A glikán-analízis a glikoproteinek glikán részének vizsgálatára szolgáló elemzés. Ez tartalmazhatja:

01/2011:20259 2.2.59. GLIKOPROTEINEK GLIKÁN-ANALÍZISE 1. BEVEZETÉS A glikán-analízis a glikoproteinek glikán részének vizsgálatára szolgáló elemzés. Ez tartalmazhatja: –

a teljes glikoprotein elemzést;

–

a glikoform fehérjék elválasztását és meghatározását;

–

a glikoproteinek enzimatikus kezelése után nyert glikopeptidek analízisét;

–

a glikoprotein kémiai vagy enzimatikus kezelése után felszabaduló glikánok analízisét.

A monoszaharidok elemzése kiegészítheti a glikán-analízissel nyert információkat. A glikoziláció meghatározó szerepet játszhat a bioterápiás szerek funkciójában, farmakokinetikájában, farmakodinamikájában, stabilitási és immungenetikai sajátságaiban. A glikoziláció, ellentétben a transzkripcióval, nem templát-vezérelt enzimatikus módosító folyamat, ami glikán-heterogenitást eredményez. A gyártási eljárás is befolyásolja a glikán-heterogenitást. Ezért a glikoprotein glikán-analízise fontos vizsgálat a glikoprotein-mintázat variációinak azonosításában és/vagy a glikoprotein mintázat állandóságának monitorozásában a gyártás során. A glikán-elemzés összehasonlító eljárás is lehet, mert a kapott információ, a megegyező módon kezelt referenciaanyaghoz hasonlítva, igazolhatja a készítmény állandóságát. Ez a fejezet a glikoproteinek glikán-elemzésére alkalmazott megközelítéseket, valamint a módszerek alkalmazásához szükséges követelményeket és a módszerek validálását ismerteti. A glikán-elemzés nem egyedüli általános módszer, hanem magában foglalja a speciális eljárások alkalmazását és mindegyik egyedi glikoprotein fajlagos glikán-térképének meghatározását is. A speciális eljárásokat ezért a vonatkozó egyedi cikkelyek tartalmazzák. 1-1.FEHÉRJE-GLIKOZILÁCIÓ A fehérjékben az enzimatikus glikozilációnak három fő típusa ismert: –

az N-glikoziláció, az oligoszaharidoknak az aszparagin terminális amid-csoportján levő nitrogénhez való kapcsolódása;

–

az O-glikoziláció, az oligoszaharidoknak a szerin, treonin és/vagy hidroxiprolin hidoxil csoportjaihoz való kapcsolódása;

–

a C-glikoziláció, ami egy α-mannopiranóznak a triptofán indolgyűrűjének C2szénatomjához való kapcsolódása.

Nem-enzimatikus kapcsolódások – pl. glikáció – is ismertek, amikor a fehérjéket redukáló cukrokkal együtt inkubálják. Ez a fejezet a glikoprotein-gyógyszerekben leggyakrabban előforduló, N-, és O-kapcsolt glikozilációk meghatározására alkalmazott analitikai módszereket írja le. 1-2. A FEHÉRJE-GLIKOZILÁCIÓ HETEROGENITÁSA A glikoproteinek előállítása során a glikán-heterogenitás különböző fokozatai jelenhetnek meg. Ez a heterogenitás a következő eltérésekből eredhet: –

a kötőhelyek lefoglaltságának foka (teljes, részleges, le nem foglalt);

–

a glikoziláció típusa (N- vagy O- kapcsolt);

–

az oligoszacharid szerkezete (kiterjedések, elágazások és kötések).

A glikoziláció heterogenitása valamely fajlagos glikoprotein számára egész készlet glikoformot eredményez. Ezek a variációk azért lépnek fel, mert - ellentétben a transzkripcióval és a transzlációval - a glikozilálás nem templát-függő poszttranszlációs módosítási folyamat. A glikozilációs-mintázat egy adott helyen számos tényezőtől függ, beleértve a Golgi apparátusban és az endoplazmás retikulumban található glikoziltranszferázok és exo-glikozidázok sejtspecifikus és/vagy növekedésfüggő hozzáférhetőségét. A fehérje-glikozilálást befolyásolja a fehérje szerkezete, a gyártási eljárás, a gazda-vektor expressziós rendszer és a sejttenyésztés körülményei is. 2. A GLIKÁN-ANALÍZISRE SZOLGÁLÓ ELJÁRÁSOK A glikoziláció heterogenitását 4 különböző és egymást kiegészítő megközelítéssel lehet meghatározni: –

az ép glikoprotein analízisével;

–

a glikopeptidek analízisével;

–

a felszabaduló glikánok analízisével;

–

a monoszaharidok analízisével.

AZ ÉP GLIKOPROTEINEK ANALÍZISE

GLIKOPROTEIN

liánok MS IEF CE Ioncserélő kromatográfia Méretkizárásos kromatográfia SDS-PAGE

GLIKOPEPTIDEK ANALÍZISE

közvetlen elemzés Elválasztás a közvetlen elemzés előtt LC/CE

proteolízis

MS

Az emésztett termék deglikozilálása

ELŐKEZELÉS (izolálás és tisztítás) ha szükséges

A FELSZABADULÓ GLIKÁNOK ANALÍZISE Jelöletlen glikánok analízise Glikánok felszabadu -lása O- és/vagy N-kapcsolt glikánok: enzimek vagy vegyszerek

HPAEC-PAD PGC-MS MS

deszializálás

Jelzett glikánok analízise Glikánok jelölése

kezelés exoglikozidázzal

MS

Elválasztás LC/CE

CE MS LC

MONOSZAHARIDOK ANALIZISE

savas hidrolízis

HPAEC-PAD PGC-MS fluorofór jelölés

kolorimetriás módszerek

LC CE

Ábraaláírások: CE: kapilláris elektroforézis; HPAEC-PAD: magas pH-n végzett anioncserélő kromatográfia pulzus amperometriás detektálással; IEF: izoelektromos fókuszálás; LC:folyadékkromatográfia; MS: tömegspektrometria, PGC: pórus grafit-kromatográfia SDS-PAGE: nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis. 2.2.59.-1.ábra. A glikán-analízis eljárásainak áttekintése Ez a fejezet az N- és O-kapcsolt glikánokat tartalmazó glikoproteinek glikán-analízisére használt módszereket és az általános követelményeket adja meg. A glikán-analízis általában egy többlépéses eljárás. A glikán-analízisre számos módszertan létezik. Ez a változatosság a glikán-szerkezetek változatosságának és bonyolultságának, valamint a rendelkezésre álló technológiák és meghatározási módszerek valamint a szükséges információk szintjétől függő megközelítések széles tartományának következménye. A 2.2.59-1. ábra a glikán-analízisnek azon analitikai eljárásairól ad áttekintést, amelyek a kiválasztott megközelítéssel/sekkel alkalmazhatók. A glikánok szerkezetétől és eredetétől függően ugyanazon technikáknak és feltételeknek számos változata áll rendelkezésünkre. Izolálás és tisztítás. Izolálásra és tisztításra szükség lehet az eljárást befolyásoló segédanyagokat tartalmazó ömlesztett gyógyszeranyagok vagy gyógyszerformák esetében, amennyiben ez követelmény az egyedi cikkelyben megtalálható. 2-1. AZ ÉP GLIKOPROTEIN ANALÍZISE Az ép glikoprotein analízise a glikoproteinek glikozilálásának általános mintázatáról ad információt. Amennyiben a molekula nagyméretű, és többszörös glikozilációs helyet tartalmaz, ez a megközelítés csak korlátozott információt szolgáltat. Olyan módszerek, mint a kapilláris elektroforézis (CE) (2.2.47) és a tömegspektrometria (MS) (2.2.43) használhatók. Méreten alapuló technikák, mint például a méretkizárásos kromatográfia (2.2.30.) és a nátrium-dodecil-szulfát poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) (2.2.31.) információt szolgáltathatnak a fehérje glikoziláltsági állapotáról. Ha a szializáció mértéke jelentősen hozzájárul a glikoprotein biológiai aktivitásához, ioncserélő kromatográfia (2.2.46), izoelektromos fókuszálás (IEF) (2.2.54) vagy CE (2.2.47) alkalmazható a szializálás nyomonkövetésére. A technikát úgy kell kiválasztani, hogy az alkalmas legyen a szializáció foka és a készítmény bioaktivitása közötti megbízható korreláció elérésére. 2-2. GLIKOPEPTIDEK ANALÍZISE A glikopeptidek analízise információt ad a hely-specifikus glikozilálási tulajdonságokról, a kötőhely lefoglaltságának mértékéről és az oligoszaharid szerkezetekről. Az analízis a

glikopreoteinek enzimatikus bontását is magában foglalja. A fehérje alaplánc (gerinc) helyspecifikus hasításának megközelítéseit a 2.2.55 Peptidtérkép-vizsgálat című általános fejezet tartalmazza. A glikoprotein proteolízisét követően a következő megközelítések választhatók. Közvetlen analízis tömegspektrometria (MS) (2.2.43) alkalmazásával. Figyelni kell arra, hogy a glikoprotein jelet más peptidek jelenléte nem nyomja-e el azokban az esetekben, amikor a glikoprotein a teljes peptid-elegynek csak kis hányada, és amikor a jel erőssége kisebb, mint a nem glikozilált peptideké. Az MS analízist megelőző elválasztás. Ez a kiegészítő lépés a fent említett problémát megoldja. A dúsítási vagy frakcionálási technikák a közvetlen analízissel párhuzamosan, vagy egymást követően alkalmazhatók. Olyan elválasztási technikák, mint a folyadékkromatográfia (LC) (2.2.29) és a kapilláris elektroforézis (CE) (2.2.47) megfelelőek. Ezeket a technikákat az MS-sel kapcsolva is lehet alkalmazni, lehetővé téve az „online” MS mérést. A glikopeptidek deglikozilálása. A glikoprotein különböző glikozilálási helyeinek azonosítását lehetővé teszi az ép glikoprotein proteolitikus emésztéssel nyert peptid-térképeinek összehasonlítása azokkal a térképekkel, amelyeket úgy nyertek, hogy a glikoproteineket a proteolitikus emésztés előtt, vagy ezt követően glikozilálták. A peptid tömege információt adhat a glikozilálási helyekről, az ép glikopeptid és a deglikozilált glikopeptid tömegének számított különbsége pedig információt szolgáltathat a kapcsolt glikánok összetételéről és heterogenitásáról. A fehérje alaplánc deglikozilálásának megközelítéseit a 2-3-1 fejezet tartalmazza. Az elválasztási lépést a deglikozilálás előtt vagy után is el lehet végezni. 2-3. FELSZABADULÓ GLIKÁNOK ANALÍZISE A felszabaduló glikánok analízise megfelelő módot ad arra, hogy információt nyerjünk a fehérjében jelen levő (kettős-hármas-, négyes elágazási pontot – „antennát”- tartalmazó) különféle glikánok mennyiségéről. A szializáció mértéke is vizsgálható ebben a lépésben. A kiválasztott módszertől függően előzetes derivatizálás/jelölés szükséges lehet a glikánok kimutatásához. A felszabaduló glikánok analízise általában magában foglalja a glikánoknak a reakcióelegyből történő felszabadulását és tisztítását, amit, ahol szükséges, a glikánok jelölése/derivatizálása követ; ezután történik a glikánok profilezése (frakcionálással vagy szeparációval). 2-3-1. A glikánok felszabadulása A glikánok felszabadulására alkalmazott megközelítés kiválasztása a vizsgált glikoproteintől függ. A hasításra alkalmazott anyagot a szükséges hasítás típusa és a szükséges információ szintje szerint választják ki. Enzimatikus vagy kémiai hasítás alkalmazható. A 2.2.59.-1 táblázat az enzimatikus hasító anyagokat és specificitásukat mutatja be, nem mindenre kiterjedően. Az emésztési hatékonyság általában a fehérjén elhelyezkedő glikánok hozzáférhetőségétől függ, így a fehérjét denaturálni lehet annak érdekében, hogy a glikozilációs hely hozzáférése a

legnagyobb legyen, kivéve, ha a felszínen elhelyezkedő és elfedett glikánok közötti különbségtétel elvárás a rendszerben. Kémiai hasító anyagokat is lehet alkalmazni, például hidrazint vagy lúgos bórhidridet a βeliminálásra. 2-3-2. Glikánok analízise A felszabaduló glikánokat kromatográfiás, elektroforetikus vagy tömegspektrometriás technikákkal vagy általában e technikák kombinált alkalmazásával lehet analizálni vagy profilezni. A módszerek választékát a glikánok természete, és a megkövetelt információ szintje szerint lehet csoportosítani. A glikánok analízise a fehérjéken jelen levő különböző glikánok mennyiségéről (nagy mannóz tartalmú, hibrid, komplex) ad információt. Az elágazó szerkezetek relatív mennyiségére vonatkozó információhoz a deszializált glikánok analízisével juthatunk. Elválasztási lépésre is szükség lehet. Ez a lépés, köztes technikaként, a folyadékkromatográfiát (2.2.29.) és a kapilláris elektroforézist (2.2.47.) foglalja magában. A folyadékkromatográfia (2.2.29.), vagy preparatív módon használható az egyedi frakciók gyűjtésével (általában jelölésre is szükség van), vagy közvetlen módon kapcsolható a tömegspektrometriával (2.2.43) 2.2.59-1 táblázat. Példák az enzimatikus hasító anyagokra

Anyagok Specifikusság N-kapcsolt glikánok felszabadulása Peptid-N4-(N-acetil-β-glukózaminil)-aszparagin N4-(N-acetil-β-D-glukózaminil)-aszparagin– amidáz (EC 3.5.1.52) maradvány hidrolízise, amelyben a glukózamin maradványt tovább lehet glikozilálni, hogy (szubsztituált) N-acetil-β-D-glukózaminilamint és aszpartát-maradványt tartalmazó peptidet nyerjünk - Peptid-N-glikozidáz F (PNGáz F) N-glikán lánc felszabadulása, de nincs (α1-3)kapcsolt mag-fukózt tartalmazó N-glikán lánc felszabadulás - Peptid-N-glikozidáz A (PNGáz A ) (α1-3)-kapcsolt mag-fukózt tartalmazó N-glikán lánc felszabadulása Mannozil-glikoprotein–endo-β-NN,N’-diacetilkitobiozil egység endohidrolízise acetilglukózaminidáz (EC 3.2.1.96) nagy mannóz tartalmú glikopeptidekben /glikoproteinekben amelyek az [Man(GlcNAc)2ASN szerkezetet tartalmazzák -Endo-β-N-acetilglukózaminidáz F (endo F) Nagy mannóz-tartalmú, hibrid és komplex oligoszaharidok felszabadulása -Endo-β-N-acetilglukózaminidáz H(endo H) Nagy mannóz-tartalmú, hibrid oligoszaharidok felszabadulása O-kapcsolt glikánok felszabadulása Glikopeptid α-N-acetilgalaktózaminidáz (EC A terminális D-galaktozil-N-acetil-α-D3.5.1.97)* galaktózaminid maradvány hidrolízise * Ennek az enzimnek korlátolt a felhasználhatósága a nagyfokú szubsztrát-specificitása miatt.

2-3-2-1. Nem jelzett glikánok analízise A natív glikánokat magas pH-jú anioncserélő kromatográfiával, pulzáló amperometriás detektálást alkalmazva (HPAEC-PAD), pórus grafit kromatográfiával (PGC) és MS-sel (2.2.43) lehet analizálni. A HPAEC-PAD nagy érzékenységű módszer és egyes kötési izomereket is el tud választani. A különböző oligoszaharid szerkezetekre vonatkozóan a különböző jelek válaszfaktora nem azonos. A glikánok abszolút tömeg-meghatározása csak abban az esetben lehetséges, ha az oligoszaharidok referencia könyvtára rendelkezésünkre áll. A mennyiségi elemzést vagy a vizsgált anyag jól meghatározott referenciaanyagával történő összehasonlítással végezhetünk, vagy minden egyes glikáncsúcs területét a térképen szereplő összes glikáncsúcs területének összegére vonatkoztatjuk. A PGC-t a natív glikánok elkülönítésére is fel lehet használni, mert szelektivitása nagyobb, mint a konvencionális nem-poláris oszlopoké. A PGC-elektrospray-ionizációval kombinált MS technika is alkalmazható a glikánok közvetlen analízisére. 2-3-2-2. Jelzett glikánok analízise A glikánok jelölése Az elvégzett derivatizálások típusa a glikánok meghatározására használt módszertől – UV, vagy fluoreszcens jel – függ. A fluoreszcens jelöléssel kombinált származékképzés a legáltalánosabban használt technika a glikánok redukáló végén történő, reduktív aminálással végzett jelölésére. Minden egyes mono-, és oligoszaharidra illeszthető egy jelölés, ily módon lehetővé téve a moláris mennyiségek meghatározását. A 2.2.59.-2. táblázat az általánosan használt fluoreszcens jelölések és a megfelelő analitikai technikák nem teljes körű listáját mutatja. 2.2.59.-2. táblázat – Példák a fluoreszcens jelölésekre és a megfelelő analitikai technikákra Név 2-aminobenzoesav 2-aminobenzamid 2-aminopiridin 2-amino-9(10H)-akridinon Trinátrium-8-aminopirén1,3,6-triszulfonsav

Betűszó 2-AA 2-AB 2-AP AMAC APTS

Analitikai technika LC (2.2.29), MS (2.2.43) LC (2.2.29), MS (2.2.43) LC (2.2.29), MS (2.2.43) Gél-elektroforézis (2.2.23) CE (2.2.47)

A glikánok permetilálását szintén lehet használni abban az esetben, ha a kimutatásra kizárólag MS-t (2.2.43) alkalmaznak. Ez a módszer az oligoszaharidok metilálásán alapul. Jelzett glikánok analízise A jelzett glikánokat különféle analitikai technikákkal, mint LC (2.2.29) CE ( 2.2.47) és MS (2.2.43), lehet vizsgálni. A glikánok elválaszthatósági tulajdonságai szerint a glikánokat megfelelő jelölést alkalmazva számos LC rendszerrel (2.2.29.) lehet profilezni, és meghatározni a mennyiségüket: fordított fázissal (a hidofób tulajdonság alapján szétválasztva), normál fázissal (méret szerinti szétválasztással) és anioncserével (töltés szerint szétválasztva). 2-4. MONOSZAHARID-ANALÍZIS A monoszacharid-analízis a glikoprotein monoszacharid-összetételéről ad felvilágosítást. A monoszacharidok analízisét vagy kolorimetriás vagy elválasztási technikákkal lehet elvégezni. 2-4-1. Kolorimetriás módszerek A kémiai festésen alapuló kolorimetriás módszerek a fajlagos cukorosztályok, mint a sziálsavak, semleges cukrok, illetőleg a hexózaminok mennyiségéről adnak felvilágosítást. 2-4-2. Elválasztási módszerek Az elválasztási módszerek segítségével információt nyerhetünk a teljes monoszacharid-összetétel mennyiségéről. A módszerek az analízis előtt az ép glikoprotein vagy a felszabaduló glikánok oligoszaharid láncának savas hidrolízises előkezelését igénylik. A sziálsav felszabadításához enyhe savas hidrolízist vagy enzimes kezelést alkalmaznak. A hidrolízis-lépésjelentős variabilitást okozhat, emiatt készítmény esetén specifikus validálásra is szükség lehet. A monoszaharidok elválasztása és mennyiségi meghatározása a következőket foglalja magában: –

a HPAEC-PAD és a PGC-MS használatát, ami lehetővé teszi a natív monoszaharidok (sziálsavak, semleges cukrok és cukoralkoholok) moláris mennyiségének meghatározását;

–

a monoszaharidok fluorofór jelölését, amelyet elválasztási technika, mint például fordítottfázisú vagy ioncserélő kromatográfia vagy CE követ.

3. AZ ADATOK ÉRTÉKELÉSE ÉS ELEMZÉSE A glikán-analízisre alkalmazott analitikai módszerekből nyert adatokat 3 különböző célból lehet elemezni és értékelni: –

az egyedi szerkezetek vagy szerkezet-családok azonosságának igazolására;

–

a vizsgált anyag minőségi megfelelésének igazolására;

–

a vizsgált anyag mennyiségi megfelelésének igazolására.

Az analízis minden egyes szintjén, a referenciaanyagokra, valamint a módszerfejlesztésre vonatkozó sajátos megfontolásokat tartalmazza a 4. illetve az 5. fejezet. 3-1. AZ EGYEDI SZERKEZETEK VAGY SZERKEZET-CSALÁDOK AZONOSSÁGÁNAK IGAZOLÁSA Valamely glikán-analízis módszernek analitikai célja lehet egy egyedi monoszaharid (például sziálsav, fukóz), valamely meghatározott oligoszaharid szerkezet (például tertaszializált, négy elágazási pontot tartalmazó glikán) vagy közös analitikai tulajdonsággal rendelkező szerkezeti családok (például tertaszializált, három elágazási pontot tartalmazó glikánok, azonos töltésű glikoprotein izomerek) elemzése. Az analitikai azonosság igazolása alapvető fontosságú az elemzésében és az adatok értékelésében, ezt a molekulaszerkezet igazolásával, vagy megfelelő referenciaanyaggal történő összehasonlítással lehet elérni. 3-1-1 Az azonosság teljes mértékű igazolása A glikán-szerkezetek azonosságának teljes mértékű igazolását általában, a termék kifejlesztése során elvégzik, így nem szükséges a rutin analízis tárgyát képeznie. Az analitikai azonosságot a molekula ismert molekuláris tulajdonsága alapján adják meg. Az egyedi szerkezetek ilyen abszolút azonosítása enzimatikus és kémiai reakciókat, elválasztási technikákat és online vagy offline meghatározási módszereket felhasználó többlépéses megközelítést kívánhat meg. Általában a szerkezet-meghatározás végső alapjaként, megfelelő tömegspektrometriás módszert alkalmazva, a molekulaionok töltés-tömeg arányát használják fel. 3-1-2 Az azonosság összehasonlító igazolása Az analitikai módszer rutin alkalmazása során az analitikai minta azonosságát bizonyítani lehet a folyamat, vagy rendszeralkalmassági referenciaanyagokkal történő összehasonlítással. A referenciaanyagokat ismert, jól jellemzett glikoproteinekből nyerhetjük, amelyeket a vizsgált készítménnyel azonos általános osztályból (például komplex N-kapcsolt glikoproteinhez való fetuin) nyertek, vagy származhatnak a vizsgált készítmény jól jellemzett, referenciaanyagként használható gyártási tételéből. A szerkezeti azonosság összehasonlító igazolására a következő azonosítások alkalmazhatók: –

a retenciós idők nagyfokú validált reprodukálhatósága esetén az abszolút retenciós idők alkalmazhatók a pontos azonosítására;

–

vagy egy glikán-markert lehet a vizsgálati szekvenciák elejére és végére injektálni, és a retenciós idők bármilyen elcsúszása ellenőrizhető; a referencia-kromatogramok alapján a vizsgálati minták glikánjai azonosíthatók;

–

azokban az esetekben, amikor referencia nem áll rendelkezésre a vizsgálati minta összes glikán csúcsának azonosítására, az azonosítatlan glikáncsúcsok monitorozására vagy jelölésére abszolút vagy normalizált retenciós időket lehet használni.

3-2 A VIZSGÁLT ANYAGOK MEGFELELŐSÉGÉNEK BIZONYÍTÁSA A MINŐSÉGI KÖVETELMÉNYEKNEK MEGFELELŐEN Az értékelésnek ezen a szintjén a vizsgált készítmény analitikai eredményeit abból a célból értékelik, hogy a specifikációnak való megfelelőségüket bizonyítsák. Ezt a célt tipikusan úgy érik el, hogy az eredményeket a vizsgált anyag referenciaanyagának párhuzamos vizsgálatakor kapott adatokkal hasonlítják össze. Az adatok értékelésekor fontos: –

annak megállapítása, hogy a referenciaanyaggal kapott analitikai eredmények széleskörűen összehasonlíthatók-e a várt eredménnyel, amihez a rendszer alkalmasságának igazolása szükséges; például egy glikán-térképezési eljárásban ezt úgy érik el, hogy a referenciaanyaggal nyert térképet összehasonlítják a referenciaanyag megállapítása során nyert mintatérképpel, biztosítva minden megállapított rendszeralkalmassági feltételnek való megfelelést;

–

a referenciaanyaggal és a vizsgálati anyaggal nyert térképek hasonlóságának bizonyítása bármilyen, az egyedi cikkelyben megadott specifikus feltétel alkalmazása esetén.

3-3 A MENNYISÉGI KÖVETELMÉNYEKNEK MEGFELELŐEN VIZSGÁLT ANYAGOK MEGFELELŐSÉGÉNEK BIZONYÍTÁSA 3-3-1. Az analit-szintek mennyiségi mérése és az eredmények kifejezése Bizonyos esetekben, például a sziálsav vagy más monoszaharidok mérésekor, az adatokat abból a célból is kifejezhetjük, hogy a sziálsav-glikoprotein moláris hányadost megkapjuk. Az adatokat a sziálsav referenciaanyagára, és a fehérje meghatározás egy validált módszerére vonatkoztatva számítják ki. Alkalmazható belső vagy külső standard módszer (lásd 2.2.46. Kromatográfiás elválasztási technikák általános fejezet). 3-3-2. Az elválasztási profil kvantitatív kifejezése A megoszlási arányokat számszerűen többféleképpen ki lehet fejezni , beleértve a nomalizációs eljárást; minden egyes analitikai célpont, például egy adott glikán százalékos tartalmát úgy számítják ki, hogy meghatározzák az adott glikán válaszát az összes glikán együttes válaszának százalékában, kivéve azokat a válaszokat, amelyek oldószerektől vagy más hozzáadott reagenstől származnak, valamint azokat, amelyek az elhanyagolási határérték alatt vannak. Használni lehet továbbá olyan numerikus kifejezéseket, mint pl. a Z-érték, amelyek módszer- és készítményspecifikusak, és az egyedi cikkelyek adják meg. 4 REFERENCIAANYAGOK

A glikánok analízisére való referenciaanyagoknak 2 funkciója van: a rendszer alkalmasságának igazolása és annak igazolása, hogy a vizsgált minta a megadott követelményeknek megfelel-e. A rendszeralkalmasságra használt referenciaanyagok lehetnek: –

a vizsgált anyagra vonatkozó referenciaanyag;

–

a vizsgált anyag, teljes mértékben jellemzett referenciaanyagából felszabaduló glikán rész;

–

a glikoproteinekből felszabaduló, jól jellemzett glikán-rész (például fetuin, IgG);

–

az azonosság és a tisztaság szempontjából jellemzett glikán-markerek.

A vizsgált glikoprotein megfelelőségére használt referenciaanyagot a vizsgálatba vont anyagból készítik. Figyelembe kell venni, hogy az egyedi cikkelyekben leírt glikán-elemzési eljárások előírják a vizsgált anyagra vonatkozó olyan referenciaanyag használatát, amelyre a glikánanalízis eljárását már validálták. 5. SZEMPONTOK, MELYEKET A MÓDSZER-FEJLESZTÉSNÉL FIGYELEMBE KELLL VENNI Ez a rész a kifejlesztés alatt álló módszer általános kivitelezésére vonatkozó lépéseket adja meg. A módszer kifejlesztésének és analitikai validálásának mértékét a specifikus készítményre vonatkozó megfelelősége alapján választják ki. A kiválasztott megközelítéstől függően a glikánanalízishez számos lépés szükséges, például: –

a glikoprotein izolálása és tisztítása (vagy sómentesítése);

–

a glikoprotein enzimatikus (vagy kémiai) kezelése, az N- vagy O-kapcsolt glikánoknak a fehérje vázról történő szelektív felszabadulása céljából;

–

a felszabadult glikánok izolálása és tisztítása;

–

a felszabadult sziálsav és monoszaharid-maradék azonosítása;

–

a felszabadult glikánok kromofór jelölése;

–

a natív, vagy fluoreszcens jelöléssel ellátott glikánok elválasztása;

–

a glikánok azonosítása és mennyiségi meghatározása (például a Z-érték meghatározása);

–

a lefoglalt kötési helyek meghatározása a glikozilált és nem glikozilált peptidek relatív mennyisége alapján.

Fehérje izolálás és tisztítás. A glikoproteineknek a mátrixtól való izolálása és tisztítása szükséges lehet az összes zavaró komponens (például segédanyagok, sók) eltávolításához és,

amennyiben ez követelmény, az egyedi cikkelyek ezt pontosítják. A fehérje mennyiségi visszanyerésének biztosítása érdekében, reprodukálható módon kell elvégezni. Az oligoszacharidok felszabadulása és izolálása. A glikán-felszabadulás választott megközelítése a vizsgált fehérjétől függ, és a glikozilálás típusán – azaz, hogy N-vagy O-kapcsolt glikozilálás – alapul. A glikán-felszabadulás nem gyógyszerkönyvi megközelítését optimalizálni kell abból a célból, hogy az összes jelen lévő glikán mennyiségét meghatározzuk. Azokat a tényezőket, amelyek a hasítási hatékonyságot befolyásolják, mint például az enzim-fehérje koncentráció aránya, a hőmérséklet, a reakcióidő hossza, valamint a fehérjék emésztés előtti denaturálása, optimalizálni kell. Figyelembe kell venni, hogy az enzimatikus/kémiai reakcióknak nem szabad megváltoztatniuk a glikán-összetételt, például nem semmisíthetik meg a sziálsav-maradékot. Ahol több, mint egy glikozilációs hely van, az enzimatikus kezelésnek arányosan kell a fehérjéhez kapcsolt összes oligoszaharidrészt felszabadítania, szerkezetüktől és a fehérjén belüli egyedi pozíciójuktól függetlenül. Bizonyítani kell az összes jelen lévő glikán esetében a reakcióelegyből történő reprodukálható visszanyerést. A felszabaduló glikánok derivatizálása. A derivatizálást általában nem gyógyszerkönyvi előírás alapján végzik el. Ezért az összes jelen levő glikán reprodukálható derivatizálását igazolni kell. Ezt a reakció körülményeinek, mint például a derivatizáló anyagok mennyisége, a reakcióhőmérséklet és a reakció-idő, optimalizálásával érhetjük el. A derivatizálási reakció semmiképp sem változtathatja meg a glikán-összetételt, például a sziálsav-maradékot nem semmisítheti meg. Elválasztás, azonosítás és rendszeralkalmasság. A glikán-analízisre alkalmazott módszereknek alkalmasnak kell lenniük a különböző glikán-részek kimutatására és szeparálására, hogy a megbízható azonosítást és mennyiségi meghatározást lehetővé tegyék. A rendszeralkalmasság elfogadási feltételei, amelyek egyúttal a glikán-hasítást, a visszanyerést és az analízist is magukban foglalják, azoktól a kritikus vizsgálati paraméterektől függenek, amelyek a kapott végeredményt befolyásolják. A vizsgált anyag és az azonos feltételek között kezelt referenciaanyag glikán-térképének összehasonlítása az analitikai eljárás teljesítményének ellenőrzésére szolgál. A kapott eredmények további igazolása céljából, az analíziseket egy ortogonális módszerrel is meg lehet ismételni. A referenciaanyag (például a vizsgált készítmény referenciaanyaga, egy rendszeralkalmassági glikán-marker) alkalmazása alapvető fontosságú a rendszeralkalmassági paraméterek megállapítása és az analitikai eljárás validálása szempontjából. A glikán-profilok menniyégi meghatározásának (például Z-érték becslés) reprodukálhatóságát igazolni kell. A lefoglalt kötőhelyek meghatározása a glikozilált és nem glikozilált peptidek relatív mennyisége alapján. Ahol a kötőhely foglaltságát enzimatikusan emésztett glikoproteinből származó glikozilált és nem glikozilált peptidek összehasonlításával becsülik meg, mindkét peptidforma reprodukálható hasítását bizonyítani kell.

6. A GLIKÁN-ANALÍZIS DÖNTÉSHOZÓ KERETRENDSZERE Ezt a döntéshozó rendszer csak tájékoztató jellegű, és nem alkotja az Európai Gyógyszerkönyv kötelező részét. A glikánok analízisére használt eljárások kiválasztását a glikoproteinek minőségbiztosításához szükséges információszintnek megfelelően állapítják meg, és ezt a készítmény kifejlesztése során állítják be. A 2.2.59-2 ábra azon módszerek kiválasztásához nyújt útmutatást, amelyeket akkor alkalmazunk, ha a glikán-analízis követelmény. 2.2.59.-2. ábra. Útmutató a módszerek alkalmazásához, ha a glikán-analízis követelmény

Ha a glikoproteinek esetében szükséges a glikán-analízis

A glikán-analízis módszereinek kiválasztása

Kis fehérje, behatárolt glikoziláció és/vagy egyszerű szerkezetek

igen

Az ép glikoprotein vizsgálata (pl. tömegspektrometriás analízise)

nem VÉGE

Nagy molekula, komplex elágazású glikánok és/vagy többszörös glikozilációs helyek

Követelmény-e a kötőhelyspecifikus glikoziláció ismerete Negatív töltés mennyiségi meghatározása. Sziálsav és/vagy monoszaharidok meghatározása

igen

nem nem

Követelmény-e a részletes glikán-analízis?

igen

VÉGE

A kötőhely-specifikus glikozilációs vizsgálat

Módszerek kiválasztása a hasított glikánok vizsgálatára (pl. elágazási profil, egyedi szerkezetek azonosítása)

A glikopeptidek proteáz-emésztése és elválasztása

VÉGE

1 04/2010:20630

2.6.30. MONOCITA-AKTIVÁLÁS VIZSGÁLAT

1. BEVEZETÉS A monocita-aktivációs vizsgálat (Monocyte Activation Test = MAT) olyan anyagok kimutatására vagy mennyiségi meghatározására használatos, amelyek aktiválás révén humán monocitákból vagy monociter sejtekből endogén mediátor anyagokat szabadítanak fel. Ilyen anyagok a gyulladást elősegítő citokinek, például a tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α), az interleukin-1-béta (IL-1β) és az interleukin-6 (IL-6). Ezeknek a citokineknek szerepük van a láz patogenezisében, következésképpen a MAT a pirogének jelenlétét mutatja ki a vizsgált mintában. A MAT alkalmas arra, hogy termékspecifikus validálás után helyettesítse a nyúl pirogénvizsgálatot. A nem-endotoxin pirogéneket vagy gyulladást elősegítő szennyező anyagokat tartalmazó gyógyszerek az endotoxin dózis-hatás görbéjéhez képest gyakran igen meredek dózis-hatás görbét mutatnak. Az ilyen szennyezett termékek esetében a legnagyobb válasz gyakran a vizsgált készítmény hígítatlan vagy kis mértékben hígított oldatával nyerhető. Ezért azokat a készítményeket, amelyek nem-endotoxin szennyezőket tartalmaznak vagy tartalmazhatnak, olyan hígítási tartományban kell vizsgálni, amely a legkisebb hígítást is magában foglalja. A jelen fejezetben a következő 3 módszer leírása szerepel. A-módszer. Kvantitatív vizsgálat B-módszer. Félkvantitatív vizsgálat C-módszer. Referencia gyártási tétel összehasonlító vizsgálata. A vizsgálatot olyan módon kell elvégezni, hogy a pirogénnel való szennyeződés kizárható legyen. 2. DEFINICÓK A legnagyobb érvényes hígítás (Maximum valid dilution = MVD) valamely minta megengedhető legnagyobb hígítása, amelynél a szennyezési határérték meghatározható. Az MVD-t a következő kifejezés alkalmazásával kell meghatározni:

CLC ⋅ C , LOD ahol: CLC = a szennyező határérték-koncentrációja; C

= a vizsgálati oldat koncentrációja;

LOD = a kimutatási határ. A megfelelésről vagy nem megfelelésről hozott döntés elfogadási kritériuma a szennyező határértékkoncentrációja (CLC), amelyet endotoxin-egyenérték/milligrammban vagy endotoxinegyenérték/milliliterben, illetve a vizsgált készítmény biológiai aktivitásának egységeiben fejeznek ki. A CLC-t a következő kifejezés alkalmazásával kell számítani:

2

K , M ahol: K = az endotoxin pirogén adagjának testtömeg-kilogrammra vonatkoztatott küszöbértéke; M = a készítmény legnagyobb ajánlott izomba adott adagja, testtömeg-kilogrammonként. Amennyiben a készítményt gyakori időközökben alkalmazott injekcióként vagy folyamatos infúzió formájában kell beadni, az M az egyórás időtartamon belül beadható legnagyobb teljes adagot jelenti. Amennyiben valamely készítményre már meghatározták az endotoxin határérték-koncentrációt (Endotoxin Limit Concentration = ELC), a CLC, hacsak nincs más előírás, azonos az ELC-vel. Ebben az esetben a vizsgálati oldat koncentrációját a következőképpen kell kifejezni: mg/ml-ben, ha az endotoxin határértékét tömegre vonatkoztatva fejezték ki (NE/mg), Egység/ml-ben, ha az endotoxin határértékét biológiai egységekben (NE/egység) határozták meg, és ml/ml-ben, ha az endotoxin határértékét térfogategységként (NE/ml) határozták meg. A szennyező koncentrációjának endotoxin-egyenértéke leolvasható a standard endotoxin dózis-hatás görbéről (A-módszer), vagy a standard endotoxin oldatokra adott válasszal összehasonlítva megbecsülhető (B-módszer). A standard enxotoxin-törzsoldat olyan endotoxin referenciastandardból készül, amelyet a Nemzetközi Standardra, például BRP endotoxin standardra állítottak be. A mérés cut-off értékét a következő kifejezés alkalmazásával számítjuk:

x + 3s , ahol:

x = a vak mintára kapott 4 párhuzamos válaszérték (R0) átlaga; s = a vak mintára kapott 4 párhuzamos válaszérték (R0) szórása. A mérés cut-off értékét a kiértékelésnek megfelelő egységekben fejezzük ki. A kimutatási határ (limit of detection = LOD) az endotoxin standard görbe felhasználásával határozható meg. Az LOD a cut-off értéknek megfelelő endotoxin-koncentráció. A vizsgálatban az LOD-t endotoxinegyenérték/ml-ben fejezzük ki. 3. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁS A vizsgált készítmény oldatát emberi monocita forrásból nyert sejtekkel, vagy humán „monociter” sejtekkel inkubálják. Ezek a sejtek származhatnak például humán heparinozott, lehetőleg négy óránál nem régebben levett perifériás vérből, vagy ugyanennek a vérnek a monocitákat tartalmazó frakciójából, például humán perifériás vérből (pl. sűrűséggradiens centrifugálással) nyert mononukleáris sejtekből (PBMC) vagy emberi monocita sejtvonalból. A humán heparinozott perifériás vért általában sejttenyésztő tápfolyadékkal vagy fiziológiás sóoldattal hígítják, például 2-50 %V/V végső koncentrációra. A PBMC-t vagy a monocita sejtvonalakat sejttenyésztő tápfolyadékban – vagy a donor saját plazmájával, vagy AB savóval együtt – tipikus esetben tenyésztőlyukanként, kémcsövenként, illetve egyéb tenyésztőedényenként 0,1-1,0×106 sejtkoncentrációban használják. A monocita sejtvonalak esetében az AB savó hővel kezelt embrionális borjúszérummal helyettesíthető. A sejtek tenyésztését 37±1 °C-on, a tápfolyadéknak megfelelő atmoszférában, például 5% CO2-t tartalmazó nedves levegőben végzik el. A tenyésztési időtartamnak elegendőnek kell lennie ahhoz, hogy a választott kiértékelési érték kellő megnövekedését lehetővé tegye. A választott kiértékelésnek a vizsgált készítmény oldatára adott válaszát, például a

3 gyulladást elősegítő vagy pirogén citokinek esetében, a standard endotoxinra vagy a vizsgált készítmény valamely referencia gyártási tételére adott válasszal hasonlítják össze. A kiválasztott kiértékelési módszert megfelelő standardok felhasználásával kalibrálják. 4. ESZKÖZÖK Minden üveget és egyéb hőálló eszközt hőlég-szárítószekrényben, validált eljárás alkalmazásával pirogénmentesíteni kell. Az általánosan használt legrövidebb idő és legalacsonyabb hőmérséklet 30 perc, illetve 250 °C. Ha műanyag eszközöket, például mikrotiter lemezt és automata pipettákhoz tartozó pipettahegyeket alkalmazunk, olyan eszközt kell használni, amelyről bizonyították, hogy mentes a meghatározható pirogén anyagoktól, és amely nem zavarja a vizsgálatot. 5. A SEJTFORRÁSOK ÉS MINŐSÍTÉSÜK 5-1. TELJES VÉR A teljes vért egyedi donoroktól vagy egyesített teljes vérből nyerik, és az 5-3, illetve az 5-4 pontban meghatározott követelményeknek megfelelő módon minősítik. 5-2. PERIFÉRIÁS VÉRBŐL NYERT MONONUKLEÁRIS SEJTEK (PBMC) A PBMC-t egyedi donoroktól nyert teljes vérből vagy egyesített teljes vérből különítik el, és az 5-3, illetve az 5-4 pontban meghatározott követelményeknek megfelelő módon minősítik. 5-3. A VÉRADÓK MINŐSÍTÉSE A véradóknak, az egyéb hatályban levő követelmények mellett, amelyek a donor belegyezésére, egészségére, a biztonságosságra és az etikai tényezőkre vonatkoznak, meg kell felelniük a következő minősítési kritériumoknak. A véradóknak nyilatkozniuk kell arról, hogy egészségi állapotuk megfelelő, nem szenvednek semmiféle bakteriális- vagy vírusfertőzésben, és a véradást megelőző legalább 1 héten belül nem volt fertőzésre utaló tünetük. A donorok a véradást megelőző 48 órában nem vehettek be nemszteroid gyulladásgátló gyógyszert, valamint a véradást megelőző 7 napban szteroid gyulladásgátló gyógyszert. Azok az egyének, akik immunszuppresszív hatású vagy más olyan gyógyszert szedtek, amelyről ismert, hogy a kiválasztott kiértékelést befolyásolhatja, nem lehetnek véradók. A véradást a hazai transzfúziós egészségügyi követelményeknek megfelelően kell fertőzési markerekre vizsgálni. 5-4. TÖBB DONORBÓL SZÁRMAZÓ EGYESÍTETT SEJTEK MINŐSÍTÉSE A teljes vérből vagy vérfrakciókból, például PBMC-ből egyesített sejtek legalább 4, de lehetőleg 8 vagy több egyedi donor véréből származzanak; ha lehetséges, minden donortól megközelítőleg azonos térfogatú vért kell levenni, illetve a sejteket megközelítőleg azonos térfogatú vérből kell kinyerni. Az egyesített sejtek minősítése a következőképpen történik: a vérvételt követő 4 órán belül az egyesített sejtek felhasználásával felvesszük a dózis-hatás görbét, amelyhez standard endotoxint használunk, legalább 4, mértani sor szerint készített hígítás (például 0,01–4,0 NE/ml koncentráció) alkalmazásával. A dózis-hatás görbének a standard görbére megadott, 6.1 pontban leírt 2 követelménynek meg kell felelnie. 5-5. A FAGYASZTVA TÁROLT (KRIOKONZERVÁLT) SEJTEK MINŐSÍTÉSE A MAT meghatározás során felhasználandó sejtforrások, például a humán teljes vér, vérfrakciók (pl. PBMC) vagy monocita sejtvonalak fagyasztva tárolhatók. Egyesített fagyasztva tárolt sejtek a sejtek fagyasztás előtti egyesítésével vagy az egyedi fagyasztva tárolt vérminták közvetlenül a felolvasztás után való egyesítésével nyerhetők. Az egyesítetések legalább 4, de lehetőleg 8 vagy több egyedi donor véréből

4 származzanak; ha lehetséges, minden donortól megközelítőleg azonos térfogatú vért kell levenni, illetve a sejteket megközelítőleg azonos térfogatú vérből kell kinyerni. A fagyasztva tárolt vér vagy vérsejtek minősítését a felolvasztás (és szükség esetén egyesítés) után azonnal el kell végezni: a fagyasztva tárolt vér vagy vérsejtek feleljenek meg a standard görbére megadott, 6.1 pontban leírt 2 követelménynek. 5-6. FOLYAMATOSAN FENNTARTOTT MONOCITA SEJTVONALAK A humán monocita sejtvonalat azért tenyésztik folyamatosan, hogy a MAT céljára megfelelő készletet biztosítsanak. A módszer optimalizálására a sejtvonalból származó klónok használhatók. A sejteket steril körülmények között kell fenntartani, és rendszeresen vizsgálni kell mikoplazma szennyezés jelenlétére. Ezen felül, a sejteket rendszeresen vizsgálni kell azonosság (például kettőződési idő, morfológia és funkció), valamint stabilitás szempontjából. A sejtvonal funkcionális stabilitását olyan módon határozzák meg, hogy a továbboltások számához viszonyított teljesítőképességét folyamatosan ellenőrzik a rutin vizsgálatok során. A funkcionális stabilitás kritériumait meg kell határozni, ami magában foglalhatja a növekedési kritériumokat, a vizsgálat során kapott legnagyobb jelet, a háttérzajt és a receptor kifejeződést. A receptor kifejeződést specifikus ligandokkal, például a „toll-like” receptor 4 (TLR4) esetében lipopoliszaharidokkal (LPS), a „toll-like” receptor 2 (TLR2) esetében lipoteikonsavval (LTA), a TLR2-TLR1, illetve a TLR2-TLR6 esetében pedig szintetikus bakteriális lipoproteinnel lehet vizsgálni. 6. ELŐKÉSZÍTŐ VIZSGÁLATOK Abból a célból, hogy a vizsgálat pontosságáról és érvényességéről meggyőződjünk, előkészítő vizsgálatokat kell elvégezni annak biztosítására, hogy a standard görbére vonatkozó kritériumok teljesülnek, hogy az oldat nem befolyásolja a vizsgálatot, hogy a vizsgálat endotoxinokat, valamint nemendotoxin jellegű szennyezéseket mutat-e ki, továbbá hogy az oldat nem befolyásolja a kimutatási rendszert. 6-1. A STANDARD GÖRBÉRE MEGADOTT KRITÉRIUMOK BIZTOSÍTÁSA A standard görbe felvételéhez a standard endotoxin legalább 4 különböző töménységű oldatát használjuk. A vizsgálatot a standard endotoxin oldat valamennyi hígítása esetében legalább 4 párhuzamos mintával kell elvégezni. A kiválasztott kiértékelésnél (vak érték) az alap kibocsátást a hozzáadott standard endotoxin jelenléte nélkül olyan módon kell optimalizálni, hogy az a lehető legalacsonyabb legyen. A standard görbe elfogadhatóságának két kritériuma van: −

A log dózis – válasz (utóbbi szükség esetén megfelelően transzformálva) függvény regressziója statisztikailag szignifikáns ( p<0.01) legyen;

−

A log dózis – válasz függvény regressziója nem térhet el szignifikánsan (p >0.05) a linearitástól. Ha az analízist 4 paraméteres logisztikai görbére végezzük el, az észlelt görbe, a szokásos statisztikai módszereket (lásd az 5.3. általános fejezetet) alkalmazva, nem térhet el szignifikánsan az elméleti görbétől.

6-2. A ZAVARÓ TÉNYEZŐK VIZSGÁLATA A vizsgálat érvényességének biztosítása céljából előzetes vizsgálatokat kell végezni annak igazolására, hogy a vizsgálati oldat nem befolyásolja vizsgálat eredményét. A vizsgálati módszert minden olyan esetben validálni kell, amikor a kísérleti feltételek úgy változnak, hogy az befolyásolhatja a vizsgálat eredményét. Megfelelő hígítószerrel a vizsgálandó készítményt mértani sor szerint hígítjuk, olyan módon ,

5 hogy egyetlen hígítás se haladja meg az MVD-t. A vizsgálandó készítményből azonos módon még egy hígítási sort készítünk, és az endotoxint a standard görbe középértékének megfelelő vagy ahhoz közeli koncentrációban (A-módszer), illetőleg a LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban (B-módszer) adjuk hozzá. Más lehetőségként olyan hígító oldatot is használhatunk, amely a standard görbe közepértékének megfelelő vagy ahhoz közeli koncentrációban (A-módszer), illetőleg a LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban (B-módszer) hozzáadott endotoxin tartalmaz. Ezeket a hígítási sorozatokat egy kísérleten belül párhuzamosan vizsgáljuk. Minden egyes oldat endotoxin-egyenérték koncentrációjának kiszámítására a standard görbét használjuk. Az oldathoz hozzáadott endotoxin átlagos visszanyerését úgy számítjuk ki, hogy az oldat átlagos endotoxin-egyenérték koncentrációját (ha egyáltalán tartalmaz endotoxint) levonjuk a hozzáadott endotoxint is tartalmazó oldatéból. A vizsgálati oldat akkor tekinthető a vizsgálatot befolyásoló tényezőktől mentesnek, ha a vizsgálati körülmények között a mért endotoxin egyenérték-koncentráció abban a vizsgálati oldatban (miután levontuk belőle a hozzáadott endotoxint nem tartalmazó oldatban mért endotoxin-egyenérték koncentrációt), amelyhez endotoxint adtunk, a hozzáadott koncentráció 50–200%-a között van. Amennyiben ez a kritérium nem teljesül, az A- vagy a B-módszer alkalmazásával szemben a C-módszert kell előnyben részesíteni. A C-módszerben a vizsgálandó készítmény oldatát három hígításban kell vizsgálni: abban a legnagyobb koncentrációban (legkisebb hígításban), amely a választott kiértékelésnél a legnagyobb kibocsátást serkenti, valamint a közvetlenül e feletti és alatti kétszeres hígításban. Minthogy az a koncentráció, amely a kiválasztott kiértékelésnél a legnagyobb kibocsátást serkenti, egyaránt függhet a donortól és a gyártási tételtől, a termékspecifikus validálást legalább három független vizsgálatban kell elvégezni, amelyekben más-más donoroktól származó sejteket kell felhasználni. A legmagasabb koncentrációt (legkisebb hígítást), amelyről úgy gondolják, hogy a kiválasztott kiértékelésnél a donorok többségében a legnagyobb kibocsátást serkentette, valamint a közvetlenül e feletti és alatti kétszeres hígítást, további vizsgálatokban kell validálni. Amennyiben a nem hígított vizsgálati oldat serkenti a legnagyobb kibocsátást a kiválasztott kiértékelésnél, a PBMC-hez való hozzáadás előtt további vizsgálatokat kell végezni a nem hígított vizsgálati oldat, valamint annak 1:2 és 1:4 arányú hígításainak felhasználásával. Az egymást követő vizsgálatokban felhasznált 3 hígítás nem haladhatja meg az MVD-t; ennek a három hígításnak a hígítási faktorát f1-gyel, f2-vel és f3-mal jelöljük. A termékspecifikus validálást követően a vizsgálatot rutinszerűen vagy 4 egyedi donorból származó sejteken, vagy egyetlen, egyesített sejteket tartalmazó szuszpenzión, vagy humán monocita sejtvonal egyetlen passzázsából származó sejteken végezzük el. 6-3. A NEM -ENDOTOXIN JELLEGŰ? MONOCITA-AKTIVÁLÓ SZENNYEZÉSEK MEGHATÁROZÁSI MÓDSZERÉNEK VALIDÁLÁSA Az előkészítő vizsgálat során azt is bizonyítani kell, hogy a kiválasztott vizsgálat, a bakteriális endotoxinok kimutatásán felül, a nem-endotoxin jellegű, gyulladást elősegítő vagy pirogén szennyezőket is kimutatja. Ezt olyan, korábban már vizsgált gyártási tételek felhasználásával lehet elvégezni, amelyekben nem-endotoxin jellegű szennyezőket mutattak ki, és amelyek a nyúl pirogén vizsgálatban pozitív reakciót adtak, illetőleg emberben nem várt gyógyszerreakciót váltottak ki. Amennyiben ilyen gyártási tételek nem állnak rendelkezésre, az előkészítő validálásnak magában kell foglalnia a vizsgáló rendszer validálását is, a „toll-like” receptorok specifikus ligandjainak (például peptidoglikánok, lipoteikolsavak vagy szintetikus bakteriális lipoproteidek) felhasználásával. 6-4 A KIMUTATÁSI RENDSZERT BEFOLYÁSOLÓ TÉNYEZŐK Amikor a vizsgálandó készítmény oldatának a további vizsgálatok céljára legmegfelelőbb hígítását már meghatározták, a meghatározási rendszerben (például ELISA) előforduló interferáló tényezők vizsgálatára a választott kiértékelés során ezt a hígítást alkalmazzák. A választott kiértékelésben a standard hígítási sorozatoknak, a vizsgálandó készítmény jelenlétében vagy a vizsgálandó készítmény nélkül, 20 százalékon belüli egyezést kell mutatniuk.

