Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet Általános Orvostudományi Kar Debreceni Egyetem
BIOKÉMIA GYAKORLAT
A MITOKONDRIÁLIS ENERGIATERMELŐ FOLYAMATOK VIZSGÁLATA Elméleti háttér Dr. Kádas János 2015 A tananyag elkészítését "Az élettudományi- klinikai felsőoktatás gyakorlatorientált és hallgatóbarát korszerűsítése a vidéki képzőhelyek nemzetközi versenyképességének erősítésére" TÁMOP 4.1.1.C-13/1/KONV-2014-0001 számú projekt támogatta. A projekt az Európai Unió támogatásával, az Európai Szociális Alap társfinanszírozásával valósult meg.
1
A MITOKONDRIÁLIS ENERGIATERMELŐ FOLYAMATOK VIZSGÁLATA – ELMÉLETI HÁTTÉR A mitokondriumok szerkezete és funkciója A mitokondriumok többnyire minden eukarióta sejtben megtalálható, kettős membránnal határolt sejtorganellumok. Szerkezetileg a mitokondriumban megkülönböztetjük a külső membránt, a belső membránt a betüremkedéseivel (kriszták), a két membrán által határolt teret, és a belső membrán által határolt mitokondriális mátrixot. A külső membrán szerkezete egyszerűbb, míg a belső membrán bonyolultabb szerkezetű, körülbelül 75% fehérjetartalommal jellemezhető. A külső membrán a kisméretű molekulák és ionok számára átjárható. Porin fehérjék képeznek rajta nagyméretű csatornákat, mely transzmembrán csatornák a kisebb molekulákat képesek átengedni. A nagyobb fehérjék szállításáért transzlokáz rendszerek felelősek. A két membrán közötti tér nagy mennyiségben tartalmaz citokróm c molekulát, és szerepet játszik a protongrádiens kialakításában. A belső membrán a legtöbb kis molekula és ion számára is átjárhatatlan (beleértve a protonokat is), az átjutáshoz specifikus transzporterekre van szükség. A belső membrán felülete igen nagy a membrán betüremkedéseinek köszönhetően. Ezek a betüremkedések a kriszták. A belső membránban található a mitokondriális elektron transzport rendszer, az ADP-ATP transzlokáz és az ATP szintetáz komplexe is. A májsejtek mitokondriumainak belső membránjában több mint 10,000 légzési lánc található. A mitokondriális mátrix tartalmazza számos anyagcsere intermedieren, a mitokondriális DNSen és a riboszómákon kívül többek között a piruvát-dehidrogenáz enzimkomplexet, a citrátköri reakciók, az aminosav oxidáció és a zsírsav oxidáció enzimeit is. A mitokondrium elsődlegesen a sejtek energiatermelésért felel, mint energiatermelő központ, szorosan összekapcsolva más anyagcsere folyamatokkal. De más egyéb folyamatban is részt vállal, úgy, mint jelátviteli funkciók, kalciumtárolás, hőtermelés, differenciálódás és növekedés, sejthalál, hem szintézis, szteroidok szintézise, valamint öregedési folyamatok (1. ábra).
1. Ábra: A mitokondriumok szerkezete
2
A biológiai oxidáció A biológiai oxidáció a szerves vegyületekben lévő szén oxidációja és az oxigén molekula redukciója. A szén széndioxiddá (CO2) oxidálódik, a terminális oxidáció során az oxigén vízzé redukálódik. A szervezetbe kerülő és a raktárakból mobilizált tápanyagok lebontása során alapvetően három szakaszt különbözetünk meg (2. ábra). Az első szakasz során a glükóz, a zsírsavak és az aminosavak oxidációjával acetilCoA keletkezik. A citrátkörben, a második szakaszban az acetil-CoA acetil csoportja széndioxiddá oxidálódik, miközben a felszabaduló energia redukált elektronszállító molekulákban konzerválódik (NADH és FADH2). A harmadik szakasz a redukált elektronszállítók oxidációját jelenti, melyek protonokat és elektronokat eredményező módon oxidálódnak a mitokondriumban zajló terminális oxidációban. A végső szakaszban az elektronok az oxigénre kerülnek, melyet vízzé redukálnak, a felszabaduló energia pedig ATP szintézisre használódik fel, az oxidatív foszforiláció során.
