A dipeptidil peptidáz IV enzim és inhibitorainak szerepe az endomorphin 2 bioszintézisében

A dipeptidil peptidáz IV enzim és inhibitorainak szerepe az endomorphin 2 bioszintézisében Doktori értekezés

Dr. Király Kornél Péter Semmelweis Egyetem Gyógyszertudományok Doktori Iskola

Témavezető: Dr Rónai András, egyetemi docens, Ph.D. Hivatalos bírálók: Dr. Kőhidai László egyetemi docens, az orvostudományok kandidátusa Dr. Helyes Zsuzsanna, egyetemi docens, D.Sc. Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Sándor Péter egyetemi tanár, D.Sc. Dr. Darvas Katalin, egyetemi tanár, Ph.D. Dr. Tarnawa István, Ph.D.

Budapest 2011

Tartalomjegyzék

2

Rövidítések jegyzéke

4

1. Bevezetés

6

1.1 Az opioid receptorok és a klasszikus opioid peptidek

6

1.2 A Tyr-Pro peptidek

8

1.3 Az endomorphinok

9

1.3.1 Az endomorphinok felfedezése

9

1.3.2 Az endomorphinok lokalizációja

10

1.3.3 Az endomorphinok jellemzői in vitro vizsgálatokban

11

1.3.3.1 Az endomorphinok farmakológiai karakterizálása in vitro vizsgálatokban

11

1.3.3.2 Az endomorphinok lebomlásának vizsgálata in vitro rendszerekben

12

1.3.4 Az endomorphinok antinociceptiv hatása

14

1.3.5 Az endomorphinok és a tolerancia

15

1.3.6 Az endomorphinok és a dependencia

16

1.4 A Dipeptidil-peptidáz IV (DPP IV, CD 26, EC 3.4.14.5)

16

1.5 Az endomorphinok képződése

19

1.6 A fájdalommal kapcsolatos fogalmak terminológiája

21

1.7 A nociceptio és annak feldolgozása

22

1.7.1 A perifériás nociceptorok

22

1.7.2 A nocicpetiv információ feldolgozása a gerincvelő hátsó szarvában

23

2. Célkitűzések, hipotézis

29

3. A kísérletek használt anyagok és a vizsgálati metodika

30

3.1 A kísérletekhez használt állatok

30

3.2 A kísérletekhez használt anyagok

30

3.3 Izolált hátsó gyöki ganglionon végzett vizsgálatok

31

3.4 Az endomorphin 2 szint mérése Radio Immuno Assay (RIA), P-anyag szint mérése ELISA segítségével

33

3.5 In vivo analgetikus vizsgálatok

34

3.5.1 Akut nociceptiv teszt

34

2

3.5.2 Gyulladásos hiperalgéziás modellen végzett vizsgálatok 34 3.6 Statisztikai analízis

35

4. Eredmények

36

4.1 Izolált L4, L5 hátsó gyöki ganglion preparátumon végzett kísérltek erdményei

36

4.1.1 Az előkísérletben kapott eredmények

36

4.1.2 A módosított kísérleti elrendezésű és feldolgozású főkísérlet eredményei

37

4.2 Az in vivo vizsgálatok eredményei

38

4.2.1 Az in vitro vizsgálatok eredményei alapján felállított alaphipotézis az in vivo vizsgálatokhoz

38

4.2.2. Dipeptidil-peptidáz inhibitorok antihiperalgéziás hatása az intraplantáris carrageenannel előidézett mechanikus hiperalgézia-modellben

38

4.2.3. Akut nociceptiv (tail flick) teszten kapott eredmények

43

5. Megbeszélés

46

5.1 Technikai szempontok

46

5.2 Tartalmi megbeszélés

47

6. Megállapítások

53

7. A kísérleti anyag alapján felállított további kutatási stratégia

54

8. Összefoglalás

57

9. Summary

58

Irodalomjegyzék

59

Saját közlemények

77

Köszönetnyilvánítás

79

3

Rövidítések jegyzéke ACE

Angiotenzin konvertáló enzim

ANOVA

Varianciaanalízis

APM

Aminopeptidáz M

APP

Aminopeptidáz P

ATP

Adenozin trifoszfát

βFNA

beta-Funaltrexamin

CART

Cocain amphetamin regulated transript

CD26

diferenciációs marker 26

CGRP

Calcitonin gene releated peptide

CHO

Kína hörcsög ovariumtumor eredetű sejtvonal

CPY

Carboxypeptidáz Y

DADLE

[D-Ala2-D-Leu5]-enkepahlin

DAMGO

[D-Ala2, MePhe4, Gly5-ol]-enkephalin

DMARD

Disease modifying anti rheumatic drug

DOR-1

Delta opioid receptor gén 1

DPP IV

Dipeptidil peptidáz IV

DRG

Hátsó gyöki ganglion (Dorsal Root Ganglion)

ED50

50% hatást kiváltó dózis negatív logaritmusa

ELISA

Enzyme linked immunosorbent assay

EM1

Endomorphin 1

EM2

Endomorphin2

EM2 AS

Endomorphin 2 ellenes nyúl antiszérum

GABA

γ-Aminovajsav

GIP

Gasztrikus inhibitoros peptid

GLP

Glukagon like peptid

GRH

Növekedési hormon releaseing hormon

GPI

Tengerimalac ileum (hosszanti simaizomcsik-Auerbach plexus)

GTPγS

Enzimrezisztens guanozin trifoszfát származék

HPLC

Nagynyomású folyadék kromatográfia

IC50

50% Inhibitoros hatást okozó koncentráció

icv.

Intracerebroventricularis, agykamrai (oldalkamra)(

IR

Immunreaktivitás 4

it.

Intrathekalis, gerincvelői liquortérbe történő injektálás

Kd

Equilibrium disszociációs konstans (biokémiai módszerrel meghatározva)

Ke

Equilibrium disszociációs konstans (farmakológiai módszerrel meghatározva)

Ki

Leszorítási konstans

KO

Génkiütött

KOR-1

Kappa opioid receptor gén 1

MIF-1

MSH (melanocita stimuláló hormon) Release Inhibiting Hormon/Faktor 1

MOR-1

Mű opioid receptor gén 1

MPE%

Maximális lehetséges hatás százaléka

mtsi.

Munkatársai

MVD

Egér vas defferens (Mouse Vas Deferens)

NEP

Neutrális endopeptidáz

NPY

Neuropeptid Y

NRS

Nem reaktív nyúl szérum

NX

Naloxon

NTX

Naltrexon

ORL-1

Opioid receptor like 1

PC

Prohormon konvertáz

PYY

Peptid YY

RIA

Radio-Immuno-Assay

sc.

subcutan

SP

P anyag

SUT-1

Natrium szulfát transzpoter gén

TCA

Triklórecetsav

TFA

Trifluorecetsav

UV

Ultraibolya

5

1. Bevezetés Az opioid vegyületek máig a leghatékonyabb fájdalomcsillapító szerek, amelyek az orvostudomány rendelkezésére állnak. Az opioidok és az endogén opioid rendszer emiatt régóta intenzív kutatás alatt áll. A rendszer legtöbb elemét sikerült feltérképezni, azonban a legutoljára felfedezett endogén peptidek az endomorphinok tekintetében máig sok a megválaszolatlan kérdés. Az egyik ilyen az endomorphinok endogén képződése. Az általunk végzett kutatások elsősorban erre kívántak fényt deríteni. 1.1 Az opioid receptorok és a klasszikus opioid peptidek A három alapvető (µ, κ, δ) opioid receptor felfedezésére a hetvenes években került sor (Gilbert and Martin, 1976; Lord et al., 1977; Martin et al., 1976), majd ezt követően azonosították a receptor-proteineket kódoló géneket is. Az egyes receptortípusok proteinjeit a MOR-1 (Chen et al., 1993), KOR-1 (Yasuda et al., 1993) és DOR-1 (Evans et al., 1992; Kieffer et al., 1992) gének kódolják. A negyedik receptor típusnak a nociceptin / orphaninFQ receptora az ORL-1 (Mollereau et al., 1994; Reinscheid et al., 1995) tekinthető, ám ehhez más opioid peptidek nem kötődnek, és a nociceptin sem kötődik a többi opioid receptorhoz. E sajátságok hátterében a közelmúltban feltárt filogenetikai folyamatok állnak. (Sundstrom et al., 2010) A receptoroknak számos altípusát írták le farmakológiai vizsgálatokkal - szelektív agonisták ill. antagonisták használatával (µ1, µ2, κ1, κ2, κ3, δ1, δ2). A farmakológiai úton differenciált altípusok genomikai háttere jelenleg is intenzíven kutatott -és vitatott- terület (Pan et al., 2005a; Pan et al., 1999; Pan et al., 2005b; Rossi et al., 1997; Rossi et al., 1995). A téma szempontjából fontos µ receptor esetében farmakológiai szinten megkülönböztetnek µ1 altípust, melyhez a természetes enkephalinok nagyobb affinitással kötődnek, (Nishimura et al., 1984) és a hatásuk szelektíven és irreverzibilisen gátolható naloxazonnal és naloxonazinnal (Hahn et al., 1982; Pasternak and Hahn, 1980), valamint egy enkephalinokat alacsonyabb affinitással kötő µ2 altípust. Ezen kívül megkülönböztetnek még egy perifériás szövetekben – elsősorban immunsejteken előforduló µ3 altípust (Stefano et al., 1993). Az első felismert opioid aktivitással rendelkező endogén peptidek a leucin és metionin enkephalinok voltak (Hughes et al., 1975). Időben a következő lépés annak felismerése volt, hogy a beta-lipotropin 61-76-os (α-endorphin) és 61-91-es (β-endorphin) töredéke opioid aktivitással bír. Mindkét szekvencia tartalmazza a Met-enkephanlin szekvenciáját (61-65), de nem tekinthető a met-enkephalin prekurzorának (Cox et al., 1976; Lazarus et al., 1976; Li et

6

al., 1976). A harmadik klasszikus opioid peptid család, a dynorphinok felfedezésére valamivel később került sor (Goldstein et al., 1979). Az enkephalinokat tartják a delta receptorok, a dynorphinokat a kappa receptorok természetes ligandjainak. A β-endorphin mind µ mind δ receptorokhoz nagy affinitással kötődik, emiatt sokáig nem találtak primer ligandot, amelyet a µ receptorhoz rendelhettek. A peptidek prekurzorai közül a beta-lipotropin szekvenciáját Li és Chung 1965-ben meghatározta, de ekkor még nem volt ismeretes az endorphinok szerkezete és jelentősége (Li et al., 1965). Azt követően, hogy kísérletesen igazolható volt, hogy az endorphinok és az ACTH közös prekurzorból származnak (Mains et al., 1977), a proopiomelanocortin (POMC) gén felfedezésére 1981-ben került sor (Nakanishi et al., 1981). A proenkephalin peptidet szintén 1981-ben fedezték fel, az ezt kódoló preproenkephalin gént 1982-ben szekvenálták (Noda et al., 1982a; Noda et al., 1982b). A dynorphint és a neo-endorphinokat kódoló prodynorphin szekvenciáját szintén 1982-ben fejtették meg (Kakidani et al., 1982; Kangawa and Matsuo, 1979). A klasszikus opioid peptidek mindegyike tartalmazza a Tyr-Gly-Gly-Phe szekvenciát (lásd 1 táblázat). Kivéve az opioid receptorokhoz nem kötődő emlős nociceptin, mely egy filogenetikailag meghatározott mutációt követően fenilalanint tartalmaz N terminálisan; a mutációs elágazást megelőzően az N-terminális e nagycsaládban is konvencionális, azaz tirozin (Sundstrom et al., 2010) . 1 táblázat A klasszikus opioid peptidek aminosav szekvenciája β-endorphin