6 7. MÓDSZEREK 7-1. A MÓDSZER: KVANTITATÍV VIZSGÁLAT Az A-módszer alapja a vizsgálandó készítmény standard endotoxin dózis-hatás görbével történő összehasonlítása. A vizsgálandó készítmény akkor felel meg a vizsgálat követelményének, ha szennyezőinek koncentrációja kisebb, mint a CLC érték. 7-1-1. A vizsgálat menete A validált vizsgálati módszert alkalmazva a 2.6.30.-1. táblázat alapján oldatokat készítünk, és minden egyes oldatból 4-4 párhuzamos mintát tenyésztünk, amit végezhetünk külön-külön 4 egyedi donor sejtjeivel, egyetlen egyesített sejtszuszpenzióval vagy humán monocita sejtvonal egy passzázsából származó sejtekkel. 2.6.30.-1. táblázat Oldat

Oldat

Hozzáadott endotoxin (NE/ml)

Párhuzamos minták száma

A

vizsgálati oldat/f

nincs

4

B

vizsgálati oldat/2f

nincs

4

C

vizsgálati oldat/4f

nincs

4

D

vizsgálati oldat/f

az endotoxin standard görbe szerinti középadag (R3)

4

R0

pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer

nincs ( negatív kontroll)

4

R1-R4

pirogénmentes élettani sóoldat vagy a vizsgálatban használt hígítószer

4-féle töménységű standard endotoxin

minden egyes koncentrációból 4 db

A-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a hígítása (itt f-fel jelölve), amellyel a zavaró tényezőkre vonatkozó vizsgálatot elvégezték, tehát az a legnagyobb töménység (legkisebb hígítás), amelynél az endotoxin visszanyerése 50–200% közé esik. B-oldat = Az A-oldat kétszeres hígítása, amely nem haladja meg az MVD értéket. C-oldat = A B-oldat kétszeres hígítása, amely nem haladja meg az MVD értéket. D-oldat = Hozzáadott standard endotoxint (az endotoxin standard görbe szerinti középadagot (R3)) tartalmazó A-oldat. R0 oldat = negatív kontroll. R1-R4 oldat = standard endotoxin oldatok, a zavaró tényezők meghatározására szolgáló vizsgálatban használt koncenrációkban. 7-1-2. Számolás és értelmezés Minden elemezendő adatnak olyan sejtekre kell vonatkoznia, amelyek megfelelnek a standard görbe két kritériumának. Az endotoxin-egyenérték visszanyerése, amit a D-oldatban az A-oldat endotoxinegyenértékének levonása után számítunk ki, 50-200% között legyen. Az A-, B- és C-oldatok párhuzamos mintái endotoxin-egyenértékének kiszámításához minden egyes különböző sejtforrás esetén (pl. egyedi vérminták, egyesített donorsejtek vagy sejtvonal) az R1-R4 endotoxin standard görbét használjuk fel. A vizsgált készítmény akkor felel meg az adott sejtforrásra vonatkozó vizsgálat követelményeinek, ha az A-, B- és C-oldatok párhuzamos mintáiban mért endotoxinegyenérték-koncentráció középértéke, a hígításra és koncentrációra történő korrekció után kisebb, mint a vizsgált készítményre előírt CLC érték.

7 7-1-3 A készítmény megfelelési/nem megfelelési kritériumai Amennyiben egyedi donorok sejtjeit használjuk, a vizsgálandó készítménynek mind a négy különböző donor sejtjei esetében meg kell felelnie a vizsgálat követelményeinek. Ha a vizsgált készítmény a 4 donor közül 3 sejtjeivel végzett vizsgálatban megfelel (egy donort kizárnak a vizsgálatból a vizsgálat követelményeinek való meg nem felelés miatt, vagy azért mert pozitív reakciót mutatott), a vizsgálatot további 4 olyan donorból származó sejtekkel kell folytatni, ahol egyetlen donor sejtjei sem szerepeltek az első számú vizsgálatban, és a vizsgált készítménynek a 8 donor közül hétnek a sejtjeivel megfelelő eredményt kell adnia (azaz 8 donorból legfeljebb egy pozitív reakció engedhető meg.) Amennyiben a monociták több egyedi donor sejtjeinek egyesítéséből származnak, a vizsgált készítménynek az egyesített sejtekkel végzett vizsgálat követelményének kell megfelelnie. Amennyiben a vizsgálatban humán monocita sejtvonalat használnak, a vizsgált készítménynek a sejtvonal egyetlen passzázsán vizsgálva meg kell felelnie a követelményeknek. 7-2 B-MÓDSZER, FÉL-KVANTITATÍV VIZSGÁLAT A B vizsgálati módszerben a vizsgálandó készítményt standard endotoxinnal hasonlítjuk össze. Az eredmény elfogadásához a vizsgált készítmény szennyezőanyag-koncentrációjának kisebbnek kell lennie, mint a CLC. Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve a felszabadítási döntéshez az A-oldatot kell választani. 7-2-1. A vizsgálat menete A validált vizsgálati módszer felhasználásával a 2.6.30.-2. táblázat szerint oldatokat készítünk, és minden egyes oldatból 4 párhuzamos tenyészetet készítünk, külön-külön 4 egyedi donor sejtjeivel, egyetlen egyesített sejtszuszpenzióval vagy humán monocita sejtvonal egy passzázsának sejtjeivel. 2.6.30.-2. táblázat

.

Oldat

Oldat

Hozzáadott endotoxin (NE/ml)


A

vizsgálati oldat/f

nincs

4

B

vizsgálati oldat/f1

nincs

4

C


nincs

4

D

vizsgálati oldat/f

A vizsgálati rendszerre számolt LOD 2-szeresének megfelelő töménységű standard endotoxin

4

E



4

F



4

R0


nincs (negatív kontroll)

4

R1

pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy A vizsgálati rendszerre számolt LOD 0,5-szeresének a vizsgálatban használt hígítószer megfelelő töménységű standard endotoxin

4

R2



4

R3



4

R4

pirogénmentes fiziológiás sóoldat vagy hígító folyadék


4

8 A-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a hígítása (itt f-fel jelölve), amellyel a zavaró körülményekre vonatkozó vizsgálatot elvégezték. B-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a – termékspecifikus validálási adatok áttekintése után kiválasztott – hígítása (itt f1-gyel jelölve), amely nem haladja meg az MVD értéket (pl. 1:2 × MVD, vagyis az MVD felének megfelelő hígítás). C-oldat = A vizsgálandó készítmény oldatának az a – termékspecifikus validálási adatok áttekintése után kiválasztott – hígítása (itt f1-gyel jelölve), amely nem haladja meg az MVD értéket (pl az MVD érték). D-oldat = Az előzetes vizsgálatok során a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban hozzáadott standard endotoxint tartalmazó A-oldat. E-oldat = A vizsgálati rendszerre meghatározott LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban hozzáadott standard endotoxint tartalmazó B-oldat. F-oldat = A vizsgálati rendszerre meghatározott LOD kétszeresének megfelelő koncentrációban hozzáadott standard endotoxint tartalmazó B-oldat. R0-oldat = negatív kontroll. R1-oldat = Standard endotoxin, a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD felének megfelelő koncentrációban. R2-oldat = Standard koncentrációban.

endotoxin,

a

vizsgálati

rendszerre

meghatározott

LOD-nak

megfelelő

R3-oldat = Standard endotoxin, a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD 2-szeresének megfelelő koncentrációban. R4-oldat = Standard endotoxin, a vizsgálati rendszerre meghatározott LOD 4-szeresének megfelelő koncentrációban. 7-2-2. Számolás és értelmezés Valamennyi elemzésre kerülő adatnak olyan sejtekre kell vonatkoznia, amelyeknél az R0-R4 oldatokra adott válaszok átlagértéke fokozatosan nő. Az R0-oldatra adott válaszok átlagértéke megegyezhet az R1oldatra adott válaszok átlagértékével. Minden egyes különböző sejtforrás, azaz az egyedi vérminták, az egyesített donorsejtek vagy a sejtvonal esetében az R2-oldatra adott válaszok átlagértékének nagyobbnak kell lennie, mint a pozitív cut-off érték. A megállapított cut-off érték alatti értékeket negatívnak kell tekinteni. Amennyiben az R1- vagy az R2-oldatra adott átlagos válaszérték meghaladja a megállapított cut-off értéket, a megfeleléssel kapcsolatos döntésre kiválasztott oldatra adott válasznak negatívnak kell lennie (= megfelelt). A hozzádadott endotoxin százalékos visszanyarésének megállapításához a vizsgálandó készítmény minden egyes negatív oldatának (A-, B-, illetve C-oldat) esetében a megfelelő, hozzáadott endotoxint is tartalmazó oldatokra (sorrendben D-, E-, illetve F-oldat) adott átlagos válaszértékeket össze kell hasonlítani az R3-oldatra kapott átlagos válaszértékkel. Adott sejtforrásra vonatkoztatva a szennyezők koncentrációja abban az esetben kisebb, mint a CLC, ha a vizsgálandó készítménynek a megfelelésől szóló döntésnél használandó oldata, valamint annak nagyobb hígításai egyaránt negatív eredményt adnak, továbbá ha a hozzáadott endotoxinra 50–200% közötti visszanyerést kapunk. 7-2-3 A készítmény megfelelési/nem megfelelési kritériumai A kritériumok azonosak az A.-módszerre leírtakkal (lásd: 7-1-3.) 7.3. C-MÓDSZER: REFERENCIA GYÁRTÁSI TÉTELLEL VÉGZETT ÖSSZEHASONLÍTÓ VIZSGÁLAT A C-módszer a vizsgálandó készítménynek, valamint a készítmény egy validált referencia gyártási tételének összehasonlításán alapul. A referencia gyártási tétel kiválasztása indokolt és engedélyezett

9 kritériumok figyelembevételével történik. A módszer olyankor alkalmazható, amikor a készítmény vizsgálata során jelentős interferencia lép fel, amely azonban nem szüntethető meg a készítménynek az MVD határértéken belüli hígításával, mivel az – biztosan vagy vélhetően – nem-endotoxin jellegű szennyezőket tartalmaz. A nem-endotoxin típusú szennyezőkre adott válasz lecsökkenése gyorsabb lehet, mint az endotoxinra adott válaszé, ami miatt a vizsgálatot olyan hígítási tartományban kell elvégezni, amely a legkisebb hígítást is tartalmazza. A vizsgálat menetét a közvetkezőkben írjuk le. A leírás egy példát is tartalmaz a vizsgálati tétel és a referencia tétel összehasonlítására vonatkozóan. 7-3-1 A vizsgálati eljárás A validált vizsgálati módszer felhasználásával elkészítjük a 2.6.30-3. sz. táblázatban megadott oldatokat, és minden egyes oldatból 4 egyedi donor mindegyikének sejtjeivel, egyesített sejtszuszpenzióval vagy humán monocita sejtvonal egy passzázsának sejtjeivel 4-4 párhuzamos tenyészetet készítünk. 2.6.30-3. táblázat Oldat

Oldat/hígítási faktor


A

a referencia gyártási tétel oldata / f1

4

B


4

C


4

D

a vizsgálandó készítmény oldata / f1

4

E


4

F


4

G

pozitív kontroll (standard endotoxin)

4

R0

hígítószer (negatív kontroll)

4

Az A-, B- és C-oldatok a referencia gyártási tételből készülnek, a zavaró tényezőkre vonatkozó vizsgálatban meghatározott f1, f2, illetőleg f3 hígítási faktor szerint hígítva. A D-, E- és F-oldatok a vizsgálandó készítményből készülnek, a zavaró tényezőkre vonatkozó vizsgálatban a referencia gyártási tételre meghatározott f1, f2, illetőleg f3 hígítási faktor szerint hígítva. A G-oldat a sejtek életképességére vonatkozó pozitív vizsgálati kontroll, illetve az a standard endotoxin koncentráció, amely egyértelmű pozitív választ ad. Az R0-oldat az a hígítószer, amit a vizsgált minta hígítására használnak és vak értékként szolgál. 7-3-2. Számítás és értelmezés Az elemezendő adatok csak olyan sejtekből származhatnak, amelyek esetében a G-oldat, valamint az A-, B- és C-oldatok közül legalább egy nagyobb választ ad, mint a kiértékelés alapértéke (R0-oldat). Minden egyes különböző sejtforrásra (pl. egyedi vérmintákból nyert sejtek, összeöntött donorsejtek vagy sejtvonalból származó sejtek) a kiértékelés standard görbéjét (két párhuzamos kalibrálási görbe vakértékkel és a választott kiértékelés standardjának legalább 4 mértani hígításával) használjuk, és kiszámoljuk az A-F-oldatokra adott párhuzamos válaszértékek átlagát. Kiszámítjuk az A-, B- és C-oldat párhuzamos mintáira adott válaszok átlagértékeinek összegét, valamint a D-, E- és F-oldat párhuzamos mintáira adott válaszok átlagértékeinek összegét. A D-, E- és F-oldatra adott válaszok átlagértékeinek összegét elosztjuk az A-, B- és C-oldatra adott válaszok átlagértékeinek összegével. A vizsgálandó készítmény megfelel egy meghatározott sejtforrásra vonatkozó vizsgálat követelményeinek, ha az eredményként kapott érték megfelel meghatározott – 2,5-et meg nem haladó – elfogadási kritériumnak. 7-3-3 A készítmény megfelelési/nem megfelelési kritériumai A kritériumok azonosak az A-módszerre leírtakkal (lásd: 7-1-3.)

10 A szennyezők mennyiségének pontosabb meghatározására az A-, B vagy C-módszert a vizsgálandó oldat olyan egyéb hígításaival is el lehet végezni, amelyek nem haladják meg az MVD-t. A következő fejezetet tájékoztató jellegű.

Útmutató 1. BEVEZETÉS A monocita aktivációs vizsgálat (MAT) elsősorban a nyúl pirogén vizsgálat alternatív módszereként szolgál. A MAT a lázkeltő, gyulladást kiváltó szennyezőanyagokat, beleértve a Gram-negatív baktériumokból származó endotoxinokat, valamint a nem-endotoxin jellegű szennyezőket, azaz a Grampozitív és Gram-negatív baktériumokból, vírusokból, gombákból származó patogén-kapcsolt molekuláris mintázatokat (PAMP) és a készítménnyel összefüggő vagy az eljárással összefüggő biológiai vagy kémiai entitásokat mutatja ki. Minthogy a nem-endotoxin jellegű szennyezőanyagok fizikai-kémiai értelemben változatos molekulaosztályokba tartoznak, és a vizsgált készítmény szennyezőanyagának természete általában ismeretlen, a szennyezés szintjét endotoxin-egyenérték egységekben fejezzük ki, a standard endotoxinra adott válasszal összehasonlított eredményből származtatva, vagy a vizsgálati készítmény referencia gyártási tételével összehasonlítva. A MAT-ban a standard endotoxinra adott válasz általában megközelítőleg 1 log hígítási tartományon belül csökken le, a nem-endotoxin jellegű szennyezők pedig (önmagukban vagy endotoxinnal kombinálva), monocita stimuláló hatásukat vizsgálva gyakran nagyon meredek dózis-hatás görbét mutatnak, rendszerint már 1 vagy két hígítási lépésen belül. Gyakran az ilyen szennyezett készítményeknél a legnagyobb választ a nem hígított vagy a kis mértékben hígított vizsgálati készítménnyel kapjuk. Ebből az okból kifolyólag a vizsgálati készítmények oldatát, amelyek nem-endotoxin jellegű szennyezéseket tartalmaznak vagy tartalmazhatnak, olyan hígítási tartományban kell vizsgálni, amely a legkisebb hígítást is magában foglalja. 2. MÓDSZEREK 2-1. A MÓDSZEREK KIVÁLASZTÁSÁRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK Az A-, B- és C-módszert általában nem alkalmazzuk olyankor, amikor maga a vizsgált készítmény olyan aktivitással bír, amely serkenti a kiválasztott kiértékelés felszabadulását, illetve amikor a vizsgálati készítmény a kiválasztott kiértékeléssel szennyezett. Ezt a tényezőt mindkét esetben figyelembe kell venni, és a kiválasztott módszert ennek megfelelően kell módosítani és validálni. A kiválasztott módszer készítményspecifikus validálásának célja, hogy egy adott készítmény-szennyezés kombináció esetében meghatározza a válasz elmaradásának gyakoriságát, és megállapítsa az ennek kezeléséhez szükséges lépéseket (például donorok szűrése, az egy vizsgálathoz tartozó donorok számának növelése, a vizsgálat megfelelési kritériumának kellő szigorúsággal történő megadását abból a célból, hogy a szennyezett gyártási tételek kimutatási valószínűsége a lehető legnagyobb legyen). Az A- és a B-módszer megfelelő abban az esetben, ha a vizsgált készítmény hígításaira adott válaszok nagyjából párhuzamosak a standard endotoxin hígításaira adott válaszokkal. A B-módszer félkvantitatív vizsgálat, amely akkor is alkalmazható, amikor a vizsgálati készítmény hígításaira adott válaszok nem párhuzamosak a standard endotoxin hígításaira adott válaszokkal. A C-módszert, a referencia gyártási tétellel való összehasonlítást azért fejlesztették ki, hogy a donoroknak

11 bizonyos készítmény-szennyezés kombinációkra adott szélsőségesen változó válaszait kezelni tudják. Ebben a tekintetben figyelembe kell venni azt, hogy míg a legtöbb donor monocitái nagyjából hasonló módon válaszolnak a bakteriális endotoxinra, a különböző donorok monocitáinak válasza a nemendotoxin jellegű szennyezésekre olyan jelentős mértékben különbözhet, hogy lehetségessé válhat a bizonyos készítmény-szennyezés kombinációkra nem reagálók azonosítása. 2-2. A SZENNYEZŐ HATÁRÉRTÉK-KONCENTRÁCIÓJÁNAK KISZÁMÍTÁSA A megfelelésről szóló döntés elfogadásának kritériuma a szennyező határérték-koncentrációja (CLC), amit a vizsgált készítményre endotoxin-egyenérték/milligrammban, endotoxin-egyenérték/milliliterben, vagy a biológiai aktivitás egységeiben fejezünk ki. Amennyiben egy készítményre az endotoxin határértékkoncentrációját (ELC) pontosan meghatározták, hacsak nincs más előírás, a CLC ugyanaz, mint az ELC. A CLC-t endotoxin-egyenérték egységekben fejezzük ki. A CLC-t a következő kifejezés alapján számoljuk:

K , M ahol K = az endotoxin lázkeltő adagja testtömeg-kilogrammonként; M = a készítmény testtömeg-kilogrammonkénti legnagyobb ajánlott izomba adott adagja. Amennyiben a készítményt gyakori időközökben alkalmazott injekcióként vagy folyamatos infúzió formájában kell beadni, az M az egyórás időtartamon belül beadható legnagyobb teljes adagot jelenti. Az endotoxin-határérték a készítménytől és az alkalmazás módjától függ. Értékét a cikkelyek írják elő. K ajánlott értékeit a 2.6.30.-4. táblázat tartalmazza. 2.6.30.-4. táblázat Alkalmazási mód

K (endotoxin NE/testtömeg-kilogramm)

Intravénás

5,0

Intravénás (radioaktív gyógyszerkészítményekre)

2,5

Intratekális

0,2

Az egyéb alkalmazási módokra a bakteriális endotoxinokra vonatkozó elfogadási kritériumot általában a készítmény kifejlesztése során kapott eredmények alapján határozzák meg. 2-3. A KRIOPROTEKTÍV ANYAGOKRA VONATKOZÓ INFORMÁCIÓK A krioprotektív anyagok, például a dimetilszulfoxid (DMSO), és felolvasztott sejtekben kimutatott maradványaik hatását figyelembe kell venni. A DMSO toxikus a sejttenyészetekre, továbbá – még abban az esetben is, ha a sejteket gondosan mossák – a fagyasztva tárolás megváltoztathatja a sejtek tulajdonságait, például a sejtmembrán áteresztőképességét. 2-4. AZ INTERFERENCIA VIZSGÁLATA Ha megvalósítható, az interferencia vizsgálatát a vizsgált készítmény legalább 3 különböző gyártási tételén el kell végezni. Azon vizsgálati készítmények esetében, amelyek gyártási tételről gyártási tételre jelentős változékonyságot mutanak, tehát az interferencia vizsgálat szempontjából minden gyártási tételük egyedinek tekinthető, az interferencia vizsgálatot minden egyedi vizsgálatnál el kell végezni (kísérő validálás).

12 Az interferencia vizsgálatot lehetőleg a vizsgált készítmény olyan gyártási tételein végezzük el, amelyek endotoxintól és más pirogén/gyulladást előidéző szennyezéstől mentesek, illetve ahol ez nem kivitelezhető, egyetlen vizsgált gyártási tétel sem lehet súlyosan szennyezett. Amennyiben csak egyetlen gyártási tétel áll rendelkezésre, a validálást ezen a gyártási tételen három független vizsgálatban kell elvégezni. A reprodukálhatóság paramétereinek (pl. ±50%) teljesülnie kell. 3. A NYÚL PIROGÉNVIZSGÁLAT HELYETTESÍTÉSE MONOCITA-AKTIVÁCIÓS VIZSGÁLATTAL Amint ezt a fentiekben említettük, a monocita-aktivációs vizsgálat (MAT) célja elsősorban a nyúl pirogénvizsgálat kiváltása. Azon parenterális célra szánt gyógyszerkészítmények esetében, amelyek pirogén szennyezőket tartalmazhatnak, a rájuk vonatkozó cikkely bakteriális endotoxin vizsgálatot vagy monocita-aktivációs vizsgálatot ír elő. Általános elvek: −

bármely olyan egyedi cikkelyben, amely vizsgálat elvégzését írja elő, csak egy vizsgálat – vagy a bakteriális endotoxin vizsgálat vagy a MAT – szerepel. A MAT csak akkor követelhető meg egy cikkelyben, ha előzetesen bizonyították, hogy a MAT fejezetben leírt három módszer közül legalább az egyik megfelelően alkalmazható a kérdéses termékre;

−

a megfelelő információt a gyártótól kell beszerezni. Kívánatos, hogy a cégek minden olyan validálási adatot rendelkezésre bocsássanak, amely a MAT adott anyagra és gyógyszerformára való alkalmazhatóságára vonatozik. Ezek az adatok tartalmazzák a mintaelőkészítés és az interferenia kiküszöböléséhez szükséges eljárások részleteit. Ezen felül minden olyan nyúl pirogénvizsgálatból származó párhuzamos adatot is rendelkezésre kell bocsátani, amely hozzájárulhat annak alátámasztásához, hogy a nyúl pirogénvizsgálat megfelelően helyettesíthető a MAT vizsgálattal.

4. AZ ALTERNATÍV MÓDSZEREK VALIDÁLÁSA A nyúlban végzett pirogénvizsgálat MAT-tal való helyettesítését, illetve a gyulladást kiváltó/pirogén szennyezők más módszerrel végzett meghatározását az Alapelvek fejezetben leírtak szerint gyógyszerkönyvi vizsgálatot helyettesítő alternatív módszernek kell tekinteni: „A Gyógyszerkönyvben előírt tartalmi meghatározások és egyéb vizsgálatok képezik azokat a hivatalos módszereket, amelyeken a Gyógyszerkönyv követelményei alapulnak. Az illetékes hatóság jóváhagyásával más vizsgálati módszerek is alkalmazhatók az ellenőrzésben, feltéve, ha ezen módszerek alapján egyértelműen eldönthető, hogy a hivatalos módszerek alkalmazása esetén teljesülnének-e a cikkely követelményei. Kétes vagy vitás esetben kizárólag a Gyógyszerkönyv vizsgálati módszerei mérvadók.” A cikkelyben előírttól eltérő MAT alkalmazása esetén a következő validálási eljárások javasoltak: −

az eljárást és a módszerben alkalmazott anyagokat és reagenseket az adott vizsgálatra előírt módon validálni kell;

−

a zavaró tényezők jelenlétét (és, amennyiben szükséges, az eltávolításukra alkalmazott eljárást) legalább három gyártási tételből származó mintákon kell vizsgálni.

13 A MAT vizsgálatot minden olyan új, parenterális célra szánt terméken el kell végezni, amelyet az Európai Gyógyszerkönyv követelményei alapján monocita-aktiváló szennyezők jelenlétére meg kell vizsgálni.

04/2010:20631 2.6.31. BEVÉTELRE SZÁNT GYÓGYNÖVÉNY-KÉSZÍTMÉNYEK MIKROBIOLÓGIAI VIZSGÁLATA

Teljes aerob mikroorganizmusszám (TAMC). A számlálást a 2.6.12. általános fejezetben leírtak szerint végezzük el. Teljes élesztőgomba/-penészgombaszám (TYMC). A számlálást a 2.6.12. általános fejezetben leírtak szerint végezzük el. Az 5.1.8 általános fejezetben ismertetett természetszerűen magas bakteriális szennyezettségű készítményeknél, antibiotikum-tartalmú Sabouraud-glükóz-agar táptalaj használható. SPECIFIKÁLT MIKROORGANIZMUSOK ESCHERICHIA COLI Mentesség-vizsgálat Mintaelőkészítés és előinkubálás. A vizsgálandó készítmény legalább 1 g-jának tízszeres hígításából, a 2.6.12. általános fejezetben leírtak szerint, mintát készítünk és ebből 10 ml-t, vagy 1 g-nak vagy l ml-nek megfelelő mennyiséget (a 2.6.13. általános fejezet 3-4. pontjában leírtak szerint) szója-kazein folyékony táptalajra oltunk. Összekeverjük, és 18-24 órán át 30-35 C °-on inkubáljuk. Szelekció és szubkultúra. A tartályt felrázzuk, majd a szója-kazein táptalaj 1 ml-ét 100 ml MacConkey táptalajhoz adjuk, és ezt 24-48 órán át 42-44 C°-on inkubáljuk. Ebből szubkultúrát készítünk MacConkey-agar lemezen, és 18-72 órán át 30-35 C °-on inkubáljuk. Az eredmények értelmezése. A telepek növekedése E. coli jelenlétét valószínűsíti. Ez azonosítási vizsgálattal megerősíthető. A készítmény megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha nem mutathatók ki telepek, vagy ha az azonosítási vizsgálatok negatív eredménnyel zárulnak. A mikroorganizmusszámot meghatározó vizsgálat. Félkvantitatív vizsgálat (a valószínű mikroorganizmusszám-módszer). Mintaelőkészítés és előinkubálás. A vizsgálandó készítmény legalább 1 g-jának tízszeres hígításából, a 2.6.12. általános fejezetben leírtak szerint, mintát készítünk és a 2.6.13. általános fejezet 3-4. pontjában leírtak szerint, megfelelő mennyiséget, azaz 0, 1 g-ot, 0,01 g-ot vagy 0,001 g-ot (illetve 0,1 ml-t, 0,01 ml-t vagy 0,001 ml-t) szója-kazein folyékony táptalajra oltunk, összekeverjük, és 18-24 órán át 30-35 C °-on inkubáljuk.

Szelekció és szubkultúra. A tartályt felrázzuk, majd a szója-kazein táptalaj 1 ml-ét 100 ml MacConkey táptalajhoz adjuk, és ezt 24-48 órán át 42-44 C°-on inkubáljuk. Ebből szubkultúrát készítünk MacConkey-agar lemezen, és 18-72 órán át 30-35 C °-on inkubáljuk. Az eredmények értelmezése. A telepek növekedése E. coli jelenlétét valószínűsíti. Ez azonosítási vizsgálattal megerősíthető. Jegyzőkönyvezni kell a készítménynek azt a legkisebb mennyiségét, amely pozitív, és azt a legnagyobb mennyiségét, amely negatív eredményt ad. A következő táblázat alapján határozzuk meg a valószínű baktériumszámot. A készítmény adott egységeire vonatkozó eredmények 0,1 g vagy 0,1 ml + + + -

0,01 g vagy 0,01 ml + + -

0,001 g vagy 0,001 ml + -

A valószínű baktériumszám a készítmény grammjára vagy milliliterére vonatkoztatva >103 <103 és >102 <102 és >10 <10

EPEÁLLÓ GRAM NEGATÍV BAKTÉRIUMOK A mikroorganizmusszámot meghatározó vizsgálat. Félkvantitatív vizsgálat (a valószínű mikroorganizmusszám-módszer). Mintakészítés és előinkubálás. A vizsgálandó készítmény legalább 1 g-jának tízszeres hígításából, a 2.6.12. általános fejezetben leírtak szerint mintát készítünk, szója-kazein folyékony táptalajt használva a hígításhoz. Összekeverjük, és 20-25 C °-on inkubáljuk annyi ideig, amennyi elegendő a baktériumok felélesztéséhez, de nem elegendő ahhoz, hogy szaporodásuk meginduljon (2-3 óra). Szelekció és szubkultúra. Mossel-féle enterobaktériumokhoz való dúsító táptalaj megfelelő mennyiségeit a fent előírt készítménnyel és/vagy, az adott termékre megadott határértéktől függően, a készítmény alábbi 4 – a vizsgálandó termékből 0,1 g-ot, 0,01 g-ot, 0,001 g-ot, illetve 0,0001 g-ot (vagy 0,1 ml, 0,01 ml–t, 0,001 ml–t, illetve 0,0001 ml–t) tartalmazó - hígításából hárommal oltjuk. A mintákat 24-48 órán át inkubáljuk 30-35 C °-on. Minden egyes tenyészetből kristályibolya-neutrálvörös-epesavas-glükózzal kiegészített agar-lemezre oltunk tovább. Ezt 3035 C °-on 18-24órán át inkubáljuk. Értelmezés. A telepek növekedése pozitív eredményt jelent. Jegyzőkönyvezni kell a készítménynek azt a legkisebb mennyiségét, amely pozitív eredményt ad, és azt a legnagyobb mennyiségét, amely negatív eredményt ad. A valószínű baktériumszámot a következő táblázat alapján határozzuk meg.

A készítmény adott egységeire vonatkozó eredmény 0,1 g vagy 0,1 ml

0,01 g vagy 0,01 ml

+ + + + -

+ + + -

0,001 g vagy 0,001 ml + + -

0,0001 g vagy 0,0001 ml + -

A valószínű baktériumszám a készítmény grammjára vagy milliliterére vonatkoztatva

>104 <104 és >103 <103 és > 102 <102 és > 10 <10

SALMONELLA Mentesség-vizsgálat Mintaelőkészítés és előinkubálás. A vizsgálandó készítményt a 2.6.12 általános fejezetben leírt módon készítjük el és készítmény legalább 25 g-jának vagy 25 ml-ének megfelelő mennyiséget 225 ml tompított pepton táptalajra oltunk. Összekeverjük (pédául keverő segítségével, stomacher típusú szűrőzsákban homogenizáljuk). 18-24 órán át 30-35 C °-on inkubáljuk. Tompított pepton táptalaj Kálium-dihidrogén-foszfát Dinátrum-hidrogén-foszfát-dodekahidrát Nátrium-klorid Pepton Tisztított víz

1,5 g 9,0 g 5,0 g 10,0 g 1000,0 ml

A pH-t olyan módon állítjuk be, hogy az sterilizálás után 7,0±0,2 legyen 25 C°-on . Autoklávban, validált ciklussal sterilizáljuk. Szelekció és szubkultúra. A tompított pepton táptalaj 0,1 ml-ét 10 ml Rappaport Vassiliadis-féle folyékony Salmonella dúsító táptalajhoz adjuk, és 30-35 C °-on 18-24 órán át inkubáljuk. Továbboltjuk xilóz-lizin-dezoxikolát-agar-lemezre. A lemezeket 30-35 C °-on 18-24 órán át inkubáljuk. Eredmények értelmezése. A Salmonella valószínű jelenlétét a jól fejlett, vörös, fekete középponttal rendelkező vagy nem rendelkező telepek növekedése jelzi. Ezt azonosítási vizsgálattal igazolni kell. A termék megfelel a vizsgálat követelményeinek, ha a leírt típusú telepek nincsenek jelen vagy az azonosítási vizsgálatok negatív eredménnyel zárulnak. Az ajánlott oldatokat és tápoldatokat a 2.6.13 általános fejezet írja le.

01/2011:20821

2.8.21. ARISZTOCHOLIASAVAK VIZSGÁLATA NÖVÉNYI DROGOKBAN FIGYELMEZTETÉS: az arisztocholiasavak igen mérgezőek és rákkeltők. A műveleteket, amennyire csak lehetséges, jól húzó vegyi fülkében végezzük. Ha száraz anyaggal dolgozunk, különösen óvatosan kell eljárni (például, manipulátor alkalmazása javasolt), mert az anyag – elektrosztatikus tulajdonságai következtében – könnyen szétszóródhat a munkaterületen. Az A- és a B-módszerre szándék szerint azon növényi drogok cikkelyeiben található hivatkozás, amelyek a kemotaxonómiai ismeretek alapján várhatóan nem tartalmaznak arisztolochiasavat, azonban előfordulhat, hogy arisztolochiasavat tartalmazó növényekkel hamisítják vagy helyettesítik őket. Az A- és B-módszerek célja annak ellenőrzése, hogy a növényi drogok tartalmaznak-e egy adott határértéket meghaladó mennyiségű arisztocholiasavat. Ezek a módszerek általában az arisztolochiasavat tartalmazó növényi anyagok jelenlétének kizárását célzó makroszkópos és/vagy mikroszkópos vizsgálatokkal is kiegészülnek. A C-módszerre az egyedi cikkelyek nem hivatkoznak. A módszer célja, hogy megerősítse a legalább 2 ppm mennyiségű arisztolochiasav-I jelenlétét a mintában. A módszer olyan esetekben alkalmazható, amikor a kromatográfiás eredmények arisztocholiasav-I jelenlétére utalnak. Ezek a módszerek nem használhatók tartalmi meghatározásként olyan drogok cikkelyeiben, amelyeknek másodlagos metabolitjai arisztocholiasavak; ilyen esetekben érzékenyebb, validált módszerekre van szükség. A-MÓDSZER: VIZSGÁLAT ARISZTOCHOLIASAVAK JELENLÉTÉRE Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Oldószerelegy: R vízmentes hangyasav – R víz – R metanol (1+9+40 V/V). Vizsgálati oldat. 1,0 g porított növényi drogot (710) (2.9.12) 10,0 ml oldószereleggyel ultrahangos vízfürdőben 10 percig kezelünk, majd a kivonatot centrifugáljuk. Összehasonlító oldat (a). 0,10 mg arisztocholiasav-I-nek megfelelő mennyiségű HRS arisztocholiasavat az oldószerelegy 20,0 ml-ében diszpergálunk, majd ultrahangos vízfürdőben 10 percig kezelünk, végül az oldatot centrifugáljuk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml a) összehasonlító oldatot R metanollal 25,0 ml-re hígítunk. Lemez: R VRK szilikagél lemez F254 (2-10 μm). Kifejlesztőszer: R vízmentes hangyasav – R víz – R etil-acetát – R toluol (3+3+30+60 V/V); a felső fázist használjuk. Felvitel: 20 µl, 8 mm-es sávok formájában. Kifejlesztés: 6 cm-es fronttávolságig. Szárítás: hideg levegőáramban, 5 percig. Előhívás: a lemezt R ón(II)-klorid R hígított sósavval készült, 100 g/l töménységű oldatával annyira permetezzük be, hogy a lemez kissé átnedvesedjen; a kromatogramot 100 °C-on 1 percig taró melegítés után 365 nm-es ultraibolya fényben értékeljük. Rendszeralkalmasság: −

az a) összehasonlító oldat kromatogramján 0,35 és 0,55 közötti Rf értékkel két zöldeskék, egymástól esetleg nem teljesen elkülönülő – az arisztocholiasav-I-nek és az arisztocholiasav-IInek megfelelő – zóna látható;

−

a b) összehasonlító oldat kromatogramján ezen zónáknak legalább egyike látható (2 ppm arisztocholiasav-I).

Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramján egyetlen olyan zóna sem jelenhet meg, amely – helyzetét és fluoreszcenciáját tekintve – megegyezik az a) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő, bármelyik arisztocholiasavnak megfelelő zónával. Amennyiben a vizsgálandó anyag kromatogramján megjelenik olyan zóna, amely – helyzetét és fluoreszcenciáját tekintve – megegyezik az a) összehasonlító oldat kromatogramján megjelenő, arisztocholiasav-I-nek vagy arisztocholiasav-II-nek megfelelő zónával, a B-módszert alkalmazzuk. B-MÓDSZER: HATÁRÉRTÉKVIZSGÁLAT ARISZTOCHOLIASAV-I-RE Folyadékkromatográfia (2.2.29). Oldószerelegy: R acetonitril – R víz (50+50 V/V). Vizsgálati oldat. 2,0 g porított növényi drogot (710) (2.9.12) 250 ml-es, csavaros kupakkal ellátott, barna üvegedénybe mérünk, hozzáadunk 100,0 ml oldószerelegyet, és 30 percen át kb. 300 r/perc fordulatszámmal kevertetjük, majd a kivonatot 0,45 μm névleges pórusméretű membránszűrőn megszűrjük. Összehasonlító oldat (a). CRS arisztocholiasav-I egy üvegcséjének tartalmából az oldószereleggyel 0,04 μg/ml töménységű oldatot készítünk. Összehasonlító oldat (b). CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt arisztocholiasav (amely arisztocholiasav-I-et és arisztocholiasav-II-t is tartalmaz) egy üvegcséjének tartalmát az oldószereleggyel 20,0 ml-re oldjuk. Oszlop: −

méretei: l = 0,15 m, Ø = 2,1 mm;

−

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (3,5 μm);

−

hőmérséklet: 40 °C.

Mozgófázis: −

A-mozgófázis: R trifluorecetsav – R víz (0,1+99,9 V/V);

−

B-mozgófázis: R trifluorecetsav – R acetonitril (0,1+99,9 V/V); Idő (perc)

A-mozgófázis (%V/V)

B-mozgófázis (%V/V)

0–25

85 → 35

15 → 65

25–30

35 → 0

65 →100

30–31

0 → 85

100 → 15

Áramlási sebesség: 0,3 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 390 nm-en. Injektálás: 25 μl. Rendszeralkalmasság: −

csúcsfelbontás: legalább 3,0, az arisztocholiasav-I és az arisztocholiasav-II között, a b) összehasonlító oldat kromatogramján;

−

jel/zaj viszony: legalább 10, az arisztocholiasav-I-nek megfelelő csúcsra számolva, az a) összehasonlító oldat kromatogramján.

Követelmény: −

a minta megfelel a vizsgálat követelményének, ha a vizsgálati oldat kromatogramján nem jelenik meg olyan csúcs, amely – retenciós idejét tekintve – azonos az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható, az arisztocholiasav-I-nek megfelelő csúccsal (2 ppm).

C-MÓDSZER: MEGERŐSÍTŐ VIZSGÁLAT ARISZTOCHOLIASAV-I-RE Folyadékkromatográfiával (2.2.29) kapcsolt tömegspektrometria (2.2.43). Oldószerelegy: R acetonitril – R víz (50+50 V/V). Vizsgálati oldat. 2,0 g porított növényi drogot (710) (2.9.12) 250 ml-es, csavaros kupakkal ellátott, barna üvegedénybe mérünk, hozzáadunk 100,0 ml oldószerelegyet, és 30 percen át ultrahangos vízfürdőben kevertetjük, majd a kivonatot 0,45 névleges pórusméretű μm membránszűrőn megszűrjük. Összehasonlító oldat (a). CRS arisztocholiasav-I egy üvegcséjének tartalmából az oldószereleggyel 0,04 μg/ml töménységű oldatot készítünk. Összehasonlító oldat (b). CRS arisztocholiasav-I-ből – a hozzá mellékelt utasítások szerint eljárva – 0,45 μg/10,0 ml töménységű oldatot készítünk; oldószerként a vizsgálati oldatot használjuk. Oszlop: −

méretei: l = 0,15 m, Ø = 2,1 mm;

−

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (3,5 μm);

−


Mozgófázis: −

A-mozgófázis: R vízmentes hangyasav – R ammónium-acetát R vízzel készült, 1 g/l töménységű oldata (0,1+99,9 V/V);

−

B-mozgófázis: R vízmentes hangyasav – R ammónium-acetát R metanollal készült, 1 g/l töménységű oldata (0,1+99,9 V/V); Idő (perc)



0–15

70 → 0

30 → 100

15–16

0

100

16–17

0 → 70

100 → 30

Áramlási sebesség: 0,4 ml/perc. Injektálás: 20 μl; az a) összehasonlító oldatot kétszer, a vizsgálati oldatot kétszer, az a) összehasonlító oldatot kétszer, végül a b) összehasonlító oldatot is kétszer injektáljuk. Detektálás: tömegdetektorral, az A, illetve B pont szerint (lásd alább). A. Elektroporlasztásos ionizátor (ESI) interfésszel és MSn analizátorral felszerelt ioncsapdás tömegspektrométer. A tömegspektrométeren MS3 üzemmódban az alábbi értékeket állítjuk be: Üzemmód 2 3

MS MS

Anyaion (m/z)

Izolálási szélesség

Relatív ütközési energia (%)

359 [M + NH4]

2,0

30

298

2,0

35

+

−

a leányionok teljes pásztázási tartománya: m/z 80 és m/z 370 között,

−

nyomon követett (monitorozott) termékionok: m/z 252, m/z 268 és m/z 281.

Rendszeralkalmasság: −

jel/zaj viszony: legalább 100, a monitorozott leányionokra, az a) összehasonlító oldat kromatogramján,

−

a mátrix zavaró hatásának vizsgálata: a b) összehasonlító oldatra kapott két arányszám átlagának az a) összehasonlító oldatra kapott 2 arányszám átlagához viszonyítva a ± 40%-os tartományon belül kell lennie; ellenkező esetben módosítjuk a detektor beállított értékeit.

Értékelés: kiszámítjuk a vizsgálati oldatban az arisztolochiasav-I 3 leányionjára kapott relatív intenzitások átlagos arányait (252/268 és 281/268), majd az a) összehasonlító oldatban is kiszámítjuk a 2 arányszám átlagait, az arisztolochiasav-I retenciós idejénél megjelenő jelek esetében. Amennyiben a vizsgálati oldatra kapott 2 arányszám átlaga az a) összehasonlító oldatra kapott 2 arányszám átlagához viszonyítva a ± 40%-os tartományon belül van, a vizsgálati oldat arisztolochiasav-I-et tartalmaz. B. Elektroporlasztásos ionizátor (ESI) interfésszel és MSn analizátorral felszerelt hármas kvadrupól tömegspektrométer. A tömegspektrométeren MS2 üzemmódban az alábbi értékeket állítjuk be: −

anyaion: m/z 359 [M + NH4]+,

−

nyomon követett (monitorozott) termékionok: m/z 265, m/z 281 és m/z 296.

Rendszeralkalmasság: −

jel/zaj viszony: legalább 100, a monitorozott termékionokra leányionokra, az a) összehasonlító oldat kromatogramján,

−

a mátrix zavaró hatásának vizsgálata: a b) összehasonlító oldatra kapott két arányszám átlagának az a) összehasonlító oldatra kapott 2 arányszám átlagához viszonyítva a ± 40%-os tartományon belül kell lennie; ellenkező esetben módosítjuk a detektor beállított értékeit.

Értékelés: kiszámítjuk a vizsgálati oldatban az arisztolochiasav-I 3 leányionjára kapott relatív intenzitások átlagos arányait (265/281 és 296/281), majd az a) összehasonlító oldatban is kiszámítjuk a 2 arányszám átlagait, az arisztolochiasav-I retenciós idejénél megjelenő jelek esetében. Amennyiben a vizsgálati oldatra kapott 2 arányszám átlaga az a) összehasonlító oldatra kapott 2 arányszám átlagához viszonyítva a ± 40%-os tartományon belül van, a vizsgálati oldat arisztolochiasav-I-et tartalmaz.

2.8.22. Ochratoxin-A meghatározása…

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.7.0 - 1

01/2011:20822

2.8.22. OCHRATOXIN-A MEGHATÁROZÁSA NÖVÉNYI DROGOKBAN FIGYELMEZTETÉS: az ochratoxin-A vesekárosító és rákkeltő anyag. Az ochratoxin-A-val végzett műveleteket vegyifülkében kell végezni. Különös óvatossággal kell eljárni, például manipulátort használva, ha a toxinok száraz formában vannak jelen, mivel az ilyen anyagok elektrosztatikus tulajdonságúak és könnyen szétszóródhatnak a munkaterületen. Az ochratoxin-A-t tartalmazó laboratóriumi üvegedények tisztítására megfelelő eljárásokat kell alkalmazni (lásd a függeléket). Azokat a növényi drogokat, amelyek ochratoxin-A-val lehetnek szennyezve, validált módszerrel kell vizsgálni. Az alábbiakban leírt módszer például alkalmasnak bizonyult az édesgyökér kivonat és az igazi édesgyökér vizsgálatára. Más növényi drogok esetében a módszer alkalmazhatóságát azonban igazolni kell, vagy egyéb validált módszert kell alkalmazni. VIZSGÁLAT Folyadékkromatográfia (2.2.29). Barna, mosószermaradványoktól mentes üvegeszközöket használunk, melyeket használat előtt szükség esetén R tömény kénsav 10 %V/V-os oldatával átöblítünk, majd R desztillált vízzel gondosan savmentesre mosunk. A-oldat. 80 térfogatrész R vizet, amelynek pH-ját előzetesen R vízmentes hangyasavval 2,3-re állítottuk be, 20 térfogatrész R acetonitrillel elegyítünk. Vizsgálati oldat. Ochratoxin-A elleni antitesteket tartalmazó immunaffinitás kromatográfiás oszlopot használunk, amelynek kapacitása legalább 100 ng ochratoxin-A, és amely legalább 70%-os visszanyerést biztosít. Hagyjuk, hogy az immunaffinitás oszlop átvegye a szobahőmérsékletet. Az elporított drog (250) (2.9.12) 2,00 g-ját R nátrium-hidrogén-karbonát 30 g/l töménységű oldatának 80 ml-ével 30 percen át ultrahangos vízfürdőben kezeljük (az ultrahangos fürdő vizét 15 perc elteltével cseréljük). A szobahőmérsékletűre lehűtött oldatot R nátrium-hidrogén-karbonát 30 g/l töménységű oldatával 100,0 ml-re hígítjuk (V1). Az így nyert oldatot centrifugáljuk. A tiszta felülúszó 5,0 ml-ét (Vi) 30 ml R tompító–oldattal (pH 7,4) alaposan összekeverjük, és a kapott oldat teljes mennyiségét 3 ml/perc (de legfeljebb 5 ml/perc) áramlási sebességgel átengedjük az immunaffinitás oszlopon. Az oszlopot, legfeljebb 5 ml/perc áramlási sebességet alkalmazva, 10 ml R tompító–oldattal (pH 7,4), majd 2×10 ml R vízzel mossuk, végül



szárítjuk (5-10 másodpercen át alkalmazott enyhe vákuummal, vagy 10 másodpercen át, fecskendő segítségével áthajtott levegővel), végül 0,5 ml R metanolt viszünk az oszlopra, amelyet saját súlyánál fogva hagyunk lecsepegni. Az eluátumot 4 ml-es üvegcsébe gyűjtjük, majd 30 másodperc elteltével ismét 0,5 ml R metanolt viszünk fel az oszlopra, és ugyanazon üvegcsébe hagyjuk ezt is saját súlyánál fogva lecsepegni. További 30 másodperc elteltével újabb 0,5 ml R metanollal megismételjük a műveletet. Az oszlopon esetleg visszamaradt oldószert levegő átnyomásával vagy vákuum alkalmazásával hajtjuk át az oszlopon. Az egyesített eluátumot melegítő blokkban (40 °C) nitrogén alatt teljesen szárazra párologtatjuk. A maradékot 0,5 ml (V2) Aoldatban oldjuk. Ha az oldat tiszta, közvetlenül felhasználhatjuk a vizsgálatra. Ellenkező esetben injektálás előtt egyszer használatos szűrőn engedjük át. Az egyszer használatos szűrő (pl. 0,45 μm pórusméretű teflon szűrő) bizonyítottan nem tarthat vissza ochratoxin-A-t, azaz nem okozhat ochratoxin-A-veszteséget. Ochratoxin-A primer törzsoldat. 1,0 ml R ochratoxin-A-oldatot R metanollal 100,0 ml-re hígítunk, és a hígított oldatot alaposan összerázzuk. Ochratoxin-A szekunder törzsoldat. 10,0 ml ochratoxin A primer törzsoldatot R metanollal 100,0 ml-re hígítunk, és a hígított oldatot alaposan összerázzuk. Ochratoxin-A standard oldatok. Az ochratoxin-A primer törzsoldat, illetve az ochratoxin-A szekunder törzsoldat 2.8.22.-1. táblázatban feltüntetett térfogatrészleteit külön-külön mérőlombikokba mérjük, és az A-oldattal valamennyit 50,0 ml-re hígítjuk. 2.8.22.-1. táblázat. – Ochratoxin-A standard oldatok Standard oldat

Az ochratoxin-A primer törzsoldat térfogata (µl)

Az ochratoxin-A végső koncentrációja aprimer oldatban (ng/ml)

1

5000

50

2

2500

25

3

1000

10

4

500

5

5

250

2,5

Standard oldat

Az ochratoxin-A szekunder törzsoldat térfogata (µl)

Az ochratoxin-A végső koncentrációja a szekunder oldatban (ng/ml)

6

500

0,5

7

100

0,1

Kalibrációs görbe. Az 1–7. számú ochratoxin-A standard oldatok felhasználásával felvesszük a kalibrációs görbét, amelynek tartománya a 0,5250 μg/kg ochratocin-A-tartalomnak felel meg a növényi drogban. Ellenőrizzük a görbe linearitását. Ha a vizsgálandó minta ochratoxin-A-



tartalma kiesik a kalibrációs tartományból, a vizsgálati oldatot úgy kell hígítani, hogy az ochratoxin-A-tartalom e tartományon belül legyen. Oszlop: −

méretei: l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm;

−

állófázis: R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagél (5 μm);

−


Mozgófázis: −

A-mozgófázis: R tömény foszforsavval pH 2,3-re beállított R víz;

−

B-mozgófázis: R acetonitril; Idő (perc)



0 – 30

80 → 40

20 → 60

30 – 35

40 → 20

60 → 80

35 – 37

20

80

37 – 40

20 → 80

80 → 20

Áramlási sebesség: 0,8 ml/perc. Detektálás: fluoreszcencia detektorral; ajánlott beállítások szabályozható detektor esetén: 330 nm (gerjesztési hullámhossz) és 460 nm (emissziós hullámhossz). Injektálás: 20 μl. Számolás: kiszámítjuk az y = ax + b kalibrációs görbe egyenletét, ahol az xértékek az ochratoxin-A-koncentrációk (ng/ml), az y-értékek pedig a mért jelek (S). A mért oldat ochratoxin-A-koncentrációja (C):

S −b . a A növényi drog nanogramm/grammban kifejezett ochratoxin-A-tartalmát a következő összefüggés segítségével számoljuk ki:

V1 ⋅ V2 ⋅ C , m ⋅ Vi ahol



m = a vizsgálati oldat készítéséhez használt növényi drog tömege, grammban; V1 = a hígított oldat térfogata, milliliterben; Vi = az immunaffinitásos tisztításhoz felvitt térfogatrészlet, milliliterben; V2 = a maradék oldásához használt térfogat, milliliterben;

C = a vizsgálati oldatban mért ochratoxin-A-koncentráció, nanogramm/milliliterben.

Függelék: a laboratóriumi üvegeszközök tisztítása Az üvegeszközöket R metanollal öblítjük, majd legalább 2 órán át R tömény nátrium-hipoklorit–oldatba merítve fertőtlenítjük, végül vízzel gondosan átmossuk.

2.8.23. Növényi drogok mikroszkópos vizsgálata

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.7.0- 1

04/2010:20823

2.8.23. NÖVÉNYI DROGOK MIKROSZKÓPOS VIZSGÁLATA A növényi drogok mikroszkópos vizsgálatát, ha a cikkelyben nincs más előírás, a porított droggal (355) (2.9.12) végezzük. A leggyakrabban előírt reagens az R klorál-hidrát–oldat. Bizonyos sajátságok ugyanakkor nem láthatók vagy nehezebben vehetők észre, ha ezzel a reagenssel kezeltük a drogot. Ilyen esetben más reagenseket használunk, például R glicerin 50 %V/V-os oldatát, amely lehetővé teszi a keményítőszemcsék észlelését. Előfordul, hogy adott cikkelyben specifikus reagenseket kell előírni. Ilyen például az R tejsavas–reagens, amely különböző sajátságok láthatóvá tételére alkalmas, vagy R floroglucin 10 %V/V-os alkoholos oldata és R tömény sósav a sejtekben vagy szövetekben jelen lévő lignin azonosítására, továbbá az R ruténiumvörös–oldat, amelyet a sejtekben jelenlévő nyák kimutatására szokás alkalmazni, illetve az R glicerin, amely keményítő és inulin kimutatására használható. Polarizált fényt alkalmazunk (keresztezett Nicol-prizmák között) a keményítőszemcsék azonosítására (fekete kioltási kereszt megjelenése), továbbá a kalcium-oxalát kristályok (fénytörés), valamint az elfásodott szerkezetek kimutatására. BEÁGYAZÁS KLORÁL-HIDRÁT–OLDATBA Mikroszkóp tárgylemezére 2–3 csepp R klorál-hidrát–oldatot cseppentünk, a porított drog igen kis mennyiségét eloszlatjuk benne, majd az így előkészített mintára fedőlemezt helyezünk. Főzőlapon vagy mikrogázégő alkalmazásával igen óvatosan forrásig melegítjük, és rövid ideig enyhe forrásban tartjuk. Biztosítani kell, hogy a beágyazó folyadék mennyisége elegendő legyen. Szükség esetén, elvékonyodó pipettával további folyadékot adagolunk a mintához. Lehűlés után mikroszkóp alatt vizsgáljuk. A melegítést mindaddig ismételjük, amíg a keményítőszemcsék és a sejtek vízoldékony tartalma mikroszkóp alatt vizsgálva már nem látható. A klorál-hidrát, hosszú tűket képezve, hajlamos a kristályosodásra. Ezt a következő módon akadályozhatjuk meg: melegítés után leemeljük a fedőlemezt, R klorál-hidrát R glicerinnel készült, 10 %V/V-os oldatátából 1 cseppet cseppentünk a mintára, majd tiszta fedőlemezt helyezünk rá. Mikroszkóp alatt vizsgáljuk. BEÁGYAZÁS 50 %V/V-OS GLICERIN–OLDATBA Mikroszkóp tárgylemezére R glicerin 50 %V/V-os oldatából 2 cseppet cseppentünk, a porított drog igen kis mennyiségét eloszlatjuk benne, majd fedőlemezt helyezünk az így előkészített mintára. Mikroszkóp alatt vizsgáljuk. BEÁGYAZÁS FLOROGLUCIN 10 %V/V-OS ALKOHOLOS OLDATÁBA ÉS SÓSAVBA Igen kis mennyiségű porított drogot tárgylemezen R floroglucin 10 %V/V-os, alkohollal készült oldatának 1–2 cseppjével elkeverünk, majd hagyjuk, hogy az oldószer csaknem teljesen elpárologjon. Ezután 1–2 csepp R tömény sósavat cseppentünk a mintára, majd fedőlemezt helyezünk rá, és mikroszkóp alatt haladéktalanul vizsgáljuk. Vörös színeződés lignin jelenlétére utal. BEÁGYAZÁS TEJSAVAS–REAGENSBE

2.8.23. Növényi drogok mikroszkópos vizsgálata


Mikroszkóp tárgylemezére 2-3 csepp R tejsavas–reagenst cseppentünk, a porított drog igen kis mennyiségét eloszlatjuk benne, majd az így előkészített mintára fedőlemezt helyezünk. Ezután igen óvatosan forrásig melegítjük, és rövid ideig enyhe forrásban tartjuk. Biztosítani kell, hogy a beágyazó folyadék mennyisége elegendő legyen. Szükség esetén, elvékonyodó pipettával további folyadékot adagolunk hozzá. Lehűlés után mikroszkóp alatt vizsgáljuk. Az elfásodott szerkezetek élénk sárgára festődnek, míg a cellulózt tartalmazó szerkezetek színtelenek maradnak. A keményítőszemcsék többékevésbé ibolyaszínűek; bizonyos váladékjellegű anyagok (pl. illóolajok, gyanták, olajos gyanták) narancsszínűre festődnek, a paraszövet pedig vörös lesz. BEÁGYAZÁS RUTÉNIUMVÖRÖS–OLDATBA Mikroszkóp tárgylemezére 2 csepp R ruténiumvörös–oldatot cseppentünk, a porított drog igen kis mennyiségét eloszlatjuk benne, majd az így előkészített mintára fedőlemezt helyezünk. Kb. 1 perc elteltével 1 csepp R desztillált vizet adunk hozzá, úgy, hogy hagyjuk, hogy ezt a tárgylemez és a fedőlemez közti minta felvegye. Mikroszkóp alatt vizsgáljuk. A nyák ibolyásvörösre festődik.

