A LÉZER HATÁSA A RETINÁRA KÍSÉRLETES ÉS PATOLÓGIÁS KÖRÜLMÉNYEK KÖZÖTT
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal Semmelweis Egyetem Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Szemészet program
Témavezető: Dr. Süveges Ildikó egyetemi tanár, az orvostudományok doktora Hivatalos bírálók: Dr. Hatvani István, egyetemi tanár, kandidátus Dr. Facskó Andrea, egyetemi docens, kandidátus Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Salacz György egyetemi tanár, kandidátus Dr. Füst Ágnes egyetemi adjunktus, Ph.D. Dr. Vámosi Péter főorvos, Ph.D.
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
TARTALOM 1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE
4
2. BEVEZETÉS
5
3. CÉLKITŰZÉSEK
9
4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
10
4.1 A lézer fizikai alapjai és biológiai hatásai
10
4.1.1. A lézer teória
10
4.1.2. Lézerkezelés hatásmechanizmusa
11
4.1.3. Lézerkezelés a szemfenéken
13
4.1.4. A retinalis pigment epithelium (RPE)
14
4.1.5. Lézer interakciója a retinával és a retinalis pigment epithelium réteggel
15
4.1.6. Lézerfotokoaguláció szövettani hatása
17
4.1.7. Glutamát és GABA
18
4.2 Retinalis capillaris hemangioma, Fotodinámiás kezelés, Retinal vessel analyser
21
4.2.1. Fotodinámiás terápia (PDT)
21
4.2.2. Retinalis capillaris hemangioma (RCH)
22
4.2.3. Retinal Vessel Analyser (RVA)
24
5. MÓDSZEREK
26
5.1 RPE – lézerkezelés – biokémiai változások monitorizása
26
5.1.1. RPE sejtkultúra
26
5.1.2. Lézer fotokoaguláció
27
5.1.3. Hőmérsékleti mérések
28
5.1.3. WST-1 cell proliferáció reagens teszt
30
5.1.4. Glutamát és GABA felvétel
30
5.1.5. Protein meghatározás
31
5.1.6. Statisztika
31
5.2 Retinalis capillaris hemangioma, Fotodinámiás terápia, Retinal vessel analyser
31
5.2.1. Fotodinámiás terápia (PDT)
31
2
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
5.2.2. A retinális erek átmérőjének meghatározása Retinal Vessel Analyser (RVA) segítségével
33
6. EREDMÉNYEK
35
6.1. A direkt lézerkezelés hatása a porcin primer retinalis pigment epithel monolayer sejtkultúrában (in vitro vizsgálat)
35
6.1.1 RPE sejtkultúra
35
6.1.2. Hőmérsékletemelkedés
37
6.1.3. WST-1 cell proliferáció reagens teszt
40
6.1.4. Glutamát és GABA felvétel
40
6.2. A retinalis capillaris hemangioma (RCH) tápláló és elvezető ereinek a vizsgálata, nyomon követése Retinal Vessel Analyser (RVA) segítségével fotodinámiás kezelést (PDT) követően (Klinikai vizsgálat humán anyagon)
41
7. MEGBESZÉLÉS
47
7.1. A direkt lézerkezelés hatása a porcin primer retinalis pigment epithel monolayer sejtkultúrában
47
7.2. A retinalis capillaris hemangioma (RCH) tápláló és elvezető ereinek a vizsgálata, nyomon követése Retinal Vessel Analyser (RVA) segítségével fotodinámiás kezelést (PDT) követően
52
8. ÚJ EREDMÉNYEK ÉS KLINIKAI JELENTŐSÉGÜK
59
9. KÖSZÖNET NYILVÁNÍTÁS
60
10. ÖSSZEFOGLALÓ
61
11. SUMMARY
62
12. PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
63
13. IRODALOM
69
14. ÉRTEKEZÉS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ KÖZLEMÉNYEK MÁSOLATAI
85
3
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
1. RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE AMD – age-related macular degeneration (időskori macula degeneráció) CNV - choroidal neovascularisation (chorioideális érújdonképződés) CT - computer tomográfia DMEM - Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium (Dulbecco által módosított Eagle féle minimális médium) EAAC - excitatory amino acid transporter (excitatórikus aminosav transzporter) EM – elektronmikroszkóp Epo – erythropoetin ETDRS - Early Treatment Diabetic Retinopathy Study FLAG - fluorescein angiográfia GLAST – glutamate-aspartate transporter (glutamát-aszpartát transzporter) GLT – glutamate transporter (glutamát transzporter) HIF - hypoxia-inducible factor (hypoxia kiváltó faktor) ICG - Indocyanin zöld angiográfia IPM - interfotoreceptor mátrix KRH - Krebs-Ringer-Hepes-glükóz médium MR – mágneses rezonancia Nd:YAG - neodymium yttrium aluminium garnet NTC - negative temperature coefficient (negatív hőmérséklet koefficiens) OCT – optical coherence tomography (optikai koherencia tomográfia) PDT – photodynamic therapy (fotodinámiás terápia) RCH - retinalis capillaris haemangioma RPE - retinalis pigment epithelium RVA- retinal vessel analyser (retinalis éranalizáló készülék) SD – standard deviáció TCA - triamcinolon acetát VEGF - vascular endothelial growth factor (vascularis endotelialis növekedési faktor) VHL - von Hippel-Lindau
4
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
2. BEVEZETÉS
A lézert a szemészeteben alkalmazták először gyógyításra. Kezdetben csak olyan lézerek voltak, amelyek hőhatását használták fel. Később, különböző lézerek felfedezésével más szövettani hatásokat is elérhettünk. Így alakult ki napjainkra az a lézersebészet, amely a lézerek hármas szövettani hatását használja fel a szemészetben: a koagulációt, a diszrupciót és az ablációt. A koaguláció elsősorban hőhatáson alapul és a retina patológiás folyamataiban alkalmazzuk. A diszrupció a szövetek folytonosságának megszakítását jelenti zárt szemgolyóban. Ezt az effektust pl. a glaukoma sebészetében, iridotomia végzésére alkmazzuk. Az abláció a refraktív sebészet alapja, a lézer effektusa szöveti elpárologtatást eredményez a szaruhártya felszínén. A szemészeti lézerkészülékek a gyakorló szemész mindennapos életében elengedhetetlenek. Leggyakrabban azon lézerek kerülnek alkalmazásra, amelyek hatása hőn alapul. Ezek a kezelések koagulációt hoznak létre. Mivel a hőt a pigment tartalmú szövetek, sejtek nyelik el, a koagulációval kiváltott hegesedés gyógyító effektusa kiválóan alkalmazható a retina betegségeiben a retinalis pigment epithelium (RPE) magas pigment tartalma miatt. Jelen munkánkban ezen lézerek hatáásval foglalkoztunk. Szemfenéki alkalmazunk:
lézerkezeléseket
időskori
macula
leggyakrabban
degenerációban
a
(AMD),
következő
betegségekben
diabéteszes
proliferatív
vitreoretinopátiában, diabéteszes makula ödémában, vénás ág-, és törzselzáródások esetén, perifériás retina szakadás esetén és még számtalan egyéb szemfenéki elváltozásban (Macular Photocoagulation Study Group 1982; Branch Vein Occlusion Study Group 1986; Macular Photocoagulation Study Group 1986; Macular Photocoagulation Study Group 1986; Blodi, Russell et al. 1990; Berger and D'Amico 1997; Bressler 2002; Ells, Uphill et al. 2002; la Cour, Kiilgaard et al. 2002; Costa, Meirelles et al. 2003). Az előbbiekben felsorolt betegségekben az alkalmazott lézerkezelés egyik hatása a direkt fotokoaguláció. A kezelés során a retinalis pigment epithelium (RPE) az a réteg, mely a lézer-közvetített energia legnagyobb részét elnyeli (Del Priore, Glaser et al. 1989), s a
5
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
lézerkezelést követő változásokban is igen jelentős feladatot játszik. A RPE réteg ezen kívül kulcsfontosságú szerepet játszik a neuroretina és a chorioidea összeköttetésében is, a külső vér-retina gátat alkotván. Szerepe nem csak egyszerűen egy mechanikus horgonyzó szerepben nyilvánul meg, hanem a retina és chorioidea köztött zajló anyagcsere folyamatokban is fontos feladatot lát el (Del Priore, Glaser et al. 1989; Semkova, Kreppel et al. 2002). A retina lézerkezelése során a lézersugár a kezelt területen, fotokoaguláció következtében direkt sejtroncsoló hatással bír. Ezen felül –a kezelés során- egy másodlagos hatással is számolnunk kell: a lézersugár környezetében a nagyfokú hőmérséklet növekedés hatásával. Ez a hatás arányos a keletkezett hő mennyiségével, vagyis az alkalmazott lézerkezelés energiájával. A kezelést követő sejtválasz és/vagy sejtkárosodás direkt hisztológiai és biokémiai módszerekkel vizsgálható (Tsang, Yew et al. 1986; Del Priore, Glaser et al. 1989; Roider, Michaud et al. 1992; Schmidt-Erfurth, Laqua et al. 2002). A szemészeti gyakorlatban a jelenleg alkalmazott lézerkezelések gyakori eredménye a szövetek fotokoagulációt követően keletkező színváltozása, pl. a retina elfehéredése. A retina elfehéredése azt mutatja, hogy lézerkezelést követően maga a látóhártya is károsodást szenved. A kezelés után jelentkező nem kívánt mellékhatások is erre a tényre vezethetőek vissza. Nemrégiben napvilágot látott publikációk alapján azt feltételezik, hogy a retina teljes vastagságára gyakorolt hatás nem szükséges a lézerkezelés terápiás hatásának az eléréséhez (Lanzetta, Dorin et al. 2001; Desmettre, Mordon et al. 2006). Állatkísérletek azt bizonyítják, hogy terápiás hatás létrehozható a retinalis pigment epithelium sejtjei körül, anélkül, hogy a felette elhelyezkedő retina komolyabb károsodást szenvedne. Ezek a publikációk vezettek és vezetnek a „Non Ophthalmoscopically Visible Endpoint Photocoagulation”, azaz a „biomikroszkóposan nem látható fotokoaguláció” fogalmának a létrehozásához (Lanzetta, Dorin et al. 2001; Brinkmann, Roider et al. 2006). Ez utóbbi tényt támasztja alá az is, hogy a RPE és a fotoreceptorok részleges destrukciója elegendő ahhoz, hogy csökkenjen a retina külső rétegének az oxigén felhasználása és, hogy növekedjen az oxigén koncentrációja a retinában (Yu, Cringle et al. 2005).
6
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
A lézerkezelés speciális formája az a 689 nm hullámhosszú „nem termális” dióda lézer, amely vetreporfin aktiválásával érújdonképződéseket roncsol el a környező szövetek károsítása nélkül. Az effektust fotodinámiás kezelésnek (PDT) nevezzük. A vetreporfinnal történő (Visudyne®) kezelés felfedezéséig egyedül a lézer fotokoaguláció rendelkezett bizonyított hatással időskori makula degeneráció (AMD) szövődményeként kialakult subretinalis chorioideális érújdonképződés kezelésében (CNV). A fotokoaguláció a juxta-, ill. extrafoveálisan elhelyezkedő CNV-k esetén végezhető, s e kezelés végeredményeként kisebb retinális terület károsodik, mint kezelés nélkül, a természetes lefolyás végeredményeként. A fokális lézerkezelésnek azonban hátránya is létezik: a lézerkezelés helyén azonnali retinakárosodás és/vagy pusztulás jön létre, az ennek a területnek megfelelő irreverzibilis látótérkieséssel (Macular Photocoagulation Study Group 1982; Macular Photocoagulation Study Group 1986; Macular Photocoagulation Study Group 1986; Macular Photocoagulation Study Group 1991; Macular Photocoagulation Study
Group
1991;
Macular
Photocoagulation
Study
Group
1991;
Macular
Photocoagulation Study Group 1993; The Canadian Ophthalmology Study Group 1993; Macular Photocoagulation Study (MPS) Group 1994; Macular Photocoagulation Study Group 1994; Macular Photocoagulation Study Group 1994; Macular Photocoagulation Study
Group
1994;
Macular
Photocoagulation
Study
Group
1995;
Macular
Photocoagulation Study Group 1996; Macular Photocoagulation Study Group 1996; Macular Photocoagulation Study Group 1997). A fotodinámiás kezelés során az előbb említett irreverzibilis retinakárosodás kiküszöbölése a cél. A Visudyne® kezelés primer mechanizmusa a CNV szelektív károsítása, a felette elhelyezkedő retina károsodása nélkül. A lézerkezelés szelektív hatását egy exogén anyag, a verteporfin segítségével érjük el, s a kezelés végeredménye az ún. szelektív vasookklúzió (Elsner and Schmidt-Erfurth 2002; Gierek-Lapinska, Wykrota et al. 2002; Haddad, Coscas et al. 2002; Michels, Barbazetto et al. 2002; Schlotzer-Schrehardt, Viestenz et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002). A kezelést nemcsak AMD esetén megfigyelt subretinalis, subfoveális érújdonképződések esetén használhatjuk, de alkalmazhatjuk egyéb subfoveális, subretinalis érújdonképződéssel járó betegségekben, pl. patológiás myopiában, angioid streaks eseteiben, feltételezett okuláris hisztoplazmózisban, és kifejezett kapilláris
7
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
hálózattal rendelkező vaszkuláris tumorok kezelésében is (Atebara 2002; Schmidt-Erfurth, Kusserow et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002; Jurklies, Anastassiou et al. 2003; Montero and Ruiz-Moreno 2003; Rogers, Duker et al. 2003; Torron FernandezBlanco, Perez Olivan et al. 2003; Krebs, Binder et al. 2004). Jelen dolgozat első részében a lézerkezelés során felszabaduló hőhatás által okozott biokémiai változásokat vizsgáltuk. A második felében beszámolunk egy retinális vaszkuláris tumor PDT kezelése során szerzett tapasztalatainkról is.
8
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
3. CÉLKITŰZÉSEK
A bevezetőben említettek alapján nyilvánvaló, hogy a hőhatáson alapuló koagulációs effektus által okozott hegesedés –és így a terápiás effektus- függ a közölt hő mértékétől, ill. annak szövetfelmelegítő hatásától. A koaguláció helyén és környezetében olyan celluláris károsodások keletkeznek, amely végső eredménye a heg kialakulása. A kívánatos terápiás hatás és a roncsoló, nem kívánatos effektus között humán alkalmazás esetében nagyon kevés az átmenet. Mivel az előbbiekben említett hatásokat és azok összefüggését in vivo vizsgálni nehéz, in vitro kísérleteket végeztünk sejtkultúrában. Célul tűztük ki: 1. a hőmérsékletváltozások mérését lézerkezelés után sejtkultúrában, 2. a sejtek károsodásának vizsgálatát GABA-, ill. glutamát felvétel monitorozásával. Speciális lézer fotodinámiás hatását in vivo vizsgáltuk retina angiomatózisában: 1. vizsgáltuk az angioma hegesedését, 2. az angioma vérellátásának csökkenését az oda-, ill. elvezető erek átmérőjénk a mérésével, 3. megfigyelhető-e az erek elzáródása, átmérőjének csökkenése, 4. milyen mértékben érintett a folyamatban az angioma tápláló, ill. elvezető ere, 5. változik-e az ereken bekövetkezett átmérőváltozás az idő elteltével?
9
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
4. IRODALMI ÁTTEKINTÉS
4.1 A lézer fizikai alapjai és biológiai hatásai
4.1.1. A lézer teória Albert Einstein 1917-ben írta le a spontán emisszió, abszorpció, stimulált emisszió fogalmakat. Spontán emisszió akkor történik, amikor egy magasabb energia állapotban lévő atom alacsonyabb energiájú szintre esik, s a két energiaszint közti különbséget elektromágnes sugárzás formájában, fotonként emittálja. Abszorpció akkor jön létre, amikor a beeső energia következtében, az energiát felvevő atom excitációs szintre kerül. Amikor az excitációs szinten lévő atomnak egy olyan foton csapódik, amely ugyanakkora energiával rendelkezik, mint az atom két energiaszintjének a különbsége, akkor az atom alapszintjére kerül ismét, és egy fotont kibocsát magából. A kibocsátott foton energiája és iránya megegyezik a becsapódó fotonéval. A stimulált emisszió az a folyamat, amikor a bejövő foton egy másik foton emisszióját stimulálja és két azonos hullámhosszú, irányú és fázisban lévő foton emisszióját eredményezi (Damjanovich S 2006). A lézer (laser) szó ACRONYM szó, a „Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation” kifejezésből származik. Három összetevő szükséges a lézer létrehozásához: aktív médium, melynek stimulált emissziója történik, energia bevitele a rendszerbe, ami a pumpálás néven ismeretes, ill. rezonáló üreg, ami oszcillációt, erősítést és a fotonok szelektív felszabadulását engedélyezi. A lézer tulajdonságai: a monokrómság, az irányíthatóság, az időbeli és térbeli koherencia, a polarizáció és az intenzitás. A monokromotivitás a lézer fény emittált hullámhosszára utal. Ennek köszönhető, hogy a megfelelő hullámhosszúságú fény csak a kívánt célszövetet károsítja. Az irányíthatóság azt jelenti, hogy a lézer fény divergenciája kicsi, ezért viszonylag nagy távolságot képes megtenni, anélkül, hogy a lézersugár jelentősen szélesedne.
10
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
A koherencia jelenti a keletkezett fotonok időbeli és térbeli szinkronját. A polarizáció következtében valósul meg a lézerfény maximális energia transzmissziója, a visszaverődés energiacsökkentő hatása nélkül. Az elektromágneses sugárzás leírására különböző paraméterek használhatóak. A sugárzó energiát joule-ban mérjük (J, 1 joule = 1 watt x 1 secundum), a sugárzó teljesítményt wattban (W, 1 watt = 1 joule/1 secundum). A lézersugárzás az egységnyi felszínre eső teljesítmény (W/cm2), míg a sugárzó energia sűrűsége az egységnyi felszínre eső energia (J/cm2) (Damjanovich S 2006).
