A Laki Kálmán Doktori Iskola Doktorandusz hallgatóinak 2009 évi konferenciája 2009. december 12.
ELŐADÁS KIVONATOK
Debreceni Egyetem, Orvos- és Egészségtudományi Centrum
A VASZKULÁRIS SIMAIZOMBAN EXPRESSZÁLÓDÓ VANILLOID RECEPTOR (TRPV1) FARMAKOLÓGIAI JELLEMZÉSE Czikora Ágnes Témavezető: Tóth Attila Intézet: DE OEC, Kardiológiai Intézet, Klinikai Fiziológiai Tanszék A vanilloid receptor (TRPV1) szerepet játszik a fájdalmas ingerületek érzékelésében, ennek megfelelően a vanilloid receptor antagonisták ígéretes farmakológiai célpontokká váltak új támadáspontú fájdalomcsillapító szerek fejlesztése során. A szenzoros neuronok mellett azonban az utóbbi időben a vanilloid receptort kimutatták arteriális simaizomsejtekben is, ahol aktivációjuk vazokonstrikcióval járt. Ezen megfigyelés nemcsak a reménybeli TRPV1 gátló terápia lehetséges vaszkuláris mellékhatásaira utal, hanem arra is, hogy a TRPV1 moduláció felhasználható a szöveti vérellátás szabályozására. Módszer: Kísérleteinkben izolált, kanülált vázizom (m. gracilis) arteriolákat (intraluminális átmérő: 207±7 µm, n=59) használtunk, mely erek spontán miogén tónussal rendelkeztek. Az ereket TRPV1 agonistákkal, parciális agonistákkal és antagonistákkal kezeltük, majd a TRPV1 ligandok farmakológiai tulajdonságait (potencia, hatékonyság, hatáskinetika és receptor deszenzitizáció) az érátmérő változás (és néhány esetben az ezzel párhuzamosan mért intracelluláris Ca2+ koncentráció változás) alapján határoztuk meg. Eredmények: A vizsgált agonisták egy része (kapszaicin, MSK-195, JYL-79) jelentős kontrakciót váltott ki, míg más agonisták (resiniferatoxin, JYL-273) nem befolyásolták az érátmérőt. Az agonistákkal történő 20 perces kezelés során tanulmányoztuk az akut deszenzitizációt, míg kapszaicin alkalmazásával a tachyphylaxist. A deszenzitizációs kinetika jelentős eltérései mellett a kapszaicin kivételével valamennyi agonista teljes deszenzitizációt okozott. A parciális agonista JYL-1511 esetében mintegy 10% aktiváció mellett figyeltünk meg jelentős deszenzitizációt. Végül, a TRPV1 antagonista AMG9810 hatását vizsgálva kompetitív jellegű gátlást találtunk. Összefoglalás: A TRPV1 farmakológiai tulajdonságai eltérőek a szenzoros neuronok és a vaszkuláris simaizomban expresszálódó receptorok esetében. Adataink arra utalnak, hogy a TRPV1 moduláció felhasználható a szöveti vérellátás szabályozásában.
AZ ANGIOTENZIN KONVERTÁZ ENZIM (ACE) EXPRESSZIÓJÁNAK KÜLÖNBÖZŐ SZABÁLYOZÁSA A SZÉRUMBAN ÉS AZ EREKBEN Daragó Andrea Témavezető: Tóth Attila Intézet: DE OEC, Kardiológiai Intézet, Klinikai Fiziológiai Tanszék Bevezetés: a vizsgálat célja az volt, hogy jellemezzük a vaszkuláris angiotenzin konvertáz enzim (ACE) és az ACE-gátlók jelentőségét CABG műtéten átesett betegekben. Anyagok és módszerek: By-pass műtéten átesett betegektől gyűjtöttünk vérmintákat és érpreparátum mintákat (vena saphena distalis részéről (n=33) és/vagy radiális artériából (n=34)). Vizsgáltuk az angiotenzin I (Ang I) és az angiotenzin II (Ang II) vaszkuláris kontrakcióra kifejtett hatását ACE-gátló mellett és ACE-gátló nélkül. Meghatároztuk a plazma és az érminta ACE koncentrációját. Eredmények: Az Ang I és Ang II kezelés mindkét érminta típuson szignifikáns konstrikciós választ váltott ki. A kiváltott erő aránya (EC50) az Ang II és Ang I-nél is szignifikánsan alacsonyabb volt a radiális artériákon, mint a saphena vénákon (0,17±0,03 mN vs. 0,51±0,14 mN, P=0,003). Az eredmények háromszor hatékonyabb Ang I átalakulást sugalltak véna saphena mintákon. Az inzomkontrakció szignifikáns csökkenését észleltük telmisartán és captopril hatására mind a saphena vénákban, mind a radiális artériákban. A vaszkuláris ACEexpresszió szignifikánsan magasabb volt saphena vénákban, mint a radiális artériákban (9,7±10 ng/mg vs. 5,3±0,7 ng/mg, P=0,01). Ezzel szemben a szérum ACE koncentráció hasonló volt a különböző betegek vérmintáiban (saphena véna mintájú betegekben 13±10 ng/ml az artéria radiális mintájú betegekben 162±20 ng/ml.) Összefoglalás: CABG műtét után az ACE gátló adása mind rövidtávon, mind hosszútávon fontos lehet a saphena véna graftok szűkületeinek és elzáródásának megelőzésében.
