A gyomor szövettani és makroszkópos eltéréseihez kapcsolódó genetikai faktorok Doktori értekezés tézisei
Dr. Szőke Dominika Semmelweis Egyetem, II. Belgyógyászati Klinika
Semmelweis Egyetem, Klinikai Orvostudományok Doktori Iskola Gasztroenterológia PhD program
Program- és témavezető: Prof. Tulassay Zsolt egyetemi tanár, az orvostudományok doktora
Budapest 2009 1
BEVEZETÉS
A gyomor rák-megelőző betegségei nagyon gyakori és számos kutatás középpontjában álló kórképek. Jó néhány mutációról már bebizonyosodott, hogy a gyomorrák kialakulásában szerepet játszik, mint genetikai befolyásoló faktor. A H. pylori fertőzés a gyomorrák kialakulásának egyik rizikó tényezője, szerepe a krónikus gasztrítisz - atrófia – intesztinális metaplázia (IM) – diszplázia szekvencia kialakulásában meghatározó. Habár a bakteriális fertőzésnek fontos szerepe van a betegség patogenezisében, számos bizonyíték szól amellett, hogy
a
gazdaszervezet
tulajdonságai
fontosabb
szerepet
játszanak
a
gyomorrák
kialakulásában, mint a kórokozó faktorai. Az IL-8 gén T-251A funkcionális polimorfizmusa nagy valószínűséggel szerepet játszik a H. pylori fertőzéssel összefüggő gyomorbetegségek patogenezisében. A G-308A polimorfizmus a TNF-α fehérje fokozott expresszióját eredményezi. A TNF-α gén promóter régiójában található genetikai variáció számos fertőző betegségre való fogékonysággal összefüggésben áll. A gyomorrák kialakulása és progressziója általában genetikai eltérések felhalmozódásához köthető, amely mutációk gyakran már a rák megelőző állapotokban, mint például IM-ban is megfigyelhetőek. Úgy tűnik, hogy ezen genetikai eltérések között a p53 tumor szuppresszor gén mutációi és polimorfizmusai kulcsfontosságú szerepet játszanak. A genetikai eltérések megjelenhetnek a szervezet összes sejtjében, de csak egy adott, a daganatos megbetegedés által érintett szervben is. A lokális eltérések vizsgálata történhet DNS szinten, mutációk és polimorfizmusok keresésével, illetve protein szinten, például immunhisztokémiai vizsgálatokkal is. A számos genetikai polimorfizmus kimutatási módszer közül a legmegbízhatóbb technika mutáció és polimorfizmus vizsgálatra a kapilláris DNS szekvenálás (CS). A chip technológia a CS egyik új, alternatív lehetősége, amely igazán alkalmas lehet mutáció és polimorfizmus szűrési feladatok ellátására. A fentiekre alapozva PhD munkám során az IL-8 gén T-251A, TNF-α gén G-308A és a p53 gén több polimorfizmusának-, illetve a H. pylori fertőzés lehetséges szerepét vizsgáltam a gyomor rák-megelőző betegségeinek, mint gasztrítisz, atrófia és IM kialakulásában, ezen túl vizsgáltam a lokális eltéréseket mind DNS, mind protein szinten és a különböző szekvencia
2
meghatározási módszerek, mint a CS és a chip módszer használhatóságát a genetikai diagnosztikában.
CÉLKITŰZÉSEK Célkitűzéseim voltak: -
Megvizsgálni az IL-8 gén T-251A polimorfizmusának és a TNF-α gén G-308A polimorfizmusának hatását a gyomor különböző szövettani- (gasztrítisz, IM, atrófia) és makroszkópos eltéréseiben (erózió).
-
Megvizsgálni, hogy vajon ezen két polimorfizmus befolyásolja-e a H. pylori fertőzés előfordulási gyakoriságát a vizsgált populációban.
-
Megvizsgálni, hogy IM-ben találhatóak-e genetikai eltérések a p53 génben.
-
Összehasonlítani a lehetséges szekvencia eltéréseket ugyanazon beteg különböző eredetű mintáiban (perifériás vérből és a gyomor korpusz és antrum régiójából származó biopsziás mintákból kinyert DNS).
-
Megvizsgálni a vad-típusú p53 fehérje expressziót IM-ban és bebizonyítani, hogy vane összefüggés a genetikai polimorfizmusok és a fehérje kifejeződése között.