01/2010:50110

5.1.10. ÚTMUTATÓ A BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLAT ALKALMAZÁSÁHOZ 1. BEVEZETÉS A gyógyszerek pirogénekkel való szennyezettsége következtében fellépő toxikus reakciókat leggyakrabban a Gram-negatív baktériumok endotoxinjai okozzák; pirogén aktivitásuk sokkal nagyobb, mint a legtöbb egyéb pirogén anyag aktivitása. Ezek az endotoxinok lipopoliszaharidok. Bár kis számban előfordulnak más szerkezetű pirogének is, általánosan elfogadott az a következtetés, hogy ha valamely termékben nincsenek jelen bakteriális endotoxinok, akkor – amennyiben a nem endotoxin jellegű pirogén anyagok jelenléte kizárható – pirogén alkotórészek sincsenek jelen. Az endotoxinok jelenlétét a termékben elfedhetik az endotoxinok és az amöbocita lizátum közötti reakciókat gátló faktorok. Ennél fogva annak az analitikusnak, aki a gyógyszerkönyvi cikkelyben előírt nyúl pirogén vizsgálatot bakteriális endotoxin vizsgálattal kívánja helyettesíteni, bizonyítania kell a vizsgálat érvényességét, ami a zavaró tényezők kiküszöbölésére szolgáló eljárás alkalmazását is maga után vonhatja. Amint arra a bakteriális endotoxinokra vonatkozó vizsgálat (2.6.14) is utal, mielőtt a mintán elvégzett vizsgálatot érvényesnek tekintjük, rendelkeznünk kell az alábbi két szempontra vonatkozó információval. −

A vizsgálatra felhasznált anyag alkalmasságát meg kell állapítani. Biztosítani kell, hogy a BET vizsgálatára alkalmas víz és az egyéb reagensek ne tartalmazzanak endotoxint, továbbá meg kell győződni az amöbocyta lizátum gyártó által megadott érzékenységéről is.

−

Minthogy a vizsgálandó termék befolyásolhatja a vizsgálatot, az amöbocita lizátum érzékenységét mind a vizsgálandó termék jelenlétében, mind annak távollétében vizsgálni kell. A két érzékenységi érték között nem lehet szignifikáns különbség.

A 2.6.14. Bakteriális endotoxinok fejezet módszereket mutat be a vizsgálatot zavaró tényezők eltávolítására; interferencia fellépése esetén az ilyen módszer alkalmazását követően újabb vizsgálatot kell végezni annak ellenőrzése céljából, hogy a zavaró tényezőt valóban sikerült-e semlegesíteni vagy eltávolítani. Ez az általános fejezet magyarázatot ad a bakteriális endotoxinok vizsgálatának követelményeire, azt követően pedig kitér az eredmények értékelésére és értelmezésére is. Amennyiben egy gyógyszerkönyvi cikkelyben előírt nyúl pirogén vizsgálatot az amöbocita lizátum vizsgálattal helyettesítik, az utóbbit – mivel ez egy alternatív módszer alkalmazását jelenti – validálni kell; ennek végrehajtásához a 11. pont ad útmutatást. A bakteriális endotoxinokra vonatkozó referenciamódszert az adott termék cikkelye adja meg; ahol nincs módszer megadva, az A módszert használjuk referenciamódszerként. Ha a referenciamódszertől eltérő módszert használnak, az analitikusnak bizonyítania kell, hogy a módszer az adott termékre megfelelő, és a referenciamódszerrel megegyező eredményt ad (lásd még a 13. pontot).

2. MÓDSZER Az endotoxin hozzáadása az amöbocita lizátumhoz zavarosodást, kicsapódást vagy dermedést (gélkoagulációt) okozhat; a Gyógyszerkönyvben a bakteriális endotoxin vizsgálat első típusában kiértékelési kritériumként csak a gélkoagulációs módszert használták. Ennek a módszernek előnye az egyszerűsége volt: a termék megfeleléséről vagy meg nem feleléséről hozott döntés azon alapult, hogy a szabad szemmel is látható gélkoaguláció megjelenik-e vagy sem. A C, D, E és F-fel jelölt kvantitatív módszereket később fejlesztették ki: ezek nagyobb műszerezettséget igényelnek, de egy adott termék nagyszámú mintáinak rendszeres vizsgálatára könnyebben automatizálhatók. Az endotoxinok bizonyos műanyagokból és üvegfajtákból készült kémcsövek és pipetták felszínén adszorbeálódhatnak. A műanyagokból felszabaduló anyagok a vizsgálat során interferenciát okozhatnak. A felhasznált eszközöket ezért ellenőrizni kell: a kémcsövek és pipetták egymást követő gyártási tételeinek összetétele kismértékben különbözhet, ezért ajánlatos, hogy az analitikus az új eszközökkel megismételje az ilyen vizsgálatokat. Amennyiben a bakteriális endotoxin vizsgálatot határérték-vizsgálatként alkalmazzák, akkor a vizsgálandó termékre meg kell határozni az endotoxin-koncentráció küszöbértékét, másrészt pedig, meg kell állapítani, hogy a vizsgált termék endotoxin-koncentrációja a küszöbérték alatt vagy felett van-e. A C, D, E és F kvantitatív módszerek lehetővé teszik, hogy meghatározzuk a vizsgált minta endotoxin-koncentrációját. A Gyógyszerkönyv követelményeinek való megfelelés szempontjából, valamint a rutinszerűen végzett minőségellenőrzésben azonban az a döntő kérdés, hogy ez a koncentráció a meghatározott határértéket meghaladja-e vagy sem. A vizsgált termék endotoxin-koncentrációja küszöbértékének megállapításakor különös figyelmet kell fordítani a termék dózisára. A küszöbértéket úgy kell megállapítani, hogy biztosítsuk: amennyiben a termék endotoxin-koncentrációja a küszöbérték alatt marad, úgy még az óránként alkalmazandó legnagyobb dózis sem tartalmaz toxikus reakció előidézéséhez elegendő mennyiségű endotoxint. Ha a termék endotoxin-koncentrációja éppen megegyezik a küszöbértékkel, gélesedés következik be – mint ahogy abban az esetben is, ha a termék endotoxin-koncentrációja sokkal magasabb – és a termék nem felel meg a vizsgálat követelményének, mert a vizsgálat „minden vagy semmi” jellege lehetetlenné teszi, hogy különbséget tegyünk a küszöbértékkel megegyező és az annál magasabb koncentráció között. Az analitikus csak abban az esetben következtethet arra, hogy az endotoxin-koncentráció a küszöbérték alatt van, ha gélesedés nem következik be. Szilárd állapotú termékek esetén az endotoxinnak ezt a tömegegységre vagy Nemzetközi Egységre (NE) vonatkoztatott küszöbkoncentrációját a vizsgálandó oldat milliliterére vonatkoztatott endotoxinkoncentrációra kell átszámítani, mert a vizsgálat csak oldatban végezhető el. Abban az esetben, ha a termék már folyékony állapotban van (mint például infúziós oldatok) a vizsgálatok menetét az alábbiakban tárgyaljuk. Endotoxin-határérték: a parenterálisan alkalmazott hatóanyagokra vonatkozó endotoxin-határérték, a dózis alapján megállapítva, a következőképpen fejezhető ki: K , M

ahol K = az endotoxin pirogén dózisküszöbe, testtömeg-kilogrammonként, M = a termék legnagyobb ajánlott, izomba adható adagja, testtömeg-kilogrammonként.

Amennyiben a terméket gyakori időközönként vagy folyamatos infúzióban adják, M az egy órán belül beadható legnagyobb teljes adagot jelenti. Az endotoxin határértéket, amely függ a terméktől és az alkalmazási módtól, a cikkely adja meg. A K értékekre vonatkozó ajánlást az 5.1.10.-1. táblázat tartalmazza. Más alkalmazási módok esetén a bakteriális endotoxinokra vonatkozó elfogadási feltételeket általában a készítményfejlesztés során kapott eredmények alapján állapítják meg. 5.1.10.-1. táblázat Az alkalmazás módja

K (NE endotoxin / testtömegkilogramm)

Intravénás

5,0

Intravénás, radioaktív gyógyszerkészítmények esetén

2,5

Intratekális

0,2

A terméknek milyen hígítását kell alkalmazni a vizsgálat során ahhoz, hogy a lehető legnagyobb mértékben biztosítsuk, hogy a negatív eredmény azt jelenti, hogy a termék endotoxin-koncentrációja kisebb, mint az endotoxin-határérték, illetve hogy a pozitív eredmény azt jelenti, hogy a lizátum az endotoxin határértékével megegyező vagy annál nagyobb endotoxin-koncentrációt határozott meg? Ez a hígítás az endotoxin-határértéktől és a lizátum érzékenységétől függ: ezt hívjuk MVD-nek (Maximum Valid Dilution= Maximális Valid Hígítás) és értékét a következő kifejezéssel lehet kiszámítani: Endotoxin-határérték × a vizsgálati oldat koncentrációja λ A vizsgálati oldat koncentrációja: −

mg/ml, ha az endotoxin-határértéket tömegegységre vonatkoztatva adták meg (NE/mg),

−

Egység/ml, ha az endotoxin határértéket a biológiai aktivitás egységére vonatkoztatva adták meg (NE/Egység),

−

ml/ml, ha az endotoxin-határértéket térfogatra vonatkoztatva adták meg (NE/ml).

λ = a feltüntetett lizátum-érzékenység a gélkoagulációs módszer esetében (NE/ml), illetve a turbidimetriás vagy kromogén technikák standard görbéiben alkalmazott legkisebb koncentráció. Amennyiben a maximális valid hígítás értéke nem egész szám, az MVD-nél kisebb, „kényelmesen” alkalmazható egész szám használható rutin célokra (ami azt jelenti, hogy a termékből kisebb hígítást készítünk, mint amit az MVD jelöl). Ebben az esetben a negatív eredmény azt jelzi, hogy a termék endotoxin-koncentrációja a küszöbérték alá esik. Ha azonban egy ilyen vizsgálatban a termék endotoxinkoncentrációja kisebb, mint az endotoxin küszöbértéke, de elég magas ahhoz, hogy a lizátummal reakcióba lépve gélesedést hozzon létre, a vizsgálat ilyen körülmények között pozitív lehet. Ennél fogva, ha a vizsgálat ezzel a „kényelmes” hígítási faktorral pozitív eredményt ad, a terméket az MVD értékre kell hígítani, és a vizsgálatot meg kell ismételni. Bármilyen kétes vagy vitatott esetben az MVD-t kell használni. Ez rávilágít arra, hogy milyen fontos a lizátum érzékenységének igazolása. Példa A fenitoin-nátrium 50 mg/ml töménységű intravénás injekciós oldatát kell vizsgálnunk. Határozzuk meg az MVD értéket, a következő változók alapján: M = az emberben alkalmazható legnagyobb adag = 15 mg/testtömeg-kilogramm,

c = 50 mg/ml, K = 5 NE endotoxin/testtömeg-kilogramm, λ = 0,4 NE endotoxin/ml. MVD =

5 ⋅ 50 1 ⋅ = 41,67 15 0,4

Ennek a terméknek a rutinszerű vizsgálataihoz célszerű a vizsgálandó oldat 1 ml-ét 20 ml-re hígítani (MVD/2, a kisebbik egész számra kerekítve). Ha azonban az így végzett vizsgálat pozitív eredményt ad, a vizsgálatot végzőnek 1 ml oldatot 41,67 ml-re hígítva meg kell ismételnie a vizsgálatot. A 41,67 ml-re történő hígítást abban az esetben is el kell elvégezni, ha a vizsgálatot vitás kérdés eldöntésének céljából végzik el. 3. REFERENCIAANYAG Referenciakészítményként BRP endotoxin standardot ajánlott használni. Ezt a WHO Nemzetközi Endotoxin Standarddal szemben határozták meg, és hatóértékét endotoxin Nemzetközi Egység/ampulla értékben fejezik ki. Az endotoxin Nemzetközi Egységét (NE) a Nemzetközi Standard meghatározott tömegének fajlagos aktivitásaként határozzák meg. Rutin célokra egyéb endotoxin készítmény is felhasználható, feltéve, hogy a Nemzetközi Endotoxin Standarddal vagy a BRP-vel szemben határozták meg, és hatóértékét endotoxin Nemzetközi Egységben fejezik ki. MEGJEGYZÉS: Az endotoxin 1 Nemzetközi Egysége (NE) 1 Endotoxin Egységgel (E.E.) egyenlő. 4. BET VIZSGÁLATÁRA ALKALMAS VÍZ A BET vizsgálatára alkalmas víz endotoxin-mentességének vizsgálatára a nyúl pirogén vizsgálati módszert gyakorlati és elméleti megfontolások alapján nem találták alkalmasnak: −

a nyúl pirogén vizsgálat nem elég érzékeny ahhoz, hogy a nagyon alacsony endotoxin-határértékű készítmények vizsgálatára alkalmazandó BET vizsgálatára alkalmas vízben az endotoxint kimutassa;

−

a nyulak testhőmérséklet-emelkedése meghatározásának viszonylagos pontatlansága a vizsgálatok többszöri ismétlését tenné szükségessé;

−

a „pirogének” és „endotoxinok” kifejezések nem teljesen egybeeső entitásokat jelentenek.

A 2.6.14. Bakteriális endotoxinok fejezet ajánlása szerint a háromszoros desztilláción kívül más módszerek is alkalmazhatók a BET vizsgálatára alkalmas víz előállítására. A fordított ozmózist eredményesen alkalmazták; egyes analitikusok a háromszorosnál többszöri desztillációt részesítik előnyben. Bármilyen módszert alkalmazzanak is, a végtermék nem tartalmazhat kimutatható mennyiségű endotoxint. 5. AZ ELEGY pH-JA A bakteriális endotoxinok vizsgálata során a legmegfelelőbb gélkoaguláció 6,0-8,0 pH-jú elegyekben megy végbe. A lizátumnak a mintához való hozzáadása azonban csökkentheti a pH-értéket.

6. A LIZÁTUM VALIDÁLÁSA Fontos, hogy a lizátum oldatait a gyártó utasításai szerint készítsük el. Az A és B gélkoagulációs módszerek alkalmazásakor a pozitív végponthoz tartozó hígítási faktorok logaritmusát képezzük. Ennek oka, hogy ezeknek a logaritmusértékeknek a gyakorisági eloszlásgörbéje általában jobban közelíti a normál eloszlásgörbét, mint maguknak a hígítási faktoroknak a gyakorisági eloszlásgörbéje; gyakorlatilag annyira hasonló, hogy a normál eloszlásgörbét elfogadhatjuk, mint matematikai modellt, és a konfidencia határokat a Student-féle t-próbával kiszámíthatjuk. 7. ELŐZETES VIZSGÁLAT ZAVARÓ TÉNYEZŐKRE Egyes termékek közvetlenül nem vizsgálhatók endotoxinok jelenlétére, mert nem elegyíthetők a reagensekkel, pH-juk nem állítható be 6,0 és 8,0 közötti értékre, vagy gátolják, illetve aktiválják a gélképződést. Ezért szükséges előzetes vizsgálatot végezni a zavaró tényezők jelenlétének ellenőrzésére. Amennyiben ilyen tényezők kimutathatók, az analitikusnak igazolnia kell, hogy az eltávolításukra szánt eljárás hatékony volt. Az előzetes vizsgálat célja annak a nullhipotézisnek a vizsgálata, amely szerint a lizátum érzékenysége a vizsgálati készítmény jelenlétében nem különbözik szignifikánsan a lizátum érzékenységétől a készítmény távollétében. Az A és B módszer esetében egyszerű kritériumot alkalmazunk: a nullhipotézist elfogadjuk, ha a lizátum érzékenysége a vizsgálati készítmény jelenlétében legalább fele és legfeljebb kétszerese a lizátum saját érzékenységének. A klasszikus megközelítés az lenne, ha a készítmény jelenlétében és távollétében is kiszámítanánk a lizátum érzékenységéhez tartozó hígítási faktor logaritmusának középértékét, és a két középérték különbségét a Student-féle t-próbával vizsgálnánk. Az A és B gélkoagulációs módszerben a zavaró tényezők vizsgálatához az előírás alapján olyan termékminta alkalmazására van szükség, amelyben endotoxin nem mutatható ki. Amennyiben teljesen új készítményt kell vizsgálnunk, ez elvi problémát vet fel. Ennél fogva, a C, D, E és F kvantitatív módszerek esetében teljesen más megközelítést alkalmazunk. 8. ZAVARÓ TÉNYEZŐK KIKÜSZÖBÖLÉSE A zavaró faktorok kiküszöbölését célzó műveletek során a vizsgálati készítmény endotoxin-tartalma nem nőhet vagy csökkenhet (például adszorpció révén). Ezt korrekt módon úgy ellenőrizhetjük, hogy az eljárásokat mesterségesen hozzáadott endotoxint tartalmazó mintákra alkalmazzuk, azaz a vizsgálatot a készítmény egy olyan mintájával végezzük el, amelyhez ismert mennyiségű endotoxint adunk, majd megmérjük a visszanyerhető endotoxin mennyiségét. C és D módszer. Ha a vizsgálandó készítmény olyan természetű, hogy a vizsgálatot zavarja, de a zavaró tényező a klasszikus módszerekkel nem küszöbölhető ki, a kalibrációs görbét megfelelő kezeléssel vagy hígítással endotoxin-mentesített, azonos típusú termékkel vehetjük fel. Ilyen esetben az endotoxin vizsgálat elvégzésekor ezt a standard görbét használjuk összehasonlításként. Cellulóz-triacetátból készült aszimmetrikus membránszűrőkön történő ultraszűrés a legtöbb esetben megfelelő eredményt ad. A szűrőket megfelelő módon validálni kell, mert bizonyos körülmények között egyes cellulóz származékok (például a β-D-glükánok) álpozitív eredményt adhatnak. A poliszulfon szűrők alkalmatlannak bizonyultak, mert egyes felhasználók ezekkel álpozitív eredményeket kaptak.

9. A KONTROLL VIZSGÁLATOK CÉLJA A BET vizsgálatára alkalmas vízzel készített kontroll és a feltüntetett lizátum érzékenységéhez képest kétszeres koncentrációjú referenciakészítmény alkalmazásának célja, hogy igazolja a lizátum aktivitását a vizsgálat időpontjában és körülményei között. A negatív kontroll alkalmazásának célja annak igazolása, hogy a BET vizsgálatára alkalmas víz nem tartalmaz kimutatható koncentrációjú endotoxint. A vizsgálandó készítményt a vizsgálatban előírt koncentrációban tartalmazó pozitív kontroll alkalmazásának célja annak igazolása, hogy a vizsgálat időpontjában és körülményei között nincsenek jelen zavaró tényezők. 10. AZ EREDMÉNYEK ÉRTÉKELÉSE ÉS ÉRTELMEZÉSE A BET vizsgálatára alkalmas vízben, illetve bármilyen más reagensben vagy anyagban, amellyel a lizátum a vizsgálat során kapcsolatba kerül, igen kis mennyiségű endotoxin mindaddig nem mutatható ki, amíg nem éri el a lizátum érzékenységi küszöbértékét. Ez az igen kis mennyiségű endotoxin azonban a vizsgált készítmény oldatában jelen levő endotoxin mennyiségét éppen az érzékenységi határ fölé emelheti, ami pozitív reakciót eredményezhet. A jelenség bekövetkezésének kockázata csökkenthető, ha a BET vizsgálatára alkalmas vizet, illetve az egyéb reagenseket és anyagokat a rendelkezésre álló legérzékenyebb lizátumokon, vagy legalább olyan lizátumon vizsgáljuk, amely érzékenyebb, mint az, amelyet a készítmény vizsgálatakor használunk. Ennek ellenére sem zárható teljesen ki az „álpozitív eredmény” kockázata. Ezzel együtt tisztában kell lennünk azzal, hogy ebben a vonatkozásban a vizsgálatot „hiba-biztosra” tervezik, ellentétben az olyan vizsgálati tervekkel, amelyek álnegatív eredmény előfordulását teszik lehetővé, ami nem megfelelő készítmények felszabadítását eredményezheti, veszélyeztetve a páciensek egészségét. 11. A NYÚL PIROGÉN VIZSGÁLAT HELYETTESÍTÉSE BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLATTAL Azon parenterális gyógyszerek cikkelyei, amelyek toxikus mennyiségű bakteriális endotoxint tartalmazhatnak, vagy bakteriális endotoxin vizsgálatot, vagy nyúl pirogén vizsgálatot írnak elő. Az általános vezérelvek a következők: −

bármely olyan egyedi cikkelyben, ahol ilyen vizsgálatot előírnak, csak az egyik, vagy a pirogén-, vagy a bakteriális endotoxin vizsgálat szerepelhet;

−

hacsak nincs bizonyíték az ellenkezőjére, a bakteriális endotoxin vizsgálatot előnyben kell részesíteni a pirogén vizsgálattal szemben, mert a beteg számára általában azonos vagy nagyobb védelmet biztosít;

−

mielőtt egy cikkely előírja a bakteriális endotoxin vizsgálatot, bizonyítani kell, hogy a 2.6.14. fejezetben leírt módszerek valamelyike megfelelő módon alkalmazható a kérdéses készítmény esetében;

−

a szükséges információkat az előállítóktól kell beszerezni; a cégeket fel kell kérni, hogy adjanak át a rendelkezésükre álló minden olyan validálási adatot, amely az érintett anyagok és gyógyszerformák bakteriális endotoxin vizsgálatának alkalmazhatóságára vonatkozik. Ezeknek az adatoknak tartalmazniuk kell a minta előállításának részleteit, és a zavaró tényezők eltávolításához szükséges valamennyi eljárás részleteit; ezenfelül közölni kell valamennyi olyan, nyulakban párhuzamosan

végzett pirogén vizsgálat rendelkezésre álló adatait, amelyek alátámaszthatják, hogy a nyúl pirogén vizsgálatnak a bakteriális endotoxin vizsgálattal történő helyettesítése megfelelő eljárás. A további követelményeket a következő pontok tartalmazzák. 12. A CIKKELYBEN ELŐÍRTTÓL ELTÉRŐ BAKTERIÁLIS ENDOTOXIN VIZSGÁLAT ALKALMAZÁSA Ha a cikkely bakteriális endotoxinra vonatkozó vizsgálatot ír elő, de a 2.6.14. fejezetben előírt 6 vizsgálat (A–F) egyikét sem nevezi meg, akkor az adott termékre vonatkozóan az A módszer, a gélkoaguláción alapuló határérték-vizsgálat a validált módszer. Amennyiben a többi módszer (B–F) egyikét megnevezik, akkor az adott termékre vonatkozóan azt a módszert validálták. 13. ALTERNATÍV MÓDSZEREK VALIDÁLÁSA A nyulakon végzett pirogén vizsgálat bakteriális endotoxin vizsgálattal történő helyettesítését, vagy a cikkelyben megnevezett vagy hivatkozott bakteriális endotixin vizsgálati módszer más módszerrel való helyettesítését – az Alapelvek értelmében – úgy kell tekinteni, mint egy alternatív módszer alkalmazását egy gyógyszerkönyvi módszer helyett: „A Gyógyszerkönyvben előírt tartalmi meghatározások és egyéb vizsgálatok képezik azokat a hivatalos módszereket, amelyeken a Gyógyszerkönyv követelményei alapulnak. Az illetékes hatóság jóváhagyásával más vizsgálati módszerek is alkalmazhatók az ellenőrzésben, feltéve, ha ezen módszerek alapján egyértelműen eldönthető, hogy a hivatalos módszerek alkalmazása esetén teljesülnének-e a cikkely követelményei. Kétes vagy vitás esetben kizárólag a Gyógyszerkönyv vizsgálati módszerei mérvadók.” A cikkelyben megnevezett vagy jelzett bakteriális endotoxin vizsgálati módszertől eltérő módszer validálására a következő eljárások javasoltak. 13.1. Az eljárást, valamint a módszer során felhasznált eszközöket és reagenseket az érintett vizsgálatra előírtak szerint kell validálni. 13.2. A zavaró tényezők jelenlétét (és szükség esetén a kiküszöbölésükre szolgáló eljárást is) legalább 3 különböző gyártási tételből származó mintán kell vizsgálni. Nem szabad megfeledkezni arról, hogy a D és E módszer esetében, amelyeknél kromogén peptidet alkalmazunk, olyan reagenseket is fel kell használni, amelyek az A, B, C és F módszerben nincsenek jelen. Ennél fogva az, hogy az A, B, C és F módszerek megfelelnek a zavaró tényezőkre vonatkozó követelményeknek, nem jelenti azt, hogy mindez a D és az E módszerre is további vizsgálatok elvégzése nélkül érvényes lenne. 14. ÚJ TERMÉKEK VIZSGÁLATÁNAK VALIDÁLÁSA Minden olyan parenterális alkalmazásra szánt új termék esetében, amelynél a Gyógyszerkönyv a bakteriális endotoxinok jelenlétére vonatkozó vizsgálatot ír elő, a 13.1. és 13.2. pontokban leírt eljárásokat kell alkalmazni.

04/2010:50108

5.1.8. BEVÉTELRE SZÁNT GYÓGYNÖVÉNY-KÉSZÍTMÉNYEK MIKROBIOLÓGIAI TISZTASÁGA Jelen fejezet a gyógynövénykészítmények mikrobiológiai követelményeire vonatkozó ajánlásokat tartalmaz.

tisztaságának

elfogadási

Bizonyos mikroorganizmusok jelenléte nem steril készítményekben csökkentheti, sőt, megszüntetheti a termék gyógyhatását és károsíthatja a beteg egészségét. Ezért a gyártók az előállítás, a tárolás és a kiszerelés folyamán a helyes gyártási gyakorlat (GMP) érvényes irányelveinek végrehajtásával kötelesek biztosítani, hogy a kész gyógyszerformák mikrobiológiai szennyezettsége igen kismértékű legyen. A nem steril termékek mikrobiológiai vizsgálatát a 2.6.12., a 2.6.13., valamint a 2.6.31. általános fejezetekben előírt módszerekkel kell végezni. A nem steril gyógyszerkészítményekre vonatkozó elfogadási követelmények, amelyek a teljes aerob mikroorganizmusszámon (TAMC) és teljes élesztőgomba-/penészgombaszámon (TYMC) alapulnak, az alábbiakban találhatók. Az elfogadási követelmények az egyedi eredményeken, illetve – ismételt számlálás esetén (pl. közvetlen lemezes módszerek) – az ismételt számolási eredmények átlagán alapulnak. Az alábbiakban felsorolt specifikált mikroorganizmusokra elfogadási követelményeket írtak elő. A felsorolás nem okvetlenül teljes, és adott készítmény esetében – a kiindulási anyagoktól és az előállítási eljárástól függően – esetleg egyéb mikroorganizmusokra is vizsgálni kell. A. Gyógynövénykészítmények, melyek forrásban lévő vízzel készített forrázatok és főzetek (pl. izjavítókat tartalmazó vagy nem tartalmazó gyógynövény teák) előállítására szánt növényi drogokat tartalmaznak segédanyagokkal, vagy azok nélkül. TAMC (2.6.12)

Elfogadási követelmény: 107 CFU/g Legnagyobb elfogadható mikroorganizmusszám: 50 000 000 CFU/g

TYMC (2.6.12)

Elfogadási követelmény: 105 CFU/g Legnagyobb elfogadható mikroorganizmusszám: 500 000 CFU/g

Escherichia coli (2.6.31)

Elfogadási követelmény: 103 CFU/g

Salmonella (2.6.31)

Nem lehet jelen (25 g)

B. Gyógynövénykészítmények, amelyek például olyan kivonatokat és/vagy növényi drogokat tartalmaznak (segédanyagokkal. vagy azok nélkül), amelyeknél a feldolgozás (pl. kivonás) vagy – egyes növényi drogok esetében – az előkezelés során a kategóriára előírt szint alá csökken a mikroorganizmusszám.

TAMC (2.6.12)

Elfogadási követelmény: 104 CFU/g vagy CFU/ml Legnagyobb elfogadható mikroorganizmusszám: 50 000 CFU/g vagy CFU/ml

TYMC (2.6.12)

Elfogadási követelmény: 102 CFU/g vagy CFU/ml Legnagyobb elfogadható mikroorganizmusszám: 500 CFU/g vagy CFU/ml

Epeálló Gram-negatív baktériumok (2.6.31)

Elfogadási követelmény: 102 CFU/g vagy CFU/ml


Nem lehet jelen (1 g vagy 1 ml)

Salmonella (2.6.31)


C. Gyógynövénykészítmények, amelyek például olyan kivonatokat és/vagy növényi drogokat tartalmaznak (segédanyagokkal vagy azok nélkül), amelyeknél igazolható, hogy a feldolgozás (például kivonás híg alkohollal vagy nem forrásban lévő vízzel, illetve alacsony hőmérsékleten végzett töményítés) vagy – növényi drogok esetében – az előkezelés, nem csökkenti olyan mértékben a mikroorganizmusszámot, hogy az megfeleljen a B pont szerinti követelményeknek. TAMC (2.6.12)


TYMC (2.6.12)


Epeálló Gram-negatív baktériumok (2.6.31)

Elfogadási követelmény: 104 CFU/g vagy CFU/ml



Salmonella (2.6.31)


Néhány gyógynövénykészítmény esetében, a rájuk jellemző mikrobiológiai szennyezettség miatt, a TAMC-re, a TYMC-re és az epeálló baktériumokra vonatkozó – az A, a B, ill. a C pont alatt feltüntetett – követelmények nem teljesülhetnek. A mikrobiológiai szennyezettség minőségi és mennyiségi jellemzését és az ilyen gyógyszerek szándékolt felhasználási módját figyelembe vevő kockázatbecslés alapján, az előírtakhoz képest kevésbészigorú elfogadási követelményeket is lehet alkalmazni. Ha bebizonyosodott, hogy az előírt szinten az előírt vizsgálatok egyikével sem állapítható meg értékelhető mikroorganizmusszám, akkor olyan validált módszert kell alkalmazni, amelynél a kimutatási határ a lehető legjobban megközelíti a jelzett elfogadási követelményt.

5.17.1. Ajánlások a kioldódási vizsgálatokhoz


07/2010:51701

5.17.1. AJÁNLÁSOK A KIOLDÓDÁSI VIZSGÁLATHOZ Ezen általános fejezet szövege nem kötelező erejű; célja, hogy tájékoztatást adjon a kioldódási vizsgálatról, a javasolt kioldófolyadékokról, és az orálisan alkalmazott gyógyszerformák kioldódási követelményeivel kapcsolatos fogalmakról (lásd a "2.9.3. Szilárd gyógyszerformák hatóanyagának kioldódási vizsgálata" c. általános fejezetet); továbbá ismerteti a kioldódás tárgykörében használatos, általánosan elfogadott paramétereket. Szilárd gyógyszerkészítmények hatóanyagkioldódási sebességének meghatározásához a következő körülményeket kell megadni: –

az alkalmazandó berendezés, és átfolyócellás készülék előírása esetén a használandó átfolyócella megjelölése;

–

a kioldófolyadék összetétele, térfogata és hőmérséklete;

–

a fordulatszám, illetve a kioldófolyadék áramlási sebessége;

–

a mintavétel időpontja, módja és a kivett minta mennyisége, illetve a folyamatos monitorozás körülményei;

–

az analitikai módszer;

–

az elfogadási követelmények.

A készüléket a gyógyszerforma fizikai-kémiai sajátságaitól függően kell megválasztani. Ha nagy mennyiségű kioldófolyadékra van szükség a bemerítési feltételek biztosításához, vagy ha változtatatni kell a pH-t, akkor átfolyócellás készüléket érdemes alkalmazni. VIZSGÁLATI KÖRÜLMÉNYEK A forgókosaras, a forgólapátos és a függőleges mozgású készülék alkalmazása egyaránt a bemerítési feltételek alkalmazásának elvén, vagyis azon alapul, hogy a már oldatban lévő anyag nem gyakorol számottevő befolyást a visszamaradt anyag kioldódási sebességére. A bemerítési feltételek általában akkor valósulnak meg, ha a kioldófolyadék térfogata legalább 3–10-szerese a telítési térfogatnak. Általában vizes közegben végezzük a vizsgálatot. A közeg összetételét a hatóanyag(ok) és a segédanyag(ok) fizikai-kémia tulajdonságai alapján kell megválasztani, mégpedig olyan határok között, amelyeken belül az összetétel jól megközelíti annak a közegnek az összetételét, amely a gyógyszerformát a beadás után körülveszi. Ez különösen a kioldófolyadék pH-jára és ionerősségére vonatkozik. A kioldófolyadék kémhatását pH = 1–8 közé szokás beállítani, indokolt esetben azonban nagyobb pHra is szükség lehet. Savas tartományban, kisebb pH-értékek beállítására általában 0,1 M sósav használatos. Néhány ajánlott kioldófolyadék felsorolását lásd alább. Önmagában víz, mint kioldófolyadék csak abban az esetben ajánlott, ha a pH-változás bizonyítottan nem befolyásolja a kioldás folyamatát. Különleges esetekben, valamint az illetékes hatóság jóváhagyásával a kioldófolyadék tartalmazhat enzimeket, felületaktív anyagokat, továbbá egyéb szervetlen és szerves anyagot is. Vízben rosszul oldódó hatóanyagokat tartalmazó gyógyszerkészítmények vizsgálata során szükségessé válhat a kioldófolyadék módosítása. Ilyen esetekben kis koncentrációjú felületaktív anyag alkalmazása javasolt; szerves oldószerek alkalmazását lehetőleg kerülni kell. A kioldófolyadékban oldott gázok befolyásolhatják kioldódási vizsgálat eredményeit. Ez különösen az átfolyócellás készülékekre érvényes, tehát az átfolyócellában képződő gázbuborék-képződés megakadályozása érdekében a kioldófolyadékot levegőmentesíteni kell. Levegőmentesítésre alkalmas eljárás a következő: a kioldófolyadékot óvatos keverés közben kb. 41 °C-ra melegítjük, majd 0,45 μm-



es vagy ennél kisebb pórusméretű szűrőn, vákuum alatt, erőteljes keverés közben, késedelem nélkül megszűrjük, és a keverést vákuum alatt még kb. 5 percen át folytatjuk. Az oldott gázok elűzésére más levegőmentesítési eljárások is alkalmazhatók. A forgólapátos és a forgókosaras készülékekhez általában 500–1000 ml kioldófolyadékot alkalmazunk. A keverő szokásos fordulatszáma 50–100 1/perc, és 150 1/perc-nél nem lehet nagyobb. Az átfolyócellás készülékekben a folyadék áramlási sebességét általában 4–50 ml/percre állítjuk be. JAVASOLT KIOLDÓFOLYADÉKOK A következő táblázat néhány használható kioldófolyadékot ismertet. 5.17.1.-1. táblázat. – Kioldófolyadékok pH

Kioldófolyadék

pH 1,0

HCl

pH 1,2

NaCl, HCl

pH 1,5

NaCl, HCl

pH 4,5

foszfát- vagy acetát-tompítóoldat

pH 5,5 és pH 5,8

foszfát- vagy acetát-tompítóoldat

pH 6,8

foszfát-tompítóoldat

pH 7,2 és pH 7,5

foszfát-tompítóoldat

A különböző közegek összetételét és készítését lásd alább. Sósavas közeg –

0,2 M sósav.

–

0,2 M nátrium-klorid–oldat. 11,69 g R nátrium-kloridot R vízzel 1000,0 ml-re hígítunk.

Az 5.17.1.-2. táblázatba foglalt pH-értékekkel jellemezhető közegek elkészítéséhez 250,0 ml 0,2 M nátrium-klorid–oldatot elegyítünk a megadott térfogatú 0,2 M sósavval, és az elegyet R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk. 5.17.1.-2. táblázat – Sósavas közegek pH

HCl (ml)

1,2

425,0

1,3

336,0

1,4

266,0

1,5

207,0

1,6

162,0

1,7

130,0

1,8

102,0

1,9

81,0

2,0

65,0

2,1

51,0

2,2

39,0

A sósavas közegek készítéséhez nátrium-klorid helyett kálium-kloridot is használhatunk.



Acetát–tompítóoldatok –

2 M ecetsav. 120,0 g R tömény ecetsavat R vízzel 1000,0 ml-re hígítunk.

–

Acetát–tompítóoldat (pH 4,5). 2,99 g R nátrium-acetátot R vízben oldunk; 14,0 ml 2 M ecetsav hozzáadása után az oldatot R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk.

–


–


Foszfát–tompítóoldatok Az 5.17.1.-3. táblázatba foglalt pH-értékekkel jellemezhető tompítóoldatok elkészítéséhez 250,0 ml R 0,2 M kálium-dihidrogén-foszfát–oldatot elegyítünk a megadott térfogatú 0,2 M nátrium-hidroxid– oldattal, és az elegyet R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk. 5.17.1.-3. táblázat – Foszfát–tompítóoldatok pH

5,8

6,0

6,2

6,4

6,6

6,8

NaOH (ml)

18,0

28,0

40,5

58,0

82,0

112,0

pH

7,0

7,2

7,4

7,6

7,8

8,0

NaOH (ml)

145,5

173,5

195,5

212,0

222,5

230,5

Egyéb foszfát–tompítóoldatok –

Foszfát–tompítóoldat (pH 4,5). 13,61 g R kálium-dihidrogén-foszfátot oldunk 750 ml R vízben. Az oldat pH-ját (2.2.3) 0,1 M nátrium-hidroxid–oldattal, illetve 0,1 M sósavval – ahogy szükséges – beállítjuk, majd az így kapott oldatot R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk.

–

R foszfát–tompítóoldat (pH 5,5).

–

R1 foszfát–tompítóoldat (pH 6,8).

–

R tompítóoldat (pH 7,2).

–

R 0,33 M foszfát–tompítóoldat (pH 7,5).

Mesterséges bélnedv (pH 6,8) 77,0 ml 0,2 M nátrium-hidroxid–oldatot 250,0 ml, 6,8 g R kálium-dihidrogén-foszfátot tartalmazó oldattal elegyítünk, és az elegyhez 500 ml R vizet adunk. 10,0 g R pankreász-por hozzákeverése után – szükség esetén – beállítjuk a pH-t (2.2.3). Az oldatot R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk. Mesterséges gyomornedv 2,0 g R nátrium-kloridot és 3,2 g R pepszin-port R vízben oldunk; 80 ml 1 M sósav hozzáadása után az oldatot R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk. A pepszin-por hozzáadása – az adott követelményektől függően – esetleg felesleges. A pH növelése Ha a vizsgálat során növelni kell a pH-t, a következő sorozatok közül kiválaszthatunk egyet: Idő (óra)

0–1

pH

1,0

pH

1,2

pH

1,2

pH

1,5

1–2

2–3

3–4

4–5

5–6

6–7

6,8 2,5

4,5 4,5

7,0

7,5 7,2

7



Ezen pH-változtatás kivitelezési módjai: –

egy tompítóoldatot egy másikkal helyettesítünk (teljes csere);

–

a kioldófolyadéknak mindig csak a felét cseréljük ki nagyobb pH-jú tompítóoldatra (fél-csere módszer): a kiindulási pH 1,2, és a második oldat foszfát–tompítóoldat (pH 7,5);

–

egy pH 1,5-ös kiindulási oldat pH-ját egy adag – R trometamolt és R vízmentes nátrium-acetátot tartalmazó – porkeverék hozzáadásával 4,5-re állítjuk be, majd egy második adag porkeverék hozzáadásával 7,2-re növeljük a pH-t, az alábbiak szerint: –

sósav (pH 1,5): 2 g R nátrium-kloridot R vízben oldunk, 31,6 ml 1 M sósav–mérőoldatot adunk hozzá, és az elegyet R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk;

–

tompítóoldat (pH 4,5): 2,28 g R trometamolt elkeverünk 1,77 g R vízmentes nátrium-acetáttal; ezt a keveréket a fentiek szerint készített sósavban (pH 1,5) oldjuk;

–

tompítóoldat (pH 7,2): 2,28 g R trometamolt elkeverünk 1,77 g R vízmentes nátrium-acetáttal; ezt a keveréket a fentiek szerint készített tompítóoldatban (pH 4,5) oldjuk.

Az átfolyócella alkalmas a pH folyamatos változtatására. MINŐSÍTÉS ÉS VALIDÁLÁS A vizsgálati módszer természete miatt a kioldódást in vitro vizsgáló berendezések fontos minősítési szempontja a tervezésen alapuló minőség. Mindennemű egyenetlen működés, például mechanikai hiányosságokból eredő nemkívánatos rezgés vagy rázkódás megengedhetetlen. A kioldódásvizsgáló berendezés minősítése során figyelembe kell venni a készülék méreteit és tűréshatárait. A használat folyamán rendszeres időközökben monitorozni kell a lényeges vizsgálati mérőszámokat, például a kioldófolyadék hőmérsékletét és térfogatát, a fordulatszámot vagy az átfolyási sebességet, továbbá a mintavételhez használt eszközöket és eljárásokat. A kioldódásvizsgáló berendezés teljesítménye a hidrodinamikai viszonyokra érzékeny referenciakészítménnyel monitorozható. Ilyen vizsgálatok – más laboratóriumokkal való összehasonlíthatóság érdekében – vagy időközönként vagy folyamatosan végezhetők. A vizsgálatok folyamán szigorú ellenőrzésre és megfigyelésre van szükség. Ez a szemlélet különösen olyan esetekben fontos, amikor valamilyen kiugró eredményt értelmezni kell. Az automatizált rendszerek validálásának – érintse az akár a mintavételt és az analitikai részt, akár a kioldófolyadék elkészítését és a vizsgálat kivitelezését – ki kell terjednie az eredmények helyességére, a kivitelezés pontosságára, és a – bármely hígítási, átviteli, tisztítási műveletnél, továbbá a minták és oldószerek előkészítése során esetleg bekövetkező – szennyeződés elkerülésére. ORÁLIS GYÓGYSZERFORMÁK KIOLDÓDÁSI KÖVETELMÉNYEI A kioldódási követelményt az adott időtartamon belül kioldódott hatóanyag mennyiségében (Q) fejezzük ki, és a termék feliratán feltüntetett tartalomra vonatkoztatott százalékban adjuk meg. Hagyományos hatóanyagleadású gyógyszerformák Ésszerű és indokolt vizsgálati körülmények között, az S1 szintű elfogadási követelmény az esetek többségében azt jelenti, hogy a hatóanyagnak legalább 80%-a kioldódik a megadott időn – rendszerint 45 percen – belül vagy ennél rövidebb idő alatt. Ez 75% Q-értéknek felel meg, mivel, mint azt a 2.9.3.-1. táblázat mutatja, S1 szinten a vizsgált 6 minta közül egyetlen egység egyedi eredménye sem lehet kisebb, mint Q+5%, azaz legalább 80%. Az egypontos elfogadási követelmény általában elegendő annak igazolására, hogy a hatóanyag nagyrésze felszabadult, egyes esetekben azonban további időpont(ok)ban is kell végezni vizsgálato(ka)t a kielégítő kioldódás bizonyítására.



Nyújtott hatóanyagleadású gyógyszerformák A nyújtott hatóanyagleadású gyógyszerformákra vonatkozó kioldódási vizsgálat elfogadási követelménye általában legalább három specifikációs pontból áll. Az első specifikációs pont szándék szerint meggátolja a hatóanyag túl gyors felszabadulását (a "dózisdömpinget"). Ezért ezt a pontot 20– 30% kioldódott mennyiségnek megfelelő vizsgálati időtartam utáni pontban szokás megjelölni. A második specifikációs pont a kioldódási folyamat lefutását határozza meg, ezért ezt a pontot a kb. 50%-os kioldódáshoz igazítjuk. Az utolsó specifikációs pont szerepe az, hogy csaknem teljes kioldódást biztosítson; ezen általában 80%-ot meghaladó kioldódás értendő. Késleltetett hatóanyagleadású gyógyszerformák A különböző kioldófolyadékokban, például a pH növelésének körülményei között végzett vizsgálat folyamán a késleltetett hatóanyagleadású gyógyszerformákból – az adott gyógyszerforma tervezésének megfelelően – vagy frakcionáltan vagy egyszerre szabadul (szabadulnak) fel a hatóanyag(ok). Ezért a kioldódási követelményeket esetről esetre kell megszabni. A gyomornedvnek ellenálló gyógyszerformáknak szekvenciális vizsgálat keretében egy legalább kétpontos követelménynek, párhuzamos vizsgálat keretében pedig két különböző követelménynek kell megfelelniük. Szekvenciális vizsgálatban a követelmény első pontja a felső határt jelenti, és savas közegben 1 óra vagy 2 óra elteltére, a követelmény második pontja megfelelő tompítóoldatban (legkedvezőbb a pH 6,8-as) egy előre meghatározott időtartamra vonatkozik. A B1 szintű elfogadási követelmény az esetek többségében azt jelenti, hogy legalább 80% hatóanyagnak kell kioldódnia. Ez 75% Q-értéknek felel meg, mivel, mint azt a 2.9.3.-4. táblázat mutatja, B1 szinten a vizsgált hat minta közül egyetlen egység egyedi eredménye sem lehet kisebb, mint Q+5%, azaz legalább 80%.

01/2010:2445

ADAPALENUM Adapalén

C28H28O3 [106685-40-9]

Mr 412,5

DEFINÍCIÓ 6-(4-Metoxi-3-triciklo[3.3.1.13.7]dekán-1-ilfenil)naftalin-2-karbonsav. Tartalom: 98,0–102,0% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; tetrahidrofuránban mérsékelten oldódik; etanolban (96%) gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS adapalénnal. VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint a BS6 szín-mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). 0,2 g anyagot R tetrahidrofuránnal 20 ml-re oldunk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29).

Ph. Hg. VIII. − Ph. Eur. 6.6

2

Adapalenum

Oldószerelegy: R tetrahidrofurán − R acetonitril − R víz (20+37+43 V/V). Vizsgálati oldat (a). 40,0 mg vizsgálandó anyagot 10 ml R tetrahidrofuránban oldunk. Az oldatot 7 ml oldószereleggyel elegyítjük, majd R tetrahidrofuránnal 20,0 ml-re hígítjuk. Vizsgálati oldat (b). 20,0 mg vizsgálandó anyagot 50 ml R tetrahidrofuránban oldunk. Az oldatot 35 ml oldószereleggyel elegyítjük, majd R tetrahidrofuránnal 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 5,0 ml-ét az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). Az a) vizsgálati oldat 1,0 ml-ét R tetrahidrfuránnal 10,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 2,4 mg CRS adapalén-C-szennyezőt 2 ml R tetrahidrofuránban oldunk, majd az oldatot R tetrahidrofuránnal 20,0 ml-re hígítjuk. A hígított oldat 2,0 ml-ét az oldószereleggyel 20,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 2,0 ml-ét az a) összehasonlító oldat 2,0 ml-ével elegyítjük, majd az így nyert oldatot az oldószereleggyel 20,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). Egy üvegcse CRS csúcsazonosításra szánt adapalént (amely A-, C- és D-szennyezőt is tartalmaz) 0,5 ml R tetrahidrofuránban oldunk, majd az oldatot az oldószereleggyel 1,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (d). 20,0 mg CRS adapalént 50 ml R tetrahidrofuránban oldunk. Az oldatot 35 ml oldószereleggyel elegyítjük, majd R tetrahidrofuránnal 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 5,0 ml-ét az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, fenilszililezett szilikagél (5 μm); széntartalom 7,5%;

−


Mozgófázis: –

A-mozgófázis: R tömény ecetsav − R víz (0,1+100 V/V);

–

B-mozgófázis: R tetrahidrofurán − R acetonitril (35+65 V/V); Idő (perc)



0 − 2,5

50

50

2,5 − 40

50 → 28

50 → 72

40 − 42

28

72


3

Adapalenum

Áramlási sebesség: 1,2 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 270 nm-en. Injektálás: 25 μl; a) vizsgálati oldat, valamint a), b) és c) összehasonlító oldat. Szennyezők azonosítása: az A-, a C- és a D-szennyező csúcsának azonosítására a CRS csúcsazonosításra szánt adapalénhoz mellékelt kromatogramot és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók az adapalénra (retenciós ideje kb. 20 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,3; C-szennyező kb. 0,9; D-szennyező kb. 1,9. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 4,5, a C-szennyező és az adapalén között;

−

jel/zaj viszony: legalább 10, a C-szennyező csúcsára vonatkozóan.

Követelmények: −

korrekciós faktorok: az egyes szennyezők mennyiségének kiszámításához csúcsterületüket a következő korrekciós tényezőkkel szorozzuk: Aszennyező 0,7; C-szennyező 7; D-szennyező 1,4;

−

A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%);

− D-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%);

− C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének másfélszerese (0,15%); −

egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%);

–

összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének ötszöröse (0,5%);

–

elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%).


4

Adapalenum

Nehézfémek (2.4.8/G): legfeljebb 20 ppm. 0,250 g anyagot vizsgálunk. Az összehasonlító oldatot 0,5 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,5%. Az anyag 1,000 g-ját szárítószekrényben 105 °C-on 4 órán át szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29) a "Rokon vegyületek" vizsgálatban leírtak szerint, az alábbi módosítással. Injektálás: b) vizsgálati oldat és d) összehasonlító oldat. A százalékos adapaléntartalmat a CRS adapalén deklarált tartalma alapján számítjuk ki. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, C, D. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nemspecifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034)) című általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10) című általános fejezetet): B.

A. 2,2'-binaftalin-6,6'-dikarbonsav,


5

Adapalenum

B. 6-[3-(3-hidroxitriciklo[3.3.1.13.7]dekán-1-il)-4-metoxifenil]naftalin-2karbonsav,

C. 1-(2-metoxifenil)triciklo[3.3.1.13.7]dekán,

D. 1,1'-[4,4'-bisz(metoxi)bifenil-3,3'-diil]bisz(triciklo[3.3.1.13.7]dekán).

Amyla hydroxyethyla


01/2011:1785

AMYLA HYDROXYETHYLA Hidroxietil-keményítők

R = -[CH2CH2O]n'H (n' = 0, 1, 2 …) R1 = -[CH2CH2O]n"H (n" = 0 vagy 1) vagy glükóz

[C6H10O5(C2H4O)x]n, ahol x = moláris szubsztitúció [9005-27-0] DEFINÍCIÓ A hidroxietil-keményítők a – főként amilopektinből álló – viaszos kukoricakeményítő vagy burgonyakeményítő részlegesen szubsztituált poli(2-hidroxietil)éterei. A hidroxietil-keményítő típusát két szám definiálja: az átlagos molekulatömeg (Mt) és az egységnyi anhidroglükózra jutó hidroxietilcsoportok száma, mely utóbbit moláris szubsztitúciónak nevezzük (MS). A hidroxietil-keményítőt a C2-höz, illetve a C6-hoz kapcsolódó hidroxietil-csoportok számaránya (C2/C6 arány) is jellemzi. A három mérőszám – Mt, MS és C2/C6 – értéke az előállítás során alkalmazott reakciókörülményektől függ. ELŐÁLLÍTÁS A hidroxietil-keményítőket viaszos kukoricakeményítőből vagy burgonyakeményítőből állítják elő savas hidrolízissel, majd etilén-oxiddal reagáltatva; tisztításukra ultraszűrést alkalmaznak. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér por. Oldékonyság: vízben és dimetil-szulfoxidban bőségesen oldódik; vízmentes etanolban gyakorlatilag nem oldódik. A kb. 12–15%-nál kevesebb vizet tartalmazó hidroxietil-keményítők nedvszívók. AZONOSÍTÁS Első azonosítás: A, C. Második azonosítás: B, C. A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS közepes móltömegátlagú (Mt) hidroxietil-keményítővel.

