A hepatitis C patogenezise és a HCV-fertozöttség kimutatásának új módszere Dr. Lotz Gábor Témavezeto: Prof. Schaff Zsuzsa
Semmelweis Egyetem ÁOK II. Pathologiai Intézet
2003. Semmelweis Egyetem Doktori Iskola, Patológiai Tudományok Szigorlati bizottság: Prof. Kerényi Tibor, Prof. Keller Éva, Prof. Tompa Anna Bírálók: Prof. Pár Alajos, Dr. Werling Klára
1
TARTALOMJEGYZÉK 1. BEVEZETÉS, CÉLKITUZÉSEK ............................................................
5.
2. A HEPATITIS C .....................................................................................
7.
2.1. A HEPATITIS C EPIDEMIOLÓGIÁJA ..............................................
7.
2.2. A HCV MOLEKULÁRIS VIROLÓGIÁJA ………….................……….
8.
2.2.1. A HCV GENOMIÁLIS STRUKTÚRÁJA ÉS FEHÉRJÉI ….…. 10. 2.2.1.1. 5’UTR …………………………………………………... 10. 2.2.1.2. Core protein ...………………………………………… 11. 2.2.1.3. E1, E2, p7 ..….………………………………………… 12. 2.2.1.4. NS2 ………….………………………………………… 14. 2.2.1.5. NS3 ………….………………………………………… 15. 2.2.1.6. NS4A, NS4B ………...………………………………… 17. 2.2.1.7. NS5A, NS5B ………...………………………………… 18. 2.2.1.8. 3’UTR …...……………………………………………... 22. 2.2.1.9. A virális transzláció szabályozása ...………………...
23.
2.2.1.8. F protein ………..……………………………………... 25. 2.2.2. A HCV ÉLETCIKLUSA ……………………………………...…. 27. 2.2.3. A HCV GENOTÍPUSAI ÉS SZUBTÍPUSAI ……………...…...
31.
2.3. A HEPATITIS C PATOLÓGIÁJA , KLINIKOPATOLÓGIÁJA ........…
33.
2.4. A KRÓNIKUS HEPATITIS C PATHOMECHANIZMUSA ÉS KAPCSOLATA A HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMA (HCC) KIALAKULÁSÁVAL .................................……………………...….....
38.
2.5. A HEPATITIS C HUMÁN GENETIKAI VONATKOZÁSAI …………..
51.
3. A HEPATITIS C VÍRUS KIMUTATÁSÁT SZOLGÁLÓ MÓDSZEREK ... 53. 3.1. ANTIGÉN-ANTITEST REAKCIÓN ALAPULÓ MÓDSZEREK ..........
53.
3.1.1. IN VITRO (SZEROLÓGIAI) MÓDSZEREK: EIA/ELISA ÉS RIBA TECHNIKA ………………………..….…. 53. 3.1.2. IN SITU MÓDSZER: IMMUNHISTOCHEMIA ……...………...
2
54.
3.2. NUKLEINSAV KIMUTATÁSON ALAPULÓ MÓDSZEREK ………… 56. 3.2.1. IN VITRO MÓDSZEREK …………………………………..…… 57. 3.2.1.1. Jel-amplifikációs módszer: Quantiplex ……….…….
57.
3.2.1.2. Target-amplifikációs módszerek: Folyadék fázisú PCR (Amplicor) és real-time PCR .. 58. 3.2.2. IN SITU MÓDSZEREK …………………………………………. 64. 3.2.2.1. In situ hybridizáció ………………………...…….……. 64. 3.2.2.2. In situ PCR ………………………………...…….……. 65. A) Különbségek a folyadék fázisú PCR és az in situ PCR között ……………………………..
66.
B) Az in situ PCR típusai ...………………………….. 68. C) Kontrollok ……………....………………………….. 70. 4. A HEPATITIS C VÍRUS KIMUTATÁSA ERYTHROCYTÁKBAN .…........ 73. 4.1. KUTATÁSI HÁTTÉR ........................................................................
73.
4.2. VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS MÓDSZEREK .........................................
74.
4.2.1. Betegek és kontroll személyek ………………………………... 74. 4.2.2. Minta-elokészítés ………………………………………….……. 74. 4.2.3. RT in situ PCR (erythrocyta-PCR) …………………………….
75.
4.2.4. Folyadék fázisú RT-PCR (szérum-PCR) ……………………..
77.
4.2.5. Lézeres pásztázású confocalis mikroszkóppal végzett vizsgálatok ……………………………………………... 78. 4.2.6. Az erythrocyta – HCV interakció in vitro modellje …………... 4.3. EREDMÉNYEK ...........................................................................….
78. 79.
4.3.1. Az erythrocyta-PCR-ok fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatának eredményei .……….........................................
79.
4.3.2. Szérum-PCR eredmények ...........……………….....................
83.
4.3.3. Confocalis mikroszkópos eredmények ...............................…
83.
4.3.1. A HCV-erythrocyta kapcsolat in vitro vizsgálatának eredményei .……….........................................
84.
4.4. MEGBESZÉLÉS ..………..................................................................
86.
4.5. KÖVETKEZTETÉSEK ......................................................................
89.
3
5. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS ...................................................................
90.
6. MELLÉKLET …………..…......................................................................
91.
A) Az Amplicor HCV teszt primer-szekvenciái és összetevoi ……... 91. B) Az RT in situ PCR (erythrocyta-PCR) kivitelezéséhez felhasznált primerek ………………………………………………... 94. C) Az in situ PCR módszer kivitelezésének általános technikája ....
94.
1. Az in situ PCR elokészítése …………...............................
94.
A) Felszerelés ..................................................................
94.
B) Technikai vonatkozások …..........................................
95.
C) A minták fajtái …….…..................................................
95.
D) Fixálás .........................................................................
96.
E) Proteolitikus (proteáz) emésztés .........................….....
98.
F) Kiegészíto elokezelések .............................................
101.
2. Amplifikáció .....……………………………...............……....
102.
A) Polimerázok ................................................................
102.
B) dNTP -k ..............….....................................................
103.
C) Amplifikáló puffer ........................................................
103.
D) Primerek .................….................................................
103.
E) A PCR-ciklus folyamata ..............................................
103.
7. IRODALOMJEGYZÉK ...........................................................................
106.
8. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE …................................................
126.
Az értekezés témájával összefüggo közlemények ……………...………..
126.
Az értekezés témájához közvetlenül nem kapcsolódó közlemények …..
131.
4
1.
BEVEZETÉS, CÉLKITUZÉSEK A vírushepatitis jelentos közegészségügyi probléma világszerte. A Föld
népességének kb. 5%-a – több mint 350 millió ember – krónikus hepatitis B vírus (HBV) és kb. 3% (170-200 millió) krónikus hepatitis C vírus (HCV) hordozó (39). Az ismert kockázati csoportokban (intravénás kábítószerezok, prostituáltak, hemodializált betegek, gyakori vér- vagy vérkészítmény-transzfúzióra szorulók, stb.), különösen az intravénásan drogot fogyasztók között azonban a krónikus HCV fertozöttek aránya jóval magasabb, mint a krónikus HBV-hordozóké (160, 56). A HCV fertozöttséghez kapcsolódó legfontosabb betegségek a krónikus hepatitis, májcirrhosis és a májrák (39). Mind a HCV, mind a HBV fertozések visszaszorításában nagy jelentoségu a megelozés, amely lehetové teheti a HCV és HBV prevalencia csökkentését, azonban – a HBV-vel ellentétben – törzskönyvezett HCV-ellenes védooltás még nem áll rendelkezésünkre. A HCV fertozések elsosorban
megelozésének, a
magatartásformák
fertozodés
megakadályozásának szempontjából
visszaszorítása,
és
a
stratégiái
között
kockázatosnak
véradók
ezért
minosülo
HCV-szurése
áll
a
középpontban. (86, 156) A vérkészítmények ellenorzésével és védooltás alkalmazásával a HBV-vel való iatrogén fertozodés nagy biztonsággal megelozhetové vált. Azonban HCV esetében relatíve hosszú a humorális immunválasz kialakulásához szükséges idotartam (az ún. ablak-periódus) ami alatt a vérkészítmények rutin szurésére használt antitest-kimutatáson alapuló vizsgálómódszerek nem képesek detektálni a kórokozó jelenlétét. Másrészt a krónikus HCV fertozés az esetek egy részében csak kismértéku viraemiával jár, és mivel a jelenleg rutin diagnosztikában használt legszenzitívebb nukleinsav detektálási módszerek érzékenységi küszöbe sem alacsonyabb kb. 100 víruskópia/ml-nél, így nagy igény van az eddigieknél érzékenyebb HCV diagnosztikai eljárások kifejlesztésére, és az erre irányuló erofeszítések egyben rendkívül érdekes és ígéretes kutatási területeket is jelentenek. (86, 181)
5
Szintén jelentos eredményeket tartogathat az a kutatási irány, amely arra keresi a választ, hogy a HCV és a gazdaszervezet közötti bonyolult kapcsolatban mely sejttípusok vesznek részt az eddig ismerteken (pl. hepatocyta, lymphocyta) kívül, hiszen ezen ismereteink további bovítése mind a diagnosztikai, mind a terápiás lehetoségek bovítését eredményezheti. Munkacsoportunk ilyen irányú kutatásai azon a korábban leírt tényen alapultak, hogy a teljes vér jelentosen több HCV RNS-t tartalmaz, mint a plazma, és ugyanakkor tisztázatlan volt, hogy a vér mely része szolgál a vírus elsodleges forrásaként (145). Ennek megfeleloen célul tuztük ki: -
a HCV-fertozés következtében kialakuló májbetegség pathomechanizmusának részletesebb megismerését,
-
ezen belül a vér alakos elemei közül az eddig ilyen tekintetben nem vizsgált vörösvértestek HCV-hordozó képességének tanulmányozását,
-
ehhez a HCV kimutatására képes RT in situ PCR technika kifejlesztését, beállítását,
-
miután sikeresen detektáltuk a vírust HCV-fertozött betegek erythrocytáiban, in vitro inokulációval a HCV-vörösvértest kapcsolat további vizsgálatát,
-
a HCV vörösvértestekbe történo internalizálódásának igazolását lézeres pásztázású confocalis mikroszkópiával,
-
a késobbiekben az erythrocytákon végzett RT in situ PCR alapú HCVkimutatási módszerünk tesztelését nagyszámú HCV-fertozött betegen, összehasonlítva a rutin diagnosztikában használt folyadék fázisú RT-PCRalapú módszerrel. Fenti
céljaink
megvalósításához
és
eredményeink
megértéséhez
szükséges a hepatitis C és kórokozója, a HCV tulajdonságainak ismerete, így eloször ez kerül tárgyalásra a 2. fejezetben. Az általunk fejlesztett, az erythrocyták HCV-kötésén alapuló, RT in situ PCR alapú detektáló módszer (4. fejezet) jellemzoirol szólva fontos az in situ PCR, valamint a HCV detektálásban használt
6
egyéb módszerek ismertetése, melyre a 3. fejezetben kerül sor. Egyes molekuláris és metodikai vonatkozások részletezése a szokásosnál mélyebb, ezért ezen, nem feltétlenül a kutatási munkámhoz szorosan kapcsolódó ismertetéseket kisebb betumérettel jeleztem.
7
2.
A HEPATITIS C
2.1. A HEPATITIS C EPIDEMIOLÓGIÁJA A
hepatitis
C
vírust
(HCV)
1989-ben
fedezték
fel,
és
bebizonyosodott, hogy ez a vírus a non-A, non-B hepatitisek illetve (a HBV eliminálása óta) a poszt-transzfúziós hepatitsek fo kórokozója. (27, 7) A HCV a Föld minden részén megtalálható, jellegzetes eloszlású prevalenciával: Kanadában 0,1-1%, az USA-ban 1-2,5% közötti, Brazíliában 5% feletti, továbbá Nyugat-Európában 0,1-1%, Kelet-Európában, Oroszországban, Görög- és Törökországban 2,5-5%, Dél-Kelet Ázsiában és Afrika nagy részén 5% feletti, de egyes országokban a 14%-ot is meghaladja a szeropozitívak aránya (163,56,39). (2.1. ábra) Ebbol kitunik, hogy a prevalencia elsosorban északról dél felé növekszik, de Európán belül ill. Európát és Ázsiát együtt tekintve az emelkedés nyugatról kelet felé haladva is megfigyelheto. A WHO 1997-es felmérése szerint összességében a krónikus HCV hordozók száma meghaladja a 170 milliót, azonban az új fertozések száma folyamatosan növekszik (39, 164, 96, 168). Ennek alapján ma már kb. 200 millió krónikus HCV-hordozóval számolhatunk. Az utóbbi évek felmérései szerint Magyarországon a prevalencia 0,7-1% közötti (116). 2.1. ábra
8
Ferrell, Theise, Scheuer (39) alapján
Az infectio legfontosabb forrása a fertozött egyének vére és váladékai. Így parenterálisan vérátömlesztés, plazma, fibrinogén vagy egyéb vérkészítmények infúziója útján; továbbá fertozött injectiós tukkel (egészségügyiek munkahelyi balesete,
i.v.
drogélvezok);
fogászati,
sebészeti
muszerekkel,
borotválkozószerekkel, illetve tetoválás és piercing útján terjedhet a vírus. Ahol a HCV-szurés még nem megoldott, ott a különféle parenterális behatolási módokon belül a legjelentosebb a transzfúzióval való átvitel. Ritkábban haemodialízis, szövet- és szervátültetés is lehet a fertozés forrása. Ugyancsak kevésbé gyakorinak tartott mód a különféle testváladékok – pl. orrváladék (intranasalis kokainisták esetében), nyál, sperma, menstruációs vér – közvetítésével, vagy transzplacentáris-perinatális úton történo átvitel. (56, 39, 86, 156) A szexuális úton fertozodöttek arányát 10-20%-ra teszi az Egyesült Államok járványügyi központja, a vertikális átvitel pedig a HCV fertozött anyák gyermekeinek 6%-át érinti. (30) A kontakt-transzmisszióval (közös háztartásban élok, akiknél fenti átviteli módok kizárhatóak) kapcsolatos vizsgálatok eredményei ellentmondásosak; bár a jelenség létét elfogadók szerint is mindenképp viszonylag ritka. (56, 39, 30, 156) A korábban non A, non B-nek nevezett hepatitisek 90%-át a HCV okozza. Az USA-ban szeropozitív a hepatocelluláris carcinomában szenvedok 60%-a, az intravénás-kábítószerélvezok és a haemophiliások 70%-a, a korábban ismeretlen eredetunek vélt májbetegségben szenvedok 80%-a, valamint az átlagnál nagyobb a HCV seropozitívak aránya a hepatitis B és D vírussal fertozöttek között is.(163)
2.2. A HCV MOLEKULÁRIS VIROLÓGIÁJA A vírus core kb. 30-38 nm átméroju, melyet tüskeszeru, 6-8 nm-es glikoprotein nyúlványokkal rendelkezo burok (envelop) vesz körül, a virion átméroje így mintegy 60 nm (39, 29, 156). Ezt alátámasztják azon elektronmikroszkópos
9
vizsgálatok is, melyekben a szerzok állítása szerint sikerült kimutatni a viriont fertozött csimpánzokban, illetve krónikus HCV-fertozött emberekben (32). A HCV genetikailag a flavivírusokkal és részben a pestivírusokkal mutat rokonságot, mely alapján a Flaviviridae család Hepacivirus genusába soroljuk (39, 59, 156). A HCV genomját egy pozitív szálú, 9,4-9,5 kilobázis hosszúságú RNS alkotja, amely egyetlen, folyamatosan leolvasható open reading frame-bol áll, vagyis egyetlen, – genotípustól és izolátumtól függoen – 3008-3037 aminosavból álló polyproteint kódol, melynek enzimatikus szétbontásával keletkeznek az egyes vírusproteinek (2.2. ábra). A vírusgenom struktúrális fehérjéket és nem-struktúrális, tehát enzimfehérjéket kódoló régióra osztható. A struktúrális rész három domént kódol, melyek a nucleocapsidot és az envelop fehérjéket adják. A nem-struktúrális rész négy domént kódol, melyekbol az NS2 egy metalloproteinázt, az NS3 egy szerin-proteázt és egy helikázt tartalmaz, az NS4 fehérjéi valószínuleg más vírusfehérjék kofaktoraként muködnek, az NS5-ben pedig a vírus RNS polimeráza található. A vírusgenom mindkét végén van egy-egy nem-transzlálódó (untranslated – UTR) szakasz is. (29)
2.2. ábra
A HCV genom felépítése
10
A vírus különleges sajátossága, hogy nukleotid szekvenciájának igen nagy a variabilitása (131). Ezen genetikus heterogenitásért elsosorban a virális RNSdependens RNS polimeráz pontatlansága felelos, ami miatt a humán DNS-hez képest a HCV bázisok mutációs rátája mintegy 106-szor nagyobb (52). A fo genotípusok ill. a szubtípusok mellett mindez úgynevezett quasispecies-ek kialakulását eredményezi, melyek egy adott vírusgazdában meglévo, egymáshoz genetikailag nagymértékben hasonló (a nukleotid-szekvenciában 2 %-nál kisebb különbséget mutató), de mégis a genom néhány apróbb – általában az envelop régióra lokalizálódó – részletében egymástól eltéro, komplex víruspopulációnak felelnek meg (131, 33).
2.2.1. A HCV GENOMIÁLIS STRUKTÚRÁJA ÉS FEHÉRJÉI
2.2.1.1.
Az 5’UTR egy hosszú, az 1-341 nukleotidnak megfelelo szakasz a
HCV genomjában. Ez a legkonzerváltabb régió, melynek térszerkezetére kiterjedt másodlagos struktúrák ill. az ezek alkotta komplex tercier térszerkezet jellemzoek. Ennek diagnosztikai jelentosége is van, hiszen a konzerváltság magas foka miatt ez a rész alkalmas leginkább a nukleinsav detektáló módszerekkel történo víruskimutatásra, ugyanakkor a másodlagos struktúrák jelentosen megnehezíthetik a primerek ill. próbák hibridizációját, így ennek kiküszöbölése érdekében fontos, hogy elso lépésben a minták – tehát a virális RNS – megfelelo denaturációja megtörténjen. Az 5’UTR nem iniciáló AUG kodonokat is tartalmaz, és ez, valamint a hosszú, nagyfokú térbeli (és funkcionális) szervezettséget mutató nemtranszlálódó szakasz jelenléte erosen emlékeztet a picornavírusok genomjának megfelelo struktúráira. Ezen vírusok genomja olyan mechanizmussal íródik át fehérjére, amely nem igényli az ún. cap (sapka) régió jelenlétét a transzláció iniciációjához az RNS 5’ végén, hanem a nem-iniciáló AUG kodonokat is tartalmazó 5’ UTR különleges térszerkezete lehetové teszi, hogy egy-egy specifikus AUG kodon ún. belso riboszomális belépési helyként (internal ribosomal entry site –IRES) legyen képes funkcionálni, biztosítva a transzláció iniciációját. Számos tanulmány igazolta, hogy a HCV esetében is ez a transzlációs
11
mechanizmus muködik, azonban ez a vírus egyedülálló abban, hogy az IRESkapcsolt régió nem ér véget az 5’UTR határánál, hanem átnyúlik a core (C) fehérjét kódoló szekvenciába is. A speciális térszerkezetu szakasz ugyanis a 40-ediktol a 370edik nukleotidig terjed, így a core-t kódoló régióból is 29 nukleotidot magába foglal. Ennek része az iniciáló AUG-t is tartalmazó IV. stem–loop (nyél-hurok) struktúra, mely térszerkezet változatlansága nem esszenciális az IRES-aktivitáshoz, azonban szabályozni képes a cap-független transzláció hatékonyságát, eredményességét. Emellett azonban egészen a core 50-edik kodonjáig találhatóak bizonyos, az optimális IRES funkcióhoz szükséges szekvenciák (melyek lötyögo bázispárosodású kodonokat is tartalmaznak!). Ezzel függhet össze az is, hogy ez a szakasz szintén extrém szekvencia-konzervációt mutat, hiszen módosulása végzetesen ronthatná az iniciáció ill. a transzláció effektivitását. További különlegessége a HCV IRES-függo transzlációjának, hogy az AUG bizonyos mutációi (pl. AUU-ra vagy CUG-re) nem befolyásolják lényegesen a transzláció hatékonyságát, sot az eredeti AUG melletti 8-8 nukleotidnyi szakaszba kísérletileg inzertált további AUG-k sem voltak hatással az iniciációs komplex eredeti AUG-t felismero képességére. Ebbol világosan kitunik: a konzervált IRES-régió szerepe az, hogy a
legszélsoségesebb körülmények között is biztosítsa a fehérjeszintézis korrekt helyen való megkezdését, és megfelelo hatékonyságát. (29)
2.2.1.2
A polyprotein amino-terminusán tehát a vírus capsid fehérjéjének
megfelelo core protein található, amely erosen bázikus aminosav-összetételu. A teljes hosszúságú fehérje (P21) a gazdasejt proteázai által a 191. aminosavnál történo proteolitikus hasítással jön létre. Ezenkívül a P21-bol több rövidebb változat is keletkezik, ezek közül a P19 valószínuleg az endoplazmás retikulum (ER) membránjának enzimjei által katalizáltan a 173-as aminosavnál történo hasítással jön létre (ennek megfeleloen a P21 elsosorban, a P19 pedig részben az ER-re lokalizálódik). 179 és 182 aminosav hosszúságú core változatok is ismertek, azonban ezek nem másodlagosan a 191-esbol keletkeznek, hanem közvetlenül a polyproteinrol hasadnak le. Két jól elkülönítheto hidrofób régió (121-151., 170191.aa) található a fehérjében, amelyek az ER és a core kapcsolódásában játszanak szerepet, és közülük a 170-191-es a core ER-ba történo bejutásában is közremuködik (ahol azután a glikolizációs és egyéb enzimek tovább módosítják a fehérjét). Így értheto, hogy a core P19 (173aa) és a core P16 (151 aa) nem jut be
12
az ER-ba; a P19 részben, a P16 pedig szinte kizárólag a magban mutatható ki. A P16 a magon belül is specifikusan a nucleolusra lokalizálható, amely így az itt összeálló riboszómákhoz való kötodéssel függhet össze. A P16 expressziója különbözo lehet a HCV egyes törzseiben, ami érdekes módon a 9. kodon által kódolt aminosav természetétol függ. A különbözo lokalizációjú core formák eltéro biológiai viselkedést, hatást mutathatnak, amelynek példájaként HepG2 sejtekben a teljes hosszúságú fehérje (P21) aktiválja az NF-?B magi transzkripciós faktort és így ki tudja védeni az anti-Fas indukálta apoptosist, ugyanakkor a P19 csak részben ill. kisebb mértékben képes ezekre, míg a P16 egyáltalán nem aktiválja az NF-?B-t és nem képes megakadályozni a sejthalált. (149,29) A core protein genomiális variációi ugyancsak befolyásolhatják az NF-?B aktivációt, mivel egy 1a szubtípusú vírusizolátum core-ja gátolta az NF-?B aktiválódását, ellentétben két 1b szubtípusú vírusvariáns core-jával (126). A core protein központi szerepet játszik abban a régebbrol ismert
jelenségben, hogy amennyiben a hepatitis C-vel párhuzamosan hepatitis B (HBV) infekció is fennáll, akkor a két vírus replikációja interferál, és többnyire a HCV elnyomja a HBV szaporodását. A HCV core elso 101 aminosavának mutációja (a 39-es és 40-es argininek kivételével) a HBV-nek csak a replikációját gátolja, a génexpressziót nem, míg a 101-es és 113-115-ös argininek integritása mindkét szuppresszor funkcióhoz szükséges, a core 104-es argininje viszont csak a génexpresszió elnyomásában játszik szerepet. A hepatitis B replikációjának gátlása úgy valósul meg, hogy a HCV core komplexet képez a HBV polimerázával, akadályozva ezzel normál muködésében, míg a HBV-génexpresszió elnyomása a core-nak a transzaktivátor HBx fehérjéhez kötodésével megy végbe. (24) A HBV szuppressziójában a core mellett az NS2 is részt vehet (ld.
2.2.1.4).
A
core
gazdaszervezetre
gyakorolt
szerteágazó
hatásaival
részletesebben még a 2.4.-es fejezet foglalkozik.
2.2.1.3.
A vírus további struktúrális fehérjéi az E1 és E2 envelop
glikoproteinek. Az E1 (gp 35) a 383-as, az E2 (gp70) a 746-os aminosavnál vágódik ki a virális polyproteinbol, mindketto erosen glikozilált, és az E2 carboxiterminálisa néha magában foglal egy kisebb, p7-nek nevezett fehérjét is (ez utóbbiról ld. még 2.2.1.4.-et). A struktúrális régió hasítási helyeinek többségétol eltéroen az E2/p7 és a p7/NS2 hasítás nem nascens, hanem poszttranszlácionálisan keletkezik. (149,29)
13
A p7 63 aminosavból épül fel, az
endoplazmás retikulum membránjában elhelyezkedo két transzmembrán doménját egy citoplazmatikus hurok köti össze, míg a fehérje két vége az ER lumenébe nyúlik. Újabb in vitro adatok szerint képes ion-csatornaként funkcionálni. Csimpánzokon végzett in vivo tanulmányok szerint viszont a p7 szükséges a HCV infektivitásához. (132) A vírus-replikációban fontos szerepet játszanak a vírusfehérjék között kialakuló kapcsolatok, és bár ilyen kapcsolódás az E1 és a core, valamint az E2 és az NS2 között is létrejön, mégis az E1/E2 interakció kiemelkedo jelentoségu, mivel ez a virális morfogenezis szempontjából kritikus lépésnek tunik. Az E1 és E2 folding, valamint kapcsolódásuk az ER-ben játszódik le, a chaperon aktivitású calnexin kezdeti segítségével. Az E1/E2 komplexet foként nemkovalens kötések kapcsolják össze, azonban kevés diszulfid-híd is megtalálható. Ezen kis számú kovalens kötés kialakulása gyorsan végbemegy, és elofeltétele a nemkovalens kapcsolatok létrejöttének, melyek lassan formálódó, stabil komplexeket hoznak létre (így ez a lépés limitálja a teljes folyamat sebességét). Ellenben ha a kovalens kapcsolatok keletkezése kerül túlsúlyba, az gyorsan kialakuló, de rossz térszerkezetu („misfolded”) komplexeket eredményez, tehát ezen folyamatok megfelelo egyensúlya létfontosságú a virion formálódása szempontjából. Az E2 régió a HCV genom
legvariábilisabb része (több ún. hipervariábilis /HVR/ régiót is tartalmaz), ami a vírus burokfehérjéje esetében egyértelmuen a neutralizáló antitestek eloli „szökést” szolgálja. Ezt alátámasztja az is, hogy az E2 elso 34 aminosavának megfelelo HVR-1 – egyébként gyakori – mutációja nem volt megfigyelheto agammaglobulinaemiásokban, tehát ezen régió extrém variábilitása a neutralizáció szempontjából lehet kiemelkedo fontosságú. (149,29) Az E1 hasonló szerepére utal, hogy a transzplantációt követo viraemia quasispecieseinek vizsgálatában amellett, hogy az E1/E2 és az NS2/NS3 gének mutatták a legnagyobb genetikai diverzitást, az E1 5’ régiójának szignifikánsan nagyobb volt a genetikai változatossága
az
aszimptomatikus
betegekben,
mint
a
súlyos
poszt-
transzplantációs hepatitist mutatókban (155). Tehát azokban a betegekben, ahol a vírus jelentos illetve nagyszámú változtatást volt képes létrehozni envelopjában, ott az immunrendszer nem volt képes hatékony támadásra a fertozött sejtek ellen, ezért nem alakult ki (vagy csak gyenge formában mutatkozott) poszttranszplantációs hepatitis. A fentiek mellett az E2 egy fontos tulajdonsága még,
14
hogy az NS5A-hoz hasonlóan részt vesz a gazdaszervezet interferon (IFN) által közvetített antivirális válaszának kivédésében, mivel gátolja az interferon-indukálta protein kináz (PKR) hatását (különben a PKR leállítja a fehérjeszintézist az eIF2? foszforilálásával). Az E2 ugyanis magában foglal egy aminosav-szekvenciát, amely tartalmaz mind a PKR autofoszforilációs, mind az általa foszforilált eIF2? foszforilációs helyének megfelelo szakaszt, így neve angolul „PKR-eIF2? phosphorylation homology domain” (PePHD). Korábban azt tartották, hogy a PePHD mintegy „csalétekként” szolgál a foszforiláció számára, így az eIF2? defoszforilált maradhat, és folytatódik a vírusfehérjék szintézise. Az 1a és 1b szubtípusok PePHD-je sokkal közelebbi homológiát mutat az eredeti foszforilációs helyekhez, mint a 2-es és 3-as genotípusoké, és (látszólag) ennek megfeleloen csak az 1-es genotípus képes kivédeni az IFN hatását a PKR gátlásával (a 2-es és 3-as nem). Ezt a tetszetos elméletet azonban cáfolni látszik, hogy az E2 nem egyszeru kompetitív módon gátolja a PKR-t, hanem egyéb – eddig még ismeretlen – mechanizmussal. (159, 53)
Az E2-nek a vírus-sejt kapcsolódásban betöltött szerepe a 2.2.2. fejezetben, az onkogenetikus vonatkozásai pedig a 2.4. alatt kerülnek tárgyalásra.
2.2.1.4.
A vírusfehérjék szerepének tisztázására irányuló kezdeti kísérletek
során feltételezett elso nem-struktúrális protein (NS1) léte nem igazolódott (illetve az E2-nek – tehát struktúrális fehérjének – felelt meg), így a nem-struktúrális fehérjék elnevezése a ma elfogadott osztályozás szerint NS2-vel kezdodik. Az NS2 több transzmembrán doménnel bíró fehérje, mely az endoplazmás retikulum membránjába épül be, és mind carboxi-terminálisa, mind amino vége az ER lumenébe nyúlik. Korábban úgy gondolták, hogy az NS2-t a virális polyproteinben elotte található p7 szignál-szekvenciája irányítja az ER membránjához, de újabban két belso szignál-szekvenciát is azonosítottak az NS2-ben a 839-883, valamint a 928-960-os aminosavaknak megfeleloen, és ezzel összefüggésben azt találták, hogy a membrán-asszociáció a transzláció során a p7-tol függetlenül megy végbe (174). Bár immunprecipitációs tanulmányok szerint az NS2 szorosan asszociált a struktúrális fehérjékkel is, azonban ennek szerepe nem tisztázott. Viszont a fehérje carboxi-terminálisa az NS3 amino végével együtt egy olyan szerin proteáz aktív centrumának felel meg, mely Zn2+-függo, ill. egyéb adatok is arra utalnak, hogy
15
metalloproteináz lehet. Ez a centrum két doménbol épül fel (egy az NS2-ben, egy az NS3-ban található), és autokatalitikus aktivitású; éppen az NS2/NS3 közötti vágást végzi el (29) (természetes körülmények között valószínuleg elsosorban ez a cisz-mechanizmus érvényesül, de kísérletesen az NS2/NS3 képes volt a transzaktivitásra, tehát másik NS2/NS3 szétvágására is). Az autokatalitikus mechanizmust tekintve valószínusítheto, hogy az NS2/NS3 hasítás, és így az NS3 szerin proteáz aminoterminálisának szabaddá válása fontos lépés a HCV replikációja szempontjából. Azonban a HCV sokkal inkább a pestivírusokra hasonlít abban, hogy – a flavivírusokkal ellentétben – az NS3 nem igényli muködéséhez az NS2-t mint szorosan asszociált cofaktort, viszont éppen a pestivírusokban a replikáció végbemehet az NS2/NS3 hasítás nélkül is – ilyenkor azonban non-cytopathicus fenotípusú vírus keletkezik. A HCV esetében is beszámoltak NS2/NS3 vágást nem mutató változatokról, azonban ezek biológiai jelentosége még nem tisztázott.
(29)
Viszont
az
NS2/NS3
hasítás
szerepet
játszhat
az
NS5A
hiperfoszforilálásában (89). Újabban beszámoltak az NS2 különféle májra specifikus
és nem-specifikus promoter illetve enhancer elemekre gyakorolt hatása révén megvalósuló génexpressziós gátlásról. Ez a hatás az NS2 amino-terminális részéhez kötheto, és nemcsak a celluláris géneken érvényesül, hanem a HBV génexpresszióját és replikációját is képes elnyomni. (36)
2.2.1.5.
Az NS3 egy 70 kDa nagyságú, flavi- és pestivírus analógjaihoz
hasonlóan konzervált katalitikus doménnel bíró szerin proteáz, amely a virális polyproteinen tole carboxi irányba eso („downstream”) összes hasításért felelos (beleértve a saját carboxi-terminálisát is). A szerin proteáz aktivitású régió a molekulán belül az NS3 amino-terminális harmadára lokalizálható. Az NS3 hasítási helyeinek egyes pozícióiban az aminosavaknak a funkció szempontjából fontos konzerválódása figyelheto meg. Az NS3 által végzett hasítások mechanizmusában vannak kisebb különbségek: az NS3/NS4A közötti spontán, gyors, autokatalitikus hasítás mindig cisz-, miközben az összes többi lehet transz-mechanizmusú is (ha jelen van másik NS3), ám ezen helyek megfelelo hatékonyságú vágásához szükség van az NS4A, mint cofaktor közremuködésére. Azonban az NS4A hatásának mértéke hasítási helyenként változó: az NS5A/NS5B hasításhoz relatíve kevéssé szükséges, míg az NS4B/NS5A vágáshoz elengedhetetlen az NS4A jelenléte. Az NS3-NS4A együttmuködést alátámasztja, hogy a két molekula stabil heterodimert képes
16
alkotni, és ezen belül az NS4A az aktív komplex fontos szerkezeti eleme. Emellett a kompex stabil struktúrájának kialakításában kritikus szerepet játszik egy Zn atom, mely három ciszteinen és egy hisztidinen át (utóbbi esetében vízmolekulán keresztül) kapcsolódik az NS3-hoz. Fontosságát mutatja, hogy bár ezen Zn atom nem szorosan az NS3-NS4A aktív centrumánál helyezkedik el, köto aminosavainak mutációja mégis drámaian lecsökkenti az enzim-komplex proteolitikus aktivitását. Az NS3 carboxi-
terminális végén az NTPáz-okra jellemzo szekvencia található, és bakteriális expressziós rendszerben igazolni is tudták a molekula NTPáz aktivitását. RNShelikázokra karakterisztikus szekvencia szintén megtalálható ebben a régióban, melynek megfeleloen leírták a tisztított fehérje RNS-helikáz aktivitásának jellemzoit: minimum 7-20 nukleotid hosszúságú molekula (nukleinsav) szükséges a muködéséhez, képes kicsavarni az RNS-RNS, az RNS-DNS és a DNS-DNS duplexeket is, elonyben részesíti az egyszálú 3’ régiókat tartalmazó duplexeket (ami 3’-5’ haladási irányra utal), és preferálja a poli(rU) szekvenciákhoz kötodést a virális genom 3’ végének közelében. Ezek alapján nyilvánvalóvá vált, hogy az NS3 RNS-helikáz funkciója egyedülálló az eddig
leírt RNS-helikázok között, beleértve még a vele közeli rokonságban álló pestivírus enzimet is. Az RNS-helikáz vírusreplikációban betöltött szerepének további tisztázását eredményezték a kristályszerkezet-vizsgálatok, melyek különálló NTPáz és RNS-köto domént mutattak ki, és alátámasztották a helikáz aktivitás jelenlétét. Muködése során az NS3 eloször egy konzervatív, arginin-gazdag szekvenciája segítségével (amely az RNS-köto domén része) felismeri a szubsztrát egyszálú 3’ régióját, majd ez az RNS-köto domén elfordul, melynek során fizikailag kitekeri a helikázt. Valószínusítheto, hogy ez a forgás a másik, NTPáz-t tartalmazó doménen keresztül NTP hidrolíziséhez kapcsolt. (149,29) Annak ellenére, hogy az NS3-nak három ismert
katalitikus aktivitása is van, nincs bizonyíték arra, hogy in vivo az ezeknek megfelelo domének hasítás útján különválnának. Ez is arra utal, hogy létezik funkcionális összefüggés a helikáz és proteáz funkciók között, amit alátámaszt, hogy polinukleotidok tesztelése során egy-egy hozzáadott polinukleotid hatására mindhárom féle enzimaktivitás együtt módosult (99). Így valószínunek tunik, hogy az enzimfunkciók egy komplex replikációs struktúra részeként muködve feltételezhetoen kritikus fontosságú szerepet játszanak a vírus-replikáció szabályozásában,
melyhez
az
NS3
különbözo
doménjai,
valamint
más
vírusfehérjék kooperációja szükséges (29). Ilyen együttmuködés lehetoségét az is
17
alátámasztja, hogy létezik egy magas szervezettségu NS2-5A komplex, melynek részeként az NS3 részt vesz az NS5A eltéro foszforilációs formáinak kialakításában (78, 105) Úgy tunik, hogy az NS3 a celluláris jelátviteli folyamatokat is módosíthatja azáltal, hogy specifikusan gátolni képes a protein kináz A katalitikus alegységét és leállítja nukleáris transzportját, valamint ehhez hasonlóan a protein kináz C foszforilációs képességét is inhibitálja, és direkt kötodéssel akadályozza subcelluláris transzportját, továbbá komplexet tud alkotni a p53-al is (149,29,14). Feltételezhetoen ezen képességek állhatnak annak is a hátterében, hogy NIH 3T3 sejtvonalban expresszáltatva az NS3 transzformációt volt képes eloidézni, majd a „nude mice” egerekbe oltott transzformált sejtekbol daganat képzodött. (149,29) Humán vizsgálatok pedig rámutattak az NS3 egyes változatai és a hepatocelluláris carcinoma (HCC) kapcsolatára: Az NS3 amino-terminális részének másodlagos térszerkezete alapján a HCV 1b szubtípusának különbözo betegekbol izolált változatait A és B csoportba sorolták, és megvizsgálták a két csoport eloszlását HCC-s és daganatmentes krónikus HCV fertozöttek között. A HCC-s csoport 11%-ában találtak A típusú NS3-al rendelkezo vírust, míg 89%-uk a B típust hordozta, a daganatmentes betegeknél viszont ellenkezo tendencia volt megfigyelheto; 2/3-ukban az A típus volt jelen, és csak 1/3-uk volt fertozött a B típussal. A HCC-s esetekben a máj nem daganatos részeit is megvizsgálták, és ott a daganatból izolálttal egyezo típusú vírust találtak, ami arra utal, hogy a B típus nagyarányú jelenléte a HCC-s populációban inkább egy lehetséges oki tényezoje, semmint következménye lehet a daganatképzodésnek. (110)
A fentiek alapján valószínusítheto, hogy a HCV NS3 fehérjéje jelentosen módosíthatja a normális sejtmuködést, és így szerepet játszhat a vírus onkogén potenciáljának kialakításában is (ld. még a 2.4. fejezetet).