-
Összehasonlítani a CS módszert a GeneChip p53 Probe Array-al és értékelni ezen utóbbi módszer alkalmasságát mutációk és polimorfizmusok kimutatására.
MÓDSZEREK I.
Betegek és minták Összesen 218 pacienst vontam be a vizsgálatokba, akikből rutin gyomor endoszkópia
során gyomor biopsziás minták vétele történt. Közülük gasztrítiszben szenvedett 86 (H. pylori pozitív: n=41), IM-ben 43 (H. pylori pozitív: n=22), atrófiában 32 (H. pylori pozitív: n=13), 57 pedig hisztológiai vizsgálattal negatívnak (Hiszt Negatív) bizonyult. A pacienseket makroszkópos diagnózis alapján is besoroltam, komplett erózió (n=102, H. pylori pozitív: n=41) és makroszkóposan negatív (Makr Negatív) (n=88, H. pylori pozitív: n=21) csoportokba. Ezen túl 50 IM-ben szenvedő betegtől (H. pylori pozitív: n=27) és 51 szövettanilag negatív (Hiszt Negatív) pacienstől (mindenki H. pylori negatív), mint kontrol csoporttól antrális gyomor biopsziás mintákat is vettünk Az 50 IM-es beteg közül 7-nél 3
nemcsak a patológiás (antrum), hanem az egészséges gyomor régióból (korpusz) is történt biopsziás minta vétele. Ezen utóbbi betegektől perifériás vért is vettünk, hogy az abból izolált DNS-ben esetlegesen jelen lévő genetikai eltéréseket összehasonlíthassuk a biopsziás mintákban található lokális eltérésekkel. A biopsziás mintákat RNAlater-ben (Qiagen) -80 oCon tároltuk a DNS izolálásáig. II.
PCR-ek, RFLP-k és kapilláris szekvenálás (CS) Az IL-8 gén T-251A polimorfizmusát ARMS (Amplification Refractory Mutation
System )-, a TNF-α gén G-308A polimorfizmusát pedig PCR-RFLP módszerrel vizsgáltam. A paciensek genotípusának maghatározása gél-elektroforézis segítségével történt. 43 IM-es beteg és az 51 Hiszt Negatív paciens biopsziás mintáit CS-el a p53 génnek csak a 4-es exonjára nézve vizsgáltam. Hét kiválasztott IM-es beteg esetében összesen 21 mintát (az antrum, korpusz biopsziás és a perifériás vérmintáját mindegyik betegnek) vizsgáltam meg a p53 gén hat exonjára nézve (4, 5, 6, 7, 8 és 10) CS-el. A p53 gén 4, 5, 6, 7, 8 és 10-es exonjának a vizsgálata Big Dye Terminator Kit-tel és ABI310 genetikai analizátorral (Applied Biosystems) történt mind az 50 IM-es beteg, mind az 51 Hiszt Negatív paciens esetében. A szekvenciák értékelése Chromas vs. 2.3 szoftverrel és a Sequence Scanner vs1 (Applied Biosystems) program segítségével történt. III. DNS reszekvenáló microarray A 7 IM-es beteg összesen 21 mintájának a p53 gén 2-11 exonjaira vonatkozó vizsgálata GeneChip p53 Assay-el (Affymetrix) történt. A paciensek DNS mintáit és a referencia DNS-t multiplex PCR segítségével amplifikáltam, majd fragmentáltam, jelöltem és a p53 microarray-ekre hibridizáltam, végül a chipeket mostam és szkenneltem, a gyártó ajánlásának megfelelő protokoll szerint. Az adatok elemzése az Affymetrix Microarray Analysis Suite 5.1 szoftver segítségével történt. IV. Vad típusú p53 (DO-7) immunhisztokémia Irodalmi adatok szerint a DO-7 antitest nem reagál a normális humán szövetekkel (beleértve a gyomrot is), míg a gyomor malignitások 22-76%-ban a p53 fehérje felülexpressziója igazolódott az antitest használatakor. Immunhisztokémiai vizsgálat történt 19 IM-es beteg antrumból származó biopsziás mintájából, a metszeteken csak az IM-es mirigyeket vizsgáltam. Festődési indexet (LI) számoltam úgy, hogy elosztottam az IM-es 4
mirigyekben található DO7 pozitív (barnára festődő) sejteknek a számát a mirigyekben található összes sejtnek a számával. V.
