Genotoxické látky a mutácie doc. Ing Anna Trakovická, CSc. Katedra genetiky a plemenárskej biológie
Genotoxické látky • látky ovplyvňujúce genetický informačný systém na úrovni jeho chemického zloženia, štruktúry a organizácie v genóme • delenie podľa mechanizmu účinku: – mutagény – karcinogény – teratogény
Mutagény a mutácie • Mutagén – vonkajší faktor schopný vyvolať dedičnú zmenu • Mutácia – náhla dedičná zmena GI, ktorá nie je podmienená kombinačnou premenlivosťou • Mutant – jedinec s mutačnou zmenou v GIS • Mutabilita – schopnosť GIS organizmu mutovať
Mutagény • Podľa pôvodu: – fyzikálne – chemické – biologické • Podľa špecifity: – všeobecné – druhovošpecifické • Podľa spôsobu účinku: – exogénne – endogénne
•Mutačné spektrum – šírka mutagénnej špecifity génov (viaceré formy príslušného génu ktoré vzniknú vplyvom mutácií) - podľa toho koľko zmutovaných foriem génov daný mutagén vyvoláva, poznáme úzke alebo široké mutačné spektrum Mutačný tlak – hladina prirodzene sa vyskytujúcich mutácii v prostredí -zisťovaný podľa frekvencie zmutovaných foriem génov v populáciach jednotlivých druhov -Mutačná dávka – množstvo mutagénu, ktoré organizmus absorboval na vytvorenie konštantného množstva mutácií •Mutačná záťaž – frekvencia alel a genotypov znižujúcich fitness populácie
Klasifikácia mutácií • Podľa úrovne genetickej informácie: – génové = bodové – chromozómové aberácie – genómové • Podľa typu bunky: – gametické – dedia sa mieoticky – somatické – dedia sa mitoticky • Podľa životaschopnosti nositeľa: – vitálne – subvitálne – letálne – semiletálne
A Génové mutácie G C Pôvodné pradie T T A Inzercia
A G C G T T A
Substitúcia
T C G C A A T
A G C G T A
T C G C A T
T C G A A T Delécia
A G C T A
Inverzia
T C G A T
A G T C T A
T C A G A T
Príklad: Bodové mutácie v kóde tyrozínu Thr Tyr Ala
proteín
5’-ACG UAU GCG -3’
mRNA
Zámena v 1. nukleotide
Zámena v 3. nukleotide
GAU = Asp UGU = Cys AAU = Asn UCU = Ser CAU = His UUU = Phe zmena zmyslu genetického kódu
UAG = stop UAA = stop UAC = Tyr
zmena zmyslu genetického kódu
nonsense
silent
REVERZIA Proces kedy mutant získa späť pôvodný štandartný fenotyp. Mutant sa nazývá REVERTANT REVERTANT. Reverzia častá pri mutáciách s posunom ORF. Dve cesty: 1. spätná mutácia (presná, málo častá) – tzv. pravá reverzia 2. supresorová mutácia Intragénová reverzia - mutácia na inom mieste génu, ktorá potlačuje (supresuje) pôvodnú mutáciu. Intergénová reverzia - mutácia v inom géne potlačuje účinok zmutovanej alely v ďalšom géne.
Reverzia supresorovou tRNA • mutácia so stratou zmyslu môže byť potlačená tzv. supresorovou tRNA • v genetickom kóde môže vzniknúť mutáciou stop kodón UAA, UAG, UGA. • existujú mutantné tRNA gény, ktoré rozpoznávajú tieto kódony ako funkčné a začleňujú do vznikajúceho polypetidu namiesto ukončenia ďalšie AK - tzv. supresorové tRNA.
Chromozómové aberácie • Štrukturálne prestavby chromozómov • Mechanizmus vzniku: fragmentácie a fúzie chromozómov • Dopad na organizmus: - Atypické mitózy a meiózy - Genómova instabilita
Chromozómové aberácie Zlomy
Dicentrický ch.