Amyla hydroxyethyla


Értékelés: az anyag spektrumában megjelenő abszorpciós sávok egyezzenek meg a CRS közepes móltömegátlagú hidroxietil-keményítő spektrumában megjelenő abszorpciós sávokkal. Az abszorpciós sávok intenzitása az anyag eltérő szubsztitúciója következtében különböző lehet. B. Az S oldat 5 ml-éhez (lásd Vizsgálatok) 0,1 ml 0,05 M jód–oldatot elegyítünk. Az oldat vörösesbarnára vagy kékesibolyára színeződik. C. Molekulatömeg (lásd Vizsgálatok). VIZSGÁLATOK S oldat. A vizsgálandó anyag (szárított anyag) 5,0 g-ját R szén-dioxid-mentes vízzel 100,0 ml-re oldjuk. Az oldat külleme. Az S oldat opaleszcenciája nem lehet erősebb, mint a II. sz. összehasonlító szuszpenzióé (2.2.1). pH (2.2.3): 4,5–7,0. 25 ml S oldathoz R kálium-klorid telített oldatának 0,2 ml-ét elegyítjük. Abszorbancia (2.2.25): legfeljebb 0,025. A 0,2 μm-es szűrőn megszűrt S oldat abszorbanciáját mérjük 400 nm-en. Molekulatömeg (Mt) és molekulatömeg-eloszlás. Méretkizárásos kromatográfia (2.2.30). Tompítóoldat. 54,34 g R nátrium-acetátot R vízben oldunk, az oldathoz 100,0 ml R tömény ecetsavat elegyítünk, és az elegyet R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk. Vizsgálati törzsoldat. A vizsgálandó anyag (szárított anyag) 2,0 g-ját R vízzel 50,0 ml-re oldjuk. Az oldathoz 10,0 ml tompítóoldatot elegyítünk, majd az elegyet R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). Az a) összehasonlító oldat készítéséhez, –

ha a vizsgálandó anyag névleges móltömege 300 000-nél kisebb, CRS közepes móltömegátlagú hidroxietil-keményítőt használunk;

–

ha a vizsgálandó anyag névleges móltömege 300 000-nél nagyobb, CRS magas móltömegátlagú hidroxietil-keményítőt használunk.

0,4 g CRS közepes móltömegátlagú hidroxietil-keményítőt vagy CRS nagy móltömegátlagú hidroxietilkeményítőt 10,0 ml R vízben oldunk. Az oldatot, 2,0 ml tompítóoldat hozzáadása után, R vízzel 20,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 10,0 ml a) összehasonlító oldatot a mozgófázissal 20,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). 10,0 ml b) összehasonlító oldatot a mozgófázissal 20,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (d). 10,0 ml c) összehasonlító oldatot a mozgófázissal 20,0 ml-re hígítunk. Oszlop: –

állófázis: R hidroxilezett polimetakrilát-gél,

–

négy sorbakapcsolt oszlop: Hosszúság (m)

Belső átmérő (mm)

Részecskeméret (μm)

Pórusméret (nm)

0,30

7,5

17

> 100

0,30

7,5

17

100

0,30

7,5

10

20

0,30

7,5

10

12,5

Amyla hydroxyethyla


Mozgófázis: 100,0 ml tompítóoldatot R vízzel 1 literre hígítunk. Áramlási sebesség: 0,5–1,0 ml/perc. Detektálás: lézer fényszórás detektorral (MALLS detector: multiple-angle laser light scattering detector) és sorbakötött, állandó hőmérsékletűre beállított refraktométerrel. Injektálás: 50 μl. A megfelelő munkaoldatok meghatározását a következő módon végezzük: injektáljuk az a) és a b) összehasonlító oldatot. A b) összehasonlító oldattal meghatározott átlagos móltömeg legfeljebb 3%kal térhet el az a) összehasonlító oldattal meghatározott átlagos móltömegtől. Ha ez a követelmény teljesül, az a) összehasonlító oldatot használjuk a rendszeralkalmassági követelmény ellenőrzésére. Ha az eltérés nagyobb, a c) összehasonlító oldatot injektáljuk az átlagos móltömeg meghatározására. A c) összehasonlító oldattal meghatározott átlagos móltömeg legfeljebb 3%-kal térhet el a b) összehasonlító oldattal meghatározott átlagos móltömegtől. Ha ez a követelmény teljesül, a b) összehasonlító oldatot használjuk a rendszeralkalmassági követelmény ellenőrzésére. Ha az eltérés nagyobb, a d) összehasonlító oldatot injektáljuk az átlagos móltömeg meghatározására. A d) összehasonlító oldattal meghatározott átlagos móltömeg legfeljebb 3%-kal térhet el a c) összehasonlító oldattal meghatározott átlagos móltömegtől. Ha ez a követelmény teljesül, a c) összehasonlító oldatot használjuk a rendszeralkalmassági követelmény ellenőrzésére. Rendszeralkalmasság: –

átlagos móltömeg: eltérése a CRS közepes móltömegátlagú hidroxietil-keményítőre vagy a CRS nagy móltömegátlagú hidroxietil-keményítőre megadott értéktől legfeljebb 5% lehet.

A vizsgálati törzsoldatot szükség esetén úgy hígítjuk, hogy koncentrációja azonos legyen a rendszeralkalmasság ellenőrzésére használt összehasonlító oldatéval. Értékelés: az átlagos molekulatömeg, valamint a legkisebb és a legnagyobb móltömegű 10%-os frakció meghatározására megfelelő integrátort alkalmazunk. Kis móltömegátlag (Mt)

Közepes móltömegátlag (Mt)

Nagy móltömegátlag (Mt)

2000–100 000

100 000–300 000

300 000–900 000

mért móltömegátlag = névleges móltömegátlag ± 15% a legkisebb móltömegű 10%os frakció móltömegátlaga

a legkisebb móltömegű 10%-os frakció móltömegátlaga

a legkisebb móltömegű 10%-os frakció móltömegátlaga

> névleges móltömegátlag 10%-a

> 15 000

> 15 000

a legnagyobb móltömegű 10%-os frakció móltömegátlaga

a legnagyobb móltömegű 10%os frakció móltömegátlaga

a legnagyobb móltömegű 10%os frakció móltömegátlaga

< névleges móltömegátlag 300%-a



C2/C6 arány. Gázkromatográfia (2.2.28). A-oldat. R hígított kénsav és R víz azonos térfogatarányú elegye. Vizsgálati oldat. 0,18 g vizsgálandó anyagot 5 ml-es üvegcsébe mérünk. Hozzáadunk 3,0 ml Aoldatot, majd az üvegcsét lezárjuk, és az anyag feloldódásáig rázogatjuk. Az üvegcsét 100 °C-ra előmelegített fűtőblokkba helyezzük és – időnként összerázva – 4 órán át melegítjük, majd szobahőmérsékletűre hűtjük. Ezután felnyitjuk, és az oldathoz óvatosan 0,9 g R bárium-karbonátot adunk. Óvatosan összerázzuk, majd kb. 9000 g-vel kb. 15 percig centrifugáljuk. A tiszta felülúszó pHját indikátorpapírral ellenőrizzük. Ha még savas, akkor 0,2 g-os adagokban további R báriumkarbonátot adunk hozzá, míg az oldat semleges nem lesz. Az így semlegesített, tiszta felülúszót megszűrjük (pórusméret 0,45 μm). A szüredék 0,5 ml-ét automatikus mintaadagoló üvegcséjébe

Amyla hydroxyethyla


mérjük, és 40 °C-on melegítve beszárítjuk (ehhez általában néhány óra szükséges). A maradékot 0,50 ml R piridinben oldjuk, az oldathoz 0,25 ml R N,O-bisz(trimetilszilil)acetamidot és 25 μl R klórtrimetilszilánt adunk. Az üvegcsét lezárjuk, és – időnként összerázva – 1 órán át 40 °C-on melegítjük, majd szobahőmérsékletűre hűtjük. Ezután az automatikus mintaadagolóba helyezzük, és mindegyik üvegcséből háromszor injektálunk. Párhuzamosan két vizsgálati oldatot készítünk. Összehasonlító oldat. A vizsgálati oldat készítésére előírtak szerint járunk el, azzal a különbséggel, hogy a vizsgálandó anyag helyett CRS közepes móltömegátlagú hidroxietil-keményítőt használunk. Oszlop: –

méretei: l = 15 m; Ø = 0,32 mm;

–

állófázis: R poli(dimetil)sziloxán (filmvastagság 0,25 μm).

Vivőgáz: állandó – 69 kPa – nyomású, R kromatográfiás célra szánt hidrogén. Mintaáram-elosztási arány: 1:20.

Oszlop

Idő (perc)

Hőmérséklet (°C)

0–1

150

1 – 25

150 → 270

25 – 28

270

Injektor

250

Detektor

300

Detektálás: lángionizációval. Injektálás: 1 μl. A csúcsok azonosítása: az 1., a 2. és a 3. származék, a 2-O-hidroxietil-α-D-glükóz, a 6-O-hidroxietilα-D-glükóz, a 2-O-hidroxietil-β-D-glükóz és a 6-O-hidroxietil-β-D-glükóz azonosítására a CRS közepes móltömegátlagú (Mt) hidroxietil-keményítőhöz melékelt kromatogramot és az összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 1,5 a 2-O-hidroxietil-β-D-glükóz és a 6-O-hidroxietil-β-D-glükóz között;

–

szimmetriafaktor: 0,6–1,5 az 1. származékra vonatkoztatva;

–

ismételhetőség: maximális szórás: 5,0% az 1. származékra számolva, 3 injektálás után.

A C2/C6 arányt a következő kifejezés alapján számoljuk ki:

A1 + A2 + A3 + A4 + A5 , A6 + A7 ahol A1 =

az 1. származék csúcsterülete;

A2 =

a 2. származék csúcsterülete;

A3 =

a 3. származék csúcsterülete;

A4 =

a 2-O-hidroxietil-α-D-glükóz csúcsterülete;

A5 =

a 2-O-hidroxietil-β-D-glükóz csúcsterülete;

A6 =

a 6-O-hidroxietil-α-D-glükóz csúcsterülete;

Amyla hydroxyethyla

A7 =


a 6-O-hidroxietil-β-D-glükóz csúcsterülete.

A C2/C6 arányt a két vizsgálati oldatra kapott értékből számoljuk ki. A vizsgálat csak abban az esetben értékelhető, ha a két érték közti különbség legfeljebb 5%. Követelmény: a C2/C6 arány a névleges érték 20,0%-án belül legyen. Moláris szubsztitúció (MS). Gázkromatográfia (2.2.28). A hidroxietil-csoportokat hidrogén-jodiddal végzett hidrolízis után, jódetán formájában határozzuk meg. Belső standard oldat. 1,0 ml R toluolt R xilollal 200,0 ml-re hígítunk. Vizsgálati oldat. 50,0 mg vizsgálandó anyagot és kb. 0,10–0,15 g R adipinsavat 5 ml-es üvegcsébe mérünk. 1,0 ml belső standard oldat és 2,0 ml R hidrogén-jodid–oldat hozzáadása után az üvegcsét szeptummal és a középen nyitott alumínium kupakkal szorosan lezárjuk. Párhuzamosan öt vizsgálati oldatot készítünk. Összehasonlító oldat. Hét, egyenként 5 ml-es üvegcse mindegyikébe kb. 0,10–0,15 g R adipinsavat mérünk. Valamennyi üvegcsébe 1,0 ml belső standard oldatot és 2,0 ml R hidrogén-jodid–oldatot mérünk, majd szeptummal és középen nyitott alumínium kupakkal szorosan lezárjuk az üvegcséket. Tömegüket 0,01 mg pontossággal lemérjük, majd 100 μl-es fecskendővel óvatosan átszúrva a szeptumot, rendre 10, 20, 30, 40, 50, 60, illetve 70 mg R jódetánt mérünk egy-egy üvegcsébe. Tömegüket 0,01 mg pontossággal ismét lemérjük, és kiszámoljuk a hozzáadott R hidrogén-jodid– oldatrészletek pontos mennyiségét. Az üvegcséket, miután tömegüket lemértük, 10 órás időtartamra egy 150 °C-ra előmelegített fűtőblokkba helyezzük; ezután szobahőmérsékletűre hűtjük, és tömegüket ismét lemérjük. Amennyiben valamelyik üvegcse esetében a mg-ra kerekített tömegekből számolt tömegveszteség 5 mg-nál nagyobb, a rá vonatkozó méréseket nem vesszük figyelembe. A vizsgálati oldatot tartalmazó 4 üvegcséből és az összehasonlító oldatokat tartalmazó 5 üvegcséből kivesszük, és automata mintaadagoló üvegcséibe mérjük a felső fázis 100–100 μl-ét, majd valamennyit 1,0 ml R xilollal hígítjuk. Az üvegcséket azonnal lezárjuk, és gyorsan összerázzuk. Oszlop: –

anyaga: kvarcüveg;

–

méretei: l = 30 m, Ø = 0,53 mm;

–

állófázis: R poli[(cianopropil)(fenil)][dimetil]sziloxán (filmvastagság 3 μm).

Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hélium. Áramlási sebesség: 8 ml/perc. Mintaáram-elosztási arány: 1:20.

Oszlop

Idő (perc) 0–4 4 – 16 16 – 20

Hőmérséklet (°C) 50 50 → 230 230

Injektor

200

Detektor

280

Detektálás: lángionizációval. Injektálás: 1 μl; valamennyi oldatot kétszer injektáljuk. Elúciós sorrend: jódetán, toluol.

Amyla hydroxyethyla


Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 1,5, a jódetán és a toluol között;

–

valamennyi kromatogramra kiszámoljuk a R jódetán csúcsterülete és a belső standard csúcsterülete közti arányt. Az összehasonlító oldatokra kapott arányokat a hozzáadott R jódetán milligrammokban megadott mennyiségeivel szemben ábrázolva kiszámoljuk a lineáris regressziót. A korrelásciós együttható (R2) legalább 0,990 legyen.

Értékelés: a vizsgálati oldatban jelenlévő, mg-ban megadott jódetán-mennyiséget (T) a következő kifejezés alapján számoljuk ki:

A− B , M ahol A

=

a jódetán csúcsterületének aránya a belső standard csúcsterületéhez a vizsgálati oldat kromatogramján;

B

=

a görbe metszéspontja az y-tengelyen,

M =

a görbe meredeksége.

Az etilén-oxid százalékos mennyiségét (C) a következő kifejezés alapján számoljuk ki: 44,05 ⋅ T ⋅ 100 , 155,97 ⋅ m

ahol m

= a vizsgálandó anyag tömege mg-ban;

44,05

= az etilén-oxid molekulatömege;

155,97 = a jódetán molekulatömege. A molekuláris szubsztitúciót (MS) a következő kifejezés alapján számoljuk ki:

C ⋅ 162,14 , (100 − C ) ⋅ 44,05 ahol 162,14 = az anhidroglükóz molekulatömege; 44,05

= az etilén-oxid molekulatömege.

A négy vizsgálati oldat eredményéből kiszámoljuk MS átlagértékét. Követelmény: az MS átlagértéke 0,05 és 2,4 között, és a névleges érték 8,0%-án belül legyen. Etilénglikol. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 1,0 g vizsgálandó anyagot (szárított anyag) R vízzel 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat. 0,800 g R etilénglikolt R vizzel 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 2,0 ml-ét R vízzel 200,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 2,0 ml-ét R vízzel 20,0 ml-re hígítjuk. Előtétoszlop: –

méretei: l = 0,01 m, Ø = 4,0 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm).

Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

Amyla hydroxyethyla


–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm);

–


Mozgófázis: R víz. Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Oszlop utáni oldat. 750 ml R 2 M nátrium-hidroxid–oldatot R vízzel 1000 ml-re hígítunk. Az oszlo -utáni oldat áramlási sebessége: 0,2 ml/perc. Detektálás: pulzáló amperometriás detektorral. Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: az etilénglikol retenciós idejének 2,5-szerese. Retenciós idő: etilénglikol: kb. 4 perc. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: –

jel/zaj viszony: legalább 10, a főcsúcsra vonatkoztatva;

–

ismételhetőség: 6 injektálás után a maximális szórás 10,0%.

Legfeljebb 8 minta injektálása után az oszlopot a következő program szerint kell átöblíteni. Öblítő oldat: R kromatográfiás célra szánt acetonitril – R víz (20+80 V/V). Idő (perc)

Mozgófázis (%V/V)

Öblítő oldat (V/V)

0 – 15

75

25

15 – 20

75 → 0

25 → 100

20 – 25

0

100

25 – 30

0 → 100

100 → 0

30 – 100

100

0

Követelmények: –

etilénglikol: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a megfelelő csúcs területe az összehasonlító oldat kromatogramján (40 ppm).

2-Klóretanol. Gázkromatográfia (2.2.28). Oldószerelegy: R metanol – R acetonitril (25+75 V/V). Belső standard oldat. 0,250 g R 2,6-dimetilanilint az oldószereleggyel 50,0 ml-re oldunk. Az oldat 0,5 ml-ét az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Vizsgálati oldat. 0,1 g vizsgálandó anyagot 20 ml-es üvegcsébe mérünk, 10,0 ml oldószerelegyet adunk hozzá, majd szorosan lezárjuk az üvegcsét, és 3,5 órára ultrahangos fürdőbe helyezzük. Ezután hagyjuk szobahőmérsékletűre lehűlni. Az oldat 1,0 ml-éhez 0,8 ml belső standard oldatot elegyítünk. Összehasonlító oldat. 0,250 g R 2-klóretanolt R vízzel 50,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-éhez 0,8 ml belső standard oldatot elegyítünk. Előtétoszlop: –

anyaga: kvarcüveg;

–

méretei: 10 m, Ø = 0,53 mm;

Amyla hydroxyethyla

–


állófázis: R polárisan dezaktivált polietilénglikol.

Oszlop: –

anyaga: kvarcüveg;

–

méretei: 30 m, Ø = 0,32 mm;

–

állófázis: R makrogol 20 000 (filmvastagság 0,25 μm).

Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hidrogén. Áramlási sebesség: 2,9 ml/perc. Mintaáram-elosztás program: Idő (perc)

Mintaáram-elosztás

Mintaáram-elosztás arány

kezdeti

be

1:20

0,01

ki

1:20

0,50

be

1:20

Hőmérséklet: Idő (perc)

Oszlop


0–4

45

4 – 23,5

45 → 240

23,5 – 28,5

240

Injektor

250

Detektor

270

Detektálás: lángionizációval. Injektálás: 1 μl. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: –

jel-zaj viszony: legalább 10, a 2-klóretanol csúcsára vonatkoztatva;

–

ismételhetőség: 6 injektálás után a maximális szórás 10,0%.

Követelmény: –

2-klóretanol: az összehasonlító oldat kromatogramja alapján kiszámoljuk a 2-klóretanol csúcsterületének a belső standard csúcsterületéhez viszonyított arányát (R); a vizsgálati oldat kromatogramja alapján is kiszámoljuk a 2-klóretanol csúcsterületének a belső standard csúcsterületéhez viszonyított arányát; ez az arány nem lehet nagyobb, mint R (5 ppm).

Etilén-oxid. Gőztér-gázkromatográfia (2.2.28). Vizsgálati oldat. 1,0 g vizsgálandó anyagot 1,0 ml R vízben oldunk. Az üvegcsét szorosan lezárjuk. Párhuzamosan két vizsgálati oldatot készítünk. Összehasonlító törzsoldat. 80 ml R vizet 100 ml-es mérőlombikban 4 °C-ra hűtünk. Legalább 30 percig tartó hűtés után a lombikot analitikai mérlegre helyezzük, és lassan 1,0 g R etilén-oxidot vezetünk bele. Differenciál-tömegméréssel pontosan meghatározzuk az etilénoxid mennyiségét, majd R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk az oldatot. Hűtőben tároljuk, és 4 héten belül felhasználjuk.

Amyla hydroxyethyla


Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml összehasonlító törzsoldatot R vízzel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. 24 órán belül felhasználjuk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 g vizsgálandó anyagot az a) összehasonlító oldat 1,0 ml-ében oldunk. Az üvegcsét szorosan lezárjuk. Párhuzamosan két oldatot készítünk. Oszlop: –

anyaga: kvarc;

–

méretei: l = 30 m, Ø = 0,32 mm;

–

állófázis: R poli[(cianopropil)(fenil)][dimetil]sziloxán (filmvastagság 1,5 μm).

Vivőgáz: 110,3 kPa nyomású, R kromatográfiás célra szánt hélium. Mintaáram-elosztási arány: 1:35. A statikus gőztér-gázkromatográfia javasolt körülményei: –

egyensúlyi hőmérséklet: 80 °C;

–

egyensúlybeállítás időtartama: 40 perc;

–

átvezetőcső hőmérséklete: 150 °C;

–

a nyomás alá helyezés időtartama: 2,0 perc;

–

injektálás időtartama: 3 másodperc.

Hőmérséklet:

Oszlop

Idő (perc)


0 – 20

40

20 – 30

40 → 240

30 – 40

240

Injektor

140

Detektor

250

Detektálás: lángionizációval. Injektálás: a vizsgálati oldat és a b) összehasonlító oldat gőzteréből megfelelő térfogatot injektálunk. Rendszeralkalmasság: –

jel-zaj viszony: legalább 10, a b) összehasonlító oldat kromatogramján az etilén-oxid csúcsára számolva.

Követelmény: –

etilén-oxid: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján a megfelelő csúcs területének 0,5-szerese (1 ppm).

Nátrium-klorid: legfeljebb 0,1%. Vizsgálati oldat. 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban 10,0 g vizsgálandó anyagot 100 ml R vízben oldunk. Az oldathoz R hígított salétromsav 2 ml-ét és R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatának 5,0 ml-ét elegyítjük. Összehasonlító oldat. 250 ml-es Erlenmeyer-lombikban R nátrium-klorid 9 g/l töménységű oldatának 5,0 ml-ét 100 ml R vízzel hígítjuk. Az oldathoz 2 ml R hígított salétromsavat elegyítünk.

Amyla hydroxyethyla


Az oldatot 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldattal potenciometriásan titráljuk (2.2.20). A nátrium-klorid százalékos mennyiségét a következő kifejezés alapján számoljuk ki:

(n1 − n2 ) ⋅ 5,844 ⋅ 100 , m ahol n1 =

a vizsgálati oldatra fogyott 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldat térfogata ml-ben;

n2 =

az összehasonlító oldatra fogyott 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldat térfogata ml-ben;

m =

a vizsgálandó anyag tömege a vizsgálati oldatban, mg-ban.

Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 10 ppm. Az anyag 2 g-ját R vízzel 20 ml-re oldjuk. Az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot R ólom−mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 15,0%. Az anyag 1,000 g-ját 105 °C-on szárítjuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 2,5 NE/g. Mikrobiológiai szennyeződés. TAMC: elfogadási kritérium 102 CFU/g (2.6.12). FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni az átlagos molekulatömeget, a moláris szubsztitúciót és a C2/C6 arányt (névleges értékek).

01/2011:2405

AMYLMETACRESOLUM Amilmetakrezol

C12H18O [1300-94-3]

Mr 178,3

DEFINÍCIÓ 5-Metil-2-pentilfenol. Tartalom: 98,0–102,0%. SAJÁTSÁGOK Küllem: tiszta vagy csaknem tiszta folyadék vagy szilárd, kristályos tömeg. A frissen előállított anyag színtelen vagy enyhén sárga színű. Tárolás folyamán megsötétedik és/vagy elszíneződik: sötétsárga, barnássárga vagy rózsaszínű lesz. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; acetonban és etanolban (96%) igen bőségesen oldódik. Kb. 22 °C-on megszilárdul. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Mintakészítés: két R kálium-bromid lemez között filmet képezünk. Összehasonlítás: CRS amilmetakrezollal.

VIZSGÁLAT OK Rokon vegyületek. Gázkromatográfia (2.2.28): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Belső standard oldat. 0,100 g R butil-hidroxitoluolt R 2-propanollal 10,0 ml-re oldunk. Vizsgálati oldat (a). 0,1000 g vizsgálandó anyagot R 2-propanollal 10,0 ml-re oldunk. Vizsgálati oldat (b). 2,0 ml a) vizsgálati oldat és 2,0 ml belső standard oldat elegyét R 2-propanollal 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). 10 mg R m-krezolt (B-szennyező) és 10 mg R pkrezolt (D-szennyező) R 2-propanollal 100,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). Egy üvegcse CRS csúcsazonosításra szánt amilmetakrezolt (amely A- G- és K-szennyezőt is tartalmaz) 1,0 ml R 2propanolban oldunk. Összehasonlító oldat (c). 0,1000 g CRS amilmetakrezolt R 2-propanollal 10,0 ml-re oldunk. Az oldat 2,0 ml-éhez 2,0 ml belső standard oldatot elegyítünk, és az elegyet R 2-propanollal 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (d). 1,0 ml a) vizsgálati oldatot R 2-propanollal 100,0 mlre hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R 2-propanollal 20,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: − anyaga: kvarcüveg; − méretei: l = 30 m, Ø = 0,25 mm; − állófázis: R makrogol 20 000 (filmvastagság 0,5 μm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hélium. Lineáris sebesség: 33 cm/másodperc. Mintaáram-elosztási arány: 1:30. Hőmérséklet:

Oszlop

Idő (perc) 0 – 17,5

Hőmérséklet (°C) 100 → 240

17,5 – 32,5

240

Injektor

250

Detektor

250

Detektálás: lángionozációval. Injektálás: 1,0 μl; a) vizsgálati oldat, valamint a), b) és d) összehasonlító oldat. Szennyezők azonosítása: az A-, a G- és a K-szennyező azonosítására a CRS csúcsazonosításra szánt amilmetakrezolhoz mellékelt kromatogramot és a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók az amilmetakrezolra (retenciós ideje kb. 16 perc) vonatkoztatva: G-szennyező (1. diasztereomer) kb. 0,51; G-szennyező (2. diasztereomer) kb. 0,53; D-szennyező kb. 0,77; B-szennyező kb. 0,78; Kszennyező kb. 0,95; A-szennyező kb. 0,99. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: − csúcsfelbontás: legalább 1,5, a D- és a B-szennyező között. Követelmények: − A-szennyező: legfeljebb 0,6%; − G-szennyező (a két diasztereomer összesen) és K-szennyező: egyenként legfeljebb 0,15%; − egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: egyenként legfeljebb 0,10%; − összes szennyező: legfeljebb 1,0%; − elhanyagolási határ: az amilmetakrezol csúcsterülete a d) összehasonlító oldat kromatogramján (0,05%) Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS

Gázkromatográfia (2.2.28) a "Rokon vegyületek" vizsgálat előírása szerint, a következő módosítással. Injektálás: 1,0 μl; b) vizsgálati oldat és c) összehasonlító oldat. A százalékos C12H18O-tartalmat a CRS amilmetakrezol deklarált tartalma alapján számoljuk ki. ELTARTÁS Légmentesen záró, nemfém tartályban, fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, G, K. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): B, C, D, E, F, H, I, J.

A. 4-metil-2-pentilfenol,

B. 3-metilfenol (m-krezol),

és enantiomere

C. 5-metil-2-[(2RS)-2-metilbutil]fenol,

D. 4-metilfenol (p-krezol),

E. 1-(2-hidroxi-4-metilfenil)pentán-1-on,

F. 1-(2-hidroxi-5-metilfenil)pentán-1-on,

G. 5-metil-2-pentilciklohexanon,

H. etil-pentanoát,

I. 3-metilfenil-pentanoát,

J. 4-metilfenil-pentanoát, K. ismeretlen szennyező.

Amylum hydroxypropylum


01/2011:2165

AMYLUM HYDROXYPROPYLUM Hidroxipropil-keményítő [9049-76-7] DEFINÍCIÓ A hidroxipropil-keményítő a Kukoricakeményítő (0344), a Burgonyakeményítő (0355), a maniókakeményítő, a Rizskeményítő (0349), illetve a Borsókeményítő (2403) részlegesen szubsztituált 2hidroxipropilétere; a keményítő éteresítésére propilén-oxidot alkalmaznak. Az így nyert, kémiailag módosított keményítőt savakkal vagy enzimekkel esetenként részlegesen hidrolizálják, annak érdekében, hogy csökkent viszkozitású, „hígított keményítőt” nyerjenek. A botanikailag különböző eredetű hidroxipropil-keményítők tulajdonságai a speciális gyógyszerészeti felhasználás szempontjából nem feltétlenül azonosak. Ezért a különböző típusú hidroxipropilkeményítőket nem szabad egymással felcserélni, csak abban az esetben, ha a felhasználhatóság egyenértékű volta bizonyított, és az illetékes hatóság is hozzájárult ehhez. A különböző botanikai eredetű keményítőket a kémiai módosítást megelőzően tilos keverni. ELŐÁLLÍTÁS A hidroxipropil-keményítőt az élelmiszeradalékokra vonatkozó európai jogszabályi követelményeknek megfelelően kell előállítani. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy kissé sárgás por. Oldékonyság: hideg vízben és etanolban (96%) gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS A. Az anyag, mikroszkóp alatt legalább 20-szoros nagyítással, R glicerin és R víz egyenlő térfogatarányú elegyében vizsgálva, botanikai eredetétől függően a következő sajátságokat mutatja: –

Kukorica alapú hidroxipropil-keményítő: sokszögletű, különböző nagyságú, 2–23 µm átmérőjű, illetve gömbölyű vagy kerekded, különböző nagyságú, 25–35 µm átmérőjű szemcsék figyelhetők meg. A lerakódási központban jól látható mélyedés vagy 2–5 sugarú hasíték jelenik meg, koncentrikus rétegezettség nem figyelhető meg. Keresztezett polarizáló lemezek vagy prizmák között vizsgálva, a keményítőszemcséken fekete kioltási kereszt jelenik meg, melynek szárai a szemcsék lerakódási centrumában metszik egymást.

–– Burgonya alapú hidroxipropil-keményítő: szabálytalan alakú, tojásdad vagy körte formájú, általában 30–100 µm átmérőjű szemcsék figyelhetők meg, de ritkán 100 µm feletti, illetve kerekded, 10–35 µm átmérőjű szemcsék is előfordulnak. Néha 2–4 részszemcséből álló összetett szemcsék is láthatók. A tojásdad és körte alakú szemcsék lerakódási központja



excentrikusan, a kerekded szemcséké centrálisan, vagy enyhén excentrikusan helyezkedik el. Minden szemcse jól láthatóan koncentrikus rétegezettséget mutat. Keresztezett polarizáló lemezek vagy prizmák között vizsgálva, a keményítőszemcséken fekete kioltási kereszt jelenik meg, melynek szárai a szemcsék lerakódási centrumában metszik egymást. –

Manióka alapú hidroximetil-keményítő: egyik oldalán csonka, jellemzően 3–35 µm átmérőjű, gömbszerű szemcsék, melyeken körkörös, vagy többsugaras, koncentrikusan elhelyezkedő hasíték látható. Néhány szemcse tojásdad, vagy süveg alakú. A lerakódási centrum koncentrikus, néha kissé repedezett. Keresztezett polarizáló lemezek vagy prizmák között vizsgálva, a keményítőszemcséken fekete kioltási kereszt látható, melynek szárai a lerakódási centrumban metszik egymást.

–

Rizs alapú hidroximetil-keményítő: sokszögletű, 1–10 µm-es, de többnyire 4–6 µm méretű magányos szemcsék figyelhetők meg, melyek gyakran tojásdad, 50–100 µm átmérőjű csoportokká állnak össze. A szemcsék lerakódási központja gyengén látható, koncentrikus rétegezettség nem figyelhető meg. Keresztezett polarizáló lemezek vagy prizmák között vizsgálva, a keményítőszemcséken fekete kioltási kereszt látható, melynek szárai a lerakódási centrumban metszik egymást.

–

Borsó alapú hidroximetil-keményítő: benne túlnyomórészt nagy, 25–45 µm-es, elliptikus keményítőszemek figyelhetők meg, melyek olykor szabálytalanok vagy vese alakúak. Ritkábban láthatók még kisebb, 5–8 µm méretű kerekded szemcsék is. Ezeken esetenként repedések, egyéb szabálytalanságok, valamint halvány koncentrikus rétegzettség is megfigyelhető. Ritkán a főtengelyük mentén hasíték látható. Keresztezett polarizáló lemezek vagy prizmák között vizsgálva, a keményítőszemeken jól látható fekete kioltási kereszt jelenik meg.

B. 1 g anyagot 50 ml R vízben szuszpendálunk; a szuszpenziót 1 percig forraljuk, majd lehűtjük. Áttetsző vagy tiszta nyák képződik. C. A B. pont szerinti azonosítás során kapott nyák 1 ml-éhez 0,05 ml R1 jód–oldatot elegyítünk. Narancsvörös vagy sötétkék színeződés keletkezik, amely melegítésre eltűnik. D. 0,1 g anyagot 1000 ml-es mérőlombikba mérünk, és 12,5 ml R hígított kénsavat adunk hozzá. A lombikot vízfürdőbe merítjük, és a minta feloldódásáig melegítjük. Ezután lehűtjük, és az oldatot R vízzel 100 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1 ml-ét 25 ml-es, beosztásokkal ellátott, üvegdugós kémcsőbe mérjük, és miután a kémcsövet hideg vízbe merítettük, cseppenként 8 ml R tömény kénsavat adagolunk az oldathoz. Gondos elegyítés után a kémcsövet pontosan 3 percre forrásban lévő vízfürdőbe merítjük, majd haladéktalanul jeges fürdőbe helyezzük, és mindaddig ott tartjuk, amíg az oldat le nem hűl. Ezután – a kémcső falán óvatosan lefolyatva – R2 ninhidrin–oldat 0,6 ml-ét mérjük hozzá, majd a kémcsövet azonnal alaposan összerázzuk, és 25 °C-os vízfürdőbe helyezzük. 100 perc elteltével az oldatot R tömény kénsavval 25 ml-re hígítjuk; a jó keveredést a kémcső többszöri megfordításával biztosítjuk, de nem rázzuk. 5 percen belül ibolya színeződés keletkezik. VIZSGÁLATOK pH (2.2.3): 4,5–8,0. 5,0 g anyagot 25,0 ml R szén-dioxid-mentes vízzel 60 másodpercig rázogatunk. A szuszpenziót 15 percig állni hagyjuk. Idegen anyagok. Az anyagot mikroszkóp alatt, R glicerin és R víz azonos térfogatarányú elegyében vizsgáljuk. A keményítőszemcséken kívül más anyag legfeljebb nyomokban lehet jelen.



Hidroxipropil-csoportok. Mágneses magrezonancia spektroszkópia (2.2.33). Belső standard oldat. 50,0 mg R 3-trimetilszilil-1-propánszulfonsav–nátriumsót 0,1 mg pontossággal mért, kb. 5 g R1 deutérium-oxidban oldunk. Az oldatot leforrasztott üvegcsében tároljuk. Vizsgálati oldat. 20 g vizsgálandó anyagot 200,0 ml R szén-dioxid-mentes vízben szobahőmérsékleten diszpergálunk. A keveréket 15 percen át rázatjuk, majd megszűrjük. E műveletet kétszer megismételjük. Kis mértékű diszpergálhatóság és lassú szűrés esetén a mosási művelethez hűtött R szén-dioxid-mentes vizet használunk. A mosott keményítőt legalább 4 órán át szárítószekrényben, csökkentett nyomáson, 30±5 °C-on szárítjuk. A „Szárítási veszteség” vizsgálat eredménye alapján kiszámoljuk az így mosott és szárított minta 5 g-jának nedvességtartalmát (W). A mosott és szárított minta 12,0 mg-ját (száraz bázis) 5 mm-es NMR-csőbe mérjük, 0,75 ml R1 deutérium-oxidot és 0,1 ml R deutérium-klorid–oldatot adunk hozzá, lefedjük, tartalmát összekeverjük, és forrásban lévő vízfürdőbe merítjük. Miután az oldat feltisztult (3–60 perc) szobahőmérsékletűre hagyjuk lehűlni. A csövet – miután a külsejét leszárítottuk – 0,1 mg pontossággal lemérjük, majd 0,05 ml belső standard oldat hozzáadása után 0,1 mg pontossággal ismét lemérjük. Kiszámoljuk a hozzáadott belső standard oldat tömegét. Az elegyet gondosan összekeverjük. Készülék: legalább 300 MHz-es FT-NMR spektrométer. A 1H NMR spektrumok felvétele. A következő paraméterekkel dolgozhatunk: –

spektrális szélesség: 8 ppm (–1,0 és 7 ppm között),

–

besugárzási frekvencia: nincs,

–

időtartomány: legalább 64 K,

–

pulzusszélesség: 90°,

–

pulzuskésleltetés: 10 s,

–

próbafelvételek száma: 0,

–

felvételek száma: 8.

Referenciaként a belső standard CH3-jelét használjuk. A multiplett középső jelének kémiai eltolódását 0 ppm-re állítjuk. A FID jelet rögzítjük. A fázis- és az alapvonal-korrekció után –0,5 és 6 ppm között integráljuk a csúcsterületeket. Megmérjük a hidroxipropil-csoportok metil-csoportjaitól származó dublett területét +1,2 ppm-nél (A2) és a belső standard metilcsoportjaitól származó jelek területét 0 ppm-nél (A1), a 13C-szatelitek nélkül. A hidroxipropil-csoport metilcsoportjának 3 protonjának jelét mérjük. A következő képlet alapján meghatározzuk a hidroxipropil-csoportok arányát %m/m-ban (szárított anyagra):

3 A2 W1 ⋅ m1 100 100 ⋅ ⋅ 59 ⋅ ⋅ , A1 218 m 100 − W ahol: 3

= a belső standard 3 metilcsoportját jelző szám,

A1

= a belső standard metilcsoportjainak csúcsterülete,

A2

= a hidroxipropil-csoport metilcsoportjának csúcsterülete,

W1 = a belső standard tömege a belső standard oldatban (mg/g), m1 = a belső standard oldat tömege az NMR-csőben (g), 218 = a belső standard móltömege (g/mól),



59 = a hidroxipropil-csoport móltömege (g/mól), m

= a mosott és szárított vizsgálati minta tömege az NMR-csőben (mg),

W

= nedvességtartalom (%m/m).

Követelmény: –

hidroxipropil-csoportok: legfeljebb 7,0%.

Oxidáló anyagok (2.5.30) legfeljebb 20 ppm, H2O2-ban kifejezve. Kén-dioxid (2.5.29): legfeljebb 50 ppm. Vas (2.4.9). –

Kukoricából, burgonyából, maniókából, illetve rizsből nyert hidroxipropil-keményítőben: legfeljebb 20 ppm. 1,0 g anyagot 20 ml R hígított sósavval összerázunk. A keveréket megszűrjük, és a szüredéket vizsgáljuk.

–

Borsóból nyert hidroxipropil-keményítőben legfeljebb: 50 ppm. 1,0 g anyagot 50 ml R hígított sósavval összerázunk. A keveréket megszűrjük, és a szüredéket vizsgáljuk.

Szárítási veszteség (2.2.32): az anyag 1,000 g-ját 90 percen át 130 °C-os szárítószekrényben szárítjuk: –

kukoricából, maniókából, rizsből, illetve borsóból nyert hidroxipropil-keményítő esetében: legfeljebb 15,0%;

–

burgonyából nyert hidroxipropil-keményítőben: legfeljebb 20,0%.

Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,6%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. Mikrobiológiai szennyeződés TAMC: elfogadási követelmény: 103 CFU/g (2.6.12). TYMC: elfogadási követelmény: 102 CFU/g (2.6.12). Escherichia coli: nem lehet jelen (2.6.13). Salmonella: nem lehet jelen (2.6.13). FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni a keményítő botanikai eredetét és a módosítás típusát.

Argon


07/2010:2407

ARGON Argon Ar [7440-37-1]

Ar 39,95

DEFINÍCIÓ A gázt a környező levegőből nyerik frakcionált desztillálással. Tartalom: legalább 99,995 %V/V Ar. A tartalmat a szennyezésvizsgálatok és a víztartalom-meghatározás eredményei alapján, az összes szennyező figyelembevételével számoljuk ki. E cikkely tárgya a gyógyászati célra szánt argon. SAJÁTSÁGOK Küllem: színtelen gáz. Oldékonyság: 20 °C-on és 101 kPa nyomáson 1 térfogatrész gáz kb. 29 térfogatrész vízben oldódik. AZONOSÍTÁS A. Paramágneses analizátor alkalmazásával (2.5.27) igazolni kell, hogy a gáz nem oxigén. B. Gázkromatográfia (2.2.28). Vizsgálandó gáz. A vizsgálandó anyag. Összehasonlító gáz. R1 metán (5 ppm V/V), R1 nitrogén (5 ppm V/V) és R oxigén (5 ppm V/V) keverékét tartalmazó R1 argon. Oszlop: – anyaga: rozsdamentes acél; – méretei: l = 2 m, Ø = 3 mm; – állófázis: R kromatográfiás célra szánt molekulaszita (részecskeméret 150–180 μm, pórusméret 0,5 nm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hélium.

Argon


Áramlási sebesség: 10 ml/perc. Hőmérséklet: – oszlop: 50 °C; – detektor: 150 °C. Detektálás: hővezetőképességi detektorral. Injektálás: 25 μl. Rendszeralkalmasság: összehasonlító gáz: – csúcsfelbontás: legalább 3,0, az argon/oxigén és a nitrogén között, és legalább 2,0, a nitrogén és a metán között. Értékelés: a vizsgálandó gáz kromatogramján látható főcsúcs – retenciós idejét tekintve – egyezzék meg az összehasonlító gáz kromatogramján látható főcsúccsal. VIZSGÁLATOK Szennyezők. Gázkromatográfia (2.2.28). Vizsgálandó gáz. A vizsgálandó anyag. Összehasonlító gáz. R1 metán (5 ppm V/V), R1 nitrogén (5 ppm V/V) és R oxigén (5 ppm V/V) keverékét tartalmazó R1 argon. Oszlop: –

anyaga: rozsdamentes acél;

–

méretei: l = 4 m, Ø = 4 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt molekulaszita (részecskeméret 150–180μm, pórusméret 0,5 nm).

Vivőgáz: R1 argon. Áramlási sebesség: 70 ml/perc. Hőmérséklet: –

oszlop: 80 °C;

–

detektor: 40 °C.

Detektálás: kisülési ionizációval. Injektálás: 1 ml. Mintavételezési sebesség: 100 ml/perc. Relatív retenciók a C-szennyezőre (retenciós ideje kb. 4,7 perc) vonatkoztatva: A-szennyező kb. 0,4; B-szennyező kb. 0,7.

Argon


Rendszeralkalmasság: összehasonlító gáz: –

csúcsfelbontás: legalább 3,0, az A- és a B-szennyező között, és legalább 2,0, a B- és a C-szennyező között.


A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az összehasonlító gáz kromatogramján a megfelelő csúcs területe (5,0 ppm V/V);

–

szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az összes csúcs területösszegének 0,0040%-a (40 ppm V/V).

Víztartalom (2.5.28): legfeljebb 10,0 ppm V/V. A vizsgálatot elektrolitikus higrométerrel végezzük. ELTARTÁS Gáz vagy folyékony halmazállapotban, megfelelő tartályban, a törvényes rendelkezéseknek megfelelően. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A,D. Egyéb kimutatható szennyezők: B, C. A. oxigén, B. nitrogén, C. metán, D. víz.

01/2011:2408

CARBONEI MONOXIDUM Szén-monoxid CO [630-08-0]

Mr 28,00

DEFINÍCIÓ A szén-monoxidot szénhidrogénekből és vízgőzből állítják elő katalitikus oxidációval. Tartalom: legalább 99,5 %V/V CO. E cikkely tárgya a gyógyászati célra szánt szén-monoxid. SAJÁTSÁGOK Küllem: színtelen, gyúlékony gáz. Oldékonyság: 20 °C-on és 101 kPa nyomáson 2,266 térfogat szén-monoxid 100 térfogatrész vízben oldódik. AZONOSÍTÁS Az azonosítást az A. vagy a B pont szerint végezzük. A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: a szén-monoxid Ph. Eur. referenciaspektrumával. B. Az anyag megfelel a "Tartalmi meghatározás" követelményeinek. VIZSGÁLATOK Szén-dioxid. Gázkromatográfia (2.2.28). Vizsgálandó gáz. A vizsgálandó anyag.

Összehasonlító gáz. 300 ppm V/V R1 szén-dioxidot tartalmazó R szén-monoxid. Oszlop: − anyaga: rozsdamentes acél; − méretei: l = 2 m, Ø = 2 mm; − állófázis: megfelelő divinilbenzol polimer, porózus (149-177 μm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt hélium. Áramlási sebesség: 30 ml/perc. Hőmérséklet: − oszlop: 50 °C; − detektor: 220 °C. Detektálás: hővezetőképesség méréssel. Injektálás: 1 ml. Kromatografálási idő: 3 perc. Relatív retenció szén-monoxidra (retenciós ideje kb. 0,4 perc) vonatkoztatva: szén-dioxid kb. 3,5. Követelmény: − szén-dioxid: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a megfelelő csúcs területe az összehasonlító gáz kromatogramján (300 ppm V/V). Metán. Gázkromatográfia (2.2.28). Vizsgálandó gáz. A vizsgálandó anyag. Összehasonlító gáz. 100 ppm V/V R metánt tartalmazó R szén-monoxid. Oszlop: − anyaga: rozsdamentes acél; − méretei: l = 2 m, Ø = 4 mm;

− állófázis: R etilvinilbenzol–divinilbenzol-kopolimer (177-250 μm). Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt nitrogén. Áramlási sebesség: 10 ml/perc. Hőmérséklet: − oszlop: 95 °C; − detektor: 240 °C. Detektálás: lángionizációval. Injektálás: 1 ml. Kromatografálási idő: 3 perc. Retenciós idő: metán: kb. 1,8 perc. Követelmény: − metán: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a megfelelő csúcs területe az összehasonlító gáz kromatogramján (100 ppm V/V). Hidrogén. Gázkromatográfia (2.2.28). Vizsgálandó gáz. A vizsgálandó anyag. Összehasonlító gáz. 300 ppm V/V R kromatográfiás célra szánt hidrogént tartalmazó R szén-monoxid. Oszlop: − anyaga: rozsdamentes acél; − méretei: l = 2 m, Ø = 2 mm; − állófázis: kromatográfiás célra szánt molekulaszita (149-177 μm); névleges pórusmérete 0,5 nm. Vivőgáz: R kromatográfiás célra szánt argon. Áramlási sebesség: 30 ml/perc. Hőmérséklet:

− oszlop: 100 °C; − detektor: 160 °C. Detektálás: hővezetőképesség méréssel. Injektálás: 1 ml. Kromatografálási idő: 4 perc. Relatív retenció szén-monoxidra (retenciós ideje kb. 2,3 perc) vonatkoztatva: hidrogén kb. 0,4. Követelmény: − hidrogén: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a megfelelő csúcs területe az összehasonlító gáz kromatogramján (300 ppm V/V). Nikkel-tetrakarbonil és vas-pentakarbonil: kimutatható mennyiség nem lehet jelen; 0,1 ppm V/V kimutatási határral rendelkező detektorcsövet alkalmazunk (2.1.6). Víztartalom (2.5.28): legfeljebb 10 ppm V/V; elektrolitikus higrométert alkalmazunk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Infravörös analizátor (2.5.25). Vizsgálandó gáz. A vizsgálandó anyag, amelyet – a szórt fény kiküszöbölése érdekében – előzetesen megszűrünk. Összehasonlító gáz (a). R szén-monoxid. Összehasonlító gáz (b). 95,0 %V/V R szén-monoxid és 5,0 %V/V R1 nitrogén elegye. A készüléket kalibráljuk; az érzékenységet az a) és a b) összehasonlító gázzal állítjuk be. Mérjük a vizsgálandó gáz szén-monoxid-tartalmát. ELTARTÁS Alkalmas tartályban, nyomás alatt, a törvényi szabályozásoknak megfelelően.

SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C, D, E, F. A. CO2: szén-dioxid, B. CH4: metán, C. H2: hidrogén, D. Ni(CO)4: nikkel-tetrakarbonil, E. Fe(CO)5: vas-pentakarbonil, F. H2O: víz.

04/2010:2360 javított 7.0

CARMELLOSUM Karmellóz DEFINÍCIÓ A cellulóz poli-karboximetil-étere. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, nedvszívó por. Oldékonyság: vízmentes etanolban gyakorlatilag nem oldódik. Vízben megduzzad, szuszpenziót képez; 1 M nátrium-hidroxid–oldatban viszkózussá válik. AZONOSÍTÁS A. pH (2.2.3): 3,5–5,0. 1,0 g anyagot 100 ml R vízben szuszpendálunk. B. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS karmellózzal. VIZSGÁLATOK Klorid: legfeljebb 0,36%. 0,8 g karmellózt 50 ml R vízzel összerázunk; 10 ml 1 M nátrium-hidroxid– mérőoldat hozzáadásával oldjuk az anyagot, majd az oldatot R vízzel 100 ml-re hígítjuk. Az így kapott oldat 20 ml-es részletét 10 ml R hígított salétromsavval elegyítjük, és az elegyet pelyhes csapadék leválásáig vízfürdőn melegítjük. Lehűtés után centrifugáljuk, és a felülúszó folyadékot elkülönítjük. A csapadékot 3×10 ml R vízzel mossuk, közben centrifugálva az egyes mosófolyadékrészleteket. A mosófolyadékokkal egyesített felülúszót R vízzel 100 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 25 ml-ét 6 ml R hígított salétromsav hozzáadása után R vízzel 50 ml-re hígítjuk (vizsgálati oldat). Az összehasonlító oldatot 0,40 ml 0,01 M sósav–mérőoldattal készítjük. Mind a vizsgálati oldathoz, mind az összehasonlító oldathoz 1 ml R2 ezüst-nitrát–oldatot elegyítünk. Az oldatokat fénytől védett helyre tesszük; 5 perc elteltével a vizsgálati oldat opaleszcenciája nem lehet erősebb, mint az összehasonlító oldaté.

Szulfát: legfeljebb 0,72%. 0,40 g karmellózt 25 ml R vízzel összerázunk; 5 ml 1 M nátrium-hidroxid– mérőoldat hozzáadásával oldjuk az anyagot, majd 20 ml R vizet adunk hozzá. Az így kapott oldatot 2,5 ml R tömény sósavval pelyhes csapadék leválásáig vízfürdőben melegítjük. Lehűtés után centrifugáljuk, és a felülúszó folyadékot elkülönítjük. A csapadékot 3×10 ml R vízzel mossuk, közben centrifugálva az egyes mosófolyadékrészleteket. A mosófolyadékokkal egyesített felülúszót R vízzel 100 ml-re hígítjuk, majd megszűrjük, elöntve a szüredék első 5 ml-ét. A szüredék 25 ml-ét 1 ml R hígított sósav hozzáadása után R vízzel 50 ml-re hígítjuk (vizsgálati oldat). Az összehasonlító oldatot 1,5 ml 0,005 M kénsavval készítjük. Mind a vizsgálati oldathoz, mind az összehasonlító oldathoz R bárium-klorid 120 g/l töménységű oldatának 2 ml-ét elegyítjük. 10 perc elteltével a vizsgálati oldatban észlelt fehér zavarosság nem lehet erősebb, mint az összehasonlító oldatban. Nehézfémek (2.4.8): legfeljebb 20 ppm. Az anyag 1,0 g-ját kvarc vagy porcelán tégelybe mérjük. A tégelyt lazán lefedjük, és az anyagot kíméletes hevítéssel elszenesítjük. Ezután lehűtjük, 2 ml R tömény salétromsavat és 5 csepp R tömény kénsavat adunk hozzá, és óvatosan hevítjük, mindaddig, amíg már nem fejlődik fehér füst, majd 500– 600 °C-on izzítva, elhamvasztjuk. A lehűtött maradékot 2 ml R tömény sósavval vízfürdőn szárazra párologtatjuk. Az így kapott maradékot 3 csepp R tömény sósavval megnedvesítjük, 10 ml forró R vizet adunk hozzá, és 2 percig melegítjük, majd 1 csepp R1 fenolftalein–oldat hozzáadása után halvány rózsaszínig R1 hígított ammónia–oldatot csepegtetünk hozzá. Ezután az oldatot 2 ml R hígított ecetsavval elegyítjük; ha szükséges, megszűrjük és 10 ml R vízzel mossuk. A szüredéket és a mosófolyadékot kémcsőben egyesítjük, és R vízzel 50 ml-re hígítjuk (vizsgálati oldat). Az összehasonlító oldat készítése: 2 ml R tömény salétromsav, 5 csepp R tömény kénsav és 2 ml R tömény sósav elegyét vízfürdőn elpárologtatjuk, majd homokfürdőn beszárítjuk. A maradékot 3 csepp R tömény sósavval megnedvesítjük. A továbbiakban a vizsgálati oldat készítésére előírtak szerint járunk el, végül 2,0 ml R ólom−mértékoldat (10 ppm Pb) hozzáadása után R vízzel 50 ml-re hígítjuk. Mind a vizsgálati oldathoz, mind az összehasonlító oldathoz 0,1 ml R1 nátrium-szulfid–oldatot elegyítünk; 5 perc elteltével a vizsgálati oldat színe nem lehet erősebb, mint az összehasonlító oldaté. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 8,0%. Az anyag 1,000 g-ját 4 órán át 105 °C-os szárítószekrényben szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 1,5%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban.