4.1.2. Lézerkezelés hatásmechanizmusa A lézerkezelés szövetekre gyakorolt hatása a következő hatásokra oszthatók: fotokémiai, ionizáló és termális. Ezen hatások mértékét a lézersugárzás, a hullámhossz és az expozíciós idő határozzák meg (Tasman W 2001). A fotokémiai hatás a koagulációs küszöbhatás alatti sugárzás alatt következik be, akkor, ha alacsony hullámhossz mellett az expozíciós idő több mint 1 microsecundum. A foton abszorpciója kémiai hatást vált ki. A folyamat jó példája a fotoabláció, ill. a fotodinámiás kezelés (Novartis 2001). Az ionizáló hatás elérésére magas energia és rövid expozíciós idő (nanosecundum, vagy picosecundum) szükséges. Ez az energia kiszakítja az elektronokat az atomokból és a molekulákból, ami a célszövet dezintegrációját és ionokra ill. elektronokra való hullását eredményezi. Az ionizáló hatás legismertebb példája a Nd:YAG lézer fotodiszrupciót okozó hatása (Gabel, Neubauer et al. 1985; Hiemer, Hutter et al. 1985; Hutter, Hiemer et al. 1985; Neubauer, Gabel et al. 1985; Steinert and Puliafito 1987; Lilledahl, Nicolaissen et al. 1988; Berger and D'Amico 1997). A termális hatás alatt értjük a fotokoagulációt és a fotovaporizációt. E két hatás akkor jön létre, ha a sugárzás moderált, a behatási idő hosszabb, mint 1 microsecundum és a fotokémiai hatás eléréséhez szükséges hullámhossznál nagyobb hullámhossz alkalmazása
11
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
esetén (Mellerio 1966; Birngruber, Hillenkamp et al. 1985; Hutter, Hiemer et al. 1985; Krauss, Puliafito et al. 1987; Berger 1997). Fotovaporizáció akkor következik be, ha a lézer energia nagyfokú felvétele esetén a szövethőmérséklet a víz forráspontjának hőfokát meghaladja, ami szövetszétesést eredményez. A CO2 lézerek említhetőek meg példaként (Mellerio 1966; Mellerio 1966; Birngruber, Hillenkamp et al. 1985; Puliafito, Deutsch et al. 1987). A lézerkezelések során kialakuló leggyakoribb hatás a fotokoaguláció (Mellerio 1966; Wieder, Pomerantzeff et al. 1981; Pomerantzeff, Timberlake et al. 1984; Stratas, Weipert et al. 1986; Roider, Michaud et al. 1992). A folyamat során a retina és a chorioidea fokális felmelegedése következik be. Fotokoaguláció során a foton abszorpciója és/vagy molekuláris vibráció olyan mértékű hőmérsékletemelkedéshez vezet, ami elég a szövetek denaturációjához, és a célszövet strukturális változásához. A retina hőmérsékletének 10-20 °C-os növekedése enzim inaktiváláshoz, protein denaturációhoz, szöveti nekrózishoz, hemosztázishoz és koagulációhoz vezet (Mellerio 1966; Marshall and Mellerio 1967; Del Priore, Glaser et al. 1989; Roider, Michaud et al. 1992). Fotokoaguláció okozta léziók a lézerkezelést követően rögtön láthatóak, a lézerkezelés következtében kialakult sejtnekrózisnak köszönhetően (Puliafito, Deutsch et al. 1987; Del Priore, Glaser et al. 1989; Roider, Michaud et al. 1992). A lézerkezelés elhúzódó hatása a gyulladásnak, a repair folyamatoknak, a sejtproliferációnak, a migrációnak és a hegképződésnek köszönhető. A fotokoaguláció hatását befolyásoló tényezők közé tartozik a leadott energia nagysága, az expozíciós idő, a lézerfény szóródása a törőközegeken való áthaladás során, ill. a szövet abszorpciós tulajdonságai (May, Klein et al. 1976; May, Klein et al. 1979; Branch Vein Occlusion Study Group 1986; Hiroshiba, Ogura et al. 1998). A lézer-okozta termális károsodás nagysága egyenesen arányos a szövetek hőmérsékleti növekedésének nagyságával és időtartamával. Szemészeti lézerek esetén a lézergóc nagysága a fókuszált lézersugár átmérőjével azonos, területének kiszámításához a πr2 képlet használható. A nagyobb góc középpontjának a lehűlése lassabb, mivel a közvetlen környezete is magas hőmérsékletű. Ezzel szemben kisebb gócok esetén a hő környező szövetekbe való diffundálása jelentősebb. Ezért van az, hogy kisebb gócátmérő esetén nagyobb energiát kell alkalmazni az azonos centrális hatás
12
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
eléréséhez. A gócátmérő kétszeres növekedése esetén (ami a területet négyszeresére növeli),
kevesebb,
mint
négyszeres
energianövelésre
van
szüksége
azonos
hőmérsékletelemelkedéshez (Tasman W 2001). Emellett nem szabad elfeledkeznünk arról sem, hogy a keletkezett hő passzív diffúzió és a szöveti keringés következtében a közvetlen célszövet területéről elvezetődhet. A jelenleg fotokoagulációkor használatos expozíciós idők esetén a neuroszenzoros retina is sérülhet a keletezett hő hatására. Ez az említett hőhatás következményesen befolyásolhatja a végső látóélességet is (Birngruber, Hillenkamp et al. 1985; Hutter, Hiemer et al. 1985; Krauss, Puliafito et al. 1987). Összefoglalva elmondhatjuk, hogy a retinában elnyelődő fényenergia hőenergiává alakul át, így növelve a szövetek hőmérsékletét. A megnövekedett hőmérséklet a sejtekben kémiai folyamatokat indít el, majd azok szétesését okozhatja. A lézerkezelést modelláló matematikai modellek szerint a szöveti hőmérsékletemelkedés mintegy 10-65˚C-os (Birngruber, Hillenkamp et al. 1985). A lézerfotokoaguláció során történő retinális hőmérséklet megmérése nehéz feladat. A mérőműszernek megfelelően kicsinek kell lennie, mivel a lézerkezelés során a gócátmérő mikrométeres nagyságrendű. Emellett a mérőműszer nem lehet hatással a környező szövetekre sem. Korábbi vizsgálatok során bebizonyosodott, hogy a fókuszált lézergócot határoló területen a lérezkezelés után a hőmérséklet eléri a 60˚C-ot (Mellerio 1966; Krauss, Puliafito et al. 1987). Ezen a magas hőmérsékleten a protein denaturálódik. A lézerkezelés következtében bekövetkező hőmérsékletemelkedés a retina csak egy meghatározott részében figyelhető meg. Pl. 0.5 mm-re a lézergóc közepétől a hőmérsékletemelkedés már csak kb. 2˚C-os (Birngruber, Hillenkamp et al. 1985; Hutter, Hiemer et al. 1985; Krauss, Puliafito et al. 1987).
4.1.3. Lézerkezelés a szemfenéken A sugárzó energia szemre gyakorolt hatását már Socrates leírta, aki egy napfogyatkozás védőeszköz nélküli megfigyelése után kialakult szoláris retinopátiáról számolt be. 1945-ben Meyer-Schwickkerath hasonlóságot vélt felfedezni a napfogyatkozás okozta szemfenék
13
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
léziók, és a diatermiával okozott szemfenéki elváltozások között (Meyer-Schwickerath 1959). Terápiás célból ezt követően többféle energiaforrást vizsgált, amelyek sugárzó energiát képesek a szemfenékre juttatni. 1956-ben xenon kisülést alkalmaztak retinalis fotokoaguláció során. A szemészeti első kereskedelmi lézer 1963-ban jelent meg, rubint lézerként. A technológia rohamszerű fejlődése hamar lecserélte az imént említett xenon, ill. rubint lézert argon-, krypton-, festék-, és dióda lézerre. A lézer, hatásos és precíz energia átvitelt eredményez, mely kezelés során a környező szövetek károsodása minimalizálható. A szem optikai jellemzői, a retina lézer fény általi megközelíthetősége, ill. a retinában megtalálható kromofórok teszik a lézerkezelést oly praktikussá.
4.1.4. A retinalis pigment epithelium (RPE) A retinalis pigment epithelium sejtrétege egyedülálló a szemben. Embriológialag ugyanazokból a sejtekből fejlődik, mint a neuroszenzórikus retina, azonban szekretórikus epitheliummá differencionálódik a fejlődés során (Soubrane 1995; Marmor MF 1998). Habár fotoreceptív, ill. idegi funkciókkal nem rendelkezik, elengedhetetlen szerepe van a fotoreceptorok életben tartásában, azok táplálásában (Tsang, Yew et al. 1986; Roider, Michaud et al. 1992). Szerepe van még ezen kívül a megfelelő környezet fenntartásában, növekedési faktorok szintetizálásában. Anatómiailag több mint egy évszázaddal ezelőtt felfedezték, élettani tulajdonságai azonban csak az utóbbi évtizedekben kerültek felismerésre (Marmor MF 1998). Nevét a benne szintetizálódó melanin pigmentről kapta, ami citoplazmatikus szemcsék formájában van jelen. Ezeket melanoszómának nevezzük. A szervezetben az első szövet a RPE, ami pigmentálttá válik, s a pigmenttermelés az egész élet során folytatódik (Whittaker 1963). Az életkor előrehaladtával ezek a szemcsék lizoszómákkal egyesülnek, feltöredeznek. Ezért van az, hogy idősebb korban a szemfenék pigmenttartalma látszólag csökken. A pigment szerepe mind a mai napig spekulatív: feltehetően a szórt fény abszorpciója révén, a szórt fény zavaró hatását csökkenti, ami optikai előnyökhöz vezethet (Soubrane 1995).
14
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Egy másik RPE pigment a lipofuscin, ami az élet előrehaladtával akkumulálódok az RPE sejtrétegben. A lipofuscin az idegrendszer „öregedési” pigmentje, amely már fiatal korban is
nyomokban
kimutatható
a
szervezetben.
Szerepet
játszik
időskori
makula
degenerációban, Stargardt betegségben, ill. Best vitelliform disztrófiában is (Marmor MF 1998). A RPE szerepet játszik a retinalis adhézió fenntartásában, mely a neuroretina és a chorioidea
közötti
kapcsolat
fenntartásában
játszik
fontos
szerepet.
Feladata
elengedhetetlen az interfotoreceptor mátrix (IPM) fenntartásában és a külső retina-vér gát alkotásában. Az IPM magas struktúráltsággal rendelkező anyag, amely a pálcikákat és a csapokat veszi körbe (Soubrane 1995). Egy másik fotoreceptor-RPE interakció része a fotoreceptor külső segmentum megújulása. Amint a bőrünk, a fotoreceptorok is állandó fényhatásnak, és oxigénnek vannak kitéve. Ezek a folyamatok szabadgyökök képződését elősegítik, ami idővel a sejtmembránok károsodását idézik elő. Emiatt a fotoreceptorok külső segmentuma egy életen keresztül nem működhet. Ez az oka annak, hogy a RPE sejtek fagocitálják a fotoreceptorok disztális lemezének végét, amik időről időre megújulnak. A RPE réteg szerepe a termosztatikus regulációban is megmutatkozik. Végül, de nem utolsó sorban, fontos szerepet játszik a felszabaduló neurotranszmitterek felvételében is (Derouiche and Rauen 1995; Lehre, Davanger et al. 1997; Maenpaa, Mannerstrom et al. 2002; Mannerstrom, Zorn-Kruppa et al. 2002).
4.1.5. Lézer interakciója a retinával és a retinalis pigment epithelium réteggel A lézerkezelés hatása az alkalmazott lézer fajtáján kívül a célszövet tulajdonságaitól is nagyban függ. A kezelt szövet a lézer energiáját elnyelheti, átengedheti, szórhatja és visszaverheti. A szem törőközegei a 380-1400 nm hullámhosszúságú lézerfényt engedik át, transzpupilláris alkalmazás esetén. 380 nm-nál rövidebb –ultraibolya- hullámhosszúságú fény a corneában és a szemlencsében nyelődik el, míg a 1400 nm-nál nagyobb hullámhosszúságú fény esetén az abszorpció a vízre korlátozódik (Mellerio 1966; Marshall
15
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
and Mellerio 1967; Wieder, Pomerantzeff et al. 1981; Branch Vein Occlusion Study Group 1986; Puliafito, Deutsch et al. 1987; Blodi, Russell et al. 1990; Hiroshiba, Ogura et al. 1998). A szemfenéken a beérkező fényt potenciálisan öt különböző pigment nyelheti el (1. ábra): a retinális és chorioideális keringésben lévő hemoglobin, az RPE és a chorioidea területén lévő melanin, az RPE-ben megtalálható lipufuscin, a külső- és belső plexiform rétegben lévő xantophyll, ill. a fotoreceptorok rodopszin és csap fotopigmentje. A fotokoagulációban fő szerephez a melanin, a hemoglobin és a xantophyll jut. Idősebb korban a lupofuscin kap potenciálisan szerepet a fény elnyelésében (King and Geeraets 1968; Tsang, Yew et al. 1986; Del Priore, Glaser et al. 1989; Roider, Michaud et al. 1992).
1.
ábra.
Szemfenéki
pigmenek
abszorpciós
koefficiense
a
hullámhosszhoz
függvényében (Hittela 2001)
Lézer fotokoaguláció során az energiaabszorpció nagyrészt a melaninban történik. A melanin abszorpciós maximuma 400-700 nm között van, a kék, a zöld, a sárga és a vörös hullámhosszúságú fényt csökkenő mértékben nyeli el. A belső retinális keringésben és a chorioidea keringésében jelenlévő hemoglobin a célpontja azoknak a lézerkezeléseknek, amikor a cél az eresztő erek károsítása, ill. elzárása. A vörösnél alacsonyabb hullámhosszú fényeknek ez elnyelődése jelentős a hemoglobinban.
16
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
A perifoveális régióban található sárga xantophyll pigment az 500 nm-nél alacsonyabb hullámhosszú fényt erősen abszorbeálja.
4.1.6. Lézerfotokoaguláció szövettani hatása A lézerfotokoaguláció hatásának vizsgálatára számos állat-, ill. humánkísérlet született különböző hullámhosszúságú lézerek alkalmazásával (King and Geeraets 1968; Pomerantzeff, Kaneko et al. 1976; Wieder, Pomerantzeff et al. 1981; Tsang, Yew et al. 1986; Del Priore, Glaser et al. 1989; Roider, Michaud et al. 1992; Berger and D'Amico 1997; Bridges, El-Sherbeny et al. 2001; Schlotzer-Schrehardt, Viestenz et al. 2002; Semkova, Kreppel et al. 2002). Lézerkezelést leggyakrabban egy meglévő patológiás elváltozással rendelkező szemen végzünk, és megállapíthatjuk, hogy maga az elváltozás, ill. az alkalmazott lézer fajtája a kezelés hatását befolyásolhatja. Ezzel szemben kevés olyan klinikai tanulmány létezik, melyek a különböző hullámhosszúságú lézerkezelések terápiás hatását hasonlítja össze. Ezek a tanulmányok nem találtak lényeges különbséget az eltérő lézerkezelések klinikai hatásossága között (Marshall and Mellerio 1967; Pomerantzeff, Kaneko et al. 1976; Birngruber, Hillenkamp et al. 1985; Marshall 1989). In vivo tanulmányok eredményei szerint alacsonyabb lézerenergia használata esetén a lézerkezelés következtében bekövetkező hatások a retina külső rétegeit érintik elsősorban. Létezik egy centrális terület, ahol a lézer pusztító hatása irraverzibilis. Ezt gyűrű formájában veszi körül egy reverzibilisen károsodott zóna. Ezen a területen kijjebb haladva károsodás már nem volt megfigyelhető. Nagyobb energia használata esetén a retina egész vastagságában
változások
következnek
be.
Ezen
változások
következményeként
vitreoretinalis adhéziók alakulhatnak ki. A folyamat végeredménye hegszövet kialakulása. Amennyiben porcin RPE és Bruch membrán szövetkultúrát kezeltek lézerrel in vitro körülmények között, a lézerkezelés következtében a RPE réteg sérülése, majd a Bruch membránról való felszakadása volt megfigyelhető. A kezelt területet egy héttel a kezelés
17
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
után szövettörmelék borította be legalább egy hónapon keresztül. (Del Priore, Glaser et al. 1989). A lézerkezelést elszenvedett RPE sejtréteg regenerációja a periféria felől, a kezelést túlélő sejtek felül indul meg. A Bruch membránnal párhuzamosan, egy a RPE sejtekkel morfológiailag heterogén epiteliális sejtréteg jön létre. Kis gócátmérő esetén ez a folyamat a lézerkezelés után 2-3 héttel kialakul, helyreállítván a külső vér-retina gátat. A regenerálódott területen ugyan fénymikroszkóppal morfológiailag ép sejteket látunk, EMpal irregulárisak az apikális mikrovillusaik és melanoszómáik elrendezése (Tsang, Yew et al. 1986; Del Priore, Glaser et al. 1989; Roider, Michaud et al. 1992). In
vivo
kísérlet
szerint,
amennyiben
ismételt
microsecond
lézerkezelést
alkalmazunk csincsilla szürke nyulakban, s oftalmoszkóppal nem látható a lézergóc, a post mortem szövettani vizsgálat során a neuroretina csökkent károsodása figyelhető meg (Roider, Michaud et al. 1992). Morfológiai vizsgálatok alapján a szerzők az alkalmazott energiák alapján két hétre becsülték a RPE funkciójának normalizálódását a kezelést követően.