2. Ábra: A sejtszintű biológiai oxidáció fázisai
A redukált elektronszállítók tehát a terminális oxidáció során adják le hidrogénjeiket és elektronjaikat. Míg a citrátköri reakciókban és a piruvát-dehidrogenáz által katalizált reakció során keletkező redukált elektronszállítók a mitokondriumon belül oxidálódhatnak, addig a glikolízis során a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz által katalizált reakcióban keletkező NADH számára transzport mechanizmusra van szükség, melynek segítségével a citoszolból a mitokondriális mátrixba transzportálódhat. A mitokondriális transzportért elsősorban a malát-aszpartát inga és a glicerol-3-foszfát-dehidrogenáz inga felel. A malát-aszpartát inga segítségével a citoszolban keletkezett NADH az elektrontranszport láncot NADH formájában éri el. Ennek során a malát-dehidrogenáz enzim az oxálacetátot maláttá alakítja a membránközti térben, a NADH oxidálása mellett. A malát a malát-α-ketoglutarát transzporter segítségével jut a mátrixba, ahol oxálacetáttá alakulása közben a malát-dehidrogenáz NAD kofaktora redukálódik. Transzaminálási reakcióban (a glutamát α-ketoglutaráttá alakulása mellett) az oxálacetát aszpartáttá alakul, mely a glutamátaszpartát cseretranszport segítségével jut ki a membránközti térbe. Itt ismételt transzaminálási 3
reakció során oxálacetát keletkezik, mely újra részt vehet a NADH transzportjában, miközben a malát-dehidrogenáz által katalizált reakcióban redukálódik (3. ábra).
3. ábra: A malát - aszpartát inga
A glicerol-3-foszfát-dehidrogenáz inga esetében a glicerol-3-foszfát-dehidrogenáz a citoszolban a dihidroxiaceton-foszfátot glicerin-3-foszfáttá alakítja, miközben a NADH oxidálódik. A mitokondriumba jutást követően az enzim mitokondriális izoformája FAD kofaktora redukálása mellett alakítja vissza a glicerin-3-foszfátot dihidroxiaceton-foszfáttá. Ezen inga használatával a citoszolban keletkezett NADH tehát FADH2 útján kerül a légzési láncba (4. ábra). Mindkét transzport inga alkalmas a redukáló ekvivalensek transzportjára. A malát-aszpartát inga reverzibilis, magas citoszolikus NADH koncentráció esetén lép működésbe, a glicerol-3-foszfát inga működése irreverzibilis, a koncentráció viszonyok nem befolyásolják a működését.
4. ábra: A glicerol - 3 - foszfát inga
4
A biológiai oxidáció során egy molekula NADH oxidációjához 3 molekula ADP foszforilációja, míg egy molekula szukcinát oxidációjához 2 molekula ATP képződése kapcsolódik. A glikolízis során keletkező két NADH molekula így 4 vagy 6 ATP szintézisére használódhat fel attól függően, hogy melyik transzportrendszeren keresztül jut be a mitokondriális mátrixba. Aerob körülmények között egy molekula glükóz teljes oxidációja 36 vagy 38 ATP keletkezéséhez vezethet. Fontos megjegyezni, hogy anaerob körülmények között a piruvát laktát szintézisére használódik fel és mindösszesen 2 ATP szintetizálódik. A mitokondriális elektronszállító rendszer A terminális oxidáció során, a mitokondriális elektonszállító rendszeren a hidrogén oxidálódik és az oxigén vízzé redukálódik. A folyamathoz kapcsolódva oxidatív foszforiláció történik, melynek során ADP foszforilálódik ATP-vé. A terminális oxidáció és az oxidatív foszforiláció térben és időben is összekapcsolt folyamatok. A mitokondriális elektronszállító rendszer felépítésében négy komplex vesz részt, ehhez kapcsolódik ötödik elemként az ATP szintetáz komplexe, valamint a rendszer részét képező Ubikinon és a Citokróm c. A redukált elektronszállító molekulák oxidációja a négy légzési komplex koordinált együttműködéseként valósul meg (5. ábra).