β-neoendorphin

Tyr-Gly-Gly-Phe-Met-Thr-Ser-Glu-Lys-Ser-Gln-Thr-Pro-Leu-ValThr-Pro-Leu-Val-Thr-Leu-Phe-Lys-Asn-Ala-Ile-Ile-Lys-Asn-AlaTyr-Lys-Lys-Asn-Ala-Tyr-Lys-Lys-Gly-Glu Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Arg-Ile-Arg-Pro-Lys-Leu-Lys-Trp-AspAsn-Gln Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu-Arg-Lys-Tyr-Pro

Met-enkephalin

Tyr-Gly-Gly-Phe-Met

Leu-enkephalin

Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu

Nociceptin(1-17)

Phe-GIy-Gly-Phe-Thr-Gly-Ala-Arg-Lys-Ser-Ala-Arg-Lys-LeuAla-Asn-Gln

Dynorphin A (1-17)

7

1.2 A Tyr-Pro peptidek – előzmények az endomorphinok felfedezéséhez Szintén felismerték, hogy léteznek még opioid receptor agonista hatással bíró egyéb peptidek is. A szarvasmarha β-caseinjét tápcsatornából származó enzimekkel emésztve előállítható a β-casomorphin 5 és 7 (Henschen et al., 1979), illetve a morphiceptin (βcasomorphin 1-4 amid, Tyr-Pro-Phe-Pro-NH2) (Day et al., 1981). A hemoglobinból hasonlóan származtatható a hemorphin 7 (Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg-Phe), és a cytochrom b-ből a cytocrophin 4 (Brantl et al., 1985; Brantl et al., 1986). Ezen peptidek mindegyike Nterminális Tyr-Pro szekvenciát tartalmaz. 1971-ben izolálták a Pro-Leu-Gly-NH2 szekvenciájú, első felismert funkciója alapján MSH Release Inhibiting Hormonnak (MIF-1) elnevezett peptidet borjú hypothalamusból (Nair et al., 1971). Ennek a vegyületnek specifikus, nem pontosan jellemzett kötőhelye van – nehezen meghatározható, mivel nem jódozható a peptid – amelyet triciált (Chiu et al., 1983) és fotóaffinitással jelölt ligand segítségével (Fisher et al., 2006) kimutattak, és amelynek szerepe lehet a dopamin receptorok allosztérikus modulációjában. A MIF-1 nem kötődik opioid receptorhoz. Számos hatását tekintve funkcionális antagonistaként viselkedik opiodokkal szemben. A MIF-1 prekurzora lehet az oxytocin (lehasadhat belőle), de nem egyértelmű, hogy valóban az e. (Versteeg, 1982). A következő láncszem az endomorphinok felfedezése felé vezető úton a Tyr-MIF-1 (Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2) izolálása volt borjú hypothalamusból (Horvath and Kastin, 1989). Ez a peptid rendelkezik saját kötőhellyel, amelyhez a klasszikus opioidok és az endomorphinok nem kötődnek, a kazein és a hemoglobin bomlásából származó peptidek viszont igen (Zadina and Kastin, 1985; Zadina et al., 1982). Ezen kívül a peptid opioid receptorokhoz is kötődik, lényegesen kisebb affinitással (1 µmol vs. 47-75 nmol). Szelektivitása a µ receptorokhoz mintegy 400-700-szoros a κ és δ receptorokkal szemben (Sartania et al., 1996). Az endomorphinok felfedezését közvetlenül megelőző láncszem a Tyr-W-MIF-1 (Tyr-ProTrp-Gly-NH2) felfedezése volt. Először emberi agykéregből mutatták ki (Erchegyi et al., 1992), majd ezt követően borjú hypothalamusból (Hackler et al., 1993). A Tyr-W-MIF-1 kötődik a Tyr-MIF-1 kötőhelyéhez és µ opioid receptorokhoz. Ez utóbbihoz az affinitása mintegy 20-szor nagyobb mint a Tyr-MIF-1-nek (DAMGO-val szembeni IC50 0,3 -0,37 µmol szemben a Tyr-MIF 16 – 5,5 µmol-os értékével) (Erchegyi et al., 1992; Hackler et al., 1993). A µ receptorokhoz mintegy 200-szoros szelektivitást mutat a κ és δ receptorokkal szemben (Zadina et al., 1994), az affinitása azonban mintegy 100-szor kisebb a DAMGO-énál. A TyrW-MIF-1 mind µ1 mind µ2 kötőhelyekhez kötődik, a µ1-hez mintegy 3-szor nagyobb

8

affinitással, azonban a µ2 altípushoz is relatív nagy affinitással rendelkezik (Zadina et al., 1996). Mivel a Tyr-W-MIF-1 az előzőhöz hasonlóan parciális agonista µ receptoron, számos esetben képes gátolni opioid hatásokat. (lásd 2 táblázat) 2. táblázat A Tyr-MIF-1 család és néhány nevezetes opioid hatóanyag kötőhelyeinek összehasonlítása (Pan and Kastin, 2007) Tyr-MIF-1

µ opioid rec.

κ opioid rec.

δ opioid rec.

MIF-1

-

-

-

-

Tyr-MIF-1

+

+

-

-

Tyr-W-MIF-1

+

+

-

-

Endomorphinok

-

+

-

-

β-endorphin

-

+

-

+

Morfin

-

+

+-

+-

1.3 Az endomorphinok (Endomorphin 1: Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2, Endomorphin 2: TyrPro-Phe-Phe-NH2) 1.3.1 Az endomorphinok felfedezése Az endomorphinok felfedezéséhez egy szokatlan kísérleti eljárás vezetett. Zadina munkacsoportja Tyr-W-MIF-1 analógokat vizsgált úgy, hogy a négyes pozícióban levő glicint kicserélte mind a húsz természetes aminosavra. A glicin fenilalaninos szubsztitúciója igen nagyfokú (több mint ötvenszeres) affinitás növekedést eredményezett opioid receptorkötési kísérletben, és ezzel párhuzamosan a szelektivitás a µ receptor irányában is jelentősen fokozódott. A glicin szubsztitúciója más hidrofób aminosavakkal szintén növelte az affinitást, de sokkal kisebb mértékben. Ez a peptid, a Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 (az endomorphin-1 elnevezés csak később keletkezett) opioid agonistának bizonyult izolált tengerimalac ileumon, illetve analgetikus tesztekben is. A peptid ellen specifikus antitestet képeztek, mely más ismert neuropeptidekkel nem mutatott keresztreakciót. Ennek az antitestnek segítségével radioimmunassay-vel izolálták a peptidet borjú cortexből. Az izoláció során az antitest egy második peptidet is megjelölt a keresetten kívül: a Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2-ot. Ezután kapták az új peptidek az endomorphin-1 és endomorphin-2 elnevezést.(Zadina et al., 1997) A két peptidet tartják azóta is a µ receptorok endogén agonistájának, bár velük kapcsolatban jelenleg is több a megválaszolatlan kérdés. (Az endomorphinok szerkezetét lásd. 1. ábra)

9

1 ábra: Az endomorphinok szerkezete 1.3.2 Az endomorphinok lokalizációja Az első izoláció borjú cortexből történt, ahol az endomorphin tartalom 2,1 pmol/g volt, amely alacsonyabb, mint az enkephalinok mennyisége, de közelítőleg megegyező a többi endogén opioid peptidével. Ugyanez a munkacsoport még ugyanebben az évben izolálta az endomorphinokat emberi agyból és ott jelentősen nagyobb mennyiségben (151 pmol/g) voltak kimutathatók, mint a többi endogén opioid (Hackler et al., 1997). Számos munkacsoport feltérképezte az endomorphinok idegrendszeri előfordulását patkányon (Martin-Schild et al., 1999; Pierce et al., 1998; Schreff et al., 1998). A legtöbb közlemény egybehangzó lényegi eleme, hogy előagyi- felső agytörzsi területeken az immunreaktiv endomorphin 1 dominál, míg alsó agytörzsi és gerincvelői szinten az endomorphin 2 előfordulása a jellemzőbb, különösen a szenzoros afferentációval és integrációval összefüggésbe hozható területeken. Dolgozatom szempontjából kulcsfontosságú volt Sanderson-Nydahl speciális technikával készült elektonmikroszkópos munkája (Sanderson Nydahl et al., 2004). A cikk azóta többszörösen megerősített (Greenwell et al., 2007; Niu et al., 2009) alapállítása, hogy gyakorlatilag valamennyi patkány hátsógyöki ganglionsejt, mely tartalmaz immunreaktiv P anyagot, tartalmaz immunreaktiv endomorphin 2-t is, és viszont. (lásd 3. táblázat)

10

3. táblázat: Az endomorphin 2 kolokalizációja neuronális markerekkel és transzmitterekkel (Sanderson Nydahl et al., 2004) Marker Pair

Cells (n1/n2)

Double labelled Cells (n)

Percentages (A of B)

(%)

NeuN/EM2

1234/295

295

EM2 of NeuN

23.9

SP/EM2

448/464

444

EM2 of SP

99.1

SP of EM2

95.7

EM2 of IB4

8.2

IB4 of EM2

16.9

EM2 of CGRP

76.5

CGRP of EM2

99.8

EM2 of TRPV1

40.1

TRPV of EM2

83.5

EM2 of Peripherin

36.6

Peripherin of EM2

95.1

EM2 of N52

3.5

N52 of EM2

9.6

IB4/EM2 CGRP/EM2 TRPV1/EM2 Peripherin/EM2 N52/EM2

797/384 570/437 911/437 1268/488 904/332

65 436 365 464 32

1.3.3 Az endomorphinok in vitro farmakológiája 1.3.3.1 Az endomorphinok farmakológiai karakterizálása in vitro vizsgálatokban Kötési kísérletekben delta és kappa receptorokon az endomorphinok specifikus ligandokkal szemben mért Ki értékei a micromoláris nagyságrendbe esnek (egy esetben fél µmol volt a határérték Ki és a fölé esett). Mivel a µ receptor iránti affinitást minden szerző DAMGO-val szemben vizsgálta ezért ezeket az adatok közvetlenül összevethetőek: Zadina és mtsi. eredeti cikkükben mindkét endomorphin esetén subnanomoláris szintű Ki-t mértek (0,36 és 0,69 nM). Goldberg és mtsi. egér membránon (5 nM DADLE jelenlétében – a µ1 kötőhelyek telítése céljából) 3,2 és 4,0 nM értéket, transzfektált CHO sejten pedig 5,3 és 19,5 nM-os értékeket kaptak. Spetea és mtsi. patkány membránon az egéren kapotthoz hasonlító értékeket kaptak (4,2 és 5,3 nM). Ez esetben a DAMGO saját homológ Ki értéke 2,5 nM volt (Goldberg et al., 1998; Spetea et al., 1998; Zadina et al., 1997). A számítható szelektivitás ezekben az esetekben nem éri el az elsőként közölt sok ezres értékeket, de lényegesen magasabb, mint a többi endogén opioid esetén.

