A HAP2-sapka és a flagelláris filamentum közötti kölcsönhatás mechanizmusának vizsgálata
Ph. D. doktori értekezés Készítette: Diószeghy Zoltán
Témavezetı: Dr. Závodszky Péter egyetemi tanár az MTA rendes tagja
ELTE TTK Biológia Doktori Iskola Vezetıje: Dr. Erdei Anna akadémikus, egyetemi tanár Szerkezeti Biokémia Doktori Program Programvezetı: Dr. Gráf László akadémikus, egyetemi tanár
Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Központ Enzimológiai Intézete Budapest 2008
Köszönetnyilvánítás
Szakdolgozatom elkészítése kapcsán ezúton szeretném kifejezni köszönetemet: Témavezetımnek, Dr. Závodszky Péter akadémikusnak, az MTA SZBK Enzimológiai Intézete igazgatójának, aki hozzájárult, hogy az általa vezetett kutatócsoportban dolgozhassam, munkámat irányította és támogatta, és mindig kitartásra biztatott; Dr. Vonderviszt Ferencnek, aki mind a kutatásokban, mind a dolgozat megírásában rendkívül sokat segített, akinek tapasztalata és hasznos tanácsai mindig átsegítettek a nehézségeken; Dr. Friedrich Péter akadémikusnak, az MTA SZBK Enzimológiai Intézete volt igazgatójának, aki lehetıvé tette, hogy kutatásaimat az intézetben végezhessem; Dr. Gráf László akadémikusnak, a Szerkezeti Biokémia Doktori Program vezetıjének; Végh Barbarának, Gugolya Zoltánnak és Szenczi Árpádnak a dolgozat elkészítéséhez nyújtott segítségükért; Csoportunk volt és jelenlegi tagjainak, Dr. Kardos Józsefnek, Dr. Svingor Ádámnak, Dr. Gál Péternek, Dr. Dobó Józsefnek, Dr. Lırincz Zsoltnak, Dr. Ambrus-Aikelin Gézának, Dr. Németh Attilának, Kamondi Szilárdnak, Hajdú Istvánnak, akiket mindig zaklathattam kérdéseimmel; Az Enzimológiai Intézet valamennyi munkatársának, aki valamilyen formában a segítségemre volt az elmúlt évek során; Volt és jelenlegi munkahelyi vezetıimnek, amiért türelemmel viselték a doktori eljárás hosszúra nyúlt folyamatát; Végül, de nem utolsó sorban feleségemnek és szüleimnek, amiért folyamatosan biztattak, támogattak és mindenben mellettem álltak.
2
Jegyzékek
Tartalomjegyzék
TARTALOMJEGYZÉK ...................................................................................................................................... 3 ÁBRÁK JEGYZÉKE ............................................................................................................................................ 5 RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE .............................................................................................................................. 6 BEVEZETÉS ......................................................................................................................................................... 7 IRODALOM .......................................................................................................................................................... 9 A BAKTÉRIUMOK MOZGATÓ MECHANIZMUSA ...................................................................................................... 9 A BAZÁLIS TEST ................................................................................................................................................. 10 AZ AXIÁLIS FEHÉRJÉK ÉS A FILAMENTUM FELÉPÜLÉSE ....................................................................................... 13 A KAMPÓ ............................................................................................................................................................ 14 A FLAGELLÁRIS FILAMENTUM ............................................................................................................................ 16 A HAP2-SAPKA ................................................................................................................................................. 22 CÉLKITŐZÉS ..................................................................................................................................................... 26 ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK ......................................................................................................................... 27 FELHASZNÁLT VEGYSZEREK ÉS MŐSZEREK ........................................................................................................ 27 FEHÉRJÉK EXPRESSZIÓJA, TISZTÍTÁSA ................................................................................................................ 27 Natív filamentumok készítése ......................................................................................................................... 27 Flagellin és HAP2 expressziója és tisztítása ................................................................................................. 28 REKONSTRUKCIÓS MÓDSZEREK.......................................................................................................................... 28 A filamentum monomerizációja és depolimerizációja ................................................................................... 28 A flagellin polimerizációja ............................................................................................................................ 28 A HAP2 sapka rekonstrukciója...................................................................................................................... 29 EMÉSZTÉSI KÍSÉRLETEK ..................................................................................................................................... 29 Áttekintés ....................................................................................................................................................... 29 Rekonstruált filamentumok emésztése ........................................................................................................... 30 Natív filamentumok emésztése ....................................................................................................................... 30 ELLENİRZİ LÉPÉSEK ......................................................................................................................................... 30 Tisztaság és koncentráció ellenırzése ........................................................................................................... 30 Mikroszkópos vizsgálatok .............................................................................................................................. 31 MUTAGENEZIS.................................................................................................................................................... 31 Áttekintés ....................................................................................................................................................... 31 Primerek megtervezése .................................................................................................................................. 32 Mutagenezis, szekvenálás .............................................................................................................................. 32
3
Jegyzékek További transzformációs lépések................................................................................................................... 33 SPEKTROFLUORIMETRIA, FESTÉSI ELJÁRÁSOK .................................................................................................... 33 Elméleti háttér ............................................................................................................................................... 33 Fluoreszcens jelölések ................................................................................................................................... 34 SPEKTROPOLARIMETRIA ..................................................................................................................................... 35 Elméleti háttér ............................................................................................................................................... 35 Mérési beállítások ......................................................................................................................................... 36 MIKROKALORIMETRIA ....................................................................................................................................... 37 Elméleti háttér ............................................................................................................................................... 37 Mérési beállítások ......................................................................................................................................... 38 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTELMEZÉSÜK .......................................................................................................... 39 A FILAMENTUM FELÉPÜLÉSÉNEK VIZSGÁLATA FRET SEGÍTSÉGÉVEL ................................................................ 39 Áttekintés ....................................................................................................................................................... 39 Mutáns flagellinek készítése .......................................................................................................................... 39 A flagellinek filamentumba történı beépülésének vizsgálata ........................................................................ 41 A terminálisan csonkított fragmentumok elkészítése ..................................................................................... 42 A csonkított fragmentumok kötıdése a filamentumok végéhez ...................................................................... 43 A flagellin rendezetlen terminális régióinak kölcsönhatása a filamentum felépülése során ......................... 45 A NATÍV FLAGELLÁRIS FILAMENTUMOK STABILITÁSA ....................................................................................... 46 A HAP2 sapka hatása a natív flagelláris filmentumok stabilitására ............................................................. 46 A HAP2 sapka depolimerizációt gátló szerepe a natív filamentumoknál ...................................................... 49 A REKONSTRUÁLT FILAMENTUMOK STABILITÁSA .............................................................................................. 51 A polimerizációs feltételek hatása a rekonstruált filamentumok stabilitására .............................................. 51 A HAP2 kötıdése rekonstruált filamentumokhoz .......................................................................................... 52 HAP2 kötıdésének hatása a rekonstruált filamentumok stabilitására .......................................................... 53 A HAP2 kötıdésének depolimerizációt gátló szerepe a rekonstruált filamentumoknál................................. 58 AZ EREDMÉNYEK ÉRTELMEZÉSE ........................................................................................................................ 60 ÖSSZEFOGLALÁS ............................................................................................................................................ 65 IRODALOMJEGYZÉK ..................................................................................................................................... 67 PUBLIKÁCIÓS LISTA ...................................................................................................................................... 77 A DOLGOZAT ALAPJÁUL SZOLGÁLÓ KÖZLEMÉNYEK ........................................................................................... 77 EGYÉB KÖZLEMÉNYEK ....................................................................................................................................... 78
4
Jegyzékek
Ábrák jegyzéke
1. ÁBRA: A BAKTERIÁLIS FLAGELLUM FELÉPÍTÉSE.
12
2. ÁBRA: A FLAGELLÁRIS EXPORTRENDSZER SEMATIKUS ÁBRÁJA.
12
3. ÁBRA: A FLAGELLUM FELÉPÜLÉSÉNEK MENETE.
14
4. ÁBRA: A FILAMENTUM POLIMORFIKUS MODELLJE.
17
5. ÁBRA: A FLAGELLIN TÉRSZERKEZETE ÉS MÁSODLAGOS STRUKTÚRÁJA.
19
6. ÁBRA: A FILAMENTUM KERESZTMETSZETI (TENGELYIRÁNYÚ) KÉPE.
20
7. ÁBRA: A HAP2 SAPKA SZERKEZETE.
24
8. ÁBRA: A HAP2-SAPKA ÉS A FILAMENTUM VÉGE KÖZÖTTI KÖLCSÖNHATÁS MODELLJE.
25
9. ÁBRA: A MUTAGENEZIS FİBB LÉPÉSEI
40
10. ÁBRA: EMISSZIÓS SPEKTRUMOK 394 NM-ES GERJESZTÉSI HULLÁMHOSSZ ESETÉN.
42
11. ÁBRA: AZ 512 NM-EN MÉRT FLUORESZCENCIA INTENZITÁS IDİBELI VÁLTOZÁSA.
44
12. ÁBRA: A NATÍV FLAGELLÁRIS FILAMENTUM HİDENATURÁCIÓJÁNAK CD-GÖRBÉJE 222 NMEN
47
13. ÁBRA: A NATÍV FLAGELLÁRIS FILAMENTUM CD-GÖRBÉJÉNEK DERIVÁLTJA 222 NM-EN
47
14. ÁBRA: NEGATÍVAN FESTETT FILAMENTUM-SAPKA KOMPLEXUMOKRÓL ELEKTRONMIKROSZKÓPPAL KÉSZÍTETT MIKROGRÁF.
49
15. ÁBRA: A NATÍV FILAMENTUM DEPOLIMERIZÁCIÓJÁNAK KÖVETÉSE CD-VEL, 50°C-ON, 222 NM-EN
50
16. ÁBRA: A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM STABILITÁSI TARTOMÁNYA
51
17. ÁBRA: MAGOKKAL TÖRTÉNİ REKONSTRUKCIÓ EREDMÉNYE
52
18. ÁBRA: A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM CD-GÖRBÉJÉNEK DERIVÁLTJA 222 NM-EN
55
19. ÁBRA: A FLAGELLIN ÉS A FILAMENTUM KALORIMETRIÁS GÖRBÉI
56
20. ÁBRA: A HAP2 ÉS A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM KALORIMETRIÁS GÖRBÉI
58
21. ÁBRA: A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM DEPOLIMERIZÁCIÓJÁNAK KÖVETÉSE CD-VEL, 45°C-ON, 222 NM-EN
59
22. ÁBRA: A NATÍV ÉS A REKONSTRUÁLT FILAMENTUM VÉGÉNEK SEMATIKUS SZERKEZETE. 63
5
Jegyzékek
Rövidítések jegyzéke
A
abszorbancia
AF350
Alexa Fluor 350 C5 maleimid
AF488
Alexa Fluor 488 C5 maleimid
AS
ammónium-szulfát, (NH4)2SO4
bp
bázispár
BSA
bovine serum albumin
CD
cirkuláris dikroizmus
CPM
7-diethylamino-3-(4’-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin
DSC
differenciális pásztázó kalorimetria
DTT
ditiotreitol
E. Coli
Escherichia coli
EDTA
etiléndiamin-tetraecetsav
ELC
endoproteináz lizin-C
FPLC
gyors fehérje-folyadékkromatográfia (Fast Protein Liquid Chromatography)
FRET
fluoreszcencia rezonancia energia transzfer
HAP
kampó asszociált fehérje (Hook Associated Protein)
IPTG
izopropil-béta D-tiogalakto-piranozid
NMR
magmágneses rezonancia
PCR
polimeráz láncreakció (Polimerase Chain Reaction)
PMSF
fenil-metán-szulfonil-fluorid
S. Typhimurium Salmonella typhimurium SDS
nátrium-dodecil-szulfát
SDS-PAGE
SDS poliakrilamid gélelektroforézis
Trisz
trisz-(hidroxi-metil)-amino-metán
V8
endoproteináz glutamin-C
6
Bevezetés
Bevezetés
A baktériumok egy összetett fehérjekomplexum, a flagellum révén aktív mozgásra képesek. Ennek jellemzı formája az egyenes vonalú úszás, amit idınként rövid kalimpálás vált fel, melynek során a baktérium mozgásiránya véletlenszerően megváltozik. A flagellum két fı része a membránfehérjékbıl álló motor és a membránból messzire kinyúló filamentum. A motor egy különleges makromolekuláris gépezet, mely az ember által készített villanymotorokhoz hasonlóan forgó mozgás létrehozására képes. Azonban, míg a mesterséges motorokat elektronok áramlása táplálja, addig ezt a bakteriális motort protonfluxus hajtja. Ezzel a mechanizmussal hatalmas, akár 90 ezres percenkénti fordulatszámot is képesek elérni, ami mintegy 20-30 µm/sec-os sebességgel hajtja elıre a baktériumot. Ez emberi méretekben a leggyorsabb japán expresszvonatok száguldásának felel meg. A motor másik különleges tulajdonsága az, hogy mindkét irányba képes forogni, amivel a baktérium mozgását tudja szabályozni. A több különbözı fehérjébıl álló filamentum szuperhelikális szerkezető. Kisebbik része a kampó, ami nemcsak összeköti a motort a flagelláris filamentummal a forgást továbbítva, hanem egyfajta molekuláris kardántengelyként is viselkedik: a kampó görbületének megváltoztatásával képes a forgás tengelyének beállítására. A szerkezet döntı részét a mintegy 10 µm hosszú flagelláris filamentum alkotja, melyet a flagellin nevő fehérje több tízezer példánya épít fel. Két figyelemre méltó tulajdonsága van: az önszervezıdı képesség és a polimorfizmus. Az elsı sajátosság azt jelenti, hogy a flagellin alegységek megfelelı külsı körülmények hatására képesek a polimerizációra, azaz a szuperhelikális szerkezet létrehozására. A második, a polimorfizmus azt takarja, hogy a filamentum külsı megjelenése többféle is lehet: bizonyos külsı körülmények megváltozása illetve a motor forgásirányának megfordulása esetén módosítja a formáját. Ez azért is szokatlan, mert teljesen egyforma alegységekbıl többféle makroszkopikus szerkezet is létrejöhet, amik között ráadásul igen gyors átkapcsolás lehetséges a környezeti körülmények megváltozása esetén. A filamentum végén egy molekuláris sapka található, melynek in vivo a polimerizáció elısegítésében van döntı szerepe. Ez a konstrukció teszi lehetıvé, hogy a citoplazmából a filamentumok
belsejében
lévı
csatornán
át
transzportálódó
flagellin
alegységek
beépülhessenek a filamentumok végére, és ne ürüljenek ki az extracelluláris térbe. A sapka különleges és látszólag ellentmondásos tulajdonságokkal rendelkezik. Egyfelıl nagyon erısen 7
Bevezetés kötıdik a filamentumok végéhez, és gyakorlatilag sohasem válik le onnan, másfelıl arra is képes, hogy viszonylag könnyen elengedje a filamentumok végét, lehetıvé téve az újonnan érkezı flagellin alegységek beépülését, azaz egyfajta „intelligens” kötıdést mutat. Mindezek a figyelemre méltó tulajdonságok a bakteriális flagellum vizsgálatára ösztönöznek. A struktúra vizsgálata önmagában is fontos ismereteket nyújthat a baktériumok mozgásáról, de ezen túl is szolgálhat érdekes megállapításokkal, hiszen az önszervezıdı képesség vagy a polimorfizmus olyan tulajdonságok, amelyek más biológiai (sıt nemcsak biológiai) rendszerekben is megtalálhatóak. Az ehhez hasonló molekuláris gépezetek tulajdonságainak, szervezıdési elveinek megismerése technológiai szempontból is fontos. Emiatt érdemes ezt a különleges fehérjekomplexumot alaposan tanulmányozni, hogy szerkezetének és mőködésének hogyanjait és miértjeit megérthessük.
8
Irodalom
Irodalom
A baktériumok mozgató mechanizmusa Mikroszkóp alatt jól megfigyelhetı, hogy a baktériumok aktív helyváltoztató mozgásra képesek. Ez az úszó mozgás flagelláris filamentumok forgatásával történik. Ezek a sejt felszínérıl messze, akár 15 µm-re is kinyúló, mintegy 30 különféle fehérjébıl felépülı helikális filamentumok, amelyekbıl fajonként változó számú (1-10) található egy sejten. A flagellum felépítésérıl és mőködésérıl több összefoglaló jellegő cikket is írtak (Manson, 1992; Wilson & Beveridge, 1993; Schuster & Khan, 1994; Blair, 1995; DeRosier, 1995; Aizawa, 1996; Namba & Vonderviszt, 1997; Macnab, 2003; 2004). A forgó mozgást egy membránba ágyazott, több különbözı fehérjébıl összeálló makromolekuláris struktúra, a bazális test hozza létre. Az itt létrejövı forgást egy különleges szerkezeti egység, a kampó viszi át a filamentumra. A kampó egyúttal kardáncsuklóként a forgás tengelyét is képes megváltoztatni. Az a tény, hogy itt valóban forgó mozgás történik, egy filamentum üveglapra kitapasztásával igazolható. Ekkor maga a sejttest fordul el mikroszkóppal jól láthatóan a filamentum körül (Berg & Anderson, 1973; Silverman & Simon, 1974; Larsen és mts., 1974). A motort a belsı sejtmembránon átáramló protonok (illetve egyes esetekben Na+ionok) hajtják, egy körbefordulás mintegy 1000 protont igényel (Matsuura és mts., 1977; Manson és mts., 1977; DeRosier, 1995). Az így elért forgási sebesség átlagosan 15-20 ezer fordulat/perc, de megfigyeltek már 90 ezres percenkénti fordulatszámot is (Lowe és mts., 1987; Kudo és mts., 1990; Magariyama és mts., 1995). A forgás 20-30 µm/sec-os úszási sebességet biztosít oly módon, hogy a filamentumok csokorba állnak össze egy balmenetes szuperhélixet alkotva, és így hajtják elıre propellerként a sejtet (Macnab & Koshland, 1972). Ez a haladás azonban nem folyamatos. A sejt pár másodpercig egyenesen úszik, amit körülbelül egy tizedmásodpercnyi idıre kalimpáló mozgás követ. Ilyenkor a motor normális, kívülrıl nézve az óramutató járásával ellentétes irányú forgása egy pillanatra átvált az óramutató járásával megegyezı irányú forgásra (Larsen és mts., 1974). A forgásirány megváltozása csavaró feszültséget kelt a filamentumban, és szintén egy pillanatra jobbmenetes szuperhélixszé alakítja. Ennek következtében az egyes filamentumok szétválnak, és egymástól függetlenül forognak, ami a sejt véletlenszerő elfordulásához vezet, így a
9
Irodalom következı egyenes úszási szakasz már az új irányba történik (Macnab & Ornston, 1977; Turner és mts., 2000). A külsı környezeti hatások különféle szignál transzdukciós mechanizmusokon keresztül erısen befolyásolják a kalimpáló szakaszok gyakoriságát, ami biztosítja, hogy a baktérium mozgása a tápanyagokban gazdag területek felé történjen. Végsı soron ez az alapja a baktériumok túlélési hatékonyságának (Namba & Vonderviszt, 1997).
A bazális test Mint minden forgó motor a bazális test is hengerszimmetrikus, álló, illetve mozgó részekbıl áll. Az álló részeket a külsı és a belsı membránhoz, illetve a peptidoglikán réteghez kötıdı győrők alkotják, a mozgó részt pedig a bennük forgó rotor. A bazális testen belül is több kisebb struktúrát sikerült elkülöníteni, melyeket különféle fehérjék építenek fel (1. ábra). Az MS győrő a rotor része, a belsı membrán vonalában helyezkedik el és mintegy 25 FliF fehérje alkotja (Jones és mts., 1990; Sosinsky és mts., 1992; Ueno és mts., 1992). Szintén a rotor részei a FliG fehérjék, amelyek szoros kapcsolatban állnak a FliF fehérjékkel és a számuk is megegyezik velük (Francis és mts., 1992). Ugyanakkor a FliG, FliM és FliN fehérjék az MS győrő citoplazmatikus oldalán elhelyezkedı, és szintén a rotorhoz tartozó C győrő alkotórészei, és együttesen az úgynevezett kapcsoló komplexet alkotják (Driks & DeRosier, 1990; Khan és mts., 1992; Francis és mts., 1992; 1994; Fukuoka és mts., 2007). A kapcsoló komplex végzi a motor forgásirányának átváltását. A MotA és MotB proteinek transzmembrán fehérjék (Dean és mts., 1984; Sharp és mts., 1995; Zhou és mts., 1995). Mindkettıbıl 10-20 darab alkot egy közös komplexet (Block & Berg, 1984; Blair & Berg, 1988). Ez a komplex részben a peptidoglikán réteghez, részben a belsı membránhoz kötıdik, és ennek megfelelıen az álló részhez tartozik (Namba & Vonderviszt, 1997; Fukuoka és mts., 2007). A MotA fehérje a belsı membránon át alkot egy protonvezetı csatornát (Blair & Berg, 1990), és valószínő, hogy a komplex a FliG fehérjével is szoros kölcsönhatásban van (Garza és mts., 1996; Lloyd és mts.,1996). A rotorhoz kapcsolódó hajtótengely a rúd. Ezt négy fehérje alkotja: FlgB, FlgC, FlgF, FlgG, illetve ide tartozik még a FliE, ami a rúdhoz csatlakozó adapter fehérje (Homma és mts., 1990a; Saijo-Hamano és mts., 2004). Az elsı három fehérjébıl egyenként mintegy hat darab alkotja a rúd közeli (sejt felé esı) végét, míg a negyedik körülbelül 26 kópiáját tartalmazza a rúd távoli vége (Jones és mts., 1990; Sosinsky és mts., 1992). Az axiális rendszer többi komponenséhez hasonlóan a rúd fehérjéi is helikális szervezıdésőek (Saijo-
10
Irodalom Hamano és mts., 2004). A rudat két csapágy tartja a helyén: az L győrő és a P győrő. Az elıbbi a külsı membránba ágyazódik be és mintegy 25 darab FlgH fehérje alkotja, az utóbbi ugyanennyi FlgI fehérjébıl áll és a peptidoglikán réteghez kötıdik (DePamphilis & Adler, 1971; Jones és mts., 1990; Sosinsky és mts., 1992). Az LP győrő szilárd komplexet alkot, mely nagyon ellenálló a külsı kémiai hatásokkal szemben (Akiba és mts., 1991). Itt kell említést tennünk az axiális fehérjék exportját végzı rendszerrıl is, mivel az többé-kevésbé a bazális testbe (az MS győrőbe) ágyazva végzi mőködését (2. ábra). Az apparátusnak kettıs szerepe van: egyrészt a flagelláris fehérjék felismerése, másrészt a bejuttatásuk a filamentum közepén húzódó csatornába. A flagelláris exportrendszer egy specializálódott III típusú fehérjeexport szerkezet (ugyanehhez a típushoz tartozik számos patogén baktérium virulencia faktorainak kiválasztását végzı mechanizmus is). A rendszert számos fehérje alkotja, melyek közül némelyiknek a pontos funkciója még ismeretlen. A membránba ágyazott elemek (FlhA, FlhB, FliO, FliP, FliQ, FliR) közül az elsı kettı a citoplazmatikus elemek (elsısorban a FliI) kötıdését segíti elı, illetve az FlhB ezen kívül még az export szubsztrát specificitást is szabályozza. A FliI ATP-áz aktivitásával a fehérjeexport hatékonyságát növeli, de nem elengedhetetlenül szükséges hozzá (Minamino & Namba, 2008). A FliH a FliI ATP-áz aktivitását szabályozza, a FliJ egy általános chaperon (egyéb, specializálódott chaperonok az FlgN, FliS, FliT), a FliK a kampó hosszát állítja be. A flagelláris fehérjék felismerése feltehetıen a rendezetlen terminális régiókban található megkülönböztetı jel (szignálszekvencia) révén történik (Kornacker & Newton, 1994; Végh és mts., 2006). Ugyanakkor a csatornába való bejutásuk mikéntje továbbra sem ismert, bár valószínősíthetı, hogy a szők keresztmetszet (20 Å) miatt csak részben vagy egészen letekeredett formában haladhatnak benne.
