A matrilin-2 expressziójának vizsgálata májregenerációban kísérletesen és hepatocelluláris carcinomában Doktori értekezés
Szabó Erzsébet Semmelweis Egyetem Patológiai Tudományok Doktori Iskola
Témavezető: Prof
Dr. Schaff Zsuzsa, egyetemi tanár, az orvostudományok doktora
Hivatalos bírálók:
Dr. Mózes Miklós, egyetemi docens, PhD Dr. Tóvári József, tudományos munkatárs, PhD
Szigorlati bizottság elnöke: Dr. Jeney András, egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Szigorlati bizottság tagjai: Dr. Kovalszky Ilona, egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Dr. Simon Károly, osztályvezető főorvos, PhD
Budapest 2007
TARTALOMJEGYZÉK 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ........................................................................... 3 2. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR .......................................................... 6 2.1. Hepatocelluláris carcinoma ................................................................................................................6 2.1.1. Epidemiológia................................................................................................................................6 2.1.2. Etiológia.........................................................................................................................................6 2.1.3. Hepatocarcinogenesis, a HBV és HCV fertőzés szerepe a patogenezisben...................................7 2.1.4. HCC típusai, lokalizációja, morfológiája......................................................................................8 2.1.5. A HCC szövettana .........................................................................................................................9 2.1.6. Májfibrosis, cirrhosis ...................................................................................................................10 2.2. Májregeneráció..................................................................................................................................11 2.2.1. A májregenerációban szerepet játszó sejtek, májregenerációs kísérleti modellek .......................11 2.2.2. A humán máj progenitor sejtjei ...................................................................................................14 2.2.3. Az őssejtek és a hepatocarcinogenesis kapcsolata .......................................................................15 2.3. Az extracelluláris mátrix (ECM).....................................................................................................18 2.3.1. Az ECM szerkezete és jelentősége ..............................................................................................18 2.3.2. Az ECM szerepe a tumorprogresszióban.....................................................................................19 2.3.3. ECM a normál májban.................................................................................................................20 2.3.4. A máj sejtjei, szerepük az ECM proteinek szintézisében.............................................................21 2.3.5. Az ECM változásai fibrosisban és cirrhosisban...........................................................................21 2.3.6. Az ECM jellemzői a májregeneráció során .................................................................................24 2.4. A matrilin fehérje család...................................................................................................................26 2.4.1. A matrilinek szerkezete ...............................................................................................................26 2.4.2. A család tagjainak jellemzése és filogenetikai eredete ................................................................28 2.4.3. A matrilinek oligomerizációja és kölcsönhatása más ECM komponensekkel.............................30 2.4.4. A matrilinek expressziója különböző szövetekben és szervekben...............................................33 2.4.5. A matrilinek szerepe betegségekben............................................................................................34 2.4.6. A matrilin-2 expressziója humán szövetekben és tumorokban....................................................36
3. CÉLKÍTŰZÉSEK.......................................................................................... 38 4. ANYAG ÉS MÓDSZER................................................................................ 39 4.1. A vizsgálatokhoz használt oldatok, pufferek összetétele ................................................................39 4.2. Állatkísérletek....................................................................................................................................40 4.2.1. Parciális hepatectomia (PH).........................................................................................................40 4.2.2. Parciális hepatectomia/acetylaminofluorén (PH/AAF) modell....................................................40 4.3. Humán szövetek.................................................................................................................................40 4.4. Morfológiai vizsgálatok.....................................................................................................................41 4.4.1. Hisztológia...................................................................................................................................41 4.4.2. Immunhisztokémiai vizsgálatok ..................................................................................................41 4.4.2.1. Paraffinos metszeteken végzett immunfestés.......................................................................41 4.4.2.2 Fagyasztott metszeteken végzett immunfloureszcenciás vizsgálat .......................................42 4.4.2.3. Fotódokumentáció................................................................................................................42 4.4.2.4. A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók morfometriai elemzése .....................................45
1
4.5. Molekuláris biológiai vizsgálatok.....................................................................................................45 4.5.1. Szöveti lézer mikrodisszekció és RNS izolálás patkány májból..................................................45 4.5.2. RNS-izolálás RNA laterben fixált humán anyagból ....................................................................45 4.5.3. cDNS előállítás ............................................................................................................................46 4.5.4. Primerek és a PCR körülményei ..................................................................................................47 4.5.5. Grádiens PCR ..............................................................................................................................47 4.5.6. Agaróz gélelektroforézis..............................................................................................................48 4.5.7. Real-time RT-PCR.......................................................................................................................49 4.5.8. Real-time RT-PCR eredmények elemzésének módszere.............................................................50 4.5.9. HCV vírus detektálása humán májmintákból Nested - PCR módszerrel.....................................51 4.5.10. RNS expresszió detektálása in situ hibridizációval ...................................................................55 4.5.11. Fehérje izolálás ..........................................................................................................................56 4.5.11.1. Patkány májakból...............................................................................................................56 4.5.11.2. Humán májakból................................................................................................................56 4.5.12. SDS-poliakrilamid gélelektroforézis .........................................................................................57 4.5.13. Western blot...............................................................................................................................57
5. EREDMÉNYEK ............................................................................................ 59 5.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata patkány májban immunhisztokémiával.......................59 5.1.1. Matrilin-2 vizsgálata immunhisztokémiával normál patkány májban .........................................59 5.1.2. Matrilin-2 immunhisztokémiai kimutatása májregenerációban..................................................60 5.2. Matrilin-2 fehérje expresszió detektálása AAF/PH kezelést követően Western blot technikával ....................................................................................................................................................................66 5. 3. Matrilin-2-t termelő sejtek detektálása májregenerációban.........................................................68 5.4. Matrilin-2 expresszió vizsgálata real-time RT-PCR analízissel ....................................................70 5. 5. Matrilin-2 expresszió vizsgálata humán májban ...........................................................................71 5.5.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata ép és cirrhotikus humán májszövetben immunhisztokémiai módszerrel.............................................................................................................71 5.5.2. Matrilin-2 fehérje expressziójának vizsgálata hepatocelluláris carcinomában ............................72 5.5.3. A laminin és matrilin-2 kolokalizációjának vizsgálata humán májszövetben..............................74 5.5.4. Matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók morfometriai elemzése és statisztikai analízise ...........75 5.5.5. Matrilin-2 fehérjeexpresszió vizsgálata Western blot technikával humán májakon ....................77 5.5.6. Matrilin-2 mRNS expressziójának real-time RT-PCR analízise humán májmintákon................78
6. MEGBESZÉLÉS .......................................................................................... 81 7. KÖVETKEZTETÉSEK ................................................................................. 88 8. ÖSSZEFOGLALÁS ..................................................................................... 89 9. SUMMARY................................................................................................... 90 10. IRODALOMJEGYZÉK ............................................................................... 91 11. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE ..................................................... 108 12. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS...................................................................... 112
2
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AAF
acetylaminofluorene, acetylaminofluorén
ABC
avidin-biotin complex, avidin - biotin komplex
AEC
3-amino-9 ethyl-carbazole
AFB1
aflatoxin B1
AFP
alpha-fetoprotein, alfa-fetoprotein
AS
aminosav
BHMED
bilateral hereditary microepiphyseal dysplasia, bilaterális örökletes microepiphysealis dysplasia
BM
basement membrane, bazális membrán
BMHSPG
bazális membrán heparán szulfát proteoglikán
BSA
bovine serum albumin, borjú szérum albumin
BT
biotinilált tiramin
CC
cholangiocarcinoma
cc
coiled coil domén
CMP
cartilage matrix protein, porc mátrix fehérje
COMP
cartilage oligomeric matrix protein, porc oligomer mátrix fehérje
DAB
3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid
DAPI
4',6-diamidino-2-phenylindol
ECL
enhanced chemiluminescence, erősített kemilumineszcencia
ECM
extracellular matrix, extracelluláris mátrix
EDTA
ethylene -diamine-tetraacetic acid
EGF
epidermal growth factor, epidermális növekedési faktor
ELISA
enzyme linked immunosorbent assay, enzim-kötött immunoszorbens próba
GAG
glükózaminoglikán
GAPDH
glyceraldehyde-3 phosphate dehydrogenase, glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz
GBM
multiform glioblastoma
HBV
hepatitis B virus, hepatitisz B vírus
HCC
hepatocellular carcinoma, hepatocellularis carcinoma
HCV
hepatitis C virus, hepatitisz C vírus
3
HE
hematoxilin –eozin
HRP
horseradish peroxidase, tormaperoxidáz
HSPG
heparánszulfát proteoglikán
IS
idiopathic sclerosis, idiopatikus szklerózis
IL-1
interleukin-1
MDR-1
multidrog resistance gene-1, multidrog rezisztencia gén-1
MED
multiple epiphiseal dysplasia, multiplex epipyseális dysplasia
MIDAS-
metal ion dependent adhesion site, fémionfüggő adhéziós hely
MMP
matrix metallpoproteinase, mátrix metalloproteináz
NF-κB
nuclear factor-κB
NOH – AAF N-hidroxi- acetaminofluorén ORF
open reading frame, nyitott olvasási keret
PA
pilocitikus astrocytoma
PBS
phosphate buffer saline, foszfát puffer
PCR
polymerase chain reaction, polimeráz láncreakció
PG
proteoglikán
PH
partial hepatectomy, parciális hepatectomia
PPARα
peroxisome proliferator-activated receptor-α
PSACH
pseudochondrodysplasia
RT
reverse transcriptase, reverz transzkriptáz
SDS
sodium dodecyl sulfate, nátrium dodecil-szulfát
SDS-PAGE
sodium dodecyl sulfate-poliacrilamide gel electrophoresis, nátrium dodecil-szulfát -poliakrilamid gél elektroforézis
SSC
sodium chloride/ sodium citrate, nátrium-klorid/citrát
NTB
nitro- tetrazolium-blue
BCIP
5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate
TBE
tris –borát- EDTA
TBS
tris-buffer-saline, tris-puffer
TGF
transforming growth factor, transzformáló növekedési faktor
TGF α
transforming growth factor-α, transzformáló növekedési faktor- α
TGF β
transforming growth factor-β, transzformáló növekedési faktor- β
TIF
tubulointersticial fibrosis, tubulointerszticiális fibrosis (vesében)
4
TIMP
tissue inhibitor metalloproteinase, szöveti metalloproteináz inhibitor
TNFα
tumor necrosis factor-α, tumor nekrózis faktor-α
U
unique domain, egyedi szekvencia
vWFA
von Willebrand factor A, von Willebrand Faktor A
5
2. BEVEZETÉS ÉS IRODALMI HÁTTÉR 2.1. Hepatocelluláris carcinoma
A hepatocelluláris carcinoma (HCC) világviszonylatban az ötödik leggyakoribb daganatos betegség. 2005-ben 667 000 esetet számoltak világszerte, ebből 17 500-at az USA-ban (Rougier és mtsai 2007). Világviszonylatban évente körülbelül egymillió új beteggel kell számolni, mortalitás tekintetében a harmadik helyen áll a malignus daganatok között. A daganat kezelése, különösen előrehaladott stádiumban megoldatlan, bár az utóbbi hónapokban ismertetett cél-orientált gyógyszer, a sorafenib, talán áttörést jelent (Llovet és mtsai 2007). A korai diagnózisban szerepet játszó érzékeny diagnosztikai markerek feltárása, a posztoperatív szakban a HCC kiújulásának monitorozása változatlanul nagy kihívást jelent. 2.1.1. Epidemiológia
A hepatocelluláris carcinoma (HCC) a humán carcinomák 5,6%-áért (férfiak: 7,5%, nők: 3,5%) felelős. Prevalenciája az utóbbi években Európában és az USA-ban is jelentősen növekedett, így a következő két évtizedben különösen jelentős orvosi és népegészségügyi probléma lesz, amint az Japánban már ma is látható (Rougier és mtsai 2007). Magyarországon nem tartozik a leggyakoribb daganatok közé, de előfordulása növekvő tendenciát mutat. (Szabo és mtsai 2003, Nagy és mtsai 2006). 2.1.2. Etiológia
A HCC etiológiájában több tényező játszik szerepet. Ezek között kiemelten a vírusfertőzések, elsősorban a hepatitisz B vírus (HBV) és a hepatitisz C vírus (HCV) fertőzés áll. A HCC előfordulásában kifejezett geográfiai különbségek tapasztalhatók. Jellegzetes földrajzi eloszlást mutat, igen gyakori Afrika középső és déli területén, Délkelet-Ázsiában, míg Európában és Észak-Amerikában ritkábban fordul elő (Buendia 1992, 2000). Az afrikai és az ázsiai HCC esetek többsége HBV fertőzéssel, míg a
6
Japánban, Európában és az USA-ban előforduló esetek HCV fertőzéssel függnek össze (Hayashi és mtsai 1999, Aizawa és mtsai 2000, Szabo és mtsai 2003, 2004). A legjelentősebb kofaktorok között az alkohol, az aflatoxin (AFB1), a dohányzás, egyes szteroidok és egyéb toxikus tényezők szerepelhetnek a HCC etiológiájában. További kockázati tényezőt jelentenek egyes genetikai rendellenességek (heamochromatosis, Wilson kór, az α1-antitrypsin hiány), amelyek növelik a HCC kialakulásának esélyeit (Hofseth és mtsai 2003). A cirrhosis önmagában is kockázati tényezőként jön számításba, ugyanis a HCC-k 70-80%-a cirrhotikus talajon alakul ki. Újabban az irodalom a nem alkoholos zsírmájat is kockázati tényezőként említi (Teufel és mtsai 2007). Hazánkban elsősorban a hepatitisz C, majd a B és D, valamint az alkoholos cirrhosis és a haemochromatosis a legfőbb oki tényező. A leggyakoribb HCV genotípus hazánkban az 1b altípus (Gervain és mtsai 2001, Lengyel és Tulassay 2007). 2.1.3. Hepatocarcinogenesis, a HBV és HCV fertőzés szerepe a patogenezisben.
A HCC kialakulása többtényezős, többlépcsős és összetett folyamat, amely gyakran a hepatitisz vírusok (HBV és HCV) perzisztens jelenlétével van összefüggésben. A HCCt tumorképződés számos jellemzője közül a gyors növekedés és infiltráció, a korai metasztázisképzés, a nagyfokú malignitás jellemzi. A HCV-vagy a HBV-fertőzés lassan progrediáló krónikus májbetegséget okoz, mely megjelenhet enyhe vagy súlyosabb aktivitású krónikus hepatitis, cirrhosis vagy HCC formájában. A kiterjedt kutatások ellenére sem a HBV és még kevésbé a HCV okozta májrák keletkezési mechanizmusa nem egyértelműen tisztázott (Schaff és mtsai 2004). Számos adat a gyulladás és a hepatocita-regeneráció jelentőségét hangsúlyozza a patogenezisben (Chisari 2000, Szabo és mtsai 2004). Más szerzők a virális antigének direkt carcinogén hatását emelik ki (Andriasini és Barnabas 1999). A HCC–ben szenvedő betegek 40%-a HBV-vel fertőzött, bár ez kiemelten Afrikában és Távol-Keleten jellemző (Hofseth és mtsai 2002, Szabo és mtsai 2004, Teufel és mtsai 2007). A HBV sajátságai közül kiemelendő, hogy a vírus-DNS integrációja a sejt DNSébe nem szükséges a vírus replikációja szempontjából, azonban e mechanizmus lehetővé teszi a virális genom perzisztálását a sejtben. Az integrálódott virális DNS a hepatocita-proliferáció során a replikálódó sejt-DNS-sel együtt szaporodik. A HBV-
7
DNS-integráció többféle hatású lehet a sejtre; így kromoszomális DNS-instabilitást, transzlokációt,
duplikációt,
kromoszóma rekombinációt,
mutagenesist
okozhat,
valamint inkomplett virális fehérjéket kódolhat. Ezek celluláris szabályozó gének, tumorszupresszor gének, többek közt a p53 elvesztését eredményezhetik (Schaff és mtsai 1995) Gyakori a p53 és más szupresszor gén mutációja, egyes növekedési faktorok expressziója pedig fokozódik (Kiss és mtsai 2002). A vírus géntermékeinek, főleg az X gén kódolta fehérjének a – HBX-nek szerepe van a HBV daganat-kialakulást elősegítő hatásában. Az X gén p53 és RB fehérjékre kifejezett közvetlen hatását is feltételezik (Staib és mtsai 2003). A HCV fertőzéssel asszociált hepatocarcinogenesis folyamata kevésbé ismert mint a HBV-vel asszociálté. A Flaviviridae családjába tartozó HCV egyszálú RNS vírus (Clarke és mtsai 1997) nem integrálódik a fertőzött sejt genomjába, mivel nem rendelkezik reverz transzkriptáz (RT) aktivitással. A vírusgenom strukturális (core, burok) és nem strukturális fehérjéket kódol, amelyek enzimfunkciókkal bírnak- helikáz, proteináz (NS3) vagy RNS-polimeráz (NS5) aktivitásuk van. A HCV fertőzés és a dagnatképződés szempontjából a HCV sejtproliferációt moduláló hatása kap elsősorban szerepet. Ezért a hatásáért egyes vírusproteinek, elsősorban a core-komponens, tehetők felelőssé. Ugyanis a HCV core-fehérje, mint különböző virális és celluláris gén regulátora befolyásolja egyes gének expresszióját, fokozott növekedési stimulust okozva, mely elősegíti a HCC kialakulását (Barba és mtsai 1997). A core fehérje közvetett módon aktiválja a TNF-α receptorát, a Raf-1 kináz, és az NF-κB útvonalakat, amely a TNF-α -indukált és Fas-mediált apoptózishoz vezet (You és mtsai 1999, Block és mtsai 2003). Az utóbbi években egyre nagyobb szerepet tulajdonítanak a NF-κBnukláris faktornak a máj carcinogenesisében (Arsura és Cavin 2005). 2.1.4. HCC típusai, lokalizációja, morfológiája
A HCC kialakulhat cirrhosis talaján és cirrhosismentes májban, az előző lényegesen gyakoribb. A HCC megjelenési formái igen változatosak lehetnek, így makroszkóposan szoliter, multiplex noduláris vagy diffúz formában mutatkozhat (Schaff és Nagy 1997). Magyarországon a HCC túlnyomórészt (70-80%-ban) cirrhosis talaján alakul ki. A kisebb méretű HCC-k tokkal rendelkezhetnek. A progresszió mértékét gyakran a makroszkóposan is szembetűnő ún. fiókdaganatok megjelenése, valamint a vénák
8
inváziója jellemzi. A tumor színe többnyire szürkésfehér vagy bevérzés miatt vöröses, néha az epetermelés miatt enyhén barnás-zöldes színű. 2.1.5. A HCC szövettana
Szövettanilag a HCC különböző szerkezetet és fokozatot mutathat (Schaff és mtsai 2004) Leggyakrabban trabeculáris, tubuláris vagy alveoláris formában jelentkezik. Sajátos formák is ismeretesek, pl. a világossejtes („hipernefroid”), a pleomorf és a fibrosus alak. Külön entitás a fibrolamelláris típusú HCC. Ezen jellegzetes szöveti szerkezetű daganat cirrhosis mentes májban, fiatalabb életkorban fordul elő (átlagos életkor 23 év). A HCC TNM klasszifikációjának elve hasonló egyéb tumorokéhoz. A T1-T3 kategóriák közötti differenciálást a 2 cm-es tumorátmérő, a daganat szoliter vagy multiplex volta, a lebenyek érintettsége határozza meg. A HCC differenciáltsági fokozatai követik az I-IV differenciáltsági fok szerinti beosztást (grade), a magasan differenciált formától a differenciálatlan formáig (Schaff és mtsai 2004). A HCC prognózisa rossz, ezért létfontosságú a korai diagnózis. Klinikai detektálásában a szérum alfa-fetoprotein (AFP) -meghatározásnak nagy jelentőséget tulajdonítanak. Noha az AFP hatékony markernek bizonyult a HCC monitorozásában és hisztológiailag is detektálható, csak bizonyos korlátokkal alkalmazható. A korai HCC diagnózisában az AFP mérése akár 40%-os hibát is okozhat (Deng-Fu Yao és mtsai 2007). Az AFPemelkedése a szérumban nem HCC – specifikus, mert más daganatokban (csírasejtes tumorok, pancreatoblastoma stb.) ugyancsak emelkedett értéket mutathat. A recidívák észlelésére azonban jól használható, valamint a cirrhosisban szenvedő betegek követésére is lehetőséget nyújt. Újabb adatok szerint az AFP-termelés alapján a HCC-k két jól elhatárolható csoportba sorolhatók (Lee és Thorgeirsson 2006). Ez a daganatok differenciáltságával is összefügg: a magasabban differenciált daganatokban az AFP mRNS expressziója alacsonyabb, mint a rosszul differenciáltakban (Craig 1997). A HCC extrahepaticus terjedése elsősorban a perihepatikus és abdominális nyirokcsomókba, a tüdőbe és a csontokba történik (Katyal és mtsai 2000, Schaff és mtsai 2004).
9
2.1.6. Májfibrosis, cirrhosis
A máj krónikus elváltozásainak közös jellemzője, hogy többnyire fokozott kötőszövet termeléssel járnak és májfibrosishoz vezetnek. A májfibrosis során az extracelluláris mátrix kórosan felhalmozódik a májban, és szerkezeti átépüléshez vezethet (Schaff és Illyés 2004, Kovalszky és mtsai 2006). Cirrhosis esetén a máj állománya nodulusosan átépül, az eredeti acináris struktúra nem ismerhető fel. Diffúz, a máj szerkezetének torzulásával, átépülésével, göbök kialakulásával és progresszív fibrosissal járó folyamat. A májcirrhosis során a májállományt képező regeneratív göböket (nodulusok) kötőszöveti rostokból álló sövények (septumok) vesznek köröl. A rostok között limfocitás infiltráció és epeút-proliferáció észlelhető. A cirrhosis osztályozása a morfológiai megjelenés és kórokok alapján történhet. Etiológiai szempontból a cirrhosis legfontosabb formái: alkoholos, virális, biliáris, toxikus eredetű, posztnekrotikus, autoimmun, metabolikus zavar okozta, egyéb fertőző ágens okozta és kriptogén (Schaff és Illyés 2004). A cirrhosis patogenezisében több tényező játszik szerepet. Ez egy multifaktoriális folyamat, elindítója a sejtkárosodás, mely részben különböző immunológiai mechanizmusok beindulását, másrészről a széteső sejtekből származó faktorok felszabadulását idézi elő. A legfontosabb patogenetikai tényezők között a sejtpusztulás eredményezte krónikus gyulladás, s ennek következtében különböző gyulladásos citokinek (TNFα, TGFα, TGFβ, interleukinek) fokozott termelődése játszik szerepet. Ez a különböző mezenhimális sejtek (Kupffer-sejt, endothelsejt, fibroblast stb.) aktiválását és az extracelluláris mátrix különböző komponenseinek felhalmozódását eredményezi (erről bővebben az Extracelluláris mátrix fejezetben lesz szó).
10
2.2. Májregeneráció 2.2.1. A májregenerációban szerepet játszó sejtek, májregenerációs kísérleti modellek
Az egészséges felnőtt májban a sejtpusztulás és sejtképződés egyensúlyban van egymással. A máj óriási regenerálódó képességgel bír (Sarraf és mtsai 1994, Taub 1996). Az elmúlt évek kutatásai során a legfontosabb kérdések egyike az volt, milyen eredetű sejtekből történik a máj regenerációja a máj sérülését követően. A máj regenerációban szerepet játszó folyamatok tanulmányozása állatmodelleken vált lehetővé. Így az eddig felhalmozódott ismeretek elsősorban patkány májra vonatkoznak. Normál körülmények közt a májsejtek minimálisan proliferálnak. A máj sérülését követően a hepatociták a sejtciklus Go fázisába lépve regenerálják a sérült májszövetet. Így a különböző májsejt - vesztéssel előidézett májsérülés, mint a parciális hepatectomia, vírus fertőzés vagy más faktor okozta gyulladásos folyamatot követően a májszövet újjáépülése elsősorban a hepatociták replikációjával történik (Forbes és mtsai 2002). Különböző állatmodellekbe transzplantált hepatocitákkal végzett kísérletek során igazolódott, hogy a beültetett hepatociták bizonyos hányada klonális expanzióban vesz részt, és jelentős regenerálódó kapacitással bír (Forbes és mtsai 2002) Ennek alapján feltételezhető, hogy a hepatociták önmagukban is a máj funkcionális őssejtjei. A májregeneráció hepatociták részvételével történő tanulmányozására általában a Higgins és Anderson által már 1931-ben leírt parciális hepatectomiát (PH) alkalmazzák. Eszerint, ha a máj 70%-át parciális hepatectomiával eltávolítjuk, a májtömeg 7-10 nap múlva regenerálja önmagát. Ennek molekuláris mechanizmusát számos kutatócsoport tanulmányozta (Fausto 2001). Ha azonban a májat súlyos károsodás éri és a hepatociták sérülnek vagy replikációjuk gátolt, az ún. potenciális őssejtek (potencial stem cell) kompartmentek aktiválódnak (Roskams és mtsai 2003, Fausto 2004, Santoni-Rugiu és mtsai 2005). Ezek a bipotenciális képességgel bíró, más néven ovális sejtek, mind hepatocitákká, mind epeút hámsejtekké képesek differenciálódni. Az ovális sejtek jellemző epeúti markerei a CK7, a CK19, OV-6, OV-1, hepatocita markere az AFP, neuroendokrin markerei a chromogranin-A, connexin 43, CD34 stb. (Roskams 2006). Az ovális sejt elnevezést az ovális mag és a halvány bazofil citoplazma miatt kapta (Farber 1956). A patkány májban a Hering canalisokat felépítő sejtek viselkednek
11
őssejtekként, melyekből aktivizálódásukkor tubulusszerű képleteket formáló ovális sejtek képződnek (Paku és mtsai 2001, 2004). Ezek a tubulusszerű képletek szövettanilag a Hering canalisok folytatását képezik. Feltételezhetően az őssejteknek van egy harmadik populációja is, amely májsejt potenciállal rendelkezik, és a csontvelőből származik. Ezek a heamatopoietikus őssejtek. Jóllehet ezeknek a sejteknek a megújulási sebessége viszonylag alacsony, jelentőségteljes szerepük felmerül a regenerációban (Theise és mtsai 2000, Alison 2005). Noha az utóbbi években igen kibővült az őssejtek eredetével fogalkozó irodalom, egészen pontosan még a mai napig sem derült fény ezek pontos anatómiai lokalizációjára, növekedési mintázatára. Az azonban ismert, hogy ezek az őssejtek a periportális területen proliferálnak és innen terjeszkednek a májparencymába. Ezt az is bizonyítja, hogy a periportális régió szelektív roncsolásával jelentősen csökkent a proliferáló ovális sejtek száma (Petersen és mtsai 1998). A Hering canalisból való eredetüket az ovális sejtek és az epeutak hámsejtjei közötti igen kifejezett fenotípusos hasonlatosság is alátámasztja. A Hering canalisok kötik össze a disztális hepatocitákat az
interlobuláris
epeúti
duktuszokkal,
amelyek
valószínűleg
az
őssejtek
„szálláshelyei”(Sell és Salman 1984). Egyes szerzők szerint valamennyi epeút hámsejt potenciálisan képes őssejtként viselkedni, míg a hepatocitákra jellemző transzkripciós faktorok megjelenése az ovális sejtekben hepatocita irányú differenciálódást jelezhet. Az 1. ábra a tudomány jelenlegi álláspontja szerinti ovális sejtekre vonatkozó terminológiát és lokalizációjukat tünteti fel.