125

I izotóppal jelölt endomorphinok

szaturációs kötésben kapott Kd értékei egér agyon mindkettő esetén 0,25 nM, transzfektált CHO sejten 1,6 és 0,5 nM. Mivel a jelölt endomorphinokkal szemben homológ leszorítási Ki

11

érétkek alacsonyabbak mint amennyit triciált DAMGO-val szemben mértek, feltételezték, hogy a kötési helyük a receptoron eltérhet némileg a DAMGO-étól (Goldberg et al., 1998). Megállapítható tehát, hogy az endomorphinok affinitása a µ receptorhoz a DAMGO affinitásához mérhető, és 1 nM körüli nagyságrendbe esik.

125

I izotóppal jelölt

endomorphinok autoradiográfiás vizsgálatban a tradicionális µ agonistákhoz hasonló eloszlást mutattak a központi idegrendszerben (Goldberg et al., 1998). [35S]GTPγS kötési kísérletekben az endomorphinok a morfinhoz hasonló maximális hatást fejtenek ki. Ez a hatás jelentősen kisebb a DAMGO-val elérhetőnél. A hatás µ antagonistákkal dózisfüggően gátolható, nem µ receptorral transzfektált sejtmembrán preparátumokon ill. µ receptor KO egér sejtmembránján nagyrészt megszűnik. Megállapítható tehát, hogy az endomorphinok ilyen teszten is µ szelektív, ám parciális agonista ligandként működnek (Hosohata et al., 1998; Monory et al., 2000; Narita et al., 1998; Sim et al., 1998; Spetea et al., 1998; Xie et al., 2008). Hosohata és mtsi. a G protein stimulációval párhuzamosan mért kötési paraméterek segítségével meghatározták a DAMGO-hoz mért relatív efficacyt. Az általuk számított értékek a következők: endomorphin-1 0,54, endomorphin-2 0,59 ill. a referencia morfin 0,77. Tehát számításaik szerint még a morfinnál is némileg parciálisabb agonistáknak bizonyultak. E tulajdonságuk az endogén ligandok között teljesen egyedülállónak tekinthető. Izolált szervi vizsgálatokban az endomorphin 1 IC50 értéke tengerimalac ileumon (GPI) 10,1 nM, egér vas deferensen (MVD) 61,6 nM volt (Naltrexon Ke 0,2 és 0,21 nM); az endomorphin 2 IC50 értékei 9,22 nM (GPI) és 22,1 nM (MVD) (Naltrexon Ke 0,41 és 0,27 nM). Ezek az értékek megfelelnek egy nagy affinitású és szelektivitású µ agonista értékeinek (Ronai et al., 1999). 1.3.3.2 Az endomorphinok lebomlásának vizsgálata in vitro rendszerekben Az

endomorphinok

lebontását

nagyrészt

extracellulárisan

aktív

(általában

membránkötött) enzimek végzik. Az endomorphinok a többi endogén opioidnál stabilabbak a lebontó enzimekkel szemben a 2. helyen található prolin miatt, amely nem csak a konformációjukat rögzíti, de akadályt jelent a legtöbb peptidáz számára is (Vanhoof et al., 1995). A C-terminális amidáció további védelmet jelent a carboxipeptidázokkal szemben. Számos kísérletben vizsgálták az endomorphinok bomlását különböző enzimek és enzim inhibitorok jelenlétében. A prolin jelenléte a láncban kulcsfontosságú: egyrészt rögzíti a struktúrát, lehetőséget adva cisz-transz izomerek létrejöttére (más aminosavakkal szemben,

12

amelyek csupa transz helyzetben stabilak, a prolin esetében 25%-ban cisz, 75%-ban transz helyzet alakul ki), másrészt jelentősen szűkíti azon enzimek számát, amelyek a degradációban részt vehetnek. Az aminopeptidázok nagy részének hozzáférhetetlenek a prolin melletti peptidkötések. Az endomorphinok bomlása szempontjából egyik kulcsfontosságú enzim a dipeptidil peptidáz IV (DPP IV, EC 3.4.14.5, CD26), egy membránkötött szerin proteáz, amely Nterminális dipeptideket (X-Pro) hasít le számos biológiailag igen aktív molekuláról. (Az enzim tulajdonságait részletesen lásd az 1.4-es fejezetben.) Az endomorphinok alkalmas szubsztrátjai ennek az enzimnek, amely Tyr-Pro dipeptidet hasít le belőlük. Mivel a DPP IV működése kulcskérdés a dolgozat témája szempontjából, később részletesen visszatérek rá. Az endomorphinok ezen kívül alkalmas szubsztrátjai továbbá az aminopeptáz M-nek (APM, EC 3.4.11.2) és aminopeptáz P-nek (APP, EC 3.4.11.9). Az APP az N-terminális aminosav és a prolin közötti peptidkötést bontja, amelynek cisz konformációjúnak kell lennie. Az endomorphinok esetén a Tyr-t hasítja le az azt követő tripeptidről. Az APM szintén Nterminális aminosavakat hasít le peptidekről, ha azonban a második aminosav prolin akkor az első két aminosav dipeptid formában hasad le a DPP IV-hez hasonlóan. Az első hasítást követően a Tyr-Pro dipeptid meglehetősen stabil és csak 5 óra elteltével hasad tovább. Az Nterminális Trp-Phe-NH2 ill. Phe-Phe-NH2 ennél gyorsabban, 1 óra alatt elbomlik. Alternatív lehetőség a carboxipeptidáz Y (CPY, EC 3.4.16.1), amely egy olyan carboxipeptidáz, mely képes a prolin kivételével az amidált C-terminális aminosavak lehasítására. Az endomorphinok esetén a hasítás két lépésben megy végbe: először dezaminálódik a C-terminális, majd a terminális aminosav (jelen esetben Phe) lehasad. Az így kapott tripeptideket ez az enzim nem hasítja tovább. Ehhez hasonló metabolizmusra képes a proteináz A (PA, EC 3.4.23.6) is (Janecka et al., 2008). Az endomorphinok bomlását vizsgálva patkány agy homogenátumon a Tömböly és mtsi. az aminopeptidáz út fontosságát állapították meg: elsőként a Pro-Trp ill. a Pro-Phe kötés hidrolizált, majd ezt követően a dipeptidek bomlottak tovább aminosavakra. Az EM1 esetén még kisebb mértékben megfigyelhető volt egy alternatív útvonal, a Tyr hasadása az Nterminális végről. A Carboxipeptidáz útvonal metabolitjait nem mutatták ki. Az endomorphinok féléletideje durva agyi membrán frakción 24,46 (EM1) ill. 19,32 (EM2) perc volt. Teljes agy homogenátumon ennél lényegesen rövidebb (4,94 ill. 3.81), de így is sokkal hosszabb, mint az enkephalinoké (Tomboly et al., 2002). Szinaptikus membrán preparátumon ehhez hasonló bomlási irány figyeltek meg Sakurada és mtsi. (Sakurada et al., 2003) az EM2 esetében. Mivel a metabolitok keletkezését a DPP IV inhibitorai erősen gátolták ez arra utalt, 13

hogy a metabolizmusnak ez lehet a kulcsenzimje. Wu és mtsi. (Wu et al., 2002) az EM1 esetén ettől eltérőt fígyeltek meg: ez első hasítási lépés a C-terminális Phe-NH2 lehasadása volt, és csak ezt követően hasadt le külön a Trp. Carboxipeptidáz inhibitort hozzáadva ugyanezt a folyamatot figyelték meg lassabban. In vivo vizsgálatokban két enzimcsoport bizonyult fontosnak: a DPP IV, amely az inaktivációért felel, és aminopeptidázok, melyek a további degradációért felelnek (Shane et al., 1999). Némileg ellentmondásos Guieu és mtsi.-nak munkája: CD 26 (DPP IV) KO egérben nem találtak eltérést az endomorphin szintekben – ám ebben az egérben az agyban mérhető DPP IV aktivitás sem különbözött szignifikánsan a vad típusétól. Ők a DPP IV szerepét a nocicepepcióban az SP szinttel hozták összefüggésbe (Guieu et al., 2006). 1.3.4 Az endomorphinok antinociceptiv hatásai. Az endomorphinok antinociceptiv hatását számos munkacsoport vizsgálta egéren (Goldberg et al., 1998; Ohsawa et al., 2000; Sakurada et al., 2001; Sakurada et al., 1999; Stone et al., 1997; Tseng et al., 2000; Zadina et al., 1997) és patkányon (Horvath et al., 1999; Przewlocka et al., 1999; Przewlocki et al., 1999; Ronai et al., 1999) icv. és it. adagolás esetén. Mindkét anyag esetén megállapítható, hogy az in vitro receptor-affinitásukhoz mérten akut nociceptiv tesztekben mindkét állatfaj esetén a vártnál nagyságrendekkel kevésbé hatékonyak: gyakorlatilag azonos affinitás mellett a DAMGO-hoz viszonyítva mintegy 10-100x kevésbé hatékonyak. ED50 értékeik a nanomolaris nagyságrendbe esnek. Ezen felül a hatásuk időtartama igen rövid: 1-5 percnél éri el a maximumot és 30 perc után teljesen megszűnik. Ezen felül az endomorphin 2 patkányon icv. adagolás mellett szinte teljesen hatástalan. (AlKhrasani et al., 2006) Patkányon, gyulladásos fájdalom modellen hatásosnak bizonyultak, azonban a hatásuk elmaradt a morfinétól (Przewlocka et al., 1999). Azonban allodyniás fájdalom tekintetében a morfinnál hatékonyabbnak bizonyultak mind dynorphin által kiváltott allodynia (Stone et al., 1997), mind n. ischiadicus roncsolás után (Przewlocka et al., 1999; Przewlocki et al., 1999). A hatás minden munkacsoport szerint antagonizálható naloxonnal és µ szelektív βFNA-val. A fájdalomcsillapító hatás gyenge µ defficiens CXBK egéren és megszűnik MOR-1 KO egéren (Goldberg et al., 1998; Mizoguchi et al., 1999). Ez a megfigyelés tiszta µ receptor mediálta hatásra utal. Közvetlen hatás a többi opioid receptoron nem feltételezhető az in vitro tulajdonságok alapján azonban több munkacsoport mutatott ki közvetett hatásokat más opioid receptorokon, icv. és it. adagolás esetén, amelynek magyarázatát immunneutralizáció

