A MEPS (Microextraction by Packed Sorbent) minta-előkészítési módszer alkalmazása környezeti vízminták GC-MS áttekintésében Novák Márton
Környezettudomány MSc.
Témavezető: Dr. Eke Zsuzsanna
2012
A GC-MS áttekintés ● takarékossági és környezetvédelmi szempontok
GC-MS áttekintés
□■■□□□□
■□□■□□■
● félkvantitatív módszer
cél előválogatás ● univerzális SIM ↔ SCAN (célszerű) ● minta-előkészítési eljárás
GC-MS áttekintés
■■■■■
□□□□□□□□□
kvantitatív
nincs
analízis
vizsgálat
diklórmetános (DCM) folyadék-folyadék extrakció (LLE)
Célkitűzések ● LLE helyettesítése ~ környezettudatos eljárással:
MEPS (Microextraction by Packed Sorbent)
● módszerfejlesztés során fenolok MEPS-es extrahálása
megfelelő határértékek elérése
A MEPS (Microextraction by Packed Sorbent)
Tömítés Szűrőbetét Minta
Fecskendő Tű
Záró gyűrű MEPS töltet (C2, C8, C18, SCX, SIL)
A nagytérfogatú injektálás
● kapilláris GC split/splitless injektor 1-5 μl injektálható ● MEPS eluálás (min. 10-30 μl) elúció ~ injektálás speciális megoldások ● legsokoldalúbbPTV injektor ● használt üzemmód: oldószer lefúvatás vezérelt sebességű injektálás
A használt készülék
● Agilent 6890 gázkromatográf ● Agilent 5973 tömegspektrométer ● CTC COMBI PAL automata mintaadagoló ● Peltier hűtéssel ellátott Gerstel CIS 4 PTV injektor
A módszerfejlesztés célkomponensei ● A módszer fejlesztéséhez szűkebb célkomponens csoport ● A válogatás szempontja: összes fenol vegyület minél jobb reprezentálása (szerkezeti + kémiai tulajdonságaikban - vízoldhatóság, polaritás, forráspont) CAS fenol 2-klórfenol 2-krezol 2-nitrofenol 2,4-dimetilfenol 2,4-diklórfenol 2,4,6-triklórfenol 2,4-dinitrofenol 2,3,4,6-tetraklórfenol pentaklórfenol
108-95-2 95-57-8 95-48-7 88-75-5 105-67-9 120-83-2 88-06-2 51-25-5 58-90-2 87-86-5
M (g/mol) 94 129 108 139 122 163 197 184 232 266
forráspont (0C) 181,7 174,9 191 214-216 211-212 209-210 246 351 268 309-310
vízoldhatóság (g/L) 80 28,5 20 2 5 4,5 0,8 6 1 0,02
log Kov
pKa
1,50 2,15 1,98 1,77 2,35 3,17 3,69 1,53 4,45 5,18
9,99 8,55 10,31 7,21 10,6 7,85 7,42 4,09 5,40 4,93
A nagytérfogatú injektálás optimálása I. ● fenolok eluálása: etil-acetát (EtOAc) és diklórmetán (DCM) ● optimálandó paraméterek: 1. Injektor kiindulási T: DCM:10 0C (fp.=40 0C) EtOAc: 30 0C (fp.=76,5-77,5 0C)
2. Fejnyomás a lefúvatás alatt: stop flow beállítás ~ légköri nyomás 3. Injektor felfűtési sebessége: 12 0C/s DCM: 120 ml/perc
4. Lefúvatás sebessége: 5. Injektálás sebessége:
=>kiindulási alap megállapítása:
1,33 μl/s EtOAc: 120 ml/perc
1,00 μl/s ● A beállításoknál jelentős csúcstorzulások túl sok oldószer kerül az oszlopra
A nagytérfogatú injektálás optimálása II. ● a probléma megoldására: kétlépcsős lefúvatás komponensek átvitele az oszlopra
második lépcső
~oldószer fp.-ja közelében
CIS - T
első lépcső injektor kiindulási T
● első lépcső-T:
lefúvatás az oszlopon keresztül (2. lefúvatás) split lefúvatás (1. lefúvatás) split szelep zár, első felfűtés
DCM: 40 0C EtOAc: 75 0C ● 2. lefúvatás ideje:
DCM és EtOAc: 3 perc IDŐ
második felfűtés
● második lépcső-T: DCM és EtOAc: 280 0C
A nagytérfogatú injektálás optimálása III. 260,0 240,0
DCM
220,0
visszanyerés (%)
200,0 180,0 160,0 140,0
1,33 µl/s
120,0
1,38 µl/s
100,0
1,43 µl/s
80,0 60,0 40,0
20,0 0,0
● vinjektálás optimálása: DCM: 1,48 μl/s (120ml/perc)
1,48 µl/s 1,53 µl/s
A nagytérfogatú injektálás optimálása IV. 200 180
EtOAc
visszanyerés (%)
160 140 120 100
1 µl/s
80
1,05 µl/s
60
1,10 µl/s
40
1,15 µl/s
20
0
● vinjektálás optimálása: EtOAc: 1,15 μl/s (120ml/perc) 1,05 μl/s az ideális
A nagytérfogatú injektálás optimálása V. ● vlefúvatás optimálása: 80, 100, 120, 140, 160 ml/perc DCM: 120 ml/perc ideális
EtOAc: 120 ml/perc ideális A
b u n d a n c e
Abundanc e
EtOAc 1,05 µl/s; 120 ml/perc
T 5 5 0 0 0 0 0
I C :
E
T
O
A
C _ O
P
T
I M
A
L A
S
DCM 1,48 µl/s; 120 ml/perc
2 . D
5 0 0 0 0 0 0
T IC : D C M _ O P T IM A L A S _ 4 .D
7000000 6500000 6000000
4 5 0 0 0 0 0
5500000 4 0 0 0 0 0 0
5000000 4500000
3 5 0 0 0 0 0
4000000
3 0 0 0 0 0 0
3500000 2 5 0 0 0 0 0
3000000 2500000
2 0 0 0 0 0 0
2000000 1 5 0 0 0 0 0
1500000 1 0 0 0 0 0 0
1000000 500000
5 0 0 0 0 0
1 2 .0 0 1 4 . 0 0 T
im
1 6 . 0 0
1 8 . 0 0
2 0 . 0 0
2 2 . 0 0
2 4 . 0 0
2 6 . 0 0
1 4 .0 0
1 6 .0 0
1 8 .0 0
2 0 .0 0
2 2 .0 0
2 4 .0 0
2 6 .0 0
2 8 .0 0
2 6 .0 0
2 8 .0 0
2 8 . 0 0
T im e - - >
e -- >
A b u n d a n c e
Abundance
EtOAc 1,05 µl/s; 160 ml/perc T
I C :
v e n t f lo w
DCM 1,48 µl/s; 80 ml/perc
_ 1 6 0 . D
T I C : v e n t f lo w _ D C M _ 8 0 . D
5 0 0 0 0 0 0
6500000 6000000
4 5 0 0 0 0 0
5500000 4 0 0 0 0 0 0
5000000 3 5 0 0 0 0 0
4500000 4000000
3 0 0 0 0 0 0
3500000 2 5 0 0 0 0 0
3000000 2500000
2 0 0 0 0 0 0
2000000
1 5 0 0 0 0 0
1500000 1 0 0 0 0 0 0
1000000 500000
5 0 0 0 0 0
1 2 .0 0 1 4 . 0 0 T
im
e -->
1 6 . 0 0
1 8 . 0 0
2 0 . 0 0
2 2 . 0 0
2 4 . 0 0
2 6 . 0 0
2 8 . 0 0
T im e -- >
1 4 .0 0
1 6 .0 0
1 8 .0 0
2 0 .0 0
2 2 .0 0
2 4 .0 0
A MEPS optimálása – a megfelelő szorbens és eluens ● TÖLTET C8 ● ELUENS: extrakció 1,5 ml 500 µg/L pH=2 vízminta, 60*100 μl - Vfelsz = 10 μl/s