5. Ábra: A mitokondriális elektronszállító rendszer elemei és az ATP szintetáz komplexe
Az I. komplex, a NADH-ubikinon-oxidoreduktáz, más néven NADH-dehidrogenáz. Kialakításában prosztetikus csoportként vas-kén (Fe-S) komplexet vagy flavin mononukleotidot (FMN) tartalmazó fehérjék vesznek részt. A NADH-t oxidálja, majd az elektronokat az ubikinonnak adja át, eközben protont pumpál a két membrán közötti térbe. A II., szukcinát-ubikinon-oxidoreduktáz komplex flavin-adenin-dinukleotid (FAD) prosztetikus csoporttal rendelkező enzimkomplex. Valójában a szukcinát-dehidrogenáz és egy hidrogén transzferáz együttese. Működése során ez a komplex is ubikinont redukál. A szukcinát-fumarát átalakulás során felszabaduló elektronok először a szukcinát-dehidrogenáz FAD-jára adódnak, majd ezután lépnek be az elektrontranszport láncba és adódnak át az
5
ubikinonnak. A szukcinát-dehidrogenáz része a citrátkörnek is, annak egyetlen membrán kötött enzime. A II. komplex protonpumpa aktivitással nem rendelkezik. Az Ubikinon a légzési lánc oxigénszállítója. Hosszú, izoprén egységekből álló hidrofób molekula, mely a membránban található és diffúzióra képes. A légzési lánc fontos elektronszállítója, mely fehérjéhez nem kapcsolódik, a membránon belül mozogva teremt kapcsolatot az I. és II. légzési komplexek és a III. komplex között. A III. komplex, az ubikinon-citokróm c-oxidoreduktáz, az elektrontranszport lánc második olyan enzimkomplexe, amely protont pumpál a membránok közötti térbe. Az ubikinon által szállított elektronok a III. komplexen keresztül a citokróm c-re kerülnek rá, amely a 4. komplexhez szállítja azokat. A komplexben b és c1 citokrómok találhatók, prosztetikus csoportjuk hem. A citokróm c hem prosztetikus csoporttal rendelkező, nem membránkötött fehérje, a membránok közötti térben mozogva köti össze a III. és IV. komplexet. Az elektronszállító rendszer utolsó eleme a IV., citokróm-oxidáz komplex. Citokróm a-t és a3-t tartalmaz, ezek hem-vas tartalmú fehérjék. Ezen felül két réz ion is található a komplexben. A citokróm-oxidáz a citokróm c-t oxidálja és az oxigén molekulát redukálja vízzé a mátrixban. A komplex protonpumpaként működik (6. ábra).
6. Ábra: A mitokondriális elektronszállító rendszer komplexei
Az ATP szintézis mechanizmusa A terminális oxidáció elektronszállító rendszerének komponensei a mitokondrium belső membránjában elhelyezkedve térben és időben összekapcsoltak az ATP szintéziséért felelős strukturális komponensekkel. Miután az ATP szintézis szorosan összefügg a végoxidációval, így oxidatív foszforilációnak is nevezzük.
6
A kemiozmotikus elmélet A mitokondriális elektron transzport proton transzporttal is össze van kötve, melynek során így kémiai és elektromos gradiens is keletkezik. A légzési láncban a protonpumpa aktivitással rendelkező komplexek működése következtében protongrádiens alakul ki a mitokondriális mátrix és a membránok közötti tér között.