14

segítségével kimutatott dynorphin és enkephalin felszabadulás jelenti (Ohsawa et al., 2000; Sakurada et al., 2001; Tseng et al., 2000). Mivel az endomorphinok lebontásáért valószínűleg a dipeptidil-peptidáz IV felel, ezért több közleményben vizsgálták, hogyan befolyásolja az endomorphin analgéziát ezen enzim gátlása. Shane és mtsi. szinergizmust találtak a DPP IV antagonista Ala-Pyrr-2-CN és az endomorphin 2 szupraspinális analgetikus hatása között (Shane et al., 1999). Rónai és mtsi. ezzel szemben nem tudtak kimutatni potencírozást endomorphin 1 és egy másik DPP IV gátló a Diprotin A között, bár a Diprotin A nagy dózisban (100-300 nmol) önmagában is naloxonnal antagonizálható analgetikus hatást fejtett ki (Ronai et al., 1999). 1.3.5 Az endomorphinok és az opioid tolerancia Egy opioid vegyület esetében mindig központi kérdés a hatásához kialakuló tolerancia. In vitro vizsgálatokban kimutatható volt, hogy krónikus endomorphin 1 és 2 expozíció után is nőtt

a

forskolinnal

stimulálható adenil-cikláz

aktivitás

naloxon kezelés

hatására

(McConalogue et al., 1999). In vivo kimutatták, hogy it. előkezelés a további it. adagolás esetén a csökkenti a hatást, ami az akut tolerancia állapotának felel meg egéren és patkányon (Horvath et al., 1999; Stone et al., 1997). Későbbi vizsgálatokban világossá vált, hogy egy nagy dózisú endomorphin adag a később adott endomorphinok hatását csökkenti egéren és patkányon (Hung et al., 2002; Labuz et al., 2002; Wu et al., 2003; Wu et al., 2001). Wu és mtsi. megfigyelték, hogy az endomorphinok gyorsabban alakítanak ki toleranciát, mint a morfin. Az endomorphin 1 esetén azonban hosszabb kezelés volt szükséges, mint az endomorphin 2 esetében. Nem tisztázott pontosan ennek az oka: vagy féléletidő, vagy a receptor-szelektivitásban mutatott különbség, vagy valamilyen neuronális hálózati eltérés, de nem a receptorstimuláció foka vagy a receptor deszenzitizációs különbség (Wu et al., 2001). Labuz és mtsi. patkány tail-flick és paw-pressure teszten EM2 kezelés esetén részleges kereszttoleranciát találtak EM1 irányába, EM1 kezelés esetén azonban nem találtak kereszttoleranciát EM2 felé. Az endomorphin 1 és a morfin között kereszttoleranciát találtak, ezért feltételezték, hogy közös receptoron hatnak (µ2), míg az endomorphin 2 felé nem, ezért arra következtettek, hogy az más receptor altípuson, esetleg splice variánson hathat. (Labuz et al., 2002). Az eddigi közlemények, amelyek az endomorphinokat tolerancia szempontjából vizsgálták csak a nociceptiv tesztekben mutatott tolerancia kérdésével foglalkoztak, így nem tudni, hogy az egyéb hatások szempontjából milyen a helyzet. Tolerancia szempontjából érdekes lehet, hogy az endomorphinok kötődése során a µ receptor eltérő G fehérje típust

15

aktivál, mint DAMGO vagy morfin esetén, továbbá eltérés figyelhető meg a két endomorphin esetében is (Sanchez-Blazquez et al., 1999). 1.3.6 Dependencia A fizikális dependencia kialakulását vizsgálva Chen és mtsi. megállapították, hogy mindkét peptid képes morfinhoz hasonló dózisban 5 napos kezelés mellett naloxonnal kiváltható elvonási tüneteket okozni (Chen et al., 2003). A gyógyszer addikcióra jellemző pszichés reward szintén kulcskérdés egy opioid vegyületnél: az addikció egyik legfontosabb mechanizmusának a ventrális tegnemtális areában (VTA) található GABAerg neuronokon található µ receptorokat tartják: ezek gátolják a GABAerg sejteket, amelyek a n. accumbensbe projiciáló glutamáterg neuronokat gátolnák, így az opioidok hatására ezek túlműködése jön létre. Zangen és mtsi. megállapították, hogy endomophin-1 microinjekciója a VTA-ba képes megerősítő hatást okozni (a n. accumbensbe adva azonban nem) (Zangen et al., 2002). Az endomorphinokat icv. adva különböző fajokban vizsgálták a megerősítő hatásukat, azonban az eredmények némileg inkonzisztensek. Narita és mtsi. egérben icv. adás mellett az endomorphin 1 esetén pozitív place preferenciát találtak, endomorphin 2 esetén place averziót. Wu és mtsi. pedig azt találták, hogy az endomorphin 2 által okozott averzió meggátolható volt mind dynorphin elleni antiszérummal, mind κ receptor antagonistával. Feltételezték, hogy az endomorphin 2 egy másik receptorpopuláción hatva dynorphin leadást okoz, és ez lenne felelős az averzióért (Narita et al., 2001a; b; Wu et al., 2004). Patkányon Wilson és mtsi. antinociceptiv dózisban nem találtak hatást kondicionált place preferencia tesztben (Wilson et al., 2000). Huang és mtsi. alacsonyabb (de már antiallodyniás hatással bíró) dózisban nem találtak pozitív place preferenciát, magasabb dózisban az endomorphin 1 mozgászavarokat (a törzs hordó szerű rotációját) okozott, az endomorphin 2 azonban pozitív place preferenciát (Huang et al., 2004). Nem ismert, hogy mi vezet a fajok között tapasztalt különbségekhez, sem az, hogy a két peptid közötti eltérést mi okozza. 1.4 A Dipeptidil peptidáz (DPP) IV (CD-26, EC 3.4.14.5) A dipeptidyl-peptidáz IV-et már 1966-ban felfedezték patkány máj homogenátumban. (Hopsu-Havu and Glenner, 1966) Jóval később került újra az érdeklődés középpontjába mint cellularis marker és kötőfehérje, melynek fontos feladata biológiailag aktív peptidek inaktiválása. A humán DPP IV egy 240 kDa méretű glikoprotein, mely két 120 kDa-os alegységből épül fel (Puschel et al., 1982). (lásd 2 ábra) A szerin proteázok családjába tartozik, amlyek 16

aktív centruma eltér a tripszin szerű enzimekétől (David et al., 1993). A Fisher-344 patkánytörzsnek létezik egy altípusa (CRJ), melynek működésképtelen a DPP IV enzime. Ez a törzs igen jó lehetőséget jelent az enzim funkcióinak vizsgálatára (Fujiwara et al., 1992), később mesterségesen előállítottak CD 26 KO egeret is (Marguet et al., 2000). Az általános szerin-proteáz inhibitorok kisebb-nagyobb mértékben képesek gátolni az enzimet. Specifikus inhibitorai a bakteriális eredetű diprotin A (Ile-Pro-Ile) és diprotin B (Val-Pro-Leu), amelyek lassan metabolizálódó kompetitív szubsztrátjai és gátlói micromoláris nagyságrendben (Rahfeld et al., 1991). Számos szubsztrátanalóg inhibitora ismert még: bórsavas

prolin

dipeptidek,

phosphonatok,

dipeptid

cyanopyrrolidinok,

aminoacyl-pyrrolididek (Mentlein, 1999). Természetes peptidek, amelyek N terminális Xaa-Xaa-Pro

szekvenciával

bírnak,

inhibitorai a DPP IV-nek (Wrenger et al., 1996).

Az

könyvezett

antidiabetikumként vildagliptin

származék

törzs-

cyanopirolidin

(1-[[(3-Hydroxy-1-

adamantyl)amino]acetyl]-2-cyano-(S)pyrrolidine). (Villhauer et al., 2003) Az

emlős

DPP

IV

szubsztrát

specificitás szempontjából a hasítási helyet megelőző

pozícióban

prolint,

vagy

valamivel kisebb affinitással alanint fogad el. Képes még hasítani glicin, szerin, valin és leucin után is, de sokkal kisebb aktivitással (Bongers et al., 1992; Martin et al.,

1993).

A

peptidlánc

hossza

80

aminosavig nem jelent problémát, nagyobb

2 ábra A DPP IV szerkezete

peptidek / proteinek esetén a harmadlagos szerkezet döntő lehet (Nausch et al., 1990). A DPP-IV csaknem az összes szövetben előfordul, azonban a mennyisége nagyon eltérő lehet. Legnagyobb mennyiségben lumenes szervek (bél, vese) apikális epithelsejtjein fordul elő, ahol emésztési funkcióval is bírhat (Brandsch et al., 1995; Heymann and Mentlein, 1978). Az enzim ezen kívül nagy mennyiségben előfordul még vérerek falán, illetve szolubilis 17

formában a plazmában is, ahol közvetlenül találkozhat keringő hormonokkal (Lojda, 1979). Az immunrendszer sejtjei közül megtalálható aktivált T sejteken és a macrophagok egy csoportján. Ezért kapta a CD 26-os jelölést (Jackman et al., 1995; Mentlein et al., 1984). Az endokrin szervekben erősen expresszálódik a kapillárisok endotheljén, de csak ritkán fordul elő parenchymális sejteken. A központi idegrendszerben ahol közvetlenül érintkezhet neuropeptidekkel,

a

DPP

IV

elsődlegesen

a

leptomeningeális

sejteken

és

a

cirkumventrikuláris területeken fordul elő (Mitro and Lojda, 1988). Ezen kívül számos agyi kapilláris és egyes ependimasejtek is immunpoztívak DPP IV-re. 4. táblázat A DPP IV bioaktív szubsztrátjai (Mentlein, 1999)