Carrageenanum


01/2011:2138

CARRAGEENANUM Karragenán

DEFINÍCIÓ A karragenánok a Rhodophyceae osztályba tartozó növényekből forró vízzel vagy alkálilúgokkal kivont poliszacharidok. A karragenánt alkoholos vagy kálium-kloridos kicsapással, gélsajtolással, dobszárításos, illetve fagyasztásos eljárással különítik el. Az elkülönítéshez és a tisztításhoz felhasznált alkohol általában 2-propanol. Az anyag fő alkotórészei D-galaktózt és 3,6-anhidro-D-galaktózt tartalmazó kopolimerek kénsavésztereinek kálium-, nátrium-, kalcium- vagy magnéziumsói, amelyek a polimer biológiai eredetétől függően különböző arányokban fordulnak elő. A leggyakoribb kopolimer-típusokat κ-, ι- és λ-karragenánként jelölik. SAJÁTSÁGOK Küllem: sárgás vagy barnás színű, illetve fehér vagy csaknem fehér por. Oldékonyság: vízben oldódik, miközben viszkózus vagy kolloid oldatot képez; szerves oldószerekben nem oldódik. AZONOSÍTÁS A. 20 g/l töménységű diszperzót készítünk, és a keveréket 80 °C-os vízfürdőben melegítjük (A-oldat). Az oldatot lehűlésig állni hagyjuk; lehűlés folyamán az oldat viszkozitása növekszik, és gél is keletkezhet belőle. A még meleg A-oldat 10 ml-éhez R kálium-klorid 100 g/l töménységű oldatából 4 cseppet elegyítünk, majd az oldatot hagyjuk lehűlni. Merev gél keletkezése azt jelzi, hogy az anyag túlnyomó része κtípusú karragenán, míg elasztikus gél képződése túlnyomóan ι-típusú karragenánt jelez. Amennyiben az oldatból nem keletkezik gél, a karragenán főként λ-típusból áll. B. 1 térfogatrész A-oldatot kb. 4 térfogatrész R vízzel hígítunk, és az oldathoz R metilénkék R etanollal (96%) készített, 0,5 g/l töménységű oldatának 2−3 cseppjét elegyítjük. Kék csapadék keletkezik. C. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Mintakészítés: a vizsgálandó anyagból 2 g/l töménységű oldatot készítünk, majd alkalmas, nem tapadó felületen filmeket képezünk (a filmvastagság száraz állapotban 5 µm). A karragenán a poliszacharidokra jellemző 1000−1100 cm−1 tartományban intenzív, széles abszorpciós sávokat mutat. A gélesedő típusokra az 1065 cm−1-en, a nem-gélesedő típusokra az 1020 cm−1 -en megjelenő abszorpciós maximumok jellemzőek. Az egyéb jellemző abszorpciós sávokat és azoknak az 1050 cm−1-en mért abszorbanciájára vonatkoztatott relatív intenzitását a 2138.1. táblázat tünteti fel.

Carrageenanum


2138.-1- táblázat – Jellemző sávok a karragenán infravörös abszorpciós spektrofotometriás azonosításához Hullámszám (cm–1)

Molekulaszerkezet

1220–1260

Az 1050 cm–1-en mért abszorbancia értékhez viszonyított relatív abszorbancia κ

ι

λ

észter-szulfát

0,7–1,2

1,6–1,6

1,4–2,0

928–933

3,6-anhidro-D-galaktóz

0,3–0,6

0,2–0,4

≤ 0,2

840–850

galaktóz-4-szulfát

0,3–0,5

0,2–0,4

-

825–830


-

-

0,2–0,4

810–820


-

-

0,1–0,3

800–805

3,6-anhidro-D-galaktóz2-szulfát

≤ 0,2

0,2–0,4

-

VIZSGÁLATOK Látszólagos viszkozitás (2.2.10): legalább 5 mPa⋅s. A vizsgálandó anyag 15 g/l (szárított anyagra) töménységű szuszpenzióját 80 °C-on legalább 15 percig, feloldódásig melegítjük. A melegítés közben elpárolgott vizet pótoljuk, majd hagyjuk lehűlni az oldatot 75 °C-ra, és ezt a hőfokot tartva végezzük el a vizsgálatot. Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 20 ppm. 2,0 g anyagot 30 ml R vízzel 2 percig rázogatunk. Az elegyet állni hagyjuk, majd a vizes fázist elkülönítjük. Az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot R ólom−mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 12,0%. 1,000 g anyagot szárítószekrényben 105 °C-on szárítunk. Összes hamu (2.4.16): legfeljebb 40,0%. Sósavban nem oldódó hamu (2.8.1): legfeljebb 2,0%. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni a karragenán típusát. A FELHASZNÁLÁST BEFOLYÁSOLÓ SAJÁTSÁGOK Az alábbiakban tájékoztatás található azokról a sajátságokról, amelyeket a segédanyagként használt anyag egy vagy több funkciójának fontos ellenőrző paramétereként tartanak számon (lásd az 5.15. általános fejezetet). A cikkelynek ez a része nem kötelező erejű, és az anyag megfelelésének bizonyításához nem szükséges ezen sajátságok vizsgálata. Ellenőrzésük azonban hozzájárulhat a gyógyszer minőségéhez, azáltal, hogy növeli az előállítási eljárásnak és a gyógyszer felhasználáskor mutatott teljesítőképességének a megbízhatóságát. Az itt megadott ellenőrző módszerek megfelelőnek bizonyultak erre a célra, de más

Carrageenanum


módszerek is alkalmazhatók. Egy adott sajátságra kapott eredmény közlésekor az alkalmazott ellenőrző módszert is fel kell tüntetni. Az alábbi sajátságok lényegesek lehetnek a viszkozitásnövelőként használt karragenánra vonatkoztatva. Gélképződés: lásd az „Azonosítás” A pontját. Látszólagos viszkozitás: lásd „Vizsgálatok”.

01/2011:2341

CEFPODOXIMUM PROXETILI Cefpodoxim-proxetil

*

és C -epimere

C21H27N5O9S2 [87239-81-4]

Mr 557,6

DEFINÍCIÓ [(1RS)-1-[[(1-Metiletoxi)karbonil]oxi]etil]–[(6R,7R)-7-[[(2Z)-2-(2-aminotiazol4-il)-2-(metoxiimino)acetil]amino]-3-(metoximetil)-8-oxo-5-tia-1azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karboxilát]. Fermentációs termékből előállított félszintetikus származék. Tartalom: 94,0–102,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy halványsárga vagy világosbarna, amorf por. Oldékonyság: vízben alig oldódik, vagy gyakorlatilag nem oldódik; acetonitrilben és metanolban nagyon bőségesen oldódik; vízmentes etanolban bőségesen oldódik. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24).

Összehasonlítás: CRS cefpodoxim-proxetillel. VIZSGÁLATOK Diasztereomer arány. Folyadékkromatográfia (2.2.29), a "Tartalmi meghatározás" pontban leírtak szerint. A normalizációs eljárást alkalmazzuk. Követelmény: vizsgálati oldat: − a cefpodoxim-proxetil II. diasztereomerjének megfelelő csúcs területe és a cefpodoxim-proxetil I. és II. diasztereomerjének megfelelő csúcsok területösszege közti arány: 0,5–0,6. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Az oldatokat közvetlenül felhasználás előtt készítjük, vagy 2-8 C °C-on tároljuk Oldószerelegy: R tömény ecetsav – R acetonitril – R víz (2+99+99 V/V). Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (b). 5 mg CRS csúcsazonosításra szánt cefpodoximproxetilt (amely B-, C- és D-szennyezőt is tartalmaz) 5,0 ml oldószerelegyben oldunk. Összehasonlító oldat (c). 5 mg CRS H-szennyező azonosítására szánt cefpodoxim-proxetilt 5,0 ml oldószerelegyben oldunk. Oszlop: − méretei: l = 0,15 m, Ø= 4,6 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt oktadecilszililezett szilikagél (5 μm); − hőmérséklet: állandóan tartott 20 °C. Mozgófázis: − A-mozgófázis: R vízmentes hangyasav – R metanol – R víz (1+400+600 V/V);

− B-mozgófázis: R vízmentes hangyasav – R víz – R metanol (1+50+950 V/V); Idő (perc) 0 – 65 65 – 145 145 – 155

A-mozgó fázis (% V/V) 95 95 → 15 15

B-mozgófázis (%V/V) 5 5 → 85 85

Áramlási sebesség: 0,6 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 20 μl. Szennyezők azonosítása: A B-, a C- és a D-szennyező azonosításához a CRS csúcsazonosításra szánt cefpodoxim-proxetilhez mellékelt kromatogramot és a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk; a H-szennyező azonosításához a CRS H-szennyező azonosítására szánt cefpodoxim-proxetilhez mellékelt kromatogramot és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a cefpodoxim-proxetil II. diasztereomerjére (retenciós ideje kb. 58 perc) vonatkoztatva: a B-szennyező I. diasztereomerje kb. 0,68; a cefpodoxim-proxetil I. diasztereomerje kb. 0,74; C-szennyező kb. 0,82; a Bszennyező II. diasztereomerje kb. 0,85; D-szennyező (két csúcs) kb. 0,88 és 1,13; a H-szennyező diasztereomerjei kb. 1,9 és 2,3 között. Rendszeralkalmasság: − a b) összehasonlító oldat kromatogramja egyezzék meg a CRS csúcsazonosításra szánt cefpodoxim-proxetilhez mellékelt kromatogrammal; − csúcsfelbontás: legalább 6,0, a cefpodoxim-proxetil I. és II. diasztereomerje között az a) összehasonlító oldat kromatogramján; – hegy-völgy arány: legalább 1,1, ahol Hp = a B-szennyező II. diasztereomerjének megfelelő csúcs alapvonaltól mért magassága és Hv = ezen csúcsot a C-szennyező csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának az alapvonaltól mért távolsága a b) összehasonlító oldat kromatogramján. Követelmény:

− C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének kétszerese (2,0%);

− D-szennyező (a két diaszteromer összege): csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területének összege (1,0%);

− H-szennyező (a két diaszteromer összege): csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területének összege (1,0%);

− B-szennyező (a két diaszteromer összege): csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének 0,5-szerese (0,5%);

− egyéb szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének 0,2-szerese (0,2%);

− összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének négyszerese (4,0%);

− elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének 0,05-szorosa (0,05%). Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 2,5%. Az anyag 0,500 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29). A-oldat: R vízmentes citromsav 20 mg/l-es, R acetonitrillel készült oldata. Vizsgálati oldat. 30,0 mg vizsgálandó anyagot az A-oldattal 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat. 30,0 mg CRS cefpodoxim-oxetilt az A-oldattal 50,0 ml-re oldunk. Oszlop: − méretei: l = 0,15 m, Ø= 4,6 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm); − hőmérséklet: 40 °C.

Mozgófázis: R metanol – R víz (9+11 V/V). Áramlási sebesség: 0,8 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 240 nm-en. Injektálás: 10 μl. Kromatografálási idő: a idejének 1,2-szerese.

cefpodoxim-proxetil II. diasztereomerje retenciós

Retenciós idő: a cefpodoxim-proxetil II. diasztereomerje: kb. 30 perc. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: − csúcsfelbontás: legalább 4,0, a cefpodoxim-proxetil I. és II. diasztereomerje között. A százalékos C21H27N5O9S2-tartalmat a két diasztereomer csúcs területösszegéből számoljuk ki, a CRS cefpodoxim-oxetil deklarált tartalma alapján. ELTARTÁS Fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: B, C, D, H. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): A, E, F, G.

A. (6R,7R)-7-[[(2Z)-2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetil]amino]-3(metoximetil)-8-oxo-5-tia-1-azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karbonsav (cefpodoxim),

*

és C -epimere

B. [(1RS)-1-[[(1-metiletoxi)karbonil]oxi]etil]–[(6R,7R)-7-[[(2Z)-2-(2aminotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetil]amino]-3-metil-8-oxo-5-tia-1azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karboxilát] (a cefpodoxim-proxetil ACAanalógja,

és C*-epimere

C. [(1RS)-1-[[(1-metiletoxi)karbonil]oxi]etil]–[(6R,7R)-7-[[(2Z)-2-(2aminotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetil]amino]-3-(metoximetil)-8-oxo-5tia-1-azabiciklo[4.2.0]okt-3-én-2-karboxilát] (delta cefpodoxim-proxetil),

és C*-epimere

D. [(1RS)-1-[[(1-metiletoxi)karbonil]oxi]etil]–[(6R,7R)-7-[[(2E)-2-(2aminotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetil]amino]-3-(metoximetil)-8-oxo-5tia-1-azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karboxilát] (anti cefpodoxim-proxetil),

*

és C -epimere

E. [(1RS)-1-[[(1-metiletoxi)karbonil]oxi]etil]–[(6R,7R)-3-(acetoximetil)-7[[(2Z)-2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetil]amino]-8-oxo-5-tia-1azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karboxilát] (a cefpodoxim-proxetil ACAanalógja),

*

és C -epimere

F. [(1RS)-1-[[(1-metiletoxi)karbonil]oxi]etil]–[(6R,7R)-7-[[(2Z)-2(formilamino)tiazol-4-il)]-2-(metoxiimino)acetil]amino]-3-(metoximetil)-8oxo-5-tia-1-azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karboxilát] (N-formil-cefpodoximproxetil),

*

és C -epimere

G. [(1RS)-1-[[(1-metiletoxi)karbonil]oxi]etil]–[(6R,7R)-7-[[(2Z)-2(acetilamino)tiazol-4-il]-2-(metoxiimino)acetil]amino]-3-(metoximetil)-8oxo-5-tia-1-azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karboxilát] (N-acetil-cefpodoximproxetil),

*

valamint C1- és C1 -diasztereomerei

H. [1-[[(1-metiletoxi)karbonil]oxi]etil]–[(6R,7R)-7-[[(2Z)-2-[2-[[(2R)-2-[[(2Z)2-(2-aminotiazol-4-il)-2-(metoxiimino)acetil]amino]-2-[(2R)-5(metoximetil)-4-[[1-[[(1-metiletoxi)karbonil]oxi]etoxi]karbonil]-3,6dihidro-2H-1,3-tiazin-2-il]acetil]amino]tiazol-4-il]-2(metoxiimino)acetil]amino]-3-(metoximetil)-8-oxo-5-tia-1azabiciklo[4.2.0]okt-2-én-2-karboxilát diasztereomerjeinek elegye (cefpodoxim-proxetil dimer).

Copolymerum macrogolo et alcoholi poly(vinylico) constatum


04/2010:2523

COPOLYMERUM MACROGOLO ET ALCOHOLI POLY(VINYLICO) CONSTATUM Makrogol-poli(vinil-alkohol) fésűs kopolimer DEFINÍCIÓ Makrogol és poli(vinil-alkohol) fésűs kopolimerje, amelynek átlagos relatív molekulatömege kb. 45 000. Kb. 75% poli(vinil-alkohol) egységből és 25% makrogol egységből áll. A porfolyás javítása érdekében hozzáadott Vízmentes kolloid szilicium-dioxidot (0434) is tartalmazhat. A vízmentes kolloid szilicium-dioxid jelenléte az anyag oldatának opálosságát eredményezi. SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy kissé sárgás por. Oldékonyság: vízben nagyon bőségesen oldódik; vízmentes etanolban és acetonban gyakorlatilag nem oldódik; híg savak és lúgok oldják. AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS makrogol-poli(vinil-alkohol) fésűs kopolimerrel. Mintakészítés: 0,2 g anyagot R vízben oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét szétterítjük egy tallium-bromid-jodid lemezen. Az oldószert 110 °C-on 30 percig tartó melegítéssel elpárologtatjuk. B. 0,4 g anyagot 2 ml R vízben oldunk. Az oldat 1 ml-ét üveglemezre visszük, és bepárologtatjuk. Átlátszó film képződik. VIZSGÁLATOK pH (2.2.3): 5,0–8,0. 5,0 g anyagot R szén-dioxid–mentes vízzel 25,0 ml-re oldunk. Észterszám (2.5.2): 10–75. Etilén-oxid és dioxán (2.4.25): legfeljebb 1 ppm etilén-oxid és 10 ppm dioxán. A-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29).



Vizsgálati oldat. A vizsgálandó anyag 0,250 g-ját 10 ml-es mérőlombikba mérjük, és kb. 1 ml R2 metanolt adunk hozzá. Az elegyet ultrahanggal kezeljük. Ezután kb. 8 ml R kromatográfiás célra szánt vizet adunk hozzá, és a térfogatát R kromatográfiás célra szánt vízzel 10,0 ml-re kiegészítjük. Az így kapott oldatot megszűrjük. Összehasonlító oldat (a). 5,0 mg CRS vinil-acetátot (A-szennyező) R2 metanollal 10,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét R kromatográfiás célra szánt vízzel 20,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R kromatográfiás célra szánt vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 5 mg R vinil-acetátot (A-szennyező) és 5 mg R 1vinilpirrolidin-2-ont 10 ml R2 metanolban oldunk, majd az oldatot R kromatográfiás célra szánt vízzel 50 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1 ml-ét R kromatográfiás célra szánt vízzel 20 ml-re hígítjuk. Amennyiben mátrix-jelenség észlelhető, R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagéllel (5 μm) töltött előtétoszlopot alkalmazhatunk. Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,0 mm;

–


–


Mozgófázis: –

A-mozgófázis: R1 acetonitril – R2 metanol – R kromatográfiás célra szánt víz (5+5+90 V/V);

–

B-mozgófázis: R2 metanol – R1 acetonitril – R kromatográfiás célra szánt víz (5+45+50 V/V); Idő (perc)



0–2 2 – 40 40 – 42

100

0

100 → 85

0 → 15

85 → 0

15 → 100

Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 205 nm-en. Injektálás: 10 μl. Retenciós idők: A-szennyező kb. 19 perc; 1-vinilpirrolidin-2-on kb. 25 perc. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat:


–


csúcsfelbontás: legalább 5,0 az A-szennyező és az 1-vinilpirrolidin-2-on között.

Követelmény: –

A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (100 ppm).

B-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 0,200 g vizsgálandó anyagot összekeverünk R kromatográfiás célra szánt vízzel, majd a keveréket az R kromatográfiás célra szánt vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat. 30 mg R ecetsavat (B-szennyező) és 30 mg R citromsavat óvatos rázogatás közben a mozgófázisban oldunk, majd az oldatot a mozgófázissal 100,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

–


Mozgófázis: 0,005 M kénsav. Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 205 nm-en. Injektálás: 20 μl. Az oszlopot minden egyes injektálás után átmossuk R kromatográfiás célra szánt acetonitril és 0,005 M kénsav azonos térfogatarányú elegyével. Retenciós idők: B-szennyező kb. 5 perc; citromsav kb. 7 perc. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 2,0, a citromsav és a B-szennyező között.

Követelmény: –

B-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a megfelelő csúcs területe az összehasonlító oldat kromatogramján (1,5%);

Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 3,0%. Az anyag 5,0 g-ját vizsgáljuk. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 5,0%. Az anyag 1,000 g-ját vákuumban 105 °C-on szárítjuk. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B.



A. vinil-acetát,

B. ecetsav. A FELHASZNÁLÁST BEFOLYÁSOLÓ SAJÁTSÁGOK Az alábbiakban tájékoztatás található azokról a sajátságokról, amelyeket a segédanyagként használt anyag egy vagy több funkciójának fontos, ellenőrző paramétereként tartanak számon (lásd az 5.15. általános fejezetet). A cikkelynek ez a része nem kötelező erejű, és az anyag megfelelésének bizonyításához nem szükséges ezen sajátságok vizsgálata. Ellenőrzésük azonban hozzájárulhat a gyógyszerkészítmény minőségéhez, azáltal, hogy növeli az előállítási eljárásnak és a gyógyszer felhasználáskor mutatott teljesítőképességének a megbízhatóságát. A hivatkozott ellenőrző módszerek megfelelőnek bizonyultak erre a célra, de más módszerek is alkalmazhatók. Egy adott sajátságra kapott eredmény közlésekor az alkalmazott ellenőrző módszert is fel kell tüntetni. Az alábbi sajátság lényeges lehet, ha a makrogol-poli(vinil-alkohol) fésűs kopolimert filmképző segédanyagként alkalmazzák filmbevonatú tablettákban. Látszólagos viszkozitás (2.2.10): jellemzően kevesebb, mint 250 mPa⋅s. Az anyag 20%-os (m/m) oldatát rotációs viszkoziméterrel 25 °C-on vizsgáljuk, 100 r/perc rotációs sebességet alkalmazva.

01/2010:2449

DOCETAXELUM TRIHYDRICUM Doketaxel-trihidrát

C43H53NO14.3H2O [148408-66-6]

Mr 862

DEFINÍCIÓ [4-(acetoloxi)-2α-(benzoiloxi)-1,7β,10β-trihidroxi-9-oxo-5β,20-epoxitax-11én-13α-il]-[(2R,3S)-3-[[1,1-dimetiletoxi)karbonil]amino]-2-hidroxi-3fenilpropanoát]−trihidrát. Tartalom: 97,5–102,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; vízmentes etanolban bőségesen oldódik; diklórmetánban oldódik. AZONOSÍTÁS A. Fajlagos optikai forgatóképesség (lásd Vizsgálatok). B. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS doketaxel-trihidráttal.


2

Docetaxelum trihydricum

VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. Az oldat opálossága nem lehet erősebb, mint a II. számú összehasonlító szuszpenzióé (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint a B5 színmértékoldaté (2.2.2, I. módszer). 1,0 g anyagot R vízmentes etanollal 20 ml-re oldunk. Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): −38,5 és −41,5 között (vízmentes anyagra). 0,250 g anyagot R metanollal 25,0 ml-re oldunk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Oldószerelegy: R tömény ecetsav − R1 acetonitril − R víz (0,05+50+50 V/V). Vizsgálati oldat. 50,0 mg vizsgálandó anyagot 2,5 ml R vízmentes etanolban oldunk, majd az oldatot az oldószerelggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). 50,0 mg CRS doketaxel-trihidrátot 2,5 ml R vízmentes etanolban oldunk, majd az oldatot az oldószerelggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). 5 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt doketaxelt (amely A-, B- és C-szennyezőt is tartalmaz) 0,25 ml R vízmentes etanolban oldunk, majd az oldatot az oldószerelggyel 5,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –

méretei: l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (3,5 μm);

−


Mozgófázis: –

A-mozgófázis: R víz;

–

B-mozgófázis: R1 acetonitril; Idő (perc)



0−9

72

28


9 → 39

3

72 → 28


28 → 72

Áramlási sebesség: 1,2 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 232 nm-en. Injektálás: 10 μl; vizsgálati oldat, valamint b) és c) összehasonlító oldat. Szennyezők azonosítása: az A-, a B- és a C-szennyező csúcsának azonosítására a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt doketaxelhez mellékelt kromatogramot és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a doketaxelre (retenciós ideje kb. 27 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,97; B-szennyező kb. 1,08; C-szennyező kb. 1,13. Rendszeralkalmasság: c) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 4,0, az A-szennyező és a doketaxel között.


korrekciós faktor: az A-szennyező mennyiségének kiszámításához csúcsterületét 1,6-del szorozzuk;

−

A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének ötszöröse (0,5%);

− B- és C-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%); −

egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%);

–

összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének tízszerese (1,0%);

–

elhanyagolási határ: a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%).

Nehézfémek (2.4.8/B): legfeljebb 20 ppm.


4


1,0 g anyagot 15 térfogatrész R víz és 85 térfogatrész R dimetilformamid elegyével − ultrahangos kezelést alkalmazva − 20 ml-re oldunk, és az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot olyan ólom−mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük, amelyet R ólom−mértékoldatból (100 ppm Pb) 15 térfogatrész R víz és 85 térfogatrész R dimetilformamid elegyével hígítottunk. Víztartalom (2.5.32): 5,0−7,0%. A vizsgálandó anyag R dimetilformamiddal készített, 100 mg/ml töménységű oldatának 200 μl-ét injektáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 0,3 NE/mg. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag − abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására megfelelő eljárást − feleljen meg e vizsgálat követelményének is. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29) a "Rokon vegyületek" vizsgálatban leírtak szerint, az alábbi módosítással. Injektálás: 10 μl; vizsgálati oldat és a) összehasonlító oldat. A százalékos C43H53NO14-tartalmat a CRS doketaxel-trihidrát deklarált tartalma alapján számítjuk ki. ELTARTÁS Fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nemspecifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034)) című általános cikkely előírásai határozzák meg.


5


Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10) című általános fejezetet): D.

A. [4-(acetiloxi)-1,7β,10β-trihidroxi-2α-[[(2E)-2-metilbut-2-enoil]oxi]-9-oxo5β,20-epoxitax-11-én-13α-il]-[(2R,3S)-3-[[(1,1-dimetiletoxi)karbonil]amino]2-hidroxi-3-fenilpropanoát] (2-O-dezbenzoil-2-O-tiglildoketaxel)

B. [4-(acetiloxi)-2α-(benzoiloxi)-1,7β-dihidroxi-9,10-dioxo-5β,20-epoxitax11-én-13α-il] -[(2R,3S)-3-[[(1,1-dimetiletoxi)karbonil]amino]-2-hidroxi-3fenilpropanoát] (10-dehidroxi-10-oxodoketaxel)


6


C.[4-(acetiloxi)-2α-(benzoiloxi)-1,7α,10β-trihidroxi-9-oxo-5β,20-epoxitax-11én-13α-il]-[(2R,3S)-3-[[(1,1-dimetiletoxi)karbonil]amino]-2-hidroxi-3fenilpropanoát] (7-epi-doketaxel),

D.[4-(acetiloxi)-2α-(benzoiloxi)-1,7α-dihidroxi-9,10-dioxo-5β,20-epoxitax-11én-13α-il]-[(2R,3S)-3-[[(1,1-dimetiletoxi)karbonil]amino]-2-hidroxi-3fenilpropanoát] (10-dehidroxi-10-oxo-7-epi-doketaxel).

Enrofloxacinum ad usum veterinarium


04/2010:2229 javított 7.0

ENROFLOXACINUM AD USUM VETERINARIUM Enrofloxacin, állatgyógyászati célra

C19H22FN3O3 [93106-60-6]

Mr 359,4

DEFINÍCIÓ 1-Ciklopropil-7-(4-etilpiperazin-1-il)-6-fluor-4-oxo-1,4-dihidrokinolin-3karbonsav. Tartalom: 98,5–101,5% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: halványsárgás vagy kissé sárga, kristályos por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; diklórmetánban bőségesen oldódik; metanolban kevéssé oldódik. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS enrofloxacinnal. VIZSGÁLATOK



Az oldat külleme. Az oldat opálossága nem lehet erősebb, mint a II. számú összehasonlító szuszpenzióé (2.2.1), színe pedig nem lehet erősebb, mint a ZS4 összehasonlító oldaté (2.2.2, II. módszer). 1,0 g vizsgálandó anyaghoz kb. 0,25 g R kálium-hidroxidot és 7 ml R vizet adunk. A keverékből ultrahangos kezeléssel nyert oldatot R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. A-szennyező. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Az oldatokat közvetlenül felhasználás előtt készítjük. Oldószerelegy: R metanol – R diklórmetán (50+50 V/V). Vizsgálati oldat. 0,100 g vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 5,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat. 5,0 mg CRS ciprofloxacin-A-szennyezőt (enrofloxacin-Aszennyező) az oldószereleggyel 50,0 ml-re oldunk. Az oldat 4,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Lemez: R VRK szilikagél F254 lemez (2-10 μm). Kifejlesztőszer: R 1-butanol – R víz – R vizmentes ecetsav – R etil-acetát (15+15+20+50 V/V). Felvitel: 10 μl. Kifejlesztés: a lemezmagasság háromnegyedéig. Szárítás: levegőn. Előhívás: 254 nm-es ultraibolya fényben. Értékelés: –

A-szennyező: az A-szennyezőnek megfelelő folt nem lehet intenzívebb az összehasonlító oldat kromatogramján látható foltnál (0,2%).

Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 10 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt enrofloxacint (amely B- és C-szennyezőt is tartalmaz) a mozgófázissal 10 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml vizsgálati oldatot a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 10,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –

méretei: l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra oktadecilszililezett szilikagél (5 μm);

szánt,

utókezelt,

dezaktivált,


–



Mozgófázis: R metanolt (15 térfogatrész) R tömény foszforsav 2,9 g/l töménységű – R trietilaminnal előzetesen pH 2,3-ra beállított – oldatával (85 térfogatrész) elegyítünk. Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 270 nm-en. Injektálás: 10 μl. Kromatografálási idő: az enrofloxcin retenciós idejének háromszorosa. Szennyezők azonosítása: a B- és a C-szennyező azonosítására a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt enrofloxacinhoz mellékelt kromatogramot és az a) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók az enrofloxacinra (retenciós ideje kb. 16 perc) vonatkoztatva: C-szennyező kb. 0,6; B-szennyező kb. 0,8. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 2,0, a B-szennyező és az enrofloxacin között.


B-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 2,5-szerese (0,5%);

–

C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,2%);

–

egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,20%);

–

szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének ötszöröse (1,0%);

–

elhanyagolási határ: a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,5-szerese (0,1%).

Nehézfémek (2.4.8/E): legfeljebb 20 ppm. 1,5 g anyagot 5 ml 2 M ecetsav és 10 ml víz elegyében oldunk. Az oldatot megszűrjük. A szüredék 12 ml-éhez – tompítóoldat helyett – 2 ml R vizet elegyítünk. Ezt az oldatot vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 12 ml R ólom−mértékoldattal (2 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 1,0%. Az anyag 2,000 g-ját 6 órán át vákuumban 120 °C-on tömegállandóságig szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk.



TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,250 g anyagot 100 ml R vízmentes ecetsavban oldunk. Az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20) 0,1 M perklórsav– mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav–mérőoldattal 35,94 mg C19H22FN3O3 egyenértékű. ELTARTÁS Fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10) című általános fejezetet): E, F, G.

A. 7-klór-1-ciklopropil-6-fluor-4-oxo-1,4-dihidrokinolin-3-karbonsav,

B. ciprofloxacin,



C. 1-ciklopropil-7-(4-etilpiperazin-1-il)-4-oxo-1,4-dihidrokinolin-3karbonsav,

E. 6-klór-1-ciklopropil-7-(4-etilpiperazin-1-il)-4-oxo-1,4-dihidrokinolin-3karbonsav,

F. 1-ciklopropil-7-(4-etilpiperazin-1-il)-6-fluorkinolin-4(1H)-on,

G. 7-[(2-aminoetil)amino]-1-ciklopropil-6-fluor-4-oxo-1,4-dihidrokinolin-3karbonsav.

01/2011:2574

ENTACAPONUM Entakapon

C14H15N3O5 [130929-57-6]

Mr 305,3

DEFINÍCIÓ (2E)-2-Ciano-3-(3,4-dihidroxi-5-nitrofenil)-N,N-dietilprop-2-énamid. Tartalom: 98,0–102,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: zöldessárga vagy sárga por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; acetonban oldódik vagy mérsékelten oldódik; vízmentes etanolban kevéssé oldódik. Polimorfiára hajlamos (5.9). AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS entakaponnal. Amennyiben a szilárd anyagok spektrumai eltérőek, a vizsgálandó anyagot és a referenciaanyagot külön-külön R acetonban oldjuk, az oldatokat szárazra párologtatjuk, és a maradékokból új spektrumokat veszünk fel.

Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Az oldatokat közvetlenül felhasználás előtt készítjük. Oldószerelegy: R tetrahidrofurán – R metanol (30+70 V/V). Vizsgálati oldat (a). 50,0 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 50,0 mlre oldunk. Vizsgálati oldat (b). 5,0 ml a) vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (a). 5 mg CRS entakapon-A-szennyezőt oldószerelegyben oldunk; 5,0 ml a) vizsgálati oldat hozzáadása után oldószereleggyel 25,0 ml-re hígítjuk az oldatot. Ezen oldat 1,0 ml-ét oldószereleggyel 20,0 ml-re hígítjuk, majd az így hígított oldat 1,0 ml-ét oldószereleggyel 10,0 ml-re tovább hígítjuk.

az az az az

Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml b) vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). 50,0 mg CRS entakapont az oldószereleggyel 50,0 ml-re oldunk. Az oldat 5,0 ml-ét az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Oszlop:

− méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; − állófázis: R szilikon–kvarc-polimer, amorf, oktadecilszililezett, utókezelt (5 μm).

Mozgófázis: R tetrahidrofuránból (2 térfogatrész), R metanolból (44 térfogatrész) és R nátrium-dihidrogén-foszfát–dihidrát 2,34 g/l-es, R tömény foszforsavval előzetesen pH 2,1-re beállított oldatából (54 térfogatrész) készült elegy. Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 300 nm-en. Injektálás: 10 μl; a) vizsgálati oldat, valamint a) összehasonlító oldat. Kromatografálási idő: az entakapon retenciós idejének 2,5-szerese. Relatív retenció az entakaponra (retenciós ideje kb. 17 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,8.

Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat:

− csúcsfelbontás: legalább 3,0, az A-szennyező és az entakapon között. Követelmények:

− A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (0,15%);

− egyedi

határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%);

− összes szennyező, az A-szennyező kivételével: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%);

− elhanyagolási határ: a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,5-szerese (0,05%). Nehézfémek (2.4.8/H): legfeljebb 10 ppm. Oldószerelegy: R dimetilformamid – R metanol (25+75 V/V). Az anyag 1,00 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 1,0 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Szűrés után a membránszűrőt legalább 20 ml R metanollal átmossuk. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,5%. Az anyag 1,000 g-ját vákuumban 60 °C-on szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29), a "Rokon vegyületek" vizsgálat előírásai szerint, a következő módosítással. Injektálás: b) vizsgálati oldat és c) összehasonlító oldat. A százalékos C14H15N3O5-tartalmat a CRS etakapon deklarált tartalma alapján számoljuk ki.

ELTARTÁS Fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyező: A. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): B, C, D, E, F, G, H, I.

A. (2Z)-2-ciano-3-(3,4-dihidroxi-5-nitrofenil)-N,N-dietilprop-2-énamid,

B. etil–[(2E)-2-ciano-3-(3,4-dihidroxi-5-nitrofenil)prop-2-enoát],

C. 3,4-dihidroxi-5-nitrobenzaldehid,

D. (2E)-2-ciano-3-(3-etoxi-4-hidroxi-5-nitrofenil)-N,N-dietilprop-2-énamid,

E. 3,5-dinitrobenzol-1,2-diol,

F. (2E)-2-ciano-3-(3,4-dihidroxi-5-nitrofenil)-N,N-dietilprop-2-énsav,

G. (2E)-2-ciano-3-(3,4-dihidroxi-5-nitrofenil)prop-2-énamid,

H. (2E)-3-(3,4-dihidroxi-5-nitrofenil)-2-(piperidin-1-ilkarbonil)prop-2-énnitril,

I. propil–[(2E)-2-ciano-3-(3,4-dihidroxi-5-nitrofenil)prop-2-enoát].

01/2010:2411 javított 7.0

EPINASTINI HYDROCHLORIDUM

és enantiomere, HCl

C16H16ClN3 [108929-04-0]

Mr 285,8

DEFINÍCIÓ (13bRS)-9,13b-Dihidro-1H-dibenzo[c,f]imidazo[1,5-a]azepin-3amin−hidroklorid. Tartalom: 99,0–101,0% (szárított anyagra).

SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, nedvszívó, kristályos por. Oldékonyság: vízben és metanolban bőségesen oldódik; diklórmetánban mérsékelten oldódik; acetonitrilben kevéssé oldódik. AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS epinasztin-hidrokloriddal. B. A kloridion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

2 Ph. Hg. VIII. − Ph. Eur. 6.6

Epinastini hydrochloridum

VIZSGÁLATOK Savasság, lúgosság. 1,0 g anyagot R szén-dioxid-mentes vízzel 10 ml-re oldunk. Az oldat 0,1 ml R metilvörös−indikátorkeverék−oldat és 0,25 ml 0,01 M nátrium-hidroxid−mérőoldat hozzáadására zöldre színeződik; ez az szín 0,5 ml 0,01 M sósav−mérőoldattól vörösesibolyára változik. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Tompítóoldat (pH 4,4). 3,8 g R nátrium-pentánszulfonát-monohidrátot és 4,0 g R kálium-dihidrogén-foszfátot R vízben oldunk. Az oldat pH-ját R tömény foszforsavval 4,4 értékre állítjuk be, ezután az oldatot R vízzel 1000,0 ml-re hígítjuk. Oldószerelegy: B-mozgófázis − A-mozgófázis (25+75 V/V). Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 100,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 10,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 5 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt epinasztint (amely A- és B-szennyezőt is tartalmaz) 10,0 ml oldószerelegyben oldunk. Oszlop: –

méretei: l = 0,10 m, Ø = 3,0 mm;

– állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (3 μm); −


Mozgófázis: –

A-mozgófázis: R2 metanol − tompítóoldat (pH 4,4) (15+85 V/V);

–

B-mozgófázis: R2 metanol − R1 acetonitril (15+85 V/V); Idő (perc) 0−4 4 − 13

A-mozgófázis (%V/V) 80 80 → 30

Áramlási sebesség: 1,4 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 220 nm-en. Injektálás: 10 μl.

B-mozgófázis (%V/V) 20 20 → 70



Szennyezők azonosítása: az A- és a B-szennyező csúcsának azonosítására a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt epinasztinhoz mellékelt kromatogramot és a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók az epinasztinra (retenciós ideje kb. 4 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 1,2; B-szennyező kb. 2,0. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: − hegy-völgy arány: legalább 2,0, ahol Hρ = az A-szennyező csúcsának az alapvonaltól mért magassága és Hν = ezt a csúcsot az epinasztin csúcsától elválasztó görbeszakasz minimuma és az alapvonal közti távolság. Követelmények: −

B-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%);

− A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%); −


–

összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének hétszerese (0,7%);

– elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%). Nehézfémek (2.4.8/H): legfeljebb 20 ppm. Oldószer: R víz. Az anyag 0,250 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 0,5 ml R ólom– mértékoldatot (10 ppm Pb) felhasználva készítjük.



Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 1,0%. Az anyag 1,000 g-ját szárítószekrényben 105 °C-on szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk.

TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,200 g anyagot R vízmentes ecetsav − R ecetsav-anhidrid (1+2 V/V) elegyének 100 ml-ében oldunk. Az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20), 0,1 M perklórsav–mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav–mérőoldattal 28,58 mg C16H16ClN3 egyenértékű.

ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban.

SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B.

A.

9H-dibenzo[c,f]imidazo[1,5-a]azepin-3-amin,

és enantiomere

B. (13bRS)-7-bróm-9,13b-dihidro-1H-dibenzo[c,f]imidazo[1,5-a]azepin-3amin.

01/2011:2390

FLUORIDI (18F) SOLUTIO AD RADIO-SIGNANDUM Fluorid(18F)-oldat radiojelzés céljára DEFINÍCIÓ Fluor-18 radioaktív izotópot fluorid formájában tartalmazó, lúgos oldat. Tartalom: a fluor-18 deklarált radioaktivitásának 90–110 %-a, a feliraton feltüntetett napon és órában. SAJÁTSÁGOK Küllem: tiszta, színtelen oldat. A fluor-18 által kibocsátott sugárzás jellemzői és felezési ideje: lásd Az Európai Gyógyszerkönyvben hivatalos radionuklidok fizikai jellemzőinek táblázata (5.7). AZONOSÍTÁS A. Gamma-spektrometria. Értékelés: a legjellegzetesebb fotonok energiája 0,511 MeV. A mérés geometriájától függően megjelenhet egy 1,022 MeV energiájú összegző csúcs is. B. Mintánként legalább három radioaktivitás-mérés alapján, ugyanazon geometriai feltételek között, alkalmas időtartamon (pl. 30 percen) belül közelítőleg meghatározzuk a felezési időt. Értékelés: 105–115 perc. C. A "Radiokémiai tisztaság" vizsgálat során nyert kromatogramokat értékeljük (lásd Vizsgálatok). Értékelés: a vizsgálati oldat radiokromatogramján látható főcsúcs retenciós ideje egyezzenk meg az összehasonlító oldat radiokromatogramján megjelenő főcsúcs retenciós idejével; az összehasonlító oldat kromatogramján a fluorid jel negatív.

VIZSGÁLATOK pH: 8,0–14,0.; R pH indikátorpapírt használunk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 20 NE/ml. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag – abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására megfelelő eljárást – feleljen meg e vizsgálat követelményének is. A készítmény felhasználás céljára felszabadítható a vizsgálat befejezése előtt. RADIONUKLIDOS TISZTASÁG A készítmény felhasználás céljára felszabadítható a B. pont szerinti vizsgálat befejezése előtt. Fluor-18: az összes radioaktivitásnak legalább 99,9%-a. A. Gamma-spektrometria. Elővizsgálat. Követelmény: a 0,511 MeV-tól, illetve 1,022 MeV-tól eltérő energiájú csúcsok a gamma-spektrumban az összes radioaktivitásnak legfeljebb 0,1%-át jelenthetik. B. Gamma-spektrometria. Meghatározzuk a fluor-18 mennyiségét, valamint a 2 óránál hosszabb felezési idejű radionuklid szennyezők mennyiségét. A szennyezők kimutatása és mennyiségi meghatározása érdekében a vizsgálandó készítményt legalább 24 órán át állni hagyjuk, hogy a fluor-18 radioaktívitása kellő mértékben csökkenjen, és így lehetővé váljék a szennyezők kimutatása. Értékelés: a radionuklid szennyezők összes radioaktivitása legfeljebb 0,1%. RADIOKÉMIAI TISZTASÁG [18F]fluorid. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó készítményt olyan mértékben hígítjuk R vízzel, hogy a hígított oldat radioaktivitása a radioaktivitás-detektor méréshatárain belül legyen. Összehasonlító oldat. 10 mg R kálium-fluoridot R vízzel 10 ml-re oldunk. Oszlop:

− méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,0 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, erősen bázisos, anioncserélő gyanta (10 μm).

Mozgófázis: R nátrium-hidroxid 4 g/l-es, R szén-dioxid-mentes vízzel készült oldata. Az oldatot védjük a levegő szén-dioxidjától Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel 220 nm-en, és sorbakötött radioaktivitásdetektorral. Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: 12 perc. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: − jel/zaj viszony: legalább 10, a főcsúcsra számolva; − a fluorid retenciós ideje: a holtidőnek legalább 3-szorosa. A vizsgálati oldat kromatogramját a radioaktivitás-detektorral értékeljük, és a fluorid-csúcsot az összehasonlító oldat spektrofotométerrel kapott kromatogramjához viszonyítva azonosítjuk. Követelmény: − [18F]fluorid: a fluor-18 összes radioaktivitásának legalább 98,5%-a. RADIOAKTIVITÁS Meghatározzuk a radioaktivitást; a méréshez kalibrált készüléket alkalmazunk. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni, − hogy az oldat nem közvetlenül beadásra szánt humán készítmény; − adott esetben, hogy az anyag alkalmas arra, hogy felhasználják parenterális készítmények előállításához.

1

01/2011:1751

FOSINOPRILUM NATRICUM Foszinopril-nátrium

C30H45NNaO7P [88889-14-9]

Mr 585,7

DEFINÍCIÓ Nátrium-[(2S,4S)-4-ciklohexil-1-[[(R)-[(1S)-2-metil-1-(1-propanoiloxi)propoxi](4fenilbutil)foszforil]acetil]pirrolidin-2-karboxilát]. Tartalom: 99,0–101,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos por. Oldékonyság: vízben bőségesen oldódik; vízmentes etanolban mérsékelten oldódik; hexánban gyakorlatilag nem oldódik. Polimorfiára hajlamos (5.9). AZONOSÍTÁS A.

Fajlagos optikai anyagra).

forgatóképesség

(2.2.7):

0,500 g anyagot R metanollal 25,0 ml-re oldunk.

–4,7

és

–6,7

között

(vízmentes

2

B.

Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS foszinopril-nátriummal. Amennyiben a szilárd anyagok spektrumai eltérőek, a vizsgálandó anyagot és a referenciaanyagot külön-külön oldjuk 2 %V/V R vizet tartalmazó R metanolban, az oldatot szárazra párologtatjuk, és a maradékokból új spektrumokat veszünk fel.

C.

A nátriumion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

VIZSGÁLATOK Rokon vegyületek A.

Folyadékkromatográfia (2.2.29).

Vizsgálati oldat. 25 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 50,0 ml-re oldunk. A teljes feloldódásig ultrahangos kezelést alkalmazunk. Összehasonlító oldat (a). 2 mg vizsgálandó anyagot, 2 mg CRS foszinopril-A-szennyezőt, 2 mg CRS foszinopril-B-szennyezőt, 2 mg CRS foszinopril-I-szennyezőt és 2 mg CRS foszinopril-Kszennyezőt a mozgófázissal 50,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). A vizsgálati oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 20,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). A b) összehasonlító oldat 5,0 ml-ét a mozgófázissal 10,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: – méretei: l = 0,15 m, Ø = 3,9 mm; – állófázis: R kromatográfiás célra szánt szilikagél (5 μm); – hőmérséklet: 33 0C. Mozgófázis: R tömény foszforsav – R víz – R1 acetonitril (0,5+3,5+1000 V/V); Áramlási sebesség: 1,2 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en.

3

Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: a foszinopril retenciós idejének négyszerese. Szennyezők azonosítása: az A-, B-, I- és K-szennyező azonosítására az a) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a foszinoprilre (retenciós ideje kb. 5 perc) vonatkoztatva: K-szennyező kb. 0,3; I-szennyező kb. 0,5; B-, E- és H-szennyező kb. 0,7; A-szennyező kb. 2,0. Rendszeralkalmasság: – csúcsfelbontás: legalább 2,0, a B-szennyező és a foszinopril között az a) összehasonlító oldat kromatogramján; – jel/zaj viszony: legalább 40, a főcsúcsra számolva a c) összehasonlító oldat kromatogramján. Követelmények: – korrekciós faktor: az I-szennyező mennyiségének kiszámításához a megfelelő csúcsterületet 1,3-del szorozzuk; – B-, E-, és H-szennyező: csúcsterületeik összege nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján a főcsúcs területének tízszerese (1,0%); – A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján a főcsúcs területének ötszöröse (0,5%); – I és K-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%); – egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%); B.

C- és D-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 25,0 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 50,0 ml-re oldunk. Az oldódást az anyag teljes feloldódásáig ultrahangos kezeléssel segítjük elő. Összehasonlító oldat (a). 5 mg vizsgálandó anyagot és 5,0 mg CRS foszinopril-C-szennyezőt a mozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 10,0 ml-ét a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítjuk.

4

Összehasonlító oldat (b). 5,0 ml a) összehasonlító oldatot a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). 5,0 mg CRS foszinopril-D-szennyezőt a mozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 10,0 ml-ét a mozgófázissal 50,0 ml-re oldjuk. Ezen oldat 5,0 ml-ét a mozgófázissal 50,0 ml-re oldjuk. Oszlop: – méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; – állófázis: R kromatográfiás célra szánt, erősen bázisos anioncserélő gyanta (5 μm); – hőmérséklet: 45 °C. Mozgófázis: R tömény foszforsav – R víz – R1 acetonitril (0,2+1,5+400 V/V); Áramlási sebesség: 0,9 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: a foszinopril retenciós idejének kétszerese. Szennyezők azonosítása: a C-szennyező azonosítására az a) összehasonlító oldat kromatogramját, a D-szennyező azonosítására a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a foszinoprilre (retenciós ideje kb. 10 perc) vonatkoztatva: C-szennyező kb. 1,2; D-szennyező kb. 1,3. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: – csúcsfelbontás: legalább 1,5, a foszinopril és a C-szennyező között. Követelmény: – C-szennyező: csúcsterület nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján a megfelelő csúcs területének 1,5-szerese (0,3%). – D-szennyező: csúcsterület nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján a megfelelő csúcs területének 1,5-szerese (0,3%).

5

C.

E- és F-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 25 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml (a) összehasonlító oldatot a mozgófázissal 20,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). Egy üvegcse CRS foszinopril-szennyezőkeveréket (amely E- és Fszennyezőt tartalmaz) az a) összehasonlító oldat 1,0 ml-ében oldunk. Oszlop: – méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; – állófázis: R kromatográfiás célra szánt, fenilszililezett szilikagél (5 μm); – hőmérséklet: 45 °C.

Mozgófázis: R tömény foszforsav 0,2 %V/V-os, R vízzel készült oldatának (44 térfogatrész) R1 acetonitrillel (56 térfogatrész) készített elegye. Áramlási sebesség: 1,0 ml/min. Detektálás: spektrofotométerrel, 205 nm-en. Injektálás: 20 μl; vizsgálati oldat, valamint b) és c) összehasonlító oldat. Kromatografálási idő: a foszinopril retenciós idejének háromszorosa. Szennyezők azonosítása: az E- és az F-szennyező azononosításához a CRS foszinoprilszennyezőkeverékhez mellékelt kromatogramot és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a foszinoprilre (retenciós ideje kb. 8 perc) vonatkoztatva: E-szennyező kb. 0,8; Fszennyező kb. 0,9. Rendszeralkalmasság: c) összehasonlító oldat: – csúcsfelbontás: legalább 1,5, az F-szennyező és a foszinopril között.

6

Követelmények: – korrekciós faktor: az E-szennyező mennyiségének kiszámításához a megfelelő csúcsterületet 0,7-del szorozzuk; – F-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%); – E-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%); 2-Etilhexánsav (2.4.28): legfeljebb 0,2 %m/m. Nehézfémek (2.4.8/H): legfeljebb 20 ppm. Oldószerelegy: R metanol – R víz (20+80 V/V). Az anyag 0,50 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 1 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 0,2%. Az anyag 1,00 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,450 g anyagot 50 ml R vízben oldunk. Az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20), 0,1 M sósav–mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M sósav–mérőoldattal 58,57 mg C30H45NNaO7P egyenértékű. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C, D, E, F, H, I, K. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): N.

7

A.

(2S,4S)-4-ciklohexil-1-[[(R)-hidroxi(4-fenilbutil)foszforil]acetil]pirrolidin-2-karbonsav,

B. (2RS,4RS)-4-ciklohexil-1-[[(RS)-[(1SR)-2-metil-1-(1-propanoiloxi)propoxi]-(4fenilbutil)foszforil]acetil]pirrolidin-2-karbonsav ,

C. (2S,4S)-4-ciklohexil-1-[[(S)-[(1S)-2-metil-1-(propanoiloxi)propoxi]-(4fenilbutil)foszforil]acetil]pirrolidin-2-karbonsav és (2S,4S)-4-ciklohexil-1-[[(R)-[(1R)-2-metil-1(propanoiloxi)propoxi]-(4-fenilbutil)foszforil]acetil]pirrolidin-2-karbonsav elegye.

8

D. (2S,4R)-4-ciklohexil-1-[[(R)-[(1S)-2-metil-1-(propanoiloxi)propoxi]-(4fenilbutil)foszforil]acetil]pirrolidin-2-karbonsav,

E. (2S,4S)-1-[[(R)-[(1S)-2-metil-1-(propanoiloxi)propoxi]-(4-fenilbutil)foszforil]acetil]-4fenilpirrolidin-2-karbonsav (fenilfoszinopril).

F. (2S,4S)-4-ciklohexil-1-[[(R)-(4-fenilbutil)-[(1S)-1-(propanoiloxi)-propoxi] foszforil]acetil]pirrolidin-2-karbonsav,

H. (2R,4S)-4-ciklohexil-1-[[(R)-[(1S)-2-metil-1-(propanoiloxi)propoxi]-(4fenilbutil)foszforil]acetil]pirrolidin-2-karbonsav,

9

és enantiomere I.

[(RS)-[(1SR)-2-metil-1-propanoiloxi)propoxi]-(4-fenilbutil)foszforil]ecetsav,

K.

(2S,4S)-4-ciklohexil-1-(2,2-dimetilpropanoil)pirrolidin-2-karbonsav,

N. (2S,4S)-4-ciklohexil-1-[[(2S,4S)-4-ciklohexil-1-[[(R)-[(1S)-2-metil-1-(propanoiloxi)propoxi]-(4fenilbutil)foszforil]acetil]pirrolidin-2-il]karbonil]pirrolidin-2-karbonsav.

Galantamini hydrobromidum


07/2010:2366 javított 7.0

GALANTAMINI HYDROBROMIDUM Galantamin-hidrobromid

C17H22BrNO3 [1953-04-4]

Mr 368,3

DEFINÍCIÓ [(4aS,6R,8aS)-3-Metoxi-11-metil-5,6,9,10,11,12-hexahidro-4aH-[1]benzfuro[3a,3,2-ef][2]benzazepin6-ol]–hidrobromid. Természetes anyagból izolált vagy szintetikus úton előállított termék. Tartalom: 99,0–101,0% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos vagy amorf por. Oldékonyság: vízben mérsékelten oldódik; vízmentes etanolban alig oldódik. Híg alkálilúgok oldják. AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS galantamin-hidrobromiddal. B. „Fajlagos optikai forgatóképesség” vagy „Enantiomer tisztaság” (lásd Vizsgálatok). C. Az anyaggal a bromidion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1), az előírt változás észlelhető. VIZSGÁLATOK S oldat. 0,60 g anyagot R szén-dioxid-mentes vízzel 30,0 ml-re oldunk. pH (2.2.3): 4,0–5,5. Az S oldatot vizsgáljuk.



Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7) természetes eredetű galantaminra: –90 és –100 között (szárított anyagra). Az S oldatot vizsgáljuk. Enantiomer tisztaság szintetikus galantaminra. Kapilláris elektroforézis (2.2.47). Az oldatokat közvetlenül felhasználás előtt készítjük. Tompító elektrolit-oldat: R dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrát 8,9 g/l töménységű oldata. Vizsgálati oldat. 25,0 mg vizsgálandó anyagot 50,0 ml R vízben oldunk, és az oldatot 0,22 µm névleges pórusméretű membránszűrőn megszűrjük. Összehasonlító oldat (a). 5 mg CRS galantamin racemátot 10,0 ml R vízben oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk, és a hígított oldatot 0,22 µm névleges pórusméretű membránszűrőn megszűrjük. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml vizsgálati oldatot R vízzel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk, és a hígított oldatot 0,22 µm névleges pórusméretű membránszűrőn megszűrjük. Üres oldat. R vizet 0,22 µm névleges pórusméretű membránszűrőn megszűrünk. Kapilláris: –

anyaga: kvarcüveg, bevonat nélkül;

–

méretei: a detektorcelláig mért hosszúság = kb. 0,50 m, Ø = 75 m.

Hőmérséklet: 20 °C. CZE–tompítóoldat. 0,196 g R -ciklodextrint 10,0 ml tompító elektrolit-oldatban oldunk. Az oldatot 0,22 µm névleges pórusméretű membránszűrőn megszűrjük. Detektálás: spektrofotométerrel, 214 nm-en. A kapilláris prekondicionálása: a kapillárist, 137,9 kPa nyomást alkalmazva, 5 percen át R vízzel, majd 5 percen át a CZE–tompítóoldattal mossuk. Injektálás: nyomás (3,45 kPa) alkalmazásával, 4 s-ig. Migráció: 15 kV feszültség alkalmazásával. Az elektroforézis időtartama: 35 perc. Relatív migráció a galantaminra (migrációs ideje kb. 18 perc) vonatkoztatva: F-szennyező kb. 1,05. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 2,5, a galantamin és az F-szennyező között.

Követelmény: –

F-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat elektroferogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (0,15%).

Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). A. Természetes eredetű galantamin vizsgálata. Oldószerelegy: B-mozgófázis – A-mozgófázis (10+90 V/V). Vizsgálati oldat. 12 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 5 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt, természetes eredetű galantamint (amely A- és E-szennyezőt is tartalmaz) az oldószereleggyel 5,0 ml-re oldunk.



Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt oktilszililezett szilikagél (5 µm);

–


Mozgófázis: –

A-mozgófázis: 3,15 g R ammónium-formiátot 900 ml R vízben oldunk, az oldat pH-ját R vízmentes hangyasavval 3,8-re beállítjuk, majd térfogatát R vízzel 1000 ml-re kiegészítjük;






0–5

95

5

5–20

95  80

5  20

20–23

80  50

20  50

23–31

50  20

50  80

31–35

20

80

Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 287 nm-en. Injektálás: 10 µl. Szennyezők azonosítása: az A- és E-szennyezők csúcsait a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt, természetes eredetű galantaminhoz mellékelt kromatogram és a b) összehasonlító oldat kromatogramja alapján azonosítjuk. Relatív retenciók a galantaminra (retenciós ideje kb. 12 perc) vonatkoztatva: E-szennyező kb. 0,8; A-szennyező kb. 1,5. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 5,0, az E-szennyező és a galantamin között.


E-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének hatszorosa (0,6%);

–

A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (0,15%);

–

egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%);

–

szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének nyolcszorosa (0,8%);

–


B. Szintetikus úton előállított galantamin vizsgálata. Oldószerelegy: 50 ml R metanolt R vízzel 1000 ml-re hígítunk. Vizsgálati oldat. 0,10 g vizsgálandó anyagot az oldószerelegy 50,0 ml-ében oldunk, majd az oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítjuk.



Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 5,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 2,5 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt, szintetikus galantamint (amely C- és D-szennyezőt is tartalmaz) az oldószereleggyel 5,0 ml-re oldunk. Oszlop: –

méretei: l = 0,10 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt oktadecilszililezett szilikagél (3,5 µm);

–


Mozgófázis: –

A-mozgófázis: 0,79 g R dinátrium-hidrogén-foszfát-dihidrátot és 2,46 g R nátriumdihidrogén-foszfátot R vízzel 1000 ml-re oldunk, és az oldat 950 ml-éhez 50 ml R metanolt elegyítünk;

–




0–6

100

0

6–20

100  95

05

20–35

95  85

5  15

35–50

85  80

15  20

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 230 nm-en. Injektálás: 20 µl. Szennyezők azonosítása: a C- és D-szennyezők csúcsait a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt, szintetikus galantaminhoz mellékelt kromatogram és a b) összehasonlító oldat kromatogramja alapján azonosítjuk. Relatív retenciók a galantaminra (retenciós ideje kb. 16 perc) vonatkoztatva: C-szennyező kb. 0,8; D-szennyező kb. 2,1. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 4,5, a C-szennyező és a galantamin között.


C- és D-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,8-szerese (0,4%);

–

egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,2-szerese (0,10%);

–

szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (1,0%);

–

elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,1-szerese (0,05%).

Palládium: legfeljebb 10 ppm, a szintetikus galantaminban. Atomabszorpciós spektrometria (2.2.23, I. módszer).



Vizsgálati oldat. Megfelelő roncsoló készülékbe mért 1,000 g anyagot R tömény salétromsavval elroncsolunk. A roncsolás befejezése után az oldatot szárazra párologtatjuk. A maradékhoz 0,125 ml R tömény salétromsavat, 0,375 ml R tömény sósavat és 2 ml R vizet adunk. Az így kapott keveréket a maradék feloldódásáig enyhén melegítjük. Kihűlés után az oldatot néhány milliliter R vízzel maradéktalanul megfelelő edénybe öblítjük, majd R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat. A milliliterenként 0,2 µg, 1,0 g, illetve 2,0 µg palládiumot tartalmazó oldatokat R palládium–mértékoldat (20 ppm Pd) hígításával frissen készítjük. A hígításhoz használandó elegy összetétele: 0,25 térfogatrész R tömény salétromsav, 0,75 térfogatrész R tömény sósav és 25,0 térfogatrész R víz. Fényforrás: palládium vájtkatód lámpa. Hullámhossz: 247,6 nm. Nehézfémek (2.4.8/G): legfeljebb 20 ppm. Az anyag 0,250 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 0,5 ml R ólommértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 1,0%. Az anyag 1,000 g-ját szárítószekrényben 4 órán át, 105 °C-on szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 2,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,275 g anyagot 40 ml R vízben oldunk. Az oldathoz 40 ml R etanolt (96%) elegyítünk. 5 ml 0,01 M sósav–mérőoldat hozzáadása után, az oldatot – potenciometriás végpontjelzést alkalmazva – 0,1 M nátrium-hidroxid–mérőoldattal titráljuk. A két inflexiós pont közötti mérőoldatfogyást olvassuk le. 1 ml 0,1 M nátrium-hidroxid–mérőoldattal 36,83 mg C17H22BrNO3 egyenértékű. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni az anyag eredetét: –

természetes eredetű;

–

szintetikus úton előállított.

SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: –

a természetes eredetű galantaminban: A, E,

–

a szintetikus galantaminban: C, D, F.

Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10) című általános fejezetet): –

a természetes eredetű galantaminban: B,


–


a szintetikus galantaminban: A ,B, E.

A. (4aS,8aS)-3-metoxi-11-metil-4a,5,9,10,11,12-hexahidro-6H-[1]benzfuro[3a,3,2-

ef][2]benzazepin-6-on (narwedin),

B. (4aS,6S,8aS)-3-metoxi-11-metil-5,6,9,10,11,12-hexahidro-4aH-[1]benzfuro[3a,3,2-

ef][2]benzazepin-6-ol (epi-galantamin),

C. (4aS,6S,8aR)-3-metoxi-11-metil-5,6,7,8,9,10,11,12-oktahidro-4aH-[1]benzfuro[3a,3,2ef][2]benzazepin-6 (dihidrogalantamin),

D. (4aS,8aS)-3-metoxi-11-metil-9,10,11,12-tetrahidro-4aH-[1]benzfuro[3a,3,2-ef][2]benzazepin-

6-ol (anhidrogalantamin),



E. (4aS,6R,8aS)-3-metoxi-5,6,9,10,11,12-hexahidro-4aH-[1]benzfuro[3a,3,2-ef][2]benzazepin-6-

ol (N-dezmetilgalantamin),

F. (4aR,6S,8aR)-3-metoxi-11-metil-5,6,9,10,11,12-hexahidro-4aH-[1]benzfuro[3a,3,2-

ef][2]benzazepin-6-ol (ent-galantamin).

01/2011:1752

GANCICLOVIRUM Ganciklovir

C9H13N5O4 [82410-32-0]

Mr 255,2

DEFINÍCIÓ 2-Amino-9-[[2-hidroxi-1-(hidroximetil)etoxi]metil]-1,9-dihidro-6H-purin-6-on. Tartalom: 99,0–101,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, nedvszívó, kristályos por. Oldékonyság: vízben kevéssé oldódik; etanolban (96%) alig oldódik. Híg ásványi savak és alkálilúgok oldják. Polimorfiára hajlamos (5.9). AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS ganciklovirral. Amennyiben a szilárd anyagok spektrumai eltérőek, a vizsgálandó anyag és a referenciaanyag 0,10– 0,10 g-ját külön-külön oldjuk kb. 3,6 ml R vízben, 80 °C-on. Az oldatokat jeges vízfürdőben hagyjuk lehűlni. A levált csapadékot kiszűrjük, 3 órán át szárítószekrényben 105 °C-on szárítjuk, és a maradékokból új spektrumokat veszünk fel. VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint az S5 szín– mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). 1,25 g anyagot R nátrium-hidroxid 40 g/l töménységű oldatával 25 ml-re oldunk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29).

Vizsgálati oldat. 30 mg vizsgálandó anyagot ultrahangos kezelést alkalmazva a mozgófázissal 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). A vizsgálati oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 3 mg CRS ganciklovirt ultrahangos kezelést alkalmazva a mozgófázissal 5,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (c). Egy üvegcse CRS ganciklovir-szennyezőkeveréket (amely A-, B-, C-, D-, Eés F-szennyezőt tartalmaz) 1,0 ml b) összehasonlító oldatban oldunk. Oszlop: −

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

−

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, erős kationcserélő szilikagél (10 μm);

−


Mozgófázis: R acetonitrilnek és R trifluorecetsav 0,05 %V/V-os oldatának azonos térfogatarányú elegye. Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: a ganciklovir retenciós idejének 2,5-szerese. Szennyezők azonosítása: az A-, B-, C-, D-, E- és F-szennyező azonosítására a CRS ganciklovirszennyezőkeverékhez mellékelt kromatogramot és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a ganciklovirre (retenciós ideje kb. 14 perc) vonatkoztatva: A-szennyező kb. 0,6; Bszennyező kb. 0,67; C-szennyező kb. 0,71; D-szennyező kb. 0,8; E-szennyező kb. 0,9; F-szennyező kb. 2,0. Rendszeralkalmasság: c) összehasonlító oldat: −

hegy-völgy arány: legalább 5, ahol Hp = az E-szennyezőnek megfelelő csúcs alapvonaltól mért magassága és Hv = az E-szennyező csúcsát a ganciklovir csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának az alapvonaltól mért távolsága.


korrekciós faktorok: a következő szennyezők mennyiségének kiszámításához csúcsterületüket a megfelelő korrekciós faktorral szorozuk: B-szennyező 1,3; F-szennyező 0,7.

−

F-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének négyszerese (0,4%);

−

B-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%);

−

A-, C-, D- és E-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (0,15%);

−

egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs fele (0,05%);

−

összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének hatszorosa (0,6%);

−

elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,3szerese (0,03%).

Nehézfémek (2.4.8): legfeljebb 10 ppm. Az anyag 0,5 g-ját módosított "F" módszerrel vizsgáljuk: a vizsgálati oldatot R tömény kénsav és R tömény salétromsav keveréke helyett 10 ml R tömény salétromsavval készítjük; az egyes oldatok által a membránszűrőkön (névleges pórusméret: 0,45 μm) hagyott foltokat vizuális összehasonlítással értékeljük. Az összehasonlító oldatot 0,5 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 4,0%. Az anyag 0,300 g-ját vizsgáljuk. Oldószerként R metanolt használunk. A vizsgálandó anyag korlátozottan oldódik metanolban. A minta zagy jellegű lesz. Az oldószert minden egyes titrálást követően cserélni kell. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, mint 0,84 NE/mg. A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag – abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására megfelelő eljárást – feleljen meg e vizsgálat követelményének is. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,200 g anyagot 10 ml R vízmentes hangyasavban oldunk. Az oldatot R tömény ecetsavval 60 ml-re hígítjuk, majd potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20) 0,1 M perklórsav–mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav–mérőoldattal 25,52 mg C9H13N5O4 egyenértékű. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B ,C, D, E, F. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): H, I, J.

A. R = CH2-O-CH2-CCl=CH2: 2-amino-9-[[(2-klórprop-2-én-1-il)oxi]metil]-1,9-dihidro-6H-purin-6on,

D. R = CH2-O-CH2-OCH(CH2OH)2: 2-amino-9-[[[2-hidroxi-1-(hidroximetil)etoxi]metoxi]metil]-1,9dihidro-6H-purin-6-on, F. R = H: 2-amino-1,9-dihidro-6H-purin-6-on (guanin),

és enantiomere

B. R = O-CO-CH2-CH3: [(2RS)-2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]-3hidroxipropil]-propanoát, C. R = Cl: 2-amino-9-[[(1RS)-2-klór-1-(hidroximetil)etoxi]metil]-1,9-dihidro-6H-purin-6-on,

és enantiomere

E. 2-amino-9-[[(2RS)-2,3-dihidroxipropoxi]metil]-1,9-dihidro-6H-purin-6-on,

H. 2-amino-7-[[2-hidroxi-1-(hidroximetil)etoxi]metil]-1,7-dihidro-6H-purin-6-on,

I. J.

R = H: [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]propán-1,3-diil]-dipropanoát, R = CO-CH2-CH3: [2-[2-(propanoilamino)-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il]metoxi]propán-1,3diil]-dipropanoát.

Somatropinum

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur.7.0-1

07/2010:2215

IODIXANOLUM Jodixanol

C35H44I6N6O15 [92339-11-2]

Mr 1550

DEFINÍCIÓ 5,5'-[(2-hidroxipropán-1,3-diil)bisz(acetilimino)]bisz[N,N'-bisz(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6trijódbenzol-1,3-dikarboxamid] sztereoizomerjeinek elegye. Tartalom: 98,5–101,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, nedvszívó por. Oldékonyság: vízben bőségesen oldódik; metanolban mérsékelten oldódik; diklórmetánban gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS jodixanollal. B. Folyadékkromatográfia (2.2.29) a "Rokon vegyületek" vizsgálat előírásai szerint, a következő módosításokkal. Injektálás: vizsgálati oldat és b) összehasonlító oldat. Értékelés: a vizsgálati oldat kromatogramján látható három főfolt retenciós ideje egyezzék meg a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható három főfolt retenciós idejével. VIZSGÁLATOK S oldat. 5,0 g anyagot R vízzel 50,0 ml-re oldunk.

Somatropinum


Az oldat külleme. Az S oldatot, anélkül, hogy felforrna, 30 percen át 98 °C-on melegítjük. A szobahőmérsékletűre lehűlt oldat tiszta legyen (2.2.1); színe nem lehet erősebb az S7 szín– mértékoldaténál (2.2.2, II. módszer). E- és H-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 0,250 g vizsgálandó anyagot R vízzel 100,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). A vizsgálati oldat 1,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 5 mg CRS jodixanol-E-szennyezőt és 5 mg CRS jodixanol-H-szennyezőt R vízzel 20,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (c). 5,0 ml vizsgálati oldat és 5,0 ml b) összehasonlító oldat elegyét R vízzel 50,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, aminopropilszililezett szilikagél (5 μm).

Mozgófázis: – A-mozgófázis: R acetonitril – R víz (50+50 V/V); –




0–2

30

70

2 – 27

30 → 68

70 → 32

Áramlási sebesség: 1,7 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 10 μl; vizsgálati oldat, valamint a) és c) összehasonlító oldat. Szennyezők azonosítása: az E- és a H-szennyező azonosításához a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a jodixanolra (1. csúcs) (retenciós ideje kb. 16 perc) vonatkoztatva: E-szennyező (1.csúcs) kb. 0,7; E-szennyező (2. csúcs) kb. 0,8; H-szennyező kb. 1,4. Rendszeralkalmasság: c) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 5,0, az E-szennyező 1. csúcsa és a jodixanol 1. csúcsa között.

Követelmények: – korrekciós faktor: az E-szennyező összes mennyiségének kiszámításához az E-szennyező 1. csúcsának területét 1,7-del szorozzuk; –

H-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének 0,6-szerese (0,6%);

–

E-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének 0,3-szerese (0,3%);

Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 0,250 g vizsgálandó anyagot R vízzel 100,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). A vizsgálati oldat 1,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 25 mg CRS jodixanolt R vízzel 10,0 ml-re oldunk.

Somatropinum


Összehasonlító oldat (c). 5 mg CRS jodixanol-C-szennyezőt és 5 mg CRS jopentolt R vízzel 10,0 ml-re oldunk. Az oldat 5,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (d). 5,0 ml vizsgálati oldat és 5,0 ml c) összehasonlító oldat elegyét R vízzel 50,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm).

Mozgófázis: –

A-mozgófázis: R víz;

–

B-mozgófázis: R acetonitril – R víz (50+50 V/V); Idő (perc)



0–2

94

6

2 – 32

94 → 80

6 → 20

32 – 72

80 → 0

20 → 100

72 – 82

0

100

Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 10 μl; vizsgálati oldat, valamint a), c) és d) összehasonlító oldat. Szennyezők azonosítása: a C-szennyező és a jopentol azonosításához a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a jodixanolra (1. csúcs) (retenciós ideje kb. 27 perc) vonatkoztatva: jopentol (1. csúcs) kb. 0,8; jopentol (2. csúcs) kb. 0,9; C-szennyező (1. csúcs) kb. 1,04; túlalkilezett szennyezők (több csúcs) 1,33–1,70. Rendszeralkalmasság: d) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: alapvonal-elválás a jopentol két csúcsa között;

–

hegy-völgy arány: legalább 1,3, ahol Hp a C-szennyező 1. csúcsának alapvonaltól mért magassága és Hv ezt a csúcsot a jodixanol 1. csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának az alapvonaltól mért távolsága.


korrekciós faktor: a C-szennyező összes mennyiségének kiszámításához a C-szennyező 1. csúcsának területét 1,3-del szorozzuk;

–

C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs összterületének 0,4-szerese (0,4%);

–

túlalkilezett szennyezők (pl. I-szennyező): csúcsterületük nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszege (1,0%);

–

egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének 0,1-szerese (0,10%);

–

szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének 1,5-szerese (1,5%);

Somatropinum

–


elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható két főcsúcs területösszegének 0,05-szorosa (0,05%).

A Gyógyszeranyagok (2034) c. általános cikkely "Rokon vegyületek" bekezdésében feltüntetett határértékeket (2034.-1. táblázat) nem alkalmazzuk. Szabad aromás aminok: legfeljebb 500 ppm. Vizsgálati oldat. 25 ml-es mérőlombikba mért, 0,200 g vizsgálandó anyagot 15,0 ml R vízben oldunk. Összehasonlító oldat.. 5,0 mg CRS johexol-J-szennyezőt R vízzel 5,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 25 ml-es mérőlombikba mért, 10,0 ml-ét 5,0 ml R vízzel elegyítjük. Üres oldat. 25 ml-es mérőlombikba 15,0 ml R vizet mérünk. A következő műveletek során a lombikokat jeges vízben tartjuk, és amíg az összes reagens hozzáadását be nem fejeztük, lehetőség szerint fénytől védjük. A vizsgálati oldatot, az összehasonlító oldatot, valamint az üres oldatot tartalmazó lombikot fénytől védett helyen 5 percre jeges vízbe helyezzük. A lombikok tartalmához kevergetés közben 1,5 ml R1 sósavat elegyítünk. Ezután R nátrium-nitrit 20 g/l-es oldatának 1,0 ml-ét elegyítjük az oldatokhoz; 4 perc várakozás után R szulfamidsav 40 g/l-es oldatának 1,0 ml-ét elegyítjük az oldatokhoz, és a felszabaduló gáz távozásának megszűntéig óvatosan kevergetjük, majd 1 percig állni hagyjuk az oldatokat. (FIGYELEM: jelentős nyomás keletkezik.) Az így kapott oldatokhoz R naftiletiléndiamindihidroklorid – R víz (30 térfogatrész) és R propilénglikol (70 térfogatrész) elegyével frissen készült – 3 g/l-es oldatának 1,0 ml-ét elegyítjük. A lombikokat kiemeljük a jeges vízből, az oldatokat R vízzel 25,0 ml-re hígítjuk, és 5 perc elteltével vizsgáljuk. A vizsgálati oldatból készült elegy színeződésének mértéke nem érheti el az összehasonlító oldatból készült elegy színeződését. Amennyiben a vizsgálati oldatból készült elegy közel azonos színű, vagy sötétebb, mint az összehasonlító oldatból készült elegy, a következő módon járunk el: 495 nm-en, 5 cm-es küvettában meghatározzuk a vizsgálati oldatból készült elegy és az összehasonlító oldatból készült elegy abszorbanciáját (2.2.25); kompenzációs folyadékként az üres oldatot használjuk. A vizsgálati oldatból készült elegy abszorbanciája nem lehet nagyobb, mint az összehasonlító oldatból készült elegyé. Szabad jód. Csiszoltdugós kémcsőbe mért, 2,0 g anyaghoz 20 ml R vizet, 5 ml R toluolt és 5 ml R hígított kénsavat adunk. Erőteljes összerázás után a fázisokat hagyjuk szétválni. A toluolos fázis nem lehet sem vörös, sem rózsaszínű. Jodid: legfeljebb 10 ppm. 5,000 g anyagot R vízzel 20,0 ml-re oldunk. Az oldatot, ezüst indikátorelektródot és megfelelő referencia-elektródot alkalmazva, 0,001 M ezüst-nitrát–mérőoldattal potenciometriásan (2.2.20) titráljuk. 1 ml 0,001 M ezüst-nitrát–mérőoldattal 126,9 μg jodid egyenértékű. Ionos vegyületek (2.2.38): legfeljebb 0,02 %m/m, nátrium-kloridban kifejezve. Használat előtt minden üvegeszközt ötször kiöblítünk R desztillált vízzel. Vizsgálati oldat. 1,0 g vizsgálandó anyagot R vízzel 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat. 20,0 mg R nátrium-kloridot R vízzel 50,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét R vízzel 100,0 ml-re hígítjuk. Megfelelő konduktométerrel mérjük a vizsgálati oldat és az összehasonlító oldat elektromos vezetőképességét. A vizsgálati oldat elektromos vezetőképessége nem lehet nagyobb, mint az összehasonlító oldaté. Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 10 ppm.

Somatropinum


Az S oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot R ólom−mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 4,0%. Az anyag 0,500 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 125 ml-es gömblombikba mért, 0,200 g anyagot R nátrium-hidroxid 50 g/l-es oldatának 25 ml-ében oldunk. Az oldathoz 0,5 g R cinkport adunk, és néhány szem üveggyöngyöt szórunk bele. Az oldatot, visszafolyóhűtőt alkalmazva, egy órán át forraljuk. Lehűlés után a visszafolyóhűtőt 20 ml R vízzel átöblítjük, úgy, hogy az öblítőfolyadékot a gömblombikba juttatjuk. Az oldatot zsugorított üvegszűrőn (40) (2.1.2) megszűrjük, majd a szűrőt néhányszor R vízzel átmossuk. A mosófolyadékot egyesítjük a szüredékkel. Az így nyert oldatot, 5 ml R tömény ecetsav hozzáadása után, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20) haladéktalanul titráljuk 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldattal. 1 ml 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldattal 25,84 mg C35H44I6N6O15 egyenértékű. ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban, fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: C, E, H és túlalkilezett szennyezők. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): A, B, F, G.

A. 5-[acetil-(2,3-dihidroxipropil)amino]-N,N'-bisz(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-trijódbenzol-1,3dikarboxamid (johexol),

B. 5-acetamido-N,N'-bisz(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-trijódbenzol-1,3-dikarboxamid,

Somatropinum


C. 5-[acetil-[3-[[3,5-bisz[(2,3-dihidroxipropil)karbamoil]-2,4,6-trijódfenil]amino]-2hidroxipropil]amino]-N,N'-bisz(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-trijódbenzol-1,3-dikarboxamid,

E. 5-[acetil-[3-[acetil-[3-karbamoil-5-[(2,3-dihidroxipropil)karbamoil]-2,4,6-trijódfenil]amino]-2hidroxipropil]amino]-N,N'-bisz(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-trijódbenzol-1,3-dikarboxamid,

F. 2-[[acetil-[3,5-bisz[(2,3-dihidroxipropil)karbamoil]-2,4,6-trijódfenil]amino]metil]-N,N'-bisz(2,3dihidroxipropil)-5,7-dijód-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoxazin-6,8-dikarboxamid,

G. 4-acetil-2-[[acetil-[3,5-bisz[(2,3-dihidroxipropil)karbamoil]-2,4,6-trijódfenil]amino]metil]-N,N'bisz(2,3-dihidroxipropil)-5,7-dijód-3,4-dihidro-2H-1,4-benzoxazin-6,8-dikarboxamid,

Somatropinum


H. 5-[acetil-[3-[acetil-[3-[[3-[3-[acetil-[3,5-bisz[(2,3-dihidroxipropil)karbamoil]-2,4,6trijódfenil]amino]-2-hidroxipropoxi]-2-hidroxipropil]karbamoil]-5-[(2,3dihidroxipropil)karbamoil]-2,4,6-trijódfenil]amino]-2-hidroxipropil]amino]-N,N'-bisz(2,3dihidroxipropil)-2,4,6-trijódbenzol-1,3-dikarboxamid,

I.

túlalkilezett szennyezők (például): 5-[acetil-[3-[acetil-[3,5-bisz[(2,3-dihidroxipropil)karbamoil]2,4,6-trijódfenil]amino]-2-hidroxipropil]amino]-N-[3-(2,3-dihidroxipropoxi)-2-hidroxipropil]-N'(2,3-dihidroxipropil)-2,4,6-trijódbenzol-1,3-dikarboxamid.

Irbesartanum

Ph.Hg.VIII. – Ph.Eur. 7.0 - 1

04/2010:2465 javított 7.0

IRBESARTANUM Irbezartán

C25H28N6O [138402-11-6]

Mr 428,5

DEFINÍCIÓ 2-Butil-3-[[2'-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil]-1,3-diazaspiro[4.4]non-1-én4-on. Tartalom: 99,0–101,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; metanolban mérsékelten oldódik; diklórmetánban kevéssé oldódik. Polimorfiára hajlamos (5.9). AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS irbezartánnal. Amennyiben a szilárd anyagok spektrumai eltérőek, a vizsgálandó anyagot és a referenciaanyagot külön-külön R metanolban oldjuk, az oldatot 60 °C-on szárazra párologtatjuk, és a maradékokból új spektrumokat veszünk fel.

Irbesartanum


VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint a B7 szín–mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). 0,50 g anyagot 2 M nátrium-hidroxid–oldat (1 térfogatrész) és R2 metanol (9 térfogatrész) elegyével 10 ml-re oldunk. B-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 0,100 g vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 5,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat. 25,0 mg R nátrium-azidot (a B-szennyező nátrium-sója) a mozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 0,25 ml-ét a mozgófázissal 200,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, erősen bázisos anioncserélő gyanta (8,5 μm).

Mozgófázis: R nátrium-hidroxid 4,2 g/l töménységű, R szén-dioxid-mentes vízzel készült oldata. Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: 3 μS érzékenységű vezetőképességi detektorral; önregeneráló anion-elnyomót alkalmazunk. Eluens semlegesítése: kémiai vagy elektrokémiai: –

kémiai: semlegesítő mikromembránon történő folyamatos ellenáramban, detektálás előtti átalakítással: – semlegesítő oldószer: 0,025 M kénsav; – áramlási sebesség: 10 ml/perc; – nyomás: kb. 100 kPa-nak megfelelő.

–

elektrokémiai: például 300 mA.

Injektálás: 200 μl. Kromatografálási idő: 25 perc. Retenciós idő: B-szennyező kb. 14 perc. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: –

jel/zaj viszony: legalább 10, a B-szennyezőnek megfelelő csúcsra számolva.

Követelmény:

Irbesartanum

–


B-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az összehasonlító oldat kromatogramján a megfelelő csúcs területe (10 ppm).

Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29) Tompítóoldat (pH 3,2). 5,5 ml R tömény foszforsavat elegyítünk 950 ml R vízzel. Az elegy pH-ját R trietil-aminnal 3,2-re állítjuk be. Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot R2 metanollal 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot R2 metanollal 20,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R2 metanollal 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 5 mg vizsgálandó anyagot és 5 mg CRS irbezartán-Aszennyezőt R2 metanollal 10,0 ml-re oldunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R2 metanollal 10,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –


–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm).

Mozgófázis: R1 acetonitril – tompítóoldat (pH 3,2) (33+67 V/V). Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 220 nm-en. Injektálás: 10 μl. Kromatografálási idő: az irbezartán retenciós idejének 1,4-szerese. Szennyezők azonosítása: az A-szennyező azonosításához a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenció az irbezartánra (retenciós ideje kb. 23 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,7. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: –

csúcsfelbontás: legalább 3,0, az A-szennyező és az irbezartán között.


A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (0,15%);

–

egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%);

–

szennyezők összesen: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%);

Irbesartanum

–


elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,5-szerese (0,05%).

Nehézfémek (2.4.8/H): legfeljebb 20 ppm. Oldószerelegy: R aceton – R metanol (20+80 V/V). Az anyag 0,25 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 0,5 ml R ólom−mértékoldatot (10 ppm Pb) felhasználva készítjük. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 0,5%. Az anyag 1,00 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,300 g anyagot 50 ml R vízmentes ecetsavban oldunk. Az oldatot potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20) 0,1 M perklórsav– mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav–mérőoldattal 42,85 mg C25H28N6O egyenértékű. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B.

A. 1-(pentanoilamino)-N-[[2'-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4-il]-metil]ciklopentánkarboxamid, N 3− B. trinitrid (azid).

01/2011:2535

LEVETIRACETAMUM Levetiracetam

C8H14N2O2 [102767-28-2]

Mr 170,2

DEFINÍCIÓ (2S)-2-(2-Oxopirrolidin-1-il)butánamid. Tartalom: 98,0–102,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér por. Oldékonyság: vízben igen bőségesen oldódik; acetonitrilben oldódik; hexánban gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS Az azonosítást vagy az A. és a B. pont szerint, vagy a B. és a C. pont szerint végezzük. A. Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): –76 és –82 között. 0,500 g anyagot R vízzel 25,0 ml-re oldunk. B. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS levetiracetammal. C. Enantiomer tisztaság (lásd Vizsgálatok).

VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint a BS6 szín–mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). 2,0 g anyagot R vízzel 10,0 ml-re oldunk. Enantiomer tisztaság. Folyadékkromatográfia (2.2.29); a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Vizsgálati oldat. 0,200 g vizsgálandó anyagot R 2-propanollal 10,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 20,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat. 5 mg vizsgálandó anyagot és 5 mg CRS levetiracetamD-szennyezőt a mozgófázissal 5,0 ml-re oldunk. Oszlop: méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; állófázis: R királis elválasztás céljára szánt szilikagél OD. Mozgófázis: R 2-propanol – R hexán (18+82 V/V); Áramlási sebesség: 0,8 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 205 nm-en. Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: a levetiracetam retenciós idejének 1,4-szerese. Relatív retenció a levetiracetamra (retenciós ideje kb. 12 perc) vonatkoztatva: D-szennyező kb. 0,8. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: csúcsfelbontás: legalább 1,5, a D-szennyező és a levetiracetam között. szimmetrafaktor: legfeljebb 2,0, a levetiracetamra számolva. Követelmény: – D-szennyező: legfeljebb 0,8%.

C-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Oldószerelegy: R víz – R1 acetonitril (7+93 V/V). Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1 mg vizsgálandó anyagot és 1 mg CRS levetiracetam-C-szennyezőt az oldószereleggyel 5,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). 5,0 mg CRS levetiracetam-C-szennyezőt az oldószereleggyel 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; állófázis: R kromatográfiás célra szánt szilikagél (5 μm). Mozgófázis: R tömény kénsav 1,96 g/l-es oldata – R1 acetonitril (7+93 V/V). Áramlási sebesség: 0,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 205 nm-en. Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: a levetiracetam retenciós idejének kétszerese. Relatív retenció a levetiracetamra (retenciós ideje kb. 14 perc) vonatkoztatva: C-szennyező kb. 1,2. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: csúcsfelbontás: legalább 4,0, a levetiracetam és a C-szennyező között. Követelmény: – C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján a megfelelő csúcs területének 0,25-szorosa (250 ppm). Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Oldószerelegy: R víz – R1 acetonitril (4+96 V/V).

Vizsgálati oldat. 50,0 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 25,0 ml-re oldunk. Az oldat 5,0 ml-ét az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). 5 mg vizsgálandó anyagot és 5 mg R 2-pirrolidont az oldószereleggyel 25,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). 50,0 mg CRS levetiracetamot az oldószereleggyel 25,0 ml-re oldunk. Az oldat 5,0 ml-ét az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 20,0 mlre hígítunk. Az oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (d). 5 mg CRS levetiracetam-A-szennyezőt és 5 mg levetiracetam-B-szennyezőt az oldószereleggyel 50,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 50,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 5,0 ml-ét az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; állófázis: R kromatográfiás célra szánt szilikagél (5 μm). Mozgófázis: R tömény kénsav 1,96 g/l-es oldata – R1 acetonitril (4+96 V/V). Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 205 nm-en. Injektálás: 10 μl; vizsgálati oldat, valamint a), c) és d) összehasonlító oldat. Kromatografálási idő: a levetiracetam retenciós idejének kétszerese. Szennyezők azonosítása: az A- és a B-szennyező azonosításához a d) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a levetiracetamra (retenciós ideje kb. 10 perc) vonatkoztatva: A-szennyező kb. 0,5; 2-pirrolidon kb. 1,1; B-szennyező kb. 1,2. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: csúcsfelbontás: legalább 1,5, a levetiracetam és a 2-pirrolidon között. Követelmények:

– korrekciós faktor: a B-szennyező mennyiségének kiszámításához a megfelelő csúcsterületet 0,5-del szorozzuk; A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének hatszorosa (0,3%); B-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,05%); egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,05%); egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,1%); összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének nyolcszorosa (0,4%); elhanyagolási határ: a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,6-szerese (0,03%). Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 10 ppm. 2,0 g anyagot 20 ml R vízben oldunk. Az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot R ólom–mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.32): legfeljebb 0,5%. Az anyag 0,500 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29) a "Rokon vegyületek" vizsgálatban előírtak szerint, a következő módosítással. Injektálás: vizsgálati oldat és b) összehasonlító oldat. A százalékos C8H14N2O2-tartalmat a CRS levetiracetam deklarált tartalma alapján számoljuk ki. SZENNYEZŐK

Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C, D.

és enantiomere A. (2RS)-2-(2-oxopirrolidin-1-il)butánsav,

B. (2Z)-2-(2-oxopirrolidin-1-il)but-2-énamid,

C. piridin-2-ol,

D. (2R)-2-(2-oxopirrolidin-1-il)butánamid ((R)-etiracetam).

01/2011:2177

LUFENURONUM ANHYDRICUM AD USUM VETERINARIUM Lufenuron állatgyógyászati célra, vízmentes

és enantiomere

C17H8Cl2F8N2O3 [103055-07-8]

Mr 511,2

DEFINÍCIÓ 1-[2,5-Diklór-4-[(2RS)-1,1,2,3,3,3-hexafluorpropoxi]fenil]-3-(2,6difluorbenzoil)karbamid. Tartalom: 98,0–102,0% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy halványsárga por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; acetonitrilben bőségesen oldódik; vízmentes etanolban oldódik. Polimorfiára hajlamos (5.9). op: kb. 172 °C. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24).

Összehasonlítás: CRS lufenuronnal. Amennyiben a szilárd anyagok spektrumai eltérőek, a vizsgálandó anyagot és a referenciaanyagot külön-külön R 2-propanolban oldjuk, az oldatot szárazra párologtatjuk, és a maradékokból új spektrumokat veszünk fel. VIZSGÁLATOK Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Oldószerelegy: R víz – R acetonitril (30+70 V/V). Vizsgálati oldat (a). 40,0 mg vizsgálandó anyagot – kb. 10 percig tartó ultrahangozással – az oldószerelegyben oldunk, majd az oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítjuk. Vizsgálati oldat (b). 1,0 ml a) vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml b) vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (b). 7 mg CRS lufenuron-G-szennyezőt az a) vizsgálati oldattal 50,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). Egy üvegcse CRS csúcsazonosításra szánt lufenuront (amely B- és C-szennyezőt is tartalmaz) 1,0 ml oldószerelegyben oldunk. Összehasonlító oldat (d). 40,0 mg CRS lufenuront – kb. 10 percig tartó ultrahangozással – az oldószerelegyben oldunk, majd az oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítjuk. Az oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: − méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,0 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt oktadecilszililezett szilikagél (5 μm); Mozgófázis: − A-mozgófázis: R tömény foszforsav 0,01 %V/V-os oldata; − B-mozgófázis: R acetonitril.

− Idő (perc) 0–5

A-mozgófázis (%V/V) 30

B-mozgófázis (%V/V) 70

5 –15

30 → 10

70 → 90

15 – 17

10

90

Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 255 nm-en. Injektálás: 20 μl; a) vizsgálati oldat, valamint a), b) és c) összehasonlító oldat. Szennyezők azonosítása: a B- és a C-szennyezőt a CRS csúcsazonosításra szánt lufenuronhoz mellékelt kromatogram és a c) összehasonlító oldat kromatogramja alapján azonosítjuk. Relatív retenciók a lufenuronra (retenciós ideje kb. 9 perc) vonatkoztatva: Bszennyező kb. 0,3; C-szennyező kb. 0,7; G-szennyező kb. 0,9. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: − csúcsfelbontás: legalább 3,0, a G-szennyező és a lufenuron között. Követelmények: − korrekciós faktorok: a mennyiségek kiszámításához a következő szennyezők csúcsterületét szorozzuk a megfelelő faktorral: B-szennyező 1,3; Cszennyező 1,3.

− C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének négyszerese (0,4%);

− B-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%);

− egyedi

határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,20%);

− összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének tízszerese (1,0%);

− elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,1%). Nehézfémek (2.4.8/B): legfeljebb 20 ppm. Az anyag 1,0 g-ját 15 térfogatrész R víz és 85 térfogatrész R dioxán elegyének 20 ml-ében oldjuk. Az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot ólom-mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük, amelyet R ólom−mértékoldatból (100 ppm Pb) készítünk 15 térfogatrész R víz és 85 térfogatrész R dioxán elegyével hígítva. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,5%. Az anyag 1,000 g-ját 105 °C-os szárítószekrényben szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk Az izzításhoz porcelán tégelyt alkalmazunk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29) a "Rokon vegyületek" vizsgálat előírása szerint, a következő módosítással. Injektálás: b) vizsgálati oldat és d) összehasonlító oldat. A C17H8Cl2F8N2O3 százalékos tartalmát a CRS lufenuron deklarált tartalma alapján számoljuk ki. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: B, C. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): A, D, E, F, G, H.

A.

2,6-difluorbenzamid,

B.

1-(2,5-diklór-4-hidroxifenil)-3-(2,6-difluorbenzoil)karbamid,

és enantiomere

C.

1-[3-klór-4-[(2RS)-1,1,2,3,3,3-hexafluorpropoxi]fenil]-3-(2,6difluorbenzoil)karbamid,

és enantiomere

D.

1-(2-klór-4-[(2RS)-1,1,2,3,3,3-hexafluorpropoxi]fenil]-3-(2,6difluorbenzoil)karbamid,

és enantiomere

E.

1-(2-klór-6-fluorbenzoil)-3-[2,5-diklór-4-[(2RS)-1,1,2,3,3,3hexafluorpropoxi]fenil]karbamid,

és enantiomere

F.

1-[2,5-diklór-4-[(2RS)-1,1,2,3,3,3-hexafluorpropoxi]fenil]-3-(2fluorbenzoil)karbamid,

G.

[2,5-diklór-4-[[(2,6-difluorbenzoil)karbamoil]amino]fenil]-fenilkarbonát,

H.

1,3-bisz[2,5-diklór-4-(1,1,2,3,3,3-hexafluorpropoxi)fenil]karbamid.

01/2010:2401 javított 6.8

MAGNESII CITRAS DODECAHYDRICUS Magnézium-citrát-dodekahidrát

Mg3(C6H5O7)2.xH2O, ahol x ≈ 12

Mr 451,1 (vízmentes anyagra)

DEFINÍCIÓ [Trimagnézium-[bisz(2-hidroxipropán-1,2,3-trikarboxilát)]]–dodekahidrát. Tartalom: 15,0–16,5% Mg (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, finom por. Oldékonyság: vízben mérsékelten oldódik; etanolban (96%) gyakorlatilag nem oldódik; híg sósavban feloldódik. AZONOSÍTÁS A.

A citrátion azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

B.

A magnéziumion azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

C.

Szárítási veszteség (lásd Vizsgálatok).

VIZSGÁLATOK S oldat. 2,5 g anyagot 15 ml R hígított sósavban melegítéssel oldunk. Az oldatot lehűtjük, majd R desztillált vízzel 100 ml-re hígítjuk.

Az oldat külleme. Az S oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint a BS6 szín–mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). pH (2.2.3): 6,0–8,5. 5,0 g anyagot R szén-dioxid-mentes vízben szétoszlatunk, majd a diszperziót R szén-dioxid-mentes vízzel 100 ml-re hígítjuk; ezután centrifugáljuk, és a tiszta felülúszó pH-ját mérjük. Oxalát: legfeljebb 280 ppm. 0,50 g anyagot 3 ml R tömény sósav és 4 ml R víz elegyében oldunk. Az oldatba 1 g R aktivált cinket szórunk. 5 perc múlva a folyadékot olyan kémcsőbe öntjük, amely R fenilhidrazin-hidroklorid 10 g/l töménységű oldatának 0,25 ml-ét tartalmazza. Az elegyet felforraljuk, majd gyorsan lehűtjük, mérőhengerbe töltjük, és azonos térfogatú R tömény sósavat, valamint 0,25 ml R kálium-[hexaciano-ferrát(III)]–oldatot adunk hozzá; ezután összerázzuk, és 30 percig állni hagyjuk. Amennyiben az oldat rózsaszínűvé válik, ez a színeződés nem lehet erősebb, mint azé az összehasonlító oldaté, amelyet egyidejűleg és azonos módon, R oxálsav 50 mg/l töménységű oldatának 4 ml-ével készítettünk. Szulfát (2.4.13): legfeljebb 0,2%. Az S oldat 3,0 ml-ét R desztillált vízzel 15 ml-re hígítjuk. Kalcium (2.4.3): legfeljebb 0,2%. 2 ml S oldat és 8 ml R desztillált víz elegyéhez kb. 0,2 ml R–ammónia–oldatot adunk, és az így kapott oldatot R desztillált vízzel 15 ml-re hígítjuk. Vas (2.4.9): legfeljebb 100 ppm. Az S oldat 4,0 ml-ét R desztillált vízzel 10 ml-re hígítjuk. Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 10 ppm. Az anyag 5,0 g-ját 15 ml R hígított sósavban melegítve oldjuk. A pH-t R ammónia–oldattal 3,5-re állítjuk be, majd az oldatot R desztillált vízzel 50 mlre hígítjuk. Ezen oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot R ólom−mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): 29,0–36,0%. Az anyag 1,000 g-ját 5 órán át 180±10 °C-os szárítószekrényben szárítjuk.

TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,200 g anyagot 5 ml R hígított sósavban melegítve oldunk. Az oldatot lehűtjük, és 50 ml R víz hozzáadása után az oldat pH-ját R ammónia–oldattal 7,0-re állítjuk be. A magnéziumot komplexometriásan titráljuk (2.5.11). 1 ml 0,1 M nátrium-edetáttal 2,431 mg Mg egyenértékű.

01/2010:2402

MAGNESII CITRAS NONAHYDRICUS Magnézium-citrát-nonahidrát

Mg3(C6H5O7)2.9H2O [153531-96-5]

Mr 613

DEFINÍCIÓ [Trimagnézium-[bisz(2-hidroxipropán-1,2,3-trikarboxilát)]]–nonahidrát. Tartalom: 15,0–16,5% Mg (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, finom por. Oldékonyság: vízben mérsékelten oldódik; etanolban (96%) gyakorlatilag nem oldódik; híg sósavban feloldódik. AZONOSÍTÁS A.

A citrátion azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

B.

A magnéziumion azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

C.

Szárítási veszteség (lásd Vizsgálatok).

VIZSGÁLATOK S oldat. 2,5 g anyagot 15 ml R hígított sósavban melegítéssel oldunk. Az oldatot lehűtjük, majd R desztillált vízzel 100 ml-re hígítjuk.

Az oldat külleme. Az S oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint a BS6 szín–mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). pH (2.2.3): 6,0–8,5. 5,0 g anyagot R szén-dioxid-mentes vízben szétoszlatunk, majd a diszperziót R szén-dioxid-mentes vízzel 100 ml-re hígítjuk; ezután centrifugáljuk, és a tiszta felülúszó pH-ját mérjük. Oxalát: legfeljebb 280 ppm. 0,50 g anyagot 3 ml R tömény sósav és 4 ml R víz elegyében oldunk. Az oldatba 1 g R aktivált cinket szórunk. 5 perc múlva a folyadékot olyan kémcsőbe öntjük, amely R fenilhidrazin-hidroklorid 10 g/l töménységű oldatának 0,25 ml-ét tartalmazza. Az elegyet felforraljuk, majd gyorsan lehűtjük, mérőhengerbe töltjük, és azonos térfogatú R tömény sósavat, valamint 0,25 ml R kálium-[hexaciano-ferrát(III)]–oldatot adunk hozzá. Ezután összerázzuk, és 30 percig állni hagyjuk. Amennyiben az oldat rózsaszínűvé válik, ez a színeződés nem lehet erősebb, mint azé az összehasonlító oldaté, amelyet egyidejűleg és azonos módon, R oxálsav 50 mg/l töménységű oldatának 4 ml-ével készítettünk. Szulfát (2.4.13): legfeljebb 0,2%. Az S oldat 3,0 ml-ét R desztillált vízzel 15 ml-re hígítjuk. Kalcium (2.4.3): legfeljebb 0,2%. 2 ml S oldat és 8 ml R desztillált víz elegyéhez kb. 0,2 ml R–ammónia–oldatot adunk, és az így kapott oldatot R desztillált vízzel 15 ml-re hígítjuk. Vas (2.4.9): legfeljebb 100 ppm. Az S oldat 4,0 ml-ét R desztillált vízzel 10 ml-re hígítjuk. Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 10 ppm. Az anyag 5,0 g-ját 15 ml R hígított sósavban melegítve oldjuk. A pH-t R ammónia–oldattal 3,5-re állítjuk be, majd az oldatot R desztillált vízzel 50 mlre hígítjuk. Ezen oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot R ólom−mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Szárítási veszteség (2.2.32): 24,0–28,0%. Az anyag 1,000 g-ját 5 órán át 180±10 °C-os szárítószekrényben szárítjuk.

TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,200 g anyagot 5 ml R hígított sósavban melegítve oldunk. Az oldatot lehűtjük, és 50 ml R víz hozzáadása után az oldat pH-ját R ammónia–oldattal 7,0-re állítjuk be. A magnéziumot komplexometriásan titráljuk (2.5.11). 1 ml 0,1 M nátrium-edetáttal 2,431 mg Mg egyenértékű.

Melissae folii extractum siccum


01/2010:2524

MELISSAE FOLII EXTRACTUM SICCUM Citromfűlevél száraz kivonat DEFINÍCIÓ Orvosi citromfű levélből (1447) készített száraz kivonat. Tartalom: legalább 2,0% rozmaringsav (C18H16O8; Mr 360,3) (szárított kivonatra). ELŐÁLLÍTÁS A kivonatot a növényi drogból olyan, megfelelő eljárással készítik, amelynek során vagy forró (legalább 70 °C-os) vizet vagy legfeljebb 70 %V/V töménységű etanolnak megfelelő vizes-alkoholos oldószert használnak. SAJÁTSÁGOK Küllem: barna vagy zöldesbarna, amorf por. AZONOSÍTÁS Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Vizsgálati oldat. A vizsgálandó kivonat 0,2 g-jához 5 ml R metanolt adunk. A csapadékos folyadékot ultrahangos fürdőben 5 percig kezeljük, majd szűrjük. Összehasonlító oldat. 1,0 mg R hiperozidot, 1,0 mg R rutint és 5,0 mg R rozmaringsavat 10 ml R metanolban oldunk. Lemez: R VRK szilikagél lemez (5-40 µm) [vagy R VRK szilikagél lemez (210 µm)]. Kifejlesztőszer: R vízmentes hangyasav – R víz – R etil-acetát (6+6+90 V/V). Felvitel: 10 µl [vagy 2 µl] 15 mm-es [vagy 8 mm-es] sávok formájában. Kifejlesztés: 8 cm-es [vagy 6 cm-es] fronttávolságig. Szárítás: levegőn.



Előhívás: a lemezt 5 percig 100 °C-on hevítjük, majd a még meleg lemezt R difenilborinsav-(2-aminoetil)-észter R etil-acetáttal készült 5 g/l töménységű oldatával bepermetezzük és 365 nm-es ultraibolya fényben értékeljük. Értékelés: az összehasonlító oldat és a vizsgálati oldat komatogramján megjelenő fluoreszkáló zónák sorrendjét lásd alább. A vizsgálati oldat kromatogramján további gyengébben fluoreszkáló zónák is megjelenhetnek. A lemez teteje Rozmaringsav: világoskék színnel fluoreszkáló zóna

Erős, világoskék színel fluoreszkáló zóna Kéken fluoreszkáló zóna

———

——— Kéken fluoreszkáló zóna

———

———

Hiperozid: narancsszínnel vagy zöldessárgán fluoreszkáló zóna Világoskék színnel fluoreszkáló zóna Rutin: narancsszínnel vagy zöldessárgán fluoreszkáló zóna Összehasonlító oldat

Vizsgálati oldat

VIZSGÁLATOK Szárítási veszteség (2.8.17): legfeljebb 6,0%. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. A vizsgálat során barna üvegpalackokat használunk. 0,200 g vizsgálandó kivonathoz 50 ml R etanolt (50 %V/V) adunk. A csapadékos folyadékot ultrahangos fürdőben 10 percig kezeljük, majd R etanollal (50 %V/V) 100,0 ml-re hígítjuk, végül membránszűrőn (névleges pórusmérete 0,45 µm) szűrjük. Összehasonlító oldat (a). 20,0 mg CRS rozmaringsavat R etanollal (50 %V/V) 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 20,0 ml-ét R etanollal (50 %V/V) 100,0 ml-re hígítjuk.



Összehasonlító oldat (b). 5 mg R ferulasavat az a) összehasonlító oldattal 50 ml-re oldunk. Oszlop: −

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

−

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktadecilszililezett szilikagél (5 µm).

Mozgófázis: −

A-mozgófázis: R tömény foszforsav – R acetonitril – R víz (1+19+80 V/V);

−

B-mozgófázis: R tömény foszforsav – R metanol – R acetonitril (1+40+59 V/V); Idő (perc)



0 – 20

100 → 55

0 → 45

20 – 25

55 → 0

45 → 100

Áramlási sebesség: 1,2 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 330 nm-en. Injektálás: 20 µl. Relatív retenció a rozmaringsavra (retenciós ideje kb. 11 perc) vonatkoztatva: ferulasav kb. 0,8. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: −

csúcsfelbontás: legalább 4,0, a ferulasav és a rozmaringsav között.

Az anyag százalékos rozmaringsav-tartalmát a következő képlet felhasználásával számítjuk ki: , A1 ⋅ m 2 ⋅ p ⋅ 0,2 A2 ⋅ m1 ahol: A1 =

a rozmaringsav csúcsterülete a vizsgálati oldat kromatogramján;

A2 =

a rozmaringsav csúcsterülete az a) összehasonlító oldat kromatogramján;

m1 =

a vizsgálati oldat készítéséhez használt vizsgálandó kivonat tömege, grammban,

m2 =

az a) összehasonlító oldat készítéséhez használt CRS rozmaringsav tömege, grammban,


p

=


a CRS rozmaringsav százalékos rozmaringsav-tartalma.