4.1.7. Glutamát és GABA A γ-aminovajsav (GABA) az emlősök idegrendszerében a legfontosabb szereppel rendelkező gátló neurotranszmitter (Mosinger, Yazulla et al. 1986; Yazulla 1986; Yazulla, Studholme et al. 1986; Yazulla 1986.; Hertz 1988.; Sivakami, Ganapathy et al. 1992; Johnson, Chen et al. 1996). 1950-ben Roberts és Awapara munkássága során került felfedezésre a molekula. 1950 és 1965 között végzett elektrofiziológiai vizsgálatok feltételezték az emlősök központi idegrendszerében betöltött szerepét. Ezt követően derült fény arra, hogy a vegyület a neurotranszmitterekre jellemző öt kritériumnak megfelel. Ezek a következőek: a vegyület jelen van az idegvégződésben, felszabadul az elektromosan stimulált neuronokból, létezik olyan mechanizmus, amely a vegyület hatását gátolni tudja, hatása megegyezik azzal a hatással, amelyet a gátló neuronok gyakorolnak a célneuronokra, és létezik specifikus receptora. A GABA központi idegrendszerben játszott
18
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
szerepe szerteágazó. Többek között szerepe van epilepsziában, alkoholizmusban, skizofréniában, alvási zavarokban, Parkinson betegségben, ill. mentális retardációban is (Yazulla 1986; Yazulla 1986.; Hertz 1988.; Jorgensen, Brooksbank et al. 1990; Hertz, Peng et al. 1998; O'Brien, Esguerra et al. 2004). A vegyület L-glutamátból szintetizálódik, dekarboxiláció során. A folyamatot -a főleg az agy szürke állományában megtalálható- pyridoxál foszfát-függő L-glutamát dekarboxiláz enzim végzi (Yazulla 1986; Yazulla, Studholme et al. 1986; Hertz 1988.; Balazs and Hack 1990; Massey 1990. ; Amato, Ballerini et al. 1994; Amato, Barbour et al. 1994; Miyamoto and Del Monte 1994; Derouiche and Rauen 1995; Furness and Lehre 1997; Lehre, Davanger et al. 1997; Ullensvang, Lehre et al. 1997; Hertz, Swanson et al. 1998; Bridges, Kekuda et al. 2001; Maenpaa, Mannerstrom et al. 2002). A GABA hatás kutatása során derült fény arra, a GABAerg molekulák vizsgálata során, hogy különböző GABA receptorok léteznek. A GABA hatása a retinában, főleg a horizontális és amakrin sejtek szintjében történő ingerületvezetés gátlásában nyilvánul meg. A
glutamát
szerepe
szintén
a
központi
idegrendszerben
végbemenő
neurotranszmisszióban van. A GABA-tól eltérően szerepe nem a folyamatok gátlásában, hanem az ingerülettovábbítás serkentésében van. A GABA receptorokhoz hasonlóan különböző receptorai ismeretesek. Alacsony koncentrációban a molekula a központi idegrendszer szinte mindegyik neuronját ingerli (Nistico, De Sarro et al. 1983; Yazulla 1986; Yazulla, Studholme et al. 1986; Hertz 1988.; Amato, Barbour et al. 1994; Hertz, Swanson et al. 1998; O'Brien, Esguerra et al. 2004). A retinában, a bipoláris sejtekben és a fotoreceptorokban a glutamát a primer serkentő neurotranszmitter. L-glutamát (glu), L-aszpartát és néhány egyéb neurotraszmitter a fotoreceptorok külső szegmentumának a fagocitózisát serkentik. A RPE sejtek és a fotoreceptorok külső segmentuma közötti információközvetítésben is szerepet játszanak. Ezen kívül Na+ dependens és oubain érzékeny glutamát áramlás figyelhető meg a retina felől a chorioidea felé. 1994-ben három különböző glutamát transzporter került leírásra. Majd ezt követően még kettő glutamát transzporter került felfedezésre. A fehérje molekulák működése
19
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
szempontjából fontos aminosav-szekvencia 50%-os azonosságot mutat a különböző glutamát transzporterek tekintetében. Jelenleg, a glutamátra öt magas affinitású aminosav transzporter ismeretes: az EAAT1 /excitatory amino acid transporter/ (GLAST, glutamátaszpartát transzporter), EAAT2 (GLT-1 - glutamát transzporter-1), EAAT3 (EACC1), EATT4 és EACC5 (Pulido, Pulido et al. 2007). Az asztrocitákba történő felvételét a GLAST (a Müller sejtekben is megtalálható) és a GLT-1 (vagy EAAT1 és 2) segíti, míg a neuronokba való felvételét a EAAC1 (vagy EAAT3), EAAT4 és EAAT5 receptorok segítik elő. Az EAAT5 a retinális fotoreceptorokban találhatóak. Kétféle glutamát receptor létezik: ionotropikus és metabotropikus. Az ionotropikus receptorok ioncsatornával működnek, a metabotropikusak G-proteinnel. Az ionotropikus receptorok három fajtája ismert: N-methyl-D-aszpartát (NMDA), amino-3-hydroxy-5methyl-isoxazolepropionate
(AMPA)
és
kainate
típusú.
Leginkább
az
NMDA
receptorokhoz kötődik a sejtek belsejébe történő kalciumáramlás és excitatórikus neurotoxicitás (Pulido, Pulido et al. 2007). Jelenleg legalább nyolcféle metabotropikus glutamát receptor ismert (mGluR). Ezeket még további három alcsoportra oszthatjuk. Az I típusú receptorokhoz intracelluláris phosphotidyl inositol metabolizmus kapcsolódik. A II és III típusokhoz gátló cAMP kaszkádok és más posztszinaptikus kaszkádokon keresztül az intracelluláris kalciumraktárak kiürülését eredményezik. Léteznek olyan adatok, melyek szerint bizonyos II típusú mGluR-ok neuroprotektív hatással bírnak. A glutamát transzporterek feladata az extracelluláris alacsony glu koncentráció megőrzése, ugyanis a glu felhalmozódása excitatórikus hatásokat válthat ki. Az RPE sejtek glutamát transzportereinek a szerepe a subretinalis tér alacsony glutamát koncentrációjának a fenntartásában jeletkezik (Miyamoto and Del Monte 1994; Rauen and Kanner 1994; Derouiche and Rauen 1995; Madl and Allen 1995; Furness and Lehre 1997; Lehre, Davanger et al. 1997; Ullensvang, Lehre et al. 1997; Bridges, Kekuda et al. 2001; Maenpaa, Mannerstrom et al. 2002). Az extracelluláris glutamát koncentrációjának növekedése esetén a glutamát receptorok aktiválódnak, a glutamát sejtekbe történő felvétele növekszik. Így fokozódik egyúttal a szabad Ca2+ sejtekbe történő áramlása is, mely során szabad gyökök keletkeznek és végső soron a sejtk apoptózisa jön létre (Yazulla, Studholme et al. 1986; Amato, Ballerini et al.
20
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
1994; Amato, Barbour et al. 1994; Kovalchuk, Miller et al. 1994; Miyamoto and Del Monte 1994; Szatkowski and Attwell 1994; Derouiche and Rauen 1995; Madl and Allen 1995; Furness and Lehre 1997; Ullensvang, Lehre et al. 1997; Hertz, Swanson et al. 1998; Bridges, Kekuda et al. 2001; Maenpaa, Mannerstrom et al. 2002). A glutamát, a glutamin és a GABA metabolizmusa jelentős összefonódást mutat. A retinában a glu felszabadulása a fotoreceptorokból és a bipoláris sejtekből (külső és belső plexiform réteg) történik. A RPE kívül a szinaptikus résből a gliasejtek csökkentik a glu extracelluláris koncentrációját. Az emlős retinában lévő ezen gliasejtek, a Müller sejtek (Kovalchuk, Miller et al. 1994; Miyamoto and Del Monte 1994; Szatkowski and Attwell 1994; Madl and Allen 1995; Furness and Lehre 1997; Ullensvang, Lehre et al. 1997; Bridges, Kekuda et al. 2001). Amennyiben a glutamát koncentrációja subretinalisan nő, akkor a neuroretinába való áramlásuk fokozódik. Ez a szabad diffúzió végső soron excitatórikus folyamatot eredményez, mely végeredményeként a sejtek károsodnak.
4.2 Retinalis capillaris hemangioma – Fotodinámiás kezelés – Retinal vessel analyser 4.2.1. Fotodinámiás terápia (PDT) Fotodinámiás terápia során 689 nm-es hullámhosszúságú, azonban alacsony fényintenzitású fényt alkalmazunk, ami a szervezetbe -egy exogén módon- bejuttatott fotoszenzitilizáló anyagot aktivál (Elsner and Schmidt-Erfurth 2002; Gierek-Lapinska, Wykrota et al. 2002; Haddad, Coscas et al. 2002; Schlotzer-Schrehardt, Viestenz et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002; Jurklies, Anastassiou et al. 2003). A fényérzékeny anyag és a fény interakciójának az eredményeként naszcens oxigén, szuperoxid ionok keletkeznek in situ, melyek a lipid membránokkal, a proteinekkel és a nukleinsavakkal léphetnek reakcióba. Ez intracellulárisan károsodást, sejthalált okoz, mely a célszövet vaszkuláris okklúzióját, ill. trombózisát okozza.
21
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
A folyamat előnye ez, hogy az alacsony intenzitású fény alkalmazása esetén minimalizálni lehet a környező retina termális károsodását (Michels, Barbazetto et al. 2002; SchlotzerSchrehardt, Viestenz et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002). A verteporfin, egy benzoporfirin derivátum (Visudyne®, Novartis Ophthalmics AG, Hettlingen, Svájc) volt az első ilyen fényaktivációval ható molekula, amely kezelést időskori macula degenerációban (AMD: age related macular degeneration) kialakult subfoveális,
subretinális
neovascularisation),
ill.
chorioidealis patológiás
érújdonképződésben myopia
talaján
(CNV:
kialakult
choroidal subfoveális
érújdonképződésben alkalmaztak (Elsner and Schmidt-Erfurth 2002; Gierek-Lapinska, Wykrota et al. 2002; Schlotzer-Schrehardt, Viestenz et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002). A kezelés előnye a fokális lézer fotokoagulációval szemben az, hogy PDT kezelés következtében nem károsodik a lézió fölött elhelyezkedő neuroszenzórikus retina, és így a kezelést követőn nincs azonnali látáskárosodás a kezelt területen, mint az extrafoveális érújdonképződések kezelése során megfigyelhető (Bressler 2002; Donati 2002; Flaxel 2002; Flower 2002; Haddad, Coscas et al. 2002; la Cour, Kiilgaard et al. 2002).
4.2.2. Retinalis capillaris hemangioma (RCH) 1878-ban került először leírásra a retina hemangioblasztómája Panas és Remy által, majd ezt követően 1882-ben Fuchs publikálta első klinikai leírását az elváltozásnak (Panas F 1879; Fuchs 1882). Keletkezésének jelenleg elfogadott teóriája Knudson-tól származik, mely szerint az elváltozásnak létezik öröklődő és sporadikus előfordulási formája is (Singh A 2001). Az öröklődő esetekben az egyik inaktivált allél a germinális vonallal öröklődik, míg a másik a szövetekben inaktiválódik. Sporadikus esetekben mindkét allél inaktiválódása a szövetekben megy végbe. Ezt követően alakul ki vagy az izolált retinalis capillaris hemangioma, vagy -von Hippel-Lindau betegség esetén- generalizált, többszörös hemangiómák (Parmar, Mireskandari et al. 2000; Atebara 2002; Schmidt-Erfurth,
22
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Kusserow et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002; Singh, Nouri et al. 2002; Zografos 2002; Costa, Meirelles et al. 2003). Az elváltozást leggyakrabban 10 és 30 éves életkor között diagnosztizálják. A diagnózis idején a beteg lehet aszimptomatikus, vagy már mutathat különböző mértékű látáscsökkenést. A vaszkuláris tumorok progresszív növekedése során noduláris formát vesznek fel, s megtágul a hozzájuk vezető tápláló és elvezető ér. Az elváltozás leggyakrabban temporálisan, a középperiférián helyezkedik el. A szemfenéken azonban szinte bárhol leírtak már capillaris hemangiomát, még a makuláris régióban is. Szövettani vizsgálat során a látott kép a cerebrális hemangioblasztómához hasonló: irreguláris kapilláris hálózat figyelhető meg a metszeten, melyben számos, lipid tartalmú poligonális strómasejt és gliasejt figyelhető még meg. Elektonmikroszkóppal (EM) a benne található kapillárisok fenesztráltak. Ez magyarázza a FLAG vizsgálat során tapasztalt jelentős exudációt (Zografos 2002). Az elváltozás kezelési stratégiája a következő tényezőktől függ: a tumor nagysága, elhelyezkedése, a társuló szerózus retinaleválás mértéke, a kísérő lipid exudátumok jelenléte és nagysága, a törőközegek átlátszósága. Terápiás döntésünket az ellenoldali szem állapota is befolyásolhatja. Használhatunk xenon-, argon-, Nd:YAG lézer photocoagulációt, krioterápiát, diatermiát, sugárkezelést,
106
Ru/106Rh applikátoros brachyterápiát és a tumor
rezekcióját is több szerző megemlítette már az irodalomban (Blodi, Russell et al. 1990; Parmar, Mireskandari et al. 2000; Atebara 2002; Schmidt-Erfurth, Kusserow et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002; Singh, Nouri et al. 2002; Costa, Meirelles et al. 2003; Jurklies, Anastassiou et al. 2003). A daganat szövettani vizsgálatának eredménye alapján merült fel RCH esetén a fotodinámiás kezelés alkalmazása. A PDT kezelés során noninvazív módon érjük el a szelektív vaszkuláris okklúziót, a környező szövetek károsítása nélkül. A PDT daganatokra való alkalmazását leírták kísérleti körülmények között pigmentszegény chorioidea tumor kezelésére. A kezelés során a neovaszkuláris rész trombózisa volt a cél (Schmidt Erfurth 2000). Ezt követően, az elmúlt években több szerző jelentetett meg olyan cikket, melyben RCH esetében alkalmazott PDT kezelésről számolnak be néhány betegen (Atebara 2002;
23
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Schmidt-Erfurth, Kusserow et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002; Singh, Nouri et al. 2002; Jurklies, Anastassiou et al. 2003).
4.2.3. Retinal Vessel Analyser (RVA) A szemgolyó vérellátása, ennek zavaraival összefüggő elváltozások a szemészet fontos részévé vált az elmúlt évtizedekben. A viszonylag régóta alkalmazott angiográfiás vizsgálatok
(FLAG,
ill.
Indocyanin
zöld
angiográfia
(ICG))
mellett
újabb
vizsgálómódszerek jelentek meg. A legtöbb alkalmazott készülék a keringés sebességének a mérésére specializálódott. A keringési paraméterek között azonban az ér keresztmetszete is fontos szerepet játszik. Az RVA egy olyan újabb műszer, mely optikai elven működik és a szemfenéki erek átmérőjének a meghatározására alkalmas (Polak, Dorner et al. 2000; Seifert 2002; Barcsay, Seres et al. 2003). A vizsgálat során két optikai útvonal különböztethető meg: a megvilágítási útvonal és az obszervációs útvonal. A képet a számítógép és a S-VHS videomagnó felé egy CCD kamera továbbítja. Másodpercenként 25 kép készül a vizsgálat során, melyeken akár a vizsgálat során, akár később, a videofelvétel segítségével lehet méréseket végezni. A vizsgáló által kijelölt területen, a számítógép felismeri az erek széleit, és méri az ér átmérőjét. A mérési paraméterek a következők: felbontás <1µm, helyi felbontás 180 µm/ér szegmens, mérési idő 1 secundum-10 perc. Értékeléshez használhatjuk az egész mérési időre vonatkozó eredményeket, illetve kiválaszthatunk egy tetszőleges intervallumra vonatkozó mérési eredményt is. Az erekre vonatkozó mérések a „Time course analysis”, a „Local course analysis”, a „Vasomotoric analysis”, a „Functional analysis” és a „Functional imaging”. A Time course analysis a különböző vizsgálatok során nyert érátmérőket hasonlítja össze, úgy, hogy az eredményekből korhoz kötött, patológiás, vagy gyógyszerindukált hatásokat lehessen vizsgálni. A Local course analysis az érszakasz megfelelő szakaszán képes helyi szűkületek, tágulatok vizsgálatára. A Vasomotoric analysis az érszakasz érmérőjének hullámszerű ingadozásait vizsgálja. A Functional analysis a Functional imaging pedig egy mesterséges ingerre bekövetkező időszakos érátmérő változás monitorizálása és
24
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
képalkotására alkalmazható. Mindezek alapján az RVA egy bizonyos beteg, meghatározott szemfenéki erének egy tetszőlegesen kiválasztott szakaszán képes felismerni és elemezni az autóregulációs hatásokra bekövetkező változásokat.
25
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
5. MÓDSZEREK
5.1 RPE – lézerkezelés – biokémiai változások monitorizása 5.1.1. RPE sejtkultúra (A kísérletet Finnországban, a tamperei egyetem, a Cell Research Center-ében végeztük) Khatami leírása szerint készítettük el a primer RPE sejtkultúráinkat (Khatami 1988; Khatami and Rockey 1988; Khatami 1988.). Helyi vágóhídról szereztük be a friss disznószemeket, amelyeket aszeptikus körülmények között dolgoztunk fel mikroszkóp alatt. A disznószem felvágása után az üvegtestet és a neuroretinát eltávolítottuk. A neuroretina alatt elhelyezkedő RPE réteget Ca2+-, és Mg2+-mentes foszfát oldattal mostuk át. Az RPE sejtréteget 0.25% tripszin oldattal inkubáltuk, a RPE sejtek felszabadítása végett. A szabadon mozgó RPE sejteket „Dulbecco modified Eagle's minimal essential medium” (DMEM) táptalajban reszuszpendáltuk (a táptalaj fötális bovin szérumot, penicillin G-t (100 IU/ml), streptomycint (100 g/ml) és amphotericin B-t (0.25 g/ml) tartalmazott). Trypan kék festés után megszámoltuk az életképes sejteket a pontos sejtszám kalkulálása végzett. A RPE sejt szuszpenziót hígítás után 4-6x104/cm2 sejtsűrűséggel helyeztük 2.0 ml-es sejttenyésztő edényekbe (Nunclon Dishes, Cat. No. 153066; átmérő: 3.35 cm, felszín: 8.8 cm2) (2. ábra). A sejteket 37°C-on levegő/CO2 95:5% koncentrációjú inkubátorba helyeztük. A sejttenyésztő folyadék felét cseréltük az első két napon naponta, majd kétszer hetente. Az összefüggő monolayer szintet a kultúrák a 7-10 nap között érték el. A konfluáló egyrétegű RPE kultúrákon végeztük a lézerkezelést.