+
Zlomy
Terminálna delécia
ACCH
Intersticiálna delécia
Zlomy
Intrachom. translokácia
Zlomy
Inzercia + delécia Interchrom. translokácia
Mutácie na úrovni organizmu Letálne mutácie – organizmus hynie v dôsledku zmeneného alebo chýbajúceho produktu génu. Môže byť letálná na základe okolitých podmienok Mutácia spôsobí iba čiastočnú zmenu funkcie génu (napr. zníženie aktivity) Mutácia génu ktorého funkcia nie je pre bunku esenciálná, alebo funkcia môže byť nahradená génom podobným (génová rodina) Skrytá mutácia (bez efektu)
SPONTÁNNÉ MUTÁCIE • mutácia je náhodný proces • všeobecne dochádza k spontánnej mutácii s pravdepodobnosťou 10-6 až 10-9 na gén za jednu generáciu • mutácia môže vzniknúť chybou v replikácii DNA – PROOFREADING aktivita DNA polymeráz (nie pri PCR!) • každý gén mutuje s inou pravdepodobnosťou (pozícia v genóme) • mutácia ovplyvňujúca fenotyp je ešte zriedkavejšia • pravdpodobnosť reverzie je ďaleko nižšia než priama mutácia
INDUKCIA MUTÁCIÍ • Rozhodujúci je typ mutagénu a mechanizmu jeho účinku • Najčastejšie mechanizmy – substitúcia analógmi báz – celková chemická zmena DNA a nukleotidov – väzba chemickej látky na DNA – depolymerizácia
Systémy hodnotenia genetického rizika doc. Ing Anna Trakovická, CSc. Katedra genetiky a plemenárskej biológie
Testovanie mutagénneho účinku látok • Pre hodnotenie genetického rizika v dôsledku pôsobenia mutagénov existuje celý rad metód a modelov, ktoré sa používajú vo viacstupňovom systéme testovania. • Testy na rôznych vývojových stupňoch organizmov: mikroorganizmy, nižšie živočíchy, cicavce, populácie • Závery o genotoxickom účinku musia byť potvrdené na troch úrovniach testovania
I. stupeň testovania: • mikrobiálne testovacie systémy (baktérie, vírusy, fágy) • kvasinky • drozofila melanogaster
Výhody použitia: • krátky generačný interval • malé genómy – vysoká pravdepodobnosť zásahu štruktúrneho alebo regulačného génu • vysoká reprodukčná schopnosť • možnosť testovania viacerých látok v jednom experimente • získané výsledky sú presne definované • výsledok poukazuje len na potenciálnu možnosť genetického rizika pre človeka
1.Test na mikroorganizmoch bez metabolickej aktivity in vitro Je založený na: • A: indukcii mutácií (tzv. forward, dopredu), kedy bunka získava schopnosť rezistencie voči toxickej látke • B: indukcii spätných mutácií (reverzií), pri ktorých bunka získava vlastnosti pôvodného nemutovaného kmeňa
2. Test na mikroorganizmoch s metabolickou aktivitou in vitro • Je založený na indukcii mutácií endogénnými mutagénmi, t. j. metabolickými produktmi mutagénnej látky (najčastejšie po pôsobení pečeňových enzýmov). • Test poskytuje informácie o mutagénnej aktivite medziproduktov metabolizmu mutagénu. 3. Test na stanovenie pohlavne viazaných recesívnych mutácií Drozofily melanogaster
II. stupeň testovania – Testy na cicavcoch • Výber metód a modelov musí zohľadňovať etické požiadavky • použité testy musia hodnotiť také typy genetických zmien, ktoré sú príčinou genetických chorôb človeka • použitý model by mal mať porovnateľný metabolizmus s človekom Význam: mutagénna aktivita zistená na tomto stupni testovania indikuje možné genetické riziko, ktoré musí byť analyzované ďalej
1.Test na stanovenie dominantných letálnych mutácií •
•
analyzujú sa genetické zmeny indukované v pohlavných bunkách, ktoré sa manifestujú po oplodnení (génové, chromozómové a genómové) zo získaných hodnôt sa určujú charakteristiky dominantnej letality