A DPP IV-nek számos neuropeptid metabolizmusa szempontjából döntő szerepe van. (lásd 4. táblázat) A P anyag (SP) esetén az N terminális kétszer két aminosavának (Arg-Pro és Lys-Pro) lehasítása nem szünteti meg a hatást az NK1 receptoron, de az 5-11-es fragment affnitása csökken (Mussap et al., 1993), valamint ez a P anyag lebomlásának általános iniciációs lépése számos szövetben (Ahmad et al., 1992; Russell et al., 1996; Wang et al., 1994; Wang et al., 1991). A neuropeptid Y (NPY) és a peptid YY (PYY) rezisztens az aminopeptidázok zömével szemben: a DPP IV-en kívül csak az X-Pro aminopeptidáz képes 18

hasítani, de jelentősen kisebb aktivitással (Mentlein et al., 1993a). A hasítás hatására egyes receptorokon megváltozik a csonka peptidek hatékonysága (Gerald et al., 1996). A disszertáció témája szempontjából fontos, hogy mindkét peptidből Tyr-Pro dipeptid szabadul fel az enzim hatására. A vékonybél L-sejtjeiben termelődő GLP-1-et (7-37) és a duodénum K sejtjeiben termelődő GIP-et, bár X-Ala szekvenciával rendelkeznek, az enzim igen nagy sebességgel bontja, és ez tekinthető a fő inaktiválás módjuknak (Deacon et al., 1995; Kieffer et al., 1995; Mentlein et al., 1993b). A DPP IV enzim gátlásával elérhető, hogy az endogén GLP-1 és GIP hatástartama emelkedjen és ezáltal jelentősen fokozódjon az inzulin-elválasztást fokozó hatásuk. Ez a hatás mára klinikailag is kihasználhatóvá vált: mind DPP IV inhibitorok mind DPP IV rezisztens GLP-1 analógok regisztrálva vannak 2. típusú diabétesz kezelésére (Moore and Saudek, 2008). További fontos DPP IV szubsztrátokat találunk a kemokinek között (lásd 4. táblázat). A DPP IV és inhibitorainak ez az immunológiai szerepe óvatosságra int az ilyen hatású antidiabetikumok használatánál. Sporadikusan megjelentek az első jelentések, amelyek a nem specifikus fertőzések gyakoriságának emelkedésére utalnak (Richter et al., 2008). 1.5 Az endomorphinok eredete Az első leíráskor feltételezték, hogy az endomorphinok a többi opioid peptidhez hasonlóan egy prekurzor proteinből képződnének. Két munkacsoport (Terskiy és mtsi., Wolfe és mtsi.) párhuzamosan vizsgált humán adatbázisokat a prekurzor gén/protein után kutatva. Wolfe és mtsi. a következő protein : Ab inition Protein, Build Protein, RefSeq Protein, és mRNS: Ab inition RNA, Build RNA, RefSeq RNA és EST adatbázisokat, Terskiy és mtsi. a következő proteom adatbázisokat: Swiss-Prot, RefSeq és TrEMBL kutatták át a lehetséges prekurzorokat keresve. Az endomorphin 1 előhívásához a Tyr-Pro-Trp-Phe-Gly, az endomorphin 2 előhívásához a Tyr-Pro-Phe-Phe-Gly szekvenciára van szükség mivel a karboxi-terminális amidációhoz egy glicin szükséges (Eipper et al., 1983). A szekvenciák előhívásához szükséges egy megelőző illetve követő bázikus aminosav (Lys vagy Arg), ha egy protein vagy peptid belsejében található a szekvencia. Endomorphin 1 esetében egyik csoport sem talált olyan szekvenciát, amely tartalmazza a négy aminosavnak és az amidációhoz szükséges glicinnek a szekvenciáját – glicin nélküli szekvenciát Terskiy és mtsi. 12 esetben találtak. Endomorphin 2 esetében a glicint is tartalmazó szekvenciát mindkét csoport kettőt talált: az egyik egy nátrium-szulfát transzporter gén (SUT-1) mindkét csoportnál. A Wolfe és mtsi. által talált másik egy magzati agyban 19

megtalálható szekvencia, ismeretlen funkcióval (AK095646). A Terskiy és mtsi. által talált másik szekvencia egy ATPáz csavart spirál (coiled coil) doménben található (NP_694955) (Terskiy et al., 2007; Wolfe et al., 2007). Azonban a fenti esetek egyikénél sem találhatók meg a hasításhoz illetve előhíváshoz szükséges bázikus aminosavak. Természetesen nem zárható ki teljes bizonyossággal annak lehetősége, hogy a genomból ennek ellenére előhívódhat a szekvencia (valamilyen alternatív spliceing mechanizmussal), de ennek kicsi az esélye. Mivel eddig semmilyen normál peptid-szintetizáló út nyomát nem sikerült kimutatni, felmerült egy lehetséges alternatív extrariboszómális szintézis lehetősége, hasonlóan a tripeptid glutationhoz, amelyet a γ-glutamilcisztein szintáz és a glutation szintáz katalizál; illetve a carnosinhoz és a homocarnosinhoz, amelyeket a carnosin szintáz állít elő ATP függően. Igaz ez utóbbi dipeptidek rendhagyó aminosavakat tartalmaznak (β-alanint ill. GABA-t). Az ebony nevű Drosophila peptid is nem riboszómális szintézissel képződik βalanin és biogén aminok konjugációja során (Richardt et al., 2003). Rónai és mtsi. [3H]-Tyr-Pro dipeptidet injektáltak patkány agykamrába, majd HPLC elválasztás után radidetektor és UV detektor kombinálásával a következőket találták: az első kísérletsorozatban 12 állatnak injektáltak 20 µCi aktivitású dipeptidet majd 4-4 állatot leöltek az injektálás után 15, 30 és 60 perccel. Sem a 15 perces, sem a 60 perces mintákban nem találtak beépülést, azonban a 30 perces minták közül két esetben radioaktív csúcs jelentkezett a szabad karboxilos EM2 retenciós idejének megfelelően – a koinjektált nem radioktív standard peptideket az UV detektor érzékelte párhuzamosan. A második kísérletsorozatban 4 állatnak 200 µCi aktivitású dipeptidet injektáltak és 30 perc elteltével ölték le az állatokat. Az előzőhöz hasonló elválasztás után a négyből egy mintában nagyon robusztus mértékű radioaktivitás jelentkezett az amidált végű EM2-nek megfelelően, és utána még egy kisebb a szabad karboxilosnak megfelelő helyen. A 30 perces megjelenési idő miatt valószínűtlen, hogy a dipeptidből először felszabadult a jelölt Tyr, majd utána beépült az endomorphinba, ez esetben a várható latenciaidő nagyobb volna. Ezzel párhuzamosan végzett kísérletekben in vivo icv. injektált 100 nmol/állat Tyr-Pro naloxonnal gátolható analgetikus hatást fejtett ki. (Ronai et al., 2006). Folytatólagosan a csoport az endomorphin 2 ellen antitestet fejlesztett. Ez az antitest nagy specificitással felismeri az EM2-t, de nem kötődik a szabad karboxilos formához. Ennek ellenére HPLC szeparáció után a szabad karboxilos EM2-nek megfelelő helyen immunreaktivitás jelentkezett, amely azonban az előbbiek miatt nem lehetett a szabad karboxilos forma, tehát elképzelhető, hogy az előző kísérlet esetén sem a szabad karboxilos forma jelent meg radioaktivitás formájában. Ennek az EM2-szerű anyagnak pontos identifikálása még nem történt meg (Szemenyei et al., 2008). 20

1.6. A fájdalommal kapcsolatos fogalamk terminológiája Dolgozatomban az International Society for the Study of Pain honlapján (IASP, www.iasp-pain.org) a 2008-ban megvalósított tartalmi frissítés szerinti ajánlások szerinti terminológiát használtam (Sandkuhler, 2009). Eszerint a fájdalom definíciószerűen „egy kellemetlen szenzoros és emocionális jelenség, amely valamilyen aktuális vagy lehetséges szöveti károsodáshoz kapcsolódik.”, s ezt egy tudattal rendelkező alany mondja el, írja le vagy jelzi, tehát az ajánlás szerint csak humán vonatkozásban teljes jogosultságú a fogalom használata. Állatkísérletek esetében helyesebb "a fájdalmi modalitások kísérletes modellje(i)" összefüggésben említeni. Általánosságban alkalmasabb a "nociceptio" kifejezést használni, és megnevezni a "nociceptiv" jelenségeket, úgymint nociceptiv ingert, ingerküszöböt stb., és a nociceptiv reakciókat (motoros-elhárító, "nocifenziv", vegetatív-hormonális stb.). A

hiperalgézia

legegyszerűbb

megfogalmazás

szerint

"megnövekedett

fájdalomérzékenység". Részjelenségekre bontva, ez jelentheti a nociceptiv ingerküszöb csökkenését, vagy küszöbfeletti ingerekre adott fokozott válaszokat, azaz a bemenő ingerintenzitás-nociceptiv reakció összefüggését leíró görbe balratolódását, meredekségének fokozódását, vagy ezek kombinációját. Az allodyniával szemben egyik legfontosabb elkülönítő sajátság az, hogy a fokozott reakciót kiváltó bemenő inger mindenkor nociceptiv minőségű. Az allodynia a nem nociceptiv minőségű bemeneti ingerre (érintés, szőrsimítás) adott nociceptiv reakció. Nem teljesen átfedő másik lehetséges definíció az Aβ rost által közvetített bemenő impulzusra bekövetkező nociceptiv esemény illetve eseménysor. A hiperalgézia és az allodynia néhány részjelenségének hátterében a perifériás vagy centrális (spinális vagy szupraspinális) szenzitizáció áll, bár az allodynia egésze sokkal összetettebb hátterű. A centrális, dolgozatom szempontjából kiemelt jelentőségű, spinális szinten kialakuló szenzitizáció kapcsán gyakran felmerül a "wind-up" és a "Long-Term Potentiation" (LTP) jelensége. Mindkettő lényege a nociceptiv információ-feldolgozás során a szinaptikus jeltovábbítás hatékonyságának a megnövelése, leggyakoribb értelmezés szerint a primer nociceptiv afferensek első szinapszisára vetítve. Mindkettő kialakulásához kiemelten szükséges a P-anyag NK1 típusú receptorainak valamint az ionotróp glutamát receptorok NMDA altípusának összerendezett működése, de állhat a háttérben a gátló kontrollműködések csökkenése vagy megszűnése is. Mindkettő elképzelhető ún. "monoszinaptikus" (Yaksh, 1999) vagy "poliszinaptikus" (D'Mello and Dickenson, 2008) háttér-mechanizmussal. A "wind-up"

rövidebb, az LTP hosszabb időskálán épül fel, s utóbbihoz szükséges a

szinaptikus elemek expressziójának mélyreható változása is. 21

1.7 Nociceptio és annak feldolgozása 1.7.1 Perifériás nociceptorok A periférián az egyes fájdalmi kvalitásokat érzékelő molekuláris receptorok közül jelenleg legjobban a hő jellegű fájdalmat közvetítő capsaicin érzékeny tranziens receptor potenciál vanilloid 1 (TRPV1) csatorna ismert. Azonban a TRPV receptorcsalád további tagjai (TRPV2, 3 és 4) is szerepet játszhat az érzékelésben. A hideg érzékelésében részt vesz a TRPM8, esetleg a TRPA1 és valószínűleg még valamilyen egyéb nem identifikált csatorna is. A mechanikus érzékelés molekuláris háttere kevésbé felderített. A nem ártalmas stimulusok közvetítésében szerepe lehet egy SLP3-nak nevezett stomatin fehérjének, mely egyes epitheliális Na+ csatornákkal áll összefüggésben. A fájdalmas mechanikai ingerek közvetítésében a feszültségfüggő K+ csatornák egy családjának lehet szerepe (KCKN). Ezek közül a KCKN2 (TREK-1) és KCKN4 (TRAAK) megtalálható nem csak mechanikus, hanem hideg ingerre reagáló rostokon is. A KCKN18 szintén feltételezett szerepet játszhat a mechanikus érzékelésben (Basbaum et al., 2009). Nem kizárható továbbá, hogy a mechanikus fájdalom során létrejövő sejtsérülések során felszabadult ATP P2x3 receptorokon keresztül részt vesz a nociceptio folyamatában (Wirkner et al., 2007). A polimodális nociceptorok egyszerre expresszálnak hő, kémiai és nem pontosan identifikált mechanoceptor(oka)t valamint a fentebb említett K+ csatornákat. (3. ábra.). A fájdalmas ingerületek vezetésében fontos szerepet játszanak a tetrodotoxin inszenzitív feszültségfüggő fájdalmas

Nav1.7 Na+ ingerület

és

Nav1.8

csatornák.