12
1. ábra. Az őssejtek lokalizációja a májban (Roskams 2006). A bal oldali rész a portális teret (PT) ábrázolja. Az epeút (biliary tree) legkisebb és legtávolabbi elágazódása portális biliáris duktuszokból (BD) és intralobuláris duktuszokból
áll.
A
Hering
canalisokat
részben
hepatociták,
részben
cholangiocyták képezik. Az őssejtek a Hering canalis legtávolabbi elágazódásai. Aartéria, V- centrális véna. Wilson és Leduc (1958) írták le először a tartalék „őssejt kompartmentet” súlyos diétát követően egérben, melyet azóta patkányban több kísérleti modellben is sikerült kimutatni.
A legtöbb modellben parciális hepatectomiát követően egy carcinogén
vegyülettel gátolják a májsejt proliferációt. Az
ovális
sejt
kompartmentek
indukálta
májregeneráció
vizsgálatára
a
2-
acetylaminofluorén (AAF)/parciális hepatectomia (PH) modell az egyik legalkalmasabb kísérleti rendszer (Evarts és mtsai 1987, Nagy 1995). Kísérletileg igazolták, hogy már az AAF kezelést követően, a hepatectomia előtti periódusban is a májban jól definiált változások figyelhetők meg. Egyetlen AAF dózis adagolása után is szignifikánsan megemelkedik a periportális régióban az osztódó sejtek száma (Paku és mtsai 2001, 2004). Az acetylaminofluorén a fluorénből származó carcinogén vegyület. A fluorént a szervezet nem metabolizálja, ezért az egy ártalmatlan, carcinogén hatással nem rendelkező anyag. Az aminofluorént (AF) már képesek a májsejtek acetaminofluorénné átalakítani, amiből N- hidroxilációval alakul ki a carcinogén hatású, DNS-hez kötődni képes N-hidroxi-acetilaminofluorén (NOH AAF).
13
Az AAF a májsejtek DNS molekuláihoz való kötődése révén megakadályozza azok belépését a sejtciklusba. Az AAF kezelést követő PH után az ovális sejtek proliferálnak és messze a májparenchymába terjednek a májsejtgerendák közé, ott hepatocitákká differenciálódnak. Az AAF kezelés parciális hepatectomiával történő kombinációja során a proliferáló ovális sejtek sokkal nagyobb számban figyelhetők meg. Az ovális sejtek hepatocitává történő differenciálódásában döntő fontosságú esemény, amikor az ovális sejtekből „bazofil fókuszok” formálódnak. A fókuszokat felépítő sejtek morfológiailag is átmenetet mutatnak az ovális sejtek és a hepatociták között, mind nagyság, mind alak vonatkozásában. Funkcionálisan is a fókuszokat felépítő sejtekben jelennek meg a magasan differenciált hepatocitákra jellemző vonások (jelentősen fokozott albumintermelés, csökkent AFP expresszió, MDR-1 expressziója, HNF-4) (Nagy 1995, Santoni-Rugiu és mtsai 2005). Az AAF analóg vegyületek is képesek a periportális sejproliferáció kiváltására. Dexamethason gátolja az ovális sejtek és a hepatociták osztódását is parciális hepatectomiát követően. Ha a májregeneráció mindkét mechanizmusát - hepatocita proliferáció, őssejt aktivizálás - gátolták, a máj tömege a hepatociták hypertrophiája révén
pótlódott.
A
periportáis
zónában
ilyenkor
a
hepatociták
jelentős
megnagyobbodása figyelhető meg (Nagy és mtsai 2001). Az AAF-hez hasonló hatást lehet elérni szén-tetraklorid (CCL4) adagolásával vagy ethionin intoxikációval is (Alison és mtsai 1996). Az egérben előidézett zsírmáj modellekben, mint például az ObOb (-/-) egérben vagy a PARP (-/-) egérben is gátolt a hepatociták proliferációja és az ovális sejtek aktiválása jellemző (Roskams és mtsai 2003). 2.2.2. A humán máj progenitor sejtjei Az eddigi irodalmi adatok alapján úgy tűnik, hogy a típusos ovális sejtek a patkány májra jellemzőek. Egérben jóval nehezebben sikerült hasonló sejteket indukálni. Hasonló a helyzet a humán májban is. Az emberi májszövetben az ovális sejt proliferációhoz egy hasonló jelenséget, az un „atipusos duktuláris proliferációt” lehetett megfigyelni elsősorban epeút elzáródással járó különböző májbetegségekben (Roskams 2006). Ezek az ovális sejtektől eltérően azonban nem mutatnak AFP expressziót. Feltételezhető, hogy az atípusos duktuláris reakciók az emberi májban egy, az őssejtekből kiinduló regeneratív válasznak felelhetnek meg. Számos morfológiai
14
hasonlóságot véltek felfedezni az ovális sejtek és a humán májban az ún. duktuláris reakciók között: •
biliáris típusú citokeratinokat expresszálnak
•
a periportális zónából a májlebenybe terjeszkednek
•
közeli kontaktusban vannak az aktivált csillag sejtekkel
•
növekedésüket ugyanaz a növekedési faktor rendszer szabályozza
•
képesek hepatocitákká differenciálódni
Néhány közlemény óvakodik a duktuláris fenotípus elnevezéstől, így inkább IMHBC („intermediate hepatobilliary cells”) –névvel illeti a közepes méret (6 µm
15
thymus-sérült egerekbe oltva HCC-t generált. Jelenleg a májban előforduló hosszú életű heptocitákat, a cholangiocytákat és a bipotenciális őssejteket (amelyek a Hering canalisok legtávolabbi részéből származnak) tekinti az irodalom a májban lezajló carcinogenesis
legújabb
célpontjainak
(Roskams
2004).
Néhány
krónikus
májbetegségben kimutatták, hogy a telomerhossz fokozatos rövidülése miatt (ezt igen jellemzően figyelték meg cirrhotikus májban) a hepatociták „replikációs képessége elöregszik”. A krónikus gyulladás, a növekedési faktorok jelenléte, a DNS-károsító ágensek és a folyamatos replikáció egyaránt szerepet játszhat ebben a kórfolyamatban. Ez a jelenség indukálja az őssejteket (a duktuláris reakciót) humán májban is. Krónikus hepatitisz C-ben a duktuláris reakció intenzitása és a fibrosis mértéke között jelentős összefüggés van (Lowes és mtsai 1999). A máj gyulladásos megbetegedéseiben a hepatocitáknak egy olyan átmeneti alakját figyelték meg, amelyek átmenetet képeznek az őssejtek és a hepatociták között. Ezek száma összefüggésben van a gyulladás mértékével és a nekrózis fokával. Mindezek alapján valószínű, hogy ilyenkor elsősorban az őssejtek differenciálódnak hepatocitákká, ezért nő meg ezen átmeneti hepatocita alakok száma. Megfigyelték, hogy cirrhotikus májban és főképpen nem alkoholos szteatohepatitiszben, a cirrhotikus nodulusokat is ilyen átmeneti hepatocita alakok képezik. Igazolták, hogy ezek az ún. „hepatocita rügyek”, minden esetben reaktív duktuszokkal vannak kapcsolatban. Ez is alátámasztja az őssejt eredetüket (Falkowski 2003). Számos tanulmányban írták le a májtumorok monoklonalitását. A májra jellemző legfontosabb
rosszindulatú
daganatoknak,
a
HCC-nek,
a
cholangiocelluláris
carcinomának (CC) és a kevert típusuknak (HCC/CC) eredete még máig sem teljesen tisztázott. A HCC és CC fokális prekurzor léziókból alakul ki, egy többlépcsős folyamat eredményeként, amelynek az őssejtek aktív résztvevői. Ezt az is bizonyítja, hogy a HCC-k nagy része expresszálja az őssejtekre jellemző markerek egy részét (CK7, CK19, OV6). A tumorsejtek ezekben a daganatokban fenotípusosan átmeneti hepatocita alakokból és éretlen hepatocitákból állnak. A tumorokban az őssejtek jelenlétét elsősorban két elmélettel hozzák összefüggésbe (Roskams és mtsai 2006): 1. Az egyik szerint a tumorsejtek őssejt eredetűek („maturation arrest theory”)
16
2. A második szerint a tumor sejtek dedifferenciálódnak és progenitor sejt tulajdonságokat vesznek fel a carcinogenesis során Ez utóbbival magyarázható az, hogy a kis sejtes diszplasztikus fókuszok (< 1nm) 55%-a progenitor sejtekből és átmeneti hepatocita alakokból áll. Míg a nagy sejtes diszplasztikus fókuszokat érett pusztuló hepatociták alkotják. CC-ben is sikerült azonosítani egyes őssejt markereket. A hepatoblastomában (HB), egy igen gyakori gyerekkori tumorban is kimutatták az ovális sejteket. Ezt a daganatot őssejt eredetűnek tartják (Fiegel és mtsai 2004). Összességében tehát minden olyan krónikus májbetegségben, amely kockázati tényezőt jelent a HCC vagy CC kialakulásához, az őssejtek (progenitor sejtek) proliferálnak, a hepatociták pedig szeneszcensé válnak (Roskams 2004). Az őssejt eredetet és a hepatocarcinogenesis összefüggését tumorokban a 2. ábra szemlélteti.
2. ábra. Az őssejtből kiinduló lehetséges májdaganatok. Az őssejtek mind hepatocitákká mind cholangiocytákká képesek differenciálódni (Roskams 2006).
17
2.3. Az extracelluláris mátrix (ECM) 2.3.1. Az ECM szerkezete és jelentősége
A szövetek felépítésében nemcsak sejtek, hanem az ezeken kívül található, az extracelluláris teret kitöltő makromolekulákból (fehérjékből és szénhidrátokból) álló hálózat – az ECM is részt vesz. A mátrixot felépítő molekulák sokfélék lehetnek, a szövet által betöltött feladatnak megfelelően. Kémiai természetük alapján a következő nagy kategóriákba sorolhatók a mátrix molekulái (Aumailley és Gayraud 1998, Kovalszky 2004): 1. Nagy
poliszacharid-láncokból
felépülő
glükózaminoglikánok
(GAG)
és
proteoglikánok (decorin, perlecan, versican, syndecan, agrin stb) 2. Fibrilláris strukturális fehérjék (kollagének, elasztin, fibrillin-1,-2, entactin stb) 3. Nem- kollagén szerkezetű fehérjék (laminin, fibronectin, vitronectin, tenascin, entactin stb.). Cukorláncok proteoglikánok
fibronektin
kollagének
integrinek 3. ábra. Az ECM szerkezete. www. fasebj.org/cgi/content/full
18
Jelenleg a mátrixban előforduló kollagéneknek 26 típusát ismerjük (Gelse és mtsai 2003). Ezek főbb csoportjai a következők: fibrilláris kollagének (I-III, V, XI), hálózatképző kollagének (IV, VIII, X), fibril- asszociált kollagének (IX, XII, XIV, XIX), transzmembrán kollagén (XIII és XVII), stb. A nem – kollagén szerkezetű ECM molekulák csoportjába szerkezetileg hosszú, flexibilis, több kollagén típust kötő doménnel rendelkező molekulák sorolandók, melyek más mátrix proteineket, poliszacharidokat, sejt-felszíni fehérjéket, növekedési faktorokat és hormonokat képesek kötni. Kulcsfontosságú szerepük van a matix-matrix és sejt-mátrix kapcsolatok kialakításában és fenntartásában. Ezek a multiadhézios fehérjék a sejt-mátrix kapcsolatot az RGD domén részvételével valósítják meg. A mátrixot felépítő molekuláknak ebbe a csoportjába tartozik a dolgozatom fő témája, a nemrégiben leírt matrilin fehérje molekulák családja is, melyek képesek kötni a kollagéneket és más ECM komponenseket (Deák és mtsai 1999) (erről majd a további fejezetekben írok). 2.3.2. Az ECM szerepe a tumorprogresszióban A daganatkutatás a mátrix (stroma) jelentőségét sokáig nem ismerte fel. A daganatokat főleg genetikai szempontból vizsgálták és a fenotípus változással magyarázták a tumorképződést. Mára már elfogadott tény, hogy a daganat kötőszövetes alapállománya nagymértékben hozzájárul a daganatok kialakulásához. Ennek megfelelően az utóbbi években az ECM a tumorbiológia egyik legintenzívebben kutatott területévé vált (Füle és mtsai 2006, Li és mtsai 2007). Az alapállományba hatolva a daganatsejtek úgy alakítják a mezenchimális sejtek működését, hogy azok olyan mátrixot állítsanak elő, mely összességében elősegíti a daganatsejtek további invázióját. A daganat növekedéséhez szükség van oxigénre és tápanyagellátásra egyaránt, amelyet a daganat az érújdonképződés (neoangiogenesis) segítségével old meg. A tumorok neoangiogenesisének szabályozásában szerepet játszó számos tényező között (növekedési faktorok, sejtadhéziós molekulák és egyéb mediátorok) meghatározó szerepet kapnak az ECM-molekulák is.
19
A tumorszövet kötőszöveti állományában jelen levő ECM mind mennyiségi mind minőségi szempontból jelentősen eltér a normál szövetekben találtaktól. Mennyiségi változások: A daganatos stromában több kollagén, proteoglikán és glükózaminoglikán van jelen, mint az egészséges szövetben (Kalluri 2003). A heparánszulfát magasabb szintű felszaporodását például melanómában, májrákokban, veserákokban
figyelték
meg.
A
laminin
egyes
alegységeinek
nagymértékű
felszaporodását áttétképző melanómákban és fibrosarcomákban igazolták (Gianelli és Antoniaci 2000, Canen és Yamada 2001, Chiquet- Ehrismann 2004). Minőségi változások: A daganatok ECM fehérjéi nemcsak mennyiségükben, hanem esetleg szerkezetükben is eltérhetnek az egészséges sejtközötti állománytól. A nagy mennyiségben lerakódott proteoglikánok általában módosultak. A fibronektin, tenascin, CD44 és versican különböző formáit mutatták ki daganatokban (Kovalszky és mtsai 2004). 2.3.3. ECM a normál májban Az ECM az egészséges májban részben a máj rostos vázát képezi, részben a Dissetérben található. A normál májban relatív mennyisége alacsony, kevesebb mint 3% -ot tesz ki. Strukturális szerepe mellett aktív szerepe van a májat alkotó sejtek működésének szabályozásában és nélkülözhetetlen a hepatociták differenciált funkciójának az ellátásához. A rostos mátrixot képező molekulák közt elsősorban a kollagéneket (I, III, V, VI), a decorint és a fibronektint említhetjük meg. Eddigi ismereteink szerint a bazális membrán (BM) felépítésében elsősorban a laminin, a IV kollagén és a heparánszulfát PG-ok (BMHSPG) játszanak szerepet. A rostos mátrix a periportális területen és centrális véna körül fordul elő, de elemei finomabb módszerekkel elszórtan a Disse-térben is kimutathatók. Normál májban a BM főleg periportálisan és a centrális vénák körül látható, de bizonyították, hogy az összes BM-t alkotó fehérje megtalálható a Disse-térben is, bár nem szerveződnek klasszikus értelemben vett BM-ná (Kovalszky 1993). A BM megjelenését a szinuszoidok mentén fibrosisban és cirrhosisban detektálták (Kovalszky és mtsai 2006).
20
Összefoglalva, tehát a májban, klasszikus értelemben vett magas denzitású BM van az erek körül, míg periszinuszoidálisan alacsony denzitású BM található. 2.3.4. A máj sejtjei, szerepük az ECM proteinek szintézisében
A hepatociták a magasan differenciált, máj specifikus működésében játszanak szerepet, a mátrix fehérjék közül azonban feltehetően csak a szöveti fibronektin termelésére képesek. A szinuszoidokat bélelő endothel sejtekben trombospondin, fibronectin, kollagén IV, entactin, HSPG és decorin expresszióját mutatták ki, ami azt bizonyítja, hogy az ECM fehérjéinek nagy része innen származik (Schaffener és Popper 1963, Maher és McGuire 1990). A periszinuszoidális térben a hepatociták és endothel sejtek között található Ito sejtek (“fat storing” sejtek vagy lipociták, vagy HSC-hepatic stellate cells, csillag sejtek) figyelhetők meg, amelyek több irodalmi adat alapján a matrix fehérjék legfontosabb termelői. A “pit” sejtek máj asszociált lymphocyták, a szinuszoidok lumenébe vannak lehorgonyozva, szoros kapcsolatban az endothel és Kupffer-sejtekkel. Pontos szerepük még nem ismert, főleg a fibrogenezist stimuláló faktorok termelésében lehet szerepük (Friedman 2004a, b). Az ECM-t termelő sejtek körül még mindig vita folyik. Még máig is az egyik leginkább elfogadott elképzelés, mely szerint a Disse-térben található periszinuszoidális csillagsejtek aktiválódnak, fenotípust váltanak, myofibroblasttá alakulnak át. Egy másik feltevés, hogy legalább három különböző eredetű sejtpopuláció ölti fel a myofibroblast fenotípust és termel kötőszövetet. Az irodalmi adatok elsősorban a periszinuszoidalis csillagsejtekkel foglalkoznak, sokkal kevesebb adat áll rendelkezésre a portális fibroblastokról. A legutóbbi álláspont (2005 decembere) szerint a periszinuszoidális csillagsejtek, a portális és centrális véna körüli fibroblastok mellett még csontvelői őssejt eredetű myofibroblastok is találhatók a májban (Kovalszky és mtsai 2006). 2.3.5. Az ECM változásai fibrosisban és cirrhosisban.
A fibrotikus máj ECM komponensei nagymértékben megegyeznek a normál máj ECM komponenseivel, azonban mennyiségi szempontból jelentősen megváltozik az ECM a fibrotikus és cirrhotikus májban. A fibrosisban a lefontosabb esemény a mátrix jelentős átépülése során bekövetkező változás, de ez a folyamat szoros összefüggésben áll olyan
21
történésekkel, mint a például a májsejt regeneráció, az érátrendeződés („vascular redistribution”). Mindezek igen jelentősen befolyásolják a máj funkcióját. Noha a krónikus májbetegségekben a kötőszövet elsősorban a portális területeken szaporodik fel, a máj funkciója szempontjából nem ez, hanem a periszinuszoidális régió megváltozása a kritikus. A fibrosis, cirrhosis során a szinuszoidok kapillarizációja a legfontosabb kísérőjelenség. Ilyenkor az endothel sejtek elvesztik fenesztráltságukat, a szinuszoidok helyett kapillárisok alakulnak ki. Az endothel és a hepatociták között az alacsony denzitású BM helyét, magas denzitású BM foglalja el. Ennek eredményeként a szabad, kétirányú molekulaáramlás, amely a plazmatér és a hepatociták közt fennáll egészséges májban, akadályozva van. A májsejtek méregtelenítési és intermedier anyagcserében betöltött szerepüket képtelenek ellátni (Martinez-Hernández és mtsai 1991). A kötőszövet mennyiségét a májban a termelés és lebontás egyensúlya szabja meg, így aktuális mennyisége a képződés és lebontás eredője. A kötőszövetet a kollagenázok bontják le, melyek termeléséért szintén a már említett myofibroblastok tehetők felelőssé. A kollagenázokat gátló TIMP (metalloproteáz-gátló) és α2 macroglobulin fokozott termelése is az ECM felszaporodását idézi elő. A 4. ábra a fibrosisban és cirrhosisban az ECM átalakulásához és a mátrix molekulák felfalmozódásához vezető fibrogenezis kaszkádot mutatja be.
22
Májkárosítás
nonparenchymális májsejtek aktiválása endothel, Kupffer
kollagenázok
TIMP α2 macroglobulin
hepatocita károsodás
Kötőszövet produkciót fokozó citokinek termelése TGFβ, TGFα, IL1, EGF, bFGF, TNFα
Kötőszövet + -
hepatocita pusztulás csillag sejt , portális fibroblast, csontvelői őssejt aktiválása
Mononuclearis sejtek aktiválódása
myofibroblast
ECM termelése (kollagén, laminin, fibronektin, proteoglikán) 4. ábra. A májfibrosis kialakulásának eseményei (Kovalszky és mtsai 2006 alapján).
23
2.3.6. Az ECM jellemzői a májregeneráció során Egészen mostanáig nagyon keveset tudunk az ECM átalakulásáról a máj regenerálódás során. Még ma sem tisztázott teljesen, hogy milyen mechanizmusok döntik el az akut vagy krónikus máj sérülés kimenetelét: az előbbi májregenerálódást, az utóbbi cirrhosist indukál. Egy lényeges eltérés azonban biztos: a májregenerálódás során a szinuszoidok újraképződése, míg cirrhosisban a kapillarizáció a jellemző, amely magas denzitású BM képződéssel jár. A máj kitűnően alkalmazható az ECM tanulmányozására, mivel nemcsakhogy „sebgyógyulással” reagál, mint más szervek, hanem regenerálódik is. E folyamat során nemcsak sejtproliferáció játszódik le, de az ECM-nek egy jelentős felhalmozása és átalakulása is végbemegy. A legfontosabb ECM komponenseket: fibronektin, laminin kollagén (I, III, IV) több tanulmányban is vizsgálták (Martinez-Hernandez és mtsai 1991, Martinez-Hernandez és Amenta 1993). Számos eltérést figyeltek meg a májregenerációban, a cirrhosisban és a fibrosisban bekövetkező ECM átépülésében. Kim és mtsai (1997) a fibronektin emelkedett, majd csökkent expresszióját írta le a Disse-térben a májregeneráció első napjaiban, amit azzal magyaráztak, hogy a fibronektin eltávolítása az ECM-ből a hepatociták osztódásának előfeltétele. Ezzel szemben krónikus májsérülést követően fellépő cirrhosis során a fibronektin igen korai depozíciója figyelhető meg a Disse-térben. Feltehetőleg ez a fehérje, mint az ECM szerveződését segítő mátrix komponens funkcionál. Ugyancsak eltérést figyeltek meg a laminin és entaktin szekréciójában is. A cirrhosisban megjelenő entaktin és laminin a szinuszoidok kapillarizációja során képződő BM kialakításában tölthet be fontos szerepet (Martinez – Hernandez és Amenta 1995). A regenerálódó máj kollagén tartalmában is hasonló csökkenést észleltek a cirrhotikushoz képest. Összességében véve a májregenerációban tehát az ECM/sejt tömeg csökkenés figyelhető meg. Mire a regenerálódás során a hepatociták vaszkularizációja
megtörténik,
és
kialakulnak
a
szinuszoidok
ez
az
arány
normalizálódik. Közvetlenül PH-t követően a laminin, entactin és fibronektin szintje is csökken a májban, majd később emelkedik a regeneráció során. Fokozott laminin expressziót
24
figyeltek meg a regenerálódó máj szinuszoidjaiban (Kim és mtsai 1997, Paku és mtsai 2001, 2004). A lamininnek a BM-ban betöltött szerepén túl igen jelentős szerepet tulajdonítanak a növekedés stimulálásában, a sejt migráció modulálásában, a sejtdifferenciációban és a morfogenezis eseményeiben, mely egy integrineket aktiváló szignalizációs kaszkádon keresztül stimulálja a májsejt proliferációt. Más nem- kollagén ECM mátrix komponensek szerepe, így például a tenascinok és egyéb
BM
komponensek
(kollagének)
konkrét
funkciója
és
változásai
a
májregenerációban és a cirrhosisban nem egészen világos. Ez a kérdéskör a további kutatások tárgyát képezi. Egyértelmű azonban, hogy a fentebb említett molekulákkal kölcsönhatásban levő fehérjék szerepe is felmerül a májregenerációban és a máj elváltozásaiban (ezek közt említendők a matrilinek is).
25
2.4. A matrilin fehérjecsalád 2.4.1. A matrilinek szerkezete
A család prototípusa a matrilin-1, mely korábban porc mátrix proteinként volt ismert (CMP, cartilage matrix protein) (Kiss és mtsai, 1989). A porc mátrix fehérje a matrilin család elsőként felfedezett tagja, kizárólag a porc érése során expreszálódik. Ezt a fehérjét a porc különböző formáiban proteoglikánokkal asszociálva írták le. (Paulsson és Heinegard 1979, 1981, 1982). A matrilin-2, matrilin-3 (Belluoccio és Trueb 1997, Deák és mtsai 1997, Wagener és mtsai 1997, Belluoccio és mtsai 1998) és a matrilin-4 (Wagener és mtsai 1998a) felfedezésével derült fény egy közös szerkezeti szekvencia felderítésére. A matrilin fehérjecsalád a nem-kollagén ECM fehérjéknek abba az alcsaládjába sorolandó, amelybe a von Willebrand A factor (vWFA) domént tartalmazó fehérjék tartoznak (Whittaker és mtsai 2002). A vWFA domén számos extracelluláris és intracelluláris fehérje molekulában szerepel és gyakran résztvevője azoknak a fehérjefehérje kölcsönhatásoknak, amelyek a multimer fehérjék kialakításában játszanak szerepet. A vWFA domén 200 aminosav (AS) maradékból épül fel, amelyek a klasszikus Rossman fold szerkezetet hordozzák, középen a β-lemezzel és körülötte az αhelikális struktúrákkal. Minden matrilin vWFA doménjére jellemző a konzervatív szerkezetű MIDAS (metal ion dependent adhesion site, fémionfüggő adhéziós hely) motívum, amelynek kitüntetett ligandumkötő szerepe van. A matrilin fehérjék vWFA doménje szerkezetileg egy egyedülálló csoportot alkot az ugyanezt a domént tartalmazó ECM molekulák között: érdekes megfigyelés, hogy minden matrilin családtag sokkal nagyobb szerkezeti hasonlóságot mutat egymással, mint minden más vWFA modult tartalmazó molekulával. Ez egyértelműen egy közös filogenetikai ősre utal (Deák és mtsai 1999). A filogenetikai vizsgálatok alapján a matrilinekre jellemző két vWFA domént két különböző csoportba sorolták be, amely szerint a matrilin-1/-3 és a matrilin2/-4 két külön alcsoportot képez a családon belül (Deák és mtsai 1999). A matrilinekben található vWFA domének az N-terminushoz közel eső vWFA1 domén és a Cterminushoz közel eső vWFA2 domén. A matrilin-3-ban a vWFA2 domén és az egér egyik splice-variáns matrilin-4-ben a vWFA1 domén kiesett.