26
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
2. ábra. A sejttenyésztéshez Nunclon 153066 edényeket használtunk (Nunclon, Roskilde, Dánia) (Nunclon).
5.1.2. Lézer fotokoaguláció A lézerkezelés előtt a tenyésztő médiumot Krebs-Ringer-Hepes-glükóz médiumra (KRH), cseréltük. Ennek összetétele: 126 mM NaCl, 5.1 mM KCl, 0.81 mM Ca2Cl, 1.3 mM MgSO4, 1.3 mM NaH2PO4, 10 mM D-glükóz és 15 mM Hepes, majd NaOH-dal állítottuk be 7.4 pH-t. Félvezető dióda lézert (678 nm) (Tampere University of Technology, Tampere, Finnország) alkalmaztunk a kezeléshez. A lézersugarat egy endolézer fej segítségével jutattuk a sejtkultúrára száloptikán keresztül. Az endolézer fejen a kultúráktól való távolságot 1 mm-re állítottuk be. Az alkalmazott energia 800, 1000, 1250 és 1600 mW volt, az expozíciós idő 0.186 másodperc, a gócátmérő pedig 1000 µm volt. Mindegyik vizsgálathoz volt kontroll csoport is és egy-egy csoporthoz 3-3 tenyészet tartozott. Minden sejttenyészeten 100 gócot alkalmaztunk a következő ábrán látható mintázat szerint (10 sor, 10 oszlop, a gócok 2 mm-re vannak egymástól):
27
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Teoretikusan a sejtek 8.9%-át károsítja a lézerkezelés direkt hatása. A számítást a tenyésztőedény aljának a területéből és az alkalmazott lézergócok átmérőjének összterületéből számítottuk ki. A többi sejt (91.1 %) csak a lézergócok körül megfigyelhető hőmérsékletemelkedés hatásának van kitéve. 1600 mW alkalmazása esetén 407 W/cm2 a maximális energiasűrűség a lézergóc középpontjában.
5.1.3. Hőmérsékleti mérések A lézergóc melletti hőmérsékletváltozások monitorozására egy NTC-termisztort (Negative Temperature Coefficient) alkalmaztunk. A félvezető elektróda ellenállásának változása alapján digitális oszcilloszkóp segítségével kalkuláltuk a hőmérsékleti változásokat (3. ábra). Az termisztor mechanikai-, termális- és elektromos jellemzőit láthatjuk a következő táblázatban (1. táblázat):
28
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
1. táblázat. NTC-termisztor jellemzői (http://www.sensorsci.com/sbt.htm) Méret Névleges átmérő
0.36 mm
Névleges hossz
0.5 mm
Termális jellemzők Időkonstans, álló levegőnél
1s
Szóródási konstans, álló levegőnél
0.1 mW/°C
Elektromos jellemzők Ellenállás 25°C-on
1000 Ω
Beta25-125 koefficiens
3000 K
R25/R125 ráció
12.5
3. ábra. Modellkísérletünk sematikus képe
29
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
5.1.3. WST-1 cell proliferáció reagens teszt A WST-1 (4-[3-(4-iodophenyl)-2-(4-nitrophenyl)-2H-5-tetrazolio]-1,3-benzol diszulfonát) teszt színelváltozáson alapul. A vizsgálat az élő és proliferáló sejteket vizsgálja. A mitokondriális dehidrogenáz enzimek azon a reakcióján alapul, amikor tetrazólium só színezett formazánná alakul át. WST-1 vizsgálatot alkalmaztunk a lézerkezelés után a sejtek életképességének a vizsgálatára. A reakció csak az életképes sejtekben zajlik, így a kezelés után a mintában mért értékkel az élő sejtek mennyisége korrelál.
5.1.4. Glutamát és GABA felvétel Lézerkezelés után a sejttenyésztő folyadékot friss, oxigenizált KRH pufferre cseréltük (pH 7.4). Ezt követően a sejteket levegő/CO2 95:5% keverékén inkubáltuk 37°C-on 30 percig, hogy a sejtek regenerálódjanak. Ezt követően, háromszoros átmosás után új, oxigenizált KRH pufferrel pótoltuk a puffert, majd 37°C-on 10 percig inkubáltuk a sejtkultúrákat. GABA felvétel vizsgálata esetén a GABA transzamináz gátlására 10 M aminooxaloacetátot is hozzáadtunk az elegyhez. Ezt követően a sejttenyészeteket 37ºC 10 percig inkubáltuk radioaktív 3H-mal jelölt L-[3H]-glutamáttal, ill. [3H]-GABA-val. A glutamát, ill. GABA végső koncentrációja 10 µM a végső 2.0 ml-es inkubációs térfogatban. A felvétel megállítására, a médiumot leszívtuk, a sejteket háromszor jéghideg KRH médiummal átmostuk, majd szobahőmérsékleten beszáradni hagytunk. A sejteket 0.4 M NaOH oldattal oldottuk, a reakciót 2 M HCl oldattal állítottuk le. A felülúszót használtuk folyadék szcintillációs vizsgálathoz, mely során a radioaktivitást LKB Wallace 1219 Rackbeta folyadék szcintilláció számlálóval (Turku, Finnország) határoztuk meg.
30
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
5.1.5. Protein meghatározás Protein meghatározásra a “Pierce BCA Protein Assay”-t alkalmaztuk. A vizsgálat Lowry metódusát használja (Lowry 1951.). A vizsgálat a protein koncentrációt egy magas szenzitivitású spektrofotometrias módszerrel határozza meg. Az egyedülálló reagens rendszer két metódust kombinál. A biuret reakció során a fehérjék Cu2+-mal, lúgos környezetben Cu1+-ot hoznak létre. A vizsgálat második részben a keletkezett réz ion bicinchominic savval lép reakcióba, s jön létre a lilá színű végtermék, amely vízoldékony és 562 nm-en erős abszorpcióval rendelkezik. Ez az alapja a fehérjék vizes oldatban történő spektrofotometriás meghatározásának.
5.1.6. Statisztika Minden számítást három azonos sejtkultúra eredményei alapján végeztünk. Statisztikai számításokhoz a független páros Student tesztet alkalmaztuk. A különbségeket szignifikánsnak tekintettük, ha p<0,05 (konfidencia intervallum 95%).
5.2 Retinalis capillaris hemangioma - Fotodinámiás terápia – Retinal vessel analyser (A vizsgálatot, a Semmelweis Egyetem, Budapest, Szemészeti klinikáján végeztük) 5.2.1. Fotodinámiás terápia (PDT) PDT során benzoporphyrin-MA (Visudyne®, Novartis Ophthalmics AG, Hettlingen, Svájc) molekulát alkalmaztunk fotoszenzitivizáló anyagként. A molekulát feloldás után i.v. juttattuk be a szervezetbe 6 mg/m2 testfelszín felületnek megfelelően. A fotoaktívációhoz Zeiss lézerkészüléket (Visulas II, Zeiss, Oberkochen, Németország) alkalmaztunk (4. ábra). A kezelést 692 nm-es emittáló fénnyel és 600 mW/cm2 energiasűrűséggel végeztük 5
31
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
perccel az infúzió vége után. A fénykezelés egy darab egyedülálló lézergócot jelentett a kezelés során. A lézergócot pontosan a daganatra irányítottuk. A gócnagyságot úgy állítottuk be, hogy a célzófény beállításával először megállapítottuk az elváltozás nagyságát, majd 1000 µm-mel növeltük a gócnagyságot a kezelés alatti mozgás hatásának a kiküszöbölése végett. A kezelés során kontaktlencsét (Quadraspheric lens, Volk, USA) alkalmaztunk a terület vizualizálásához. A 83 másodperc alatt leadott összenergia 50 J/cm2 volt. Egy retinalis capillaris hemangiómával diagnosztizált beteg PDT kezelését végzetük el. Betegünket megvizsgálatuk a kezelés előtt, 1, 5, 12 nappal, ill. 6 hónappal a kezelés után.
4. ábra. A fotodinámiás kezeléshez használt Zeiss lézerkészülék (Visulas II, Zeiss, Oberkochen, Németország).
32
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
5.2.2. A retinális erek átmérőjének meghatározása Retinal Vessel Analyser (RVA) segítségével Az RVA (Imedos, GmbH, Weimar, Németország) felépítése a következő: papilla közeli nagyobb ereket -pupillatágítás után- egy funduskamera (FF450 Zeiss, Jéna, Németország) segítségével vizsgáljuk.
5. ábra. Retinal Vessel Analyser (Imedos, GmbH, Weimar, Németország) /http://www.imedos.de/_deutsch/index_d.htm?/_deutsch/produkte/produkte.htm/
Betegünknél a „Time course analysis” protokoll szerint végeztük a vizsgálatot. A vizsgálat során a nyert érátmérőket hasonlítottuk össze.
33
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
A vizsgálathoz a papillához közeli területen, ill. az RCH közelében választottunk ki érszakaszokat. Az érszakaszokat úgy választottuk ki, hogy kereszteződés ne essen a vizsgált érszakaszba és az érszakasz hossza kb. ½ papilla-átmérőnek megfeleljen. Regisztrátomot készítettünk a PDT kezelés előtt, 5, 12 nappal, ill. 6 hónappal a PDT kezelést követően.
34
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
6. EREDMÉNYEK
6.1. A direkt lézerkezelés hatása a porcin primer retinalis pigment epithel monolayer sejtkultúrában (in vitro vizsgálat) 6.1.1 RPE sejtkultúra Trypan kék festés után, Bürker kamra segítségével határoztuk meg az életképes sejtek számát (6. ábra, A kép). A sejtek szabadon úsztak a tenyésztő edény alján a tenyészetek elkészítés után (6. ábra, B kép). A sejttenyésztő edényekbe helyezett sejtszuszpenziók 1 napos korukban nyúlványokat kezdtek növeszteni (6. ábra, C kép). A nyúlványok további növekedése volt megfigyelhető az ezt követő napokban (6. ábra, D kép). Egy hetes korukban a sejtek kezdtek fokozatosan összeolvadni (6. ábra, E kép). A porcin pigment epithel sejtkultúrák az összefüggő monolayer szintet 7-10 nap között érték el (6. ábra, F kép). Primer sejtkultúrák lévén pigmentet tartalmaztak a sejtek (Whittaker 1963). Ezt használtunk ki a lézerkezelés során.
35
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
A
B
C
D
E
F
E
F
6. ábra. Primer RPE sejtkultúra. A: Trypan kék festés Bürker kamrában, B: 0 napos kultúra, C: 1 napos, D: 3 napos, E: 1 hetes, F: konfluens sejtkultúra.
36
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
6.1.2. Hőmérsékletemelkedés Az észlelt hőmérsékletemelkedéseket tüntettük fel a 7., 8. és 9. ábrán. A legkisebb hőmérsékletemelkedést 800 mW alkalmazása esetén figyelhető meg. 1000 mW esetén ez fokozódik,
és
1600
mW
esetén
észleltük
vizsgálatunkban
a
legnagyobb
hőmérsékletemelkedést. A mért hőmérsékletemelkedések tendenciájukban hasonló eredményeket mutattk, ha mérésünket a lézergóc közepén, ill., ha attól távolabb (0.5 mmre) végeztük.
37
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
7. ábra. Hőmérsékletemelkedés a lézergóc közepén. 800mW (piros), 1000mW (zöld) és 1600mW (kék).
8. ábra. Hőmérsékletemelkedés a lézergóc közepétől 0,5 mm-re. 800mW (piros), 1000mW (zöld) és 1600mW (kék).
38
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
9. ábra. Lézer-indukált hőmérsékletemelkedés RPE sejkultúrán.
Lézerkezelés közben a lézergóc közeli terület a 9. ábrán látható módon szenved hőmérsékletemelkedést. Lézerkezelés után a lézergócban, a RPE sejtek szintjében akut nekrózist figyelhettünk meg. Néhol sejtek szakadtak fel a sejttenyésztő edény aljáról. A lézergócok szomszédságában a Trypan kék festés sejtkárosodást mutatott (10. ábra).
39
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
B
A
10. ábra. Sejtpusztulás a lézerkezelés után, a lézergócnak megfelelően (A). Jobbra tőle a kontroll sejtkultúra látható (B). (Hematoxilin-eosin festés.)
6.1.3. WST-1 cell proliferáció reagens teszt Lézerkezelést követően a WST-1 teszt során a keletkezett formazan mennyisége szignifikánsan csökkent. 800 mW energia alkalmazásakor a kontrollhoz képest 79,1% formazan keletkezett. 1600 mW esetén az érték 80,1% volt (***P< 0,001, 3. táblázat).
6.1.4. Glutamát és GABA felvétel Az RPE sejtek lézerkezelése után a glutamát felvétel a kontrollhoz képest 86,9 %-ra csökkent 800 mW energia használatakor. A felvétel jelentősebb csökkenését (59,4%) tapasztaltuk 1600 mW energia esetén. GABA felvétel esetén a változások ellenkezők voltak: a GABA felvétel 800 mW esetén a kontroll 127%-ra, 1800 mW esetén 280,8 %-ra növekedett lézerkezelést követően (3. táblázat).
40
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
3. táblázat. Lézerkezelés hatása az RPE sejtre (WST-1 teszt, GABA és glutamát felvétel). A sejtkultúrákat különböző energiával kezeltük. A felvételek vizsgálatához, 30 perces várakozási idő után L-[3H]-glutamátot vagy [3H]-GABA-t (10 µM) adtunk a sejtekhez 37ºC-on 10 percig. A kontroll sejtkultúrákon előzetes lézerkezelést nem végeztünk. A kontroll WST-1 érték 1,08 volt, glutamát felvétel esetén: 24 nmol/s/kg protein, ill. GABA felvétel esetén: 0,16 nmol/s/kg protein (3 különálló kísérlet, 3 párhuzamos minta). Az eredményeket a kontroll értékének megfelelően %-ban adtuk meg. A kontrollértéktől való statisztikailag szignifikáns különbségről beszélünk, ha: **P<0,01; ***P< 0,001.
WST-1 ± SD
Glutamát felvétel ± SD
GABA felvétel ± SD
Kontroll
100% ± 12,4
100% ± 1,6
100% ± 43,6
800 mW
79,1% ± 12,1***
86,9% ± 6,8
127% ± 30,3
1600 mW
80,1% ± 9,3***
59,4% ± 2,8***
280,8% ± 36,4**
6.2. A retinalis capillaris hemangioma (RCH) tápláló és elvezető ereinek a vizsgálata, nyomon követése Retinal Vessel Analyser (RVA) segítségével fotodinámiás kezelést (PDT) követően (Klinikai vizsgálat humán anyagon) Klinikánkra egy 26 éves fiatal hölgybeteget utaltak, bal szemén kialakult 4 hetes homályos látás miatt. A beutalt hölgy anamnézise és családi anamnézise sem utalt von Hippel-Lindau (VHL) betegségre. A látóélesség meghatározását ETDRS (Early Treatment Diabetic Retinopathy Study) táblával végeztük. A vizsgálat során a legjobb korrigálható látóélessége 20/20 volt jobb szemén és 20/25 bal szemén. Biomikroszkópos vizsgálat során ép jobb szemfenék mellett bal oldalon, a papilla felett, XII h-nál, a középperiférián, egy 3-4 mm
41
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
átmérőjű, piros, kerek elváltozást találtunk. A látott kép alapján állítottuk fel a retinalis capillaris hemangioma (RCH) diagnózist. Kísérőjelenségként finom epiretinális membránt és a foveolának megfelelően subretinalis folyadékot találtunk. Az elvégzett fluorescein angiográfia (FLAG) jelentős festékszivárgást mutatott a RCH területéből (11. ábra). Általános vizsgálata során végeztünk neurológiai-, hasi-, és koponya képalkotó vizsgálatot, vizeletvizsgálatot, ám VHL betegségre jellemző elváltozásokat nem találtunk.
11. ábra. A RCH kezdeti biomikroszkópos és FLAG képe. A leírt elváltozásra fotodinámiás kezelést (PDT) alkalmaztunk. A kezelést az irodalomban leírt ajánlások alapján végeztük (Atebara 2002; Gierek-Lapinska, Wykrota et al. 2002; Jurklies, Anastassiou et al. 2003). Egy lézergócot alkalmaztunk, a 83 másodpercig tartó kezelés során. A PDT kezelést követően a látóélesség jelentős romlását tapasztaltuk. 20/200-os legjobb korrigált látóélesség mellett a maculáris terület komplett szerózus elemelkedését tapasztaltuk biomikroszkópos vizsgálat során (12. ábra). UH-os vizsgálattal a maculáris terület 2.0 mm-es magasságú szerózus leválását találtuk (13. ábra).
42
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
12. ábra. A PDT kezelést követő napon biomikroszkóppal megfigyelt szerózus neuroretinalis elemelkedés (Sztereó felvétel).
13. ábra. A PDT kezelést követő napon készült UH vizsgálat felvétele.
A kezelést követő 12 nap alatt a subretinalis folyadék teljesen felszívódott. A hátsó pólus területén minimális exudátum volt maradványtünetként megfigyelhető, és ekkorra a legjobb korrigálható látóélesség 20/20-ra javult. Hat hónappal a PDT kezelést követően teljes
43
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
látóélesség mellett már csak minimális foveoláris pigment epithel egyenetlenség volt megfigyelhető (14. ábra).
14. ábra. A RCH biomikroszkópos képe a követési idő végén, 6 hónappal a PDT kezelést követően.
Összehasonlítottuk az elváltozás kezelés előtti, és 6 hónappal a kezelés utáni biomikroszkópos képét. A két kép összehasonlításánál megállapíthatjuk, hogy a -tápláló és elvezető ér szemmel látható vékonyodása mellett- a kezelés utáni képen az elváltozás felszínét borító fibrózis növekedett, a daganat mérete viszont jelentősen csökkent (15. ábra).