Statisztikai elemzés Az IL8 és a TNF-α gének polimorfizmusai esetén a genotípusok elemzése Fischer
teszttel történt, az Odds Ratio-t (OR) 95%-os Confidence Interval-al (CI) határoztam meg 2x2-es kontingencia táblázatok alapján. A p53 gén polimorfizmusainak a magyarázó változóktól való függésének elemzéséhez logisztikus regresszióval történt. A p<0,05 értékeket fogadtam el statisztikailag szignifikánsnak. A statisztikai elemzések R-környezetben történtek.
EREDMÉNYEK I.
Gyomor eltérések és az IL8 gén T-251A polimorfizmusa Az IL8 gén T-251A polimorfizmusa esetén a T/T és a T/A genotípusok szignifikánsan
különböztek a Hiszt Negatív és az IM csoportok között (p=0,038, CI=1,07-Inf, OR=2,96 ha OR>1). Az A/A genotípus szignifikánsan gyakoribb volt a H. pylori negatív Gasztrítisz csoportban (p=0,049, CI=0,93-8,24, OR=2,73 ha OR≠1), mint a kontrol, vagyis a H. pylori negatív Hiszt Negatív csoportban. Érdekes módon a H. pylori negatív Atrófia alcsoport nagyon hasonló eredményeket mutatott a kontrol csoportéval és szignifikánsan különbözött a H. pylori negatív Gasztrítisz csoporttól (p=0,033, CI=0-0,86, OR=0,12 ha OR<1). A makroszkópos erózió alapján történő csoportosítás során a H. pylori fertőzést is figyelembe véve sem találtam statisztikailag szignifikáns különbséget az IL8 gén T-251A polimorfizmusának előfordulási gyakorisága között a vizsgált csoportokban. II.
Gyomor eltérések és a TNF-α gén G-308A polimorfizmusa A TNF-α gén G-308A polimorfizmusa esetén a H. pylori fertőzést is figyelembe véve
sem találtam statisztikailag szignifikáns különbséget a vizsgált csoportokban az egyes genotípusok előfordulási gyakorisága között.
5
A G/G és G/A genotípusok szignifikánsan különbözőnek bizonyultak az Erózió és a Makr Negatív csoportok között (p=0,035, CI=1,0055-4,72, OR=2,15 ha OR≠1), és a H. pylori pozitív Erózió és a H. pylori pozitív Makr Negatív alcsoportok között (p=0,027, CI=1,10528,84, OR=5,22 ha OR≠1). A G/G genotípus szignifikánsan gyakrabban fordult elő mindkét csoportban a kontrol csoporthoz képest. III.
IM és a p53 gén polimorfizmusai A H. pylori pozitív IM csoportot a kontrol csoporthoz hasonlítva azt lehetett
megfigyelni, hogy az RR genotípus szignifikánsan csökkenti az IM esélyét (p=0,0087). A H. pylori negatív IM és a H. pylori pozitív IM csoport között nem találtam statisztikailag szignifikáns összefüggést. Nem találtam eltérő genotípusokat ugyanazon beteg eltérő eredetű mintái között. A betegekben talált összes polimorfikus helyen ugyanazon genotípus volt megfigyelhető a perifériás vérből, a gyomor normális (korpusz) és patológiás részéből (antrum) vett biopsziás mintákból izolált DNS-ben. Eredményeim azt mutatják, hogy az RR genotípus, de már az R allél jelenléte is csökkenti az IM előfordulási gyakoriságát. Ez összefüggésben áll azzal a megfigyeléssel, hogy az R72-es allél variáns jobban indukálja az apoptózist, mint a P72-es, ez előbbinek jellemzően mitokondriális elhelyezkedése és az MDM2 E3 ubikvitin ligáz általi nagyobb mértékű ubikvitinációja miatt. IV.
A különböző eredetű minták közötti genetikai eltérések vizsgálata Nem találtam szekvencia eltérést az egyes betegek különböző eredetű mintáiban
(perifériás vérből, a gyomor korpuszából és antrumából kinyert DNS minták), amely azt sugallja, hogy IM-ben nincsenek a gyomorban kialakuló genetikai eltérések a p53 génben. V.