26
A matrilin-1-et a csirke, egér és emberi cDNS-ből írták le. Szerkezetileg két vWFA domént tartalmaz, amelyet egy darab EGF-szerű domén köt össze. A matrilin-1 és matrilin-3 splice-variánsaiból, hiányzik az EGF-szerű domén. Az összes többi családtagban legalább egy ilyen domén van, legtöbb belőle a matrilin-4 splicevariánsában található, amely 12 EGF-t tartalmaz (Ko és mtsai 2005). Ez az EGF-szerű domén nem mutat szerkezeti hasonlóságot a Ca2+- kötő EGF-szerű motívumokkal: nem Ca2+- kötők és növekedési faktor aktivitásuk sem bizonyított. Nagyobb valószínűséggel egy elosztóként (ún. „spacerként”) szerepelnek a vWFA domének között. Szerkezetileg leginkább a fibulin, a fibrillin EGF doménjeivel mutatnak rokonságot. Végül a molekulák karboxi végén egy úgynevezett coiled-coil (cc) struktúra helyezkedik el, amely α-hélixet formál. Ez teszi alkalmassá az egyedülálló alegységeket a virágcsokorszerű oligomerizációra (Argaves és mtsai 1987, Kiss és mtsai 1989, Hauser és Paulsson 1994). Az összes többi matrilin családtag ugyanezeket a doméneket tartalmazza és ugyanolyan sorrendben, mint a matrilin-1. Kivétel jellemzi a matrilin-3-t, amelyik szerkezetét jellemzi, hogy csak egyetlen vWFA doménje van és az EGFdomének közvetlenül a C-teminálison levő coiled-coil szakaszhoz kapcsolódnak. Továbbá, a matrilin-2 és a matriln-3 a fent említett doméneken kívül az N-terminálison pozitív töltésű oldalláncokkal bíró AS maradékokat hordoz. Egyedül a matrilin-2-t jellemzi egy úgynevezett egyedi (U, unique) szekvencia, a második vWFA domén és az oligomerizációs domén között, amely egyedi, eddig még egyetlen más fehérjében sem írtak le hozzá hasonlót. A humán matrilin-2 prekurzort 4.0 kb mRNS kódolja, 956 aminosavból áll és 93%-os egyezést mutat az egér fehérjével. 2 vWFA domént, 10 EGF-domént, egy egyedi szekvenciát és egy oligomerizációs domént tartalmaz. Az első vWFA domén a legkonzerváltabb. A matrilin-2 a 8q22 kromoszómára lokalizálódik. Az 5. ábrán a matrilin család domén szerkezetét láthatjuk.
27
5. ábra. A matrilinek domén szerkezete (Wagener és mtsai 2005). 2.4.2. A család tagjainak jellemzése és filogenetikai eredete
A matrilin-1 (CMP), a vWFA-szerű domént tartalmazó család egyik legegyszerűbb tagja, egy homotrimér glikoprotein, 52 000 Da alegységeket hordoz. 3, 9% szénhidrátot, főképpen N-kapcsolt oligoszacharidokat tartalmaz (Paulsson és Heinegard 1981). A porc különböző formáiban, nagy mennyiségben előforduló fehérje. A szem alkotóelemeiben is kimutatták (Stirpe és mtsai 1989), ennek alapján egy nagyon specifikus funkciója feltételezett. Elektronmikroszkópos felvételen egy tipikus virágcsokorszerű szerkezetet mutat, ahol az egyedülálló vWFA domének nem nyitottak, hanem egymással kölcsönhatásban van a már említett vWFA1 és a vWFA2. A domének
28
3 egymással párhuzamos láncú, diszulfid-híddal kapcsolt, α-helikális coiled-coilokba rendeződnek. A matrilin-2 a legnagyobb molekulasúlyú családtag, 104 300 Da méretű az egérben, Nterminális oligoszacharidokat tartalmaz (Piecha és mtsai 1999). Elektronmikroszkópos vizsgálatok igazolták, hogy a matrilin-1-hez hasonlóan itt is a két vWFA domén egymáshoz kötődik. Jellemző, hogy szöveti kivonatból nyert fehérjekivonatban minden esetben egy igen heterogén összetételű fehérje mutatható ki, valószínűleg a proteolitikus hasítás következményeként. A humán matrilin-2 313 AS ORF régiója 87% -os egyezést mutatott az egér matrilin-2-vel. A 87%-os egyezés az AS szekvenciában az egér és a humán matrilin-2 között azt mutatja, hogy valószínűleg a matrilin-2 funkcionálisan egy nagy jelentőséggel bíró ECM komponens lehet az emlős szövetekben és szervekben. (Deák és mtsai 1997). Néhány tény igazolja, hogy a matrilin-2 valóban a CMP közeli rokona: 1) a vWFA-szerű domének hasonlósága; 2) a vWFA-és EGF-szerű domének azonos sorrendisége. A közös domén szerkezetből feltételezhető hogy valószínűleg a matrilin-1 és a matrilin-2 ugyanannak a közös génnek a duplikációjából származik, amely egy duplikált vWFA-t, egy egyedülálló EGF-et, és egy oligomerizációs domént tartalmazott. A matrilin-3 a legkisebb családtag, többnyire a matrilin-1-el koexpresszálódik (Wagener és mtsai 1997, Klatt és mtsai 2000). MALDI-TOF tömegspektrometriával az egér matrilin-3 tömegét 49300 Da-nak találták. A második vWFA domén hiánya miatt az alegységek nincsenek kölcsönhatásban önmagukkal ezért az elektronmikroszkópban ezt a fehérjét több kifeszített, flexibilis karral látjuk. A matrilin-4 egérben a két vWFA modul között 4 EGF- szerű domént tartalmaz. (Wagener és mtsai 1998a,b, Klatt és mtsai 2001). A rekombináns fehérje tömege 72900 Da, ami 7%-os poszttranszlációs modifikációra utal. Noha a matrilin-4 két vWFA domént tartalmaz, elektronmikroszkópban nem mutatható ki nyilvánvaló kölcsönhatás a domének között (Klatt és mtsai 2001). Összességében véve tehát a matrilinek egy közös ősből származnak, amelyben a vWFA domének már megduplázódtak, mert az összes vWFA1 domén közelebb áll egy másik molekula vWFA1 doménjéhez, mint a vWFA2-es modulhoz. A feltételezhető hipotézis az, hogy a primordiális matrilin gén duplikálódik és ebből ered a matrilin-1 és matrilin3 valamint a matrilin-2 és matrilin-4 közös őse. Továbbá, a második génduplikációt
29
követően, a matrilin-3-ban a matrilin-1 vWFA2 doménjével megegyező vWFA domén kiesett (Deák és mtsai 1999). 2.4.3. A matrilinek oligomerizációja és kölcsönhatása más ECM komponensekkel
Ahogy azt már említettem, a matrilin család C-terminális régióján lévő α-helikális coiled-coil
domén
teszi
lehetővé
a
molekula
alegységek
virágcsokorszerű
oligomerizációját. A teljes hosszúságú molekulák elektronmikroszkópos vizsgálata kimutatta, hogy a matrilin -1 és matrilin-4 homotrimereket (Hauser és Paulsson 1994, Klatt és mtsai 2001), míg a matrilin-2 és-3 homotetramereket képez (Pan és Beck 1998, Piecha és mtsai 1999, Klatt és mtsai 2000). Az oligomerizációt E. coli-ban termeltetett rekombináns coild-coil doménekkel is tanulmányozták (Frank és mtsai 2002). A biokémiai és biofizikai vizsgálatok nemcsak igazolták a teljes hosszúságú molekulák által képzett eddig ismert homo- és heteromer oligomereket, de újabb további hét rekombináns matrilin lánckombinációra derítettek fényt. Termodinamikai mérésekkel alátámasztották a heterooligomerek nagyobb hőstabilitását. A különböző matrilin láncok kombinációja igen változatos képet mutat (6. ábra) és expressziós szint által szabályozott. A teljes hosszúságú matrilin-2 láncokkal szemben a rekombináns coiledcoil ccMat2 domének csak trimereket képeznek. A coiled-coil domének ugyanazon a helyen oligomerizálódnak, mint a teljes hosszúságú fehérjék azzal az előnnyel, hogy rájuk nem jellemző a szupramolekuláris szerveződés. A coiled-coilok funkcionális szerepe
abban
rejlik,
hogy
a
multimerek
képződéséhez
vezető
alegységek
oligomerizációjában vesznek részt. Az oligomerizáció eredményeként többértékűség jön létre, és a funkcionális helyek helyileg koncentrálódnak (Deák és mtsai 1999). Továbbá a
heteromerek
növelik
a
matrilinek
funkcionális
diverzitását.
A
homo-és
heterooligomerek képződése a vWFA domén ligandkötő aktivitására és affinitására is hatással van. (Ugyanez a jelenség jobban érthető a trombospondin vagy a laminin hasonló példáján, amelyekre jellemző, hogy heparinkötő affinitása a homo-és heterotrimerek képzésével fokozódik). A vWFA doméneken keresztül a matrilinek kölcsönhatnak önmagukkal és egymással, ami szupramolekuláris szerkezetek képződéséhez vezet, amelyek az ECM struktúrák stabilizálásában vesznek részt.
30
A teljes fehérjék elektronmikroszkópos felvételén kimutatható, hogy a matrilin-1és a matrilin-4 homotrimereket (Hauser és Paulsson 1994, Klatt és mtsai 2001), míg a matrilin-2 és -3 homotetramereket képez (Piecha és mtsai 1999, Klatt és mtsai 2000). Matrilin-1 és matrilin-3 heterooligomereket izoláltak újszülött humán – és borjú porcból (Wu és Eyre 1998, Klatt és mtsai 2000). Matrilin-1 és matrilin-2, matrilin-1 és matrilin3, matrilin-1 és matrilin-4 valamint matrilin-2 és matrilin-4 heterooligomereket mutattak ki. Matrilin-2 és matrilin-3, matrilin-3 és matrilin-4 heterooligomerek nem voltak kimutathatók (Frank és mtsai 2002). Egyéb molekulákkal történő kölcsönhatását illetően a matrilin-1-t elsőként az aggrekánhoz kötve együtt tisztították (Paulsson és Heinegard 1979, Hauser és mtsai 1996). Még nem ismert, hogy ebben a molekula komplexben egyedülállóan az aggrekán és a matrilin-1 vesz részt vagy egyéb matrilinek is képesek proteoglikánokhoz kötődni. Elképzelhető, hogy azok a család más tagjaihoz kötődnek. A matrilin-1 a II típusú kollagén fibrillumokhoz egy meghatározott periodikussággal kötődik (Winterbottim és mtsai 1992) és részt vesz a kollagén-független filamentózus hálózat kialakításában is. Az aggrekánhoz való kötődése kovalens kereszt-kötéseket vesz igénybe, ami a kor előrehaladásával fokozódik. Azt pontosan nem tudjuk, hogy a CMP-nek melyik doménje vehet részt ebben a kölcsönhatásban, de nagy valószínűséggel a vWFA-szerű domén az, amelyik szerepet kap ebben. Mindkét vWFA-szerű doménnek jelentős szerepe van a hálózatképzésben. Ha kiesik a vWFA2 domén, nem képződik multimer matrilin-1 fehérje, ha hiányzik valamelyik vWFA domén, akkor nem képződik kollagén-független hálózat sem (Chen és mtsi 1999). Porcsejt-tenyészetekkel végzett kísérletek igazolták a matrilin-1 jelenlétét pericelluláris kollagén-függő és kollagéntól– független filamentumokban egyaránt (Chen és mtsai 1995). A matrilin-1, matrilin-3 és a matrilin-4 köti a kollagénV összetételű mikrofibrillumokat az aggrekán core proteinhez és a kollagén II típusú fibrillumokhoz a biglikánon vagy a dekorin alkotta csoportosuláson keresztül (Wiberg és mtsai 2003). Matrilin-1 defficiens egerekben nem volt kimutatható elváltozás a kollagén II, IX, X, XI, aggrekán és COMP expressziójában. Ennek alapján feltételezhető, hogy a matrilin-1 expressziójának változása nem befolyásolja szignifikánsan ezeknek a molekuláknak a biokémiáját. Valószínűleg itt is a többi matrilin fehérje redundáns funkciója érvényesül, mivel a fejlődő csontban minden matrilin fehérje expresszálódik.
31
Immunfluoreszcenciás
kísérletekkel
igazolták,
hogy
a
matrilin-2
sejtkultúra
tenyészetben képes saját molekulákkal alkotott, sejten kívüli hálózat létrehozására. Emellett más, kollagén és nem kollagén természetű extracelluláris molekulákhoz is tud kötődni, tehát részt vesz több fehérjéből felépülő, heteromolekuláris fehérjehálózatok létrehozásában is. A matrilin-2 a legnagyobb mennyiségben előforduló szöveti kollagénhez, a kollagén Ihez kötődik. Ebben a kapcsolatban a tropokollagén molekula két terminálisát részesíti előnyben.
Plasma rezonanciás módszerrel igazolták a matrilin-2 kölcsönhatását a
kollagén II, III, IV és V molekulákkal is (Piecha és mtsai 2002 a). A matrilin-2-t gyakran BM-hoz és mikrofibrillumokhoz asszociáltan írták le. Így számos más molekulát is kimutattak matrilin-2-vel köcsönhatásban: a fibronectin, a laminin-1 és a nidogén kötődését igazolták csonkolt matrilin-2-höz (Piecha és mtsai 2002 b). ELISA-n alapuló ligand esszével mutatták ki a matrilin-4 molekula kötődését a kollagén I, II, XI, XII, XIV, XXII molekulákhoz. Az említett molekulákhoz képest néhány nem-kollagén molekula nagyobb affinitással köti a matrilineket, különösen a COMP-ra (cartilage oligomeric matrix protein) jellemző ez a jelenség (Mann és mtsai 2004). Abból eredendően, hogy a COMP és a decorin is kölcsönhat a kollagénnel, a matrilinek a kollagén rostokhoz elképzelhetően egy szendvics részeként kötődnek, ahol a többi résztvevő komponens közvetlenül és erős affinitással kötődik a kollagénhez.
6. ábra. A matrilinek oligomerizációja. Lehetséges homo-és heteromerek. Pirosmatrilin-1, fekete-matrilin-2, zöld-matrilin-3, kék-matrilin-4 (Frank és mtsai 2002).
32
2.4.4. A matrilinek expressziója különböző szövetekben és szervekben
A szöveti eloszlásuknak megfelelően a matrilineket két csoportra oszthatjuk. A matrilin1 és -3 a váz elemek jelentős alkotóeleme, de felnőtt egérben kimutatták a matrilin-1 gén expresszióját extraszkeletálisan is (Aszódi és mtsai 1996, Klatt és mtsai 2002). A vázképződés során a matrilin-1 fehérje és mRNS akkumulálódik a humán, egér és csirke porc növekedési zónájában (Aszódi és mtsai 1994). A matrilin-1 expressziója térben és időben egyaránt szigorúan szabályozott. Matrilin-1 ellenes antitesttel a fehérje detektálható az embrionális myocardiumban az embriogenesis 9, 5 napján. Ez egy tranziens expresszió és valójában nincs élettani jelentősége. A leghosszabb ideig tartó matrilin-1 és matrilin-3 expressziót az emrionális kötőszövetben mérték, a fejlődés 12, 5 napján. A vázfejlődés előrehaladásával a matrilin-1és a matrilin -3 expresszálódó doménjei megegyeznek a kollagén II doménjeivel. A fejlődés későbbi szakaszában a porc felszíni rétegeiben ezeknek a matrilineknek az expressziója már nem olyan kifejezett, mint a porc mélyebb rétegeiben (Segat és mtsai 2000). A kalcifikáció után a matrilin -1 és a matrilin-3 a csontba épül. Immunhisztokémiával a matrilin-1-t kimutatták a korneában, a szklerában, a placentában, a lencse tokban és a lencse epithéliumában (Tsonis és Goetnick 1988, Kabosava és mtsai 2007).
In situ
hibridizációval kimutatták a humán embrió retinájában (Mundlos és Zabel 1994). Tranziens matrilin -1 expresziót mutattak ki embrionális egér szívben (Segat és mtsai 2000). A matrilin-3 megtalálható a porc minden típusában és a csontban egyaránt (Wagener és mtsai 1997, Klatt és mtsai 2000), szélesebb spektrumú szöveti expressziót mutatva a matrilin-1-hez képest. A matrilin-3 szöveti expressziója azonban születés után leáll. Nagy valószínűséggel ez a két családtag, a matrilin-1, -3- az élet korai szakaszában expresszálódik jelentős mértében, de a fehérjék lassú turnovere miatt szöveti szinten az élet későbbi szakaszában is detektálhatók. A porcsejtek mátrixában a matrilin-3-t egy filamentózus, sejteket összekötő, kollagén-függő hálózatban és egy kollagén-független pericelluláris hálózatban is kimutatták. A matrilin-2- a matrilin- 4 képezi a másik alcsoportot. Ezek sokkal elterjedtebbek a szövetekben. Northern blot vizsgálatokkal, a porcot kivéve, magas expressziójukat detektálták az uterusban, a szívben, a koponyatetőben és az agyban, alacsonyabb
33
expresszió volt detektálható a vesében, a vázizomban és a bőrben. A matrilin-1-hez hasonlóan a matrilin-2 is elsőként az egér embrió szívében detektálható, de a matrilin-2 a matrilin-1-hez képest később jelenik meg, a fejlődés 10, 5 napján és szintézise nem áll le, hanem folyamatos. A fejlődés későbbi szakaszaiban számos kötőszöveti sejt, simaizomsejtek és egyes hámsejtek expresszálják (Piecha és mtsai 1999). Ezek a sejtek a matrilin-2-t az őket körülvevő pericelluláris mátrixba halmozzák fel. Jóllehet sok esetekben BM-al asszociált, még ezidáig sem tisztázott integráns BM fehérje volta. Más esetekben a matrilin-2 egy filamentumokból felépülő hálózat komponense. Jelen van a porcban is. Minden eddig vizsgált szervben a matrilin-2 fehérje exszpresszió a mért mRNS expresszióhoz képest alacsonyabb szinten volt. Az egér matrilin-2 gén expressziót detektálták laza és tömött kötőszövetekben, izomsejtekben és néhány epitheliális sejttípusban (Deák és mtsai 1997, Piecha és mtsai 1999), szubepitheliális kötőszövetekben, bőrben és emésztő traktusban, vérerek falában. Matrilin-2 mRNS-t detektáltak a szív kötőszöveti elemeiben, simaizomsejtekben, méhizomzatben és az agyban (Deák és mtsai 1997, Sharma és mtsai 2006). Az összes matrilin közül a matrilin-4 a legáltalánossaban előforduló, és mindenhol kimutatható, ahol a többi matrilin megjelenik (Klatt és mtsai 2001). A matrilin-2-höz hasonló a matrilin-4 szöveti expressziója: tömött- és laza- rostos kötőszövetben, csontban, porcban, idegrendszerben és számos más szervben fordul elő (Wagener és mtsai 1998a; 1998b). Részleges átfedést mutat a matrilin-2-vel. Az idegrendszeri kifejeződése sokkal kifejezettebb, mint más matrilineké, így például az agy a leggazdagabb matrilin-4-ben (Klatt és mtsai 2001). A szöveti kivonatokban a matrilin-2 és matrilin-4 általában degradált, fragmentálódott. Továbbá, a teljes hosszúságú fehérjékhez képest a fragmentekből hiányzik egy vagy több alegység (Klatt és mtsai 2001). A matrilin-4 rekombináns formáját humán embrionális vese - 293 sejtekben expresszálva, monomer, dimer és trimer fragmentek keverékét kapták (Klatt és mtsai 2001). 2.4.5. A matrilinek szerepe betegségekben
A matrilin fehérje családban a matrilin-3 az egyetlen olyan családtag, amelynek mutációja az eddigi ismeretek alapján a chondrodysplasia különböző formáival van kapcsolatban (Aszódi 1998, 1999, Leighton és mtsai 2007).
34
A
matrilin-1
és
matrilin-3
mutánsok
fenotípusosan
normális
vázrendszerrel
rendelkeznek, de biokémiai és ultrastruktúrális vizsgálatokkal eltéréseket lehetett kimutatni. Ezt matrilin-1, -2 és -3 knock-out egereken is igazolták. Mind a matrilin-1, mind a matrilin-3 modulálja a kollagén fibrillogenezisét a porcban, a normálisan megjelenő fenotípus a matrilinek egymással történő kompenzációjára utal. A matrilin1/-3 kettős knock-outokban átmenetileg megemelkedő matrilin-4 homotrimer is a kompenzációs mechanizmust támogatja, míg más elméletek szerint a funkcionális redundancia lehetősége merül fel a matrilin molekulák és a kölcsönható molekulák között (COMP, dekorin, biglikán). A COMP, matrilin-3 és kollagén IV károsodását írták le pseudochondro-dysplasiában (PSACH). A multiplex epiphysealis dysplasia domináns
formájában
(MED)
(Briggs
2004),
és
az
örökletes
bilaterális
microepiphysealis dysplasiában (BHMED) is detektálható a matrilin-3 mutációja. A mutáció elsősorban a vWFA domén β-lemezét érinti (Chapman és mtsai 2001, Jackson és mtsai 2004, Mabuchi és mtsai 2004). A matrilin-3-ban a mutáció az első EGF-szerű doménben is lehet, így például osteoarthritisben az EGF-ek első doménjében bekövetkező cystein-serin csere okozza az S-S diszulfid-híd képződésében létrejövő károsodást (Stefánsson és mtsai 2003). MED-ben nem írtak le matrilin-1 mutációt. Ezzel szemben német populáció osteoarthritises betegeiben matrilin-1 gén mutációt, matrilin-1 és matrilin-3 overexpressziót találtak (Okimura és mtsai 1997). Összefüggést írtak le a felnőttkori idiopatikus szklerózis (IS) és a matrilin-1 expressziója között. Egy igen ritka autoimmun porcbetegségben, amely elsősorban a külső fület és a tracheát érinti a visszatérő polychondritisben (PA) matrilin-1 ellenes immunválaszt mutattak ki (Buckner és mtsai 2000), rheumatoid arthritisben szenvedő betegekben emelkedett volt a matrilin-1 fehérje expresszió szintje (Saxne és mtsai 1989). Matrilin-2 és a matrilin-4 mutációval összefüggő genetikai elváltozásokat nem sikerült kimutatni. Matrilin mutáns egerekben nem volt kimutatható fenotípusos elváltozás, noha megfigyelhető volt az abnormális kollagén fibrillumok felhalmozódása és a kollagén molekulák átmérőjének növekedése (Aszódi és mtsai 1999, Ko és mtsai 2004, Mátés és mtsai 2004). A matrilin-2 hiányos egerek látszólagos normális fejlődése többféleképpen is értelmezhető. Egyik kézenfekvő magyarázat az, hogy más matrilin, vagy a sejtközöttti állomány más fehérjéje átveheti azokat a szerepeket, amelyeket a matrilin-2 betölt. Erre azért gondolhatunk, mert a matrilinek szerkezeti felépítése és
35
szöveti előfordulása igen hasonló, részlegesen átfedő, továbbá nemcsak homo-, hanem hétféle heterooligomert is tudnak formálni. A funkcionális redundancia lehet az oka annak is, hogy eddig nem írtak le olyan súlyos fejlődési rendellenességet, amit a matrilin gének mutációja idéz elő. Egérben indukált fibrotikus vese modellben (TIF = renal tubulointerstitial fibrosis) az ECM-re fókuszált klaszter analízissel, a betegséggel asszociált gének között a matrilin-2 down-reguláltságát mutatták ki (Sadlier és mtsai 2004). Összességében véve elmondható, hogy a matrilinek in vivo betöltött funkciója még máig sem egészen pontosan tisztázott. Szupramolekuláris struktúrákban betöltött „adaptor” szerepük ismert, noha ennek részletes tanulmányozását e molekulák redundanciája nehézkéssé teszi. A sejt-mátrix kölcsönhatásokban is szerepük lehet: a sejt felszíni filamentumok között foglalnak helyet, de azonkívül, hogy integrin receptorok, még nem sokat tudunk a sej-sejt illetve sejt-mátrix kölcsönhatásban betöltött szerepükről. 2.4.6. A matrilin-2 expressziója humán szövetekben és tumorokban Humán szerveket illetően kevés tudásunk van a matrilin-2 expressziójáról. Bőrben és a bőr függelékekben, az erek BM-nak legalsó rétegében mutattak ki matrilin-2 expressziót. In situ hibridizációval a keratinocytákban és a fibroblastokban is sikerült mRNS expressziót detektálni. Noha mindkét sejttípus expresszálta a matrilin-2-t, különböző módon történik a fehérje processzálása. A fibroblastok, úgy tűnik, leginkább fokozzák a matrilin-2 expresszióját (Piecha és mtsai 2002 b). A keratinocyták termelik, majd a szubepidermális szövetek felé transzportálják, a kötőszöveti stroma irányában. Ez a mechanizmus egészen pontosan nem ismert, de feltehetőleg specifikusan kölcsönható partner molekulák bizosítják a matrilin-2 BM-ban történő lokalizációját (Piecha és mtsai 2002 a, b). Az egyik leggyakoribb gyerekkori primer agytumorban, a pilocitikus astrocytomában (PA) és multiform glioblastoma (GBM) mintákban mérték az mRNS szintjét real-time RT- PCR módszerrel. A PA tumorokban a matrilin-2 mRNS szintje hétszer olyan magas volt, mint a tumor által nem érintett agyi fehérállományban. A GBM minták nem mutattak matrilin-2 fehérjeszint emelkedést. A magas matrilin-2 szint tehát összefügghet klinikailag agresszívebb tumorok kialakulásával és hozzájárulhat a tumor
36
terjedéséhez. A matrilin-2 overexpresszió prognosztikus marker lehet PA tumorokban (Sharma és mtsai 2006). A matrilin-2-ről májra vonatkozó adatokat mostanáig még nem találtunk az irodalomban. Minthogy ECM és BM komponens, így jelentősége felmerülhet mind a májregenerációban mind, pedig a máj cirrhotikus és tumoros elváltozásaiban. A ECM lehetséges célpontot jelenthet a daganat terápiában. A közelmúltban beigazolódott, hogy az ECM mikrokörnyezet jelentősen módosítani képes az egészséges és a malignus sejtek fenotípusát, a tumorsejtek szaporodását, invaziv és metasztatikus képességét, valamint daganatellenes szerekkel szembeni válaszreakcióját (Hodkinson és mtsai 2007). Ez utóbbi is kiemeli e nemrégiben leírt mátrix molekulák vizsgálatának a jelentőségét a HCC-ben és cirrhosisban egyaránt.