AZ ANGIOTENZIN-KONVERTÁLÓ ENZIM GÉN I/D POLYMORPHISMUSÁNAK SZEREPE A CHRONICUS ALLOGRAFT NEPHROPATHIA KIALAKULÁSÁBAN Fedor Roland Témavezető: Tóth Attila Intézet: DE OEC Kardiológiai Intézet, Klinikai Fiziológiai Tanszék A chronicus allograft nephropatia (CAN) esetében az angiotenzin-konvertáló enzim (ACE) gátló kezelés klinikai hatékonysága a renin-angiotenzin rendszer érintettségére utal. Munkánk során a háttérben álló mechanizmusok megértése érdekében vizsgáltuk az ACE I/D polymorphismus, szérum ACE mennyiség és aktivitás értékeit CAN (n=38) és normál vesefunkciójú (NRF, n=34) betegek esetében. A DD genotípus szignifikánsan gyakoribb volt a CAN csoportban. A DD homozigótákban magasabb ACE szintet mértünk (II: 137,78 µg/l; ID: 157,68 µg/l; DD: 179,21 µg/l), ami a magasabb enzimaktivitáson keresztül emelkedett angiotenzin-II értékeket eredményezhet, így hajlamosíthat CAN kialakulására. Az ACE gén I/D polymorphismusa szerepet játszhat a CAN pathogenesisében, ezért hasznos lenne vizsgálata minden transzplantációra váró betegnél, a CAN rizikójának felmérésére. DD genotípus esetén – kontraindikációk hiányában – előnyös lehet az ACE gátló terápia mihamarabbi elindítása.
A CA2+ ÉRZÉKENYÍTÉS KONSTRIKCIÓJÁBAN
SZEREPE
PATKÁNY
ARTERIA
BASILARIS
Rutkai Ibolya Témavezető: Tóth Attila Intézet: DE OEC Kardiológiai Intézet, Klinikai Fiziológiai Tanszék Napjainkban Magyarországon a magas vérnyomás az egyik leggyakoribb népbetegség, a felnőtt lakosság közel 40%-a hipertóniás. Pathomechanizmusáról sokat felfedtek az utóbbi évtizedek, azonban a mai napig nem teljesen tisztázott, sok az idiopathiásnak mondott eset. Általánosságban elmondható, hogy a megnövekedett értónus mellett, a vascularis simaizmok fokozott Ca2+ érzékenysége figyelhető meg, amely legalább két módon (emelkedett spontán miogén tónus illetve agonistákra adott nagyobb válasz) magyarázhatja a hipertóniát. Kísérleteink célja a Ca2+ érzékenyítés vizsgálata volt izolált, ép membránrendszerrel rendelkező ereken. A patkányokból kipreparált arteria basilarist 3-5 mm hosszú gyűrűkre vágtuk, melyeken ezután az izometriás kontrakció rögzítésével párhuzamosan, Fura-2-AM felhasználásával raciometriás intracelluláris kalcium koncentráció mérést végeztünk. Eredményeink azt mutatják, hogy a KCl pusztán az intracelluláris Ca2+ szint emelése révén hat [maximális Ca2+ emelkedés: 0,14±0,03 (340/380 arány) ; konstrikció: 3.0±0,3 mN; Ca2+ érzékenység: 17-22 mN/egységnyi Ca2+ koncentráció emelkedés]. Ehhez képest a szerotonin által kiváltott konstrikció hasonló Ca2+ változás mellett [0,16±0,03 (340/380 arány)] jelentősen nagyobb (7,4±0,5 mN) és a Ca2+ érzékenység a kiindulási 20-ról 47-re nőtt (EC50=32 nM). A tromboxánA2 receptor agonista U-46619 esetében a maximális kontrakció a KCl-hoz hasonló (3.9±0,6 mN), ám ez jelentősen kisebb intracelluláris Ca2+ emelkedés (0,04±0,02 340/380 arány) mellett jön létre és ennek megfelelően a Ca2+ érzékenység fokozódás (a kiindulási 27-ről 107-re nő, EC50=7,9 nM) még kifejezettebb. Kísérleteinkben beállítottunk egy, a vaszkuláris simaizom preparátum in vivo Ca2+ érzékenységének mérésére alkalmas módszert. Kontroll kísérleteinkben jellemeztük a patkány arteria basilaris konstrikcióját kiváltó molekuláris mechanizmusokat. További kísérleteinkben a subarachnoidális vérzést követő vazokonstrikció modellben fogjuk vizsgálni a Ca2+ érzékenyítés érintettségét.