7. Ábra: Az elektron szállítás és az ATP szintézis sematikus bemutatása
Peter Mitchell kemiozmotikus elmélete szerint a mitokondriális elektrontranszport során az elektronok energiája a belső membrán két felszíne között H+-ion koncentrációkülönbség (protongrádiens) létrehozására fordítódik. A komplexek működésük közben protonokat pumpálnak ki a membránok közötti térbe, így proton koncentrációkülönbség alakul ki, amely pH-változást eredményez. A proton transzport következtében kialakuló szabadenergia változás meghatározásakor figyelembe kell azt is venni, hogy a belső membrán két oldala között eleve létezik elektrokémiai membrán potenciál, a mátrix negatív, míg a membrán közti tér pozitív. Az ATP szintézist hajtó proton motoros erő az elektrokémiai potenciál és a protongrádiens összege (7. ábra). Az oxidatív foszforiláció Az ATP szintézis energiaforrása tehát az elektronáramhoz kapcsolt protongrádiens illetve az elektrokémiai potenciálkülönbség, amely az ATP makroerg foszfátkötéseinek kialakulásához vezet. A membránközti térbe kipumpált protonok számára az ATP szintetáz komplex proton-specifikus csatornái (F0) biztosítanak visszajutási lehetőséget a mátrixba. A koncentráció különbségből és membrán potenciálból származó energia a kiegyenlítődés során ATP szintézisre használódik fel. Az ATP szintetáz F1 és F0 részből áll. A négy membrán integráns alegységből álló F0 képezi a protoncsatornát, míg a mátrix felőli oldalon található F1 felelős az ATP szintézisért. A mitokondriumban szintetizálódott ATP az ADP-ATP transzlokáz segítségével exportálódik, míg a belső membrán transzportrendszere szállítja a mátrixba az ADP-t és az anorganikus foszfátot, melyek az ATP szintézishez szükségesek. A proton motoros erő tehát 7
nem csak az ATP szintézishez szükséges, hanem az újonnan szintetizálódott ATP kijuttatásához is. Az akceptor-kontroll és a P/O hányados Az elektron transzport és az oxidatív foszforiláció szorosan kapcsolt folyamatok. A jelenséget az akceptor-kontroll szabályozó mechanizmus segítségével is magyarázhatjuk. Az oxidatív foszforilációhoz szükséges elektronokat és hidrogéneket a redukált elektronszállítók biztosítják, míg az ATP szintézishez oxigénre, anorganikus foszfátra és ADP-re is szükség van. Az ADP koncentráció meghatározó az ATP szintézis szempontjából. Magas ADP koncentráció esetén az ATP szintézis fokozódik. Az ADP-nek ezt a sebességfokozó hatását nevezzük akceptor- vagy respirációs kontrollnak (RC). Alacsony ADP szint esetén az oxidatív foszforiláció sebessége csökken, ami miatt csökken a protonok visszaáramlásának sebessége is. Ha a protonok mátrixba áramlása gátolt, az F0-F1 komplexen keresztül, a membrán közti térben jelentősen megnő a proton koncentráció és egyre nagyobb energiához van szükség ahhoz, hogy a proton pumpa aktivitású komplexek a megnövekedett grádienssel szemben protonokat legyenek képesek kipumpálni. Amennyiben ez az energia meghaladja az elektrontranszfer során rendelkezésre álló energiát, az elektron transzfer megáll. A protongrádiens növekedése ugyanakkor nem csak a terminális oxidációt állítja le, hanem a megnövekedett NADH koncentráció visszahat a citrátkörre, annak gátlását is okozza. A terminális oxidáció során, az egy oxigénatom felhasználására, azaz egy molekula víz keletkezésére eső anorganikus foszfát beépülése kísérletesen meghatározható, mely érték a P/O hányados. A szukcinát fumaráttá alakulása során a II. komplex (szukcinát-ubikinonoxidoreduktáz) a hidrogéneket a szukcinát-dehidrogenáz FAD-jára viszi át (FADH2 keletkezik), majd ezt követően az ubikinont redukálja, majd elektrontranszfert követően beindul az ATP szintézis. A malát a malát-α-ketoglutarát transzporter segítségével juthat át a belső membránon. A malát-dehidrogenáz oxálacetáttá alakítja, melynek során NADH+H+ keletkezik, mely az I. komplexen (NADH-ubikinon oxidoreduktáz) oxidálódik, ami ezt követően az ubikinont redukálja. Egy molekula ATP szintéziséhez 4 proton transzportjára van szükség. Összesen 10 proton kerül kipumpálásra a protonpumpa aktivitással rendelkező komplexek által a membránközti térbe a NADH+H+ oxidálása esetén, míg 6 a FADH2 esetében. Ha tehát 4 proton szükséges 1 molekula ATP szintéziséhez, akkor a P/O hányados értéke a NADH+H+ esetében 2,5 (10/4), míg a FADH2 esetében 1,5 (6/4). A NADH+H+ esetében a 3, míg a FADH2 esetében a 2 is általánosan használt P/O érték