., Nakamura, T., Abe, A., Shayman, J. A., Boxer, L. A. (1994) Phospholipase D-mediated diradylglycerol formation coincides with H2O2 and lactoferrin release in adherent human neutrophils. J. Biol. Chem. 269, 8063– 8068. 10. Stutchfield, J., Cockcroft, S. (1993) Correlation between secretion and phospholipase D activation in differentiated HL60 cells. Biochem. J. 293, 649 – 655. 11. Kanaho, Y., Kanoh, H., Saitoh, K., Nozawa, Y. (1991) Phospholipase D activation by platelet-activating factor, leukotriene B4, and formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine in rabbit neutrophils. Phospholipase D activation is involved in enzyme release. J. Immunol. 146, 3536 –3541. 12. Brown, H. A., Gutowski, S., Moomaw, C. R., Slaughter, C., Sternweis, P. C. (1993) ADP-ribosylation factor, a small GTP-dependent regulatory protein, stimulates phospholipase D activity. Cell 75, 1137–1144. 13. Exton, J. H. (2000) Phospholipase D. Ann. N. Y. Acad. Sci. 905, 61– 68. 14. Fensome, A., Cunningham, E., Prosser, S., Tan, S. K., Swigart, P., Thomas, G., Hsuan, J., Cockcroft, S. (1996) ARF and PITP restore GTP gamma S-stimulated protein secretion from cytosol-depleted HL60 cells by promoting PIP2 synthesis. Curr. Biol. 6, 730 –738. 15. Fensome, A., Whatmore, J., Morgan, C., Jones, D., Cockcroft, S. (1998) ADP-ribosylation factor and Rho proteins mediate fMLP-dependent activation of phospholipase D in human neutrophils. J. Biol. Chem. 273, 13157–13164. 16. Dana, R. R., Eigsti, C., Holmes, K. L., Leto, T. (2000) A regulatory role for ADP-ribosylation factor 6 (ARF6) in activation of the phagocyte NADPH oxidase. J. Biol. Chem. 275, 32566 –32571. 17. Helms, J. B., Rothman, J. E. (1992) Inhibition by brefeldin A of a Golgi membrane enzyme that catalyses exchange of guanine nucleotide bound to ARF. Nature 360, 352–354.
700
Journal of Leukocyte Biology Volume 71, April 2002
18. Peyroche, A., Antonny, B., Robineau, S., Acker, J., Cherfils, J., Jackson, C. L. (1999) Brefeldin A acts to stabilize an abortive ARF-GDP-Sec7 domain protein complex, involvement of specific residues of the Sec7 domain. Mol. Cell 3, 275–285. 19. Mansour, S. J., Skaug, J., Zhao, X. H., Giordano, J., Scherer, S. W., Melancon, P. (1999) p200 ARF-GEP1, a Golgi-localized guanine nucleotide exchange protein whose Sec7 domain is targeted by the drug brefeldin A. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7968 –7973. 20. Mo´ csai, A., Ba´ nfi, B., Kapus, A., Farkas, G., Geiszt, M., Buday, L., Farago´ , A., Ligeti, E. (1997) Differential effects of tyrosine kinase inhibitors and inhibitor of the mitogen-activated protein kinase cascade on the degranulation and superoxide production of human neutrophil granulocytes. Biochem. Pharmacol. 54, 781–789. 21. Borregaard, N., Kjeldsen, L., Rygaard, K., Bastholm, L., Nielsen, M. H., Sengelov, H., Bjerrum, O. W., Johnsen, A. H. (1992) Stimulus-dependent secretion of plasma proteins from human neutrophils. J. Clin. Investig. 90, 86 –96. 22. Bolscher, B. G., van Zwieten, R., Kramer, I. M., Weening, R. S., Verhoeven, A. J., Roos, D. (1989) A phosphoprotein of Mr 47,000, defective in autosomal chronic granulomatous disease, copurifies with one of two soluble components required for NADPH:O2 oxidoreductase activity in human neutrophils. J. Clin. Investig. 