A TITIN-AKTIN INTERAKCIÓ OXIDATÍV KÁROSODÁSA HOZZÁJÁRUL A SZÍVIZOMSEJTEK
EMELKEDETT
PASSZÍV
FESZÜLÉSÉHEZ
HUMÁN
SZÍVELÉGTELENSÉGBEN Czuriga Dániel Témavezető: Papp Zoltán Intézet: DE OEC Kardiológiai Intézet, Klinikai Fiziológiai Tanszék Humán szívelégtelenségben az izolált szívizomsejtekre emelkedett passzív feszülés jellemző, melynek hátterében a titin molekula megváltozott rugalmassági paraméterei állnak. Jelen tanulmány során azt vizsgáltuk, hogy a Z-vonalak mellett elhelyezkedő, 100 nm széles titinaktin interakció oxidatív károsodása milyen mértékben járul hozzá az emelkedett passzív feszüléshez. Méréseinkhez donorokból származó explantált szívizomszövetet (Kontroll), aorta stenosisos betegek sebészi biopsziáit (AS) és szívelégtelenségben szenvedő betegek transzvaszkuláris, endomyocardiális biopsziáit (HF) használtuk fel. Mechanikai erőmérések során izolált, permeabilizált szívizomsejtek aktív és passzív tulajdonságait határoztuk meg 2,2 µm-es szarkomerhosszon. In vitro Dithiotreitol (DTT) kezeléssel vizsgáltuk a myofilamentumok oxidatív károsodásának revertálhatóságát. In vitro gelsolin inkubációval eltávolítottuk a vékony filamentumot, ezzel vizsgálva a titin-aktin interakció hozzájárulását a szívizomsejtek emelkedett passzív feszüléséhez. Immunfluoreszcens jelöléssel (alpha-aktinin, nitrotirozin) vizualizáltuk a myofilamentumok oxidatív károsodásának szarkomerikus lokalizációját. A DTT kezelés mindhárom csoportban csökkentette a passzív feszülést (Kontroll n=9; AS n=7; HF n=6). Minél magasabb volt a passzív feszülés a kezelés előtt, annál nagyobb mértékben csökkent a passzív feszülés a DTT kezelés hatására (p=0.0025, r=0.61). A gelsolin kezelés ugyancsak mindhárom csoportban csökkentette a passzív feszülést (Kontroll n=10; AS n=10; HF n=12). Minél magasabb volt a passzív feszülés a kezelés előtt, annál nagyobb mértékben csökkent a passzív feszülés a gelsolin kezelés hatására (p<0.0001, r=0.63). A Kontroll és az AS szívizomsejtekben a nitrotirozilált fehérjék eloszlása a Zvonalak közé esett. A HF szívizomsejtek a nitrotirozilált fehérjékre nézve homogén festődést mutattak, beleértve a Z-vonalak területeit is. Konklúzió: a titin-aktin interakció oxidatív károsodása hozzájárul a humán szívelégtelenségből származó szívizomsejtek emelkedett passzív feszüléséhez, mely in vitro antioxidáns kezeléssel és/vagy a vékony filamentum eltávolításával csökkenthető. Valószínűsíthető, hogy a Z-vonal fehérjék és a vékony filamentum oxidatív károsodása miatt a titin-aktin interakció passzív feszülésre gyakorolt hatása a legkifejezettebben a szívelégtelenségből származó szívizomsejtekben érvényesül. Ez a megfigyelés hozzájárulhat a szívelégtelenség során fellépő kontraktilis diszfunkcióhoz.
RITKA KÓRKÉPEK - ÚJ KLINIKAI ENTITÁS Kovács Erzsébet Témavezető: Pfliegler György Intézet: DE OEC, Belgyógyászati Intézet, II. Belgyógyászati Klinika, Ritka Betegségek Tanszék A ritka kórképek okai változatosak: anyagcsere, genetikai, daganatos, immunológiai, fertőzéses, de ismeretlen is maradhat. Diagnosztikájuk és hatásos terápiájuk sok esetben több éves késést szenved. Előadásunkban, ezen, etiológiai vezérfonal mentén számolunk be néhány általunk felismert és gondozott ritka betegségről. A szénhidrát anyagcsere súlyos zavarával járó nesidioblastosis, a perzisztens hiperinzulinémiával járó, nem insulinoma eredetű hipoglikémia (PHH), gyermekkorban jól ismert, felnőttkorban azonban igen ritka. Ismeretlen eredetű hipoglikémia esetén, ha képalkotó eljárásokkal nincs körülírt képlet, a laboratóriumi adatok viszont emelkedett inzulinszekrécióra utalnak, gondolni kell nesidioblastosis lehetőségére. A sebészi beavatkozás veszélye pancreas elégtelenség éppúgy lehet, mint a betegség fennmaradása a hasnyálmirigy rezekciója miatt. Diazoxid adásával tartós tünetmentesség érhető el, ezért – ezt támasztják alá eredményeink - elsőként konzervatív kezeléssel célszerű próbálkozni. Genetikai eredetű vérzékenységek