11
Irodalom
1. ábra: A bakteriális flagellum felépítése. A különbözı színek eltérı fehérjéket jelentenek. A szaggatott vonalak a takarásban lévı szerkezeteket jelölik. (Namba & Vonderviszt, 1997; Yonekura és mts., 2002)
Axiális fehérje
MS győrő
FliR FliQ
FliP FliO
MS győrő
FlhA FlhB C győrő
Axiális fehérje
FliI FliI FliI
C győrő FliI FliI FliI FliJ Axiális fehérje
FliI
FliH FliH
12
2. ábra: A flagelláris exportrendszer sematikus ábrája. Sötétkék szín jelöli a bazális test, világoszöld pedig az export apparátus elemeit. Az exportálandó fehérje sárga színő. (Macnab, 2004 alapján).
Irodalom
Az axiális fehérjék és a filamentum felépülése A szekvenciális hasonlóságok alapján az axiális fehérjék három csoportba oszthatók: az elsıbe a tartoznak rudat alkotó proteinek, a kampófehérje és a HAP1, a másodikba a flagellin és a HAP3, míg a HAP2 önmagában alkot egy családot (Homma és mts., 1990a, 1990b).
Ugyanakkor
mindegyik
axiális
fehérje
közös
szerkezeti
motívumokkal:
konzerválódott terminális régiókkal és változékony középsı szakasszal rendelkezik. Az utóbbiakon belül hidrofób aminosavakból álló héttagú ismétlıdések találhatók, ami az αhelikális kötegekbe rendezıdı szekvenciák sajátossága (Homma és mts., 1990a). Korábban azt feltételezték, hogy a szomszédos alegységek terminális régiói alkotják a helikális kötegeket a polimerizáció során, stabilizálva ezáltal a filamentumot. Az újabb eredmények azonban megkérdıjelezték ezt a modellt, és inkább az alegységen belüli helikális kötegek lehetıségét valószínősítették (Yonekura és mts., 2003). A különféle (proteolítikus, kaloriméteres, NMR) vizsgálatok feltárták, hogy az axiális fehérjék terminális régiói rendezetlen szerkezetőek, szemben a rendezett struktúrájú, kompakt középsı szakasszal (Vonderviszt és mts., 1989; 1992a; 1998; Furukawa és mts., 2002). Ugyanakkor az elızı szakaszban leírtaknak megfelelıen a rendezetlen terminális régiók a fehérjék leginkább konzerválódott részét alkotják, ami jelentıs és sokrétő szerkezeti és funkcionális szerepükre utal. Egyik legfontosabb feladatuk a polimerizáció szabályozása: rendezetlenségüknek köszönhetıen a citoplazmában nem, csak a filamentum távoli végén tudnak a monomer alegységek aggregálódni (Iino, 1974; Vonderviszt és mts., 1991; 1995; Mimori-Kiyosue és mts., 1997). Ezen kívül az alegységek közötti kölcsönhatásokat is befolyásolják, illetve lehetıvé teszik a különféle típusú axiális fehérjék közötti kapcsolatokat (Vonderviszt és mts., 1998; Kitao és mts., 2006). Végül feltehetıen a rendezetlen terminális régiók jelentik azt a megkülönböztetı jelet, melynek révén a flagellum specifikus exportrendszer felismeri ezeket a fehérjéket (Kornacker & Newton, 1994; Végh és mts., 2006).
13
Irodalom 3. ábra: A flagellum felépülésének menete. (Namba & Vonderviszt, 1997)
Az
eddigiek
alapján
a
filamentum
felépülése a következıképpen történik (3. ábra) (Macnab, 2004). Elıször kialakul az MS győrő, majd ebbe beleágyazódik az export rendszer. Ezután létrejön a motor és a kapcsoló komplex. Az export apparátus segítségével két lépcsıben felépül a rúd az öt fehérjéjébıl, melyhez szükség van egy segédfehérjére (FlgJ), amely a rudat átmenetileg lezárja. Eközben a peptidoglikán réteg áttörésénél kialakul a P-győrő, majd a külsı membránnál az Lgyőrő. A rúd elkészülte után a segédfehérje leválik, és elkezdıdik a kampó felépítése. Ez szintén igényel egy segédfehérjét (FlgD), ami átmenetileg lezárja a kampót (Ohnishi és mts., 1994). Miután a kampó elérte a megfelelı hosszúságot (55±6 nm), az exportrendszer specificitása a rúd-kampó jellegő fehérjék
felismerésérıl
a
filamentum
típusú
fehérjékére (flagellin, HAP fehérjék) vált át (Ferris és mts., 2006). A kampó végérıl leválik az FlgD sapka, helyette sorban ráépülnek a kis példányszámú asszociált fehérjék: a HAP1, majd a HAP3, végül a HAP2 (Homma & Iino, 1985). A helikális filamentum felépülése csak ezután indulhat meg a HAP3 és a HAP2 között, majd a továbbiakban a filamentum végén.
A kampó A rúdhoz már a sejten kívül kapcsolódik hozzá a következı erısen görbült szerkezető elem, a kampó (1. ábra), amely egyrészt létrehozza a kapcsolatot a motor és a filamentum között,
másrészt
képes
a
forgástengely
irányának
tág
határok
között
történı
megváltoztatására. Hossza 55±6 nm, és mintegy 130 fehérje alegységbıl áll (Hirano és mts., 1994). Ezt az értéket két fehérje szabályozza: a fliK és a flhB (Hirano és mts., 1994;
14
Irodalom Kutsukake és mts., 1994), de valószínőleg nem a hagyományos értelemben vett molekuláris vonalzóként. Az alegységek képesek polimerizálódni in vitro körülmények között (Kato és mts., 1982), de in vivo szükség van egy segédfehérjére is a kampó létrehozásához: ez az FlgD. A filamentum felépülése során elıször néhány FlgD alegység molekuláris sapkaként ráépül a rúd végére, majd alatta, azaz az FlgD sapka és a rúd között megindul a kampófehérjék polimerizációja. Amikor a kampó elkészült, az FlgD alegységek leválnak a filamentum végérıl, hogy helyet adjanak a további komponensek ráépülésének (Ohnishi és mts., 1994). A kampó másik érdekes tulajdonsága, hogy nagyfokú polimorfizmusra képes: a környezeti körülmények megváltozása esetén egymástól lényegesen eltérı helikális formákat vesz fel (Kato és mts., 1984). A szerkezetérıl tudjuk, hogy 11 darab, egymással csaknem párhuzamosan futó protofilamentum alkotja, amelyek közül mindig a görbület belsı oldalán lévı a legrövidebb, a külsı oldalán lévı a leghosszabb. Mivel ezek folytonosan cserélıdnek, ezért nagyfokú flexibilitásra van szükség. A legvalószínőbbnek tőnı magyarázat a kampó kardáncsuklóként való mőködésére a protofilamentumok konformációjának a forgásiránnyal ellentétesen történı folytonos változása, melynek köszönhetıen a filamentum tengelye változatlan helyzetben marad. A kampófehérje szerkezetérıl tudjuk, hogy a többi axiális fehérjéhez hasonlóan kompakt magja és rendezetlen terminális régiói vannak. A kompakt mag két, fıként βlemezekbıl álló domént tartalmaz (Samatey és mts., 2004). Az önszervezıdı képesség annak is köszönhetı, hogy a rendezetlen terminális régiók képesek α-helikális kötegekbe rendezıdni, és ezáltal polimerizálódni, akárcsak a többi axiális fehérjénél. Ugyanakkor valószínő, hogy nem ez a fı hajtóerı a kampó szerkezetének kialakulásánál, inkább csak a kampó stabilizációjában és a polimerizációs képességében van szerepe. A kampó és a filamentum között van egy nagyon rövid összekötı szakasz, amit két kampó asszociált fehérje alkot: a HAP1 (FlgK) és a HAP3 (FlgL) (Ikeda és mts., 1987). Mindkét fehérjébıl 13 darab alkotja az összekötı győrőt (Homma és mts., 1984a; Ikeda és mts., 1987; Jones és mts., 1990). Ennek a szakasznak a legfontosabb szerepe valószínőleg a kampó és filamentum szerkezeti különbségeinek áthidalása, az ebbıl eredı feszültségek mérséklése (Namba & Vonderviszt, 1997). A többi axiális fehérjéhez hasonlóan a HAP1 és a HAP3 terminális régiói szintén rendezetlenek (Homma és mts., 1990a; Vonderviszt és mts., 1992a; Furukawa és mts., 2002).
15
Irodalom
A flagelláris filamentum A flagellum leghosszabb része a filamentum, amelyet a flagellin nevő fehérje épít fel, és akár 30000 alegységbıl is állhat. A filamentum helikális szerkezető, és (a kampóhoz hasonlóan) 11 egymáshoz képest kismértékben elcsúsztatott protofilamentum alkotja (O’Brien & Bennett, 1972). Külsı átmérıje 230 Å (Mimori és mts., 1995) és 11 flagellin alegység alkot két menetet a helikális szerkezetben, azaz menetenként 5.5 alegység van (Namba & Vonderviszt, 1997). A helikális filamentum egy szuperhélixet alkot, ez teszi képessé a baktérium propellerszerő elırehajtására. A filamentum két nagyon lényeges és figyelemre méltó tulajdonsága az önszervezıdı képesség és a polimorfizmus. Az önszervezıdı képesség azt jelenti, hogy az egyes alegységek megfelelı körülmények hatására képesek polimerizálódni, ami azért különleges, mert a szuperhelikális struktúra miatt ezek az alegységek eltérı környezetben vannak. A polimorfizmus az egymástól lényegesen eltérı külsı megjelenési formák felvételére való képességet takarja. Ezek a formák többek között a következık lehetnek: egyenes, normál (dugóhúzó alakú), spirális, fodros (ívelt), stb. (Asakura, 1970) Az egyenes filamentum lehet balra (Ltípus) vagy jobbra (R-típus) dılı (Kamiya és mts., 1979). Az eltérı formák magyarázata az, hogy a flagellin alegységek két, egymástól kis mértékben eltérı konformációt vehetnek fel. Ugyanakkor azt is megállapították, hogy egy protofilamentum mentén a konformáció nem változik. Ha mind a 11 protofilamentum ugyanazzal a konformációval rendelkezik, akkor egyenes filamentumot kapunk: az egyik konformáció esetén L-típusút, a másiknál R-típusút. A normál, balra dılı helikális filamentumban mindkét konformációjú protofilamentum megtalálható (4. ábra) (Asakura, 1970; Calladine, 1975; 1976; 1978). A külsı környezeti feltételek, mint az ionerı vagy a pH megváltozása (Kamiya & Asakura, 1976; 1977), erıs ellenáramlás (Hotani, 1982), valamely aminosavcsere (Martinez és mts., 1968) hatására, illetve a motor forgásirányának megfordulása esetén (Berg & Anderson, 1973; Silverman & Simon 1974; Larsen és mts., 1974) egy vagy több protofilamentum mentén kooperatívan megváltozik a konformációs állapot, és ezáltal a normál filamentumból valamely másik forma jöhet létre. Ez tulajdonság teszi lehetıvé a haladó mozgásból a kalimpáló állapotba való áttérés mechanizmusát is.
16
Irodalom
4. ábra: A filamentum polimorfikus modellje. A felsı sorban a filamentum morfológiája, az alsóban az alegységek elrendezıdése látható. A két szín az alegységek kétféle konformációját jelöli. Balról jobbra haladva az egyes típusok elnevezése: (1) L-típusú egyenes, (2) normál, (3) ívelt és (4) R-típusú egyenes. (Namba & Vonderviszt, 1997)
Az önszervezıdı képesség szorosan összefügg a HAP2 mőködésével, ezért annak mechanizmusával ott foglalkozunk. A polimerizáció és az önszervezıdés részletesebb vizsgálata elıtt azonban célszerő a flagellin molekula és a filamentum szerkezetét megismerni. A flagellin molekulatömeg fajonként erısen eltér, az általunk használt, Salmonella typhimurium-ból származó fehérje molekulatömege 51.5 kDa (Kanto és mts., 1991). Proteolítikus emésztési kísérletek segítségével megállapították, hogy két fı részre osztható. A rendezetlen terminális régiók könnyen emészthetık, míg a kompakt belsı mag - ez mintegy 41 kDa molekulatömegő, a jele F41 - viszonylag jól ellenáll a proteolízisnek. Kalorimetriás vizsgálatokból az is kiderült, hogy ez a belsı mag három doménbıl áll. További emésztéssel egy 27 kDa-os fragmentumot (F27) lehetett elkülöníteni (Kostyukova és mts., 1988; Vonderviszt és mts., 1989; 1990). A 494 aminosavból álló flagellin 1-55 és 451-494 szakasza tartozik a rendezetlen terminális régiókhoz, a 56-450 szakasz alkotja az F41-es fragmentumot, ezen belül a 178-422 az F27-est (5. ábra) (Vonderviszt és mts., 1991; Yamashita és mts., 1995). A másodlagos szerkezetre a terminális régiókban az α-hélixek, a belsı részen pedig a β-lemezek és a β-fordulatok jellemzıek (Fedorov és mts., 1988; Vonderviszt és mts., 1990). Különbözı baktériumfajokból származó flagellinek összehasonlításával azt találták, hogy a terminális részek, mégpedig a rendezetlen régióknál jóval hosszabb szakaszon (mintegy 180
17
Irodalom aminosav az NH2-végen és 100 a COOH-végen) konzervatívak és nagyfokú homológiát mutatnak. Ezzel szemben a belsı mag változékonysága nagy (Joys, 1985; Wei & Joys, 1985; Trachtenberg & DeRosier, 1988; Kanto és mts., 1991). Mindez arra utal, hogy a terminális régióknak fontos szerepük van a filamentumok felépítésében és mőködésében (Namba és mts., 1989; Homma és mts., 1990a; DeRosier, 1992), ezért ezeket részletesebb vizsgálatoknak vetették alá. Egyrészt azt találták, hogy ezeknek a fehérjeszakaszoknak nagy az α-hélix-, illetve a helikális kötegképzı potenciáljuk (Fedorov és mts., 1988; Vonderviszt és mts., 1990), másrészt a cirkuláris dikroizmus (CD) mérésével azt is kimutatták, hogy bár harmadlagosan rendezetlen a szerkezetük, de tartalmaznak dinamikusan változó fel-/letekeredı másodlagos helikális struktúrákat (Vonderviszt és mts., 1989; 1990). Proteolítikus emésztési kísérletekbıl és magmágneses rezonancia (NMR) spektrumokból ugyanakkor az derült ki, hogy polimerizálódva, azaz a filamentumban ezek a terminális régiók rendezıdnek, stabil harmadlagos szerkezetet vesznek fel (Aizawa és mts., 1990). További vizsgálatok azt is kiderítették, hogy valószínőleg egymásba tekeredı amfipatikus α-helikális kötegeket alkotnak (az eredeti feltételezés szerint) a szomszédos flagellin alegységek végei (Yamashita és mts., 1995). Terminálisan csonkított fragmentumokkal végzett kísérletekbıl az is kiderült, hogy ezek a régiók nem szükségesek a filamentum létrehozásához: megfelelı mennyiségő ammónium-szulfát jelenlétében a polimerizáció a csonkított alegységekkel is lehetséges. A szerepük sokkal inkább a filamentum stabilizálásában és a polimorfizmus létrehozásában rejlik (nélkülük csak egyenes filamentumok keletkezhetnek) (Vonderviszt és mts., 1991). A
monomer
flagellin
és
a
filamentum
szerkezetét
röntgendiffrakciós
és
elektronmikroszkópos kísérletekkel vizsgálták. Ezek során egyenes filamentumokat használtak, mivel ezek egyféle konformációs állapotú alegységekbıl állnak, ezért egyszerőbb a szerkezetük, mint a normál filamentumnak. A vizsgálatok révén sikerült az F41 fragmentum szerkezetét 2 Å felbontással, a filamentumét pedig 4 Å felbontással meghatározni (Mimori és mts., 1995; Morgan és mts., 1995; Samatey és mts., 2001; Yonekura és mts., 2003). A kapott eredmények alapján megállapítható, hogy a flagellin négy doménbıl (D0, D1, D2, D3) áll (5. ábra). Az N-terminális vég a D0-ban van, innen indulva a lánc végigmegy az összes doménen, a D3-ban visszafordul, és ismét végigmegy az összes doménen, azaz a Cterminális vég szintén a D0-ban van. Ezeken kívül érdemes még megemlíteni a D0 és D1 domént összekötı viszonylag hosszabb szakaszt, amit a filamentumban betöltött helye (lásd késıbb) alapján küllı régiónak (DS) neveztek el. A D0 a monomer formában rendezetlen 18
Irodalom terminális régiókat tartalmazza, azonban a polimerizáció után mindkét láncvég α-hélixet alkot, melyek a filamentumban helikális kötegekbe állnak össze (Yonekura és mts., 2003). A D1 domén jellemzıen α-hélixekbıl áll, míg a D2 és D3 döntıen β-szálas szerkezető (Samatey és mts., 2001).
5. ábra: A flagellin térszerkezete és másodlagos struktúrája. Az utóbbin sárga szín jelöli az α-hélixeket, zöld a β-lemezeket, lila a β-fordulatokat. Alatta a domének szekvenciához való hozzárendelése látható, még lejjebb pedig az alegységek közötti kölcsönhatásokban résztvevı szakaszok külön-külön csoportosítva a 11-, az 5-, a 6- és a 16-menetes hélix mentén fennálló kapcsolatokat. (Yonekura és mts., 2003 alapján)
A filamentum szerkezetét a 6. ábra mutatja. Átmérıje mintegy 230 Å, közepén egy 20 Å átmérıjő csatorna húzódik. Sőrőségtérképe alapján a filamentum két részre osztható: egy belsı (mag) részre, ami sugárirányban 10-tıl 55 Å-ig terjed, és egy külsı részre 55-tıl 115 Åig. A belsı részen két nagy sőrőségő koncentrikus képzıdmény különíthetı el: a belsı győrő (10-30 Å), melyet a flagellin alegységek D0 doménjei alkotnak, és a külsı győrő (35-55 Å), melyet a D1 domének építenek fel. A két győrőt összekötı küllıket a DS domén alkotja
19
Irodalom (innen jön az elnevezésük). A D0 és D1 domén helikális kötegei mind tengely-, mind oldalirányban szorosan kölcsönhatnak, stabilizálva ezáltal a filamentumot (Mimori és mts., 1995; Yonekura és mts., 2003). Csonkított flagellinekbıl képzett filamentumokat vizsgálva megállapították, hogy már pár aminosav levágása esetén is helytelenül tekeredik fel a belsı győrő, és a belsı csatorna helyén aggregátumok keletkeznek. Ugyanakkor hosszabb szakaszok elemésztésekor egyre nagyobb darabok tőnnek el az aggregátumból. Ez a megfigyelés is azt bizonyítja, hogy a terminális régiók a belsı győrőt alkotják (Yamashita és mts., 1995).
6. ábra: A filamentum keresztmetszeti (tengelyirányú) képe. Az ábrán 11 alegység, azaz két teljes menet látható. A különbözı színek a különbözı másodlagos szerkezeti elemeket jelölik. (Yonekura és mts., 2003)
A belsı győrővel szemben a filamentum külsı részén az egyes alegységek jól elkülönülnek egymástól, és két részre oszlanak. A külsı győrőhöz csatlakozik 60-tól 80 Å-ig a vertikális oszlop domén, melyet a flagellin D2 doménje alkot. Ehhez kapcsolódik a D3 domén által felépített 50 Å hosszúságú nyúlvány, melyet egy keskeny nyak oszt fel két részre.