2. Test s metabolickou aktivitou in vitro •
analyzujú sa genetické zmeny mutagénov v organizme cicavcov • dáva informácie o schopnosti cicavčieho metabolizmu 1. detoxikovať mutagénnu látku 2. metabolizovať látku in vitro nemutagénnu na mutagénny produkt
3. Cytogenetická charakteristika chromozómových a genómových mutácií
• kostná dreň hlodavcov in vitro • ľudské periferné lymfocyty in vitro
III. stupeň testovania - Genetické monitorovanie populácie • Genetické monitorovanie populácie je sledovanie zmien frekvencie mutácií, v dôsledku ktorých sa zvyšuje výskyt dedičných chorôb a vád. • Úroveň monitoringu: teritoriálna regionálna profesionálna expozícia populačno – genetické analýzy
Systém hodnotenia genetického rizika pre človeka • navrhnutý na základe všeobecných vzťahov mutagénov s genetickým systémom • vychádza z faktu, že genetické riziko mutagénov môže byť rôzne pre rôzne skupiny populácie • hlavný dôraz je kladený na látky, ktoré človek používa v širokom merítku a často s nimi prichádza do styku
Systém je tvorený dvoma etapami: 1. Orientačná časť: q vytypovanie látky s mutagénnym účinkom na testovacie systémy 2. Kompletný systém testovania: q explorácia experimentálnych výsledkov na človeka
Podmienky explorácie experimentálnych výsledkov na človeka: • použité sú len výsledky testovania na cicavcoch a ľudských tkanivových kultúrach • spôsob, dávka a doba aplikácie testovanej látky musí zodpovedať prirodzenej expozícií na ľudskú populáciu
• Postup hodnotenia genetického rizika: – mutagénna aktivita látky – trojstupňovým systémom – metabolizmu mutagénu u človeka biomarkéry – odhad množstva testovanej látky, ktorá bude pôsobiť na populáciu a jednotlivca – odhad rizika expozície testovanou látkou – stanovenie najvyššej prípustnej úrovne genetického poškodenia
Genetické monitorovanie
• sledovanie zmien frekvencie mutácií v dôsledku, ktorých sa zvyšuje výskyt dedičných vád • umožňuje posúdiť: – skutočnú genetickú záťaž populácie – vývoj genetických zmien zo vzťahu k meniacemu sa prostrediu – dôsledky kombinovaného pôsobenia mutagénov na genetickú záťaž
• pre sledovanie zvýšenej frekvencie mutácií v ľudskej populácií sú doporučované štyri metódy: – metóda charakterizácie populácie – metóda určovania signálnych fenotypov – metóda určovania špecifických biochemických mutácií – metóda určovania chromozomálnych a genómových mutácií (karyotyp)
Metóda charakteristiky populácie • sledovanie špecifických kategórií • ukazovatele sú sledované v rôznych podmienkach a vplyve exogénnych faktorov • Napr. novorodenci: – – – – –
pomer pohlavia počet mŕtvo narodených detí VVV – počet detí s vrodenou vývojovou vadou hmotnosť pri narodení úmrtnosť do jedného roku života fyzický a duševný vývoj do jedného roku života
Metóda signálnych fenotypov • choroby známych génov • choroby neistých génov • choroby neznámych génov
Odhad zdravotného rizika (HRA - Health Risk Assessment)
Odhad zdravotného rizika (HRA - Health Risk Assessment) • metóda určovania pravdepodobnosti a závažnosti nepriaznivého zdravotného vplyvu látok • východisko pre stanovenie bezpečnej koncentrácie látok v životnom prostredí (štandardov) • Štyri zložky HRA
Identifikácia rizika (Hazard Identification)
• určovanie presného stupňa ohrozenia zdravia v dôsledku kontaminácie nebezpečnou látkou: – identifikovanie koncentrácie látky – ohodnotenie toxicity látky