közül az Osler-kór, különösen annak gyomor-bél traktust és tüdőt érintő formája életveszélyes állapot. A Tanszéken gondozott eseteink áttekintésével a terápia új lehetőségeire, ill. szoros együttműködésben a Klinikai Kutató Központtal a genetikai diagnosztika jelentőségére hívjuk fel a figyelmet. Nőbetegünk számos tünete hátterében, számos tévesnek bizonyult diagnózis után, felnőttkorban igazoltuk molekuláris genetikailag a cystás fibrosist. A thrombophilia geno-fenotípus összefüggéseit és különbségeit vizsgáltuk veleszületett thrombophiliás betegeinkben. A ritka daganatos betegségek a legnagyobb diagnosztikai és terápiás kihívások közé tartoznak. Myelodysplasia, Behcet kór és antithrombin hiány társulása volt észlelhető férfibetegünkben. A nyálkahártya eltérések hátterében felismert kórkép társulása malignus haematológiai betegséggel valamint szerzett antithrombin hiánnyal nagyon ritkán fordul elő; immunszuppresszív kezeléssel átmeneti tünetmentességet értünk el. A malignus betegségek kevesebb mint 0,1%-át kitevő retroperitonealis liposarcomás fiatal férfibetegünk esetismertetésével a korszerű kezeléssel (sebészi rezekciót követő ifoszfamid-doxorubicin alapú kombinált kemoterápia) szerzett tapasztalatunkat elemezzük. Középkorú nőbetegünk esetében a hormonkezelés indukálta haemangiosarcomatosis disseminalt intravasalis alvadás tüneteivel jelentkezett és jelentős diagnosztikai és kezelési nehézséget jelentett. A diffúz osteosclerosissal járó myeloma multiplex igen ritkán fordul elő. Esetünk érdekessége a differenciál diagnózishoz vezető útban és kitűnő terápiás válaszban van. Autoimmun progeszteron dermatitis igazolódott nőbetegünk fájdalmas, vörös bőrelváltozásainak („stigmáinak”) hátterében. A rendszertelen menstruáció miatt nehézséget jelentett a tünetek összevetése a menstruációs ciklussal. A diagnózis intravaginális progeszteron provokációval történt, tudomásunk szerint az irodalomban elsőként. Gonadotropin analóg kezeléssel tünetmentességet értünk el az első tünetek jelentkezésétől számítva több mint tíz évvel. Eseteinkkel a ritka betegségek, mint önálló entitás fontosságát szeretnénk alátámasztani, amely elősegítheti a diagnózishoz vezető út rövidítését, az egyénre szabott terápiát és a holisztikus szemlélet érvényesülését.
D-PENICILLAMIN GÁTOLJA AZ OXIDÁLT LDL ÁLTAL INDUKÁLT ENDOTELIÁLIS VEGF KÉPZŐDÉST Bérces Mária Témavezető: Balla György Intézet: DE OEC, Gyermekgyógyászati Intézet, Neonatológiai Tanszék A neonatológia fő problémája az extrém kis súlyú koraszülöttek túlélésének javulásával az életminőségük javítása, az utóbetegségek elkerülése, ill. kezelése. A koraszülött retinopátia a legfontosabb érzékszervet, a szemet érinti, a vakság elkerülése egyik legfontosabb feladatunk. A betegség két egymástól független rizikófaktora a kóros érburjánzást segítő magasabb VEGF szint, ill. a hosszasan alacsony IGF-1 szint. A DPA-t az 198O-as években az újszülöttkori sárgaság kezelésére használták, de a gyógyszer másodlagos hatásaként azt észlelték, hogy a kezelt koraszülötteknél nem alakult ki ROP. Laboratoriumi eredmény bizonyítja a hemoxigenáz-ferritin rendszer endogén indukálható protektív hatását a stresszreakcióban. A mechanizmus sejt-, szöveti és szerv szinten is megnyilvánul. Mivel a DPA befolyásolja a hemoxigenase funkciót, kiváncsiak voltunk a sejtszintű hatásra. Metodus: in vitro endoteliális és simaizomsejt-kultúrán a HO-t hemmel ill. oxidált LDL-el indukáltuk és a DPA hatást teszteltük transzkripciós és poszttranszkripciós szinten. Eredmény: a DPA nem gátolja a HO-t, sem a HO-1 transzlációt, de a HO-1 gén indukciót igen (RT-PCR technika). A gyógyszer gátló hatása szignifikánsabb volt, ha a HO-1 indukálása oxidált LDL-el történt. A DPA megnyújtja az LDL oxidáció idejét (mikromoláris koncentráció esetén) Következtetés: a DPA kezelés ígéretes a koraszülöttek retinopátiájának kezelésében. Az igen kis súlyú koraszülöttek esetében multicentrikus tanulmányra lenne szükség.
