A glükokortikoidok iránti érzékenység és a csontanyagcsere összefüggéseinek vizsgálata endogén hypercortisolismusban
Doktori értekezés
dr. Szappanos Ágnes Semmelweis Egyetem Doktori Iskola Klinikai Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola
Témavezető: Hivatalos bírálók:
Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Tóth Miklós egyetemi docens, Ph.D. Dr. Nagy Endre egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc. Dr. Kiss Emese egyetemi docens, Ph.D. Dr. Lakatos Péter egyetemi tanár, Ph.D., D.Sc. Dr. Andréka Péter egyetemi magántanár, Ph.D. Dr. Nyitrayné Pap Erna egyetemi docens, Ph.D.
Budapest 2010.
TARTALOMJEGYZÉK RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE______________________________________________5 1. BEVEZETÉS__________________________________________________________7 2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS______________________________________________8 2.1. Cushing-kór és adrenális Cushing-szindróma______________________________8 2.2. A glükokortikoidok csontszövetre kifejtett hatása__________________________12 2.3. A glükokortikoid receptor______________________________________________17 2.3.1. A glükokortikoid receptor működése és izoformái __________________________17 2.3.2. A glükokortikoid receptor génje és fehérje szerkezete___________________18 2.3.3. A glükokortikoid receptor genetikai variánsai__________________________19 2.4. A 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim________________________________22 2.4.1. A 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim izoformái és működése_________22 2.4.2. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim gén szerkezete_____27 2.4.3. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim genetikai variánsai__28 2.5. Endogén hypercortisolismussal járó állapotok glükokortikoid érzékenységének genetikai jellegzetességei__________________________________________________31 3. CÉLKITŰZÉSEK_____________________________________________________35 4. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK___________________________________________37 4.1. Vizsgált betegcsoportok________________________________________________37 4.2. Klinikai, kémiai- és hormon-laboratóriumi vizsgálatok______________________37 4.3. Oszteodenzitometriás paraméterek és a csontforgalom vizsgálata_____________38 4.4. Molekuláris genetikai vizsgálatok_______________________________________39 4.4.1. A glükokortikoid receptor genetikai variánsainak kimutatása______________39 4.4.2. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim genetikai variánsainak kimutatása___________________________________________________________44
2
4.5. Statisztikai módszerek_________________________________________________51 5. EREDMÉNYEK_______________________________________________________53 5.1. A glükokortikoidok csontanyagcserét befolyásoló hatásának vizsgálata endogén hypercortisolismusban________________________________________________ 53 5.2. A glükokortikoid receptor genetikai variánsainak vizsgálata endogén hypercortisolismusban________________________________________________60 5.3. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim genetikai variánsainak kimutatása új allélspecifikus PCR módszer segítségével_____________________67 5.4. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim genetikai variánsainak vizsgálata endogén hypercortisolismusban________________________________67 6. MEGBESZÉLÉS______________________________________________________74 6.1. A glükokortikoidok csontanyagcserét befolyásoló hatása endogén hypercortisolismusban és annak gyógyulását követően_____________________74 6.2. A glükokortikoid receptor gén BclI polimorfizmusa és a csontanyagcsere közötti összefüggés endogén hypercortisolismusban________________________77 6.3. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim rs846910 és rs846911 genetikai variánsainak kimutatására kidolgozott új allél-specifikus módszer ___79 6.4. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim rs846910 és 83,557insA polimorfizmusának jelentősége endogén hypercortisolismusban_____________79 7. KÖVETKEZTETÉSEK________________________________________________82 8. MAGYAR NYELVŰ ÖSSZEFOGLALÓ__________________________________84 9. ANGOL NYELVŰ ÖSSZEFOGLALÓ____________________________________86 10. IRODALOMJEGYZÉK_______________________________________________88
3
11. SAJÁT KÖZLEMÉNYEK JEGYZÉKE__________________________________101 11.1 A Doktori értekezéshez kapcsolódó közlemények_________________________101 11.2 A Doktori értekezéstől független közlemények____________________________101 12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS__________________________________________103
4
RÖVIDÍTÉSEK JEGYZÉKE ACTH:
adrenocorticotrop hormon
BMD:
csont ásványianyag sűrűség
BMI:
testtömeg index
BMP:
csont morfogenetikus protein
bp:
bázis pár
C/EBP:
CAAT/ enhancer kötő fehérje
CBFA I:
core binding faktor alfa 1
CT:
computer tomográfia
DM:
diabetes mellitus
dxm:
dexamethason
ER:
endoplazmás retikulum
G6P:
glükóz-6-foszfát
6PG:
6-foszfoglikonát
GH:
növekedési hormon
GR:
glükokortikoid receptor
GSK-3β:
glikogén szintetáz kináz-3 β
H6PDH :
hexóz-6-foszfát dehidrogenáz
HSD11B1:
1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz
IGF-1:
inzulinszerű növekedési faktor I
IGT:
kóros glükóz tolerancia
M-CSF:
makrofág kolónia stimuláló faktor
MRI:
mágneses rezonanciás képalkotás
NADP:
nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát
NADPH:
nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát-oxidáz
OC:
osteocalcin
OPG:
oszteoprotegerin
PCOS:
polycystás ovarium szindróma
PCR:
polimeráz láncreakció
PPARγ:
peroxiszóma-proliferátor-aktivált-receptor- gamma
5
RANK:
nukleáris-faktor-κB receptor aktivátor molekula
RANKL:
nukleáris-faktor-κB receptor aktivátor molekula ligandja
Real Time PCR:
valós idejű polimeráz láncreakció
RFLP:
restrikciós fragmens hossz polimorfizmus
TNF α:
tumornekrózis-faktor-α
UFC:
vizelet szabad kortizol
β-CTx:
I-es típusú kollagén karboxiterminális telopeptid β-izomerje
6
BEVEZETÉS Az endogén hypercortisolismussal járó állapotok kialakulásáért 70%-ban ACTHtermelő hypophysis adenoma, míg további 15-15%-ban mellékvese eredetű, illetve ectopiás ACTH túltermelés következtében kialakuló Cushing-szindróma tehető felelőssé. A kortizol túltermelés következtében létrejövő kórkép incidenciája az európai lakosság körében 3,5 millió beteg évente. Az egész szervrendszerre kiterjedő kórkép tüneteit, a hypophysis működéseinek kutatása területén maradandót alkotó Harvey W. Cushing idegsebész jegyezte fel elsőként. A csontszövet tekintetében, a tartósan emlekedett kortizol szint következtében, a csontok ásványi anyag tartalma csökken és a betegek egyharmadában glükokortikoid indukált osteoporosis alakul ki. A csontszövetre kifejtett tartós glükokortikoid túltermelés sejtszinten megfigyelhető hatásai a csontépítés és a csontbontás egyensúlyának felborulását eredményezik. Korábbi kutatási eredmények azonban arra utalnak, hogy a megváltozott csontátépülés helyreáll endogén Cushing-szindróma gyógyulása után. Munkám során endogén Cushing-szindrómában szenvedő betegek csontanyagcsere változásait vizsgáltam a betegség aktív stádiumában, illetve a betegség gyógyulását követő 4 éves utánkövetési periódus alatt. A glükokortikoidok szövet szintű szabályozásában a kortizol biológiai hatását közvetítő glükokortikoid receptornak (GR), illetve a sejtek glükokortikoid ellátását biztosító 11βhidroxiszteroid-dehidrogenáz enzimnek (HSD11B) van szerepe. Az endogén és az exogén glükokortikoidok iránti érzékenység nagyfokú egyéni variabilitást mutat, melynek szöveti szintű szabályozását a GR kortizol iránti affinitása és a HSD11B enzim aktivitása határozza meg. Az I-es típusú izoenzim a HSD11B1 a hormonálisan inaktív kortizont hormonálisan aktív kortizollá alakítja át. Az endogén hypercortisolismussal járó állapotok genetikai háttere eddig ismeretlen, ugyanakkor felmerült a GR és a HSD11B1 enzim génjén előforduló genetikai variánsoknak a hypothalamus-hypophysis-mellékvese tengely által közvetített glükokortikoid aktivitást módosító hatása. Munkámban a GR és a HSD11B1 enzim génjén található - korábbi irodalmi adatok alapján a glükokortikoid érzékenységet befolyásoló
-
genetikai
eltéréseknek
a
hypercortisolismusban szenvedő betegekben.
7
jelentőségét
vizsgáltam
endogén
2. IRODALMI ÁTTEKINTÉS 2.1. Cushing-kór és adrenális Cushing-szindróma A mellékvesekéreg-hormonok tartós túltermelése vagy exogén glükokortikoidok tartós alkalmazása jellegzetes klinikai tünetek kialakulásához vezet. Az endogén hypercortisolismus 70%-ban adrenocorticotrop hormon (ACTH)-termelő hypophysis adenoma, míg további 15-15%-ban mellékvese eredetű illetve ectopiás ACTH túltermelés miatt kialakuló Cushing-szindróma következtében jön létre. A szintetikus glükokortikoidok számos betegcsoportban történő kiterjedt alkalmazásának köszönhetően az endogén hypercortisolismus mellett napjainkban előtérbe került a iatrogén Cushing- szindróma. 1932-ben Harvey W. Cushing írta le a hypophysis basophil adenomája által kiváltott kórképet (1). A Cushing-kór kialakulásáért leggyakrabban hypophysis corticotrop adenoma, ritkább esetben a fokozott hypothalamicus CRH túltermelés következtében kialakuló corticotrop hyperplasia tehető felelőssé. A betegség előfordulása ritka; a hypophysis elváltozás miatt létrejövő kórkép incidenciája európai epidemiológiai adatok szerint 2,4/millió/év, prevalenciája 39/millió. Nőkben 3-8-szor gyakoribb a megjelenése, mint férfiakban és leginkább a 25-45. év közötti korosztály érintett. A mellékvese adenoma vagy carcinoma következtében kialakuló klinikai tünetegyüttes az adrenális Cushingszindróma elnevezést kapta. A betegség becsült incidenciája 3,5/millió/év; 3-4-szer gyakrabban fordul elő nőkben, mint férfiakban. Az ectopiás Cushing-szindróma olyan ACTH-dependens endogén hypercortisolismus, melyet ectopiás ACTH- és/vagy CRHtermelő daganat okoz. Az esetek számottevő részében ismert malignus daganatban – leggyakrabban tüdőcarcinómában – szenvedő betegekben fordul elő. Az összes ACTHdependens Cushing-szindróma kialakulásáért mintegy 15-20%-ban paraneoplasticus Cushing-szindróma tehető felelőssé. Az endogén hypercortisolismus következtében kifejlődő klinikai tüneteket a betegség etiológiája nagy mértékben befolyásolja, így bizonyos domináló tünetek alapján a kór eredete valószínűsíthető. A sok szervrendszerre kiterjedő kórkép elsősorban szénhidrát-, zsír- és fehérje anyagcsere változásokat, valamint izom-, ideg- és immunrendszeri
8
eltéréseket eredményez. A Cushing-kór legkorábbi és leggyakoribb tünete a centrális elhízás. A felszaporodott zsírszövet eloszlását tekintve elsősorban a hasi zsigerekben és a mediastinumban, illetve az arc és a nyak bőr alatti kötőszövetében figyelhetünk meg fokozott zsírlerakódást. Ez eredményezi a betegek jellegzetes küllemét: kerek arc (holdvilág arc), kitöltött supraclavicularis árok, vastag nyak, valamint a cervicodorsalis régió párnaszerű zsírfelrakódása (háti zsírpúp). A törzsi elhízás mellett a végtagi izomzat sorvad, a végtagok vékonyabbá válnak. Elsősorban a törzs közeli izomzat gyengül, a distalis izomerő viszonylag megtartott marad. A subcutan zsírszövet csökkenése következtében a bőr elvékonyodik, sérülékennyé válik, ezért bevérzések láthatóak. Az elvékonyodott bőr miatt az erek áttűnőek lesznek, a polyglobulia pedig plethorás küllem kialakulását okozza, amely az arcon a legkifejezettebb. Elsősorban a törzsön széles (>1 cm) livid striák jelennek meg. Az ACTH által stimulált magasabb androgén szint miatt nőkben gyakran enyhe hirsutismus, ritkán virilis típusú hajhullás alakul ki. Az arcon acnék figyelhetőek meg. Menstruációs zavarok, amenorrhea, infertilitás jelenhet meg. Gyakran alakulnak ki gombás fertőzések, melyet a fokozott infekció hajlam okoz, a bőr sérülései pedig gyakran elfertőződnek és lassan gyógyulnak a kortizol immunszuppresszív, illetve kollagén szintézis gátló hatása miatt. Az ACTH-prekurzor proopiomelanocortin fragmenseinek tartósan magas szintje a bőrpigmentáció fokozódását eredményezi. Gyakoriak a pszichés eltérések, elsősorban affektív kórképek. A fokozott kortizol termelés a mineralocorticoid receptorok aktiválásán keresztül hypertonia, súlyos hypokalaemia, ritkább esetben oedema kialakulásához vezet. Az endogén hypercortisolismus különböző társbetegségek megjelenését eredményezi; osteoporosis, diabetes mellitus (DM), kóros glükóz tolerancia (IGT), illetve különböző lipidanyagcsere zavarok gyakori szövődményei a kórképnek. Az adrenális Cushing-szindróma klinikai tünetei a Cushing-kórhoz hasonlóak, de a szupprimált plazma ACTH-prekurzor szintek miatt hyperpigmentatió nem alakul ki. A kortizol-termelő mellékvese daganatok egy része androgén-hormonokat is termel. Ha mellékvesekéreg adenoma okozza a betegséget, a panaszok lassan és fokozatosan jelennek meg. Amennyiben carcinoma áll a betegség kialakulásának hátterében, akkor a tünetek gyorsan progrediálnak. A daganat gyors növekedése és felismerésekor már kialakult nagy mérete miatt az endogén hypercortisolismus általános tünetei mellett, hasi vagy deréktáji
9
fájdalom, fogyás és egyéb, rosszindulatú daganat okozta általános tünetek is megjelenhetnek Az ectopiás Cushing-szindróma típusos eseteiben a klinikai tünetek rendszerint hirtelen alakulnak ki és rövid idő alatt súlyossá válnak. Az igen magas plazma ACTH szint gyorsan progrediáló hyperpigmentációt okoz és a plazma kortizol szint gyakran kifejezetten magas. A klinikai tüneteket a metabolikus eltérések jellemzik, valamint a mineralcorticoid receptorok kortizol általi aktivitásával függenek össze. A carcinoid szöveti szerkezetet mutató tumorok esetén a klinikai tünetek megjelenésekor a beteg anamnézisében nem szerepel daganatos megbetegedés és a tünetek kialakulásának dinamikája megegyezik a Cushing-kór kialakulásának dinamikájával. (1. táblázat, 1. ábra). 1. táblázat A Cushing-szindróma tüneteinek relatív gyakorisága.
1. ábra Cushing-szindrómás beteg Abdominális obezitás és széles alapú livid striák Cushing-szindrómás betegen.
10
A diagnózis felállításához első lépésben a hypercortisolismust jelenlétét kell bizonyítani, majd ezt követően kerülhet sor az etiológiai diagnózishoz szükséges hormontesztek alkalmazására. Az emelkedett kortizol szint kimutatásához különböző laboratóriumi vizsgálatok állnak rendelkezésre: reggeli és éjféli szérum kortizol szint meghatározás, a vizelet szabad kortizol szintjének vizsgálata (UFC), a kis dózisú dexamethason (dxm) szupressziós teszt, valamint a szérum kortizol napszaki ritmusának meghatározása. Napjainkban a rutin laboratóriumi szűrési módszerek között már a nyál kortizol koncentrációjának meghatározása is előtérbe került. Az UFC és a nyál kortizol vizsgálat alapján a biológiailag aktív, fehérjéhez nem kötött kortizol mennyiségéről kapunk információt. Az UFC meghatározásához egymás után több alkalommal 24 órás vizelet gyűjtésére van szükség. A kis dózisú dxm tesztnek kétféle változata ismert. A standard 2 napos teszt (Liddle teszt) során 2 napon keresztül 6 óránként 0,5 mg dxm-t adunk és közben plazma kortizol és UFC meghatározást végzünk. A rövid (overnight) teszt alkalmazása során a beteg 1 mg dxm-t kap éjfélkor és a másnap reggel 8 órakor levett vérmintából történik a hormonszint meghatározás. Egészséges személyeknél a beadott dxm hatására jelentősen csökken a kortizol termelés, míg hypercortisolismusban szenvedő betegeknél ez a szuppresszió nem figyelhető meg; a Cushing-kór lehetősége nagy valószínűséggel kizárható, ha a szérum kortizol szint 2 μg/dl alá csökken. Emellett a szérum kortizol elválasztás fiziológiás napszaki ritmusa is megszűnik. A következő lépés a betegség etiológiájának tisztázása. Az ACTH-dependens és az ACTH-independens
Cushing-szindróma
elkülönítése
a
plazma
ACTH
szint
meghatározásával történik. Mellékvesekéreg eredetű Cushing-szindrómában a plazma ACTH szint kisebb, mint 10 pg/ml, míg Cushing-kórban és ectopiás ACTH-szindrómában ennél magasabb. A két utóbb említett betegség elkülönítésére ajánlott a nagy dózisú dxm teszt.
Hypophysis
adenomában
a
corticotrop
sejtek
részlegesen
megőrzik
a
glükokortikoidok gátló hatása iránti érzékenységüket, míg mellékvese eredetű és ectopiás Cushing-szindrómában nagy dózisú glükokortikoid sem csökkenti az endogén kortizol szekréciót. A kis dózisú dxm teszthez hasonlóan szintén standard tesztet (2 napon keresztül 6 óránként 2 mg dxm) és overnight tesztet (éjjel 8 mg dxm, majd másnap reggel 8 órakor vérvétel plazma kortizol
meghatározásra) alkalmazhatunk.
11
Az ACTH-dependens
hypercortisolismus hypophyser vagy ektópiás eredetének eldöntésére napjainkban a legpontosabb módszer a sinus petrosus inferiorok katéterezése. Mindkét oldali sinus petrosus inferiorba katétert vezetnek. Ezekből, valamint egy perifériás vénából vett vérmintákból ACTH-t határozunk meg. A vérvételeket CRH beadása után is megismétlik. Az azonos időpontban nyert vérminták ACTH-koncentrációiból kiszámolható a centrális/perifériás ACTH hányados. A betegségek elkülönítéséhez segítséget nyújthat még a plazma dehydroepiandroszteron-szulfát koncentráció meghatározása, a metyrapon teszt, a CRH teszt, a vazopresszin teszt, és a desmopressin teszt. Cushing-kór gyanúja esetén a képalkotó vizsgálatok közül a sella MR a leginformatívabb, bár a leggyakrabban előforduló mikroadenomák az esetek csaknem felében így sem ábrázolhatók. Adrenális Cushingszindróma esetében a mellékvesék morfológiai vizsgálatához CT-t vagy MRI-t használunk. A betegség kezelése során a Cushing-kóros betegek 80%-ában gyógyulást eredményez az adenoma transsphenoidalis hypophysis műtéttel történő eltávolítása. Sikeres műtét után a plazma kortizol és ACTH szint gyorsan csökken és hypadrenia tünetei jelentkezhetnek, ezért a legtöbb, sikeresen operált beteg esetében átmeneti - és a kontrollvizsgálatok eredményétől függően fokozatosan leépítendő - glükokortikoid szubsztitúciós kezelésre van szükség. Adrenális Cushing-szindrómában nyílt vagy laparoscopos adrenalectomiát végeznek. Sikeres műtét után a kortizol túltermelés azonnal megszűnik. Az ellenoldali, nem tumoros mellékvese a műtét előtti tartósan magas kortizol szint következtében atrophizálhat, így ezekben a betegekben is számolni kell hypadrenia kialakulásával, mely glükokortikoid pótlást tehet szükségessé. Amennyiben a műtét valamilyen oknál fogva kontraindikált, vagy nem eredményezi a kortizol szint normál tartományba való visszatérését, a tünetek enyhítésére szteroid bioszintézis gátló kezelés alkalmazható (mitotan, metopyron, aminoglutethimid, ketokonazol, etomidat, trilostan, mifepriston) (2-5). 2.2. A glükokortikoidok csontszövetre kifejtett hatása Az endogén és az exogén glükokortikoidok tartósan emelkedett szintje jellegzetes klinikai tünetek kialakulásához vezet, mely a csontszövet tekintetében a csontok ásványi
12
anyag tartalmának csökkenésében és fokozott törékenyéségében nyilvánul meg. Az endogén hypercortisolismus ACTH-termelő hypophysis adenoma és mellékvese eredetű illetve, ectopiás ACTH túltermelés miatt kialakuló Cushing-szindróma következtében jön létre. Ugyanakkor napjainkra a szintetikus glükokortikoidok számos betegcsoportban történő kiterjedt alkalmazásának köszönhetően az endogén hypercortisolismus mellett előtérbe
került
a
iatrogén
Cushing-szindróma
(6).
Ezen
állapotokat
kísérő
csontbetegségeket nevezzük összefoglalóan glükokortikoid indukált osteoporosisnak. Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben a csonttörési rizikó 30-50%-al nagyobb mint az egészséges populációban megfigyelt törési rizikó, míg az osteoporosis incidenciája ezekben a betegekben eléri az 50%-ot. Tartós szteroid terápiában részesülő betegek csonttörési rizikója szintén 30-50%-al nagyobb az egészséges populációban észlelt rizikóhoz viszonyítva. A csontvesztés mértéke függ az alkalmazott kezelés dózisától, illetve a kezelés időtartamától. A legújabb epidemiológiai adatok szerint tartós kezelés esetén már napi 2,5-7,5 mg prednisolon 3-6 hónapon keresztül növeli a csontritkulás kialakulásának esélyét és a csonttörések gyakoriságát (7). Az emelkedett kortizol szint csontkárosító hatása többféle mechanizmuson keresztül érvényesül. Célszerűnek látszik megkülönböztetni a csontszövetre kifejtett direkt, valamint az egyéb szövetekre, szervekre gyakorolt, de áttételesen a csontszövet működését is befolyásoló indirekt hatásokat (8). A glükokortikoid effektus intenzitása -azaz a betegség súlyossága, illetve az exogén glükokortikoid dózisa- mellett a glükokortikoid hatás időtartamának (rövid ideig tartó, illetve krónikus glükokortikoid túlsúly) is jelentősége van. Az indirekt hatásokért elsősorban a bélrendszerben és a vesében végbemenő kórélettani folyamatok, valamint a hormonháztartásban bekövetkező változások tehetők felelőssé. Glükokortikoidok hatására csökken a bélben a kálcium-felszívódás - feltehetőleg a kialakult D-vitamin rezisztencia miatt -, illetve ezzel párhuzamosan csökken a vesékben a kálcium tubularis reabszorpciója. Elsősorban az így létrejött negatív kálcium-egyensúly következményének tekintik a szekunder hyperparathyreosis kialakulását, bár néhány vizsgálatban nem találtak összefüggést a kortizol és az emelkedett parathormon szintek között (8). Ugyanakkor kimutatták, hogy a glükokortikoidok in vitro körülmények között a parathormon szekréciót fokozzák, illetve képesek a parathormon iránti érzékenységét
13
befolyásolni az osteoblast és osteoclast sejteken (9). A csontkárosító hatást tekintve kóroki tényezőként szerepel még a glükokortikoidoknak a csont metabolizmust befolyásoló hormonokra kifejtett hatása. A fokozott glükortikoid hatás következtében csökkenő gonadotropin szekréció a szexuálszteroidok szintjének csökkenésében nyilvánul meg. Ismert, hogy az androgének és az ösztrogének gátolják az osteoclastogenesist lokálisan stimuláló faktorokat, így a csökkent androgén és ösztrogén koncentráció önmagában az osteoclast aktivitás fokozódását eredményezi (9). Emellett a glükokortikoidok a növekedési hormon-inzulinszerű növekedési faktor I (GH - IGF-1) tengely szabályozásában is részt vesznek; a megváltozott szomatosztatin egyensúlyon keresztül csökkentik a GH szekréciót, illetve gátolják az osteoblastokban az IGF-1 transzkripciót (8). A glükortikoidoknak az osteoblastokra kifejtett direkt hatása a sejtek proliferációs és metabolikus aktivitásának változásában nyilvánul meg (9). Az irodalmi adatok alapján mind az akut, mind a krónikus glükokortikoid túlsúly gátolja az osteoblastos aktivitást. A túlzott glükokortikoid hatás következtében az osteoblast sejteken fokozott apoptosis, csökkent proliferáció és csökkent differenciálódás jön létre. Az osteoblastok a csontvelői pluripotens őssejtekből differenciálódnak. A mesenchymalis őssejtek elköteleződésének folyamatában kiemelkedő szerepet játszik a core binding transzkripciós faktor 1 (CBFA1), mely a preosteoblastokban elindítja és szabályozza az éréshez és a normális osteoblastaktivitáshoz szükséges gének átírását. A CBFA1 gén transzkripcióját a csont morfogenetikus proteinjei (BMP2, BMP4) serkentik. Emelkedett glükokortikoid szint hatására a BMP-2-szint csökkenése és a peroxiszóma-proliferátor-aktivált-receptor-gamma2 (PPAR-γ2), illetve a CCAAT/enhancer kötő fehérje β (C/EBPβ) szint fokozódása révén az osteoblast prekurzorok differenciálódása elmarad, vagy a mesenchymalis őssejtek differenciálódása az adipocyta-képződés irányába tolódik el (6, 10, 11). A preosteoblastok érésének és a csontképzéshez szükséges fehérjék termelésének a legfontosabb serkentői az interleukin-1 (IL-1), az IGF-1, a tumornekrózis-faktor-α (TNF-α) és a transzformáló növekedési faktor-β (TGF-β). Ezen citokineknek és faktoroknak csökkent aktivitását mutatták ki számos tanulmányban fokozott glükokortikoid hatás mellett (6, 8, 9). A legújabb kutatások szerint a Wnt/β-catenin jelátviteli rendszer kulcsfontosságú az osteoblastok érési folyamatainak szabályozásában. A jelátviteli útvonal egyik legfontosabb
14
lépését a β-catenin foszforilációja képezi. A Wnt fehérje specifikus receptor komplexhez kötődve (frizzled és alacsony sűrűségű lipoprotein receptor-related protein LRP5, LRP6) a glikogén szintetáz kináz-3 β (GSK-3β) gátlásán keresztül megakadályozza a β-catenin bomlását, illetve elősegíti a β-catenin sejtmagba történő transzlokációját. A sejtmagba bekerült β-catenin transzkripciós faktorokhoz kötődve képes bizonyos célgének expresszióját szabályozni. Wnt fehérje hiányában a GSK-3β gátlása nem jön létre, melynek következtében a β-catenin foszforilálódik és az APC fehérjék által szabályozott mechanizmus útján lebomlik. A Wnt intracelluláris útvonal egyik legfontosabb gátlója a Dickkopf fehérje, mely a Wnt fehérje-receptorkomplex kötődését akadályozza meg. A glükokortikoidok fokozzák a Dickkopf fehérje expresszióját, mely a β-catenin fokozott lebomlásán keresztül gátolja az osteoblastok érési folyamatait (8, 10, 12). A glükokortikoidok csont reszorpciót fokozó hatása részben az osteoblastok közvetítésével, részben pedig az osteoclastokra gyakorolt direkt hatás révén valósul meg, a sejteken megfigyelhető csökkent apoptózis, illetve fokozott osteoclastos differenciáció következményeként (8). Akutan, nagy dózisban alkalmazott glükokortikoid hatására emelkedik, majd a 8. naptól csökken a szérum CTX (13). Krónikus glükokortikoid túltermelés -endogén Cushing-szindróma- esetén a csont-reszorpció vonatkozásában az irodalmi adatok messze nem egybehangzóak, normális (14-17), csökkent (15, 18, 19) és emelkedett (20-22). Az osteoclastok nagy, sokmagvú, a monocyta-macrophag közös őssejtből származó sejtek. Érési folyamatukban és működésük szabályozásában számos tényező játszik fontos szerepet, melyek közül kiemelt jelentőségük van az osteoblastok által termelt faktoroknak. Az osteoblastok a mesenchymalis őssejtből indulnak fejlődésnek a BMP hatására. Ezek indítják be a CBFA-1 gént, mely a normális csontképzéshez nélkülözhetetlen. A CBFA-1 fehérje indukálja az NF-κB receptor aktivátor molekula ligandjának (RANKL) a termelődését az osteoblastokban. A RANKL a hematopoietikus őssejtek NF-κB receptor aktivátor molekula (RANK) receptorához kapcsolódva azokat osteoclast irányú differenciálódásra, az érett osteoclastokat pedig aktív csontbontásra készteti. Mindez arra utal, hogy az osteoclast képzéshez nélkülözhetetlen az osteoblastok jelenléte. A szabályozás másik fontos eleme a szintén az osteoblastok által termelt osteoprotegerin (OPG).