Identifikácia rizika (Hazard Identification) • nepriaznivý efekt (Adverse Effect) - akákoľvek biochemická, fyziologická, anatomická alebo patologická zmena, spôsobujúca funkčné poškodenie organizmu alebo zníženú schopnosť adaptability • základná toxicita látky je určená: – typom poškodenia – podmienkami expozície – zdrojom informácií
• typy poškodenia – systémové: orgánové poškodenie, reprodukčná toxocita, vývojová toxicita, teratogenéza, karcinogenéza – kontaktné: v mieste kontraktu s látkou (koža)
• podmienky expozície: • akútne: jedna alebo niekoľko dávok po dobu niekoľkých dní • subchronické: opakovaná expozícia za 14-90 dní • chronické: opakovaná expozícia za viac ako jeden rok počas života
• zdroj informácií – experimenty a štúdie: • epidemiologické • testovanie živočíchov • bunkové kultúry • analýza štruktúrno-funkčných vzťahov
Epidemiologické štúdie: • založené na štúdiu expozície v ľudskej populácií – poskytuje presné informácie o väzbe medzi expozíciou a nepriaznivým efektom – problematické je vylúčenie spolupôsobiacich faktorov a nedostatok informácií o nových rizikových látkach • vyjadrenie: Relatívne riziko (Relative Risk): – výskyt ochorenia a mortality v populácií na celkovú populáciu
Testovanie zvierat (Animal studies) • predpokladá rovnaký efekt pozorovanej látky u zvierat i ľudí • akútne: – jednorázová dávka počas 14 dní – LD50 (letálna dávka): dávka následkom ktorej ochorie alebo hynie 50% jedincov z pokusnej populácie
• subchronické: – menšie dávky v pravidelných intervaloch po dobu 5-90 dní – sledované hodnoty: • MTD maximálne tolerovaná látka • NOEL úroveň bez pozorovaných efektov • LOEL úroveň s minimálnym efektom • chronické: – doba trvania pokusu 1-2 roky – určovanie hodnoty NOEL, LOEL
– aplikácia sledovanej látky v minimálne v troch skupinách zvierat: § orálne § dermálne § inhalácia – sledovanie klinických ukazovateľov: § strata hmotnosti § orgánové a tkanivové poškodenia § vývojové a reprodukčné poškodenia § karcinogenéza § imunotoxicita
Odhad: dávka/odpoveď (Dose /Response Assassment) • odhad odpovede živých organizmov na rôzne dávky látok: – dávka spôsobujúca viditeľný efekt organizmu LOEL – dávka bez viditeľného efektu na organizmu NOEL
Odhadnutie expozície (Exposure Assissment) • určovanie presného stupňa expozície, s ohľadom na koncentráciu populácie a cesty expozície(voda, pôda, vzduch, potrava)
Genetická modulácia exopozičného rizika Rezistentný
Bez expozície
genotyp Vnímavý genotyp
Rezistentný
Expozícia
genotyp Vnímavý genotyp
Pozadie Úroveň rizika (nízka)
2-násobné riziko 4-násobné riziko
Expozícia • výpočet: koncentrácia x príjem x čas x frekvencia –––––––––––––––––––––––––––––––––––hmotnosť tela • vyjadrenie: mg/kg hmotnosti tela/deň
Absorbovaná dávka • príjem: presné množstvo látky, ktorú organizmus prijal • absorbácia: presné množstvo látky, ktorú organizmus absorboval • absorbovaná dávka: rozdiel medzi príjmom a výdajom látky (pohyb látky v tele, metabolizmus, vylučovanie )
• výpočet absorbovanej dávky: – expozícia x absorbčný faktor • vyjadrenie v hodnote: – AADD priemerná denná absorbovaná látka – LADD priemerná dávka absorbovaná za život
4. Charakterizácia rizika (Risk Characterization)
• zhrnutie výsledkov: charakterizácia závažnosti a pravdepodobnosti negatívneho vplyvu látky na zdravie populácie • výsledky analýzy identifikácie rizika sú zhrnuté do krivky • tri sledované body: – poškodenie pečene – vývojová toxicita – mortalita • referenčná dávka (RfD): – RfD = NOEL x UF (mg/Kg/deň) – UF: neurčitý faktor
Otázky
?