A XIII-AS FAKTOR AKTIVÁCIÓJA AZ V-ÖS FAKTOR LEIDEN MUTÁCIÓT HORDOZÓ EGYÉNEKBEN; ÚJ BIOKÉMIAI MECHANIZMUS A FOKOZOTT TROMBÓZIS RIZIKÓ HÁTTERÉBEN Koncz Zsuzsa Témavezető: Muszbek László Intézet: DE OEC, Klinikai Kutató Központ Bevezetés: Az V-ös faktor (FV) Leiden mutációja (FVLeiden) gyakori mutáció a kaukázusi populációban, mely heterozigóták esetén 5-8-szorosra, homozigóták esetén mintegy 80szorosra növeli a tromboembóliák rizikóját. A mutáció hatására az aktivált protein C egyik hasítási helye megszűnik, így csökken a prokoaguláns aktivitás down-regulációja illetve a FV antikoaguláns hatása is gátolt. A FVLeiden hatása az alvadékképződésre, a XIII-as faktor (FXIII) aktivációjára és az alvadék keresztkötéseinek kialakulására azonban kevéssé ismert. Anyagok és módszerek: 15 egészséges, FXIII-A Val34Leu polimorfizmusra nézve vad típusú, ismert FVLeiden genotípusú egyén (5 vad típus, 5 heterozigóta, 5 homozigóta mutáns) plazma mintáját vizsgáltuk. A plazma mintákat rekombináns humán szöveti faktor és foszfolipid hozzáadásával különböző időkig aktiváltuk, rekombináns humán trombomodulin (rhTM) jelenlétében és hiányában egyaránt. A képződött alvadékokat SDS-PAGE és Western blotting technikával vizsgáltuk. Eredmények: A rhTM jelenléte jelentősen lassította az alvadékképződést, a FXIII aktivációját és a fibrin keresztkötések kialakulását a FVLeiden vad típusú egyéneknél. Ez a hatás a FVLeiden mutációt hordozók esetén elhanyagolható mértékű volt. A FVLeiden mutációt hordozók plazmájában rhTM jelenlétében a fibrin keresztkötések lényegesen hamarabb alakultak ki, mint a vad típusú egyének esetén. Következtetés: A korai FXIII aktiváció és fibrin keresztkötések kialakulása a FVLeiden mutációt hordozók esetén védelmet jelent a fibrinolízissel szemben, amely hozzájárulhat a mutáció következtében kialakuló fokozott trombózis kockázathoz.
AGYI PERFÚZIÓ ÉS SZÖVETI OXIGENIZÁCIÓ VIZSGÁLATA DUCTUS ARTERIOSUS LIGATURA SORÁN EXTRÉM KISSÚLYÚ KORASZÜLÖTTEKBEN Kovács Tamás Témavezető: Balla György Intézet: DE OEC, Gyermekgyógyászati Intézet, Neonatológiai Tanszék
A nyitott ductus arteriosus kóroki szerepe az extrém kissúlyú újszülöttek agykárosodásában egyértelműnek látszik, egyik terápiás lehetőség a sebészi ligatura. A műtét kapcsán a ductuson áramló vérmennyiség hirtelen változásain kívül több tényező is kockázatot jelenthet az agyi perfúzió, oxigenizáció szempontjából, mint például pCO2, pO2, hőmérséklet változások, hypotensio. A „Near infrared” spektroszkópia (NIRS) lehetőséget nyújt az agyi oxigenizáció és perfúzió változásainak non-invazív követésére. A mért értékeket alapvetően az artériás oxigén kínálat és az agyi szöveti oxigén-konszumpció kritikus egyensúlya határozza meg. Célkitűzésünk a DE OEC, Neonatológiai Tanszékén kezelt extrém kissúlyú újszülöttek ductus ligaturája során észlelhető agyi haemodynamikai változások vizsgálata volt. Kilenc gyermeket vontunk be a vizsgálatba. Az átlagos gestatios idő 24,5 (±1,01) hét volt, a születési súly 596,6 (±161,8) g, az életkor a műtét időpontjában pedig 27,2 (±1,01) nap volt. Az összhemoglobin (cHb), redukált hemoglobin (HHb), oxihemoglobin (O2Hb), szöveti oxigenizációs index (THI), és szöveti hemoglobin index (nTHI) változások mellett mértük a vérnyomás, pulzusszám és transzkután O2 szaturáció változásokat, illetve -4 esetben- a transcutan pO2, pCO2 értékeket. A beavatkozás során az agyi összhemoglobin érték szignifikánsan emelkedik, de a műtét végére visszatér a kiindulási érték közelébe. A háttérben részben a pCO2 emelkedéssel együttjáró vazodilatáció áll, de emellett az akadályozott vénás visszafolyás is szerepet játszik. A ligatura felhelyezésének időpontjában a szisztémás vérnyomás (diastoles és MAP) szignifikánsan emelkedik, ezt azonban rövid távon nem kíséri CBF és szöveti oxigenizáció változás. Ez a tény arra utal, hogy extrém éretlen koraszülöttek esetében 4 hetes kor körül hatékony agyi vascularis autoregulációval lehet számolni. Eredményeink jelentős agyi perfúzió változásokat jeleznek a műtét során, amelyek azonban nem a ligatura felhelyezéhez kapcsolódnak, hanem a műtét során végzett nem specifikus tevékenységek (például mellkas nyitás, tüdő kompresszió, iv. gyógyszerelés) állnak a háttérben. A leírt eltérések magyarázatul szolgálhatnak azon megfigyelésekre, amelyek szerint a ligaturán átesett betegek esetében fejlődésneurológiai deficittel kell számolni hosszabb távon.