15
Csontvédő hatását azáltal fejti ki, hogy a RANKL-ot a RANK receptorhoz hasonlóan megköti, így a RANKL csontbontást elősegítő hatása megszűnik. Glükokortikoid hatására nő a RANKL és csökken az OPG termelődése, melynek következtében a normális csontműködéshez szükséges RANKL/OPG arány megváltozik és fokozott csontbontás jön létre.
A
RANKL/OPG
rendszer
mellett
a
glükokortikoidok
egyéb
jelátviteli
mechanizmusokon, lokálisan termelődő citokineken és növekedési faktorokon keresztül is képesek befolyásolni a csontbontó sejtek működösét: fokozzák a makrofág kolónia stimuláló faktort (M-CSF), mely az osteoclastok differenciálódását segíti elő, illetve gátolják az interferon-β (IFN-β) termelődését, mely a RANKL útvonal egyik legfontosabb gátló eleme (2. ábra) (6, 8, 10, 23).
2. ábra A glükokortikoidok osteoblast és osteoclast sejtekre kifejtett hatása Piros nyilak a glükokortikoid hatást jelzik. BMP-2: csont morfogenetikus protein-2; CBFA1: core binding faktor alfa 1; RANK: nukleáris-faktor-κB receptor aktivátor molekula; RANKL: nukleárisfaktor-κB receptor aktivátor molekula ligandja; OPG: oszteoprotegerin; M-CSF: makrofág kolónia stimuláló faktor Forrás: Orvosi patobiokémia (130)
A csontsejtek harmadik csoportját képező sejtek, az osteocyták, az osteoblastokból keletkeznek. Bár működésük minden részleten még nem tisztázott, a funkciójukra
16
vonatkozó számos teória közül a legelfogadottabb, hogy a mechanikai ingereket biokémiai jelekké
alakítják
át
(mechanoreceptor-funkció),
részt
vesznek
a microfrakturák
felismerésében és fontos szerepet töltenek be a csontátépülés folyamatának beindításában. A mechanikai ingereket érzékelve nitrogén-monoxidot, prosztaglandinokat és IGF-1-et termelnek, amelyeken keresztül képesek befolyásolni az osteoblastok és osteoclastok működését. Emellett többféle, a csontszövet működését szabályozó jelátviteli folyamatot is képesek szabályozni (Wnt/β-catenin, RANKL). A glükokortikoidok - a sejthalál molekuláris szintű szabályozásában szerepet játszó caspase-3 enzimen keresztül - az osteoblastok apoptosisát fokozzák, aminek eredményeként csökken a csontformáció (6, 7, 10, 24). 2.3. A glükokortikoid receptor 2.3.1. A glükokortikoid receptor működése és izoformái Az emberi szervezetben a GR többféle izoformája ismert, amelyek a különböző szövetekben változatos transzkripciós aktivitással rendelkeznek és különböző cél-génekre fejtik ki hatásukat. Alternatív splicing útján képződő számos izoforma közül a GRα és GRβ izoformák működéséről és klinikai jelentőségéről áll rendelkezésünkre a legtöbb irodalmi adat. Ezen izoformák esetében az 1-727 aminósav szakasz azonos, míg a 9-es exonnak megfelelő karboxi-terminális szakasz különböző. A 777 aminosavból álló GRα a hormonhatás közvetítéséért felelős, ezzel szemben a 742 aminosavból álló GRβ izoforma nem rendelkezik hormon-kötő és géntranszkripciót aktiváló képességgel (25, 26). A GRβ expresszióját számos szövetben kimutatták; immuncitokémiai vizsgálatok alapján a receptor megtalálható a tüdőben, a thymusban, lymphocytákban, a vesében, a májban, az agy számos regiójában, a myocardiumban és a harántcsíkolt izmokban. Az expresszió a máj epithéliális sejtjeiben, a thymusban és a tüdőben volt a legkifejezettebb és bizonyos szövetekben nagyobb mennyiségben volt kimutatható, mint a GRα. Irodalmi adatok szerint a GRβ domináns negatív hatást fejt ki az aktív GRα működésére, melynek pontos molekuláris mechanizmusa mindezidáig ismeretlen (27, 28). Yudt és munkatársai a
17
β izoforma hatásáért az alábbi molekuláris tényezőket tartják felelősnek: (1) a domináns negatív hatás kialakításában a GRβ-ra jellemző utolsó 15 aminosav, ezen belül is főként 2 aminosav játszik fontos szerepet; (2) a GRβ nukleáris lokalizációja és a GRα/β heterodimer képződése a negatív hatás fontos eleme; (3) a GRα karboxi-terminális végén található 12. hélix szintén szerepet játszhat a negatív hatás közvetítésében, hiánya miatt a receptor képtelenné válik a ligand kötésére és a génátíródás aktiválására (29). A GRβ-nak bizonyos kórfolyamatokban betöltött lehetséges patofiziológiai szerepét is számos vizsgálat alátámasztja. Gyulladásos állapotokban fokozott GRβ expressziót mutattak ki, valamint rheumatoid arthritises betegekben egy a GRβ mRNS-t stabilizáló és GRβ fehérje mennyiségét növelő polimorfizmus gyakoribb előfordulását figyelték meg (30-32). Megállapították, hogy bizonyos citokinek, mint az IL-2, IL-4, IL-1, IL-8, illetve a TNFα a GRβ expresszióját növelik (31). 2.3.2. A glükokortikoid receptor génje és fehérje szerkezete A GR gén (génazonosító: NR3C1, GenBank accession number: NM_000176, AY436590, NT_029289) az 5. kromoszóma 5q31-es szakaszán helyezkedik el. A receptor génjét Hollenberg és munkatársai klónozták 1985-ben (33), szerkezetét pedig Encio és munkatársai írták le 1991-ben (34). A receptor génje 9 exonból áll, a fehérje kódoló rész a 2-es exonon kezdődik. A 2-es exon kódolja az első transzaktivációs domént, a 3-4. exonok a két cink-ujjat és a DNS kötő domén többi részét, az 5. exontól kezdődően pedig a ligandkötő domén található (34). A humán GR mRNS-ben legalább 3 különböző promótert írtak le (1A, 1B, 1C). A transzkripciós faktorok kötődésére szolgáló specifikus szekvenciák közül a receptor génjének promóter régiójában több GC-box található, ami az SP-1 transzkripciós faktor kötődését teszi lehetővé, míg TATA- és CAAT-box nincs jelen. Ugyanakkor a -2300 bp-tól kezdődő promóter régió számos transzkripciós faktor számára biztosít kötőhelyet: Sp1, AP-1, NFkB és GR (31). A GR a nukleáris hormonreceptor család tagja. Szerkezete megegyezik ennek a receptor családnak a szerkezeti sajátosságaival: aminó-terminális részét egy nem homológ, változó méretű immunogén domén alkotja, a középső DNS-kötő szakasz 60-70
18
aminósavból áll, míg a karboxi-terminális végén egy kb. 250 aminósavat tartalmazó ligandkötő szakasz található. Ligand nélküli, inaktív állapotban a GR a citoszolban helyezkedik el heterooligomert képezve többféle fehérjével (hsp90, hsp70, hsp56, hsp40, immunophilin p59, calreticulin). A ligand kötődése után a receptoron létrejövő konformációs változások hatására a receptor leválik a hősokk-fehérjékről és mint homodimer a sejtmagba vándorol. Itt transzkripciós faktorokkal, illetve a genom glükokortikoid-érzékeny elemeivel (glucocorticoid response element) lép kölcsönhatásba és közvetlenül, vagy más faktorok kapcsolódását befolyásolva serkenti, vagy gátolja a cél gének transzkripcióját (31). A glükokortikoidok egyes hatásai a klasszikus genomiális mehanizmussal nem magyarázhatóak. A szteroid-terápiára adott bizonyos válaszreakciók ugyanis már másodperceken-perceken belül jelentkeznek, a géntranszkripció befolyásolásán keresztül megvalósuló genomiális hatás kialakulásához pedig legalább 30 percre van szükség. A néhány percen belül bekövetkező nem-genomiális hatást a GR sejtmembránhoz kötött formájával magyarázzák. Feltételezik, hogy a sejtmembránban elhelyezkedő GR a sejtmembránon zajló kation-transzportot, továbbá a mitokondriumokban zajló protonáramlását befolyásolja. A nem-klasszikus glükokortikoid hatás létezését jelző további érvnek tekintik, hogy a prednisolon hatása az egyszeri dózisként adott grammos nagyságrendig növelhető, pedig felnőttekben már 200-300 mg prednisolon megköti az összes citoplazmatikus receptort (9). 2.3.3. A glükokortikoid receptor genetikai variánsai GR génen napjainkig leírt 42 genetikai elváltozás közül, irodalmi adatok szerint elsősorban négy polimorfizmus hozható összefüggésbe a glükokortikoidok iránti érzékenység különbözőségével. A BclI-es (C>G) polimorfizmus a 2. és 3. exon között elhelyezkedő, fehérjét nem kódoló, intronikus régióban található. Az N363S, illetve az ER22/23EK variáns fehérjét kódoló szakaszon helyezkedik el, a 2. exonon. Mindkét polimorfizmus esetében a nukleotid csere aminósav cserét hoz létre. Az N363S (1220 A>G) polimorfizmus jelenléte aszparagin → szerin cserét eredményez, míg az ER22/23EK
19
(198G>A és 200 G>A) variáns esetében a két együtt előforduló nukleotid-csere eredményez aminósav változást (glutamin → glutamin, arginin → lizin). A GRß splice variánson található A3669G (A>G) polimorfizmus a transzkripció szempontjából fontos intronikus régióban található (26). A BclI polimorfizmus (rs41423247) irodalmi adatok szerint a glükokortikoidok iránti érzékenységet fokozza. A polimorfizmust homozigóta formában hordozó egyénekben a budesonid iránt fokozott érzékenységet figyeltek meg (35), míg egy másik vizsgálatban a G allél jelenléte dxm iránti fokozott érzékenységgel mutatott összefüggést, allél-dózis dependens módon (36). Ugyanakkor felmerült, hogy a polimorfizmus a glükokortikoidok iránti érzékenységet képes szövetspecifikus módon befolyásolni, miután in vitro vizsgálatokban
a
polimorf
allélt
homozigóta
formában
hordozó
személyek
fehérvérsejtjeiben a dxm iránti affinitás és érzékenység növekedését nem sikerült igazolni (35). Emellett a polimorfizmus hordozása összefüggést mutatott elhízott egyénekben a hyperinsulinaemiával és az inzulin rezisztenciával (37), a magasabb plazma kortizol szinttel (38), az emelkedett koleszterinszinttel és az abdominalis zsírlerakódással (39-41), a metabolikus változásokkal (42), a pszihoszociális stresszre adott fokozott adrenocorticális válaszreakcióval (43), a rheumatoid arthritissel (44), a terhességi szövődményként fellépő HELLP szindrómával (45), illetve a Graves-ophtalmopathiával (46). A BclI-es polimorfizmus molekuláris hatásmechanizmusát tekintve a legelfogadottabb feltételezés, hogy a GR gén transzkripciója során, a promóter régióra kifejtett hatásán keresztül képes befolyásolni a transzkripció folyamatát (40).
Az aminósavcserével járó N363S polimorfizmus (rs56149945) in vivo és in vitro vizsgálatok alapján - a BclI-es polimorfizmushoz hasonlóan - a glükokortikoidok iránti érzékenységet fokozza. Kimutatták, hogy kis adag dxm adását követően a plazma kortizol szint csökkenése szignifikánsan kifejezettebb az N363S polimorfizmust hordozó személyekben, mint a polimorfizmust nem hordozókban (40, 43, 47), míg más vizsgálatban ezt az összefüggést nem tudták igazolni (48). A metabolikus paraméterek vizsgálatával kapcsolatban az N363S polimorfizmus az elhízást jelző nagyobb testtömeg indexszel (BMI) és/vagy a centrális zsírfelszaporodást jelző derék/csípő hányadossal mutatott összefüggést (41, 47, 49, 50-52), valamint a metabolikus szindrómára szintén jellemző
20
magas vérnyomással (41, 47-49, 51, 53). DM esetén nem volt kimutatható összefüggés a polimorfizmus hordozásával (41, 48, 50, 52, 53). Szívkoszorúér betegségben szenvedő betegekben nagyobb szérum koleszterin és triglicerid szinteket és kisebb HDL-koleszterin arányt találtak (51), míg egészséges egyénekben ez nem volt igazolható (41, 48, 53). Korábbi vizsgálatainkban kimutattuk, hogy az N363S polimorfizmus szerepet játszhat a kétoldali mellékvese-adenomák patogenézisében (54). Funkcionális vizsgálatban igazolták az N363S polimorfizmus glükokortikoid érzékenységet fokozó hatását; transzfektált sejteken végzett in vitro és a polimorf allélt hordozó egyének fehérvérsejtjein végzett ex vivo vizsgálatokkal igazolták az N363S megnövekedett transzaktivációs képességét, míg a transzrepressziós képességgel nem találtak összefüggést (55). Ellentétben az előbbiekben bemutatott két GR gén polimorfizmussal, az ER22/23EK genetikai variáns (rs6189-6190) irodalmi adatok alapján a glükokortikoidok iránti érzékenységet csökkenti. A polimorfizmust hordozó egyénekben dxm adását követően kisebb mértékű plazma kortizol szint csökkenést mutattak ki (56, 57). Az eddig megjelent, a polimorfizmus klinikai összefüggéseit vizsgáló tanulmányok alapján úgy tűnik, hogy a ER22/23EK jelenléte kedvezőbb metabolikus állapotot eredményez: a polimorf allélt hordozó egészséges idős egyénekben kisebb éhomi vércukor-, inzulin- és koleszterin szintet, valamint kisebb LDL-koleszterin arányt mutattak ki (40, 57). Fiatal férfiakban a polimorfizmus hordozása nagyobb izomerővel és testmagassággal mutatott összefüggést, míg idős férfiakban hosszabb túlélést figyeltek meg (48, 59). Ugyanakkor a BMI értékkel, a derék/csípő hányadossal, illetve a DM vagy a hypertonia előfordulásával a polimorfizmus nem mutatott összefüggést (57-59). A polimorfizmus molekuláris hatásmechanizmusát ER22/23EK variánssal transzfektált sejteken végezett in vitro, illetve az ER22/23EK polimorfizmust hordozó egyének fehérvérsejtjein végzett ex vivo kísérletekkel vizsgálták. A kutatás során a GR csökkent transzaktivációs képességét mutatták ki, míg a transzrepressziós képességgel nem találtak összefüggést (55). A GRß splice variánson található A3669G polimorfizmus (rs6198) a GRβ mRNS-t stabilizálja és GRβ fehérje mennyiségét növeli (32). Ex vivo vizsgálatban kimutatták, hogy a polimorfizmus csökkenti a transzrepressziós képességet, míg a transzaktivációs képességét nem befolyásolja (60). Populációs genetikai kutatás kapcsán az A3669G variáns
21
összefüggést mutatott rheumatoid arthritissel, míg egy másik vizsgálatban a polimorf allél jelenlétét csökkent centrális elhízással és kedvezőbb lipid profillal hozták összefüggésbe (61, 62). Ez utóbbi alátámasztja az eddigi kutatási eredményeket, miszerint az A3669G variáns a glükokortikoidok iránti érzékenységet csökkenti. Feltételezik, hogy a polimorfizmus jelenléte esetén - fokozott a GRβ expresszió miatt - a GRα transzkripcionális aktivitása csökken (62) (3. ábra).
3. ábra Glükokortikoid receptor gén polimorfizmusok és allél gyakoriságuk. Az N363S polimorfizmus (1220A>G) esetében a nukleotid csere aminosav cserét hoz létre. A BclIes polimorfizmus esetében a citozin guanin csere (C>G) aminósav cserét nem okoz. Az ER22/23EK (198G>A és 200G>A) esetében a két, együtt előforduló nukleotid-csere eredményez aminósav változást. Az A3669G polimorfizmus esetében adenin guanin csere jön létre (A>G).
2.4. A 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim 2.4.1. A 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim izoformái és működése
22
A természetes kortikoszteroidok biológiai aktivitásáért a 21 szénatomos szteránvázukban található szerkezeti sajátosságok felelősek. A biológiailag aktív kortizol, illetve kortikoszteron szerkezetében a C11-helyen hidroxilcsoportot (C11-OH) figyelhetünk meg, míg az inaktív kortizon és a 11-dehydrokortikoszteron ugyanezen a helyen egy ketocsoportot (C11=O) tartalmaz (63). A glükokortikoid aktivitás szövet szintű szabályozását a HSD11B enzim két izoenzimje biztosítja; az 1-es típusú reduktáz aktivitással rendelkező HSD11B1 a hormonálisan inaktív kortizont hormonálisan aktív kortizollá alakítja át, míg a 2-es típusú izoenzim a HSD11B2 dehidrogenáz aktivitása révén a kortizol inaktiválását végzi (64-66) (4. ábra).
4. ábra A 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz izoenzimek működése. HSD11B1: 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz; HSD11B2: 2-es típusú 11βhidroxiszteroid-dehidrogenáz
A HSD11B izoenzimek a rövid láncú dehidrogenáz/reduktáz enzimcsalád tagjai. Ez napjaink egyik legnépesebb enzimcsaládja, csaknem 3000 tagja ismert. Minden tagjában konzervált régió a nukleotid kötőhely, a kofaktor kötőhely és az aktív centrum. Az enzim a nukleotid kötőhely GXXXGXG szekvenciája miatt specifikus nikotinamid-adenozindinukleotid-foszfátra (NADPH). A kofaktorkötőhely másodlagos szerkezete α-hélixek, és β-redők meghatározott sorrendjéből épül fel, az ún. Rossmann-zsebet alkotva. Az aktív centrum primer szerkezetére nagy mennyiségű tirozin, lizin és szerin előfordulása jellemző (65, 67). A HSD11B1 enzim az endoplazmás retikulumban (ER) való elhelyezkedése alapján három részre osztható; egy rövid, öt aminosavból álló régió a citoszolban található, ezt követi a transzmembrán szakasz, majd az enzim legnagyobb része, a katalitikus domén
23
az ER lumenében helyezkedik el. Az N-terminális régió a citoplazma felé, a C-terminális régió az ER lumene felé néz (68). Több bizonyíték utal arra, hogy a HSD11B1 enzim intakt sejtekben reduktázként működik és a kortizol aktiválását végzi, ugyanakkor a sejtekből történő kivonás után dehidrogenáz aktivitással rendelkezik és a kortizol inaktiválásáért felelős (65). Úgy tűnik, hogy az enzim ezen működésbeli különbsége az intakt és a homogenizált sejtek között, a hexóz-6-foszfát dehidrogenáz (H6PDH) jelenlétével függ össze. A mikroszómákban jelen lévő H6PDH feladata a redukált NADPH képzése, amely a szintén mikroszómális lokalizációjú HSD11B1 izoenzim működéséhez kofaktorként szolgál (64, 65) (5. ábra).
5. ábra Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim sejten belüli működése. G6P: glükóz-6-foszfát; 6PG: 6-foszfoglikonát; NADP: nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát; NADPH: nikotinsavamid-adenin-dinukleotid-foszfát-oxidáz; H6PDH: hexóz-6-foszfát dehidrogenáz; HSD11B1: 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz
A HSD11B1 enzim expressziójának szabályozásában számos tényező játszik fontos szerepet. Glükokortikoidok, C/EBP, PPARγ és néhány proinflamatorikus citokin (TNFα, IL-1β) az enzim expresszióját növelik, míg az IGF-1-en keresztül a GH, illetve a májban található aktivált X-receptor az enzim expresszióját csökkentik. Egyéb faktorok (szexuálszteroidok, inzulin, trijódthyronin) esetében az expresszióra kifejtett hatás nem
24
egységes: a különböző szövetek, illetve fajok között az enzim működésére kifejtett hatásuk változó (65). A HSD11B1 enzim elsősorban a glükokortikoidok célszöveteiben expresszálódik; legnagyobb mennyiségben a májban, a gonádokban, a zsírsejtekben és az agyban figyelhető meg (65). A HSD11B izoenzimek közül a vesében először az 1-es típusú enzim jelenlétét írták le, melynek expressziója humán vizsgálatok szerint a vese velőállományára korlátozódik. A HSD11B1 enzim aktivitását humán vastagbélben, izomszövetben, illetve a tüdő interstitialis fibroblast és II. típusú pneumocytáiban is kimutatták, illetve a bőr legfelső rétegében, az epidermisben is megfigyelhető az enzim expresssziója. A látószervünkben is kimutatták az enzim jelenlétét, mégpedig a csarnokvíz termelését biztosító sugártest nem pigmentált epithelialis sejtjeiben. Mindemellett felmerült az enzim jelentősége a coronaria erek gyulladásos reakcióiban, miután az enzim jelenléte megfigyelhető volt az erek simaizom sejtjeiben, patkány aorta endothelialis sejtjeiben, illetve az endocardium interstitialis fibroblastjaiban. A női reprodukciós rendszer tekintetében a fejlődő oocyta és theca-lutein sejtekben detektálták a HSD11B1 enzim expresszióját. A férfi nemi szervek esetében a here Leydig sejtjeiben, a mellékhere farki részében, az ondóvezeték epitheliumában, az ondóhólyagban, illetve a pars spongiosa urethraeban mutatták ki az enzim jelenlétét. A Sertoli-sejtekben a HSD11B1 nem expresszálódik (65). Egészséges humán hypophysisben, illetve a mellékvese zona reticularis rétegében – elsősorban a corticomedulláris junctióban – is jelen van a HSD11B1 enzim, csakúgy, mint corticotroph és mellékvese adenomákban (69-73). Az enzim nagy mennyiségben expresszálódik a központi idegrendszerben, különösen a hippocampusban, a frontális kéregben és egyéb, a kognitív funkciókban fontos szerepet játszó régiókban. A tartósan magas glükokortikoid szint in vitro és in vivo vizsgálatokban is ártalmasnak bizonyult a neuronokra és a gliasejtekre; HSD11B1 génkiütött egerek kognitív funkciója nem csökkent párhuzamosan az életkorukkal, mint ahogy az fiziológiás körülmények között megfigyelhető (65). A glükokortikoidok serkentik a sejtdifferenciációt és gátolják a sejtproliferációt, így daganatellenes hatásúak. A HSD11B1-et nagy mennyiségben expresszáló sejtek proliferációs aktivitása alacsonyabb, míg a HSD11B2 hatása onkogén (74).