A

létrejöttében

közreműködnek továbbá a feszültségfüggő Ca2+ csatornák, a periférián elsősorban az N- és T-típusúak (Basbaum et al., 2009). A gyulladásos fájdalom kiváltásában (az ún. „gyulladásos levesben”) a periférián részt vesznek (a teljesség igénye nélkül) neuropeptidek (bradikinin, SP, CGRP), eikozanoidok

3. ábra A nociceptorok felosztása (Basbaum et al., 2009)

triének,

(prostaglandinok,

endokannabinoidok),

leukocitokinek

(IL-1, NGF, IL-6 stb.), a hisztamin, purinok (adenozin, ATP) valamint protonok (TRPV1 csatornán keresztül). A perifériás aktiváció gátlásában fontos szerepe lehet az opioidoknak (elsősorban µ receptoron keresztül) 22

(Schafer et al., 1995) és a szomatosztatinnak (a szomatosztatin 4 receptoron keresztül) (Helyes et al., 2009). 1.7.2 A nociceptiv információ feldolgozása gerincvelő hátsó szarvban: funkcionális neuroanatómia A gerincvelői hátsószarv a nociceptiv információ-feldolgozás második állomása. Ehhez a területhez köthető elsődlegesen számos kóros fájdalmi jelenség, így krónikus gyulladásos és immunológiai hátterű szövetkárosodással kapcsolatos fájdalmak, neuropátiás fájdalmakszerveződése is. A gerincvelőt hagyományosan az ún. Rexed laminák (Rexed, 1952) (4. ábra) szerinti anatómiai bontásban tárgyalom. A disszertáció tárgya szempontjából az I-III laminák bemeneti- és kimeneti viszonyai, valamint az interneuronális hálózatok elrendeződése a legjelentősebb. A bemenetet a perifériás nociceptorok és más jellegű információkat észlelő szöveti érzékelők felől a gerincvelői hátsógyöki dúcok (angol néven "dorsal root ganglia", eszerinti rövidítéssel DRG) pszeudounipoláris idegsejtjeinek centrális nyúlványai szállítják. A bementi (primer afferens) rostok

mind

átmérő,

velőshüvelyezettség,

impulzus-vezetési

sebesség,

elektromos

ingerlékenység, ingerületátvivő-anyag (transzmitter) készlet, az eredő idegsejtek mérete, valamint a közvetített érzet-minőség szempontjából osztályozható (lásd. 4. ábra ill. 5. táblázat). A fenti osztályozási szempontokat összefoglalóan az alábbi táblázatban mutatom be. 5. táblázat: Az érző idegek típusai

Aβ Aδ C

Velőshüvely Vezetési sebesség (m/s) vastag 30-100 vékony 4-30 0,5-2,5

Az ingerület jellege Finom vibráció és tapintás, izomorsók állapota Durva tapintás és nyomás Hő és fájdalom

23

4. ábra A gerincvelő rétegei Rexed szerint és az érző idegek projekciói (Todd, 2010) A C- és Aδ-rostok magas ingerküszöbű érzetminőségeket közvetítenek, így nociceptiospecifikusnak tekinthetők, míg az Aβ-rostok által közvetített érzetek élettani körülmények között alacsony küszöbűek (pl. elemi tapintás), és e rostok csak kóros körülmények (neuropathiás fájdalmat indukáló tényezők) között járulnak hozzá a kóros nociceptiv jelenségek (allodynia, hiperalgézia) megjelenéséhez. Valamennyi rost centrális terminálisán az elsődleges ingerület-átvivő anyag a glutaminsav. A C-rostok, és ebből eredően a kisátmérőjű (~35 µm) DRG idegsejtjeik mintegy fele peptiderg is, lehetséges specifikus markereik a calcitonin gén-rokon peptid (calcitonin gene-related peptide, CGRP) (Gibson et al., 1984), TrkA-R vagy a TRPV1-R. A nem peptiderg, C-rostokhoz tartozó hátsógyöki ganglionsejtek és nyúlványaik markere az izolektin B, míg az Aδ-rostoké a kolera B-toxin akkumuláció (Robertson and Grant, 1985; Silverman and Kruger, 1988). A hátsógyöki, kisméretű ganglionsejtek és nyúlványaik peptidkészletét élettani körülmények között a Panyag (substance P, SP) (Chan-Palay and Palay, 1977), a CGRP, a galanin (Skofitsch and Jacobowitz, 1985), a somatostatin (Hokfelt et al., 1976), az endomorphin 2 (Martin-Schild et al., 1998) és a cocain-amphetamin regulált transzkript (CART) peptid (Kozsurek et al., 2007) adják. Disszertációm szempontjából lényeges elem, hogy a peptiderg DRG sejtek élettani feltételek mellett nem expresszálnak neuropeptid Y-t (NPY), de kóros körülmények között (pl. n. ischiadikus lekötéssel modellezett neuropathiás folyamat kapcsán) ennek a peptid expressziója (mRNS, peptid végtermék szinten) jelentős mértékben indukálódik (Wakisaka et al., 1991). A gerincvelő hátsó szarvában GABA-erg interneuronokban viszont megtalálható 24

(Polgar et al., 1999). Régebben ismeretes a P anyag és a CGRP kolokalizációja (WiesenfeldHallin et al., 1984). Szintén lényeges elem és a dolgozat 1.3.2 fejezetében részletezésre is került, hogy az immunreaktív SP és az endomorphin 2 mindkét irányban csaknem 100 %-os mértékben kolokalizált (Sanderson Nydahl et al., 2004) míg a CART és az endomorphin 2 között a kolokalizáció részleges (Kozsurek és mtsi. lásd 7. fejezet). Megjegyzendő, hogy bár csaknem minden DRG (vagy ekvivalens) neuron, amely tartalmaz SP-t, tartalmaz endomorphin 2-t is, az ún. "dense-core" vezikulákban a P-anyag mennyisége jelentősen nagyobb, mind lumbális, mind trigeminális érző ganglionokban (Sanderson Nydahl et al., 2004). Számos peptid tekintetében kimutatták, hogy izolált ganglion-preparátumon ill. ganglionból izolált sejttestekből depolarizációval kiváltott módon, Ca2+-függő exocitózissal felszabadíthatók (Eberhardt et al., 2008; Huang and Neher, 1996). Bizonyított, hogy a DRG neuronok expresszálnak µ-opioid receptorokat, valamint somatostatin- (Bar et al., 2004) és NPY- (Zhang et al., 1994) receptorokat is. Az endomorphin 2 hatása szempontjából elsődleges µ receptorok eloszlása a lumbális gerincvelői hátsó szarvban röviden az alkábbiakban foglalható össze:. A receptordenzitás mintegy 50%-os csökkenése dorzális rhizotómiát követően arra utal, hogy a receptorkészlet mintegy fele a primer afferensek terminálisán, preszinaptikusan lokalizált (Abbadie et al., 2002). A posztszinaptikus struktúrák markerezése alapján a teljes receptorkészlet kb. 12 %-a rendelhető ezen elemekhez, míg a fennmaradó hányad eddig még pontosan nem definiált arányban a hátsószarvi neuronok nyúlványain, preszinaptikusan helyezkedik el. A µ receptor denzitás az I-es laminában és a II lamina

külső

rétegében

(IIo)

a

legmagasabb

(Arvidsson et al., 1995; Spike et al., 2003). A lumbális hátsó szarvban az I- és III lamina neuronjai adnak felszálló vetületi pályákat (Todd et al., 2000). Az uralkodó "spinothalamikus" vetületi elméletet patkány esetében némileg módosítani szükséges, mivel a felszálló pályák többségének 5. ábra A gerincvelő hátsó

szupraspinális célpontjai a thalamikus magoktól

szarvi

neuronok

eltérők (5. ábra). Látható, hogy a 424 db hátsószarvi

célpontjai (Todd, 2010) alapján.

projekciós neuron kollaterálisai mintegy 90 %-ban

projekiós

25

adnak vetületet a caudális ventrolaterális medulla (CVLM) és a laterális parabrachiális nucleus (LPb) területére, 20-30%-ban a nucleus tractus solitarii (NTS) és a periaqueductális szürkeállomány (periaqueductal grey matter, PAG) területére, míg csupán 5 %-uk irányul a thalamikus magok felé (Todd, 2010). Ezen célpontok további vetületei szervezik a nociceptiv ingereket kísérő vegetatív, hormonális és limbikus rendszeri jelenségeket. Ezek teszik lehetővé Aδ afferentáció esetén a nociceptiv ingerbehatás pontos lokalizálását, és indítják el a hátsószarvba irányuló, a nociceptiv információ feldolgozásában érintett ingerület-átviteli helyeket moduláló leszálló vetületi rendszereket. A legegyszerűbb elhárító ("nocifenziv") motoros reflexek (pl. tail-flick kísérletes modell) gerincvelői szinten zajlanak. Az Aδ nociceptorok és a peptiderg C rostok a teljes I illetve a II lamina külső (IIo) rétegébe adnak afferentációt (4. ábra), a nem-peptiderg C rostok a II lamina belső (IIi) rétegébe illetve az Aβ rostok a III-V rétegekbe projiciálnak. A lamina I C rostot fogadó projekciós neuronjainak mintegy 80 %-a hordoz NK1 receptort (Todd et al., 2002). A II lamina idegsejtjei fogadnak a periféria felől afferentációt, de felszálló projekciót nem adnak. Erre a rétegre jellemző, hogy a III lamina afferentációt fogadó neuronjai és az I réteg fogadó neuronjai közötti szabályozó idegi kapcsolat elemei (izgató és gátló befolyások) itt haladnak át. A III lamina neuronjainak többsége nem nocicepció-specifikus, hanem mind alacsony-, mind magas ingerküszöbű bementet fogadó, ún. széles dinamikus skálájú idegsejtek ("wide dynamic range", WDR). A disszertáció szempontjából lényeges az a III laminából induló, glutamát-erg neuronokból álló neuronális lánc, amely az I lamina bemenetet fogadó idegsejtjein végződik, és amelynek aktiválása a nociceptiv afferentáció átviteli hatékonyságát növeli (Todd, 2010). Ezt az egyébként élettani körülmények között is aktiválható láncot szintén élettani feltételek mellett, gátló interneuronok kontrollálják, valószínűleg két ponton is. A gátló idegsejtek lehetnek GABA- és NPY tartalmúak, ezek a III lamina területén hatnak az NK-1 receptort is expresszáló sejteken (Polgar et al., 1999), és tartalmazhatnak kolokalizáltan GABA-t, glicint és neuronális NO szintázt, ezek valószínűsíthetően ugyanazon a stimuláló glutamáterg láncon, de az I lemezben hatnak (Todd, 2010). A GABA-erg transzmisszió kóros körülmények között megváltozhat elsősorban idegsérüléssel járó állapotokban és nem az általunk vizsgált gyulladásos hiperalgézia esetén (Sandkuhler, 2009) A patkány gerincvelő hátsó szarv transzmitter- és receptorkészletének a disszertáció szempontjából lényeges elemeit az alábbiakban ismertetem. A lumbális szakasz neuropeptidjei közül a CGRP illetve az endomorphin 2 és a CART-peptid döntően primer, C rost afferens, kisebb mértékben lokális eredetű (Kozsurek et al., 2007), endomorphin 2 esetén igen kismértékű, leszálló pályából származó peptidkészlet is lehetséges (Hui et al., 2010). A 26