A KORASZÜLÖTTEK SZOCIALIZÁLÓDÁSA ÉS A SZÜLŐI MEGELÉGEDETTSÉG MÉRÉSE KÉRDŐÍVES FELMÉRÉS ALAPJÁN Polonkai Edit Témavezető: Balla Gy Intézet: DE OEC Gyermekgyógyászati Intézet, Neonatológiai Tanszék Az elmúlt egy-két évtizedben a koraszülött ellátásban bekövetkezett jelentős minőségi változás következtében egyre több extrém kissúlyú koraszülött maradt életben és került haza egészségesen vagy utóbetegséggel. Ezen utóbbiak nem kis terhet jelentenek a családnak, a társadalomnak és nem utolsó sorban az egyénnek. Ennek nehézségeit szülők kérdőíves felmérésével vizsgáltuk meg. A kérdőívet a DE OEC Szülészeti Klinikán született és III-as szintű Neonatológiai Tanszéken 2001 és 2005 között kezelt, 36. terhességi hétnél fiatalabb koraszülöttek szüleinek küldtük ki. 980 családot kerestünk meg levelünkkel. 460 szülőtől érkezett vissza válaszlevél. 101 család ismeretlen helyre költözött. A kérdőív öt kérdéscsoportra osztható: szülés körülményei, tartós betegségek, szomatomotoros és mentalis fejlődés, családi háttér, elégedettségi szint mérés. A szülők válaszai alapján a kezelt gyermekek 30%-a tartozott a különböző súlyosságú utóbetegségben szenvedő csoportba, közel 70%-a az egészségesek csoportját alkotta, mely egyben a kontroll csoportot jelentette. A beteg csoporthoz tartozó szülők 34%-a vélte úgy, hogy többlet kiadással jár beteg gyermekük nevelése. Míg érzelmi többlet terhet 68%-ban jelent a sérült gyermek. Érdekes, hogy az egészségesként hazament koraszülöttek szülei között is 7%-ban jelentett érzelmi terhet gyermekük további sorsa. A beteg koraszülöttek szülei 93%-ban, az egészséges koraszülöttek szülei 97%-ban számíthatnak a család támogatására. A beteg gyermekek szülei 73%-ban gondolták úgy, hogy gyermekük önálló életre képes lesz, 18%-a segítségre szorul, míg 9% állandó gondozást igényel majd. A visual analogic scale-n mért elégedettségi érték az egészséges gyermekek szüleinél mutatott magasabb értéket. Ezzel a felméréssel szerettünk volna rávilágítani arra a nehéz etikai kérdésre, hogy az extrém koraszülöttek életben tartásában és kezelésében a mai napig nincs egységes állásfoglalás a szakmában. A neonatológus előre nem tudhatja pontosan a végső kimenetelt az egyes eset kapcsán, ezért fontos az, hogy mindenkinek válogatás nélkül megadja az esélyt az életben maradáshoz.
AZ α2-PLAZMIN INHIBÍTOR IZOFORMÁINAK ALKALMAS MÓDSZEREK KIDOLGOZÁSA
MEGHATÁROZÁSÁRA
Orosz Adrienn Témavezető: Katona Éva Intézet: DE OEC, Klinikai Kuatató Központ Bevezetés: Az α2-plazmin inhibítor (α2-PI) egy 66 kDa molekulatömegű szerin proteáz inhibitor, a plazmin legfontosabb inhibítora. Plazma koncentrációja ≈60 µg/ml. A májban szintetizálódó teljes hosszúságú, metioninnal kezdődő forma (Met-α2-PI) 464 aminosavból áll, melyről a plazmában az első 12 aminosav enzimatikusan lehasad, létrejön egy aszparaginnal kezdődő N-terminális forma (Asn-α2-PI). A Met-α2-PI mennyisége ∼30%. Az aktivált FXIII által fibrinnel keresztkötött α2-PI a fibrinolízist hatékonyabban gátolja. Irodalmi adatok szerint az Asn-α2-PI jobb szubsztrátja az aktivált FXIII-nak, 3-13-szor gyorsabban keresztkötődik a fibrinogén α-láncába. Ebből következően a Met-α2-PI jóval kisebb védelmet nyújt a fibrinolízissel szemben. Célkitűzés: Az α2-PI izoformáinak meghatározására alkalmas módszerek kifejlesztése az izoformák elkülönítésére képes monoklonális és poliklonális antitestek segítségével. Módszer:
Az
izoformák
N-terminális
dodekapeptidjeinek
megfelelő
peptideket
megszintetizáltuk, majd BSA és KLH hordozó fehérjéhez konjugáltuk őket. Mind a peptidkonjugátumokkal, mind tisztított α2-PI preparátummal Balb/c egereket immunizáltunk és monoklonális antitesteket állítottunk elő. Eredmények: Eddigi munkánk során sikerült előállítani 2 db anti-Asn-α2-PI, 8 db anti- Metα2-PI és 2 db mindkét izoformát felismerő (anti-α2-PI) monoklonális antitestet. Az antitesteket tisztítottuk, biotinnal ill. HRPO enzimmel jelöltük. Az antitestek karakterizálása folyamatban van ELISA, SDS-PAGE, immunoblotting, immunprecipitációt követő MALDITOF MS technikák alkalmazásával. A monoklonális antitesteket elfogó antitestként, poliklonális antitestet jelző antitestként alkalmazva teszteltük, hogy szendvics típusú immunoassay kifejlesztésére alkalmasak-e az előállított antitestek. A mindkét izoformát kimutató módszer evaluálása folyamatban van. Összefoglalás: Reményeink szerint az előállított antitestek segítségével lehetővé válik az Nterminális α2-PI izoformák arányának meghatározása, jelentőségük felderítése a fibrinolízis regulációjában és a thrombosisra való veszélyeztettség mértékének meghatározásában.