25
A normoglikémia fenntartását illetően a májban a glükokortikoidok az inzulinnal ellentétes hatásúak: fokozzák a glukoneogenesis sebesség meghatározó enzimének, a foszfoenolpiruvát-karboxikináznak az expresszióját. A HSD11B1 az emberi májsejtekben a v. centrális körül található legnagyobb mennyiségben (65). Az enzim szelektív gátlásával bizonyították, hogy a csökkent glükokortikoid koncentráció a hepatocyták megnövekedett inzulinérzékenységéhez vezet (75). Ugyanakkor a májszövetben található HSD11B1 enzimet felülexpresszáló transzgén egéren zsírmáj, hypertonia és inzulinrezisztencia fejlődik ki (76). A glükokortikoidok zsírszövetre kifejtett hatása többféle módon nyilvánulhat meg: az emelkedett kortizol szint növeli a zsírsejtek méretét, a preadipocyták érésének serkentése révén növeli a sejtek számát, valamint aktiválja a lipolízist, ami által szabad zsírsavakat juttat a keringésbe (77). Preadipocytákban a HSD11B1 enzim dehidrogenáz aktivitását figyelték meg, míg a kifejlett zsírsejtekben a reduktáz aktivitás érvényesült (78). In vitro kortizollal és inzulinnal kezelt omentális zsírsejtekben emelkedett HSD11B1 mutattak ki (77). Az enzimet zsírsejtjeikben túlexpresszáló transzgénikus egerek viscerálisan elhíznak, hypertonia, inzulin rezisztencia és diszlipidaemia alakul ki náluk. Ezzel ellentétben a HSD11B1 génkiütött egerekben magas zsírtartalmú táplálékbevitel mellett sem jelentek meg ezek az elváltozások (76). Fokozott HSD11B1 expressziót találtak több tanulmányban is elhízott emberek adipocytáinak vizsgálata során, ahol a cseplesz zsírsejtjeiben az aktivitás a szubkután zsírszövethez képest is magasabb volt, ugyanakkor ezzel párhuzamosan a plazma kortizolszint a normál tartományban maradt (77, 79). Ezért egyes szerzők az elhízást a hypercortisolismus zsírszöveti megjelenésének tekintik. A kortizol-metabolizmus szövetspecifikus szabályozásáért felelős HSD11B1 enzim jelentősége számos kórfolyamatban felmerült. A kortizonreduktáz-defektus mellett a polycystás ovarium szindrómában (PCOS) is feltételezik a HSD11B1 enzim csökkent működését, melynek következtében a hormonálisan inaktív kortizon nem alakul át aktív kortizollá. Az ACTH szint kompenzatórikusan megemelkedik, a mellékvesekéreg androgénjeinek szintje megnő, ami többek között a menstruációs zavar, a hirsutizmus és az acne megjelenésében nyilvánul meg (64, 65). Hypopituitarismus miatt GH terápiában részesülő betegekben az enzim metabolitjainak szintjében bekövetkező változások az enzim
26
aktivitásának csökkenésére utalnak, melyet in vivo patkány kísérletek támasztanak alá: GHnal kezelt patkányokban a májban található HSD11B1 expressziója csökkent. A HSD11B1 enzimre a GH az IGF-1-en keresztül fejti ki gátló hatását (65). 2.4.2. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim gén szerkezete A humán HSD11B1 gént Tannin és munkatársai klónozták és izolálták először 1991ben (80). Az enzim génje (GenBank Accession Number: BC012593) az 1. kromoszóma (1q32.2-41) hosszú karján helyezkedik el; 6 exonból (182, 130, 111, 185, 143 és 617 bázispár), és a közöttük levő, nem kódoló intronikus (776, 767, 120, 25300 és 1700 bázispár) régiókból áll, hosszát 30 kb-ra becsülik (64, 65). Az eukarióta gének promóterén leggyakrabban megtalálható, obligát transzkripciós faktorok kötődésére szolgáló specifikus szekvenciák tekintetében, a HSD11B1 gén szerkezeti sajátosságai közé tartozik, hogy az 5’-végén hiányzik a TATA-box, ugyanakkor a transzkripció kiindulási helyétől ellentétes irányban 76 bázispárnyira CAAT-box található (80). Emellett az enzim génjén számos transzkripciós faktor kötőhelyet azonosítottak, úgy, mint a glükokortikoid érzékeny elem, hepatocyta nukleáris faktor 1, hepatocyta nukleáris faktor 3 és a C/EBP. Patkányokon végzett kísérlet során kimutatták, hogy HSD11B1 promóterének elsődleges szabályozója a C/EBP transzkripciós faktor családba tartozó C/EBP α. A C/EBP α számos, az energia háztartással kapcsolatos gén szabályozását végzi, míg szövet szintű szabályozásában a glükokortikoidok játszanak fontos szerepet. A patkány májszövetben igen magas bazális C/EBP α szint található, amely így a fokozott HSD11B1 transzkripción keresztül, magas glükokortikoid szintet biztosít. A HSD11B1 gén promóter régiójában ezen transzkripciós faktorok számát szokatlanul magasnak találták – legalább 10 -, ellentétben más génekkel, ahol átlagosan 2-3 kötőhely fordul elő. Ezen eredményeket támasztja alá egy C/EBP α génkiütütt egereken végzett kutatás: C/EBP α knockout egerek májszövetében a HSD11B1 RNS expressziója jelentősen lecsökkent a vad típusú egerekhez képest (65). A HSD11B1 enzim működésének megismerésében nagy előrelépést jelentett a HSD11B1 génkiütött egerek (-/-) előállítása. A HSD11B1 -/- egereken fenotípusos
27
elváltozás nem látható és az egerek termékenységüket megőrzik. Az utódaikat normál születési súly és postnatalis fejlődés jellemezi. Ugyanakkor a HSD11B1 -/- egerek a 11dehidrokortikoszteront nem képesek hormonálisan aktív kortikoszteronná alakítani, ami bizonyítja, hogy egérben a HSD11B1 enzim az egyetlen 11-oxoreduktáz, ami képes az inaktív dehidrokortikoszteront aktív kortikoszteronná redukálni. Emellett az egerekben adrenocorticalis hyperplasia fejlődik ki, ami a hypothalamus-hypophysis-mellékvese tengely fokozott működésének a következménye. A fokozott ACTH-hatás következtében magasabb a szérum kortikoszteron koncentráció is (64, 65). 2.4.3. A 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim genetikai variánsai Internetes adatbázis alapján (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/snp) a humán HSD11B1 génen napjainkig 61 különböző polimorfizmust írtak le. Irodalmi adatok szerint ezeknek a polimorfizmusoknak egy része összefüggést mutat bizonyos betegségekkel vagy betegségekre hajlamosító elváltozásokkal. A három leggyakrabban vizsgált polimorfizmus a HSD11B1 enzim génjén a promóter régióban elhelyezkedő rs846910 (A/G) és rs846911 (A/C), illetve a 3. intronikus régióban található 83,557insA (-/A). Az rs846910-es genetikai variáns a HSD11B1 gén promóter régiójában helyezkedik el, 3034 bp távolságra a start kodontól és jelenléte adenin/guanin szubsztitúciót eredményez. Ezen genetikai variáns az eddigi populációgenetikai vizsgálatok alapján inzulin rezisztenciára, 2-es típusú diabetes mellitusra (DM) és hypertoniára hajlamosít (81, 82). A polimorf allélt hordozó pima indiánokban az orális glükóz tolerancia teszt során szignifikánsan magasabb éhomi, 30 perces és 2 órás plazma inzulin koncentrációt mértek, illetve nagy dózisú inzulin adása mellett csökkent a glükóz sejtekbe történő felvétele. Ugyanakkor a G allél jelenléte nem befolyásolta a BMI-t és a testzsír %-ot, valamint nem volt kimutatható különbség a zsírszövetben és izomszövetben mért HSD11B1 mRNS koncentrációban a polimorfizmust hordozók és nem hordozók között (81). Egy másik, szintén pima indiánokon végzett populációgenetikai kutatás során kimutatták, hogy a kóros allél jelenléte hypertoniára hajlamosít; a polimorf allélt hordozókban szignifikánsan magasabb volt a szisztolés és a diasztolés vérnyomás, valamint az artériás középnyomás,
28
mint a vad típusú kontroll csoportban (82). Ez az összefüggés a fiatalabb generációban kevésbé volt jelentős, mint idősebb korosztály esetén, ami felveti bizonyos környezeti faktorok jelentőségét: a pima indiánok csoportjában a korábban sóban gazdag étrendet a modern társadalmakra jellemző, szénhidrátokban gazdag táplálékok váltották fel. Egy harmadik, 2010-ben megjelent kutatási eredmény szerint az rs846910-es polimorfizmus a HSD11B1 gén promóter aktivitását nem befolyásolja in vitro körülmények között (83). A HSD11B1 gén promóter régiójában található másik genetikai variáns az rs846911. A citozin/adenin szubsztitúciót eredményező polimorfizmus az rs846910-es variánstól 930, a start kodontól 2037 bp-ra található. Dominique J.-F. de Quervain és munkatársai a polimorf allél gyakoriságát 814 Alzheimer kórban szenvedő betegben határozták meg és a polimorf allél jelenléte az Alzheimer kór kialakulásában fokozott kockázati tényezőnek bizonyult (esélyhányados: 6,2). Az egészséges kontroll csoport 0,5%-ában, míg a betegek 2,9%-ában észlelték a ritka allélt. Kimutatták, hogy az rs846911-es polimorfizmus kapcsoltan fordul elő a start kodontól 718 bázispárra található rs860185 polimorfizmussal. Egy riporter gén konstrukció segítségével végzett vizsgálatban a luciferáz aktivitást 20%-kal csökkentette az rs846911 és az rs860185 polimorfizmusokból álló haplotípus, a vad allélokat tartalmazó haplotípusokkal szemben. Ebből a funkcionális vizsgálati eredményből következik, hogy a mutáns allél jelenléte csökkenti a HSD11B1 gén transzkripcionális aktivitását, melynek kapcsán feltételezik, hogy ennek hatására emelkedik a neuronok kortizon koncentrációja, mely felelős lehet az Alzheimer kórra jellemző neuronális toxicitásért (84). Ezzel ellentétben, egy később megjelent, kognitív változásokat vizsgáló populációgenetikai vizsgálatban, az rs846911-es polimorfizmus jelenléte nem volt kimutatható a kutatócsoport által vizsgált skót populációban (85). A HSD11B1 gén legtöbbet vizsgált genetikai variánsa a 3. intronikus régióban elhelyezkedő adenin inzerció, a 83,557insA (rs45487298). Az irodalmi adatok ezen polimorfizmus esetében nem egységesek. Túlsúlyos gyermekekben az adenin inzerció hordozása összefüggést mutatott emelkedett BMI értékekkel, magasabb derék- illetve haskörfogat hányadossal, valamint fokozott inzulin rezisztenciával, ugyanakkor idős kaukázusi populációban a polimorf allél jelenléte nem mutatott összefüggést a vizsgált metabolikus paraméterekkel (86, 87). Pima indiánokon végzett populációgenetikai vizsgálat
29
esetében az adenin inzerció a 2-es típusú DM kialakulásában bizonyult fokozott kockázati tényezőnek, míg San Milan és munkatársai nem találtak összefüggést az inzerció jelenléte és PCOS között (81, 88). Ismert, hogy a 83,557insA, illetve a tőle körülbelül 40 bázispárra található timin-guanin szubsztitució 83,597T→G (rs12086634), valamint a 3’UTR régióban a 6. exonon elhelyezkedő rs6752 polimorfizmus között linkage disequilibrium áll fenn (81). Draper és munkatársai riporter gén konstrukció segítségével igazolták, hogy a 3. intronon egymástól 40 bp-ra található 83,557insA, illetve 83,597T→G polimorfizmus csökkenti a HSD11B1 gén transzkripcionális aktivitását. Arra a következtetésre jutottak, hogy ez a régió a HSD11B1 expressziójában intronikus enhancerként játszik fontos szerepet, így a polimorf allélok jelenléte csökkent enzim expressziót eredményez (89). A 83,557 insA-val kapcsolt 83,597T→G polimorfizmust összefüggésbe hozták PCOS nők hormonális változásaival. A polimorfizmust hordozókban alacsonyabb reggeli kortizol szintet, ACTH-ra adott nagyobb kortizol választ, emelkedett dehidroepiandroszteronszulfát (DHEAS) szintet, dxm-ra adott kifejezettebb DHEAS szuppressziót, valamint alacsonyabb LDL szintet figyeltek meg a polimorf allélt nem hordozókhoz képest (90). Ezzel ellentétben White PC nem talált összefüggést a polimorfizmus hordozása és kortizon reduktáz deficiencia között (91). Továbbá kimutatták, hogy Kanadában élő francia férfiakban, ezen kapcsolt polimorfizmusoknak nincsen jelentősége a metabolikus szindróma kialakulásában, de a ritka allélok jelenléte esetén szignifikánsan magasabb apolipoprotein B szintet mértek. (92) (6. ábra).
30
6. ábra 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim leggyakoribb gén-polimorfizmusai és allél gyakoriságuk. A 83,557insA polimorfizmus jelenléte adenin inzerciót eredményez. Az rs846910-es polimorfizmus adenin guanin, míg az rs846911-es citozin adenin szubsztitúciót hoz létre.
2.5. Endogén hypercortisolismussal járó állapotok glükokortikoid érzékenységének genetikai jellegzetességei Az endogén hypercortisolismussal járó állapotokban felmerült bizonyos genetikai tényezők jelentősége a glükokortikoidok iránti érzékenység illetve a hypothalamushypophysis-mellékvese tengely aktivitásának meghatározásában (25, 40, 43, 47). A glükokortikoidokra adott válaszreakció mind fiziológiás, mind pedig patológiás körülmények között nagyfokú egyéni variabilitást mutat, melynek sejt-, illetve szövetszintű szabályozását elsősorban a GR kortizol iránti affinitása és a HSD11B1 enzim aktivitása határozza meg (7. ábra). Egy kutatás kapcsán endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek perifériás vérmintáiból származó mononukleáris sejtjeiben vizsgálták a GR ligand affinitását és a receptor számának változását. Az egészséges kontroll csoport
31
mononukleáris sejtjeihez viszonyítva alacsonyabb volt a receptor kortizol iránti affinitása, míg a receptor számában nem volt kimutatható eltérés. A receptor csökkent ligand aktivitása feltehetőleg a tartósan emelkedett kortizol szintekre adott válaszreakció következménye (93). Egy másik
tanulmányban Cushing-szindrómában szenvedő
betegekben a betegség aktív illetve gyógyult stádiumában vizsgálták a GR expresszióját. Műtét előtti stádiumban, ebben az esetben is csökkent a receptor kortizol iránti affinitása, ami a betegség gyógyulását követően reverzibilisnek bizonyult. Ezzel párhuzamosan fokozott, majd csökkent GRβ expressziót mutattak ki a betegség aktív, illetve gyógyult stádiumában (94). Mariniello és mtsai. Cushing-szindrómás, elhízott és normál testsúlyú kontroll személyek zsírszövetében vizsgálták a HSD11B1 mRNS expresszióját. Nem találtak különbséget az mRNS expresszió tekintetében a Cushing-szindrómás és normál testsúlyú kontroll személyek között, ugyanakkor elhízott személyekben fokozott expressziót mutattak ki (95). Feltételezik, hogy Cushing-szindrómában az enzimnek az alacsonyabb aktivitása - a GR esetében megfigyelhető reverzibilis affinitás csökkenéshez hasonlóan - a fokozott glükokortikoid hatást tompító ellenregulációs mechanizmus részét képezi (77). Az endogén és az exogén hypercortisolismussal járó állapotokban a glükokortikoidok csontszövetre kifejtett káros hatása regionális eltérést és szövetspecificitást mutat. Ismert, hogy a glükokortikoid hatás jobban érvényesül a trabekuláris csontokon, mint a kortikális állományon. Ennek az oka valószínűleg a trabekuláris állomány kortikális állományhoz viszonyított gyorsabb anyagcseréjében, nagyobb felület/térfogat hányadosában, illetve eltérő
glükokortikoid
érzékenységben
keresendő
(96,
97).
A
hypercortisolismus
következtében létrejövő csontvesztés mértéke az axiális csontokon jelentősebb, mint a perifériás csontokon, így ezekben az állapotokban a gerincen és a bordákon kell elsősorban fokozott törési rizikóval számolni. A glükokortikoid hatás ezen regionális különbségeiért az axiális csontok magasabb trabekuláris állománya, a centrális és a perifériás csontszövet eltérő glükokortikoid érzékenysége, illetve az osteoblast sejtek eltérő fejlődése tehető felelőssé (6). Az eltérő glükokortikoid érzékenység kialakításában a sejtek kortizol ellátását biztosító HSD11B1 enzim, illetve a kortizol hatását közvetítő GR játszik fontos szerepet. A HSD11B1 enzim expresszióját mind osteoblast, mind osteoclast sejteken kimutatták (98).
32
Kimutatták, hogy az enzim expressziójának és aktivitásának autokrin szabályozása fontos szerepet tölt be abban, hogy az osteoblast sejteket megfelelő gükokortikoid hatás érje, ami elengedhetetlenül szükséges az osteoblastok differenciálódáshoz (99). Humán osteoblast sejteken végzett in vitro vizsgálatok alapján a HSD11B1 enzim aktivitása pozitív korrelációt mutatott a korral, illetve dózis-függő összefüggés volt megfigyelhető az enzim aktivitása és a glükokortikoid terápia között (100). Emellett proinflamatorikus citokinek (TNF-α és IL-1) in vitro körülmények között az enzim expresszióját és reduktáz aktivitását fokozták (102). A GRα és β splice variánsainak expressziója megfigyelhető osteoblast sejteken, míg osteoclast sejtek esetében a GRα jelenléte nem volt kimutatható (103). Ugyanakkor más kutatók azt találták, hogy óriássejtes csonttumor osteoclast-szerű sejtjeiben mind GRα, mind GRβ molekula jelen van (104). Napjainkra a kutatás középpontjába került a genetikai polimorfizmusok jelentősége a sejtek glükokortikoid érzékenységének kialakításában. A GR gén polimorfizmusok csontszövettel való kapcsolatának vizsgálata során az intronikus régióban található BclI és az exonikus N363S polimorfizmus mutatott összefüggést a csont ásványianyag sűrűség (BMD) értékekkel (105, 106). A HSD11B1 enzim génjén található hat vizsgált polimorfizmus közül kettő jelenléte (rs1000283 és rs932335) posztmenopauzális osteoporosisban a vertebrális törési rizikót csökkentette (107).
33
7. ábra A sejtek glükokortikoid ellátásának szabályozása. A HSD11B1 enzim a hormonálisan inaktív kortizont hormonálisan aktív kortizollá alakítja. A GR a kortizol kötődése után a sejtmagba vándorolva befolyásolja a glükokortikoid érzékeny gének transzkripcióját.
34
3. CÉLKITŰZÉSEK Munkám
során
a
glükokortikoidok
iránti
érzékenység
individuális
különbözőségének lehetséges okait kívántam tanulmányozni. Vizsgálati célcsoportként a kérdésfeltevés szempontjából eddig még nem, vagy csak kevéssé vizsgált betegcsoportot, az
endogén
hypercortisolismusban
szenvedő
betegek
csoportját
választottam.
Tanulmányozni kívántam a betegség klinikai manifesztációit, különös tekintettel az endogén Cushing-szindrómához társuló csontbetegségre. A csontbetegség individuális variabilitását meghatározó egyes, az irodalmi előzmények alapján feltételezhető tényezők molekuláris genetikai hátterét vizsgáltam. A Semmelweis Egyetem ÁOK II. sz. Belgyógyászati Klinikán gondozott Cushing-kóros és -szindrómás betegek és kontroll egyének klinikai- és hormonlaboratóriumi leleteit dolgoztam fel, valamint a betegek és a kontroll személyek DNS mintáin molekuláris biológiai vizsgálatokat végeztem. Kutatásom során az alábbi konkrét célokat tűztem ki magam elé: 1. Vizsgálni kívántam az endogén hypercortisolismus súlyosságát reprezentáló szérum kortizol koncentrációk, valamint a csontépítés és csontbontás markerei közötti összefüggést a betegség aktív stádiumában. 2. Célul tűztem ki a csontépítés és a csontbontás egy-egy markerének hosszú távú nyomon követését az endogén Cushing-szindróma gyógyulását követően. 3. Tanulmányozni kívántam, hogy a hypercortisolismusra jellemző csontanyagcsere eltéréseket jól tükröző csontmarkerek kaphatnak-e szerepet az endogén Cushingszindróma diagnosztikájában vagy a betegség súlyosságának a megállapításában. 4. Vizsgálni kívántam, hogy a GR génnek a nemzetközi irodalomban leggyakrabban vizsgált
négy
polimorfizmusa
(BclI,
N363S,
ER22/23EK
és
A3669G)
összefüggésbe hozható-e az endogén Cushing-szindróma különböző formáinak kialakulásával.
35
5. Összefüggést kerestem a GR gén BclI, N363S, ER22/23EK és az A3669G genetikai variánsai, valamint az endogén Cushing-szindróma klinikai manifesztációi között, különös tekintettel a csontok ásványi anyag tartalmára és a csontmetabolizmusra. 6. Célul tűztem ki a HSD11B1 génen található rs846910 és rs846911 genetikai variánsok kimutatásához egy egyszerű, megbízható, idő- és költségkímélő molekuláris biológiai módszer kidolgozását. 7. Vizsgálni kívántam, hogy a HSD11B1 génen található rs846910, rs846911 és 83,557insA
genetikai
variánsoknak
van-e
hypercortisolismussal járó állapotok kialakulásában.
36
jelentősége
az
endogén
4. BETEGEK ÉS MÓDSZEREK 4.1. Vizsgált betegcsoportok Munkám során a Semmelweis Egyetem II. számú Belgyógyászati Klinika Endokrinológiai osztályán gondozott, endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek klinikai-,
hormonális-
és
genetikai
adatait
dolgoztam
fel.
Az
endogén
hypercortisolismusban szenvedő betegek csontanyagcsere változásának követéséhez a vizsgált betegcsoportba 49 ACTH termelő hypophysis adenomás, 26 mellékvese eredetű Cushing-szindrómás és 9 ektópiás Cushing-szindrómás beteg tartozott. A kontroll csoportba 161 egészséges, hazai populációból származó személyt vontam be. A GR génen található genetikai variánsok endogén hypercortisolismusban betöltött pathogenetikai szerepének vizsgálata során 35 Cushing-kóros és 25 adrenális Cushing-szindrómás beteg genetikai analízisét végeztem el. A HSD11B1 gén rs846910, rs846911 és 83,557insA genetikai variánsainak jelentőségét az endogén hypercortisolismussal járó állapotok kialakulásában 43 Cushing-kóros és 32 adrenális Cushing-szindrómás betegben vizsgáltam. Mindkét gén elemzése során a kontroll csoportba 129 hazai, egészséges populációból származó személyt vontam be. A betegek és az egészséges kontroll csoport tagjai a klinikai adataik feldolgozásához, valamint a vérmintáikon történő genetikai vizsgálatok elvégzéséhez, részletes tájékoztatás után írásos beleegyező nyilatkozatot írtak alá. A vizsgálati protokollt a Semmelweis Egyetem Kutatásetikai Bizottsága, a genetikai vizsgálatokat az Egészségügyi Tudományos Tanács jóváhagyásával végeztük. 4.2. Klinikai-, kémiai- és hormon-laboratóriumi vizsgálatok Az endogén Cushing-szindróma diagnózisát részletes klinikai- és endokrinológiai kivizsgálás eredményeként állítottuk fel. A kortizolszekréció diurnális jellegének meghatározása reggel 8- és éjjel 24 órakor levett vérmintákból, a plazmakortizol szintek mérésével történt. A kis dózisú dxm teszt során a kortizol szint meghatározás reggel 8 és 9 óra között levett vérmintából, illetve este 24 órakor, szájon át adott 1 mg dxm után, másnap
37
reggeli vérmintából történt. Egyetlen hypercortisolismusban szenvedő beteg sem szedett a kis dózisú dxm teszt eredményét befolyásoló gyógyszert. Plazma ACTH szint meghatározás reggel 8 és 9 óra között levett vérmintából történt, immunkemiluminometriás eljárással (Elecsys, F. Hoffmann-La Roche Ltd, Basel, Switzerland). Az ACTH-termelő hypophysis adenoma diagnózisát a hormonszintek és a hypophysis mágneses rezonanciás képalkotó (MRI) eljárással kapott eredmények segítségével állítottuk fel. Amennyiben az ACTH-termelés forrását illetően a képalkotó vizsgálatok nem voltak egyértelműek, a sinus petrosus inferiorokból történő vénás vérvételre, illetve ebből történő ACTH-meghatározásra is sor került. A mellékvese eredetű Cushing-szindróma igazolása a hormonértékek és a mellékvese computer tomográfia (CT) és MRI eredmények segítségével történt. A betegség fennállásának időtartamát, az időben elsőként felismert, a Cushing-szindróma részjelenségének tekinthető tünet megjelenésétől számítottuk. 4.3. Oszteodenzitometriás paraméterek és a csontforgalom vizsgálata A csont ásványi anyag sűrűség (BMD) mérése DEXA módszer segítségével történt (QDR 4500C, Hologic Inc., Waltham, MA, USA; Software version 9.03) a lumbális gerincen (L1-4) és a proximalis combcsont régióiban (teljes femur, valamint femur-nyak, trochanterikus és intertrochanterikus regiók). A mérési eredményeket ásványi anyag tartalomban (bone mineral content – BMC; gramm), felületi sűrűségben (gramm/cm2), az életkor- és nem-specifikus átlagtól való, szórásegységben kifejezett eltérés (z-score), továbbá a fiatalkori csúcs-csonttömegtől, szórásegységben kifejezett eltérés (t-score) formájában adtuk meg. Referencia értékként a gyártó által rendelkezésre bocsájtott adatokat használtuk. A műszert minden munkanap reggelén a gyártó által készített gerincphantommal kalibráltuk, e módszerrel a készülék hosszútávú pontossága variációs koefficiens formájában kifejezve 0,35% volt.