2.2.1.6.
A polyprotein NS4 régiója két fehérjét, az NS4A-t és az NS4B-t
foglal magába, melyek az NS3/NS4A között cisz-hasítással, az NS4A/NS4B és az NS4B/NS5A között transz-mechanizmusú vágással szabadulnak fel (ld. az NS3 leírásánál). Az NS4A egy kis méretu, körülbelül 8 kDa-os fehérje, mely kofaktorként
szolgál
az
NS3
proteáz
funkciójához,
valamint
az
NS5A
hiperfoszforilálásához ill. horgonyzóhelyként a replikációs komplexek számára. Az
18
NS4B szintén részt vesz az NS5A hiperfoszforilálásában, és bár más funkciói még jórészt ismeretlenek, ám valószínuleg integráns szerepet játszik a vírus replikációs komplexében, és a gazdaszervezet mechanizmusait befolyásoló képességére utal, hogy az NIH 3T3 sejteket transzformálni tudta Ha-ras onkogén jelenlétében. (149, 29, 78, 105) Ezt magyarázhatja, hogy mind az NS4A, mind az NS4B poszttranszkripcionálisan – a transzláció szintjén – gátolni képes a p21/Waf1 illetve kisebb mértékben a p53 expressziót. (40) Emellett az NS4A és az NS4B in vitro expresszáltatva képes volt a celluláris transzláció általános gátlására is, ugyanakkor a HCV IRES-mechanizmusát valamint a sejtek proliferációját szintén inhibitálta (71). Ezen funkció valószínuleg a HCV nyugvó sejtekben történo perzisztálását segítheti elo. Az NS4B-rol (illetve az NS4A-ról) azt is kimutatták, hogy kapcsolatba lép a CREB-RP-vel (cyclic AMP response-element binding protein related protein), amelyet ATF6? -nak (activating transcription factor 6beta) is neveznek. Az ATF6? – bár gyengébben – szintén interakcióba lép az NS4B-vel. A CREB-RP/ATF6? és az ATF6? endoplazmás retikulum stressz által indukált transzkripciós faktorok, ami annak lehetoségére utal, hogy az NS4B befolyásolhat egyes ER-stresszre adott celluláris válaszokat. (165, 40)
2.2.1.7.
Az NS5 régió két fehérjéje az NS5A (p56) és az NS5B (p65),
melyek az NS3-NS4A enzimkomplex általi transz-hasítással keletkeznek a virális polyproteinbol. Az NS5A-t p58 méretu formában is azonosították, korábban azt feltételezték, hogy egy kisméretu fehérje (p2) hasad le az amino-terminálisáról, így keletkezik a p56. A késobbiekben felismerték, hogy mind a p58, mind a p56 teljes hosszúságú NS5A-nak felel meg, ám a p58 hiperfoszforiláltsága okozza a látszólagos
méretbeli
eltérést.
(29)
Mindkét
forma
jellemzoen
szerin-
foszforiláltságot mutat (bár kisebb mértékben a treoninok is érintettek), amely foszforiláció az NS5A-nak a polyproteinbol történo felszabadulása után megy végbe. Ez az alap-foszforiláltság két régióban (2200-2250 aa és az NS5A carboxi végén a 2351-2419 aa), valamint a 2321-es szerinen figyelheto meg és független bármely más vírusfehérje jelenlététol. Ezek közül a 2321-es szerin jelenlétét a foszforilációs folyamat szempontjából kritikusnak találták egy vizsgálatban, ezért az NS5A fo foszforilációs
19
helyeként azonosították. (29, 127, 62) Az elozoekkel ellentétben a hiperfoszforiláltság a 2197-es, 2201-es és a 2204-es szerinek jelenlététol függ, és kialakulását az NS4A, mint cofaktor segíti. Kimutatták továbbá, hogy az NS4A-kapcsolt foszforilációhoz az NS4A és az NS5A 2135-2139-es aminosavai közötti asszociáció szükséges. Újabb eredmények alapján azonban úgy tunik, hogy a hiperfoszforiláció kialakulásához nem csak önmagában az NS4A szükséges, hanem az NS3, NS4A és NS4B együttes ciszmechanizmusú
hatása,
vagyis
hogy
az
NS5A-val
közös
polyproteinben
expresszálódjanak. A polyproteinben az NS3 egyes pontmutációi serkenteni vagy gátolni tudják az NS5A hiperfoszforilációját, de az NS4A középso és carboxi-terminális doménjének mutációi, valamint az NS4B rövid deléciói szintén képesek csökkenteni vagy blokkolni a hiperfoszforilációt. A folyamatban szerepet játszhat az NS2 is, mivel az NS2NS3 komplex – illetve az abból autokatalitikusan felszabaduló NS2 – (akár transzmechanizmussal is) képes visszaállítani az NS2-5 polyproteinnek az NS2/NS3 autoproteolízis kiiktatása kapcsán elvesztett hiperfoszforiláló képességét. Ezen adatok arra utalnak, hogy egy magas szervezettségu NS2-5A komplex lehet felelos az
NS5A eltéro foszforilációs formáinak kialakulásáért. (29, 78, 62, 89, 105) Bár egy vizsgálatban azt találták, hogy míg az 1b szubtípus NS5A-ja hiperfoszforilálódik, a 2a-n csak az alap-foszforiláció található meg (57), mindazonáltal a foszforilációs helyek körüli régiók extrém fokú szekvencia-konzervációja volt megfigyelheto a különbözo vírustörzsek között (29). Ennek ellenére a foszforiláció biológiai jelentosége még nem tisztázott, mint ahogy a benne résztvevo kinázok sem teljesen ismertek. (29, 62)
A 2321-es szerin egy prolin-gazdag régióba van
ágyazva, ami arra utalhat, hogy egy prolin-irányított kináz foszforilálhatja (127). Más vizsgálatokban azt találták, hogy a foszforilációért felelos enzim képes a kazeint és a H1 hisztont is szubsztrátként kezelni, majd késobb a CMCG kináz-családba tartozó kazein kináz II-ként azonosították. Emellett még a cAMP-függo protein kináz A is képes foszforilálni az NS5A-t. (74, 62) Az NS5A tartalmaz magi lokalizációs szignált, de ennek ellenére többnyire a citoplazmában illetve a perinukleáris citoplazmatikus membránokon mutatható ki. Az NS5B (a HCV polimeráza) hasonló lokalizációjáról is beszámoltak, ami arra utal, hogy az NS5A és NS5B szorosan kapcsolt komponensei lehetnek egy membrán-asszociált replikációs komplexnek. (29) Ezt támasztja az is alá, hogy mindkét virális protein képes kapcsolatba lépni a hVAP-33 nevu SNARE-szeru fehérjével
20
(SNARE: soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attached protein /SNAP/ receptor; membránfúziós fehérjecsalád). A hVAP-33 az intracelluláris membránforgalomban feltételezett szerepének megfeleloen az endoplazmás reticulumban, a Golgi-komplexben és a prelizoszómális membránban mutatható ki. A fehérje transzmembrán domént is tartalmazó C-terminálisához kötodik az NS5A, míg az NS5B az N-terminushoz kapcsolódik. (149, 167) Az NS5A esetében leírták, hogy N-terminális 30 aminosava egy erosen konzervált, alfa-hélix térszerkezetu régiót alkot, amely hidrofób aminosavaival képes lipid membránokhoz kötodni, így ez tekintheto a fehérje membránköto helyének (18). A replikációs komplexben feltételezett közös szerepüknek megfeleloen az
NS5A kötodik is az NS5B-hez (ebben 105-162 és 277-334 aminosav-régiói vesznek részt) és kis koncentrációban serkenti, nagyobb koncentrációban gátolja annak aktivitását (150). A képzodo virális RNS-el együtt az NS5A majdnem teljesen, az NS5B pedig részben a gazdasejt membránfrakciójában található, együtt a caveolin-2 nevu, lipid-tutaj asszociált intracelluláris membránfehérjével, de elkülöníthetoen az ER fehérjéitol. A confocalis mikroszkópos vizsgálatok szintén alátámasztották, hogy a vírus RNS és a HCV nem-struktúrális (NS) fehérjéi az ERtol elkülönülten lokalizálódnak a citoplazmában. Ezen adatok alapján a HCV RNS replikáció olyan „hordozó” membránon megy végbe, amely az intracelluláris membránokból
származó
valószínusíthetoen
egy
ER
lipid-tutajokból eredetu,
épül
módosult
fel
(147),
celluláris
és
amely
compartment
membránjának felel meg (18). A replikációban játszott esetleges szerepétol függetlenül az NS5A kitüntetett fontosságú a vírus interferon-érzékenységének meghatározásában is, mivel egy jól körülírt régiójának (ISDR –interferon sensitivity determining region) mutációjával mutatott összefüggést az interferon (IFN) terápia eredményessége. További vizsgálatok eredményei az NS5A és az antivirális válaszban résztvevo, IFNindukált protein kináz (PKR) direkt kapcsolatát valószínusítették, és mivel a PKR központi tényezoje az IFN-válasznak, ezért az NS5A általi inaktivációja fontos része lehet a gazdaszervezet immunválasza alóli szökésnek. Az is világossá vált azonban, hogy nemcsak a PKR gátlása, hanem más, az IFN jelátviteli útját befolyásoló, gátló hatásai is közremuködnek ebben. (149, 29, 53)
21
Az NS5A emellett amino-terminálisának deléciója, lehasadása esetén képes transzkipcionális transzaktivátorként is funkcionálni. Az amino-terminus lehasítása celluláris caspase-szeru proteáz(ok) hatására mehet végbe, mivel apoptotikus stimulusok fokozzák, caspase-gátló szer pedig inhibitálja. Az N-terminális hiányában az NS5A a magba transzlokálódik, amely lokalizációval fizikailag is lehetové válik számára a transzkipcionális aktivátor muködés. Ezt a transzlokációt magyarázza, hogy egyrészt az N-terminális 27-38. aminosavak által alkotott régió „maszkírozza” a C-terminálison elhelyezkedo (NS5A aa 354-362) nukleáris lokalizációs szignált (NLS), így ezen maszkírozó szakasz hiánya, sérülése esetén az NLS szabaddá válik, továbbá az 1-21. aminosav-régió hiánya is szükséges, mivel ez ma még nem teljesen ismert mechanizmussal képes a citoplazmában tartani az NS5A-t. Emellett a Cterminális régió is szerepet játszik a fehérje citoplazmába horgonyzásában – feltételezések szerint poszt-transzlácionálisan módosított aminosavain keresztül. (135,
152) Egy in vitro expressziós rendszereken végzett vizsgálatban a core protein képes volt kapcsolódni az NS5A-val. Ugyanakkor a core megnövekedett expressziója apoptosist váltott ki, és az ezáltal aktivált caspase-ok a fentebb részletezett módon hasították az NS5A-t. Mindamellett a core-NS5A kapcsolat jelentosége nem tisztázott. (49) Amint fentebb említésre került, a cAMP-függo protein kináz A (PKA) képes foszforilálni az NS5A-t, és ezzel összefügghet, hogy egy kísérleti rendszerben a transzkripcionális aktivátor hatás csak a PKA alfakatalitikus
alegységének
jelenlétében
volt
megfigyelheto
(135).
Bár
a
transzaktiváció interferon-független mechanizmusnak tunik, de az NS5A ezen funkcióért felelos régiója és az ISDR között átfedés van, és ez állhat annak hátterében is, hogy bizonyos ISDR mutációk – különösen a 252.aa pozíciót érintok – esetén a fehérje transzaktivátor aktivitása jelentosen megnohet (44). Az NS5A transzkripcionális transzaktivátor hatásának biológiai jelentosége nem ismert. Nem zárható ki, hogy hozzájárulhat a vírus fentmaradásához, szaporodásához, illetve onkogén potenciáljához, és az sem elképzelhetetlen, hogy az ISDR régió mutációival együttjáró IFN-érzékenység növekedés és következményes vírus-szint csökkenés kivédésének egyik mechanizmusaként szolgálhat a HCV számára, de jelenleg ezeket alátámasztó egyértelmu, konkrét adatokkal nem rendelkezünk.
22
Akadnak olyanok is az NS5A-val kapcsolatba lépo számos sejtfehérje között, melyeknek a HCV-gazdasejt kölcsönhatásban betöltött szerepét még alig ismerjük. Ilyen például a humán PTX1 homeodomén fehérje, mely az IFN-válasz modulálásában vehet részt (47), valamint az amphiphysin II, amely a clathrin-mediált endocytosisban és a celluláris membránok szervezodésében játszik szerepet, de gátolni képes a p53-hoz hasonló struktúrájú és funkciójú p73-at is (180, 76, 182). Továbbá az NS5A gátló interakcióba lép a karyopherin ß3 nevu fehérjével is, amely a magpórusokhoz csatlakozva részt vesz egyes fehérjék NLS-ének felismerésében és így a magi import felügyeletében. Ez arra utal, hogy az NS5A képes lehet megakadályozni bizonyos fehérjék magba jutását, ezzel befolyásolva a celluláris szabályozó folyamatokat. (53)
Az NS5A antiapoptotikus és onkogén tulajdonságai részletesebben a 2.4.es fejezetben kerülnek tárgyalásra. Az NS5B aminosav-szekvenciája nagyfokú konzerváltságot mutat nemcsak a HCV különbözo törzsei, de a flavi- és pestivírusok, illetve más RNS-vírusok között is. Ebbol is kiemelkedik a G-D-D aminosav-motívum teljes megorzöttsége a HCV-t, flavivírusokat, polio- és dohánymozaik vírust tekintve. Ez a motívum karakterisztikus minden ismert RNS-függo RNS polimerázra, így az NS5B nagy valószínuséggel a HCV polimerázának felel meg. Ezt igazolták sejtkultúrában expresszáltatott HCV-fehérjék muködésének vizsgálatával is, és valószínuleg más fehérjékkel együttmuködésben – egy multimolekuláris replikációs komplex részeként – látja el ezen funkcióját (lásd NS5A-nál). (29)
2.2.1.8.
A 3’UTR feltérképezését célzó kezdeti tanulmányok egy poli-U farok
létét valószínusítették, azonban a negatív szálú (anti-genomikus) HCV RNS analízise nyilvánvalóvá tette, hogy létezik egy 98 nukleotidos szekvencia a genom feltételezett végzodése után is. Ezen újabb ismeretek tükrében a 3’ UTR 3 részre tagolódik: a „hagyományos” 3’ vég (=variábilis régió /VR/) után következo poli(U/UC) régió és egy új, 3’X végzodésnek nevezett, nagymértékben konzervált szekvencia alkotja. Érdekes, hogy bár a poli(U/UC) farok extrém fokú változatosságot mutat, nemcsak a különbözo vírustörzsek, de még az egyazon májból izolált vírusváltozatok között is, ugyanakkor a 3’X vég extrém módon konzervált, még a két genetikailag egymástól legtávolabb álló HCV genotípust, az
23
1b-t és a 2a-t tekintve is. (Habár egyes eredmények arra utalnak, hogy néhány 1b izolátum 3’X /azaz extrém 3’/ vége tartalmazhat 2 addicionális uridint.) A számítógépes modellvizsgálatok ezen szekvencia térszerkezetét bonyolult nyélhurok kombinációkba hajtogatódott struktúraként jelezték elore, amely alapján feltételezheto volt, hogy a vírusreplikáció egyik igen fontos funkcionális eleme (amint hasonló struktúrák esetében számos pozitív szálú vírus esetében bebizonyosodott). Ennek megfeleloen 3 nyél-hurok kombinációt írtak le a 3’X régióban, és az eddigi adatok alapján a vírus RNS-szintézisének (replikációjának) iniciációja a 3’UTR-en, vagy annak közelében történhet. Ezt az is alátámasztja, hogy a replikációs komplex fontos részének tartott NS3 specifikusan kötodik a 3’ véghez, amelyben mind a 3’X, mind a 3’UTR másik két régiója szerepet játszik (a negatív szál esetében viszont csak a 3’X utolsó nyél-hurok kombinációja!). Olyan celluláris fehérjéket is azonosítottak, amelyekrol feltételezték, hogy a 3’UTR-hez kötodve befolyásolhatják a replikációt: a PTB (polypyrimidine tract-binding protein; illetve másik nevén hnRNP I heterogén nukleáris ribonukleoprotein I), valamint a hnRNP C (heterogén nukleáris ribonukleoprotein C) specifikus asszociációját igazolták. Azonban eddig csak a transzláció szabályozásában játszott szerepüket ismerjük részletesebben (ld. lentebb), transzkripciót befolyásoló képességük kérdéses. (29, 100, 11, 42, 176) A 3’X régió
replikációban feltételezett szerepét alátámasztotta, hogy a HCV egy in vitro infektív klónja, amely nem tartalmazta a 3’X véget, csak kismértéku replikációt mutatott, ám a 3’X jelenlétében normális volt a replikatív effektivitás (29). Hepatoma sejtvonalakban végzett további vizsgálatok is megerosítették illetve pontosították ezt: a 3’X régió hiánya vagy nyél-hurok elemei közül bármelyiknek a deléciója megakadályozza a replikációt; a poli-(U/UC) régió 3’ végének épsége szintén abszolút mértékben szükséges, és a hiányzó 5’ poli(U/UC) rész hosszával arányosan romlik a replikációs effektivitás; míg a variábilis régió komplett deléciója esetén lehetséges ugyan a replikáció, de jelentosen kisebb hatékonysággal megy végbe, és ezen régió parciális deléciói is a replikáció effektivitásának részleges csökkenésével járnak. A deléciós mutánsok romlott replikációs kapacitásáért pedig nem a transzlációs aktivitás vagy az RNS stabilitásának esetleges csökkenése a felelos, így valószínuleg a 3’UTR mutációi a virális replikázkomplex RNS-felismerését rontják a negatív szál szintézisének kezdeti fázisában, ami képes negatívan befolyásolni – vagy akár meg is akadályozni – a replikációt. (42,176) In
vivo kísérletek eredményei is egybevágtak az in vitro tapasztaltakkal, mivel a 3’X hiányában a HCV nem volt képes szaporodni csimpánzokban, illetve egy másik
24
vizsgálatban nemcsak a 3’X, de a poli(U/UC) régió részleges vagy teljes hiánya is hasonló eredményre vezetett, míg a 3’UTR maradék részének (variábilis régió) mutációja ellenére a vírus tudott a csimpánzokban replikálódni. (175,79) A poli(U/UC) régiónak a replikáz-komplexet szabályozó szerepére utalhat, hogy az NS3/NS4A aktivitását befolyásoló polinukleotidok közül a poli(U) mutatta a legeroteljesebb hatást (99).
2.2.1.9.
Számos adat utal arra, hogy a 3’ UTR – és benne a 3’X – az IRES-
mechanizmusú transzláció tekintetében együttmuködik a hasonlóan nagyfokú térbeli szervezettségu 5’UTR-el illetve core 5’ terminussal, ahova a transzláció iniciációja lokalizálható (a kooperáció részben fizikailag egymásra hatva, részben közvetíto fehérjéken keresztül történhet) (100). Ennek némiképp ellentmondóan volt olyan kísérleti rendszer is, amelyben a 3’X sem a transzláció effektivitását, sem a virális RNS stabilitását nem befolyásolta (80), azonban mások kimutatták, hogy az egyik vizsgált HCV változat (1a) esetében a 3’X vég szükséges a virális RNS stabilitásához (3’X hiányában az RNS degradálódik), míg más szubtípusú HCV genom (1b) a 3’X hiányában is stabilnak bizonyulhat. Viszont éppen az 1b szubtípusú izolátum esetében a transzláció effektivitása némileg javult a 3’X vég jelenlétében, míg az 1a izolátumú HCV-nél hasonló hatást nem észleltek (37). Amint már a replikáció/transzkripció szabályozásában a
3’UTR és egyes sejtfehérjék kapcsolata felmerült, úgy hasonló mechanizmus a transzláció regulációjában is feltételezheto volt, és egyre több adat igazolja is ezen feltevést: -
A PTB (hnRNP I) (ld. 2.2.1.8.), ami a pre-RNS splicing (vagyis a celluláris RNS „érési” folyamatának) negatív regulátora, valamint picornavírusokban leírták az IRES-mechanizmusú transzlációt erosíto hatását is (75), képes mind az 5’UTR-hez, mind a 3’UTR-hez (a 3’X területén) specifikusan kötodni (100). Úgy tunik, hogy a HCV IRES-függo transzlációjához szükséges a PTB jelenléte (9, 6), bár ennek konkrét hatásmechanizmusáról ellentmondó eredmények születtek (100, 6, 65). A core proteint kódoló régióban is leírtak egy PTB-köto szakaszt, amely a transzláció negatív szabályozójaként azonosítottak (100).
25
-
A hnRNP L specifikusan kötodik az 5’UTR-hez, és növeli a transzlációs effektivitást (51). Ugyanezen család egy másik fehérjéje, a hnRNP C a 3’ UTR-hez kötodik, azonban pontos szerepe még nem tisztázódott (100).
-
A HCV IRES régióhoz (5’UTR + core 5’régió) specifikusan kötodo La autoantigén (ami az RNS polimeráz III esetében a transzkripció terminációs faktora (50)) szelektíven képes az iniciáló AUG kodonhoz kötodni, ezzel segítve, serkentve az IRES-függo iniciációt és transzlációt (5).
-
Az eukarióta iniciációs faktor 2 és 2B (eIF2 és eIF2B) blokkolása gátolja az IRES-mechanizmusú transzlációt, ami ezen faktorok részvételére utal a folyamatban (83). Kimutatták az eIF3 direkt kötodését is az 5’UTR IRESrégiójához, méghozzá a 40S riboszómális alegységgel komplexben. Ez arra utal, hogy a HCV IRES régió nemcsak felépítésében egyedülálló, de muködésében, riboszómális szabályozási stratégiájában is különleges. (21,73).
A fentebb felsorolt faktorok mellett valószínuleg még továbbiak is résztvesznek ebben az igen bonyolult, jelenleg még csak részleteiben ismert szabályozásban. Erre utal az IRES aktivitás sejtciklustól függo változása is: mitotikus fázisban magasabb, G0-ban alacsonyabb szint volt megfigyelheto, továbbá, hogy a növekvo, proliferáló sejtekben a celluláris, cap-függo transzlációhoz képest intenzívebb az IRES-mechanizmusú (a nyugvó sejtekben pedig gyengébb). Ezen megfigyelések arra utalnak, hogy a HCV transzlációjának szabályozásában olyan celluláris fehérjék is részt vesznek, amelyek mennyisége – vagy effektivitása, funkciója – a sejtciklus során változó, valamint hogy egyes májsejt-regenerációt stimuláló faktorok fokozhatják a virális transzlációt (58). További érdekes probléma a HCV replikációjának és transzlációjának összehangolása, mivel a pozitív szálú vírusgenom szolgál templátként mindkét, ellentétes irányú folyamat számára (transzkripció: 3’? 5’; transzláció: 5’? 3’). Úgy tunik, hogy ebben a core protein játszhat szerepet, amely specifikusan az IRESrégióhoz kötodve csökkenti illetve elnyomja a transzlációs aktivitást, lehetoséget adva ezzel a transzkripció iniciációjának (183). Másrészrol a HCV NS5A és az NS4B fehérjéi képesek serkenteni az IRES-mechanizmusú transzlációt (amihez hozzájárul, hogy az NS5B gátolja az eIF2alfa és eIF4E foszforilációját) (55), tehát
26
valószínuleg az egymással ellentétes hatású vírusproteinek kényes egyensúlya szabályozhatja a transzkripció/transzláció arányát.
2.2.1.10.
Sokáig a HCV fehérjestruktúrája teljesen felderítettnek tunt, azonban
újabban leírtak egy eddig ismeretlen vírusproteint, amely az egyes aminosavakat kódoló nukleotid-tripletek (a kodonok) leolvasási keretének eltolásával (reading frame shift), az egyébként a core-t is kódoló nukleotidszakaszról keletkezik. A programozott frameshift lehetoségének kihasználására számos példát találunk a retrovírusok, coronavírusok, astrovírusok között, hiszen így akár egy viszonylag rövid genomban is nagyszámú fehérje kódolható. Ezekhez csatlakozott a Flaviviridae család a HCV révén, melynek F proteinje a frameshift-rol kapta a nevét, mivel a -2/+1 frame-ben szintetizálódik, a core régiójának megfelelo RNSszakaszról. (26) Úgy tunik, hogy a hepatitis C vírus nemcsak az IRES-régió felépítésében, muködésében, továbbá az NS3 RNS-helikáz funkciója
tekintetében mutat
egyedülálló tulajdonságokat, de esetében a frameshifting (kereteltolódás) is különleges mechanizmussal zajlik. Ugyanis a riboszómális kereteltolódásnak általában meghatározott iránya van: vagy elore vagy vissza csúszik el egy nukleotidot a polipeptidlánc szintézise a nullás kerettol (tehát vagy a -2/+1 vagy a 1/+2 frame-be), azonban a HCV riboszómális frameshift szignálja (mely az adenozin-gazdag 8-14 kodon-régión belül a 9-11-es kodonnak felelhet meg) mind a -2/+1, mind a -1/+2 frame-be történo átcsúszást támogatja. Ennek megfeleloen nemcsak a -2/+1-ben képzodo, 17 kDa-os F protein, hanem egy 1,5 kDa-os, a -1/+2-ben szintetizálódó
fehérje
is
megjelenik.
Ezen
kisebb
fehérje
valószínuleg
csak
„mellékterméke” az F protein képzodésének, mivel a frameshift szignál egy elore- (-2/+1be) és két hátracsúsztatási helyet (-1/+2-be, majd onnan -2/+1-be) tartalmaz, amely tehát a -1/+2 frame-bol is vissza képes terelni a polipeptid szintézisét az F protein termelésére, ám bizonyos arányban a folyamat megmaradhat a -1/+2-ben, így létrehozva az 1,5 kDaos proteint. A frameshifting szabályozásában valószínuleg fontos szerepet játszhat
a szignálszekvencia utáni, a 15-53 kodonoknak megfelelo nukleotidszakasz, melynek térszekezetében feltételezhetoen két nyél-hurok kombináció képez egy álcsomót. Ez a régió – speciális térszerkezetének köszönhetoen – képes a 0-ás
27
frame transzlációját jelentosen lecsökkento (az elongációt gátló) puromycin jelenlétében frameshifting-el a másik két frame-ben szintetizálódó fehérjék termelésére átterelni a fehérjeszintézist. Számos kérdés tisztázatlan még ezen szabályozó folyamatok pontos mechanizmusát illetoen, csakúgy mint magának az F proteinnek, illetve a 1,5 kDa-os fehérjének a patofiziológiai szerepe. Annyi bizonyos, hogy mindketto kimutatható volt HCV-fertozöttek szérumából, ami – ha az antitestek nem keresztreagáltak pl. a core-al az egyezo elso néhány aminosav miatt – azt jelenti, hogy a természetes fertozés során is képzodik ezen két frameshifting-fehérje, és az is felvetodhet, hogy esetleg a core proteinnek tulajdonított néhány hatás mögött valójában ezek állnak. (26) Újabb eredmények szerint a core és NS5A fehérjékhez hasonlóan a sejten belül az F protein is elsosorban az endoplazmás reticulumra lokalizálható, ami szintén a virális morfogenezisben és/vagy replikációban játszott szerepének lehetoségét veti fel. Bármilyen módon venne is részt azonban ezen folyamatokban, valószínuleg csak gyors szabályozó szerepet tölthet be, mivel labilis fehérje (féléletideje 10 percnél kisebb). (173)
2.2.2. A HCV ÉLETCIKLUSA A hepatitis C vírus szaporodásának elso lépése természetesen a gazdaszervezetbe kerülés, melynek módja a 2.1.-es fejezetben (epidemiológia) került tárgyalásra. Ezután a nyirokkeringés illetve a véráram segítségével juthat el célsejtjéhez a vírus. A HCV suruségét – a nem fertozoképessel összehasonlítva – kisebbnek találták fertozoképes szérumban, aminek magyarázataként késobb igazolták, hogy a vírus az LDL (low density lipoprotein) frakcióval asszociálva található
a
fertozoképes
vérplazmában.
Ugyanakkor
a
HCV-fertozöttek
szérumában van egy surubb vírusfrakció is, amelyben HCV—anti-HCV komplexek találhatóak (ez a frakció tehát a B-sejtek termelte specifikus, HCV-elleni antitestek által megkötött vírusokat tartalmaz) (29). Következo lépésként a célsejt felszínén található molekulákkal kapcsolódik. E tekintetben még sok a tisztázatlan részlet, valószínuleg több sejtfelszíni molekula is részt vesz a kapcsolódásban. Elsoként
28
egy 26 kDa-os tetraspanin molekulát, a CD81-et azonosították, mint E2-köto sejtfelszíni
fehérjét,
és
kötodését
a
CD81-et expresszáló májsejtekhez
immunhisztokémiailag is igazolták, ami alapján feltételezheto volt receptor szerepe. A CD81 négy hidrofób transzmembrán domént tartalmaz, valamint egy kisebb és egy nagyobb extracelluláris hidrofil domént. A nagyobbik extracelluláris doménhez kötodik az E2, amelyben a CD81 163-as, 186-os, 188-as és 196-os aminosavainak részvételét írták le. (115) Az E2 részérol a 613-618-as aminosavak körüli régió elengedhetetlen a felismerés szempontjából, ezenkívül pedig a két hipervariábilis régió is befolyásolja a kapcsolódást. Az E2-CD81 kölcsönhatásnak azonban megismertük egy olyan sajátosságát is, amely alapján szinte bizonyossá vált, hogy nem egyedüli – talán nem is a fo – HCV receptor a CD81, mivel az egyes HCV-szubtípusok E2-jét igen eltéro mértékben köti (nevezetesen az 1b eredetu E2 szignifikánsan kevésbé kötodik a CD81-el, mint az 1a szubtípusból származó). (128) Más eredmények viszont már korábban is arra utaltak, hogy a HCV az LDL (low density lipoprotein) receptorokhoz kötodve, endocitózis útján kerülhet be a sejtbe, bár a pontos mechanizmus nem tisztázódott. Különös jelentoséget kap ez a feltevés annak fényében, hogy – amint már említésre került – a HCV az LDL-frakcióval asszociálva található a vérplazmában. A késobbiekben az E2-t megkötni képes hepatocyta membránfehérjéket keresve azonosítottak egy 25-28 kDa-os proteint, amely a már ismert CD81-nek felelt meg, valamint egy eddig még nem karakterizált 59-60 kDa-os fehérjét, míg mások egy 40 kDa-os E2-köto proteinrol számoltak be. (115) A legújabb eredmények szerint a HCV keresett receptora az emberi scavanger receptor B osztályának I-es típusa (SR-BI) lehet. Erre utal, hogy nemcsak megköti az E2-t, de az E2–SR-BI kapcsolat nagyon szelektív is (sem a vele közeli rokonságban álló humán scavanger receptor CD36, sem az egér SRBI nem képes E2 kötésre), azonkívül – ellentétben a CD81-el – nem mutat izolátumtól (szubtípustól) függo eltérést a kötés erossége. (136) Azonban – minthogy eddig csak az E2 és nem a teljes vírus megkötését írták le – további vizsgálatok szükségesek az SR-BI szerepének tisztázására.
29
A fentebb ismertetett, a HCV klasszikus receptorának szerepére jelölt fehérjék mellett újabban leírtak olyan receptorokat is, amelyek nem közvetlenül a vírus sejtbe történo belépéséért felelosek, hanem inkább az internalizáció hatékonyságának fokozásában, a fertozésre való érzékenység növelésében játszhatnak szerepet. Ilyen a dendritikus (antigénprezentáló) sejteken leírt DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3 /ICAM-3/-grabbing nonintegrin; CD209) és közeli rokona, a foként májsinusoidok endotheljén és a nyirokcsomókban expresszálódó L-SIGN (liver/lymph node-specific ICAM-3-grabbing integrin; CD 209L), amelyek mintegy „elfogó” receptorként funkcionálhatnak: megkötik a vírust, és prezentálják a májsejtek számára, így valószínuleg kevesebb klasszikus („fúziós”) receptor jelenléte is elég a célsejt felszínén, továbbá chaperon funkciójuk lehetové teszi a vírusnak, hogy az endocitotikuslizoszómális lebontó enzimek ellenében is megorizze fehérjéi integritását. Az endothel esetében a vírus transzcitózisa valószínuleg szintén az L-SIGN által lehet mediált. E fehérjék az immunválaszt is befolyásolhatják a vírusprezentációval (a dendritikus sejtek által a CD8+ T sejteknek prezentált antigének immunstimulust jelentenek, míg a sinusoidális endothelsejteken bemutatott antigének inkább immuntoleranciát váltanak ki) (45)
Újabb in vivo eredmények szerint vírus részérol az envelop proteinek mellett a p7 fehérje integritása is szükséges lehet az infektivitáshoz (132). Jelenlegi ismereteink szerint a fertozés következo lépéseként a HCVreceptor komplex internalizálódik, majd a komplexet tartalmazó endocitotikus vezikulum membránjának és a virion burkának egyesülésével és kinyílásával a vírus pozitív szálú RNS-e szabaddá válik (uncoating). (33) A szabad pozitív szálról megindulhat a HCV polyprotein szintézise, és az ebbol keletkezo nem-strukturális fehérjék segítségével a negatív szálú RNS képzodése is kezdetét veszi. A negatív szálról azután pozitív szálak íródnak át, amelyek a keletkezo strukturális fehérjékbol összeálló capsid-okba csomagolódnak be. Ezeket azután az envelop fehérjéket tartalmazó lipidmembrán burkolja be, létrehozva a komplett viriont. (33) Az NS5B (a HCV polimeráza) és többnyire az NS5A is a citoplazmában illetve a perinukleáris citoplazmatikus membránokon mutatható ki, ami arra utal, hogy az NS5A és NS5B szorosan kapcsolt komponensei lehetnek egy citoplazmatikus, azon belül is talán mag-környéki membrán-asszociált replikációs komplexnek. (29) Újabb adatok alapján (ld. 2.2.1.7.) a HCV RNS replikáció olyan
30
„hordozó” membránon megy végbe, amely az intracelluláris membránok lipidtutajait tartalmazza, membránizolálás során az endoplazmás retikulumtól külön frakcióban jelenik meg (147), és amely valószínusíthetoen egy ER eredetu, módosult celluláris compartment membránjának felel meg (18). A HCV-replikáció illetve transzláció folyamata kapcsolódik magával az endoplazmás retikulummal is, minthogy a keletkezo vírusfehérjék közül egyesek processzálása (pl. folding, glikolizáció) biztosan az ER-hez kötött (170, 29). A fentebbieket megerosítik azon in situ hybridizáción alapuló eredmények is, amelyek szerint a vírus replikációja a citoplazmában többnyire egy helyre lokalizálva megy végbe, és ez a sejtek egy részében a mag környékén található. Ugyanis általában egyetlen virális replikatívintermedier (=részlegesen kettosszálú) RNS-t reprezentáló nagyobb fluoreszcens jel, vagy kisebb fluoreszcens particulumok által alkotott egyetlen csoport volt jelen a fertozött sejtben, ami az esetek egy részében perinukleáris lokalizációban volt megfigyelheto. Ugyanakkor a vírus genomiális (pozitív szálú) RNS-ének intracelluláris eloszlása nagyobb variációt mutatott: egyes sejtek egyetlen nagyobb perinukleáris jelet tartalmaztak, míg másokban emellett még több kisebb, a citoplazmában szétszórt jel volt látható, és némely sejt citoplazmájában csak ezek a többhelyütt megtalálható, kisebb fluoreszcens particulumok voltak jelen. Valószínuleg a genomiális RNS ezen eltéro eloszlása a HCV-replikáció különféle stádiumainak felelhet meg. (23) A HCV genomiális RNS sejtek közötti megoszlása tekintetében is nagyok a különbségek; krónikus hepatitis C-ben 4,8% és 87,6% közöttinek találták a pozitív májsejtek arányát (az adott szerzok 31% és 85% közöttinek találták, 56%-os átlaggal), míg a replikatív-intermediert tartalmazó sejtek aránya 4% és 25% között változott, 14%-os átlaggal. A fertozött májsejtek átlagosan 33 kópia genomiális HCV RNS-t tartalmaznak, az egy sejtben detektált legnagyobb kópiaszám 74 volt, míg ugyanez a replikatív-intermedier esetében 34 kópia. (23)
A vírus sejtbol történo kiszabadulásának pontos mechanizmusa nem ismert; korábbi feltételezések és in vitro vizsgálatok szerint vezikuláris transzporttal történne, amit azonban a legújabb, in vivo ultrastruktúrális eredmények cáfolni látszanak (32).
31
A következo folyamatábra a HCV replikáció jelenleg ismert menetét mutatja be (Di Bisceglie (33) alapján):
2.3. ábra
A HCV replikációs ciklusa
HCV kapcsolódása a sejtfelszínre és internalizáció
Uncoating (szabaddá válás)
Vírus kibocsájtás
Pozitív szálú RNS / Replikációs komplex
Negatív szálú RNS / Replikációs komplex
Envelop fehérjék & lipidmembrán
Becsomagolódás
Pozitív szálú RNS
Pozitív szálú RNS Nem-struktúrális fehérjék Virális polyprotein
Capsid
Struktúrális fehérjék
Valószínusítheto, hogy az interferon terápia kezdeti hatása a HCV életciklusára nem az újabb sejtek fertozodésének gátlásában nyilvánul meg, hanem a virionok keletkezése vagy sejtbol történo kibocsájtása blokkolódik. Azonban az IFN további adagolását kíséro vírustiter-csökkenés mögött már inkább a fertozött sejtek citotoxikus T limfociták általi eliminációja áll. (53)
2.2.3. A HCV GENOTÍPUSAI ÉS SZUBTÍPUSAI A hepatitis C vírus elnevezés nem egy egységes, homogén, stabil víruspopulációt takar, hanem – amint fentebb is említésre került – a virális genom magas mutációs rátája miatt számos variáns keletkezik, így genotípusok, ill.