37
3. CÉLKÍTŰZÉSEK
Az előzőekben vázolt irodalmi áttekintés alapján vizsgálataink a következő kérdések megválaszolását célozták meg: 1. Kimutatható-e matrilin-2 mRNS és fehérje expresszió normális patkány és humán májban? 2. Milyen mértékben és hol expresszálódik a matrilin-2 a májregeneráció során? 3. Milyen jelentősége lehet a matrilin-2-nek a májregenerációban? 4. Milyen sejteknek lehet szerepe a matrilin-2 termelésében a májregeneráció során? 5. Hogyan
változik
mennyiségében
és
lokalizációjában
a
matrilin-2
expressziója a cirrhotikus májban, összehasonlítva normál májszövettel? 6. Van-e eltérés a matrilin-2 expressziójában a tumoros májszövetben a normál májakhoz képest? 7. Milyen különbség figyelhető meg a matrilin-2 expresszió szempontjából az eltérő
eredetű
(cirrhotikus
és
nem
cirrhotikus
talajon
létrejött)
hepatocelluláris carcinomákban? 8. Van-e eltérés a matrilin-2 expressziójában a különböző differenciáltságú tumorokban?
38
4. ANYAG ÉS MÓDSZER 4.1. A vizsgálatokhoz használt oldatok, pufferek összetétele
Oldat neve DEPC víz 10xPBS
Összetétel DEPC (Sigma D 5758), 1l deszt víz 1,5 M NaCl (Sigma, S9625), 12,2 Na2HPO4 (Sigma, S0876), 0,014mM K2HPO4 (Interkémia, 04190203)
10x TBE
1 M Tris (GIBCO, 15504-020), 0,83 Bórsav (GIBCO, 15705-023), 0,01 M EDTA(GIBCO 15576-028)
10x Tris-HCl
0,05 M Tris (GIBCO, 15504-020), 0,3 M NaCl (Sigma, S9625)
TBS
0,05 M Tris (GIBCO, 15504-020), 0,15 M NaCl (Sigma, S9615)
TBS-Tween
0,05 M Tris (GIBCO, 15504-020), 0,15 M NaCl (Sigma, S9615), 0,1% Tween
20x SSC
3 M NaCl (Sigma, S9625), 0,3 M Na –citrát (Sigma, S 4641)
10%-os
40% Formalin (Sigma, 8775), 6,5g Na2HPO4 (Sigma, S 0876), NaH2PO4
Pufferolt
(Sigma, S0751)
formalin
39
4.2. Állatkísérletek 4.2.1. Parciális hepatectomia (PH) A beavatkozás 180-200g súlyú hím Fisher 344 (F- 344) patkányokon történt Higgins és Anderson klasszikus módszere szerint (Higgins és Anderson 1931, Grisham és mtsai1997) az SE I. sz Patológia és Kísérletes Rákkutató Intézetében. A vizsgálatokat a parciális hepatectomiát követően 24, 48, és 72 órával a műtét után vett szövemintákon végeztük. Az altatás dietil-éterrel történt. A májminták egy részét formalinban fixáltuk, más részét folyékony nitrogénben fagyasztottuk további vizsgálatok céljából. 4.2.2. Parciális hepatectomia/acetylaminofluorén (PH/AAF) modell Az
állatok
az
1
%-os
dimethylcellulózban
2mg/ml
koncentrációban
oldott
acetylaminofluorént (AAF) 5 mg/kg dózisban kapták hat egymást követő napon át. Ezt követően parciális hepatectomia történt a 7. napon, amit ezután még hat AAF-es kezelés követett. Az állatok leölése a kezelés során különböző időpontokban történt (a PH-t követő 9., 11. és 13. napokon) az ovális sejt proliferáció csúcspontjának meghatározása végett. Az állatkísérleteket a Nemzetközi Állategészségügyi Intézet kísérleti protokolljaival megegyező módon végeztük el. 4.3. Humán szövetek A Semmelweis Egyetem II. sz. Patológiai Intézetében archivált valamint újonnan gyűjtött humán májmintákat használtuk fel vizsgálatainkhoz, amelyeket formalinban, illetve RNAlaterben (Sigma) fixáltunk vagy folyékony nitrogénben történt fagyasztás után -80◦C-on tároltunk. A sebészileg rezekált anyagok az SE I. sz. Sebészeti Klinikáról, a kontrollként használt egészséges normál májak pedig balesetben elhunyt személyekből származtak, az SE Igazságügyi Orvostani Intézetéből. A vizsgálatokhoz TUKEB engedéllyel rendelkezünk (# 172/2003, # 2/2004). A vizsgált HCC-k csoportosítása az Edmonson-Steiner féle klasszifikáció alapján történt (G1G3) (1. táblázat). A nemek szerinti megoszlás a következő volt: 27 férfi, 8 nő. Az átlag életkor 65 év (44-82). A 35 eset közül 15 esetben a hepatocelluláris carcinoma cirrhosis talaján fejlődött ki. A többi esetben enyhe és igen mérsékelt mértékű fibrosis volt jellemző a
40
tumort környező májszövetre, de sem nodulus képződés, sem pedig a cirrhosisra jellemző duktuláris reakció nem volt megfigyelhető. A 15 eset közül 7 minta volt HCV-vel fertőzőtt. 1. táblázat. A vizsgálatokhoz használt humán májminták.
Vizsgált májminták
esetszám
Normál májminták
10
HCC környező tumormentes máj
35
HCC
35
I. 1. cirrhotikus talajú HCC
15
2. nem cirrhotikus talajú HCC
20
II. 1. jól differenciált HCC (G1)
19
2. közepesen differenciált HCC (G2)
9
3. rosszul differenciált HCC (G3)
7
4.4. Morfológiai vizsgálatok 4.4.1. Hisztológia A patkány máj, valamint a sebészetileg eltávolított tumor mintákat a környező nem tumoros szövetekkel együtt, valamint a normál humán máj mintákat 10%-os neutrálisan pufferolt formalinban fixáltuk 24 órán keresztül, utána dehidráltuk és paraffinba beágyaztuk. A morfológiai elváltozások kimutatása és a tumor grade megítélése 3-4 µm-os hematoxilineozinnal (HE) festett metszeteken történt. Kiegészítő PAS, Shikata-féle orcein, Picrosiriusvörös festéseket rutinszerűen elvégeztük. 4.4.2. Immunhisztokémiai vizsgálatok 4.4.2.1. Paraffinos metszeteken végzett immunfestés A formalinban fixált, paraffinba ágyazott mintákból 3-4 µm-es metszeteket készítettünk, majd deparaffináltuk: kétszer 10 percig xilolos, majd kétszer 5 percig etanolos áztatással. Desztillált vízzel történő mosás után az endogén peroxidáz blokkolást 3%-os H2O2-ban végeztünk 20 percig. PBS pufferes mosás után az antigénfeltárás proteáz emésztéssel történt (ready-to-use
41
proteináz-K, 10 perc, 25◦ C, DAKO, CA, USA). Újabb PBS-sel történő mosás után az antitest aspecifikus kötődéseket 1%-os normál ló szérummal illetve 3%-os BSA-val (PBS) blokkoltuk 20 percen át szobahőmérsékleten. Ezután a megfelelő elsődeges antitest oldatával egy éjszakán át 4 ◦C-on inkubáltunk. PBS-ben történt mosásokat követően 20 percig a másodlagos antitesttel inkubáltuk a metszeteket. A biotinilált másodlagos antitestnél ezt az ABC inkubálás követte. A matrilin-2 kimutatása végett az immunreakció érzékenységét egy nagy érzékenységű jelamplifikációs immuntechnika alkalmazásával, biotinilált tiraminnal fokoztuk (ABC-BT módszer) (7. ábra) Az immunreakció Merz és munkatársai által leírt módszer szerint történt (Merz és mtsai 1995). Az ABC inkubálást biotinilált tiraminos inkubálás követte (7mM biotinált tiramin törzsoldatból 1: 125 + 0,033% H2O2 (PBS-ben) 10 perc, 37 ◦C). Ismételt ABC reakció után az immunreakciót 3-amino-9-ethyl-carbazol (AEC) (Biogenex HK 129-5K, San Ramon, USA) vagy 3,3’-diaminobenzidin tetrahidroklorid (DAB) (Genetex, San Antonio, USA) kromogénekkel hívtuk elő. A háttérfestés Mayer-féle hematoxilinnal történt és glicerines fedőanyaggal fedtük a metszeteket. A kontroll metszeteknél az elsődleges antitesttel való inkubálást elhagytuk.
4.4.2.2 Fagyasztott metszeteken végzett immunfloureszcenciás vizsgálat 6 µm vastag fagyasztott metszeteket készítettünk kriosztáttal (SHANDON CC 0053000603, Patosystems, Minnesota, USA), ezt követően 10 percig metanolban fixáltuk – 20◦C-on. A fixálás után a metszeteket TRITON tartalmú PBS-ben (pH 7,4) tártuk fel 5 percig. A metszeteket 1 éjszakán át 4 ◦C-on inkubáltuk az elsődleges antitesttel. Ezt követően egymás után háromszor 5 percig mostuk a metszeteket PBS-ben. A reakciót Alexa Flour-488konjugált- anti-egér IgG másodlagos antitesttel tettük láthatóvá (Molecular Probes, Oregon, USA). A metszeteket DAPI-t tartalmazó Vectashield Mounting Mediummal fedtük le (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA). Az immunhisztokémiai vizsgálatokhoz használt antitesteket a 2. táblázat foglalja össze. 4.4.2.3. Fotódokumentáció A fotókat Olympus BX mikroszkóphoz (Tokyo, Japán) rögzített kamera segítségével készítettük. Az immunfluoreszcenciás képeket konfokális lézer-szcanning mikroszkóppal elemeztük és a hozzá tartozó szoftverrel fotóztuk (Bio-Rad MRC-1024 system, Bio-Rad, Richmond, CA, USA). 42
2. táblázat. Az immunhisztokémiai vizsgálatok során használt antitestek
Elsődleges antitestek •
poliklonális nyúl anti - matrilin-2 (1:150 hígításban (PBS), ajándék dr Deák Ferenc munkacsoportjától, Szeged, SZBK, Piecha és mtsai 1999)
•
monoklonális egér anti-laminin (1:100 hígításban (PBS), Novocastra, Newcastle, UK)
•
poliklonális nyúl anti-laminin (1:100 hígításban (PBS), DAKO)
•
monoklonális anti-egér OV-6 (1:100 hígításban (PBS), R&D, Minneapolis, USA)
•
monoklonális CD34 (1:100 hígításban ( PBS), DAKO, clone QBEnd/10)
Másodlagos antitestek •
biotinilált anti-nyúl IgG (ABC kit, Novocastra, Newcastle, UK)
•
biotinilált anti-egér IgG (ABC kit, Novocastra, Newcastle, UK)
•
Alexa Flour-488-konjugált anti-egér IgG (1: 100 hígításban (PBS), Molecular Probes, Oregon, USA)
•
Alexa Flour-568-konjugált anti-nyúl IgG (1: 100 hígításban (PBS), Molecular Probes, Oregon, USA)
43
7. ábra. Az ABC –BT: biotinilált tiramin jelamplifikációs módszert bemutató sematikus ábra (Füle és Kovalszky 2002) A mintában található jelet (a kimutatni kívánt antigént) specifikus ellenanyaggal reagáltatjuk. Ehhez kötjük a biotinnal jelzett másodlagos ellenanyagot. A következő lépésben avidin.biotin - peroxidáz komplexet adunk a mintához, ekkor az avidin a biotinhoz kötődik. A peroxidáz a következő lépésben alkalmazott hidrogénperoxidot redukálja, a szabad gyökként viselkedő nascens oxigén felszabadulási helyére bekötődik a biotinált tiramin, ami az ABCvel újra amplifikálható. A reakciót végül AEC-vel, a hidrogén-peroxidáz szubsztrátjával tesszük láthatóvá. A tiraminhoz más molekulát kötve (fluoreszcein, digoxigenin) a reakció fluoroszcens kimutatásra is használható.
44
4.4.2.4. A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók morfometriai elemzése A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciókat fénymikroszkóp segítségével vizsgáltuk (200X nagyítás, Olympus BX). Tíz egymást nem fedő random kiválaszott területet értékeltünk
ki.
A
matrilin-2
immunreakciót
rögzítő
digitális
képeknek
az
immunreakciók intenzitására és a pozitív területek meghatározására a Leica QWin programot (Leica Microsystems Imaging Solutions Ltd., Cambridge, UK) használtuk fel. Az immunpozitív területet kijelölve végeztük el a méréseket. A vörös, zöld, kék összetevők alapján állítottuk be a küszöbértéket, amelyet minden metszet esetében állandónak fogadtunk el az összevethetőség érdekében. Az értékelésre kiválasztott területen azokat a reakciókat fogadtuk el pozitívnak, amelyek a küszöbértéket meghaladták. 4.5. Molekuláris biológiai vizsgálatok 4.5.1. Szöveti lézer mikrodisszekció és RNS izolálás patkány májból AAF/PH kezelt és a kontroll normál májakból 10 µm vastag fagyasztott metszeteket készítettünk, acetonban fixáltuk és szobahőmérsékleten szárítottuk majd RN-áz mentes HE-al festettük. A kiválasztott területeket lézer katapult technikával vágtuk ki a metszetekből RNS izolálás és PCR vizsgálat céljából. A célterületek kivágásánál nagyfokú óvatossággal jártunk el az RN-áz mentes környezet megőrzése miatt. A mikrodisszekciót a PALM lézer mikrodisszekciós rendszer segítségével végeztük a II. Belgyógyászati Klinika kutatólaboratóriumában. A kivágott sejteket steril Eppendorf csövek kupakjában gyűjtöttük, 500-1000 ovális sejtet és hepatocitát gyűjtöttünk össze (a PH-t követő 13. napon az AAF/PH-kezelt állatokból) lysis pufferbe (Qiagen). Az RNS izolálást RNeasy Mini Kit-tel (Qiagen) végeztük el, a gyártó utasítása szerint. 4.5.2. RNS-izolálás RNA laterben fixált humán anyagból 13 HCC-t, ugyanennyi környező mintát és 10 normál májat használtunk fel RNS izoláláshoz. Egyenként kb. 20 mg RNA laterben (Sigma) fixált szövetből Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) módszerrel RNS-t izoláltunk (Mannhalter és mtsai
45
2000). Homogenizálás után a szövethomogenizátumot Trizol reagensben inkubáltuk szobahőmérsékleten 15 percig, majd 0,2 ml kloroform hozzáadása után vortexeltük és centrifugáltuk. Ezután a felülúszót, amely az RNS-t tartalmazta, kloroformmal tovább tisztítottuk. Az RNS-t izopropanollal kicsaptuk, vortexeltük és tíz perc állás után újra centrifugáltuk. Ezután leöntöttük a felülúszót és 75 %-os etanollal mostuk, majd centrifugáltuk. Roche RNS tisztító kitből (Roche, 3270289, Indianapolis, USA) származó elúciós pufferben oldottuk az RNS-t, DNázzal emésztettük és tisztítottuk. A kapott pelletnek spektrofotométerrel megmértük az optikai denzitását (O.D.) és az RNS koncentrációját. További felhasználásig a tisztított RNS-t -80°C-on tároltuk. Az RNS-ek integritását 1%-os agaróz gélen történt futtatással ellenőriztük. 4.5.3. cDNS előállítás 1 µg-nyi mennyiségű totál RNS felhasználásával egy RT-PCR reakcióban cDNS-t állítottunk elő. A reakcióhoz random hexamert és M-Mulv reverz transzkriptázt használtunk. A reakcióelegy összetételét a 3. táblázat foglalja össze. 3. táblázat. A cDNS szintézis komponensei Komponensek
Térfogat
A kompnenst gyártó cég
RT Puffer
2 µl
Applied Biosystems, CA, USA
Hexamer
0,5 µl
Applied Biosystems, CA, USA
dNTP mix
0,5 µl
Roche D 8220, Indianapolis, USA
20 U/ µl RN-áz gátló
0,5 µl
Applied Biosystems, CA, USA
1 µl
Applied Biosystems, CA, USA
dH2O
4,5 µl
Eppendorf 0032006159
RNS templát
1 µg
Összesen
10 µl
50U/ µl Reverz Transzkriptáz
A reakció paraméterei: 25°C 10 perc 42°C 50 perc 95°C 5 perc, 4°C
∞
46
4.5.4. Primerek és a PCR körülményei A kísérletek megkezdése előtt a rendelkezésre álló szekvenciák alapján a Primer Expressz 2 program (Applied Biosystems, CA, USA) segítségével megterveztük a lehetőségek szerinti legideálisabb primereket. A tervezésnél figyelembe vettük, hogy bizonyos fehérjéknek több transzkripciós variánsa is létezik; ezeknél olyan primereket használtunk, amely valamennyi variáns expressziójának kimutatására alkalmas. A tervezés eredményei az 4. táblázatban összefoglalt primerek: 4. táblázat. A kísérletek során alkalmazott primerek. Primer neve
Orientáció
Szekvencia (5’-3)
HUMÁN PRIMEREK MATN2
forward
GACGGAAGACGGTGCAAGAA
MATN2
reverse
CCAGTGACAAACTGCTTCACGA
GAPDH
forward
CATGGGTGTGAACCATGAGAAGT
GAPDH
reverse
TGGACTGTGGTCATGAGTCCTT
PATKÁNY PRIMEREK Matn2
forward
AAACTGGACTCTTGTGCTTTGGG
Matn2
reverse
AAACTGGACTCTTGTGCTTTGGG
Gapdh(rat)
forward
TGGAGAAACCTGCCAAGTGTG
Gapdh(rat)
reverse
GAGTGGGAGCTGCTGTTGAAGT
4.5.5. Grádiens PCR A PCR-hez beállítottuk az optimális primer kötődési hőmérsékletet grádiens PCR-rel (Merck, Eppendorf Mastercycler Gradient). A reakcióhoz használt komponenseket az 5. táblázat tartalmazza. Az azonos tartalmú PCR csöveket úgy helyeztük el a készülékben, hogy 53°C és 66°C közötti hőmérsékleten történjen meg a primer kötődés.
47
5. táblázat. A grádiens PCR-hez használt komponensek. Komponensek
Térfogat
A komponenst gyártó cég
10x PCR puffer MgCl2dal
2,5 µl
Roche J 0051
10mM dNTP mix
0,5 µl
Applied Biosystems, D8220
25 µM forward primer (MATN2)
0,5 µl
Csertex
25 µM forward primer (MATN2)
0,5 µl
Csertex
5U/ µl AmpliTaq Gold Enzim
0,5 µl
Roche G0448
dH2O
19,5 µl
Eppendorf 0032006159
cDNS
1 µl
Összesen
25 µl
A reakció paraméterei: kezdeti denaturálás
95°C
denaturálás
95°C.............. 30 másodperc
primer kötődés
53-66°C ....... 30 másodperc
szintézis
72°C ............. 30 másodperc
leállítás
10 perc
4°C………… ∞
Ciklusszám: 35 A következő hőmérsékleteken vizsgáltuk a primerek kötődését: 53, 2°C, 55, 5◦C, 58, 1°C, 60, 8°C, 63, 5°C, 66°C. 4. 5. 6. Agaróz gélelektroforézis A grádiens PCR reakciók során nyert termékeket 2%-os agaróz gélben futtattuk meg (8. ábra). A gélkészítésnél 1 g agarózhoz (GIBCO 15510-019) 50 ml 1x-es TBE puffert adtunk, majd forraltuk és 2, 5 µl etidium-bromidot (BIO-RAD 161 0433) adtunk hozzá. A mintákat (12 µl) mintafelvivő pufferben (Novagen 69180) futtattuk párhuzamosan a DNS létrával (5 µl) (Novagen 70539), 1x TBE pufferben. A futtatás 100 V-on 40 mA áramerősség mellett 20-30 percig történt. Ezután a SYNGENE MultiGenius Bio Imaging rendszerével GeneSnap szoftver felhasználásával lefotóztuk a gélt. Ez alapján a primer legoptimálisabb kötődési hőmérsékletének a 63°C találtuk. A későbbiekben
48
elvégzett
real-time
RT-PCR
reakciókban
ezt
állítottuk
be
primer
kötődési
hőmérsékletként. A továbbiakban ezen a hőmérsékleten végeztük a reakciókat.
1
2
3
4 5
6
L
100 bp
8. ábra. Matrilin-2 grádiens PCR termékek (1 - 53,2 ◦C; 2 - 55, 5◦C; 3 - 58,1◦C; 4 - 60,8 ◦C; 5 - 63,5 ◦C;L - DNS létra)
4.5.7. Real-time RT-PCR A real-time RT-PCR-hez mintánként 12, 5 µl Sybr Green Master Mixet (BIO-RAD 1708882), illetve az általunk megtervezett primerekből 500 nM koncentrációban 0,5-0,5 µl-t és a korábban előállított cDNS-ből 2 µl-t, valamint 9,5 µl desztillált vizet használtuk fel. A reakció paraméterei: Kezdeti denaturálás.............95°C .........2 perc Denaturálás .........................95°C .........20 másodperc Primer kötődés ....................63°C .........30 másodperc Szintézis..............................72°C .........30 másodperc Ciklusszám: 40 A termék homogenitásának ellenőrzése miatt olvadáspont analízist végeztünk el 55 °C 95°C-on (9. ábra), mely a termékek homogenitását és a primer specifikus kötődését is alátámasztotta. A mérések 96-os plate-eken, duplikátumokban történtek a kontroll génekkel párhuzamosan futtatott reakcióban. A PCR termékek méretének ellenőrzésére a reakció termékekből 10 µl-t futtattunk 2%-os agaróz gélen, majd etídium-bromidos festéssel tettük láthatóvá az amplikonokat (9. ábra).
49
A
B
9. ábra. A. Matrilin-2 real-time RT-PCR termékek agaróz gélen. B. A termékek olvadáspont analízise. 4.5.8. Real-time RT-PCR eredmények elemzésének módszere A kapott adatokat a REST (Relative Expression Software Tool) néven ismert relatív kvantifikálásra alkalmas számítógépes program segítségével értékeltük ki. (Pfaffl és mtsai 2002). A vizsgálatokhoz a GAPDH háztartási gént használtuk, ezekhez viszonyítottuk az általunk vizsgált gének expresszióját, az alábbi képletet figyelembe véve.
R=
(E célgén) ▲CPcélgén (Ct kontroll – Ct minta) (E referencia gén) ▲CPreferencia
gén (Ct kontroll – Ct minta)
R= a relatív expresszió;
E = a PCR reakció hatékonysága (azaz a ciklusonként észlelt PCR növekedés szorzója); CP = crossing point, az a ciklusszám, ahol az RNS mennyisége meghaladja a detektálhatóság küszöb (treshold) értékét; t - treshold, küszöbérték: exponenciális fázisban; Ct – treshold ciklus: hányadik ciklusban lépi át az adott minta fluoreszcenciája ezt a szintet – a kiindulási DNS mennyiséggel arányos;
50
Ct
kontroll
– a kontrollnak vett minta treshold ciklus értéke, Ct
minta-
a minta treshold
ciklus értéke. A statisztikai kiértékelést mind az immunhosztokémiai reakciók esetében, mind pedig a real-time RT-PCR eredményeknél a GraphPad Prism 2.01 (GraphPad Software, Inc. San Diego, CA, USA) program segítségével végeztük. A csoportok közötti összehasonlításra a Mann-Whitney U tesztet alkalmaztuk. A különbséget p < 0,05 esetén vettük szignifikánsnak. 4.5.9. HCV vírus detektálása humán májmintákból Nested - PCR módszerrel A módszer két egymást követő PCR lépésből áll, melynek során az első amplifikálás alatt felszaporított nagyobb DNS fragmentről a második lépésben egy kisebb bennfoglalt szakaszt amplifikálunk. A módszer növeli a DNS amplifikáció érzékenységét azáltal, hogy egy nem specifikus DNS amplifikáció is történik a reakció során. Ez azt jelenti, hogy a HCV esetében egy olyan – általánosabb DNS szakaszt felszaporítunk, amely a vírus több típusában is megtalálható. Ehhez két primer párt használunk. Az első amplifikálás során nyert DNS terméket használjuk a második PCR-ben templátként. A második lépésben a felszaporított fragmentről amplifikáljuk a belső, specifikus primerpárok segítségével az adott HCV típusra egyedien jellemző DNS szakaszt (10. ábra).
51
Külső primer pár
Target DNS
Külső primer pár
Az első amplicon
Belső primer pár
Belső primer pár
A target DNS specifikus amplifikációs terméke
10.
ábra. A Nested PCR elvét bemutató sematikus ábra.
Az első lépésben a cDNS szintézist a külső primer pár forward primerével (HCV-8) végeztük el. A használt reakcióelegy és paraméterek a 6. táblázatban vannak feltüntetve. 6. táblázat. HCV- cDNS szintézishez használt komponensek Komponensek RT puffer 5x
Térfogat (µl) 2
A komponenst gyártó cég Boehringer 1465376
HCV-8 primer
0,5
Genset 351330F
10 mM dNTP mix
0,5
Roche D 8220
20 U/ µl RN-áz gátló
0,5
Applied Biosystems, D8220
50 U/ µl Reverz Transzkriptáz
0,5
Boehringer 84106920
H 2O
5
DNS
1
Összesen
10
Eppendorf 0032006159
52
A reakció paraméterei: 25◦C 10 perc, 42◦C 30 perc, 48◦C 10 perc, 95 ◦C 5 perc, 4◦C – on leállítás. A második körben a kapott cDNS-t amplifikáltuk fel a cDNS előállítás során használt reakcióelegyében fölöslegben maradt forward primerrel és a külső reverse (HCV-11) primerrel. A reakcióelegy összetételét a 7. táblázat tartalmazza. 7. táblázat. Az első amplifikációs körben használt reakcióelegy összetétele. Komponensek
Térfogat µl
A komponenst gyártó cég
10x PCR puffer
5
Roche J0051
Taq Gold enzim
0,5
Roche G0448
10 mM dNTP mix
1
Roche D 8220
HCV-11 primer
1
Genset 351332
38,3
Eppendorf 0032006159
dH2O RNS templát
5
Összesen
50 µl
95◦ C
10 perc
denaturáció
95◦ C
30 másodperc
primer kötődés
55◦ C
30 másodperc
DNS szintézis
72◦ C
60 másodperc
Reakció paraméterek: kezdeti denaturáció
4 ◦C
extenzió
4 perc
Az utolsó amplifikációs körben alkalmazott reakcióelegy és primerek a 8. és 9. táblázatban vannak összefoglalva. A reakció paraméterek az előző ampifikációs kör paramétereivel egyeztek meg. A reakciót Perkin Elmer Gene Amp 2400 PCR System készülékkel (Perkin Elmer Cetus, Foster City, CA, USA) végeztük. Pozitív és negatív kontrollokat egyaránt használtunk. A termékeket 2%-os agaróz gélen futtattuk (11. ábra).