A proximális femur csontsűrűségének
értékeléséhez egészséges kontrollcsoportként a NHANES III vizsgálatból származó adatokat használtuk fel (108).
38
A csontépítés mértékét jelző szérum osteocalcin (OC) és a csontbontás mértékét jelző I-es típusú kollagén karboxiterminális telopeptid (β-CTx) méréseket egy, a Roche Laboratórium által forgalmazott kit segítségével végeztük (N-MID Osteocalcin and βCrossLaps/serum, Diagnostics GmbH, Mannheim, Németország). Az Elecsys N-MID OC teszt két monoklonális antitest segítségével a MID- és az N-terminális fragmenst detektálja a szérum OC kimutatásához, míg az Elecsys β-CTx teszt az I-es típusú kollagén karboxiterminális izomerizált telopeptidjének 8 aminósavas részletét ismeri fel. A szérum β-CTx és OC meghatározás analitikai jellemzői a következők: méréstartomány 0,01–6,00 ill. 0,5–300 ng/ml; intra-assay precizitás 1,0–4,6 ill. 0,5–1,1 CV%; teljes precizitás 2,7–7,6 ill. 1,1–1,6 CV%. 4.4. Molekuláris genetikai vizsgálatok A polimorfizmusok kimutatásához szükséges laboratóriumi eljárások során első lépésben perifériás vérmintákból DNS-t izoláltunk. A DNS izolálás a kereskedelemben forgalmazott kit-ek segítségével történt (DNA Isolation Kit for Mammalian Blood, Boehringer Mannheim, Németország, illetve Qiamp DNA Blood Kit, Qiagen, USA). Az így kapott DNS mintákat a felhasználásig -80 C0-on tároltuk. 4.4.1. A glükokortikoid receptor genetikai variánsainak kimutatása
A BclI polimorfizmus kimutatása A GR gén 3. intronikus régiójában található BclI polimorfizmust az irodalomban leírt allélspecifikus PCR módszer segítségével vizsgáltuk (109). 1. A BclI PCR-amplifikálásához használt primerek nukleotid szekvenciája: F Forward: 5-AGAGCCCTATTCTTCAAACTG-3 R Reverz: 5-GAGAAATTCACCCCTACCAAC-3 MF Mutáns Forward: 5-GACAAGTTATGTCTGCTGATG-3
39
VR Vad Reverz: 5-CAATTCCTCTCTTAAAGAGATTG-3 (Invitrogene Life Technologies, Glasgow, UK) A PCR reakció összetétele 25 l
A PCR program paraméterei:
végtérfogatban: 2,5l oligonukleotid forward primer
1: 95 oC 7 perc
2,5l oligonukleotid reverz primer
2: 95 oC 1 perc
2,5l oligonukleotid mutáns forward primer
3: 56 oC 1 perc
2,5l oligonukleotid vad reverz primer
4: 72 oC 1 perc 30 másodperc
12,5 μl Bioline ImmoMix
5: 34x2 ciklustól
0,5 μl desztillált víz
6: 72 oC 10 perc
50 ng DNS
7: 4 oC
2. Az amplifikált DNS szakaszokat 2%-os ethidium-bromid-agaróz gélen elektroforézissel választottuk szét, majd Polaroid, illetve Olympus Camedia 3020 típusú digitális kamerával és UVP-Doc-It szoftverrel (Ultra-Violet Products Ltd, Cambride, UK) detektáltuk. Az elektroforézis képen a nem specifikus forward és reverz primernek köszönhetően minden esetben látható egy 418 bázispár méretű fragmens, amely belső kontrollként szolgált. A vad és a mutáns allélra specifikus primereknek megfelelően homozigóta vad személyeknél 177, míg homozigóta mutáns személyeknél 284 bázispárból álló fragmenst láthatunk. A heterozigóta mutáns minta mindkét specifikus primernek megfelelő fragmenst tartalmazza. Az N363S polimorfizmus kimutatása A GR gén 2. exonikus régiójában található N363S polimorfizmus kimutatásához az irodalomban leközölt allél-specifikus PCR módszert használtuk (110). 1. Az N363S PCR-amplifikálásához használt primerek nukleotid szekvenciája: 2/4 Forward 5’-CCAGTAATGTAACACTGCCCC-3’
40
2/4 Reverz 5’-TTCGACCAGGGAAGTTCAGA-3’ 363W 5’-ATCCTTGGCACCTATTCCAAT-3’ 363M 5’-ATCCTTGGCACCTATTCCAAC-3’ (Invitrogene Life Technologies, Glasgow, UK) A PCR reakció összetétele 25 l
A PCR program paraméterei:
végtérfogatban: 2,5l oligonukleotid forward primer
1: 95 oC 7 perc
1,25l oligonukleotid reverz primer
2: 95 oC 1 perc
2,5l oligonukleotid vad reverz primer
3: 63 oC 1 perc
vagy 2,5l oligonukleotid mutáns reverz primer
4: 72 oC 1 perc
12,5 μl Bioline ImmoMix
5: 34x2 ciklustól
3,75 μl desztillált víz
6: 72 oC 10 perc
50 ng DNS
7: 4 oC
2. Az amplifikált DNS szakaszokat 2%-os ethidium-bromid-agaróz gélen elektroforézissel választottuk szét, majd Polaroid, illetve Olympus Camedia 3020 típusú digitális kamerával és UVP-Doc-It szoftverrel (Ultra-Violet Products Ltd, Cambride, UK) detektáltuk. Az elektroforézis képen a PCR termék minden esetben tartalmazott egy 357 bázispár méretű fragmenst, amely belső kontrollként szolgált, valamint a specifikus primer által felismert szekvencia jelenléte esetén egy allélspecifikus 306 bázispár mérető fragmenst. Az ER22/23EK polimorfizmus kimutatása A GR gén ER22/23EK polimorfizmus kimutatásához az irodalomban leírt restrikciós fragmens hossz polimorfizmus (RFLP) módszer (49, 56) módosított változatát használtuk.
41
1. A genetikai variánst tartalmazó 2. exonikus régió PCR-amplifikálása újonnan tervezett forward és reverz primerek segítségével történt. Az ER22/23EK PCR-amplifikálásához használt primerek nukleotid szekvenciája: 2/1 Forward: 5’-TGCATTCGGAGTTAACTAAAAG-3’ 2/1 Reverz: 5’-ATCCCAGGTCATTTCCCATC-3’ (Invitrogene Life Technologies, Glasgow, UK) A PCR reakció összetétele 25 l végtérfogatban:
A PCR program paraméterei:
2,5l oligonukleotid forward primer
1: 95 oC
2,5l oligonukleotid reverz primer
2: 95 oC 1 perc
12,5 μl Bioline ImmoMix
3: 56 oC 1 perc
5 μl desztillált víz
4: 72 oC 1 perc 30 másodperc
50 ng DNS
5: 34x2 ciklustól
7 perc
6: 72 oC 10 perc 7: 4 oC 2. Az amplifikált DNS szakaszokat az MnlI restrikciós enzimmel (New England Biolabs, Beverly, USA) 37°C-on 90 percen keresztül emésztettük. Az emésztés után a vad típusú allél esetében 149, 163, 50, 49 és 35 bázispár, míg a polimorf allél esetében163, 184, 50 és 49 bázispár méretű fragmenseket kaptunk. 3. Az emésztett PCR termékeket 3,5%-os agaróz gélen futtattuk, majd kromatográfiát követően Polaroid, illetve Olympus Camedia 3020 típusú digitális kamerával és UVPDoc-It szoftverrel (Ultra-Violet Products Ltd, Cambride, UK) detektáltuk. Az 50, 49 és 35 bázispáros fragmensek kis méretük miatt nem voltak jól detektálhatók az elektroforézis képen, így a homozigóta vad minta esetében két 150 bp körüli, míg mindkét polimorf allélt tartalmazó minta esetében két 150 bp-nál nagyobb sávot figyelhetünk meg. Heterozigóta minta esetében három sávot láthatunk.
42
Az A3669G polimorfizmus kimutatása A GRβ izoformán található A3669G variáns kimutatásához Taqman allél diszkriminációs assay-t használtunk, gyárilag tervezett próba és PCR primerek segítségével (Applied Biosystems). A TaqMan vizsgálati módszer 7500 Fast Real Time PCR System (Applied Biosystems) alkalmazásával történt (8. ábra). 1. Az A3669G PCR-amplifikálásához használt primerek és TaqMan próba: A Taqman allél-diszkriminációs módszerhez alkalmazott primer-próba szetett az Applied Biosystem cégtől rendeltük (Applied Biosystems, Applied Biosystems Group 850 Lincoln Center Drive Foster City, CAA). A PCR reakció összetétele 25 l végtérfogatban:
A PCR program paraméterei:
12,5l Taq Man egyetemes PCR mesterkeverék
1: 95 oC 20 másodperc
18 M oligonukleotid forward primer
2: 95 oC 3 másodperc
18 M oligonukleotid reverz primer
3: 60 oC 30 másodperc
5 M FAM-mal jelölt Taq Man próba
4: 40x2 ciklustól
10 ng DNS
43
8. ábra Az A3669G variáns kimutatásához használt Taqman allél diszkriminációs assay eredménye. Az ábra bal oldalán látható minta a polimorf allélt nem hordozza (AA), a középen látható minta a polimorf allélt heterozigóta (AG), míg az ábra jobb oldalán homozigóta pozitív (GG) formában hordozza.
2. Az eredményeket automata DNS szekvenálással ellenőriztük 40 véletlenszerűen kiválasztott egészséges kontroll, illetve endogén hypercortisolismusban szenvedő beteg eredményéből. A szekvenálást Big Dye Terminator Cycle-Sequencing kit segítségével 310 Genetic Analyser készüléken (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) végeztük. A szekvenálás során kapott erdmények 100%-ban megegyeztek a Taqman allél diszkriminációs assay segítségével kapott eredményekkel. 4.4.2. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim genetikai variánsainak kimutatása Az rs846910 és rs846911 genetikai variánsok kimutatása allél-specifikus módszerrel A HSD11B1 génen található rs846910 és rs846911 polimorfizmus vizsgálatára egy új allélspecifikus módszert dolgoztunk ki.
44
1. Az allél-specifikus PCR elve és működése A HSD11B1 gén promóter régiójában egymástól 1542 bázispárnyira található rs846910-es és rs846911-es polimorfizmusok detektálásához készített allél specifikus PCR reakcióhoz a belső kontroll fragmenst megjelenítő nem-specifikus, illetve az egyes allélokra specifikus forward és reverz primereket terveztünk. Az egyes primerek tervezéséhez a Primer Premier 5.0 programcsomagot (Primer Biosoft International, Palo Alto CA) és a Primer3 Input 0.4.0-t használtuk. Az rs846910 (A/G) polimorfizmus kimutatására egy a vad allélra specifikus forward (VF10) és egy a polimorf allélra specifikus szintén forward (MF10) primert, az rs846911 (C/A) polimorfizmus kimutatására pedig egy vad (VR11) és egy mutáns (MR11) allélra specifikus reverz primert terveztünk. A vizsgálathoz két további primert használtunk, amelyek a két vizsgált polimorfizmus közötti szakaszra specifikus reverz (R) és forward (F) primereknek feleltek meg (9. ábra). A PCR reakció összeállítása során minden vizsgált személyhez két reakció elegy tartozik. Az első reakció mindkét polimorfizmus vad alléljára, míg a második reakció mindkét polimorfizmus mutáns alléljára specifikus primereket tartalmazza, a megfelelő közti primerekkel (10. ábra).
9. ábra Az rs846910 és rs846911 polimorfizmusok kimutatására tervezett allélspecifikus PCR reakció működési elve. VF10 és MF10: az rs846910 polimorfizmus vad, illetve polimorf alléljára specifikus forward primerek, VR11 és MR11: az rs846911 polimorfizmus vad illetve polimorf alléljára specifikus reverz primerek, R és F: rs846910 és az rs846911 polimorfizmusok közötti szakaszra specifikus reverz és forward primerek
45
Az rs846910 és rs846911 PCR-amplifikálásához használt primerek nukleotid szekvenciája: F-Forward: 5-AGAGCCCTATTCTTCAAACTG-3 R-Reverz: 5-GAGAAATTCACCCCTACCAAC-3 VF10-A allélra specifikus Vad Forward: 5-TTGATTCCATTTATTCTGGTGA-3 MF10-G allélra specifikus Mutáns Forward: 5-TTGATTCCATTTATTCTGGTGG-3 VR11-C allélra specifikus Vad Reverz: 5-GCAAAAGCATCCAATAAAGTGAG-3 MR11-A allélra specifikus Mutáns Reverz: 5-GCAAAAGCATCCAATAAAGTGAT-3 (Invitrogene Life Technologies, Glasgow, UK) A PCR reakció összetétele 50 l végtérfogatban: 1.reakció:
2.reakció
F: 2,5 µl
F: 2,5 µl
R: 3 µl
R: 3 µl
VF10: 3 µl
MF10: 3 µl
VR11: 2,5 µl
MR11: 2,5 µl
Bioline: 25 µl
Bioline: 25 µl
Desztillált víz: 11,5 µl
Desztillált víz: 11,5 µl
DNS: 50 ng
DNS: 50 ng
1. reakció
2. reakció
VF10+R VR11+F
MF10+R MR11+F
10. ábra A PCR reakció elegy összetétele. Az első reakció elegybe mindkét polimorfizmus vad alléljára specifikus primerek és a közti primerek kerülnek (VF10+R és VR11+F), míg a 2. reakció elegy a mutáns allélra specifikus primereket tartalmazza a közti primerekkel (MF10+R és MR11+F).
A PCR program paraméterei: 1: 95 oC 7 perc; 2: 95 oC 1 perc; 3: 62 oC 1 perc; 4: 72 oC 1 perc 30 másodperc; 5: 34x2 ciklustól; 6: 72 oC 10 perc; 7: 4 oC
46
2. A DNS fragmensek szétválasztása gélelektroforézissel Az amplifikált DNS szakaszokat 2%-os ethidium-bromid-agaróz gélen elektroforézissel választottuk szét. Az amplifikált DNS szakaszok azonosításánál a felső sor az rs846911-es, míg az alsó sor az rs846910-es polimorfizmust jellemzi. A két reakció elegynek megfelelően a gélképen minden személyhez két oszlop tartozik. Az első oszlop a vad, míg a második a polimorf allélok jelenlétét mutatja. Tehát az rs846911-es polimorfizmus esetében ez azt jelenti, hogy az A-val jelölt minta homozigóta formában hordozza a ritka, polimorf allélt, míg a B-vel és a C-vel jelölt beteg szintén homozigóta, de csak a vad allélt hordozzák. Az rs846910 polimorfizmus az A és a B mintában heterozigóta formában van jelen, mivel mind a vad mind a mutáns allél detektálható mindkét betegnél, míg a C mintában ez a polimorfizmus homozigóta pozitív formában fordul elő, mivel ez a beteg csak a mutáns allélt hordozza (11. ábra).
11. ábra Az rs846910 és az rs846911 polimorfizmusok PCR amplifikációja során keletkezett fragmentumok szétválasztása ethidium-bromid-agaróz gélelektroforézissel a: rs846910 +/rs846911 +/+
b: rs846910 +/rs846911 -/-
c: rs846910 +/+ rs846911 -/-
3. Klónozás Az rs846911-es polimorfizmus irodalomban ismertetett alacsony allél gyakorisága miatt a kidolgozott allél specifikus PCR módszerhez kontrollként egy olyan
47
rekombináns DNS-t állítottunk elő, mely az rs846911-es polimorfizmust homozigóta pozitív, míg az rs846910-es polimorfizmust heterozigóta formában hordozza. A klónozási eljárás során a HSD11B1 gén 1542 bázispárból álló fragmensét perifériás vérminta DNS templátjából PCR reakció segítségével amplifikáltuk (Herculase Hotstart PCR Master Mix, Stratagene). Az így kapott amplifikált PCR termékeket pcDNA3.1 TOPO vektorba (Invitrogen) ligáltuk. A plazmid szekvenálása során kapott bázissorrend megegyezett a referencia szekvenciával. A kívánt pontmutációk előállítása in vitro mutagenezis segítségével történt (Herculase Hotstart PCR Master Mix, Stratagene). A mutációt tartalmazó HSD11B1 gén szakaszt pcDNA3.1 vektorba ligáltuk a KpnI – XhoI restrikciós helyeknek megfelelően. A mutációt tartalmazó klónok szekvencia analízise igazolta az általunk beépíteni kívánt pontmutációk jelenlétét. 4. Az eredmények ellenőrzése DNS szekvenálással Az eredményeket automata DNS szekvenálással ellenőriztük, 129 véletlenszerűen kiválasztott egészséges kontroll személy esetében. A szekvenálást Big Dye Terminator Cycle-Sequencing kit segítségével 310 Genetic Analyser készüléken (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) végeztük. A szekvenálás során kapott eredmények 100%-ban megegyeztek a többszörös allél-specifikus módszer segítségével kapott eredményekkel (12. ábra).
48
12. ábra Az rs846910 és az rs846911 genetikai variánsok DNS szekvenálás során kapott kromatogrammok. a: rs846910 vad típusú minta szekvenciája ; b: rs846910 heterozigóta minta szekvenciája; c: rs846910 homozigóta mutáns minta szekvenciája; d: rs846911 vad típusú minta szekvenciája; e: rs846911 homozigóta mutáns plazmid szekvenciája.
A 83,557insA polimorfizmus kimutatása A HSD11B1 génen található adenin inzerció kimutatásához az irodalomban leírt RFLP módszer módosított változatát használtuk (86). 1. Az inzerciót tartalmazó 3. intronikus régió PCR-amplifikálása újonnan tervezett forward és reverz primerek segítségével történt. A 83,557insA PCR-amplifikálásához használt primerek nukleotid szekvenciája: AIF Forward: 5’-TGCATTCGGAGTTAACTAAAAG-3’ AIR Reverz: 5’-ATCCCAGGTCATTTCCCATC-3’
49
(Invitrogene Life Technologies, Glasgow, UK) A PCR reakció összetétele 25 l végtérfogatban:
A PCR program paraméterei:
2,5l oligonukleotid forward primer
1: 95 oC 7 perc
2,5l oligonukleotid reverz primer
2: 95 oC 1 perc
12,5 μl Bioline ImmoMix
3: 57 oC 1 perc
5 μl desztillált víz
4: 72 oC 1 perc
50 ng DNS
5: 34x2 ciklustól 6: 72 oC 10 perc 7: 4 oC
2. A kapott PCR termék restrikciós enzim emésztése: Az amplifikált DNS szakaszokat az XcmI restrikciós enzimmel (New England Biolabs, Beverly, USA) 65°C-on 3 órán át emésztettük. Vad allélok hordozása esetén a 3. intronikus régióban a CCA és a TGG bázisok között 8 nukleotid található. Az adenin inzerció jelenléte esetén ez 9 nukleotidra változik, mely hasítási helyet biztosít az XcmI restrikciós endonukleáz számára. Így a polimorf allélt hordozók esetében az emésztés után 461 bázispár helyett 252 és 210 bázispár méretű fragmenseket figyelhetünk meg (13. ábra).
13. ábra Az XcmI restrikciós enzim működése. 3. Az emésztett PCR termékeket 2 %-os agaróz gélben kromatográfiát követően Polaroid, illetve Olympus Camedia 3020 típusú digitális kamerával és UVP-Doc-It szoftverrel (Ultra-Violet Products Ltd, Cambride, UK) detektáltuk (14. ábra).
50
14. ábra A 83,557insA restrikciós enzim emésztése során keletkezett fragmentumok szétválasztása ethidium-bromid-agaróz gélelektroforézis segítségével. A bemutatott gélképen az első oszlopban lévő minta a vizsgált polimorfizmust homozigóta pozitív formában hordozza, míg a 8. oszlopban egy heterozigóta személy eredményét láthatjuk. A negyedik oszlopban az adenin inzerció nincs jelen.
4. Az eredményeket automata DNS szekvenálással ellenőriztük. A szekvenálást Big Dye Terminator Cycle-Sequencing kit segítségével 310 Genetic Analyser készüléken (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) végeztük. 4.5. Statisztikai módszerek Az adatokat a Statistica (7.0 verzió, Statsoft Inc) szoftver segítségével elemeztük. Statisztikailag szignifikánsnak a p<0,05 értéket tekintettük. Az adatok normalitását Shapiro-Wilk's W-teszt segítségével ellenőriztük. A gyakoriságokat χ2–próbával és Fisherféle egzakt teszttel hasonlítottuk össze. Az átlagok összehasonlítására a normális eloszlású változóknál a Student-féle t-tesztet, a nem normális eloszlásúaknál pedig a Mann-Whitney U-tesztet alkalmaztuk. Kettőnél több független minta összehasonlítása egy utas varianciaanalízissel - one-way ANOVA –, illetve Kruskal-Wallis-féle próbával történt, az adatok normalitásának megfelelően. A Post hoc páronkénti összehasonlításokat a Bonferroni-teszt segítségével végeztük. Amennyiben a folytonos függő változónkat több független változó függvényében vizsgáltuk és a magyarázó változók között kategóriás és
51
folytonos változó egyaránt szerepelt, akkor az adatok értékelését kovariancia analízis (ANCOVA) segítségével végeztük. Két változó közötti kapcsolat meghatározása Spearman-féle rang-korrelációs teszttel történt, míg egy vagy több folytonos magyarázó változó és egy függő változó közötti függvénykapcsolat meghatározásához, egy vagy többváltozós lineáris regressziót alkalmaztunk. A szérum OC diagnosztikus értékének vizsgálatára receiver operating characteristics (ROC) analízist alkalmaztunk. Az egyes polimorfizmusok vizsgálata során – amennyiben az allél gyakoriság lehetővé tette elvégeztük a Hardy-Weinberg egyensúly ellenőrzését.
52
5. EREDMÉNYEK 5.1. A glükokortikoidok csontanyagcserét befolyásoló hatásának vizsgálata endogén hypercortisolismusban 5.1.1. Demográfiai adatok és szérum csontmarker szintek endogén Cushing-szindrómában szenvedő betegekben és kontroll személyekben A vizsgálatba bevont endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek, valamint a kontroll személyek átlag életkora, nemi megoszlása és szérum β-CTx szintje nem különbözött egymástól. Ugyanakkor a vizsgált betegcsoportban szignifikánsan magasabb BMI és szignifikánsan alacsonyabb szérum OC szint volt kimutatható a kontroll csoporthoz képest (2. táblázat). 2. táblázat Demográfiai adatok és szérum csontmarker szintek endogén Cushing-szindrómában szenvedő betegekben és kontroll személyekben. Az eredmények bemutatása: median és szélső érték. *: p<0,001 vs. kontroll csoport
Betegek szám
161
Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek 87
Nő/férfi arány
118/43
69/18
Egészséges kontroll csoport
Átlag életkor, év
44 (16-63)
37 (15-74)
2
24.1 (17,3-41,2)
29,4 (18,6-55,8) *
Szérum β-CTx,, ng/ml
0,40 (0,01-1,32)
0,38 (0,05-2,82)
Szérum OC, ng/ml
23,1 (8,4-68,7)
9,9 (0,5-32,7) *
BMI, kg/m
5.1.2. Hormonkoncentrációk és szérum csontmarker szintek az endogén Cushingszindrómában szenvedő betegek három alcsoportjában A Cushing-kóros, az adrenális Cushing-szindrómás és az ektópiás Cushingszindrómás betegek reggeli, éjszakai és kis dózisú dxm után mért szérum kortizol
53
koncentrációit a betegség aktív stádiumában az 15. ábra szemlélteti. A legmagasabb szérum kortizol szintekkel az ektópiás Cushing-szindrómás betegek rendelkeztek. A szérum OC koncentrációk szignifikánsan alacsonyabbak voltak mind a három betegcsoportban az egészséges kontroll személyekhez viszonyítva. Az ektópiás Cushing-szindrómában a szérum β-CTx szintek szignifikánsan magasabbak voltak, mint a kontroll személyekben, ugyanakkor a Cushing-kóros és az adrenális Cushing-szindrómás betegek szérum β-CTx szintje nem mutatott eltérést a kontroll személyekhez viszonyítva.
A
B
C
D
E
15. ábra A reggeli (A), az éjféli (B) és a kis dózisú dxm után mért (C) szérum kortizol koncentrációk Cushing-kóros, adrenális Cushing-szindrómás és ektópiás Cushingszindrómás betegekben. Szérum OC (D) és szérum β-CTx (E) koncentrációk az endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben és egészséges kontroll személyekben.
54
Eredmények bemutatása: medián és 25-75%-os percentilis. HC: egészséges kontroll csoport, CD: Cushing-kór, ECS: ectopiás Cushing-szindróma, ACS: adrenális Cushing-szindróma, sOC: szérum OC, sCTX: szérum β-CTx *: p<0,05, **: p<0,01
5.1.3. A szérum csontmarkerek és kortizol koncentrációk, valamint a hypercortisolismus szövődményei közötti összefüggések vizsgálata az endogén Cushing-szindróma aktív szakaszában A reggeli, az éjszakai és a kis dózisú dxm után mért szérum kortizol koncentrációk negatív korrelációt mutattak a szérum OC, illetve pozitív korrelációt a szérum β-CTx szintekkel endogén Cushing-szindrómás betegekben (16. ábra). Az egyes betegcsoportokat külön-külön vizsgálva a szérum kortizol koncentrációk illetve csontmarker szintek közötti korrelációs kapcsolat megmaradt (3. táblázat). Szignifikáns összefüggés volt kimutatható a hypercortisolismus következtében kialakuló klinikai szövődmények és a szérum OC szintek között az IGT (IGT jelen van 8,6 ± 4,0 ng/ml vs. IGT nincs jelen 14,1 ± 7,7 ng/ml; p=0,03), a DM (DM jelen van 9,9 ± 5,1 ng/ml vs. DM nincs jelen 14,1 ± 7,7 ng/ml; p=0,04) és a myopathia (myopathia jelen van 8,3 ± 6,3 ng/ml vs. myopathia nincs jelen 12,2 ± 5,8 ng/ml; p=0,001) tekintetében, míg a csonttörések és a hypertonia vonatkozásában a szérum OC-nal hasonló összefüggés nem volt kimutatható. A szérum β-CTx koncentrációk nem mutattak összefüggést a fent említett klinikai szövődményekkel.