32
szubtípusok jöttek létre, sot egy adott egyénben is több ún. quasispecies alakulhat ki a betegség folyamata során. Az egyes genotípusok nukleotid szekvenciája kb. 70%-ban, a szubtípusoké 75-80%-ban egyezik, az azonos szubtípusok különbözo izolátumai 90-95%-os egyezést mutatnak, míg a quasispecies-ek homológiája 98%-nál nagyobb. A jelenleg használatos osztályozás Simmonds és munkatársai nevéhez fuzodik, akik 6 genotípust különítettek el, és az ezeken belüli esetleges szubtípusokat a-c-vel jelölték. (151,33) (2.4. ábra)
a
c
b
4 2 6
5
1
c
3 a b
2.4. ábra
b
a
Az NS5 régió nukleotid szekvenciájának különbségein alapuló filogenetikai vizsgálatok eredménye: a HCV geno- és szubtípusai Simmonds P. Hepatology, 21(2):570-83, 1995
A vírusgenom változási rátájából (10-2-10-3 csere/nukleotid/év
/131/),
valamint a típusok számából és földrajzi eloszlásából következtetve egy új genotípus kialakulásához kb. 400 év, egy szubtípushoz 200-270 év szükséges, ami arra utal, hogy a HCV évezredek óta jelen lehet az emberi populációban. Ez azonban felveti a kérdést, hogy a foként parenterálisan terjedo vírus miként maradhatott fent az invazív orvosi beavatkozások elotti korszakokban, hacsak nem feltételezünk valamilyen ismeretlen hatásra bekövetkezett evolúciós ugrást, amely
33
a jelenleg számított változásnál gyorsabban, szinte robbanásszeruen alakított ki vírusváltozatokat. A HCV geno- és szubtípusok elkülönítése nem öncélú rendszerezés, hanem epidemiológiai és klinikopatológiai jelentoséggel bír, ugyanis úgy tunik, hogy az egyes típusok által okozott májbetegség sok tekintetben eltéro lehet (súlyosság, progresszió, gyógyhajlam, stb.), valamint információkat kaphatunk egy adott vírus származásáról, terjedésérol is. Így például a hazánkban is legelterjedtebb 1b genotípusra egyes tanulmányok jellemzonek találták a viraemia magasabb szintjét, a nagyobb interferon rezisztenciát, a gyakoribb progressziót cirrhosisba, valamint a
súlyosabb
poszttranszplantációs
hepatitist
(bár
ezeknek
ellentmondó
eredmények is születtek), a 3-as genotípus esetében pedig a hepatocyták zsíros degenerációját gyakoribbnak és súlyosabb fokúnak tartják (81, 107, 101), bár a foként 1b-vel fertozött hazai C hepatitisesek körében is gyakori a súlyos steatosis (68,137,117). Más vizsgálatok megerosítették, hogy az 1-es és 4-es genotípusok rezisztensebbek az interferon kezelésre, mint a 2-es és a 3-as. Ehhez még az is társul, hogy az 1-es genotípusú vírussal fertozöttek között az interferon terápiát követoen
ritkább
a
szérum
aminotranszferázok
szintjének
hosszú
távú
normalizációja. (53) Mindazonáltal nem tisztázott, hogy a különbözo genotípusok eltéro válasza mögött mennyiben a vírusfajták és az interferon közötti direkt interakció eltérései állnak, vagy esetleg a vírus virulenciájának ill. replikációs rátájának különbségei okozzák. Az 1a szubtípus esetében a 3’X vég szükséges a virális RNS stabilitásához (3’X hiányában az RNS degradálódik), míg az 1b szubtípusú HCV genom a 3’X hiányában is stabil. Viszont éppen az 1b szubtípusú izolátum esetében a transzláció effektivitása némileg javult a 3’X vég jelenlétében, míg az 1a izolátumú HCV-nél hasonló hatást nem észleltek (37) Bár az NS5A esetében a foszforiláció biológiai jelentosége még nem tisztázott, a foszforilációs
helyek
körüli
régiók
extrém
fokú
szekvencia-konzervációja
volt
megfigyelheto a különbözo vírustörzsek között (29). Mindazonáltal egy vizsgálat kimutatta, hogy míg az 1b szubtípus NS5A-ja hiperfoszforilálódik, a 2a-n csak az alapfoszforiláció található meg (57). Az NS5A hiperfoszforilációs helyei és Grb2-köto régiója átfedi egymást, valamint a Grb2-kötésben szerepet játszó C-terminális prolin-gazdag
34
motívum egyben a hiperfoszforilációhoz is szükséges, és ennek fényében különösen érdekes, hogy a 2-es genotípusú törzsek NS5A-jának Src-homológ 3 (SH3) domén konszenzus-kötohelyei (melyek a Grb2-höz történo kapcsolódásához szükségesek) gyengébbek, mint az 1-es genotípusúaké, (53) A p7 fehérje funkció szempontjából genotípus-specifikus: az 1a genom p7 régiójának kicserélése 2a-ból származóra a vírus fertozoképességének elvesztésével jár. Az
infektivitás
megorzéséhez
az
1a
típusú
fehérjébol
az
intraluminális
(ER)
elhelyezkedésu amino- és carboxi-terminális megtartása szükséges. (132)
2.3. A HEPATITIS C PATOLÓGIÁJA, KLINIKOPATOLÓGIÁJA A hepatitis C patológiai jellegzetességei megegyeznek a korábbi években leírt, parenterálisan terjedo sporadikus non-A non-B hepatitis jellemzoivel. Lappangási ideje feltunoen hosszú, elérheti a 60-120 napot is. A vírus májsejtekben történo szaporodása többnyire asymptomatikusan zajlik, akut hepatitis a HCV fertozöttek csak mintegy 25%-ában jelenik meg. (144, 90, 86) A májsejteken kívül valószínuleg képes megfertozni a monocyta-macrophag rendszer elemeit (beleértve az agy mikroglia sejtjeit is), limfocitákat, továbbá a nyál- és könnymirgy sejteket is. (118, 17, 125). Részben ezzel, részben a keringo HCVantigén/antitest immunkomplexek jelenlétével magyarázható, hogy az akut és krónikus májgyulladáson túl a HCV fertozés számos extrahepatikus manifesztációja illetve társult betegsége is ismert: Sjörgen-syndromához hasonló lymphocytás sialoadenitis, autoimmun thyreoiditis, cryoglobulinaemia, vasculitis, glomerulonephritis, arthritis, idiopathiás (vagy immun) thrombocytopenia (ITP), porphyria cutanea tarda, de a II-es típusú autoimmun hepatitis valamint a B-sejtes non-Hodgkin lymphoma szintén ezek közé tartoznak. (118)
A HCV által okozott akut hepatitis hisztológiai képe megfelel az egyéb hepatitis vírusok által okozott májgyulladásban észlelteknek. Ennek megfeleloen a májsejtek
duzzadása,
apoptotikus
Councilman-szeru
testek
képzodése
(elsosorban centrolobulárisan), cholestasis, a portális traktusok és a lobulusok lymphocytás infiltrációja jellemzi. Bizonyos szövettani eltérések viszont utalhatnak a HCV fertozésre, így a jellegzetes triász: az epeútkárosodás megjelenése, a májsejtek zsíros degenerációja valamint a különösen suru lymphoid aggregátum ill. folliculus-képzodés. Ritkán elofordulhat centrolobuláris confluáló nekrózis, ill.
35
bridging nekrózis is. Fulmináns hepatitis ritkán alakul ki. (144, 39) A szövettan alapján az akut szakban nehezen jósolható meg a krónikus, perzisztáló fertozésbe való átmenet (144, 39), ami – bár az akut C hepatitis többnyire enyhe, tünetmentes formában zajlik le – mégis gyakran (85%) bekövetkezik. Ez krónikus hepatitisbe (a krónikus HCV fertozések 70%-ában), majd cirrhosisba (a krónikus HCV fertozések kb. 20%-ában) progrediálhat, ezért sokszor már csak a súlyos májkárosodás tünetei hívják fel a figyelmet a fertozésre (39,131,146). (ld. 2.5. ábra) Akut C hepatitis 15%
85%
Spontán gyógyulás
Krónikus HCV fertozés ? 10%
70%
Hordozó (egészséges)
Krónikus hepatitis (enyhe – közepes – súlyos)
? 20%
Cirrhosis
2.5. ábra
évente 3-4%
Hepatocellularis carcinoma
A hepatitis C betegség természetes lefolyásának lehetséges kimenetelei (131, 146)
A HCV okozta idült májkárosodás leggyakrabban viszonylag enyhe krónikus hepatitis képét mutatja (a régebbi nómenklatúra szerinti krónikus perzisztáló és krónikus aktív hepatitis határán; ami az újabb osztályozás szerint kb. 4 és 6 közötti hisztológiai aktivitási indexnek (HAI) felel meg). A necroinflammatoricus elváltozások
részeként
fokális
intraacináris
májsejtkárosodás,
acidophil
(Councilman) test képzodés, és – a gyulladás aktivitásától függoen – piecemeal
36
nekrózis (interface hepatitis) figyelheto meg. Mégis, a krónikus hepatitis C-re az epeútkárosodás és a nagyfokú, portális lymphoid aggregátumok vagy akár komplett folliculusok képzodésével is járó lymphoid beszurodés a leginkább karakterisztikus.
Az
epeútkárosodás
mértéke
az
enyhe
fokális
reaktív
elváltozásoktól (az epithelium vakuolizációja, stratificatiója – többmagsorossá válása –, a sejtek torlódása) gyakran a súlyos, az epeúti hámsejtek pyknosisával, lelökodésével, járó, masszív lymphocytás infiltrációval kísért károsodásig terjed. További jellemzo elváltozás a hepatocytákban gyakran megjeleno kevert, microés macrovesicularis típusú, mérsékelt vagy közepes fokú zsíros degeneráció (13, 39). Újabb vizsgálatok alapján úgy tunik, hogy a krónikus HCV-ben gyakran megfigyelheto enyhe fokú zsíros degeneráció metabolikus eredetu (mértéke korrelál a testtömeg indexszel, és rezisztens lehet az antivirális terápiára), míg a közepes és súlyos fokú steatosis – mely legkifejezettebben a 3-as genotípust hordozó betegekben fordul elo – virális eredetu lehet (107). Jármay dr-no megfigyelései szerint azonban a foként 1b szubtípussal fertozött hazai C hepatitisesek körében is gyakori a súlyos steatosis. (68, 137, 117) Megfigyelték továbbá krónikus hepatitis C-ben, hogy a máj vastárolása
gyakorta megnövekszik. Emögött a cirrhosis fennállása nélküli esetekben foként az emelkedett
mesenchymális
vaslerakódás
áll,
amely
úgy
tunik,
hogy
a
necroinflammatoricus aktivitással mutat összefüggést, és az interferon terápiára adott rosszabb válasszal is együtt jár. A betegség stádiumának elorehaladtával tovább no a lerakódott vas mennyisége, mivel cirrhosis esetén már jelentosebb parenchymás vastárolás is megjelenik (39). A vas lerakódása növeli az oxidatív stresszt,
depletálhat egyes hepatoprotektív faktorokat, rontja az immunitást, melyek összességében elosegíthetik a HCV replikációját. Ennek megfeleloen felmerült a hemochromatosis gén (HFE) esetleges súlyosbító szerepe is a mutált allélokat hordozó heterozigóták krónikus hepatitis C betegségében, melyet azonban az eddigi vizsgálatok nem támasztottak alá. (161) A gyakran igen enyhe szövettani kép ellenére a betegek jelentos részében cirrhosis alakul ki, melynek lényege, hogy a normális májstruktúrát destruáló hepatitis – foként az ismétlodo epizódokban jelentkezo piecemeal és bridging nekrózis – hatására fibrotikus szeptumokkal határolt állebenykék képzodnek a májban. A krónikus C hepatitisek kb. 20%-a progrediál cirrhosisba. (39, 131, 146)
37
(ld. 2.5. ábra) A cirrhosis megjelenéséig eltelt ido nagy variációkat mutat; néha évek alatt kialakulhat, más esetekben csak évtizedek eltelte után. A betegség diagnosztizálásakor fennálló elorehaladottabb stádium (nagyobb fokú fibrózis /score 3 felett/) esetén jelentosen gyakrabban és hamarabb fejlodik ki a cirrhotikus állapot (81). Ezt magyarázhatják egy másik vizsgálat eredményei, miszerint a krónikus HCV-ben szenvedo betegek 3 csoportra oszthatók, kb. 1/3-uk ún. „slow fibroser”, akikben egyáltalán nem vagy csak igen hosszú ido (kb. 50 év ill. több) alatt alakul ki cirrhosis, egy másik harmaduk „intermediate fibroser”, akikben 20-50 év alatt jön létre cirrhosis, és a maradék harmad az ún. „rapid fibroser”, akikben a megfertozodéstol számított 20 éven belül cirrhosis fejlodik ki (81). Tehát azok, akik a betegség felismerése idején már a fibrózis elorehaladottabb stádiumában voltak, valószínusíthetoen a „rapid fibroser” csoportba tartozók, így értheto, hogy hamarabb és nagyobb arányban fejlodött ki bennük cirrhosis. Összefüggést találtak a necroinflammatoricus aktivitás és a fibrózis
között is – a nagyobb mértéku aktivitás gyakoribb és gyorsabban kialakuló cirrhosissal társul –, ami alátámasztja, hogy a gyulladásos aktivitás jelentos szerepet játszhat a betegség progressziójában (81, 41). Erre utal az is, hogy a fibrózis kialakulásában kulcsszerepet játszó cytokin, a TGF-? 1, mRNS-ének májszintje arányos a lobuláris és az össz- necroinflammatoricus aktivitással. Azonban az interface hepatitis és a portalis gyulladás mértékével nem mutat arányosságot a TGF-? 1 mRNS szint – ez részben megmagyarázza, hogy bár a gyulladás sokszor viszonylag enyhe (krónikus aktív hepatitisnek az interface hepatitis hiánya miatt nem felel meg a látott kép), ennek ellenére a fibrózis mégis progrediál (81). Másrészt a gyulladás mértéke nem állandó, hanem fellángolások és viszonylag enyhébb aktivitású periódusok váltakoznak, azonban az egyes idoszakok hatásai kumulálódva vezetnek fibrózis és szerkezeti torzulások kialakulásához (81). A cirrhosisba való fokozott progresszióra hajlamosító
faktornak találták még az idosebb korban (40 év felett) történo fertozodést, a rendszeres alkoholfogyasztást, az immunszupprimált állapotokat (pl. HIV infekció) és azt, ha a HCV genotípusai közül az 1b-vel, illetve ha transzfúzió útján történt a fertozodés (2.1. táblázat) (81, 131, 146).
38
2.1. táblázat A krónikus HCV fertozés kimenetelét befolyásoló faktorok (146) virális
környezeti
gazdaszervezeti
?
vírus-dózis
?
coinfectio (HIV, HBV)*
?
életkor*
?
genotípus,
?
életkörülmények
?
férfi nem*
quasispecies
?
dohányzás
?
rassz
?
krónikus alkoholizmus*
?
földrajzi elhelyezkedés
* Jól dokumentáltan, szélesköruen igazolt prognosztikai faktor
A HCV infectio következtében kialakuló cirrhosis szövettani megjelenése nem specifikus, bár lymphoid aggregátumok, folliculusok elofordulhatnak (144). A cirrhotikus májban megjeleno kissejtes dysplasia a késobbiekben kifejlodo hepatocelluláris carcinoma (HCC) független prognosztikai faktorának bizonyult egy prospektív vizsgálatban (81). Bár HCC keletkezése szempontjából bármely eredetu cirrhosis fokozott kockázatot jelent, de ezen betegség elofordulását illetoen a HCV major faktornak tekintheto (ld. következo fejezet). Ezért is fontos, hogy a krónikus hepatitis C interferon-? (IFN) ill. Ribavirin kezelése után a HCV-RNS eltunhet a szérumból. Önmagában az IFN kezelés csak a betegek 13-22%-ában eredményezett tartós remissziót, de Ribavirinnel kombinálva ez az arány nagyjából megduplázódott (36%), míg újabban a polietilénglikollal tartósabb hatásúvá tett interferon (PEG-IFN) és a Ribavirin együtt adva 50% körüli tartós remissziós arányt eredményezett (116). Egy retrospektív vizsgálat kimutatta, hogy az interferon kezelésre reagáló
betegek között (komplett és átmeneti responderek) a HCC kialakulásának valószínusége 48%-al csökkent, miközben a hosszútávú túlélés nott. Az idosebb kor és elorehaladottabb szövettani stádium, a férfi nem, továbbá az alacsony thrombocyta szám magasabb HCC kockázattal járt együtt. (158) Az IFN kezelés a piecemeal nekrózis és a lobuláris sérülés (grade) mértékének enyhülését, valamint a fibrózis csökkenését is eredményezheti. Sot még a virológiai választ nem mutató betegekben is csökkenti a hepatoma, a májelégtelenség, a
39
transplantatio-szükségesség és a halál esélyét (131). Hazánkban Jármay dr-no vizsgálatai igazolták a grade IFN hatására bekövetkezo javulását, ám eredményei azt mutatták, hogy a fibrózis progresszióját a kezelés nem befolyásolta (67,66) (annak ellenére, hogy egyes tanulmányok szerint – kiváltó okának megszunésével, enyhülésével – akár a humán cirrhosis is regrediálhat (169)). Fel kell azonban hívni a figyelmet arra, hogy a szövettani elváltozások nem mutatnak közvetlen összefüggést a tünetekkel és a labordiagnosztikai jellemzokkel (39,81), valamint a szérum és a máj (egymással korreláló) HCV-szintje sem mutat összefüggést a szövettani grade-del (31), ezért a biopsziás vizsgálat elengedhetetlen a beteg állapotának, stádiumának korrekt megítéléséhez.
2.4. A KRÓNIKUS HEPATITIS C PATHOMECHANIZMUSA ÉS KAPCSOLATA A HEPATOCELLULÁRIS CARCINOMA (HCC) KIALAKULÁSÁVAL A HCV okozta fertozés lassan (akár 30 éven át) progrediáló májbetegséget (enyhe vagy súlyosabb aktivitású krónikus hepatitis) okoz, amely következményes cirrhosist és esetenként akár hepatocellularis carcinoma (HCC) kialakulását is eredményezheti. A HCC okozta halálozás az elmúlt 20-30 évben emelkedett, jelenleg világszerte az összes rosszindulatú daganat mintegy 4%-át teszi ki, férfiak között a 7., nok között a 9. a gyakorisága (15, 19, 22, 38, 72). A HCC földrajzi eloszlása jellegzetes, szorosan korrelál a HBV és a HCV prevalenciájával: gyakori Afrika középso és déli területén, Délkelet-Ázsiában, míg Európában és ÉszakAmerikában ritkábban fordul elo (19). Az afrikai és az ázsiai HCC esetek többségét a hepatitis B vírus (HBV) fertozéssel hozzák összefüggésbe, bár megjegyzendo, hogy ugyanezen területeken a HCV prevalencia szintén igen magas (2.1.ábra). A dél-európai és a Japánban eloforduló HCC esetek viszont egyértelmuen inkább hepatitis C vírus fertozéshez kapcsolódnak (4, 34, 52, 61, 63). A jelentosebb kofaktorok között az alkohol, az aflatoxin és egyes szteroidok szerepelnek a HCC etiológiájában (139) . A kiterjedt kutatások ellenére a HCV okozta májrák keletkezési mechanizmusa nem teljes mértékben tisztázott (139). Számos adat a gyulladás és
40
a hepatocyta regeneráció szerepére utal a pathogenesisben (25, 141). Ezt alátámasztja
az
is,
hogy
a
súlyosabb
gyulladással
járó
és
aktívabb
májbetegségben szenvedo betegek a HCC kialakulása szempontjából nagyobb kockázatnak vannak kitéve (4, 149). Jelenlegi ismereteink szerint a HCV nem direkt cytotoxicus vírus, hiszen az intrahepatikus HCV RNS szint nem mutat összefüggést a necroinflammatoricus elváltozások mértékével (106,31). A nemzetközi
kutatási
eredmények
mellett
saját
megfigyeléseink
(69,77,91,92,97,138,140, 141,142,143,157) is azt támasztják alá, hogy az expresszálódó vírusproteinek stimulálják a beteg immunrendszerét, triggerelik a gyulladást, és a fertozött sejtek pusztulása immunmechanizmussal következik be. Erre utal az aktivált T sejtek predominanciája a gyulladásos infiltrátumban, és hogy a T és B sejtek, valamint a különbözo antigén-prezentáló reticulumsejtek elhelyezkedése megfelel a nyirokcsomókban észlelteknek, gyakran szabályos lymphoid folliculust formálnak. Szintén az immun-pathomechanizmus mellett szól, hogy a normál májjal ellentétben a piecemeal necrosis során erosen expresszálódnak a hepatocytákon a HLA I-es, a T sejteken a HLA I-es és II-es és az endothelsejteken a HLA II-es osztályú molekulák. A lymphocyták és hepatocyták szoros kapcsolata is megfigyelheto peripolesis és emperipolesis formájában. (39,118, 140,141,142,143) (2.6. ábra) 2.6. ábra Schaff et al. (140) alapján
41
A hepatocyták pusztulásának egyik módja, hogy a fertozött sejtek felszínén megjeleno, vagy a nem fertozött sejtekre kötodo HCV-fehérjékhez antitestek kapcsolódnak, és a cytotoxicus T sejtek antitest-dependens celluláris cytotoxicitási mechanizmus (ADCC) útján eliminálják ezen sejteket. (140,141,143, 153) További bizonyíték az immunmechanizmusok szerepére, hogy a hepatocyták fokozottan expresszálják az ICAM-1-es molekulákat, és a Fas/FasL rendszer expressziója is fokozódik vírushepatitisben. A HCV infectio hatására a hepatocyták expresszálják a Fas/Apo1 receptort, a cytotoxicus lymphocyták pedig a prezentálódó vírusantigének hatására aktiválódnak, és expresszálják a Fas ligandot, amely Fas/Apo1 receptorhoz kapcsolódva apoptosist indukál a májsejtekben. A cytotoxicus lymphocyták másik jelentos pusztító mechanizmusa a fertozött sejtek ellen a megtámadott sejt membránjába juttatott perforin és az ezen át bejutó fragmentin hatására bekövetkezo sejthalál. Ezek mellett szerepet játszhat még a májsejtek pusztulásában a TGF-beta és a TNF által mediált sejthalál is. (69,118,138,140,141,142,143) (2.6. ábra) A
kezdeti
immunválasz
erossége
meghatározó
lehet
a
betegség
szempontjából, mivel gyengébb reakció esetén fokozottabb a krónikus hepatitis C-be való átmenet kockázata. (131) Az immunrendszer HCV fertozés hatására bekövetkezo aktivációja ugyanis többnyire nem képes a vírus eliminálására. Ezzel összefüggésben leírták a killer T sejtek csökkent számát a perifériás vérben, a natural killer (NK) sejtek funkciójának romlását, valamint a csökkent perforin expressziót. Emellett a helper T sejtek (TH) funkciója sem megfelelo. Krónikus HCV-ben foként a humoralis immunitásban szerepet játszó TH2 sejtek aktiválódnak, míg a víruseliminációban (és a daganat-ellenes védekezésben) elsodleges celluláris immunitás serkentéséért felelos TH1-es sejtek csak gyenge válaszra képesek. Az antigén-prezentálás szintjén is
képes lehet a vírus rontani az adekvát immunválaszt: a core egy peptid fragmentuma gátolja a fehérjének a prezentáláshoz szükséges feldolgozását. Az
42
immunrendszer
elleni
virális
védekezésben
szerepet
játszhat
a
core
szignáltranszdukcióra gyakorolt hatása (ld.lentebb valamint 2.2.1.2.), és az az érdekes jelenség is, hogy a krónikus HCV-s betegekben a core fehérjével történo stimuláció a halál-receptor fehérje szupercsaládba tartozó CD30 megjelenését indukálja a T lymphocytákon. (118) A HCV-nek olyan variánsai is megjelentek, amelyek T sejt receptor anatgonistaként funkcionáló sejtfelszíni peptidligandokkal rendelkeznek. (131) Az
ismétlodoen
következményesen
megjeleno
állandósuló
necroinflammatoricus
májsejt-regeneráció
laesiok
genetikai
és
a
változásokat
okozhatnak, amelyek HCC-t eredményezo malignus fenotípus kialakulásához vezethetnek. Ugyanis a gyulladás és a regeneráció hatására a májsejteket állandó proliferációs szignálok érik, melyek hatására a sejtciklus felgyorsul, és a repairmechanizmusok elégtelenné válnak, így mutációk, ill. chromosomális aberrációk jelennek meg a genomban (10,12,30,52,61,63,87,166). (2.7. ábra) Úgy tunik, hogy a genomiális instabilitás inkább allélikus imbalance, mint mikroszatellita instabilitás eredménye lehet (35). Werling dr-no (S.E. II. Belklinika) mutatta ki, hogy a HCV hatására más hepatitiseknél enyhébb sejtproliferáció növekedés jön csak létre (ebben valószínusítheto a G01/S átmenet direkt virális hatásra bekövetkezo gátlása), ugyanakkor a genomiális instabilitás jeleként a hepatocyták DNStartalma növekszik, aneuploiddá válnak (míg a nem HCV eredetu hepatitisekben diploidok maradnak a májsejtek) (171). Jelenlegi ismereteink szerint a HCV nem integrálódik a fertozött sejt genomjába, mivel a vírus nem rendelkezik reverz transzkriptáz (RT) aktivitással (29), így ez a mechanizmus – a HBV-vel ellentétben – a HCV által okozott genomiális károsodásokban nem játszik szerepet. A fentiekhez hozzájárul, hogy nagyobb aktivitású, súlyosabb gyulladás esetén csökken az apoptosis gyakorisága (amelyet magyarázhat a HCV fehérjéinek apoptosist gátló tulajdonsága is – ld. lentebb) ami így még több károsodott genetikai állományú sejt fennmaradásához vezethet, növelve ezzel a HCC kialakulásának kockázatát (130). A DNS microarray technikán alapuló legújabb vizsgálatok kimutatták, hogy a HCV
43
és HBV fertozéssel asszociált májrákok eltéro génexpressziós mintát mutatnak, mely eltérések foleg carcinogen metabolizáló és detoxikáló enzimeket érintenek. Ez az adat a vírusfertozés és a májrák kialakulása közti összefüggést helyezi új megvilágításba. A HCV (a HBV-hez hasonlóan) tehát részben direkt, részben indirekt, egymást erosíto utakon, fokozott regenerációhoz vezet. A fokozott növekedési stimulus a genetikusan károsodott sejt klonális expanzióját okozhatja, mely végül HCC kialakulását eredményezheti (2.7. ábra) (92).
2.7. ábra
HCV
Lotz et al. (92) alapján
cytokinek, oxidatív stressz, immunválasz
proliferáció, sejthalál, gyulladás, fibrózis
15% gyógyulás
85% krónikus gyulladás (CH cirrhosis)
virális fehérjék (core, E2, NS3, NS5A) növekedési faktorok (TGF? , TGF? , HGF, IGF II, stb.) sejthalál, proliferáció; celluláris gének transzaktiválása; genetikai instabilitás, genetikai változások
Klonális expanzió
HCC
44
Bár a HCV nem tekintheto cytopathogen vírusnak, de a vírusfehérjék módosíthatják a sejtproliferációt. Számos adat szól amellett, hogy egyes virális antigének direkt carcinogén hatásúak is lehetnek, többféle mechanizmus alapján (ahogy az a 2.2.1.-es fejezetben az egyes vírusfehérjék jellemzése kapcsán is már részben leírásra került) (10, 12, 30, 52, 61, 63, 87, 166). (2.2. táblázat)
2.2. táblázat
A HCV fehérjék szerepe a sejtmuködés szabályozásában
HCV fehérje
HCV fehérje által befolyásolt faktor
core
A HCV fehérje által befolyásolt funkció
Apolipoprotein AII
- módosítja a lipid metabolizmust
kölcsönhatás a p53-al ill. a p21/waf1-el
- a sejtproliferáció és az apoptosis szabályozásának módosítása
TNF receptor 1
- apoptosist, steatosist befolyásolja
Az RNS helikáz DEAD domainja
- gátolja a gazdasejt mRNS-ének transzlációját - HCC-t indukál transzgén egérben
Lymphotoxin ? receptor
- steatosis transzgén egérben - gátolja a p53 transzaktiváló funkcióját
E2
PKR
- gátolja a PKR funkcióját
NS3
p53
- NIH 3T3 sejteket transzformálja
NS4B
p53
- NIH 3T3 sejteket transzformálja
NS5A
PKR ISG-k p53
- interferon szenzitivitást módosítja - anti-apoptotikus és oncogen hatású - gátolja a PKR aktivitást - transzaktiváló hatású
Shimotohno K. (149) alapján
Úgy tunik, hogy a HCV core proteinjének szerepe különösen jelentos lehet a daganat-keletkezés folyamatában, ugyanis képes több különbözo viralis és
45
cellularis gén (beleértve a c-myc, c-fos, RB, p53 stb.) transzkripcióját regulálni (149). Habár a core direkt transzformáló hatását általában gyengének tartják, azonban
a
BALB/3T3
sejtvonal
egyik
szubklónjával
(A31-I-1)
végzett
vizsgálatokban a v-H-ras mellett expresszáltatott core protein transzformáló képessége a myc onkogénével azonos mértékunek bizonyult. A core és ras közös hatására a sejtek klasszikus transzformációja következett be a sejtmorfológia és a normál orientáció megváltozásával, a kontakt gátlás elvesztésével és fókuszképzo kolóniák valamint a folyékony fázisban való növekedés képességének megjelenésével. A további kísérletek azt igazolták, hogy bár önmagában a core protein nem stimulálja a sejtproliferációt, de növekedési szignál – EGF ill. ras-gén termékek – hatását erosíti, amiben a c-fos onkogén promoterét reguláló SRE (serum responsive element) core hatására bekövetkezo – szérum jelenlététol független – aktivációja játszhat szerepet, mivel a core aktiválja az Erk-SRE utat (149).
Az eddigiek alapján tehát a HCV core protein közvetlenül módosíthatja a celluláris szignálfolyamatokat és valószínunek tunik, hogy befolyásolva egyes gének expresszióját, fokozott növekedési stimulust okoz. Emellett – az elozoekkel összefüggésben – a core fehérje az apoptosis gátlásával is képes lehet elosegíteni a HCC kialakulását (149). A komplett core protein (191 aa) a citoplazmába, elsosorban a perinuclearis régióba lokalizálódik, hasított (inkomplett) formái azonban a magba is bejuthatnak, elsosorban a regenerálódó hepatocytákban (a core 151 a magba ill. a nucleolusba, a perinuclearis régióban keletkezo core 173 a magba is lokalizálódik, ld. bovebben 2.2 fejezet) (12, 149, 29), így a core közvetlen sejtmagi hatásokat is kifejthet. A fehérje C-terminálisa – mely az inkomplett formákról
lehasad – szükséges ahhoz, hogy a core a perinuclearis membránra lokalizálva maradhasson, és ez utóbbi elengedhetetlen feltétele az NF-?B magi transzkripciós faktor core által történo indukciójának. Ez az NF-?B aktiváció szükséges a core anti-apoptotikus hatásához (149). A genomiális variációk azonban befolyásolhatják a core protein NF-?B aktivációját, mivel egy vizsgálatban az 1a szubtípusú vírusizolátum core-ja nem aktiválta, hanem gátolta az NF-?B-t, szemben két 1b szubtípus core-jával, ám az 1a-core másodlagos térszerkezetét módosító pontmutációk enyhítették az NF-?B aktiváció gátlását. (126). Egyes esetekben a HCV core protein elo is segítheti az
apoptotikus sejthalált, melynek egyik mechanizmusa, hogy a core a TNF receptor
46
citoplazmatikus doménjához ill. a lymphotoxin-beta receptorhoz kötodik (149). Fiziológiás
körülmények
között
valószínuleg
ezen
tényezok,
valamint
a
sejtproliferációt befolyásoló egyéb faktorok hatásának eredoje határozza meg a sejt sorsát. A core protein direkt módon a sejtciklus szabályozására hatva is képes lehet antiapoptotikus és sejtproliferációs hatást kifejteni, mivel a p53-nak illetve „végrehajtó” molekulájának, a p21/Waf1-nek az expresszióját poszt-transzkripcionálisan gátolja, rontva normál muködési potenciálját (177, 112). A HCV-fertozés során jól ismert a lipid metabolizmus zavara; zsíros degeneráció gyakori jelenség az infektált májszövetben (ld. a HCV betegség patológiája
–2.3.
fejezet).
In
vitro,
core
fehérje
génjével
transzfektált
sejttenyészetben igazolható a HCV core lipid akkumulációt okozó hatása, ill. hogy a citoplazmában a core részben lipidcseppekkel co-lokalizálódik, és in vivo szintén igazolták a core és a lipidcseppek ezen szoros kapcsolatát HCV-fertozött csimpánzokon (12). Hepatoma sejtvonalon kimutatták, hogy a lipidcseppekben a core-al együtt lokalizálódik az NS5A is, az apolipoprotein A1-hez kötodve (148). A HCV core fehérjét expresszáló transzgén egerekben súlyos zsíros degeneráció és hiányos immunválasz alakul ki, melyet HCC kialakulása követ (87). Ezekben a transzgén egerekben igazolható, hogy a HCV core fehérje közvetlenül interferál a "very low density lipoproteinnel" (VLDL), mely feltehetoen abból következik, hogy a core csökkenti a microsomalis triglicerid transfer protein (MTP) aktivitását (123). Emellett a core protein mitochondrialis toxicitására és ezzel összefüggésben reaktív oxigén származékok keletkezésére szintén vannak adatok (114). Ugyanakkor magának a steatosisnak is funkcionális következménye, hogy fokozódik a lipid peroxidáció, mely reaktív oxigén gyökök képzodése révén DNS károsodást okozhat és carcinogen hatású lehet. Ezen, transzgén egér kísérleti rendszerekben megfigyelt összefüggések
fontos tendenciákat mutatnak a core protein és a steatosis vonatkozásában, azonban a HCV-fertozött betegekben lejátszódó folyamatok nem minden vonatkozásban egyeznek az állatmodellekben tapasztaltakkal (107). Mégis ezek, valamint a fentebb ismertetett adatok arra mutatnak rá, hogy a core protein közvetlenül interferálhat a sejt metabolizmusát, proliferációját
47
szabályozó faktorokkal, ami által onkogén tulajdonságú lehet. Ezt támasztják alá azon vizsgálat eredményei is, amelyben a core fehérje humán májrákok kialakulásában játszott szerepét tanulmányozták. Ugyanis a HCV-1b fertozöttekben kialakult HCC-k 40%-ában a core protein elso 20 aminosavnyi szakaszán pontmutáció volt megfigyelheto, szemben az ugyancsak HCV-1b fertozött, tumormentes kontroll csoporttal, melynek tagjai között senki sem hordozott hasonló mutációt. Egy másik, a 141-es és 160-as aminosavak közötti corerégióban a HCC-sek 33%-ában találtak pontmutációt, míg a kotrollok 7%-ában. A HCC-sekben talált core-mutációk nemcsak a tumorból, de a környezo májszövetbol izolált vírusokban is ugyanúgy kimutathatóak voltak, ami arra utal, hogy ezen mutánsok már a daganat keletkezését megelozoen is jelen lehettek, így felmerül, hogy egyes core-mutált vírusváltozatok fokozott kockázatot jelenthetnek a HCC kifejlodésének szempontjából. (111) Érdekes a core protein és a HCV-asszociált B sejtes non-Hodgkin lymphomák kapcsolata is. Ezen malignus lymphoproliferatív betegség hátterében régebben feltételezik
a
HCV
immunmoduláns
hatása
(a
sejtes
immunitás
gyengülése)
következtében reaktiválódó vírusok, elsosorban az EBV (valamint a herpes 6) szerepét. Emellett a HCV fertozés egyrészt tartós immunstimulust jelent a B sejtek számára, amelynek fenntartásában a felszínükön jelen lévo CD81 is részt vehet a HCV megkötésével, másrészt autoimmun reakciókat is kivált. Így például a core proteinnel való részleges szekvencia-homológia állhat azon auto-antitestek képzodése mögött, amelyek a GOR nevu magi fehérje (egy feltételezett onkogén) ellen termelodnek. A stimulált B sejtek által termelt IgG-IgM immunkomplexek által kiváltott, a HCV fertozéshez gyakran társuló cryoglobulinaemia egyes adatok szerint szintén praedisponáló tényezoje, megelozo állapota lehet a B sejtes non-Hodgkin lymphomának, amit magyarázhat a lymphoma-képzodésben
szerepet
játszó,
anti-apoptotikus
hatású
bcl-2
onkogén
cryoglobulinaemiásokban talált fokozott expressziója. Továbbá ismert, hogy a core transzkripciós regulátorként befolyásolja a lymphomák kialakulásában szintén nagy jelentoségu c-myc onkogén expresszióját is. Mindezek arra utalna, hogy a HCV immunrendszerre gyakorolt hatásai akár lymphomák kialakulásához is vezethetnek, melynek pontos mechanizmusát azonban még nem ismerjük. (118)
Számos vizsgálat eredménye utal arra, hogy a HCV anti-apoptotikus és onkogén potenciáljának kialakításában szerepet játszik a vírusnak az interferon
48
(IFN) antivirális hatását módosító, kivédo képessége, és az ebben kulcsszerepet játszó NS5A (53). Az NS5A a HCV fehérjéi közül azért kitüntetett fontosságú a vírus-interferon kapcsolatban, mivel egy 40 aminosavból álló régiójában (ISDR – interferon sensitivity determining region, aa2209-2274) található mutációk száma összefüggést
mutatott
az
interferon
(IFN)
terápia
eredményességével.