milliárd
eluálás 100 µl DCM-el és EtOAc-al, 5 párhuzamos mérés - Vfelsz= 2 μl/s 0,8 0,7
Csúcsterület
0,6 0,5
DCM
EtOAc
●DCM nitrofenolok fenol nagyobb szórás
0,4 0,3
0,2 0,1 0
●EtOAc nagyobb csúcsterületek kisebb szórás EtOAc a megfelelő
A MEPS optimálása – a töltet vízmentesítése ● mérés: a töltet vizes mosása, 100 µl 1 mg/L standard oldat
● eredmények: alacsony visszanyerések + magas szórás ● ok: Veluens reprodukálhatatlan & injektorba kerülő víz ● megoldás: 20*100 μl levegő átszívatása, vfelsz = 20 μl/s, extrakció - elúció vízmentesítés nélkül
levegő átszívatás
100
visszanyerés (%)
90 80 70 60
50 40 30 20 10 0
szórás csökken + visszanyerés nő
A MEPS optimálása – a töltet mosása, kondicionálása ● kondicionálás: MeOH + deszt. víz, 5*100 μl ↔ 100 μl MeOH
● mosás: takarékosság, memóriaeffektus ● mérés: 200 µg/L vízminta, újabb 100 μl EtOAc ● 4-es beállítás~valós vízminták mátrixtartalmanagyobb mosó oldószer igény A módszer takarékos és hatékony kondicionálás mintafelvitel előtt 1 2 3 4 5 6 7
mosás injektálás után
MeOH
EtOAc
MeOH
100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl 100 µl
9 * 70 µl 7 * 70 µl 5 * 70 µl 3 * 70 µl 2 * 70 µl 1 * 70 µl -
9 * 70 µl 7 * 70 µl 5 * 70 µl 3 * 70 µl 2 * 70 µl 1 * 70 µl -
felhasznált oldószer
memória effektus
EtOAc MeOH 630 µl 490 µl 350 µl 210 µl 140 µl 70 µl -
730 µl
komponens fenol 2-klórfenol 2-krezol 2-nitrofenol 2,4-dimetilfenol 2,4-diklórfenol 2,4,6-triklórfenol 2,4-dinitrofenol 2,3,4,6-tetraklórfenol pentaklórfenol
visszanyerés (%)
A MEPS optimálása – a mintafelvitel, folyamatos átpumpálás ● folyamatos átpumpálás ↔ megszakított átpumpálás ● mintamennyiség 20 ml (általában 1-2 ml; előny ↔hátrány)
milliárd
0,7
Csúcsterület
● átmozgatások száma: 100; 200; 300; 400; 500 ~ vfelsz=10 μl/s, 50 µg/L
0,5
2,4,6-triklórfenol
2,3,4,6-tetraklórfenol
pentaklórfenol
0,6
● 400 ~ maximális kinyerés közelében
0,4 0,3
● időigények vfelsz befolyásol
0,2 0,1
cél: nagyobb sebességek
0 0
100
200
300
Átmozgatások száma
400
500
A MEPS optimálása – a mintafelvitel, folyamatos átpumpálás ● felszívási sebesség: optimálás 200, 300, 400 átmozgatás; 10, 15, 20 μl/s Átmozgatások száma 200 300 400 Felszívási sebesség (µl/s) 10 15 20
Szükséges idő (perc) 48 28 18
66 42 33
82 55 48
● megfigyelés folyadékfront lemarad~a töltet ellenállása Vgőztér ● 15 és 20 μl/s-nál Vminta reprodukálhatatlan jelentős hiba ● megoldás: Vgőztér szabályozó módszer kifejlesztése Vminta reprodukálható
