A laboratóriumi hematológiai vizsgálatok lehetőségei, algoritmusai, szinergizmusa a pathológiai és radiológiai leképező diagnosztikával Synlab továbbképzés oktatási anyag készítette: Dr.Magyarlaki Tamás PTE ÁOK LMI 2011
Haematológiai betegségek diagnosztikája 1. Klinikai tünetek 2. Laboratóriumi vizsgálatok 3. Pathológia - csontvelő aspirátum vagy biopszia - nyirokcsomó FTAB vagy rezekció 4. Képalkotó eljárások
Acut leukaemia típusok (FAB) AML M0 differenciálatlan M1 érés jelei nélkül M2 granulocyta irányú érés jelei M3 akut promyelocytás M4 granulocyta és monocyta irányú M5 monoblastos vagy monocytás
ALL L1 kis, egyforma blastok, nagy sejtmag : citoplazma arány L2 nagyobb, heterogénebb blastok, kisebb sejtmag : citoplazma arány L3 a blastok citoplazmája vakuolizált, basophil (rendszerint B-ALL) Megjegyzés: A c-ALL, pre-ALL, null-ALL,
M6 erythroleukaemia
és L1 és L2 képét és hagyományos
M7 megakaryoblastos
(May-Grünwald-Giemsa) morfológia alapján nem különíthetők el egymástól
I. táblázat. Az acut leukaemiák FAB osztályozása {12}
Chronicus myeloproliferatív syndroma (CMPD) típusok 1/ Policythaemia rubra vera
CMPD, PV
erythroid proliferáció
2/ Essentialis thrombocythaemia
CMPD, ET
thrombocyta szaporulat
3/ Chronicus Granulocytás leukaemia
CGL
4/ Chronicus granulocytás megakariocytás myelosis
CMGL
Általában a Ph+ chronicus granulocytás leukaemia Myelofibrosissal, thrombocythaemiával járó CML
# 1-3 típusoknál : chronicus fázis (1% alatti blast)- acceleráció (1-5%) - blastos crisis (5% feletti blast) # # 4. Típusnál : általában myelofibrosis alakul ki a terminális fázisban
Myeloblastos transformáció
Table 6. Hodgkin's disease in the REAL/WHO Classifications • Classical Hodgkin's disease o Nodular sclerosis o Mixed cellularity o Lymphocyte depletion o Lymphocyte-rich • Lymphocyte predominance Hodgkin's disease
B-sejtes differenciálódás Lymphopoiesis
Lymphatic T stem cell Lymphopl asmacytoid cell B-immunoblast
NK cells Stem cell
Plasma cell AG
B1 -lymphocyte Lymphatic B-stem cell
Centroblast
Centrocyte
B2 -lymphozyte
T-és NK-sejtes differenciálódás Lymphopoiesis AG
T2-lymphocyte
T1 -lymphocyte T-immunoblast
Lymphatic T stem cell
NK cells Stem cell
Lymphatic B-stem cell
Choroid plexus epithelial expression of MDR1 Pglycoprotein and MRP contribute to the blood-cerebrospinal-fluid drug-permeability barrier
GF120918 (inhibitor of Pgp)
Proc Natl Acad Sci, USA 1999; 96:3900-5
F-18 FDG PET Fluorine-18 Fluorodeoxyglucose Positron EmissionTomographyPredicts Tumor Differentiation, P-glycoprotein Expression. Clin.Cancer Res. DOI:10.1158/1078-0432.CCR-06-1357
MDR(+) tumor(A)
MDR(-) tumor(B)
JNM 2001; 42:646-54
• GLUT-1 levels are diminished progressively with elevated Pgp levels. Cancer Lett. 1997;115:221-7
Laboratóriumi vizsgálatok a haematologiai diagnosztikában - Vérkép (1 db EDTA cső) - Vérkenet - Vörösvérsejt süllyedés, CRP, PCT - Serum protein elfo, Ig-ok, Immunfixáció - B12, Fólsav, Haptoglobin - Tumor markerek: LDH, béta-2- MG - Véralvadási vizsgálatok - Áramlási cytometria (FCM) - Genetika: kromoszóma (metafázis) FISH (interfázis) molekuláris biológia (PCR)
Vérkép automaták
Coulter-elv
TARTALOM Bevezetés………………………………….……...1-14 1. Thrombocyta, erythrocyta, retikulocyta mérés ...15-24 2. Anaemiák és vörösvértest anomáliák…….……..25-49 3. Fehérvérsejt populációk mérése…….…………..50-65 4. Leukaemiák cytometriai mérése…...……………66-78 5. Esetbemutatás……………………………………79-90
RBC és PLT paraméterek mérése Impedance PLT/RBC counting with hydrodynamic focussing.