Nevezetesen azok a betegek, akiknél a HCV ISDR régiójában négy vagy több aminosav mutálódott, érzékenyek voltak az IFN kezelésre, míg a 3 vagy kevesebb mutált aminosavval bíró ISDR a non-responderek vírusaira volt jellemzo. Azt is kimutatták, hogy az ISDR szabályozó szerepet tölthet be a vírusreplikációban, mivel komplett deléciója esetén a replikációs folyamat jelentosen kisebb effektivitással megy végbe. (53) További vizsgálatok igazolták, hogy az NS5A az ISDR-t is magában foglaló aa2209-2274-es régiójával interakcióba lép az antivirális válaszban résztvevo (a fehérjeszintézist az eIF2? foszforilálásával leállító) dsRNS-függo protein kinázzal (PKR) és képes azt inaktiválni, mivel az NS5A/PKR heterodimerek képzodése megakadályozza a PKR funkcionális homodimereinek kialakulását. Az NS5A IFN-ellenes hatásával arányosan csökken a PKR és az eIF2? foszforilációs szintje. A klinikailag megfigyelheto interferon-rezisztencia különbségek hátterében nemcsak egy szubtípus variánsainak eltéro számú ISDR mutációja, hanem az egyes szubtípusok más-más IFN-gátló képessége is állhat, mivel pl. az 1b genotípus NS5A-ja sokkal hatásosabban képes kivédeni az IFN antivirális hatását, mint az 1a genotípusé (53). Az is világossá vált azonban, hogy a gazdasejt vírusinfekció elleni mechanizmusainak modulálása a PKR-tol független módon is megvalósulhat. Ugyanis az NS5A az IFN jelátviteli útját több támadási ponton gátolni képes, de az ISDR-nek a HCV transzlációját és/vagy replikációját szabályozó hatása révén szintén modulálhatja az antivirális választ (29, 53) (2.8. ábra): A HCV az IFN jelátviteli útjának befolyásolásával képes módosítani egyes IFN-stimulált gének (ISG) expresszióját. Ezek közül egyik a virális nukleinsavak degradációjában szerepet játszó 2’-5’ oligoadenilát szintetáz (2-5OAS), melynek expresszióját elnyomják a vadtípusú NS5A-jú HCV-k, míg a mutált ISDR-t
49
tartalmazó vírusokban magasabb a szintje. A HCV-viraemiás betegek vérébol izolált perifériás mononukleáris sejtekben a 2-5OAS-nak mind az alapszintje, mind az IFN-kezelés utáni szint csökkent volt, és ez együttjárt az IFN-ra adott gyengébb in vitro válasszal. Mindazonáltal úgy tunik, hogy az IFN-kezelésre in vivo adott virológiai válasz hosszabb távon nem függ össze a 2-5OAS aktivitással, mivel a responderek és non-responderek e tekintetben nem mutattak szignifikáns különbséget. Ugyanakkor a responderek perifériás mononukleáris sejteiben a szintén IFN-indukált MxA (amely a dynamin szupercsaládba tartozó citoplazmatikus GTPáz, antivirális hatással) mRNS szintje megemelkedett az IFN-kezelés hatására, míg a non-responderek esetében nem változott. Érdekes módon maga az IFN-? receptor is egy olyan IFN-stimulált gén, melynek expresszióját képes elnyomni a HCV. (53) Az interleukin-8 (IL-8) képes gátolni az interferon antivirális hatásait, így transzkripciójának serkentése egy további olyan mód, amivel az NS5A kivédheti az IFN hatását. Az NS5A hatására megnövekedett IL-8 expressziót mutattak ki több sejtvonalon, valamint az IL-8 emelkedett szintjét találták IFN-rezisztens HCVbetegekben, ami arra utal, hogy in vivo is szerepet játszik a HCV pathogenesisében ez a mechanizmus. (53) A következo (2.8.-as) ábra az NS5A-nak az interferon jelátviteli útjára gyakorolt fontosabb ismert hatásait mutatja (53):
2.8. ábra
50
Ábramagyarázat: IFNAR1/2: interferon(IFN)-? receptor, amely a ligandkötéskor dimerizálódik, majd egy tirozinján foszforilálják a Janus kinázok; JAK: Janus kináz családba tartozó enzimek (Jak-ok ill. Tyk-ek); STAT: Signal Transducer and Activator of Transcription (jelátvivo és transzkripciós aktivátor molekulák); MAPKs: mitogén-aktivált protein kinázok? ERK (Extracelluláris szignál Regulált Kináz(ok)) és p38; ISGF3: Interferon-Stimulált Gén Faktor 3, heterotrimer, mely a p48 DNS-köto fehérjébol valamint a STAT1 és STAT2 fehérjékbol épül fel, és a magba transzlokálódva az interferon-stimulált gének (ISGs) promoter régiójában található Interferon-Stimulált Responsiv Elem-hez (ISRE) kötodik; IR/GAS: IFN regulatory factor / IFN-gamma-activated sequence (IFN-reguláló faktor / IFN-?-aktivált szekvencia); Grb2: growth-factor receptor binding protein 2 (növekedési faktor receptor-köto fehérje 2)
Az NS5A a Grb2-n keresztül gátolja a mitogén hatásokat, miközben a PI3K– AKT útvonalon át elosegíti a sejt túlélését, amely tulajdonságok fontos szerepet játszhatnak a HCV perzisztálása és pathogenesise szempontjából. Ugyanis az NS5A képes C-terminális prolin-gazdag régiója segítségével a Grb2-höz kötodni, és ezáltal meggátolni az ERK-k mitotikus stimulusok általi aktivációját. Ugyanakkor az NS5A komplexet képez a Grb2-asszociált kötofehérje 1-el (Gab1), amely kapcsolat indirekt módon, a foszfatidil-inozitol 3 kináz (PI3K) p85-ös alegységének közvetítésével jön létre. Az NS5A–p85 PI3K asszociáció eredményeként a p85 PI3K fokozottan foszforilálja extracelluláris mitotikus szignál hatására az AKT protein kinázt, és ennek hatására az AKT növeli a BAD proapoptotikus faktor foszforiláltságát, ezzel az apoptózis ellen hatva. (53,
54) A transzláció során keletkezo egyes vírusfehérjék folding-ja illetve poszttranszlácionális módosulása bizonyosan az endoplazmás retikulumban (ER) megy végbe (ld. E1/E2) (29). Az ily módon bekerülo nagy mennyiségu vírusfehérje,
51
valamint a vírus szaporodása által megzavart celluláris folyamatok ER-t befolyásoló hatásai ER stresszt váltanak ki, amely beindíthatná a sejthalál mechanizmusait. Azonban a HCV az ER stressz jelátviteli útjait úgy képes befolyásolni, hogy a sejthalál megakadályozásával biztosítja a saját túlélését. Ez két eltéro ER stressz válasz-mechanizmus révén valósul meg, mégpedig az EOR (endoplasmic reticulum overload response – ER túltöltési válasz) út és az UPR (unfolding protein response – hiányosan „összehajtogatódott” fehérjék felszaporodására adott válasz) út triggerelésével. Az EOR-t az NS5A stimulálja; hatására Ca2+ áramlik ki az endoplazmás
retikulumból,
és
az
így
megemelkedett
intracelluláris
Ca2+ szint
mitochondriális eredetu reaktív oxigéngyökök keletkezésével JAK aktivációhoz és ezáltal az NF-?B és a STAT3 aktivációjához vezet, amihez hozzájárul az NF-?B-t gátló I?B? degradációjának serkentése is. Az UPR utat a HCV E2 fehérjéje indukálja. Ezen mechanizmus lényege, hogy proteolitikus vágás hatására az ATF6-ból (activating transcription factor 6) egy transzkripcionálisan aktív N-terminális domén, az ATF6? szabadul fel, és transzlokálódik a magba, ahol indukálja az ER stressz reszponzív elemeket (ERSE) tatalmazó gének transzkripcióját. (170) Az NS4A és NS4B képes interakcióba lépni az ATF6? -val illetve az ATF6? -val (ld. 2.2.1.6.) (165) –lehetséges, hogy ez áll annak hátterében, hogy egy E2-t nem tartalmazó HCV replikon is képes volt beindítani az UPR utat (170). Mindkét ER-stressz válasz-mechanizmus aktivációja
végso soron antiapoptotikus hatású, és így a HCV perzisztálását, valamint potenciálisan a sejt malignus transzformációját segíti elo (170). Az NS5A antiapoptotikus és onkogén tulajdonságai mögött további mechanizmusok is állhatnak: A PKR gátlásán keresztül képes interferálni a dsRNS-függo apoptózis jelátviteli útjával és az NIH3T3 sejteket transzformálja, amely onkogén potenciál részben a PKR-gátló képességével függ össze (53). A TNF-? –indukált apoptózist HEK 293 sejtekben a TNF receptor-asszociált faktor 2 (TRAF2) útján történo NF-?B aktiváció gátlásával (119), illetve HepG2 sejtekben a caspase 3 aktivációjának blokkolásával megakadályozza (53), és ezeket az eredményeket megerosítették azon NS5A transzgén egér kísérletek is, amelyekben az NS5A inhibitálta a TNF-? által kiváltott apoptosist a TRADD (TNFreceptor 1 asszociált death (=halál) domén fehérje) megkötésével és a TRADDmediált NF-?B aktiváció gátlásával (ugyanakkor a Fas-mediált sejthalált nem befolyásolta) (95). Mindazonáltal egyes vizsgálatokban ezekkel ellentétes eredmények
52
is születtek: HeLa sejtekben az NS5A nem gátolta a dsRNS-függo apoptózist, továbbá az NS5A konstitutív expressziója egyes osteosarcoma és máj eredetu sejtvonalakban nem növelte, hanem csökkentette a sejtproliferációt és a kolónia-formáló képességet, valamint cytopathiás hatása volt. (53) Ezen ellentmondó eredményeket magyarázhatják a különféle sejttípusok egymástól (és az in vivo humán májsejttol!) eltéro tulajdonságai – erre utal pl. hogy a HCV-nek a kísérletes eredménnyel ellentétben in vivo csak elhanyagolható cytopathiás hatása van. Ez is felhívja arra a figyelmet, hogy valamely faktor mindig egy komplex rendszerben muködik; onnan kiragadva és egy más rendszerbe helyezve esetleg teljesen eltéro hatást fejt ki. A különféle kísérletes és
humán megfigyelések összességébol azonban egyre inkább az bontakozik ki, hogy a core-hoz hasonlóan az NS5A is jelentos szerepet játszhat a HCV onkogén tulajdonságainak kialakításában. Talán az egyik legfontosabbnak tunik ebben a vonatkozásban, hogy a corehoz hasonlóan képes befolyásolni a sejtproliferációt és apoptózist felügyelo egyik központi rendszert, a p53 illetve az általa aktivált p21/WAF1 ellenorzése alatt álló mechanizmust. (84, 94, 124) Az NS5A ugyanis heterodimert képez a p53-al, valamint a TBP-vel (TATA box binding protein), mely utóbbi a celluláris transzkripció iniciációjának egyik kulcsfaktora. A p53- és TBP-kötés révén blokkolódik a p53-TBP kapcsolat, így gátolva a p53 ezen úton történo befolyását a celluláris transzkripcióra, továbbá a TBP inaktivációja
szerepet
játszhat
abban
a
folyamatban,
melynek
során
a
vírus
átprogramozza a sejtet a celluláris fehérjék képzodésével interferálva a virális proteinek termelésére. Emellett az NS5A a p53 N-terminálisára kapcsolódva elfoglalja az ERCC3 (excision repair cross complementing factor 3) kötodési helyét. Az ERCC3 egy ATP-függo DNS helikáz, amelyen keresztül a p53 képes befolyásolni a transzkripciót, illetve a DNSkárosodások kivédésében kulcsszerepet játszó transzkripció-kapcsolt DNS-repair-t, ám az NS5A bekötodésével a p53 ezen funkciói romlanak, gátlódnak. Normál muködése során a p53 modulálja celluláris gének átíródását, kapcsolatba lépve olyan általános transzkripciós faktorokkal (GTFs –general transcriptional factors), mint a fentebb említett TBP és a TFIIH (transzkripciós faktor II H) komplex részét képezo ERCC3, továbbá a hTAFII40 és hTAFII60 (humán TBP-asszociált faktor II 40 és 60). A transzkripciós faktorok aktivitását pedig celluláris és virális transzaktivátor fehérjék befolyásolhatják – mint
a
2.2.1.7.
fejezetben
említésre
került,
magának
az
NS5A-nak
is
van
transzkripcionális transzaktivátor hatása. (124) Az NS5A képes közvetlenül kapcsolatba lépni további transzkripciós faktorokkal, például a hTAFII32-vel, amely a TFIID komplex része, és in vivo a p53 esszenciális coaktivátora (84), valamint az ATPáz aktivitású
53
SRCAP-vel (SRCAP: Snf2-related CBP activator protein;
CBP: cyclic AMP response-
element binding protein (CREB)-binding protein) (48). Az SRCAP önmagában ill. a CBP-n keresztül képes serkenteni a transzkripciót, ugyanakkor erosíti az NS5A azon hatását, amely – valószínuleg a p53-on keresztül - a p21/WAF1 promoter gátlásában nyilvánul meg (94, 48, 70)
Az NS5A-ról fenti adatok alapján elmondható, hogy p53-, TBP- és más transzkripciós faktorokat köto képessége révén valószínuleg egyes celluláris transzaktivátorok illetve transzkripciós faktorok kapcsolatait, valamint ez utóbbiak DNS-el
alkotott
komplexeinek
kialakulását
gátolja,
mely
tulajdonságok
hozzájárulhatnak onkogén potenciáljához.
2.5. A HEPATITIS C HUMÁN GENETIKAI VONATKOZÁSAI A hepatitis C kialakulását, lefolyását nemcsak a vírus, hanem a gazdaszervezet genetikai változatossága is befolyásolhatja. Számos vizsgálat próbálta tisztázni a hepatitis C és egyes HLA allélok elofordulása közötti összefüggéseket is. Ezen tanulmányok a HCV fertozés három fo vonatkozásában szolgáltattak adatokat: ezek a clearence (a vírus eliminálása), a betegség progressziója, továbbá a fertozésre való érzékenység (hajlam) voltak. A HLA II-es allélok közül egybehangzóan igazolták a DQB1*0301 pozitív asszociációját a clearenceel, de egyes eredmények a DRB1*04, a DQA1*03, a DRB1*1101 és a DRB1*11 hasonló szerepére is utaltak. Negatív asszociáció a DQB1*0302 esetében volt megfigyelheto. A lassabb progresszióval társultként azonosították a DRB1*1302-t, továbbá a clearence-el szintén asszociált DRB1*1101 a progresszió ellen is protektív faktornak tunik, csakúgy, mint a DQB1*0301-et is tartalmazó DR5. A krónikus HCV fokozottabb progresszióját észlelték a DQB1*0401-et és DQB1*0405-öt, valamint a HLA I-es családba tartozó HLA B54-et, illetve ezek kombinációit hordozók esetén. A HCV fertozésre hajlamosító illetve az ellen védo genetikai tényezok után kutatva – bár számos ellentmondó eredmény született – a DQA1*03-at (mely a clearence-el is pozitívan asszociált) és a DRB1*1302-t (mely a lassabb progresszióval is társult) azonosították mint a fertozéssel szemben protektív faktorokat, csakúgy mint a DRB1*1601-DQB1*0502 haplotípust. A DR4 és DQB1*0401 (melyek a gyorsabb progresszióval is társultak) a HCV fertozöttekben gyakrabban voltak megtalálhatóak, ami a fertozésre érzékenyíto szerepükre utalhat. (161) A hazai szerzok
közül Pár és munkatársai kimutatták, hogy a HLA B8 és a DR3 gyakoribb krónikus HCV fertozöttekben, és megerosítették a DR5 protektív szerepére vonatkozó
54
korábbi eredményeket. (118) A genetikai különbségek hatására mutat rá az is, hogy a kaukázusi rasszhoz viszonyítva az afro-amerikai populációhoz tartozó krónikus HCV fertozöttekben szignifikánsan magasabb azok aránya, akikben markáns, specifikus CD4+ T-sejt válasz alakul ki a vírus ellen (mégha ezek a limfociták bizonyos antivirális funkciók – így az IFN-? termelés – tekintetében károsodottak is), és az afro-amerikaiakban a betegség – legalábbis klinikai paramétereit tekintve – kevésbé súlyos képet mutat (154). Ennek hátterében az állhat, hogy egyes HLA II antigének rassztól függoen eltéroen befolyásolhatják a CD4+ Tsejt válasz erosségét, és ezáltal a clearence-t: afro-amerikaiakban a HLA DQB1*301 erosebben asszociált a clearence-el, míg etnikailag kevert populációban csak gyenge összefüggés volt kimutatható. Fehérekben viszont a clearence a DRB1*0101-DQB1*0501 haplotípussal társult, a perzisztencia pedig a DRB1*0301-DQB1*0201-el. (162) A HCV betegséget befolyásoló további genetikai tényezo lehet a TNF-? gén, minthogy a citotoxikus ilmfociták által termelt TNF-? szintje emelkedett a hepatitises májban, és szerepet játszhat a betegség pathogenesisében (ld. 2.4.-es fejezet). Ezt alátámasztotta, hogy a TNF-? gén –238A promoter-variánsa szignifikáns asszociációt mutatott a perzisztens HCV fertozéssel. (161)
55
3.
A HEPATITIS C VÍRUS KIMUTATÁSÁT SZOLGÁLÓ MÓDSZEREK
3.1. ANTIGÉN-ANTITEST REAKCIÓN ALAPULÓ MÓDSZEREK 3.1.1. IN VITRO (SZEROLÓGIAI) MÓDSZEREK: EIA/ELISA ÉS RIBA TECHNIKA A szerológiai módszerek a humoralis immunitás HCV infekcióra adott válaszaként képzodo antitesteket mutatják ki valamely testváladékból vagy testnedvbol; általában szérumból. A mérésre legyakrabban használt technika az EIA (enzyme immunoassay), más néven ELISA (enzyme-linked immunosorbant assay). Kiegészíto tesztként használják a nagyobb specificitású recombinant immunoblot assay-t (RIBA). Ennek nitrocellulóz membránjára az ELISA esetében használt antigéneken túl superoxid dismutase-t (SOD) is felvisznek. A SOD ahhoz szükséges, hogy ki lehessen mutatni a mintában esetleg jelen lévo éleszto-ellenes antitesteket, amelyek a rekombináns technikával élesztobol eloállított HCV-antigénekhez nem-HCV specifikus ellenanyagként kötodve álpozitív eredményt adhatnak. (117, 86,
43, 90) Az anti-HCV IgG vagy IgM típusú antitest. Az ablakperiódus alatt (amely a fertozés kezdetétol a detektálható mennyiségu antitest megjelenéséig tart) a szerológiai próbák negatívak. Az elso generációs EIA/ELISA módszer az NS4A régiónak
megfelelo
C100-3
rekombináns
fehérjét
használta
antigénként.
Az
ablakperiódus itt kb. 6 hónapnyi volt, és különféle keresztreakciók miatt álpozitív eredmény is gyakran fordult elo (ennek hátterében gyakran autoimmun hepatitis áll). A második generációs tesztek a C100-3 mellett a core-nak megfelelo C22-3-at és az NS3/NS4A-t
átfogó
C200-at
tartalmazzák
epitópként,
ezáltal
jelentosen
jobb
szenzitivitással és specificitással bírnak, az ablakperiódus pedig átlagosan 11-12 hétre rövidült. A harmadik generációs teszteket az NS5-nek megfelelo rekombináns fehérjével is kiegészítették, valamint megváltoztatták a core-t és az NS3-at reprezentáló epitópokat. Ennek hatására a szenzitivitás gyengén emelkedett, és az ablakperiódus 7-8 hétre csökkent, de ugyanakkor gyengébb specificitással kell számolni. Jelenleg a rutin diagnosztikában II. és III. generációs EIA/ELISA-t használnak. Megjelentek negyedik generációs tesztek is, azonban ezek nem terjedtek még el szélesköruen. Jellemzojük a korrekt specificitás mellett elért magas szenzitivitás. Elsosorban a rutin EIA/ELISA tesztekkel nem meghatározható esetek diagnosztikájában használatosak (hazánkban
56
Gervain Judit dr-no /székesfehérvári Szent György Kórház/ folytatott vele vizsgálatokat). Mindazonáltal
érdemes
megjegyezni,
hogy
álnegativitás minden szerológiai
vizsgálatnál elofordulhat, amennyiben immunszupprimált vagy hemodializált, vesetranszplantált a beteg illetve ha az ablakperióduson belül történik a vizsgálat. (117, 86, 43) Az álpozitív (jellemzoen valamilyen autoimmun betegséghez, leggyakrabban autoimmun hepatitishez kapcsolódó) eredmények kiszurésére, tehát a magasabb specificitás érdekében alkalmazható az EIA/ELISA vizsgálatok konfirmációs tesztjeként a fentebb említett immunoblot alapú RIBA módszer, melyeknek szintén több generációját fejlesztették már ki a fentiekhez hasonló alapon. A felhasznált epitópokban vannak kisebb eltérések az EIA/ELISA-nál megismertektol: a C200 (NS3/NS4A) helyett a C33c (NS3) és a C100-3 (NS4A) kombinációját valamint egy további NS4A epitópot, az 5-1-1-et tartalmazzák, továbbá természetesen az aspecifikus antitesteket detektáló SOD-t. A RIBA esetében HCV pozitivitásként értékelheto, ha a humán antitestek ketto vagy több, a HCV genom eltéro régióiból származó epitóppal szemben mutatnak reaktivitást, miközben a SOD-al nem reagálnak. Ha csak egy HCV antigénnel szemben mutatnak reaktivitást illetve ha többel, de mellette a SOD-al is, akkor az negatívként értékelendo. (90, 117,
86, 43)
3.1.2. IN SITU MÓDSZER: IMMUNHISTOCHEMIA HCV valamely fehérjéjének (és így a vírus) szöveti kimutatására szolgáló detektáló módszer. Speciális változatával, ún. immun-arany módszerrel korábban az elsok között sikerült a HCV-t kimutatnunk formalin fixált, paraffinba ágyazott májbiopsziás anyagból, core- illetve többféle NS4-elleni primer antitest segítségével (HCV NS4: DBA C 288 (IgG1) (Diagnostic Brokers Associated; Milan, Italy) valamint ? -HCV 11-055 (IgG1) és ? -HCV 11-056 (IgG2b) (Argene - Biosoft; Varilhes, France) monoclonalis egér antitestek;
HCV core protein: MAb 598 PF (IgG1)
(Labometrics s.r.l.; Milan, Italy) monoclonalis egér antitest; arannyal jelölt szekunder antitest, ezüstözéses erosítésu elohívás) (91). A core és NS4 fehérjék – mások
eredményeivel összhangban – citoplazmatikus lokalizációt mutattak (3.1. ábra). Ma már kereskedelmi forgalomban kapható antitestek is rendelkezésre állnak; mind a BioGenex, mind a Novocastra cég immunizáló antigénként
57
recombináns NS3-at használva egér monoclonalis antitestet állít elo. Mindazonáltal megjegyzendo, hogy míg a BioGenex magi lokalizációjú jelet ad meg pozitivitásként, addig a Novocastra citoplazmatikus festodést tart specifikusnak. (http://www.biogenex.com/pdf/932-378m.pdf ; http://www.novocastra.co.uk/data/mv-a/hcvns3.pdf)
Mindkét antitest használható a gyári információk szerint formalin-fixált, paraffinba ágyazott szövetbol készült metszeten, azonban a BioGenex antitest esetében ellentmondásosak a tapasztalatok, minthogy egyes tanulmányok szerint kiválóan használhatónak bizonyult, míg más közleményben nem specifikusnak találták az ezzel kapott eredményeket. Fagyasztott metszeten viszont mindkét fajta antitestet megbízhatóan használhatónak tartják. (64) Ez is azt mutatja, hogy az immunhistochemia felhasználási területe a HCV esetében ma még inkább a kutatás, amit az is alátámaszt, hogy a fenti gyártók sem diagnosztikai antitestként forgalmazzák ezen termékeiket. Kiegészíto módszerként azonban a HCV antigénantitest immunkomplexek által okozott betegségek –így elsosorban glomerulonephritisek – pathologiai diagnosztikájában helyet kaphat az immunhistochemia, mivel ezen immunkomplexek nem feltétlenül komplett virionokat tartalmaznak, így a vírusfehérjék kimutatása célravezetobb lehet, mint a nukleinsav-detektálás. Azonkívül az immunhistochemia egyszerubben kivitelezheto, mint az in situ hybridizáció vagy az in situ PCR, így ha a HCV szöveti lokalizálása a cél, akkor elso választandó módszerként ajánlható.
58
3.1. ábra
A HCV core protein kimutatása immun-arany módszerrel májban (Mab 598 PF primer, arannyal jelölt szekunder antitest, ezüst elohívás; a barnás színu szemcsék jelzik a pozitivitást /nyíl/, 500x)
59
3.2. NUKLEINSAV KIMUTATÁSON ALAPULÓ MÓDSZEREK A sejtbiológiai és virológiai folyamatok teljesebb megértéséhez a celluláris és virális géneknek és expressziójuknak detektálása elengedhetetlen, és esetenként a sejtek morfológiájával összefüggo tanulmányozásuk is szükséges. Specifikus nukleinsav-szakaszok kimutatására jelenleg sokféle módszer áll rendelkezésre, melyek közül a legelterjedtebb és saját vizsgálatainknál is használt polimeráz láncreakció (= polymerase chain reaction /PCR/), illetve klinikai jelentosége miatt az elágazódó (branched) DNS próba hybridizáción alapuló Quantiplex módszer és a szöveti detektálásban nagy jelentoséggel bíró in situ hybridizáció kerül tárgyalásra az alábbiakban. A PCR lényege, hogy mesterségesen felszaporítunk (amplifikálunk) egy általunk kiválasztott, meghatározott nukleinsav szakaszt (amennyiben az a mintában jelen van). A folyamat láncreakciószeruen zajlik, ugyanis minden ciklusban megduplázódik az elozo ciklus végén jelen levo kópiaszám. Folyadék fázisú PCR-nál a nukleinsavakat ki kell vonni a szövetmintából és az amplifikált anyag detektálása agaróz gél-elektroforézissel, vagy a folyamat során keletkezo DNS szálakba beépített jelzomolekulához (biotin vagy digoxigenin) kapcsolt enzim által katalizált színreakcióval történik. Ugyanakkor az in situ hybridizációs (ISH) módszerek lehetové
teszik
a
szöveti
lokalizációt
és
a
legtöbb
alkalmazáshoz
elegendo
érzékenységuek. Ezen módszer kivitelezése azonban nagy technikai felkészültséget igényel, és kis mennyiségu célszekvencia esetén a szenzitivitása sem mindig elegendo. Az in situ PCR egyesíti a PCR és az ISH elonyeit, így a genetikai információt vizualizálva igen kis nukleinsav-mennyiségek specifikus kimutatását is lehetové teszi rendkívüli érzékenységgel, és emellett a sejtek integritása és a szöveti szerkezet megorzött marad, így a keresett nukleinsav szakasz lokalizálható is lesz. A reverz (RT) in situ PCR lehetové teszi alacsony mennyiségu emberi vagy viralis RNS gyors és rutinszeru kimutatását sejtekbol, szövetekbol. Az RNS-t eloször DNS-é (copy DNS; cDNS) írjuk át megfelelo enzim segítségével (reverz transzkripció). Ezen DNS egy szakaszát sokszorozzuk meg az elozoekben leírtakkal megegyezo módon. (109, 103, 82)
A HCV szérumszintjének meghatározására kétféle módszer használatos: a target-amplifikáción alapuló kvantitatív PCR (kvantitatív Amplicor), és a szignálamplifikáció alapú bDNS hybridizációs (Quantiplex) technológia. A bDNS módszer esetében a HCV RNS a valódi fiziológiás koncentrációján kerül detektálásra, ami ugyan kisebb detektálhatósági tartományt tesz lehetové, de
60
nagyobb reprodukálhatóságot biztosít, kevésbé érzékeny a kontaminációra és nagyobb linearitású még magasabb HCV RNS-szintek esetén is. A kvantitatív PCR viszont érzékenyebb, és jóval szélesebb tartományban képes a viraemia szintjének kimutatására. (131) 3.2.1. IN VITRO MÓDSZEREK 3.2.1.1. JEL-AMPLIFIKÁCIÓS MÓDSZER: QUANTIPLEX A Quantiplex eljárás a célszekvenciához specifikusan kötodo, másik végükön pedig elágazódó DNS próbák „ágaira” sztöchiometrikusan kapcsolódó, enzimmel jelölt próbák enzimaktivitása által kiváltott kemilumineszcens jelenség mérésén alapul. Itt tehát nem a keresett szekvenciát sokszorozzuk fel, hanem az ahhoz hybridizáló specifikus próbákból felépülo komplex jelölésével kialakuló arányos jelerosítés a detektálás lényege. A folyamatot az ELISA eljárásnál is használt microwell plate-en (mikrotiteredény) végzik, melyek mikrovályúiba „elfogópróbák” (szerepüket ld. lentebb) vannak rögzítve. Elso lépésként a mikrovályúkba helyezett vérplazma- vagy szérummintákban az RNáz aktivitás blokkolása, majd a HCV RNS feltárása történik megfelelo reagensek segítségével (3.2. ábra: 1-es lépés). Ezután az úgynevezett célpróbák (C) hozzáadása következik
(2-es
lépés),
melyek
egyik
vége
specifikusan
kötodik
a
vírus
célszekvenciájához, míg a másik vég az edény falához mint szilárd fázishoz rögzített elfogópróbával (E) hybridizál, vagy szabadon marad. Az elfogópróba-célpróba hybridek lehorgonyozzák a virális RNS-t, a szabadon maradt végu célpróbák pedig a következo (3as) lépésben a rendszerhez adott amplifier (a fa ágaihoz hasonlóan elágazódó láncú /branched/ DNS) végével hybridizálnak. A továbbiakban alkalikus foszfatázzal konjugált próbát (L) kötnek az amplifier ágaihoz (4-es lépés), ami a hozzáadott dioxetane-nal (5-ös lépés) kemilumineszcens reakciót katalizál. A kemilumineszcencia fénykibocsájtása
arányos a vizsgált mintában jelen lévo virális RNS mennyiségével, mivel a különféle próbák hybridizációja minden lépésben szigorúan meghatározott arányok szerint történik. Ezért a bDNS technika nagyobb linearitást biztosít (még magasabb HCV RNS-szintek esetén is) a célszekvencia felsokszorozásán alapuló PCR módszernél, továbbá nagyobb a reprodukálhatósága valamint kevésbé
61
érzékeny a kontaminációra, hiszen a PCR-al szemben itt az amplifikáció effektivitása gyakorlatilag állandó, és a rendszerbe bekerült „szennyezo” szekvenciák nem amplifikálódhatnak. Ugyanakkor azonban az érzékenysége kisebb, mivel a jelet nem lehet olyan nagymértékben felerosíteni, mint amire a PCR szekvencia-sokszorozó képessége lehetoséget ad, továbbá alacsonyabb a rendszer telítodési koncentrációja is, és ezek miatt szukebb tartományban képes csak detektálásra. (131, 60)
3.2. ábra
A Quantiplex HCV teszt folyamatának sémás bemutatása Horányi M. (60) alapján
3.2.1.2. TARGET-AMPLIFIKÁCIÓS MÓDSZEREK: FOLYADÉK FÁZISÚ PCR (AMPLICOR) ÉS REAL-TIME PCR A folyadék fázisú PCR módszerek közül a szélesköruen elterjedt és általunk is használt használt Roche Amplicor HCV Test PCR metodika részfolyamatai kerülnek ismertetésre az alábbiakban, melyhez az Amplicor (manuális) teszt gyári
62
leírása és a Semmelweis Egyetem Transzplantációs és Sebészeti Klinikájának munkacsoportjának
a
Roche
(Magyarország)
Kft.
Diagnosztikai
Divízió
munkatársával közös, 2001-ben az Orvosi Hetilapban megjelent közleménye szolgált alapul, mely utóbbi az automatával (Cobas Amplicor) végzett HCV diagnosztika hazai tapasztalatairól ad számot (134). Az Amplicor HCV tesztet úgy tervezték, hogy képes legyen kimutatni valamennyi ismert HCV genotíp ust. Ezért a HCV leginkább konzervált régiójának, az 5’ UTR egy szakaszának amplifikálásán alapul. (20, 113) Ehhez a KY78 (downstream) és KY80 (upstream) jelzésu primereket használja, amelyek egy 244 nukleotid hosszúságú 5’ UTR szakaszt határoznak meg (a termék nukleotid szekvenciáját és rajta a primereknek megfelelo szakaszokat, valamint a kit pontos összetételét ld. a mellékletben) (179). A metodika a következo részmunkafolyamatokra osztható: 1. Mintagyujtés: A mérést szérumból, ill. plazmából végezhetjük. A savót nemalvadásgátolt, a plazmát ACD vagy EDTA antikoagulánst tartalmazó vérvételi csobe levett vérbol gyujthetjük. Heparinizált plazma, vagy hemolizált szérum, illetve plazma nem alkalmas a mérésre. A levételt követo 6 órán belül a csöveket le kell centrifugálni szobahomérsékleten (1500 rpm, 20 perc). Ezután a felülúszót steril 1,5 vagy 2 ml-es csavaros fedelu (Sarstedt 72.692.105 ill. 72.693.005 típusú) csövekbe pipettázva, 2–8 °Con tárolhatók a minták, maximum 72 órán át. Lefagyasztva (-20–80 °C) tovább is eltarthatóak, ha szükséges. 2. Vírusszeparálás: A vírusszeparálás a steril 1,5 v. 2 ml-es mikrocsövekben zajlik. A vírust Lysis Reagent-el izoláljuk a szérumból, amely a chaotrop tulajdonságú (nagy ionerosségu)
guanidin
tiocianát
tartalmánál
fogva
képes
a
vírus-particulumokat
alkotórészeire bontani, és a virális RNS-t kicsapni. Ezt követoen az RNS-t alkohollal tovább precipitáljuk, majd a felülúszó eltávolítása után speciális (alacsony ionerosségu) pufferel visszük oldatba. Mivel a minták tartalmazhatnak a PCR folyamatot gátló inhibitorokat, valamint az extrakció esetében is adódhatnak természetes illetve hibákból adódó különbségek a hatékonyságban, ezért a Lysis Reagent tartalmaz egy, a reakció belso kontrolljául szolgáló, adott koncentrációjú RNS-t (HCV Internal Control /IC/ RNA). Az IC RNS-en a primereknek (=a keresett /amplifikálandó/ szekvencia két végét kijelölo oligonukleotid próbák) megfelelo régiók azonosak az amplifikálandó HCV szakaszéval, a köztük lévo szekvencia hossza és bázis-összetétele pedig hasonló ahhoz, de random
63
nukleotid-sorrenddel bír, és tartalmaz egy egyedi próba-köto régiót is, amellyel el lehet különíteni a HCV target-szekvenciától. Ez az IC a mintákhoz adva mind az extrakció, mind az amplifikáció hatékonyságának ellenorzésére alkalmas. A vírusizolálási procedúra fokozott precizitást, sterilitást (szeparált, steril munkatér; filteres, steril pipettahegyek; steril eszközök, megfelelo kesztyu stb.) igényel, és kb. 2 órát vesz igénybe. 3. Reverz transzkripció (RT) és polimerizáció (amplifikáció; Polimerase Chain Reaction /PCR/): A HCV genomja RNS, amelyet a termostabil Thermus thermophilus (rTth) DNS-polimeráz enzim segítségével DNS-sé (copy /=másolat/ DNS, cDNS) írunk át (reverz transzkripció). Az rTth ugyanis mangán ionok e j lenlétében (60-70 ?C közötti homérsékleten)
reverz
transzkriptázként
képes
muködni,
megfelelo
magnézium-
koncentráció mellett pedig polimeráz aktivitással (is) bír. (104) Ez lehetové teszi, hogy ugyanazon reakcióelegyben menjen végbe a cDNS-é átírás és az amplifikáció. A reverz transzkripciós lépésre azért van szükség, mert az RNS nem hostabil molekula, így PCRreakcióra nem alkalmas, az átírt DNS-szakasz viszont, ugyanúgy, mint a natív DNS ellenáll a polimeráz láncreakció egyes fázisainak eltéro homérséklet-igényébol adódó szélsoséges hougrásoknak. A reverz transzkripció során az eredeti HCV RNS szakaszról szigorúan komplementer DNS-átirat készül, mely ugyanúgy alkalmas a HCV genom azonosítására, mint RNS eredetije. A reakcióelegy tartalmazza a primereket (=a keresett /amplifikálandó/ szekvencia két végét kijelölo oligonukleotid próbák), melyek közül a downstream vagy antiszenz primer (KY78) biotinnal jelölt az 5’ végén (a KY80 nem). A reakcióelegyhez hozzáadjuk az elokészített mintákat, majd ezen oldat 50 ?C-ra melegítésével (5 min) és 62 ?C-on tartásával (30 min) a downstream (KY78) primer bekötodik
a
HCV
IC
RNS-hez
illetve
az
esetlegesen
jelen
lévo,
a
vizsgált
plazmából/szérumból származó HCV RNS-hez, majd az rTth innen kiindulva elkészíti (az elegyben jelenlévo nukleotidokból felépítve) a cDNS-t. Az elkészült RNS–cDNS hibrid kettos szál 90 °C-ra felmelegítve szétnyílik, az RNS degradálódik, a DNS-átirat pedig 58°C-ra (kézi) ill. 60 °C-ra(Cobas) visszahutve alkalmas targetje lesz a reakcióelegyben lévo upstream (KY80) primer bekötodésének. Ezt követoen, a még mindig jelenlévo rTth enzim (az oldat megfelelo magnézium koncentrációjának köszönhetoen) polimerázként muködve a jelen lévo nukleotidokból megépíti a DNS-szakasz komplementerét, amely ugyanúgy hordozza a HCV keresett szakaszának specifikus szekvenciáját, mint az eredeti RNS. Az elso PCR-ciklus végére tehát minden egyes RNS-szekvenciából két, egymással komplementer DNS szál szintetizálódott, mely hibridizált kettos szál formájában van jelen. Ha ezeket a szálakat (amplikon) 90 °C-ra (vagy a fölé) melegítve denaturáljuk, akkor a kettos szál kettényílik, így az elozo ciklushoz képest dupla mennyiségu egyszálú nukleinsav lesz jelen, és az elegyet 58°C-ra (kézi) ill. 60 °C-ra (Cobas) visszahutve megismételheto a DNS-szintézis a
64
fentiek szerint, de most már egyszerre két szálon. Ebbol következoen a ciklusokat ismételve az elkészült mesterséges másolatok száma a 2 hatványaival növekszik. 37 ciklust használunk, melynek végén a kimutatáshoz elegendo másolat készül. A PCRreakció specifikusan a primerek által kijelölt régióban történik meg, más szekvenciák nem szaporodnak fel. A megfelelo primerek és a hibridizációs próba kiválasztása dönto fontosságú a teszt valamennyi genotípusra hasonló érzékenysége, illetve specificitása szempontjából. Az Amplicor HCV teszt olyan primereket tartalmaz, amelyek hybridizálnak minden ismert HCV genotípus szekvenciájával, ezért a HCV variabilitásból adódó hibaforrások kizárhatóak. A kontamináció kizárására a teszt AmpErase (uracil-N-glikoziláz) enzimet, valamint dTTP nukleotid helyett helyett dUTP-t tartalmaz. Mivel a dUTP a természetes DNS-ben (és RNS-ben) nem fordul elo, ezért a mintában dUTP tartalmú DNS csak az általunk korábban végzett PCR-ból származó szennyezodésként (kontaminációként) fordulhat
elo. Az AmpErase lebontja az ilyen (dUTP tartalmú) DNS-t, ezáltal
megakadályozva, hogy fals pozitivitásként detektáljuk. Minthogy az enzim 55 °C felett inaktív, ezért a ciklusok során keletkezo dUTP tartalmú amplikont nem bontja le, és az utolsó PCR-ciklust követoen a denaturáló oldat (Denaturation Solution) hozzáadásával a maradék enzim kicsapódik, így lehulve sem képes lebontani az újonnan keletkezett dUTP tartalmú DNS-t. 4. Hibridizációs reakció: Az utolsó PCR-ciklust követoen a Denaturation Solution hatására az amplikon is denaturálódik és egyszálú DNS formájában lesz jelen. Ezután specifikus
szekvenciájú
hibridizációs
próbához
kötjük.