20
Irodalom A külsı rész a balkezes ötmenetes hélix mentén szomszédos alegységgel áll kölcsönhatásban (Mimori és mts., 1995; Yamashita és mts., 1995; Mimori-Kiyosue és mts., 1997). A szerkezetek ismeretében mind a polimorfizmusra, mind az önszervezıdésre magyarázatot adhatunk. A polimorfizmus jobb megértéséhez csonkított flagellinekbıl növesztett filamentumok vizsgálatai járultak hozzá (Mimori-Kiyosue és mts., 1996; 1997). Ezek a filamentumok egy újfajta szimmetriával rendelkeztek, ami mind az L-, mind az Rtípusútól eltért: az Lt-típusúval. A csonkítás miatt a filamentumok nem rendelkeztek belsı győrővel, a külsı győrő pakolása viszont csaknem tökéletesen megegyezett az R-típusúéval. Viszont a protofilamentumok (a külsı győrő távolságában) sokkal nagyobb mértékben fordultak el a filamentum tengelyéhez képest, mint az R- vagy az L-típusnál. Ennek alapján elmondható, hogy a külsı győrő magától az R-típusú szimmetriát választja, de a belsı győrővel való kölcsönhatása olyan feszültségeket okoz, amik az elfordulási szöget megváltoztatják. Ugyanakkor az elfordulási szög szabja meg a kétféle protofilamentum arányát is, mivel a hengerpalást megfelelı záródása csak így biztosítható. A kétfajta szimmetria közötti átkapcsolás pontos mechanizmusának felderítésére kiterjedt molekuladinamikai szimulációt végeztek (Kitao és mts., 2006). Ennek során az alegységek között háromféle kölcsönhatás típust különítettek el: „állandó” kölcsönhatásokat, melyek minden konformációban jelen vannak, „csúszó” kölcsönhatásokat, melyek kis energiaváltozással járnak, és „kapcsoló” kölcsönhatásokat, melyek az alegységek közötti kölcsönhatásokat az alegységen belüliek rovására stabilizálják. A szimuláció megmutatta, hogy a sóhidak és hidrogénkötések kialakulása az eredetileg (monomer formában) R-típusú konformációval rendelkezı alegységeket az L-típus felvételére ösztönzi. Az önszervezıdı képesség két fontos kérdést vet fel: hogy továbbítódnak a flagellin molekulák a polimerizáció helyére, ami a filamentum csúcsán van (Iino, 1969), és itt hogyan történik maga a polimerizáció. A második kérdéssel a HAP2-sapka mőködésénél foglalkozunk. Az elsıvel kapcsolatban már régóta tudjuk, hogy a filamentum különféle alegységei a belsı csatornán keresztül jutnak el a polimerizáció helyéhez, ami a folyamatosan épülı flagellum csúcsán van (Morgan és mts., 1993; 1995; Mimori és mts., 1995). Szintén tudható, hogy a következı szerkezeti egység fehérjéinek az expressziója csak az elızı egység elkészülte után indul el (a HAP1 a kampó-fehérje után, a HAP3 a HAP1 után, stb.) (Kutsukake és mts., 1990; Liu & Matsumura, 1994; Aizawa, 1996). Az viszont részleteiben még ma sem ismert, hogyan haladnak elıre a monomerek a csatornában. A filamentum nagy felbontású szerkezetébıl ugyanakkor kiderült, hogy a belsı csatorna átmérıje mindössze 20 Å
21
Irodalom (Yonekura és mts., 2003), ami nem teszi lehetıvé például a flagellin alegységek számára, hogy natív térszerkezettel ide beférjenek. Erre két elmélet létezik: az egyik szerint a filamentum lokálisan kitágul a monomer áthaladásának a helyén, míg a másik azt állítja, hogy az alegységek részben vagy egészen letekeredve jutnak át a csatornán (Ruiz és mts., 1993). Mindenesetre valószínőnek tőnik, hogy a terminális régióknak a továbbításban is fontos szerepük van, mivel a csatornában haladó alegység elsısorban a belsı győrőt alkotó végszakaszokkal kerülhet kapcsolatba (Mimori-Kiyosue és mts., 1997). Végül a flagellin alegységek a filamentum csúcsához érkeznek, ahol a HAP2 sapkával lépnek kölcsönhatásba, és alatta polimerizálódnak.
A HAP2-sapka A filamentum végén egy molekuláris sapka található, amit öt darab HAP2 (FliD) fehérje épít fel (Ikeda és mts., 1984; 1985; 1987; Imada és mts., 1998; Maki és mts., 1998). A sapka a flagellin molekulák polimerizációjához szükséges (Homma és mts., 1985; 1986), hiányában a sejten nem képzıdik filamentum (a felépülés megáll a kampónál), a flagellin alegységek nem épülnek be a filamentum végére, hanem monomer formában az extracelluláris térbe ürülnek (Homma és mts., 1984b). Másrészt viszont a sapkával ellátott filamentumhoz kívülrıl nem lehet további flagellin molekulákat hozzáadni (Homma és mts., 1986). Eszerint a sapka szerepe egyrészt a flagellin kijutásának a megakadályozása, másrészt a polimerizáció elısegítése. Ez okozza azt a furcsa kettısséget, hogy a HAP2 nagyon erısen kapcsolódik a filamentum végéhez, és ezáltal megakadályozza a flagellin molekulák kiürülését az extracelluláris térbe, ugyanakkor mégis elég laza a kötıdés ahhoz, hogy az újabb és újabb alegységek képesek legyenek a sapka és a filamentum vége közé ékelıdni. Laboratóriumi körülmények között viszont éppen a sapkával ellátott filamentum az, amelyre nem tudnak további alegységek ráépülni (Ikeda és mts., 1985). In vitro kétféle módon keletkezhet filamentum a monomerekbıl: ammónium-szulfát (Ada és mts., 1963; Wakabayashi és mts., 1969), illetve rövid filamentum kezdemények (magok) hozzáadásával (Asakura és mts., 1964). Az eltérı konformációs állapotú alegységek kopolimerizálhatók, és a különféle polimorfikus formájú magokra bármilyen monomer ráépíthetı (a normálra akár csonkított is, ha elegendıen magas az ammónium-szulfát koncentrációja, ekkor spirális lesz a kialakuló filamentum) (Asakura & Iino, 1972; Kamiya és mts., 1980).
22
Irodalom A Salmonella typhimurium-ból származó HAP2 molekulasúlya 49.8 kDa és 466 aminosavból áll. A molekula szerkezeti vizsgálatai azt mutatták, hogy a többi axiális fehérjéhez hasonlóan a HAP2 is rendezetlen terminális régiókkal, illetve egy 40 kDa-os kompakt maggal (HP40) rendelkezik, másrészt viszont szekvenciálisan nem hasonlít hozzájuk (Vonderviszt és mts., 1998). Ugyanakkor úgy tőnik, hogy kismértékben homológ egyes chaperonokkal. A HAP2 monomerek képesek nagyobb, győrőszerő struktúrákba rendezıdni: dekamereket, pentamereket és kismértékben egyéb oligomereket alkotni (Ikeda és mts., 1996; Imada és mts., 1998; Maki és mts., 1998). Ez a rendezıdés erısen hımérséklet-, pH- és ionerı-függı: 36°C alatt a dekamer, felette a pentamer forma jellemzı (Vonderviszt és mts., 1998), 8-as pH alatt a dekamer, 8.5-es pH felett viszont a monomer forma van túlsúlyban, és a sókoncentráció növelése is a monomerképzıdés irányába tolja el az egyensúlyt (Imada és mts., 1998). A különféle struktúrák felépülésére NMR- és CD-spektrumok, illetve keresztkötéses kísérletek alapján a következı modellt állították fel (Vonderviszt és mts., 1998). Öt HAP2 molekula győrőszerően összekapcsolódva egy pentamert alkot. Ennek a szélessége 120 Å, a vastagsága pedig 25 Å. Kialakulásában a HP40 fragmentumok közötti kölcsönhatásoknak van döntı szerepük. Két ilyen pentamer aztán egy bipoláris dekamerré áll össze, amelyben a pentamerek rendezetlen terminális régiókat tartalmazó oldalai kapcsolódnak egymáshoz oly módon, hogy ezek a szakaszok α-helikális kötegekké fonódnak össze. Az elektronmikroszkópos vizsgálatok (Yonekura és mts., 2000; Maki-Yonekura és mts., 2003) megerısítették ezt a képet (7. ábra). Ezek szerint a HAP2 négy doménbıl áll: fedılemez, nagy láb, vékony rúd, kötılemez. A polipeptidlánc feltehetıen a flagellinhez hasonlóan fut végig ezeken: az N-terminális vég a kötılemezen van, innen indulva a lánc végighalad az összes doménen, a fedılemeznél visszafordul, és ismét végigmegy az összes doménen, azaz a C-terminális vég szintén a kötılemezen van (Maki-Yonekura és mts., 2003). A kötılemez és a vékony rúd a monomer formában rendezetlen terminális régiókat tartalmazza, melyek a dekamer vagy a filamentum végét lezáró sapka kialakulásakor rendezett (a többi axiális fehérjéhez hasonlóan α-helikális) térszerkezetet vesznek fel. A kötılemez a filamentumhoz való kapcsolódásért, míg a vékony rúd feltehetıen a sapka különleges flexibilitásáért felelıs. A nagy láb és a fedılemez (a többi axiális fehérje jellemzıen β-szerkezető kompakt magjától némileg eltérıen) hasonló arányban tartalmaz αhelikális és β-lemezes szerkezeti elemeket (Vonderviszt és mts., 1998). 23
Irodalom
7. ábra: A HAP2 sapka szerkezete. A bal oldali ábra a HAP2 dekamer háromdimenziós sőrőségtérképének reprezentációja, a jobboldali pedig a HAP2-sapka és a filamentum vége által alkotott szerkezeté. A jobb alsó képen látható fordított L-alakú rés a sapka és a filamentum között feltehetıen az újonnan érkezı flagellin alegység beépülési helye. A lépték a filamentum átmérıjével egyenlı (230 Å). (Yonekura és mts., 2000)
Az elektronmikroszkópos vizsgálatok azt mutatják, hogy a filamentumot lezáró sapka a pentamer forma (Maki és mts., 1998; Yonekura és mts., 2000). Ezt a szerkezetrıl nyert ismeretek is alátámasztják, hiszen a HAP2 rendezetlen terminális régiói tudnak kölcsönhatásra lépni a flagellin hasonló szakaszaival, ami csak a pentamer formánál lehetséges. Feltételezhetı, hogy a sapka és a filamentum között hasonló kapcsolat van, mint a filamentumon belül, azaz α-helikális kötegek biztosítják a stabilitást. A kötıdés erısségét két további topológiai tényezı befolyásolja. Egyrészt a sapka ötszörös szimmetriája nem illeszkedhet tökéletesen a filamentum 11-szeres szimmetriájához. Másrészt a filamentum vége nem egy sík felület: részben - a hélix emelkedése miatt - az alegységek eltolódása egymáshoz képest, részben az egy alegységen belüli strukturáltság igen bonyolult felületet eredményez. Emiatt a sík HAP2 sapka alegységei eltérı erıséggel, illetve eltérı konformációban vesznek részt a kölcsönhatásban, így a leggyengébben kötıdınél viszonylag könnyebben be tud épülni egy új flagellin alegység (Vonderviszt és mts., 1998; Maki-Yonekura és mts., 2003).
24
Irodalom Mindezek alapján a következı modellt állították fel a HAP2 sapka mőködésére (8. ábra). A korábban leírtaknak megfelelıen a flagellinek polimerizációja a HAP3 és a HAP2 között indul meg, majd a továbbiakban a filamentum végén folytatódik. A belsı csatornán keresztül megérkezik a flagellin alegység feltehetıen részben vagy egészen letekeredett formában. Itt a sapka egyrészt megakadályozza, hogy kikerüljön az extracelluláris térbe, másrészt
az
effektív
koncentráció
megnövelésével
meggyorsítja a polimerizációt.
Másodpercenként akár 20 flagellin alegység is képes beépülni (Iino, 1974). A sapka alatt lévı üreg a nagysága alapján éppen egy flagellin alegységet tud befogadni, ami lehetıvé teszi a natív térszerkezet újbóli kialakulását anélkül, hogy más alegységekkel aggregálódna közben. A mechanizmus alapján a HAP2 egyfajta feltekeredést segítı chaperonnak is tekinthetı (Ikeda és mts., 1993), amit a gyenge homológia is alátámaszt.
8. ábra: A HAP2-sapka és a filamentum vége közötti kölcsönhatás modellje. A felsı ábra a HAP2-sapka és a filamentum vége által alkotott szerkezetet mutatja be az öt HAP2 alegység öt különbözı nézıpontjából. Az alsó ábra a HAP2-alegységek lábainak mozgását mutatja be egy (kék színnel jelölt) új flagellin alegység beépülése során. (Maki-Yonekura és mts., 2003)
Az új flagellin alegység beépülésének helye a következı szabad hely lesz az egymenetes hélix mentén. Az ehhez tartozó HAP2 alegység az új flagellin alegységhez fog kötıdni, míg a másik négy HAP2 kis mértékben konformációt vált (8. ábra). Az apró elmozdulások eredményeként a sapka folyamatosan felfele mozog (alegységenként 4.7 Åmel), illetve a flagellinek beépülésével ellentétes irányban forog (alegységenként 6.5 fokkal) (Yonekura és mts., 2000; Maki-Yonekura és mts., 2003). A konformációs változások energiáját közvetlenül feltehetıen a flagellin kötıdése, végsı soron pedig a fehérjeexportot hajtó proton gradiens biztosítja (Minamino & Namba, 2008).
25
Célkitőzés
Célkitőzés A teljes bakteriális flagellum rendkívül bonyolult makromolekuláris struktúra, amelynek egyszerre csak egyes részei tanulmányozhatóak megfelelı alapossággal. Vizsgálataink ennek megfelelıen a flagelláris filamentum felépülésére, a filamentum stabilitására, illetve a HAP2 sapka ebben játszott szerepének felderítésére korlátozódtak. Kísérleteink során konkrét céljaink a következık voltak: •
A rendezetlen terminális régiók szerepének tisztázása a filamentum felépülésében. A fı célkitőzés a kölcsönhatásban résztvevı csoportok pontos felderítése volt festett flagellin monomerek terminális csonkítás utáni polimerizációjával.
•
A flagelláris filamentum stabilitásának, illetve a HAP2 stabilizáló képességének pontosabb jellemzése a következı munkaterv alapján:
A natív filamentum stabilitásának vizsgálata különös tekintettel a HAP2 sapka esetleges stabilizáló hatására.
A rekonstruált filamentumok stabilitásának vizsgálata HAP2 nélkül különféle rekonstruálási módszerek és körülmények alkalmazása esetén.
Megfelelı módszer kidolgozása a HAP2 rekonstruált filamentumokhoz történı kötıdésének detektálására.
A rekonstruált filamentumok stabilitásának vizsgálata HAP2 kötıdése után. Ezen belül különféle inkubálási technikák alkalmazásával a filamentum végére bekötıdött HAP2 molekulák mennyiségének változtatása, és a stabilizációs különbségek mikrokaloriméter, illetve spektropolariméter segítségével történı detektálása.
•
A kapott eredmények felhasználásával egy olyan eljárás kidolgozása, melynek segítségével intakt sapkával ellátott filamentumok hozhatók létre. Ennek fontossága abban rejlik, hogy így lényegében az in vivo létrejövı filamentumokat lehet tanulmányozni, azaz a baktériumokban ténylegesen fennálló kölcsönhatások vizsgálhatók.
26
Anyagok és módszerek
Anyagok és módszerek
Felhasznált vegyszerek és mőszerek A vizsgálatok során felhasznált fehérjék (flagellin és HAP2) a Salmonella typhimurium SJW1103-as törzsébıl (i szerotípus) származtak. A tripszin, a tripszin inhibitor, a Staphylococcus aureus V8 törzsbıl származó endoproteináz Glu-C (V8) és az endoproteináz Lys-C (ELC) a Boehringer-tıl származtak. A többi vegyszer is analitikai tisztaságú volt, és hagyományos kereskedelmi forrásokból származott. A rekonstruált filamentumokkal végzett mérések foszfát pufferban (10 mM Nafoszfát, 150 mM NaCl, pH=7.0), míg a natív filamentumokkal végzett kísérletek Triszpufferban (20 mM Trisz-HCl, 150 mM NaCl, pH=7.8) történtek. A flagellin koncentrációja minden esetben 1mg/ml körül volt (amennyiben nem jelezzük másként a szövegben). A fehérjék preparálása során a centrifugálásokat BECKMAN Avanti és L7-55 centrifugákkal végeztük. Kis mennyiségő filamentum centrifugálásához BECKMAN TL-100 asztali ultracentrifugát használtunk. Az ioncserélı kromatográfiát Pharmacia FPLC készüléken végeztük. A spektroszkópiai (fotometria, fluorimetria, polarimetria) méréseknél különféle HELLMA kvarcküvettákat használtunk.
Fehérjék expressziója, tisztítása Natív filamentumok készítése A natív filamentumokat a következı módon állítottuk elı: Az SJW1103 szalmonella törzsbıl származó sejteket o/n növesztettük 3%-os élesztıkivonatot tartalmazó kultúrában (LB tápoldat). A sejteket 4°C-on 10 perc 2000 rpm-es, majd 30 perc 4000 rpm-es centrifugálással győjtöttük össze. A csapadékot Trisz-pufferban szuszpendáltuk és 3 percig vortexszel kevertettük. Ezután a mintát újból centrifugáltuk, ezúttal 20 percig, 12000 rpmmel, 4°C-on. A csapadékot kidobtuk, mivel a letöredezett filamentumok a felülúszóban voltak. Ezeket egy újbóli, 60 perces, 40000 rpm-es, 15°C-os ultracentrifugálással győjtöttük össze és a fehérjét a mérésekig ebben a csapadék formában tároltuk.
27
Anyagok és módszerek Flagellin és HAP2 expressziója és tisztítása Mind a vad típusú, mind a mutáns flagellinek expresszióját és tisztítását az irodalomban megtalálható módszertan szerint hajtottuk végre apróbb módosításokkal (Asakura és mts., 1964; 1966; Wakabayashi és mts., 1969; Vonderviszt és mts., 1989). A mutáns flagellinhez az ioncserélı kromatográfia alkalmazása elıtt 5mM dithiothreitolt (DTT) adtunk a molekulák közötti diszulfid hidak redukálása érdekében. A HAP2-t az E. coli BL21(DE3) törzsében expresszáltuk, ami a pLysS és pKOT134 plazmidokat is tartalmazta. A fehérje tisztítása az irodalomban leírtaknak megfelelıen történt (Ikeda és mts., 1996; Imada és mts., 1998).
Rekonstrukciós módszerek A filamentum monomerizációja és depolimerizációja A
továbbiakban
megkülönböztetem
a
filamentum
monomerizációját
a
depolimerizációtól. Az elıbbi a monomer flagellinek elıállítását jelenti a filamentumból, míg az utóbbi a filamentum ellenırzött körülmények között történı lassú lebomlását. A monomerizálásnál 10 percig 65-70°C-on inkubáltuk a fehérjeoldatot, majd újabb 10 percig jeges vízfürdıben lehőtöttük, végül 12 percig, 95000 rpm-mel, 4°C-on centrifugáltuk. Az utóbbira azért volt szükség, mert az esetleg az oldatban maradó filamentumkezdemények polimerizációs magokként szolgálhatnak, és pár óra alatt az egész oldat újra polimerizálódhat. A centrifugálás után a felülúszót megtartottuk, ez lett a monomeroldat, míg a csapadékot eldobtuk. A filamentum depolimerizációja a monomerizációnál lényegesen alacsonyabb hımérsékleten történt: a natív filamentumok esetében 50, illetve 55°C-on, míg a rekonstruált filamentumoknál 45, 42.5 és 40°C-on. A depolimerizáció folyamatát minden esetben a CD-jel változásával követtük, az ezzel kapcsolatos beállítások a spektropolarimetriáról szóló szakaszban találhatók.
A flagellin polimerizációja A polimerizációra kétféle eljárást alkalmaztunk. Az elsınél a tisztított monomer flagellinekbıl álló oldathoz 0.2-0.9 M-nyi ammóniumszulfátot ((NH4)2SO4) adtunk hozzá, míg a másodiknál 10-20 %-nyi filamentumkezdeményt, azaz rövid filamentumot (magot). A 28
Anyagok és módszerek reakciót sokáig (pár órától pár napig terjedı intervallumban) hagytuk folyni, majd az elegy centrifugálása után a felülúszót eldobtuk (megszabadulva ezzel az ammónium-szulfáttól, illetve a nem polimerizálódott flagellin alegységektıl), a csapadékot pedig foszfát pufferban feloldottuk. Megjegyzendı, hogy az ammónium-szulfátos polimerizáció után a centrifugálásiszuszpendálási lépéseket többször is meg kellett ismételni. A polimerizáció eredményességét sötét látóterő mikroszkóp használatával állapítottuk meg (lásd késıbb). A magok létrehozásához elıször 0.8 M ammónium-szulfáttal az elızı szakaszban leírt módon végrehajtottuk a polimerizációt (a tisztítási lépéseket is beleértve), majd néhány percig tartó szonikálással apró darabokra törtük a filamentumokat.
A HAP2 sapka rekonstrukciója A HAP2 sapka létrehozására irányuló kísérletekben a flagellin polimerizációjánál leírt módon rekonstruált filamentumokhoz adtunk hozzá 10%-nyi HAP2-t (tömegarányosan). Az inkubálást többféle körülmény beállításával is végrehajtottuk: 20 és 37°C-on, 2 órán keresztül és o/n. A fölös HAP2-t ultracentrifugálással távolítottuk el (12 perc, 95000 rpm, 4°C). A HAP2 kötıdés hatékonyságának ellenırzéséhez a HAP2-vel kezelt filamentumokhoz monomer flagellint adtunk 20-szoros mennyiségben (tömegarányosan), majd egy napos 25°Con történı inkubálás után sötét látóterő mikroszkóppal ellenıriztük a filamentumok növekedését.
Emésztési kísérletek Áttekintés A proteolítikus emésztési kísérletek kétféle célt szolgáltak és ennek megfelelıen két típusuk volt. Az egyiknél a ciszteint tartalmazó mutáns flagellineket csonkítottuk a fluoreszcens jelöléssel történı vizsgálatokhoz, a másiknál pedig a natív filamentumokat a HAP2 stabilizáló szerepének bemutatásához (ezek elméleti hátterét lásd az eredményekrıl szóló részben).
29
Anyagok és módszerek Rekonstruált filamentumok emésztése Ahogy az korábban már említésre került, a flagellin rendezetlen terminális régiókkal rendelkezik, amelyek proteolítikus emésztı enzimekkel könnyen eltávolíthatóak. A festési kísérleteknél alkalmazott enyhe proteolítikus kezelés célja ezeknek a terminális régióknak az ellenırzött eltávolítása volt. A fehérje méretének fokozatos csökkenése gélelektroforézissal jól nyomon követhetı: a terminális régiók elemésztésével elıször az F40-es fragmentumot kapjuk meg, majd további proteolízissel az F27-es kompakt magot, amely viszonylag jobban ellenáll az emésztésnek. Az emésztéshez használt különféle proteolítikus enzimekrıl, illetve az alkalmazott eljárásokról az irodalomban részletes leírások találhatók (Vonderviszt és mts., 1991). A mostani vizsgálatok során alkalmazott korlátozott proteolízis során háromféle emésztı enzimet használtunk: az F(20-494) fragmentum elıállításához ELC-t, az F(1-461) és az F(30-461) fragmentumokhoz V8-at, míg az F(67-450) fragmentumhoz tripszint. Az emésztések eredményeként kapott fragmentumokat ioncserélı kromatográfiával különítettük el a kisebb fragmentumoktól, illetve az el nem emésztett flagellintıl.