CART-peptid denzitás az I. lamina II. lamina külső részének irányában meredeken csökken, míg endomorphin 2 esetén is ez a csökkenési iránya, de az esés kevésbé meredek. (Kozsurek et al., 2007; Martin-Schild et al., 1997). A P anyag legnagyobb része szintén primer peptiderg afferensekből származik, de ennél a peptidnél valamelyest jelentősebb az extrinsic, nem primer afferens hozzájárulás (Chan-Palay and Palay, 1977; Sanderson Nydahl et al., 2004). Bár a NPY ismerten kolokalizál a noradrenalinnal a szupraspinális eredetű leszálló pályákban, ezek a vetületek a thoracális gerincvelő oldalszarvában végződnek (Blessing et al., 1987), így a lumbális hátsószarvi NPY tisztán intrinsic (interneuron) eredetűnek tekinthető. Mivel a NPY a kóros nociceptiv jelenségek szempontjából a "mérleg nyelve" szerepét töltheti be, így jelentős lehet, hogy a III. laminában a NPY-erg idegelemek mind izgató, mind gátló interneuronokkal egyaránt létesíthetnek kontaktust, míg az endomorphin 2 pozitív idegelemek csupán izgató interneuronokat céloznak meg (Kemp et al., 1996). Az endomorphin 2 mellett a klasszikus opioid peptidcsaládok (pro-enkefalin-, pro-opio-melanocortin- és pro-dynorfineredetű peptidek) tagjai megtalálhatók patkány gerincvelőben, de csak az enkephalin- és dynorphin család tagjai fordulnak elő a hátsó szarvban (I.-III. és V. lamina) (Marvizon et al., 2009). A proenkephalin és prodynorphin peptidek különböző idegsejt-populációkban találhatók. Az enkephalinok egyértelműen nem primer afferens eredetűek (Marvizon et al., 2009), míg a dynorphinok esetén vegyesebb az irodalmi állásfoglalás (Basbaum et al., 1986; Botticelli et al., 1981; Tuchscherer and Seybold, 1989). Valószínű azonban, hogy a dynorphinok esetén is (a NPY-hoz hasonlóan) az élettani expresszió szintje alacsony, csupán pathológiás (neuropathiát indukáló tényezők) körülmények között növekszik meg az expresszió, mind az afferensek eredő sejtjeiben, mind a spinális intrinsic neuronokban (Kajander et al., 1990). A neurotensin (Uhl et al., 1977) és a neuropeptid FF (Roumy and Zajac, 1998) a disszertáció szempontjából kisebb jelentőségű, utóbbi jelentősége abban áll, hogy az endomorphin 2 antiszérum kismértékű kereszt-reakciót adhat a peptid -Phe-NH2 Cterminálisa miatt (Sanderson Nydahl et al., 2004). Az arachidonsavból levezethető messengerek (endocannabinoidok és prosztanoidok), valamint receptoraik szintén jelen vannak gerincvelői hátsó szarvban (Calignano et al., 1998; Marley et al., 1977), és részt vesznek a nociceptiv információ feldolgozásában, de a disszertáció tárgyával nem állnak szoros kapcsolatban. A szupraspinális irányból leszálló pályák közül a szerotonerg és noradrenerg projekciók a legjelentősebbek. A szerotonin elsősorban 5-HT3 receptoron hatva (Ali et al., 1996) "pronociceptiv" (Millan et al., 1996), más receptortípuson pedig "antinociceptiv" (Sawynok and Reid, 1996) befolyást is kifejthet. A noradrenerg pályák preszinaptikus α2-adrenoceptorok 27

(valószínűsíthető az α2A-altipus) útján antinociceptiv hatásúak (Fairbanks et al., 2002; Guo et al., 1999; Sullivan et al., 1987). A hátsószarvi transzmitterek receptoriális célpontjait illetően a glutamát mind ionotróp, AMPA altípusú (akut nociceptio) mind ionotróp NMDA altípusú (homo- és heteroszinaptikus patológiás szenzitizáció) receptoron fejtheti ki hatását (Bleakman et al., 2006; Kerr et al., 1998; Nagy et al., 2004; Polgar et al., 2008; Tolle et al., 1995; Tolle et al., 1993), valamint különböző metabotróp glutamát receptorokon keresztül is indíthat jeltovábbítást (Fisher and Coderre, 1996; Young et al., 1994). Az ionotróp kainát receptor altípus szerepe kevéssé tisztázott. A tachykinin receptorok közül az NK1-R kiemelt jelentőségű, és interakciójuk az NMDA receptor-mediált kóros nociceptiv modalitások kapcsán intenzíven vizsgált terület (Sandkuhler, 2009; Yaksh, 1999). Nincs egyetértés a tekintetben, hogy carrageenan indukálta gyulladásos modellben van-e spontán SP felszabadulás. (Garry and Hargreaves, 1992; Honor et al., 1999) Valószínűsíthető, hogy a P-anyag inkább a hiperalgézia iniciációjáért felel és nem a fenntartásáért (Traub, 1996). A disszertáció szempontjából legfontosabb µ opioid receptor elsődlegesen Gi/o jeltovábbitási utat használ (Satoh and Minami, 1995). Megjegyzendő, hogy különböző, nociceptioval kapcsolatos jelenségekben a µ-opioid receptok agonistái (a viszonylagos szelektivitású parciális agonista morfin, a nagy szelektivitású, "full agonista" prototipus enkephalin analóg DAMGO, valamint a kiemelten nagy szelektivitású parciális agonista endomorphin 1- és 2) esetenként eltérő Gi/o altipus-készleteket használhatnak (SanchezBlazquez et al., 1999). A posztszinaptikus lokalizációjú µ receptor jellemzően (βγ G protein alegység közvetítésével) különböző feszültségfüggő K+ csatornák nyitását serkenti, ezúton hiperpolarizál és gátol (Marker et al., 2005), míg a preszinaptikus receptorok mind a fenti, K+csatorna-modulációs módon, mind Ca2+-csatornák gátlása révén közvetíthetik hatásukat. Hátsó szarvi primer afferensek esetén a Ca2+ (N és P/Q típus) csatornák gátlásának van fokozott jelentősége1 (Heinke et al., 2011). A klasszikus jeltovábbítási utak mellett más módozatok is lehetségesek (Schulz et al., 2004).

28

2. Hipotézisek, célkitűzések: Az endomorphinok hagyományos képződésére eddig semmilyen bizonyítékot nem találtak, ezért feltételezhető, hogy valamilyen extrariboszomális úton képződnének. Mivel tríciummal jelölt Tyr-Pro dipeptid agykamrai injektálása után jelent meg az endomorphin 2nek megfelelő radioaktív jel, emiatt elképzelhető, hogy a szintézis két precursora a Tyr-Pro dipeptid és a Phe-Phe-Gly tripeptid, ahol a glicin a C terminális amidációhoz lenne szükséges (Eipper et al., 1983). Az összekapcsolást végző enzimre az egyik lehetséges megoldás az endomorphinok katabolizmusáért is felelős dipeptidil-peptidáz IV lehet, mivel a peptidázok bizonyos körülmények között megfelelő egyensúlyi helyzetben fordított szintetikus működésre is képesek lehetnek. Mivel Rónai és mtsi. csak endomorphin 2-nek megfelelő helyen találtak beépülést, endomorphin 1-nek megfelelő helyen nem, ezért vizsgálataink tárgyául a hátsó gyöki gangliont és a gerincvelő hátsó szarvát választottuk, mivel ott az irodalom szerint az endomorphin 2 a domináns típus (Martin-Schild et al., 1998; 1999; Martin-Schild et al., 1997), és a fájdalomérzékelés szempontjából fontos szerepet tölt be. Kísérleteink célja volt megvizsgálni, hogy: 1. A szövetekhez in vitro adott Tyr-Pro prekurzor hatására a fokozódik-e az endomorphin 2 képződése? 2. Az endomorphin 2 képződését a DPP IV gátlók befolyásolják-e? 3. Az endomorphin 2 és a P-anyag párhuzamosan szabadul-e fel a hátsó gyöki ganglionból? 4. In vivo vizsgálataink során arra kerestük a választ, hogy fokozható-e az endogén endomorphin képződése, és ezáltal elérhető-e antinociceptiv illetve antihiperalgéziás hatás?