44
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
15. ábra. A RCH összehasonlító képe. A: kezelés előtt, B: 6 hónappal a PDT után.
A PDT kezelés előtt, majd 5, 12 nappal és 6 hónappal később végeztünk RVA-val vizsgálatot. A vizsgálat során a hemangiómát tápláló és elvezető erének az átmérőjét mértük, a papilla mellett és a daganat közvetlen közelében. PDT kezelés után 5 nappal később, mind az artéria, mind a véna átmérőjének a csökkenése volt megfigyelhető. A tápláló ér átmérőjének a csökkenése a papilla közelében nagyobb mértékű volt. A 6 hónapos követési idő végére is stabilnak találtuk az érátmérőket (4. táblázat).
45
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
4. táblázat. Retinális érátmérők PDT előtt és után (µm).
PDT után 5
PDT után 12
PDT után 6
nappal
nappal
hónappal
243,8
188,9
183,7
199,1
Tápláló ér (RCH mellett)
350,4
322,7
293,9
298,3
Elvezető ér
231,0
145,9
153,1
167,8
PDT előtt Tápláló ér (papilla mellett)
46
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
7. MEGBESZÉLÉS
7.1. A direkt lézerkezelés hatása a porcin primer retinalis pigment epithel monolayer sejtkultúrában Fokális lézerkezelés során elengedhetetlen az optimális hullámhossz kiválasztása, a neuroretina másodlagos sérülésének az elkerülése céljából. Az infravörös hullámhosszban működő félvezető dióda lézerkészülékek viszonylag olcsó berendezések (Puliafito, Deutsch et al. 1987; McHugh, Marshall et al. 1989; Berger 1997; Parmar, Mireskandari et al. 2000). Az áruk mellett több más előnyük is van: fényük kevésbé szóródik, viszonylag jobban hatolnak át a neuroretina rétegén és csökkent transzparenciájú rétegeken, ami pl. fokozott lencsehomály, vagy subretinalis vérzés esetén fordulhat elő. Az előbb leírt előnyüknek megfelelően széleskörű használatuk terjedt el, chorioideális neovaszkularizáció, proliferatív diabéteszes retinopátia, a koraszülöttek retinopátiája és chorioidea menaloma kezelésében (Puliafito, Deutsch et al. 1987; McHugh, Marshall et al. 1989; Berger 1997; Parmar, Mireskandari et al. 2000). A retina lézerezése során a fényenergia a szem szöveteiben jelenlévő három pigmentben nyelődik el legfőképpen. Ezek a következőek: hemoglobin, a xanthophyllin és melanin. A szemfenék szövetei közül a legnagyobb abszorpcióval a melanin tartalmú retinalis pigment epithelium réteg rendelkezik (Soubrane 1995; Haddad, Coscas et al. 2002). A melanin pigment abszorpciós hullámszélessége elég széles, abszorpciós koefficiense csökken a beeső fény hullámhosszának a növekedésével. Az általunk végzett in vitro kísérlet során használt lézerkezelés 678 nm-es hullámhossza, teoretikusan 35-65˚C-os hőmérsékletemelkedést hoztat létre a szövetekben in situ, és ehhez a hőmérsékletemelkedéshez a RPE kb. 70-80%-ban járul hozzá (Mellerio 1966; Birngruber, Hillenkamp et al. 1985; Hutter, Hiemer et al. 1985; Krauss, Puliafito et al. 1987; Berger 1997). In vivo mérések a lézergóc közepén az előbb említett hőmérsékletnél magasabbat igazoltak (Mellerio 1966; Vogel 1992).
47
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Az általunk használt modell esetén ugyanazon dióda lézer használatakor, azonos gócátmérő esetén az energia növelésével fokozódó hőmérsékletemelkedést tapasztaltunk. Méréseinket a gócok közepén, ill. a gócok szélén is elvégeztük. A lézergóc közepén észlelt hőmérsékletemelkedés meghaladta a lézergóc szélén mért értékeket. A két különböző helyen mért eredmények tendenciájukban hasonlóak voltak. Az általunk mért hőmérsékletemelkedések megegyeztek az irodalomban előttünk leírt eredményekkel (Mellerio 1966; Birngruber, Hillenkamp et al. 1985; Krauss, Puliafito et al. 1987; Berger 1997). Több faktor létezik in vivo és in vitro is, mely befolyásolhatja a kapott hőmérsékletemelkedést. In vivo elengedhetetlen a környező szövetek hővezetésének a figyelembe vétele (pl. chorioidea keringése). In vitro pedig a sejttenyésztő edény falával, ill. a sejttenyésztő médiummal kell, mint hővezető közeggel számolnunk. Léteznek olyan publikált vizsgálatok is, amelyekben a sejtetnyészet alá fekete papírt helyeztek lézerezés alatt az elnyelődés elősegítésére. Arról sem szabad elfeledkeznünk, hogy a hőmérséklet mérésére alkalmas mérőműszer sem szabad, hogy befolyásolja a mérési eredményt. Kísérletünkben, a lézerkezelést követően a sejtkultúrák mikroszkópos vizsgálatakor a gócnak megfelelő sejtek teljes pusztulását, a tenyésztő edény aljáról való felszakadását és feltöredezését tapasztaltuk. A gócnak megfelelő területeken sejthiányos területek alakultak ki, amiket -Trypan kék festés tanúsága szerint – károsodott sejtek vették körbe. A fundusra vetülő lézersugár elsősorban a RPE melanin pigmentjében és a chorioideában nyelődik el. Az abszorpció során az energia hővé alakul át, mely hő a pigmentált szövet hőmérsékletét növeli. Ez a hő terjed ezt követően a pigmentált szövetek felől a pigmenttel nem rendelkező, s kezelésen át nem esett területek felé. A standard, jól látható lézerkezelés 40-60°C-os hőmérsékletemelkedést okoz a szövetekben. Ez a hőmérsékletemelkedés jóval meghaladja az alig látható lézerkezelés során keletkező hőmérsékletemelkedést. A lézergócok akkor válnak láthatóvá, amikor a hővezetés következtében a neuroretina is károsodást szenved és elveszti transzparenciáját (Desmettre, Mordon et al. 2006). Ezzel ellentétesen a rövid ideig tartó, mikropulzus kezelés a lézersugár hatását a pigmentált szövetekre korlátozza. A subthersold, vagy lefordítva „határ alatti” lézerkezelés során olyan
48
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
energiát használunk, mely esetén a retinára gyakorolt lézerhatás kialakulásának a valószínűsége 50%-os. Ez a fajta lézerkezelés a chorioretinalis termális károsodás valószínűségét csökkenti. A láthatósági határ alatti lézerkezelésnél használt energia sokszor töredéke a perifériás lézerkezelés során használt energiának. Irodalmi adatok alapján – állatkísérletekben- a láthatósági határnál 25%-kal kevesebb energia használatakor a lézerkezelés hatása a RPE sejtjeire korlátozódik. 50%-kal kevesebb energia alkalmazásakor pedig már sem biomikroszkóposan, sem FLAG vizsgálatkor nem marad nyom a lézerkezelés helyén (Desmettre, Mordon et al. 2006). A határ alatti lézerkezeléssel kapcsolatban írták le a következő eredményt. Pilot tanulmányban, száraz típusú makula degenerációs betegeknél végzett lézerkezelés, akár határérték alatti energiával, akár e feletti energiával végzik, 50%-kal, vagy annál nagyobb mértékben képes a drusenek által elfoglalt terület nagyságát csökkenteni (Friberg, Musch et al. 2006). Határ alatti lézerkezelés esetén a drusenekre gyakorolt hatás hosszabb idő alatt következett be, igaz, de egyúttal kevesebb iatrogén komplikációt tapasztaltak. A drusenek felszívódását az epiteliális sejtek makrofágokká való differenciálódásával, és/vagy humorális tényezőkkel magyarázták (Friberg, Musch et al. 2006). Mind a „Prophylactic Treatment of Age-Related Macular Degeneration”, mind a „Drusen Laser Study Group” vizsgálatai alapján azt a következtetést vonhatjuk le, hogy, ha druseneket találunk betegünk második, makula degenerációs szemén –akiknél az első szemen subfoveális, subretinalis chorioideális neovaszkularizáció miatt romlott meg a látása- a preventíven végzett lézerkezelés ugyan csökkenti a drusenek mennyiségét, viszont növeli a chorioideális neovaszkularisáció előfordulását. Emiatt az ilyen jellegű megelőző lézerkezelések jelenleg nem javasoltak (Friberg, Musch et al. 2006). A WST-1 teszt színelváltozáson alapuló reakció. Az életképes, proliferáló sejtek kimutatására alkalmas vizsgálómódszer. Közvetve a kialakult sejtkárosodásra lehet eredménye alapján következtetni. A kísérletünk során elvégzett WST-1 teszt az életképes sejtek számának a csökkenését mutatta. Eredményeink szerint a lézerkezelés a sejtkultúrában lévő sejtek kb. 20%-ra volt káros hatással. A kapott eredmény érdekességét az adja, hogy mind 800, mind 1600 mW-os energia
alkalmazásakor
azonos
WST-1
49
teszt
eredmény
csökkenést
kaptunk.
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Munkacsoportunk a vizsgálat előtt azt feltételezte, hogy magasabb energia alkalmazásákor, tehát magasabb hőmérsékletnövekedés esetén a környező sejtek nagyobb mérkékben károsodhatnak. Az eltérés hiányát magyarázhatja az, hogy a WST-1 vizsgálatot közvetlenül a lézerkezelés után végeztük. Lehetséges, hogy ez a teszt csak a lézersugár által direkt károsodott sejtek mennyiségét tudja kimutatni, s a hőhatás oly mértékben nem károsította a környező sejteket, hogy azt ezzel a módszerrel kimutathassuk. Elképzelhető az is, hogy a néhány órával, ill. néhány nappal később végzett vizsgálat már kimutatta volna a különböző energiaszinteknek megfelelő különböző mértékű károsodást. A RPE sejtek glutamát és GABA Na+ függő transzportját már többen leírták az irodalomban (Sivakami, Ganapathy et al. 1992; Amato, Ballerini et al. 1994; Johnson, Chen et al. 1996; O'Brien, Esguerra et al. 2004). Nemrégiben GABA-transzporter 2 (GAT-2), glumatát/aszpartát transzporter (EAAT1) és cisztin/glutamát transzporter expressziója került kimutatásra a RPE sejtrétegben (Johnson, Chen et al. 1996). Ezek a felfedezések mindkét transzporter RPE-ben játszott fontos szerepéről tesz tanulságot. A RPE sejtek a glutamát nem toxikus raktározásában játszhatnak fontos szerepet, de a teljes patomechanizmus még nem teljesen ismeretes. Azt már korábban kimutatták, hogy a hipertermia csökkenti a serkentő aminosavak felvételét a hippocampus területében (Madl and Allen 1995). A glutamát RPE sejtekben történő transzportja ATP függő folyamat. Ezen túlmenően a glutamátnak kettős hatása van az RPE-ben: ingerlő aminosavként normális viszonyok között, azonban magasabb koncentrációban toxikus anyagként viselkedhet (Kleinschmidt, Zucker et al. 1986; Yazulla 1986; Hertz 1988.; Amato, Ballerini et al. 1994; Amato, Barbour et al. 1994; Kovalchuk, Miller et al. 1994; Miyamoto and Del Monte 1994; Derouiche and Rauen 1995; Lehre, Davanger et al. 1997; Ullensvang, Lehre et al. 1997; Hertz, Peng et al. 1998; Bridges, Kekuda et al. 2001). Lézerkezelést követően a RPE sejtek glutamát felvétele csökkent. Nagyobb energia alkalmazása esetén a glutamátfelvétel nagyobb mértékű csökkenést mutatott. Ezzel szemben, sejtjeink lézerezés után több GABA-t vettek fel a kontrollokhoz képest. Vizsgálatunk alapján úgy tűnik, hogy a RPE sejtek glutamát transzportere lézerkezelést
50
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
követően sokkal kevéssé aktív, mint a GABA transzportere. A pontos mechanizmus nem igazán tisztázott, de a két transzporter lézerkezelés utáni ellenkező módon való viselkedése, és ennek következtében a két neurotranszmitter ellentétes felvétele könnyen magyarázható a kezelés után megfigyelhető diszfunkcióval. Létezik eredményinket alátámasztó olyan publikáció, amely lézerkezelés követően bizonyos transzport folyamatok ellentétes változásairól számol be. Csirke RPE sejtekben, lézer után megnövekedett thymidin felvételt, viszont csökkent leucin felvételt találtak. A változás függött a használt energiától és a szövettípustól is (Tsang, Yew et al. 1986). A vizsgálatunkban tapasztalt ellentétes hatást is hasonló folyamatnak gondoljuk. Léteznek a glutamát és egyéb szemészeti betegségek, pl. glaukoma kapcsolatát vizsgáló publikációk is. Dreyer glaukomában végzett azon tanulmányát, ami a glutamát emelkedett szintjének a jelentőségét tárgyalta sokan megkérdőjelezték (Dreyer, Zhang et al. 1995). Az ezt követően megjelent tanulmányok igazoltán, hogy a glutamát koncentrációja az üvegtesti térben emeldik glaukomában, ill. retinaleválásban. A glutamát ugyanolyan fontos szereppel rendelkezik ezekben a betegségekben, mint ischémiás agykárosodásban, a központi idegrendszerben. Az, hogy az üvegtesti térben megemelkedett glutamát szintje a betegség markere-e, vagy a betegség következménye, az nem teljesen tisztázott. Központi idegrendszeri tanulmányokból arra következtethetünk, hogy a feleslegben lévő glutamát megkötése a neurotoxicitás csökkenését eredményezheti (Pulido, Pulido et al. 2007). Nemrég érdekes tanulmány jelent meg a glutamát receptorok normál tenziós glaucomában játszott szerepéről (Harada, Harada et al. 2007). Glaukoma esetén a betegség kialakulásában többszörös genetikai és környezeti tényezők szerepe állapítható meg. A betegség során jelentkező lassú, progresszív retinális ganglion sejtek pusztulása következtében jön létre az irreverzibilis látáskárosodás. Különböző - a betegség kialakulásában szereppel rendelkezhető- faktorokat vizsgáltak már eddig: az okuláris vérkeringést, az okuláris vaszkuláris diszregulációt, a szisztémás vérnyomás változását. Ezen felül a glutamát-rendszer, ezen belül a NMDA alcsoportok excesszív stimulációját feltételezték a ganglionpusztulás okaként. A retina extracelluláris folyadékából egyedül a glutamát transzporterek képesek a feleslegben lévő glutamát eltávolítására. Ebből következik az a hipotézis, hogy a megnövekedett glutamát koncentráció a glutamát
51
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
receptorok alulműködésének a következménye. Irodalmi eredmények alapján glaukomára jellemző ganglionkárosodás mutatható ki olyan knock out egerekben, akiknél a glutamát receptorok működését gátolták (Harada, Harada et al. 2007). Munkacsoportunk vizsgált preperimetrikus primer nyitott zugú glaukomás betegeket is. Betegeink szemnyomása gyógyszeresen kompenzált volt. 12 hónap eltelte után statisztikailag szignifikáns eltéréseket nem talált standard Humphrey Field Analyzer II, model 750 (Zeiss-Humphrey Instruments, Inc. San Leandro, CA, USA) 24-2 küszöb vizsgálat-, és a Frekvencia Kettőzött Perimetria (Zeiss-Humphrey Inc, San Leandro, CA, USA) fontosabb paraméterei (MS, MD, PSD) között. Ezzel szemben, a papilla GDx Nerve Fiber Analyzerrel (Laser Diagnostic technologies, Inc., San Diego, CA, USA) történő idegvastagság
mérése során
statisztikailag szignifikáns idegrostréteg
csökkentést
tapasztaltunk 1 év elteltével a felső és az alsó szektorokban. E két szektor tartalmazza legnagyobb mennyiségben a ganglionsejt axonokat, amelyek károsodása korai glaukomás elváltozásra jellemző. Ezért úgy gondoljuk, hogy korai, enyhe glaukomás eltérések detektálására az idegrostréteg-vastagság vizsgálata alkalmasabb, mint a hagyományos látótérvizsgálat. A tenyésztett RPE sejtkultúra viselkedése és regenerációja különbözik ugyan az in situ RPE sejtekétől, és a felszabaduló citokinek és növekedési faktorok mennyiségileg és minőségileg is mutathatnak eltéréseket. Ez az eltérést a normális in situ milieu és a környező szövetek, mint pl. Bruch membrán, chorioidea, neuroretina hiányának köszönhető. Ennek ellenére az általunk bemutatott RPE sejtkultúrát a valóságban végbemenő biokémiai folyamatok jól használható modelljének tartjuk.