az irodalomban. A mitokondriális elektronszállító rendszer és az ATP szintézis gátlószerei Az elektron transzport lánc működése, komplexeinek működési sorrendje, valamint a terminális oxidáció és az oxidatív foszforiláció kapcsoltsága kísérletes módszerek segítségével vizsgálható és meghatározható. A légzési lánc komplexeinek mitokondrium frakcióból kromatográfiás módszerekkel történő izolálásával, majd az izolált és a komplexet tartalmazó frakciók vizsgálatával meghatározható az egyes komplexek által katalizált reakció. Az elektronátvivők működési sorrendje meghatározható a különböző elektron transzfer inhibítoroknak az egyes átvivők oxidáltsági állapotára, kinetikájára gyakorolt hatásának vizsgálatával is (8. ábra). 8
8. Ábra: A mitokondriális elektrontranszport lánc és az ATP szintézis gátlószerei
A terminális oxidáció és az oxidatív foszforiláció néhány ismert inhibítora és működésének mechanizmusa (9. ábra):
Cianid (CN-) és szénmonoxid (CO): a citokróm-oxidáz (IV. komplex) gátlószerei, gátolják a Citokróm a és a3 oxidációját, és az elektronok oxigénre történő áramlását. Antimicin A: gátolja az elektronátmenetet a Citokróm b és a Citokróm c1 között a III. komplexben. Malonát: a szukcinát-dehidrogenáz (II. komplex) kompetitív inhibítora. Rotenon: gátolja az elektrontranszportot a NADH-ubikinon oxidoreduktáz Fe-S centruma (I. komplex) és az ubikinon között. Oligomicin: az ATP szintetáz specifikus inhibítora, az F0 és CF1 gátlásáért felelős.
Egyéb, oxidatív foszforilációt befolyásoló szerek:
Dinitrofenol (DNP): protonofor, szétkapcsoló reagens, amely a membránt átjárhatóvá teszi a protonok számára, így a protonok nem az ATP szintetázon keresztül fognak a mátrixba visszaáramlani. Ezáltal szétkapcsolja az elektrontranszport láncot és az oxidatív foszforilációt. Atraktilozid: az ATP-ADP transzlokáz (adenin nukleotid szállító) specifikus inhibítora, amely gátolja az adenin nukleotid kicserélődést a belső membrán két oldala között.
9
9. Ábra: Gátlószerek hatása a mitokondriális elektrontranszport lánc egyes lépéseire
A különböző inhibítorok az elektrontranszport láncnak a különböző lépéseit specifikusan képesek gátolni. A gátolt lépést megelőzően található elektronszállító redukált állapotba kerül és állapotban marad, míg az ezt követő lépésekben szereplő elektronszállítók oxidált állapotban maradnak, az elektrontranszport és az oxigénfelvétel leáll (10. ábra).
10. Ábra: Néhány gátlószer blokkoló hatása a mitokondriális elektrontranszport lánc lépéseire
Bizonyos fiziológiás körülmények között is célszerű lehet az ATP szintézis (oxidatív foszforiláció) és az elektrontranszport szétkapcsolása. A termogenin jellemzően a barna zsírszövet sejtjeinek mitokondriumaiban, a belső membránban előforduló fiziológiás szétkapcsoló fehérje. Működésének köszönhetően a protonok nem az F0 csatornán keresztül áramlanak vissza a mátrixba. A termogenin pórusokon történő alternatív áramlás hőtermelést eredményez ATP termelés helyett (11. ábra).
10
11. Ábra: A szétkapcsoló fehérje (UCP, Termogenin) működése és hatása
Az oxigénfogyasztás mérése a gyakorlatban, P/O hányados meghatározása Megfelelő kísérletes körülmények között, izolált mitokondrium szuszpenzió felhasználásával a terminális oxidáció és az elektrontranszport lánc tulajdonságai, különböző gátlószerek hatása az oxigén felhasználás mérésével nyomon követhetőek. Az oxigénfogyasztás vizsgálatára alkalmas módszer az oldott oxigén koncentrációjának mérése Clark-típusú polarográfiás oxigénelektród segítségével (12. ábra). Ez a műszer egy bipoláris elektrokémiai oxigén szenzor, mely egy platina katódot és egy nagyobb méretű ezüst-kloriddal borított ezüst anódot tartalmaz. Az elektródok káliumklorid (KCl) elektrolit oldatba merülnek. Az elektródokat a reakciótértől olyan membrán választja el, mely permeábilis az oldott gázok, így az oxigén számára is, de nem átjárható az oldat komponensei számára (víz, ionok). A két elektród közötti polarizációs feszültség 0.6-0.7 V. Az elektródra adott feszültség hatására a platina elektród (katód) felülete negatívvá válik, a folyadék mintából az oxigén az oldott gázok számára permeábilis membránon keresztül a katódhoz diffundál, ahol redukálódik, az anódon az ezüst oxidálódik és ezüst-klorid (AgCl) válik ki. Az elektród folyamatok során keletkező áram erőssége egyenesen arányos a katódon redukálódott oxigén mennyiségével.