A
próba
szekvenciája
kulcsfontosságú, a nem specifikus kötodések (fals pozitív eredmények) elkerülése érdekében. A “kézi” kivitelezésu Amplicor teszt esetében egy mikrotiter edény vályúinak falához vannak kötve az amplifikált HCV szekvenciára specifikus KY150 és a szintén felsokszorozott
IC
RNS
szakasz
próba-köto régiójához hybridizáló SK535 jelu
oligonukleotid próbák. Ezért a hozzájuk asszociáló HCV és IC RNS eredetu amplikonok az ezt követo mosási lépésben az edényhez rögzítve maradnak, míg a reakcióelegy egyéb összetevoi (maradék primerek, nukleotidok, enzimek, egyéb szekvenciák) kimosásra kerülnek. A Cobas Amplicor automatán végzett HCV-tesztben a specifikus próbák mágneses partikulumok felületére vannak rögzítve, tehát a hozzáhibridizált, amplifikált minta „mágnesezheto”, mechanikusan szeparálható a próbához nem kötött reakciókomponensektol. Az automatán mágneses szeparációs és mosási lépések után a detektáló csoben csak a PCR reakcióval felszaporított szekvenciamásolatok maradnak. Az automata az RT PCR, a denaturáló, a hibridizációs, mosási és kimutatási lépéseket automatikusan végzi.
65
5. Detektálás (az amplifikált szakasz kimutatása színreakcióval): A hibridizációs próbán keresztül a mikrotiter edény falához vagy a mikrogyöngyökhöz kötött PCRtermékekbe
beépült
KY78-as
vége
biotinnal
jelölt,
amihez
avidinon
keresztül
tormaperoxidáz enzimet (Horse Radish Peroxidase /HRP/) kötünk, majd a felesleget kimossuk. Az enzim aktivitása a bekötheto enzim mennyiségével, tehát a jelenlevo PCRtermékek számával arányos, amely a hozzáadott és a HRP által oxidált szubsztrát (TMB: 3,3',5,5'-tetrametilbenzidin)
színváltozásán
alapuló
kolorimetriás
reakcióval
kerül
kimutatásra. A reakciót egy gyenge savas mosással állítjuk le, majd az absorbanciát 450 nm-en mérjük.
66
3.2. ábra
Az Amplicor HCV teszt folyamatának sémás bemutatása Horányi M. (60) alapján
A HCV infekció igazolása (kvalitatív PCR) után a vírus mennyiségét is meg tudjuk mérni kvantitatív PCR, vagyis a HCV MONITORTM teszt elvégzésével. A vírusszint meghatározása ma már szerves része a HCV betegség diagnosztikájának; a HCV
titer
mérése
lehetoséget
ad
az
antivirális
kezelések
(interferon/ribavirin)
hatékonyságának illetve a májtranszplantációt követo HCV rekurrencia monitorozására. A víruskoncentráció rendszeres mérésével korán megjósolhatjuk a terápia hatásosságát. A
mérés elve ugyanaz, mint a kvalitatív HCV PCR metodikáé, de sokkal precízebb vírusszeparálást igényel. A diagnosztika speciális szempontjait tekintve megállapítható, hogy az Amplicor módszer számos elonnyel bír mind a szerológiai és bDNS módszerrel, mind az egyedileg beállított, hagyományos PCR-al szemben: a) szenzitívebb a szerológiai és a bDNS módszereknél, mivel a (nagyságrendekkel) felsokszorozott célszekvencia könnyen detektálható (a nagy szenzitivitás a gyakran alacsony szintu viraemiával járó krónikus hepatitis C diagnosztikájában kitüntetett jelentoséggel bír). b) A HCV minden genotípusát egyaránt nagy hatásfokkal képes amplifikálni,
(olyan
primert
használ,
amelynek
célszekvenciája
minden
genotípusban megegyezo). c) Az eloírt kritériumok betartása és a többszörös kontroll-rendszer biztosítja az álpozitív vagy álnegatív eredmények elofordulásának minimalizálását. Az álpozitív eredmény megakadályozására hozzáadott AmpErase enzim a levegobol vagy kesztyurol bekerült nukleinsavakat, illetve az esetleges korábbi bekötodésbol származó szennyezoket szelektíven bontja. Az álnegatív eredmény elofordulásának valószínuségét csökkenti, hogy a betegmintába belemért ismert kópiaszámú Internal Control (IC) RNS jelzi, ha a virális target-szekvencia amplifikációja gátolt volt a PCR során. Az IC használata arról is tájékoztat, ha a vírusszeparáláskor a vírus RNS-t elvesztettük. Egy PCR sorozathoz minimum két pozitív és két negatív kontrollt kell használni, így ellenorizhetoek az RNS izolálásának, tisztításának lépései, és kizárhatók az álpozitív illetve álnegatív eredmények.
67
d) A Cobas Amplicor esetében az e) pontban leírtak mellett még az esetleges kontaminációból adódó álpozitivitás veszélye azért is igen kicsi, mivel a rendszer zárt (a kipreparált vírusminta bemérése után a mikrocsövek lezárásra kerülnek és a továbbiakban a minták a környezettol izolálva vannak). e) reprodukálhatóság: A metodika cut off értéke egzakt, éles különbség van a negatív (0,0–0,15 –automata; 0,0–0,3 –kézi) és pozitív (? 1,0) értékek között. Amennyiben a leolvasott abszorbancia értéke 0,15/0,3–1,0 között van, a mérést másik (újonnan levett) mintából meg kell ismételni. A kolorimetriás reakció során kialakult szín egyértelmuen a HCV jelenlétét igazolja, a PCR eredményt nem „zavarhatja” egyéb antitest, mint az anti-HCV szerológia-vizsgálatnál. Mind a pozitív, mind a negatív minták
ismétléskor az elozovel gyakorlatilag megegyezo abszorbanciákat adnak. f) A HCV-titer meghatározásánál, csak akkor kapunk eredményt, ha a három pontosan preparált és adott, egymástól különbözo kópiaszámmal bíró HCV-standard eredményei a kívánt tartományban vannak. g) az automatával (Cobas Amplicor) végzett vizsgálat gyors (kb. 7 óra) Real-time PCR Fontos megemlíteni még a real-time PCR technikát, amely az utóbbi években jelent meg, és máris számos helyen alkalmazzák a korábbi PCR módszerekkel szemben mutatott elonyei miatt. Lényege, hogy míg a hagyományos PCR esetében csak a reakció folyamatának végén jelen lévo kópiák száma mutatható ki, a valós ideju (real-time) detektálásnál az amplikon keletkezésének dinamikája is vizsgálható. Technikailag vagy a kettosszálú
DNS-be interkalálódó fluoreszcens festékkel, vagy különféle típusú
fluoreszcens próbákkal mérheto az adott pillanatban jelenlévo PCR termék mennyisége. Minden ciklusban lemérésre kerül a minta fluoreszcenciája, így követhetové válik az amplikon keletkezése. Ezáltal sokkal pontosabban meghatározhatóvá válik a kiindulási kópiaszám (=kvantitálási lehetoség), méghozzá nagyobb érzékenységgel, mint az a régebbi módszerek esetében elérheto volt. Jelenleg a Roche cég LightCycler készülékéhez már elérheto HCV kimutatására alkalmas kit. Mindazonáltal a módszer még nem szélesköruen elterjedt (további tapasztalatok és standardizálás szükséges ahhoz, hogy a rutin diagnosztikában alkalmazható legyen).
68
3.2.2. IN SITU MÓDSZEREK 3.2.2.1. IN SITU HYBRIDIZÁCIÓ Az in situ hybridizáció alkalmas a HCV kimutatására, mégis ezen technika – relatív bonyolultsága és nagy technikai felkészültséget igénylo volta miatt – nem szélesköruen elterjedt, csak kutatási célra használják. Elonye, hogy – mint az in vitro módszerek között a jel-amplifikációs Quantiplex módszer – a targetamplifikáción alapuló in situ technikáknál (pl. in situ PCR) általában kisebb szenzitivitású,
azonban
alkalmasabb
a
vírus
kópiaszámának
pontos
meghatározására, különösen a fluoreszcens detektálású formája. Az elsok között használta HCV detektálására az in situ hybridizációs módszert Christian Brechot professzor (INSERM U370, Necker Kórház, Párizs) munkacsoportja. Ebben részt vett Moldvai Judit dr-no, akinek a neves Blood folyóiratban 1994-ben megjelent közleményének magyar változatát az Orvosi Hetilap közölte (98). A módszer lényege a következo: Elso lépésként plazmidba klónozott HCV 5’ UTR cDNS szakaszról DNS-függo RNS polimerázzal átírva szenz és/vagy antiszenz RNS próbákat készítenek, melyek szintéziséhez jelölt nukleotidokat használnak fel. Régebben radioaktív jelölést alkalmaztak, de minthogy ez speciális labor-körülményeket igényel, ezért újabban a direkt módon fluoreszcens festékkel illetve indirekt detektáláshoz digoxigeninnel vagy biotinnal jelölt próbák terjedtek el. Ezek után a tárgylemezre rögzített, fixált
sejteket
vagy
a
paraffinos
blokkból
készült,
deparaffinált
és
rehidrált
szövetmetszetet proteázzal emésztik, hogy felszabadítsák a nukleinsavak és a fehérjék közötti – részben fiziológiásan is már meglévo, részben a fixálás során keletkezett – kapcsolatokat. Kiegészíto utókezelések után (utófixálás, acetilálás, puffer- és sóoldatos mosások, dehidrálás, szárítás, stb.) a sejteket vagy szövetet hordozó tárgylemezre helyezik a hybridizáló oldatot, melyet a próbák denaturálása érdekében elozoleg magas homérsékletre melegítettek (pl. 80 °C, 2 percig). Ezután – a próba tulajdonságaitól és a metodika egyéb paramétereitol függo homérsékleten és ideig (pl. 52 °C, 16 órán át) – inkubálják a hybridizáló oldattal a sejteket, szöveteket, melynek során a próbák a célszekvenciához kötodnek. Az inkubáció után magas koncentrációjú sóoldatos, formamidos mosásokkal stabilizálják a specifikus próba-célszekvencia kapcsolatokat, majd csökkeno koncentrációjú sóoldatos (SSC) mosásokal távolítják el az aspecifikusan, tehát gyengébben kötodött próbákat. A detektálás a jelöléstol függo: a bekötött radioaktív próbák helyét az autoradiográfiás emulzióval bevont sejteken vagy szöveten
69
kicsapódó ezüstszemcsék jelzik; a direkt fluoreszcens jelölésu próbák vagy a fluoreszcensen jelölt anti-digoxigenin antitesttel detektált digoxigenin-jelölt próbák, továbbá a fluoreszcensen jelölt avidinnal detektált biotin-jelölésu próbák fluoreszcens illetve confocalis laser scanning mikroszkóppal lokalizálhatóak, míg ha alkalikus foszfatázzal jelölt az anti-digoxigenin antitest vagy ha biotinnal jelölt próbát és avidinbiotin-peroxidáz rendszert használunk, akkor az enzim által katalizált színreakció jelzi a pozitivitást a fénymikroszkópos vizsgálatnál. (98, 23, 82, 1)
3.2.2.2. IN SITU PCR A HCV szöveti detektálására az in situ PCR módszer is alkalmas (64, 88, 8, 102). Minthogy az in situ amplifikálás módszere számos ponton eltér a folyadék fázisú technikától, ezért a HCV kimutatására általunk használt RT in situ PCR metodika (mellyel részletesen a 4. fejezet foglalkozik) elméleti alapjainak megértéséhez szükséges áttekinteni az in situ PCR általános vonatkozásait. (a technikai jellegu ismertetést ld. a mellékletben)
A)
KÜLÖNBSÉGEK A FOLYADÉK FÁZISÚ PCR ÉS AZ IN SITU PCR KÖZÖTT Az in situ PCR ismeretéhez fontos megérteni a különbséget egy 50 µl-es
térfogatban végzett folyadék fázisú PCR és egy 5 mikron nagyságú, tehát térfogatát tekintve kb. 1000-szer kisebb sejtben lezajló in situ amplifikáció között. Eloször is kifejezett különbség van a felszín-térfogat arány között. A 0.5 ml-es csoben ez az arány kb. 1:2-höz. Az in situ PCR-nál (feltételezve hogy 10 mm-es fedolemezt használunk és 10 µl a minta térfogata) a felszín-térfogat arány több mint 20-szor nagyobb. Emiatt in situ PCR-nál más ciklusparamétereket kell használni, különösen a denaturáció homérsékletét és hosszát tekintve. A második különbség, hogy a sokszorozó oldat a folyadék fázisú PCR esetében többnyire vízalapú, és a vizsgálandó DNS vagy RNS a szövetbol történt kivonása után relatíve kis mennyiséget tartalmaz a másik (vizsgálni nem kívánt) nukleinsav-típusból, fehérjébol pedig még kevesebbet. In situ PCR-nál viszont a sejtmagban a DNS, RNS és fehérjék meglehetosen suru mátrixa található, és az aldehides fixálás következtében ebben a mátrixban kiterjedt keresztkötések jönnek létre, így egy
70
komplex,
háromdimenziós
labirintus
keletkezik.
A
sejtplazma
is
egy
háromdimenziós mátrixból áll, mely elsosorban intermedier filamentumokat, különféle fehérjéket és RNS-t tartalmaz. A meglehetosen suru és összetett fehérjenukleinsav mátrix a citoplazmában megakadályozza a PCR termékek (az amplikon) migrációját a sejten kívülre. A fixált sejtben található relatíve koncentrált fehérje-nukleinsav elegy alapvetoen befolyásolja a PCR során a DNS szintézist, melynek különbözo módjai közül így mások lehetnek hatásosak az in situ PCR esetében, mint a folyadék fázisú PCR-nál. (109, 103) A részletes áttekintés elott a következo fogalmakat kell definiálni (3.3. és 3.4. ábrák) (109, 103): • RT in situ PCR: az RNS-rol átírt cDNS egy PCR-ral felsokszorozott szakaszának kimutatása direkt vagy indirekt módon • direkt in situ PCR: a jelzett nukleotidokat az amplifikáció során a polimeráz enzim közvetlenül beépíti a PCR-termékbe • indirekt in situ PCR vagy PCR in situ hybridizáció (PCR ISH ): a PCRtermék kimutatása jelölt próbával történo hybridizációval a sejten belül
Mintavétel Fixálás Beágyazás (paraffinba) Metszetkészítés Deparaffinálás Rehidrálás Proteolitikus emésztés
in situ PCR
in situ RT-PCR
DNáz emésztés (opcionális)
Reverz transzkripció
71
DNS amplifikálás
Direkt
Indirekt (PCR ISH)
In situ hybridizáció
Immunhistochemia
Vizualizálás 3.3. ábra
A metszeten végzett in situ PCR folyamatának és típusainak sémás bemutatása
RNS RNS
reverz reverz 3´ 3´ transztranszkriptáz kriptáz ; Mulv) (rTth primer primer primer (rTth ; Mulv)
5´ 5´ cDNS cDNS
++ jelzõjelzõjelzõmolekula molekula
Muro-Cacho (103) alapján
vagy vagy
DNS DNS polimeráz polimeráz ((rTth rTth;; Taq Taq))
DNS DNS 5´ 5´
3´ 3´
vagy vagy
++ jelzõjelzõjelzõmolekula molekula
PCR PCR termékek termékek
PCRPCRtermékek termékek detektálása detektálása
3.4. ábra
solution solution phase phase
agaróz elektroforézis agaróz gél gél elektroforézis immun colorimetria immun -- colorimetria colorimetria indirekt: hybridizáció indirekt: in in situ situ hybridizáció hybridizáció direkt: immunhistochemia direkt: immunhistochemia
in in situ situ
A PCR folyamatának és típusainak sémás bemutatása
72
B)
AZ IN SITU PCR TÍPUSAI A direkt módszer során jelölt nukleotidokat (pl. digoxigenin-11-dUTP)
építünk be az elongáció alatt a képzodo szálakba és az amplifikált terméket immunhisztokémiával mutatjuk ki. Az indirekt módszernél a sokszorosított terméket in situ hybridizációval (ISH) mutatjuk ki specifikus, jelölt próbát használva. Direkt in situ PCR (109, 103) A direkt in situ PCR-ban a jelzoanyag, a digoxigenin vagy biotin beépül a sokszorosított termékbe. A digoxigenin csak a Digitalis növénycsalád tagjaiban található, ezért más biológiai anyagban nem fordul elo. Nagy affinitású, nem konjugált és alkalikus foszfatázzal, peroxidázzal, fluoresceinnel vagy rhodaminnal konjugált anti-digoxigenin antitestek állnak rendelkezésre. A biotin a B vitamin komplex egyik eleme és anti-biotin antitestekkel mutatható ki. A végso eredmény mindkét jelzoanyagnál a chromogén enzimatikus lokalizálása a DNS amplifikálás területére. A direkt in situ PCR technika csak RNS kimutatására terjedt el (direkt RT in situ PCR), mivel paraffinba ágyazott minták esetén a jelölt nukleotidok direkt beépülése nemcsak az amplifikált DNS célszekvenciákba, hanem a beágyazás során a szövetek metszetkészítéshez szükséges felmelegítése miatt keletkezett DNS-résekbe is megtörténhet a polimeráz repair-aktivitása révén, ami álpozitivitást eredményezne. Bár ez elvileg kiküszöbölheto a DNS törések javítására használható T4 ligázzal vagy a kezdeti sokszorozó ciklusokban jelöletlen nukleotidok használatával, mégis DNS célszekvencia kimutatásához többnyire szabályos hybridizációs lépésre van szükség a PCR után (PCR ISH, indirekt in situ PCR). Az RT in situ PCR kezdeti lépéseként egy reverz transzkripciós lépéssel az RNS-t cDNS-sé kell átalakítani, mivel az RNS nem hostabil, és így nem lehet templát a PCR-ban. Az RT in situ PCR alkalmas kis kópiaszámú célszekvenciák kimutatására, így pl. mRNS-ek illetve virális RNS detektálására, még ha kevesebb mint 10 kópia található is sejtenként.
73
A jelölt nukleotid beépülése direkt RT in situ PCR esetében is történhet nemspecifikusan, ha mispriming (a primer bekötodése nem a specifikus helyre történik), endogén priming (a sejt saját DNS-ének darabjait vagy a cDNSt használja fel a reakcióban primerként), primer-oligomerizáció vagy a DNS repair muködik a sejtben. Az optimális proteáz emésztés és az ezt követo DNáz emésztés kiküszöböli ezeket a nemspecifikus utakat. Ennek eredményeképpen a PCR-ral sokszorosított cDNS-be a jelölt nukleotidok direkt beépülése a célra specifikusan történik meg. A jel hiánya a negatív kontroll (emésztés DNáz-zal, reakció RT enzim nélkül) esetében és az intenzív jel a legtöbb sejt magjában a pozitív kontroll (DNáz emésztés nélküli) esetében szintén szükséges ahhoz, hogy értékelheto legyen a szöveten végzett direkt RT in situ PCR. Kb. 8000 digoxigeninnel jelzett nukleotidra van szükség a sejten belül hogy a jel egyértelmu legyen. A számítások azt mutatják, hogy az RT in situ PCR pozitív kontrolljában több mint 100.000 jelzo nukleotid épülhet be a magba, elsosorban a DNS repair útján. Ez a mennyiség korrelál a pozitív kontrollokban található jel intenzitásával.
Indirekt in situ PCR (109, 103) Az indirekt módszer – bár nehézkesebb – nagyobb specificitást ad, mivel a próba úgy van tervezve, hogy komplementer legyen egy, az amplifikált terméken belül található szekvenciával. Egy- és kettos szálú DNS-t, 20-30 bázis hosszúságú oligonukleotidokat és egyszálú RNS-t is sikerrel használnak próbaként a sokszorozott termékek kimutatására. A próbák és a PCR termékek hybridizációjának kinetikáját befolyásolják: a, a célszekvencia elérhetosége (in situ PCR-nál a célszekvencia jól elérheto, mert a hybridizáció a DNS sokszorosítás után történik) b, a próba koncentrációja c, a hybridizáció pontossága (stringenciája) A hibridek stabilitását több paraméter is befolyásolja: a, Tm (formamid csökkenti a Tm -t és lehetové válik pontosabb kötodés elérése alacsonyabb homérsékleten is)
74
b, bázisösszetétel (minél több a G+C, annál magasabb a Tm ) c, a próba és a célszekvencia közötti szekvenciaazonosság mértéke d, a hybridizáló / mosó oldat összetétele (a monovalens kationok koncentrációjának növelése emeli a hibridek stabilitását) A végso érzékenység a próba jelölésén és detektálásán múlik. A próbát jelölhetjük radioaktív elemekkel ( 3H,
35
S,
32
P,
33
P ) vagy nem radioaktív hapténekkel, mint
biotin, digoxigenin, FITC, és használható immun-arany detektálórendszer is, amely nagymértékben képes növelni a jel intenzitását.
C)
KONTROLLOK
Álnegativitás okai és kiküszöbölése (109, 103) Megbízhatatlan
eredményeket
és
álnegativitást
eredményezhet
a
tárgylemez vagy – amennyiben folyadék fázisú PCR készülék futo-huto blokkján dolgozunk – a blokk gyenge hovezetése, az egyenlotlen hoáramlás, a reagensek adszorpciója az üveghez, DNS polimeráz inhibitorok jelenléte, párolgás, túlzott mosás és a reagensek szivárgása. Ezért a folyamat számos lépését kontrollálni szükséges a technika optimalizálása során. Az in situ PCR-ral kimutatandó szekvencia kópiaszáma kicsi lehet, és az archivált anyagok fixálása tovább csökkentheti a nukleinsav-tartalmat, rontva az eljárás érzékenységét. A paraffinba ágyazás hatására a nukleinsav-láncok töredezése jöhet létre. Ezért, hogy biztosak lehessünk abban, hogy a negatív eredményt nem a reagensek elégtelen penetrációja vagy a célszekvencia elérhetetlensége okozza, javasolt egy olyan kontroll minta használata, amiben egy adott szekvenciát, mint pl. az aktinét amplifikálunk.
Álpozitivitás okai és kiküszöbölése (109, 103) Több vizsgálat kimutatta, hogy a direkt detektáláson alapuló módszerek álpozitív eredményt adhatnak. Ennek oka lehet a jelölt nukleotidok nem specifikus beépítése a fragmentálódott endogén DNS-ekbe az ilyen nemkívánatos repair-t is
75
végzo DNS polimeráz által, vagy az endogén priming cDNS-el vagy DNS fragmentumokkal. Ide tartozik a mispriming is, melynek lényege, hogy a primerek nem a célszekvenciához hybridizálva indítják meg a ciklust, így nem kívánt szekvenciák is amplifikálódhatnak. A mispriming számos okra vezetheto vissza, szerepet játszhat benne a nem megfelelo primer-specificitás, ion-koncentráció, pH és kapcsolódási homérséklet. Az álpozitív jel helye jellemzoen a mag, különösen apoptotikus és öregedo sejteken, ahol DNS fragmentáció történik. Ezt az endogén DNS amplifikációt még DNáz emésztéssel is nehéz elkerülni. A mutermék csökkentése részben megoldható exonukleáz aktivitás mentes DNS polimerázzal, a DNS törések javítására használható T4 ligázzal vagy a kezdeti sokszorozó ciklusokban jelöletlen nukleotidok használatával. A primerek tervezésénél figyelembe kell lenni, hogy ne mutassanak homológiát nem kívánt szekvenciákkal, ill. egymással. Mivel a mispriming alacsony Tm esetén jöhet létre, ezért megelozheto, ha a polimerázt nem adjuk az amplifikáló oldathoz addig, amíg az el nem érte az 55 °C-t (hot start). Egy másik alternatíva az anti-Taq antitest alkalmazása, amely a Taq polimerázt megköti alacsonyabb homérsékleten, majd egy adott hofok elérésekor leválik az antitest az enzimrol, és megindulhat a ciklus. A módszer specificitását ellenorizhetjük a PCR termékek metszetrol történo kinyerésével és gél-elektroforézises analízisével. Az indirekt módszer esetében az in situ hybridizációs lépés nagyobb specificitást biztosít, továbbá egy másik metszeten egy, az adott szekvenciához nem megfelelo próbával végzett hybridizációnak negatív eredményt kell adnia. „Nested PCR” (az elso PCR terméken
belüli
szekvencia
amplifikálása)
szintén
növelheti
a
módszer
specificitását. További lehetoség a PCR reagensek kihagyásával végzett reakció, amivel a detektáló rendszer esetleges nem specifikus jeleit szurhetjük ki.
76
4. A HEPATITIS C VÍRUS KIMUTATÁSA ERYTHROCYTÁKBAN 4.1.
KUTATÁSI HÁTTÉR A nukleinsav-kimutatási technikák – különösen a polimeráz láncreakció
(PCR) – alapkutatási módszerekbol kereskedelmi forgalomban kapható diagnosztikai tesztekké fejlodtek a HCV esetében. A viraemia szintje azonban krónikus hepatitis C-ben sokszor igen alacsony lehet, ami a víruskimutatást még a jelenleg legérzékenyebbnek tartott rutin diagnosztikai módszerekkel is nagyon megnehezíheti. (86,181) Habár leírták, hogy a teljes vér jelentosen több HCV RNSt tartalmaz, mint a plazma, tisztázatlan volt, hogy a vér mely része szolgál a vírus elsodleges forrásaként (145). Korábbi vizsgálatok szerint a HCV fertozött betegek 50%-ában tartalmaztak a perifériás vér mononuclearis sejtjei HCV RNS-t, mégpedig 0,2-8,1%-os arányban. Egy másik munkacsoport adatai szerint a perifériás makrofágokban a HCV fertozöttek 20%-ában volt található HCV RNS. (102,16) A perifériás vér mononukleáris sejtjei (PBMC) tehát lehetséges forrásai a HCV-nek, azonban ezen munkák eredményei alapján nyilvánvalóvá vált, hogy ezek a sejtek a teljes vér viralis RNS tartalmának csak kis részét tartalmazhatják. Elméletileg a vérlemezkék is szóba jöhetnek vírushordozóként, azonban ez ellen szól, hogy a szakirodalomban fellelheto adatok szerint thrombocyta transzfúzió csak ritkán teheto felelossé a HCV fertozés forrásaként. Mindezek arra utalnak, hogy a HCV elsodleges forrásai a vérben nem a fentebb említettek, hanem nagy valószínuséggel más alakos elem(ek) szolgál(nak) a vírus számára rezervoir-ként. Munkacsoportunk ezért megvizsgálta annak a lehetoségét, hogy a vér alakos elemeinek legnagyobb részét kitevo vörösvértestek (vvt-ek) lehetnek-e a vírus elsodleges forrásai. A vvt-ek HCV fertozésben feltételezett szerepének igazolására, valamint az in situ és a hagyományos detektálás érzékenységének összehasonltására korábban bizonyítottan HCV fertozésen átesett betegek vérmintáit vizsgáltuk. Az ezekbol származó vörösvértest-keneteken végzett RT in situ PCR („erythrocyta-PCR”) eredményeit hasonlítottuk össze ugyanazon betegek
77
vérplazmájából vagy -szérumából végzett folyadék fázisú RT-PCR („szérum-PCR”) eredményeivel.
4.2.
VIZSGÁLATI MINTÁK ÉS MÓDSZEREK
4.2.1. Betegek és kontroll személyek 105 krónikus hepatitis C-ben szenvedo és emiatt hepatológiai gondozásban részesülo beteg vérmintája került feldolgozásra, akiknek HCV fertozöttsége 6-12 hónappal ezen vizsgálat-sorozatba bevonásuk elott igazolódott. A krónikus C hepatitist a következo vizsgálatok egybehangzóan ezt alátámasztó eredményei alapján tekintettük igazoltnak: a) anti-HCV antitestek jelenléte a vérplazmában/szérumban, második generációs ELISA (Ortho Diagnostic System, Raritan, NJ,USA) vizsgálat többszöri pozitív eredménye alapján, b) a szérum alanin transzamináz (ALT) kórosan emelkedett szintje, c) vastagtu-májbiopszia, a hisztológiai aktivitási index (HAI) meghatározásával (7), d) HCV RNS kimutatása vérplazmából/-szérumból. Negatív kontroll mintaként 12 egészséges egyén vérmintája szolgált, esetükben a betegség semmiféle rizikófaktora vagy bizonyítéka sem volt kimutatható. További kontrollként 8 nem-HCV eredetu májbetegségben szenvedo, HCV negatív beteg (közte egy hepatitis B fertozött) vérmintáját dolgoztuk fel. Vizsgálatainkat az 1975-ös Helsinki Deklaráció etikai eloírásai alapján végeztük, a Semmelweis Egyetem etikai bizottságának jóváhagyásával (TUKEB engedély száma: 150/1997).
4.2.2. Minta-elokészítés 4 ml vénás vér került levételre minden HCV fertozött betegtol és kontroll személytol EDTA-s vérvételi csobe (Vacutainer EDTA (K3), Becton Dickinson Vacutainer Venous Blood CollectionSystem; Franklin Lakes, NJ, USA). Párhuzamosan vett nem-alvadásgátolt vérmintát is feldolgoztunk egyes esetekben szérum kinyerése céljából. A beérkezett mintákat kóddal láttuk el és rögzítettük a klinikai adatokat. A továbbiakban csak a kódszám szolgált azonosítóként, biztosítva a befolyásmentes
78
értékelést. A vérbol 25 µl került kivételre és fixálásra 1 ml 4%-os (w/v) paraformaldehidben (pH 7.4), szobahomérsékleten 20 percig, a vörösvértestszámot ezáltal ~1x105/ml-re beállítva. Ebbol a fixálási ido letelte után 10 µl-nyit aminoalkylsilane-al (silane) bevont tárgylemezen (Sigma cat. no. 465 vagy S4651; St. Louis, Mo., USA) 1x1 cm-es területen szétterítettünk, és Wilkinson (172) szerint 2 órán át szobahomérsékleten szabadon hagyva szárítottuk, hogy kialakuljon a vvtek és a tárgylemez közötti tapadás. Minden HCV-s és kontroll eset vérmintájából 4 darab ilyen kenet készült, melyeket a szárítást követoen a további felhasználásig jól záródó tárgylemez-tartóban tároltunk szobahomérsékleten. A procedúra folytatásakor a keneteken lévo vvt-eket permeabilizáltuk (0.1% (v/v) Triton X-100/ PBS (pH 7.4), 10 min és 0.2 M HCl, 10 min), majd proteolitikus emésztés következett 3 mg/ml proteináz K -val (Boehringer Mannheim, Mannheim, Germany) (melynek puffere: 10 mM Tris, pH 8.0 ; 0.2 mM CaCl2 ; 50 mM EDTA) 37 °C-on 6 percig. Az emésztés leállításához a tárgylemezeket jéghideg 0.1 M-os glycine/PBS oldatba (pH 7.2) mártottuk 10 percig. Ezután overnight (12 órás) DNáz emésztés következett nedveskamrában 37 °C-on: a tárgylemezek vvt-eket tartalmazó részére 10 µl 1U/µl koncentrációjú RNáz-mentes DNáz-t rétegeztünk (Boehringer Mannheim; puffer: 105 mM Na-acetát, 5 mM MgSO4, pH 7.4). A folyamat leállítására a tárgylemezeket elobb DEPC-kezelt vízben (DEPC: diethyl pyrocarbonate, Sigma Chemical, St. Louis, Mo., USA), majd 100%-os etanolban mostuk 1-1 percig, végül levegon hagytuk megszáradni. A fenti mintaelokészíto procedúrák során mindenben az RNáz-kontamináció megelozésére szolgáló standard eloírások szerint jártunk el.
4.2.3. RT in situ PCR (erythrocyta-PCR) Minthogy a HCV genom legkonzervatívabb része az 5’ UTR regió (ld. 2.2.1.1.), ezért ennek egy részlete szolgált amplifikálandó célszekvenciaként a HCV RNS kimutatásához. Az ún. nested- (“fészek”) PCR reakció lényege, hogy két primerpárt használ; elobb felsokszorozunk az egyik párral egy hosszabb szakaszt, míg a másik pár ezen belül egy rövidebb szekvenciát jelöl ki, és ezzel amplifikálunk
79
másodszorra. Így egyrészt jóval nagyobb lehet az amplifikálás mértéke, ami kis kópiaszámú célszekvencia esetén elonyös, másrészt sokkal specifikusabb lesz az eredmény. Mi a nested-PCR egy speciális típusát alkalmaztuk, amelynél nem egymás utáni két reakcióban, hanem egyszerre amplifikálunk mindkét primerpárral. Ez az amplifikálás mértékét ugyan nem növeli, azonban a reakció specificitása valamelyest így is fokozódik, és az egyszeri amplifikálással csökkentheto a PCR szélsoséges hoingadozásaiból adódó, a sejtek struktúráját torzító, roncsoló hokárosodás. A valódi nested-PCR-nál kisebb amplifikálóképességet pedig az általunk is alkalmazott fluoreszcens detektálás nagyobb érzékenysége ellensúlyozza. (102,28,46,85) A virális RNS cDNS-sé átírásához (RT reakció) a vörösvértest-kenetekre 20 µl RT mixet rétegeztünk [RT puffer: 50 mM TRIS-HCI, 75 mM KCI, 3 mM MgCI2, 10 mM dithiothreitol; RT enzim: 200 U rekombináns – RNáz H mentes – Moloney murine leukemia virus (M-muLV) reverz transzkriptáz (Gibco Life Technologies, Inc.; Rockville, Md., USA); 40 U RNáz inhibitor (Boehringer Mannheim); nukleotidok: 1 mM dGTP, dCTP, dATP és dTTP; primer: 50 pmol/ml HCV8 (5’GCACGGTCTACGAGACCT3’)], majd a tárgylemezeket a thermocycler (BIOMED Thermocycler 60, Biotrade, Vienna, Austria) futo-huto blokkján 42 °C-on 1 órán át inkubáltuk. A kenetek kiszáraradásának megakadályozására az RT mixhez Self-Seal reagenst (MJ Research, Inc., Waltham, Mass., USA) is adtunk a gyártó által eloírt módon (a mix végso térfogatának 50%-át 2x Self-Seal reagens adja – illetve ha minden egyéb komponens együttes térfogata eléri illetve meghaladja a teljes volumen felét, akkor az egyébként a fennmaradó mennyiséget kitevo DEPC-kezelt vizet teljes egészében 2x Self-Seal reagenssel helyettesítjük), és a keneteket RNáz-mentes fedolemezzel lefedtük. Az RT reakció leállításához a keneteket 94 °C-ra melegítve 5 percen át inkubáltuk. Az amplifikáláshoz a 70 °C-ra elomelegített kenetekre 20 µl amplifikáló oldatot rétegeztünk, amelyet elozoleg a primer oligomerizáció elkerülése és az AmpliTaq Gold enzim (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA) aktiválása érdekében 15 percen át 95 °C-on tartottunk. Az amplifikáló oldat tartalmazta a külso [HCV 8, HCV 11 (5’CCATAGATCACTCCCCTGTG3’)] és a
80
belso primer-párt [HCV 3 (5’CTGTGAGGAACTACTGTCTTCACGCAG3’), HCV 4 (5’CGGTTCCGCAGACCACTATG3’)] 10 pmol/ml koncentrációban (a primerek részletesebb ismertetését ld. a mellékletben). Ezenkívül AmpliTaq Gold polimerázból 5U-t, 2.5 µl 10xPCR puffer II-t, 2.25 mM MgCl2-t (Perkin Elmer Applied Biosystems, Foster City, Calif., USA), 62.5 mM dGTP-t, dCTP-t és dATPt, továbbá 42.5 mM dTTP-t és 20 mM digoxigenin-jelölt dUTP-t (Boehringer Mannheim) tartalmazott a 20 µl amplifikáló oldat. A PCR ciklusparaméterei a következok voltak: 3 perces kezdo denaturációs lépés után 20 ciklus következett; 1 perc denaturáció (94 °C), 1 perc annealing (55 °C), és 1 perc elongáció (72 °C). A párolgás megakadályozására az RT reakciónál ismertetett módszert alkalmaztuk. A negatív szálú (replikatív) HCV RNS kimutatása a Lanford és munkatársai által közölt módszerrel történt (85). A PCR lépés után a nem-specifikus PCR-termékek eltávolítására speciális mosást alkalmaztunk [1xSSC, 0.15 mM NaCl, 0.015 mM Na-citrát, 0.1% BSA (Sigma cat. no. 4628), 56 °C, 10 perc]. A digoxigenin-jelölt amplikonokat fluoresceinnel konjugált nagy affinitású anti-digoxigenin antitestekkel [fluorescein 5 (6)-carboxi-fluorescein-N-hidroxisuccinimid-észter-anti-DIG; Mannheim;
1:4
kiküszöbölésére
hígítás blokkoló
PBS-ben] oldatot
detektáltuk. használtunk
A (no.