A fehérje expresszió vizsgálata p53 DO-7 immunhisztokémiai módszerrel A metszetek LI eredményeit elemezvén azt tapasztaltam, hogy az RR genotípusú
minták esetén az LI szignifikánsan magasabb (p=0,004, a különbség 23,52) a H. pylori pozitív metszetekben, mint a H. pylori negatívokban, illetve azt, hogy a H. pylori negatív esetekben az LI szignifikánsan magasabb az RP genotípusú metszetekben (p=0,012, a különbség 23,31) mint az RR genotípusúakban. H. pylori pozitív esetekben az LI szignifikánsan magasabbnak
6
bizonyult a PP genotípusú metszetekben (p=0,0027, a különbség 26,99) mint az RR genotípusúakban. A 72-es kodon R-P cseréje nem változtatja meg a DO-7 antitest kötődési kapacitását, így a p53 fehérje pozitív jelet ad az ezzel az antitesttel történő festés során. Úgy tűnik, hogy a P allél jelenléte növeli a p53 fehérje mennyiségét az IM-es sejtekben. Eredményeim azt sugallják, hogy a H. pylori fertőzés szintén emeli a p53 fehérje expresszióját ezen sejtekben. VI.
A microarray alapú szekvenálás és a CS összehasonlítása A 7 IM-es beteg 21 mintáját GeneChip p53 Array módszerrel vizsgáltam a p53 gén tíz
exonjára és CS-al annak hat exonjára nézve. Minden, a GeneChip által talált mutáció CS-el is ellenőrzésre került. CS-el az R72P polimorfizmus minden beteg minden mintájában kimutatható volt, míg a GeneChip módszer csak hármat azonosított ezen 21 darab R72P polimorfizmus közül, és PP helyett RP-nek határozta meg a genotípusukat. Ezen kívül 16 darab aminosav eltéréssel járó és 2 darab aminosav eltéréssel nem járó misszensz mutációt azonosítottam GeneChip módszerrel, amelyeket azonban CS-el nem tudtam megerősíteni. Úgy tűnik, hogy a GeneChip p53 Assay (Affymetrix) önmagában nem használható a p53 gén mutáció analízisére, hiszen a microarray módszer eredményei nem voltak reprodukálhatóak CS-el. Az észlelt eltérés oka valószínűleg a microarray módszernél alkalmazott multiplex PCR kivitelezésének a nehézsége.
LEGFONTOSABB MEGFIGYELÉSEIM -
Úgy tűnik, hogy az IL-8 gén T-251A polimorfizmusának hatása a gyomor hisztológiai
eltérései közül a gasztrítisz és az IM, míg a TNF-α gén G-308A polimorfizmusának hatása a gyomor makroszkópos eltérésében, az erozív gasztrítisz patogenezisében bír jelentőséggel. -
A p53 gén R72P polimorfizmusa összefüggésben áll az IM-el. A megfigyelés mögött
álló mechanizmus az lehet, hogy az R72-es allél jobban indukálja az apoptózist, mint a P72es. -
A H. pylori fertőzést vizsgálva a gyomor mikroszkópos és makroszkópos eltéréseiben
úgy tűnik, hogy sem az IL-8 gén T-251A polimorfizmusa, sem a TNF-α gén G-308A polimorfizmusa nem befolyásolja a fertőzés kialakulását, bár a H pylori fertőzés megnöveli p53 protein expresszióját az IM-es sejtekben. 7
-
Nem volt szekvencia eltérés kimutatható ugyanazon beteg eltérő eredetű mintái között
a p53 gén vizsgált exonjaiban. -
A p53 fehérje expressziója az IM mirigysejtekben összefüggésben áll a p53 gén 72-es
kodonjának genotípusával, és függ a H. pylori státusztól. -
A munkám során alkalmazott GeneChip p53 Probe Array módszer az akkori
formájában nem volt elég érzékeny és megbízható ahhoz, hogy önállóan alkalmazható lehessen a p53 gén genetikai szűrésére.