MICRO
DC
-
MACRO
Thrombocyta anomáliák URI
thrombocythaemia
thrombocytopenia
LRI
Pseudothrombocytopaenia EDTA indukált tct aggregáció
Citráttal tct aggregáció NINCS
tct vesztés
N-tct
PLT mérés optikai elv High angle detector (5o - 15o )
670nm Laser Diode
Low angle detector (2o -3o)
Large Platelets Microcytes
RBC Ghosts
Platelets
Fsc (2-3°)
Low angle scatter (2º to 3 º)
2-D PLT analízis: PLT eloszlási hisztogram
Debris RBC Fragments
High angle scatter (5º to 15 º)
Ssc (5-15 °)
RBC származtatott paraméterek 1.
MCV (Mean Cell Volume) = Htc / RBC A hematokrit és a vörösvérsejtszám hányadosa, az átlagos (vörösvér) sejttérfogatot adja. Mértékegysége: fl.
2.
MCHC (Mean Cell Hemoglobin Concentration) =
Hgb / Htc
Átlagos celluláris hemoglobin koncentrációt jelent, értékét a hemoglobin koncentráció és a hematokrit hányadosa adja. Mértékegysége: g/l.
2.
MCH (Mean Cell Hemoglobin) = Hgb / RBC Az egy sejtre eső hemoglobin mennyiségét jelenti, a hemoglobin koncentráció és a vörösvérsejtszám hányadosa. Mértékegysége: pg.
3.
Az RDW (Red Cell Distribution Width) érték a vörösvérsejt-csúcs magasságának 20 %nál mért eloszlás-szélessége, az esetleges poikilocytósis mérőszáma.
Vörösvértest diagram anomáliák
Bimorph RBC (transfusio)
Haemolyticus anaemia
Reticulocyta mérés (acridine orange fluorescencia = gold standard) DIFF- Channel
RET channel
(Fragments)
(RET abn. scattergram)
1 2
(PLT abn. scattergram)
High Angle (5-15 degrees)
Reticulocyte Cytogram and Relationship to Maturity
Oxazine 750 Absorbance
Reticulocyta mérés
ANAEMIÁK 1. Microcyter / hypochrom anaemiák 2. Macrocyter / hyperchrom anaemiák 3. Normocyter / normochrom •veleszületett •Szerzett Csökkent termelés (pl. aplasticus) Fokozott lebomlás (pl.haemolyticus) intrinsic extrinsic
Anaemiák típusai
Tünetek
MICROCYTER ANAEMIÁK
Cell Dyn3700
2. sz. ábra:
Vashiányos anaemia
3. sz. ábra:
Perifáriás vérkenet vashiányos anaemiában
RBC cytogram és hisztogram
Fsc
RBC Volume (fL)
Macro
0 120fL
60 120 RBC Volume (V)
200 fL
60fL 28g/dL
41g/dL
0
Micro
Hypo
28 41 50 g/dL Hgb Concentration (HC)
Hyper
Hgb Concentration (g/dL)
Ssc
0
100 pg Hgb Content (CH)
Vashiányos Anemia
• MCV = 61.1 fL; M/H ratio = 0.63 • Diagnosis: vashiányos anaemia
M/H < 0.9 : Vas hiány
ß-Thalassemia
MCV = 66 fL; M/H ratio = 2.05 Nincs vashiány (iatrogén vastúlterhelés)
M/H > 0.9: Nem igazolható vashiány
VASHIÁNYOS ANAEMIA? Sysmex
Thalassaemia (Hgb-pathia) •XE result : Order CBC
Thalassaemia α (3.7 & 4.2 & del) β-major,intermedia,minor,minima
Céltáblasejtek HUN:β minor és minima
Mentzer index MCV/RBC <11
Capillaris zona electrophoresis 34
Vashiány meghatározására alkalmazott új laboratóriumi tesztek 1. Ferritin index (sTfr/log ferritin arány) - emelkedett szint funkcionális vashiány 2. Hypo% (RBC Hb-Fe marker) RBC-Y -183.8
RET-YFSc
% Hypo >20%
-196.3 -171.0
-168.7
FWSc
FWSc
Fl
3. Ret Hb tartalom (korai RET Hb-Fe marker)
VASHIÁNYOS ANAEMIA KEZELÉSÉNEK KÖVETÉSE
RBC-Y
RET-Y FSc -196.3
-183.8
-171.0 -168.7
FWSc
FWSc
RBC-Y: the mean value of the forward scatter histogram within the mature RBC population Normal rage = 168.7 – 183.8 (Channels) RET-Y: the mean value of the forward scatter histogram within the reticulocyte population Normal range = 171.0 – 196.3 (Channels)
Fl
Hypochromic anaemia Flow diagram.