12. Ábra: A gyakorlat során alkalmazott készülék elemei
11
A reakciótérben lévő reakcióelegyet állandó hőmérsékleten kell tartani, mert a hőmérséklet változása befolyásolja az oxigén oldékonyságát. A reakcióelegy mágneses keverő segítségével történő folyamatos keverése szükséges, hogy a mitokondrium szuszpenzió és a hozzáadott szubsztrátok és inhibítorok egyenletesen elkeveredjenek a reakciótérben. A buborékképződést el kell kerülni a reagensek hozzáadása során, valamint további oxigén beoldódásának elkerülése érdekében a reakcióteret le kell zárni. Ezáltal biztosítható az egyenletes oxigén koncentráció, így állandó feszültség alkalmazása mellett az elektród által mért oxigén mennyisége arányos lesz a mintában található reakcióelegybeli koncentrációjával. Mivel a membrán nem permeábilis az oldott anyagok, így a mitokondrium szuszpenzióhoz adott szubsztrátok és inhibítorok számára sem, ezek az anyagok nem befolyásolják az elektródokon zajló folyamatokat. Amikor az inhibítor hozzáadását követően a gátlás kialakult, szétkapcsolószer hozzáadásával ellenőrizhetjük (DNP), hogy a légzés újra megindítható-e. Az adott hőmérsékletre vonatkoztatott telítési oxigén koncentráció meghatározható (a hőmérsékletet megközelítőleg állandó értéken kell tartani). A nulla oxigén koncentráció nátrium-ditionit hozzáadásával meghatározható, mely az oxigént kivonja a reakcióelegyből, továbbá segítségével igazolható, hogy a légzés nem az oxigén hiánya miatt lassul, vagy áll le. A kísérletek során az oxigénfogyasztás időben követhető és az áramerősség változása számítógépes rendszer segítségével regisztrálható. Az adott körülmények között mért áramerősség a légzés közbeni oxigén szint meghatározásához használható (13. és 14. ábra).
13. Ábra: Különböző pufferekben regisztrált görbék. A pufferek hatása az oxigén felhasználásra.
12
14. Ábra: A mérések során alkalmazott anyagok hatása az oxigén felhasználásra.
A légzési lánc működése következtében ATP szintézis történik, a felszabaduló oxigén mennyisége kísérletesen meghatározható és a kísérletes adatokból kiszámítható a P/O hányados. ADP hiányában a légzés lassú és az O2-fogyasztás alacsony, míg ADP hozzáadásának következtében az O2-fogyasztás fokozódik. ADP-hozzáadás mellett az O2felvétellel sztöchiometrikus arányban képződik ATP, ez az együttható adja meg a P/O arányt. A P/O hányados az egy oxigén atom fogyására eső ATP szintézisek számát adja meg, azaz a NADH-tól az O2-ig szállított 2 elektrononként keletkező ATP molekulák számát (szintetizált ATP molekulák száma / 2 elektron). A P/O hányados meghatározható a telítési oxigénkoncentráció és a reakcióban felhasznált ADP mennyiségének ismeretében (15. ábra).
15. Ábra: A P/O arány számításának módja
13
Felhasznált irodalom
Törő Imre (Szerk.): Az élet alapjai. Gondolat Kiadó, Budapest 1989. A mitokondriális energiatermelő folyamatok vizsgálata: az elektron transzport, A H+ elektrokémiai potenciál és az ATP-szintézis kapcsolatának tanulmányozása. Orvosi Biokémia és Molekuláris Biológia gyakorlati jegyzet. Semmelweis Egyetem Orvosi Biokémia Intézet, Budapest, 2014. A mitokondrium biokémiája. Biokémia I. előadásanyag. Biokémiai és Molekuláris Biológiai Intézet, Általános Orvostudományi Kar, Debreceni Egyetem, Debrecen, 2014.
14