Enzo-Boehringer
nem-specifikus 1096176
háttér
Boehringer
Mannheim) a gyártó eloírásai szerint. Az amplikonok fluoreszcens jeleit három sávos (triple band) szurovel (DAPI; FITC; TEXAS RED) ellátott fluoreszcens mikroszkóppal (NIKON Alphaphot 2-H microscope; Nikon Corporation, Tokyo, Japan) vizsgáltuk, 500-szoros nagyításnál. A pozitív zöld szignált tartalmazó vörösvértestek
arányát
kenetenként
300
erythrocyta
leszámolásával,
szemikvantitatívan adtuk meg.
4.2.4. Folyadék fázisú RT-PCR (szérum-PCR) Minden HCV-fertozött beteg valamint a kontroll személyek esetében az erythrocyta-PCR-hoz is használt vérmintából kinyert plazmán, vagy ugyanazon alkalommal vett nem-alvadásgátolt vérmintából kinyert szérumon folyadék fázisú
81
RT-PCR-t végeztünk a HCV kimutatására. Erre a 3.2.1.2. fejezetben leírt módon AMPLICOR Hepatitis C Virus Test-et (Roche Diagnostic Systems) használtunk. Az adatok kiértékelése után azokban az esetekben, ahol az erythrocyta-PCR és a szérum-PCR eredménye eltéro volt, mindkettot megismételtük az eredeti mintákból és ha ezen eredmények sem egyeztek, akkor 1 éven belül újabb vérmintából ismételtük meg a reakciókat.
4.2.5. Lézeres pásztázású confocalis mikroszkóppal végzett vizsgálatok A vörösvértest-keneteken végzett erythrocyta-PCR-ok eredményeinek nagyobb felbontású, és a térbeli viszonyokat lényegesen jobban megjeleníto fluoreszcens vizsgálatához lézeres pásztázású confocalis mikroszkópot használtunk (Confocal laser scanning microscope MRC 1024; Bio-Rad, Munich, Germany). A confocalis mikroszkóp pásztázó lézernyalábjával tized mikron vastagságú képszeletek készíthetok, az így készített szummációmentes rétegképek ezután térben ismét rekonstruálhatóak. Vizsgálataink során egymástól 0.1–0.3 µm vertikális távolságra elhelyezkedo horizontális síkokban végigpásztázva a minta kiválasztott részletét megkaptuk ezen síkok képeit, majd a confocalis mikroszkóp programja segítségével a horizontális pásztázás adataiból digitálisan rekonstruáltunk egyes vertikális átmetszeteket is.
4.2.6. Az erythrocyta – HCV interakció in vitro modellje Egészséges kontroll személyek vérébol 5x107 vörösvértestet izoláltunk 2%-os dextrán szedimentációval, majd háromszor mostuk foszfát puffer oldatban (PBS). 5x106 erythrocytát reszuszpendáltunk RPMI sejttenyészto médiumban (Gibco Life Technologies, Inc.; Rockville, Md., USA), amely 10% ho-inaktivált autológ plazmát is tartalmazott. HCV-fertozött betegek egybegyujtött vérplazmáját fertozo inokulumként használva a MOI (multiplicity of infection) 1.5 kópia/sejt-re lett beállítva (az inokulum létrehozása és a kópiaszám meghatározása: IMMUNO AG, Vienna, Austria) Harminc másodperccel az inokulálás után mintavétel történt az esetleges specifikus, azonnal kialakuló HCV-erythrocyta kapcsolat vizsgálatához.
82
A
további
kötodések
megakadályozására
az
ezen
mintában
található
vörösvértesteket háromszor átmostuk PBS-ben. A többi erythrocytát tovább inkubáltuk 12 órán át (overnight) a fertozo plazmával, majd az inokulumot a fentebbi mintavételnél ismertetett módon kimostuk. Az inkubálást tovább folytattuk szén-dioxid termosztátba helyezve (CO2 incubator Cytoperm, Heraeus), 10% hoinaktivált magzati borjúszérumot tartalmazó RPMI sejttenyészto médiumban (Gibco Life Technologies, Inc.; Rockville, Md., USA), és 24 órával illetve 8 nappal a beoltás után mintát vettünk. Mindhárom idopontban vett mintából vörösvértestkeneteket készítettünk, amiken erythrocyta-PCR-t végeztünk. A vörösvértesteket ezután fluoreszcens és confocalis mikroszkóppal vizsgáltuk.
4.3.
EREDMÉNYEK
4.3.1. Az erythrocyta-PCR-ok fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatának eredményei A 125 vizsgált egyén (105 HCV-fertozött beteg, 20 kontroll) közül 99 HCVfertozött vörösvértest-keneteiben sikerült kimutatni a HCV genomiális RNS-ét (Fig. 4.1/a-b), míg a 8 egyéb májbetegségben szenvedo és 12 egészséges kontroll személy mindegyike negatív volt (Fig. 4.1/c). Ezen eredmények a 4.1.-es táblázatban láthatóak összesítve.
HCV esetek (105)
Esetszám Százalékos
erythrocyta erythrocyta erythrocyta erythrocyta + + – – szérum +
?
szérum –
szérum +
szérum – ‡
†
esetek (20)
21
1
5
74,3 %
20 %
0,9 %
4,8 %
Esetszám Százalékos arány
83
erythrocyta – szérum –
§
78
arány
Kontroll
20
100 %
?
4.1. táblázat ? : Mind erythrocyta-PCR-al, mind szérum-PCR-al pozitív HCV esetek. † : Erythrocyta-PCR-al pozitív, szérum-PCR-al negatív HCV esetek. ‡ : Erythrocyta-PCR-al negatív, szérum-PCR-al pozitív HCV eset. § : Mind erythrocyta-PCR-al, mind szérum-PCR-al negatív HCV esetek. ? : Mind erythrocyta-PCR-al, mind szérum-PCR-al negatívnak bizonyult a 8 nem-HCV eredetu májbetegségben szenvedo és 12 egészséges kontroll egyén vérmintája.
A fluoreszcens mikroszkópos vizsgálat során a fertozött vvt-eken észlelt pozitivitás – amely a HCV RNS-bol erythrocyta-PCR-ral amplifikált terméknek felel meg – morfológiailag nagy változatosságot mutatott (4.1/a-b ábra). Helyenként változó vastagságú zöld sávként vagy ívelt formaként jelent meg, míg másutt inkább pontszeru volt a szignál. Elhelyezkedését tekintve többnyire a vvt-ek perifériájára lokalizálódott, illetve membrán-asszociáltnak tunt. Egyes vvt-eken a sejtfelszínrol eloemelkedo gömbszeru illetve vezikuláris fluoreszcens szignálok is láthatóak voltak.
4.1/a ábra
Nagyarányú HCV pozitivitást mutató vörösvértest-kenet 84
A pozitív erythrocyták aránya általában 10%–80% között változott. Vörösvértestektol függetlenül elhelyezkedo zöld fluoreszcenciájú precipitátumok is megfigyelhetoek voltak, melyeket háttérként értékeltünk. Ezeknek a vvt-ekhez viszonyított aránya egyszer sem haladta meg az 5%-ot, ezért az erythrocytákon látható szignálok tekintetében is ezt határoztuk meg küszöbértékként: csak akkor értékeltük pozitívnak a kenetet, ha a pozitív vvt-ek aránya 5% felett volt.
10 ?m
4.1/b ábra
Elszórt HCV pozitivitást mutató vörösvértest-kenet
A kontroll csoport vörösvértest-keneteiben nem voltak megfigyelhetoek a pozitív
esetekben
az
erythrocytákon észlelt, specifikusnak értékelt zöld
fluoreszcens jelek (4.1/c ábra). Abban a 21 esetben, ahol a szérum-PCR negatív volt, de az erythrocyta-PCR kimutatta a HCV jelenlétét, a pozitív vvt-ek aránya 10-
85
60% volt (átlagosan 50% körül), míg azon 78 esetben, ahol mindkét módszerrel igazolható volt a vírus jelenléte a pozitív erythrocyták aránya 30-80% volt (az átlag 60% körüli), azonban ezen különbségek statisztikailag nem voltak szignifikánsak. Ennek hátterében az állhat, hogy az általunk alkalmazott RT in situ PCR technika (erythrocyta-PCR)
nem
kvantitatív
módszer:
a
reakció
non-lineáris
karakterisztikájából adódóan az alacsonyabb virális kópiaszámú mintákban relatíve hatékonyabban mehet végbe az amplifikáció, így az egyes vörösvértestkenetek HCV-tartalmában fennálló különbségek az erythrocyta-PCR pozitivitásban kevésbé megfigyelhetoek. Másrészt lehetséges, hogy a szérum és az erythrocyták HCV-tartalma nem (egyenesen) arányos, és ezért még a szérum-PCR negatív esetekben is relatíve nagy mennyiségu vírus mutatható ki a vörösvértestekben.
4.1/c ábra
Kontroll esetbol származó vörösvértest-kenet (negatív)
Egy éven keresztül követtük azon 21 beteg HCV-státuszát, akiknél kezdetben az erythrocyta-PCR pozitív volt, míg a szérum-PCR-al nem tudtuk a HCV jelenlétét igazolni. Az utánkövetés során közülük 17 esetében a vírus
86
kimutathatóvá vált szérum-PCR-al is, azonban 4 betegnél 1 év után is ismételten negatív volt a plazmából/szérumból történo víruskimutatás eredménye (míg az erythrocyta-PCR továbbra is pozitív volt). Egy esetben az erythrocyta-PCR negatív eredményt adott, a szérum-PCRpozitivitás ellenére. Az ugyanazon mintavételnél készült keneten megismételt erythrocyta-PCR szintén negatív volt. Feltételezésünk szerint ennek valamilyen, a mintafeldolgozás során bekövetkezett technikai hiba lehetett az oka (pl. túl késoi vagy elégtelen fixálás). Sajnos ez esetben nem nyílt lehetoség a késobbi mintavételre, így tisztázatlan maradt az eltérés pontos háttere. 10 erythrocyta- és szérum-PCR-al is pozitív esetben, valamint két egészséges kontrollnál a negatív szálú (replikatív) HCV RNS kimutatására irányuló RT in situ PCR vizsgálat is történt a vörösvértest-keneteken. Mind a HCV-fertozöttek, mind a kontrollok negatívak voltak, ami – tekintve, hogy az erythrocytákban nincsenek meg a vírusreplikáció feltételei – egybevág elozetes feltételezésünkkel.
4.3.2. Szérum-PCR eredmények Az erythrocyta-PCR-okkal párhuzamosan, ugyanazon vérmintákból elvégzett szérum-PCR vizsgálatok 79 esetben igazolták HCV jelenlétét, míg 26 esetben (beleértve a 20 kontrollt is) negatív eredményt adtak (4.1.-es táblázat).
4.3.3. Confocalis mikroszkópos eredmények Mivel a szignál lokalizációja – vagyis, hogy a vvt-ek felszínén vagy belsejében helyezkedik-e el az RT in situ PCR-ral amplifikált virális RNS – a fluoreszcens fénymikroszkópos eredmények alapján nem volt egyértelmuen eldöntheto, ezért lézeres pásztázású confocalis mikroszkóppal további vizsgálatokat végeztünk. Ehhez 8, fluoreszcens fénymikroszkópiával pozitívnak bizonyult vörösvértestkenetet használtunk, amelyeknek véletlenszeruen kiválasztott területein látható eros fluoreszcenciájú, specifikus szignálokat vizsgáltunk.
87
A confocalis mikroszkóppal készült horizontális metszeteken az amplifikált virális RNS-nek megfelelo, zöld fluoreszcenciájú, specifikus jelek
voltak
megfigyelhetoek az erythrocyták területén, többnyire a sejthatárokhoz közel (4.2/ab ábra). A vörösvértestek vertikális metszetein jól látható, hogy a pozitivitás egyes helyeken a citoplazmába is beterjed (4.2/c ábra), sot esetenként egyértelmuen a plazmamembrántól függetlenül helyezkedik el, ami a vírus internalizációs képességét igazolja (4.2/d ábra).
88
b a
c
d
4.2. ábra HCV-pozitív erythrocyták (confocalis mikroszkópos felvételek - ld. 4.3.3)
4.3.4. A HCV-erythrocyta kapcsolat in vitro vizsgálatának eredményei A fertozo plazmával inkubált, majd sejttenyészto médiumban fenntartott vörösvértestekbol 30 másodperc, 24 óra és 8 nap után vett minták kenetein elvégzett erythrocyta-PCR eredményeit fluoreszcens és confocalis mikroszkóppal vizsgáltuk. A HCV már a 30 másodperc után történt mintavételnél is kimutatható volt az erythrocyták felszínéhez asszociáltan, mint multiplex, pontszeru, zöld fluoreszcenciájú specifikus szignál (4.3/a ábra). 24 óra elteltével még
89
megfigyelheto volt a sejtfelszíni pozitivitás, de már intracitoplazmatikus lokalizációban is megjelent a vírus, a sejthatárok közelében látható, változó nagyságú, pontszeru specifikus szignálok formájában (4.3/b ábra). 8 nap után a vörösvértestekben egygócú (nem multiplex), viszont relatíve nagy kiterjedésu, excentrikusan elhelyezkedo, szabálytalan alakú pozitivitást észleltünk, ugyanakkor az erythrocyta felszínén nem volt látható specifikus szignál (4.3/c ábra).
a
b
4.3. ábra In vitro HCV-vel inkubált erythrocyták (a: 30s; b: 24h; c: 8 nap; fluorescens mikroszkópos felvételek – ld. 4.3.4.)
c
90
4.4.
MEGBESZÉLÉS
Kutatási
célkituzéseinknek
megfeleloen
megvizsgáltuk,
hogy
a
vörösvértestek (vvt-ek) hordozhatják-e a hepatitis C vírust. Ehhez direkt jelölésu RT in situ PCR technikát („erythrocyta-PCR”) használtunk, 105 krónikus HCV fertozöttbol származó és 20 kontroll vörösvértest-keneten. Emellett ugyanazon vérminták plazmájából/szérumából elvégeztük a rutin diagnosztikában is használt folyadék fázisú PCR alapú Amplicor módszerrel („szérum-PCR”) is a HCVkimutatást.
Ezáltal
lehetoségünk
nyílt
összehasonlítani
a
két
módszer
érzékenységét. Eredményeink igazolták feltételezésünket, hogy a HCV képes az erythrocytákhoz kötodni és internalizálódni, az ennek kimutatásán alapuló erythrocyta-PCR pedig érzékenyebben képes jelezni a vírus jelenlétét, mint a hagyományosan használt szérum-PCR. Adataink alapján valószínusítheto, hogy a vvt-ek a HCV fo sejtes rezervoárjai a vérben. Jelenlegi ismereteink még hiányosak a hepatitis C vírus és a sejtek közötti kapcsolat pontos molekuláris mechanizmusát illetoen. Mint a 2.2.2.-es fejezetben részletesebben is tárgyalásra került, több sejtfelszíni molekula is képes lehet a HCV megkötésére, így a CD 81, az LDL-receptor és a scavanger receptor B osztályának I-es típusa (SR-BI) is felmerült mint potenciális HCV-receptor. Az erythrocyták esetében egy további mechanizmus is szóba jön: A fertozoképes vérplazmában a HCV egyrészt az LDL (low density lipoprotein) frakcióval asszociálva található, ugyanakkor van egy surubb vírusfrakció is, amelyben HCV— anti-HCV komplexek találhatóak (29, 129, 133). Ez azzal magyarázható, hogy a HCV
erosen
lipofil
envelopja
a
vírust
lipoproteinekhez
és
lipoprotein-
immunkomplex aggregátumokhoz kapcsolhatja (2, 3). Régen ismert, hogy a keringo immunkomplexek kapcsolódni képesek az erythrocytákhoz (108). Ezen immun-adherencia a vörösvértestek felszínén jelen lévo complement receptor 1-en (CR1, CD35) keresztül jön létre (93, 122). In vivo eredmények azt mutatták, hogy a CR1 nem homogén eloszlású az erythrocyták membránján, hanem kisebb csoportokba
(cluster-ekbe)
összecsapzódva
91
helyezkedik
el
(121,
120).
Valószínusítheto, hogy a saját vizsgálatainkban a HCV-pozitív erythrocyta-PCR-ok esetében észlelt, extracellularis elhelyezkedésu, de gyakran a vvt-ek felszínéhez asszociálódó,
eros
pozitivitást
mutató
particulumok
(4.1/a
ábra)
HCV-
immunkomplex precipitátumoknak felelhetnek meg. Az in vitro HCV-erythrocyta kapcsolódás esetén hasonló jellegu pozitivitás volt megfigyelheto a vvt-ek felszínén. A vírus specifikus (receptor-mediált) kötodését támasztja alá ezen szignálok hasonló elhelyezkedése a CR1 (és más receptorok) esetében leírt inhomogén sejtfelszíni eloszláshoz, továbbá, hogy az in vitro tesztben a HCVerythrocyta kapcsolat már harminc másodperc után létrejött. A negatív kontroll egyének vvt-kenetein sem a fent emített precipitátumokhoz hasonló, sem egyéb specifikus fluoreszcens szignál nem volt látható (4.1/c ábra). Mindazonáltal további vizsgálatok szükségesek annak tisztázására, valóban az immunkomplex-CR1 kapcsolat teremt-e hidat a HCV-erythrocyta asszociáció számára. A negatív szálú (replikatív) HCV RNS nem volt kimutatható a vörösvértesteken, ami egyrészt belso kontrollt is jelent (hiszen az erythrocytákban nincsenek meg a feltételek a vírus szaporodásához, tehát negatív szálú HCV RNSpozitivitás esetén itt elsosorban álpozitivitásra kellene gondolni), másrészt megerosíti, hogy a vörösvértest csak mint hordozó játszhat szerepet a HCV életciklusában. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a plazma/szérum HCV negativitása (folyadék fázisú PCR-al) nem feltétlenül jelenti a teljes vér HCV-mentességét (178, 145). Ennek megfeleloen az alakos elemekben vagy azokhoz kötodve jelen lévo HCV kimutatására is képes módszerek nagyobb szenzitivitással bírhatnak, mint a rutin diagnosztikában is használt szérum-PCR. Saját eredményeink is ezt támasztják alá, mivel 105 krónikus HCV-fertozött betegbol 99 bizonyult erythrocyta-PCR-ral pozitívnak, míg szérum-PCR-ral csak 79 esetében volt igazolható a fertozés. Mind a 21 erythrocyta-PCR pozitív / szérum-PCR negatív vérminta interferon-kezelt betegbol származott, akik esetében a kezelés hatására a szérum-PCR érzékenységi határa alá csökkent a plazma/szérum HCV-tartalma. Az általunk alkalmazott erythrocyta-PCR azonban ezen esetekben is biztosította a
92
vírus kimutathatóságát. Ennek hátterében egyfelol az állhat, hogy a folyadék fázisú PCR technikával ellentétben az in situ amplifikálás során az amplikon nem hígítódik ki, hanem a képzodés helyén maradva jelentosen nagyobb lokális koncentrációt ér el, ami még alacsony virális kópiaszám esetén is biztosítja a detektálhatóságot (különösen fluoreszcens jelölés használatával). Míg a folyadék fázisú technika általában csak 100 víruskópia/ml felett ad (megbízhatóan) értékelheto eredményt, addig az in situ módszer 1-5 víruskópia/sejt kimutatását már lehetové teszi (181,109,103). Másrészt az erythrocyta-PCR a vérben található HCV-tartalomnak egy olyan részét detektálja, ami a szérum-PCR számára rejtve marad. A vér össz-HCV-mennyiségének a különféle vérfrakciók közötti eloszlását Schmidt
és
munkatársai
(145)
vizsgálták.
Ezen
tanulmány
némileg
ellentmondásos eredményeket hozott, mivel azt találták, hogy a teljes vér HCVtartalma sokszorosa a vér különféle alakos elemei és a plazma összesített HCVmennyiségének. Kísérleteik alapján arra a következtetésre jutottak, hogy a plazmához képest a teljes vérben talált HCV RNS-többlet intracelluláris illetve az alakos elemek felszínéhez asszociált vírustartalomnak felelhet meg. Minthogy ez a vírus-többlet igen jelentos mértéku, ezért elképzelhetetlen, hogy kizárólagosan a HCV-fertozött fehérvérsejtek legyenek a vírushordozók, mivel ehhez a vérben sokkal nagyobb számban jelen lévo sejtes elem szükséges. A vörösvértestek viszont megfelelnek ezen feltételezett sejtes hordozó kritériumainak, és ilyen szerepüket igazolják saját eredményeink is, hiszen erythrocyta-PCR-al a vörösvértestek felszínén és belsejében nagy mennyiségu HCV-t sikerült azonosítanunk. Annak okaként, hogy Schmidt és munkatársai az erythrocytafrakció vírustartalmát is alacsonynak találták – és ezáltal a fenti ellentmondásos eredményre jutottak (miszerint a vér egyes alakos elemeibol és a plazmából különkülön kivonható vírustartalom összege jóval kevesebb, mint a teljes vérbol izolálható mennyiség) – feltételezheto a vvt-ek felszínéhez asszociált HCV RNS elvesztése
illetve
degradációja
a
mintafeldolgozás,
RNS-izolálás során.
Feltevésünk szerint az erythrocyták felszínén talált HCV-tartalmú particulumok
93
jelentos része csak viszonylag gyengén kötött formában van jelen, és a sejtek erosebb tisztításakor, mosásakor leválva detektálhatatlanná válhat. Az elozoekben tárgyaltakból következoen a standard HCV-detektáló módszerek számára a vér sejtes elemeiben illetve azok felszínéhez asszociáltan található hepatitis C vírus kimutathatatlan marad. Emiatt az általunk alkalmazott erythrocyta-PCR (vagyis a vörösvértesteken végzett RT in situ PCR) sokkal érzékenyebben képes a HCV RNS-ének kimutatására az alacsony vírusszámú esetekben mint a szérum-PCR (folyadék fázisú PCR). Ez azért nagy jelentoségu, mivel a gyakorló orvosok, hepatológusok érdekeltek egy, a jelenlegieknél szenzitívebb HCV-diagnosztikai teszt kifejlesztésében, ugyanis a HCV-kimutatás érzékenységének növelése csökkentheti az álnegatív diagnózisok számát, pontosíthatja a kezelések (elsosorban az igen drága interferon-ribavirin kezelés) eredményeinek
értékelését
a
krónikus
HCV
fertozöttséghez
társuló
májbetegségben. Ez effektívebbé teheti a kezelést, ill. a kezelésre alkalmasság, a kezelés szükségességének elbírálását, ami új, hatékonyabb terápiás protokollok létrejöttét segítheti elo. A HCV-erythrocyta kapcsolódás ténye további kérdéseket is felvet. Jelenlegi ismereteink alapján nem eldöntheto, hogy a vírus intakt marad-e a vörösvértestekhez
kötodés
és
internalizáció
során.
Ha
igen,
akkor
a
vörösvértestek a vér belso HCV-tároló- és -rejtohelyeként muködhetnek, ahonnan kiszabadulva (pl. az erythrocyta elöregedése és lebomlása kapcsán) a vírus reaktiválódhat. Másrészt ha a HCV a kapcsolódás illetve az internalizáció során irreverzibilis kötésbe kerül, vagy integritása sérül, akkor ezen folyamat a szervezet víruseliminációs stratégiájának részét képezheti.
4.5.
KÖVETKEZTETÉSEK
1. A vér HCV-tartalma részben az erythrocytákhoz kapcsoltan található. Ezt elsoként igazoltuk, vörösvértest keneteken végzett RT in situ PCR módszer segítségével.
94
2. A vörösvértestek számát és pozitivitásuk arányát tekintve valószínusítheto, hogy a HCV egyik fo rezervoir-ja a vérben az erythrocyta-frakció. 3. A lézeres pásztázású confocalis mikroszkópiával kapott eredményeink alapján a HCV képes internalizálódni is a vörösvértestekbe. 4. Az in vitro inokulációs vizsgálatok eredményei arra utalnak, hogy a HCVerythrocyta kapcsolódás specifikus (receptor mediált) lehet. 5. A jelenleg rutin diagnosztikában alkalmazott, folyadék fázisú RT-PCR-alapú Amplicor HCV teszt a krónikus hepatitis C miatt hepatológiai gondozásban részesüloknek
csak
mintegy
75%-ában
képes
kimutatni
a
HCV-t
(valószínusítheto, hogy ez a kezeltekben bekövetkezo virális kópiaszámcsökkenéssel függ össze) 6. A vörösvértesteken végzett RT in situ PCR (erythrocyta-PCR) a folyadék fázisú technikánál jóval érzékenyebben képes kimutatni a HCV-t, mivel az Amplicor teszt 75%-os eredményességével szemben a vizsgált krónikus hepatitis C-sek 94%-ában adott pozitivitást. 7. További vizsgálatok szükségesek a HCV-vörösvértest kapcsolódás pontos mechanizmusának, és a folyamat biológiai jelentoségének tisztázására.
5.
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönettel tartozom dr. Krajcsi Péternek és dr. Bauer Pálnak, akiktol
biokémiai szemléletet és a molekuláris biológiai technikák alapjait tanultam, valamint dr. Kiss Andrásnak, aki patológia gyakorlat- majd TDK-vezetomként egyengette utamat a kutatómunka felé. Külön köszönettel tartozom Schaff Zsuzsa professzor asszonynak, PhD témavezetomnek, aki szakmai és emberi pédát nyújtva mindenben segített eddigi pályámon.
95
Hálás vagyok dr. Simon Zsuzsa segítségéért és tanácsaiért, mivel jelen munkám nem jöhetett volna létre korábbi ilyen tárgyú kutatásai nélkül, valamint dr. Fritz Kurynek, aki lehetové tette a bécsi ViennaLab cégnél történt méréseket. Köszönetemet fejezem ki továbbá annak a nagyszeru hepatológus csapatnak, akik a klinikai hátteret biztosították munkánkhoz: Abonyi Margit és Lengyel Gabriella doktornoknek, dr. Ibrányi Endrének, dr. Telegdy Lászlónak, dr. Firneisz Gábornak, és külön köszönet illeti Szalay Ferenc professzor urat, aki figyelemmel kísérte és tanácsaival segítette kutatómunkámat.
96
6. A)
MELLÉKLET
Az Amplicor HCV teszt primer-szekvenciái és összetevoi
*Roche Amplicor? HCV teszt: a primer-köto régiók (KY80/KY78, Young, 1993) aláhúzva; a képzodo PCR termék 244 bázispár hosszúságú
97
98
99
B)
Az RT in situ PCR (erythrocyta-PCR) kivitelezéséhez felhasznált primerek
Forward
Primer
Reverse
Szekvencia 5'-3' HCV 11- ccatagatcactcccctgtg
30-49
20
Szekvencia 5'-3' gcacggtctacgagacct
45-71
27
cggttccgcagaccactatg
Hely Hossz
TermékHely Hossz hossz 321-338
18
308
139-159
20
114
8 HCV 3-4
C)
ctgtgaggaactactgtcttcacgcag
Az in situ PCR módszer kivitelezésének általános technikája
1. AZ IN SITU PCR ELOKÉSZÍTÉSE A) Felszerelés (103) A PCR kivitelezésére kifejlesztett, elektronikusan vezérelt futo-huto blokkot tartalmazó
berendezéseket
(thermocycler-ek) úgy tervezték, hogy beállítsák és
fenntartsák a minták megfelelo homérsékletét a szükséges idon át, és képesek legyenek ezt reprodukálható módon, elore meghatározott számban ciklikusan ismételni. Minthogy a folyadék fázisú PCR-t mikrocsövekben, az in situ PCR-t pedig többnyire tárgylemezen végezzük, ezért kifejlesztettek speciálisan in situ PCR céljait szolgáló készülékeket is. Egyes thermocyclerek-nek független tárgylemez- és cso-egysége van, melyeket egy közös programozható egységhez csatlakoztatnak, ami lehetoséget ad a különbözo protokollok egyidoben való végzésére, és így összehasonlítható a folyadék fázisú PCR eredménye az in situ PCR-éval. Az in situ PCR céljaira tervezett rendszerekben különbözo
mechanizmusokkal igyekeznek meggátolni a párolgást (különben az
amplifikáló oldat bekoncentrálódása, illetve a minta kiszáradása akár le is állíthatná a reakciót), így növelve az amplifikáció hatékonyságát és a reprodukálhatóságot. Általában
100
a metszeteket lezárt nedveskamrába helyezik, vagy a mintákat egyenként vízmentesen lezárják. Hagyományos folyadék fázisú PCR thermocycler-rel szintén végezheto in situ PCR, ha a metszeteket a csövek befogadására szolgáló futo-huto blokkra helyezik. Így azonban a hoátadás a szöveteknek kevesbé megbízható, és kevésbé lehet kontrollálni a mintában végbemeno homérsékletváltozásokat, ami negatívan befolyásolhatja a reakció eredményességét.
B) Technikai vonatkozások (109, 103) Ugyanazon óvintézkedések, melyeket a folyadék fázisú PCR eljárásnál alkalmazunk, az in situ PCR-nál is betartandók. A PCR extrém sokszorozó képessége miatt bármilyen kis mennyiségu, kontaminációból származó DNS a mintában
óhatatlanul
megakadályozásához
felsokszorozódhat, a
mintakezelésre
álpozitív és
a
jelet
PCR
adva.
Ennek
részfolyamatainak
szeparálására vonatkozó szabályok maradéktalan betartása szükséges. A minta kezelése során kerülendok azon helyiségek, laborterületek ahol elozetesen sokszorozott DNS-el érintkezhet, az in situ PCR-hoz használt eszközöket külön kell kezelni és fontos a gyakori kesztyucsere is. Ha szövetmetszetekkel dolgozunk, különösen fontos a megfeleloen burkolt tárgylemezek használata (pl. poly-L-lysin, aminoalkylsilane) hogy elkerüljük a szövetrészek proteolitikus emésztés alatti leválását. Amint fentebb emítésre került, a párolgás megakadályozására különbözo módszereket alkalmazhatunk. Az egyik mód a metszetre rétegzett amplifikáló oldat befedése fedolemezzel, melyet körömlakkal vagy gumicementtel rögzítünk, szigetelünk, vigyázva hogy ne keletkezzen buborék. Az amplifikálás után a rögzítés csipesszel lefejtheto és a fedolemezt 0.1X SSC-ben távolítjuk el. Használható speciálisan ilyen célra kifejlesztett keret is (MJ Research, USA), amely a minta köré helyezve megakadályozza az amplifikáló oldat szétfolyását, és rátéve a fedolemezt zárt, párolgásmentes teret hozhatunk létre a minta körül. Ennek alternatívájaként kifejlesztettek egy speciális reagenst (Self-Sealing Reagent; MJ Research, USA), melyet közvetlenül az amplifikáló oldathoz adva egy barrier képzodik a folyadékréteg szabad szélein, ami megakadályozza a párolgást. Más lehetoség, hogy különlegesen kiképzett kónuszt (Hybaid, UK) rögzítve a metszeten kiválasztott részhez a sokszorozó oldat ezen keresztül óvatosan a szövetre rétegezheto; így buborék keletkezése nélkül egyenletesen oszlik el. A kónuszt lezárva megakadályozzuk az adott területen az oldat párolgását.
101
C) A minták fajtái (103) Az in situ PCR sokféle mintán sikeresen alkalmazható: sejtkeneteken, cytospin preparátumokon, metafázisos kromoszóma preparátumokon, fagyasztott metszeteken és paraffinba vagy muanyagba ágyazott szövetekbol készült metszeteken. A módszer kivitelezheto amplifikáló oldatban szuszpendált fixált sejteken is, mikrocentrifuga
csoben.
Ezen
eljárás
során
az
amplifikálás
után
a
sejteket
centrifugálással elkülönítve tárgylemezre viszik. A módszer elonye, hogy a sejteket lizálni lehet az amplifikálás után és a lizátumgél- elektroforézissel és Southern blottal vizsgálható. Ha szöveteket vizsgálunk, 4-6 mikron vastag metszeteket kell készítenünk paraffinból vagy szövetblokkokból. Bár a vastagabb paraffinos metszetek mofológiailag nehezebben vizsgálhatóak, de valószínuleg több nukleinsavat tartalmaznak kiinduláskor, és így az amplifikált jel is erosebb lesz. A fagyasztás során bekövetkezo morfológiai változások és az amplikon nagyobb mértéku diffúziója miatt a fagyasztott metszetek kevésbé használatosak in situ PCR céljára.
D) Fixálás (109, 103) Az aldehid bázisú fixálószerek (mint pl. a 10%-os neutrális pufferolt formalin oldat) a legalkalmasabbak a szerkezet megorzésére és egyben a jel diffúziójának minimalizálására. A formalinon kívül a paraformaldehid és a glutáraldehid is ebbe a csoportba tartoznak. Az aldehidek keresztkötéseket hoznak létre a fehérjék amino-csoportjai és a nukleinsavak között és így muködésképtelenné teszik a lebontó enzimeket is.
A keresztkötések kialakulásának folyamata során egy
bonyolult, háromdimenziós „út” jön létre a sejtmag állományától a citoszkeleton és az endoplazmás retikulum felé. Ez a térszerkezet fizikális gátat alkot azon molekulák számára, melyek másképp átdiffundálnának a magon és a citoplazmán. De egy ionos gát is létrejöhet azáltal, hogy a fixálás szilárdan (és adott esetben nem természetes pozícióban) rögzíti az aminosavak pozitív és negatív töltésu oldalláncait. Az aldehides fixálás által kialakított sejtbeli térhálózat többnyire túl suru ahhoz, hogy az amplifikáló oldat minden komponense képes legyen bediffundálni a mintába. Emiatt a fehérjék és a nukleinsavak közötti keresztkötéseket proteolitikus emésztéssel szükséges utólag fellazítani. Mivel nem minden minta fixálása történik ideális standard feltételek mellett, ezért a legtöbb
102
esetben többféle proteolitikus emésztési módot ki kell próbálni (ld. E) pont). Az aldehid bázisú fixálók egy további tulajdonsága, hogy a natív kettosszálú DNS-ben az egyik szál törésével réseket (nick) idézhetnek elo, melyeket ha a DNS polimeráz a jelölt nukleotidokkal kijavít, fals pozitivitáshoz vezetnek (bár ezen törések kialakulásában nagyobb szerepet játszik a paraffinba ágyazás; ld. lentebb). Kevésbé gyakran használt fixálószerek az aceton és az etanol, amelyek a lebontó fehérjéket denaturálják, azonban nem hoznak létre olyan kiterjedt keresztkötéseken alapuló térszerkezetet, mint az aldehidek. Ennél fogva alkalmasabbak immunhistochemiai célú fixálásra, hiszen használatuk mellett a térszerkezet-változásra érzékenyebb epitópok antigenitása jobban megorzodik, ugyanakkor in situ PCR esetében az amplikon migrációját kevésbé képesek meggátolni. Egyes, ritkábban alkalmazott, formalin alapú fixálók olyan speciális komponenseket is tartalmaznak, melyek hatására a nukleinsavak degradálódhatnak, ezért ezen szerek molekuláris patológiai célú felhasználása általában nem ajánlott. Ilyen összetevo a pikrinsav (pl. Bouin oldat), amely javítja a mag finomstruktúrájának
megorzöttségét,
ezért
alkalmazása
pl.
limfoid
elváltozások
vagy
herebiopsziák morfológiai diagnosztikájában hasznos lehet. Ide tartoznak a nehézfémek is, így a higanyt (pl. Zenker oldat) vagy cinket tartalmazó fixálók melyek szintén a mag citológiai megítélhetoségét javíthatják. A fixálást a leheto leghamarabb el kell kezdeni, hogy megelozzük, mérsékeljük a nukleinsavak lebomlását. A szöveteket, melyek vastagsága lehetoleg kevesebb mint 0.5 cm, szobahomérsékleten 10%-os formalinban fixáljuk. Általában a sejtszuszpenziókat és citológiai
preparátumokat
95%-os
alkoholban
1
órán
át
szobahomérsékleten fixálhatjuk. Foszfát puffer oldatban (PBS) 4
4
o
C-on
vagy
o
C-on rövid ideig
o
tárolhatók vagy dehidrálva -70 C-on hosszú ideig is eltarthatók. A paraformaldehid is kiváló eredménnyel használható 1-4%-os koncentrációban 4-24 órán át fixálva a preparátumokat 4 oC-on vagy szobahomérsékleten, a fixálandó minta természetétol és nagyságától függoen.