55
A
B r=0,76; p=1,9x10-14
r=-0,39; p=0,00081
C
D r=0,27; p=0,035
r=-0,54; p=0,0000041
E
F r=-0,53; p=0,000004
r=0,43; p=0,0004
16. ábra Szérum csontmarker koncentrációk és a reggeli (A, B), az éjszakai (C, D), és a kis dózisú dxm után mért (E, F) kortizol koncentrációk közötti lineáris korreláció az endogén Cushing-szindróma aktív szakaszában. sOC: szérum OC, sCTX: szérum β-CTx; dxm: dexamethason
56
3. táblázat Lineáris korrelációszámítás Cushing-kóros, adrenális Cushing-szindrómás és ektópiás Cushing-szindrómás betegek szérum csontmarker és kortizol koncentrációi között a betegség aktív stádiumában. r=korrelációs együttható; *p<0,05; ** p<0,01
Szérum OC – 08:00 kortizol
r=-0,27
Ektópiás Cushingszindróma r=-0,38
Szérum OC – 24:00 kortizol
r=-0,47 **
r=-0,85 *
r=-0,54*
Szérum OC - kis dózisú dxm utáni szérum kortizol Szérum β-CTx – 08:00 kortizol
r=-0,45 **
r=-0,66
r=-0,52*
r=0,46**
r=0,84 *
r=0,34
Szérum β-CTx – 08:00 kortizol
r=0,25
r=0,06
r=0,49 *
Szérum β-CTx - kis dózisú dxm utáni kortizol
r=0,36 *
r=-0,18
r=0,53 **
Cushing-kór
Adrenális Cushingszindróma r=-0,39
5.1.4. A csontépítés és a csontbontás közti összefüggés az endogén Cushing-szindróma aktív
szakaszában és a betegség gyógyulását követően illetve az egészséges kontroll csoportban Az endogén Cushing-szindróma aktív stádiumában nem volt összefüggés a szérum OC és β-CTx szintek között (17.A ábra), míg a betegség gyógyulását követően a szérum csontmarker szintek pozitív korrelációt mutattak egymással (17.B ábra; r= +0,80, p<0,001), hasonlóan az egészséges kontroll populációban észlelt korrelációhoz (17.C ábra r= +0,79, p<0,001).
57
A
B r=-0,14; p=0,23
C r=0,80; p=0,00
r=0,79; p=0,00
17. ábra Lineáris korreláció a szérum OC és a szérum β-CTx szintek között az endogén Cushing-szindróma aktív (A) és gyógyult (B) stádiumában, valamint egészséges kontroll csoportban (C). sOC: szérum OC, sCTX: szérum β-CTx
5.1.5. A szérum csontmarker koncentrációk változása az endogén Cushing-szindróma gyógyulását követően Az endogén Cushing-szindróma miatt operált betegek szérum OC és a szérum βCTx szintjeinek időbeni változását az 18. ábra mutatja be. A szérum OC szintek minden egyes posztoperatív mérési időpontban szignifikánsan magasabbak voltak a műtét előtti szérum OC koncentrációhoz képest (0, 1, 6, 12, 24, 36, 48 hónap). A szérum OC emelkedés csúcspontját a műtét utáni 6. hónapban érte el (59,1 ± 32,8 ng/ml), a referencia tartomány felső határát jóval meghaladva. A szérum OC szint szignifikánsan alacsonyabb volt a 24. hónapban (31,4 ±16,6 ng/ml) a 6. hónaphoz (59,1 ± 32,8 ng/ml) képest, míg a 12. hónapban (44,3 ± 27,5 ng/ml) mért szérum OC nem különbözött a 6. hónapban mért koncentrációtól. A 24. hónaptól a szérum OC szintek nem mutattak változást. Az endogén hypercortisolismus megszűnése nem okozott statisztikailag értékelhető eltérést a szérum CTx koncentrációkban.
58
90 80
sOC (ng/ml)
70 60 50 40 30 20 10 0 0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
Hónap 1,6 1,4
sCTX (ng/ml)
1,2 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
Hónap 18. ábra A szérum OC és a szérum β-CTx koncentrációk időbeni változása az endogén Cushing-szindróma aktív (0. hónap) és gyógyult stádiumában (posztoperatív 1., 6., 12., 24., 36., 48. hónap). A 0. az 1., a 6., a 12., a 24., a 36. és a 48. hónapban a betegek száma 71-23-19-12-8-5-12 a szérum OC és 69-23-19-12-8-5-12 a szérum β-CTx koncentrációknak megfelelően. Eredmények bemutatása: medián és 25-75%-os percentilis. Mindkét ábra esetében az első mérési pont a betegség aktív stádiumát, míg a második az első posztoperatív hónapot jelzi. sOC: szérum OC, sCTX: szérum β-CTx
59
5.1.6. A szérum OC lehetséges diagnosztikai értékének vizsgálata az endogén Cushingszindróma kórismézésében A szérum OC és β-CTx diagnosztikai értékének vizsgálatához használt ROC görbét a 19. ábra mutatja be. A szérum OC ROC-görbéjének görbe alatti területe (AUC) 0,9227 volt.
19. ábra ROC analízis a szérum OC és β-CTx diagnosztikai értékének vizsgálatához. 5.2.
A
glükokortikoid
receptor
genetikai
variánsainak
vizsgálata
endogén
hypercortisolismusban 5.2.1.Demográfiai adatok és hormonvizsgálati eredmények endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben és kontroll személyekben A GR BclI, N363S, ER22/23EK és az A3669G genetikai variánst 35 Cushing-kóros, 25 adrenális Cushing-szindrómás és 129 egészséges hazai populációból származó személyben vizsgáltam. Az adrenális Cushing-szindrómában szenvedő betegek, valamint a
60
kontroll személyek átlag életkora nem különbözött egymástól, míg a Cushing-kóros betegek átlag életkora szignifikánsan alacsonyabb volt a másik betegcsoporthoz, illetve a kontroll populációhoz viszonyítva (p <0,01). Az endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek BMI-e szignifikánsan magasabb volt, mint a kontroll csoport tagjaié (p <0,01). A Cushing-kóros betegek éjszakai és kis dózisú dxm utáni szérum kortizol szintjei szignifikánsan magasabbak voltak az adrenális Cushing-szindrómás betegek szérum kortizol szintjeihez képest (p <0,01). A vizsgált betegcsoportok és a kontroll populáció demográfiai adatait és hormonvizsgálati eredményeit az 4. táblázatban mutatom be. 4. táblázat Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek és a kontroll személyek demográfiai adatai és hormonvizsgálati eredményei. Referencia tartományok: plazma ACTH: 20-70 pg/ml; 08:00 szérum kortizol: 8-25 µg/dl; 24:00 szérum kortizol: <5 µg/dl; kis dózisú dxm utáni szérum kortizol <2,0 µg/dl. Eredmények bemutatása: átlag ± tapasztalati szórás. *: p<0,05 vs. adrenális Cushing-szindróma **: p<0,01 vs. adrenális Cushing-szindróma a : p<0,01 vs. egészséges kontroll csoport
Betegek száma
35
Cushingszindróma 25
Nő/férfi arány
30/5
22/3
94/35
Cushing-kór
Kontroll 129
Átlag életkor, év
34,63 ± 12,97**,a
46,88 ± 14,09
49,38 ± 14,95
BMI, kg/m2
30,15 ± 5,38a
30,09 ± 5,05 a
26,47 ± 4,7
08:00 plazma ACTH, pg/ml
141,83 ± 88,32**
4,75 ± 5,38
-
08:00 szérum kortizol, µg/dl
22,93 ± 11,16
17,93 ± 6,59
-
24:00 szérum kortizol, µg/dl
19,15 ± 13,0*
11,76 ± 6,74
-
kis dózisú dxm utáni szérum kortizol, µg/dl
17,84 ± 10,73*
12,33 ± 7,7
-
5.2.2.Oszteodenzitometriás paraméterek és csontmarkerek endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben és kontroll személyekben A lumbalis és a femorális régióban mért BMD, Z- és T-score értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a Cushing-kóros és adrenális Cushing-szindrómás betegekben a
61
kontroll populációhoz viszonyítva. Ugyanakkor a két betegcsoport között nem volt szignifikáns eltérés az oszteodenzitometriás paraméterek tekintetében. A szérum β-CTx Zscore értékek szignifikánsan magasabbak voltak Cushing-kóros betegekben, az adrenális Cushing-szindrómában
szenvedő
betegek,
illetve
a
kontroll
személyek
szérum
koncentrációihoz viszonyítva (5. táblázat). 5. táblázat Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek és kontroll személyek oszteodenzitometriás paraméterei és szérum csontmarker értékei. N: vizsgált személyek száma. Oszteodenzitometriás eredmények bemutatása: átlag ± tapasztalati szórás. *: p<0,05 vs. kontroll csoport **: p<0,01 vs. kontroll csoport a : p<0,05 vs. adrenális Cushing-szindróma
Cushing-kór
N
Cushingszindróma
N
Kontroll
N
0,884 ± 0,126**
(34)
0,859 ± 0,112**
(25)
1,051 ± 0,183
(129)
Lumbalis 1-4 Z-score
-1,15 ± 1,23**
(35)
-1,12 ± 1,05**
(25)
-0,12 ± 1,13
(129)
Lumbalis 1-4 T-score
-1,52 ± 1,15**
(35)
-1,76 ± 1,02**
(25)
-0,44 ± 1,07
(129)
0,842 ± 0,119**
(32)
0,823 ± 0,128**
(25)
0,997 ± 0,147
(23)
-0,65 ± 1,02*
(30)
-0,60 ± 1,00 *
(25)
+0,11 ± 1,10
(23)
-0,91 ± 1,00**
(32)
-1,05 ± 1,01**
(25)
+0,03 ± 1,10
(23)
0,752 ± 0,101**
(34)
0,705 ± 0,112**
(25)
0,872 ± 0,114
(129)
-0,61 ± 0,93**
(33)
-0,54 ± 0,98**
(25)
+0,15 ± 0,97
(129)
-1,01 ± 0,92
(35)
-1,35 ± 0,99
(25)
-0,96 ± 1,03
(129)
0,984 ± 0,138 **
(32)
0,980 ± 0,159**
(25)
1,161 ± 0,167
(23)
Intertrochanterikus Z-score
-0,64 ± 0,91**
(30)
-0,49 ± 1,00*
(25)
+0,11 ± 1,02
(23)
Intertrochanterikus T-score
-0,83 ± 0,92 **
(32)
-0,84 ± 1,00**
(25)
+0,04 ± 1,01
(23)
Trochanterikus BMD, g/cm2
0,623 ± 0,105**
(32)
0,602 ± 0,103**
(25)
0,763 ± 0,123
(23)
Trochanterikus Z-score
-0,68 ± 1,13**
(30)
-0,69 ± 0,95**
(25)
+0,27 ± 1,16
(23)
Trochanterikus T-score
-0,88 ± 1,06**
(32)
-1,08 ± 0,95**
(25)
+0,18 ± 1,16
(23)
(26)
15.91 ± 10.16**
(15)
25.18 ± 9.86
(115)
(26)
0.37 ± 0.20
(15)
0.44 ± 0.20
(114)
(26)
+ 0,006 ± 1,09
(15)
+0,18 ± 1,23
(114)
Lumbalis 1-4 BMD, g/cm2
Teljes femur BMD, g/cm2 Teljes femur Z-score Teljes femur T- score 2
Femur-nyak BMD, g/cm Femur-nyak Z-score Femur-nyak T-score
Intertrochanterikus BMD, g/cm
Szérum OC, ng/ml Szérum β-CTx, ng/ml Szérum β-CTx, Z-score
2
, a,
11.20 ± 7.39** 0.52 ± 0.31
,a
+1,41 ± 2,28 *
62
5.2.3. GR gén polimorfizmusok allél gyakorisága endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben és kontroll személyekben A BclI, N363S, ER22/23EK és az A3669G genetikai variánsok allél gyakorisága nem mutatott szignifikáns eltérést a Cushing-kóros és az adrenális Cushing-szindrómás betegek között. Az egyes betegcsoportok allél gyakorisága nem különbözött a kontroll populációban észlelt gyakoriságtól (6. táblázat). A BclI és az A3669G variánsok genotípus eloszlása mindhárom csoportban megfelelt a Hardy-Weinberg egyensúlynak, míg az N363S és az ER22/23EK polimorfizmusok alacsony allél gyakorisága nem tette lehetővé a HardyWeinberg egyensúly kiszámítását. 6. táblázat GR gén polimorfizmusok genotípus megoszlása és allél gyakorisága endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben és kontroll személyekben. Cushing-kór (n=35) Genotípus megoszlás BclI CC CG GG N363S AA AG GG A3669G AA AG GG ER22/23EK GG GA AA
10 21 4
(28,6%) (60,0%) (11,4%)
33 2 0
Cushing-szindróma (n=25)
Polimorf allél Genotípus gyakorisága megoszlás
0,41
14 (56,0%) 9 (36,0%) 2 (8,0%)
(94,3%) (5,7%)
0,03
22 13 0
(62,9%) (37,1%)
34 1 0
(97,1%) (2,9%)
Polimorf allél gyakorisága
Kontroll (n=129) Genotípus megoszlás
Polimorf allél gyakorisága
0,26
54 (41,9%) 61 (47,3%) 14 (10,8%)
0,34
23 (92,0%) 2 (8,0%) 0
0,04
122 (94,6%) 7 (5,4%) 0
0,03
0,18
17 (68,0%) 8 (32,0%) 0
0,16
82 (63,6%) 37 (28,7%) 10 (7,7%)
0,22
0,014
25 0 0
0,00
127 (98,4%) 2 (1,6%) 0
0,01
63
(100%)
5.2.4. GR gén polimorfizmusok, hormonvizsgálati eredmények és a betegség becsült időtartama közti összefüggés endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben nem volt kimutatható szignifikáns összefüggés a vizsgált GR gén polimorfizmusok és a plazma ACTH, valamint a szérum kortizol koncentrációk (08:00, 24:00, kis dózisú dxm után) között. Az egyes genotípusok nem mutattak összefüggést a betegség becsült kezdetétől számított betegségtartammal (BclI CC, CG és GG genotípusoknak megfelelően 3,96 ± 3,34, 4,02 ± 3,46 és 1,6 ± 0,55 év, N363S AA és AG genotípusoknak megfelelően 3,90 ± 3,36 és 2,25 ± 1,89 év, A3669G AA és AG genotípusoknak megfelelően 3,22 ± 2,82 és 4,89 ± 3,92 év). 5.2.5. GR gén polimorfizmusok, oszteodenzitometriás paraméterek és a szérum csontmarker koncentrációk közti összefüggés endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben 60 endogén hypercortisolismusban szenvedő beteg vizsgálata során a BclI polimorfizmust homozigóta (GG) formában hordozó, a femur-nyak és a trochanterikus régióban mért Z-score értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a polimorf allélt (CC) nem hordozó személyekhez képest (femur nyak Z-score: –1,44 ± 0,73 vs. –0,39 ± 0,91; trochanterikus Z-score: –1,89 ± 0,47 vs. –0,54 ± 0,98). A lumbális régióban nem volt kimutatható összefüggés a BclI polimorfizmus hordozása és a Z-score értékek között (7. táblázat, 16. ábra). A kontroll populációban a BclI polimorfizmus különböző genotípusai között nem volt eltérés a lumbális és a femorális régióban mért Z-score értékekben. A N363S, az ER22/23EK és az A3669G polimorfizmus esetében nem találtunk összefüggést a különböző területeken mért oszteodenzitometriás paraméterekkel és szérum csontmarker koncentrációkkal. A
BclI
polimorfizmust
homozigóta
(GG)
formában
hordozó
endogén
hypercortisolismusban szenvedő betegek szérum β-CTx koncentrációi magasabbak voltak a
64
polimorfizmust heterozigóta (CG) formában hordozó, illetve a polimorf allélt nem hordozó (CC) betegekhez képest (β-CTx Z-score: +4,42 ± 2,37 vs. +0,79 ± 1,67 és +0,11 ± 1,47) (7. táblázat, 20. ábra). BclI genotípusok nem mutattak összefüggést a szérum OC szintekkel a vizsgált két betegcsoportban, illetve a szérum csontmarker koncentrációkkal az egészséges kontroll populációban. 7. táblázat Oszteodenzitometriás paraméterek és szérum csontmarker koncentrációk a BclI genotípus szerint, endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben. Adatok bemutatása: átlag ± tapasztalati szórás. P*: ANOVA /ANCOVA szignifikancia vizsgálat eredménye. a : adjusztálva korra, nemre és BMI-re; b: adjusztálva korra, nemre BclI genotípusok CC
CG
GG
P*
+0,883 ± 0,136
+0,874 ± 0,115
+0,833 ± 0,068
0,46a
Lumbalis 1-4 Z-score
-0,98 ± 1,16
-1,11 ± 1,20
-1,85 ± 0,56
0,25
Lumbalis 1-4 T-score
-1,53 ± 1,24
-1,61 ± 1,06
-2,01 ± 0,64
0,64
+0,835 ± 0,130
+0,847 ± 0,119
+0,725 ± 0,018
0,25 a
Teljes femur Z-score
-0,54 ± 1,00
-0,53 ± 1,00
-1,74 ± 0,11
0,067
Teljes femur T- score
-0,94 ± 1,05
-0,87 ± 0,97
-1,86 ± 0,11
0,05
+0,731 ± 0,124
+0,743 ± 0,097
+0,683 ± 0,081
0,19 a
Femur-nyak-score
-0,39 ± 0,91
-0,55 ± 0,94
-1,44 ± 0,73
0,048
Femur-nyak T-score
-1,13 ± 1,06
-1,08 ± 0,88
-1,61 ± 0,87
0,47
+0,981 ± 0,156
+1,000 ± 0,142
+0,866 ± 0,052
0,32 a
Intertrochanterikus Z-score
-0,55 ± 1,00
-0,45 ± 0,91
-1,51 ± 0,20
0,10
Intertrochanterikus T-score
-0,82 ± 1,00
-0,74 ± 0,93
-1,62 ± 0,12
0,07
Trochanterikus BMD, g/cm2
+0,621 ± 0,104
+0,621 ± 0,106
+0,515 ± 0,041
0,25 a
Trochanterikus Z-score
-0,54 ± 0,98
-0,63 ± 1,07
-1,89 ± 0,47
0,049
Trochanterikus T-score
-0,88 ± 0,99
-0,90 ± 1,02
-1,98 ± 0,57
0,078
Szérum OC, ng/ml
11.77 ± 6.61
12.83 ± 9.05
17.77 ± 13.89
0,14 b
0.90 ± 0.32
0,005 b
+4,42 ± 2,37
0,0002
Lumbalis 1-4 BMD, g/cm2
Teljes femur BMD, g/cm2
Femur-nyak BMD, g/cm2
Intertrochanterikus BMD, g/cm2
Szérum β-CTx, ng/ml Szérum β-CTx Z-score
0.39 ± 0.26 +0,11 ± 1,47
65
0.44 ± 0.22 +0,79 ± 1,67
Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek
Kontroll személyek
A
D
B
E
C
F
20. ábra Femur-nyak és trochanterikus, valamint β-CTx z-score értékek endogén hypercortisolismusban és egészséges egyénekben, a BclI genotípus szerinti bontásban.
66
Adatok ábrázolása átlag ± átlag szórása. *: BclI GG vs.CC, p<0,05; **: BclI GG vs.CG and CC, p<0,01 A, B, C: Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek; D, E, F: Egészséges kontroll csoport
5.3. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim genetikai variánsainak kimutatása új allélspecifikus PCR módszer segítségével A HSD11B1 génen található rs846910 és rs846911 polimorfizmus vizsgálatára kidolgozott új allél-specifikus módszert az ”Molekuláris genetikai vizsgálatok” alfejezetben részleteztem. 5.4. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim genetikai variánsainak vizsgálata endogén hypercortisolismusban 5.4.1. Demográfiai adatok, hormonvizsgálati eredmények és oszteodenzitometriás paraméterek
endogén
hypercortisolismusban
szenvedő
betegekben
és
kontroll
személyekben A HSD11B1 génen található rs846910, rs846911 és 83,557insA genetikai variánsokat 41 Cushing-kóros, 32 adrenális Cushing-szindrómás és 129 egészséges, hazai populációból származó személyben vizsgáltam.
Az adrenális Cushing-szindrómában
szenvedő betegek valamint a kontroll személyek átlag életkora nem különbözött egymástól, míg a Cushing-kóros betegek átlag életkora alacsonyabb volt a másik betegcsoporthoz illetve a kontroll populációhoz viszonyítva (p<0,01). Az endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek BMI-e magasabb volt, mint a kontroll csoporté (p<0,01). A Cushingkóros betegek éjszakai szérum kortizol szintjei szignifikánsan magasabbak voltak az adrenális Cushing-szindrómás betegek szérum kortizol szintjeinél (p<0,01). A vizsgált betegcsoportok és a kontroll populáció demográfiai adatai és hormonvizsgálati eredményei az 8. táblázatban lettek feltüntetve. A lumbalis és a femorális régióban mért BMD, Z- és T-score értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a Cushing-kóros és az adrenális Cushing-szindrómás betegekben a kontroll populációhoz viszonyítva. Ugyanakkor a két betegcsoport között nem volt
67
kimutatható szignifikáns eltérés az oszteodenzitometriás paraméterek tekintetében. A szérum OC értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak a hypercortisolismusban szenvedő betegekben, mint a kontroll csoportban (9. táblázat). 8. táblázat Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek és a kontroll személyek demográfiai adatai és hormon szintjei. Referencia tartomány: plazma ACTH: 20-70 pg/ml; 08:00 szérum kortizol: 8-25 µg/dl; 24:00 szérum kortizol: <5 µg/dl; kis dózisú dxm utáni szérum kortizol <2,0 µg/dl. Eredmények bemutatása: átlag ± tapasztalati szórás. *: p<0,05 vs. adrenális Cushing-szindróma **: p<0,01 vs. adrenális Cushing-szindróma a : p<0,01 vs. egészséges kontroll csoport Cushing-kór
Cushingszindróma
Kontroll
Betegek száma
41
32
129
Nő/férfi arány
35/6
27/5
94/35
Átlag életkor, év BMI, kg/m
2
34,46 ± 12,30** 30,53 ± 6,73
,a
a
48,66 ± 13,60 29,74 ± 5,84
a
49,38 ± 14,95 26,47 ± 4,7
08:00 plazma ACTH, pg/ml
142,04 ± 133,28**
5,34 ± 7,58
-
08:00 szérum kortizol, µg/dl
22,86 ± 11,32
19,48 ± 10,48
-
24:00 szérum kortizol, µg/dl
19,82 ± 13,27*
14,31 ± 11,47
-
kis dózisú dxm utáni szérum kortizol, µg/dl
17,82 ± 9,62
14,89 ± 11,67
-
68
9. táblázat Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek és kontroll személyek oszteodenzitometriás paraméterei és szérum csontmarker értékei. N: vizsgált személyek száma. Oszteodenzitometriás eredmények bemutatása: átlag ± tapasztalati szórás. *: p<0,05 vs. kontroll csoport **: p<0,01 vs. kontroll csoport a : p<0,05 vs. adrenális Cushing-szindróma
Cushing-kór
Cushingszindróma
Kontroll
Lumbalis 1-4 BMD, g/cm2
0,878 ± 0,127**
0,863 ± 0,117**
1,051 ± 0,183
Lumbalis 1-4 Z-score
-1,21 ± 1,27**
-1,05 ± 1,12**
-0,12 ± 1,13
Teljes femur BMD, g/cm2
0,843 ± 0,117**
0,833 ± 0,132**
0,997 ± 0,147
Teljes femur Z-score
-0,66 ± 1,01**
-0,48 ± 1,09
+0,11 ± 1,10
Femur-nyak BMD, g/cm2
0,744 ± 0,105**
0,722 ± 0,119**
0,872 ± 0,114
Femur-nyak Z-score
-0,67 ± 0,97**
-0,36 ± 1,10*
+0,15 ± 0,97
Intertrochanterikus BMD, g/cm2
0,988 ± 0,138 **
0,989 ± 0,164**
1,161 ± 0,167
Intertrochanterikus Z-score
-0,63 ± 0,89**
-0,41 ± 1,10
+0,11 ± 1,02
Trochanterikus BMD, g/cm2
0,622 ± 0,104**
0,631 ± 0,108**
0,763 ± 0,123
Trochanterikus Z-score
-0,71 ± 1,13**
-0,54 ± 1,07*
+0,27 ± 1,16
Szérum OC, ng/ml
10,21 ± 5,39**
14,38 ± 9,95**
25,18 ± 9,86
0,47 ± 0,28
0,39 ± 0,22
0,44 ± 0,20
Szérum β-CTx, ng/ml
5.2.2.A HSD11B1 gén polimorfizmusok allél gyakorisága endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben és kontroll személyekben Az rs846910, rs846911 és 83,557insA genetikai variánsok allél gyakorisága nem mutatott szignifikáns eltérést a Cushing-kóros és az adrenális Cushing-szindrómás betegek között. Az egyes betegcsoportok allél gyakorisága szintén nem különbözött a kontroll populációban észlelt gyakoriságtól (10. táblázat). A rs846910 és a 83,557insA variánsok genotípus eloszlása mindhárom csoportban megfelelt a Hardy-Weinberg egyensúlynak, míg az rs846911 polimorfizmus alacsony allél gyakorisága nem tette lehetővé a HardyWeinberg egyensúly vizsgálatát.