ASPIRIN REZISZTENCIA KIMUTATÁSÁRA HASZNÁLT ÖSSZEHASONLÍTÁSA EGÉSZSÉGES ÖNKÉNTESEKEN
MÓDSZEREK
Kovács Emese Témavezető: Muszbek László Intézet: DE OEC, Klinikai Kutató Központ Bevezetés: A szekunder prevencióban alkalmazott Aspirin terápiára az irodalmi adatok szerint a betegek 5-30%-a nem válaszol. Ez a tág intervallum azzal magyarázható, hogy az Aspirin hatás követésére használt laboratóriumi módszerek közt gyenge korreláció áll fenn, a rezisztencia megállapítására alkalmazott határértékekben nincs konszenzus, illetve nincs elfogadott referencia módszer. Célunk a követésre használható laboratóriumi módszerek összehasonlításával és azok egy általunk kidolgozott referencia módszerrel történő összevetésével a leghatékonyabban alkalmazható módszer(ek) azonosítása volt. Anyag és módszer: Referenciamódszerünk a thrombocyták arachidonsavval (AA) történő indukcióját követő tromboxán A2 stabil végtermékét, a tromboxán B2-t (TXB2) meghatározó immunassay-n alapul. A referencia módszer mellett a PFA-100 záródási idő meghatározását kollagén/ADP (CADP) és kollagén/adrenalin jelenlétében (CEPI), a Verify Now Aspirin Assay-t, AA (500 ug/mL), kollagén (1 ug/mL), ADP (10 umol/L) és adrenalin (10 ug/mL) agonistákra adott thrombocyta aggregáció és ATP szekréció lumiaggregométerrel történő vizsgálatát végeztük el 100 mg/nap Aspirint szedő 90 egészséges önkéntesen az első dózis előtt, ill. utána 1 és 7 nappal. Eredmények: A résztvevők átlagéletkora 34 év volt, 53 nő és 37 férfi vett részt a tanulmányban. Megállapítottuk, hogy a referencia módszer valóban érzékeny és megbízható jelzője a ciklooxigenáz enzim (COX) Aspirin által történő gátlásának és az irodalmi adatokkal egyezően, az Aspirin filmtabletta még nem minden esetben okoz teljes COX blokkot 24 óra elteltével. A referencia módszerrel rezisztens személyt eddigi vizsgálatainkban nem találtunk, a TXB2 koncentrációk mediánja 425 pg/mL (interkvartilis tartomány: 332-513 pg/mL) volt a 7. napon, a terápia előtti értékhez (medián 30511 pg/mL, interkvartilis tartomány: 2307737666 pg/mL) képest igen jelentősen csökkent. Adrenalin hatására a résztvevők egy részénél már a gyógyszer bevétele előtt levett mintában is jelentősen csökkent aggregáció/szekréció figyelhető meg, így ez a paraméter a rezisztencia kimutatására alkalmatlan. A PFA-100 CADP egyáltalán nem jelezte az Aspirin hatást, a CEPI a korábbi közlésekkel ellentétben nem volt elég érzékeny jelzője az Aspirin hatásnak. Következtetések: Az Aspirin rezisztencia sokkal ritkább, mint az az irodalmi adatok alapján feltételezhető. A referencia módszerrel az AA aktivációra bekövetkezô aggregáció és szekréció, valamint a Verify Now Aspirin assay mutatta a legjobb egyezést, ezért a laboratóriumi Aspirin rezisztencia megállapítására ezen módszerek alkalmazását ajánljuk. Az általánosan használt kollagén/adrenalin/ADP aggregációk fals magas rezisztencia értékeket adnak, ezért nem alkalmasak az Aspirin rezisztencia megállapítására.