7.2. A retinalis capillaris hemangioma (RCH) tápláló és elvezető ereinek a vizsgálata, nyomon követése Retinal Vessel Analyser (RVA) segítségével fotodinámiás kezelést (PDT) követően 1878-ban Panas és Remy nevéhez fűződik az elváltozás hisztopatológiai leírása, és Fuchstól származik, 1882-ból az első esetismertetés (Panas F 1879; Fuchs 1882). A
52
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
betegség oka ekkor még nem volt ismeretes és Fuchs az általa leírt, piros színű, kerek elváltozást arterio-venozus kommunikációként értelmezte. 1904-ben Von Hippeltől származik az első komplett klinikai leírás. Ő az elváltozás hosszútávú lefolyásáról is említést tett (v Hippel 1904). Hét évvel később egy általa követett beteg enukleációját követően született publikációja már tartalmazza az elváltozás hisztopatológiai leírását is. Ebben a közleményben a retina leírt vaszkuláris daganatát hemangioblasztómaként említi, s a többszörös elváltozás következtében nevezi a kórképet „angiomatosis retinae”-nak. 1926-ban, egy svéd patológus, Lindau szedte össze és írta le az elváltozásban megfigyelhető szisztémás elváltozásokat, és alkotta meg a meghatározott klinikai jellemzőkkel rendelkező, független betegségcsoportot, amit „von Hippel-Lindau betegség”nek nevezünk (Lindau 1926). A retinális capilláris hemangioma (RCH) a von Hippel-Lindau (VHL) betegség leggyakoribb és leghamarabb manifesztálódó tünete (Atebara 2002; Schmidt-Erfurth, Kusserow et al. 2002; Singh, Nouri et al. 2002; Zografos 2002; Costa, Meirelles et al. 2003). A retinalis és papilláris capillaris hemangiomák lehetnek szoliterek, vagy multifokálisak, s klinikailag sokféle előfordulást mutathatnak. Ezeket a különféle előfordulásokat nevezzük retinalis angiomatózisnak. Az elváltozás természetes lefolyása szerint Vail négyféle stádiumot különböztetett meg (Vail 1957): -I stádium: angiómák kialakulása és retinalis arteriovenosus dilatáció; -II stádium: az elváltozás körül vérzések és csillag formájú lipid exudátumok megjelenése; -III stádium: masszív exudáció és retinaleválás; -IV stádium: szekunder glaucoma, uveitis és a látás elvesztése. A betegség progresszióját, illetve a stádiumok közti átmenetek gyorsaságát eddig még nem írták le prospektív módon. A betegséget általában 10 és 30 éves kor között diagnosztizálják (átlagéletkor: 25-27 év) (Zografos 2002). A diagnózis idején a betegek panaszai változóak. Egészen aszimptomatikusak is lehetnek, de betegeink jelezhetnek különböző fokú látáscsökkenést is. A von Hippel-Lindau szindróma részjelenségeként jelentkező retinalis elváltozásokat
53
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
általában hamarabb diagnosztizálják, mint a szoliter módon jelentkező capillaris hemangiomákat. Fejlődésük legkorábbi stádiumában a retinalis capillaris hemangiomák jól körülírt, vörös foltként jelentkeznek. Néha finom fibrotikus membrán fedi az elváltozást. A tápláló és elvezető erek tágulatot ebben a stádiumban még nem mutatnak. Az elváltozások ebben az állapotban teljesen aszimptomatikusak lehetnek, s csak alapos szemfenékvizsgálat során kerülnek felfedezésre. Ezt követően az elváltozás növekedni kezd, s hamarosan az afferens és efferens erek fokozatos tágulata figyelhető meg. Ebben a stádiumban az elvégzett FLAG vizsgálat a keringés fokozódását, és a -tumor közelében- fluorescein festék üvegtesti térbe való diffundálását mutatja. Az ezután bekövetkező exsudáció, lipid exudátumok megjelenése, szerózus neuroretina leválások komplex képet hozhatnak létre. Az elváltozás általában temporálisan, a középperiférián helyezkedik el. Azonban a funduson már számos helyen leírtak capillaris hemangiomát, beleértve ritkán a makuláris régiót is. Differenciál diagnózisként a Coats betegségtől, a perifériás pigment epithel leválástól, a szerzett, felnőttkori
vaszkuláris
tumoroktól,
a
cavernosus
hemangiomától,
és
ritkábban
melanomától, ill. retinoblasztómától kell elkülönítenünk. RCH diagnózisa esetén -VHL betegség kizárása céljából- a beteg szisztémás vizsgálata elengedhetetlen. Ennek többek közt tartalmaznia kell a következő vizsgálatokat: a központi idegrendszer MR vizsgálata, vizelet katekolamin szint vizsgálata, hasi CT vizsgálat. VHL betegség esetén a betegek 49–85%-nál figyelhető meg capillaris hemangioma (Chan 2007). Minden okuláris hemangiománál magas az VEGF, HIF, uboquitin, Epe és EpoR expressziója. Magasabb VEGF szintet detektáltak a fibrovaszkuláris epiretinális membránok érújdonképződéseiben, viszont nem találták magasabbnak koncentrációját az üvegtesti
térben.
A
VEGF,
HIF,
ubiquitin
és
Epo
szerepet
játszanak
a
hipervaszkularizációban, és/vagy angiogenezisben is (Chan 2007). Az Epo szerepét leírták különböző humán daganatokban. Szerepe a tumor növekedésében, életképességének fenntartásában és az angiogenezisben van. Az EpoR szerepét központi idegrendszeri-, uterus-, és ovarium daganatok esetén állapították meg és VHL betegségben leírt ocularis hemangiómák esetén expressziója fokozottabb, mint az Epo expressziója (Chan 2007).
54
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
A RCH egyes eseteiben a kezelés igen nehéz feladat lehet. Ez vonatkozik például kétoldali többszöri tumorok kezelésére, amikor bármikor megjelenhet újabb elváltozás. A retinalis capillaris hemangiomát leggyakrabban obszerváljuk. Amennyiben panaszt okoz a következő terápiák közül választhatunk: lézer photocoaguláció, kryoterápia, radioterápia, hipertermia, transzpupilláris termoterápia, vitrectomia, fototrombózis, és ritkán (fájdalmas, vak szem esetén) enukleáció (Balazs, Berta et al. 1990; Blodi, Russell et al. 1990; Parmar, Mireskandari et al. 2000; Atebara 2002; Schmidt-Erfurth, Kusserow et al. 2002; SchmidtErfurth, Michels et al. 2002; Singh, Nouri et al. 2002; Costa, Meirelles et al. 2003). A daganat sugárkezelését követő hemodinamikai változásokról már korábban beszámoltak. Transzkraniális doppler ultrahanggal követhető az ipszilaterális a. ophthalmica-ban bekövetkezett patológiás áramlás csökkenése és a vaszkuláris rezisztencia növekedése a kezelést követően (Balazs, Berta et al. 1990). A verteporfinnal végzett fotodinámiás kezelés hasznos beavatkozás az időskori macula degenerációban és patológiás myopiában komplikációként jelentkező subfoveális, subretinalis neovaszkularizáció kezelésében (Elsner and Schmidt-Erfurth 2002; GierekLapinska, Wykrota et al. 2002; Haddad, Coscas et al. 2002; Michels, Barbazetto et al. 2002; Schlotzer-Schrehardt, Viestenz et al. 2002). PDT során az erek szelektív okklúziója következik be, s a kezelés alatt a közeli neuroretina károsodásától nem kell tartanunk (Michels, Barbazetto et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002). Ezért merült fel a PDT kezelés a retinában lévő egyéb vaszkularizált elváltozások kezelésére is. Az irodalmi beszámolások alapján, a PDT kezelés a choroidea területében lévő hemangiómák kezelésében alkalmas kezelési mód (Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002; Jurklies, Anastassiou et al. 2003). In vivo kísérletek azt demonstrálták, hogy RCH jól válaszol a PDT kezelésre: a kezelést követően a tumorméret csökkenése és a kísérő jelenségként megfigyelt exudáció felszívódása figyelhető meg (Atebara 2002). Sajnos a kezelést követően a vaszkuláris komplikációk (pl. retinalis egyéb érelzáródás) nem ritkák (Schmidt-Erfurth, Michels et al. 2002; Schmidt-Erfurth, Kusserow et al. 2002), és leírtak már csupán átmeneti sikert, átmeneti vasculáris elzáródást is (Bakri, Sears et al. 2005). Nemrégiben PDT kezelés és intravitreálisan adott triamcinolon acetát (TCA, Kenalog®, Bristol-Myers Squibb, Uxbridge, UK) kezelés kombinációjáról számoltak be egy 15 éves
55
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
betegnél diagnosztizált RCH esetében (Suh SC 2007). A PDT kezelést követő harmadik posztoperatív napon jelentős szerózus neuroretinális leválást követően alkalmaztak intravitreálisan 4 mg TCA-ot, s az öt hónapos követési idő végén a visus és a biomikroszkópos tünetek jelentős javulásáról számoltak be. A cikkben a kortikoszteroidok anti-angiosztatikus hatásáról tesznek említést. A TCA sejtkultúrákban fokozza a humán chorioidea sejtek permeabilitását és adhézióját. A kombinált kezelés előnye: a PDT kezelés vaszkuláris okklúziót okozó hatásának a TCA injekció angiosztatikus tulajdonságaival való kombinációjában rejlik. A kombinált kezelésnek azonban nincs mindig az előbbiekben leírt kedvező hatása. Egy 2006-ban, Németországból publikált esetismertetés szerint az először kombinációban alkalmazott kezelés, majd azt követően monoterápiakánt alkalmazott TCA kezelés nem hozott kedvező eredményt RCH-s betegük kezelésében (von Buelow, Pape et al. 2007). Újabban, farmakológiai ismetereink növekedése következtében kerültek az anti-VEGF molekulák az érdeklődés középpontjába. Habár néhány esetben a makulaödéma mértéke és a kemény exudátumok száma csökkent anti-VEGF kezelés következtében, az alkalmazott monoterápia nem befolyásolta lényegesen az okuláris hemangiomákat. Ez egyik tanulmányban, ahol a SU5416 molekulát adtak iv hét hónapon keresztül, az alkalmazott VEGF
receptor
inhibitor
kezelés
következtében
nem
változott
a
retinalis
hemangioblasztóma mérete (Chan 2007). Egy másik vizsgálat során intravitreális pegaptanib (Macugen®, Pfizer Inc, New York, USA) kezelést alkalmaztak 6 hetenként. A tanulmányba bevont öt esetből kettőnél írtak le az exudátumok és makulaödéma csökkenését. A tumorok klinikai megjelenése nem változott a követési idő alatt (Dahr, Cusick et al. 2007). Bevacizumab (Avastin®, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Svájc) használatáról is rendelkezünk bizonyos tapasztalatokkal RCH kezelésében (von Buelow, Pape et al. 2007). A bevacizumab rekombináns technikával előállított monoklonális IgG1 antitest, ami a humán VEGF molekulához kötődve gátolja annak endoteliális sejteken lévő receptorához való kötődését. A német szerzőktől származó cikkben a metasztatikus kolorektális rákok kezelésére alkalmazott protokoll szerint, szisztémásan adták a bevacizumab kezelést (6 mg⁄ testsúly kg). A kezelést követően moderált eredményeket értek el – igaz, ezeken a
56
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
szemeken előzetesen PDT és TCA kombinált kezelést végeztek, így a bevacizumab kezelés eredményessége csak fenntartásokkal értékelhető. VHL sejtek felelősek azokért a termelt faktorokért és citokinekért, amelyeknek jelentős szereppel rendelkeznek az angiogenezis folyamatában. A jövőben olyan kezelésekre lesz szükség, amelyek direkt ezeket a sejteket veszik célba, azonban valószínűleg ezek a kezelések
egyedül
nem
lesznek
elégségesek
a
VHL-ben
megfigyelt
okuláris
hemangioblasztómák kezelésében. A
hemodinamikai
változások
monitorozására
kiválóan
alkalmas
noninvazív
vizsgálómódszer az RVA, mely készülék a retinában található erek átmérőjének a mérésére alkalmas. A Zeiss, RVA készülék hatékony érzékenységgel rendelkezik és jól alkalmazható farmakológiai vizsgálatokban is (Polak, Dorner et al. 2000; Barcsay, Seres et al. 2003). A mai napig viszonylag kevés információval rendelkezünk RCH PDT kezelésével kapcsolatban. Az irodalomban e témával kapcsolatban eddig csupán néhány esetimertetés, illetve egy-két beteget magába foglaló tanulmány került leírásra. A követési idők is igen rövidek. Emiatt úgy gondoljuk, hogy minden újabb kezelés leírása plusz információt adhat betegségről, illetve segítséget nyújthat a megfelelő kezelés kiválasztásában. Ezért gondoljuk vizsgálatunkat érdekesnek. Bemutatott esetünkben a fiatal nőbetegnél diagnosztizált RCH esetében sikeresen alkalmaztuk a PDT kezelést. Intraoperatív komplikáció nem történt. A korai posztoperatív szakban jelentkezett komplikáció következtében átmenetileg romlott betegünk látóélessége. A fotodinámiás kezelést követően hátsó pólusra lokalizálódó szerózus neuroretina-leválás alakult ki. A jelenség fokozott exsudációval magyarázható, mely folyadék ezt követően fokozatosan csökkent. A PDT-t követő 12. napon a folyadék teljesen felszívódott, s betegünk látóélessége ismét teljes volt. Hat hónappal a PDT kezelést követően már csak enyhe fibrotikus elváltozásokat találtunk a RCH felszínén, stabil, teljes látóélesség mellett. Emellett, az összehasonlító színes felvételeken a PDT méretének a csökkenését észleltük. A kezelést követő ötödik napon biomikroszkóposan megfigyelhettük és RVA-val számszerűen ki tudtuk mutatni az elváltozást tápláló-, és elvezető ereinek az átmérőcsökkenését. Ez a változás a PDT kezelést követő hatodik hónapban is
57
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
megfigyelhető volt, azaz a követési idő alatt progresszió nem alakult ki a RCH ereinek átmérője tekintetében. Összefoglalva a kezelést követően kialakult komplikáció nem bizonyult tartósnak, a látóélesség javult, az erek átmérője és a daganat mérete csökkent. Ezek a tünetek, ill. az a tény, hogy a beteg szubjektív panaszai eltűntek, a kezelés hatékonyságát bizonyítja.
58
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
8. ÚJ EREDMÉNYEK ÉS KLINIKAI JELENTŐSÉGÜK
1. Primer retinalis pigment epithel (RPE) monolayer sejtkultúrák lézerkezelésekor a keletkezett hőmérséklet emelkedését mértük. A mért hőmérsékletemelkedés a lézergóc közepén, ill. a szélén tendenciájukban hasonlónak bizonyultak.
2. RPE biokémiai reakciói lézerkezelést követően megváltoznak. 1600 mW-os energia alkalmazása esetén a sejtek glutamát felvétele csökken, a 800mW-os kezeléshez képest, ami pedig a kontroll értékekhez képest mutatott csökkenést. A sejtek a GABA felvételre ellenkezően reagáltak: amikor nagyobb az alkalmazott energia, nő a sejtek GABA felvétele.
3. Nemzetközileg elsőként vizsgáltuk retinalis capillaris hemangioma (RCH) fotodinámiás kezelése (PDT) után a daganatot tápláló és elvezető erek átmérőjének a vastagságát.
4. Kimutattuk, hogy a RCH PDT kezelése után, mind a tápláló, mind az elvezető ér átmérőjének a csökkenése figyelhető meg. Az átmérőcsökkenés öt nappal a kezelés után kimutatható és mértéke nem változik 6 hónappal a kezelést követően sem.
59
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
9. KÖSZÖNETNYÍLVÁNÍTÁS Legelőször feleségemnek és gyermekeimnek köszönöm, hogy segítettek, hogy e dolgozat elkészülhessen. Köszönettel tartozom szüleimnek, akik felneveltek és segítettek abban, hogy erre a pályára kerüljek. Köszönöm Süveges Ildikó és Lotta Salminen Professzor Asszonyoknak, akik segítségemre voltak az első ötletek létrehozásában, ill. ezek megvalósításában. Köszönettel tartozom Varga Vince Professzor Úrnak, aki az élettani kísérletek megvalósításában nyújtott pótolhatatlan segítséget. Köszönöm Németh János Professzor Úr támogatását, aki klinika igazgatóként folyamatosan tudományos munkára ösztönzött és annak lehetőségét biztosította. A klinika minden dolgozójának köszönöm a megértését és támogatását kiemelve: Seres Andrást, akinek ötletei és diszkussziói nélkül ez az anyag most nem lehetne itt ilyen formában. Köszönettel tartozom a Retina szakambulancián jelenleg ill. korábban dolgozó kollégáimnak is: Czumbel Norbertnek, Kálmán Zsuzsannának, Papp Andrásnak és Pregun Tamásnak. Köszönöm továbbá a Retina ambulancián dolgozó asszisztensnőknek is segítségüket: főként Gáspár Editnek, de Pinczehelyi Krisztinának, Csabai Tímeának és Csorba Angélának, akik a mindennapi klinikai életben nyújtottak számomra nélkülözhetetlen segítséget. Deutsch Róbert és Somfalvi Dániel a számítógépes munkákban segítettek. A Semmelweis Egyetem Doktori Iskolája minden munkatárásának köszönettel tartozom segítőkészségükért. Ösztöndíjak •
Centre for International Mobility; 1999.
•
International Postgraduate Programme, Neuroscience, Tampere, Finnország, 2000.
60
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
11. ÖSSZEFOGLALÓ
Szemfenéki lézerkezelések végzésekor, a retinalis pigment epithel (RPE) sejtrétegben elnyelődő lézersugár különböző hatásokat okoz. A direkt lézerhatás mellett másodlagosan kialakuló hőmérsékletemelkedést mértük RPE monolayer sejtkultúrák lézerkezelésekor. A mért hőmérsékletemelkedés a lézergóc közepén, ill. a szélén tendenciájukban hasonlónak bizonyultak. Vizsgálatunkban a RPE biokémiai reakciói a lézerkezelést követően megváltoznak. 1600 mW-os energia alkalmazása esetén a sejtek glutamát felvétele csökken, a 800 mW-os kezeléshez képest. A sejtek a GABA felvételre ellenkezően reagáltak: amikor nagyobb volt az alkalmazott energia, nőtt a sejtek GABA felvétele. Klinikai körülmények között retinalis capillaris hemangioma (RCH) fotodinámiás kezelését (PDT) követően vizsgáltuk és monitorizáltuk a daganatot tápláló és elvezető erek átmérőjének a vastagságát. Kimutattuk, hogy a RCH PDT kezelése során, mind a tápláló, mind az elvezető ér átmérőjének a csökkenése figyelhető meg. Az átmérőcsökkenés öt nappal a kezelés után kimutatható és mértéke nem változik 6 hónappal a kezelést követően sem.