69
10. táblázat A HSD11B1 gén polimorfizmusok genotípus megoszlása és allél gyakorisága endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben és kontroll személyekben. Cushing-szindróma
Cushing-kór (n=41) 83,557insA -/-/A A/A Polimorf allél gyakoriság rs846910 G/G A/G A/A Polimorf allél gyakoriság rs846911 C/C A/C A/A Polimorf allél gyakoriság
29 11 1
(70,7%) (26,9%) (2,4%)
23 9 0
0,16 38 3 0
(71,9%) (28,1%) (0%)
0,14 (92,7%) (7,3%) (0%)
29 3 0
0,04 41 0 0
Kontroll (n=129)
(n=32)
32 0 0
0
0
(66,7%) (31,0%) (2,3%)
0,18 (90,6%) (9,4%) (0%)
0,05 (100%) (0%) (0%)
86 40 3
119 9 1
(92,2%) (7,0%) (0,8%)
0,04 (100%) (0%) (0%)
129 0 0
(100%) (0%) (0%)
0
5.2.3. A HSD11B1 gén 83,557insA polimorfizmusa és klinikai paraméterek közti összefüggés hiánya egészséges kontroll populációban Az egészséges kontroll populációban nem volt kimutatható összefüggés a 83,557insA polimorfizmus, valamint a BMI, lumbális és femorális BMD, illetve csontmarker értékek között. 5.2.4. A 83,557insA polimorfizmus és klinikai paraméterek közti összefüggés adrenális Cushing-szindrómában szenvedő betegekben A reggeli, az éjszakai és a kis dózisú dxm után mért szérum kortizol koncentrációkban nem volt különbség a 83,557insA-t hordozó és nem hordozó, adrenális Cushing-szindrómában szenvedő betegekben. Ugyanakkor az ACTH szintek összefüggést
70
mutattak a 83,557insA polimorfizmus hordozásával; a 83,557insA-t heterozigóta formában hordozó adrenális Cushing-szindrómás betegek plazma ACTH koncentrációi szignifikánsan magasabbak (azaz kevésbé szupprimáltak) voltak a polimorfizmust nem hordozó betegekhez viszonyítva (7,38 ± 4,05 pg/ml vs. 4,81 ± 8,25 pg/ml, p=0,025). Emellett a 83,557insA-t hordozókban a mellékvese daganat mérete kisebb volt, mint a polimorfizmust nem hordozók daganata (28,44 ± 9,91 mm vs. 51,05 ± 38,53 mm, p=0,03) (4. táblázat). Cushing-kóros betegekben a 83,557insA polimorfizmus nem mutatott összefüggést a plazma ACTH szintekkel, kortizol értékekkel, a betegség fennállásának idejével és BMI-vel (11. táblázat). 11. táblázat Hormon eredmények és klinikai paraméterek a 83,557insA genotípus szerinti bontásban, endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben. ∆ kortizol: kis dózisú dxm utáni szérum kortizol szint csökkenés a 08:00 szérum kortizol értékekhez viszonyítva
Cushing-szindróma
08:00 plazma ACTH, pg/ml 08:00 szérum kortizol, µg/dl 24:00 szérum kortizol, µg/dl kis dózisú dxm utáni szérum kortizol, µg/dl ∆ szérum kortizol, µg/dl Átlag életkor, év BMI, kg/m2 Mellékvese tumor méret, mm
Cushing-kór
83,557insA nem hordozók
83,557insA hordozók
P
83,557insA nem hordozók
83,557insA hordozók
P
4,81 ± 8,25
7,38 ± 4,05
0,025
143,66 ± 91,22
138,41 ± 204,15
0,11
19,62 ± 11,53
19,00 ± 6,58
0,73
24,55 ± 11,97
19,07 ± 9,00
0,20
15,63 ± 12,40
9,50 ± 5,39
0,17
19,36 ± 12,15
20,93 ± 16,20
0,80
16,63 ± 12,51
9,43 ± 6,45
0,09
18,18 ± 9,22
16,94 ± 10,94
0,69
2,70 ± 8,65
9,57 ± 10,55
0,09
6,37 ± 7,98
2,77 ± 4,94
0,17
45,78 ± 11,77
56,00 ± 15,87
0,05
36,59 ± 12,61
29,33 ± 10,24
0,09
29,92 ± 6,69
29,21 ± 1,95
0,79
31,14 ± 7,02
29,08 ± 6,03
0,22
51,05 ± 38,53
28,44 ± 9,91
0,03
71
5.2.5. A 83,557insA polimorfizmus és csontmarkerek közötti összefüggés endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben A 83,557insA polimorfizmust hordozó, endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben szignifikánsan magasabb szérum OC szinteket tudtam kimutatni a polimorf allélt nem hordozó betegekhez képest (15,88 ± 10,24 ng/ml vs. 10,24 ± 5,87 ng/ml, p=0,027). Ugyanakkor nem volt kimutatható összefüggés a polimorfizmus hordozása és a különböző területeken mért oszteodenzitometriás paraméterek között (12. táblázat). A 83,557insA polimorfizmus és a csontanyagcsere paraméterek közötti összefüggés statisztikai elemzését kovariancia analízis segítségével is elvégeztem. A csontanyagcserét befolyásoló tényezők figyelembevétele mellett (kor, nem és BMI) szintén kimutatható volt az 83,557insA hordozása és a szérum OC szintek közötti összefüggés (13. táblázat). 12. táblázat Oszteodenzitometriás paraméterek és szérum csontmarkerek 83,557insA genotípus szerinti bontásban, endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben. 83,557insA nem hordozók
hordozók
P
0,876 ± 0,129
0,860 ± 0,106
0,64
-1,13 ± 1,20
-1,16 ± 1,24
0,93
0,841 ± 0,134
0,835 ± 0,097
0,873
-0,60 ± 1,14
-0,52 ± 0,77
0,80
0,743 ± 0,118
0,712 ± 0,091
0,33
-0,47 ± 1,11
-0,66 ± 0,82
0,52
0,981 ± 0,727
1,005 ± 0,126
0,42
-0,62 ± 1,05
-0,30 ± 0,75
0,12
0,627 ± 0,116
0,598 ± 0,071
0,35
Trochanterikus Z-score
-0,59 ± 1,22
-0,74 ± 0,74
0,63
Szérum β-CTx, ng/ml
0,43 ± 0,28
0,46 ± 0,20
0,44
Szérum OC, ng/ml
10,24 ± 5,87
15,88 ± 10,24
0,027
Lumbalis 1-4 BMD, g/cm2 Lumbalis 1-4 Z-score Teljes femur BMD, g/cm2 Teljes femur Z-score Femur-nyak BMD, g/cm2 Femur-nyak Z-score Intertrochanterikus BMD, g/cm2 Intertrochanterikus Z-score Trochanterikus BMD, g/cm
2
72
13. táblázat Szérum csontmarkerek és a 83,557insA polimorfizmus közötti összefüggés vizsgálata kovariancia analízis segítségével, endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben. Endogén Cushing-szindróma statisztikai P modell 83,557insA 0,953
Kontroll statisztikai P modell 83,557insA 0,727 Szérum
Kor
0,237
Kor
0,189
β-CTx
Nem
0,828
Nem
0,423
BMI
0,097
BMI
0,482
83,557insA
0,839
83,557insA
0,004
Kor
0,206
Kor
0,015
Nem
0,114
Nem
0,024
BMI
0,059
BMI
0,07
Szérum OC
73
6. MEGBESZÉLÉS
6.1.
A
glükokortikoidok
csontanyagcserét
befolyásoló
hatása
endogén
hypercortisolismusban és annak gyógyulását követően Ebben a tanulmányban endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek csontanyagcsere változásait vizsgáltuk a betegség aktív, illetve gyógyult stádiumában. A csontanyagcsere változását a gyógyulást eredményező műtétet követő első 4 éven át elemeztük. Az irodalomban megjelent korábbi kutatási eredményekhez hasonlóan (111-115), az általunk vizsgált betegcsoportban a Cushing-szindróma aktív stádiumában, a szérum OC koncentrációk szignifikánsan alacsonyabbak voltak az egészséges kontroll populációhoz viszonyítva. A Cushing-kóros, az adrenális Cushing-szindrómás betegek csont-reszorpciós markere (β-CTx) nem különbözött az egészséges kontrollokétól. A szérum kortizol koncentrációk alapján az endogén hypercortisolismus a legkifejezettebb az ektópiás Cushing-szindrómás betegek csoportjában volt, a csontbontás egyedül ebben a csoportban volt fokozott. A glükokortikoidok csont-reszorpcióra gyakorolt hatását vizsgáló tanulmányok értékelésekor figyelembe kell venni, hogy akut –és többnyire közép, vagy nagydózisú, exogén-, vagy krónikus (mint például az endogén hypercortisolismusok) glükokortikoid túlsúlyról van-e szó. Akutan, nagy dózisban alkalmazott exogén glükokortikoid hatására emelkedik, majd a 8. naptól csökken a szérum β-CTx koncentráció (13), míg krónikus glükokortikoid túltermelés -endogén Cushing-szindróma- esetén, a csont-reszorpció az irodalmi adatok alpján nem egységes: normális (14-17), csökkent (15, 18, 19) vagy emelkedett (20-22). Ezek értelmében az általunk vizsgált betegcsoport közül, az általában rövid idő alatt kialakuló, a kifejezett hypercortisolismus miatt rendszerint korai stádiumban felismert ektópiás Cushing-szindrómás betegek esetén észleltünk fokozott csont-reszorpciót. A betegség aktív stádiumában, a szérum OC negatív, míg a -CTx koncentrációk pozitív korrelációt mutattak a szérum kortizol értékekkel, ennek megfelelően a normális csontanyagcserére jellemző korreláció a csont formációs és reszorpciós markerek között nem volt kimutatható. Ezen eredmények klinikai jelentőségét alátámasztja, hogy
74
betegeinkben a szérum OC szintek szignifikáns összefüggést mutattak az endogén hypercortisolismus következtében kialakult tünetekkel (DM, myopathia). Eredményeink alapján felvetjük annak a lehetőségét, hogy a csont-formációt tükröző szérum OC alkalmas lehet a glükokortikoid aktivitás, illetve Cushing-szindrómában a betegség súlyosságának megítélésére. Kiemeljük továbbá azt a megfigyelésünket, mely szerint Cushing-szindrómás betegekben a csontmarkerek és a szérum kortizol szintek között szoros korreláció áll fenn. Megjegyezzük, hogy számos korábbi vizsgálatban -egyetlen kis esetszámú vizsgálat kivételével (12 beteg) (111)-, nem volt kimutatható korreláció a csontmarkerek és a vizelettel ürülő szabad (16, 21, 116, 117), illetve szérum kortizol koncentrációk között (15, 21, 116). A szérum kortizol koncentrációk az ektópiás Cushing-szindrómában szenvedő betegeinkben voltak a legmagasabbak és ezekben a betegekben volt a szérum OC a legalacsonyabb, míg a -CTx a legmagasabb. A relatíve nagyszámú, endogén Cushingszindrómás beteg vizsgálata során nyert eredményeink, újabb adalékul szolgálnak a glükokortikoid-túltermelésnek a csontanyagcserére gyakorolt hatásával kapcsolatos korábbi ismereteinkhez. Más munkacsoportok, illetve saját munkacsoportunk egy korábbi vizsgálatában a BMD értékek nem mutattak korrelációt sem a szérum (21, 116-118), sem pedig a vizelettel ürülő (16, 116, 117, 119, 120) szabad kortizol koncentrációkkal. Endogén
hypercortisolismusban
szenvedő
betegeken
tett
megfigyeléseinkkel
ellentétben, egészséges egyénekben a reggeli szérum kortizol szint nem mutatott összefüggést a reggeli OC valamint a vizelettel ürülő I-es típusú kollagén amino-terminális telopeptid koncentrációival (121). Ugyanakkor a dolgozat szerzői szoros korrelációt mutattak ki a szérum kortizon és OC szintek között, amit a HSD11B1 enzim osteoblast sejtekben való jelenléte indirekt bizonyítékaként interpretáltak. A szérum kortizol és OC koncentrációk közötti viszonynak az egészséges és a Cushing-szindrómás egyénekben megfigyelt különbözőségének ellentmondása feloldható úgy, ha feltételezzük, hogy a szérum kortizol koncentrációnak létezik egy olyan –a fiziológiás kortizol koncentráció felső határa körüli- köszöbértéke, ami alatt a kortizol csak minimális, felette azonban jelentős hatással bír a csontszövetre. Ezen feltételezés helyességét támasztja alá az a korábbi megfigyelés is, miszerint, egészséges nőkben a szérum kortizol koncentrációk csak a kóros tartomány felső harmadában mutattak összefüggést a BMD értékekkel (106). A szérum
75
kortizol fiziológiás cirkadián ingadozása szintén egy lehetséges magyarázata lehet a reggeli kortizol és OC szintek közötti korreláció hiányának az egészséges populációban. A szérum OC koncentrációk ugyanis mintegy 6 órával követik a szérum kortizol koncentrációban bekövetkező változásokat, így lehetséges, hogy egészséges személyekben a reggeli OC szintek elsősorban az éjszakai kortizol koncentrációt tükrözik. Az endogén Cushing-szindróma műtéti kezelését követően 48 hónapig követtük a szérum OC és a szérum β-CTx szintek időbeni változását. A szérum OC szintek már a posztoperatív első napokban-hetekben jelentős emelkedést mutattak, az emelkedés a csúcspontját a műtét utáni 6. hónapban érte el. A 24. hónaptól a szérum OC szintek nem mutattak változást. Az endogén hypercortisolismus megszűnése nem okozott statisztikailag értékelhető eltérést a szérum β-CTx koncentrációkban a 4 éves utánkövetési periódus alatt. Kristo és munkatársai írták le elsőként a megváltozott csontátépülés helyreállását az endogén Cushing-szindróma gyógyulása után, melyet az általunk kapott eredmények teljes mértékben megerősítenek (113). A szérum OC-nak a különböző mértékű glükokortikoid hatásokra vonatkozó gyors válaszreakciója, az endogén Cushing-szindrómás betegek szérum kortizol koncentrációval való szoros összefüggése, illetve a Cushing-szindróma gyógyulását követő gyors és nagy mértékű változása adta meg számunkra arra az alapot, hogy megvizsgáljuk, felhasználhatóe a szérum OC meghatározás az endogén Cushing-szindrómás betegeknek az egészségesektől való elkülönítésére. A szérum OC diagnosztikai értékének vizsgálata során a ROC analízissel nyert görbe alatti terület (0,9227) alig volt kisebb, mint az endogén Cushing-szindróma diagnózisára jelenleg ajánlott és használt legjobb tesztek görbe alatti területe (vizelet szabad kortizol ürítés, 0,9645; éjféli szérum kortizol, 0,9730; rövid kis dózisú dxm teszt, 0,9771; hosszú kis dózisú dxm teszt, 0,9399) (122, 123). Eredményeink azt mutatják, hogy a szérum OC meghatározásnak a hypercortisolismust eredményező állapotok elkülönítő diagnosztikájában lehet szerepe.
76
6.2. A glükokortikoid receptor gén BclI polimorfizmusa és a csontanyagcsere közötti összefüggés endogén hypercortisolismusban Munkám során a GR gén négy polimorfizmusának a jelentőségét vizsgáltam endogén hypercortisolismussal járó állapotokban (BclI, N363S, ER22/23EK és az A3669G). Az általam vizsgált genetikai variánsok allél gyakorisága nem mutatott szignifikáns eltérést a Cushing-kóros és a Cushing-szindrómás betegek között, illetve az egyes betegcsoportok allél gyakorisága szintén nem különbözött a kontroll populációban észlelt gyakoriságtól. Az egyes polimorfizmusok előfordulási gyakorisága a nemzetközi irodalomban közölt egészséges kaukázusi populációban észlelt gyakorisággal megegyezett
(40, 56, 106, 109, 125). Ezen eredményeim azt mutatják, hogy a vizsgált 4 GR gén variáns nem befolyásolja az endogén hypercortisolismussal járó állapotok kialakulását. A
BclI
polimorfizmust
homozigóta
formában
hordozó,
endogén
hypercortisolismusban szenvedő betegekben a femur-nyak és a trochanterikus régióban mért Z-score értékek szignifikánsan alacsonyabbak voltak, mint a polimorf allélt nem hordozó személyekben. A polimorf allélt hordozó betegekben szignifikánsan magasabb ß-CTx szinteket tudtunk kimutatni a nem hordozókhoz képest. A heterozigóta (CG) és a vad genotípusú (CC) betegekben a BMD z-score értékek eltérésének hiánya felveti annak a lehetőségét, hogy a BclI-es polimorfizmus elsősorban homozigóta pozitív formában fejti ki hatását. A glükokortikoidok iránti érzékenység nagyfokú egyéni variabilitást mutat, melyért a kortizol biológiai hatását közvetítő GR, illetve a sejteket érő aktív glükokortikoid mennyiségét alapvetően meghatározó HSD11B1 enzim tehető felelőssé (6). Számos tanulmány vizsgálta a GR gén polimorfizmusok szövet-specifikus glükokortikoid érzékenységet befolyásoló hatását (35, 40, 125), ugyanakkor a GR gén polimorfizmusok csontszövettel való kapcsolatáról mindössze két tanulmány jelent meg eddig az irodalomban. Az N363S polimorfizmus esetében a polimorf allélt hordozó személyeket alacsonyabb BMD értékek jellemezték a lumbális régióban (105). Egy másik, 858 egészséges személyt magában foglaló tanulmányban összefüggés volt kimutatható a BclI polimorfizmus hordozása és BMD között (106).
77
A munkám során vizsgált, endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben, a legalacsonyabb BMD Z-score értékeket a lumbális régióban tudtam kimutatni, amit más szerzők által közölt nemzetközi irodalmi adatok is alátámasztanak (114, 118). Ugyanakkor a lumbális régióban nem találtam összefüggést a BclI polimorfizmus hordozása és a Zscore értékek között. Az eltérő glükokortikoid hatás kialakításában a genetikai polimorfizmusok glükokortikoid érzékenységet befolyásoló hatása mellett számos más tényező is fontos szerpet játszhat. Ismert, hogy a glükokortikoid hatás jobban érvényesül a trabekuláris csontokon, mint a kortikális állományon, valamint a csontvesztés mértéke az axiális csontokon jelentősebb, mint a perifériás csontokon. Ennek oka valószínűleg a trabekuláris állomány kortikális állományhoz viszonyított gyorsabb anyagcseréjében, nagyobb felület/térfogat hányadosában, illetve a centrális és a perifériás csontszövet eltérő glükokortikoid érzékenységben keresendő (96, 97). Munkám során a csontmarkerek és a BclI polimorfizmus közötti kapcsolat vizsgálatakor a ß-CTx szintekkel ellentétben a BclI-es polimorfizmus és a szérum OC szintek között nem volt kimutatható összefüggés az általam vizsgált betegpopulációban. Az egészséges kontroll populációban a BclI-es polimorfizmus nem mutatott összefüggést sem a femorális régióban mért Z-score értékekkel, sem pedig a ß-CTx szintekkel, ami azt jelzi, hogy egy adott polimorfizmus meglétének funkcionális következménye nemcsak a genetikai variáns minőségének, hanem a hormonális miliőnek is a függvénye. Az endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben a plazma kortizol koncentrációk nem mutattak összefüggést a vizsgált négy GR gén polimorfizmussal. Ennek kapcsán felmerül, hogy a Cushing-kór és a Cushing-szindróma következtében létrejött hypercortisolismusban az egyes polimorfizmusok glükokortikoid jelátviteli mechanizmust módosító hatása eltérő mértékben érvényesül, mint fiziológiás körülmények között. Így az emelkedett kortizolszint következtében módosult glükokortikoid jelátviteli útvonalak elfedhetik ezen polimorfizmusok hatását.
78
6.3. Az 1-es típusú 11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz enzim rs846910 és rs846911 genetikai variánsainak kimutatására kidolgozott új allél-specifikus módszer A HSD11B1 gén promóter régiójában található rs846910-es polimorfizmus jelentőségét populáció-szintű vizsgálatokban igazolták (81, 82), míg a rs846911-es polimorfizmusnak a HSD11B1 enzim aktivitására kifejtett hatását funkcionális vizsgálat kapcsán bizonyították (84). Korábbi tanulmányokban az rs846910 és az rs846911 genetikai variánsok kimutatása tömegspektrométer és direkt DNS szekvánálás segítségével történt (126, 81, 82, 84). Az általam kidolgozott új allél-specifikus PCR módszer előnye a korábbi módszerekkel megegyező pontosság mellett az egyszerűség, költséghatékonyság és gyors
kivitelezhetőség. A homozigóta és a heterozigóta genotípusok kiszűrése egyetlen minta esetében két PCR reakció segítségével történik, a megfelelő kontroll forward és reverz primerek, illetve a mutációra specifikus primerek felhasználásával. Az rs846911 polimorfizmus alacsony allél gyakorisága miatt, klónozási eljárás segítségével egy rekombináns DNS-t állítottam elő. Ez, az egyes reakciókhoz kontrollként szolgáló DNS, az rs846911-es polimorfizmust homozigóta pozitív, míg az rs846910-es polimorfizmust heterozigóta formában hordozza. Az új allél-specifikus PCR módszerrel nyert eredmények ellenőrzése nagyszámú DNS mintán, direkt DNS szevenálás segítségével történt, ami minden esetben azonos eredményt mutatott az új módszerrel kimutatott eredményekkel. A módszer alkalmasnak tűnik nagy mintaszámú populációs vizsgálatok elvégzésére.
6.4.
Az
1-es
típusú
11β-hidroxiszteroid-dehidrogenáz
enzim
83,557insA
polimorfizmusának jelentősége endogén hypercortisolismusban Mind az endogén, mind az exogén glükokortikoidok tartósan emelkedett szintje Cushing-szindróma kialakulását eredményezik, míg a normál tartomány felső határán lévő, vagy azt enyhe mértékben meghaladó kortizol szintek esetében metabolikus szindróma jöhet létre (127). Ez utóbbi – anyagcsere eltérésekkel jellemezhető – betegség kapcsán felmerült, hogy az enyhe hypercortisolismus a perifériás szövetek megváltozott glükokortikoid érzékenységének és/vagy a hypothalamus-hypophysis-mellékvese tengely
79
kóros szabályozásának köszönhető (127, 128). A Cushing- illetve a metabolikus szindróma számos vonatkozásban közös klinikai jellemzői felvetik a kortizol szekréció szabályozása mellett a glükokortikoid hatás sejtszintű szabályozásának a jelentőségét (127). Ezen szindrómákban a glükokortikoid túltermelés következtében létrejövő szövet-specifikus válaszreakciók kialakulásában, a kortizol biológiai hatását közvetítő GR érzékenysége, illetve a sejtek glükokortikoid ellátásáért felelős HSD11B1 enzim aktivitása játszhat fontos szerepet. A GR receptor és a HSD11B1 enzim működésében bekövetkező változások ezen kórképek kialakulása iránt fokozott kockázati tényezőt jelenthetnek, illetve hatással lehetnek a betegség tüneteinek súlyosságára (64). Korábbi, egészséges egyéneken végzett vizsgálatokban kimutatták a GR génen található genetikai elváltozások összefüggését bizonyos metabolikus paraméterekkel (25, 40, 124). Emellett egy koreai tanulmányban a HSD11B1
génen
található
polimorfizmusok
(rs1000283
és
rs932335)
jelenléte
posztmenopauzális osteoporosisban a vertebralis törési rizikót csökkentette (107). Munkám során a HSD11B1 gén három polimorfizmusának (rs846910, rs846911 és 83,557insA) a jelentőségét vizsgáltam endogén hypercortisolismussal járó állapotokban. A kapott eredmények közül a 83,557insA polimorfizmussal kapcsolatos megfigyelést emelem ki: az insA-t hordozó, endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben szignifikánsan magasabb szérum OC szinteket tudtam kimutatni a polimorf allélt nem hordozó betegekhez képest. Ezzel szemben nem találtam összefüggést a polimorfizmus hordozása és az endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek csontsűrűsége között, ami azt jelzi, hogy a csontanyagcsere és főként a csontépítés sokkal érzékenyebben és/vagy gyorsabban reagál a glükokortikoid túlsúlyra, mint a csontok DEXA-val mérhető ásványianyag tartalma (118). További kutatási eredményeim azt mutatták, hogy a 83,557insA-t hordozó, mellékvese eredetű Cushing-szindrómás betegeket szignifikánsan magasabb ACTH szintek és kisebb tumor méret jellemzi a polimorfizmust nem hordozó betegekhez képest. A HSD11B1 gén 83,557insA polimorfizmust tartalmazó intronikus regiójában megtalálható egy enhancer transzkripciós aktivátor fehérjét kötő - DNS szakasz is. Az adenin inzerció jelenléte ezen régióban a HSD11B1 gén csökkent transzkripcionális aktivitását eredményezi (89). Feltehetőleg a 83,557insA-t hordozókban megfigyelhető magasabb szérum OC és ACTH szintek, illetve kisebb tumor méret, az insA jelenlétének következtében csökkent HSD11B1
80
enzim aktivitásnak köszönhető. A HSD11B1 enzim jelenlétét kimutatták humán osteoblast sejteken (98, 129), így a csökkent enzim aktivitás ezen csontsejteken, kevésbé szuppresszált szérum OC koncentrációban nyilvánulhat meg. Hypophysis tumorokban – különösen a corticotroph adenomákban -, illetve a normál hypophysis szövetben szintén megfigyelhető a HSD11B1 enzim expressziója (71, 72), amely így befolyásolhatja a kortizol ACTHszekrécióra
kifejtett
gátló
hatását.