01/2011:2234

MEROPENEMUM TRIHYDRICUM Meropenem-trihidrát

C17H25N3O5S.3H2O [119478-56-7]

Mr 437,5

DEFINÍCIÓ (4R,5S,6S)-3-[[(3S,5S)-5-[(Dimetilamino)karbonil]pirrolidin-3-il]szulfanil]-6[(1R)-1-hidroxietil]-4-metil-7-oxo-1-azabiciklo[3.2.0]hept-2-én-2-karbonsav– trihidrát. Fermentációs termékből előállított félszintetikus származék. Tartalom: 97,5–102,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy kissé sárga, kristályos por. Oldékonyság: vízben mérsékelten oldódik; etanolban (96%) és diklórmetánban gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS meropenem-trihidráttal.

VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint az S5 szín–mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). 1,0 g anyagot R nátrium-hidrogén-karbonát 50 g/l-es oldatának 20 ml-ében oldunk. pH (2.2.3): 4,0–6,0. 0,20 g anyagot R szén-dioxid-mentes vízzel 20 ml-re oldunk. Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): –17 és –21 között (vízmentes anyagra). 0,125 g anyagot R vízzel 25,0 ml-re oldunk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Az a) és a b) vizsgálati oldatot, valamint a c) összehasonlító oldatot közvetlenül a felhasználás előtt készítjük. Az a) összehasonlító oldatot elkészítés után 4 °C-on tároljuk, és 6 órán belül felhasználjuk. Oldószerelegy. 1,0 ml R trietil-aminhoz 900 ml R kromatográfiás célra szánt vizet adunk. Az oldat pH-ját R hígított foszforsavval 5,0-re állítjuk be, térfogatát pedig R kromatográfiás célra szánt vízzel 1000,0 ml-re egészítjük ki. Vizsgálati oldat (a). A vizsgálandó anyag 0,100 g-ját az oldószereleggyel 25,0 ml-re oldjuk. Vizsgálati oldat (b). A vizsgálandó anyag 50,0 mg-ját a mozgófázissal 25,0 mlre oldjuk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml a) vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). Az A- és a B-szennyező in situ előállítása céljából 10 ml a) vizsgálati oldatot kb. 20 percen át 60 °C-on melegítünk, vagy úgy is eljárhatunk, hogy 10 ml a) vizsgálati oldatot kb. 8 órán át közönséges hőmérsékleten állni hagyunk. Összehasonlító oldat (c). 50,0 mg CRS meropenem-trihidrátot a mozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Oszlop: − méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

− állófázis: R kromatográfiás célra oktadecilszililezett szilikagél (5 μm);

szánt,

dezaktivált,

utókezelt

− hőmérséklet: 40 °C. Mozgófázis: R1 acetonitril – oldószerelegy (7+100 V/V). Áramlási sebesség: 1,6 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 220 nm-en. Injektálás: 10 μl; a) vizsgálati oldat, valamint a) és b) összehasonlító oldat. Kromatografálási idő: a meropenem retenciós idejének négyszerese. Relatív retenciók a meropenemre (retenciós ideje kb. 6 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,5; B-szennyező kb. 2,2. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: − csúcsfelbontás: legalább 5,0, az A-szennyező és és a meropenem között. Követelmények: − korrekciós faktor: az A-szennyező csúcsterületét 1,6-del szorozzuk.

mennyiségének

kiszámításához

− A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének ötszöröse (0,5%); − B-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%); − egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%); − összes szennyező az A- és a B-szennyező kivételével: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%); − elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,5-szerese (0,05%).

Nehézfémek (2.4.8/G): legfeljebb 10 ppm. Az anyag 0,50 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 0,5 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): 11,4–13,4%. Az anyag 0,100 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): kevesebb, parenterális gyógyszerkészítmények előállítására esetben, ha a készítmény előállítása során nem endotoxinok eltávolítására megfelelő eljárást – követelményének is.

mint 0,125 NE/mg. A szánt anyag – abban az alkalmaznak a bakteriális feleljen meg e vizsgálat

TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29) a "Rokon vegyületek" vizsgálat előírása szerint, a következő módosítással. Injektálás: b) vizsgálati oldat és c) összehasonlító oldat. A százalékos C17H25N3O5S-tartalmat a CRS meropenem-trihidrát deklarált tartalma alapján számoljuk ki. ELTARTÁS Amennyiben az anyag steril, akkor steril, légmentesen záró, garanciazáras tartályban. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni adott esetben, hogy az anyag felhasználható parenterális készítmények előállítására. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B.

A. (4R,5S)-5-[(1S,2R)-1-karboxi-2-hidroxipropil]-3-[[(3S,5S)-5[(dimetilamino)karbonil]pirrolidin-3-il]szulfanil]-4-metil-4,5-dihidro-1Hpirrol-2-karbonsav,

B. (4R,5S,6S)-3-[[(3S,5S)-1-[(2S,3R)-2-[(2S,3R)-5-karboxi-4-[[(3S,5S)-5[(dimetilamino)karbonil]pirrolidin-3-il]szulfanil]-3-metil-2,3-dihidro-1Hpirrol-2-il]-3-hidroxibutanoil]-5-[(dimetilamino)karbonil]pirrolidin-3il]szulfanil]-6-[(1R)-1-hidroxietil]-4-metil-7-oxo-1-azabiciklo[3.2.0]hept-2én-2-karbonsav.

01/2010:2259 javított 7.0

ORBIFLOXACINUM AD USUM VETERINARIUM Orbifloxacin, állatgyógyászati célra

C19H20F3N3O3 [113617-63-3]

Mr 395,4

DEFINÍCIÓ 1-Ciklopropil-7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-5,6,8-trifluor-4-oxo-1,4dihidrokinolin-3-karbonsav. Tartalom: 99,0–101,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy halványsárga kristályok vagy kristályos por. Oldékonyság: vízben alig oldódik; tömény ecetsavban oldódik; vízmentes etanolban gyakorlatilag nem oldódik. Polimorfiára hajlamos (5.9). AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS orbifloxacinnal.

Amennyiben a szilárd anyagok spektrumai eltérőek, a vizsgálandó anyag és a referenciaanyag 0,1-0,1 g-ját külön-külön 12 ml R metanolban oldjuk, az oldatokat rázogatás közben forrásig melegítjük, majd megszűrjük, és lassan hagyjuk lehűlni szobahőmérsékletűre. A kivált csapadékokat vákuum alkalmazásával kiszűrjük, hűtött R metanollal mossuk, majd vákuumban szárítjuk, és az így nyert maradékokból új spektrumokat veszünk fel. VIZSGÁLAT OK Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint a ZS4 szín–mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). 0,4 g anyagot R nátrium-hidroxid 4 g/l töménységű oldatával 20 ml-re oldunk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Tompítóoldat. 5,9 g R trinátrium-citrát 800 ml R vízzel készült oldatához 90 ml R tömény ecetsavat elegyítünk. Az oldat pH-ját R nátrium-hidroxid R vízzel készült, 240 g/l töménységű oldatával 3,5-re állítjuk be, majd az így nyert oldatot R vízzel 1000 ml-re hígítjuk. Vizsgálati oldat. 10 mg vizsgálandó anyagot a tompítóoldattal 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot a tompítóoldattal 50,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a tompítóoldattal 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 10,0 mg R metil-(4-aminobenzoát)ot a tompítóoldattal 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 10,0 ml-ét 5,0 ml vizsgálati oldattal elegyítjük, és az elegyet a tompítóoldattal 50,0 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a tompítóoldattal 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). Egy üvegcse CRS orbifloxacin-szennyezőkeveréket (amely A- és D-szennyezőt tartalmaz) 1,0 ml tompítóoldatban oldunk. Összehasonlító oldat (d). 0,25 ml c) összehasonlító oldatot a tompítóoldattal 1,0 ml-re hígítunk. Oszlop:

− méretei: l = 33 mm, Ø = 4,6 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, dezaktivált, oktadecilszililezett szilikagél (3 μm);

Mozgófázis: R dioxán – R metanol – tompítóoldat (4+11+86 V/V). Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 290 nm-en. Injektálás: 10 μl. Kromatografálási idő: az orbifloxacin retenciós idejének kilencszerese. Szennyezők azonosítása: az A- és a D-szennyező azonosítására a CRS orbifloxacin-szennyezőkeverékhez mellékelt kromatogramot és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók az orbifloxacinra (retenciós ideje kb. 2 perc) vonatkoztatva: A-szennyező kb. 0,5; metil-(4-aminobenzoát) kb. 1,2; D-szennyező kb. 2,5. Rendszeralkalmasság:

− csúcsfelbontás: legalább 2,0, az orbifloxacin és a metil-(4-aminobenzoát) között, a b) összehasonlító oldat kromatogramján.

− jel/zaj viszony: legalább 10, az A-szennyezőre vonatkoztatva, a d) összehasonlító oldat kromatogramján. Követelmények: –

korrekciós faktorok: a következő szennyezők mennyiségének kiszámításához csúcsterületüket a megfelelő faktorral szorozzuk: Aszennyező 2,8; D-szennyező 1,4.

− A- és D-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján a főcsúcs területe (0,2%);

− egyedi

határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,20%);

− összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,4%);

− elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,10%).

Víztartalom (2.5.12): 1,5–2,9%. Az anyag 0,250 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,300 g anyag 100 ml R vízmentes ecetsavval készült oldatát, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20), 0,1 M perklórsav–mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav–mérőoldattal 39,54 mg C19H20F3N3O3 egyenértékű. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, D. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): B, C, E, F, G.

A.

1-ciklopropil-5,7-bisz[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-6,8-difluor-4oxo-1,4-dihidrokinolin-3-karbonsav,

B.

7-[[(2R)-2-aminopropil]amino]-1-ciklopropil-5,6-difluor-4-oxo-1,4dihidrokinolin-3-karbonsav,

C.

R1 = CO2H, R2 = H: 1-ciklopropil-7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]6,8-difluor-4-oxo-1,4-dihidrokinolin-3-karbonsav,

G.

R1 = H, R2 = F: 1-ciklopropil-7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-5,6,8trifluorkinolin-4(1H)-on,

D. 1-ciklopropil-7-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-6,8-difluor-5-hidroxi4-oxo-1,4-dihidrokinolin-3-karbonsav,

E.

1-ciklopropil-5-[(3R,5S)-3,5-dimetilpiperazin-1-il]-6,7,8-trifluor-4-oxo1,4-dihidrokinolin-3-karbonsav,

F. 1-ciklopropil-5,6,7,8-tetrafluor-4-oxo-1,4-dihidrokinolin-3-karbonsav.

07/2010:2416

PRAMIPEXOLI DIHYDROCHLORIDUM MONOHYDRICUM Pramipexol-dihidroklorid-monohidrát

C10H19Cl2N3S.H2O [191217-81-9]

Mr 302,3

DEFINÍCIÓ [(6S)-6-N-Propil-4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzotiazol-2,6-diamin]– dihidroklorid–monohidrát. Tartalom: 99,0–101,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos por. Oldékonyság: vízben bőségesen oldódik; metanolban oldódik; etanolban (96%) mérsékelten, illetve kevéssé oldódik; diklórmetánban gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS Vagy a B, C és D pont, vagy az A, B és D pont szerint azonosítjuk az anyagot. A. Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): –67,0 és –69,5 között (vízmentes anyagra). 0,250 g anyagot R metanollal 25,0 ml-re oldunk. B. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24).

Összehasonlítás: CRS pramipexol-dihidroklorid-monohidráttal. C. Enantiomer tisztaság (lásd: "Vizsgálatok"). D. Az oldattal a kloridion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető. VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint az S6 szín–mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). 0,1 g anyagot R vízzel 10 ml-re oldunk. pH (2.2.3): 2,8–3,4. 0,4 g anyagot R szén-dioxid-mentes vízzel 20 ml-re oldunk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Tompítóoldat. 5 g R nátrium-oktánszulfonát-monohidrátot és 9,1 g R káliumdihidrogén-foszfátot 900 ml R vízben oldunk. Az oldat pH-ját R tömény foszforsavval 3,8-ra állítjuk be, majd az így kapott oldat térfogatát R vízzel 1000 ml-re egészítjük ki. Oldószerelegy: R acetonitril – tompítóoldat (200+800 V/V). Vizsgálati oldat. 75 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 7,5 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt pramipexolt (amely A- B- és C-szennyezőt is tartalmaz) 5,0 ml oldószerelegyben oldunk. Oszlop: –

méretei: l = 0,125 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm);

–


Mozgófázis: –

A-mozgófázis: tompítóoldat;

–

B-mozgófázis: R acetonitril –tompítóoldat (500+500 V/V). Idő (perc)



0 – 15

60 → 20

40 → 80

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 264 nm-en. Injektálás: 5 μl. Szennyezők azonosítása: az A-, B- és C-szennyező azonosításához a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt pramipexolhoz mellékelt kromatogramot, és a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a pramipexolra (retenciós ideje kb. 6 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,7; B-szennyező kb. 1,5; C-szennyező kb. 1,7. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat:

− csúcsfelbontás: legalább 6,0, az A-szennyező és a pramipexol között. Követelmények:

− A-, B- és C-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5szerese (0,15%);

− egyedi


− összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének ötszöröse (0,5%);

− elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,5-szerese (0,05%). Enantiomer tisztaság. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 6 mg vizsgálandó anyagot 5 ml R vízmentes etanollal 20,0 mlre oldunk. Összehasonlító oldat (a). 2 mg CRS pramipexol-D-szennyezőt a mozgófázissal 10 ml-re oldunk. 1,0 ml oldathoz 1 ml vizsgálati oldatot elegyítünk, majd az elegyet a mozgófázissal 20 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml vizsgálati oldatot a mozgófázissal 20,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 10,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: –

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

–

állófázis: R királis elválasztás céljára szánt, OD szilikagél.

Mozgófázis: R dietil-amin – R vízmentes etanol – R hexán (1+150+850 V/V). Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 75 μl. Kromatografálási idő: a pramipexol retenciós idejének 1,5-szerese. Relatív retenció a pramipexolra (retenciós ideje kb. 11 perc) vonatkoztatva: Dszennyező kb. 0,5. Rendszeralkalmasság::

− csúcsfelbontás: legalább 5, a D-szennyező és a pramipexol között az a) összehasonlító oldat kromatogramján.

− szimmetria-faktor: legfeljebb 2,4, a pramipexol-csúcsra vonatkoztatva a b) összehasonlító oldat kromatogramján. Követelmények:

− D-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,5%).

Nehézfémek (2.4.8/H): legfeljebb 10 ppm. Oldószer: R víz. Az anyag 0,500 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 0,5 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 4,5–6,5%. Az anyag 0,500 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,120 g anyagot 150 ml R vízben oldunk. 10 ml 3 M salétromsav hozzáadása után az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20) 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldattal 14,213 mg C10H19Cl2N3S egyenértékű. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C, D. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): E.

A.

(6S)- 4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzotiazol-2,6-diamin,

B.

(6S)-N,N'-dipropil-4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzotiazol-2,6-diamin,

C.

a (6S)-6-N-[3-[(6S)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzotiazol-6-il]-1etil-2-metilpropil]-4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzotiazol-2,6-diamin diasztereomerjeinek elegye,

D.

(6R)-6-N-propil-4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzotiazol-2,6-diamin,

E.

N-[(6S)-2-amino-4,5,6,7-tetrahidro-1,3-benzotiazol-6-il]propánamid.

01/2010:2375

RALOXIFENI HYDROCHLORIDUM Raloxifen-hidroklorid

C28H28ClNO4S [82640-04-8]

Mr 510,0

DEFINÍCIÓ [[6-Hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-1-benzotiofen-3-il]-[4-[2-(piperidin-1il)etoxi]fenil]metanon]–hidroklorid. Tartalom: 97,5–102,0% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: csaknem fehér vagy halványsárga por. Oldékonyság: vízben és acetonban alig oldódik vagy gyakorlatilag nem oldódik; etanolban (96 %V/V) kevéssé oldódik. AZONOSÍTÁS A.

Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS raloxifen-hidrokloriddal.

B.

20 mg vizsgálandó anyagot 2 ml R metanolban oldunk. Az oldattal a kloridion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

VIZSGÁLATOK Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Oldószerelegy: R acetonitril – A-mozgófázis (30+70 V/V). Vizsgálati oldat. 30 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). A C-szennyező in situ előállítása céljából 6 mg vizsgálandó anyaghoz 15 ml R acetonitrilt, 3 ml R vizet és 5 ml stabilizált R tömény hidrogén-peroxid–oldatot adunk. A keveréket legalább 6 órán át 30 °Con tartjuk, majd az A-mozgófázissal 50,0 ml-re hígítjuk. Az így nyert oldat 1,0 ml-éhez 3 mg – az oldószerelegyben előzetesen feloldott – vizsgálandó anyagot adunk, majd az oldatot az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). 3 mg CRS csúcsazonosításra szánt raloxifent (amely A-szennyezőt is tartalmaz) az oldószereleggyel 10,0 ml-re oldunk. Oszlop:

− méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, dezaktivált, oktilszililezett szilikagél (5 μm);

–


Mozgófázis: − A-mozgófázis: R kálium-dihidrogén-foszfát 9,0 g/l töménységű, R tömény foszforsavval pH 3,0-ra beállított oldata; − B-mozgófázis: R acetonitril; Idő (perc)



0–9

75

25

9–40

75→50

25→50

Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 280 nm-en. Injektálás: 10 μl. A-szennyező azonosítása: az A-szennyező azonosításához a CRS csúcsazonosításra szánt raloxifenhez mellékelt kromatogramot és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a raloxifenre (retenciós ideje kb. 18 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,7; C-szennyező kb. 1,2. Rendszeralkalmasság: −

csúcsfelbontás: legalább 3,0, a raloxifen és a C-szennyező között a b) összehasonlító oldat kromatogramján;

–

szimmetriafaktor: legfeljebb 1,8, az a) kromatogramján látható főcsúcsra vonatkoztatva.

összehasonlító

oldat

Követelmények:

− A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%);

− egyedi


− összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének ötszöröse (0,5%);

− elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%). Nehézfémek (2.4.8/C): legfeljebb 10 ppm. 2,0 g anyagot vizsgálunk. Az összehasonlító oldat készítéséhez 2 ml R ólom– mértékoldatot (10 ppm Pb) használunk. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,5%. Az anyag 1,000 g-ját 3 órán át 105 °C-os szárítószekrényben szárítjuk.

Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29) Tompítóoldat (pH 2,5). R kálium-dihidrogén-foszfát 7,2 g/l töménységű, R tömény foszforsavval pH 2,5-re beállított oldata. Vizsgálati oldat. 50,0 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Ezen oldat 5,0 ml-ét a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). 50,0 mg CRS raloxifen-hidrokloridot a mozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Ezen oldat 5,0 ml-ét a mozgófázissal 50,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). A C-szennyező in situ előállítása céljából 6 mg vizsgálandó anyaghoz 15 ml R acetonitrilt, 3 ml R vizet és 5 ml stabilizált R tömény hidrogén-peroxid–oldatot adunk. A keveréket legalább 6 órán át 30 °Con tartjuk, majd a tompítóoldattal (pH 2,5) 50,0 ml-re hígítjuk. Oszlop:

− méretei: l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, dezaktivált, oktilszililezett szilikagél (3,5 μm);

–


Mozgófázis: R acetonitril – tompítóoldat (pH 2,5) (33+67 V/V). Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 280 nm-en. Injektálás: 10 μl. Kromatografálási idő: a raloxifen retenciós idejének kétszerese. Relatív retenció a raloxifenre (retenciós ideje kb. 3 perc) vonatkoztatva: Cszennyező kb. 1,2. Rendszeralkalmasság:

−

csúcsfelbontás: legalább 2,0, a raloxifen és a C-szennyező között a b) összehasonlító oldat kromatogramján; szükség esetén módosítjuk az acetonitril koncentrációját a mozgófázisban.

–

szimmetriafaktor: legfeljebb 1,8, az a) kromatogramján látható főcsúcsra vonatkoztatva.

összehasonlító

oldat

A százalékos C28H28ClNO4S-tartalmat a CRS raloxifen-hidroklorid deklarált tartalma alapján számoljuk ki. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyező: A. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): B, C.

A. [6-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-7-[4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]benzoil]-1benzotiofen-3-il]-[4-[2-(piperidin-1-il)etoxi]fenil]metanon,

B.

[6-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-1-benzotiofen-7-il]-[4-[2-(piperidin-1il)etoxi]fenil]metanon,

C.

[6-hidroxi-2-(4-hidroxifenil)-1-benzotiofen-3-il]-[4-[2-(piperidin-1il)etoxi]fenil]metanon–N-oxid.

01/2011:1796

SUCRALFATUM Szukralfát

C12H30Al8O51S8[Al(OH)3]n[H2O]n' ahol n = 8–10 és n' = 22–31. DEFINÍCIÓ β-D-Fruktofuranozil-α-D-glükopiranozid-oktakisz(dihidroxi-alumínium-szulfát) 8-10 molekula alumínium-hidroxiddal és 22-31 molekula vízzel. Tartalom: − β-D-fruktofuranozil-α-D-glükopiranozid-oktakisz-szulfát (szacharózoktaszulfát) (C12H14O35S88– ; Mr 975): 30,0–36,0%. − alumínium (Al; Ar 26,98): 16,5–18,5%. SAJÁTSÁGOK Küllem. fehér vagy csaknem fehér, amorf por. Oldékonyság: vízben, etanolban (96%) és diklórmetánban gyakorlatilag nem oldódik; híg ásványi savak és alkálilúgok oldják.

AZONOSÍTÁS A.

Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS szukralfáttal.

B.

2 g anyagot 10 ml 0,1 M sósavval felforralunk. Az oldatot lehűtjük, és 0,1 M nátrium-hidroxid–oldattal semlegesítjük. Az oldat 5 ml-éhez 0,15 ml frissen készített R réz(II)-szulfát–oldatot és 2 ml frissen készített R hígított nátrium-hidroxid–oldatot elegyítünk. Az oldat kék színű és tiszta lesz, és forralás után is ilyen marad. A forró oldatot 4 ml R hígított sósavval elegyítjük, és 1 percig forraljuk. Ezután 4 ml R hígított nátrium-hidroxid–oldatot adunk hozzá: azonnal narancsszínű csapadék válik le.

C.

Kb. 15 mg anyagot 0,5 ml R hígított sósav és 2 ml R víz elegyében oldunk. Az oldattal az alumíniumion azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

VIZSGÁLATOK A-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 450,0 mg vizsgálandó anyagot R nátrium-hidroxid 88 g/l-es oldatának és R tömény kénsav 196,2 g/l-es oldatának azonos térfogatarányú elegyével 10,0 ml-re oldunk. Az oldat pH-ját R nátrium-hidroxid 4 g/l-es oldatának – mérsékelt rázogatás közben történő – haladéktalan hozzáadásával megközelítőleg 2,3-ra állítjuk, pontosan mérve a hozzáadott milliliterek számát (V). Az oldatot ezután (15,0 – V) ml R vízzel hígítjuk, majd 1 percen át rázogatjuk. Ha ezután a pH értéke nem esne 2,3 és 3,5 közé, akkor az eljárást R nátrium-hidroxid 4 g/l-es oldatának megfelelően eltérő térfogatával megismételjük. Összehasonlító oldat (a). 40,0 mg CRS kálium-szacharóz-oktaszulfátot a mozgófázissal 5,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml a) összehasonlító oldatot a mozgófázissal 10,0 ml-re hígítunk. Oszlop: − méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,0 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt aminopropilszilil szilikagél (5 μm).

Mozgófázis: R ammónium-szulfát R tömény foszforsavval pH 3,5-re beállított 70 g/l -es oldata. Áramlási sebesség: 1 ml/perc. Detektálás: differenciál-refraktométerrel. Injektálás: 50 μl; vizsgálati oldat és b) összehasonlító oldat. Relatív retenció szacharóz-oktaszulfátra (retenciós ideje kb. 6 perc) vonatkoztatva: A-szennyező kb. 0,6. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: − elméleti tányérszám: legalább 400; − szimmetriafaktor: legfeljebb 4,0. Követelmény: − A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (5,0%). Semlegesítő kapacitás. 0,25 g anyagot 100,0 ml, előzetesen 37 °C-ra melegített 0,1 M sósav–mérőoldatban – 1 órán át 37 °C-os vízfürdőben folyamatos keverés közben – diszpergálunk. A lehűtött oldat 20,0 ml-ét 0,1 M nátrium-hidroxid–mérőoldattal pH 3,5-ig titráljuk. Legfeljebb 14,0 ml 0,1 M nátrium-hidroxid–mérőoldat fogyhat. Klorid (2.4.4): legfeljebb 0,50%. 0,10 g anyagot 5 ml R hígított salétromsavban oldunk, és az oldatot R vízzel 50 ml-re hígítjuk. Ezen oldat 5 ml-ét R vízzel 15 ml-re hígítjuk. Arzén (2.4.2/A): legfeljebb 4 ppm. 0,25 g vizsgálandó anyagot roncsolólombikba mérünk, és 5 ml R tömény kénsavat, majd óvatosan néhány milliliter R tömény hidrogén-peroxid–oldatot adunk hozzá. Az oldatot forrásig melegítjük. A feltisztult és színtelen oldat melegítését a víz és lehetőleg minél több kénsav eltávolításáig folytatjuk. A maradékot R vízzel 25 ml-re hígítjuk. Nehézfémek (2.4.8/F): legfeljebb 10 ppm. Az anyag 2,0 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 2 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük.

TARTALMI MEGHATÁROZÁS Alumínium. 1,0 g anyagot 10 ml R 6 M sósavban diszpergálunk. A diszperziót 70 °C-on vízfürdőben, folyamatos kevertetés közben 5 percig melegítjük. Ezután szobahőmérsékletűre hűtjük, a teljes mennyiséget maradéktalanul átvisszük egy mérőlombikba, és gondos elegyítéssel R vízzel 250,0 ml-re hígítjuk, majd megszűrjük. A szüredék első részletét elöntjük. Ezután 10,0 ml szöredéket 10,0 ml 0,1 M nátrium-edetát–mérőoldattal, majd R ammóniumacetát–oldat és R hígított ecetsav azonos térfogatarányú keverékének 30 mlével elegyítünk. Az elegyet vízfürdőben 70 °C-on 5 percig melegítjük, majd lehűtjük, és R etanol (96%) 25 ml-ét, valamint R ditizon R etanollal (96%) frissen készített, 0,25 g/l-es oldatának 1 ml-ét adjuk hozzá. A nátrium-edetát feleslegét 0,1 M cink-szulfát–mérőoldattal titráljuk; a tirálást addig folytatjuk, míg az oldat rózsaszínű nem lesz. 1 ml 0,1 M nátrium-edetát–mérőoldattal 2,968 mg Al egyenértékű. Szacharóz-oktaszulfát. Folyadékkromatográfia (2.2.29) az A-szennyező vizsgálatánál előírtak szerint, de a következő eltérésekkel. Mozgófázis: R ammónium-szulfát R tömény foszforsavval pH 3,5-re beállított 132 g/l -es oldata. Injektálás: vizsgálati oldat és a) összehasonlító oldat. A százalékos C12H14O35S8-tartalmat a CRS kálium-szacharóz-oktaszulfát deklarált tartalmából számoljuk ki, 0,757-del szorozva a kálium-szacharózoktaszulfát-tartalmat. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyező: A.

R = SO3H és H aránya 7:1.

A. β-D-fruktofuranozil-α-D-glükopiranozid-heptakisz(hidrogén-szulfát).

07/2010:2420

TIOTROPII BROMIDUM MONOHYDRICUM Tiotrópium-bromid-monohidrát

C19H22BrNO4S2.H2O

Mr 490,4

DEFINÍCIÓ [(1R,2R,4S,5S,7s)-7-[[2-Hidroxi-2,2-di(tiofén-2-il)]acetil)oxi]-9,9-dimetil-3oxa-9-azoniatriciklo[3.3.1.02,4]nonán]-bromid–monohidrát. Tartalom: 98,5–101,5% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy sárgásfehér por, illetve kristályok. Oldékonyság: vízben mérsékelten oldódik; diklórmetánban gyakorlatilag nem oldódik.

metanolban

oldódik;

AZONOSÍTÁS A.

Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS tiotrópium-bromid-monohidráttal.

B.

Az oldattal a bromidion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető.

VIZSGÁLATOK

Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1). Színe nem lehet erősebb, mint az S6 szín–mértékoldaté (2.2.2, II. módszer). 0,2 g anyagot R vízzel 20 ml-re oldunk. G- és H-szennyező. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Az oldatokat közvetlenül felhasználás előtt készítjük. Oldószerelegy. 1 térfogatrész 1 M sósavat R metanollal 100-szorosára hígítunk. Vizsgálati oldat. 0,40 g vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 10 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (a). Egy üvegcse CRS tiotrópium-szennyezőkeveréket (amely 40 μg G-szennyezőt és 40 μg H-szennyezőt tartalmaz) 1,0 ml oldószerelegyben oldunk. Összehasonlító oldat (b). 0,1 ml vizsgálati oldatot 0,1 ml a) összehasonlító oldattal elegyítünk. Lemez: R VRK szilikagél F254 lemez (2-10 μm). Kifejlesztőszer: R víz – R vízmentes hangyasav – R acetonitril – R diklórmetán (10+15+35+50 V/V). Felvitel: 10–10 μl vizsgálati oldat és a) összehasonlító oldat, valamint 20 μl b) összehasonlító oldat. Kifejlesztés: a lemezmagasság kétharmadáig. Szárítás: levegőn. Előhívás: a lemezt a foltok jól láthatóvá válásáig (kb. 15 perc) jód-gőztérbe helyezzük, és kiemelés után késedelem nélkül értékeljük. RF-értékek: G-szennyező kb. 0,33; H-szennyező kb. 0,38; tiotrópium kb. 0,64. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: −

a kromatogramon három, egymástól jól elkülönülő folt látható.


G-szennyező: a G-szennyezőnek megfelelő folt nem lehet erősebb, mint a megfelelő folt az a) összehasonlító oldat kromatogramján (0,1%);

−

H-szennyező: a H-szennyezőnek megfelelő folt nem lehet erősebb, mint a megfelelő folt az a) összehasonlító oldat kromatogramján (0,1%).

Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Minden oldatot fénytől védett helyen készítünk. Vizsgálati oldat. 50,0 mg vizsgálandó anyagot a B-mozgófázissal 25,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 5,0 mg CRS tiotrópium-F-szennyezőt a Bmozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Az oldat 1,0 ml-ét a B-mozgófázissal 25,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 4 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt tiotrópiumot (amely A-, C- és E-szennyezőt is tartalmaz) 2,0 ml Bmozgófázisban oldunk. Összehasonlító oldat (c). 1,0 ml vizsgálati oldatot a B-mozgófázissal 100,0 mlre hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a B-mozgófázissal 10,0 ml-re hígítjuk. Oszlop:

− méretei: l = 0,15 m, Ø = 3,0 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, propilszililezett szilikagél (3,5 μm); − hőmérséklet: 50 °C. Mozgófázis: –

A-mozgófázis: 1,0 g R nátrium-metánszulfonátot és 5,0 g R káliumdihidrogén-foszfátot kb. 980 ml R vízben oldunk. Miután az oldat pH-ját R hígított foszforsavval 3,0-ra beállítottuk, térfogatát R vízzel kiegészítjük 1000 ml-re.

– B-mozgófázis: R metanol – R acetonitril – A-mozgófázis (10+40+50 V/V); Idő (perc)



0–3

90

10

3 – 17

90 → 80

10 → 20

17 – 28

80 → 25

20 → 75

28 – 30

25

75

Áramlási sebesség: 1,2 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 240 nm-en. Injektálás: 5 μl. Szennyezők azonosítása: az A-, C- és E-szennyező azonosításához a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt tiotrópiumhoz mellékelt kromatogramot és a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a tiotrópiumra (retenciós ideje kb. 15 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,5; C-szennyező kb. 1,2; E-szennyező kb. 1,7; F-szennyező kb. 1,8. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: −

csúcsfelbontás: legalább 2,4, a tiotrópium és a C-szennyező között.


korrekciós faktorok: a következő szennyezők mennyiségének kiszámításához a megfelelő csúcsterületeket a következő faktorokkal szorozzuk: A-szennyező 0,5; E-szennyező 0,5;

− C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%);

− F-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (0,15%);

− A- és E-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5szerese (0,15%);

− egyedi

határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%);

− összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat háromszorosa (0,3%);

kromatogramján

látható

főcsúcs

területének

− elhanyagolási határ: a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%). Nehézfémek (2.4.8/H): legfeljebb 10 ppm. Oldószerelegy: R víz – R metanol (10+90 V/V). 0,50 g vizsgálandó anyagot, kb. 10 percig tartó ultrahangos kezelést alkalmazva, 20 ml oldószerelegyben oldunk. Az összehasonlító oldatot 0,5 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): 2,5–4,0%. Az anyag 0,300 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,35 g anyagot 100 ml R vízben oldunk, és 10 ml R2 hígított salétromsav hozzáadása után az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20) 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldattal 47,24 mg C19H22BrNO4S2 egyenértékű. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, C, E, F, G, H. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): B, D, I, J, K.

A.

2-hidroxi-2,2-di(tiofén-2-il)ecetsav,

B.

. [(1R,2R,4S,5S,7s)-9-metil-3-oxa-9-azatriciklo[3.3.1.02,4]nonán-7-il]-[2hidroxi-2,2-di(tiofén-2-i)acetát],

C.

[(1R,3s,5S)-3-[[2-hidroxi-2,2-di(tiofén-2-il)acetil]oxi]-8,8-dimetil-8azoniabiciklo[3.2.1]okt-6-én]-bromid,

D.

[(1R,3s,5S)-8-metil-8-azabiciklo[3.2.1]okt-6-én-3-il]-[2-hidroxi-2,2di(tiofén-2-il)acetát],

E.

metil-[2-hidroxi-2,2-di(tiofén-2-il)acetát´],

F.

(ditiofén-2-il)metanon,

G.

[(1R,2R,4S,5S,7s)-7-hidroxi-9,9-dimetil-3-oxa-9azoniatriciklo[3.3.1.02,4]nonán]-bromid,

és enantiomere

H.

[(1s,3RS,4RS,5RS,7SR)-4-hidroxi-6,6-dimetil-2-oxa-6azoniatriciklo[3.3.1.03,7]nonán]-bromid,

I.

[(1R,2R,4S,5S,7r)-7-[[2-hidroxi-2,2-di(tiofén-2-il)acetil]oxi]-9,9-dimetil3-oxa-9-azoniatriciklo[3.3.1.02,4]nonán]-bromid,

J.

[(1R,3s,5S,8s)-8-(klórmetil)-3-[[2-hidroxi-2,2-di(tiofén-2-il)acetil]oxi]-8metil-8-azoniabiciklo[3.2.1]okt-6-én]-klorid,

K.

[(1R,2R,4S,5S,7s)-9-acetil-3-oxa-9-azatriciklo[3.3.1.02,4]nonán-7-il]-[2hidroxi-2,2-di(tiofén-2-il)acetát].

07/2010:2297

TREHALOSUM DIHYDRICUM Trehalóz-dihidrát

C12H22O11.2H2O [6138-23-4]

Mr 378,3

DEFINÍCIÓ α-D-Glükopiranozil-α-D-glükopiranozid–dihidrát (α,α-trehalóz–dihidrát). Keményítő enzimatikus átalakítása útján állítják elő. Tartalom: 97,0–102,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos por. Oldékonyság: vízben bőségesen oldódik; metanolban kevéssé oldódik; etanolban (96%) gyakorlatilag nem oldódik. AZONOSÍTÁS A.

Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS trehalóz-dihidráttal.

B.

2 g anyagot 5 ml R vízben oldunk. Az oldat 1 ml-éhez R 1-naftol 50 g/l-es, R etanollal (96%) készült oldatának 0,4 ml-ét elegyítjük. A gondosan elegyített oldathoz óvatosan 2 ml R tömény kénsavat adagolunk. Az érintkezési felületen ibolya színeződés alakul ki.

C.

1 g anyagot 25 ml R vízben oldunk. Az oldat 2 ml-éhez 1 ml R hígított sósavat elegyítünk. Az elegyet 20 percen át szobahőmérsékleten hagyjuk állni, majd R nátrium-hidroxid 40 g/l-es oldatának 4 ml-ét, és R glicin 40 g/l-es oldatának 2 ml-ét elegyítjük hozzá. Az oldat, 10 percen át vízfürdőben melegítve, nem színeződhet barnára.

VIZSGÁLATOK S oldat. 10,0 g anyagot R desztillált vízből készült, R szén-dioxid-mentes vízzel 100,0 ml-re oldunk. Az oldat külleme. Az S oldat tiszta legyen (2.2.1) és színtelen (2.2.2, II. módszer). pH (2.2.3): 4,5–6,5. Az S oldatot vizsgáljuk. Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): +197 és +201 között (vízmentes anyagra). Az S oldatot vizsgáljuk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 0,100 g vizsgálandó anyagot R vízzel 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 0,100 g CRS trehalóz-dihidrátot R vízzel 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml vizsgálati oldatot R vízzel 100,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (c). 5,0 ml b) összehasonlító oldatot R vízzel25,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (d). 25 mg R glükózt (A-szennyező) és 25 mg R maltotriózt R vízben oldunk, az oldathoz 2,5 ml a) összehasonlító oldatot elegyítünk, és az így kapott oldatot R vízzel 10,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: −


−

állófázis: R erősen savas kationcserélő gyanta (nátrium-formában) (6 μm);

−


Mozgófázis: R víz. Áramlási sebesség: 0,4 ml/perc. Detektálás: refraktométerrel, 40 °C-on. Injektálás: 20 μl; vizsgálati oldat, valamint b), c) és d) összehasonlító oldat. Kromatografálási idő: a trehalóz retenciós idejének kétszerese. Szennyezők azonosítása: az A- és a B-szennyező azonosításához a d) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk; a B-szennyező retenciós ideje megegyezik a maltotriózéval. Relatív retenciók a trehalózra (retenciós ideje kb. 15 perc) vonatkoztatva: Bszennyező kb. 0,9; A-szennyező kb. 1,2. Rendszeralkalmasság: d) összehasonlító oldat: −

csúcsfelbontás: legalább 1,5, a maltotrióz és a trehalóz között.


A- és B-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,5-szerese (0,5%);

−

egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,2%);

−

összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (1,0%);

−

elhanyagolási határ: a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,5-szerese (0,1%).

Klorid (2.4.4): legfeljebb 125 ppm.

A vizsgálathoz 4 ml S oldatot R vízzel 15 ml-re hígítunk. Szulfát (2.4.13): legfeljebb 200 ppm. A vizsgálathoz 7,5 ml S oldatot R desztillált vízzel 15 ml-re hígítunk. Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 5 ppm. 4,0 g anyagot R vízzel 20 ml-re oldunk. Az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot R ólom−mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Oldódó keményítő. 1 g anyagot 10 ml R vízben oldunk. Az oldathoz 0,1 ml R1 jód–oldatot elegyítünk. Az oldat nem kékülhet meg. Víztartalom (2.5.12): 9,0–11,0%. Az anyag 0,10 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. Mikrobiológiai szennyezés Ha az anyagot parenterális gyógyszerkészítmény előállításához használják: –

TAMC: elfogadási határérték 102 CFU/g (2.6.12).

Ha az anyagot nem parenterális gyógyszerkészítmény előállításához használják: –

TAMC: elfogadási határérték 103 CFU/g (2.6.12);

–

TYMC: elfogadási határérték 102 CFU/g (2.6.12);

–

Escherichia coli nem lehet jelen (2.6.13);

–

Salmonella nem lehet jelen (2.6.13).

Bakteriális endotoxinok (2.6.14). A parenterális gyógyszerkészítmények előállítására szánt anyag – abban az esetben, ha a készítmény előállítása során nem alkalmaznak a bakteriális endotoxinok eltávolítására megfelelő eljárást – feleljen meg e követelménynek is: –

ha a parenterális gyógyszerkészítmény a trehalóz-dihidrátot 100 g/l vagy ennél kisebb koncentrációban tartalmazza: legfeljebb 4 NE/g,

–

ha a parenterális gyógyszerkészítmény a trehalóz-dihidrátot 100 g/lnél nagyobb koncentrációban tartalmazza: legfeljebb 2,5 NE/g.

TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29) a "Rokon vegyületek" vizsgálat előírásai szerint, a következő módosítással. Injektálás: vizsgálati oldat és a) összehasonlító oldat. A százalékos trehalóztartalmat a CRS trehalóz-dihidrát deklarált tartalma alapján számoljuk ki. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni –

adott esetben a bakteriális endotoxinok maximális koncentrációját;

–

adott esetben azt, hogy az anyag alkalmas parenterális gyógyszerkészítmény előállítására.

SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B.

és C*-epimere

A. (+)-D-glükopiranóz (glükóz),

B. oligoszacharidok, főként glükoziltrehalózok: α-D-glükopiranozil-[α-Dglükopiranozil-(1→4)-α-D-glükopiranozid] (4-O-glükoziltrehalóz vagy α-D-maltozil-α-D-glükozid) és [α-D-glükopiranozil-(1→6)-α-Dglükopiranozil]-α-D-glükopiranozid (6-O-glükoziltrehalóz vagy α-Dizomaltozil-α-D-glükozid) keveréke.

01/2011:2182

TRIMEBUTINI MALEAS Trimebutin-maleát

és enantiomere

C26H33NO9 [34140-59-5]

Mr 503,5

DEFINÍCIÓ [(2RS)-2-(Dimetilamino)-2-fenilbutil)-[3,4,5-trimetoxibenzoát]–(Z)-buténdisav (1/1). Tartalom: 99,0–101,5% (szárított anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, kristályos por. Oldékonyság: vízben kevéssé oldódik; acetonitrilben oldódik; acetonban mérsékelten oldódik; etanolban (96%) kevéssé oldódik. op: kb. 133 °C. AZONOSÍTÁS Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS trimebutin-maleáttal.

VIZSGÁLATOK Az oldat külleme. Az oldat tiszta legyen (2.2.1) és színtelen (2.2.2, II. módszer). 0,5 g anyagot R acetonnal – ultrahangos kezelést alkalmazva – 100 ml-re oldunk. Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Oldószerelegy. 0,24 g R vízmentes nátrium-dihidrogén-foszfátot 180 ml R vízben oldunk. Az oldatot R hígított foszforsavval pH 2,5 értékűre állítjuk be, majd R vízzel 200 ml-re hígítjuk. Végül 50 ml R acetonitrilt elegyítünk hozzá. Vizsgálati oldat. 10 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). 5 mg R metil-3,4,5-trimetoxibenzoátot (C-szennyező) az oldószerelegy 10,0 ml-ében oldunk. Az oldat 1.0 ml-ét az oldószereleggyel 20,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). Egy üvegcse CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt trimebutint (amely D- és E-szennyezőt is tartalmaz) a b) összehasonlító oldat 1,0 ml-ében oldunk. Oszlop: − méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm), − hőmérséklet: 25 °C. Mozgófázis: − A-mozgófázis: 3,6 g R vízmentes nátrium-dihidrogén-foszfátot 990 ml R vízben oldunk. Az oldatot R tömény foszforsavval pH 3,0 értékűre állítjuk be, majd R vízzel 1000 ml-re hígítjuk. − B-mozgófázis: R1 acetonitril;

Idő (perc)



0–3 3 – 6,5

78

22

6,5 – 15 15 – 35

78 → 65

22 → 35

65 → 60 60

35 → 40 40

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel 215 nm-en. Injektálás: 20 μl; vizsgálati oldat és a) összehasonlító oldat. Szennyezők azonosítása: a C-, a D- és az E-szennyező azonosításához a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt trimebutinhoz mellékelt kromatogramot és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a trimebutinra (retenciós ideje kb. 12 perc) vonatkoztatva: maleinsav kb. 0,17; E-szennyező kb. 0,9; D-szennyező kb. 1,3; C-szennyező kb. 1,4. Rendszeralkalmasság: c) összehasonlító oldat: − csúcsfelbontás: legalább 1,5, a D- és a C-szennyező között; − hegy-völgy arány: legalább 10, ahol Hp = az E-szennyezőnek megfelelő csúcs alapvonaltól mért magassága és Hv = az E-szennyező csúcsát a trimebutin csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának az alapvonaltól mért távolsága. Követelmények: − E-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének hatszorosa (0,6%); − egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%); − összes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének tízszerese (1,0%);

− elhanyagolási határ: az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,5-szerese (0,05%); a maleinsavnak megfelelő csúcsot nem vesszük figyelembe. Nehézfémek (2.4.8/B): legfeljebb 10 ppm. Az anyag 2,0 g-ját 15 térfogatrész R víz és 85 térfogatrész R dioxán elegyének 20 ml-ében oldjuk. Az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot ólom–mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük, amelyet R ólom−mértékoldat (100 ppm Pb) hígításával készítünk. A hígításhoz 15 térfogatrész R víz és 85 térfogatrész R dioxán elegyét használjuk. Szárítási veszteség (2.2.32): legfeljebb 0,5%. Az anyag 1,000 g-ját 105 °C-os szárítószekrényben szárítjuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,300 g anyagot 50 ml R vízmentes ecetsavban oldunk. Az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20) 0,1 M perklórsav– mérőoldattal titráljuk. 1 ml 0,1 M perklórsav–mérőoldattal 50,35 mg C26H33NO9 egyenértékű. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyező: E. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): A, B, C, D.

és enantiomere

A. (2RS)-2-(dimetilamino)-2-fenilbutanol,

B. 3,4,5-trimetoxibenzoesav,

C. metil-(3,4,5-trimetoxibenzoát),

és enantiomere

D. [(1RS)-1-[(dimetilamino)metil]-1-fenilpropil]-(3,4,5-trimetoxibenzoát),

és enantiomere

E. [(2RS)-2-(metilamino)-2-fenilbutil]-(3,4,5-trimetoxibenzoát).

01/2011:2442

VACCINUM MORBILLORUM, PAROTITIDIS, RUBELLAE ET VARICELLAE VIVUM Kanyaró, mumpsz, rubeola és bárányhimlő vakcina (élő)

DEFINICIÓ A kanyaró, mumpsz, rubeola és bárányhimlő élő vakcina a kanyaró-, mumpsz- és rubeola vírus, valamint a humán herpeszvírus-3 megfelelő legyengített (attenuált) törzseiből készült, fagyasztva szárított készítmény. A vakcinát közvetlenül a felhasználás előtt, a feliraton megadott módon feloldva tiszta folyadék nyerhető, amely sav-bázis indikátor jelenléte miatt színes lehet. ELŐÁLLÍTÁS A négy komponenst a Kanyaró vakcina (élő) (0213), Mumpsz vakcina (élő) (0538), Rubeola vakcina (élő) (0162) és Varicella vakcina (0648) cikkelyekben leírtak szerint állítják elő, és az ezen cikkelyekben előírt követelményeknek kell megfelelniük. Az előállítási eljárást validálni kell annak bizonyítására, hogy a készítmény, amennyiben vizsgálnák, megfelelne az embergyógyászati immunszérumokra és vakcinákra előírt abnormális toxicitás vizsgálat (2.6.9) követelményeinek. LETÖLTÉS ELŐTTI KÉSZTERMÉK VAKCINA Az egyes komponensek egyszeri vírusaratásait egyesítik, és a sejtek eltávolítása céljából tisztítják. Az egyesített aratásokhoz megfelelő stabilizátor adható. A komponensek egyesített aratásai megfelelő mértékben hígíthatók. Az egyes komponensek egyesített aratásainak megfelelő mennyiségeit elegyítik. A kész gyártási tétel előállítására csak olyan letöltés előtti késztermék vakcina használható fel, amely megfelel a következő vizsgálat követelményének. Bakteriális és gombaszennyezettség. Sterilitási vizsgálatot (2.6.1) végzünk. Minden tápfolyadékra 10 ml mintát oltunk. KÉSZ GYÁRTÁSI TÉTEL A készítmény felszabadításához minden egyes komponensre vonatkozóan meg kell határozni a legkisebb víruskoncentrációt, annak biztosítására, hogy – a stabilitási adatok fényében – a feliraton feltüntetett legkisebb víruskoncentráció az eltarthatósági idő végéig jelen lesz a készítményben. A letöltés előtti késztermék vakcinát aszeptikus körülmények között steril, garanciazáras tartályokba osztják szét, és a vakcina stabilitása szempontjából igazoltan kedvező nedvességtartalom eléréséig liofilezik. Ezután a tartályokat olyan módon zárják le, hogy a szennyeződést és a nedvesség behatolását megakadályozzák. Csak az a kész gyártási tétel szabadítható fel, amely valamennyi komponens esetében megfelel a felszabadításhoz szükséges legkisebb vírustartalomra vonatkozó követelményeknek, valamint a „Hőstabilitás”, a „Szarvasmarha szérumalbumin” és a „Víztartalom” vizsgálat, továbbá az „Azonosítás” és „Vizsgálatok” részben előírt valamennyi vizsgálat követelményeinek. Amennyiben a szarvasmarha

szérumalbumnira vonatkozó vizsgálatot a letöltés előtti késztermék vakcinán elvégezték, és ez megfelelő eredménnyel zárult, ez a vizsgálat a késztermék esetében elhagyható. Hőstabilitás. Indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve a hőstabilitás vizsgálatát el kell végezni. A kanyaró, mumpsz és rubeola komponensek esetében a fagyasztva szárított kész gyártási tétel legalább 3 ampulláját száraz állapotban 7 napon át 37±1 °C-on tároljuk. A „Hatóérték-meghatározás” részben leírt módszerrel meghatározzuk a víruskoncentrációt a melegen, illetve a tárolásra előírt hőmérsékleten tárolt vakcinákban. A melegen tartott vakcina víruskoncentrációja valamennyi komponensre vonatkoztatva legfeljebb 1,0 log egységgel lehet kevesebb, mint a nem melegített vakcináé. Szarvasmarha szérumalbumin. Megfelelő immunkémia módszerrel (2.7.1) meghatározva, nem haladhatja meg az illetékes hatóság által jóváhagyott értéket. Víztartalom (2.5.12). Nem lehet nagyobb, mint az az illetékes hatóság által jóváhagyott mennyiség, amely bizonyítottan biztosítja a vakcina stabilitását. A meghatározáshoz a fél-mikro módszert használjuk. AZONOSÍTÁS A feliraton magadott módon feloldott vakcina, kanyaró-, mumpsz- és rubeolavírusok, valamint humán herpeszvírus-3 elleni specifikus antitestekkel elegyítve, nem képes a fogékony sejtkultúrát fertőzni. A feliraton feltüntetett módon feloldott vakcinát bármely három antitestnek az adott víruskomponensek semlegesítésére elegendő mennyiségével elegyítve, a negyedik víruskomponens a fogékony sejtkultúrát megfertőzi. VIZSGÁLATOK Bakteriális és gombaszennyezettség. A feloldott vakcina feleljen meg a sterilitási vizsgálat (2.6.1) követelményének. HATÓÉRTÉK-MEGHATÁROZÁS A sejtvonalakat és/vagy a semlegesítő antiszérumokat olyan módon kell megválasztani, ami biztosítja, hogy az egyes komponensek meghatározását a másik három komponens ne zavarja. A vakcina fertőző kanyaró-, mumpsz- és rubeola vírus, valamint humán herpeszvírus-3-tartalmának meghatározásához a vakcina legalább 3 üvegcséjének tartalmát titráljuk. Minden egyes hígítási lépés esetében a titráló lemez megfelelő számú mélyedését használjuk. Az egyes meghatározások validálására a megfelelő referenciakészítmény egy üvegcséjének tartalmával 3 párhuzamos titrálást végzünk. A referenciakészítmény vírustartalmát egy kontrollgrafikon segítségével kell nyomon követni, és a készítmény titerét minden egyes laboratórium a feljegyzett előzmények alapján állapítja meg. Amennyiben a gyártó referenciakészítményét használjuk, indokolt és engedélyezett esetektől eltekintve, a kanyaró-, mumpsz-, rubeola- és humán herpeszvírus 3 vírusok hatóértékét a megfelelő Európai Gyógyszerkönyvi Biológiai Referenciakészítményekhez kell hasonlítani, és rendszeres időközönként monitorozni kell. A vakcina egyes ampulláira és a referenciakészítmény ismételt meghatározásaira számított egyedi víruskoncentráció értékeket, valamint a megfelelő kombinált víruskoncentrációkat a szokásos statisztikai módszerek felhasználásával (például: 5.3) számítjuk ki. A kanyaró vírus, mumpsz vírus, rubeola vírus és humán herpeszvírus-3 koncentrációinak kombinált becsült értéke a 3 vakcina ampulla esetén nem lehet kevesebb a feliraton megadott értéknél; a feliraton megadott legkisebb kanyaróvírus-koncentráció nem lehet kisebb, mint 3,0 log CCID50 érték, egy emberi

adagra számítva; a feliraton megadott legkisebb mumpszvírus-koncentráció nem lehet kisebb, mint 3,7 log CCID50 érték, egy emberi adagra számítva; a feliraton megadott legkisebb rubeolavírus-koncentráció nem lehet kisebb, mint 3,0 log CCID50 érték, egy emberi adagra számítva. A meghatározás csak akkor értékelhető, ha: −

a referenciakészítmény 3 párhuzamos meghatározásból számított vírustartalmának konfidencia intervalluma (P = 0,95) nem haladja meg a ±0,3 log CCID50 értéket (kanyaró vírusra, mumpsz vírusra és rubeola vírusra vonatkozóan) vagy a ±0,3 log PFU értéket (humán herpeszvírus-3-ra vonatkozóan),

−

a referenciakészítmény vírustartalma legfeljebb 0,5 log CCID50 értékkel (kanyaró vírusra, mumpsz vírusra és rubeola vírusra vonatkozóan) vagy legfeljebb 0,5 log PFU értékkel (humán herpeszvírus 3ra vonatkozóan) tér el a feltüntetett értéktől.