A fixálás után a szövetmintákat 4 órán át 65
o
C-os paraffinba merítve
ágyazzák be. A paraffinba ágyazott szöveti blokk szobahomérsékleten megkeményedik és néhány µm-es szeletek készíthetok mikrotómmal. Ezen szükségszeru melegítési lépés következményeit fontos figyelembe venni az in situ PCR szempontjából: a száraz hohatás következtében a kettosszálú DNS-eken egyszálas törések, rések képzodnek és ez a jelzo nukleotidok primertol független
103
beépüléséhez vezet a direkt in situ PCR alatt. Ez a DNS repair mechanizmus direkt RT in situ PCR-nál felfüggesztheto DNáz emésztéssel, ami megakadályozza a jelölt nukleotidok nem specifikus direkt beépülését a DNS-be, ellentétben az RNS célszekvenciákkal. Felteheto a kérdés, hogy az aceton, etanol, vagy egyszeruen a fixálás elhagyása miért alkalmas folyadék fázisú PCR és in situ hybridizáció (ISH) esetében ha in situ PCR-nál általában nem eredményes? A folyadék fázisú PCR és az in situ PCR technika során is alaplépés a DNS szintézis. Az ISH-ban és az in situ PCR-ban viszont közös, hogy hasonló méretuek a két eljárás során használt nukleinsav molekulák (primer /PCR/; próba /ISH/), és a DNS polimerázok mérete is ezekhez hasonló nagyságrendu (Taq polimeráz ? 100 bp hosszú jelölt nukleinsav), mely molekuláknak át kell haladniuk egy összetett, fehérjékbol és nukleinsavakból álló háromdimenziós mátrixon, hogy létrejöhessen a szükséges összekapcsolódás a primer / próba, a polimeráz és a célszekvencia között. A legfobb különbség az in situ PCR és a két másik módszer között a végtermék kompartmentalizációjában rejlik. ISH-nál a próba-célszekvencia komplex a hybridizáció révén a magállományhoz kötött. A folyadék fázisú PCR folyamán az amplikon (a PCR termék) szétdiffundál az amplifikáló oldatban. Az in situ PCR egyedi abban a tekintetben, hogy a célszekvencia a maghoz rögzített (vagy a citoplazmához RNS estében) , de az amplikon megmaradhat eredeti helyén vagy átdiffundálva az egész sejten az amplifikáló oldatba juthat attól függoen hogy elozoleg
hogyan
fixálták
a
sejteket,
szöveteket.
Kimutatták,
hogy
a
keresztkötéseket létrehozó aldehid alapú fixálók alkalmasak csak arra, hogy teljesen megakadályozzák az amplikon eldiffundálását keletkezési helyérol. E) Proteolitikus (proteáz) emésztés (109, 103) Az aldehid-alapú szerekkel történt fixálás során nehezen eltávolítható keresztkötések alakulnak ki a celluláris és magi fehérjék valamint a nukleinsavak között, és más változások is bekövetkeznek amelyek gátolják a reagensek eljutását
célpontjukhoz,
ezáltal
gyengítve
a
PCR
hatékonyságát.
Ezért
proteázokkal való elokezelés szükséges, mely fellazítja a merev, fixált struktúrát,
104
megfelelo pórusméretet alakítva ki a reakciókomponensek bejuttatásához. A proteolitikus
emésztés
szoros
kontrolljával
elérheto,
hogy
a
szöveti
szerkezet
fennmaradjon és optimális legyen a jel/zaj arány. Ezért az álnegatív eredmény elkerülése érdekében – amit a reagensek alacsony fokú penetrációja egy alulemésztett mintában vagy túlemésztés miatt a szöveti szerkezet pusztulása okozhat – meg kell találni az ideális proteáz emésztés mértékét. A denaturáló fixálók (etanol, aceton) esetében nincs szükség emésztésre, minthogy ezek sokkal lazább intracelluláris mátrixot alakítanak ki (viszont épp ebbol következoen az amplikon kidiffundálhat a sejtbol, álnegativitást okozva).
E/1)
A proteáz emésztés speciális szempontjai (109, 103):
Az aldehid bázisú szerekkel végzett fixálás során létrejött fehérje-nukleinsav mátrix akadályozza meg az amplikon migrációját a sejten kívülre és teszi lehetové ezáltal a célszekvencia biztos kimutatását, szemben a denaturálószerekkel végzett fixálással. A keresztkötések létrejötte azonban szükségessé teszi a szövet emésztéssel történo fellazítását a reagensek bejuttatása érdekében. A proteáz feladata, hogy lehetové tegye a próba/ primer/ Taq polimeráz eljutását a célszekvenciához ISH és in situ PCR esetében. Ezt az eljárást direkt RT in situ PCR esetében is használják, de a proteáz emésztés további különleges funkciója hogy a genom összes DNS-ét amplifikálhatatlanná teszi azáltal hogy elérhetové teszi a DNS-t a következo lépésben alkalmazott DNáz számára. Elégtelen proteáz emésztés eredményeképp sok DNS-fehérje keresztkötés marad fenn és a DNáz nem lesz képes az összes sejtben lévo DNS megfelelo lebontására. Így a PCR során a nemspecifikus DNS repair következtében álpozitív jel keletkezik. A legfontosabb változó (direkt) RT in situ PCR esetében az az ido, ameddig a mintát proteázzal kezeljük. Megállapítást nyert, hogy a proteolitikus emésztés idejének korrelálnia kell a fixálás idotartamával. Általában 10 perces emésztés szükséges, ha a szövetet 4 órán át fixáltuk 10%-os formalinban, azonban 90 perces emésztés lehet szükséges, ha a szövet 24 órán át fixálódott. Bagasra és munkatársai szerint az emésztett sejtek membránján megjeleno borsszeru pontok jó indikátorai a megfelelo emésztésnek. A proteolitikus emésztés leállítását minden esetben el kell végezni az enzim inaktiválásával.
E/2)
A proteáz kiválasztása (109, 103)
A diagnosztikus és molekuláris patológiában leggyakrabban használt 3 proteáz a proteináz K, a pepszin és a tripszin. A legjobb ha kiválasztunk egy enzimet és kizárólagosan
ezt
használjuk
hogy
megfeleloen
tulajdonságaival.
105
tisztában
legyünk
a
speciális
A frissen elkészített proteáz oldatok lefagyaszthatóak kisebb (pl. 1 ml-es) adagokban. Fagyasztva a proteináz K több hónapig megtartja aktivitását, de 4 °C-on tárolva is hosszú ideig felhasználható. A pepszint (ill. tripszint) azonnal fel kell használni, vagy ha fagyasztjuk, akkor 1 héten belül. A felolvasztott pepszin oldatát jégen kell tartani felhasználásig és ekkor 37 °C-ra vagy szobahomérsékletre felmelegíteni. A proteázokat RNS munkákhoz használatos DEPC vízben oldjuk, ami RNáz mentes, RNáz gátló tulajdonságú (habár a proteáz valószínuleg bármilyen RNáz-t lebontana ami jelen van az oldatban).
E/3) Az optimális proteáz emésztés fogalma (109, 103) Az egyik legfontosabb dolog (amely egyben rávilágít a különféle detektálású in situ
PCR
technikák
mechanizmusainak
különbségeire)
a
proteáz
emésztéssel
kapcsolatban a következo: Ugyanazon szövetben a direkt RT in situ PCR-hoz szükséges optimális proteáz emésztési ido erosen különbözik az indirekt (RT) in situ PCR-hoz használt optimális idotol. Az indirekt in situ PCR (PCR ISH) esetében 30 perces emésztés pepszinnel a legtöbb sejt- és szövetpreparátum esetében megfelelo, a fixálás idotartamától függetlenül. A legtöbb szövetben, különösen amelyeket több mint 8 órán át fixáltak, a 30 perces emésztés pepszinnel nem lenne elgendo direkt RT in situ PCR-hoz. Ennek oka feltételezhetoen az a tény, hogy direkt RT in situ PCR-hoz a genom összes DNS templátjának DNáz-zal való lebontására van szükség, ennek lehetové tételéhez pedig a fehérje-DNS keresztkötéseket extenzíven fel kell szakítani a proteáz emésztéssel. Hosszabb fixálás esetén kiterjedtebb keresztkötések jönnek létre. Így érthetové válik a arány a proteáz emésztés és a fixálás ideje között.
Direkt RT in situ PCR esetében az optimális proteáz emésztést így határozhatjuk meg: az az ido, amely alatt – a jelzo nukleotidok direkt beépülése során – teljesülnek a következok: a sejtmagokban • ha DNáz emésztés nem történik: intenzív jel látható • DNáz emésztés után: nincs jel Szuboptimális proteáz emésztés esetén: a sejtmagokban • ha DNáz emésztés nem történt: mérsékelt vagy hiányzó jel • DNáz emésztés után: mérsékelt vagy eros a jel
106
Pozitív kontrollokban (nincs DNáz emésztés) az intenzív jel a magban optimális proteáz emésztés esetén a következo módon jöhet létre: a, célspecifikus DNS szintézis (ha a primerek valamely genomiális DNS-szakasz szekvenciájával is egyeznek) b, mispriming (ha a reagensek /beleértve a primereket is/ hozzáadása a mintához szobahomérsékleten történt; ilyenkor a primerek a célszekvenciától eltéro helyre is hybridizálhatnak nem specifikusan, és itt is megindulhat a folyamat) c, DNS repair vagy primertol független DNS szintézis (ami a paraffinba ágyazott minták feldolgozásánál a DNS-en szükségszeruen létrejövo egyszálas törések miatt van) Fontos megfigyelés, hogy szuboptimális proteáz emésztés esetén jel észlelheto a negatív kontrollokban, ami rendszerint erosebb mint a megfelelo pozitív kontrollok pozitivitása. A lehetséges magyarázat: az elégtelen emésztés miatt elegendo keresztkötés marad, hogy megakadályozza a genom teljes elemésztését a DNáz-zal. A DNáz képes megnövelni az egyszálú DNS-törések réseit, így ide a jelölt nukleotidok beépülnek és a primerektol független jel jön létre. Ezért ebben az esetben meg kell ismételni az eljárást hosszabb emésztési idovel.
E/4) Túlemésztés (109, 103) Ennek jelei a következokben mutatkoznak meg: a, gyengén látható mag és citoplazma b, feltuno basalis membránok c, a pozitív kontrollokban hiányzik a jel, vagy gyenge jel látható a citoplazmában (az amplikon a nagyfokú túlemésztés következtében a sejten kívülre /az amplifikáló oldatba/, enyhébb túlemésztésnél a citoplazmába vándorol) A proteináz K-val gyakoribb a túlemésztés mint pepszinnel vagy tripszinnel. In situ PCR-nál a proteázt könnyen inaktiválhatjuk. Egyszeruen le kell mosni az üveglemezrol: 1 perces mosás DEPC vízben, majd 1 perces mosás 100%-os etanolban elegendo. Nem szabad melegítéssel inaktiválni a proteázt, mint az folyadék fázisú PCRnál szokásos. A száraz ho alkalmazása ugyanis megakadályozza minden további hybridizációs lépésen alapuló jel létrejöttét a tárgylemezen lévo szövetben, akár standard ISH-t, akár az in situ PCR valamely fajtáját végezzük.
107
F)
Kiegészíto elokezelések (109,103) Ha jelölt nukleotidokat használunk, a szövetminta töltésének csökkentésével
minimalizálni tudjuk a nem specifikus kötodéseket. Ezt elérhetjük, ha a metszeteket 5 percig 0.1M trietanolamin és 0.25%-os acet-anhidrid oldatában mossuk. Ha peroxidázt akarunk használni a detektálásnál, az endogén peroxidázt inaktiválnunk kell bármelyik rutin módszerrel.
Az RT in situ PCR-nál szükséges lehet a minta eloemésztése RNáz mentes DNáz-zal (direkt módszer esetén), hogy eltávolítsuk az endogén DNS-t. A DNáz emésztést egész éjszakás (overnight) inkubációval célszeru végezni 37 °C-on. Habár megfelelo DNáz emésztéshez 8 óra is elég lehet, ennél hosszabb emésztési ido javasolt. A nem megfelelo DNáz emésztés, amire a negatív kontrollokban (DNáz; RT nélkül vagy RT nemspecifikus primerekkel) látható pozitivitás utal, leginkább a nem megfelelo proteáz emésztés következménye. A DNáz emésztési ido növelése vagy a DNáz koncentrációjának emelése rendszerint nem oldja meg ezt a problémát. Ebben az esetben a proteáz hatásidejét kell növelni, ami így már képes lesz teljes mértékben eltávolítani a DNS-emésztést lehetetlenné tevo DNSfehérje keresztkötéseket.
2. AMPLIFIKÁCIÓ Az in situ PCR végzéséhez fontos, hogy megfelelo tudással és tapasztalattal rendelkezzünk a folyadék fázisú PCR metodikájának területén, mivel a két módszer elméleti háttere közel azonos. Az elozetes ellenorzés folyamatának is része kell legyen a reagensek és reakció-feltételek folyadék fázisú PCR-ral való tesztelése. A következo pontokban az in situ technika speciális reagens- és beállítás-igényei kerülnek tárgyalásra. A) Polimerázok (109, 103) A kereskedelemben sokféle, különbözo tulajdonságú polimeráz kapható. A választott
enzimnek
hatékonyan
kell
muködnie
az
elongáció
(DNS
szintézis)
homérsékletén és meg kell oriznie aktivitását 95 °C-nál magasabb hofokon is. Fontos követni a felhasználásra vonatkozó gyártói eloírásokat, mivel a forgalmazótól függoen
108
ugyanazon enzim más-más reakció-körülményeket igényelhet. A hagyományos (viszont költségkímélo) Taq-nál jóval termostabilabb és pontosabb polimeráz a Pwo. Az rTth minthogy magnesium ionok jelenlétében polimeráz, mangán ionok mellett reverz transzkriptáz aktivitása van- RNS amplifikálásra használható. Általában 0.5-2.5 egység Taq DNS polimeráz elegendo egy 100 µl-es reakcióhoz, azonban a célszekvencia vagy a primerek fajtájától függoen az enzim koncentrációja változhat. Ajánlatos 0.5-5 egység/100 µl mennyiségben tesztelni az enzimet.
B) dNTP –k (109, 103) Mind a négy dNTP-t egyenlo koncentrációban, 20-200 µM-os tartományban ajánlott használni. A mispriming csökkentheto és az érzékenység növelheto, ha csökkentjük a dNTP-k koncentrációját. Általában egy 100 µl-es reakció 20 µM-os dNTP koncentrációnál 2.6 µg DNS vagy 400 bázispárnyi szakasz szintézisét teszi lehetové.
C) Amplifikáló puffer (109, 103) Fontos a megfelelo fémionok jelenléte az amplifikáló pufferben és az enzim számára optimális pH. Folyadék fázisú PCR-ral összehasonlítva magasabb DNS polimeráz és Mg2+ ion koncentráció szükséges in situ PCR-nál. Ez valószínuleg azzal függ össze, hogy a reagensek szekvesztrálódhatnak a tárgylemezen és a szöveti mintában esetlegesen jelen levo inhibitorok is gátolhatják a reakciót. Az ionkoncentráció a PCR kísérletek egyik kritikus faktora és optimalizálni kell az adott kísérleti feltételekhez.
D) Primerek (109, 103) A primereket rendszerint 18-28 nukleotid hosszúságúra kell tervezni, kiegyenlített G/C és A/T aránnyal úgy, hogy ne legyen komplementaritás a 3´ végek között (hogy ne képzodhessen
primer-dimer alak), és hogy belso másodlagos térszerkezet ne
alakulhasson ki. Általában 0.1-1.5 µM-os koncentráció megfelelo. A primer olvadási homérsékletének (=az a hofok, amelynél melegítés hatására a primerek fele már levált a célszekvenciáról) ismerete fontos, hogy megbecsülhessük, milyen homérséklet megfelelo a primerek bekötodéséhez. A 14-70 bp hosszúságú oligonukleotidok becsült olvadási homérsékletét (Tm) a következo képlettel számolhatjuk ki (mint a képletbol is kitunik, ezt elsosorban a primer hosszúsága, valamint a gyengébb kettos (A,T) és erosebb hármas hidrogénhíd kialakítására képes (G,C) bázisok aránya határozza meg): T m (°C)= 2 °C (#A+#T) + 4 °C (#G+#C)
109
E) Reverz transzkripció (109, 103) Az enzim, ami az RNS-t cDNS-sé alakítja, a reverz transzkriptáz (RT). Három fajta RT van kereskedelemi forgalomban: az Avian Myeloblastosis Virusból (AMV) és a Moloney Murine Leukemia Vírusból (M-muLV) származó mezofil viralis RT és az rTth, egy rekombináns technikával eloállított hostabil DNS polimeráz a Thermus thermophilusból, ami felhasználható reverz transzkripció és PCR egy lépésben való végrehajtásához. Az (RNáz H aktivitás-mentes) AMV és a M-muLV RT egészen 10 kb-ig tud átírni RNS-t, az rTth 1-2 kb-os tartományban szintetizál cDNS-t. A legfontosabb tényezok, melyeket az enzim kiválasztásánál figyelembe kell vennünk: a, endogén RNáz H aktivitás, ami az RNS-t az RNS-cDNS hybridbol lebontja (mindhárom enzim vad változata Rnáz H aktivitással bír, aminek hatására még a cDNS szintézis közben elkezd lebomlani az RNS; az AMV-nek és az M-muLV-nek kapható RNáz H aktivitás-mentes változata, melyek ezáltal hosszabb szakaszt képesek átírni) b, homérséklet: M-muLV 37 °C-on, az AMV 42 °C-on éri el maximális aktivitását; az rTth 60-70 °C-on írja át az RNS-t és 60-94 °C-on amplifikálja a cDNS-t c, divalens ion szükséglet: az rTth-nak mangánra van szüksége Háromféle primer használható reverz transzkripciós reakciókhoz: a, Oligo (dT) 12-18 (az mRNS endogén poly(A) farkához kötodik) b, random hexanukleotidok (ezek bármilyen komplementer szakaszhoz kötodhetnek az RNS teljes hosszában) c, specifikus oligonukleotidok (specifikus mRNS vagy viralis RNS szakaszhoz kötodik)
F) A PCR-ciklus folyamata (109, 103) Ahhoz hogy a primerek megfeleloen kötodjenek a DNS-hez, a kettos lánc szétválásának teljesnek kell lennie. Az inkomplett denaturáció a PCR kudarcának egyik lehetséges oka. Ezért az elso ciklus elé egy hosszabb denaturációt (5-10 perc) szoktak beiktatni, hogy biztosan végbemenjen a láncok szétválása. A denaturáció a késobbi ciklusok közben általában 95 °C-on 30 sec alatt vagy 97 °C-on 15 sec alatt érheto el, bár G+C-ban gazdag célszekvencia esetében szükség lehet magasabb homérsékletre. Magasabb homérséklet és hosszabb ido az enzimaktivitás elvesztéséhez vezethet, ugyanis a Taq polimeráz féléletideje 40 perc 95 °C-on és kevesebb, mint 5 perc 100 °Con, ezért érdemes a thermostabilabb Pwo polimerázt használni (féléletido kb. 2 óra 100 °C-on).
110
Az összekapcsolódás homérséklete és ideje függ a primerek alapösszetételétol, hosszától és koncentrációjától. Általában 5 °C-al az amplifikáláshoz használt primerek valódi Tm-je alatti homérséklet a megfelelo és ennek megfeleloen az 55-72 C0 közötti tartomány adja a legjobb eredményeket. Ha standard koncentrációjú primert használunk (0.2 µM), az összekapcsolódáshoz néhány másodpercre van szükség. Az elongáció rendszerint 72 °C-on 20 sec-tól 1 percig tartó idotartam alatt jön létre. Az elso PCR ciklusoknál az eloírtnál több idore lehet szükség, mivel a szubsztrát koncentrációja alacsony, és a végso ciklusoknál is, amikor a szubsztrát koncentrációja jelentosen meghaladja az enzim koncentrációját. Az utolsó ciklus után záró lépésként 72 °C-o n 5-15 percig fenntartjuk még a reakciót, hogy a részlegesen hybridizált primerpárok elongálása és az inkomplett elongációk befejezodhessenek.
Általánosan elfogadott, hogy az in situ DNS amplifikálás alacsony hatásfokú. Becslések szerint 30 ciklus alatt, még a legjobb feltételek mellett is, a DNS sokszorozása nem több mint 50-100-szoros szuszpendált sejtekben és még alacsonyabb lehet szöveti metszetekben. Ennek okai valószínuleg a DNS-hiszton keresztkötések, a DNS egyszálú törései, továbbá hozzájárulhat a DNS polimeráz és a reakcióhoz szükséges egyéb reagensek szekvesztrálódása a metszet felszínén. A ciklusok mennyisége elsosorban a DNS kezdeti koncentrációjától függ. Ha a célmolekula kezdeti kópiaszáma kb. 300.000, akkor 25-30 ciklusban végzett sokszorosítás elegendo. Ha csak 50 molekula van jelen, 40-45 ciklus lehet szükséges, azonban a ciklusszám növelésével az amplifikálás effektivitása és pontossága jelentosen csökkenhet.
111
7. 1.
IRODALOMJEGYZÉK Ádány R, Balázs M, Varga Cs: Klinikai és morfológiai laboratóriumi módszerek in: Molekuláris medicina (szerk. Kopper, Marcsek, Kovalszky) 1997, Medicina, pp.90100.
2.
Agnello V: Hepatitis C virus infection and type II cryoglobulinemia: an immunological perspective. Hepatology. 26(6):1375-9, 1997.
3.
Agnello V: The etiology and pathophysiology of mixed cryoglobulinemia secondary to hepatitis C virus infection. Springer Semin Immunopathol. 19(1):111-29, 1997.
4.
Aizawa Y, Shibamoto Y, Takagi I, Zeniya M, Toda G: Analysis of factors affecting the appearance of hepatocellular carcinoma in patients with chronic hepatitis C. A long term follow-up study after histologic diagnosis. Cancer. 89(1):53-9, 2000.
5.
Ali N, Pruijn GJ, Kenan DJ, Keene JD, Siddiqui A: Human La antigen is required for the hepatitis C virus internal ribosome entry site-mediated translation. J Biol Chem. 275(36):27531-40, 2000.
6.
Ali N, Siddiqui A: Interaction of polypyrimidine tract-binding protein with the 5' noncoding region of the hepatitis C virus RNA genome and its functional requirement in internal initiation of translation. J Virol. 69(10):6367-75, 1995.
7.
Alter H: Discovery of non-A, non-B hepatitis and identification of its etiology. Am J Med. 107(6B):16S-20S, 1999.
8.
Alzahrani AJ, Vallely PJ, McMahon RF: Development of a novel nested in situ PCR-ISH method for detection of hepatitis C virus RNA in liver tissue. Journal of Virological Methods. 99(1-2):53-61, 2002.
9.
Anwar A, Ali N, Tanveer R, Siddiqui A: Demonstration of functional requirement of polypyrimidine tract-binding protein by SELEX RNA during hepatitis C virus internal ribosome entry site-mediated translation initiation. J Biol Chem. 275(44):34231-5, 2000.
112
10.
Aoki H, Hayashi J, Moriyama M, Arakawa Y, Hino O: Hepatitis C virus core protein interacts with 14-3-3 protein and activates the kinase Raf-1. Journal of Virology. 74(4):1736-41, 2000.
11.
Banerjee
R,
Dasgupta
A:
Specific
interaction
of
hepatitis
C
virus
protease/helicase NS3 with the 3'-terminal sequences of viral positive- and negative-strand RNA. J Virol. 75(4):1708-21, 2001. 12.
Barba G, Harper F, Harada T, Kohara M, Goulinet S, Matsuura Y, Eder G, Schaff Zs, Chapman MJ, Miyamura T, Bréchot C: Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets. Proc Natl Acad Sci USA. 94:1200-5, 1997.
13.
Bianchi L, Gudat F: Chronic hepatitis. in: Pathology of the Liver (eds: MacSween, Anthony, Scheuer, Burt, Portmann) 3rd ed., 1994, Churchill Livingstone pp.349395.
14.
Borowski P, zur Wiesch JS, Resch K, Feucht H, Laufs R, Schmitz H: Protein kinase C recognizes the protein kinase A-binding motif of nonstructural protein 3 of hepatitis C virus. J Biol Chem. 274(43):30722-8. 1999.
15.
Bosch FX: Global epidemiology of hepatocellular carcinoma. in: Liver Cancer. (eds: Okuda, Tabor) 1997, Churchill Livingstone, pp.13-28.
16.
Bouffard P, Hayashi PH, Acevedo R, Levy N, Zeldis JB: Hepatitis C virus is detected in a monocyte/macrophage subpopulation of peripheral blood mononuclear cells of infected patients. J Infect Dis. 166(6):1276-80. 1992.
17.
Boyer N, Marcellin P: Pathogenesis, diagnosis and management of hepatitis C. J Hepatol. 32(1 Suppl):98-112, 2000.
18.
Brass V, Bieck E, Montserret R, Wolk B, Hellings JA, Blum HE, Penin F, Moradpour D. An amino-terminal amphipathic alpha-helix mediates membrane association of the hepatitis C virus nonstructural protein 5A. J Biol Chem. 277(10):8130-9, 2002.
19.
Buendia MA: Hepatitis B viruses and hepatocellular carcinoma. Adv Cancer Res. 59:167-226, 1992.
113
20.
Bukh J, Purcell RH, Miller RH: Sequence analysis of the 5' noncoding region of hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 89(11):4942-6, 1992.
21.
Buratti E, Tisminetzky S, Zotti M, Baralle FE. Functional analysis of the interaction between HCV 5'UTR and putative subunits of eukaryotic translation initiation factor eIF3. Nucleic Acids Res. 26(13):3179-87, 1998.
22.
Caselmann WH, Alt M: Hepatitis C virus infection as a major risk factor for hepatocellular carcinoma. J Hepatol. 24(2 Suppl):61-6, 1996.
23.
Chang M, Williams O, Mittler J, Quintanilla A, Carithers RL Jr, Perkins J, Corey L, Gretch DR: Dynamics of hepatitis C virus replication in human liver. Am J Pathol. 163(2):433-44, 2003.
24.
Chen SY, Kao CF, Chen CM, Shih CM, Hsu MJ, Chao CH, Wang SH, You LR, Lee YH: Mechanisms for inhibition of hepatitis B virus gene expression and replication by hepatitis C virus core protein. J Biol Chem. 278(1):591-607, 2003.
25.
Chisari FV: Viruses, immunity, and cancer: lessons from hepatitis B. (RousWhipple Award Lecture) Am J Pathol. 156(4):1117-32, 2000.
26.
Choi J, Xu Z, Ou JH. Triple decoding of hepatitis C virus RNA by programmed translational frameshifting. Mol Cell Biol. 23(5):1489-97, 2003.
27.
Choo QL, Kuo G, Weiner AJ, Overby LR, Bradley DW, Houghton M: Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome. Science. 244(4902): 359-62, 1989.
28.
Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C, Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina-Selby R, Barr PJ, Weiner AJ, Bradley DW, Kuo G, Houghton M: Genetic organization and diversity of the hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci USA. 88(6):2451-5, 1991.
29.
Clarke B: Molecular virology of hepatitis C virus. J Gen Virol. 78(Pt10):2397-410, 1997.
30.
Cohen J: The scientific challenge of hepatitis C. Science. 285(5424):26-30, 1999.
114
31.
Creedon G, Mabruk MJ, Grace A, Murphy M, Albloushi S, Billett P, Murray F, Leader M, Kay E: Lack of association between hepatitis C viral RNA in serum and liver and histologic gradings: a study on Irish anti-D-treated patients. Diagn Mol Pathol. 11(1):27-32, 2002.
32.
De Vos R, Verslype C, Depla E, Fevery J, Van Damme B, Desmet V, Roskams T: Ultrastructural visualization of hepatitis C virus components in human and primate liver biopsies. Journal of Hepatology. 37(3):370-9, 2002.
33.
Di Bisceglie AM: Hepatitis C – virology and future antiviral targets. Am J Med. 107(6B):45S-48S, 1999.
34.
Di Bisceglie AM: Hepatitis C and hepatocellular carcinoma: Hepatology. 26(3 Suppl 1):34S-38S, 1997.
35.
Dore MP, Realdi G, Mura D, Onida A, Massarelli G, Dettori G, Graham DY, Sepulveda AR: Genomic instability in chronic viral hepatitis and hepatocellular carcinoma. Human Pathology. 32(7):698-703, 2001.
36.
Dumoulin FL, von dem Bussche A, Li J, Khamzina L, Wands JR, Sauerbruch T, Spengler U: Hepatitis C virus NS2 protein inhibits gene expression from different cellular and viral promoters in hepatic and nonhepatic cell lines. Virology. 305(2):260-6, 2003.
37.
Fang JW, Moyer RW: The effects of the conserved extreme 3' end sequence of hepatitis C virus (HCV) RNA on the in vitro stabilization and translation of the HCV RNA genome. J Hepatol. 33(4):632-9, 2000.
38.
Feo F, Pascale RM, Simile MM, De Miglio MR, Muroni MR, Calvisi D: Genetic alterations in liver carcinogenesis: implications for new preventive and therapeutic strategies. Crit Rev Oncog. 11(1):19-62, 2000.
39.
Ferrell LD, Theise ND, Scheuer PJ: Acute and chronic viral hepatitis. in: Pathology of the Liver (eds: MacSween, Burt, Portmann, Ishak, Scheuer, Anthony) 4th ed., 2002, Churchill Livingstone pp.313-362.
115
40.
Florese RH, Nagano-Fujii M, Iwanaga Y, Hidajat R, Hotta H: Inhibition of protein synthesis by the nonstructural proteins NS4A and NS4B of hepatitis C virus. Virus Res. 90(1-2):119-31, 2002.
41.
Fontaine H, Nalpas B, Poulet B, Carnot F, Zylberberg H, Brechot C, Pol S: Hepatitis activity index is a key factor in determining the natural history of chronic hepatitis C. Hum Pathol. 32(9):904-9, 2001.
42.
Friebe P, Bartenschlager R: Genetic analysis of sequences in the 3' nontranslated region of hepatitis C virus that are important for RNA replication. J Virol. 76(11):5326-38, 2002.
43.
Fried MW: Diagnostic testing for hepatitis C: practical considerations. Am J Med. 107(6B):31S-35S, 1999.
44.
Fukuma T, Enomoto N, Marumo F, Sato C: Mutations in the interferon-sensitivity determining region of hepatitis C virus and transcriptional activity of the nonstructural region 5A protein. Hepatology. 28(4):1147-53, 1998.
45.
Gardner JP, Durso RJ, Arrigale RR, Donovan GP, Maddon PJ, Dragic T, Olson WC: L-SIGN (CD 209L) is a liver-specific capture receptor for hepatitis C virus. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(8):4498-503, 2003.
46.
Garson JA, Tedder RS, Briggs M, Tuke P, Glazebrook JA, Trute A, Parker D, Barbara JA, Contreras M, Aloysius S: Detection of hepatitis C viral sequences in blood donations by "nested" polymerase chain reaction and prediction of infectivity. Lancet. 335(8703):1419-22, 1990.
47.
Ghosh AK, Majumder M, Steele R, Ray R, Ray RB: Modulation of interferon expression by hepatitis C virus NS5A protein and human homeodomain protein PTX1. Virology. 306(1):51-9, 2003.
48.
Ghosh AK, Majumder M, Steele R, Yaciuk P, Chrivia J, Ray R, Ray RB: Hepatitis C virus NS5A protein modulates transcription through a novel cellular transcription factor SRCAP. J Biol Chem. 275(10):7184-8, 2000.
116
49.
Goh PY, Tan YJ, Lim SP, Lim SG, Tan YH, Hong WJ: The hepatitis C virus core protein interacts with NS5A and activates its caspase-mediated proteolytic cleavage. Virology. 290(2):224-36, 2001.
50.
Gottlieb E, Steitz JA: Function of the mammalian La protein: evidence for its action in transcription termination by RNA polymerase III. EMBO J. 8(3):851-61, 1989.
51.
Hahm B, Kim YK, Kim JH, Kim TY, Jang SK: Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L interacts with the 3' border of the internal ribosomal entry site of hepatitis C virus. J Virol. 72(11):8782-8. 1998.
52.
Hayashi J, Aoki H, Arakawa Y, Hino O: Hepatitis C virus and hepatocarcinogenesis. Intervirology. 42(2-3):205-10, 1999.
53.
He Y, Katze MG: To interfere and to anti-interfere: the interplay between hepatitis C virus and interferon. Viral Immunol. 15(1):95-119. 2002.
54.
He Y, Nakao H, Tan SL, Polyak SJ, Neddermann P, Vijaysri S, Jacobs BL, Katze MG: Subversion of cell signaling pathways by hepatitis C virus nonstructural 5A protein via interaction with Grb2 and P85 phosphatidylinositol 3-kinase. J Virol. 76(18):9207-17, 2002.
55.
He Y, Yan W, Coito C, Li Y, Gale M Jr, Katze MG: The regulation of hepatitis C virus (HCV) internal ribosome-entry site-mediated translation by HCV replicons and nonstructural proteins. J Gen Virol. 84(Pt 3):535-43. 2003.
56.
Heintges T, Wands JR: Hepatitis C virus: epidemiology and transmission. Hepatology. 26(3): 521-6, 1997.
57.
Hirota M, Satoh S, Asabe S, Kohara M, Tsukiyama-Kohara K, Kato N, Hijikata M, Shimotohno K: Phosphorylation of nonstructural 5A protein of hepatitis C virus: HCV group-specific hyperphosphorylation. Virology. 257(1):130-7, 1999.
58.
Honda M, Kaneko S, Matsushita E, Kobayashi K, Abell GA, Lemon SM: Cell cycle regulation of hepatitis C virus internal ribosomal entry site-directed translation. Gastroenterology. 118(1):152-62, 2000.
117
59.
Hoofnagle JH: Course and outcome of hepatitis C. Hepatology. 36(5I):S21-S29, 2002.
60.
Horányi M: A vírushepatitisek molekuláris géntechnológiai diagnosztikája. in: Hepatológia (eds: Fehér, Lengyel) 1st ed., 2001, Medicina pp.236-245.
61.
Huang H, Fujii H, Sankila A, Mahler-Araujo BM, Matsuda M, Cathomas G, Ohgaki H: Beta-catenin mutations are frequent in human hepatocellular carcinomas associated with hepatitis C virus infection. Am J Pathol. 155(6):1795-801, 1999.
62.
Ide Y, Tanimoto A, Sasaguri Y, Padmanabhan R: Hepatitis C virus NS5A protein is phosphorylated in vitro by a stably bound protein kinase from HeLa cells and by cAMP-dependent protein kinase A-alpha catalytic subunit. Gene. 201(1-2):151-8, 1997.
63.
Idilman R, De Maria N, Colantoni A, Van Thiel DH: Pathogenesis of hepatitis B and C-induced hepatocellular carcinoma. J Viral Hepat. 5(5):285-99, 1998.
64.
Ishak KG: Pathologic features of chronic hepatitis. A review and update. Am J Clin Pathol. 113(1):40-55, 2000.
65.
Ito T, Tahara SM, Lai MM: The 3'-untranslated region of hepatitis C virus RNA enhances translation from an internal ribosomal entry site. J Virol. 72(11):8789-96, 1998.
66.
Jármay K, Karácsony G, Ozsvár Zs, Nagy I, Lonovics J, Lotz G, Schaff Zs: Histological evaluation of the response to interferon-? therapy in chronic hepatitis C. Journal of Hepatology. 26(Suppl.1.):220, 1997.
67.
Jármay K, Karácsony G, Ozsvár Zs , Nagy I, Lonovics J, Schaff Zs: Krónikus
C
hepatitis klinikopatológiai képének alakulása 6 és 12 hónapos interferon-alfa kezelést követoen. Orv Hetil. 139(15):875-81, 1998. 68.
Jármay K, Karácsony G, Ozsvár Zs, Nagy I, Schaff Zs, Lonovics J: Krónikus C vírus
hepatitis
szövettani
jellemzoi
139(33):1955-60, 1998.
118
biopsziás
anyagunkban.
Orv
Hetil.
69.
Jármay K, Szepesi Á, Lotz G, Lonovics J, Karácsony G, Ozsvár Zs, Nagy I, Schaff Zs: FAS antigen (APO1/CD95) expression in chronic hepatitis C. Journal of Hepatology. 26(Suppl. 1.):257, 1997.
70.
Johnston H, Kneer J, Chackalaparampil I, Yaciuk P, Chrivia J: Identification of a novel SNF2/SWI2 protein family member, SRCAP, which interacts with CREBbinding protein. J Biol Chem. 274(23):16370-6, 1999.
71.
Kato J, Kato N, Yoshida H, Ono-Nita SK, Shiratori Y, Omata M: Hepatitis C virus NS4A and NS4B proteins suppress translation in vivo. J Med Virol. 66(2):187-99, 2002.
72.
Kew MC, Yu MC, Kedda MA, Coppin A, Sarkin A, Hodkinson J: The relative roles of hepatitis B and C viruses in the etiology of hepatocellular carcinoma in southern African blacks. Gastroenterology. 112(1):184-7, 1997.
73.
Kieft JS, Zhou K, Jubin R, Doudna JA. Mechanism of ribosome recruitment by hepatitis C IRES RNA. RNA. 7(2):194-206, 2001.
74.
Kim J, Lee D, Choe J: Hepatitis C virus NS5A protein is phosphorylated by casein kinase II. Biochemical & Biophysical Research Communications. 257(3):777-81, 1999.
75.
Kim JH, Paek KY, Choi K, Kim TD, Hahm B, Kim KT, Jang SK: Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein C modulates translation of c-myc mRNA in a cell cycle phase-dependent manner. Mol Cell Biol. 23(2):708-20, 2003.
76.
Kim KC, Kim TS, Kang KH, Choi KH: Amphiphysin IIb-1, a novel splicing variant of amphiphysin II, regulates p73beta function through protein-protein interactions. Oncogene. 20(46):6689-99. 2001.
77.
Kiss A, Lotz G, Kaposi Novák P, Schaff Zs: Hepatitis vírusok és hepatocarcinogenesis. Orvosi Hetilap. 143: 83-86, 2002.
78.
Koch
JO,
Bartenschlager
R:
Modulation
of
hepatitis
C
virus
NS5A
hyperphosphorylation by nonstructural proteins NS3, NS4A, and NS4B. J Virol. 73(9):7138-46, 1999.
119
79.
Kolykhalov AA, Mihalik K, Feinstone SM, Rice CM: Hepatitis C virus-encoded enzymatic activities and conserved RNA elements in the 3' nontranslated region are essential for virus replication in vivo. J Virol. 74(4):2046-51, 2000.
80.