Emellett
humán
mellékvesekéregben,
illetve
adrenocorticalis adenomákban is detektálható az enzim jelenléte (70, 73). Az rs846911-es polimorfizmus az elsőként publikált vizsgálat szerint hatszorosára növeli az Alzheimer-kór kialakulásának esélyét, 0,5%-os allél gyakoriságot mutatott egészséges svájci illetve mediterrán populációban (84). Az általam vizsgált egészséges kontroll populációban és betegcsoportokban nem volt kimutatható a polimorfizmus jelenléte, ami megegyezik egy skót kutatócsoport eredményeivel, ahol a polimorf allélt szintén nem tudták detektálni (85). A polimorfizmus allél frekvenciájára vonatkozó ellentmondásos eredmények feltehetőleg a különböző populációs mintákkal, az egyes tanulmányok esetszámbeli különbségeivel, illetve a polimorfizmus fiziológiás és patológiás körülmények közti különböző előfordulási gyakoriságával magyarázható.
81
7. KÖVETKEZTETÉSEK 1. Endogén hypercortisolismusban, a szignifikánsan alacsonyabb szérum OC koncentrációk csökkent csontépítésre, míg a normál tartományban lévő β-CTx koncentrációk normál mértékű
csontbontásra
utalnak.
A
betegség
aktív
stádiumában
a
normális
csontanyagcserére jellemző csontformációs és -reszorpciós markerek közötti szoros kapcsolat megbomlik. A szérum OC szintek szignifikáns összefüggést mutatnak az endogén hypercortisolismus következtében kialakult tünetekkel. A szérum OC diagnosztikai értékének vizsgálata során elsőként igazoltam, hogy a szérum OC meghatározásnak szerepe lehet az endogén Cushing-szindrómás betegeknek az egészségesektől való elkülönítésében. Korábbi vizsgálatok már jelezték, hogy a betegség aktív szakaszát jellemző csökkent csontépítés az endogén Cushing-szindróma gyógyulását követően normalizálódik, azonban ennek időbeli lefolyását korábban nem vizsgálták. Saját eredményeim alapján sikeres műtétet követően a szérum OC már a posztoperatív első napokban-hetekben gyorsan emelkedik, az emelkedés csúcspontját a műtét utáni 6. hónapban éri el, majd a 24. hónaptól a szérum OC szintek nem különbözik az egészséges egyénekétől. Ugyanakkor az endogén hypercortisolismus megszűnése nem okoz változást a szérum β-CTx koncentrációkban a 4 éves utánkövetési periódus alatt. 2. A GRα intronikus régiójában elhelyezkedő BclI, a 2. exonon található N363S és ER22/23EK valamint a GRβ splice variánson lévő A3669G polimorfizmusok vizsgálata során kapott eredményeink arra utalnak, hogy a GR gén ezen 4 polimorfizmusa az endogén hypercortisolismussal járó állapotok kialakulásának kockázatát feltehetően nem befolyásolja. Kimutattam, hogy a BclI polimorfizmus fontos szerepet játszik a glükokortikoidok
iránti
egyéni
érzékenység
meghatározásában
endogén
hypercortisolismusban szenvedő betegekben, valamint a glükokortikoidok iránti érzékenységet fokozó hatásán keresztül a csontmetabolizmust a lebontás irányába tolja el.
82
3. A HSD11B1 gén promóter régiójában található rs846910-es és rs846911-es polimorfizmusok egyidejű kimutatására kidolgozott új allél-specifikus PCR módszer előnye a korábbi módszerekkel megegyező pontosság mellett az egyszerűség, költséghatékonyság és gyors kivitelezhetőség. Az rs846911 polimorfizmus alacsony allél-gyakorisága miatt, klónozással rekombináns DNS-t állítottam elő, mely az egyes reakciókhoz kontrollként szolgál. A laboratóriumunkban kidolgozott allél-specifikus PCR módszer segítségével nyert eredmények ellenőrzése igazolja a módszer alkalmasságát, a HSD11B1 gén promóter régiójában elhelyezkedő két polimorfizmus kimutatására. 4. A HSD11B1 gén promóter régiójában elhelyezkedő rs846910 és rs846911, valamint az intronikus régióban található 83,557insA polimorfizmusok eredményeim alapján a Cushing-kór,
illetve
a
Cushing-szindróma
kialakulásának
kockázatát
nem
befolyásolják. A 83,557insA feltehetően az enzim aktivitását csökkentő hatása révén módosíthatja a glükokortikoidok által közvetített feed-back szabályozást, illetve a glükokortikoidoknak a szérum OC szintre kifejtett gátló hatását. Klinikai beteganyagon nyert vizsgálati eredményeim összhangban vannak a mindmáig egyetlen, in vitro funkcionális vizsgálatokból levont következtetésekkel: az 83,557insA variáns jelenléte endogén hypercortisolismusban is –a HSD11B1 enzim csökkent aktivitása révén- a glükokortikoid hatás csökkenéséhez vezet.
83
8. MAGYAR NYELVŰ ÖSSZEFOGLALÓ Az endogén hypercortisolismussal járó állapotok csontanyagcsere változásainak hosszú távú következményei, illetve a glükokortikoid érzékenységet módosító genetikai eltérések jelentősége a betegség kialakulásában, a tünetek és a szövődmények (más szóval: glükokortikoid-indukált csontbetegség) megjelenésében még napjainkban is nagyrészt ismeretlenek. Endogén hypercortisolismusban szenvedő betegekben a szérum kortizol és szérum OC koncentrációk között szoros negatív, míg a szérum kortizol és β-CTx koncentrációk között
szoros
pozitív
korrelációt
igazoltam.
Megerősítettem,
hogy
endogén
hypercortisolismusban a normális csontanyagcserére jellemző csontformációs és reszorpciós markerek közötti szoros kapcsolat megbomlik, a betegség gyógyulása után az egészségesekre jellemző szoros kapcsolat helyre áll. A szérum OC feltételezett diagnosztikai értékének vizsgálata során igazoltam, hogy a szérum OC meghatározásnak szerepe lehet az endogén Cushing-szindrómás betegeknek az egészségesektől való elkülönítésében. A hypercortisolismus műtéti kezelését követően a szérum OC gyorsan emelkedik és a 24. postoperatív hónapig magas marad, míg a β-CTx koncentrációkban nem volt értékelhető változás. A GR génen található BclI, N363S, ER22/23EK és A3669G polimorfizmusok nem módosítják
az
endogén
hypercortisolismus
kialakulásának
kockázatát.
A
BclI
polimorfizmus hordozása esetén a proximális femorális régiók csontsűrűsége alacsonyabb és fokozott csontbontás igazolható, ami arra utal, hogy a BclI polimorfizmus a csontszövetben is fokozza a glükokortikoidok iránti érzékenységet. A HSD11B1 gén promóter régiójában található rs846910-es és rs846911-es polimorfizmusok kimutatásához egy egyszerű, költséghatékony és gyorsan kivitelezhető allél-pecifikus PCR módszert dolgoztam ki. A módszer segítségével nyert eredmények ellenőrzése direkt DNS szekvenálás segítségével történt, ami minden esetben megerősítette az allél-specifikus PCR reakció eredményeit. A kidolgozott módszer alkalmas lehet populáció-genetikai kutatásokban a HSD11B1 gén polimorfizmusok vizsgálatára.
84
A HSD11B1 gén három vizsgált polimorfizmusa (rs846910, rs846911 és 83,557insA)
az
endogén
hypercortisolismussal
járó
állapotok
kialakulását
nem
befolyásolja. A HSD11B1 gén 83,557insA polimorfizmusának hatását endogén hypercortisolismusban
vizsgálva
megállapítottam,
hogy
a
83,557insA-t
hordozó
betegeknek magasabb a szérum OC és ACTH koncentrációja, míg a mellékvese tumorok mérete kisebb. Az endogén hypercortisolismusban szenvedő betegek vizsgálata során nyert eredményeim megerősítik a 83,557insA polimorfizmusnak, egy korábbi, funkcionális vizsgálat kapcsán már feltételezett, HSD11B1 enzim aktivitást csökkentő hatását.
85
9. SUMMARY
The long-term consequences of prolonged glucocorticoid excess on the skeleton (glucocorticoid-induced bone disorder) and the importance of the genetic variants in the determination of glucocorticoid sensitivity, as well as clinical variability and disease severity are mostly unexplored. Serum OC of patients with endogenous hypercortisolism showed strong negative, while β-CTx displayed strong positive correlation with serum cortisol. Our results confirm some previous findings regarding the uncoupling of bone formation and bone resorption in hypercortisolism and the restoration of coupled remodelling after the cure of endogenous Cushing’s syndrome. Furthermore our findings suggest that serum OC reflecting the bone formation process should be considered as a sensitive biologic marker of glucocorticoid activity and perhaps disease severity in patients with endogenous Cushing’s syndrome. In the time course of bone marker changes after the cure of Cushing’s syndrome, serum OC increased rapidly and remained increased until the 24th postoperative month, while β-CTx levels failed to show differences at baseline during the 4-year follow-up period. Investigating the clinical importance of glucocorticoid receptor gene variants in patients with endogenous Cushing’s syndrome, we have shown that the BclI, N363S, ER22/23EK and A3669G polymorphisms probably do not modify the risk for the development of Cushing’s disease and Cushing’s syndrome. BclI polymorphism may increase the skeletal sensitivity to glucocorticoids in endogenous glucocorticoid excess states since patients carrying the BclI variant in a homozygous form had reduced BMD at femoral subregions and displayed significantly increased bone resorption. For detection of the rs846910 and the rs846911 polymorphisms of the HSD11B1 gene, located at the 5’ regulatory region, I have planned a rapid, simple and cost-effective multiplex allele-specific PCR method. The reliability of the method was verified with direct sequencing results, showing 100% accuracy of the new method. These results suggest that this method newly developed for the combined detection of rs846910 and the rs846911 polymorphisms may also be applied in large-scale, population-based studies.
86
To evaluate the potential importance of gene variants of the HSD11B1 gene in patients with endogenous hypercortisolism, I have demonstrated that the rs846910, rs846911 and the 83,557insA polymorphisms do not modify the risk for the development of endogenous Cushing’s syndrome. Patients carrying the 83,557insA variant had higher serum OC and plasma ACTH concentrations and smaller adrenal tumor size. Since the intronic region containing the site of the 83,557 insA polymorphism may act as an enhancer of the HSD11B1 expression and the presence of the 83,557insA variant results in a reduced transcriptional activity of the HSD11B1 gene, we suggest that these results could be explained by reduced HSD11B1 enzyme activity.
87
10. IRODALOMJEGYZÉK
1. Cushing HW. (1932) The Basophil Adenomas of the Pituitary Body and Their Clinical Manifestations (Pituitary Basophilism) Bull. Johns Hopkins Hosp, 50: 137195. 2. Boscaro M, Arnaldi G. (2009) Approach to the patient with possible Cushing's syndrome. J Clin Endocrinol Metab, 94: 3121-3131. 3. Makras P, Toloumis G, Papadogias D, Kaltsas GA, Besser M. (2006) The diagnosis and differential diagnosis of endogenous Cushing's syndrome. Hormones, 5: 231250. 4. Findling JW, Raff H. (2006) Cushing's Syndrome: important issues in diagnosis and management. J Clin Endocrinol Metab, 91: 3746-3753. 5. Newell-Price J, Bertagna X, Grossman AB, Nieman LK. (2006) Cushing's syndrome. Lancet, 367: 1605-1617. 6. Cooper MS. (2004) Sensitivity of bone to glucocorticoids. Clin Sci, 107: 111-123. 7. Compston J. (2010) Management of glucocorticoid-induced osteoporosis. Nat Rev Rheumatol, 6: 82-88. 8. Mazziotti G, Angeli A, Bilezikian JP, Canalis E, Giustina A. (2006) Glucocorticoidinduced osteoporosis: an update. Trends Endocrinol Metab, 17: 144-149. 9. Patschan D, Loddenkemper K, Buttgereit F. (2001) Molecular mechanisms of glucocorticoid-induced osteoporosis. Bone. 29: 498-505. 10. Canalis E, Mazziotti G, Giustina A, Bilezikian JP. (2007) Glucocorticoid-induced osteoporosis: pathophysiology and therapy. Osteoporos Int, 18: 1319-1328. 11. Pierotti S, Gandini L, Lenzi A, Isidori AM. (2008) Pre-receptorial regulation of steroid hormones in bone cells: insights on glucocorticoid-induced osteoporosis. J Steroid Biochem Mol Biol, 108: 292-299. 12. Issack PS, Helfet DL, Lane JM. (2008) Role of Wnt signaling in bone remodeling and repair. HSS J, 4: 66-70. 13. Dovio A, Perazzolo L, Osella G, Ventura M, Termine A, Milano E, Bertolotto A, Angeli A. (2004) Immediate fall of bone formation and transient increase of bone resorption in the course of high-dose, short-term glucocorticoid therapy in young patients with multiple sclerosis. J Clin Endocrinol Metab, 89: 4923-4928.
88
14. Osella G, Terzolo M, Reimondo G, Piovesan A, Pia A, Termine A, Paccotti P, Angeli A. (1997) Serum markers of bone and collagen turnover in patients with Cushing’s syndrome and in subjects with adrenal incidentalomas. J Clin Endocrinol Metab, 82: 3303–3307. 15. Cortet B, Cortet C, Blanckaert F, d'Herbomez M, Marchandise X, Wémeau JL, Decoulx M, Dewailly D. (2001) Quantitative ultrasound of bone and markers of bone turnover in Cushing's syndrome. Osteoporos Int, 12: 117-123. 16. Francucci CM, Pantanetti P, Garrapa GG, Massi F, Arnaldi G, Mantero F. (2002) Bone metabolism and mass in women with Cushing's syndrome and adrenal incidentaloma. Clin Endocrinol, 57: 587-593. 17. Camozzi V, Sanguin F, Albigier N, Scaroni C, Mantero F, Zaninotto M, Frigo A, Piccolo M, Luisetto G. (2010) Persistent increase of osteoprotegerin levels after cortisol normalization in patients with Cushing's syndrome. Eur J Endocrinol, 162: 85-90. 18. Sartorio A, Ambrosi B, Colombo P, Morabito F, Faglia G. (1998) Osteocalcin levels in Cushing's disease before and after treatment. Horm Metab Res, 20: 70. 19. Tauchmanovà L, Pivonello R, Di Somma C, Rossi R, De Martino MC, Camera L, Klain M, Salvatore M, Lombardi G, Colao A. (2006) Bone demineralization and vertebral fractures in endogenous cortisol excess: role of disease etiology and gonadal status. J Clin Endocrinol Metab, 91: 1779-1784. 20. Godang K, Ueland T, Bollerslev J. (1999) Decreased bone area, bone mineral content, formative markers, and increased bone resorptive markers in endogenous Cushing's syndrome. Eur J Endocrinol, 141: 126-131. 21. Kristo C, Jemtland R, Ueland T, Godang K, Bollerslev J. (2006) Restoration of the coupling process and normalization of bone mass following successful treatment of endogenous Cushing's syndrome: a prospective, long-term study. Eur J Endocrinol, 154: 109-118. 22. Chiodini I, Carnevale V, Torlontano M, Fusilli S, Guglielmi G, Pileri M, Modoni S, Di Giorgio A, Liuzzi A, Minisola S, Cammisa M, Trischitta V, Scillitani A. (1998) Alterations of bone turnover and bone mass at different skeletal sites due to pure glucocorticoid excess: study in eumenorrheic patients with Cushing’s syndrome. J Clin Endocrinol Metab, 83: 1863–1867. 23. Lafage-Proust MH, Boudignon B, Thomas T. (2003) Glucocorticoid-induced osteoporosis: pathophysiological data and recent treatments. Joint Bone Spine, 70: 109-118.
89
24. Rochefort GY, Pallu S, Benhamou CL. (2010) Osteocyte: the unrecognized side of bone tissue. Osteoporos Int, 21:1457-1469. 25. DeRijk RH, Schaaf M, de Kloet ER. (2002) Glucocorticoid receptor variants: clinical implications. J Steroid Biochem Mol Biol, 81: 103-122. 26. Bray PJ, Cotton RG. (2003) Variations of the human glucocorticoid receptor gene (NR3C1): pathological and in vitro mutations and polymorphisms. Hum Mutat, 21: 557-568. 27. Bamberger CM, Bamberger AM, de Castro M, Chrousos GP. (1995) Glucocorticoid receptor beta, a potential endogenous inhibitor of glucocorticoid action in humans. J Clin Invest, 95: 2435-2441. 28. Oakley RH, Sar M, Cidlowski JA. (1996) The human glucocorticoid receptor beta isoform. Expression, biochemical properties, and putative function. J Biol Chem, 271: 9550 –9559 29. Yudt MR, Jewell CM, Bienstock RJ, Cidlowski JA. (2003) Molecular origins for the dominant negative function of human glucocorticoid receptor beta. Mol Cell Biol, 23: 4319-4330. 30. Derijk RH, Schaaf MJ, Turner G, Datson NA, Vreugdenhil E, Cidlowski J, de Kloet ER, Emery P, Sternberg EM, Detera-Wadleigh SD. (2001) A human glucocorticoid receptor gene variant that increases the stability of the glucocorticoid receptor betaisoform mRNA is associated with rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 28: 23832388. 31. DeRijk RH, Schaaf M, de Kloet ER. (2002) Glucocorticoid receptor variants: clinical implications. J Steroid Biochem Mol Biol, 81: 103-122. 32. Schaaf MJ, Cidlowski JA. (2002) AUUUA motifs in the 3'UTR of human glucocorticoid receptor alpha and beta mRNA destabilize mRNA and decrease receptor protein expression. Steroids, 67: 627-636. 33. Hollenberg SM, Weinberger C, Ong ES, Cerelli G, Oro A, Lebo R, Thompson EB, Rosenfeld MG, Evans RM. (1985) Primary structure and expression of a functional human glucocorticoid receptor cDNA. Nature, 318: 635-641. 34. Encío IJ, Detera-Wadleigh SD. (1991) The genomic structure of the human glucocorticoid receptor. J Biol Chem. 266: 7182-7188. 35. Panarelli M, Holloway CD, Fraser R, Connell JM, Ingram MC, Anderson NH, Kenyon CJ. (1998) Glucocorticoid receptor polymorphism, skin vasoconstriction,
90
and other metabolic intermediate phenotypes in normal human subjects. J Clin Endocrinol Metab, 83: 1846-1852. 36. van Rossum EF, Koper JW, van den Beld AW, Uitterlinden AG, Arp P, Ester W, Janssen JA, Brinkmann AO, de Jong FH, Grobbee DE, Pols HA, Lamberts SW. (2003) Identification of the BclI polymorphism in the glucocorticoid receptor gene: association with sensitivity to glucocorticoids in vivo and body mass index. Clin Endocrinol, 59: 585-592. 37. Weaver JU, Hitman GA, Kopelman PG. (1992) An association between a Bc1I restriction fragment length polymorphism of the glucocorticoid receptor locus and hyperinsulinaemia in obese women. J Mol Endocrinol, 9: 295-300. 38. Rosmond R, Chagnon YC, Holm G, Chagnon M, Pérusse L, Lindell K, Carlsson B, Bouchard C, Björntorp P. (2000) A glucocorticoid receptor gene marker is associated with abdominal obesity, leptin, and dysregulation of the hypothalamicpituitary-adrenal axis. Obes Res. 8: 211-218. 39. Buemann B, Vohl MC, Chagnon M, Chagnon YC, Gagnon J, Pérusse L, Dionne F, Després JP, Tremblay A, Nadeau A, Bouchard C. (1997) Abdominal visceral fat is associated with a BclI restriction fragment length polymorphism at the glucocorticoid receptor gene locus. Obes Res, 5: 186-192. 40. van Rossum EF, Lamberts SW. (2004) Polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and their associations with metabolic parameters and body composition. Recent Prog Horm Res, 59:333-357. 41. Di Blasio AM, van Rossum EF, Maestrini S, Berselli ME, Tagliaferri M, Podestà F, Koper JW, Liuzzi A, Lamberts SW. (2003) The relation between two polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene and body mass index, blood pressure and cholesterol in obese patients. Clin Endocrinol, 59: 68-74. 42. Ukkola O, Rosmond R, Tremblay A, Bouchard C. (2001) Glucocorticoid receptor Bcl I variant is associated with an increased atherogenic profile in response to longterm overfeeding. Atherosclerosis, 157: 221-224. 43. Wüst S, Van Rossum EF, Federenko IS, Koper JW, Kumsta R, Hellhammer DH. (2004) Common polymorphisms in the glucocorticoid receptor gene are associated with adrenocortical responses to psychosocial stress. J Clin Endocrinol Metab, 89: 565-573. 44. Lee EB, Kim JY, Lee YJ, Song YW. (2005) Glucocorticoid receptor polymorphisms in Korean patients with rheumatoid arthritis. Ann Rheum Dis, 64: 503-504.
91
45. Bertalan R, Patocs A, Nagy B, Derzsy Z, Gullai N, Szappanos A, Rigo J Jr, Racz K. (2009) Overrepresentation of BclI polymorphism of the glucocorticoid receptor gene in pregnant women with HELLP syndrome. Clin Chim Acta, 405: 148-152. 46. Boyle B, Korányi K, Patocs A, Liko I, Szappanos A, Bertalan R, Racz K, Balazs C. (2008) Polymorphisms of the glucocorticoid receptor gene in Graves ophthalmopathy. Br J Ophthalmol, 92: 131-134. 47. Huizenga NA, Koper JW, de Lange P, Pols HA, Stolk RP, Grobbee DE, de Jong FH, Lamberts SW. (1998) Interperson variability but intraperson stability of baseline plasma cortisol concentrations, and its relation to feedback sensitivity of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis to a low dose of dexamethasone in elderly individuals. J Clin Endocrinol Metab, 83: 47-54. 48. Rosmond R, Bouchard C, Björntorp P. (2001) Tsp509I polymorphism in exon 2 of the glucocorticoid receptor gene in relation to obesity and cortisol secretion: cohort study. BMJ, 322: 652-653. 49. Lin RC, Wang WY, Morris BJ. (1999) High penetrance, overweight, and glucocorticoid receptor variant: case-control study. BMJ, 319: 1337-1338. 50. Lin RC, Wang XL, Dalziel B, Caterson ID, Morris BJ. (2003) Association of obesity, but not diabetes or hypertension, with glucocorticoid receptor N363S variant. Obes Res, 11: 802-808. 51. Lin RC, Wang XL, Morris BJ. (2003) Association of coronary artery disease with glucocorticoid receptor N363S variant. Hypertension, 41: 404-407. 52. Roussel R, Reis AF, Dubois-Laforgue D, Bellanné-Chantelot C, Timsit J, Velho G. (2003) The N363S polymorphism in the glucocorticoid receptor gene is associated with overweight in subjects with type 2 diabetes mellitus. Clin Endocrinol, 59: 237241. 53. Dobson MG, Redfern CP, Unwin N, Weaver JU. (2001) The N363S polymorphism of the glucocorticoid receptor: potential contribution to central obesity in men and lack of association with other risk factors for coronary heart disease and diabetes mellitus. J Clin Endocrinol Metab, 86: 2270-2274 54. Majnik J, Patocs A, Balogh K, Toth M, Gergics P, Szappanos A, Mondok A, Borgulya G, Panczel P, Prohaszka Z, Racz K. (2006) Overrepresentation of the N363S variant of the glucocorticoid receptor gene in patients with bilateral adrenal incidentalomas. J Clin Endocrinol Metab, 91: 2796-2799. 55. Russcher H, Smit P, van den Akker EL, van Rossum EF, Brinkmann AO, de Jong FH, Lamberts SW, Koper JW. (2005) Two polymorphisms in the glucocorticoid
92
receptor gene directly affect glucocorticoid-regulated gene expression. J Clin Endocrinol Metab, 90: 5804-5810. 56. Koper JW, Stolk RP, de Lange P, Huizenga NA, Molijn GJ, Pols HA, Grobbee DE, Karl M, de Jong FH, Brinkmann AO, Lamberts SW. (1997) Lack of association between five polymorphisms in the human glucocorticoid receptor gene and glucocorticoid resistance. Hum Genet, 99: 663-668. 57. van Rossum EF, Koper JW, Huizenga NA, Uitterlinden AG, Janssen JA, Brinkmann AO, Grobbee DE, de Jong FH, van Duyn CM, Pols HA, Lamberts SW. (2002) A polymorphism in the glucocorticoid receptor gene, which decreases sensitivity to glucocorticoids in vivo, is associated with low insulin and cholesterol levels. Diabetes, 51: 3128-3134. 58. van Rossum EF, Voorhoeve PG, te Velde SJ, Koper JW, Delemarre-van de Waal HA, Kemper HC, Lamberts SW. (2004) The ER22/23EK polymorphism in the glucocorticoid receptor gene is associated with a beneficial body composition and muscle strength in young adults. J Clin Endocrinol Metab, 89: 4004-4009 59. van Rossum EF, Feelders RA, van den Beld AW, Uitterlinden AG, Janssen JA, Ester W, Brinkmann AO, Grobbee DE, de Jong FH, Pols HA, Koper JW, Lamberts SW. (2004) Association of the ER22/23EK polymorphism in the glucocorticoid receptor gene with survival and C-reactive protein levels in elderly men. Am J Med, 117: 158-162. 60. van den Akker EL, Russcher H, van Rossum EF, Brinkmann AO, de Jong FH, Hokken A, Pols HA, Koper JW, Lamberts SW. (2006) Glucocorticoid receptor polymorphism affects transrepression but not transactivation. J Clin Endocrinol Metab, 91: 2800-2803. 61. Derijk RH, Schaaf MJ, Turner G, Datson NA, Vreugdenhil E, Cidlowski J, de Kloet ER, Emery P, Sternberg EM, Detera-Wadleigh SD. (2001) A human glucocorticoid receptor gene variant that increases the stability of the glucocorticoid receptor betaisoform mRNA is associated with rheumatoid arthritis. J Rheumatol, 28: 23832388. 62. Syed AA, Irving JA, Redfern CP, Hall AG, Unwin NC, White M, Bhopal RS, Weaver JU. (2009) Association of glucocorticoid receptor polymorphism A3669G in exon 9beta with reduced central adiposity in women. Obesity, 14: 759-764. 63. Cope CL, Black E. (1958) The production rate of cortisol in man. Br Med J, 1: 1020-1024. 64. Draper N, Stewart PM. (2005) 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase and the prereceptor regulation of corticosteroid hormone action. J Endocrinol, 186: 251-271.