A meghatározást meg kell ismételni, ha a vakcina kombinált víruskoncentrációjának konfidencia intervalluma (P = 0,95) nagyobb, mint ±0,3 log CCID50 érték (a kanyaró vírusra, mumpsz vírusra és rubeola vírusra vonatkozóan), illetve ±0,3 log PFU érték (a humán herpeszvírus-3-ra vonatkozóan); a minta vírustartalmának kiszámításánál csak az érvényes meghatározásokból nyert adatokat szabad, a szokásos statisztikai módszerek alkalmazásával (lásd például 5.3), egyesíteni. A kombinált víruskoncentrácó konfidencia intervalluma (P = 0,95) nem lehet nagyobb, mint ±0,3 log CCID50 érték (kanyaró vírusra, mumpsz vírusra és rubeola vírusra vonatkozóan) vagy ±0,3 log PFU érték (humán herpeszvírus 3-ra vonatkozóan). Referenciakészítményként BRP élő kanyaró vakcina használható. Referenciakészítményként BRP élő mumpsz vakcina használható. Referenciakészítményként BRP élő rubeola vakcina használható. Referenciakészítményként BRP élő varicella vakcina használható. Indokolt és engedélyezett esetekben más hatóérték-meghatározási módszer is alkalmazható, ilyenkor előfordulhat, hogy eltérő validitási és elfogadhatósági kritériumokat kell alkalmazni. A vakcinának azonban, amennyiben vizsgálnák, ebben az esetben is meg kellene felelnie a fenti vizsgálat követelményeinek. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: −

a vakcina előállításához felhasznált vírustörzseket,

−

a vakcina előállításához felhasznált sejtek típusát és eredetét,

−

a vakcina komponenseire vonatkozó legkisebb víruskoncentrációt,

−

azt, hogy a vakcina nem kerülhet kapcsolatba fertőtlenítőszerekkel.

Vaccinum papillomaviri human (ADNr)


01/2010:2441

VACCINUM PAPILLOMAVIRI HUMANI (ADNr) Humán papillómavírus vakcina (rDNS)

DEFINICIÓ A humán papillómavírus vakcina (rDNS) egy vagy több humán papillómavírus (HPV) genotípus fő kapszidfehérjéjének (L1) tisztított vírusszerű részecskéiből (VLP) előállított készítmény. Az antigéneket rekombináns DNS technikával nyerik. A vakcina megfelelő adjuvánst tartalmazhat. ELŐÁLLÍTÁS ÁLTALÁNOS RENDELKEZÉSEK A vakcinának emberben bizonyítottan specifikus semlegesítő ellenanyagok képződését kell előidéznie. Az előállítási eljárásról igazolni kell, hogy folyamatosan olyan vakcinát eredményez, amely minőségét tekintve hasonló a klinikailag hatékonynak és ártalmatlannak bizonyult vakcinával. Az előállítási eljárást validálni kell annak bizonyítására, hogy a készítmény, amennyiben vizsgálnák, megfelelne az embergyógyászati immunszérumok és vakcinák abnormális toxicitására végzett vizsgálatok követelményeinek (2.6.9). A vakcinát a kapszid fehérjét kódoló vírusgén kifejezésével állítják elő élesztőben vagy rovarsejt/bakulovírus vektor expressziós rendszerben. A létrejövő VLP-ket tisztítják és immunogén készítménnyé alakítják. Az expressziós rendszerek alkalmasságát és biztonságosságát az illetékes hatóság hagyja jóvá. A vakcina gyártása oltócsíra/sejtbank rendszeren alapul. Indokolt és engedélyezett esetek kivételével a vakcina gyártására felhasznált vírus és sejtek átoltásainak száma (az oltócsíra/sejtbank rendszertől számítva) nem haladhatja meg azt az átoltásszámot, amelyet a klinikai vizsgálatok során az ártalmatlanság és hatékonyság tekintetében megfelelőnek bizonyult vakcina előállításánál alkalmaztak. Referenciakészítmény, Referenciavakcinaként a klinikai vizsgálatok során hatékonynak bizonyult vakcina gyártási tételt vagy egy azt reprezentáló gyártási tételt kell használni. A referenciavakcinát lehetőleg stabilizálni kell. Bizonyítani kell, hogy a stabilizációs módszernek nincs jelentős hatása a hatóértékmeghatározás érvényességére. JELLEMZÉS A VLP-k jellemzését a vakcina kifejlesztése során előállított tételeken végzik el, beleértve az eljárás validálásához használt gyártási tételeket is. A jellemzés magában foglalja a fehérje-összetétel meghatározását, például olyan technikák alkalmazásával, mint nátrium-dodecilszulfát–poliakrilamid gélelektroforézis (SDS-PAGE) és Western blot vagy tömegspektrometria, peptidtérkép-vizsgálat és/vagy terminális aminosav-szekvencia analízis. A hatékonyság szempontjából alapvető konformációs epitópok jelenlétének igazolására meghatározzák a VLP-k morfológiai jellemzőit és az aggregáció mértékét is. A VLP jellemzése elvégezhető atomerő mikroszkópiával és transzmissziós elektronmikroszkópiával, dinamikus fényszórással, az epitópok térképezésével, valamint a semlegesítő monoklonális ellenanyagokkal való reakciójuk alapján. Ezen felül, adott esetben, mérik a fehérje-, a lipid-, a nukleinsav



és a szénhidráttartalmat is. A rovarsejtekből származó maradék gazdasejt eredetű fehérjeszintnek meg kell felelnie az illetékes hatóság által megállapított elfogadható ártalmatlansági kritériumnak. SEJTBANKOK ÉS OLTÓCSÍRATÉTELEK Előállítás rekombináns élesztősejtekben. Az előállításra csak olyan sejtbankok használhatók fel, amelyeket azonosságuk, mikrobiológiai tisztaságuk, sejtszaporodási jellemzőik és stabilitásuk tekintetében megfelelően jellemeztek. A törzssejtbankok és szaporító-sejtbankok génhomogenitását vizsgálni kell. A gazdasejt és az expressziós vektorok biológiai jellemzőinek teljes körű leírását meg kell adni. A klónozott gének gazdasejtben történő expressziójának elősegítésre és szabályozására tett élettani lépéseket részletesen le kell írni. Ennek a gazdasejt genetikai markereit, az expressziós vektor konstrukcióját, genetikáját és szerkezetét, valamint a klónozott gén eredetét és azonosítását is tartalmaznia kell. A beillesztett gén és a környező vektorsszegmensek nukleotidszekvenciáját, valamint a beillesztett gént tartalmazó vektor restrikciós enzim térképét is meg kell adni, továbbá azokat az adatokat is, amelyek bizonyítják, hogy az expressziós rendszer a rekombináns szaporító-sejtbank tárolása alatt is stabil marad, az előállításra használt vagy azt meghaladó átoltásszámon. Előállítás rovarsejt/bakulovírus expressziós rendszerben −

Rovarsejt szubsztrátum. Csak olyan sejtbankokat szabad az előállításra felhasználni, amelyeket azonosság, tisztaság, sejtszaporodási jellemzők, stabilitás, idegen kórokozók és daganatkeltő képesség szempontjából megfelelően jellemeztek. Ezt a jellemzést az előállítás különböző stádiumaiban végzik el, az 5.2.3 Embergyógyászati vakcinák előállítására szánt sejtszubsztrátumok, és a 2.6.16 Vizsgálat idegen kórokozókra humán élővírus-vakcinákban című általános fejezeteknek megfelelően. Különleges figyelmet kell fordítani a rovareredetű vírusokra, elsősorban az emberben potenciálisan patogén rovareredetű vírusokra (pl. arbovírusok). A rovarsejtek járulékos fertőző kórokozói nem szükségszerűen rendelkeznek sejtkárosító hatással. Emiatt a vizsgálatokat nukleinsav-amplifikációs módszerekkel és más technikák, például elektronmikroszkópos vizsgálat és együtt-tenyésztés alkalmazásával végzik.

−

Rekombináns bakulovírus. A rekombináns bakulovírus vektor alkalmazása oltócsírarendszeren alapul, az eredeti vírus és az oltócsíra-törzstétel, illetve -szaporítótételek közötti meghatározott, az illetékes hatóság által jóváhagyott átoltásszámmal. A rekombináns bakulovírus expressziós vektor a HPV L1 antigént kódoló szekvenciát tartalmazza. A expresszált HPV L1 antigének minőségének és állandóságának igazolása céljából az expressziós szerkezet szakaszait nukleinsav-amplifikációs módszerrel vizsgálják, a tisztított rekombináns fehérjéken végzett egyéb vizsgálatokkal kapcsoltan. A HPV vakcina előállítására felhasznált rekombináns bakulovírusokat feljegyzett történetük alapján azonosítják. Ez a klónozott gén eredetére és azonosságra, valamint a bakulovírus expressziós vektor(ok) konstrukciójára, genetikájára és szerkezetére vonatkozó adatokat is tartalmaz. Az expressziós szerkezet genetikai stabilitását a bakulovírus törzstételétől kezdve legalább az előállítás során alkalmazott legmagasabb szintig, de lehetőség szerint ezt a szintet meghaladva kell igazolni.

A rekombináns bakulovírus oltócsíratételeket nagy mennyiségben állítják elő, és a stabilitás szempontjából kedvező hőmérsékleten tárolják. Csak olyan oltócsíratétel használható a vírusszaporításra, amely megfelel a következő előírásoknak. Azonosítás. Az oltócsíra-törzstételt és -szaporítótételeket a beillesztett gén HPV típusának eredete szerint megfelelő módszerrel, például nukleinsav amplifikációs módszerekkel (NAT) (2.6.21) azonosítják. A vírus koncentrációja. Az előállítás állandóságának folyamatos nyomon követése céljából az oltócsíratörzstétel és -szaporítótételek víruskoncentrációját meg kell határozni. Idegen kórokozók (2.6.16). Az oltócsíra-szaporítótétel feleljen meg az oltócsíratételekre és a



kontrollsejtekre vonatkozó követelményeknek. Különleges figyelmet kell fordítani a Spiroplasma fajokra és a rovareredetű vírusokra, elsősorban az emberben potenciálisan patogén rovareredetű vírusokra (pl. arbovírusok). VÍRUSSZAPORÍTÁS ÉS ARATÁS A sejtbankokkal, illetve a bakulovírus oltócsíratételekkel és az azt követő sejttenyészetekkel végzett minden műveletet aszeptikus körülmények között kell végezni, olyan helyen, ahol más sejtekkel nem dolgoznak. Indokolt és engedélyezett esetben a rovarsejt/bakulovírus expressziós rendszerben olyan tárolt vírus köztitenyészet használható vírusszaporításra, amely megfelel a következő 5 követelménynek. Azonosítás. Minden egyes tárolt vírus köztitenyészetet, a HPV típusa szerint, specifikus ellenanyagot felhasználó immunológiai módszerrel, vagy molekuláris azonosító vizsgálattal – pl. NAT (2.6.21) – kell azonosítani. Bakteriális és gombaszennyezettség. Minden egyes tárolt vírus köztitenyészet feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményének (2.6.1). Minden egyes tápfolyadékból 10 ml-t vizsgálunk. Víruskoncentráció. Az előállítás állandóságának folyamatos nyomon követése céljából minden egyes tárolt vírus köztitenyészet víruskoncentrációját megfelelő módszerrel – pl. plakk-képzés vagy NAT (2.6.21) – meg kell határozni. Idegen kórokozók (2.6.16). Minden egyes tárolt vírus köztitenyészete feleljen meg az idegen kórokozók vizsgálatára vonatkozó követelményeknek. Kontrollsejtek. Annak a készítménynek a sejttenyészetéből származó kontrollsejtjek, amely készítményből minden tárolt vírus köztitenyészet származik, feleljenek meg az azonosítási vizsgálat követelményeinek és az idegen kórokozókra vonatkozó előírásoknak (2.6.16). Előállítás rekombináns élesztősejtekben. Az azonosságot, a tisztaságot, a plazmid-retenciót és a termelés állandóságát az előállítás megfelelő szakaszaiban meg kell határozni. Előállítás rovarsejt/bakulovírus expressziós rendszerben. A rovarsejt-tenyészeteket a rekombináns bakulovírus, illetékes hatóság által jóváhagyott mennyiségével fertőzik. A vizsgálat előtt több egyedi aratást össze lehet önteni. Antibiotikum hozzáadása sem az aratás időpontjában, sem a gyártás későbbi szakaszában nem megengedett. EGYEDI ARATÁSOK Csak olyan egyedi aratás vagy egyesített egyedi aratások használható(k) fel a tisztított monovalens antigén elkészítésére, amely(ek) a következő előírásoknak megfelel(nek). Azonosítás. Minden egyes egyedi aratást a megfelelő HPV típusa szerint immunológiai meghatározással vagy molekuláris biológián alapuló meghatározással, például hibridizációval vagy polimeráz láncreakcióval (PCR) azonosítunk. Bakteriális és gombaszennyezettség. A rovarsejt /bakulovírus expresszíós rendszerben történő előállítás esetében az egyedi aratás feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek (2.6.1). Az élesztősejtekben történő előállítás esetében az egyedi aratást megfelelő tápfolyadékra oltva kell a tenyészet tisztaságára vonatkozóan vizsgálni, annak biztosítása céljából, hogy kizárólag a gazdaszervezet növekszik. Idegen kórokozók (2.6.16). A rovarsejt/bakulovírus expresszíós rendszerben történő előállítás esetében az egyedi aratás feleljen meg az idegen kórokozók vizsgálatára vonatkozó követelményeknek. Különös



figyelmet kell fordítani a rovareredetű vírusok kimutatására, a „Sejtbankok és oltócsíratételek” részben leírtak szerint. Kontrollsejtek. A rovarsejt/bakulovírus expresszíós rendszerben történő előállítás esetében a kontrollsejtek feleljenek meg az azonosításra szolgáló vizsgálat követelményeinek és az idegen kórokozókra vonatkozó előírásoknak (2.6.16). Különös figyelmet kell fordítani a rovareredetű vírusok kimutatására a „Sejtbankok és oltócsíra tételek” részben leírtak szerint. TISZTÍTOTT MONOVALENS ANTIGÉN Az aratásokat validált módszerek alkalmazásával kell tisztítani. Amennyiben rovarsejt/bakulovírus expressziós rendszer szubsztrátumot használnak, az előállítási eljárást a véletlenszerűen előforduló vírusok és rekombináns bakulovírusok kiküszöbölő (eltávolítására és/vagy inaktiválására) képességére validálják. A letöltés előtti késztermék elkészítéséhez csak olyan tisztított monovalens antigén használható fel, amely megfelel a következő előírásoknak. Az illetékes hatóság jóváhagyásával az alábbiakban leírt egy vagy több vizsgálat elvégzése elhagyható, ha azokat az adszorbeált monovalens antigénen elvégzik. Összes fehérje. A teljes fehérjetartalom meghatározását validált módszerrel végezzük el. A tartalomnak az adott termékre vonatkozó határértéken belül kell lennie. Antigéntartalom és -azonosítás. Minden egyes antigéntípus mennyiségét és specifikusságát megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1), például radioimmun meghatározással (RIA), enzimhez kötött immunszorbens meghatározással (ELISA), immunoblot vizsgálattal (lehetőség szerint védő epitóp elleni monoklonális antitestet használva) vagy radiális diffúzióval kell meghatározni. Meghatározható az antigén/fehérje arány is, amelynek adott esetben a készítményre jóváhagyott határértéken belül kell lennie. Antigéntisztaság. Minden egyes monovalens antigén tisztaságát megfelelő módszerrel (pl. denzitometriás mennyiségi meghatározással végzett SDS-PAGE, amelynek kimutatási határa nem rosszabb, mint 1% szennyező, a teljes fehérjetartalomra vonatkoztatva) kell meghatározni. Minden egyes vizsgálat validálására referenciakészítményt kell használni. A fehérje tisztaságát az L1 fehérjéhez kötött sávok és a teljes fehérje sávok arányából számítjuk, és százalékban fejezzük ki. A vakcinában jelen levő genotípusok esetében a tisztaságra számított értéknek az adott készítményre jóváhagyott határértéken belül kell lennie. Az ép L1 monomerek százalékos aránya. Az antigéntisztaság vizsgálata az L1 monomerek integritásának vizsgálataként is szolgál. Az ép L1 monomerek százalékos aránya az ép L1 monomereknek a teljes fehérjemennyiségre vonatkoztatott aránya, százalékban kifejezve. VLP méret és szerkezet. A VLP-k méretét és szerkezetét megfelelő módszerrel, például dinamikus fényszórással kell megállapítani és nyomon követi. A méretnek az adott készítményre jóváhagyott határértéken belül kell lennie. Összetétel. Adott esetben a fehérje-, lipid-, nukleinsav- és szénhidráttartalmat meg kell határozni. Gazdasejt és vektor eredetű DNS: legfeljebb 10 ng DNS, a vakcina egy humán dózisának megfelelő mennyiségű tisztított antigénben. A meghatározást minden egyes monovalens tisztított antigén esetében érzékeny módszerrel végezzük. Maradék gazdasejt eredetű fehérjék. Elvégezzük a maradék gazdasejt fehérjékre vonatkozó vizsgálatokat. A fehérjetartalomnak az adott készítményre jóváhagyott határértéken belül kell lennie. A bontáshoz és tisztításhoz használt vegyszerek. A tisztításra vagy az előállítás egyéb lépései során használt vegyszerek vizsgálatát el kell végezni. A vegyszertartalomnak az adott készítményre jóváhagyott határértéken belül kell lennie. Sterilitás (2.6.1) Minden egyes monovalens antigénnek meg kell felelnie a sterilitási vizsgálat



követelményeinek. Minden táptalajhoz 10-10 ml mintát használunk.

ADSZORBEÁLT MONOVALENS ANTIGÉN A tisztított monovalens antigéneket ásványi vivőanyagokra, például alumíniumsókra lehet adszorbeálni. A letöltés előtti késztermék készítésére csak olyan adszorbeált monovalens antigén használható, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Sterilitás (2.6.1). Minden egyes adszorbeált monovalens antigénnek meg kell felelnie sterilitási vizsgálat követelményeinek. Minden táptalajhoz 10-10 ml mintát használunk. Bakteriális endotoxinok (2.6.14). Minden egyes adszorbeált monovalens antigént vizsgálni kell bakteriális endotoxinokra. A bakteriális endotoxin tartalomnak az illető készítményre jóváhagyott határértékeken belül kell lennie. Antigéntartalom és -azonosítás. Minden egyes antigéntípust megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1), például radioimmun meghatározással (RIA), enzimhez kötött immunszorbens meghatározással (ELISA), immunoblot vizsgálattal (lehetőség szerint védő epitóp elleni monoklonális antitestet használva) vagy radiális diffúzióval kell azonosítani. Az antigén/fehérje arányt meg kell határozni. Ásványi vivőanyag koncentráció. Adott esetben minden egyes adszorbeált monovalens antigént vizsgálni kell az ásványi vivőanyag-tartalomra. A vivőanyag-tartalomnak az illető készítményre jóváhagyott határértéken belül kell lennie. LETÖLTÉS ELŐTTI KÉSZTERMÉK VAKCINA A letöltés előtti késztermék vakcina az egyes tisztított monovalens antigén HPV típusokból, vagy adszorbeált monovalens antigén HPV típusokból közvetlenül készül. A készítményhez mikrobiológiai tartósítószer, valamint adjuváns, például 3-O-dezacil-4’monofoszforil-lipid-A-t lehet adni. A kész gyártási tétel előállításához csak olyan letöltés előtti késztermék vakcina használható fel, amely megfelel az alábbi követelményeknek. Mikrobiológiai tartósítószer. Adott esetben a mikrobiológiai tartósítószer mennyiségét megfelelő kémiai vagy fizikai-kémiai módszerrel határozzuk meg. A tartalomnak a felhasználásra szánt mennyiség 85 és 115%-a között kell lennie. Sterilitás (2.6.1). A letöltés előtti késztermék vakcina feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményének. Minden egyes táptalajhoz 10-10 ml készítményt használunk. KÉSZ GYÁRTÁSI TÉTEL Csak az a kész gyártási tétel szabadítható fel, amely megfelel az „Azonosítás”, „Vizsgálatok” és „Hatóérték-meghatározás” pontok alábbiakban előírt követelményeinek. Feltételezve, hogy a letöltés előtti késztermék vakcinán az mikrobiológiai tartósítószer tartalomra vonatkozó vizsgálatot (adott esetben) elvégezték, és az megfelelő eredménnyel zárult, ez a vizsgálat a kész gyártási tétel esetében elhagyható. Amennyiben a letöltés előtti késztermék vakcinával in vivo vizsgálatot végeztek, feltéve, hogy az megfelelő eredménnyel zárult, a kész gyártási tétel esetében ez a vizsgálat is elhagyható. Adjuvánsok. Ha a vakcina adjuvánst tartalmaz, annak mennyiségét meg kell határozni, és a mért tartalomnak, a várható értékre vonatkoztatva, bizonyíthatóan az elfogadható határértéken belül kell lennie. A 3-O-dezacil-4’monofoszforil-lipid-A meghatározására például a gázkromatográfia alkalmas.



Az adszorpció foka. Az adszorpció fokát minden egyes antigénre és (adott esetben) a 3-O-dezacil4’monofoszforil-lipid-A ra is meg kell határozni. AZONOSÍTÁS Megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1) igazolni kell, hogy a vakcinában jelen vannak a különböző típusú HPV antigének. A vakcina azonosítására az in vitro vizsgálat szolgálhat. VIZSGÁLATOK Alumínium (2.5.13): legfeljebb 1,25 mg, egy humán dózisra vonatkoztatva, ha adszorbensként alumínium-hidroxidot vagy kristályvizet tartalmazó alumínium-foszfátot használnak. Mikrobiológiai tartósítószer. Adott esetben a mikrobiológiai tartósítószer mennyiségét megfelelő kémiai vagy fizikai-kémiai módszerrel határozzuk meg. A mikrobiológiai tartósítószer mennyisége nem lehet kevesebb a legkisebb igazoltan hatékony mennyiségnél, és nem lehet nagyobb, mint a feliraton feltüntetett érték 115%-a. Sterilitás (2.6.1). A vakcina feleljen meg a sterilitási vizsgálat követelményeinek. Bakteriális endotoxinok (2.6.14): legfeljebb 5 NE, egy egyszeri humán adagra vonatkoztatva. Ha az adjuváns nem teszi lehetővé az endotoxin-tartalom meghatározását, a megfelelő vizsgálatot a gyártás közben kell elvégezni. HATÓÉRTÉK-MEGHATÁROZÁS A hatóérték-meghatározást in vivo vizsgálattal, vagy olyan in vitro vizsgálattal lehet elvégezni, amelynek elfogadási feltételeit az in vivo vizsgálattal szemben végzett összehasonlító tanulmányban már megállapították. In vivo vizsgálat. A megfelelő in vivo vizsgálati módszer a vizsgálandó vakcina legalább három hígításának, valamint egy referenciakészítménynek a beadásából áll. Minden egyes hígításhoz megfelelő törzsből származó és megfelelő számú nőstény egeret tartalmazó csoportot használunk. A vakcina hígításához R nátrium-kloridnak a vakcina előállításához használt alumínium adjuvánst tartalmazó oldatát használjuk. A beadás időpontjában 6-8 hetes egereket 0,5-0,5 ml vakcinával oltjuk. A preimmunizációs szérummintát az oltás előtt, a végső szérummintát pedig a 21. és 28. nap közötti meghatározott időpontban vesszük le. Az egyedi szérummintákat minden egyes HPV típus elleni specifikus semlegesítő ellenanyagra megfelelő immunkémiai módszerrel (2.7.1) vizsgáljuk. A vizsgálat csak akkor értékelhető, ha: −

mind a vizsgálandó, mind a referenciavakcina esetében az ED50 az állatokba beadott legkisebb és legnagyobb adag közé esik;

−

a statisztikai vizsgálat nem mutat jelentős eltérést a linearitástól vagy a párhuzamosságtól;

−

a konfidenciahatárok (P = 0,95) az illető készítménye jóváhagyott határértékeken belül esnek.

In vitro vizsgálat. Minden egyes antigén genotípusra immunkémiai vizsgálatot (2.7.1) végzünk. Az L1 fehérje védőhatást kiváltó epitópjaira specifikus monoklonális ellenanyagokat felhasználó enzimhez kötött immunszorbens meghatározás (ELISA) és radioimmun meghatározás (RIA) megfelelőnek bizonyult. A meghatározáshoz a vizsgálandó vakcina megfelelő számú hígítását és a gyártó referenciakészítményét



használjuk, és az adatok elemzésére megfelelő modellt alkalmazunk. Az antigéntartalomnak minden egyes típusra az adott készítményre jóváhagyott határértéken belül kell lennie. FELIRAT A feliraton fel kell tüntetni: −

a vakcinában levő L1 fehérje mennyiségét és a HPV genotípusát;

−

a vakcina előállításához használt sejtszubsztrátumot;

−

a vakcinához adott adjuváns nevét és mennyiségét;

−

azt, hogy a vakcinát tilos fagyasztani.

01/2011:1768

VALACICLOVIRI HYDROCHLORIDUM ANHYDRICUM Valaciklovir-hidroklorid, vízmentes

C13H21ClN6O4 [124832-27-5]

Mr 360,8

DEFINÍCIÓ [2-[(2-Amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-L-valinát– hidroklorid. Tartalom: 95,0–102,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér por. Oldékonyság: vízben bőségesen oldódik; vízmentes etanolban kevéssé oldódik. Polimorfiára hajlamos (5.9). AZONOSÍTÁS Az A, a B és a C vagy az A, a B és a D vizsgálatot végezzük el. A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS vízmentes valaciklovir-hidrokloriddal. Amennyiben a szilárd anyagok spektrumai eltérőek, a vizsgálandó anyagot és a referenciaanyagot külön-külön a lehető legkisebb mennyiségű R

vízmentes etanolban oldjuk, az oldatokat exszikkátorban, erősen csökkentett nyomáson, R foszfor(V)-oxid felett szárazra párologtatjuk, és a maradékokból új spektrumokat veszünk fel. B. A kloridion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető. C. Az anyag megfelel az R-szennyezőre a "Rokon vegyületek" vizsgálat A. pontjában megadott határértéknek. D. Optikai forgatóképesség (2.2.7): az anyag balraforgató. A vizsgálathoz 2,50 g anyagot R vízzel 50,0 ml-re oldunk. VIZSGÁLATOK E-, F- és G-szennyező. Vékonyréteg-kromatográfia (2.2.27). Vizsgálati oldat. 0,250 g vizsgálandó anyagot 2 ml R vízben oldunk, és az oldatot R etanollal (96%) 5,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (a). 5 mg CRS valaciklovir-D-szennyezőt, 5,0 mg CRS valaciklovir-E-szennyezőt, 5,0 mg CRS valaciklovir-G-szennyezőt és 8,4 mg CRS valaciklovir-F-szennyező-para-toluolszulfonátot 2 ml R víz és 6 ml R etanol (96%) elegyében oldunk. Az oldatot R etanollal (96%) 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). Az a) összehasonlító oldat 3,0 ml-ét R etanollal (96%) 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). Az a) összehasonlító oldat 2,0 ml-ét R etanollal (96%) 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (d). Az a) összehasonlító oldat 0,5 ml-ét R etanollal (96%) 10,0 ml-re hígítjuk. Lemez: R VRK szilikagél F254 lemez (2-10 μm). Előkezelés: a lemezt R metanollal mossuk: az oldószerfrontot legalább a lemezmagasság négyötödéig vándoroltatjuk. Ezután a lemezt száradni hagyjuk. Kifejlesztőszer: R tömény ammónia–oldat – R tetrahidrofurán – R metanol – R diklórmetán (3+12+34+54 V/V); közvetlenül felhasználás előtt készítjük. Felvitel: 4 μl; vizsgálati oldat, valamint b), c) és d) összehasonlító oldat.

Kifejlesztés: a lemezmagasság négyötödéig. Szárítás: levegőáramban. Előhívás: az E- és a G-szennyező kimutatására a lemezt 254 nm-es ultraibolya fényben értékeljük. Az F-szennyező kimutatására a lemezt R fluoreszkamin R diklóretánnal készített, 0,1 g/l töménységű oldatával bepermetezzük és 365 nm-es ultraibolya fényben értékeljük. Rf-értékek: A-szennyező kb. 0; B-szennyező kb. 0,2; valaciklovir kb. 0,3; Cszennyező kb. 0,5; D-szennyező kb. 0,6; E-szennyező kb. 0,7; F-szennyező kb. 0,75; G-szennyező kb. 0,79; a C-szennyezőt elfedi a valaciklovir-folt felső széle; az F- és a G-szennyező együtt vándorolhatnak, de ez nem befolyásolja kedvezőtlenül az értékelésüket, mert megjelenésük különböző. Rendszeralkalmasság: a b), a c) és a d) összehasonlító oldat 254 nm-es ultraibolya fényben vizsgált kromatogramján egyaránt 3-3, egymástól jól elkülönülő folt látható; ezek rendre a D-, az E-, illetve a G-szennyező foltjai. Követelmények: − E-szennyező: az E-szennyezőnek megfelelő folt nem lehet erősebb, mint a megfelelő folt a c) összehasonlító oldat kromatogramján (0,2%); − F-szennyező: az F-szennyezőnek megfelelő folt nem lehet erősebb, mint a megfelelő folt a b) összehasonlító oldat kromatogramján (sósav-sóra számolva 0,3%); − G-szennyező: a G-szennyezőnek megfelelő folt nem lehet erősebb, mint a megfelelő folt a d) összehasonlító oldat kromatogramján (0,05%). Rokon vegyületek. A. A-, B-, I- és R-szennyező. Folyadékkromatográfia (2.2.29): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Vizsgálati oldat. 50,0 mg vizsgálandó anyagot R tömény sósav 0,5 %V/V-os oldatával 100,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 2,5 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt valaciklovirt (amely A-, B-, C-, D-, H-, I-, J-, M- és R-szennyezőt is tartalmaz) R tömény sósav 0,5 %V/V-os oldatával 5,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). 50,0 mg CRS vízmentes valaciklovir-hidrokloridot R tömény sósav 0,5 %V/V-os oldatával 100,0 ml-re oldunk.

Összehasonlító oldat (c). 3,0 ml vizsgálati oldatot R tömény sósav 0,5 %V/V-os oldatával 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét R tömény sósav 0,5 %V/V-os oldatával 100,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: − méretei: l = 0,15 m, Ø = 4,0 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, koronaéterezett szilikagél (5 μm); − hőmérséklet: 10 °C. Mozgófázis: R perklórsav – R metanol – R víz (0,5+5+95 V/V); Áramlási sebesség: 0,75 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 10 μl; vizsgálati oldat és a) összehasonlító oldat. Kromatografálási idő: a valaciklovir retenciós idejének 1,5-szerese. Szennyezők azonosítása: az A- + B-, a C- + R-, a D-, az I- és az Mszennyező azonosítására a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt valaciklovirhez mellékelt kromatogramot és az a) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a valaciklovirre (retenciós ideje kb. 21 perc) vonatkoztatva: A- és B-szennyező kb. 0,2; I-szennyező kb. 0,4; C- és Rszennyező kb. 0,6; D-szennyező kb. 0,7; M-szennyező kb. 1,3. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: − hegy-völgy arány: legalább 1,5, ahol Hp = a D-szennyezőnek megfelelő csúcs alapvonaltól mért magassága és Hv = a D-szennyező csúcsát a Cés R-szennyező csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának az alapvonaltól mért távolsága. Követelmények: − korrekciós faktor: az A- és B-szennyező mennyiségének kiszámításához 0,7-del szorozzuk a megfelelő csúcsterületet;

− R-szennyező: a C-szennyezőnek a "Rokon vegyületek" vizsgálat B. pontja szerint meghatározott mennyiségét levonjuk az együtt eluálódott – jelen vizsgálat során meghatározott – C- és R-szennyező mennyiségéből (legfeljebb 3,0%); − A- és B-szennyező: összesen legfeljebb 2,0%; − I-szennyező: legfeljebb 0,2%; − elhanyagolási határ: a c) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,03%); egyéb csúcsokat nem veszünk figyelembe, kivéve az A-+B-, a C-+R-, illetve az I-szennyezőnek megfelelő csúcsokat. B. Folyadékkromatográfia (2.2.29): a normalizációs eljárást alkalmazzuk. Az oldatokat elkészítésük után 24 órán belül fel kell használni. Oldószerelegy: R etanol (96%) – R víz (20+80 V/V). Vizsgálati oldat. 40 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 100 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 2,5 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt valaciklovirt (amely A-, B-, C-, D-, H-, I-, J-, M- és R-szennyezőt is tartalmaz) az oldószereleggyel 5,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). A vizsgálati oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 100,0 ml-re hígitjuk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 20,0 ml-re hígítjuk. Oszlop: − méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, fenilhexilszililezett szilikagél (5 μm); − hőmérséklet: 15 °C. Mozgófázis: − A-mozgófázis: R trifluorecetsav – R víz (2+1000 V/V); − B-mozgófázis: R trifluorecetsav – R2 metanol (2+1000 V/V).

Idő (perc) 0–5

A-mozgófázis (%V/V) 90

B-mozgófázis (%V/V) 10

5 – 35

90 → 60

10 → 40

Áramlási sebesség: 0,8 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 254 nm-en. Injektálás: 10 μl. Szennyezők azonosítása: az A-, B-, C-, D-, H-, I-, J- és D-szennyező azonosításához a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt valaciklovirhez mellékelt kromatogramot és az a) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a valaciklovirre (retenciós ideje kb. 19 perc) vonatkoztatva: A-szennyező kb. 0,3; B-szennyező kb. 0,4; H-szennyező kb. 0,5; C-szennyező kb. 1,06; I-szennyező kb. 1,09; D-szennyező kb. 1,2; Jszennyező kb. 1,3; M-szennyező kb. 1,6. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: − hegy-völgy arány: legalább 2,5, ahol Hp = a C-szennyezőnek megfelelő csúcs alapvonaltól mért magassága és Hv = a C-szennyező csúcsát a valaciklovir csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának az alapvonaltól mért távolsága. − kromatogramja egyezzék meg a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt valaciklovirhez mellékelt kromatogrammal. Követelmények: − M-szennyező: legfeljebb 1,5%; − D-szennyező: legfeljebb 0,5%; − C-szennyező: legfeljebb 0,3%; − H-szennyező: legfeljebb 0,1%; − J-szennyező: legfeljebb 0,1%;

− egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: egyenként legfeljebb 0,05%; − elhanyagolási határ: a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,6-szerese (0,03%); az A-, a B- és az I-szennyező csúcsát nem vesszük figyelembe. Követelmény: − összes szennyező az A. és a B. pont szerinti vizsgálat alapján: legfeljebb 5,0%. Klorid: 9,4–9,9% (vízmentes és oldószermentes anyagra). 0,350 g anyagot 100 ml R vízben oldunk. Az oldatot 0,2 ml R tömény salétromsav hozzáadása után 0,1 M ezüst-nitrát–mérőoldattal potenciometriásan titráljuk (2.2.20). Ezüst indikátorelektródot és ezüst–ezüstklorid összehasonlító elektródot vagy kombinált ezüstelektródot alkalmazunk. Az első titrálás az elektródok beállítására szolgál, ezért ennek eredményét nem vesszük figyelembe. Üres titrálást is végzünk. 1 ml 0,1 M ezüst-nitráttal 3,543 mg Cl egyenértékű. Palládium: legfeljebb 10 ppm. Atomemissziós spektrometria (2.2.22, I. módszer). Vizsgálati oldat. 0,1 g anyagot R tömény sósav R dimetil-szulfoxiddal készült, 2 %V/V-os oldatával 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldatok. Az oldatsorozatot milliliterenként 1000 μg Pd-ot tartalmazó oldat megfelelő hígításával készítjük. A hígításokhoz R tömény sósav R dimetil-szulfoxiddal készült, 2 %V/V-os oldatát használjuk. Hullámhossz: 340,5 nm. Nehézfémek (2.4.8/A): legfeljebb 20 ppm. 2,0 g anyagot R vízzel 20 ml-re oldunk. A vizsgálathoz az oldat 12 ml-ét használjuk. Az összehasonlító oldatot 10 ml R ólom−mértékoldattal (2 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 2,0%. Az anyag 0,250 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk.

TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29) a "Rokon vegyületek" vizsgálat A. pontja szerint a következő módosítással. Injektálás: vizsgálati oldat és b) összehasonlító oldat. A százalékos C13H21ClN6O4-tartalmat a CRS vízmentes valaciklovir-hidroklorid deklarált tartalma alapján számoljuk ki. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C, D, E, F, G, H, I, J, M, R. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): K, L, N, O,P, Q.

A. 2-amino-1,9-dihidro-6H-purin-6-on (guanin),

B. 2-amino-9-[(2-hidroxietoxi)metil]-1,9-dihidro-6H-purin-6-on (aciklovir),

C. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-(N-metil-Lvalinát),

D. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-(N-etil-Lvalinát),

E. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-(N[(benziloxi)karbonil]-L-valinát),

F. (2-hidroxietil-L-valinát),

G. N,N-dimetilpiridin-4-amin,

H. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-L-alaninát,

I. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-acetát,

J. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-L-izoleucinát,

K. 9-[(2-hidroxietoxi)metil]-2-[[[(6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2il)amino]metil]amino]-1,9-dihidro-6H-purin-6-on,

L. 2,2'-(metiléndiimino)bisz[9-[(2-hidroxietoxi)metil]-1,9-dihidro-6H-purin-6on],

M. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-(N-formil-Lvalinát),

N. [2-[[6-oxo-2-[[[(6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2-il)amino]metil]amino]-1,6dihidro-9H-purin-9-il]metoxi]etil]-L-valinát,

O. [2-[[2-[[[[9-[(2-hidroxietoxi)metil]-6-oxo-6,9-dihidro-1H-purin-2il]amino]metil]amino]-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il]metoxi]etil]-Lvalinát,

P. [2,2'-[metilénbisz[imino(6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-2,9diil)metilénoxi]]dietil]-di(-L-valinát),

Q. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-(N-[[(6-oxo-6,9dihidro-1H-purin-2-il)amino]metil]-L-valinát),

R. [2-[(2-amino-6-oxo-1,6-dihidro-9H-purin-9-il)metoxi]etil]-D-valinát.

01/2010:2423

VALSARTANUM Valzartán

C24H29N5O3 [137862-53-4]

Mr 435,5

DEFINÍCIÓ (2S)-3-Metil-2-[pentanoil-[[2'-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4il]metil]amino]butánsav. Tartalom: 99,0–101,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy csaknem fehér, nedvszívó por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag nem oldódik; vízmentes etanolban bőségesen oldódik; diklórmetánban mérsékelten oldódik. AZONOSÍTÁS A és a B, vagy az A és a C pont szerinti azonosítást kell elvégezni. A.

Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS valzartánnal.

B.

Enantiomer tisztaság (lásd Vizsgálatok).

C.

Fajlagos optikai forgatóképesség (2.2.7): –64,0 és –69,0 között (vízmentes anyagra). 0,200 g anyagot R metanollal 20,0 ml-re oldunk.

VIZSGÁLATOK Enantiomer tisztaság. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 50,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 5 mg CRS csúcsazonosításra szánt valzartánt (amely A-szennyezőt is tartalmaz) a mozgófázissal 5,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml vizsgálati oldatot a mozgófázissal 100,0 ml-re hígítunk. Oszlop: −

méretei: l = 0,25 m, Ø = 4,6 mm;

−

állófázis: R királis elválasztás céljára szánt szilikagél OD.

Mozgófázis: R trifluorecetsav – R 2-propanol – R hexán (0,1+15+85 V/V); Áramlási sebesség: 0,8 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 230 nm-en. Injektálás: 10 μl. Kromatografálási idő: a valzartán retenciós idejének 1,5-szerese. Szennyezők azonosítása: az A-szennyező azonosítására a CRS csúcsazonosításra szánt valzartánhoz mellékelt kromatogramot és az a) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenció a valzartánra (retenciós ideje kb. 13 perc) vonatkoztatva: Aszennyező kb. 0,6.

Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: −

csúcsfelbontás: legalább 2,0, az A-szennyező és a valzartán között.


A-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (1,0%).

Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). Vizsgálati oldat. 50 mg vizsgálandó anyagot a mozgófázissal 100,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (a). 1,0 ml vizsgálati oldatot a mozgófázissal 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét a mozgófázissal 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (b). Egy üvegcse CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt valzartánt (amely C-szennyezőt is tartalmaz) a mozgófázis 1,0 ml-ében oldunk. Oszlop: −

méretei: l = 0,125 m, Ø = 3,0 mm;

−

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, utókezelt, oktadecilszililezett szilikagél (5 μm).

Mozgófázis: R tömény ecetsav – R1 acetonitril – R víz (1+500+500 V/V); Áramlási sebesség: 0,4 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 225 nm-en. Injektálás: 10 μl. Kromatografálási idő: a valzartán retenciós idejének hatszorosa. Szennyező azonosítása: a C-szennyező azonosítására a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt valzartánhoz mellékelt kromatogramot és a b) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk.

Relatív retenció a valzartánra (retenciós ideje kb. 5 perc) vonatkoztatva: Cszennyező kb. 0,8. Rendszeralkalmasság: b) összehasonlító oldat: −

csúcsfelbontás: legalább 3,0, a C-szennyező és a valzartán között.


C-szennyező: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%);

−


−

össszes szennyező: csúcsterületük összege nem lehet nagyobb, mint az a) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének háromszorosa (0,3%);

−


Nehézfémek (2.4.8/B): legfeljebb 20 ppm. Az anyag 1,0 g-ját 15 térfogatrész R víz és 85 térfogatrész R aceton elegyével 20 ml-re oldjuk. Az oldat 12 ml-ét vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 10 ml R ólom−mértékoldattal (1 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): legfeljebb 2,0%. Az anyag 0,500 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS 0,170 g anyagot 70 ml R 2-propanolban oldunk. Az oldatot, potenciometriás végpontjelzést alkalmazva (2.2.20), 2-propanolos 0,1 M tetrabutilammóniumhidroxid–mérőoldattal titráljuk. Minden műveletet nitrogén légtérben végzünk. 1 ml 2-propanolos 0,1 M tetrabutilammónium-hidroxid–mérőoldattal 21,78 mg C24H29N5O3 egyenértékű.

ELTARTÁS Légmentesen záró tartályban. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, C. Egyéb kimutatható szennyezők (a következő szennyezők a cikkely valamelyik vizsgálatával kimutathatók, ha bizonyos határon felüli mennyiségben vannak jelen. Határértéküket az egyéb/egyedi határértékhez nem kötött (nem specifikált) szennyezőkre vonatkozó általános követelmény és/vagy a Gyógyszeranyagok (2034) általános cikkely előírásai határozzák meg. Ezért ezeket a szennyezőket nem szükséges a megfelelés bizonyítása céljából azonosítani. Lásd még a Gyógyszeranyagok szennyezésvizsgálata (5.10.) című általános fejezetet): B.

A.

R1 = H, R2 = CO2H, R3 = CH3: (2R)-3-metil-2-[pentanoil-[[2'-(1Htetrazol-5-il)bifenil-4-il]metil]amino]butánsav,

C.

R1 = CO2H, R2 = R3 = H: (2S)-2-[butanoil-[[2'-(1H-tetrazol-5-il)bifenil4-il]metil]amino]-3-metilbutánsav,

B.

benzil-[(2S)-3-metil-2-[pentanoil-[[2'-(1H-tetrazol-5-il)bifenil-4il]metil]amino]butanoát].

01/2011:2421

ZIPRASIDONI HYDROCHLORIDUM MONOHYDRICUM Ziprazidon-hidroklorid-monohidrát

C21H22Cl2N4OS.H2O [138982-67-9]

Mr 467,4

DEFINÍCIÓ 5-[2-[4-(1,2-Benzizotiazol-3-il)piperazin-1-il]etil]-6-klór-1,3-dihidro-2H-indol2-on–hidroklorid–monohidrát. Tartalom: 98,0–102,0% (vízmentes anyagra). SAJÁTSÁGOK Küllem: fehér vagy enyhén rózsaszínű por. Oldékonyság: vízben gyakorlatilag diklórmetánban kevéssé oldódik.

nem

oldódik;

metanolban

Polimorfiára hajlamos (5.9). AZONOSÍTÁS A. Infravörös abszorpciós spektrofotometria (2.2.24). Összehasonlítás: CRS ziprazidon-hidroklorid-monohidráttal.

és

Amennyiben a szilárd anyagok spektrumai eltérőek, a vizsgálandó anyagot és a referenciaanyagot külön-külön R metanolban oldjuk, az oldatokat szárazra párologtatjuk, és a maradékokból új spektrumokat veszünk fel. B. 30 mg anyagot 2 ml R vízben szuszpendálunk, a szuszpenziót 0,15 ml R hígított salétromsavval megsavanyítjuk, majd megszűrjük. A tiszta szüredékkel a kloridion a) pont szerinti azonossági reakcióját elvégezve (2.3.1) az előírt változás észlelhető. VIZSGÁLATOK Rokon vegyületek. Folyadékkromatográfia (2.2.29). A vizsgálatot fénytől védett helyen végezzük, és az oldatokat közvetlenül felhasználás előtt készítjük. A-oldószerelegy: R víz – R metanol (40+60 V/V). B-oldószerelegy: R tömény sósav – R víz – R metanol (0,04+20+80 V/V). Vizsgálati oldat (a). 23 mg vizsgálandó anyagot az A-oldószereleggyel 100,0 ml-re oldunk. Vizsgálati oldat (b). 23 mg vizsgálandó anyagot a B-oldószereleggyel 50,0 mlre oldunk. Összehasonlító oldat (a). 2,5 mg CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt 1 ziprazidont (amely A-, B- és C-szennyezőt tartalmaz) a B-oldószereleggyel 10,0 ml-re oldunk. Összehasonlító oldat (b). 1,0 ml b) vizsgálati oldatot a B-oldószereleggyel 100,0 ml-re hígítunk. Ezen oldat 1,0 ml-ét az oldószereleggyel 10,0 ml-re hígítjuk. Összehasonlító oldat (c). Egy üvegcse CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt 2 ziprazidont (amely D- és E-szennyezőt tartalmaz) 1,0 ml Boldószerelegyben oldunk. A. Oszlop: −

méretei: l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm;

−

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktilszililezett szilikagél (5 μmes gömbök);

−


Mozgófázis: −

A-mozgófázis: R metanol (40 térfogatrész) és R kálium-dihidrogénfoszfát 6,8 g/l töménységű, R tömény foszforsavval pH 3,0-ra beállított oldatának (60 térfogatrész) elegye;

−

B-mozgófázis: R metanol. Idő (perc) 0 – 20

A-mozgófázis (% V/V) 100

B-mozgófázis (% V/V) 0

20 – 21

100 → 0

0 → 100

21 – 24

0

100

Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 229 nm-en. Injektálás: 20 μl; a) és b) vizsgálati oldat, valamint a) és b) összehasonlító oldat. Szennyezők azonosítása: az A-, a B- és a C-szennyező azonosításához a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt 1 ziprazidonhoz mellékelt kromatogramot, és az a) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a ziprazidonra (retenciós ideje kb. 7 perc) vonatkoztatva: A-szennyező kb. 0,4; B-szennyező kb. 0,8; C-szennyező kb. 0,9. Rendszeralkalmasság: a) összehasonlító oldat: –

hegy-völgy arány: legalább 1,2, ahol Hp = a C-szennyezőnek megfelelő csúcs alapvonaltól mért magassága és Hv = a C-szennyező csúcsát a B-szennyező csúcsától elválasztó görbeszakasz minimumának az alapvonaltól mért távolsága.

Követelmények: – korrekciós faktor: az A-szennyező mennyiségének kiszámításához a megfelelő csúcsterületet 0,7-del szorozzuk; − B-szennyező a b) vizsgálati oldatban: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének kétszerese (0,2%);

– A-szennyező a b) vizsgálati oldatban: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (0,15%); − C-szennyező az a) vizsgálati oldatban: csúcsterülete nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 0,75-szorosa (0,15%); − egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők a b) vizsgálati oldatban: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%); − elhanyagolási határ a b) vizsgálati oldatban: a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%); a Cszennyezőnek megfelelő csúcsot és a 20 percnél nagyobb retenciós idejű csúcsokat figyelmen kívül hagyjuk. B. Oszlop: −

méretei: l = 0,15 m, Ø = 4,6 mm;

−

állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktilszililezett szilikagél (5 μmes gömbök);

−


Mozgófázis: R metanol (5 térfogatrész), R kálium-dihidrogén-foszfát 6,8 g/l töménységű, R kálium-hidroxid 280 g/l töménységű oldatával pH 6,0-ra beállított oldata (40 térfogatrész) és R1 acetonitril (55 térfogatrész) elegye. Áramlási sebesség: 1,0 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 229 nm-en. Injektálás: 20 μl; b) vizsgálati oldat, valamint b) és c) összehasonlító oldat. Kromatografálási idő: a ziprazidon retenciós idejének 11-szerese. Szennyezők azonosítása: a D- és az E-szennyező azonosításához a CRS rendszeralkalmassági vizsgálatra szánt 2 ziprazidonhoz mellékelt kromatogramot, és a c) összehasonlító oldat kromatogramját használjuk. Relatív retenciók a ziprazidonra (retenciós ideje kb. vonatkoztatva: D-szennyező kb. 2,0; E-szennyező kb. 3,0.

4,5

perc)

Rendszeralkalmasság: c) összehasonlító oldat: −

csúcsfelbontás: legalább 6,0, a ziprazidon és a D-szennyező között.


korrekciós faktorok: a következő szennyezők mennyiségének kiszámításához csúcsterületeiket a megfelelő faktorokkal szorozzuk: D-szennyező: 1,4; E-szennyező 0,5.

–

D- és E-szennyező: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének 1,5-szerese (0,15%);

–

egyedi határértékhez nem kötött (nem-specifikált) szennyezők: csúcsterületük egyenként nem lehet nagyobb, mint a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területe (0,10%);

–

elhanyagolási határ: a b) összehasonlító oldat kromatogramján látható főcsúcs területének fele (0,05%); a ziprazidonnak megfelelő csúcs előtt eluálódó csúcsokat figyelmen kívül hagyjuk.

Követelmény: − szennyezők az A. és a B. pont szerinti vizsgálatban: összesen legfeljebb 0,5%. Nehézfémek (2.4.8/C): legfeljebb 20 ppm. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. Az összehasonlító oldatot 2 ml R ólom−mértékoldattal (10 ppm Pb) készítjük. Víztartalom (2.5.12): 3,7–5,0%. Az anyag 0,250 g-ját vizsgáljuk. Szulfáthamu (2.4.14): legfeljebb 0,1%. Az anyag 1,0 g-ját vizsgáljuk. TARTALMI MEGHATÁROZÁS Folyadékkromatográfia (2.2.29). A vizsgálatot fénytől védett helyen végezzük, és az oldatokat közvetlenül felhasználás előtt készítjük. Oldószerelegy: R víz – R metanol (40+60 V/V). Vizsgálati oldat. 23,0 mg vizsgálandó anyagot az oldószereleggyel 100,0 ml-re oldunk.

Összehasonlító oldat. 23,0 mg CRS ziprazidon-hidroklorid-monohidrátot az oldószereleggyel 100,0 ml-re oldunk. Oszlop: − méretei. l = 0,15 m; Ø = 4,6 mm; − állófázis: R kromatográfiás célra szánt, oktilszililezett szilikagél (5 μm-es gömbök); − hőmérséklet: 40 °C. Mozgófázis: R metanol (40 térfogatrész) és R kálium-dihidrogén-foszfát 6,8 g/l töménységű, R tömény foszforsavval pH 3,0-ra beállított oldatának (60 térfogatrész) elegye; Áramlási sebesség: 1,5 ml/perc. Detektálás: spektrofotométerrel, 229 nm-en. Injektálás: 20 μl. Kromatografálási idő: a ziprazidon retenciós idejének kétszerese. Rendszeralkalmasság: összehasonlító oldat: − szimmetriafaktor: legfeljebb 2,0, a ziprazidonra számolva. A százalékos C21H22Cl2N4OS-tartalmat a CRS monohidrát deklarált tartalma alapján számoljuk ki.

ziprazidon-hidroklorid-

ELTARTÁS Fénytől védve. SZENNYEZŐK Egyedi határértékhez kötött (specifikált) szennyezők: A, B, C, D, E.

A. 3-(piperazin-1-il)-1,2-benzizotiazol,

B. 5-[2-[4-(1,2-benzizotiazol-3-il)piperazin-1-il]etil]-6-klór-1H-indol-2,3dion,

C. 2-[2-amino-5-[2-[4-(1,2-benzizotiazol-3-il)piperazin-1-il]etil]-4klórfenil]ecetsav,

D. 5,5'-bisz[2-[4-(1,2-benzizotiazol-3-il)piperazin-1-il]etil]-6,6'-diklór-3hidroxi-1,1',3,3'-tetrahidro-2H,2'H-3,3'-biindol-2,2'-dion,

E. 3-(1,2-benzizotiazol-3-il)-5-[2-[4-(1,2-benzizotiazol-3-il)piperazin-1il]etil]-6-klór-1,3-dihidro-2H-indol-2-on.

A glikán-analízis a glikoproteinek glikán részének vizsgálatára szolgáló elemzés. Ez tartalmazhatja:

Recommend Documents