● mérések: a 9 beállításnál 3 párhuzamos, 50 µg/L 20 ml
A MEPS optimálása – a mintafelvitel, folyamatos átpumpálás 15 μl/s-nál is alacsony szórások 20 μl/s csak korlátozva alkalmazható (időnyereség elvész)
milliárd
1,2
200
1
10 µl/s
0,6
15 µl/s
0,4
20 µl/s
0,2 2,4-diklórfenol
2,4,6-triklórfenol
2,3,4,6-tetraklórfenol
milliárd
0
Csúcstzerület
Csúcsterület
0,8
300
1
10 µl/s
0,6
15 µl/s 0,4
20 µl/s 0,2 0
pentaklórfenol
1,2
1,2
0,8 Csúcsterület
milliárd
leghatékonyabb: 300*10 μl/s & 400*15 μl/s (~10 p. nyereség)
2,4-diklórfenol
2,4,6-triklórfenol
400
1 0,8
10 µl/s
0,6
15 µl/s
0,4
20 µl/s
0,2 0
2,4-diklórfenol
2,4,6-triklórfenol
2,3,4,6-tetraklórfenol
pentaklórfenol
2,3,4,6-tetraklórfenol
pentaklórfenol
Csúcsterület
milliárd
A MEPS optimálása – a mintafelvitel, megszakított átpumpálás 1,2
folyamatos
megszakított
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0 2,4-diklórfenol
2,4,6-triklórfenol
2,3,4,6-tetraklórfenol
pentaklórfenol
● a feldolgozható minta mennyisége a tű behatolási mélysége ~a 20 ml-ből 10,5 ml mozgatható át Az extrakció hatásfoka a folyamatos módszerrel nagyobb
Az optimált MEPS módszer PARAMÉTER Fecskendő & töltet Kondicionálás
MINTA-ELŐKÉSZÍTÉS
Mintafelvitel
20 ml; 400*100 μl ; vfelsz= 15 μl/s; Vgőztér szabályozó folyamatos átpumpálás
Eluálás
100 µl EtOAc, vfelsz=2 µl/s
Mosás
3*70 μl EtOAc és 3*70 μl MeOH
Injektor beállítások
Oszlop
MS
5*100 μl MeOH és 5*100 μl deszt. víz 20*100 µl levegő, 20 µl/s
vinj. & vlefúvatás
GC
100 μl-es MEPS fecskendő; C8
Vízmentesítés
CIS T-program
INJEKTÁLÁS
OPTIMÁLT BEÁLLÍTÁS
Vivőgáz, váramlási
30 0C (1,59 perc), 12 0C/s 75 0C (3 perc), 12 0C/s 280 0C (10 perc) stop flow (1,59 perc), splitless time (5 perc)
1,05 µl/s - 120 ml/perc DB5-MS; 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm 5.0-ás tisztaságú He; 1,0 ml/perc
T-program
50 0C (6,94 perc); 10 0C/perc →100 0C; 6 0C/perc → 180 0C; 40 0C/perc → 300 0C (2 perc)
Üzemmód
SCAN (41-400 AMU)
Adatgyűjtés kezdete
10 perc
Transfer line-T
300 0C
Kvadrupol -T
150 0C
Ionforrás-T
230 0C
A folyadék-folyadék extrakciós eljárás ● 500 ml vízminta feldolgozása rázótölcsérben ● 100-150 g NaCl mintánként ~ habosodás megelőzése, fázisok szételegyedése ● extrakcó 2 * 10 ml DCM, részletenként 5 perces kirázás ● vízmentesítés 2-3 g Na2SO4 ● szűrés 0,45 μm papírszűrő ● koncentrálás nitrogénáramban történő bepárlás 1 ml-re ● injektálás 1 μl, hideg splitless
A MEPS eljárás összehasonlítása az LLE-vel I.