PUBLIKÁCIÓS JEGYZÉK Összesített IF: 23,358 ELSŐ SZERZŐS, A PhD TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ CIKKEK - Szoke D, Molnar B, Solymosi N, Racz K, Gergics P, Blasko B, Vasarhelyi B, Vannay A, Mandy Y, Klausz G, Gyulai Z, Galamb O, Spisak S, Hutkai B, Somogyi A, Berta K, Szabo A, Tulassay T, Tulassay Z. Polymorphisms of the ApoE, HSD3B1, IL-1beta and p53 genes are associated with the development of early uremic complications in diabetic patients: Results of a DNA resequencing array study. Int J Mol Med. 2009 Feb;23(2):217-27. IF: 1.847 (2007-ben) - Szoke D, Molnar B, Solymosi N, Sipos F, Galamb O, Gyorffy A, Tulassay Zs. The RR genotype of codon 72 of p53 gene reduces the development of intestinal metaplasia. Dig. Liver Dis. 2009 Mar;41(3):179-84. IF: 1,982 (2007-ben) - Szoke D, Molnar B, Solymosi N, Klausz G, Gyulai Zs, Toth B, Mandi Y, Tulassay Zs. On the T-251A polymorphism of IL-8 relating to the development of histological gastritis and on the G-308A polymorphism of TNF-α relating to the development of macroscopic erosion. Eur J Gastroen Hepatol. 2008 Mar;20(3):191-5. IF: 1,830 (2007-ben) - Szőke D., Molnár B., Tulassay Zs.: A ritka sejtes minták DNS vizsgálatának lehetőségei, módszertana, jelentősége az őssejt-terápia szempontjából. Orv Hetil. 2004;43:2177-82. - Szőke D., Sipos F., Berta K., Molnár B.: Urémiás betegek emésztőrendszeri szövődményei. Orvosképzés, 2004;79(1-2):50-3. - Szőke D., Sipos F., Spisák S., Molnár B., Tulassay Zs.: A p53 gén és fehérje 2005-ben: új eredmények, ígéretes lehetőségek. Orv Hetil. 2005;30:1587-94. MÁSODIK- ÉS TÁRSSZERZŐS, A PhD TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ CIKKEK - Molnar B, Szoke D, Ruzsovics A, Tulassay Z.Significantly elevated Helicobacter pylori density and different genotype distribution in erosions as compared with normal gastric biopsy specimen detected by quantitative real-time PCR. Eur J Gastroenterol Hepatol. 2008 Apr;20(4):305-13. IF: 1,830 (2007-ben) 8
- Galamb O, Gyõrffy B, Sipos F, Dinya E, Krenács T, Berczi L, Szõke D, Spisák S, Solymosi N, Németh AM, Juhász M, Molnár B, Tulassay Z.Helicobacter pylori and antrum erosionspecific gene expression patterns: the discriminative role of CXCL13 and VCAM1 transcripts. Helicobacter. 2008 Apr;13(2):112-26. IF: 2,423 (2007-ben) - Hofner P, Gyulai Z, Kiss ZF, Tiszai A, Tiszlavicz L, Toth G, Szoke D, Molnar B, Lonovics J, Tulassay Z, Mandi Y. Genetic polymorphisms of NOD1 and IL-8, but not polymorphisms of TLR4 genes, are associated with Helicobacter pylori-induced duodenal ulcer and gastritis. Helicobacter. 2007 Apr;12(2):124-31. IF: 2,423 - Galamb O, Sipos F, Molnar B, Szoke D, Spisak S, Tulassay Z. Evaluation of malignant and benign gastric biopsy specimens by mRNA expression profile and multivariate statistical methods. Cytometry B Clin Cytom. 2007 Mar 15;72B(5):299-309 IF: 2,065 (in 2006) - Ladanyi A, Sipos F, Szoke D, Galamb O, Molnar B, Tulassay Z.: Laser microdissection in translational and clinical research. Cytometry A. 2006 Sep 1;69(9):947-60. IF: 3,293 - Sipos F., Szőke D., Galamb O., Molnár B., Tulassy Zs.: A lézer-mikrodisszekció jelentősége és gyakorlati alkalmazása a klinikai kutatásban és a diagnosztikai módszerfejlesztésben. Orv Hetil. 2004;26:1355-1361. PhD TÉMÁHOZ NEM KAPCSOLÓDÓ, ELSŐ- ÉS TÁRSSZERZŐS CIKKEK: - Szöke D, Györffy A, Surowiak P, Tulassay Z, Dietel M, Györffy B. Identification of consensus genes and key regulatory elements in 5-fluorouracil resistance in gastric and colon cancer. Onkologie. 