Natív filamentumok emésztése A natív filamentumok proteolítikus kezelése tripszinnel történt, és ennek célja a HAP2-sapkával nem rendelkezı filamentumok teljes elemésztése volt (azaz a sapkával lezártak elkülönítése). A fehérjekoncentráció ezeknél a méréseknél 3 mg/ml körüli volt. A filamentumokat elıször 20 percig 45°C-os hıkezelésnek vetettük alá, majd hozzáadtuk a tripszint (1:50 tömegarányban). A proteolítikus kezelés szintén 45°C-on történt és 12 órán át tartott, a végén tripszin inhibitor hozzáadásával állítottuk le (1:40 tömegarányban). Az elemésztett fragmentumokat és az enzimeket ultracentrifugával (10 perc, 60000 rpm, 25°C) választottuk el az intakt (emésztetlen) filamentumoktól. A felülúszót kidobtuk, a csapadékot pedig nagyon óvatosan (nehogy megint eltöredezzenek a sapkával lezárt filamentumok) szuszpendáltuk Trisz-pufferban.
Ellenırzı lépések Tisztaság és koncentráció ellenırzése A
fehérjék
tisztaságát,
illetve
az
emésztési
folyamatot
poliakrilamid
gélelektroforézissel (SDS-PAGE) ellenıriztük (Stryer, 1995). A fehérjék koncentrációját az
30
Anyagok és módszerek abszorpciós görbéjük felvételével határoztuk meg a Beer-Lambert törvény alapján (Cantor & Schimmel, 1980) egy JASCO V-550 típusú spektrofotométerrel. 1 cm úthosszú küvettánál, a 280 nm-en megadott moláris extinkciós koefficiensek behelyettesítésével és a formula átalakításával a következı alakra hozható az összefüggés: C=2.9·A280 (HAP2)
C=3.1·A280 (monomer flagellin)
Itt A280 a 280 nm-en mért abszorpciót jelöli, a koncentrációt pedig a képlet alkalmazásával mg/ml-ben kapjuk meg. Fontos megjegyezni, hogy a flagellinre megadott 3.1es érték a monomer állapotra vonatkozik, azaz a koncentráció méréséhez elıször monomerizálni kell a filamentumot. Ennek oka az, hogy a filamentum nagy mérete miatt erısen szórja a fényt, ami komolyan befolyásolhatja az elnyelés mért értékeit.
Mikroszkópos vizsgálatok A különféle polimerizációs kísérletek ellenırzéséhez sötét látóterő mikroszkópot használtunk. Ez egy hagyományos Nikon LABOPHOT-2 típusú fénymikroszkóp volt, melyet sötét látóteret biztosító kondenzorral szereltek fel. A képalkotás immerziós technikával történt, azaz a kondenzorlencse és a tárgylemez közti rést n=1.515 törésmutatójú immerziós olaj töltötte ki. A használt 20-szoros és 40-szeres objektívekkel megfelelı nagyítást lehetett elérni, amivel már tanulmányozni tudtuk a filamentumokat. A natív filamentumok emésztés utáni elektronmikroszkópos vizsgálata 1% (w/v) uranil-acetáttal negatívan festett mintákon történt. Az alkalmazott mőszer egy JEM1010 (JEOL) elektronmikroszkóp, a tipikus nagyítás pedig 50000-szeres volt.
Mutagenezis Áttekintés A fluoreszcens vizsgálatoknál tiol-reaktív festékeket használtunk, amihez szükséges volt ciszteint tartalmazó mutáns flagellinek gyártása (mivel a vad típusú flagellin nem tartalmaz ciszteint). A ciszteint pontmutációként (azaz egyetlen aminosav megváltoztatásával) illesztettük be a flagellin középsı, variábilis régiójába, amirıl irodalmi ismereteink alapján feltételeztük, hogy nem elengedhetetlenül szükséges a filamentumképzıdéshez. Eredetileg háromféle pontmutánst (S356C, G365C, G377C) gyártottunk, mivel elıfordulhatott volna, 31
Anyagok és módszerek hogy valamelyik mégis zavarja a filamentumok képzıdését, illetve bármilyen egyéb módon a flagellin rendes mőködését. Ezek közül az egyikbıl (G365C) nem kaptunk jó klónt, a másik kettıbıl viszont sikerült filamentum képzésére alkalmas fehérjét gyártani. A fluoreszcens vizsgálatoknál végül az S356C került felhasználásra. Az irányított mutagenezis a hagyományos módon, egyes szálú DNS (M13mp18 fliCi (KpnI, BamHI) SS-DNS) felhasználásával történt. Az M13mp18 fliCi (KpnI, BamHI) SSDNS olyan egyes szálú M13mp18 DNS, mely a KpnI-BamHI hasítóhelyeken beillesztett vad típusú fliCi (azaz flagellin) gént tartalmazza. A mutáns géneket a pKOT1 vektor segítségével transzformáltuk a megfelelı sejtekbe. A pKOT1 annak a plazmidnak az elnevezése, amely a pBR322 plazmidból az EcorI hasítóhelyen a vad típusú fliCi gén beillesztésével jött létre (9. ábra).
Primerek megtervezése Az irányított mutagenezis elsı lépéseként kijelöltük a mutációk pontos helyét, és ez alapján megterveztük a primer szekvenciákat. A hely kijelölésében a fent már említett szempontokon kívül azt is célul tőztük ki, hogy az eredeti aminosav a ciszteinhez nagyjából hasonló mérető legyen, és a cisztein bevitelét egyetlen bázis megváltoztatásával meg tudjuk oldani. Ezek alapján a következı primer szekvenciákat terveztük meg: Mutáció S356C G365C G377C
Primer szekvencia Eredeti kodon Új kodon 5’-acggtacatgcaaaactgc-3’ S356: tcc C356: tgc 5’-aaactgggttgcgcaga-3’ G365: ggc C365: tgc 5’-tctattggttgtaaaactta-3’ G377: ggt C377: tgt
A primer szekvenciában a módosított kodont vastag bető jelöli, azon belül külön kiemeltük a megváltoztatott bázist.
Mutagenezis, szekvenálás A mutagenezis az irodalomban is szereplı hagyományos módon történt (Yamashita és mts., 1995). Elıször foszforileztük a primereket, majd hibridizáltuk a vad típusú flagellint tartalmazó egyes szálú DNS-sel (M13mp18 fliCi (KpnI, BamHI) SS-DNS), végül szintetizáltuk az új szálat. Ezekhez a lépésekhez egy MJ Research PCR készüléket használtunk.
32
Anyagok és módszerek A mutagenezis után a Sanger módszer szerinti kézi szekvenálással kerestük meg a jó klónokat (Sanger & Coulson, 1975). Ehhez elıször egyes szálú DNS-t preparáltunk a mutáns génekbıl, hibridizáltuk a szekvenáló primerrel és radioaktív jelölıvel (α-35S) láttuk el. A polimerizációt a megfelelı ddNTP-kkel állítottuk le. A mintákat karbamidos poliakrilamid gélelektroforézissel futtattuk, majd az eredményként kapott gélrıl autoradiogramot készítettünk. Ennek kiértékelésével kerestük meg a jó (sikeresen mutált) klónokat.
További transzformációs lépések A jó klónokat ezután E. Coli 7118-ba transzformáltuk, majd KpnI és BamHI enzimekkel preparatív emésztést végeztünk rajtuk. A mintákat preparatív gélelektroforézissel (SeaPlaque GTG agaróz gélen) futtattuk, melynek végén a mutáns gént tartalmazó inzerteket kivágtuk a gélbıl. Az inzerteket beligáltuk az üres (azaz a KpnI és BamHI hasítóhelyek közti szakasz nélküli) pKOT1 vektorba, majd az így kapott plazmidokat elıbb E. Coli 7118-ba, majd E. Coli LB5000-be, végül elektroporáció segítségével a flagellin-deficiens SJW2536 S. Typhimurium törzsbe transzformáltuk. Az így kapott mutáns törzsekbıl azután a vad típussal megegyezı módon expresszáltuk és tisztítottuk a (mutáns) flagellineket.
Spektrofluorimetria, festési eljárások Elméleti háttér A fluoreszcencia spektroszkópia a fehérjék vizsgálatának egyik elterjedt módszere. Lényege az, hogy a fehérje által elnyelt fény egy része fluoreszcencia formájában visszasugárzódik, és ez a viszonylag lassú folyamat sokféle információval szolgál a molekuláról, mivel a kromofórok, azaz a fény elnyelésére képes csoportok környezete erısen befolyásolja egyrészt az elnyelésük, másrészt az emissziójuk tulajdonságait (Cantor & Schimmel, 1980; Eftink, 1991). Az optikailag gerjesztett állapot kioltásának egy különleges módja, amikor egy térben viszonylag közeli kromofór (az akceptor, A) kerül gerjesztett állapotba, miközben az eredeti molekula (a donor, D) visszakerül az alapállapotba. Ezt hívjuk fluoreszcencia rezonancia energiatranszfernek (FRET), amelynek Förster dolgozta ki az elméletét (Förster, 1948). A fehérjék természetes fluoreszcenciája többnyire gyenge, mivel az azért felelıs három aromás aminosav (fenilalanin, tirozin, triptofán) fluoreszcencia érzékenysége alacsony.
33
Anyagok és módszerek Ezen olyan festékekkel lehet segíteni, amelyek stabilan képesek kapcsolódni a fehérjéhez és erısen fluoreszkálnak. Ezek a festékek általában két részbıl állnak: az egyik a kötıdést biztosítja, a másik a fluoreszcencia tulajdonságait (gerjesztési és emissziós spektrum) szabja meg. A fluoreszcencia jelölés másik kedvezı tulajdonsága, hogy lehet olyan festékpárokat találni, amelyeknél az egyik emissziós spektruma erısen átfed a másik gerjesztési spektrumával, és így FRET vizsgálatokra alkalmasak (Cantor & Schimmel, 1980; Lakowicz, 1983; Eftink, 1991; Haugland, 2002).
Fluoreszcens jelölések A fluoreszcens jelölésekhez tiol-reaktív festékeket használtunk. A FRET kísérletekben a donor molekula 7-diethylamino-3-(4’-maleimidylphenyl)-4-methylcoumarin (CPM) vagy Alexa Fluor 350 C5 maleimide (AF350), míg az akceptor molekula Alexa Fluor 488 C5 maleimide (AF488) volt, melyek a Molecular Probes-tól származtak. Mindhárom festék kovalensen kötıdik a fehérje tiol-csoportjaihoz (Haugland, 2002). A jelölést a monomer formájú (natív, illetve terminálisan csonkított) flagellinen végeztük. A felhasznált festékek spektrális tulajdonságai a következık (Haugland, 2002): Festék CPM AF350 AF488
FRET szerep Donor Donor Akceptor
Moláris extinkciós koefficiens 33 000 cm-1·M-1 19 000 cm-1·M-1 65 000 cm-1·M-1
Abszorpciós csúcs 384 nm 346 nm 495 nm
Emissziós csúcs 470 nm 442 nm 519 nm
A tiol-reaktív fluoreszcens festékeket kovalensen kötöttük a ciszteint tartalmazó (natív és csonkított) mutáns flagellinekhez az irodalomban szereplı standard eljárásoknak megfelelıen (Haugland, 2002). A jelölési reakció elıtt a molekulák közötti diszulfid hidakat Tris-(2-carboxyethyl)phosphine segítségével redukáltuk. A maradék festéket Sephadex G-25 oszlopon történı gélszőréssel választottuk el a megjelölt flagellintıl. A festés hatékonyságát a következı képlettel számítottuk ki:
Festék mennyisége (mól) Ax Fehérje molekulasúlya = ⋅ Fehérje mennyisége (mól) ε mg fehérje ml Itt Ax az abszorpció értéke, ε pedig a festék moláris extinkciós koefficiense az abszorpciós csúcsnál. Ezek számszerő értékei az elızı táblázatban láthatók. A flagellin és csonkított fragmentumainak koncentrációját a 280 nm-en mért elnyelés alapján számoltuk ki
34
Anyagok és módszerek (a korábban részletezett módon), azonban azt korrigáltuk a festék abszorpciójával ugyanezen a hullámhosszon (Haugland, 2002). A festés hatékonysága jellemzıen 40% és 70% között volt, azaz 0.4-0.7 festék molekula jutott egy fehérje molekulára. A festékkel jelölt flagellin molekulák polimerizációs képességének ellenırzése céljából
ammónium-szulfát
hozzáadásával
filamentum
képzıdést
indukáltunk.
A
filamentumok létrejöttét fluoreszcencia mikroszkópiával vizsgáltuk meg, az ehhez használt mőszer egy fluoreszcencia feltéttel ellátott Olympus BX50 mikroszkóp volt. A FRET detektálásához elıször rövid filamentumokat készítettünk a jelöletlen flagellinekbıl a korábban leírt polimerizációs eljárás segítségével. Következı lépésként vékony rétegben donor molekulával jelölt monomereket polimerizáltattunk a rövid filamentumok végére (a monomer:filamentum összetétel 1:50 volt tömegarányosan). A vékony réteg azért fontos, hogy ne legyen túl nagy a fluoreszcens hátterünk, hanem csak a kötıdés közelében legyenek festékmolekulák. Ezután AF488-cal megfestett alegységeket adtunk a mintához 0.1 mg/ml koncentrációban, melyek kötıdését az akceptor 512 nm-nél mért indukált fluoreszcenciájának FRET miatti megjelenésével detektáltuk. Ezeket a méréseket
egy
számítógép
által
vezérelt
Fluoromax-2
(Jobin-Yvon)
fluoreszcens
spektrofotométerrel hajtottuk végre.
Spektropolarimetria Elméleti háttér A biológiai makromolekulák többsége optikailag aktív, melynek két formája van: az optikai forgatás (ORD), ami a cirkuláris kettıs töréssel egyenértékő, és a cirkuláris dikroizmus (CD), ami az ellipszicitással egyezik meg. Az elsı esetben a lineárisan poláros fény síkja elfordul a mintán való áthaladás során. A másodikban a balra és jobbra cirkulárisan poláros fény abszorpciójának eltérése miatt a mintát elhagyó fény elliptikus lesz (Cantor & Schimmel, 1980). A fehérjék esetében különösen a kitüntetett iránnyal rendelkezı másodlagos szerkezetek (α-hélix, β-lemez, β-fordulat) optikai aktivitása erıs, mivel ezeknél a peptidkötések dipólmomentumai nagyjából párhuzamosan állnak, és így összeadódnak. Ezeknek a másodlagos szerkezeteknek jellegzetes CD-spektrumuk van, mivel a forgatóerı, akárcsak az elnyelés, a hullámhossz függvényében változik.
35
Anyagok és módszerek A másodlagos szerkezetekre jellemzı CD görbék segítségével elvileg bármilyen ismeretlen szerkezető fehérje másodlagos struktúráinak aránya meghatározható a fehérje CDspektrumának ismeretében. Másrészt a denaturáció is vizsgálható a CD-jel mérésével, ugyanis ennek során a másodlagos szerkezetek eltőnnek, a fehérje teljesen letekeredett állapotba kerül. Ez természetesen azt eredményezi, hogy megszőnik az ezen szerkezetek rendezettségébıl fakadó dipólmomentum, ami erısen lecsökkenti a CD-jelet. Ezzel a módszerrel jól tanulmányozható például a hımérsékleti átmenet helye.
Mérési beállítások A fehérjék CD görbéinek vizsgálata a távoli UV tartományban történt. A méréshez használt mőszer egy szabályozható hımérséklető cellatartóval felszerelt JASCO J-720 típusú spektropolariméter volt. A mérést minden esetben 1 mm vastagságú, termosztálható, hengeres kvarcküvettával végeztük. A fehérje koncentrációja 1 mg/ml körüli volt. A CD-jelen kívül az elnyelés nagyságát is ellenıriztük, mivel annak túl alacsony értéke rontja a jel/zaj arányt, a túl magas viszont a bizonytalanságot növeli. Alapvetıen háromféle különbözı típusú görbét vettünk fel: a CD-jel változását a hullámhossz, a hımérséklet, illetve az idı függvényében. Az elsı egyszerően a CD-spektrum felvételét jelentette, a második a denaturációs hımérséklet meghatározására szolgált, míg a harmadikkal a filamentum depolimerizációját követtük nyomon. A spektrumméréseknél 300 nm-tıl 200 nm-ig vettük fel a CD-jelet 100 nm/perc sebességgel. A hımérsékleti görbéket 222 nm-en mértük, 20°C-ról 75°C-ra 50°C/óra sebességgel főtöttük fel a mintát. A 222 nm kiválasztásában az játszott szerepet, hogy itt a fehérjék CD-jele általában nagy, ráadásul a polimerizáció és a depolimerizáció során végbemenı α-hélix tartalom változás is itt követhetı jól nyomon. Végül az idımérés során 100 percig vettük fel a CD görbét szintén 222 nm-en. A rekonstruált filamentumok 45°C-on végzett depolimerizációs vizsgálatánál a 100 perces mérés két részre oszlott. Az elsı egy gyors felfőtési szakasz volt, ahol a mintát kb. 20°C-ról mintegy 10 perc alatt az adott (45°C-os) hımérsékletre melegítettük, míg a maradék idıben ezen a hımérsékleten vizsgáltuk a CD-jel változását. Hasonló mérést végeztünk 40°C-on és 42.5°C-on is. A natív filamentumok 50°C-on végrehajtott depolimerizációs vizsgálatánál ettıl kissé eltérı módszert alkalmaztunk. A spektropolarimétert elımelegítettük 50°C-ra, mielıtt
36
Anyagok és módszerek betettük volna a mintát, ezzel elkerültük a kezdeti 10 perces tranziens szakaszt. Hasonló mérést végeztünk 55°C-on is. A görbék kiértékelését mind a hımérsékleti, mind az idımérések esetén részben a JASCO által a mőszerhez biztosított Standard Analysis segédprogrammal (zajszőrés), részben az ORIGIN grafikonkezelı programmal végeztük.
Mikrokalorimetria Elméleti háttér A fehérjék térszerkezetének változásait a termodinamikai paraméterek: az entrópia, az entalpia, a hıkapacitás változása kíséri. Ezek mérésére szolgál a differenciális pásztázó mikrokalorimetria (Differential Scanning Calorimetry, DSC), melynek segítségével tanulmányozható különbözı fehérjék hıstabilitása, valamint a natív háromdimenziós térszerkezetükbıl való letekeredésük. Ezáltal a molekulán belüli kölcsönhatások erısségére (van der Waals erık, H-hidak, stb.), a molekula kompaktságára, a kooperatív egységek (domének) számára következtethetünk. A kalorimetriás mérések során a minta és a referenciaként használt puffer hıkapacitáskülönbségét mérjük a hımérséklet függvényében egy adott hımérséklettartományban. A denaturáció egy (vagy több) éles csúcsként jelentkezik a hıkapacitás görbén. A folyamat (kalorimetrikus) entalpiaváltozása a görbe alatti területtel egyenlı. Meghatározásánál figyelembe kell venni, hogy a natív és a denaturált fehérje hıkapacitásai eltérnek egymástól, melynek fı oka a natív állapotban eltemetett hidrofób csoportok felszínre kerülése. A kalorimetrikus entalpiaváltozáson kívül meghatározható a Van't Hoff entalpia is, mely az egyensúlyi állandó hımérsékletfüggésébıl számítható ki valamilyen adott (alapesetben kétállapotú) denaturációs modellt feltételezve. Egy doménbıl álló fehérje és kétállapotú átmenet esetén a kétféle entalpia megegyezik egymással. Ha ettıl eltérı esettel van dolgunk, akkor az entalpiák értéke is különbözik. A kalorimetrikus entalpiaváltozás magasabb értéke jellemzıen többlépcsıs, intermedier állapotokon keresztüli átmenetre utal, míg a fordított eset (magasabb Van't Hoff entalpia) gyakran oligomer szerkezetet és az ezzel járó erısen kooperatív denaturációt jelez.
37
Anyagok és módszerek Mérési beállítások A HAP2 kötıdésének hatását vizsgáló DSC méréseket egy DASZM-4 típusú, számítógéppel vezérelt differenciális pásztázó mikrokaloriméterrel végeztük, míg a polimerizációs körülmények hatását a filamentum stabilitására egy MicroCal VP-DSC segítségével tanulmányoztuk. A mérés során a kaloriméter két cellája közül az egyikbe a mérendı minta, a másikba a referencia anyag került (azaz hıkapacitás-különbséget mértünk) mindkét mőszernél. A rendszer felfőtésénél megfelelıen alacsony főtési sebesség (1°C/perc) választásával kvázistacionárius folyamatra törekedtünk. A mérési tartomány a DASZM-4 esetében 10-70°C, míg a MicroCal VP-DSC-nél 15-75°C volt. Utóbbinál a mérés elıtt 30 percig az induló hımérsékleten termosztáltuk a rendszert. A konkrét méréseknél elıször egy alapvonalat rögzítettünk (mindkét cellába referencia oldatot töltve), majd az egyik cellában a referenciát a mérendı mintára cseréltük, és felvettük a fehérjére jellemzı termogramot. A minta hıabszorpciós görbéjébıl kivontuk az alapvonalat, ezzel kiküszöböltük a két cella közötti különbséget, és megkaptuk a fehérje Cp(T) függvényét. A kapott eredményeket az ORIGIN grafikonkezelı program segítségével dolgoztuk fel (simítás, görbe alatti terület számítása, stb.).
38
Eredmények
Eredmények és értelmezésük
A filamentum felépülésének vizsgálata FRET segítségével Áttekintés Kísérleteink elsı szakaszában a filamentum felépülését, illetve a flagellin rendezetlen terminális régióinak ebben játszott szerepét tanulmányoztuk. A fı célkitőzés a kölcsönhatásban résztvevı csoportok pontos felderítése volt festett flagellin monomerek terminális csonkítás utáni polimerizációjával, kihasználva a fluoreszcencia rezonancia energia transzfer (FRET) jelenségét. A FRET két festékmolekula közötti erısen távolságfüggı, fotonkibocsátás nélküli kölcsönhatás. Minden olyan folyamat, ami a donort és az akceptort közel hozza egymáshoz, energiatranszfert fog eredményezni. Ennek köszönhetıen a FRET nagyon érzékeny eszköz a makromolekulák közötti kölcsönhatások detektálására, így alkalmas annak felderítésére is, miként építik fel a rendezetlen terminális régiók a filamentumok belsı magját. Mivel a fluoreszcens jelölésekhez tiol-reaktív festékeket (CPM, AF350 és AF488) választottunk, ezért elıször ciszteint is tartalmazó mutáns flagellineket kellett gyártanunk. Ezután az így kapott mutáns flagellinek polimerizációja során detektáltuk a FRET jelenségét. Végül különféle terminálisan csonkított flagellin fragmentumot készítettünk, és a FRET segítségével megvizsgáltuk a polimerizációs képességüket.
