A Flowcytometriás keresztpróba jelentısége élıdonoros veseátültetést megelızıen.
Sinkovichné Bak Erzsébet, Schmidt Lászlóné
Mikor végezhetı el a veseátültetés? • Veseátültetés akkor végezhetı , ha a donor és a recipiens között az ún. HLA-keresztpróba negatív, azaz a donor HLAantigénjeivel szemben specifikus antitestek nem mutathatók ki a recipiens szérum mintájában.
• Az Európai Immungenetikai Társaság elıírása (EFI standard)
szerint cadaver veseátültetést megelızıen kötelezı a CDC technikával kivitelezett keresztpróba. Élıdonoros átültetés elıtt szükséges egy érzékenyebb technikával kivitelezett keresztpróba is, ugyanis az alacsonyabb titerő citotoxikus ellenanyag nem mutatható ki biztonságosan a CDC módszerrel.
• Érzékenyebb módszer a flowcytometriás keresztpróba.
Röviden a Flowcytometriáról • A flowcytometria különálló sejtek rendkivül gyors,
multiparaméteres vizsgálatára alkalmas laboratóriumi eljárás.
• Felhasználásával lehetıvé válik sejtpopulációk elkülönítése és szétválasztása az immunfenotipus vagy a funkcionális állapot alapján.
• Nagyon fontos a minta elıkészítés, a sejt szuszpenzió elıállítása.
• A szövetek szétválasztásánál törekedni kell az egyes sejtek életképességének megmaradására, mert a vizsgálat elvégzésének, értékelhetıségének feltétele az ép sejtek jelenléte.
A flowcytométer mőködési elve • Az analizálni kívánt sejtek morfológiai tulajdonságaik alapján történı megkülönböztetésére, funkcionális állapotuk jellemzésére fluoreszkáló festékkel történı jelöléseket alkalmaznak.
• A jelölt sejteket lézer sugár világítja meg. A készülék a lézer indukálta optikai jeleket detektálja, és dolgozza fel .
Mi a keresztpróba? • Laboratóriumunkban 1 éve kezdtük el alkalmazni a
flowcytometriás keresztpróbát a CDC ( complement dependens citotoxicitás) keresztpróbával párhuzamosan, az élıdonoros átültetések elıtt.
• A keresztpróba olyan eljárás, amikor a beteg savójához
adjuk a donor sejtjét, inkubáljuk szobahın 30 percig, majd complement hozzá adása után ismét inkubáljuk 1 óráig.
• Ezután festjük, és végül formalinnal leállítjuk a festési reakciót majd értékeljük a keresztpróbát.
Három eset ismertetése • CDC technikával végzett keresztpróba negatív lett,
szemben a flowcytometriás keresztpróba pozitív eredményt adott.
• Két esetben a donor a férj volt. • Az alloimmunizációt a terhességek válthatták ki. • Az ELISA technikával végzett ellenanyagszőrés során
igazolódott, hogy a betegek szérummintájában , a férj idegen HLA-antigénjével szemben mutatható ki az antitest.
Két esetben pozitív keresztpróba
Harmadik eset bemutatása • A harmadik esetben potenciális donorként a testvér szerepelt.
• Az ellenanyagszőrés olyan specificitást mutatott (anti-HLA-A2), ami a testvér idegen HLA-antigénje ellen irányult .
A harmadik eset diagrammja
Az eredmények értékelése • A donor sejt+beteg szérum csövekben mért Geo-Mean
értékeket osszuk el a negatív kontrollban mért Geo-Mean értékekkel. Külön a T és B sejt populációkban.
• Ha a hányados nagyobb mint 1.5, a keresztpróba POZITÍV. Ez azt jelenti, hogy a vizsgált keresztreakcióban az antihumán IgG jelölıdés több mint másfélszerese a negatív kontrollénak.
• Gyenge aspecifikus kötıdés szinte minden mintában látható (jobb alsó kvadráns) ez azonban nem zavarja a T ill. B sejteken megjelenı pozitivitás értékelését.
Egy különleges eset • Kétféle keresztpróba • CDC-módszerrel erısen pozitív, flowcytométerrel negatív
• Egy hónap múlva ismételt keresztpróba, csak CDC- módszerrel.
• Az eredmény negatív
A flowcytometria jelentısége • Csak a humán sejteket érzékeli a mérés során, más eredető anyagok nem tudják megzavarni a pontos mérést.
• A bemutatott esetek azt igazolják, hogy szükség van olyan érzékeny módszer alkalmazására, amely az alacsony titerő, de a beültetett szervre káros citotoxikus ellenanyagot is biztonságosan kimutatja.
Köszönöm megtisztelı figyelmüket!