53
8. táblázat. A második amplifikációs körben használt reakcióelegy összetevői. Komponensek
Térfogat
A komponenst gyártó cég
10x PCR puffer
5 µl
Roche J0051
Taq Gold enzim
0,5 µl
Roche G0448
10 mM dNTP mix
1 µl
Roche D 8220
HCV-3 primer
1 µl
Genset 351332
HCV-4 primer
1 µl
Genset 351334
38,5 µl
Eppendorf 0032006159
dH2O RNS templát
3 µl
Összesen
50 µl
9.táblázat. A HCV detektálása során használt primerek Primer
Orientáció
Szekvencia (5’-3)
HCV 8
forward
ccatagatcactcccctgtg
HCV 11
reverse
gcacggtctacgagacct
HCV 3
forward
ctgtgaggaactactgtcttcacgcag
HCV 4
reverse
cggttccgcagaccactatg
GI 2764397
lokalizáció
amplikon
13-32
308
321-304 28-54
7669491
141-122
114
100 bp
11. ábra. HCV vírus detektálása humán máj mintákban. Futtatás 2%-os agaróz gélen. +k– pozitív kontroll, -k – negatív kontroll, 903, 951- tumoros májszövet; 904, 952- tumormentes májszövet. L - DNS létra.
54
4.5.10. RNS expresszió detektálása in situ hibridizációval Az in situ hibridizációs technika adott nukleinsav-szekvenciák kimutatására használt molekuláris biológiai módszer. Alapja, hogy az ismert egy szálú szekvencia, esetünkben RNS – egy szakasza és a hozzá tervezett komplementer, jelzett próba adott körülmények között hibridizálni képesek egymással. A 644 bp hosszú patkány matrilin-2 fragmentet RT-PCR-el amplifikáltunk a következő primerekkel (5’ cctaccccaacggcataca 3’), (5’ tgtgtgaacagtggcgaatc 3’). Az amplifikált fragmentnek pBluescript IISK vektorba történt a klónozása. A sense és antisense matrilin-2 riboprobákat digoxigenin-UTP-vel jelöltük (Roche, Mannheim, Germany). 6 µm vastag RN-áz mentesen kezelt paraffinba ágyazott metszetek deparaffinálása 3 x 15 percig xilolban, majd 2x10 percig etanolban történt. Ezt követően a metszeteket RNáz mentesen készített PBS-ben mostuk. Ezután pepszines emésztés következett (10 µl/ml, 37◦C-on, 25 percig 0,2N HCl-ban). A metszeteket 4%-os paraformaldehydben (PBS-ben) posztfixáltuk (jégen 10 percig) és 0,25 %-os ecetsavanhidriddel acetiláltuk. A metszetekre prehibridizáló oldatot tettünk és hibridizálás előtt denaturáltuk a ribopróbákkal együtt (94◦C- 4 perc). A prehibridizáló oldatot kicseréltük az ugyanilyen összetételű, de jelzett próbát is tartalmazó hibridizáló elegyre, amit 53◦C-on történő inkubálás követett 12-16 órán át. Negatív kontrollként párhuzamos metszeteken az antiszenz RNS próba helyett szenz próbát hibridizáltunk. A hibridizációt mosások követték: 20 percig a hibridizációs hőmérsékleten 2x nátrium-citrate/klorid pufferben (SSC); majd 20µg/ml RNA-ázzal kezeltük TNE pufferben 30 percig (10 mM Tris- HCl, pH 7,05; 0,5 M NaCl, 1mM EDTA, 37 ◦C –on), majd tovább mostuk 50 ◦C-on 2x SSC 0.01%, Triton X-100 és 0.1x SSC, 0.01% TritonX-100, 5mM EDTA oldatokban 20-20 percig. A
reakció
detektálása
anti-digoxygenin-
alkalikus-foszfatáz-
IgG-Fab-ellenes
fragmenttel történt (Roche). Az endogén alkalikus-foszfatáz enzimaktivítást 1 perces 20%-os ecetsavval történő kezeléssel blokkoltuk. Az alkalikus-foszfatáz reakció detektálását NTB (nitro-tetrazolium-blue chloride) (Sigma) és BCIP (5-bromo-4-chloro3-indolyl-phosphate) (Sigma) elegyével végeztük. A metszeteket Kaiser- féle glicerinzselatinnal fedtük le.
55
4.5.11. Fehérje izolálás A humán és patkány mintákból a Western blothoz fehérjét izoláltunk. 4.5.11.1. Patkány májakból A fehérje kinyeréshez használt izoláló puffer (0. 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM EDTA (pH 7.4), proteáz inhibitorok: 2 mM phenylmethylsulfonyl fluorid, 2mM N– ethylmaleimid, 0.1 M ε-amino-kapronsav, 15 mM benzamidin és 1660 egység GORDOX (aprotinin)) 1 ml-éhez 100 mg szövetmintát adtunk és Turrax homogenizátorral végeztük el a szövetek homogenizálást. A homogenizálás után a mintákat 15 percig 4◦C-on 8000 rpm-en centrifugáltuk, majd a pelletet ugyanilyen összetételű homogenizáló oldatban szuszpendáltuk és 4M-os ureával történt kezelés után a mintákat 30 percig jégen extraháltuk. Az így kapott elegyet ismét 8000 rpm-en 15 perig centrifugáltuk 4◦C-on. A kapott felülúszót használtuk a fehérjék további vizsgálatához. Felhasználás előtt meghatároztuk az íly módon kapott fehérje oldatok koncentrációját. 4.5.11.2. Humán májakból
A humán minták esetében használt izoláló puffer összetétele eltért a patkány minták esetében használtaktól (a patkány májmintáknál az intenzívebb proteáz gátlás miatt többféle proteázgátlót is használtunk). Ebben az esetben az izoláló puffer összetétele a következő volt: 50 mM/l Tris-HCl (pH 7,6), 100 mM NaCl, 10 mM EDTA, 2 mM Nethylmaleimid és 2mM phenylmethylsulfonyl fluorid. A kapott homogenizátumot 8000 rpm-en 15 percig centrifugáltuk, majd a felülúszót összegyűjtöttük
és
a
fehérjekoncentráció
mérése
után
SDS-poliakrilamid
gélelektroforézisnek vetettük alá. A fehérje koncentrácót minden esetben a Qubit Fluorimeterrel (Molecular Probes) mértük a Quanti-iTM Protein Assay Kit (Molecular Probes, Q33212) leírásának megfelelően.
56
4.5.12. SDS-poliakrilamid gélelektroforézis
Az izolált fehérjék szeparálása SDS-poliakrilamid (SDS-PAGE) gélelektroforézissel történt nem redukáló körülmények között. Minden mintából 40 µg fehérjét futtattunk azonos térfogatban. A minták kihígítása és gélre történő felvitele mintapufferben (0,5 M/l Tris-HCl, (pH 6.8), 10% (v/v) glycerol, (0,5 v/v) bromophenol kék) történt. A patkány mintákat 4-8 %-os grádiens gélen, a humán mintákat pedig 4-12%-os grádiens gélen futtattuk előrefestett molekulasúly markerekkel párhuzamosan (Amersham Pharmacia Biotech, Little Chalfont, United Kingdom és PageRulerTM Prestained Protein Ledder, Fermentas). A futtatást először 80 V-on 10 percig, majd 60 V feszültségen kb. 1 órán át végeztük, BIORAD PowerPac készülékkel. Futtató pufferként 10 x-es Tris/Glicin/SDS puffert (BIORAD, 161-0732) használtunk tízszeresére hígítva. Minden esetben ugyanabból a mintasorozatból párhuzamosan két-két gélt futtattunk. Elektroforézis után az egyik gélt Commassi-kék (BIORAD) fehérje markerrel festettük meg 30 percig. Majd a fehérjék láthatóvá tétele végett a megfestett gélt differenciáltuk 5% metanolt és 7,5% ecetsavat tartalmazó oldattal. Ez abból a célból történt, hogy ellenőrizzük a fehérjék futását és szeparálódását a gélben. A másik gélt blottoláshoz használtuk. 4.5.13. Western blot A futtatás után nitrocellulóz membránra (Protran, Schleicher and Schuell, BIORAD, CA) blottoltuk a fehérjét, amely 4°C-on, 10 percig 60 V-on, majd 50 percig 80 V -on történt. A blottolás után a membránt desztillált vízzel mostuk, majd Ponceau festéssel ellenőriztük, hogy a fehérjék transzferje megtörtént-e. A festék membránból történő eltávolításához NaOH-t használtunk, majd mostuk TBS-sel. A filtert ezután egész éjszakán keresztül blokkoltuk a nem specifikus kötődés megakadályozása miatt. A blokkoló oldat 5%-os zsírmentes tejpor volt TBS-ben oldva (pH = 7,6). A filtert ezután nyúl anti-matrilin-2 antitesttel (1: 500 hígítva a blokkoló pufferben) 1 éjszakán keresztül inkubáltuk 4◦C-on. TBS-Tweennel történő alapos mosás után a membránt ezen antitest ellen termelt, peroxidáz-konjugált kecske anti-nyúl IgG ellenanyaggal 1: 1000 hígítva
57
ugyancsak a blokkoló oldatban inkubáltuk 1 órán át, végül a jelet erősített kemilumineszcenciával (ECL, Amersham Pharmacia Biotech) mutattuk ki.
58
5. EREDMÉNYEK 5.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata patkány májban immunhisztokémiával 5.1.1. Matrilin-2 vizsgálata immunhisztokémiával normál patkány májban Normál, kezeletlen patkány májban immunhisztokémiai reakcióval a matrilin-2 a portális térben, az erek és az epeutak BM-ban, valamint az azt körülvevő kötőszöveti rétegben volt kimutatható (12. ábra). Az ereket erős pozitivitás jellemezte, míg az epeutak BM-ja nem mutatott intenzív reakciót, helyenként az epeúti pozitivitás igen gyenge vagy fragmentált volt. A májparenchymában a szinuszoidok mentén nem volt matrilin-2 expresszió. A centrális vénákban sem detektáltunk matrilin-2-t.
A
B
PT PT
12. ábra. A, B. Matrilin-2 immunreakció normál patkány májban. Pozitív reakció detektálható a portális tér (PT) ereiben (nyíl), az epeutakat körülvevő kötőszövetben (nyíl). Nagyítás: A. 200x; B. 600x.
59
5.1.2. Matrilin-2 immunhisztokémiai kimutatása májregenerációban
A
matrilin-2
expressziójában
bekövetkező
változásokat
először
a
parciális
hepatectomiát (PH) követően vizsgáltuk F-344 patkány májban. Mint arról már az irodalmi áttekintésben szó esett, ilyenkor a májtömeg pótlása döntően a hepatociták osztódása réven történik. A hepatociták DNS szintézisének csúcsa patkányban jól reprodukálhatóan 24 órával a műtét után van, amit a nem parenchymális sejtek osztódása 24-48 óra múlva követ. Ennek alapján a parciális hepatectomiával kezelt patkányokból immunhisztokémiai vizsgálatokhoz a mintákat a PH-t követően a 24., 48. és a 72.-ik órában leölt állatokból nyertük. Mindhárom időpontban az immunreakció hasonló pozitivitást mutatott mind a lokalizáció mind pedig az intenzitás tekintetében. Immunhisztokémiával
a
különböző
időpontokban
vett
mintákból
nem
volt
fénymikroszkóppal látható eltérés. A PH utáni metszeteken végzett immunreakciót összehasonlítva
a kezeletlen normál májakból nyert mintákkal a reakció jelentős
hasonlóságot mutatott: a matrilin-2 hasonló lokalizációját figyelhettük meg mint a normál májakban, azaz minden esetben detektálható volt a matrilin-2 jelenléte a portális térben (13. ábra). Az epeutak és az erek BM-jában is láttunk hasonlóan gyengén pozitív reakciót, itt az epeutak BM-jában detektálható pozitív reakció sokkal egyértelműbb volt mint a kezeletlen májakban. Míg a máj szinuszoidjaiban és a centrális vénákban ezekben az esetekben sem volt immunhisztokémi módszerrel kimutatható matrilin-2 fehérjeexpresszió.
60
A
B
PT PT
C
D
PT PT
13.
ábra.
Matrilin-2
fehérje
immunhisztokémiai
detektálása
parciális
hepatectomiával kezelt patkány májakon, PT-portális tér. A nyíl a pozitív reakciót jelzi. A. 24 órával a PH után, B. 48 órával a PH után, C, D. 72 órával a PH után. Nagyítás: A, B, C 200x; D 600x. A következő lépésben a matrilin-2 fehérje expresszióját immunhisztokémiával az ovális sejtek
részvételével
történő
májregenerációban
vizsgáltuk.
Az
ovális
sejtek
proliferációját AAF/PH kezeléssel értük el az „Anyag és módszer” fejezetben leírtaknak megfelelően. Az AAF/PH kísérleti rendszerben történő májregenerációt a 14. ábra mutatja be.
61
Alacsony dózisú AAF
3-4 nap
Norm máj
5-6 nap
Magas dózisú AAF
8-10 nap
11-13 nap
14. Ábra. Az AAF/PH kísérleti rendszerben lezajló májregenerációt bemutató sematikus ábra. Alacsony dózisú modell: az ovális sejt duktuszok a májlebenybe penetrálnak és szimultán „kis hepatocitákká” differenciálódnak. Magas-dózisú modell: Az ovális sejtek mélyen a májparenchymába hatolnak és csak jelentéktelen mértékben változnak. A differenciálódó sejtek fókuszokat képezve tekervényes és elágazó duktuszokba rendezőnek. A napok száma a parciális hepatectomia után eltelt időt jelenti (Paku és mtsai 2004). Kísérleteinkhez a magas – dózisú modellt használtuk. Az ovális sejtek a PH utáni 5. napon jelentek meg először, számuk ezután a napok múlásával progresszíven növekedett. A mintavétel az AAF/PH kezelés során a PH-t követően a 9., 11., és 13. napokon történt. A különböző időpontokban történt mintavételt abból a célból végeztük, hogy meghatározzuk azt az időpontot, amikor az ovalis sejt proliferáció a legintenzívebb. Az AAF/PH kezelést követően az ovális sejtek proliferációja és a duktuláris reakció legintenzívebben a parciális hepatectomiát követően a 13. napon volt detektálható (15., 16. ábra).
62
A
B
15. ábra. HE festés AAF/PH kezelést követő regenerálódó patkány máj metszeten. A. Ovális sejt proliferációban gazdag portális tér (nyilak), 200 x; B. Ovális sejtek (nyilak), 600x Az ovális sejtek detektálása specifikus OV-6 antitesttel is megtörtént fagyasztott metszeteken. OV-6-al egyértelműen azonosíthatóak az ovális sejt proliferációban gazdag portális terek és a májparenchymába mélyen behatoló “ovális sejt képezte duktuszok”, az ún. „ovális sejt lécek” (16. ábra). BB
A
* * 16.
ábra.
Hepatikus
ovális
sejtek
detektálása
OV-6
antitesttel
(zöld),
immunfluoreszcenciával AAF/PH kezelt patkány májakon. A. Erős pozitív reakció a portális terekben (nyíl), 200x; B. Ovális sejt lécek (*), 400x. A kék festődés a magokat jelzi.
63
A matrilin-2 fehérje kifejeződése ez esetben erősen követte az OV-6 festődést. A normál és PH- kezelt májakhoz hasonlóan az AAF/PH regenerációs modellben is pozitív reakció jellemezte a portális tereket, amelynek intenzitása sokkal erősebb volt, mint a hepatociták osztódásával történő májregeneráció során és a normál májban. Továbbá matrilin-2 reakció volt megfigyelhető a szinuszoidok egy részében (a lebenyek külső 2/3-ban) és az ovális sejt képződményekben, a duktuszokban. Míg a májparenchyma centrális zónájában - amelyik területen ovális sejtek nem jelentek meg – a matrilin-2 expressziója nem volt kimutatható (17. ábra).
B
A
CV
C
D
PT
17. ábra. A matrilin-2 immunhisztokémiai detektálása AAF/PH kezelt patkány májakon. A. Erős pozitivitás látható a periportális területen, a proliferáló ovális sejtek területén, a portális térben és a szinuszoidok külső 2/3-ában, 100x. B. Nincs pozitív
reakció
a
centrális
vénában
(CV)
és
a
centrolobuláris
régió
szinuszoidjaiban, 200x. C. Erős matrilin-2 expresszió detektálása a portális térben (PT), 400x, AEC. D. Negatív kontroll, 100x. A nyilak a pozitív reakciót jelzik.
64
Abból a célból, hogy megvizsgáljuk a matrilin-2 expresszója hogyan követi a laminin expresszióját, párhuzamos metszeteken minden esetben laminin immunreakciót is végeztünk. A laminin expressziójának változását már előző kísérletekben leírták (Paku és mtsai 2004). Ezen eredmények alapján feltételezhettük, hogy a matrilin-2 expressziója hasonló mintázatot mutat, mint a lamininé. Megfigyelhető volt a laminin és a matrilin-2 koexpressziója (18. ábra).
A
B CV
D 18. Ábra. Laminin immunhisztokémiai detektálása AAF/PH kezelt patkány májakon, paraffinba ágyazott metszeten. A. Erős pozitivitás látható a periportális (nyilak) területen, a proliferáló ovális sejtek területén, a portális térben és a lebenyke külső 2/3-ának a szinuszoidjaiban, 100x. B. Nincs pozitív reakció a centrális vénában (CV, nyíl) és centrális szinuszoidokban, 200x, AEC.
65
5.2. Matrilin-2 fehérje expresszió detektálása AAF/PH kezelést követően Western blot technikával Azonos mennyiségű normál patkány, PH kezelt és AAF/PH kezelt patkány májszövet homogenizátumot 4-8%-os poliakrilamid gélen futtatva igen jelentős eltéréseket találtunk az AAF/PH kezelt májakban a normál májak matrilin-2 fehérje expressziójához képest. Jelentős mennyiségű matrilin-2 volt detektálható az AAF/PH kezelt májakban, míg a normál májakban illetve a PH-kezelt patkány májakban a fehérje igen jelentéktelen mennyiségben volt jelen, vagy egyáltalán nem volt kimutatható.
A
B
19. ábra. Matrilin-2 fehérje expresszió detektálása Western blot technikával. PH kezelt máj (p), AAF/PH kezelt máj (a), kontroll máj homogenizátum (c), uterus, pozitív kontroll (u); A. A gél Commassie-kékkel festett fehérjeképe. B. A párhuzamos minták immunoblotja. A matrilin-2 monomer ~ 100kDa-nál detektálható. A máj homogenizátum Commassie-val visszafestett fehérjeképén jól látható, hogy a különböző mintákból azonos mennyiségű fehérjét vittünk fel (19.A.ábra). Több próbálkozás után a patkány májmintákból a detektált jel mindegyik mintában megközelítőleg 100 kDa-nál volt látható, ez jól megegyezik a matrilin-2 monomer
66
molsúlyával. Pozitív kontrollként a matrilin-2 fehérjében igen gazdag uterusból nyert fehérje kivonatot használtuk. Ezzel többek közt az is volt a célunk, hogy ellenőrizzük az általunk használt antitest specificitását, valamint azt, hogy a szérum felismeri-e a redukálatlan uterus mintákban már régebben kimutatott oligomereket is (Piecha és mtsai 1999). A matrilin-2 sok más fehérjéhez hasonlóan, amelyekben van von Willebrand Faktor modul, tartalmaz egy úgynevezett MIDAS motívumot (Metal Ion Dependent Adhesion Site, fémionfüggő adhéziós hely), amely - nevéből adódóan - fémion kötésre képes, és ezen keresztül más fehérjékhez kapcsolódhat. Ez a kölcsönhatás megszüntethető volt azzal, hogy EDTA-t adtunk az extrakciós pufferbe. Az ureát tartalmazó oldattal pedig megszüntettük az ionos kölcsönhatások nagy részét, illetve az úgynevezett gyenge kölcsönhatásokat. Az ábrán jól látható, hogy az uterus szövetkivonatból futtatott mintában a fő csík elektroforetikus mobilitása a patkány mintákban található monomerrel azonosan fut. Az uterus mintában látható, hogy a fehérjének több formája is létezik (a proteolízis megakadályozására proteázgátlót, fenil-metil-szulfonil-fluoridot raktunk a pufferekbe, ezért a csíkok nem lehetnek a vizsgálat során esetlegesen képződő fehérje-degradáció melléktermékei). Az uterus kivonatban megjelenő többféle matrilin-2 oligomer molsúlya megfelel a más szerzők által már azonosított méreteknek (Piecha és mtsai 2002; Korpos és mtsai 2005). Azonban a fehérjének ezeket a formáit a patkány májban többszöri próbálkozás után és intenzív proteáz gátlás mellett sem sikerült azonosítani. Azt hogy az oligomerek hiánya egy intenzív proteolitikus emésztés eredménye a májban, vagy más folyamatok játszanak szerepet ebben a jelenségben, nem tudjuk. A kísérletet AAF/PH kezelt májakon több egymást követő napon vett mintákból is megismételtük (9., 11., 13., napokon) Pozitív kontrollként ez esetben patkány vesét használtunk (20. ábra).
67
20. ábra. Matrilin-2 fehérje expresszió detektálása Western blot technikával. 1, 2, 3 normál májak; 4, 5, 6 - AAF/PH kezelt minták a PH-t követő 9, 11, és 13. napon vett mintákból, 7- pozitív kontroll, vese. A matrilin-2 monomer csík ~ 100kDa-nál detektálható. NK-negatív kontroll, az elsődleges antitest helyett blokkoló pufferrel inkubáltuk. A Western blottal az eltérő napokon vett mintákból nem volt kimutatható eltérés a matrilin-2 fehérje mennyiségében. A Western blottal nyert eredmények alátámasztották az immunhisztokémiával nyert eredményeket: a matrilin-2 fehérje nagy mennyiségben detektálható az ovális sejtek proliferációjával történő májregeneráció során, míg a normál májban és a hepatociták részvételével történő májregenerációban nem, vagy csak alig mutatható ki. 5. 3. Matrilin-2-t termelő sejtek detektálása májregenerációban
A fehérjeexpresszió vizsgálatára irányuló kísérleteink azt sugallták, hogy az AAF/PH májregenerációs modellben az ovális sejtek proliferációval történő regeneráció során sokkal kifejezettebb a matrilin-2 fehérje expresszió, mint a hepatociták regenerációja
68
során a PH modellben illetve a normál kezeletlen májakban. Ennek alapján az volt a célunk, hogy megvizsgáljuk milyen sejtek termelhetik a megemelkedett matrilin-2 fehérjét a májregeneráció során, és megvizsgáljuk, hogy van-e kimutathtaó eltérés mRNS expressziós szinten a matrilin-2 termelésében a normál májban, és az AAF/PH kezelt májakban. Mivel a PH-kezelt májak a normál májhoz hasonlóan viselkedtek a Western blot analízis során, így ezzel a csoporttal mRNS szinten nem foglalkoztunk. A matrilin-2 fehérjét termelő sejtek azonosítását nem radioaktív in situ hibridizációval végeztük és a reakciót alkalikus foszfatáz-rendszerrel detektáltuk. Az in situ hibridizációs kísérletek alapján az intenzíven pozitív jelnek értékelhető indigókék reakciót csak az ovális sejtek citoplazmájában láttunk, míg az érett hepatociták nem mutattak pozitivitást (21. ábra). Ennek alapján úgy tűnik, hogy az ovális sejtek termelik és szekretálják a matrilin-2-t az őket burkoló BM-ba, amely a proliferáció során képződő „ovális-sejt léceket” veszi körül. Feltételezhető, hogy a matrilin-2-nek fontos szerepe lehet az ovális sejtek indukálta májregenerációban. Az in situ hibridizáció során kapott eredmény az immunhisztokémia és Western blot eredményeinket
is
alátámasztja.
A
B
PT PT
*
21. ábra. A, B. Matrilin-2 mRNS detektálása ovális sejtekben in situ hibridizációval. A periportális területen jól láthatók az indigókék reakciót mutató ovális sejt duktuszok (nyíl), PT-portális traktus. A 200x; B 400x.
69
5.4. Matrilin-2 expresszió vizsgálata real-time RT-PCR analízissel
Annak igazolására, hogy a matrilin-2-t valóban az ovális sejtek termelik a SE II. Belgyógyászati Klinika Kutatólaboratóriumában (dr Molnár Béla vezetésével) ovális sejteket és hepatocitákat disszekáltunk lézer mikrodisszekcióval. Az ovális sejteket az AAF/PH kezelést követően a 13. napon vett májmintákból disszekáltuk. Az ún. „régi” hepatocitákat normál kezeletlen patkány májból izoláltuk, illetve az „új” hepatocitákat a PH műtétet követő regeneráció során képződött érett hepatocitákból nyertük. 3-3 párhuzamos mintával végeztük el a kísérletet. A real-time RT-PCR-el kapott adatok alapján egyik hepatocita frakcióban sem volt detektálható a matrilin-2 expressziója mRNS szinten (a matrilin-2 mRNS a 40. ciklusnál sem volt detektálható). mRNS expressziót csak az ovális sejtekben detektáltunk. A mikrodisszekció az ovális sejtekben gazdagon proliferáló periportális területről történt. A sejtek eredetét AFP (ovális -sejt marker) expresszió detektálásával igazoltuk. A PCR reakció eredménye is az in situ hibridizációval nyert eredményeket támasztja alá, miszerint detektáható matrilin-2 mRNS expresszió csak az ovális sejtekben volt.
100 bp
22. ábra. Az RT-PCR reakció termékek futtatása 2%-os agaróz gélen. Matrilin-2 (Matn2) mRNS detektálható az ovális sejtekben (1), nincs matrilin-2 PCR termék a „régi hepatocitákban”(2) és az „új hepatocitákban”. (3). A GAPDH (1, 2, 3) belső kontrollként szerepelt. L – 100 bp DNS létra.