Mutáns flagellinek készítése A kiválasztott tiol-reaktív fluoreszcens festékek ciszteinhez tudnak kötıdni, azonban a S. typhimuriumból származó flagellin aminosav szekvenciája egyetlen ciszteint sem tartalmaz (Kanto és mts., 1991). A FRET kísérletek elsı lépése éppen ezért olyan mutáns flagellinek gyártása volt, amelyek ciszteint is tartalmaznak. A mutáció során a ciszteint a flagellin központi, változékony részébe illesztettük be, mivel a molekulának errıl a régiójáról kimutatták, hogy nem szükséges alapvetıen a filamentum kialakításához (Namba & Vonderviszt, 1997; Yamashita és mts., 1995; MimoriKiyosue és mts., 1997). A pontmutáció pontos helyéhez három pozíciót választottunk ki: a
39
Eredmények 356-os szerint, a 365-ös glicint és a 377-es glicint, azaz összesen három különbözı pontmutánst próbáltunk meg elkészíteni. EcoRI
FliC i gén (3500 bp) pBR322 (4363 bp)
Kódoló szakasz STOP
START
KpnI STOP
EcoRI
Üres pKOT1 (5680 bp)
KpnI
BamHI
STOP START EcoRI
EcoRI
pKOT1 (7863 bp)
BamHI
Inzert (2183 bp) KpnI
Inzert (2183 bp) KpnI
S356C
START BamHI EcoRI
Inzert (2183 bp)
START BamHI EcoRI
KpnI
Inzert (2183 bp)
START BamHI EcoRI
G365C
KpnI
G377C
S356C
START BamHI EcoRI
G377C
KpnI
KpnI
STOP
STOP START
EcoRI
START
G365C
EcoRI
pKOT1 (7863 bp)
KpnI
EcoRI
STOP BamHI
START
EcoRI
EcoRI
pKOT1 (7863 bp)
BamHI
EcoRI
pKOT1 (7863 bp)
BamHI
9. ábra: A mutagenezis fıbb lépései
Az irányított mutagenezist a hagyományos génsebészeti technikák segítségével hajtottuk végre egyes szálú DNS (M13mp18 fliCi (KpnI, BamHI) SS-DNS) felhasználásával. A jó klónokat. preparatív emésztés (KpnI-BamHI) és gélelektroforézis után a pKOT1 vektor
40
Eredmények segítségével (9. ábra) transzformáltuk több lépésen keresztül a flagellin-deficiens SJW2536 S. Typhimurium törzsbe. A kapott mutáns törzsekbıl azután a vad típussal megegyezı módon expresszáltuk és tisztítottuk a (mutáns) flagellineket. A mutagenezis végeredményeként a három mutáció közül kettıbıl lettek jó klónok: az S356C és a G377C-bıl, melyek közül a további vizsgálatoknál az S356C jelő mutánst használtuk fel.
A flagellinek filamentumba történı beépülésének vizsgálata A kísérletek következı szakaszában az elızı lépésben legyártott S356C jelő mutáns flagellin segítségével vizsgáltuk a filamentum felépülését. Ennek során fı célunk a flagellin alegységek filamentum végére történı beépülésekor létrejövı energiatranszfer detektálása volt. A tiol-reaktív fluoreszcens festékeket kovalensen kapcsoltuk a ciszteint tartalmazó mutáns flagellinhez. Donor és akceptor molekulának CPM-et, illetve AF488-at (Haugland, 2002) választottunk az energiatranszfer mérések során. Ennek a donor-akceptor párak magas a kvantumhatásfoka, az abszorpciós spektrumaik jól elkülönülnek, ugyanakkor a CPM emissziós spektruma jelentıs mértékben átfed az AF488 abszorpciós spektrumával. A CPM-et 394 nm-en gerjesztettük és a FRET jelenségét az akceptor aktivált fluoreszcenciájának megjelenésével mutattuk ki 512 nm-en. A mutáció során módosított 356-os pozíció a filamentum külsı oldalán helyezkedik el, vagyis feltételezésünk szerint nem befolyásolta a polimerizációt. Annak bizonyítására, hogy a fluoreszcens festékek kötıdése a flagellinhez valóban nem zavarja a filamentum kialakulását, a CPM-mel, illetve AF488-cal jelölt flagellin polimerizációs képességét teszteltük AS-tal indukálva
a
filamentum
képzıdését
(Wakabayashi
és
mts.,
1969).
Egynapos,
szobahımérsékleten történı inkubálás után fluoreszcencia mikroszkóppal megfigyelhetı volt, hogy a festékkel megjelölt flagellin mintáink (0.2 M AS koncentráció felett) helikális filamentumokká polimerizálódtak. A filamentumok képzıdése arra utal, hogy a festékek flagellinhez kapcsolódása nem gátolta meg a polimerizációs képességet. A következı kísérlet célja az volt, hogy detektáljuk mindössze néhány molekula kötıdését a filamentumok végéhez. Az érzékenység növelése érdekében rendkívül rövid filamentumokat készítettünk nagy (1M) AS koncentráció alkalmazásával, majd ezt a mintát szonikáltuk, hogy tovább növeljük a szabad végek számát, amelyeken az alegységek beépülése lezajlik. A jelöletlen filamentumok végeire csak néhány CPM által megfestett
41
Eredmények flagellin alegységet polimerizáltattunk rá, hogy az energiatranszfer mérésekhez a donor molekulákból minél vékonyabb réteget képezzünk, ezáltal minimalizálva a fluoreszcens hátteret. Az AF488-cal festett flagellin hozzáadása a CPM által megjelölt alegységekkel lefedett rövid filamentumokat tartalmazó oldathoz a fluoreszcencia intenzitás csökkenését eredményezte a CPM emissziós maximumánál (470 nm), miközben egy új csúcs jelent meg 512 nm körül (10. ábra, kék vonal). Az idı függvényében vizsgálva a fluoreszcens jel változását 512 nm-en növekedést tapasztaltunk (11. ábra, kék vonal), amit a donor és akceptor molekulák között létrejövı energiatranszferként, vagyis a flagellin alegységek filamentum végén történı egymáshoz kötıdéseként lehetett interpretálni. A kontrollkísérletekben nem észleltünk energiatranszfert a CPM és AF488 által megjelölt flagellin monomerek között az oldatban.
10. ábra: Emissziós spektrumok 394 nm-es gerjesztési hullámhossz esetén. Az egyes görbék natív flagellin (kék) és F(67-450) fragmentum (zöld) monomerek filamentumhoz történı hozzáadása esetében mutatják az intenzitás alakulását. Az alacsonyabb hullámhosszú csúcs a donor, a magasabb az akceptor emissziós maximumát jelzi.
A terminálisan csonkított fragmentumok elkészítése A következı lépés a festett flagellin monomerek terminális csonkítása utáni polimerizációs vizsgálat volt, melynek során azt tanulmányoztuk, hogy a rendezetlen terminális régiók közül melyik milyen szerepet játszik a filamentum felépülésében. Azt már az irodalomból tudjuk, hogy a csonkított alegységek megfelelı körülmények között képesek
42
Eredmények ráépülni a filamentumkezdeményekre (Vonderviszt és mts., 1991). Kérdés, hogy ebben milyen szerepet játszanak az N-, illetve a C-terminális régiók. A kérdés megválaszolásához fel lehet használni a festett monomereket, mivel ezek polimerizációja fluoreszcencia mikroszkóppal, illetve a FRET jelenségét kihasználva fluoriméterrel jól követhetı. A fragmentumok elkészítéséhez az elızıekben elkészített ciszteint tartalmazó S356C jelő mutáns flagellint használtuk fel. Erısen specifikus proteázok alkalmazásával a flagellin rendezetlen terminális régiói elıre meghatározott módon távolíthatók el, és az eredményül kapott fragmentumok könnyen tisztíthatók ioncserélı kromatográfiával (Vonderviszt és mts., 1991). Az F(20-494) fragmentumok, amelyeknél a flagellin 19 N-terminális aminosava hiányzik, ELC-vel történı enyhe proteolítikus kezeléssel állíthatók elı, míg az F(1-461) és az F(30-461) fragmentumokat V8 proteázzal történt emésztéssel kaptuk. Az F(1-461) intakt Nterminális régióval rendelkezik, de hiányzik 33 C-terminális aminosava, míg az F(30-461) mindkét végén csonkításokat tartalmaz. Ezeken túlmenıen mindkét rendezetlen terminális régiót teljesen eltávolítottuk tripszines emésztéssel, ami az F(67-450) fragmentumot eredményezte.
A csonkított fragmentumok kötıdése a filamentumok végéhez A FRET kísérletek utolsó szakaszában a flagellin N- és C-terminális rendezetlen régióinak polimerizáció során játszott szerepének felderítése érdekében megvizsgáltuk különbözı terminálisan csonkított fragmentumok kölcsönhatását a flagelláris filamentumok végével. A tiol-reaktív fluoreszcens festékeket a fentebb már ismertetett módon kovalensen kapcsoltuk a ciszteint tartalmazó mutáns flagellin terminálisan csonkított fragmentumaihoz. Az AF488 által jelölt flagellin fragmentumok polimerizációjának FRET által történı nyomon követése feltárta, hogy a 19 N-terminális aminosav eltávolítása utáni F(20-494) fragmentumok hatékonyan tudtak kötıdni a filamentumok végéhez (11. ábra, piros vonal). Ezzel szemben a C-terminális szakaszok eltávolítása a kötıdési képesség teljes elvesztését eredményezte mind az F(1-461), mind az F(67-450) fragmentumok esetében (11. ábra, fekete és zöld vonal).
43
Eredmények
11. ábra: Az 512 nm-en mért fluoreszcencia intenzitás idıbeli változása. Az egyes görbék natív flagellin (kék), F(20-494) fragmentum (piros), F(1-461) fragmentum (fekete) és F(67450) fragmentum (zöld) monomerek filamentumhoz történı hozzáadása esetében mutatják az emisszió alakulását. Az F(20-494) fragmentumokkal lezárt filamentumhoz további F(20-494) alegységek hozzáadásakor tapasztalt jelváltozást a sárga görbe mutatja. A gerjesztési hullámhossz minden esetben 394 nm volt.
Habár az F(20-494) fragmentumok képesek voltak kötıdni a filamentumok végéhez, fiziológiás körülmények között alkalmatlanok voltak a folyamatos polimerizációra, amit a következı kísérlettel tártunk fel. Elsı lépésként AF488-jelölt F(20-494) fragmentumokat a fent leírt módon kötöttünk a filamentumok végéhez, ami akceptorok által jelölt, csonkított alegységekkel lezárt filamentumokat eredményezett. A donorok által jelölt CPM-F(20-494) fragmentumok ezt követı hozzáadása során nem észleltünk energiatranszfert (11. ábra, sárga vonal), ami arra utal, hogy az F(20-494) fragmentumok tengelyirányban nem képesek egymáshoz kötıdni, vagyis feltehetıen csak egyetlen alegység réteget képeznek a filamentum végén. A kontrollkísérletekben a CPM által megjelölt flagellin hozzáadása az AF488-cal festett
alegységekkel
lezárt
filamentumokhoz
nagyon
hasonló
kötıdési
görbéket
eredményezett, mint amiket a fent részletezett fordított elrendezés során kaptunk, ami arra utal, hogy a dipólus geometria mindkét esetben hatékony energiatranszfert tesz lehetıvé.
44
Eredmények A flagellin rendezetlen terminális régióinak kölcsönhatása a filamentum felépülése során A bakteriális ostorok helikális filamentumainak szerkezete a monomer flagellin rendezetlen terminális régiói által felépített legbelsı mag kivételével atomi felbontásban már korábban meghatározásra került (Samatey és mts., 2001). A rendezetlen terminális régiókról ugyanakkor tudjuk, hogy erıs hajlamot mutatnak amfipatikus α-hélixek kialakítására (Vonderviszt és mts., 1990; 1992b). A flagellin polimerizációját ezeknek a rendezetlen szakaszoknak α-helikális konformációba történı stabilizálódása kíséri (Aizawa és mts., 1990; Namba & Vonderviszt, 1997; Yamashita és mts., 1998). Mindezek alapján korábban azt feltételezték, hogy a tengelyirányban szomszédos alegységek α-helikális N- és C-terminális régiói kölcsönhatnak, és összefonódó helikális kötegeket (coiled-coil) alakítanak ki a polimerizáció során (Homma és mts., 1990a). Ezzel szemben a legfrissebb eredmények azt mutatják, hogy a helikális kötegek ugyan valóban léteznek, de nem az alegységek között, hanem az alegységeken belül alakulnak ki az N- és C-terminális régiók összefonódásával. A már létrejött kötegek közötti hidrofób kölcsönhatás alapvetı szerepet játszik a filamentum szerkezetének stabilizálásában (Yonekura és mts., 2003). A filamentum szerkezetérıl alkotott képünk megváltozásával saját eredményeink értelmezését is módosítanunk kellett. Korábban úgy magyaráztuk megfigyeléseinket, hogy a filamentumok távoli végén az alegységek szabad N-terminális véggel rendelkeznek, ami hozzáférhetı az újonnan beépülı flagellin molekulák C-terminális szakasza számára. Az újabb szerkezeti ismeretek tükrében a magyarázat ennél némileg bonyolultabb. Eszerint az F(1-461), az F(30-461) és az F(67-450) flagellin fragmentumoknál teljesen hiányzik az összefonódó helikális kötegek kialakításához szükséges C-terminális α-hélix. Ennek hiányában ugyanakkor a helikális kötegek sem tudnak kialakulni, ami viszont az alegységek közötti hidrofób kölcsönhatásokat is lehetetlenné teszi. A filamentumot stabilizáló kölcsönhatások nélkül viszont nem tudnak új alegységek beépülni, ami azt eredményezi, hogy ezek a fragmentumok teljesen elveszítik a polimerizációs képességüket. Ezzel szemben az F(20-494) fragmentumnál az N-terminális α-hélix csak részben hiányzik, vagyis a helikális kötegek feltehetıen részben ki tudnak alakulni. Ezek a fragmentumok képesek voltak hozzákötıdni a filamentumok végéhez, ami arra utal, hogy a tökéletlen helikális kötegek is képesek voltak elegendı stabilizáló hidrofób kölcsönhatás létrehozására a már felépült filamentummal. Ugyanakkor nem észleltünk energiatranszfert a
45
Eredmények donorokkal jelölt F(20-494) monomerek hozzáadásakor az akceptorral jelölt F(20-494) alegységek által lezárt filamentumokhoz, vagyis mindössze egyetlen F(20-494) réteg tudott kialakulni. Ebbıl arra következtethetünk, hogy a tökéletlen helikális kötegek egymással már nem tudtak megfelelı hidrofób kapcsolatokat alkotni. Összességében elmondható, hogy eredményeink alátámasztják a filamentum szerkezetének legújabb, alegységen belüli összefonódó helikális kötegeket, és az ezek között fennálló, a szerkezetet stabilizáló hidrofób kölcsönhatásokat tartalmazó modelljét.
A natív flagelláris filamentumok stabilitása A HAP2 sapka hatása a natív flagelláris filmentumok stabilitására Kísérleteink következı szakaszában a natív filamentumok stabilitását vizsgáltuk HAP2 sapkával, illetve sapka nélkül. Ennek során elıször a filamentum denaturációs hımérsékletét, illetve annak változását tanulmányoztuk különféle körülmények között. A natív flagelláris filamentumokat több lépcsıben történı centrifugálással és újraszuszpendálással választottuk le a baktériumokról és különítettük el tılük. A tisztítási eljárás során a filamentumok könnyen kisebb darabokra törnek. Ennek köszönhetıen a natív filamentum
elegyek
várhatóan
mind
HAP2-sapkával
rendelkezı,
mind
anélküli
filamentumokat tartalmaznak. A natív filamentum minták olvadási profiljai kétfázisú viselkedést mutattak (12. ábra és 13. ábra, piros vonal) a 222 nm-en mért távoli ultraibolya CD spektroszkópia alapján. Kézenfekvınek tőnik az a magyarázat, hogy az elsı, 57°C körüli átmenet a sapka nélküli filamentumok denaturációjához köthetı, míg a második, 61°C körüli átmenet a HAP2-sapkával rendelkezı filamentumoknak köszönhetı. A kapott olvadási profilok alapján feltételezhetı, hogy a filamentumoknak mintegy 20%-a tartalmazhat intakt sapkát, ugyanakkor ez az arány eltért a különbözı mintákban.
46
Eredmények
0
CD-jel [mdeg]
-100 Natív filamentum Natív filamentum emésztés után Natív filamentum inkubálás után
-200
-300 25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Hımérséklet [°C] 12. ábra: A natív flagelláris filamentum hıdenaturációjának CD-görbéje 222 nm-en
8
A CD-jel deriváltja
6 Natív filamentum Natív filamentum emésztés után Natív filamentum inkubálás után
4
2
0 25
30
35
40
45
50
55
60
65
Hımérséklet [°C] 13. ábra: A natív flagelláris filamentum CD-görbéjének deriváltja 222 nm-en
47
70
Eredmények Arra a feltételezésre alapozva, hogy a HAP2 sapkával rendelkezı filamentumok ellenállóbbak a hıindukált depolimerizációval szemben, mint a sapka nélküliek, kialakítottunk egy eljárást az intakt HAP2 sapkával lezárt filamentumok elkülönítésére: a natív filamentum mintákat hosszasan inkubáltuk 45°C-on tripszin jelenlétében. Míg a flagelláris filamentumokról tudható, hogy meglehetısen ellenállóak a proteolítikus emésztéssel szemben, addig a monomer flagellint nagyon gyorsan lebontják a proteolítikus enzimek, mivel a terminális régiói rendezetlenek (Vonderviszt és mts., 1989; Aizawa és mts., 1990). Feltételeztük, hogy a sapka nélküli filamentumok megnövelt hımérsékleten történı inkubációja elısegíti a depolimerizációt. Az egyensúlyt még inkább a szétesés irányába lehet eltolni proteázok hozzáadásával, mivel a fentebb leírtaknak megfelelıen proteolítikus emésztéssel a monomerek hatékonyan eltávolíthatók az oldatból. Ezek alapján azt vártuk a tripszinnel történı kezeléstıl magas hımérsékleten, hogy a sapka nélküli filamentumok teljes depolimerizációját és megsemmisítését eredményezze. Másrészt viszont az intakt sapkával rendelkezı filamentumokról feltételeztük, hogy túlélik a kezelést. Kísérleteink tanúsága szerint a natív filamentumoknak csaknem 80%-a lebontódott a 45°C-on 12 órán át alkalmazott tripszines kezelésnek köszönhetıen, ami jó összhangban volt az olvadási profilból kikövetkeztethetı arányokkal. Várakozásunknak megfelelıen a maradék az eredeti minta második átmenetének megfelelı hıdenaturációs profilt mutatott (12. ábra és 13. ábra, zöld vonal). Az elektronmikroszkópos ábrák is azt mutatták, hogy ez a minta megfelelı sapkával lezárt filamentumokat tartalmaz (14. ábra). A kontrollkísérletek során a 45°C-os, hosszan tartó inkubálás proteolítikus kezelés nélkül a CD-jel enyhe csökkenését eredményezte, ugyanakkor az olvadási profil kétfázisú viselkedése megmaradt (12. ábra és 13. ábra, lila vonal). Megfigyeléseink azt mutatják, hogy a natív filamentum elegyek HAP2 sapkával rendelkezı része hatékonyan elválasztható a fent leírt eljárással.
48
Eredmények
14. ábra: Negatívan festett filamentum-sapka komplexumokról elektronmikroszkóppal készített mikrográf. A nagyítás 50000-szeres, a lépték 100 nm-t mutat.
A HAP2 sapka depolimerizációt gátló szerepe a natív filamentumoknál A denaturációs hımérséklet, illetve annak megváltozása sok mindent elárul egy fehérjekomplexum stabilitásáról, azonban a flagelláris filamentumok esetében a stabilizáció változását nemcsak a denaturációs hımérséklet eltolódásával, hanem a hıindukált depolimerizációval szembeni ellenállás, a depolimerizációs sebesség megváltozásával is lehet jellemezni, ahogy az már az elızı fejezetbıl is kiderült. A natív filamentumok tanulmányozásának következı lépéseként ezért megvizsgáltuk a depolimerizáció alakulását különféle körülmények esetén.
49
Eredmények A HAP2 sapkával történı lezárás védıhatását a hıindukált depolimerizációval szemben szintén a 222 nm-en mért távoli ultraibolya CD spektroszkópia segítségével vizsgáltuk. A depolimerizáció során a CD jel intenzitása számottevıen csökken (Uratani és mts., 1972), mivel a flagellin alegységek terminális régiói, melyek összefonódó helikális kötegeket alkotnak a filamentáris szerkezetben (Samatey és mts., 2001; Yonekura és mts., 2003), rendezetlen állapotot vesznek fel monomer formában (Vonderviszt és mts., 1989; Aizawa és mts., 1990). Míg a natív filamentum minták meglehetısen gyorsan depolimerizálódtak 50°C-on (15. ábra, piros vonal), addig a tripszines kezelés révén megtisztított rész lassan változó CD jelet mutatott ezen a hımérsékleten (15. ábra, kék vonal). A HAP2 sapkával rendelkezı filamentumok centrifugálással és újraszuszpendálással történı elválasztása az emésztési elegytıl enyhe töredezettséget okozhat. Ellenıriztük, hogy a megfigyelt lassú szétesés valóban jellemzı-e az intakt filamentum-HAP2 komplexumokra, vagy ezekbıl a töredezett filamentumdarabokból ered. Amikor a nyers (mind HAP2 sapkával rendelkezı filamentumokat, mind elemésztett és lebomlott flagellintörmeléket tartalmazó) emésztési elegyeket közvetlenül vizsgáltuk meg, a depolimerizáció sebessége elenyészı volt (15. ábra, zöld vonal), ami arra utal, hogy a natív filamentum-HAP2 komplexumok 50°C-on ellenállnak a hıindukált depolimerizációnak. Tapasztalataink szerint a HAP2-sapkával történı lezárás hatékonyan gátolta meg a filamentumok depolimerizációját még 55°C-on is (az adatok nincsenek bemutatva).