61
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
12. SUMMARY
When performing retinal laser photocoagulation the laser beam causes different effects at the level of the retinal pigment epithelial (RPE) layer, where it is mostly absorbed. Besides the direct effects of the laser beam there is a secondary effect, a temperature elevation, that we could measure at the level of the RPE layer after laser treatment. The temperature increase measured in the center and at the border of the laser spot had the same tendency. In our experiment the biochemical reactions of the RPE monolayer changed after laser photocoagulations. Using 1600 mW energy the glutamate uptake of our cells decreased as compared to 800 mW. An opposite effect was observed when examining the GABA uptake: the higher the energy for the treatment the higher the GABA uptake was. We have perfomed a photodynamic treatment (PDT) for a retinal capillary haemangioma (RCH). We looked upon and monitorized the diameter of the feeder and draining vessel of the RCH under clinical conditions. We have shown that a decrease of the diameter of both feeder and draining vessel was observed. This decrease was present five days after the treatment and did not change six months after the treatment.
62
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
13. PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE
13.1. Értekezés témájához kapcsolódó közlemények 1. Szabó A, Varga V, Toimela T, Hiitelä K, Tähti H, Oja SS, Süveges I, Salminen L. Laser Treatment of Cultured Retinal Pigment Epithelial Cells-Evaluation of the Cellular Damage In Vitro. J Ocul Pharmacol Ther. 2004; 20: 246-255.
IF: 1,228
2. Szabó A, Géhl Zs, Seres A: Photodynamic (Verteporfin) therapy for retinal capillary haemangioma, with monitoring of feeder and draining blood-vessel diameters. Acta Ophthalmol. Scand. 2005; 83: 512-513.
IF: 1,581
3. Holló G, Szabó A, Vargha P: Scanning laser polarimetry versus frequency-doubling perimetry and conventional threshold perimetry: Changes during a 12-month follow-up in preperimetric glaucoma. A pilot study; Acta Ophthalmol. Scand. 2001; 79: 403-407. IF: 0,561
13.2. Egyéb közlemények 1. Szabó A, Holló G, Follmann P, Vargha P: Fehér és kék-sárga perimetria primer nyitott zugú glaucomában: hogyan befolyásolja a vizsgálatot a szemlecse autofluoreszcenciája, Szemészet. 1998; 135: 117-120. 2. Follmann P, Szabó A, Holló G: Latanoprost (Xalatan) a nyitott zugú glaucoma kezelésében, Szemészet. 1999; 136: 123-126.
63
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
3. Nagy Z Zs, Füst Á, Németh J, Szabó A, Süveges I: Az excimer lézeres fotorefraktív keratectomia tapasztalatai 2053 szem kezelése kapcsán, Orvosi Hetilap. 1999; 140: 747754. 4. Nagy Z Zs, Szabó A, Krueger R R, Süveges I: Treatment of intraocular pressure elevation after photorefractive keratectomy. J Cataract Refract Surg. 2001; 27:1018-24. IF: 2,130 5. Szabó A, Seres A, Németh J: Papillagödör ellenoldali microphthalmusszal és látóidegcisztákkal szövődött esete, Szemészet. 2003; 140: 43-47.
13.3. Az értekezés témájában elhangzott előadások, poszterek 1. Szabó A: Biochemical effects of laser in posterior segment of the eye. Suomen Silmälääkäriyhdistys Ry, 2000.03.24-25., Tampere, Finnország. 2. Szabó A: Histological changes in the posterior segment of the eye. Suomen Silmälääkäriyhdistys Ry, 2000.03.24-25., Tampere, Finnország. 3. Seres A, Papp A, Szabó A: Tapasztalataink időskori macula degeneratio transpupilláris thermotherápiájával: első benyomások egy kettős vak, randomizált vizsgálat alapján; Tihany, 2001-es Retina Kongresszus. 4. Seres A, Papp A, Szabó A: Photodynamiás therápia: Indikációk és technikai kivitelezés; Továbbképző tanfolyam, Tihany, 2001-es Retina Kongresszus. 5. Szabó A: Tapasztalatok primer retinális sejtkultúrával, Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Miskolc, 2002.08.29-31.
64
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
6. Papp A, Seres A, Pregun T, Szabó A, Süveges I: Az első két év tapasztalatai photodynamiás kezeléssel: időskori maculadegeneratió eredetű érújdonképződések, Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Miskolc, 2002.08.29-31. 7. Pregun T, Seres A, Papp A, Szabó A, Süveges I: Az első két év tapasztalatai photodynamiás kezeléssel: myopia és más, nem AMD eredetű érújdonképződések, Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Miskolc, 2002.08.29-31. 8. Seres A, Szabó A, Papp A, Süveges I: Photothérapie dynamique dans la dégénérescence maculaire liée à l’âge. Résultats après 3 ans. Francia Szemésztársaság 110. Kongresszusa. 2004.05.8.-12., Párizs. 9. Szabó A, Géhl Zs, Seres A: PDT treatment for capillary haemangioma of the retina, Case report. Alpe Adria Community. 2004.10.9.10., München. 10. Szabó A, Papp A, Tóth J: Szövettani elváltozások transpupilláris thermoterápia-val kezelt chorioidea melanomá-ban Magyar Szemorvostársaság 2005. évi Kongresszusa. Szeged. 2005.06.09-11. 11. Szabó A, Varga V, Toimela T, Tähti H, Oja SS, Salminen L, Süveges I: Laser photocoagulatio hatása glutamat és gamma-aminovajsav transzportfolyamataira primer pigment epithel sejtkultúrán (XXII. Membrán-Transzport Konferencia, Sümeg, 2002.05.21-24.) 12. Szabó A, Varga V, Tähti H, Oja SS, Salminen L, Süveges I: Diode laser photocoagulation and its affects in cultured retinal pigment epithelial cells. XV International congress of Eye Research. Genf. 2002.10.06-10.
65
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
13. Szabó A, Varga V, Salminen L, Süveges I: Lézer photocoagulation hatása glutamát és γ-aminovajsav traszportfolyamataira primer pigment epithelial sejtkultúrán, Magyar Szemorvostársaság Kongresszusa, Miskolc, 2002.08.29-31. 14. Szabó A, Géhl Zs, Seres A: PDT treatment for capillary haemangioma of the retina, case report. 2003, SOE, 2003.06.07-12. 15. Szabó A, Géhl Zs, Seres A: Photothérapie dynamique d’une hémangiome capillaire de la rétine, Cas clinique. Francia Szemésztársaság 110. Kongressusa. 2004.05.8.-12., Párizs. 16. Seres A, Papp A, Borbándy Á Pregun T, Szabó A, Czumbel N, Süveges I: Photodynamic therapy in pathologic, myopia: importance of age and baseline visual acuity. 4th Euretina Congress, 2004.05.13.-15 17. Szabó A, Papp A, Tóth J : Résultats histopathologies après la thermothérapie transpupillaire (TTT) pour mélanomes de la choroïde. Francia Szemésztársaság 111. Kongresszusa. 2005.05.7.-11., Párizs. 18. Szabó A, Seres A: Un cas de maladie Von Hippel Lindau traité avec le PDT. Francia Szemésztársaság 112. Kongresszusa. 2006.05.6.-10., Párizs.
13.4. Tudományos munkásságot mutató egyéb előadások, poszterek 1. Follmann P, Szabó A: CTN: 9600PG054 Xalatan (latanoprost) III. fázisú klinikai vizsgálata a Semmelweis OTE I sz. Szemészeti klinkáján, Xalatan meeting, Hotel Mariotte
66
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
2. Szabó A, Nagy Z Zs, Füst Á, Süveges I: Intraoculáris szemnyomás emelkedés fotorefraktív lézerkezelés után, SHIOL, Keszthely, 1998 március 26-28. 3. Nagy Z Zs, Németh J, Szabó A, Füst Á, Süveges I: A fotorefraktív keratectomiák utáni szekunder szemnyomásemelkedés kezelése Timolol és Dorzolamid kombinációjával; Magyar Szemorvotársaság Nagygyűlés, Kaposvár, 1998 augusztus 27-29. 4. Szabó A: Rövidhullámú automa küszöbperimetria: működési elv, paraméterek, indikáció, értékelés, hibalehetőségek. Gyakorlati perimetria glaucomában (továbbképző kurzus), Kaposvár, 1998. 5. Szabó A: A retinális idegrostréteg és a látásfunkciók 1 éves összehasonlító vizsgálata korai glaucomában. Modern, praktikus kérdések és válaszok a gyakorló szemorvos számára, 2000. Szeptember 9., Semmelweis Egyetem, I. sz. Szemészeti Klinika. 6. Holló G, Szabó A: Scanning laser polarimetry versus frequency-doubling perimetry and conventional threshold perimetry: detection of the progression during one year in early glaucoma; 3rd International Glaucoma Symposium – I.G.S., Prága, Cseh Köztársaság, 2001 március 21-25. 7. Nagymihály A, Seres A, Szabó A, Papp A: Első tapasztalatok a Retinal Thickness Analyserrel; Tihany, 2001-es Retina Kongresszus.
8. Szabó A, Molnár B, Seres A: Helicobacter pylori fertőzés szerepe a chorioretinopathia centralis serosában. Magyar Szemorvostársaság kongresszusa. 2003. Augusztus 28-30, Budapest.
67
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
9. Papp A, Szabó A, Pregun T, Schneider M, Seres A, Németh J: Első eredményeink intravitreális triamcinolone acetonide injekció adásával diabeteses macula ödéma esetén VII. Fiatal Diabetológusok Találkozója, Siófok, 2005. április 21-25. 10. Szabó A: Intravitreális injekciók adásának javasolt protokollja. A Magyar Szemorvostársaság és a Retina Szekció tudományos ülése, 2006.04.28. 11. Szabó A: VEGF gátló gyógyszerek lehetséges adásmódjai, Magyar Szemorvostársaság 2006. évi Kongresszusa. Sopron. 2006.06.15-17. 12. Szabó A, Holló G, Follmann P, Vargha P: Perimetry and it’s relation to lens autofluorescence in primary open-angle glaucoma, Jermov 97, Montpellier, Franciaország. 13. Szabó A, Nagy ZZs, Füst A, Süveges I: Congress of the Societé Française d'Ophthalmologie (SFO): Results of photorefractive excimer keratectomy in eyes with mixed astigmatism·(1998), Párizs, Franciaország. 14. Szabó A, Molnár B, Seres A: The role of Helicobacter Pylori infection in central serous chorioretinopaty. 4th EURETINA Congress, 2004.05.13.-15. 15. Szabó A, Seres A: Szénmonoxid mérgezés és retinopathia; esetismertetés, Magyar Szemorvostársaság 2006. évi Kongresszusa. Sopron. 2006.06.15-17.
68
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
IRODALOM Amato, A., L. Ballerini, et al. (1994). "Intracellular pH changes produced by glutamate uptake in rat hippocampal slices." J Neurophysiol 72(4): 1686-96. Amato, A., B. Barbour, et al. (1994). "Counter-transport of potassium by the glutamate uptake carrier in glial cells isolated from the tiger salamander retina." J Physiol 479 ( Pt 3): 371-80. Atebara, N. H. (2002). "Retinal capillary hemangioma treated with verteporfin photodynamic therapy." Am J Ophthalmol 134(5): 788-90. Bakri, S. J., J. E. Sears, et al. (2005). "Transient closure of a retinal capillary hemangioma with verteporfin photodynamic therapy." Retina 25(8): 1103-4. Balazs, E., A. Berta, et al. (1990). "Hemodynamic changes after ruthenium irradiation of Hippel's angiomatosis." Ophthalmologica 200(3): 128-32. Balazs, R. and N. Hack (1990). "Trophic effects of excitatory amino acids in the developing nervous system." Adv Exp Med Biol 268: 221-8. Barcsay, G., A. Seres, et al. (2003). "The diameters of the human retinal branch vessels do not change in darkness." Invest Ophthalmol Vis Sci 44(7): 3115-8. Berger, J. W. (1997). "Thermal modelling of micropulsed diode laser retinal photocoagulation." Lasers Surg Med 20(4): 409-15. Berger, J. W. and D. J. D'Amico (1997). "Modeling of erbium: YAG laser-mediated explosive photovaporization: implications for vitreoretinal surgery." Ophthalmic Surg Lasers 28(2): 133-9.
69
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Birngruber, R., F. Hillenkamp, et al. (1985). "Theoretical investigations of laser thermal retinal injury." Health Phys 48(6): 781-96. Blodi, C. F., S. R. Russell, et al. (1990). "Direct and feeder vessel photocoagulation of retinal angiomas with dye yellow laser." Ophthalmology 97(6): 791-5; discussion 796-7. Branch Vein Occlusion Study Group (1986). "Argon laser scatter photocoagulation for prevention of neovascularization and vitreous hemorrhage in branch vein occlusion. A randomized clinical trial." Arch Ophthalmol 104(1): 34-41. Bressler, N. M. (2002). "Early detection and treatment of neovascular age-related macular degeneration." J Am Board Fam Pract 15(2): 142-52. Bridges, C. C., A. El-Sherbeny, et al. (2001). "A comparison of caveolae and caveolin-1 to folate receptor alpha in retina and retinal pigment epithelium." Histochem J 33(3): 149-58. Bridges, C. C., R. Kekuda, et al. (2001). "Structure, function, and regulation of human cystine/glutamate transporter in retinal pigment epithelial cells." Invest Ophthalmol Vis Sci 42(1): 47-54. Brinkmann, R., J. Roider, et al. (2006). "Selective retina therapy (SRT): a review on methods, techniques, preclinical and first clinical results." Bull Soc Belge Ophtalmol(302): 51-69. Chan, C., Collins, ABD, Chew , EYC (2007). "Molecural pathology of eyes with von Hippe-Lindau (VHL) disease A Review." Retina. 1: 1–7. Costa, R. A., R. L. Meirelles, et al. (2003). "Retinal capillary hemangioma treatment by indocyanine green-mediated photothrombosis." Am J Ophthalmol 135(3): 395-8.
70
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Dahr, S. S., M. Cusick, et al. (2007). "Intravitreal anti-vascular endothelial growth factor therapy with pegaptanib for advanced von Hippel-Lindau disease of the retina." Retina 27(2): 150-8. Damjanovich S, Fidy J, Szöllősi J, (2006). "Orvosi biofizika (2. kiadás)." Medicina. Del Priore, L. V., B. M. Glaser, et al. (1989). "Response of pig retinal pigment epithelium to laser photocoagulation in organ culture." Arch Ophthalmol 107(1): 119-22. Derouiche, A. and T. Rauen (1995). "Coincidence of L-glutamate/L-aspartate transporter (GLAST) and glutamine synthetase (GS) immunoreactions in retinal glia: evidence for coupling of GLAST and GS in transmitter clearance." J Neurosci Res 42(1): 131-43. Desmettre, T. J., S. R. Mordon, et al. (2006). "Micropulse and continuous wave diode retinal photocoagulation: visible and subvisible lesion parameters." Br J Ophthalmol 90(6): 709-12. Donati, G. (2002). "[Current treatment of choroidal neovascularization in age-related macular degeneration]." J Fr Ophtalmol 25(7): 740-6. Dreyer, E. B., D. Zhang, et al. (1995). "Transcriptional or translational inhibition blocks low dose NMDA-mediated cell death." Neuroreport 6(6): 942-4. Ells, A. L., J. B. Uphill, et al. (2002). "Regression of severe retinopathy of prematurity after laser treatment." Arch Ophthalmol 120(10): 1404-5. Elsner, H. and U. Schmidt-Erfurth (2002). "[Photodynamic therapy of subfoveal choroid neovascularization. Analysis of fixation behavior]." Ophthalmologe 99(8): 620-4. Flaxel, C. J. (2002). "Use of radiation in the treatment of age-related macular degeneration." Ophthalmol Clin North Am 15(4): 437-44, v.
71
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Flower, R. W. (2002). "Optimizing treatment of choroidal neovascularization feeder vessels associated with age-related macular degeneration." Am J Ophthalmol 134(2): 22839. Friberg, T. R., D. C. Musch, et al. (2006). "Prophylactic treatment of age-related macular degeneration report number 1: 810-nanometer laser to eyes with drusen. Unilaterally eligible patients." Ophthalmology 113(4): 622 e1. Fuchs, E. (1882). "Aneurysma arterio-nevosum retinae. ." Arch Augenheilkd(11): 440-445. Furness, D. N. and K. P. Lehre (1997). "Immunocytochemical localization of a highaffinity glutamate-aspartate transporter, GLAST, in the rat and guinea-pig cochlea." Eur J Neurosci 9(9): 1961-9. Gabel, V. P., L. Neubauer, et al. (1985). "Ocular side effects following neodymium:YAG laser irradiation." Int Ophthalmol Clin 25(3): 137-49. Gierek-Lapinska, A., H. Wykrota, et al. (2002). "[New methods of treatment of age-related macular degeneration. Photodynamic therapy. Part I]." Klin Oczna 104(3-4): 27682. Haddad, W. M., G. Coscas, et al. (2002). "Eligibility for treatment and angiographic features at the early stage of exudative age related macular degeneration." Br J Ophthalmol 86(6): 663-9. Harada, T., C. Harada, et al. (2007). "The potential role of glutamate transporters in the pathogenesis of normal tension glaucoma." J Clin Invest 117(7): 1763-70. Hertz, L., Drejer, J., Schousboe, A. (1988.). "Energy metabolism in glutamatergic neurons, GABAergic neurons and astrocytes in primary cultures." Neurochem Res. 13: 605610.