2007 Sep;30(8-9):421-6. IF: 1,227 (2007-ban) - Gyorffy A, Vásárhelyi B, Szöke D, Dietel M, Tulassay T, Györffy B. Comparative promoter analysis of doxorubicin resistance-associated genes suggests E47 as a key regulatory element. Anticancer Res. 2006 Jul-Aug;26(4B):2971-6. IF: 1,604 - Szolnoki Z., Havasi V., Bene J., Komlosi K., Szoke D., Somogyvari F., Kondacs A., Szabo M., Fodor L., Bodor A., Gati I., Wittman I., Melegh B.: Endothelial nitrit oxide synthase gene interactions and the risk of ischaemic stroke. Acta Neurol Scand. 2005;111(1):29-33. IF:1,226 - Toldy E., Lőcsei Z., Szabolcs I., Góth M. I., Kneffel P., Szőke D., Kovács G.L.: Macroprolactinemia: the consequences of a laboratory pitfall. Endocrine. 2003;22:267-73. IF: 1,608 - Toldy E., Lőcsei Z., Szabolcs I., Kneffel P., Góth M., Szőke D., Kovács G.L.: A macroprolactinaemia és a hyperprolactinaemia differenciáldiagnosztikája, Orv Hetil. 2003;43:2121-7. A PhD témához kapcsolódó, nyomtatásban megjelent első szerzős absztraktok: - Szőke D, Mándy Y, Szabó A, Berta K, Molnár B, Tulassay Z. Prediction of gastric erosive complications in uremic diabetic patients using multigene DNA sequencing arrays Z Gastroenterol 2007; 45
9
- Szőke D, Klausz G, Gyulai Z, Tóth B, Molnár B, Mándy Y, Tulassay Z.: Determination of T-251A polymorphism of IL-8 and G-308A polymorphism of TNF-α in different gastric diseases Z Gastroenterol 2006; 05 - Szőke D., Patócs A., Molnár B. Tulassay Z.: p53 determination in intestinal metaplasia by immunohistochemistry, chip and conventional sequencing technology Z Gastroenterol 2005; 43 - Szoke D., Mandy Y., Toth B., Molnar B., Tulassay Z.: Differences between somatic (in-situ biopsies) and germ-line (peripheral blood) mutations in gastrointestinal diseases. Tissue Antigens. 2004; 64(4):400 - Szőke D., Patócs A., Molnár B., Tulassay Z.: p53 sequence determination in gastric biopsy specimens by chip and conventional sequencing technology Z Gastroenterol 2004; 42
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Köszönetet szeretnék mondani mindazoknak, akik segítették PhD munkám elkészítését: -
Program- és témavezetőmnek, Prof. Dr. Tulassay Zsolt egyetemi tanárnak és Dr. Molnár Béla tudományos főmunkatársnak, laborvezetőnek, hogy lehetővé tették és támogatták PhD munkám elvégzését a Semmelweis Egyetem (SE) II. számú Belgyógyászati Klinika Sejtanalitikai Laboratóriumában;
-
Az SE II. számú Belgyógyászati Klinika és a Sejtanalitikai Laboratórium összes munkatársának, hogy segítettek a munka kivitelezésében és a felmerülő problémák megoldásában;
-
A különböző projektek kivitelezésében részt vevő egyéb laboratóriumok, elsősorban a Szegedi Egyetem Mikrobiológiai és Immunológia Laboratórium munkatársainak;
-
A szekvenálások kivitelezésére lehetőséget nyújtó laboratóriumoknak, az SE II. számú Belgyógyászati
Klinika
endokrinológiai
kutatólaboratóriumának,
és
az
SE
Bőrgyógyászati Klinika Immunlaboratóriumának és munkatársaiknak; -
Dr. Solymosi Norbertnek a statisztikai elemzések elvégzéséért;
-
Jelenlegi munkahelyem, az SE Kútvölgyi Klinikai Tömb Központi Laboratórium vezetőjének és dolgozóinak, amiért segítettek abban, hogy a napi munka mellett cikkeim megírására és a PhD dolgozatom elkészítésére is koncentrálni tudjak.
10