70
5. 5. Matrilin-2 expresszió vizsgálata humán májban 5.5.1. Matrilin-2 fehérje expresszió vizsgálata ép és cirrhotikus humán májszövetben immunhisztokémiai módszerrel
35 sebészileg rezekált tumormintából és azok megfelelő környező szövetéből nyert, formalinban fixált, paraffinba ágyazott metszeteken végeztük el az „Anyagok és módszerek” fejezetben leírtaknak megfelelően az immunhisztokémiai reakciókat. Minden általunk vizsgálatra kiválasztott normál máj HE metszetén a máj szerkezetére jellemző normál méretű portális tér, fibrosismentes szerkezet volt látható. A normál májban (23. ábra) illetve a tumor melletti nem cirrhotikus májszövetben a matrilin-2 csak a portális térben, az erek és az epeutak BM-jában mutatott erősen pozitív reakciót. Nem volt azonban kimutatható matrilin-2 fehérje expresszió sem a centrális vénák körül, sem pedig a szinuszoidokban és hepatocitákban sem. Ezek az eredmények megegyeznek
a
patkány
normál
májmintákban
kapott
immunhisztokémiai
eredményekkel. A
B PT
PT
23. ábra. A, B. Matrilin-2 immunhisztokémiai reakció normál májban. A matrilin2 festődés jól látható a portális erekben (nyíl) és az epeutakat körülvéve (nyílhegy). A szinuszoidokban nem látható pozitív reakció. A 200x, B 600x, AEC. A HCC-k, melyekből a mintavétel történt, 42, 8 %-a cirrhotikus talajon alakult ki. A tumor környéki cirrhotikus májszövetben a matrilin-2 expressszió fokozott mértékben
71
volt jelen a cirrhotikus nodulusok széli részén, a szinuszoidok mentén. Különösen erős pozitív reakciót észleltünk a cirrhosisra jellemző kötőszöveti sövényekben, az itt előforduló erekben és a proliferáló epeutak BM zónájában (24. ábra).
A
B
C
D
24. ábra. A. Negatív matrilin-2 immunfestés a tumor melletti nem cirrhotikus szövet
acinusaiban,
pozitivitás
csak
a
tumor-máj
határ
kötőszövetében
detektálható, elsősorban az erekben (nyíl) 400x. B. Intenzív matrilin-2 pozitív reakció a tumor melletti cirrhotikus szövetben, az erekben és a májszinuszoidok mentén (nyilak), 200x. C. Intenzív matrilin-2 reakció a cirrhotikus kötőszöveti sövényekben (nyíl), 100x; D. Matrilin-2 reakció cirrhotikus szinuszoidokban (nyilak) 600x, AEC. 5.5.2. Matrilin-2 fehérje expressziójának vizsgálata hepatocelluláris carcinomában
Az általunk vizsgált, morfológiailag jól differenciált tumorok (G1, grade1) trabekuláris növekedési mintázatot mutattak. A tumorsejtekre jellemző volt a pleiomorfizmus eltérő, bár viszonylag enyhe foka. A kevésbé differencált (G2, grade 2) tumorokban a
72
daganatsejtekre az acináris, tubulo-acináris szerkezet volt jellemző. Mindegyik szövetminta
tartalmazott
ép
vagy
cirrhotikus
peritumorális
májszövetet
összehasonlításként. A 35 vizsgált esetből 15 eset cirrhotikus talajon kialakult HCC volt. A további 20 esetben a tumort környező szövet ép volt vagy enyhe fibrosis jellemezte. Nodulusok képződése, duktuláris reakció nem volt megfigyelhető ezekben az esetekben. Az immunhisztokémiával detektált matrilin-2 megjelenési mintázata a HCC-ben jelentősen eltért a normál májszövetéhez képest. Igen intenzív matrilin-2 fehérje expresszió volt megfigyelhető az újonnan képződő az erek BM zónájában, a tumor neovaszkulatúra mentén. A tumorok differenciáltsági fok szerint nem mutattak eltérést. A makrotrabekuláris egységekben azonban nem jelent meg matrilin-2 a tumor sejteket kísérve, hasonlóan a normális máj trabekuláihoz. A
B
** *
*
25. ábra. Matrilin-2 lokalizációja jól és gyengén differenciált tumorokban (nyíl). A. Heterogén tumor, (*) jól differenciált (G1), (**) mérsékelten (G2) differenciált területek a HCC-ben. A jól differenciált tumorsejtek trabekuláit matrilin-2 expresszió kíséri (nyíl), a rosszabbul differenciált területeken a nagyobb tumorsejt csoportokon belül, az egyes sejtek környezetében nincs matrilin-2 expresszió, 200x. B.
Rosszul
differenciált
tumorban
matrilin-2
expresszió
csak
a
neovaszkulatúrának megfelelően detektálható (G3), 200x. A matrilin-2 neovaszkuláris BM-ban történő lokalizációjának a megerősítése végett elemeztük a CD34, mint endothel markert ezeken a tumor mintákon. A CD34 lokalizációban nagy mértékű hasonlóságot mutatott a matrilin-2 expressziójával a HCCben (26. ábra)
73
A
B
26. ábra. Immunhisztokémiai reakció trabekuláris (G1) HCC-ben. (A) Matrilin-2, AEC. (B) CD34 (DAB), 200x. A nyilak a pozitív reakciót jelzik. 5.5.3. A laminin és matrilin-2 kolokalizációjának vizsgálata humán májszövetben Az irodalmi leírásoknak megfelelően a matrilin-2 különböző struktúrák BM-jában lokalizálódik és több helyen is kolokalizációt mutatott a lamininnal, például bőrben (Piecha és mtsai 1999, 2002 a, b). Ezért fontosnak tartottuk, hogy megvizsgáljuk, hogyan viszonyul a matrilin-2 és a laminin lokalizációja egymáshoz normál májban, cirrhotikus májban, valamint hepatocelluláris carcinomában. A 27. ábra a laminin immunhisztokémiai reakcióját mutatja be cirrhotikus májban. A párhuzamos metszeteken jól látható, hogy a matrilin-2 és a laminin egyes részeken kolokalizálódik.
A
részleges
kolokalizációt
immunfluoreszcenciával is igazoltuk.
74
paraffinos
metszeten
kettős
A
B
C
D
27. ábra. Immunhisztokémiai reakció paraffinba ágyazott metszeten. Matrilin-2 (A) és laminin (B) expresszió cirrhotikus nodulusban, 200 x, AEC. C. Laminin és matrilin kettős immunfloureszcencia (C, D). Zöld-matrilin-2, piros-laminin; sárgakolokalizáció, C 200x, D 400x. 5.5.4.
Matrilin-2
immunhisztokémiai
reakciók
morfometriai
elemzése
és
statisztikai analízise Az immunhisztokémiai reakciók morfometriai értékelése során a matrilin-2 pozitív területek eloszlására százalékos arányban a következő eredményeket kaptuk: 0,57 % a normál májakra, 0,59 % a környező nem cirrhotikus májakra, 3,97 % a cirrhotikus környező májakra, 4,26 % a cirrhotikus talajon képződött HCC-re és 3,03 % a nem cirrhotikus talajon képződött HCC-re vonatkoztatva. Ezek alapján azt mondhatjuk, hogy szignifikánsan több matrilin-2 fehérje volt detektálható a HCC-ben és a cirrhotikus májakban, mint a nem cirrhotikus környező májakban és az ép szövetekben ( p< 0.0001) (28. ábra). A cirrhotikus talajon kialakult HCC-k és a nem cirrhotikus talajon képződött
75
HCC-k matrilin-2 fehérje expressziója között nem volt szignifikáns eltérés. Továbbá, a jól – és közepesen differenciált tumorok sem mutattak szignifikáns eltérést a fehérje expressziójában
a
rosszul
differenciált
tumorokhoz
képest.
A
tumorok
differenciáltságának megfelelően az immunpozitív területek százalékos eloszlására a következő értékeket kaptuk 3, 78 % G1, 4,62% G2 , 4,33 % a G3 HCC-re ( 29. ábra).
28. ábra. A matrilin-2 immunhisztokémiai reakciók során mért intenzitások összehasonlítása normál májban, cirrhotikus májban és HCC-ben. NORM = normál máj; NCIRRH = környező nem-tumoros, nem cirrhotikus májszövet; CIRRH = környező nem tumoros, cirrhotikus máj; HCC (ncirrh) = nem cirrhotikus talajon kifejlődött HCC; HCC (cirrh) = cirrhotikus talajon létrejött HCC. A * a csoportok közötti szignifikáns eltérést jelöli. Az immunhisztokémiai reakciók analízise a Leica Qwin Pro programmal történt, az adatokat a GrapPad Prism 2.01 programmal értékeltük ki.
76
29. ábra. Különböző differenciáltsági fokú tumorok matrilin-2 immunhisztokémiai reakcióinak összehasonlítása (G1= grade 1, jól differenciált, G2 = grade 2, közepesen differenciált, G3 = grade 3, rosszul differenciált tumor). Az immunhisztokémiai reakciók analízise a Leica Qwin Pro programmal történt, az adatokat a GraphPad Prism 2.01 programmal értékeltük ki. 5.5.5. Matrilin-2 fehérjeexpresszió vizsgálata Western blot technikával humán májakon Azonos mennyiségű normál májból, cirrhosis talaján létrejött HCC-ből, nem cirrhotikus HCC-ből és ezeknek megfelelő nem tumoros környezetből nyert fehérje kivonatot futtattunk 4-12%-os SDS poliakrilamid grádiens gélen, majd blottoltuk az „ Anyag és módszer” fejezetben leírtaknak megfelelően. A Western blot detektálás eredménye megerősítette a patkány májban nyert eredményeinket. A pozitív jelet minden mintában kb 95 kDa – nál észleltük. Ez a mobilitás és a molekulatömeg megfelel a már leírt matrilin-2 monomernek (~100 kDa). Hasonló eredményre jutottunk a patkány májak esetében is. A humán májak futtatásánál pozitív
kontrollként
matrilin-2-ben
igen
77
gazdag
humán
veséből
származó
fehérjekivonatot használtunk (30. ábra). Az ábrán jól látható, hogy a matrilin-2 fehérjére jellemző nagyobb molekulasúlyú oligomer frakció is jelen volt a humán májakban. A patkány májakban, ezt nem tapasztaltuk, ott csak a matrilin-2 monomert tudtuk detektálni. Noha ez esetben is ez az oligomer frakció a monomer frakcióhoz képest elenyésző intenzitású volt és az immunoblot képen alig látható. Megfigyelhető, hogy a normál humán májban és a tumoros májakban az általunk alkalmazott módszerrel hasonló intenzitású és azonos mennyiségű matrilin-2 fehérje volt detektálható.
30. ábra. Humán májminták matrilin-2 protein tartalmának összehasonlítása immunoblot analízis során nyert eredmények alapján. N – normál májból származó minta; 1 – nem cirrhotikus talajon kialakult HCC-ből származó minta; 2-cirrhotikus talajon létrejött HCC minta; 3 – nem cirrotikus, nem tumoros környező szövet; 4 – cirrhotikus környező szövet, C- pozitív kontroll, humán vese.
5.5.6. Matrilin-2 mRNS expressziójának real-time RT-PCR analízise humán májmintákon A matrilin-2 mRNS expressziót az eddigiekhez hasonlóan humán májmintákban is realtime RT-PCR módszerrel vizsgáltuk. Olvadáspont analízissel, illetve 2%-os agaróz gélen történt futtatással ellenőriztük a termékeket.
78
Amint azt már az „Anyagok és módszer” fejezetben írtam, a real-time RT- PCR-rel kapott adatokat egy relatív kvantifikációra alkalmas program segítségével értékeltük ki. Ebben a programban az általunk választott GAPDH kontrollgén Ct értékeit a referencia gén adatainak fenntartott helyre illesztettük be és a kiértékelésnél minden esetben két csoportot hasonlítottunk össze egymással. A 11. táblázatban a kontroll csoport elnevezés arra a mintacsoportra vonatkozik, amelyikhez a másik csoportot hasonlítottuk. (Így például a 11. táblázat 1. sora azt mutatja meg, hogy a cirrhotikus talajon létrejött HCC-ben a matrilin-2 mRNS expressziója hányszorosára változott a normál minták esetén tapasztalt értékekhez képest). A 11. táblázat összefoglalja a real-time RT-PCR eredményeit valamennyi általunk vizsgált csoportra vonatkoztatva. Ezek az adatok azt mutatják, hogy az egyes csoportokban jelentősebb, szignifikánsnak mondható mRNS expressziós eltérés a normál májakhoz képest nem volt detektálható (31. ábra). Összehasonlítottuk a HCV vírussal fertőzött környező cirrhotikus májak matrilin-2 expresszióját a nem fertőzött környező cirrhotikus májak matrilin-2 expressziójával. A két csoport között csak jelentéktelen, szignifikánsnak nem mondható eltérést detektáltunk. A HCV-vel nem fertőzött cirrhotikus májakban a matrilin-2 expressziója alacsonyabb volt a HCV-vel fertőzött májakhoz képest. 11. táblázat. A matrilin-2 mRNS relatív expressziója real-time RT-PCR-el detektált Ct értékek alapján. MINTA
KONTROLL
MATRILIN-2 RELATÍV
CSOPORT
CSOPORT
EXPRESSZIÓ
NORM
CIRRH(HCC)
U 1,21
NS
p= 0,756
NORM
NCIRRH(HCC)
U 1,39
NS
p= 0,245
NORM
HCC(cirrh)
U 1,91
NS
p= 0,213
NORM
HCC(ncirrh)
U 1,55
NS
p= 0,245
HCC(cirrh)
HCC(ncirrh)
D 1,34
NS
p= 0,715
CIRRH
HCC(cirrh)
D 2,32
NS
p= 0,415
NCIRRH
HCC(ncirrh)
U 1,21
NS
p= 0,654
HCV(+)cirrh
HCV(-)cirrh
D 1,14
NS
p= 0,785
Magyarázat: A félkövérrel szedett oszlopban feltüntetett csoportok a vizsgálni kívánt minta csoportot jelentik, amelyet a kontrollként vett csoportokhoz
79
hasonlítottunk (a táblázat 1. oszlopa). U-up-regulált, D-down-regulált relatív expressziót jelent, NS - nem szignifikáns; NORM - normál máj, HCC hepatocelluláris carcinoma, CIRR (HCC) - cirrhotikus talajon létrejött HCC tumormentes környezete, NCIRRH (HCC) – nem cirrhotikus talajon kifejlődött HCC tumormentes környezete; HCC (cirrh)-cirrhotikus talajon létrejött HCC; HCC (ncirrh)- nem cirrhotikus talajon kifejlődött HCC.
MATRILIN-2 mRNS expresszió Matriln-2 mRNS expresszió 2 1,5 1 0,5 0 -0,5 -1 -1,5 -2 -2,5
NORM
CIRRH(HCC)
NORM
NCIRRH(HCC)
NORM
HCC(cirrh)
NORM
HCC(ncirrh)
HCC( cirrh) HCC(ncirrh) CIRRH HCC(cirrh) NCIRRH HCC(ncirrh)
1
HCV(+)cirrh HCV(-)cirrh
31. ábra. A matrilin-2 mRNS relatív expresszióját ábrázoló diagram. A különböző színnel jelölt csoportok megegyeznek a 11. táblázatban feltüntetett csoportokkal. A csoportok matrilin-2 mRNS expressziója között nincs szignifikáns eltérés.
80
6. MEGBESZÉLÉS
Az elmúlt évtizedben a normális és kóros szöveti működés sejten belüli eseményeinek vizsgálata mellett egyre inkább hangsúlyt kaptak azok a kutatások, amelyek a szöveti kötelék szerves részét képező ECM-re és sejtfelszíni molekulákra irányulnak. Számos kutatás tárgya a stroma – daganatos sejt kapcsolat, valamint azok mennyiségi, minőségi változásai összefüggéseinek a vizsgálata. Munkámban egy nemrégiben felfedezett ECM fehérje, a matrilin-2 expresszióját tanulmányoztam májszövetben, valamint próbáltam választ keresni arra, hogy mint az ECM alkotóelemének és a BM komponensének, ennek a fehérjének lehet-e szerepe kísérletileg indukált májregenerációban, illetve cirrhosisban és HCC-ben. A tumorok heterogének lehetnek mind a vaszkularizáció mértékében, mind pedig a stroma jellegében és bizonyos anyagok termelésében egyaránt, többek közt a mátrix termelésében is. Mivel a daganatok ECM-je különböző módon befolyásolhatja egy tumor biológiai viselkedését, egyre több olyan irodalmi adat jelenik meg, melyek szerint bizonyos mátrix komponensek fokozott vagy kóros expressziója rosszabb prognózist jelenthet (Xiong és mtsai 2006). Szinte minden mátrix fehérje képes a tumoros sejtek biológiai viselkedésének a befolyásolására. Matrilin-2 expresszió regenerálódó májban Jelen tanulmány során a matrilin-2 expresszióját vizsgáltuk normál májakban és májregenerációs modelleken. Kísérleteinkben ezen újonnan felfedezett mátrix fehérje csak nagyon kis mennyiségben volt kimutatható a normál patkány májban és a parciális hepatectomiát követő májregeneráció során. Immunhisztokémiai vizsgálatokkal kizárólag a portális tér ereiben illetve az epeutak BM zónájában, valamint az ezt körülvevő kötőszöveti rétegben volt kimutatható matrilin-2 expresszió. Az ovális sejt indukálta májregenerációban az ovális sejteket magába ágyazó ECM BM zónájában volt kimutathaó jelentősen megemelkedett matrilin-2 expresszió a normál májakhoz képest. Ezt mind immunhisztokémiai módszerrel mind Western blot technikával sikerült igazolni.
81
Kísérleteinkben in situ hibridizációval kimutattuk az mRNS expressziót az ovális sejtek citoplazmájában. Érett hepatocitákban a matrilin-2 mRNS expressziója nem volt detektálható. Lézer mikrodisszekcióval disszekált ovális sejtekből és hepatocitákból tisztított RNS-el végzett PCR kísérletek is alátámasztották az in situ hibridizáció eredményeit. Ezek birtokában feltételezhető, hogy májregenerációban a vizsgált modellben, az ECM-ben lezajló változások során a matriln-2-t elsődlegesen termelő sejtek az ovális sejtek lehetnek. Ahogyan azt már a bevezetőben is írtam, a matrilin fehérjéket számos szövetben azonosították (Deák és mtsai 1999, Wagener és mtsai 2005). A matrilin-2–t elsősorban BM-hoz asszociálva találták meg különböző szervekben (Piecha és mtsai 1999, Segat és mtsai 2000, Mátés és mtsai 2004, Korpos és mtsai 2005). Az ovális sejt indukálta májregenerációban különös jelentőséggel bír a BM. A differenciált májsejtekre nem jellemző a BM. Ezzel szemben a differenciálatlan ovális sejtek BM-on ülnek. A differenciálódás során ez a struktúra eltűnik (Paku és mtsai 2001). Kísérletileg igazolták, hogy egy anti-BM ellenes antitest az ovális sejtek igen gyors differenciálódását idézi elő (Paku és mtsai 2004). Az ECM komponensei intenzíven termelődnek
a
regenerálódó
májban,
ugyanis
az
ECM
normál
struktúrája
nélkülözhetetlen a hepatociták differenciált funkciójához. Úgy tűnik, elsősorban a BM komponenseket tartalmazó mátrix és bizonyos glikoproteinek azok, melyek jelenléte szükséges ezekhez a folyamatokhoz. Így a laminin és a vele kölcsönható molekulák jöhetnek először számításba, közöttük lehet a matrilin-2 is (Gressner 1988). A laminin, ahogy azt már igazolták, kulcsfontosságúnak bizonyult a differenciálódó ovális sejtlécek mentén az újonnan formálódó BM-ban (Paku és mtsai 2004). Kísérleteinkben a matrilin-2 mintázat hasonló lokalizációt mutatott a májregeneráció során a lamininéhoz, ennek alapján feltételezhető, hogy a matrilin-2 a lamininhez hasonlóan igen fontos szerepet tölthet be az ECM alakulásában a regeneráció során. Az ovális sejtek differenciálódását gátló és indukáló mechanizmusok az ECM komponensei közötti kölcsönhatásukat illetően még nem teljesen ismertek. Az arra vonatkozó adatok, hogy a regeneráció során egészen pontosan mikor, melyik fázisban jelennek meg az egyes ECM komponensek még hiányosak. Nemrégiben igazolták egy kötőszöveti növekedési faktorról, (CTGF = connective tissue growth factor), hogy
82
stimulálja az ECM termelését és kíséletesen indukált májregenerációban számos májsejt expresszálja, többek közt a máj csillag sejtek és epitheliális sejtek is (Sedlaczek és mtsai 2001). AAF/PH indukált májregenerációs modellben pedig az ovális sejtekben fokozott expresszióját mérték ennek a növekedési faktornak; továbbá a CTGF up-reguláció gátlása az ovális sejtek számának szignifikáns csökkenéséhez vezetett. Ez a jelenség is a kötőszövet igen fontos szerepét támasztja alá az ovális sejtekkel történő májregenerációban (Pi és mtsai 2005). Feltehető, hogy többek közt ennek a faktornak is szerepe lehet a matrilin-2 expresszióját fokozó szignalizációs kaszkádban. Kísérleteink alapján normál patkány májban nem volt kimutatható matrilin-2 expresszió a centrális vénákban, a szinuszoidokban, és nagyon gyenge expressziót mutatott az epeutak BM-jában, míg az ovális sejtekkel történő regeneráció során a matrilin-2 expressziója igen intenzív, a szinuszoidok mentén a portális areában, míg a centrolobuláris régió felé az expresszió eltűnik és a centrális vénákban nem detektálható a matrilin-2. Ez a matrilin-2-nek a májregeneráció korai szakaszában betöltött szerepét sejteti. Az eddig leírtaknak megfelelően (lásd Bevezetés) a máj csillagsejtek lehetnek az ECMet felépítő molekulák fő forrásai (Martinez -Hernandez és mtsai 1995, Bedossa és Paradis 2003). Noha egyre több sejt kap szerepet a máj ECM komponenseinek a termelésében, még mai napig sem tisztázott teljesen, hogy egyes mátrix komponenseket milyen sejtek termelnek (lásd Bevezető). Ahogyan már említettem, eredményeink alapján a matrilin-2–t a regenerálódó májban az ovális sejtek csoportja termelheti. Az a kérdés, hogy milyen más sejtek, így elsősorban a csillagsejtek, fibroblastok milyen körülmények között, milyen arányban termelhetnek matrilin-2-t (pl. cirrhosisban) további vizsgálatok tárgya. Igazolták, hogy matrilin-2 mRNS expresszió kimutatható hámsejtekben, de a fehérje expresszió csak szubepitheliális szövetekben volt kimutatható. Patkány bőrben a dermisz felső rétegében, az erekben és az idegekben volt detektálható (Piecha és mtsai 1999). Humán bőrben in situ hibridizációval keratinocytákban és fibroblastokban is sikerült matrilin-2 mRNS-t detektálni. A matrilin-2 fehérje termelésének mechanizmusa és transzportja a BM-on kersztül a stromába pontosan nem ismert, de feltehetőleg a matrilin-2-vel specifikusan kölcsönható molekulák biztosítják a fehérje transzportját a
83
kötőszöveti stroma irányába és a BM-ban lévő specifikus kötő ligandjai eredményezik a depozicióját a BM-ba (Piecha és mtsai 2002 a). A
vWFA-szerű
doménjének
köszönhetően
a
matrilin-2
a
kollegénekkel,
proteoglikánokkal, a laminin család tagjaival és egyéb ECM komponensekkel is kölcsönhatásba lép, de makromolekuláris kölcsönhatások révén szerepe van az ECM molekulák összeszerelésében, a kollagén fibrilláris hálózat képzésében is (Piecha és mtsai 2002 b, Mátés és mtsai 2002). A matrilin-2 vWFA doménje révén erősen kötődik a kollagén rostokhoz, esetleg azok integráns része, bőrben kolokalizációt mutat a kollagénnel és szilárd fázisú vizsgálatokban kölcsönhatásba lép a fibrilláris kollagénekkel, fibrillinekkel, fibronektinnel, laminin-nidogén komplexszel (Piecha és mtsai 2002 a, b). Ezen ismeretek birtokában feltételezhető, hogy a matrilin-2 a normális májban a portális terület mátrixot alkotó fibrilláris hálózat kialakításában vehet részt, ahol a kollagén makromolekuláris szerveződését segítheti. A regenerálódó májban ettől némileg eltérő szerepe lehet. Az eredményeink azt sugallják, hogy a matrilin-2 a regenerálódó májban az elsőként termelődő ECM komponensek között lehet. Feltételezhető, hogy a matrilin-2-re, mint az elsők között megjelenő BM komponensre a laminin, a kollagének, és más molekulák együttes szerveződésében lehet szükség, amely a májregenerációban a proliferáló ovális sejtek differenciálatlan állapotának a fenntartásában alapvető szerepet játszhat. A matrilin-2 pontos funkciójának kérdése azonban a májregeneráció során még további tisztázásra vár. A szarvas agancsban, mely egy különlegesen csontosodó szerv, modellje a csontregenerációnak, emlősökben az egyetlen eset, amikor egy teljes szerv regenerálódik, vizsgálták a matrilin fehérjék expressziójának változását. Ebben a differenciálódási rendszerben, is a matrilin-2-t igen intenzíven osztódó, még nem teljesen differenciálódott sejtek markereként azonosították. Emelt protein expressziós szinten fejeződött ki mesenchyma sejtekben, előporcban és preosteoblastokban. Ezek az eredmények szolgáltatták az első bizonyítékait annak, hogy a matrilin-2 különböző szövetek differenciálatlan sejtjeiben is kifejeződik (Segat és mtsai 2000, Korpos és mtsai 2005). Újabban pedig cornea-limbalis stem sejtekben mutattak ki matrilin-2 expressziót, nidogénnel és agrinnal párhuzamosan (Schlötzer-Schrehardt és mtsai 2007).