-25 -30 -35 Natív filamentum emésztés elıtt Natív filamentum emésztés után Natív filamentum emésztés után, centrifugálás nélkül
CD-jel [mdeg]
-40 -45 -50 -55 -60 -65 -70 -75 0
20
40
60
80
100
Idı [perc] 15. ábra: A natív filamentum depolimerizációjának követése CD-vel, 50°C-on, 222 nm-en
50
Eredmények
A rekonstruált filamentumok stabilitása A polimerizációs feltételek hatása a rekonstruált filamentumok stabilitására Kísérleteink következı szakaszában a rekonstruált filamentumok stabilitását vizsgáltuk különös tekintettel a HAP2 kötıdésének hatására. Mielıtt azonban erre rátértünk volna, megvizsgáltuk, mennyiben befolyásolja a stabilitást, ha megváltoztatjuk a filamentum monomer flagellinekbıl történı létrehozásának körülményeit. A módszertani fejezetben leírtaknak megfelelıen kísérleteink során a filamentumokat vagy ammónium-szulfát (AS), vagy rövid filamentumkezdemények (magok) segítségével rekonstruáltuk a monomer flagellin alegységekbıl (Wakabayashi és mts., 1969). Ugyanakkor tapasztalataink szerint mind az AS, mind a magok koncentrációjának módosítása jelentıs mértékben megváltoztatta a rekonstruált filamentum tulajdonságait. Minél magasabb volt az alkalmazott AS- (vagy mag-) koncentráció, annál gyorsabban ment végbe a polimerizáció, ami több szerkezeti hiba kialakulásához vezetett, csökkentve ezáltal a létrejött filamentum stabilitását. A mikrokalorimetriával kapott denaturációs hımérsékletek különbsége jól mutatja ezt a jelenséget (16. ábra). Az ábra a monomer flagellin és a natív filamentum görbéjét is tartalmazza, mivel ezek az elméletileg elérhetı hıstabilitás alsó, illetve felsı korlátjának tekinthetık.
0.4 0.3
Hıkapacitás [cal/°C]
0.2 0.1 0.0 -0.1 -0.2 -0.3
Monomer (alsó korlát) Polimerizáció 0.9 M (NH4)2SO4 Polimerizáció 0.6 M (NH4)2SO4 Polimerizáció 0.3 M (NH4)2SO4 Polimerizáció 0.2 M (NH4)2SO4 Natív filamentum (felsı korlát)
-0.4 -0.5 -0.6 20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
Hımérséklet [°C] 16. ábra: A rekonstruált filamentum stabilitási tartománya
51
70
75
Eredmények A 0.9 M AS koncentrációval polimerizált filamentum átmeneti hımérséklete alig magasabb a monomernél. A polimerizációhoz használt AS koncentrációjának csökkentésével fokozatosan növekszik a denaturációs hımérséklet, ami javuló hıstabilitásra utal. A 0.2 M AS alkalmazásával polimerizált minta átmeneti hımérséklete csak kis mértékben alacsonyabb a natív filamentuménál. Ugyanakkor az is megállapítható, hogy a magok alkalmazása általában magasabb átmeneti hımérsékleteket eredményez, mint az AS használata (17. ábra): 10%-nyi maggal, illetve 0.2M AS-tal történı polimerizáció hozzávetıleg ugyanahhoz a denaturációs hımérséklethez vezetett.
0.0
Hıkapacitás [cal/°C]
-0.1
-0.2
-0.3 Polimerizáció 2% mag Polimerizáció 10% mag Polimerizáció 0.2 M (NH4)2SO4
-0.4 20
25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
75
Hımérséklet [°C] 17. ábra: Magokkal történı rekonstrukció eredménye
A HAP2 kötıdése rekonstruált filamentumokhoz A rekonstruált filamentumok stabilitásvizsgálatának logikus következı lépéseként tanulmányozni kívántuk a HAP2 kötıdés hatását. Ehhez azonban elıször ki kellett dolgoznunk egy olyan módszert, amelynek segítségével egyszerő eszközök felhasználásával lehetséges a HAP2 kötıdésének detektálása a filamentum végéhez. A HAP2-sapka kötıdését a filamentum növekedését gátlı hatása alapján kívántuk detektálni, amihez a flagelláris filamentumok vizsgálatához széles körben alkalmazott sötét látóterő mikroszkópiát használtuk fel. Elıször HAP2 nélkül polimerizáltuk a flagellint AS vagy magok hozzáadásával. Az ammónium-szulfáttal végzett polimerizációknál azt
52
Eredmények állapítottuk meg, hogy a sókoncentráció csökkenésével egyre hosszabbak és így egyre jobban láthatóak a filamentumok. Ugyanakkor az ammónium-szulfát arányának növelésével egyre több, de egyre rövidebb filamentumot kapunk (Wakabayashi és mts., 1969). Ezt a sajátosságot lehet kihasználni nagyszámú filamentumkezdemény létrehozására, melyek monomer oldathoz hozzáadva
polimerizációt
indukáló
magokként
viselkednek.
Az
ezekkel
végzett
polimerizációs kísérleteknél azt tapasztaltuk, hogy a magok arányát csökkentve az elızıhöz hasonló jelenség volt megfigyelhetı, azaz egyre hosszabb és jobban látható filamentumok keletkeztek. Ez a módszer rendkívül érzékeny volt, már 1 %-nyi mag hozzáadása is elindította a polimerizációt, sıt éppen ilyenkor keletkeztek a leghosszabb és így legjobban látható filamentumok. Összességében megállapítható, hogy a sötét látóterő mikroszkópia nagyon hatékonyan képes detektálni a polimerizáció megtörténtét. A módszer kialakításának második lépéseként elvégeztük a polimerizációs kísérleteket HAP2
hozzáadásával
is.
Ennek
során
0.5-1
%-nyi
HAP2-t
adtunk
hozzá
a
filamentumoldathoz, majd pár órán át inkubáltuk szobahımérsékleten. Azután ehhez az oldathoz adtunk sokszoros (10-100-szoros) mennyiségő monomert, majd több óráig vagy akár pár napig is állni hagytuk, akárcsak a normál polimerizációs kísérleteknél. Az így kapott minták közül egyikben sem voltak sötét látóterő mikroszkóppal detektálhatók filamentumok, ami arra utal, hogy a HAP2 hozzáadása megakadályozta a képzıdésüket, mivel minden egyéb körülmény megegyezett a normál polimerizációnál alkalmazottal, és a detektálási módszer nagyon érzékeny a sapka nélküli magok jelenlétére, hiszen már egészen alacsony magkoncentrációnál beindul a mikroszkóppal jól ellenırizhetı polimerizáció. Vagyis a hozzáadott HAP2 kötıdött a filamentumokhoz, és ezt a kötıdést tudtuk is detektálni, azaz egy egyszerő mikroszkópos vizsgálattal megállapítható, hogy a HAP2 valóban kapcsolódott-e a filamentum végéhez. Sikerült tehát kidolgoznunk egy olyan módszertant melynek révén egyszerő eszközökkel is detektálható a HAP2 kötıdésének ténye.
HAP2 kötıdésének hatása a rekonstruált filamentumok stabilitására A HAP2 kötıdésének detektálása lehetıvé tette, hogy megvizsgáljuk a HAP2 hatását a rekonstruált filamentumok stabilitására. Ennek során elıször (hasonlóan a natív filamentumok vizsgálatához) tanulmányoztuk
a
filamentum különféle
denaturációs
körülmények
hımérsékletét,
között.
illetve
Ugyanakkor
annak
bıvítettük
változását a
korábbi
módszertant, mivel ezúttal nemcsak spektropolariméterrel, hanem mikrokaloriméterrel is végeztünk méréseket. 53
Eredmények A filamentum-sapka komplexumot a rövid rekonstruált filamentumok és tisztított HAP2 oldat elegyítésével hoztuk létre. A korábbi rekonsturálási próbálkozások (Maki és mts., 1998) kimutatták, hogy a sapka kialakulásának hatékonysága széles pH tartományban (5 és 11 pH között) nem különbözött számottevıen, ugyanakkor az inkubálási hımérséklet megváltoztatásának jelentıs hatása volt. A rekonstruálást 20°C-on, illetve 37°C-on hajtottuk végre, variálva az inkubálási idıtartamokat. A rövid filamentumok tisztított flagellinbıl készültek 0.8 M végsı koncentrációjú ammónium-szulfát hozzáadásával. A HAP2 kötıdését polimerizációs kontrollkísérletekkel ellenıriztük, ahol azt használtuk ki, hogy csak a HAP2-vel nem lefedett filamentumokra tudnak további flagellin monomerek polimerizálódni és ezáltal hosszú, mikroszkóp alatt is látható filamentumokat létrehozni. A polimerizációs vizsgálatot a korábban leírtakkal egyezı módon végeztük, a filamentum:monomer arány 1:20 volt. A HAP2-vel inkubált mintákban nem volt megfigyelhetı polimerizáció, ami a mikroszkóppal történı detektálás rendkívüli érzékenysége miatt azt jelenti, hogy a HAP2 szilárdan kötıdik a flagelláris filamentumok végéhez, és gyakorlatilag minden filamentumot, legalábbis részben, HAP2 fedett (Vonderviszt és mts., 1998). Alapvetıen ötféle mintát vizsgáltunk: kezeletlen filamentumot, illetve négy különbözı módon létrehozott filamentum + 10% HAP2 keveréket. Az elsınél 2 órán át 20°C-on inkubáltuk az elegyet, majd további kezelés nélkül lemértük. A másodiknál ugyanez volt az inkubálási módszer, de a 2 óra letelte után a keveréket centrifugáltuk, a felülúszót leöntöttük eltávolítva így a fölös (nem kötıdött) HAP2-t, majd a kapott csapadékot újraszuszpendálva mértük az elegyet. A harmadik minta elkészítése ehhez teljesen hasonló volt, csak az inkubálás nem 20°C-on, hanem 37°C-on történt. A negyedik mintánál ugyancsak 37°C-on történt az inkubálás, azonban nem 2 óráig, hanem overnight. A stabilizációra vonatkozó méréseket egyrészt cirkuláris dikroizmus (CD), másrészt mikrokalorimetria (DSC) alkalmazásával végeztük el. A kísérletek során arra a kérdésre kerestük a választ, hogy mennyiben változtatja meg a HAP2 bekötıdése a filamentum stabilitását, illetve mennyire tekinthetı intaktnak az in vitro létrehozott sapka. Az utóbbi esetben azt vártuk, hogy amennyiben intakt sapkák jönnek létre a filamentumok végén, akkor az inkubálási körülményektıl, illetve az oldatban lévı szabad HAP2 mennyiségétıl nem különösebben függ a stabilitás változása, feltéve persze, hogy a megfelelı számú sapka képzıdéséhez elegendı HAP2-t adtunk a filamentumokhoz. A hımérséklet függvényében felvett méréssorokkal azt próbáltuk kideríteni, hogy milyen hatással van a HAP2 kötıdése a
54
Eredmények filamentum denaturációs hımérsékletére, azaz a stabilitására. Az in vivo tapasztalt tulajdonságok alapján azt vártuk, hogy a HAP2 stabilizálja a filamentumot. A CD-vel végzett mérések eredményeinek tanúsága szerint a rekonstruált filamentumok HAP2-vel történı kezelése a stabilitás kismértékő növekedését eredményezte (18. ábra). A rövid rekonstruált filamentumaink 52.3°C-on gombolyodtak le. A HAP2-vel 20°C-on 2 órán tartó kezelést követıen a denaturációs hımérséklet 53.2°C-ra nıtt, míg a hasonló módon, de 37°C-on végrehajtott kezelés 53.9°C-os átmeneti hımérsékletet eredményezett. A rekonstruált filamentumok 37°C-os, overnight inkubálása HAP2-vel 54.4°C-ra emelte az olvadási hımérsékletet. Ugyanakkor még magasabb átmeneti hımérsékletet, Tm=55.3°C-ot figyeltünk meg, amikor a fölös HAP2-t az oldatban hagytuk. Ez arra utal, hogy dinamikus egyensúly áll fenn a HAP2 kötött és szabad formái között. Emlékeztetıül: a natív HAP2 sapka kötıdése a filamentum végéhez nagyon stabil volt ebben a hımérsékleti tartományban. A hıstabilitás kismértékő, de jól reprodukálható növekedése a filamentumok 20°C helyett 37°C-on végrehajtott HAP2-vel történı kezelésének köszönhetıen arra utal, hogy a sapka kialakulása hatékonyabban megy végbe 37°C-on.
35 Filamentum HAP2 nélkül Filamentum+HAP2 (20°C, 2h, fugálva) Filamentum+HAP2 (37°C, 2h, fugálva) Filamentum+HAP2 (37°C, o/n, fugálva) Filamentum+HAP2 (20°C, 2h, fuga nélkül)
30
CD-jel deriváltja
25 20 15 10 5 0 25
30
35
40
45
50
55
60
65
70
Hımérséklet [°C] 18. ábra: A rekonstruált filamentum CD-görbéjének deriváltja 222 nm-en
A DSC-vel felvett hıabszorpciós görbék (19. ábra) tanúsága szerint a kezeletlen rövid rekonstruált filamentumok elsı felfőtésekor a kalorimetrikus görbe 53.2°C-nál mutatott éles 55
Eredmények maximumot, amely viszonylag jól egyezett a CD-nél mért denaturációs hımérséklettel. A második felfőtésnél - jelentısen eltolódva - 47°C-nál volt a csúcs helye, a harmadik felfőtésnél pedig már nem változott. A filamentum monomerekre esett szét, tehát az átmenet nem reverzibilis (azonban a flagelliné igen), ebbıl adódóan a flagellin stabilitása és a csúcs alatti terület is lényegesen kisebb lett. A filamentum hıkapacitás görbéjének alakja nem teljesen szabályos, egy váll látszik a csúcson, amely az oldatban lévı monomer állapotú flagellinre utal. Korábbi filamentummal végzett kalorimetriás méréseknél két csúcsot regisztráltak (Fedorov & Kostyukova, 1984). Lényegében a monomer csúcsa szuperponálódik rá a polimeréra, amelyrıl korábban, kettıs csúcsnak vélve, a filamentum két stabil állapoton keresztüli denaturációját tételezték fel tévesen. A hıabszorpciós csúcs alatti területbıl számított kalorimetrikus entalpiaváltozás filamentumra ∆Hcal=1950kJ/mol, flagellinre ∆Hcal=960 kJ/mol. Ezek az eredmények azt mutatják, hogy polimerizációkor a fehérje szerkezete jelentısen stabilizálódik, hiszen olvadáspontja és kalorimetrikus entalpiája is számottevıen megnı. A flagellin denaturációjánál kétállapotú átalakulást feltételezve kiszámíthatjuk a folyamat Van't Hoff entalpiáját: ∆HVan'tHoff=660 kJ/mol. A kalorimetrikus entalpiával összehasonlítva, az eltérés jelentısnek mondható, vagyis a feltételezés nem helyes, az átalakulás többállapotú, intermedier állapotokon keresztüli denaturációra utal.
4 J/g°C
Filamentum Flagellin Filamentum+HAP2
10
20
30
40
50
60
70
Hımérséklet [°C] 19. ábra: A flagellin és a filamentum kalorimetriás görbéi
56
80
Eredmények
A HAP2 hıabszorpciós görbéje 59.2°C-nál, azaz a filamentuménál jóval magasabb hımérsékleten éri el maximumát (20. ábra, piros görbe). A számított kalorimetrikus entalpiaváltozás ∆Hcal=590 kJ/mol és Van't Hoff entalpia ∆HVan'tHoff=1680kJ/mol. Az utóbbi majdnem háromszorosa a kalorimetrikus entalpiaváltozásnak, így itt sem klasszikus kétállapotú átalakulással van dolgunk. A második felfőtéskor eltőnt a csúcs, ami azt jelenti, hogy a HAP2 hıdenaturációja irreverzibilis. Ezek után felvettük a korábban már leírt (filamentumhoz 10 % HAP2 hozzáadásával készült) minták hıabszorpciós görbéit is (20. ábra). A görbék maximumhelyei kis mértékben eltolódtak a magasabb hımérsékletek felé. A 20°C-on, illetve 37°C-on inkubált, majd centrifugált minták esetében 53.7°C-nál, a nem centrifugáltnál pedig 54.8°C-nál jelentkeztek az éles csúcsok. Az elıbbi esetben mintegy 0.5°C-os, az utóbbiban 1.5-2°C-os eltolódás tapasztalható. Ezek az eredmények szintén nagyrészt megegyeznek a CD mérésekbıl kapott átalakulási hımérséklet értékekkel. Itt is a legalacsonyabb denaturációs hımérséklető a kezeletlen filamentum volt, ezt követték a 20°C-on, illetve 37°C-on inkubált, centrifugált minták, majd a 20°C-on inkubált nem centrifugált minta. A számított kalorimetrikus entalpiaváltozások 1700 kJ/mol körüli értékek köré estek (a 20°C-os centrifugált mintánál ∆Hcal=1670 kJ/mol, a 37°C-osnál 1710 kJ/mol, a 20°C-os nem centrifugáltnál pedig 1620 kJ/mol). A kis mértékő csökkenés valószínőleg az anyagveszteségnek és a HAP2 hatásának tulajdonítható.
57
Eredmények
9 8
Hıkapacitás [J/g°C]
7 6 5 HAP2 Filamentum+HAP2 (20°C) Filamentum+HAP2 (37°C)
4 3 2 1 10
20
30
40
50
60
70
80
Hımérséklet [°C] 20. ábra: A HAP2 és a rekonstruált filamentum kalorimetriás görbéi
A HAP2 kötıdésének depolimerizációt gátló szerepe a rekonstruált filamentumoknál A denaturációs hımérséklet mellett ebben az esetben ugyancsak célszerő a hıindukált depolimerizáció sebességét is megvizsgálni (hasonlóan a natív filamentumok vizsgálatához). Ennek
megfelelıen
a
rekonstruált
filamentumok
stabilitásvizsgálatának
következı
szakaszában a depolimerizáció alakulását tanulmányoztuk különféle körülmények esetén. A hıindukált depolimerizáció detektálására szintén a CD-jel változását használtuk fel, csak ezúttal nem a hımérséklet, hanem az idı függvényében. A mérési eljárás az volt, hogy a különbözıféleképpen inkubált mintákat viszonylag magas (de a denaturációsnál alacsonyabb) hımérsékletre főtöttük fel, majd mértük, hogy mennyire különbözik az ezen a hımérsékleten már jelentıs depolimerizációjuk gyorsasága. Feltételezésünk ebben az esetben is az volt, hogy a HAP2-nek stabilizáló a hatása, azaz lassítja a depolimerizációt. Fontos megjegyezni, hogy (az anyagok és módszerek részben leírtaknak megfelelıen) a mérések egy gyors felfőtési szakasszal kezdıdtek, melynek során a mintát kb. 20°C-ról mintegy 10 perc alatt az adott mérési hımérsékletre melegítettük, ami a görbéken egy kezdeti, nagyjából lineáris szakaszként jelentkezik.
58
Eredmények A méréseket 45°C-on hajtottuk végre, és a kapott eredmények jól tükrözték a feltételezéseket, és megerısítették a hımérsékleti görbék tapasztalatait. A kezeletlen filamentumnál volt a leggyorsabb a depolimerizáció, a 20°C-on inkubált, majd centrifugált mintánál lassabb, még lassabb a 37°C-on inkubált mintánál, végül itt is a 20°C-on inkubált, de nem centrifugált minta okozta a leglassabb depolimerizációt, azaz a legnagyobb stabilizációt (21. ábra). Mindezek alapján egyrészt megállapítható, hogy a HAP2 hozzáadása lassította a depolimerizációt, vagyis növelte a filamentum stabilizációját. Másrészt az egyes inkubálási módok között is voltak különbségek, amelyek szintén a hımérsékleti mérések tapasztalatait erısítették meg.
-50 -70
CD-jel [mdeg]
-90 -110 -130 -150 Filamentum HAP2 nélkül Filamentum+HAP2 (20°C, 2h, fugálva) Filamentum+HAP2 (37°C, 2h, fugálva) Filamentum+HAP2 (20°C, 2h, fuga nélkül)
-170 -190 0
20
40
60
80
100
Idı [perc] 21. ábra: A rekonstruált filamentum depolimerizációjának követése CD-vel, 45°C-on, 222 nm-en
A depolimerizációs vizsgálatokat 45°C-nál alacsonyabb hımérsékleteken (42.5°C-on és 40°C-on) is végrehajtottuk, ami lényegében hasonló eredményekre vezetett, bár a görbék konkrét lefutása némileg eltért (az adatok nincsenek bemutatva). Az eltérések oka az, hogy az alkalmazott hımérséklet módosítása nemcsak a depolimerizáció sebességét változtatja meg, hanem a filamentumvég dinamikus egyensúlya (fel-/leépülése) miatt folyamatosan keletkezı monomerek denaturációját is, ami természetesen befolyásolja az eredményt, hiszen nemcsak a depolimerizációra vonatkozó stabilizáló hatás játszik benne szerepet.
59
Eredmények Összességében elmondható, hogy az idımérések is alátámasztják a hımérsékleti görbéknél tapasztaltakat. Másrészt viszont az is megállapítható, hogy a natív filamentumhoz képest a rekonstruált minták sokkal érzékenyebbek voltak, hiszen már 40°C-on is instabilnak bizonyultak, és hıindukált depolimerizáción mentek keresztül. Bár a HAP2-vel történı kezelés egyértelmően csökkentette a depolimerizáció sebességét, minden rekonstruált filamentum-HAP2 mintánk sokkal érzékenyebbnek bizonyult a hıindukált depolimerizációval szemben, mint a natívok. Nem sikerült a tökéletes sapkával rendelkezı rekonstruált filamentumokat megtisztítanunk proteolítikus emésztés megemelt hımérsékleteken történı alkalmazásával sem. A filamentumok rekonstruálása során kipróbáltunk különféle ammónium-szulfát
koncentrációkat,
használtunk
rövid
filamentumkezdeményeket,
alkalmaztunk változatos HAP2 inkubációs módszereket, azonban a mintáink minden esetben teljesen elemésztıdtek.