A MEPS előnyei: + alacsony mintaigény + alacsony oldószerigény + időtakarékos + automatizálható + szorbens többször használható
MEPS
LLE
Mintaigény
1-20 ml
500 ml
Oldószerigény
0,6 ml
20 ml
Időigény
40 perc
2-3 óra
Költség
$
$$$
Automatizálás
A MEPS eljárás összehasonlítása az LLE-vel II. 6/2009 (IV. 14.) KVVM-EÜM-FVM EGYÜTTES RENDELET,
2.
melléklet
● szimultán SIM/SCAN
Az optimált módszer alkalmazása valós vízmintákra ● mintavétel Duna ●
valós vízminta & adalékolt vízminta (10-300 μg/L)
● jelentős mátrixtartalom nem okoz problémát:
~ töltet nem tömődik ~ könnyen mosható Az extrakció és az elúció zavartalanul kivitelezhető
Összefoglalás ● nagytérfogatú injektálás optimálása DCM és EtOAc esetén ● MEPS optimálása (töltet & eluens; vízmentesítés; mosás; időigény↓) ● MEPS összehasonlítása az LLE-vel (minta- oldószer- időigények; LOD)
● MEPS alkalmazhatósága valós vízmintákra ● tervek: MEPS alkalmazása fenolok kvantitatív analízise más vegyületcsoportok GC-MS áttekintése Az elért eredmények alapján a MEPS minta-előkészítési eljárás korszerű, takarékos és praktikus helyettesítője lehet az eddigiekben alkalmazott technológiáknak.
KÖSZÖNÖM A FIGYELMET !
1. Magyarázza el, hogy mit ért a diszkrimináció fogalma alatt (pl. 9. lap). ● a mérendő komponensek a mintában lévő arányoknak megfelelően kerüljenek az oszlopra torzítatlanul, ellenkező esetben diszkrimináció ● leggyakrabban: forráspont-diszkrimináció (magasabb fp. vegyületek)
● tű-diszkrimináció (illékonyabb vegyületek)
● hőbomlás okozta diszkrimináció (hőre érzékeny vegyületek)
2. Sajnálatos, hogy pont a katekolt kihagyta a módszerfejlesztésből, hiszen a klórbenzolok biológiai bomlásterméke. Jelenléte nagyon jó indikátora lehet a szennyezésnek. A töltet megfelelő kiválasztása nem jelenthet megoldást a
vízoldhatóság problémájára? ● katekol és rezorcin extrém magas vízoldhatóság 430 g/L és 717 g/L
kereskedelemben kapható MEPS töltetek : SIL, C2, C8, C18, SCX ~ vízből nem dúsítható
● a probléma megoldása: extrahálás előtt származékképzés szükséges (MSZ 1484-9:2009 szabvány: fenolok vízmintából való meghatározása) acetilezés ecetsavanhidriddel
3. A dinitrofenol ellentmondásos viselkedését mi magyarázza? Nagyon érdekes lett volna e tekintetben az átmozgatás hatásvizsgálatánál alkalmazása! Miért nem tette? ● fenolok ~ savas tulajdonságúak (OH-csoport könnyen disszociál fenolát ion képződik) ● a fenolok savi erőssége ~ aromás gyűrűhöz kapcsolódó szubsztituensek függvénye ~ nitrocsoport savi erősség nő ● LOD értéke nagy nagy töménységű
oldatot igényel (~3000 μg/L) ● nagy szórás
● az extrakció paramétereinek változtatása kevéssé befolyásol
fenol 2-klórfenol 2-krezol 2-nitrofenol 2,4-dimetilfenol 2,4-diklórfenol 2,4,6-triklórfenol 2,4-dinitrofenol 2,3,4,6-tetraklórfenol pentaklórfenol
vízoldhatóság log Kov (g/L) 80 1,50 28,5 2,15 20 1,98 2 1,77 5 2,35 4,5 3,17 0,8 3,69 6 1,53 1 4,45 0,02 5,18
pKa 9,99 8,55 10,31 7,21 10,6 7,85 7,42 4,09 5,40 4,93