72
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Hertz, L., L. Peng, et al. (1998). "Functional studies in cultured astrocytes." Methods 16(3): 293-310. Hertz, L., R. A. Swanson, et al. (1998). "Can experimental conditions explain the discrepancy over glutamate stimulation of aerobic glycolysis?" Dev Neurosci 20(45): 339-47. Hiemer, H., H. Hutter, et al. (1985). "[Retinal damage in neodymium:YAG laser surgery in the area of the vitreous body]." Fortschr Ophthalmol 82(5): 447-9. Hiroshiba, N., Y. Ogura, et al. (1998). "Alterations of retinal microcirculation in response to scatter photocoagulation." Invest Ophthalmol Vis Sci 39(5): 769-76. Hittela, K. (2001). "Diploma work." http://www.sensorsci.com/sbt.htm "Termosztát jellemzői ezen a weblapon találhatóak." Hutter, H., H. Hiemer, et al. (1985). "[Thermal neodymium:YAG laser effects on the retina]." Fortschr Ophthalmol 82(5): 443-6. Johnson, J., T. K. Chen, et al. (1996). "Multiple gamma-Aminobutyric acid plasma membrane transporters (GAT-1, GAT-2, GAT-3) in the rat retina." J Comp Neurol 375(2): 212-24. Jorgensen, O. S., B. W. Brooksbank, et al. (1990). "Neuronal plasticity and astrocytic reaction in Down syndrome and Alzheimer disease." J Neurol Sci 98(1): 63-79. Jurklies, B., G. Anastassiou, et al. (2003). "Photodynamic therapy using verteporfin in circumscribed choroidal haemangioma." Br J Ophthalmol 87(1): 84-9. Khatami, M. (1988). "Carrier-dependent and carrier-independent uptake of myo-inositol in cultured retinal pigment epithelial cells: activation by heat and concentration." Biochem Cell Biol 66(9): 942-50.
73
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Khatami, M. (1988.). " Na+-linked active transport of ascorbate into cultured bovine retinal pigment epithelial cells: heterologous inhibition by glucose." Membr Biochem 7: 115-130. Khatami, M. and J. H. Rockey (1988). "Regulation of uptake of inositol by glucose in cultured retinal pigment epithelial cells." Biochem Cell Biol 66(9): 951-7. King, R. G., Jr. and W. J. Geeraets (1968). "The effect of Q-switched ruby laser on retinal pigment epithelium in vitro." Acta Ophthalmol (Copenh) 46(4): 617-32. Kleinschmidt, J., C. L. Zucker, et al. (1986). "Neurotoxic action of kainic acid in the isolated toad and goldfish retina: II. Mechanism of action." J Comp Neurol 254(2): 196-208. Kovalchuk, Y., B. Miller, et al. (1994). "Arachidonic acid depresses non-NMDA receptor currents." Brain Res 643(1-2): 287-95. Krauss, J. M., C. A. Puliafito, et al. (1987). "Interferometric technique for investigation of laser thermal retinal damage." Invest Ophthalmol Vis Sci 28(8): 1290-7. Krebs, I., S. Binder, et al. (2004). "[Photodynamic therapy for severe myopia]." Ophthalmologe 101(1): 25-32. la Cour, M., J. F. Kiilgaard, et al. (2002). "Age-related macular degeneration: epidemiology and optimal treatment." Drugs Aging 19(2): 101-33. Lanzetta, P., G. Dorin, et al. (2001). "Theoretical bases of non-ophthalmoscopically visible endpoint photocoagulation." Semin Ophthalmol 16(1): 8-11. Lehre, K. P., S. Davanger, et al. (1997). "Localization of the glutamate transporter protein GLAST in rat retina." Brain Res 744(1): 129-37.
74
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Lilledahl, N. P., B. Nicolaissen, Jr., et al. (1988). "The effect of a pulsed neodymium-YAG laser on chorioretinal monolayered cell cultures." Acta Ophthalmol (Copenh) 66(5): 528-32. Lindau, A. (1926). "Zur Frage der Angiomatosis retinae und Ihrer Hirnkomplikationen." Acta Ophthalmol 4: 193-226. Lowry, O. H., Rosenbough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951.). "Protein measurement with the Folin phenol reagent." J Biol Chem. 193: 265-275. Macular Photocoagulation Study (MPS) Group (1994). "Evaluation of argon green vs krypton red laser for photocoagulation of subfoveal choroidal neovascularization in the macular photocoagulation study." Arch Ophthalmol 112(9): 1176-84. Macular Photocoagulation Study Group (1982). "Argon laser photocoagulation for senile macular degeneration. Results of a randomized clinical trial." Arch Ophthalmol 100(6): 912-8. Macular Photocoagulation Study Group (1986). "Argon laser photocoagulation for neovascular maculopathy. Three-year results from randomized clinical trials." Arch Ophthalmol 104(5): 694-701. Macular Photocoagulation Study Group (1986). "Recurrent choroidal neovascularization after argon laser photocoagulation for neovascular maculopathy." Arch Ophthalmol 104(4): 503-12. Macular Photocoagulation Study Group (1991). "Laser photocoagulation of subfoveal neovascular lesions in age-related macular degeneration. Results of a randomized clinical trial." Arch Ophthalmol 109(9): 1220-31.
75
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Macular Photocoagulation Study Group (1991). "Laser photocoagulation of subfoveal recurrent neovascular lesions in age-related macular degeneration. Results of a randomized clinical trial." Arch Ophthalmol 109(9): 1232-41. Macular Photocoagulation Study Group (1991). "Subfoveal neovascular lesions in agerelated macular degeneration. Guidelines for evaluation and treatment in the macular photocoagulation study." Arch Ophthalmol 109(9): 1242-57. Macular Photocoagulation Study Group (1993). "Laser photocoagulation of subfoveal neovascular lesions of age-related macular degeneration. Updated findings from two clinical trials." Arch Ophthalmol 111(9): 1200-9. Macular Photocoagulation Study Group (1994). "Laser photocoagulation for juxtafoveal choroidal neovascularization. Five-year results from randomized clinical trials." Arch Ophthalmol 112(4): 500-9. Macular
Photocoagulation
neovascularization
Study
after
Group
laser
(1994).
photocoagulation
"Persistent for
and
recurrent
subfoveal
choroidal
neovascularization of age-related macular degeneration. ." Arch Ophthalmol 112(4): 489-99. Macular
Photocoagulation
Study
Group
(1994).
"Visual
outcome
after
laser
photocoagulation for subfoveal choroidal neovascularization secondary to agerelated macular degeneration. The influence of initial lesion size and initial visual acuity." Arch Ophthalmol 112(4): 480-8. Macular Photocoagulation Study Group (1995). "Laser photocoagulation for neovascular lesions nasal to the fovea. Results from clinical trials for lesions secondary to ocular histoplasmosis or idiopathic causes." Arch Ophthalmol 113(1): 56-61.
76
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Macular Photocoagulation Study Group (1996). "Five-year follow-up of fellow eyes of individuals with ocular histoplasmosis and unilateral extrafoveal or juxtafoveal choroidal neovascularization." Arch Ophthalmol 114(6): 677-88. Macular Photocoagulation Study Group (1996). "Occult choroidal neovascularization. Influence on visual outcome in patients with age-related macular degeneration." Arch Ophthalmol 114(4): 400-12. Macular
Photocoagulation
Study
Group
(1997).
"Risk
factors
for
choroidal
neovascularization in the second eye of patients with juxtafoveal or subfoveal choroidal neovascularization secondary to age-related macular degeneration." Arch Ophthalmol 115(6): 741-7. Madl, J. E. and D. L. Allen (1995). "Hyperthermia depletes adenosine triphosphate and decreases glutamate uptake in rat hippocampal slices." Neuroscience 69(2): 395405. Maenpaa, H., M. Mannerstrom, et al. (2002). "Glutamate uptake is inhibited by tamoxifen and toremifene in cultured retinal pigment epithelial cells." Pharmacol Toxicol 91(3): 116-22. Mannerstrom, M., M. Zorn-Kruppa, et al. (2002). "Evaluation of the cytotoxicity of selected systemic and intravitreally dosed drugs in the cultures of human retinal pigment epithelial cell line and of pig primary retinal pigment epithelial cells." Toxicol In Vitro 16(2): 193-200. Marmor MF, W. T. (1998). "The Retinal Pigment Epithelium." Oxford University Press. Marshall, J. (1989). "Structural aspects of laser-induced damage and their functional implications." Health Phys 56(5): 617-24.
77
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Marshall, J. and J. Mellerio (1967). "Pathological development of retinal laser photocoagulations." Exp Eye Res 6(4): 303-8. Massey, S. C. (1990.). "Cell types using glutamate as a neurotransmitter in the vertebrate retina." Prog Retinal Res 9: 399-425. May, D. R., M. L. Klein, et al. (1976). "A prospective study of xenon arc photocoagulation for central retinal vein occlusion." Br J Ophthalmol 60(12): 816-8. May, D. R., M. L. Klein, et al. (1979). "Xenon arc panretinal photocoagulation for central retinal vein occlusion: a randomised prospective study." Br J Ophthalmol 63(11): 725-34. McHugh, J. D., J. Marshall, et al. (1989). "Initial clinical experience using a diode laser in the treatment of retinal vascular disease." Eye 3 ( Pt 5): 516-27. Mellerio, J. (1966). "Is there a hazard in laser photocoagulation?" Br Med J 1(5489): 719. Mellerio, J. (1966). "The thermal nature of retinal laser photocoagulation." Exp Eye Res 5(4): 242-8. Meyer-Schwickerath, G. (1959). "Indications ad limitations of light coagulation of the retina." Trans Am Acad Ophthalmol Otolaryngol 63: 725-738. Michels, S., I. Barbazetto, et al. (2002). "[Changes in neovascular membranes and normal choroid blood vessels after multiple photodynamic therapy treatments]." Ophthalmologe 99(2): 96-100. Miyamoto, Y. and M. A. Del Monte (1994). "Na(+)-dependent glutamate transporter in human retinal pigment epithelial cells." Invest Ophthalmol Vis Sci 35(10): 3589-98.
78
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Montero, J. A. and J. M. Ruiz-Moreno (2003). "Verteporfin photodynamic therapy in highly myopic subfoveal choroidal neovascularisation." Br J Ophthalmol 87(2): 173-6. Mosinger, J. L., S. Yazulla, et al. (1986). "GABA-like immunoreactivity in the vertebrate retina: a species comparison." Exp Eye Res 42(6): 631-44. Neubauer, L., V. P. Gabel, et al. (1985). "[Corneal endothelial changes in anterior capsulotomy and postcataract membranotomy with the neodymium:YAG laser]." Fortschr Ophthalmol 82(1): 80-2. Nistico, G., A. De Sarro, et al. (1983). "Lack of relation between dopaminergic and gabaergic mechanisms in chick retina." Res Commun Chem Pathol Pharmacol 40(1): 29-39. Novartis (2001). "Visudyne, Verteporin. Product Monograph. Second edition." Novartis Ophthalmics AG Nunclon "www.biokom.com.pl/nunc/gifs/prod_fot/deltadish.jpg." O'Brien, K. B., M. Esguerra, et al. (2004). "Monitoring neurotransmitter release from isolated retinas using online microdialysis-capillary electrophoresis." Anal Chem 76(17): 5069-74. Panas F, R. A. (1879). "Décollement kystique de la rétine." Anatomie pathologique de la l’œil. Adrien Delahaye, Paris: 88-93 . Parmar, D. N., K. Mireskandari, et al. (2000). "Transpupillary thermotherapy for retinal capillary hemangioma in von Hippel-Lindau disease." Ophthalmic Surg Lasers 31(4): 334-6.
79
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Polak, K., G. Dorner, et al. (2000). "Evaluation of the Zeiss retinal vessel analyser." Br J Ophthalmol 84(11): 1285-90. Pomerantzeff, O., H. Kaneko, et al. (1976). "Effect of the ocular media on the main wavelengths of argon laser emission." Invest Ophthalmol 15(1): 70-7. Pomerantzeff, O., G. Timberlake, et al. (1984). "Automation in krypton laser photocoagulation." Invest Ophthalmol Vis Sci 25(6): 711-9. Puliafito, C. A., T. F. Deutsch, et al. (1987). "Semiconductor laser endophotocoagulation of the retina." Arch Ophthalmol 105(3): 424-7. Pulido, J. E., J. S. Pulido, et al. (2007). "A role for excitatory amino acids in diabetic eye disease." Exp Diabetes Res: 36150. Rauen, T. and B. I. Kanner (1994). "Localization of the glutamate transporter GLT-1 in rat and macaque monkey retinae." Neurosci Lett 169(1-2): 137-40. Rogers, A. H., J. S. Duker, et al. (2003). "Photodynamic therapy of idiopathic and inflammatory choroidal neovascularization in young adults." Ophthalmology 110(7): 1315-20. Roider, J., N. A. Michaud, et al. (1992). "Response of the retinal pigment epithelium to selective photocoagulation." Arch Ophthalmol 110(12): 1786-92. Schlotzer-Schrehardt, U., A. Viestenz, et al. (2002). "Dose-related structural effects of photodynamic therapy on choroidal and retinal structures of human eyes." Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol 240(9): 748-57. Schmidt-Erfurth, U., H. Laqua, et al. (2002). "Histopathological changes following photodynamic therapy in human eyes." Arch Ophthalmol 120(6): 835-44.
80
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Schmidt-Erfurth, U., S. Michels, et al. (2002). "Photodynamic effects on choroidal neovascularization and physiological choroid." Invest Ophthalmol Vis Sci 43(3): 830-41. Schmidt-Erfurth, U. M., C. Kusserow, et al. (2002). "Benefits and complications of photodynamic therapy of papillary capillary hemangiomas." Ophthalmology 109(7): 1256-66. Schmidt-Erfurth, U. M., S. Michels, et al. (2002). "Photodynamic therapy for symptomatic choroidal hemangioma: visual and anatomic results." Ophthalmology 109(12): 2284-94. Seifert, U., Vilser, W. (2002). "Retinal Vessel Analyzer (RVA) -Design and Function." Biomed Tech(47, Suppl. 1). Semkova, I., F. Kreppel, et al. (2002). "Autologous transplantation of genetically modified iris pigment epithelial cells: a promising concept for the treatment of age-related macular degeneration and other disorders of the eye." Proc Natl Acad Sci U S A 99(20): 13090-5. Singh A, S. J., Shield C (2001). "Solitary retinal capillary hemangioma: hereditary (von Hippel-Lindau disease or nonhereditary? ." Arch Opthlalmol 119: 232-34. Singh, A. D., M. Nouri, et al. (2002). "Treatment of retinal capillary hemangioma." Ophthalmology 109(10): 1799-806. Sivakami, S., V. Ganapathy, et al. (1992). "The gamma-aminobutyric acid transporter and its interaction with taurine in the apical membrane of the bovine retinal pigment epithelium." Biochem J 283 ( Pt 2): 391-7.
81
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Soubrane, G. (1995). "Affection aquises de l'épithelium pigmentaire rétinien." Bulletin des Societés d'Ophthalmologie de France, Rapport Annuel. Steinert, R. F. and C. A. Puliafito (1987). "YAG lasers in cataract surgery." Int Ophthalmol Clin 27(3): 181-94. Stratas, B. A., J. D. Weipert, et al. (1986). "Observations on the microvascular repair process after confluent argon laser photocoagulation." Arch Ophthalmol 104(1): 126-9. Suh SC, J. S., Bae SH, Kim CG, Kim JW. (2007). "Retinal capillary hemangioma treated with verteporfin photodynamic therapy and intravitreal triamcinolone acetonide." Korean J Ophthalmol. 3 178-84. Szatkowski, M. and D. Attwell (1994). "Triggering and execution of neuronal death in brain ischaemia: two phases of glutamate release by different mechanisms." Trends Neurosci 17(9): 359-65. Tasman W, J. E. (2001). "Duane's Ophthalmology, CD Rom." The Canadian Ophthalmology Study Group (1993). "Argon green vs krypton red laser photocoagulation of extrafoveal choroidal neovascular lesions. One-year results in age-related macular degeneration." Arch Ophthalmol 111(2): 181-5. Torron Fernandez-Blanco, C., S. Perez Olivan, et al. (2003). "[Photodynamic therapy for choroidal neovascularization not caused by age related macular degeneration or pathologic myopia]." Arch Soc Esp Oftalmol 78(9): 471-6. Tsang, D., D. T. Yew, et al. (1986). "Further studies on the effect of low-dose laser irradiation on cultured retinal pigment cells of the chick." Acta Anat (Basel) 125(1): 10-3.
82
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Ullensvang, K., K. P. Lehre, et al. (1997). "Differential developmental expression of the two rat brain glutamate transporter proteins GLAST and GLT." Eur J Neurosci 9(8): 1646-55. v Hippel, E. (1904). "Über eine sehr seltene Erkrankunk der Netzhaut: klinische Beobachtungen. ." Albrecht v Graefes Arch Ophthalmol(59): 84-106. Vail, D. (1957). "Angiomatisus retinae, eleven years after diathermy coagulation." Trans Am Ophthalmol Soc(55): 217-238. Vogel, A., Birngruber, R. (1992). "Temperature profiles in human retina and choroid during laser coagulation with different wavelengths raging from 514 to 810 nm." Lasers Light Ophthalmol. 5: 9-19. von Buelow, M., S. Pape, et al. (2007). "Systemic bevacizumab treatment of a juxtapapillary retinal haemangioma." Acta Ophthalmol Scand 85(1): 114-6. Whittaker, J. R. (1963). "Changes in Melanogenesis durng the Dedifferentation of Chick Retinal Pigment Cells in Cell Culture." Developmental Biology 8: 99-127. Wieder, M., O. Pomerantzeff, et al. (1981). "Retinal vessel photocoagulation: a quantitative comparison of argon and krypton laser." Invest Ophthalmol Vis Sci 20(3): 418-24. Yazulla, S. (1986). "Neurochemistry. Is GABA the neurotransmitter for some photoreceptors?" Nature 320(6064): 685-6. Yazulla, S. (1986.). "GABAergic mechanisms in the retina." Prog Retinal Res 5: 1-52. Yazulla, S., K. Studholme, et al. (1986). "Comparative distribution of 3H-GABA uptake and GAD immunoreactivity in goldfish retinal amacrine cells: a double-label analysis." J Comp Neurol 244(2): 149-62.
83
Doktori értekezés
Dr. Szabó Antal
Yu, D. Y., S. J. Cringle, et al. (2005). "Laser-induced changes in intraretinal oxygen distribution in pigmented rabbits." Invest Ophthalmol Vis Sci 46(3): 988-99. Zografos, L. (2002). "Tumeurs intraoculaires." Rapport de la Société Française d'ophtalmologie
84