Az eredmények értelmezése A flagelláris filamentumok in vitro képesek a spontán önszervezıdésre, ám in vivo csak a HAP2 fehérjekomplexum jelenlétében megy végbe szerkezetük kialakulása. A HAP2 molekulák öt alegységbıl álló molekuláris sapkát formálnak a filamentumok végén. Az alegységek kooperatívan kötıdnek a filamentum végéhez: minden újabb beépülı molekula növeli a korábbi kötıdések stabilitását is. Az így létrejövı HAP2 sapka teszi lehetıvé, hogy a citoplazmából a filamentumok belsejében lévı csatornán át transzportálódó flagellin alegységek beépülhessenek a filamentumok végére, és ne diffundáljanak szét a közegben. A HAP2 sapka „intelligens” kötıdésre képes, és látszólag ellentmondásos tulajdonságokkal rendelkezik. Egyfelıl nagyon erısen kötıdik a filamentumok végéhez, és gyakorlatilag sohasem válik le onnan. Másfelıl képesnek kell lennie arra is, hogy viszonylag könnyen elengedje a filamentumok végét, lehetıvé téve az újonnan érkezı flagellin alegységek beépülését. Vagyis a HAP2 in vivo alapvetı szerepet játszik a flagelláris filamentumok létrejöttében azáltal, hogy egy sapkát alkot a filamentumok végén, ami elısegíti a flagellum központi csatornáján keresztül exportálódó flagellin alegységek beépülését (Yonekura és mts., 2002). A flagelláris filamentumok több ezer flagellin alegységbıl épülnek fel. A natív filamentumokkal végzett kísérleteink kimutatták, hogy az apró HAP2 sapka jelentıs stabilizációs hatást fejt ki erre az óriási makromolekuláris szerkezetre: a hıstabilitását
60
Eredmények mintegy 4°C-kal emeli (57°C-ról 61°C-ra) és egészen 55°C-ig hatékonyan gátolja a hıindukált depolimerizációt is. A monomer flagellin 47°C-on hıindukált denaturáción megy keresztül (Vonderviszt és mts., 1990). Méréseink szerint a sapka nélküli natív flagelláris filamentumok denaturációs hımérséklete 57°C volt, ami azt mutatja, hogy a flagellin alegységek stabilizálódnak a filamentum állapotban. A flagelláris filamentumok polimerizációja, illetve depolimerizációja egyirányú folyamat, ami csak a filamentumok távolabbi végén megy végbe (Iino, 1974). 47°C fölött a filamentumok depolimerizációja az alegységek azonnali denaturációja miatt visszafordíthatatlan. A HAP2 sapka stabilizáló hatása arra utal, hogy a filamentumok hımérséklet okozta megsemmisülése depolimerizációval kezdıdik, amit az alegységek legombolyodása követ. Egy rövidebb filamentumokat tartalmazó minta várhatóan magasabb depolimerizációs sebességet mutat, mivel ilyenkor magasabb a szabad filamentumvégek száma, azaz egyszerre több helyen történik a depolimerizáció. A gyorsabb depolimerizáció következtében ugyanakkor alacsonyabb denaturációs hımérsékletet tapasztalunk. Ez a jelenség megmagyarázza, miért mutattak a rövid rekonstruált filamentumaink számottevıen alacsonyabb átmeneti hımérsékletet, mint a jóval hosszabb natívok. Ugyanakkor azt is érthetıvé teszi, hogy a csökkenı ammónium-szulfát koncentrációval készített, emiatt egyre hosszabb filamentumokat tartalmazó rekonstruált minták miért mutattak fokozatosan növekvı denaturációs hımérsékletet, megközelítve a sapka nélküli natív filamentumok esetén kapott értéket. A HAP2 61°C körül hıdenaturálódik (Vonderviszt és mts., 1998). Míg a HAP2 sapkával való kölcsönhatás a filamentumok stabilizálódását eredményezi, addig ez a stabilizáló hatás aszimmetrikus: a natív filamentum-HAP2 komplexum ugyanazon a hımérsékleten gombolyodik le, ahol a HAP2 hıdenaturációja megtörténik. Vagyis a HAP2 denaturációja az a lépés, ami a natív filamentum-sapka szerkezetek széteséséhez és denaturációjához vezet. A HAP2 sapka stabilizáló hatására alapozva kifejlesztettünk egy eljárást, amivel a HAP2 sapkával rendelkezı natív filamentumok elválaszthatók és megtisztíthatók. Az elektronmikroszkópos ábrák azt mutatták, hogy az eljárással kapott minta megfelelı sapkával lezárt filamentumokat tartalmaz. A natív filamentum-sapka komplexumok erısen ellenálltak a proteolítikus lebontásnak és depolimerizációnak. Ezek a minták elısegíthetik a filamentumHAP2 komplexumok egyrészecske képanalízissel történı szerkezeti tanulmányozását.
61
Eredmények A
flagelláris
filamentumok
flagellin
oldatból
rekonstruálhatók
rövid
filamentumkezdemények (Asakura és mts., 1964) vagy valamilyen precipitálószer (mint például az ammónium-szulfát) (Wakabayashi és mts., 1969) hozzáadásával. Korábban kimutatták a filamentum-HAP2 komplexumok képzıdését, amennyiben a rekonstruált filamentumokhoz HAP2 alegységeket adtak (Maki és mts., 1998). A rekonstruált filamentumok és a filamentum-HAP2 komplexumok széles körben használatosak a krioelektronmikroszkópiával, illetve röntgen-száldiffrakcióval történı szerkezeti analízishez (Yonekura és mts., 2000; 2001; 2003; Maki-Yonekura és mts., 2003). Vizsgálataink feltárták, hogy a HAP2 ugyan könnyen kötıdött a rekonstruált filamentumok végéhez, azonban a kapott filamentum-HAP2 komplexumok egyik esetben sem érték el a natív szerkezetek stabilitását, és megemelt hımérsékleteken gyors depolimerizáción mentek keresztül. A HAP2 kötıdés stabilizáló hatása jelentıs mértékben függött az alkalmazott inkubációs módszertıl, például a hosszan tartó 37°C-os inkubálás a szobahımérsékleten történıhöz képest elısegítette a sapka kialakulását. Ennek az eltérésnek a magyarázata valószínőleg az, hogy az in vitro növesztett filamentumok vége eltér az in vivo filamentumokétól. A filamentum vége még a natív esetben sem sík felület: ezt eltorzítja egyrészt a szomszédos protofilamentumokban az alegységek egymáshoz képesti közel fél alegységnyi eltolódása, másrészt az alaphélix ehhez hozzáadódó menetemelkedése. Emiatt a sík HAP2 sapka alegységei eltérı erıséggel, illetve eltérı konformációban vesznek részt a filamentum végével való kölcsönhatásban (22. ábra) (Vonderviszt és mts., 1998; Maki-Yonekura és mts., 2003). Bár a filamentum felépülése az egymenetes hélix mentén történik, azonban ez a HAP2 sapka hatásának következménye, ami csak így engedi polimerizálódni az új alegységeket. Ugyanakkor a filamentumot stabilizáló kölcsönhatások nem az egymenetes, hanem az 5-, 6-, 11- és 16-menetes hélix mentén szomszédos alegységek között állnak fenn (5. ábra) (Yonekura és mts., 2003). Ez viszont azt jelenti, hogy az in vitro rekonstrukció során a felépülés valószínőleg nem az egymenetes hélix mentén fog történni, hiszen a megfelelı stabilizáló kölcsönhatások megléte esetén (azaz ha az 5-, 6-, 11- és 16-menetes hélix mentén egyaránt vannak szomszédos alegységek) be tud épülni egy új monomer. Természetesen az így kimaradó helyeket a filamentum továbbépüléséhez elıbb-utóbb fel kell tölteni, azonban a filamentum végén nagy valószínőséggel nem a natív esetre jellemzı viszonylag egyenletes felület található, hanem egy egyenetlen, nagyobb kiugrásokkal és bemélyedésekkel tarkított struktúra jön létre (22. ábra).
62
Eredmények
Sapka HAP2 alegység
Filamentum
Flagellin alegység
Natív filamentum
Rekonstruált filamentum
22. ábra: A natív és a rekonstruált filamentum végének sematikus szerkezete. A könnyebb áttekinthetıség kedvéért csak a kölcsönhatások egy részét jeleztük az ábrán. A részletes struktúra az irodalmi bevezetıben (8. ábra) látható.
Az egyenetlen végekre viszont valószínőleg nem tud olyan intakt, öt alegységbıl álló HAP2 sapka ráépülni, mint az in vivo filamentumoknál, hanem csak pár HAP2 alegység fog megkötıdni.
Ugyanakkor
a
HAP2-flagellin
kötıdés
erısebb
a
flagellin-flagellin
kölcsönhatásnál, vagyis az egyszer már kapcsolódott HAP2 alegység nehezen válik le a filamentum végérıl. A hımérséklet emelésével viszont csökken a filamentum stabilitása, gyorsul a végeken a dinamikus fel-leépülés, vagyis megnı az esélye, hogy egy már megkötött HAP2 mellett lévı kiemelkedés vagy gödör eltőnik, és így kedvezı feltételek teremtıdnek egy újabb HAP2 alegység kooperatív bekötıdéséhez. Mivel a HAP2 kötıdésére a hımérséklet növelése kevésbé hat, ezért a végek gyors változása azt eredményezi, hogy megnı a több alegységbıl álló, sıt akár tökéletesen intakt sapkák kialakulásának esélye, vagyis lényegében több HAP2 alegység fog kötıdni a filamentumok végeihez. Összegezve: a magasabb inkubálási hımérséklet növeli a megkötıdött HAP2 mennyiségét, a több HAP2 viszont jobban megemeli a denaturációs hımérsékletet, vagyis jobban növeli a filamentum stabilitását. Szintén hasonló magyarázat állhat a nem centrifugált, vagyis fölös, nem kötıdött HAP2-vel rendelkezı mintának még az elızıeknél is magasabb denaturációs hımérséklete mögött. A denaturálás során ugyanis, ahogy melegítjük a filamentumokat, úgy válnak a végek
63
Eredmények egyre változékonyabbá, vagyis úgy nı a több alegységes és intakt sapka kialakulásának esélye. A lecentrifugált mintákban azonban már nincs szabad HAP2, ami ki tudná használni ezt a kedvezı kötıdési lehetıséget, vagyis a kötıdött HAP2 mennyisége nem nı. Ezzel szemben a nem centrifugált mintában van fölös HAP2, ami a hımérséklet emelésével egyre gyorsabban módosuló végekre rá tud kötıdni, vagyis ebben a mintában nıni fog a megkötött HAP2 mennyisége, ami ismét magasabb denaturációs hımérsékletet és nagyobb stabilitást eredményez. A korábbi rekonstrukciós kísérletek arra utaltak, hogy a sapka-filamentum rekonstrukciójának hatékonysága 37°C-on akár a 60%-ot is elérheti (Yonekura és mts., 2001). Ennek ellenére a korábban leírt és a natív filamentumoknál jól mőködı emésztési eljárással nem sikerült izolálnunk az intakt sapkával rendelkezı filamentumokat tartalmazó mintát. A rekonstruált filamentum-HAP2 komplexumok proteolízissel szembeni ellenállása meglepıen alacsony volt. Függetlenül attól, hogy melyik filamentum vagy HAP2 inkubációs módszert alkalmaztuk, a mintáink minden esetben teljes mértékben elemésztıdtek. Eredményeink azt mutatják, hogy tökéletes filamentum-HAP2 komplexumok aligha kaphatók a hagyományos rekonstrukciós módszerekkel. Habár a rekonstruált filamentumHAP2 komplexumok alakjukat tekintve nagyon hasonlítanak a HAP2 sapkával rendelkezı natív filamentumokhoz, szerkezeti hibákat tartalmaznak, melyek csökkentik a stabilitásukat, és érzékenyebbé teszik ıket a proteolítikus emésztéssel szemben. Ugyanakkor a tökéletes sapkával rendelkezı natív filamentumok izolálására általunk kifejlesztett eljárás megnyithatja az utat a pontosabb szerkezeti információk megszerzése elıtt.
64
Összefoglalás
Összefoglalás
A doktori értekezés a flagelláris filamentumokkal és az ıket lezáró molekuláris sapkával foglalkozik. Ennek során tanulmányoztuk a rendezetlen terminális régiók szerepét a filamentum felépülésében, a filamentum stabilitásának változását a HAP2 kötıdése során és az intakt sapkával ellátott filamentumok in vitro létrehozásának lehetıségét. A kísérletek során a következı eredményekre jutottunk: •
Irányított mutagenezis segítségével elkészítettünk két flagellin pontmutánst (S356C, G377C), melyek a vad típussal ellentétben ciszteint is tartalmaztak. A mutáns fehérjék alkalmasak voltak filamentumok létrehozására, azaz megırizték polimerizációs képességüket.
• Az egyik flagellin pontmutáns (S356C) különbözı fluoreszcens festékekkel történı megfestése révén sikerült a filamentumba beépülı flagellin alegységek között fluoreszcencia rezonancia energia transzfert (FRET) létrehozni, és ennek segítségével alátámasztani a filamentum szerkezetének legújabb, alegységen belüli összefonódó helikális kötegeket, és az ezek között fennálló, a szerkezetet stabilizáló hidrofób kölcsönhatásokat tartalmazó modelljét. Ezen túlmenıen sikerült az egyes régiók pontosabb szerepét is tisztázni. •
A hıdenaturációs folyamat spektropolariméterrel történı nyomon követésével megállapítottuk, hogy a HAP2 sapka jelentısen (mintegy 4°C-kal) emeli a natív filamentumok
denaturációs
hımérsékletét,
illetve
növeli
a
hıindukált
depolimerizációval szembeni ellenálló képességüket is. A HAP2 stabilizáló hatása arra utal,
hogy
a
natív
filamantumok
hıdenaturációját
(illetve
hıindukált
depolimerizációját) vezérlı lépés a HAP2 denaturációja. •
A HAP2 sapka stabilizáló hatására alapozva kifejlesztettünk egy eljárást, melynek segítségével az intakt HAP2 sapkával rendelkezı natív filamentumok hatékonyan elválaszthatók és megtisztíthatók. A módszer lényege a natív filamentum minták hosszas inkubálása 45°C-on tripszin jelenlétében. A kapott natív filamentum-sapka komplexumok erısen ellenálltak a proteolítikus lebontásnak és a depolimerizációnak. Ezek a minták elısegíthetik a filamentum-HAP2 komplexumok egyrészecskés elektronmikroszkópiás szerkezetanalízissel történı tanulmányozását.
65
Összefoglalás •
Mikrokalorimetriás mérésekkel megmutattuk, hogy a filamentum létrehozásának körülményei (a filamentumkezdemények, illetve az ammónium-szulfát aránya) szintén jelentıs
mértékben
befolyásolják
a
filamentum
stabilitását.
A
magasabb
precipitálószer koncentráció egyfelıl megnöveli a polimerizáció sebességét, ugyanakkor a szerkezeti hibák számát is emeli, csökkentve ezáltal a filamentum stabilitását. • A HAP2-kötıdés sötét látóterő mikroszkóppal történı detektálására kidolgoztunk egy módszert, melynek lényege az, hogy csak azokra a filamentumkezdeményekre fognak további flagellin alegységek ráépülni, melyek végén nem található HAP2, vagyis csak ekkor növekszik látható méretővé a filamentum a mikroszkóp alatt. Ez praktikus, kevés felszerelést igénylı módszer, ráadásul rendkívül érzékeny, mivel a filamentumkezdemények
egészen
alacsony
koncentrációjánál
megindul
a
polimerizáció, viszont már egy-két HAP2 alegység is tökéletesen meggátolja azt. •
Spektropolarimetriás és mikrokalorimetriás vizsgálatok segítségével megállapítottuk, hogy a rekonstruált filamentum stabilitása megnı a HAP2 kötıdésével, ami egyrészt a denaturációs szembeni
hımérséklet ellenállás
megemelkedésében,
megnövekedésében
másrészt
mutatkozik
a meg.
depolimerizációval A
stabilizáció
növekedésének mértéke szabályozható az inkubálási feltételek megváltoztatásával. •
A rekonstruált filamentumok HAP2 hozzáadása után kevésbé voltak stabilak, mint a sapkával
lezárt
natív
filamentumok.
Magasabb
hımérsékleten
gyorsan
depolimerizálódtak, és a proteolítikus emésztéssel szemben is érzékenyebbek voltak. Mindez arra utal, hogy laboratóriumi körülmények között csak kivételesen keletkezik intakt sapka, az esetek többségében ötnél kevesebb HAP2 molekula kötıdik be a filamentum végére. Az intakt sapka nehéz létrehozásának az a valószínő magyarázata, hogy in vitro a filamentum vége bonyolult szerkezető, nagyobb kiugrásokkal és bemélyedésekkel tarkított struktúra. Az inkubálási körülmények megváltoztatásával szabályozható a bekötıdött HAP2 alegységek száma (így az intakt sapkák aránya is), ami a filamentum eltérı stabilitásához vezet. Minél több HAP2 molekula kötıdik, annál stabilabb a filamentum.
66
Irodalomjegyzék
Irodalomjegyzék ADA, G.L., NOSSAL, G.J., PYE, J. & ABBOT, A. (1963). Behavior of active bacterial antigens during the induction of the immune response. (I) Properties of flagellar antigens from Salmonella. Nature (London) 199, 1257-1259. AIZAWA, S.-I., VONDERVISZT, F., ISHIMA, R. & AKASAKA, K. (1990). Termini of Salmonella flagellin are disordered and become organized upon polymerization into flagellar filament. J. Mol. Biol. 211, 673-677. AIZAWA, S.-I. (1996). Flagellar assembly in Salmonella typhimurium. Mol. Microbiol. 19, 15. AKIBA, T., YOSHIMURA, H. & NAMBA, K. (1991). Monolayer crystallization of flagellar L-P rings by sequential addition and depletion of lipid. Science 252, 1544-1546. ASAKURA, S., EGUCHI, G. & IINO, T. (1964). Reconstitution of bacterial flagella in vitro. J. Mol. Biol. 10, 42-56. ASAKURA, S., EGUCHI, G. & IINO, T. (1966). Salmonella flagella: in vitro reconstruction and overall shapes of flagellar filaments. J. Mol. Biol. 16, 302-316. ASAKURA, S. (1970). Polymerization of flagellin and polymorphism of flagella. Advan. Biophys. (Japan) 1, 99-155. ASAKURA, S. & IINO, T. (1972). Polymorphism of Salmonella flagella as investigated by means of in vitro copolymerization of flagellins derived from various strains. J. Mol. Biol. 4, 251-268. AZEVEDO, J.R. & JOHNSON, D.A. (1990). Temperature-dependent lateral and transverse distribution of the epidermal growth factor receptor in A431 plasma mebranes. J. Membrane Biol. 118, 215-224. BERG, H.C. & ANDERSON, R.A. (1973). Bacteria swim by rotating their flagellar filaments. Nature (London) 245, 380-382. BLAIR, D.F. & BERG, H.C. (1988). Restoration of torque in defective flagellar motors. Science 242, 1678-1681. BLAIR, D.F. & BERG, H.C. (1990). The MotA protein of E. coli is a proton-conducting component of the flagellar motor. Cell 60, 439-449. BLAIR, D.F. (1995). How bacteria sense and swim. Annu. Rev. Microbiol. 49, 489-522. BLOCK, S.M. & BERG, H.C. (1984). Successive incorporation of force-generating units in the bacterial rotary motor. Nature (London) 309, 470-472.