83, 757–763. 23. Estabrook, R. W. (1967) Mitochondrial respiratory control and the polarographic measurement of ADP:O ratios. Methods Enzymol. 10, 41– 47. 24. Ligeti, E., Doussiere, J., Vignais, P. V. (1988) Activation of the O2(䡠 ⫺)generating oxidase in plasma membrane from bovine polymorphonuclear neutrophils by arachidonic acid, a cytosolic factor of protein nature, and nonhydrolyzable analogues of GTP. Biochemistry 27, 193–200. 25. Morgan, C. T., Sengelov, H., Whatmore, J., Borregaard, N., Cockroft, S. (1997) ADP-ribosylation-factor-regulated phospholipase D activity localizes to secretory vesicles and mobilizes to the plasma membrane following N-formylmethionyl-leucyl-phenylalanine stimulation of human neutrophils. Biochem. J. 325, 581–585. 26. Tokumura, A., Moriyama, T., Minamino, H., Hayakawa, T., Tsukatani, H. (1997) Exogenous phosphatidic acid with saturated short-chain fatty acyl groups induces superoxide anion release from guinea pig peritoneal polymorphonuclear leukocytes by three different mechanisms. Biochim. Biophys. Acta 1344, 87–102. 27. Orci, L., Perrelet, A., Ravazzola, M., Wieland, F. T., Schekman, R., Rothman, J. E. (1993) “BFA bodies”, a subcompartment of the endoplasmic reticulum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 11089 –11093. 28. Mitchell, R., McCulloch, D., Lutz, E., Johnson, M., MacKenzie, C., Fennell, M., Fink, G., Zhou, W., Sealfon, S. C. (1998) Rhodopsin-family receptors associate with small G proteins to activate phospholipase D. Nature 392, 411– 414. 29. McCulloch, D. A., Lutz, E. M., Johnson, M. S., Robertson, D. N., MacKenzie, C. J., Holland, P. J., Mitchell, R. (2001) ADP-ribosylation factordependent phospholipase D activation by VPAC receptors and a PAC(1) receptor splice variant. Mol. Pharmacol. 59, 1523–1532. 30. Qualliotine-Mann, D., Agwu, D. E., Ellenburg, M. D., McCall, C. E., McPhail, L. C. (1993) Phosphatidic acid and diacylglycerol synergize in a cell-free system for activation of NADPH oxidase from human neutrophils. J. Biol. Chem. 268, 23843–23849. 31. Borregaard, N., Miller, L., Springer, T. A. (1987) Chemoattractant-regulated mobilization of a novel intracellular compartment in human neutrophils. Science 237, 1204 –1206. 32. Cavenagh, M. M., Whitney, J. A., Carroll, K., Zhang, C., Boman, A. L., Rosenwald, A. G., Mellman, I., Kahn, R. A. (1996) Intracellular distribution of Arf proteins in mammalian cells. Arf6 is uniquely localized to the plasma membrane. J. Biol. Chem. 271, 21767–21774. 33. Zhang, Q., Cox, D., Tseng, C. C., Donaldson, J. G., Greenberg, S. (1998) A requirement for ARF6 in Fcgamma receptor-mediated phagocytosis in macrophages. J. Biol. Chem. 273, 19977–19981. 34. Shome, K., Nie, Y., Romero, G. (1998) ADP-ribosylation factor proteins mediate agonist-induced activation of phospholipase D. J. Biol. Chem. 273, 30836 –30841. 35. Guillemain, I., Exton, J. H. (1997) Effects of brefeldin A on phosphatidylcholine phospholipase D and inositolphospholipid metabolism in HL-60 cells. Eur. J. Biochem. 249, 812– 819. 36. Tarricone, C., Xiao, B., Justin, N., Walker, P. A., Rittinger, K., Gamblin, S. J., Smerdon, S. J. (2001) The structural basis of Arfaptin-mediated cross-talk between Rac and Arf signalling pathways. Nature 411, 215– 219.
http://www.jleukbio.org