93
65. Tomlinson JW, Walker EA, Bujalska IJ, Draper N, Lavery GG, Cooper MS, Hewison M, Stewart PM. (2004) 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1: a tissue-specific regulator of glucocorticoid response. Endocr Rev, 25: 831-866. 66. Penning TM. (1997) Molecular endocrinology of hydroxysteroid dehydrogenases. Endocr Rev, 18: 281-305. 67. Oppermann U, Filling C, Hult M, Shafqat N, Wu X, Lindh M, Shafqat J, Nordling E, Kallberg Y, Persson B, Jörnvall H. (2002) Short-chain dehydrogenases/reductases (SDR): the 2002 update. Chem Biol Interact, 143-144: 247-253. 68. Odermatt A, Arnold P, Stauffer A, Frey BM, Frey FJ. (1999) The N-terminal anchor sequences of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenases determine their orientation in the endoplasmic reticulum membrane. J Biol Chem, 274: 2876228770. 69. Korbonits M, Bujalska I, Shimojo M, Nobes J, Jordan S, Grossman AB, Stewart PM. (2001) Expression of 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase isoenzymes in the human pituitary: induction of the type 2 enzyme in corticotropinomas and other pituitary tumors. J Clin Endocrinol Metab, 86: 2728-2733. 70. Ricketts ML, Verhaeg JM, Bujalska I, Howie AJ, Rainey WE, Stewart PM. (1998) Immunohistochemical localization of type 1 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase in human tissues. J Clin Endocrinol Metab, 83: 1325-1335. 71. Tateno T, Izumiyama H, Doi M, Yoshimoto T, Shichiri M, Inoshita N, Oyama K, Yamada S, Hirata Y. (2007) Differential gene expression in ACTH -secreting and non-functioning pituitary tumors. Eur J Endocrinol, 157: 717-724 72. Nigawara T, Iwasaki Y, Asai M, Yoshida M, Kambayashi M, Sashinami H, Hashimoto K, Suda T. (2006) Inhibition of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase eliminates impaired glucocorticoid suppression and induces apoptosis in corticotroph tumor cells. Endocrinology, 147: 769-772. 73. Mune T, Morita H, Suzuki T, Takahashi Y, Isomura Y, Tanahashi T, Daido H, Yamakita N, Deguchi T, Sasano H, White PC, Yasuda K. (2003) Role of local 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 2 expression in determining the phenotype of adrenal adenomas. J Clin Endocrinol Metab, 88: 864-870. 74. Rabbitt EH, Gittoes NJ, Stewart PM, Hewison M. (2003) 11beta-hydroxysteroid dehydrogenases, cell proliferation and malignancy. J Steroid Biochem Mol Biol, 85: 415-421.
94
75. Tomlinson JW, Stewart PM. (2005) Mechanisms of disease: Selective inhibition of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 as a novel treatment for the metabolic syndrome. Nat Clin Pract Endocrinol Metab, 1: 92-99. 76. Morton NM, Seckl JR. (2008) 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and obesity. Front Horm Res, 36: 146-164. 77. Espindola AD, Kater CE. (2007) Adipose tissue expression of 11betahydroxysteroid dehydrogenase type 1 in Cushing's syndrome and in obesity. Arq Bras Endocrinol Metabol, 51: 1397-1403. 78. Stulnig TM, W Waldhausl. (2004) 11beta-Hydroxysteroid dehydrogenase Type 1 in obesity and Type 2 diabetes. Diabetologia, 47: 1-11. 79. Stewart PM. (2005) Tissue-specific Cushing's syndrome uncovers a new target in treating the metabolic syndrome 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1. Clin Med, 5: 142-146. 80. Tannin GM, Agarwal AK, Monder C, New MI, White PC. (1991) The human gene for 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase. Structure, tissue distribution, and chromosomal localization. J Biol Chem, 266:16653-16658. 81. Nair S, Lee YH, Lindsay RS, Walker BR, Tataranni PA, Bogardus C, Baier LJ, Permana PA. (2004) 11beta-Hydroxysteroid dehydrogenase Type 1: genetic polymorphisms are associated with Type 2 diabetes in Pima Indians independently of obesity and expression in adipocyte and muscle. Diabetologia, 47: 1088-1095. 82. Franks PW, Knowler WC, Nair S, Koska J, Lee YH, Lindsay RS, Walker BR, Looker HC, Permana PA, Tataranni PA, Hanson RL. (2004) Interaction between an 11betaHSD1 gene variant and birth era modifies the risk of hypertension in Pima Indians. Hypertension, 44: 681-688. 83. Malavasi EL, Kelly V, Nath N, Gambineri A, Dakin RS, Pagotto U, Pasquali R, Walker BR, Chapman KE. (2010) Functional effects of polymorphisms in the human gene encoding 11 beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (11 betaHSD1): a sequence variant at the translation start of 11 beta-HSD1 alters enzyme levels. Endocrinology, 151: 195-202. 84. de Quervain DJ, Poirier R, Wollmer MA, Grimaldi LM, Tsolaki M, Streffer JR, Hock C, Nitsch RM, Mohajeri MH, Papassotiropoulos A. (2004) Glucocorticoidrelated genetic susceptibility for Alzheimer's disease. Hum Mol Genet, 13: 47-52. 85. Deary IJ, Hayward C, Permana PA, Nair S, Whalley LJ, Starr JM, Chapman KE, Walker BR, Seckl JR. (2006) Polymorphisms in the gene encoding 11B-
95
hydroxysteroid dehydrogenase type 1 (HSD11B1) and lifetime cognitive change. Neurosci Lett, 393: 74-77. 86. Gelernter-Yaniv L, Feng N, Sebring NG, Hochberg Z, Yanovski JA. (2003) Associations between a polymorphism in the 11 beta hydroxysteroid dehydrogenase type I gene and body composition. Int J Obes Relat Metab Disord, 27: 983-986. 87. Smit P, Dekker MJ, de Jong FJ, van den Beld AW, Koper JW, Pols HA, Brinkmann AO, de Jong FH, Breteler MM, Lamberts SW. (2007) Lack of Association of the 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 gene 83,557insA and hexose-6phosphate dehydrogenase gene R453Q polymorphisms with body composition, adrenal androgen production, blood pressure, glucose metabolism, and dementia. J Clin Endocrinol Metab, 92: 359-362. 88. San Millán JL, Botella-Carretero JI, Alvarez-Blasco F, Luque-Ramírez M, Sancho J, Moghetti P, Escobar-Morreale HF. (2005) A study of the hexose-6-phosphate dehydrogenase gene R453Q and 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 gene 83557insA polymorphisms in the polycystic ovary syndrome. J Clin Endocrinol Metab, 90: 4157-4162. 89. Draper N, Walker EA, Bujalska IJ, Tomlinson JW, Chalder SM, Arlt W, Lavery GG, Bedendo O, Ray DW, Laing I, Malunowicz E, White PC, Hewison M, Mason PJ, Connell JM, Shackleton CH, Stewart PM. (2003) Mutations in the genes encoding 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 and hexose-6-phosphate dehydrogenase interact to cause cortisone reductase deficiency. Nat Genet, 34: 434439. 90. Gambineri A, Vicennati V, Genghini S, Tomassoni F, Pagotto U, Pasquali R, Walker BR. (2006) Genetic variation in 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 predicts adrenal hyperandrogenism among lean women with polycystic ovary syndrome.J Clin Endocrinol Metab, 91: 2295-2302. 91. White PC. (2005) Genotypes at 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 11B1 and hexose-6-phosphate dehydrogenase loci are not risk factors for apparent cortisone reductase deficiency in a large population-based sample. J Clin Endocrinol Metab, 90: 5880-5883. 92. Robitaille J, Brouillette C, Houde A, Després JP, Tchernof A, Vohl MC. (2004) Molecular screening of the 11beta-HSD1 gene in men characterized by the metabolic syndrome. Obes Res, 12: 1570-1575. 93. Huizenga NA, De Herder WW, Koper JW, de Lange P, v D Lely AJ, Brinkmann AO, de Jong FH, Lamberts SW. (2000) Decreased ligand affinity rather than glucocorticoid receptor down-regulation in patients with endogenous Cushing's syndrome. Eur J Endocrinol, 142: 472-476.
96
94. Hagendorf A, Koper JW, de Jong FH, Brinkmann AO, Lamberts SW, Feelders RA. (2005) Expression of the human glucocorticoid receptor splice variants alpha, beta, and P in peripheral blood mononuclear leukocytes in healthy controls and in patients with hyper- and hypocortisolism. J Clin Endocrinol Metab, 90: 6237-6243. 95. Mariniello B, Ronconi V, Rilli S, Bernante P, Boscaro M, Mantero F, Giacchetti G. (2006) Adipose tissue 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 expression in obesity and Cushing's syndrome. Eur J Endocrinol. 155: 435-441. 96. Mancini T, Doga M, Mazziotti G, Giustina A. (2004) Cushing's syndrome and bone. Pituitary, 7: 249-252. 97. Brixen K, Beckers S, Peeters A, Piters E, Balemans W, Nielsen TL, Wraae K, Bathum L, Brasen C, Hagen C, Andersen M, Van Hul W, Abrahamsen B. (2007) Polymorphisms in the low-density lipoprotein receptor-related protein 5 (LRP5) gene are associated with peak bone mass in non-sedentary men: results from the Odense androgen study. Calcif Tissue Int, 81: 421-429. 98. Cooper MS, Walker EA, Bland R, Fraser WD, Hewison M, Stewart PM. (2000) Expression and functional consequences of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase activity in human bone. Bone, 27: 375-381. 99. Eijken M, Hewison M, Cooper MS, de Jong FH, Chiba H, Stewart PM, Uitterlinden AG, Pols HA, van Leeuwen JP. (2004) 11beta-Hydroxysteroid dehydrogenase expression and glucocorticoid synthesis are directed by a molecular switch during osteoblast differentiation. Mol Endocrinol, 19: 621-631. 100. Cooper MS, Rabbitt EH, Goddard PE, Bartlett WA, Hewison M, Stewart PM. (2002) Osteoblastic 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 activity increases with age and glucocorticoid exposure. J Bone Miner Res, 17: 979-986. 101. Cooper MS, Bujalska I, Rabbitt E, Walker EA, Bland R, Sheppard MC, Hewison M, Stewart PM. (2001) Modulation of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase isozymes by proinflammatory cytokines in osteoblasts: an autocrine switch from glucocorticoid inactivation to activation. J Bone Miner Res, 16:1037-1044. 102. Cooper MS, Bujalska I, Rabbitt E, Walker EA, Bland R, Sheppard MC, Hewison M, Stewart PM. (2001) Modulation of 11beta-hydroxysteroid dehydrogenase isozymes by proinflammatory cytokines in osteoblasts: an autocrine switch from glucocorticoid inactivation to activation. J Bone Miner Res, 16:1037-1044. 103. Beavan S, Horner A, Bord S, Ireland D, Compston J. (2001) Colocalization of glucocorticoid and mineralocorticoid receptors in human bone. J Bone Miner Res, 16: 1496-1504.
97
104. Huang L, Xu J, Kumta SM, Zheng MH. (2001) Gene expression of glucocorticoid receptor alpha and beta in giant cell tumour of bone: evidence of glucocorticoidstimulated osteoclastogenesis by stromal-like tumour cells. Mol Cell Endocrinol, 181: 199-206. 105. Huizenga NA, Koper JW, De Lange P, Pols HA, Stolk RP, Burger H, Grobbee DE, Brinkmann AO, De Jong FH, Lamberts SW. (1998) A polymorphism in the glucocorticoid receptor gene may be associated with and increased sensitivity to glucocorticoids in vivo. J Clin Endocrinol Metab, 83: 144-151. 106. van Schoor NM, Dennison E, Lips P, Uitterlinden AG, Cooper C. (2007) Serum fasting cortisol in relation to bone, and the role of genetic variations in the glucocorticoid receptor. Clin Endocrinol, 67: 871-878. 107. Hwang JY, Lee SH, Kim GS, Koh JM, Go MJ, Kim YJ, Kim HC, Kim TH, Hong JM, Park EK, Lee JY, Kim SY. (2009) HSD11B1 polymorphisms predicted bone mineral density and fracture risk in postmenopausal women without a clinically apparent hypercortisolemia. Bone, 45: 1098-1103. 108. Looker AC, Wahner HW, Dunn WL, Calvo MS, Harris TB, Heyse SP, Johnston CC Jr, Lindsay RL. (1995) Proximal femur bone mineral levels of US adults. Osteoporos Int, 5: 389-409. 109. Gergics P, Patocs A, Majnik J, Balogh K, Szappanos A, Toth M, Racz K. (2006) Detection of the Bcl I polymorphism of the glucocorticoid receptor gene by single-tube allele-specific polymerase chain reaction. J Steroid Biochem Mol Biol, 100: 161-166. 110. Majnik J, Patócs A, Balogh K, Tóth M, Rácz K. (2004) A rapid and simple method for detection of Asn363Ser polymorphism of the human glucocorticoid receptor gene. J Steroid Biochem Mol Biol, 92: 465-468. 111. Piovesan A, Terzolo M, Reimondo G, Pia A, Codegone A, Osella G, Boccuzzi A, Paccotti P, Angeli A. (1994) Biochemical markers of bone and collagen turnover in acromegaly or Cushing's syndrome. Horm Metab Res, 26: 234-237. 112. Sartorio A, Ambrosi B, Colombo P, Morabito F, Faglia G. (1998) Osteocalcin levels in Cushing's disease before and after treatment. Horm Metab Res, 20: 70. 113. Kristo C, Jemtland R, Ueland T, Godang K, Bollerslev J. (2006) Restoration of the coupling process and normalization of bone mass following successful treatment of endogenous Cushing's syndrome: a prospective, long-term study. Eur J Endocrinol, 154: 109-118.
98
114. Tauchmanovà L, Pivonello R, Di Somma C, Rossi R, De Martino MC, Camera L, Klain M, Salvatore M, Lombardi G, Colao A. (2006) Bone demineralization and vertebral fractures in endogenous cortisol excess: role of disease etiology and gonadal status. J Clin Endocrinol Metab, 91: 1779-1784. 115. Godang K, Ueland T, Bollerslev J. (1999) Decreased bone area, bone mineral content, formative markers, and increased bone resorptive markers in endogenous Cushing's syndrome. Eur J Endocrinol, 141: 126-131. 116. Di Somma C, Pivonello R, Loche S, Faggiano A, Marzullo P, Di Sarno A, Klain M, Salvatore M, Lombardi G, Colao A. (2002) Severe impairment of bone mass and turnover in Cushing's disease: comparison between childhood-onset and adulthood-onset disease. Clin Endocrinol, 56: 153-158. 117. Minetto M, Reimondo G, Osella G, Ventura M, Angeli A, Terzolo M. (2004) Bone loss is more severe in primary adrenal than in pituitary-dependent Cushing's syndrome. Osteoporos Int, 15: 855-861. 118. Füto L, Toke J, Patócs A, Szappanos A, Varga I, Gláz E, Tulassay Z, Rácz K, Tóth M. (2008) Skeletal differences in bone mineral area and content before and after cure of endogenous Cushing's syndrome. Osteoporos Int, 19: 941-949. 119. Karavitaki N, Ioannidis G, Giannakopoulos F, Mavrokefalos P, Thalassinos N. (2004) Evaluation of bone mineral density of the peripheral skeleton in pre- and postmenopausal women with newly diagnosed endogenous Cushing's syndrome. Clin Endocrinol, 60: 264-270. 120. Ohmori N, Nomura K, Ohmori K, Kato Y, Itoh T, Takano K. (2003) Osteoporosis is more prevalent in adrenal than in pituitary Cushing's syndrome. Endocr J, 50: 17. 121. Cooper MS, Syddall HE, Fall CH, Wood PJ, Stewart PM, Cooper C, Dennison EM. (2005) Circulating cortisone levels are associated with biochemical markers of bone formation and lumbar spine BMD: the Hertfordshire Cohort Study. Clin Endocrinol, 62: 692-697. 122. Nieman LK, Biller BM, Findling JW, Newell-Price J, Savage MO, Stewart PM, Montori VM. (2008) The diagnosis of Cushing's syndrome: an Endocrine Society Clinical Practice Guideline. J Clin Endocrinol Metab, 93: 1526-1540. 123. Elamin MB, Murad MH, Mullan R, Erickson D, Harris K, Nadeem S, Ennis R, Erwin PJ, Montori VM. (2008) Accuracy of diagnostic tests for Cushing's syndrome: a systematic review and metaanalyses. J Clin Endocrinol Metab, 93: 1553-1562.
99
124. Bray PJ, Cotton RG. (2003) Variations of the human glucocorticoid receptor gene (NR3C1): pathological and in vitro mutations and polymorphisms. Hum Mutat, 21: 557-568. 125. Kumsta R, Entringer S, Koper JW, van Rossum EF, Hellhammer DH, Wüst S. (2008) Glucocorticoid receptor gene polymorphisms and glucocorticoid sensitivity of subdermal blood vessels and leukocytes. Biol Psychol, 79: 179-184. 126. Kokoris M, Dix K, Moynihan K, Mathis J, Erwin B, Grass P, Hines B, Duesterhoeft A. (2000) High-throughput SNP genotyping with the Masscode system. Mol Diagn, 5: 329-340. 127. Anagnostis P, Athyros VG, Tziomalos K, Karagiannis A, Mikhailidis DP. (2009) The pathogenetic role of cortisol in the metabolic syndrome: a hypothesis. J Clin Endocrinol Metab, 94: 2692-2701. 128. Walker BR. (2006) Cortisol--cause and cure for metabolic syndrome? Diabet Med, 23: 1281-1288. 129. Pierotti S, Gandini L, Lenzi A, Isidori AM. (2008) Pre-receptorial regulation of steroid hormones in bone cells: insights on glucocorticoid-induced osteoporosis. J Steroid Biochem Mol Biol, 108: 292-299. 130. Lakatos P. A csont, a porc és az ízületek beetgségei. In: Mandl J, Machovich R (szerk.) Orvosi patobiokémia. Medicina, Budapest, 2007: 600-603
100
11. SAJÁT PUBLIKÁCIÓK JEGYZÉKE 11.1. A Doktori értekezéshez kapcsolódó közlemények 1. Szappanos A, Patócs A, Tőke J, Boyle B, Sereg M, Majnik J, Borgulya G, Varga I, Likó I, Rácz K, Tóth M. (2009) BclI polymorphism of the glucocorticoid receptor gene is associated with decreased bone mineral density in patients with endogenous hypercortisolism. Clin Endocrinol, 71: 636-643. IF 2008: 3,201 2. Szappanos A*, Tőke J*, Lippai D, Patócs A, Igaz P, Szücs N, Fütő L, Gláz E, Rácz K, Tóth M. (2010) Bone turnover in patients with endogenous Cushing’s syndrome before and after successful treatment. Osteoporos Int, 21: 637-645. IF 2009: 4,997 (* These two authors contributed equally to this work.) 3. Szappanos A, Patócs A, Gergics P, Bertalan R, Kerti A, Ács B, Feldmann K, Rácz K, Tóth M. (2010) The 83,557insA variant of the gene coding 11β-hydroxysteroid dehydrogenase type 1 enzyme associates with serum osteocalcin in patients with endogenous Cushing’s syndrome. J Steroid Biochem Mol Biol 123: 79–84. IF 2009: 2,655 11.2. A Doktori értekezéstől független közlemények
1. Majnik J, Patocs A, Balogh K, Toth M, Gergics P, Szappanos A, Mondok A, Borgulya G, Panczel P, Prohaszka Z, Racz K. (2006) Overrepresentation of the N363S variant of the glucocorticoid receptor gene in patients with bilateral adrenal incidentalomas. J Clin Endocrinol Metab, 91: 2796-2799. IF.: 5,799
2. Gergics P, Patocs A, Majnik J, Balogh K, Szappanos A, Toth M, Racz K. (2006) Detection of the Bcl I polymorphism of the glucocorticoid receptor gene by single-tube allele-specific polymerase chain reaction. J Steroid Biochem Mol Biol, 100: 161-166. IF.:
101
2,825
3. Majnik J, Patocs A, Balogh K, Luczay A, Torok D, Szabo V, Borgulya G, Gergics P, Szappanos A, Bertalan R, Belema B, Toke J, Sereg M, Nagy Z, Solyom J, Toth M, Glaz E, Racz K, Nemeth J, Fekete G, Tulassay Z. (2006) Nucleotide sequence variants of the glucocorticoid receptor gene and their significance in determining glucocorticoid sensitivity] Orv Hetil, 147: 2107-2115.
4. Belema B, Koranyi K, Patocs A, Liko I, Szappanos A, Bertalan R, Racz K, Balazs Cs. (2008) Polymorphisms of the glucocorticoid receptor gene in Graves’ ophthalmopathy. Br J Ophthalmol, 92: 131-134. IF 2008: 2,859 5. Füto L, Toke J, Patocs A, Szappanos A, Varga I, Glaz E, Tulassay Zs, Racz K, Toth M. (2008) Skeletal differences in bone mineral area and content before and after cure of endogenous Cushing's syndrome. Osteoporos Int, 19: 941-949. IF.: 4,29
6. Sereg M, Szappanos A, Toke J, Karlinger K, Feldman K, Kaszper E, Varga I, Glaz E, Racz K, Toth M. (2009) Atherosclerotic risk factors and complications in patients with non-functioning adrenal adenomas treated with or without adrenalectomy. A long-term follow-up study. Eur J Endocrinol, 160: 647-655. IF 2009.: 3,539
7. Bertalan R, Patocs A, Nagy B, Derzsy Z, Gullai N, Szappanos A, Rigo J Jr, Racz K. (2009) Overrepresentation of BclI polymorphism of the glucocorticoid receptor gene in pregnant women with HELLP syndrome. Clin Chim Acta, 405: 148-152. IF 2009: 2,535 8. Gergics P, Toke J, Szilágyi A, Szappanos A, Kender Z, Barta G, Tóth M, Igaz P, Rácz K, Patócs A. (2009) Methods for the analysis of large gene deletions and their application in some monogenic disorders. Orv Hetil, 150: 2258-2264.
102
12. KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS Munkámhoz nyújtott segítségükért szeretnék köszönetet mondani: Dr. Rácz Károly Professzor Úrnak, programvezetőmnek, a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika igazgatójának, aki lehetővé tette, hogy TDK, majd PhD munkámat a II. sz. Belgyógyászati Klinikán végezhessem. Szakmai irányításával, magas színvonalú tudományos munkára való ösztönzéssel, értékes tanácsaival és segítségével, valamint a betegellátásban mutatott példa értékű emberi szemlélet átadásával a munkámhoz nagy támogatást nyújtott. Dr. Tulassay Zsolt professzor Úrnak, a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika előző igazgatójának és a Klinikai Orvostudományok Tudományági Doktori Iskola igazgatójának, aki biztosította számomra a lehetőséget, hogy PhD hallgatóként
kutatómunkámat végezhessem. Dr. Tóth Miklós egyetemi docens Úrnak, témavezetőmnek, aki szakmai irányításával, értékes tanácsaival, emberi hozzáállásával, türelmével, minden feltételt biztosított számomra a magas szintű tudományos munka végzéséhez. Dr. Patócs Attilának a Molekuláris Biológiai Laboratórium vezetőjének a mindnennapi munkámban nyújtott segítségéért, valamint a jövőbeni tudományos kutatási munkásságomhoz is követendő példát adó szakmai szemléletem kialakításáért.
Prof. Dr Gláz Editnek, Prof. Dr. Gerendai Idának és a II. sz. Belgyógyászati Klinika endokrin munkacsoportjában dolgozó valamennyi klinikusnak, akik a munkámhoz szükséges betegek és klinikai adatok gyűjtésében segítettek: Dr. Kiss Róbertnek, Dr. Igaz Péternek, Dr. Ádler Ildikónak, Dr. Szűcs Nikolettnek, Dr. Pusztai Péternek, Dr. Sármán Beatrixnak.
103
Krauszné Vaczula Mária aszisztensnőnek, a molekuláris biológiai vizsgálatokban nyújtott segítségéért. Dr. Likó Istvánnak értékes tanácsaiért, illetve a molekuláris biológiai módszerek kidolgozásában nyújtott segítségéért. Dr. Varga Ibolyának és a Semmelweis Egyetem II. sz. Belgyógyászati Klinika Endokrinológiai és Izotóp Laboratóriumában dolgozó valamennyi asszisztenseknek. A II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Biológiai Laborjában dolgozó valamennyi PhD hallgatónak: Dr. Balogh-Klimaj Katalinnak, Dr. Majnik Juditnak, Dr. Mondok Ágnesnek, Dr. Bertalan Ritának, Dr. Tőke Juditnak, Dr. Sereg Mártának, Dr. Gergics Péternek, Dr. Boyle Belemának, Dr. Tömböl Zsófiának, Dr. Szabó Péternek és Dr. Butz Henriettnek. A II. sz. Belgyógyászati Klinika Molekuláris Biológiai Laborjában dolgozott TDK hallgatóknak: Dr. Lippai Dórának, Dr. Kerti Andreának és Dr. Ács Bencének. Dr. Borgulya Gábornak a statisztikai elemzésekben nyújtott segítségéért. Családomnak a rengeteg segítségért és végtelen türelmükért.
104