67
Irodalomjegyzék CALLADINE, C.R. (1975). Construction of bacterial flagella. Nature (London) 225, 121-124. CALLADINE, C.R. (1976). Design requirements for the construction of bacterial flagella. J. Theoret. Biol. 57, 469-489. CALLADINE, C.R. (1978). Change of waveform in bacterial flagella: The role of mechanics at the molecular level. J. Mol. Biol. 118, 457-479. CANTOR, C.R. & SCHIMMEL, P.R. (1980). Biophysical Chemistry. Part II.:Techniques for the Study of Biological Structure and Function. Freeman, San Francisco. DEAN, G.E., MACNAB, R.M., STADER, J., MATSUMURA, P. & BURKE, C. (1984). Gene sequence and predicted amino acid sequence of the MotA protein, a membraneassociated protein required for flagellar rotation in Eschericia coli. J.Bacteriol. 159, 991-999. DEPAMPHILIS, M.L. & ADLER, J. (1971). Attachment of flagellar basal bodies to the cell envelope: specific attachment to the outer lipopolysaccharide membrane and the cytoplasmic membrane. J. Bacteriol. 105, 396-407. DEROSIER, D.J. (1992). Whipping flagellin into shape. Curr. Op. Struct. Biol. 2, 280-285. DEROSIER, D.J. (1995). Spinning tails. Curr. Op. Struct. Biol. 5, 187-193. DRIKS, A. & DEROSIER, D.J. (1990). Additional structures associated with bacterial flagellar basal body. J. Mol. Biol. 211, 669-672. EFTINK, M.R. (1991). Fluorescence techniques for studying protein structure. Methods of Biochem. Anal. 35, 127-205. FAHRNER, K.A., BLOCK, S.M., KRISHNASWAMY, S., PARKINSON, J.S. & BERG, H.C. (1994). A
mutant
hook-associated
protein
(HAP3)
facilitates
torsionally
induced
transformations of the flagellar filament of Escherichia coli. J. Mol. Biol. 238, 173186. FEDOROV, O.V. & KOSTYUKOVA, A.S. (1984). Domain structure of flagellin. FEBS Lett. 171, 145-148. FEDOROV, O.V., KOSTYUKOVA, A.S. & PYATIBRATOV, M.G. (1988). Architectonics of a bacterial flagellin filament subunit. FEBS Lett. 241,145-158. FERNANDEZ, S.M. & BERLIN, R.D. (1976). Cell surface distribution of lectin receptors determined by resonance energy transfer. Nature 264, 411-415. FERRIS H.U. & MINAMINO T. (2006). Flipping the switch: bringing order to flagellar assembly. Trends. Microbiol. 14, 519-526. FÖRSTER, V.TH. (1948). Zwischenmolekulare energiewanderung und fluorezenz. Ann. Phys. (Leipzig) 2, 55-75. 68
Irodalomjegyzék FRANCIS, N.R., IRIKURA, V.M., YAMAGUCHI, S., DEROSIER, D.J. & MACNAB, R.M. (1992). Localization of the Salmonella typhimurium flagellar switch protein FliG to the cytoplasmic M-ring face of the basal body. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 6304-6308. FRANCIS, N.R., SOSINSKY, G.E., THOMAS, D. & DEROSIER, D.J. (1994). Isolation, characterization and structure of bacterial flagellar motors containing the switch complex. J. Mol. Biol. 235, 1261-1270. FUKUOKA H., SOWA Y., KOJIMA S., ISHIJIMA A. & HOMMA M. (2007). Visualization of functional rotor proteins of the bacterial flagellar motor in the cell membrane. J. Mol. Biol. 367, 692-701. FURUKAWA Y., IMADA K., VONDERVISZT F., MATSUNAMI H., SANO K., KUTSUKAKE K. & NAMBA K. (2002). Interactions between bacterial flagellar axial proteins in their monomeric state in solution. J. Mol. Biol. 318, 889-900. GARZA, A.G., BIRAN, R., WOHLSCHLEGEL, J.A. & MANSON, M.D. (1996) Mutations in motB suppressible by changes in stator or rotor components of the bacterial flagellar motor. J. Mol. Biol. 258, 270-285. GENNIS, L.S., GENNIS, R.B. & CANTOR, C.R. (1972). Singlet energy-transfer studies on associating protein systems. Distance measurements on trypsin, α-chymotrypsin, and their protein inhibitors. Biochemistry 11, 2517-2524. GENNIS, L.S. & CANTOR, C.R. (1976). Singlet-singlet energy transfer and other optical studies on the structure of trypsin and chymotrypsin complexes. J. Biol. Chem. 251, 769-775. HAUGLAND, R.P. (2002). Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals. 9th edition. Molecular Probes, Eugene, OR. HIRANO, T., YAMAGUCHI, S., OOSAWA, K. & AIZAWA, S.-I. (1994). Roles of FliK and FlhB in determination of flagellar hook length in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 176, 5439-5449. HOMMA, M., KUTSUKAKE, K., IINO, T. & YAMAGUCHI, S. (1984a). Hook-associated proteins essential for flagellar filament formation in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 157, 100-108. HOMMA, M., FUJITA, H., YAMAGUCHI, S. & IINO, T. (1984b). Excretion of unassembled flagellin by Salmonella typhimurium mutants deficient in hook-associated proteins. J. Bacteriol. 159, 1056-1059. HOMMA, M. & IINO, T. (1985). Excretion of unassembled hook-associated proteins by Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 164, 1370-1372. 69
Irodalomjegyzék HOMMA, M., KUTSUKAKE, K. & IINO, T. (1985). Structural genes for flagellar hookassociated proteins in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 163, 464-471. HOMMA, M., IINO, T., KUTSUKAKE, K. & YAMAGUCHI, S. (1986). In vitro reconstitution of flagellar filaments onto hooks of filamentless mutants of Salmonella typhimurium by addition of hook-associated proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83, 6169-6173. HOMMA, M., DEROSIER, D.J. & MACNAB, R.M. (1990a). Flagellar hook and hook-associated proteins of Salmonella typhimurium and their relationship to other axial components of the flagellum. J. Mol. Biol. 213, 819-832. HOMMA, M., KUTSUKAKE, K., HASEBE, M., IINO, T. & MACNAB, R.M. (1990b). FlgB, FlgC, FlgF and FlgG. A family of structurally related proteins in the flagellar basal body of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 211, 465-477. HORTON, H.R. & KOSHLAND, D.E.JR. (1967). Environmentally sensitive groups attached to proteins. I. Dansyl chloride (1-Dimethylaminonaphtalene-5-sulfonyl chloride). Methods Enyzmol. 11, 857-866. HOTANI, H. (1982). Micro-video study of moving bacterial flagellar filaments. III. Cyclic transformation induced by mechanical force. J. Mol. Biol. 156, 791-806. IINO, T. (1969). Polarity of flagellar growth in Salmonella. J. Gen. Microbiol. 56, 227-239. IINO, T. (1974). Assembly of Salmonella flagellin in vitro and in vivo. J. Supramol. Str. 2, 372-384. IKEDA, T., KAMIYA, R. & YAMAGUCHI, S. (1984). In vitro polymerization of flagellin excreted by a short-flagellum Salmonella typhimurium mutant. J. Bacteriol. 159, 787789. IKEDA, T., ASAKURA, S. & KAMIYA, R. (1985). „Cap” on the tip of Salmonella Flagella. J. Mol. Biol. 184, 735-737. IKEDA, T., HOMMA, M., IINO, T., ASAKURA, S. & KAMIYA, R. (1987). Localization and stoichiometry of hook-associated proteins within Salmonella typhimurium flagella. J. Bacteriol. 169, 1168-1173. IKEDA, T., YAMAGUCHI, S. & HOTANI, H. (1993). Flagellar growth in a filament-less Salmonella fliD mutant supplemented with purified hook-associated protein 2. J. Biochem. 114, 39-44. IKEDA, T., OOSAWA, K. & HOTANI, H. (1996). Self-assembly of the filament capping protein, FliD, of bacterial flagella into an annular structure. J. Mol. Biol. 259, 679-686.
70
Irodalomjegyzék IMADA, K., VONDERVISZT, F., FURUKAWA, Y., OOSAWA, K. & NAMBA, K. (1998). Assembly characteristics of flagellar cap protein HAP2 of Salmonella: decamer and pentamer in the pH-sensitive equilibrium. J. Mol. Biol. 277, 883-891. JONES, C.J., MACNAB, R.M., OKINO, H. & AIZAWA, S.-I. (1990). Stoichiometric analysis of the flagellar hook-(basal-body) complex of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 212, 377-387. JOYS, T.M. (1985). The covalent structure of the phase-1 flagellar filament protein of Salmonella typhimurium and its comparison with other flagellins. J. Biol. Chem. 260, 15758-15761. KAMIYA, R. & ASAKURA, S. (1976). Helical transformations of Salmonella flagella in vitro. J. Mol. Biol. 106, 167-186. KAMIYA, R. & ASAKURA, S. (1977). Flagellar transformations at alkaline pH. J. Mol. Biol. 108, 513-518. KAMIYA, R., ASAKURA, S., WAKABAYASHI, K. & NAMBA, K. (1979). Transition of bacterial flagella from helical to straight forms with different subunit arrangements. J. Mol. Biol. 131, 725-742. KAMIYA, R., ASAKURA, S. & YAMAGUCHI, S. (1980). Formation of helical filaments by copolymerization of two types of ‘ straight’ flagellins. Nature (London) 286, 628-630. KANTO, S, OKINO, H., AIZAWA, S.-I. & YAMAGUCHI, S. (1991). Amino acids responsible for flagellar shape are distributed in terminal regions of flagellin. J. Mol. Biol. 219, 471480 KATO, S., AIZAWA, S.-I. & ASAKURA, S. (1982). Reconstruction in vitro of the flagellar polyhook from Salmonella. J. Mol. Biol. 161, 551-560. KATO, S., OKAMOTO, M. & ASAKURA, S. (1984). Polymorphic transition of the flagellar polyhook from Escherichia coli and Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 173, 463476. KHAN, I.M., REESE, T.S. & KHAN, S. (1992). The cytoplasmic component of the bacterial flagellar motor. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 89, 5956-5960. KITAO A., YONEKURA K., MAKI-YONEKURA S., SAMATEY F.A., IMADA K., NAMBA K. & GO N. (2006). Switch interactions control energy frustration and multiple flagellar filament structures. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103, 4894-4899. KORNACKER M.G. & NEWTON A. (1994). Information essential for cell-cycle-dependent secretion of the 591-residue Caulobacter hook protein is confined to a 21-amino-acid sequence near the N-terminus. Mol. Microbiol. 14, 73-85. 71
Irodalomjegyzék KOSTYUKOVA, A.S., PYATIBRATOV, M.G., FILIMONOV, V.V. & FEDOROV, O.V. (1988). Flagellin parts acquiring a regular structure during polymerization are disposed on the molecule ends. FEBS Lett. 241, 141-144. KUDO, S., MAGARIYAMA, Y. & AIZAWA, S.-I. (1990). Abrupt changes in flagellar rotation observed by laser dark-field microscopy. Nature (London) 346, 677-680. KUTSUKAKE, K., OHYA, Y. & IINO, T. (1990). Transcriptional analysis of the flagellar regulon of Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 172, 741-747. KUTSUKAKE, K., MINAMINO, T. & YOKOSEKI, T. (1994). Isolation and characterization of FliK-independent flagellation mutants from Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 176, 7625-7629. LAKOWICZ, J.R. (1983). Principles of Fluorescence Spectroscopy. Plenum, New York. LARSEN, S.H., READER, R.W., KORT, E.N., TSO, W.-W. & ADLER, J. (1974). Change in direction of flagellar rotation is the basis of the chemotactic response in Escherichia coli. Nature (London) 249, 74-77. LIU, X. & MATSUMURA, P. (1994). The FlhD/FlhC complex, a transcriptional activator of the Escherichia coli flagellar class II operons. J. Bacteriol. 176, 7345-7351. LLOYD, S.A., TANG, H., WANG, X., BILLINGS, S. & BLAIR, D.F. (1996). Torque generation in the flagellar motor of Eschericia coli: evidence of a direct role for FliG but not for FliM or FliN. J. Bacteriol. 178, 223-231. LOWE, G., MEISTER, M. & BERG, H.C. (1987). Rapid rotation of flagellar bundles in swimming bacteria. Nature (London) 325, 637-640. MACNAB, R.M. & KOSHLAND, D.E.JR. (1972). The gradient-sensing mechanism in bacterial chemotaxis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2509-2512. MACNAB, R.M. & ORNSTON, M.K. (1977). Normal-to-curly flagellar transitions and their role in bacterial tumbling. Stabilization of an alternative quaternary structure by mechanical force. J. Mol. Biol. 112, 1-30. MACNAB, R.M. (2003). How bacteria assemble flagella. Annu. Rev. Microbiol. 57, 77-100. MACNAB, R.M. (2004). Type III flagellar protein export and flagellar assembly. Biochim. Biophys. Acta 1694, 207-217. MAGARIYAMA, Y., SUGIYAMA, S., MURAMOTO, K., MAEKAWA, Y., KAWAGISHI, I, IMAE, Y. & KUDO, S. (1995). Very fast flagellar rotation. Nature (London) 371, 752-752. MAKI, S., VONDERVISZT, F., FURUKAWA, Y., IMADA, K. & NAMBA, K. (1998). Plugging interactions of HAP2 pentamer into the distal end of flagellar filament revealed by electron microscopy. J. Mol. Biol. 277, 771-777. 72
Irodalomjegyzék MAKI-YONEKURA, S., YONEKURA, K. & NAMBA, K. (2003). Domain movements of HAP2 in the cap-filament complex formation and growth process of the bacterial flagellum. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100, 15528-15533. MANSON, M.D., TEDESCO, P., BERG, H.C., HAROLD, F.M. & VAN DER DRIFT, C. (1977). A protonmotive force drives bacterial flagella. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 30603064. MANSON, M.D. (1992). Bacterial motility and chemotaxis. Adv. Microbial Physiol. 33, 277346. MARTINEZ, R.J., ICHIKI, A.T., LUNDH, N.P. & TRONICK, S.R. (1968). Single amino acid substitution responsible for altered flagellar morphology. J. Mol. Biol. 34, 559-564. MATSUURA, S., SHIOI, J. & IMAE, Y. (1977). Motility in Bacillus subtilis driven by an artificial protonmotive force. FEBS Lett. 82, 187-190. MIMORI, Y., YAMASHITA, I., MURATA, K., FUJIYOSHI, Y., YONEKURA, K., TOYOSHIMA, C. & NAMBA, K. (1995). The structure of the R-type straight flagellar filament of Salmonella at 9 Ĺ resolution by electron cryomicroscopy. J. Mol. Biol. 249, 69-87. MIMORI-KIYOSUE, Y., VONDERVISZT, F., YAMASHITA, I., FUJIYOSHI, Y. & NAMBA, K. (1996). Direct interaction of flagellin termini essential for polymorphic ability of flagellar filament. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93, 15108-15113. MIMORI-KIYOSUE, Y., VONDERVISZT, F. & NAMBA, K. (1997). Locations of terminal segments of flagellin in the filament structure and their roles in polymerization and polymorphism. J. Mol. Biol. 270, 222-237. MINAMINO, T. & NAMBA, K. (2008). Distinct roles of the FliI ATPase and proton motive force in bacterial flagellar protein export. Nature 451, 485-488. MORGAN, D.G., MACNAB, R.M., FRANCIS, N.R. & DEROSIER, D.J. (1993). Domain organization of the subunit of the Salmonella typhimurium flagellar hook. J. Mol. Biol. 229, 79-84. MORGAN, D.G., OWEN, C., MELANSON, L.A. & DEROSIER, D.J. (1995). Structure of bacterial flagellar filaments at 11 Ĺ resolution: packing of the α-helices. J. Mol. Biol. 249, 88-110. NAMBA, K., YAMASHITA, I. & VONDERVISZT, F. (1989b). Structure of the core and central channel of bacterial flagella. Nature (London) 342, 648-654. NAMBA, K. & VONDERVISZT, F. (1997). Molecular architecture of bacterial flagellum. Quarterly Rev. of Biophysics 30, 1, 1-65.
73
Irodalomjegyzék O'BRIEN, E.J. & BENNETT, P.M. (1972). Structure of straight flagella from a mutant Salmonella. J. Mol. Biol. 70, 133-152. OHNISHI, K., OHTA, Y., AIZAWA, S.-I., MACNAB, R.M. & IINO, T. (1994). FlgD is a scaffolding protein needed for flagellar hook assembly in Salmonella typhimurium. J. Bacteriol. 176, 2272-2281. RUIZ, T., FRANCIS, N., MORGAN, D.G., & DEROSIER, D.J. (1993). Size of the export channel in the flagellar filament of Salmonella typhimurium. Ultramicroscopy 48, 417-425. SAIJO-HAMANO Y., UCHIDA N., NAMBA K. & OOSAWA K. (2004). In vitro characterization of FlgB, FlgC, FlgF, FlgG and FliE, flagellar basal body proteins of Salmonella. J. Mol. Biol. 339, 423-435. SAMATEY, F.A., IMADA, K., NAGASHIMA, S., VONDERVISZT, F., KUMASAKA, T., YAMAMOTO, M. & NAMBA, K. (2001). Structure of the bacterial flagellar protofilament and implications for a switch for supercoiling. Nature 410, 331-337. SAMATEY F.A., MATSUNAMI H., IMADA K., NAGASHIMA S., SHAIKH T.R., THOMAS D.R., CHEN J.Z., DEROSIER D.J., KITAO A. & NAMBA K. (2004). Structure of the bacterial flagellar hook and implication for the molecular universal joint mechanism. Nature 431, 1062-1068. SANGER, F. & COULSON, A.R. (1975). A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J. Mol. Biol. 94, 441-448. SCHUSTER, S.C. & KHAN, S. (1994). The bacterial flagellar motor. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 23, 509-539. SHARP, L.L., ZHOU, J. & BLAIR, D.F. (1995). Tryptophan-scanning mutagenesis of MotB, an integral membrane protein essential for flagellar rotation in Eschericia coli. Biochemistry 34, 9166-9171. SILVERMAN, M. & SIMON, M. (1974). Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature (London) 249, 73-74. SOSINSKY, G.E., FRANCIS, N.R., DEROSIER, D.J., WALL, J.S., SIMON, M. & HEINFELD, J. (1992). Mass determination and estimation of subunit stoichiometry of the bacterial hook-basal body flagellar complex of Salmonella typhimurium by scanning transmission electron microscopy. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4801-4805. STRYER, L. (1995). Biochemistry. Freeman, New York. TRACHTENBERG, S. & DEROSIER, D.J. (1988). Three-dimensional structure of the frozen hydrated flagellar filament. The left-handed filament of Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 195, 581-601. 74
Irodalomjegyzék TURNER, L., RYU, W.S. & BERG, H.C. (2000). Real-time imaging of fluorescent flagellar filaments. J. Bacteriol. 182, 2793-2801. UENO, T., OOSAWA, K. & AIZAWA, S.-I. (1992). M ring, S ring and proximal rod of the flagellar basal body of Salmonella typhimurium are composed of subunits of a single protein, FliF. J. Mol. Biol. 227, 672-677. URATANI, Y., ASAKURA, S. & IMAHORI, K. (1972). A circular dichroism study of Salmonella flagellin: evidence for conformational change on polymerization. J. Mol. Biol. 67, 8598. VÉGH B.M., GÁL P., DOBÓ J., ZÁVODSZKY P., VONDERVISZT F. (2006). Localization of the flagellum-specific secretion signal in Salmonella flagellin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 345, 93-98. VONDERVISZT, F., KANTO, S., AIZAWA, S.-I. & NAMBA, K. (1989). Terminal regions of flagellin are disordered in solution. J. Mol. Biol. 209, 127-133. VONDERVISZT, F., UEDAIRA, H., KIDOKORO, S. & NAMBA, K. (1990). Structural organization of flagellin. J. Mol. Biol. 214, 97-104. VONDERVISZT, F., AIZAWA, S.-I. & NAMBA, K. (1991). Role of the disordered terminal regions of flagellin in filament formation and stability. J. Mol. Biol. 221, 1461-1474. VONDERVISZT, F., ISHIMA, R., AKASAKA, K. & AIZAWA, S.-I. (1992a). Terminal disorder: a common structural feature of the axial proteins of bacterial flagellum? J. Mol. Biol. 226, 575-579. VONDERVISZT, F., SONOYAMA, M., TASUMI, M. & NAMBA, K. (1992b). Conformational adaptability of the terminal regions of flagellin. Biophys. J. 63, 1672-1677. VONDERVISZT, F., ZÁVODSZKY, P., ISHIMURA, M., UEDAIRA, H. & NAMBA, K. (1995). Structural organization and assembly of flagellar hook protein from Salmonella typhimurium. J. Mol. Biol. 251, 520-532. VONDERVISZT, F., IMADA, K., FURUKAWA, Y., UEDAIRA, H., TANIGUCHI, S. & NAMBA, K. (1998). Mechanism of self-association and filament capping by flagellar HAP2. J. Mol. Biol. 284, 1399-1416. WAGNER, R., PODESTÁ, F.E., GONZÁLEZ, D.H. & ANDREO, C.S. (1988). Proximity between fluorescent probes attached to four essential lysyl residues in phophoenolpyruvate carboxylase. Eur. J. Biochem. 173, 561-568. WAKABAYASHI, K., HOTANI, H. & ASAKURA, S. (1969). Polymerization of Salmonella flagellin in the presence of high concentrations of salts. Biochim. Biophys. Acta 175, 195-203. 75
Irodalomjegyzék WEI, L.-N. & JOYS, T.M. (1985). Covalent structure of three phase-1 flagellar filament proteins of Salmonella. J. Mol. Biol. 186, 791-803. YAMASHITA, I., VONDERVISZT, F., MIMORI, Y., SUZUKI, H., OOSAWA, K. & NAMBA, K. (1995). Radial mass analysis of the flagellar filament of Salmonella: implications for subunit folding. J. Mol. Biol. 253, 547-558. YAMASHITA, I., HASEGAWA, K., SUZUKI, H., VONDERVISZT, F., MIMORI-KIYOSUE, Y. & NAMBA, K. (1998). Structure and switching of bacterial flagellar filaments studied by X-ray fiber diffraction. Nat. Struct. Biol. 5, 125-132. YONEKURA, K., MAKI, S., MORGAN, D.G., DEROSIER, D.J., VONDERVISZT, F., IMADA, K. & NAMBA, K. (2000). The bacterial flagellar cap as the rotary promoter of flagellin self-assembly. Science 290, 2148-2152. YONEKURA, K., MAKI-YONEKURA, S. & NAMBA, K. (2001). Structure analysis of the flagellar cap-filament complex by electron cryomicroscopy and single-particle image analysis. J. Struct. Biol. 133, 246-253. YONEKURA, K., MAKI-YONEKURA, S. & NAMBA, K. (2002). Growth mechanism of the bacterial flagellar filament. Res. Microbiol. 153, 191-197. YONEKURA, K., MAKI-YONEKURA, S. & NAMBA, K. (2003). Complete atomic model of the bacterial flagellar filament by electron cryomicroscopy. Nature 424, 643-650. ZHOU, J., FAZZIO, R.T. & BLAIR, D.F. (1995). Membrane topology of the MotA protein of Eschericia coli. J. Mol. Biol. 251, 237-242.
76
Publikációk
Publikációs lista
A dolgozat alapjául szolgáló közlemények Nemzetközi folyóiratokban megjelent közlemények: Diószeghy Z., Závodszky P., Namba K., Vonderviszt F. (2004). Stabilization of flagellar filaments by HAP2 capping. FEBS Lett. 568, 105-109. Gugolya Z., Muskotál A., Sebestyén A., Diószeghy Z., Vonderviszt F. (2003). Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon flagellar filament formation. FEBS Lett. 535, 66-70.
Nemzetközi konferenciákon szereplı poszterek: Vonderviszt F., Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. XIVth INTERNATIONAL BIOPHYSICS CONGRESS. Buenos Aires, Argentína, 2002. április 27.- május 1. Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z., Vonderviszt F.: Interaction of the disordered terminal regions of flagellin upon filament formation. KEIHANNA INTERNATIONAL CONFERENCE ON MOLECULAR BIOPHYSICS. Kyoto, Japán, 2002. szeptember 19-21.
Hazai konferenciákon szereplı poszterek: Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F.: A HAP2 sapka szerepe a flagelláris filamentumok
szerkezetének
stabilizálásában.
MAGYAR
BIOKÉMIAI
EGYESÜLET
MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI SZAKOSZTÁLYA 5. MUNKAÉRTEKEZLETE. Sopron, 2000. május 811. Muskotál A., Sebestyén A., Gugolya Z., Diószeghy Z., Vonderviszt F.: A flagellinmolekula rendezetlen terminális régióinak szerepe az alegységek kölcsönhatásaiban. MAGYAR BIOKÉMIAI
EGYESÜLET
MOLEKULÁRIS
MUNKAÉRTEKEZLETE. Keszthely, 2002. május 14-17.
77
BIOLÓGIAI
SZAKOSZTÁLYA
7.
Publikációk
Egyéb közlemények Nemzetközi folyóiratban megjelent absztrakt: Sebestyén A., Gugolya Z., Jakab G., Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F. (2005): The FliH component of the flagellarexport apparatus is a multi-zinc enzyme with phospholipase activity. 30th FEBS CONGRESS AND 9th IUBMB CONFERENCE. Budapest, Magyarország, 2005. július 2-7. FEBS Journal 272, 347.
Hazai konferenciákon szereplı poszterek: Vonderviszt F., Jakab G., Diószeghy Z., Gugolya Z., Závodszky P.: A FliH fehérje szerepe a flagellum-specifikus exportapparátus mőködésében. MAGYAR BIOKÉMIAI EGYESÜLET MOLEKULÁRIS BIOLÓGIAI SZAKOSZTÁLYA 8. MUNKAÉRTEKEZLETE. Tihany, 2003. május 12-15. Sebestyén A., Gugolya Z., Jakab G., Muskotál A., Diószeghy Z., Závodszky P., Vonderviszt F.: A flagellum-specifikus exportrendszer FliH komponense foszfolipáz aktivitással rendelkezı multi-cink fehérje. MBFT XXII. KONGRESSZUSA. Debrecen, 2005. június 26-29.
78