84
A matrilin-2 expressziója humán májban
A munkának ebben a részében a matrilin-2 exressziójával foglalkoztunk normál májban, májcirrhosisban és hepatocelluláris carcinomában. Vizsgálataink során a matrilin-2 a humán normál máj portális terében, így az epeutak BM-jában, a portális artériák, és vénák BM-jában volt erős intenzitással kimutatható, míg a centrális vénában a matrilin-2 immunohisztokémiai módszerrel nem volt detektálható. A normál máj szinuszoidjaiban sem volt detektálható a matrilin-2 expressszió. A cirrhotikus májban a matrilin-2 fehérje expressziója jelentős mértékben volt kimutatható a szinuszoidokban. A HCC-ben a matrilin-2 a neovaszkularizáció BMjai mentén figyelhető meg. A tumorban a vaszkularizáció során kialakuló erek biztosítják a tumor tápanyagellátását. A matrilin-2 neovaszkuláris BM lokalizációjának megerősítésére CD34-ellenes antitesttel végzett immunreakció, mint az endothel expressziós markere, részben kolokalizációt mutatott a matrilin-2-vel. Noha a matrilin-2 a májrákok neovaszkulaturáját kirajzolva jelenik meg tumorokban, az eltérő differenciáltságú
tumorok
matrilin-2
szignifikánsnak mondható eltérés.
fehérje
expressziója
között
nem
volt
Az utóbbi években derült fény arra, hogy a
daganatos kapillárisok szerkezete eltérő, ennek alapján több BM komponensről igazolódott, hogy kevésbé differenciált tumorokban eltűnik illetve fragmentálódik, amely a BM fellazulásával is jár. A szinuszoidális kapillarizáció a tumor dedifferenciálódása során történik. A tumorsejtek progresszív dedifferenciálódásával, atipikussá válnak az ECM termelésére, ezáltal a tumorok metasztázis képző hajlamát növelve (Giannelli és mtsai 2003). A munkacsoportunk által vizsgált agrinról is ez igazolódott (Kovalszky és matsai 2004, Batmunkh és mtsai 2007). Az hogy a matrilin-2 fehérje expressziója nem mutat jelentősebb mennyiségbeli eltérést az eltérő differenciáltságú tumorok és a cirrhosis között, azt jelentheti, hogy ez a fehérje már a cirrhosis során megjelenik és nincs különösebb jelentősége a tumor kialakulásában, illetve prognózisában. Az is érdekes jelenség, hogy a matrilin-2 expressziójában az eltérő talajon (cirrhotikus és nem cirrhotikus) kialakult HCC-k között sincs lényeges
85
különbség. Az irodalomból ugyanis ismeretes, hogy a májrákokat befolyásolja, hogy a tumor cirrhotikus vagy nem cirrhotikus májban alakul ki. Így egyes stroma komponensek is eltérhetnek az eltérő talajú tumorokban, pl. a syndecan, a decorin és a már említett agrin expresszióját nem befolyásolja a cirrhosis jelenléte, míg pl. a glipican-3 expressziójának fokozódása figyelhető meg cirrhosishoz társult tumorokban (Kovalszky és mtsai 2004). A matrilin-2 expresszióját feltehetőleg nem befolyásolja nagy mértékben a cirrhosis jelenléte tumorban. Mindenestre felsorolt eredményeink alátámasztják azt a tényt, miszerint a matrilin-2 az eddigi irodalmi adatoknak megfelelően elsősorban a BM struktúrákban volt detektálható (Piecha és mtsai 1999, 2002, Schlötzer-Schrehardt és mtsai 2007), májrákokban is ezt találtuk. Számos közlemény született bizonyos BM-t alkotó, ECM komponensek szerepéről a fibrogenezisben és a különböző tumorok patogenezisében, többek közt a HCC-ben is. Így például a kollagén IV, a laminin és az integrinek fokozott expresszióját írták le cirrhotikus májban és HCC-ben (Kin és mtsai 1994). A COMP (oligomer porc mátrix fehérje) fokozott expresszióját írták le HCC-ben. Erről a fehérjéről ismertették, hogy a matrilinekkel szerkezeti hasonlóságot mutat és makromolekuláris kölcsönhatásban áll velük (Xiao és mtsai 2004). A lamininnel és matrilin-2-vel párhuzamos metszeteken végzett immunhisztokémiai reakciókkal kimutattuk, hogy ezek a fehérjék részben kolokalizálódnak. Ez is igazolja, hogy a matrilin-2 a lamininhez hasonlóan egy BM komponens és a lamininhez, valamint más ECM molekulákhoz hasonlóan a „kapillarizáció” során felszaporodik a cirrhotikus máj szinuszoidjaiban (Kovalszky 2006). Immunoblottal a matrilin-2 monomert kb 100 kDa-nál detektáltuk, mind a humán, mind a patkány májak esetében. A nagyobb molekulasúlyú dimer-, és oligomer frakciónak megfelelő fehérje a patkány májakban nem volt kimutatható, míg minden humán májban csekély mennyiségben ugyan, de jelen volt ez a frakció is. Eddigi közleményekben publikált Western blot kísérletek során kapott adatok a matrilin-2-t kimutatták dimer és oligomer formában is (Piecha és mtsai 2002, Korpos és mtsai 2005). Annak, hogy saját eredményeink nem ezt mutatták, több oka lehet: a májban olyan intenzív proteolitikus hasítása történik a fehérjének, hogy csak a monomer formája marad meg; de
86
elképzelhető, hogy a májból csak a matrilin-2 oligomerek mutathatók ki, vagy a fehérjének ez a formája van túlsúlyban a többihez képest. Western blottal nem volt kimutatható mennyiségi eltérés a humán normál májban, a cirrhotikus és nem cirrhotikus környező májakban valamint a HCC-ben. Ez ellentmondásosnak tűnik az immunhisztokémiával nyert eredményekhez képest, amely alapján a cirrhotikus májban és a tumorokban is megemelkedik a matrilin-2 mennyisége. A matrilin-2 monomer sávok intenzitásának hasonlósága a különböző mintákban a cirrhotikus májban található fehérje nem megfelelő szolubilizációjával magyarázható a normál máj és a nem cirrhotikus májakhoz képest. Egy másik magyarázat lehetne erre az ellentmondásra, hogy a portális terek képleteinek BM-jai igen nagy mennyiségű matrilin-2-t tartalmaznak. Az újonnan képződött szinuszoidok BM-ja viszont relatíve az összmennyiséghez képest csekélyebb mennyiségben tartalmaz matrilin-2-t.
Bár
immunhisztokémiával
ez
egyértelműen
detektálható,
de
ez
mennyiségben elmarad a Western blottal mérhető összehasonlításban. Összességében eredményeink alapján feltételezhető, hogy a matrilin-2 mind a májregenerációban mind a kapillarizációban az elsők között megjelenő ECM komponensként szerepelhet. Elképzelhető, hogy ezekben az esetekben is a már ismert „adaptor” funkciója révén a mátrix átépítésében vesz részt más fehérjékkel együttes kölcsönhatásban. Eredményeink újabb kérdések sorozatát vetik fel: 1) Milyen molekulákkal együtt jelenik meg a matrilin-2 a májregenerációban és a cirrhosisban, valamint a tumorokban ? 2) Milyen transzkripciós faktorok indukálják az expresszióját? 3) Milyen molekulák hatására csökken a matrilin-2 fehérje expressziója a májban és a májregeneráció melyik fázisban következik ez be? A
matrilinek
carcinogenezisben
és
fibrosisban
betöltött
szerepének
precíz
tanulmányozása knock-out állatokon lehetséges. Ilyen irányú vizsgálatok már folyamatban vannak.
87
7. KÖVETKEZTETÉSEK
1.
A normál patkány májszövetben a matrilin-2 fehérje a portális terek ereinek és epeútjainak BM-ban fordul elő, míg a májszinuszoidokban a matrilin-2 expressziója nem mutatható ki.
2.
Az ovális sejtekkel történő májregeneráció során patkányban a matrilin-2 expresszió megnő a normál májban detektált expresszióhoz képest és kimutatható a szinuszoidokban valamint az ovális sejt képezte duktuszokban is. A matrilin-2 mRNS expresszióját az ovális sejtekben az RT-PCR és az in situ hibridizáció is igazolta, tehát a matrilin-2 termelésben az ovális sejtek részt vesznek, melyet elsőként detektáltunk az irodalomban.
3.
A matrilin-2 az ovális sejt duktuszok mentén kolokalizációt mutat a lamininnal, tehát a lamininhoz hasonlóan fontos komponens lehet az ECM-ben a májregeneráció során.
4.
Humán májban elsőként mutattuk ki a matrilin-2 expressziót mind mRNS, mind fehérje szinten.
5.
Normál humán májban fehérje szinten a matrilin-2 az epeutak, a portális tér ereinek BM zónájában detektálható, a szinuszoidok mentén nem volt megfigyelhető matrilin-2 fehérje pozitivitás.
6.
A cirrhotikus májszövetben a matrilin-2 fehérje expressziót a proliferáló epeutak és az erek BM zónájában, valamint a szinuszoidokban azonosítottuk.
7.
A hepatocellularis carcinomákban (HCC) erős matrilin-2 expresszió figyelhető meg az újonnan képződött erek BM-jában, mely azonban nem mutat szignifikáns eltérést a különböző differenciáltságú tumorokban.
8.
Az endothelt jellemző CD34 fehérje expresszió a HCC-ben részben kolokalizál a matrilin-2 expresszióval.
88
8. ÖSSZEFOGLALÁS A hepatocelluláris carcinoma (HCC) az egyik leggyakoribb malignus daganatok közé sorolható a világon. A hepatociták malignus transzformációja olyan többlépcsős folyamat eredménye, amelyben a daganat kialakulásához vezető genetikai elváltozások mellett egyre jobban felismerjük a tumor extracelluláris mátrixának (ECM) jelentőségét, mely cél-orientált terápia célpontja is lehet. A mátrix biológia csak az utóbbi évtizedben fedezte fel a nem-kollagén szerkezetű ECM fehérjékhez tartozó matrilin fehérjék családját. A matrilin fehérjék négy tagja közül a matrilin-2 szöveti előfordulása a legszélesebb körű: számos szerv bazális membránjában (BM) leírták jelenlétét. Amikor ebben az értekezésben ismertetett munka elkezdődött, humán májjal kapcsolatos irodalmi adatok még nem voltak a matrilin-2-ről. Kutatásaink legfőbb célkitűzése éppen ezért a matrilin-2 expressziójának tanulmányozása volt májregenerációban, cirrhosisban és HCC-ben, figyelembe véve az ECM jelentőségét ezen folyamatokban. Kísérleteinkben tanulmányoztuk a matrilin-2 mRNS és fehérje expresszióját patkány normál májban, parciális hepatectomiát követően hepatocitákkal történő, illetve ovális sejtek indukálta májregenerációs kísérleti modelleken. Elsőként mutattuk ki, hogy az ovális sejtekkel történő májregenerációban az ovális sejtek termelik a matrilin-2-t. Ezt fehérje és mRNS szinten is igazoltuk, detektáltuk a matrilin-2 monomer formáját. Humán májmintákon (35 HCC, 15 cirrhotikus, 20 nem cirrhotikus környező szövet) és 10 normál máj) a matrilin-2-t a normál máj portális tereiben, az epeutak és a portális erek BM zónájában elsőként detektáltuk; a szinuszoidokban nem volt kimutatható matrilin-2 fehérje expresszió. A cirrhotikus májak szinuszoidjaiban erős matrilin-2 fehérje expressziót mutattunk ki. A HCC-ben intenzív matrilin-2 fehérje expressziót találtunk az erek mentén, amely a tumorok differenciáltsági fokával nem mutatott összefüggést. Feltételezhető, hogy a matrilin-2 a májregenerációban az elsők között megjelenő ECM komponensként szerepelhet. A fokozott matrilin-2 expresszió cirrhosisban
és
a
tumorokban
e
fehérjének
a
kapillarizációban
és
a
neovaszkularizációban betöltött szerepére utalhat. Elképzelhető, hogy ezekben az esetekben is a már ismert „adaptor” funkciója révén a daganat mátrix átépítésében vesz részt, más fehérjékkel együttes kölcsönhatásban.
89
9. SUMMARY
Hepatocellular carcinoma (HCC) is among the most common causes of cancer death worldwide. The malignant transformatiormation of the hepatocytes is a longterm multistep process, in which the genetic alterations and molecular changes in the extracellular matrix (ECM) play role together in carcinogenesis and tumor progression. The recently described matrilin protein family is part of the ECM, their pathophysiological role as well as distribution in the liver have not yet been studied. Matrilin-2 displays a broad tissue distribution and has been detected in basement membranes of other tissues. Considering its role in cell growth and tissue remodeling we aimed to study the expression of matrilin-2 during liver regeneration, in normal human liver, HCC and surrounding cirrhotic liver. Liver regeneration was induced in rats by partial hepatectomy (PH) and 2acetylaminofluorene (AAF)/partial hepatectomy (PH) in experimental models. A total of 35 cases of surgically resected HCCs, 35 corresponding surrounding liver tissues and 10 normal liver samples were used for the study of human tissues. The expression of matrilin-2 was analyzed both at mRNA and protein levels. Matrilin-2 was detected in normal rat liver and partially hepatectomized liver in the portal area, but could not be demonstrated in the acini. In the AAF/PH model the oval cells but not the hepatocytes produced matrilin-2 mRNA. Increase in protein level in the AAF/PH regenerating liver model was demonstrated by Western blotting. The protein was present in the basement membrane zone around the tubules formed by oval cells. In normal human liver matrilin-2 expression was detected in normal liver, portal blood vessels, while sinusoids were negative. Cirrhotic surrounding tissues of HCCs showed intensive matrilin-2 staining along the sinusoids. Tumorous neovasculature was found to be strongly positive in HCCs. No differences, however, were detected by morphometry based on the grade of HCC. Taken together, our data show that among mesenchymal cells hepatic oval cells produce matrilin-2, a novel ECM protein which appears during capillarization in liver cirrhosis and hepatocarcinogenesis. Based on our findings, it is suggested that matrilin-2 is one of the important components of ECM during stem cell-driven liver regeneration and is also synthetised during the remodeling of the cirrhotic ECM and tumor stroma. Matrilin-2 as putative adaptor protein might help other molecules for proper ECM assembly during the reorganization of matrix.
90
10. IRODALOMJEGYZÉK
Aizawa Y, ShibamotoY, Takagi I, Zeniya M, Toda G. (2000) Analysis of factors affecting the appearance of hepatocellular carcinoma in patients chronic hepatitis C. Cancer, 89: 53-59. Alison M, Golding MH, Sarraf CE. (1996) Pluripotential liver stem cells: facultative stem cells located in the biliary tree. Cell Prolif, 29: 373-402. Alison M. (2005) Liver stem cells: implications for hepatocarcinogenesis. Stem Cell Rev, 1: 253-260. Andrisani OM, Barnabas S. (1999) The transcriptional function of the hepatitis B virus X protein and its role in hepatocarcinogenesis. Int J Oncol, 15: 373-379. Argraves WS, Deák F, Sparks K, Kiss I, Goetinck PF. (1987) Structural features of cartilage matrix protein deduced from cDNA. Proc Natl Acad Sci USA, 84: 464-468. Arsura M, Cavin LG. Nuclear factor-kappa B and liver carcinogenesis. (2005) Cancer Lett, 229: 157-169. Aszódi A, Bateman JF, Hirsch E, Baranyi M, Hunziker EB, Hauser N, Bösze Z, Fasller R. (1999) Normal skeletal development of mice lacking matrilin1: redundant function of matrilins in cartilage? Mol Cell Biol, 19: 7841-7845. Aszódi A, Beier DR, Hiripi. L, Bösze Z, Fassler R. (1998) Sequence, structure and chromosomal localization of Crtm gene encoding mouse cartilage matrix protein and its exclusion as a candidate for murine achondroplasia. Matrix Biol, 16: 563-673. Aszódi A, Hauser N, Studer D, Paulsson M, Hiripi L, Bösze Z. (1996) Cloning, sequencing and expression analysis of mouse cartilage marix protein (CMP) cDNA. Eur J Biochem, 236: 970-977.
91
Aszódi A, Módis L, Páldi A, Rencendroj A, Kiss I, Bösze Z. (1994) The zonal expression of chicken cartilage matrix protein gene in the developing skeleton of transgenic mice. Matrix Biol, 14: 181-190. Aumailley M, Gayraud B. (1998) Structure and biological activity of the extracellular matrix. J Mol Med, 76: 253-65. Barba G, Harper F, Harada T, Kohara M, Goulinet S, Matsuura Y, Eder G, Schaff Z, Chapman MJ, Miyamura T, Brechot C. (1997) Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 1200-1205. Batmunkh E, Tátrai P, Szabó E, Lódi C, Holczbauer A, Páska C, Kupcsulik P, Kiss A, Schaff Z, Kovalszky I. (2007) Comparison of the expression of agrin, a basement membrane heparan sulfate proteoglycan, in cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma Hum Pathol, 38: 1508-1515. Bedossa P, Paradis V. (2003) Liver extracellular matrix in health and disease. J Pathol, 200: 504-515. Belluoccio D, Schenker T, Baici A, Trueb B. (1998) Characterization of human matrilin-3. Genomics, 53: 391-394.
Belluoccio D, Trueb B. (1997) Matrilin-3 from chicken cartilage. FEBS Lett, 415: 212-216.
Block TM, Mehta AS, Fimmel CJ, Jordan R. (2003) Molecular viral oncology of hepatocellular carcinoma. Oncogene, 22: 5093-5107. Briggs MD. (2004) Missense mutations in the beta strands of the single A-domain of matrilin3 result in multiple epiphyseal dysplasia. J Med Genet, 41: 52-9.
92
Buckner JH, Wu JJ, Reife RA, Terato K, Eyre DR. (2000) Autoreactivity against matrilin-1 in a patient with relapsing polychondritis. Arthritis Rheum, 43: 939-43. Buendia MA. (1992) Hepatitis B viruses and hepatocellular carcinoma. Adv. Cancer Res, 59: 167-226. Buendia MA. (2000) Genetics of hepatocellular carcinoma. Semin Cancer Biol, 10: 185-200. Canen EH, Yamada KM. (2001) Fibronectin, integrins and growth control. J Cell Physiol, 189: 1-13. Chapman KL, Mortier GR, Chapman K, Loughlin J, Grant ME, Briggs MD. (2001) Mutations in the region encoding the von Willebrand factor A domain of matrilin-3 are associated with multiple epiphyseal dysplasia. Nat Genet, 28: 393-396. Chen Q, Johnson DM, Haudenschild DR, Tondravi MM, Goetinck PF. (1995) Cartilage matrix protein forms a types II collagen-independent filamentous network: Analysis in primary cell cultures with a retrovirus expression system. Mol Biol Cell, 6: 1743-1753. Chen Q, Zhang Y, Johnson DM, Goetinck PF. (1999) Assembly of a novel cartilage matrix protein filamentous network: molecular basis of differential requirement of von Willebrand factor A domains. Mol Biol Cell, 10: 2149-2162. Chiquet-Ehrismann R. (2004) Tenascins. Int J Biochem Cell Biol, 36: 986-990. Chisari FV. (2000) Viruses, immunity, and cancer: Lessons from hepatitis B. Am J Path, 156: 1118-1132. Clarke B. (1997) Molecular virology of hepatitis C virus. J Gen. Virol, 78: 2397-2410. Craig JR. (1997) Cirrhosis, hepatocellular carcinoma, and survival. Hepatology, 26: 798-799.
93
Deák F, Piecha D, Bacharati C, Paulsson M, Kiss I. (1997) Primary structure and expression of matrilin-2, the closest relative of cartilage matrix protein within the von Willebrand factor type A module superfamily. J Biol Chem, 272: 9268-9274. Deák F, Wagener R, Kiss I, Paulsson M. (1999) The matrilins: a novel family of oligomeric extracellular matrix proteins. Matrix Biol, 18: 55-64. Deng-Fu Yao, Zhi-Zhen Dong, Min Yao (2007): Specific molecular markers in hepatocellular carcinoma, Hepatobiliary Pancrat Dis Int, 6: 241-247. Dumble ML, Croager EJ, Yeoh GC, Quail EA. (2002) Generation and characterization of p53 null transformed hepatic progenitor cells: oval cells give rise to hepatocellular carcinoma. Carcinogenesis, 23: 435-445. Desmet VJ. (2005) Cystic diseases of the liver. From embryology to malformations. Gastroenterol Clin Biol, 29: 858-860. Eleazar JA, Memeo L, Jhang JS, Mansukhani MM, Chin S, Park SM, Lefkowitch JH, Bhagat G. (2004) Progenitor cell expansion: an important source of hepatocyte regeneration chronic hepatitis J Hepatol, 41: 983-991. Evarts RP, Nagy P, Marsden ER, Thorgeirsson SS. (1987) A precursor-product relationship exists between oval cells and hepatocytes in rat liver. Carcinogenesis, 8: 1737-1740. Falkowski O, An HJ, Ianus IA, Chiriboga L, Yee H, West AB, Theise ND. (2003) Regeneration of hepatocyte 'buds' in cirrhosis from intrabiliary stem cells. J Hepatol, 39: 357364. Farber E. (1956) Similarities in the sequence of early histological changes induced in the liver of the rat by ethionine, 2-acetylaminofluorene, and 3’ methyl-4-dimethylaminoazobenzene. Cancer Res, 16: 142-148. Fausto N. (2001) Liver regeneration: from laboratory to clinic. Liver Transpl, 7: 835-844. 94
Fausto N. (2004) Liver regeneration and repair: hepatocytes, progenitor cells, and stem cells. Hepatology, 39: 1477-1487. Fiegel HC, Glüer S, Roth B, Rischewski J, von Schweinitz D, Ure B, Lambrecht W, Kluth D. (2004) Stem-like cells in human hepatoblastoma. Histochem Cytochem, 52: 1495-501. Forbes S, Vig P, Poulsom R, Thomas H, Alison M. (2002) Hepatic stem cells. J Pathol, 197: 510-518. Frank S, Schulthess T, Landwehr R, Lustig A, Mini T, Jenö P, Engel J, Kammerer RA. (2002) Characterization of the matrilin coiled-coil domains reveals seven novel isoforms. J Biol Chem, 277: 19071-19079. Friedman SL. (2004a) Mechanism of disease: mechanisms of hepatic fibrosis and therapeutic implications. Nature Clin Practice Gastroenterol Hepatol, 1: 98-105.
Friedman SL. (2004b) Stellate cells: a moving target in hepatic fibrogenesis. Hepatology, 40: 1041-1043.
Fujita M, Furukawa H, Hattori M, Todo S, Ishida Y, Nagashima K. (2000) Sequential observation of liver cell regeneraton after massive hepatic necrosis inauxiliary partial orthotopic liver transplantation. Mod Pathol, 13: 152-157.
Füle T, Baghy K, Tátrai P, Péterfia B, Kovalszky I. (2006) A stroma szerepe a daganatok biológiai viselkedésében. Orvosképzés, 3. 137-244.
Füle T, Kovalszky I. (2002) Vírusok molekuláris diagnosztikája. Magy Onkol, 46: 17-22.
95
Gelse K, Poschl E, Aigner T. (2003) Collagens-structure, function, and biosynthesis. Adv Drug Deliv Rev. 55: 1531-1546. Gervain J, Simon G Jr, Papp I, Szabóné BK. (2001) A magyarországi krónikus C vírushepatitises betegek vírustípus- és szubtípus meghatározása. Orv Hetil, 2001. 142: 13151319. Giannelli G, Antoniaci S. (2000) Biological and clinical revelance of Laminin-5 in cancer. Clin Exp Metastasis, 18: 439-443. Giannelli G, Quaranta V, Antonaci S. (2003) Tissue remodelling in liver diseases. Histol Histopathol, 18: 1267-1274. Gressner AM. (1998) The cell biology of liver fibrogenesis - an imbalance of proliferation, growth arrest and apoptosis of myofibroblasts. Cell Tissue Res, 292: 447-52. Grisham JW. (1980) Cell types in long term propagable cultures of rat liver. Ann NY Acad Sci, 349: 128-134. Hauser N, Paulsson M, Heinegard D, Morgelin M. (1996) Interaction of cartilage matrix protein (CMP) with aggrecan. Increased covalent cross-linking with tissue maturation. J Biol Chem, 271: 32247-32252. Hauser N, Paulsson M. (1994) Native cartilage matrix protein (CMP). A compact trimer of subunits assembled via a coiled-coil α-helix. J Biol Chem, 269: 25747-26753. Hayashi J. Aoki H, Arakawa Y, Hino O. (1999) Hepatitis C virus and hepatocarcinogenesis. Intervirology, 42: 205-210. Higgins GM, Anderson RM. (1931) Experimental pathology of the liver: restoration of the of the white rat following partial surgical removal. Experimental Pathol, 12: 186–202. Hodkinson PS, Mackinnon AC, Sethi T. (2007) Extracellular matrix regulation of drug resistance in small-cell lung cancer. Int J Radiat Biol, 28. 1-9. 96
Hofseth LJ, Saito S, Hussain SP, Espey MG, Miranda KM, Araki Y, Jhappan C, Higashimoto Y, He P, Linke SP, Quezado MM, Zurer I, Rotter V, Wink DA, Appella E, Harris CC. (2003) Nitric oxide-induced cellular stress and p53 activation in chronic inflammation. Proc Natl Acad Sci USA, 100: 143 -148. Hsia CC. Evarts RP. Nakatsukasa N, Marsden E, Thorgeirsson SS. (1992) Occurence of ovaltype cells in hepatitis B virus associated human hepatocarcinogenesis. Hepatology, 16: 13271333. Jackson GC, Barker FS, Jakkula E, Czarny-Ratajczak M, Mäkitie O, Cole WG, Wright MJ, Smithson SF, Suri M, Rogala P, Mortier GR, Baldock C, Wallace A, Elles R, Ala-Kokko L, MD Briggs. (2004) Missense mutations in the β strands of the single A-domain of matrilin-3 result in multiple epiphyseal dysplasia. J Med Genet, 41: 52-59.
Kabosova A, Azar DT, Bannikov GA, Campbell KP, Durbej M, Ghohestani RF, Jones JC, Kenney MC, Koch M, Ninomiya Y, Patton BL, Paulsson M, Sado Y, Sage EH, Sasaki T, Sorokin LM, Steiner-Champliaud MF, Sun TT, Sundarraj N, Timpl R, Virtanen I, Ljubimov AV. (2007) Compositional Differences between Infant and Adult Human Corneal Basement Membranes. Invest Ophthalmol Vis Sci, 48: 4989-99. Kalluri R. (2003) Basement membranes: structure, assembly and role in tumor angiogenesis. Nat Rev Cancer, 3: 422-433. Katyal S, Oliver JH 3rd, Peterson MS, Ferris JV, Carr BS, Baron RL. (2000) Extrahepatic metastases of hepatocellular carcinoma. Radiology, 216: 698-703. Kim TH, Wendy M, Mars DB, Stolz B, Petersen E, Michalopoulos GK. (1997) Extracellular matrix remodeling at the early stages of liver regeneration in the rat. Hepatology, 26: 896-904. Kin M, Torimura T, Ueno T, Inuzuka S, Tanikawa K. (1994) Sinusoidal capillarization in small hepatocellular carcinoma. Pathol Int, 44: 771-778.
97
Kiss A, Lotz G, Kaposi NP, Schaff Zs. (2002) Hepatitisvírusok és hepatocarcinogenesis. Orv Hetil, 143: 83-86. Kiss I, Deák F, Holloway RG, Delius H, Mebust KA, Frimberger E, Argraves WS, Tsonis PA, Winterbottom N, Goetnick PF. (1989) Structure of the gene for cartilage matrix protein, a modular protein of the extracellular matrix. J. Biol. Chem, 264: 8126-8134. Klatt AR, Nitsche DP, Kobbe B, Mörgelin M, Paulsson M, Wagener R. (2000) Molecular structure and tissue distribution of matrilin-3, a filament-forming extracellular matrix protein expressed during skeletal development. J Biol Chem, 275: 3999-4006. Klatt AR, Nitsche DP, Kobbe B, Macht M, Paulsson M, Wagener R. (2001) Molecular structure, procesing, and tissue distribution of matrilin-4. J Biol Chem, 276: 17267-17275.
Klatt AR, Paulsson M, Wagener R. (2002) Expression of matrilins during maturation of mouse skeletal tissues. Matrix Biol, 21: 289-296.