Iron deficiency anaemia
<12ng/ml
Serum ferritin High Normal/ High
Serum transf. receptor Normal
Low
Bone marrow
Ringed sideroblasts
Infection/tumour anaemia
Normal/ High
Serum iron
MDS
Normal
HgB-elektroph.
Pathological
Thalassaemia/ haemoglobinopathy
MACROCYTER ANAEMIÁK
Tünetek
Anaemiák típusai
Anaemia perniciosa pathogenesis
Haemolyticus anaemia
Magvas vörösvérsejtek vérkép automatán
Specifikus alaki eltéréssel járó anaemiák
Specifikus alaki eltéréssel járó anaemiák
Specifikus alaki eltéréssel járó anaemiák
Egyéb anaemiák vörösvértest alaki eltérésekkel hidegagglutinin
acanthocyták
könnycsepp sejtek
schistocyták
buzogány vvt
fragmentocyták
Vörösvértest inclusios testek Basophil punctatio
tct
Howell-Jolly test
vas depositum
plasodium Ring sideroblastok
DIGITÁLIS MORPHOLOGIA
Fehérvérsejtek mérése Haemocytometria laser optikai módszerrel
Hematológiai automaták – mérési elvek 1. Elektromos impedancia változás – Coulter elv (WBC, RBC, Thr) 2. Optikai mérés – sejtek fényszórása alapján (WBC, RBC, Thr) 3. Peroxidáz festés – WBC 4. Fluoreszcens festés után fényszórás alapján – WBC 5. Basophil/mag lobularitás - WBC
Vérkép direkt optikai mérési elv (488 nm Argon laser) 0o:
Egyenes szögű fényszórás (1o–3o): a sejtek nagyságának mérésére szolgál.
10o:
Kis szögű szórás (7o–11o): a sejt szerkezetének és felépítésének relatív indikátora.
90o:
Derékszögű fényszórás (70o–110o): elsődlegesen a sejtek belső granuláltságát és lebenyezettségét méri.
WBC/Baso channel
90 DEP:
90 fokos depolarizált fényszórás (70o–110o): az eosinophiloknak
2. ábra. Fényszórási paraméterek {15}
a neutrophiloktól és a többi sejttől való elkülönítését teszi lehetővé, az eosinophil sejtek
CellDyn,
azon egyedülálló tulajdonsága alapján, hogy azok granulumai az eredetileg derékszögben polarizált lézer fényét depolarizálják.
Coulter +CONDUCTIVITÁS
II. Normál vérkép a CELL-DYN 3500-as haematológiai automatával
eo
Reaktív monocytosis
ba
Basophil / Nuclear Lobularity Flow Cytometric Analysis High angle detector (5o - 15o ) 670 nm Laser Diode
Low angle detector (2o -3o)
SYSMEX ÉS ADVIA
Normál fehérvérsejtkép (Sysmex) DNA fluorescent dye (polymethine)
Basophilia (Sysmex)
Peroxidase Analysis High angle detector (5o - 15o )
TungstenHalogen Lamp
Absorbance Peroxidase
5 2 ADVIA
4
1
3
DIFFDIFFChannel channel
Balratoltság vérképben
Imm gran !
Left shift !