Kong LK, Sarnow P: Cytoplasmic expression of mRNAs containing the internal ribosome entry site and 3' noncoding region of hepatitis C virus: effects of the 3' leader on mRNA translation and mRNA stability. J Virol. 76(24):12457-62. 2002.
81.
Koukoulis GK: Chronic hepatitis C: grading, staging, and searching for reliable predictors of outcome. Hum Pathol. 32(9):899-903, 2001.
82.
Kovalszky I: Módszerek. in: Molekuláris medicina (szerk. Kopper, Marcsek, Kovalszky) 1997, Medicina, pp.54-76.
83.
Kruger M, Beger C, Li QX, Welch PJ, Tritz R, Leavitt M, Barber JR, Wong-Staal F: Identification of eIF2Bgamma and eIF2gamma as cofactors of hepatitis C virus internal ribosome entry site-mediated translation using a functional genomics approach. Proc Natl Acad Sci U S A. 97(15):8566-71, 2000.
84.
Lan KH, Sheu ML, Hwang SJ, Yen SH, Chen SY, Wu JC, Wang YJ, Kato N, Omata M, Chang FY, Lee SD: HCV NS5A interacts with p53 and inhibits p53mediated apoptosis. Oncogene. 21(31):4801-11, 2002.
85.
Lanford RE, Sureau C, Jacob JR, White R, Fuerst TR: Demonstration of in vitro infection of chimpanzee hepatocytes with hepatitis C virus using strand-specific RT/PCR. Virology. 202(2):606-14, 1994.
86.
Lengyel G, Fehér J: Vírushepatitisek (? Hepatitis C). in: Hepatológia (eds: Fehér, Lengyel) 1st ed., 2001, Medicina pp.512-522.
87.
Lerat H, Honda M, Beard MR, Loesch K, Sun J, Yang Y, Okuda M, Gosert R, Xiao SY, Weinman SA, Lemon SM: Steatosis and liver cancer in transgenic mice expressing the structural and nonstructural proteins of hepatitis C virus. Gastroenterology. 122 (2):352-65, 2002.
88.
Lidonnici K, Lane B, Nuovo GJ: Comparison of serologic analysis and in situ localization of PCR-amplified cDNA for the diagnosis of hepatitis C infection. Diagnostic Molecular Pathology. 4(2):98-107, 1995.
120
89.
Liu Q, Bhat RA, Prince AM, Zhang P: The hepatitis C virus NS2 protein generated by NS2-3 autocleavage is required for NS5A phosphorylation. Biochem Biophys Res Commun. 254(3):572-7, 1999.
90.
Lott JA, Nolte FS, Gretch DR, Koff RS, Seeff LB: Hepatitis serologic markers and nucleic acid testing. in: Laboratory Medicine Practice Guidelines – Laboratory guidelines for screening, diagnosis and monitoring of hepatic injury (ed: Dufour) Vol.12, 2000, The National Academy of Clinical Biochemistry (USA) pp.18-24.
91.
Lotz G, Jármay K, Karácsony G, Ozsvár Zs, Nagy I, Lonovics J, Schaff Zs: Detection of HCV antigens by immunogold method. Z Gastroenterol. 34:321(abstr. 84.), 1996.
92.
Lotz G, Kiss A, Kaposi Novák P, Sobel G, Schaff Zs: Hepatitis viruses and hepatocarcinogenesis. Journal of Physiology (Paris). 95:417-422, 2001.
93.
Madi N, Paccaud JP, Steiger G, Schifferli JA: Immune complex binding efficiency of erythrocyte complement receptor 1 (CR1). Clin Exp Immunol. 84(1):9-15, 1991.
94.
Majumder M, Ghosh AK, Steele R, Ray R, Ray RB: Hepatitis C virus NS5A physically associates with p53 and regulates p21/waf1 gene expression in a p53dependent manner. J Virol. 75(3):1401-7, 2001.
95.
Majumder M, Ghosh AK, Steele R, Zhou XY, Phillips NJ, Ray R, Ray RB: Hepatitis C virus NS5A protein impairs TNF-mediated hepatic apoptosis, but not by an antiFAS antibody, in transgenic mice. Virology. 294(1):94-105, 2002.
96.
Martinot-Peignoux M, Roudot-Thoraval F, Mendel I, Coste J, Izopet J, Duverlie G, Payan C, Pawlotsky JM, Defer C, Bogard M, Gerolami V, Halfon P, Buisson Y, Fouqueray B, Loiseau P, Lamoril J, Lefrere JJ, Marcellin P: Hepatitis C virus genotypes in France: relationship with epidemiology, pathogenicity and response to interferon therapy. The GEMHEP. J Viral Hepat. 6(6):435-43, 1999.
97.
Mester P, Lotz G, Szalay F, Schaff Zs: Grading and staging of chronic hepatitis and its correlation with transforming growth factor ?1. Z Gastroenterol 33:288(abstr. 88.), 1995.
121
98.
Moldvay J, Deny P, Pol S, Brechot C, Lamas E: Hepatitis C vírus RNS kimutatása in situ hibridizációval, fertozött betegek perifériás vérének mononuclearis sejtjeiben. Orv Hetil. 136(42):2267-71, 1995.
99.
Morgenstern KA, Landro JA, Hsiao K, Lin C, Gu Y, Su MS, Thomson JA: Polynucleotide modulation of the protease, nucleoside triphosphatase, and helicase activities of a hepatitis C virus NS3-NS4A complex isolated from transfected COS cells. J Virol. 71(5):3767-75, 1997.
100. Murakami K, Abe M, Kageyama T, Kamoshita N, Nomoto A. Down-regulation of translation driven by hepatitis C virus internal ribosomal entry site by the 3' untranslated region of RNA. Arch Virol. 146(4):729-41, 2001. 101. Murashima S, Kumashiro R, Ide T, Miyajima I, Hino T, Koga Y, Ishii K, Ueno T, Sakisaka S, Sata M: Effect of interferon treatment on serum 2',5'-oligoadenylate synthetase levels in hepatitis C-infected patients. J Med Virol. 62(2):185-90, 2000. 102. Muratori L, Gibellini D, Lenzi M, Cataleta M, Muratori P, Morelli MC, Bianchi FB: Quantification of hepatitis C virus-infected peripheral blood mononuclear cells by in situ reverse transcriptase-polymerase chain reaction. Blood. 88(7):2768-74. 1996. 103. Muro-Cacho CA: In situ PCR. Overview of procedures and applications. Front Biosci. 2:c15-29, 1997. 104. Myers TW, Gelfand DH: Reverse transcription and DNA amplification by a Thermus thermophilus DNA polymerase. Biochemistry. 30(31):7661-6, 1991. 105. Neddermann P, Clementi A, De Francesco R: Hyperphosphorylation of the hepatitis C virus NS5A protein requires an active NS3 protease, NS4A, NS4B, and NS5A encoded on the same polyprotein. J Virol. 73(12):9984-91, 1999. 106. Negro F, Krawczynski K, Quadri R, Rubbia-Brandt L, Mondelli M, Zarski JP, Hadengue A: Detection of genomic- and minus-strand of hepatitis C virus RNA in the liver of chronic hepatitis C patients by strand-specific semiquantitative reverse-transcriptase polymerase chain reaction. Hepatology. 29(2):536-42, 1999.
122
107. Negro F. Hepatitis C virus and liver steatosis: is it the virus? Yes it is, but not always. Hepatology. 36(5):1050-2, 2002. 108. Nelson RA Jr.: The immune-adherence phenomenon; an immunologically specific reaction between microorganisms and erythrocytes leading to enhanced phagocytosis. Science. 118(3077):733-7, 1953. 109. Nuovo GJ: The foundations of successful RT in situ PCR. Front Biosci. 1:c4-c15, 1996. 110. Ogat S, Ku Y, Yoon S, Makino S, Nagano-Fujii M, Hotta H: Correlation between secondary structure of an amino-terminal portion of the nonstructural protein 3 (NS3) of hepatitis C virus and development of hepatocellular carcinoma. Microbiol Immunol. 46(8):549-54, 2002. 111. Ogata S, Nagano-Fujii M, Ku Y, Yoon S, Hotta H: Comparative sequence analysis of the core protein and its frameshift product, the F protein, of hepatitis C virus subtype 1b strains obtained from patients with and without hepatocellular carcinoma. J Clin Microbiol. 40(10):3625-30, 2002. 112. Oka K, Nagano-Fujii M, Yoshida I, Hidajat R, Deng L, Akutsu M, Hotta H: Hepatitis C virus core protein selectively inhibits synthesis and accumulation of p21/Waf1 and certain nuclear proteins. Microbiol Immunol. 47(6):429-38, 2003. 113. Okamoto H, Okada S, Sugiyama Y, Yotsumoto S, Tanaka T, Yoshizawa H, Tsuda F, Miyakawa Y, Mayumi M: The 5'-terminal sequence of the hepatitis C virus genome. Jpn J Exp Med. 60(3):167-77, 1990. 114. Okuda M, Li K, Beard MR, Showalter LA, Scholle F, Lemon SM, Weinman SA: Mitochondrial injury, oxidative stress, and antioxidant gene expression are induced by hepatitis C virus core protein. Gastroenterology. 122(2):366-75, 2002. 115. Pandya J, Chakraborti A, Chawla Y, Dilawari JB, Sehgal S, Ganguly NK: Identification of human hepatocyte protein(s), which binds specifically to the recombinant envelope-2/non-structural-1 protein of hepatitis C virus. Virus Res. 87(2):135-143, 2002.
123
116. Pár A, Telegdy L, Dalmi L, Müller É; Hungarian Viral Hepatitis Treatment Study Group: Therapy for chronic hepatitis C. J Physiol Paris. 95(1-6):399-405. 2001. 117. Pár A: Diagnosis and management of chronic hepatitis C. Can J Gastroenterol. 14 Suppl B:83B-88B, 2000. 118. Pár A: Pathogenesis and treatment of autoimmune hepatitis and chronic viral hepatitis B and C. Acta Physiol Hung. 87(4):373-95, 2000. 119. Park KJ, Choi SH, Lee SY, Hwang SB, Lai MM: Nonstructural 5A protein of hepatitis C virus modulates tumor necrosis factor alpha-stimulated nuclear factor kappa B activation. J Biol Chem. 277(15):13122-8, 2002. 120. Pascual M, Danielsson C, Steiger G, Schifferli JA: Proteolytic cleavage of CR1 on human erythrocytes in vivo: evidence for enhanced cleavage in AIDS. Eur J Immunol. 24(3):702-8, 1994. 121. Pascual M, Lutz HU, Steiger G, Stammler P, Schifferli JA: Release of vesicles enriched in complement receptor 1 from human erythrocytes. J Immunol. 151(1):397-404, 1993. 122. Pascual M, Schifferli JA: Another function of erythrocytes: transport of circulating immune complexes. Infusionsther Transfusionsmed. 22(5):310-5, 1995. 123. Perlemuter G, Sabile A, Letteron P, Vona G, Topilco A, Chretien Y, Koike K, Pessayre D, Chapman J, Barba G, Brechot C: Hepatitis C virus core protein inhibits microsomal triglyceride transfer protein activity and very low density lipoprotein secretion: a model of viral-related steatosis. FASEB J. 16(2):185-94, 2002. 124. Qadri I, Iwahashi M, Simon F: Hepatitis C virus NS5A protein binds TBP and p53, inhibiting their DNA binding and p53 interactions with TBP and ERCC3. Biochim Biophys Acta. 1592(2):193-204, 2002. 125. Radkowski M, Wilkinson J, Nowicki M, Adair D, Vargas H, Ingui C, Rakela J, Laskus T: Search for hepatitis C virus negative-strand RNA sequences and analysis of viral sequences in the central nervous system: evidence of replication. J Virol. 76(2):600-8, 2002.
124
126. Ray RB, Steele R, Basu A, Meyer K, Majumder M, Ghosh AK, Ray R: Distinct functional role of Hepatitis C virus core protein on NF-kappaB regulation is linked to genomic variation. Virus Res. 87(1):21-9, 2002. 127. Reed KE, Rice CM: Identification of the major phosphorylation site of the hepatitis C virus H strain NS5A protein as serine 2321. J Biol Chem. 274(39):28011-8, 1999. 128. Roccasecca R, Ansuini H, Vitelli A, Meola A, Scarselli E, Acali S, Pezzanera M, Ercole BB, McKeating J, Yagnik A, Lahm A, Tramontano A, Cortese R, Nicosia A: Binding of the hepatitis C virus E2 glycoprotein to CD81 is strain specific and is modulated by a complex interplay between hypervariable regions 1 and 2. J Virol. 77(3):1856-67, 2003. 129. Roccatello D, Morsica G, Picciotto G, Cesano G, Ropolo R, Bernardi MT, Cacace G, Cavalli G, Sena LM, Lazzarin A, Piccoli G, Rifai A: Impaired hepatosplenic elimination of circulating cryoglobulins in patients with essential mixed cryoglobulinaemia and hepatitis C virus (HCV) infection. Clin Exp Immunol. 110(1):9-14, 1997. 130. Rodrigues CMP, Brites D, Serejo F, Costa A, Ramalho F, de Moura MC: Apoptotic cell death does not parallel other indicators of liver damage in chronic hepatitis C patients. Journal of Viral Hepatitis 7(3):175-83, 2000. 131. Rosen HR, Gretch DR: Hepatitis C virus: current understanding and prospects for future therapies. Mol Med Today. 5(9):393-9, 1999. 132. Sakai A, Claire MS, Faulk K, Govindarajan S, Emerson SU, Purcell RH, Bukh J: The p7 polypeptide of hepatitis C virus is critical for infectivity and contains functionally important genotype-specific sequences. Proc Natl Acad Sci U S A. 100(20):11646-51, 2003. 133. Sansonno D, Iacobelli AR, Cornacchiulo V, Lauletta G, Distasi MA, Gatti P, Dammacco F: Immunochemical and biomolecular studies of circulating immune complexes isolated from patients with acute and chronic hepatitis C virus infection. Eur J Clin Invest. 26(6):465-75, 1996.
125
134. Sárváry E, Varga M, Nemes B, Kóbori L, Zalka A, Sulyok B, Görög D, Fehérvári I, Járay J, Halmos O, Alföldy F, Tóth A, Lakatos M, Perner F: Hepatitis C-vírus (HCV)-RNS kvalitatív és kvantitatív kimutatása PCR technikával. A HCV–RNSkópiaszám monitorozása májtranszplantációt követõen. Orv Hetil. 142(18):93942. 2001. 135. Satoh S, Hirota M, Noguchi T, Hijikata M, Handa H, Shimotohno K: Cleavage of hepatitis C virus nonstructural protein 5A by a caspase-like protease(s) in mammalian cells. Virology. 270(2):476-87, 2000. 136. Scarselli E, Ansuini H, Cerino R, Roccasecca RM, Acali S, Filocamo G, Traboni C, Nicosia A, Cortese R, Vitelli A: The human scavenger receptor class B type I is a novel candidate receptor for the hepatitis C virus. EMBO J. 21(19):5017-25, 2002. 137. Schaff Zs, Jármay K, Lotz G, Kovalszky I: Steatosis and chronic hepatitis C. Pathologica 94:83, 2002. 138. Schaff Zs, Jármay K, Szepesi Á, Szalay F, Patonai A, Nemes B, Lotz G, Lonovics J: Correlation of Transforming Growth Factor ß1, apoptosis and proliferation in chronic hepatitis C. Journal of Hepatology. 28(Suppl.1.):101, 1998. lg12 139. Schaff Zs, Lapis K, Henson DE: Liver. in: Pathology of Incipient Neoplasia. Major Problems in Pathology. Vol. 28. (eds: Henson, Albores-Saavedra) 2nd ed., 1993, W.B. Saunders Co. pp.151-166. 140. Schaff Zs, Lotz G, Eder G, Schulte-Hermann R: Pathogenesis and apoptosis in viral hepatitis. Antiviral Therapy. 1(Suppl. 3):25-32, 1996. 141. Schaff Zs, Lotz G, Eder G, Schulte-Hermann R: Pathomorphology and apoptosis in viral hepatitis. in: Therapies for Viral Hepatitis. (eds. Schinazi, Sommadossi, Thomas) 1998, Int. Med. Press Ltd pp.77-86. 142. Schaff Zs, Lotz G, Jármay K: A vírus hepatitis patológiája és patogenezise. Orvosi Hetilap. 138(22)(Suppl. I.):1459-1462, 1997.
126
143. Schaff Zs, Lotz G, Schulte-Hermann R: Pathomorphological characteristics and pathogenesis of viral hepatitis. Pathology & Oncology Research.
2:132-143,
1996. 144. Scheuer PJ: Viral hepatitis. in: Pathology of the Liver (eds: MacSween, Anthony, Scheuer, Burt, Portmann) 3rd ed., 1994, Churchill Livingstone pp.243-267. 145. Schmidt WN, Wu P, Han JQ, Perino MJ, LaBrecque DR, Stapleton JT: Distribution of hepatitis C virus (HCV) RNA in whole blood and blood cell fractions: plasma HCV RNA analysis underestimates circulating virus load. J Infect Dis. 176(1):20-6, 1997. 146. Seeff LB: Natural history of hepatitis C. Am J Med. 107(6B):10S-15S. 1999. 147. Shi ST, Lee KJ, Aizaki H, Hwang SB, Lai MM: Hepatitis C virus RNA replication occurs on a detergent-resistant membrane that cofractionates with caveolin-2. J Virol. 77(7):4160-8, 2003. 148. Shi ST, Polyak SJ, Tu H, Taylor DR, Gretch DR, Lai MM: Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins. Virology. 292(2):198-210. 2002. 149. Shimotohno K: Hepatitis C virus and its pathogenesis. Semin Cancer Biol. 10(3):233-40, 2000. 150. Shirota Y, Luo H, Qin W, Kaneko S, Yamashita T, Kobayashi K, Murakami S: Hepatitis C virus (HCV) NS5A binds RNA-dependent RNA polymerase (RdRP) NS5B and modulates RNA-dependent RNA polymerase activity. J Biol Chem. 277(13):11149-55, 2002. 151. Simmonds P, Alberti A, Alter HJ, Bonino F, Bradley DW, Brechot C, Brouwer JT, Chan SW, Chayama K, Chen DS, et al. A proposed system for the nomenclature of hepatitis C viral genotypes. Hepatology. 19(5):1321-4. 1994. 152. Song J, Nagano-Fujii M, Wang F, Florese R, Fujita T, Ishido S, Hotta H: Nuclear localization and intramolecular cleavage of N-terminally deleted NS5A protein of hepatitis C virus. Virus Res. 69(2):109-17, 2000.
127
153. Spengler U, Dumoulin FL, Woitas R, Leifeld L, Schneiders A, Langhans B, Schweitzer S, Düesberg U, Lechmann M, Sauerbruch T: Hepatitis C – immunopathogenesis in: Liver cirrhosis and its development (eds: Boyer, Blum, Maier, Sauerbruch, Stalder) 2000, Kluwer Academic Publishers pp.113-123. 154. Sugimoto K, Stadanlick J, Ikeda F, Brensinger C, Furth EE, Alter HJ, Chang KM: Influence of ethnicity in the outcome of hepatitis C virus infection and cellular immune response. Hepatology. 37(3):590-9, 2003. 155. Sullivan DG, Wilson JJ, Carithers RL Jr, Perkins JD, Gretch DR: Multigene tracking of hepatitis C virus quasispecies after liver transplantation: correlation of genetic diversification in the envelope region with asymptomatic or mild disease patterns. J Virol. 72(12):10036-43, 1998. 156. Szabó B: Hepatitisvírusok. in: Orvosi mikrobiológia (ed: Gergely) 1st ed., 1999, Semmelweis pp.353-367. 157. Szepesi Á, Lotz G, Patonai A, Schaff Zs: Cyclin A and PCNA expression in chronic hepatitis C. Journal of Hepatology. 26(Suppl.1.):144, 1997. 158. Tanaka H, Tsukuma H, Kasahara A, Hayashi N, Yoshihara H, Masuzawa M, Kanda T, Kashiwagi T, Inoue A, Kato M, Oshima A, Kinoshita Y, Kamada T: Effect of interferon therapy on the incidence of hepatocellular carcinoma and mortality of patients with chronic hepatitis C: a retrospective cohort study of 738 patients. Int J Cancer. 87(5):741-9, 2000. 159. Taylor DR, Shi ST, Romano PR, Barber GN, Lai MM: Inhibition of the interferoninducible protein kinase PKR by HCV E2 protein. Science. 285(5424):107-10, 1999. 160. Tennant F, Moll D: Seroprevalence of hepatitis A, B, C, and D markers and liver function abnormalities in intravenous heroin addicts. Journal of Addictive Diseases. 14(3):35-49, 1995. 161. Thio CL, Thomas DL, Carrington M: Chronic viral hepatitis and the human genome. Hepatology. 31(4):819-27, 2000.
128
162. Thio CL, Thomas DL, Goedert JJ, Vlahov D, Nelson KE, Hilgartner MW, O'Brien SJ, Karacki P, Marti D, Astemborski J, Carrington M: Racial differences in HLA class II associations with hepatitis C virus outcomes. J Infect Dis. 184(1):16-21, 2001. 163. Thomas HC: Chronic Hepatitis C - The role of interferons in chronic viral hepatitis. Roche Consultant Series (4) No. 2, 1994. (Gardiner-Caldwell Communications Ltd., UK) 164. Tokita H, Okamoto H, Iizuka H, Kishimoto J, Tsuda F, Lesmana LA, Miyakawa Y, Mayumi M: Hepatitis C virus variants from Jakarta, Indonesia classifiable into novel genotypes in the second (2e and 2f), tenth (10a) and eleventh (11a) genetic groups. J Gen Virol. 77(Pt 2):293-301, 1996. 165. Tong WY, Nagano-Fujii M, Hidajat R, Deng L, Takigawa Y, Hotta H: Physical interaction between hepatitis C virus NS4B protein and CREB-RP/ATF6beta. Biochem Biophys Res Commun. 299(3):366-72, 2002. 166. Tornillo L, Carafa V, Richter J, Sauter G, Moch H, Minola E, Gambacorta M, Bianchi L, Vecchione R, Terracciano LM: Marked genetic similarities between hepatitis B virus-positive and hepatitis C virus-positive hepatocellular carcinomas. Journal of Pathology. 192(3):307-12, 2000. 167. Tu H, Gao L, Shi ST, Taylor DR, Yang T, Mircheff AK, Wen Y, Gorbalenya AE, Hwang SB, Lai MM: Hepatitis C virus RNA polymerase and NS5A complex with a SNARE-like protein. Virology. 263(1):30-41. 1999. 168. Vince A, Palmovic D, Kutela N, Sonicky Z, Jeren T, Radovani M: HCV genotypes in patients with chronic hepatitis C in Croatia. Infection. 26(3):173-7, 1998. 169. Wanless IR, Nakashima E, Sherman M: Regression of human cirrhosis: Morphologic features and the genesis of incomplete septal cirrhosis. Arch Pathol Lab Med. 124(11):1599-607, 2000. 170. Waris G, Tardif KD, Siddiqui A: Endoplasmic reticulum (ER) stress: hepatitis C virus induces an ER-nucleus signal transduction pathway and activates NFkappaB and STAT-3. Biochem Pharmacol. 64(10):1425-30, 2002.
129
171. Werling K, Szentirmay Z, Szepesi A, Schaff Z, Szalay F, Szabo Z, Telegdy L, David K, Stotz G, Tulassay Z: Hepatocyte proliferation and cell cycle phase fractions in chronic viral hepatitis C by image analysis method. Eur J Gastroenterol Hepatol. 13(5):489-93, 2001. 172. Wilkinson DG: In situ hybridization. A practical approach. 1992, IRL Press, pp.86– 92. 173. Xu Z, Choi J, Lu W, Ou JH: Hepatitis C virus F protein is a short-lived protein associated with the endoplasmic reticulum. J Virol. 77(2):1578-83, 2003. 174. Yamaga AK, Ou JH: Membrane topology of the hepatitis C virus NS2 protein. J Biol Chem. 277(36):33228-34, 2002. 175. Yanagi M, St Claire M, Emerson SU, Purcell RH, Bukh J. In vivo analysis of the 3' untranslated region of the hepatitis C virus after in vitro mutagenesis of an infectious cDNA clone. Proc Natl Acad Sci U S A. 96(5):2291-5, 1999. 176. Yi M, Lemon SM: 3' nontranslated RNA signals required for replication of hepatitis C virus RNA. J Virol. 77(6):3557-68, 2003. 177. Yoshida I, Oka K, Hidajat R, Nagano-Fujii M, Ishido S, Hotta H: Inhibition of p21/Waf1/Cip1/Sdi1 expression by hepatitis C virus core protein. Microbiol Immunol. 45(10):689-97, 2001. 178. Young KC, Chang TT, Liou TC, Wu HL: Detection of hepatitis C virus RNA in peripheral blood mononuclear cells and in saliva. J Med Virol. 41(1):55-60, 1993. 179. Young KK, Resnick RM, Myers TW: Detection of hepatitis C virus RNA by a combined reverse transcription-polymerase chain reaction assay. J Clin Microbiol. 31(4):882-6, 1993. 180. Zech B, Kurtenbach A, Krieger N, Strand D, Blencke S, Morbitzer M, Salassidis K, Cotten M, Wissing J, Obert S, Bartenschlager R, Herget T, Daub H: Identification and characterization of amphiphysin II as a novel cellular interaction partner of the hepatitis C virus NS5A protein. J Gen Virol. 84(Pt 3):555-60, 2003.
130
181. Zeuzem S, Ruster B, Roth WK: Clinical evaluation of a new polymerase chain reaction assay (Amplicor HCV) for detection of hepatitis C virus. Z Gastroenterol. 32(6):342-7, 1994. 182. Zhang B, Zelhof AC. Amphiphysins: raising the BAR for synaptic vesicle recycling and membrane dynamics. Traffic. 3(7):452-60. 2002. 183. Zhang J, Yamada O, Yoshida H, Iwai T, Araki H: Autogenous translational inhibition of core protein: implication for switch from translation to RNA replication in hepatitis C virus. Virology. 293(1):141-50. 2002.
131
8.
SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE Az értekezés témájával összefüggo közlemények:
I. Könyvfejezetek 1. Schaff Zs, Lotz G, Eder G, Schulte-Hermann R: Pathomorphology and apoptosis in viral hepatitis. In: Therapies for Viral Hepatitis. Schinazi RF, Sommadossi JP, Thomas H (eds.) Int. Med. Press Ltd., London 1998., pp.77-86. 2. Schaff Zs, Lotz G: A máj anatómiája és pathologiája. In: Hepatologia. Fehér J, Lengyel G (szerk.), Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest 2001., pp. 121-150. 3. Simon S, Lotz G, Kury F, Reipert B, Steinkasserer A, Eibl MM et al.: In situ localization of PCR-amplified hepatits C virus RNA on human erythrocytes. In: Frontiers in viral hepatitis. Schinazi R, Rice C, Sommadossi JP (eds.) Elsevier Science, Amsterdam, New York, London 2003. In press.
II. Lektorált publikációk 1. Schaff Zs, Lotz G, Schulte-Hermann R: Pathomorphological characteristics and pathogenesis of viral hepatitis. Pathology & Oncology Research 2:132-143, 1996. 2. Schaff Zs, Lotz G, Eder G, Schulte-Hermann R: Pathogenesis and apoptosis in viral hepatitis. Antiviral Therapy 1(Suppl. 3):25-32, 1996.
132
3. Lotz G, Kiss A, Schaff Zs: TGF ? 1 jó- és rosszindulatú májdaganatokban. Magyar Onkológia 40(4):163-168, 1996. 4. Schaff Zs, Lotz G, Jármay K: A vírus hepatitis patológiája és patogenezise. Orvosi Hetilap 138(22)(Suppl. I.):1459-1462, 1997. 5. Lotz G, Koltai P, Schaff Zs: Giant cell hepatitis in adults. Pathology & Oncology Research 3:215-218, 1997. 6. Kiss A, Szepesi Á, Lotz G, Schaff Zs: Expression of transforming growth factor alpha in hepatoblastoma. Cancer 83: 690-697, 1998. IF: 3,660 7. Lotz G, Kiss A, Kaposi Novák P, Sobel G, Schaff Zs: Hepatitis viruses and hepatocarcinogenesis. Journal of Physiology (Paris) 95:417-422, 2001. IF: 0,862 8. Kiss A, Lotz G, Kaposi Novák P, Schaff Zs: Hepatitis vírusok és hepatocarcinogenesis. Orvosi Hetilap 143: 83-86, 2002. 9. Lotz G, Szalay F, Firneisz G, Abonyi M, Lengyel G, Telegdy L, Ibrányi E, Nemes B, Kury F, Schaff Zs, Simon S: Localization of hepatitis C virus RNA on human erythrocytes by RT in situ PCR technique. Scandinavian Journal of Gastroenterology 37(5):578-84, 2002. IF: 1,847
133
III. Abstractok 1. Mester P, Lotz G, Szalay F, Schaff Zs: Grading and staging of chronic hepatitis and its correlation with transforming growth factor ? 1. 37th Annual Meeting of Gastroenterology; Balatonaliga 30. May, 1995.
Z Gastroenterol 33:288(abstr. 88.), 1995. IF: 0,887 2. Schaff Zs, Mester P, Lotz G, Szalay F: Grading and staging of chronic hepatitis and its correlation with transforming growth factor ? 1. XV. European Congress of Pathology; Copenhagen, 3-8. Sept. 1995.
Pathol Res Pract 191: 770, 1995.
IF: 0.009
3. Schaff Zs, Kiss A, Lotz G, Nagy P: Transforming growth factor ? 1 in liver tumors. X. International Congress of Liver Diseases. Acute and chronic liver diseases? Molecular biology and clinics. Basel Liver Week, Basel 19-21. oct. 1995.
4. Jármay K, Karácsony G, Ozsvár Zs, Nagy I, Lonovics J, Lotz G, Schaff Zs: Histological evalutaion of the response to interferon-therapy in chronic hepatitis C. 38th Annual Meeting of Gastroenterology; Balatonaliga 1996.
Z Gastroenterol 34:315(abstr. 59.), 1996. IF: 0,887 5. Lotz G, Jármay K, Karácsony G, Ozsvár Zs, Nagy I, Lonovics J, Schaff Zs: Detection of HCV antigens by immunogold method. 38th Annual Meeting of Gastroenterology; Balatonaliga 1996.
Z Gastroenterol 34:321(abstr. 84.), 1996. IF: 0,887
134
6. Szepesi Á, Lotz G, Patonai A, Schaff Zs: Cyclin A and PCNA expression in chronic hepatitis C Postgraduate Course and Abstracts of the 32nd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 9-12 April, 1997, London, UK
Journal of Hepatology 26(Suppl. 1.):144, 1997. IF: 3.761 7. Jármay K, Karácsony G, Ozsvár Zs, Nagy I, Lonovics J, Lotz G, Schaff Zs: Histological evaluation of the response to interferon-? therapy in chronic hepatitis C. Postgraduate Course and Abstracts of the 32nd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 9-12 April, 1997, London, UK
Journal of Hepatology 26(Suppl. 1.):220, 1997. IF: 3.761 8. Jármay K, Szepesi Á, Lotz G, Lonovics J, Karácsony G, Ozsvár Zs, Nagy I, Schaff Zs: FAS antigen (APO1/CD95) expression in chronic hepatitis C. Postgraduate Course and Abstracts of the 32nd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 9-12 April, 1997, London, UK
Journal of Hepatology 26(Suppl. 1.):257, 1997.
IF: 3.761
9. Schaff Zs, Szepesi Á, Lotz G, Nagy P, Tabor E: Expression of transforming growth factor ? in hepatoblastoma and correlation with tumor proliferation. Postgraduate Course and Abstracts of the 32nd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 9-12 April, 1997, London, UK
Journal of Hepatology 26(Suppl. 1.):140, 1997. IF: 3.761 10. Simon Zs, Lotz G, Nemes B, Szalay F, Lengyel G, Abonyi M, Ibrányi E, Schaff Zs: Comparative study of solution phase RT-PCR and RT in situ PCR for HCV RNA in HCV infected patients. Postgraduate Course and Abstracts of the 33rd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 15-18 April, 1998, Lisbon, Portugal
Journal of Hepatology 28(Suppl. 1.):105, 1998. IF: 3.761
135
11. Schaff Zs, Jármay K, Szepesi Á, Szalay F, Patonai A, Nemes B, Lotz G, Lonovics J: Correlation of Transforming Growth Factor ß1, apoptosis and proliferation in chronic hepatitis C. Postgraduate Course and Abstracts of the 33rd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 15-18 April, 1998, Lisbon, Portugal
Journal of Hepatology 28(Suppl. 1.):101, 1998. IF: 3.761 12. Lotz G, Nagy P, Patonai A, Kiss A, Nemes B, Szalay F, Schaff Zs: TGF ß1 and apoptosis in human hepatocellular carcinoma and focal nodular hyperplasia Postgraduate Course and Abstracts of the 33rd Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 15-18 April, 1998, Lisbon, Portugal
Journal of Hepatology 28(Suppl. 1.):175, 1998. IF: 3.761 13. Lotz G, Nemes B, Patonai A, Simon Zs, Mohos A, Schaff Zs: Detection of HCV-RNA by RT-in situ PCR after liver transplantation Postgraduate Course and Abstracts of the 34th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. Naples, Italy, 8-12 April, 1999.
Journal of Hepatology 30(Suppl. 1.):55, 1999. IF: 3.761 14. Mohos A, Lotz G, Simon Zs, Schaff Zs: Detection of HCV-RNA in bile duct cells obtained by laser microdissection from patients infected with HCV. Postgraduate Course and Abstracts of the 34th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. Naples, Italy, 8-12 April, 1999.
Journal of Hepatology 30(Suppl. 1.):228, 1999. IF: 3.761 15. Simon Zs, Lotz G, Szalay F, Lengyel G, Mohos A, Ibrányi E, Telegdy L, Schaff Zs: RT-in situ PCR detection of HCV RNA in circulating blood cells before and after interferon therapy. Postgraduate Course and Abstracts of the 34th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. Naples, Italy, 8-12 April, 1999.
136
Journal of Hepatology 30(Suppl. 1.):113, 1999. IF: 3.761 16. Simon Zs, Schaff Zs, Lotz G, Kury F, Reipert B, Olas K, Steinkasserer A, Nuovo GJ, Eibl MM: In situ localization of PCR-amplified hepatitis C. IUMS XIth International Congress of Virology, Aug. 9-13, Sydney, Australia, 1999.
17. Simon Zs, Lotz G, Nuovo GJ, Nemes B, Szalay F, Schaff Zs: In situ localization of PCR-amplified hepatitis C virus cDNA in human erythrocytes. 3rd International Conference on Therapies for Viral Hepatitis. 12-16 December, Maui, USA, 1999.
18. Schaff Zs, Lotz G, Kiss A: Virus induced inflammation and hepatocarcinogenesis. 10th International Conference on Ulcer Research and 5th International Symposium on Cell Injury and Protection in the Gastrointestinal Tract. Budapest-Pécs, 2000, October 25-28.
19. Lotz G, Szalay F, Firneisz G, Abonyi M, Lengyel G, Telegdy L, Ibrányi E, Schaff Zs: Localization of hepatitis C virus RNA on red blood cells by RT-in situ PCR technique. 36th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 18-22 April, Prague, Czech Republic, 2001
Journal of Hepatology 34(Suppl. 1.):119, 2001. IF: 3.761 20. Lotz G, Szalay F, Firneisz G, Abonyi M, Lengyel G, Telegdy L, Ibrányi E, Schaff Zs: Localization of hepatitis C virus RNA on red blood cells by RT-in situ PCR technique. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 43. Nagygyûlése Balatonaliga, jún. 5-9, 2001.
Z Gastroenterol 39:121(abstr. 142.), 2001. IF: 0,857 21. Schaff Zs, Jármay K, Lotz G, Kovalszky I: Steatosis and chronic hepatitis C.
137
Inter-Congress of the European Society of Pathology, Baveno, Italy, May 19-21, 2002. Pathologica 94:83, 2002.
Az értekezés témájához nem közvetlenül kapcsolódó közlemények:
I. Könyvfejezetek 1. Schaff Zs, Lotz G: A máj anatómiája és normális szerkezete. In? Gastroenterologia. Varró V (szerk.). Medicina Könyvkiadó Rt., Budapest 1997., pp. 377-379.
II. Lektorált publikációk 1. Lotz G, Szepesi Á, Göndöcs Cs, Rosivall L, Szende B: A vese glomerulusainak xanthomatoid elváltozása diabetes mellitusban. Lege Artis Medicinae 5:520-526, 1995. 2. Lotz G, Simon S, Patonai A, Sótonyi P, Nemes B, Sergi C, Glasz T, Füle T, Nashan B, Schaff Zs: Detection of Chlamydia pneumoniae in liver transplant patients with chronic allograft rejection. Transplantation 2003. (accepted for publication) IF: 3.265
III. Abstractok 1. Schaff Zs, Lotz G, Simon S, Patonai A, Sótonyi P, Nemes B, Georgopoulos
A, Graninger W: Detection of Chlamydia pneumoniae in liver transplant patients with chronic allograft rejection. 36th Annual Meeting of the European Association for the Study of the Liver. 18-22
138
April, Prague, Czech Republic, 2001
Journal of Hepatology 34(Suppl. 1.):43, 2001. IF: 3.761 2. Schaff Zs, Lotz G, Simon Zs, Patonai A, Sótonyi P, Nemes B, Georgopoulos A, Graninger W: Detection of Chlamydia pneumoniae in liver transplant patients with chronic allograft rejection. Magyar Gasztroenterológiai Társaság 43. Nagygyûlése Balatonaliga, jún. 5-9, 2001.
Z Gastroenterol 39:124(abstr. 154.), 2001. IF: 0,857 3. Lotz G, Patonai A, Simon S, Sergi C, Nashan B, Schaff Zs: Localization of Chlamydia pneumoniae by immunohistochemistry and in situ PCR in chronic liver allograft rejection with obliterative arteriopathy. 37th Meeting of the European Association for the Study of the Liver, Madrid, Spain, April 18-21, 2002.
Journal of Hepatology 36(Suppl. 1.):40, 2002. IF: 3.761
139