A FXIII SZINTEK ÉS A FXIII-A VAL34LEU POLIMORFIZMUS HATÁSA A FIATAL KORI MYOCARDIÁLIS INFARCTUS KIALAKULÁSÁRA Mezei Zoltán András Témavezető: Muszbek László Intézet: DE OEC, Klinikai Kutató Központ Bevezetés: A cardiovascularis betegségek (CVD) mind férfiakban, mind a nőkben első helyen állnak a haláloki statisztikában. Korábbi tanulmányok kimutatták, hogy a hemosztázis bizonyos tényezői CVD rizikó faktorok lehetnek. Ezek közül az emelkedett XIII-as alvadási faktor szint (FXIII) a myocardiális infarctus (MI) független kockázati tényezőjének bizonyult nőkben. A FXIII A alegységének Val34Leu polimorfizmusa (FXIII-A V34L) vonatkozásában a Leu allél hordozása védő hatással rendelkezik a MI-al szemben magas fibrinogén szintek esetén mindkét nemben. Az eddig közölt megfigyelések főleg az idősebb populációban történtek. Célunk ezért a FXIII szintjének és a FXIII-A V34L polimorfizmusának a fiatal korban MI-t elszenvedett betegekben történő vizsgálata. Anyag és Módszer: A tanulmányba coronarographiás vizsgálaton átesett, 40 éves kor alatti személyeket vonunk be. Eddig 87 MI-t elszenvedett beteg (MI+), (átlagéletkoruk 35 év) és 54 azonos életkorú, de az anamnézisben MI-al nem rendelkező kontrollt (MI-) válogattunk be. A férfi/nő arány 82%/18% volt a beteg és 52%/48% a kontroll csoportban. Perifériás vérmintából fibrinogén, FXIII aktivitás, FXIII antigén koncentráció meghatározás és a FXIIIA V34L polimorfizmus kimutatása történt. A statisztikai feldolgozás SPSS 16.0 szoftverrel történt. Eredmények: A FXIII aktivitása és antigén koncentrációja szignifikánsan magasabb volt a MI+ csoportban (FXIII aktivitás MI+ vs MI-: 120±26% vs 96±24%, p<0,001; FXIII antigén MI+ vs MI-: 24,6±6,0 mg/L vs 19,8±4,2 mg/L, p<0,001). Az emelkedett FXIII szintek (FXIII aktivitás esetén ≥120%, FXIII antigén esetén ≥23,9 mg/L) a MI kockázatának szignifikáns, ötszörös fokozódását jelentették. Az emelkedett FXIII szintek kockázatfokozó hatása mindkét nemben érvényesült. A FXIII-A Val34Leu polimorfizmusát vizsgálva a Leu allél frekvenciája 0,25 és 0,33 volt a beteg, illetve a kontroll csoportban. A különbség nem bizonyult szignifikánsnak. Az emelkedett fibrinogén szint esetén az eredmények hasonlóan alakultak. Következtetés: Az emelkedett FXIII szintek a MI kockázatát fiatal korban jelentősen fokozzák. A férfiak és nők számára jelentett rizikó ebben az életkorban nem különbözik. A FXIII-A Leu34 allél védő hatását ebben a betegcsoportban kimutatni nem lehetett még emelkedett fibrinogén szintek esetén sem. Az eredmények megfelelő értékeléséhez azonban a vizsgált csoport létszáma még nem elegendő, további személyek bevonása szükséges.
KIS MOLEKULASÚLYÚ HEPARIN HATÁSÁNAK MÉRÉSE THROMBIN GENERÁCIÓS TESZTTEL Batta Zoltán Témavezető: Hársfalvi Jolán Intézet: DE OEC Klinikai Kutató Központ Háttér: A heparin therápia célja a hypercoagulabilitás csökkentése a thrombin képződésének és aktivitásának antithrombinIII–heparin gátlásán keresztül. A thrombinképződés gátlásának mértéke függ az aktuális heparin szinttől, és az egyéni haemostasis állapottól. Azonos kis molekulasúlyú heparin (LMWH) koncentráció mellett nagy interindividuális különbség tapasztalható az anticoaguláció mértékében, ezért a koncentráció helyett a heparin hatását mérő módszer alkalmazása tűnik adekváltabbnak. Célkitűzés: Lehetővé tenni a minta pre- és postheparin thrombin potenciálja közötti arány meghatározását in vivo és in in vitro heparinizált citrátos vérben fluorescens peptid szubsztrátok hasításával mérő módszerrel, a minta heparin tartalmának hexadimetrin bromiddal (polybren) való neutralizálásával. Módszerek: Technothrombin® TGA (Technoclone, Bécs, Ausztria) kitet alkalmazva az egy perc alatt maximálisan képződött thrombin mennyiségét mértük (peak thrombin, nM). Thrombocyta szegény plazmában (PPP), különböző mennyiségű LMWH jelenlétében, majd polibrenel neutralizálva LMWH-t, mértük a peak thrombin értékeket. Eredmények: LMWH hatására a peak thrombin koncentrációfüggően csökkent. A PPP-hez in vitro hozzáadott heparin hatása teljes mértékben felfüggeszthető 12 µg/mL Polybrennel, az így kezelt PPP peak thrombin értékei megegyeztek a párhuzamosan mért heparin mentes PPP értékeivel. Az in vivo heparinizált minták polybrenes neutralizálása az eredeti peak thrombin 0,77 -szeresét érte el. Összefoglalás: Az anticoaguláció hatékonysága a thrombin képződésének mérésével követhető, de az egyedi a thrombin generáció jelentős interindividuális különbségei miatt, előre meghatározott referencia tartománnyal való összehasonlítása nehézségekbe ütközik. Munkánk
eredményeként
az anticoaguláció
mértéke referencia tartománnyal
való
összehasonlítás helyett, a saját thrombingenerációs kapacitással válik összevethetővé, azonban a módszer diagnosztika értékét még vizsgáljuk.