4
Balratoltság vérképben IMI Channel
(Left shift !) RF
Stab cells
(Imm gran !) Metamyelocyte Myelocyte
DC
Variáns lymphocyta szaporulat DIFF channel
Atypical lymph
Abnorm. lymph / L-blast
Mononucleosis
Mononucleosis korai B-sejtes fázis
Kappa
Lambda
LEUKAEMIÁK
ALL
Burkitt„kiérett, perifériás” B-sejtes
EBV !?!
t(8;14) (c-myc/IgH) + t(2;8) (kappa/c-myc) t(8;22) (c-myc/lambda)
Lymphoid folyamatok
•B- és T-CLL •PLL •FL •MCL és MZL •NK/T-sejtes ML 10. sz. ábra:
CLL
11. sz. ábra: Perifériás vérkenet CLL-ben
FWBC (fragilis fvs-ek) KWOK (kineticus optikai fvs szám) Gumprecht rögök CLL-ben cell count
time (sec) cell count
time (sec)
Naive-B-CLL „Monoclonal-B” (B-cell low grade lymphoma)
Acut myeloid leukaemia
AML-M1(micromyeloblast)
diff.dg.: CML
Négy éves septicus gyermek vérkép vizsgálatának „meglepetései” és más „csapdák”
Esetbemutatás Dr.Magyarlaki Tamás PTE ÁOK LMI MLDT Kongresszus 2010.
Vérkép numerikus eredmény
3 éves kisfiú (2009 május) Negatív anamnézis Recurráló léguti infectiok (1,5 hó) Septicus állapot (CRP=82 mg/L)
MLDT Kongresszus 2010.
Vérkép diagram
MLDT Kongresszus 2010.
Részben MPO+ heterogén blastok
Fent: Giemsa Lent : MPO
Giemsa festés Csontvelőben: 81% blast (telfonos háttér információ)
MLDT Kongresszus 2010.
Áramlási cytometria „morphologia”
MLDT Kongresszus 2010.
Áramlási cytometria fenotípus CD33 myeloid
CD33/CD7 Myeloid+T-sejt
Bifenotípus leukemia (myeloid-T-B- és őssejtes kevert vonásokkal)
CD19+ CD10B-sejt CD34 őssejt
MLDT Kongresszus 2010.
Therápia
Acut leukemiás gyermek TX után
2009 május – 2010 augusztus 1. Chemotherápia I. (ALL IC BFM 2001 Protocol1) 2. Chemotherápia II. (AML BFM 200 HAM block intenzifikált nagy dózis ARA-C) 3. Antibioticus (ceftazidime/amikacin) és antimycoticus (amfotericinB/ flucunasol) kezelések 4. Parenterális táplálás, polytransfusio 5. Szedálás (Valproate) 6. Hypotensio/tachicardia – ITO 7. Allogén csv transplantáció (febr.) 8. GVHR, CMV – MRD majd Remissio …
MLDT Kongresszus 2010.
Ami egyszer megtörténhet…
22 éves fiatalember: asthma, 2008 dec: splenomegalia, preB-ALL(Ph-), chemoth. Hoelzer: indukció, halasztott konszolidációs kezelés,infectio, PTX, pneumonia (2009.03-05) Aplasia(2009.07),Sepsis - Th megszakítás,obs. MLDT Kongresszus 2010.
Kenetfestés 2010.05. – RELAPSUS (perif=5%, cs.v.=91%)
Sepsis, légzési elégtelenség, pitvarfibrilláció, cardioverzió(4x) 2010.06.19 – Exitus letalis MLDT Kongresszus 2010.
Áramlási cytometria CD19+ CD10+ preB-sejt
cALLA+ leukemia
CD13 myeloid Normál Gran-Ly-Mo arány MLDT Kongresszus 2010.
CD34 őssejt
THM – take home message FONTOS ! - rutin laboratóriumok szintjén – szűrés, vérkép, gyanús esetben kenet -
kis vérkép, 3 part diff helyett nagy vérkép, 5 part diff
-
normál sejtszám esetén is találkozhatunk gyanús felhőképekkel (dot plot) – minden esetben kenetfestés
-
laboratórium – konzultatív szakma, fontos a klinikussal való kapcsolatfelvétel és az eset megbeszélése gyanús esetben, ,,van amit csak a laboros lát,,
- betegség súlyosságának megítélésére esteleges követésére alkalmas más rutin paraméterek mérése pl. LDH – labor feladat
Még van dolgunk!
MLDT Kongresszus 2010.