Ko YP, Kobbe B, Paulsson M, Wagener R. (2005) Zebrafish (Danio rerio) matrilins: shared and divergent characteristics with their mammalian counterpart. Biochem J, 386: 367-379. Korpos E, Molnar A, Papp P, Kiss I, Orosz L, Deak F. (2005) Expression pattern of matrilins and other extracellular matrix proteins characterize distinct stages of cell differentiation during antler development. Matrix Biol, 24: 124-135. Kovalszky I, Baghy K, Tátrai P, Schaff Zs. (2006) A májfibrogenezis pathomechanizmusa. Orv Hetil, 33: 1593-1599. Kovalszky I, Dudás J, Gallai M, Hollósi P, Tátrai P, Tátrai E, Schaff Z. (2004) Proteoglikánok a májban. Magy Onkol, 48: 207-213. Kovalszky I. (1993) Máj fibrogenesis-fibrózis, cirrhózis. Orv Hetil, 1: 59-64.
98
Lee JS, Thorgeirsson SS. (2006) Comparative and integrative functional genomics of HCC. Oncogene, 25: 3801- 3809. Leighton MP, Nundlall S, Starborg T, Meadows RS, Suleman F, Knowles L, Wagener R, Thornton DJ, Kadler KE, Boot-Handford RP, Briggs MD. (2007) Decreased chondrocyte proliferation and dysregulated apoptosis in the cartilage growth plate are key features of a murine model of epiphyseal dysplasia caused by a matn3 mutation. Hum Mol Genet, 16: 1728-1741. Lengyel G, Tulassay Z. (2007) A májtranszplantáció után visszatérő hepatitis-C-vírus-fertőzés kezelése. Orv Hetil, 148: 1875-1881. Li H, Fan X, Houghton J. (2007) Tumor microenvirovment: the role of the tumor stroma in cancer. J. Cell Biochem, 101: 805-815. Llovet J, Ricci S, Mazzaferro V, Hilgard P, Raoul J, Zeuzem S, Poulin-Costello M, Moscovici M. (2007) Randomized phase III trial of sorafenib versus placebo in patients with advanced hepatocellular carcinoma. ASCO Annual Meeting Proceedings, 25:1. Lowes KN, Brennan BA, Yeoh GC, Olynyk JK. (1999) Oval cell numbers in human chronic liver diseases are directly related to disease severity. Am J Pathol, 154: 537-541. Mabuchi A, Haga N, Maeda K, Nakashima E, Manabe N, Hiraoka H, Kitoh H, Kosaki R, Nishimura G, Ohashi H, Ikegawa S. (2004) Novel and recurrent mutations clustered in the von Willebrand factor A domain of MATN3 in multiple epiphyseal dysplasia. Hum Mutat, 24: 439-40.
Maher JJ, McGuire RF. (1990) Extracellular matrix gene expression increases preferentially in rat lipocytes and sinusoidal endothelial cells during hepatic fibrosis in vivo. J Clin Invest, 86: 1641-1648.
99
Mann HH, Özbek S, Eugel J, Paulsson M, Wagener R. (2004) Interactions between the cartilage oligomeric matrix protein and matrilins. Implications for matrix assembly and the pathogenesis of chondrodysplasisas. J Biol Chem, 279: 25294-25298. Mannhalter C, Koizar D, Mitterbauer G. (2000) Evalution of RNA isolation metods and reference genes for RT-PCR analyses of rare target RNA. Clin Lab Med, 38: 171-177.
Martinez-Hernandez A, Amenta PS. (1993) The hepatic extracellular matrix. Ontogenesis, regeneration and cirrhosis. Virchows Archiv A Pathol Anat, 423: 77-84.
Martinez-Hernandez A, Amenta PS. (1995) The extracellular matrix in hepatic regeneration. FASEB J, 9: 1401-1410. Martinez-Hernandez A, Mertinez- Delgado F, Amenta PS. (1991) The extracellular matrix in hepatic regeneration. Localization of collagen types I, III, IV, laminin, and fibronectin. Lab Invest, 64: 157-166.
Mátés L, Korpos E, Déak F, Liu Z, Beier DR, Aszódi A, Kiss I. (2002) Comparative analysis of the mouse and human genes (Matn2 and MATN2) for matrilin-2, a filament-forming protein widely distributed in extracellular matrices. Matrix Biol, 21: 163-174. Mátés L, Nicolae C, Mörgelin M, Deák F , Kiss I , Aszódi A. (2004) Mice lacking the extracellular matrix adaptor protein matrilin-2 develop without obvious abnormalities. Matrix Biol, 23: 195-204. Merz H, Malisius R, Mannweiler S, Zhou R, Hartmann W, Orscheschek K, Moubayed P, Feller AC. (1995) ImmunoMax. A maximized immunohistochemical method for the retrieval and enhancement of hidden antigens. Lab Invest, 73: 149-156.
100
Mundlos S, Zabel B. (1994) Develpomental expression of human cartilage matrix protein. Dev Dyn, 199: 241-252. Nagy P, László V, Schaff Zs. (2006) A hepatocarcinogenesis folyamata humán májban. Magy Onkol, 50: 107-112. Nagy P. (1995) The facultative stem cell: a new star in liver pathology. Pathol Oncol Res. 1: 123-126. Nagy P, Teramoto T, Factor VM, Sanchez A, Schnur J, Paku S, Thorgeirsson SS. (2001) Reconstitution of liver mass via cellular hypertrophy in the rat. Hepatology, 33: 339-345.
Okimura A, Okada Y, Makihira S , Pan H , Yu L , Tanne K, Imai K, Yamada H, Kawamoto T, Noshiro M, Yan W, Kato Y. (1997) Enhancement of cartilage matrix protein synthesis in arthritic cartilage. Arthritis Rheum, 40: 1029-1036. Paku S, Schur J, Nagy P, SS Thorgeirsson. (2001) Origin and strctural evolution of the early proliferating oval cells in rat liver. Am J Pathol, 158: 1313-1323. Paku S, Nagy P, Kopper L, Thorgeirsson SS. (2004) 2-acetylaminofluorene dose-dependent differentiation of rat oval cells into hepatocytes: confocal and electron microscopic studies. Hepatology, 39: 1353-1361. Pan OH, Beck K. (1998) The C-terminal domain of matrilin-2 assembles into a three-stranded α-helical coiled coil. J Biol Chem, 273: 14205- 14209. Paulsson M, Heinegard D. (1979) Matrix proteins bound to associatively prepared proteoglycans from bovine cartilage. Biochem J, 183: 539-545. Paulsson M, Heinegard D. (1981) Purification and structural caracterization of a cartilage matrix protein. Biochem J, 183: 539-545.
101
Paulsson M, Heinegard D. (1982) Radioimmunoassay of the 148-kilodalton cartilage protein. Biochem J, 207: 207-213. Petersen BE, Zajac VF, Michalopoulos GK. (1998) Hepatic oval cell activation in response to injury following chemically induced periportal or pericentral damage in rats. Hepatology, 27: 1030-1038. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. (2002) Relative expression software tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res, 1: 30-36.
Pi L, Oh SH, Shupe T, Petersen BE. (2005) Role of the connective tissue growth factor in oval cell response during liver regeneration after 2-AAF/PHx in rats. Gastroenterology, 128: 2077-2088. Piecha D, Muratoglu S, Morgelin M, Hauser N, Studer D, Kiss I, Paulsson M, Deak F. (1999) Matrilin-2, a large, oligomeric matrix protein, is expressed by a great variety of cells and forms fibrillar networks. J Biol Chem, 274: 13353-13361. Piecha D, Hartmann K, Kobbe B, Haase I, Mauch C, Krieg T, Paulsson M. (2002a) Expression of matrilin-2 in human skin. J Invest Dermatol, 119: 38-43. Piecha D, Wiberg C, Morgelin M, Reinhardt DP, Deak F, Maurer P, Paulsson M. (2002b) Matrilin-2 interacts with itself and with other extracellular matrix proteins. Biochem J, 367: 715-721. Roskams T, Yang SQ, Koteish A, Durnez A, DeVos R, Huang X, Achten R, Verslype C, diehl AM. (2003) Oxidative stress and oval cell accumulation in mice and humans with alcoholic and nonalcoholic fatty liver disease. Am J Pathol, 163: 1301-1311.
102
Roskams T. (2006) Liver stem cells and their implication in hepatocellular and cholangiocarcinoma. Oncogene, 25: 3818-3822. Roskams TA, Theise ND, Balabaud C, Bhagat G, Bhathal PS, Bioulac-Sage P, Brunt EM, Crawford JM, Crosby HA, Desmet V, Finegold MJ, Geller SA, Gouw AS, Hytiroglou P, Knisely AS, Kojiro M, Lefkowitch JH, Nakanuma Y, Olynyk JK, Park YN, Portmann B, Saxena R, Scheuer PJ, Strain AJ, Thung SN, Wanless IR, West AB. (2004) Nomenclature of the finer branches of the biliary tree: canals, ductules, and ductular reactions in human livers. Hepatology, 39: 1739-1745. Rougier P, Mitry E, Barbare JC, Taieb J. (2007) Hepatocellular carcinoma (HCC): An Update. Semin Oncol, 4: 12-20. Sadlier DM, Connolly SB, Kieran NE, Roxburgh S, Brazil DP, Kairaitis L, Wang Y, Harris DC, Doran P, Brady HR. (2004) Sequential extracellular matrix-focused and baited-global cluster analysis of serial transcriptomic profiles identifies candidate modulators of renal tubulointerstitial fibrosis in murine adriamycin-induced nephropathy. J Biol Chem, 279: 29670 -2980. Santoni-Rugiu, E, Jelnes, P, Thorgeirsson, SS, Bisgaard, HC. (2005) Progenitor cells in liver regeneration: molecular responses controlling their activation and expansion. APMIS, 113: 876-902. Sarraf C, Lalani EN, Golding M, Anilkumar TV, Poulsom R, Alison M. (1994) Cell behavior in the acetylaminofluorene-treated regenerating rat liver. Light and electron microscopic observations. Am J Pathol, 145: 1114-1126. Saxne T, Heinegard D. (1989) Involvment of non-articular cartilage, as demonstrated by release of a cartilage-specific protein, in rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 32: 10801086. Schaff Z, Nagy P. Pathology techniques and grading systems in the diagnosis of HCC. In Liver Cancer. Eds. Okuda K, Tabor E. Churchill Livingstone, London, 1997: 111-133.
103
Schaff Z, Sárosi I, Hsia CC, Kiss A, Tabor E. (1995) p53 in malignant and beningn liver lesions. Eur J Cancer, 31A: 1847-1850. Schaff Zs, Illyés Gy. A máj és az epeutak patológiája. In: Kopper L és Schaff Zs (szerk), Patológia. Medicina, Budapest, 2004: 827-839. Schaff Zs, Székely E, Járay B, Kiss A. (2004) A májdaganatok patológiája. Orv Hetil, 145: 368-374. Schaffener F, Popper H. Capillarization of hepatic sinusoids in man. Gastroenterology, 1963. 44: 239-242. Schlötzer-Schrehardt U, Dietrich T, Saito K, Sorokin L, Sasaki T, Paulsson M, Kruse FE. (2007) Characterization of extracellular matrix components in the limbal epithelial stem cell compartment. Exp Eye Res, nyomtatásban. Sedlaczek N, Jia JD, Bauer M, Herbst H, Ruehl M, Hahn EG, Schuppan D. (2001) Proliferating bile duct epithelial cells are a major source of connective tissue growth factor in rat biliary fibrosis. Am J Pathol, 158: 1239-1244. Segat D, Frie C, Nitsche PD, Klatt AR, Piecha D, Korpos E, Deák F, Wagener R, Paulsson M, Smyth N. (2000) Expression of matrilin-1, -2 and -3 developing mouse limbs and heart, Matrix Biol, 19: 649-655. Sell S, Salman J. (1984) Ligh- and electron-microscopic autoradiographic analysis of proliferating cells during the early of chemical hepatocarcinogenesis in the rat induced by feeding N-2 fluorenylacetamide in a choline-deficient diet. Am J Pathol, 114: 287-300.
Sell S. (2004) Stem cell origin of cancer and differentiation therapy Crit Rev Oncol Hematol, 51: 1-28.
104
Sharma MK , Watson MA, Lyman M, Perry A, Aldape KD, Deak F, Gutmann DH. (2006) Matrilin-2 expression distinguishes clinically relevant subsets of pilocytic astrocytoma. Neurology, 66: 127-130. Staib F, Hussain SP, Hofseth LJ, Wang XW, Harris CC. (2003) TP53 and liver carcinogenesis. Hum Mutat, 21: 201-16. Stefánsson SE, Jónsson H, Ingvarsson T, Manolescu I, Jónsson HH, Olafsdóttir G, Pálsdóttir E, Stefánsdóttir G, Sveinbjörnsdóttir G, Frigge ML, Kong A, Gulcher JR, Stefánsson K. (2003) Genomewide scan for hand osteoarthritis: a novel mutation in matrilin-3. Am J Hum Genet, 72: 1448-1459.
Stirpe NS, Goetinck PF. (1989) Gene regulation during cartilage differentiaton: temporal and spatial expression of link protein and cartilage matrix protein in the developing limb. Development, 107: 23-33. Szabo E, Lotz G, Paska C, Kiss A, Schaff Z. (2003) Viral hepatitis: new data on hepatitis C infection. Pathol Oncol Res, 9: 215-221. Szabo E, Paska C, Kaposi Novak P, Schaff Z, Kiss A. (2004) Similarities and differences in hepatitis B and C virus induced hepatocarcinogenesis. Pathol Oncol Res, 10: 5-11. Taub R. (1996) Liver regeneration in health and disease. Clin Lab Med, 16: 341-360. Teufel A, Staib F, Kanzler S, Weinmann A, Schulze-Bergkamen H, Galle PR. (2007) Genetics of hepatocellular carcinoma. World J Gastroenterol, 13: 2271-2282. Theise ND, Nimmakayalu M, Gardner R, Illei PB, Morgan G, Teperman L, Henegariu O, Krause DS. (2000) Liver from bone marrow in humans. Hepatology, 32: 11-16. Thung SM. (1990) The development of proliferating ductular structures in liver disease. Arch Pathol Lab Med, 114: 407-411.
105
Tsonis PA, Goetinck PF. (1988) Expression of cartilage-matrix genes and localization of their translation products in the embryonic chick eye. Exp Eye Res, 46: 753-764. Wagener R, Kobbe B, Paulsson M. (1997) Primary structure of matrilin-3, a new member of a family of extracellular matrix proteins related to cartilage matrix protein (matrilin-1) and von Willebrand factor. FEBS Lett, 413: 129-134. Wagener R, Kobbe B, Paulsson M. (1998 a) Genomic organisation, alternative splicing and primary structure of human matrilin-4. FEBS Lett, 438: 165-170. Wagener R, Kobbe B, Paulsson M. (1998 b) Matrilin-4, a new member of the matrilin family of extracellular matrix proteins. FEBS Lett, 436: 123-127. Wagener R., Ehlen HW, Ko YP, Kobbe B, Mann HH, Sengle G, Paulsson M. (2005) The matrilins - adaptor proteins in the extracellular matrix. FEBS Lett, 579: 3323-3329.
Whittaker CA. Hynes RO. (2002) Distribution and evolution of von Willebrand/Integrin A domains: widely dispersed domains with roles in cell adhesion and elsewhere. Mol Biol Cell, 13: 3369-3387. Wiberg C, Klatt AR, Wagener R, Paulsson M, Bateman JF, Heinegård D, Mörgelin M. (2003) Complexes of matrilin-1 and biglycan or decorin connect collagen VI microfibrils to both collagen II and aggrecan. J Biol Chem, 278: 37698-37704. Wilson JW, Leduc EH. (1958) Role of cholangioles in restoration of the liver of the mouse after dietary injury. J Pathol Bacteriol, 76: 441-449. Winterbottim N, Tondravi MM, Harrington TL, Klier FG, Vertel BM, Goetinck PF. (1992) Cartilage matrix protein is a component of collagen fibril of cartilage. Dev Dyn, 193: 266276.
106
Wu JJ, Eyre DR.(1998) Matrilin-3 forms disulfide-linked oligomers with matrilin-1 in bovine epiphyseal cartilage. J Biol Chem, 273: 17433-17438. Xiao Y, Kleeff J, Guo J, Gazdhar A, Liao Q, Cesare PD, Büchler MW, Friess H. (2004) Cartilage oligomeric matrix protein expression in hepatocellular carcinoma and the cirrhotic liver. J Gastroenterol and Hepatol, 19: 296-302. Xiong ZW, Dan C, Guang RX. (2006) Extracelular matrix remodelling in hepatocellular carcinoma: effects of soil on seed? Medical Hypotheses, 66: 1115-1120. You LR, Chen CM, Lee YH. Hepatitis C virus core protein enhances NF-kappaB signal pathway triggering by lymphotoxin-beta receptor ligand and tumor necrosis factor alpha. J Virol. 1999. 73: 1672-1681.
107
11. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés alapjául szolgáló elsőszerzős közlemények jegyzéke: Szabó E., Lódi C., Korpos E., Batmunkh E., Rottenberger Z., Deák F., Kiss I, Tőkés AM., Lotz G., László V., Kiss A., Schaff Z., Nagy P. Expression of matrilin-2 in oval cells during rat liver regeneration. Matrix Biol, 2007. 26: 554-560. IF: 3,679 Szabó E., Korpos É., Batmunkh E., Lotz G., Holczbauer Á., Kovalszky I., Deák F., Kiss I., Schaff Zs., Kiss A. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Pathol Oncol Res, 2007. Accepted for publication, august 2007. IF: 1,241 Szabo E., Lotz G., Paska C., Kiss A., Schaff Z. Viral hepatitis: New data on hepatits C infection. Pathol Oncol Res, 2003. 9: 215-221. Szabó E., Páska C., Kaposi Novák P., Schaff Z., Kiss A. Similarities and differences in hepatitis B and C virus induced hepatocarcinogenesis. Pathol Oncol Res, 2004. 10: 5-11. Nem az értekezés alapjául szolgáló közlemények: Paska C., Bögi K., Szilák L., Tőkés A., Szabó E, Sziller I, Rigó J Jr, Sobel G, Szabó I, Kaposi-Novák P, Kiss A, Schaff Z. Effect of formalin, acetone, and RNA later fixatives on tissue preservation and different size amplicons by real-time PCR from paraffin-embedded tissue. Diagn Mol Pathol, 2004. 13: 234-240. IF 2,292 Lódi C., Szabó E., Holczbauer Á., Batmunkh E., Szíjártó A., Kupcsulik P., Kovalszky I, Paku S., Illyés G., Kiss A., Schaff Z. Claudin-4 differentiates biliary tract cancers from hepatocellular carcinomas. Mod Pathol, 2006. 19: 460-469.
IF 3,753 Batmunkh E., Tátrai P., Szabó E., Lódi C., Holczbauer A., Páska C., Kupcsulik P., Kiss A., Schaff Z., Kovalszky I. Comparison of the expression of agrin, a basement membrane heparan sulfate proteoglycan, in cholangiocarcinoma and hepatocellular carcinoma. Hum Pathol, 2007. 38: 1508-1515. IF: 2,81 Borka K., Kaliszky P., Szabó E., Lotz G., Kupcsulik P., Schaff Z., Kiss A. Claudin expression in pancreatic endocrine tumors as compared with ductal adenocarcinomas. Virchows Arch, 2007. 450: 549-557. IF 2,251 Megjelent, illetve elfogadott in extensio közlemények impakt faktora összesen: 16, 026 Az értekezéssel összefüggő, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstractok: Szabó E., Nagy P., Paku S., Korpos E., Kiss I., Deak F., Lódi C., Páska C., Kiss A., Schaff Z. High expression of matrilin-2 by stem cells in liver regeneration. 40th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, April 13-17, 2005, Paris, France. J Hepatol, 42. S2, 2005. Szabó E., Páska C., Deák F., Kiss I., Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Kiss A., Kovalszky I., Schaff Z. Matrilin-2, a novel extracellular matrix component in cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, April 13-17, 2005, Paris, France. J Hepatol, 42. S2, 2005.
109
Szabó E., Páska C., Lódi C., Batmunkh E., Holczbauer Á., Korpos É., Deák F., Kiss I., Kiss A., Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 07-11, 2005, Z. Gastroenterol, Issue 5. Volume 43. 2005. Egyéb kutatási témákból, lektorált folyóiratban megjelent idézhető abstractok: Szabó E., Kaposi Novák P., Kiss A., Páska Cs., Lotz G., Schaff Zs. Activation of beta-catenin pathway in human hepatocellular carcinoma negatively correlates to AFP and CD-44 expression. 46th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 1-5, 2004, Z. Gastroenterol, 42: 438, 2004. Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P., Páska C., Kiss A., Kupcsulik P., Kovalszky I, Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. 40th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, April 13-17, 2005, Paris, France, J Hepatol, 42. S2, 2005. Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P., Páska C., Kiss A., Kovalszky I., Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. 47th Annual Meeting of the Hungarian Society of Gastroenterology, Balatonaliga, June 7-11, 2005. Gastroenterol, 43, 2005. Lódi Cs., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Paku S., Kiss A., Kupcsulik P., Illyés Gy., Schaff Zs. High expression of claudin-4 in biliary carcinomas. 20th European Congress of Pathology, Paris, France, September 3-8, 2005, Virchows Arch, 447: 404, 2005. Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Kiss A., Illyés G., Paku S., Schaff Z., Nagy P. High expression of claudin-7 during liver regeneration.
41th Annual Meeting of the
European Association for the Study of the Liver, Viena, Austria, April 26-27, 2006, J Hepatol, 44. S2, 2006 Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Holczbauer Á., Paku S., Kupcsulik P., Illyés G., Kiss A., Schaff Z. Different claudin-4 expression on biliary and hepatocellular carcinomas. 41th
110
Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver, Vienna, Austria, April 26-27, 2006, J Hepatol, 44. S2, 2006. Egyéb kutatási témákból készült, nem idézhető abstractok: Kiss A., Páska C., Szabó E., Holczbauer Á., Szíjártó A., Kupcsulik P., Schaff Z. Markedly downregulated claudin-4 expression differentiates human hepatocellular carcinomas from metastatic liver tumors. Falk Symposium, Freiburg, Germany, October 16-17, 2004. Batmunkh E., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Tátrai P, Páska C., Kiss A., Kupcsulik P., Kovalszky I., Schaff Z. High expression of agrin in hepatocellular and cholangiocellular carcinoma. Falk Symposium, Berlin, Germany, October 3-4, 2005. Lódi C., Szabó E., Holczbauer Á., Batmunkh E., Kiss A., Illyés G., Paku S., Schaff Z., Nagy P. High expression of claudin-7 during liver regeneration. Falk Symposium, Berlin Germany, October 3-4, 2005.
Batmunkh E., Tátrai P., Lódi C., Holczbauer Á., Szabó E., Páska C., Kiss A., Kupcsulik P., Kovalszky I., Schaff Z. High expression of agrin in cholangiocarcinoma. Falk Symposium, Freiburg, Germany, October 10-11, 2006. Lódi C., Szíjártó A., Holczbauer Á., Szabó E., Batmunkh E., Kiss A., Illyés G., Schaff Z., Kupcsulik P. High expression of claudin-4 in human cholangiocarcinomas. 6th Congress of the European Hepato-Pancreato-Biliary Association, Heidelberg, Germany, May 25-28, 2005. Holczbauer Á., Halász J., Lódi C., Szabó E., Batmunkh E., Benyó G., Galántai I., Kiss A., Schaff Zs. Expression of claudins in human hepatoblastoma. 7th Ph.D. Conference at Semmelweis University, Budapest, Hungary, April 14-15, 2005. Szabó E., Orbán E., Lódi C., Batmunkh E., Holczbauer Á., Korpos E., Deak F., Kiss I., Kiss A., Schaff Z. Expression of matrilin-2 in liver cirrhosis and hepatocellular carcinoma. 1st Central European Regional Meeting, Liver and Pancreas Pathology, Eger, Hungary, june 1-3, 2006.
111
12. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Köszönetet mondok témavezetőmnek, Schaff Zsuzsa professzor asszonynak, aki lehetővé tette számomra, hogy a vezetése alatt álló Semmelweis Egyetem, II. sz Patológia Intézetben végezhessem PhD tanulmányaimat. Köszönöm mindenkori támogatását, rendkívüli türelmét, tanácsait és szakmai segítségét egyaránt. Köszönöm továbbá a részéről jövő kemény, de építő szavakat is. Szintén szeretném kifejezni köszönetemet dr. Kiss András docensnek, aki laborvezetőként mindig biztosította számunkra az anyagi és szellemi támogatást egyaránt, köszönöm a szakmai tanácsait és segítő emberi jó tanácsait. Hálás köszönettel tartozom dr. Deák Ferencnek és dr. Kiss Ibolyának, akik előkísérletei nélkül ez a munka nem született volna meg. Külön köszönöm dr. Deák Ferenc szakmai tanácsait, türelmét és hogy lehetővé tette számomra számos kísérlet elvégzését laboratóriumában. Hálás és baráti köszönettel tartozom dr. Korpos Évának és Rottenberger Zsoltnak, akik segítettek a kísérletek elvégzésében. Hasonlóképpen külön köszönöm dr. Nagy Péter egyetemi tanárnak minden jó tanácsát és szakmai támogatását. Valamint köszönöm dr. Kovalszky Ilona egyetemi tanárnőnek az értékes szakmai tanácsait. Köszönöm PhD társaimnak, hogy mindig segítségemre voltak, dr. Lódi Csabának, dr. Szász Attila-Marczellnek, dr. Holczbauer Ágnesnek, Német Zsuzsannának. Külön köszönettel tartozok dr. Batmunkh Enkjhargal kollégámnak, akivel végig együtt dolgoztam, és mindig számíthattam rá a segítségnyújtásban. Köszönöm dr. Tőkés Anna-Máriának a mindenkori bátorító szavait, értékes szakmai észrevételeit és tanácsait valamint baráti és emberi támogatását. Továbbá köszönettel tartozom dr. Páska Csilla biológus kollégámnak, aki sokat segített a módszertani alapok elsajátításában, dr. Lotz Gábor adjunktusnak a türelmét a fotók igényes elkészítésében. Szeretném kifejezni köszönetemet Szik Ágnesnek, Pekár Zoltánnénak, Azumahné Erzsébetnek és Oláh Júliának, akik a munkám gyakorlati részében nyújtottak nagy támogatását. Hasonlóan köszönettel tartozom az intézet minden munkatársának az általuk nyújtott segítségért, Rigóné Kálé Elvirának az angol nyelvű cikkek lektorálásáért és formába öntésért tartozom köszönettel. És végül, de nem utolsósorban szavakba nem önthető hálával tartozom Szüleimnek, különösképpen Édesanyámnak és Testvéremnek a támogatásukért.
112