29

3. Metodika 3.1 A kísérletekhez használt állatok: A kísérletekhez hím Wistar patkányokat használtunk. Az in vivo vizsgálatokhoz 160-220 g, az in vitro vizsgálatokhoz 250-280 g súlyúakat. Az állatok tartása temperált (22±0,5 °C) és páratartalom kontrollált körülmények között 12 órás sötét/világos ciklusok mellett történt. Normál rágcsáló tápot és csapvizet igény szerint kaptak. Az állatok hétfői napon kerültek az intézet állatházába és az in vivo kísérletek esetében a kísérleteket megelőző napokban szoktattuk őket a körülményekhez („handling”). A kísérleteket szerdai vagy csütörtöki napokon végeztük. Az állatok kezelése az Európai Unió direktívájának (86/609/ECC) és a magyar Állatvédelmi Törvénynek (XXVIII. tv 32. paragrafus) megfelelően történt. A kísérleteket a Semmelweis Egyetem Állatkísérletes Etikai Bizottságának jóváhagyásával folytattuk le. 3.2 A kísérletekhez használt anyagok: Captopril (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Blenheim, Németország) Phosphoramidon (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Blenheim, Németország) Ile-Pro-Ile (Diprotin A) (szintetizálta: Magyar A.és Kocsis L., MTA/ELTE Peptidkémiai Kutatócsoport) Endomorphin 1 és 2 (szinetizálta: Szemenyei E. és Tóth G., MTA Biokémiai Intézet, Biológiai Kutató Központ, Szeged) Tyr-Pro, Tyr-Pro-Ser(O-glukóz) (szintetizálta: Szemenyei E. és Tóth G., MTA Biokémiai Intézet, Biológiai Kutató Központ, Szeged) Radiotracer (I131-Tyr EM-2) (szintetizálta: Tóth G., MTA Biokémiai Intézet, Biológiai Kutató Központ, Szeged) Vildagliptin (NVP-LAF237) (Ingrid DeMester, Laborathory of Medical Biochemistry, University of Antwerpen, Wilrijk,Belgium) Carrageenan (Sigma-Aldrich magyarországi képviselete) Naloxon (ICN Hungary, Tiszavasvári, Magyarország) Naltrexon (DuPont Pharmaceuticals, Genf, Svájc) DAMGO (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Blenheim, Németország) Morfin-klorid (ICN Hungary, Tiszavasvári, Magyarország) Cyclodextrin (Cyclolab Ltd., Budapest) A kísérletekhez használt egyéb reagensek (NaCl, KCl, glukóz stb. a Sigma-Aldrich magyarországi képviseletétől származnak. 30

Az Ile-Pro-Ile törzsoldatot 25% (m/V) cyclodextrin oldatban vettük fel és hígítottuk tovább kétszeresen desztillált vízzel tízszeresre. A többi anyag törzsoldatát kétszeresen desztillált vízzel készítettük el. Az in vivo kísérletekhez a hígításokat steril fiziológiás sóoldattal (Salsol, Teva) végeztük. 3.3 Izolált hátsó gyöki ganglion vizsgálatok Az állatok dekapitációval történő leölése után feltártuk a gerincvelőt, és a lumbális L4 és L5 ganglionokat 1 ml oxigenizált (95% O2, 5% CO2) hideg (4°C), 3mM káliumot tartalmazó Krebs oldatba helyeztük (összetétel mmol/l: NaCl: 119,7; NaHCO3: 25; Na2HPO4: 1,2; KCl 3,0; glukóz 11,0; CaCl2: 2,5; MgSO4: 1,2). Az első kísérletsorozat során egy állat – 4 ganglion/cső – mintáját, a második sorozatban két állat szöveteit (8 ganglion/cső) használtuk fel. 10 percig szobahőmérsékleten, majd további 30 percen át 36 °C-on inkubáltuk. Ezután az oldatot 3 µM neutrális endopeptidáz (NEP) inhibitor phosphoramidont és 30 µM ACE inhibitor captoprilt, valamint a vizsgálni kívánt anyago(ka)t tartalmazó Krebs oldatra cseréltük. (Az inhibitorok hozzáadására a P anyag kimutatása miatt volt szükség.) 30 perc után azonos összetételű friss oldatra cseréltük a szöveteken lévőt. További 30 perc után 0,5 ml oldatot mintának elkülönítettünk (nyugalmi felszabadulás), a többi oldat leszívása után 30 mM káliumot, az enziminhibitorokat, és ugyanazt a vizsgálni kívánt anyago(ka)t tartalmazó Krebs oldatra cseréltük. 30 perc inkubálás után 0,5 ml oldatot elkülönítettünk (depolarizációs felszabadulás). A mintákat az elkülönítés után 0,5 ml 10%-os ecetsavval 10 percig 80°C-os vízfürdőbe helyeztük, majd ezután fagyasztva tároltuk. A szövetek nedves tömegét lemértük, üveg homogenizálóban kézzel homogenizáltuk és 1ml 10%-os ecetsavval 10 percig 80°C-os vízfürdőbe tettük, ezután sonicátorral tovább homogenizáltuk, 1 ml 1%-os triklórecetsavval precipitáltattuk, 20 percig 4°C-on, 10000g centrifugálás után 0,5 ml felülúszót mintának elkülönítettünk (lásd 6. ábra). Az első kísérletsorozatban a következő csoportokat vizsgáltuk: Kontroll csoport (nincs egyéb hozzáadott hatóanyag); 1 mM Tyr-Pro; 0,1 mM Tyr-Pro-Ser(O-glukóz). A második kísérletsorozatban kontroll, 0,1 mM DPP IV inhibitor Ile-Pro-Ile (IPI, Diprotin A), 1mM TyrPro és ezek kombinációját (Ile-Pro-Ile + Tyr-Pro). Minden esetben négy párhuzamos minta volt csoportonként.

31

6. ábra: Az izolált hátsó gyöki ganglionon végzett vizsgálatok menete Az első kísérletsorozatban a mintákból 110-110 µl-t véve azok pH-ját jégecet segítségével 4,0 alá állítottuk, egy-egy mintát használva fel az EM2 RIA és az SP-ELISA végzésére. A második sorozatban a teljes mintát liofilizáltuk, majd a liofilizátumokat 220 µl MilliQ vízben felodottuk és a pH-t az előzőhöz hasonlóan beállítottuk. Ezután a mintákhoz 1,2 ill. 2,4 µl („Próba” ill. „Fő” kísérlet) 100%-os trifluorecetsavat (TFA) adtunk, vortexelés után 1000g-n centrifugáltuk 30 percig. A felülúszókból az extrakcióhoz C18 ZipTip-et (P10, Milipore, Billerica, Massachusetts, USA) használtunk; az első sorozatban 1 hegyet, a második sorozatban 4 hegyet mintánként. A pipettákat 15 µl-re állítottuk, kétszer átmostuk 100%-os TFA-val, majd ekvilibráltuk két 0,1% TFA MilliQ vizes átmosással. A mintákat kétszer passzáltuk a preparált ZipTip-eken 15 µl-es lépcsőkben. Ezután lemosást végeztünk, majd kétszeri leoldás történt a következő oldattal: 5,0 ml acetonitril, 4,9 ml MilliQ víz, 0,1 ml 10% TFA. Az eluátumokat (1-1 az első sorozatban, 4-4 összesített elátum a második sorozatban) vákuum alatt szárítottuk, majd feloldottuk a megfelelő puffer oldatban a RIA-hoz ill. ELISAhoz. Endomorphin 2 RIA: A RIA-hoz használt antitest létrehozása nyúlban történt. A jelen kísérletekben használt antitest (R1) az endomorphin 2-t ismeri fel 65,5±7,5 pg/cső szenzitivitással, valamint ennek C-terminális „-ol” származékát. Nem ismerte fel az 32

endomorphin 1-et, sem az endomorphinok N terminális di- és tripeptidjeit, sem a szabad karboxilos formákat, sem más opioid peptideket. Valószínűsíthetően keresztreakciót adhat peptidFF-fel, azonban ennek vizsgálata nem történt meg (Szemenyei et al., 2008). 3.4 Az endomorphin 2 szint mérése Radio Immuno Assay (RIA), P-anyag szint mérése Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) segítségével Az endomorphin 2 méréséhez használt Radioimmunoassay menete a következő volt: 150 µl standard oldathoz vagy ismeretlen mintához 150 µl 5000-szeres hígítású szérumot adtunk (puffer: 63 mM foszfát-EDTA, pH=7,4; 0,1% Triton X-100), majd két éjszakán át inkubáltuk 4°C-on. A 3. napon 15000 dpm aktivitású

125

I-EM2 tracert adtunk hozzá 100 µl

pufferben és további egy éjszakán át inkubáltuk 4°C-on. A 4. napon 20-szoros hígítású kecske eredetű anti-nyúl szekunder antiszérumot adtunk hozzá 100µl oldatban és további 5 órán át inkubáltuk 4°C-on. A kötött és szabad radioaktivitás szeparálására 1 ml 6% polietilénglikolt adtunk hozzá, majd 1500g-n centrifugáltuk 30 percig 4°C-on, majd eltávolítottuk a felülúszót. A pellet radioaktivitását LKB 1272 Clingamma gamma counterrel (Wallac, Turku, Finnország) mértük. P anyag ELISA méréséhez MDBioscience Co. (Morwell Diagnostics GmbH, Zürich, Svájc) gyártmányú kitet használtunk és a gyártó ajánlását követtük. A kitben található polisztirén plate-ek mélyedései előre fedve vannak SP specifikus antitestekkel. 50-50 µl standard, kontroll illetve kísérleti mintát adtunk hozzá, minden esetben duplikátummal. 25 µl biotinnal kapcsolt SP-t adtunk ezután minden mélyedésbe, és 120 percen át inkubáltuk. A kit mosópufferrével történő 6-szoros mosás után 100 µl streptavidin-horseradix peroxidázt adtunk hozzá és további 60 percig inkubáltuk. Végezetül 100 µl 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidin szubsztrátot adtunk hozzá, mely sárgás színű végterméket képzett. A reakciót 100 µl 2N HCl adásával termináltuk. Az optikai denzitást 450 nm-es hullámhosszon Dynatech ELISA leolvasóval olvastuk le. A RIA és az ELISA esetén is mintákban az anyagok mennyiségének megállapítására a standard kalibrációs görbe alapján került sor. Az EM2 standard görbe 0,98-500 pg peptid/cső között volt. Minden leolvasást kétszeresen végeztünk el. Az EM2 visszanyerési arány az első sorozatban 78,3 ± 6,7% (n=4), a második sorozatban. 117,7 ± 20% (n=4) volt. A végső mennyiségek megállapításához nem alkalmaztunk korrekciós faktort. A mennyiségeket 1 ml mintára fejeztük ki, amit a 30 perces gyűjtés után illetve a szöveti extrakciónál nyertünk, majd normalizáltuk a szövetek nedves tömegére.

33

3.5 In vivo analgetikus vizsgálatok: 3.5.1 Akut nociceptiv vizsgálatok Az akut nociceptio vizsgálatához radiant heat tail flick tesztet (D'Amour and Smith, 1941) használtunk (IITC Life Science, Mod 33. Woodland Hills, CA). A kísérlet kezdetén megmértük az összes állat kontroll latenciáját, több mint 4 s kontroll latencia esetén az adott állatot kizártuk a vizsgálatból. A hatóanyagot ezután adagoltuk Hylden és Wilcox módszerének Mestre és mtsi. által patkányra adaptált direkt transcutan intrathecalis adagolási módszerével injektáltuk. (Mestre et al., 1994) Az adagoláshoz 250 µl-es Hamilton dispensert és 23G-s cserélhető tűt alkalmaztunk, és a kívánt dózist 5 µl-es térfogatban juttattuk be a lumbális L5 és L6 csigolyák közötti résen, 6mm mélységben. Adagolási bizonytalanság esetén az állatot a további vizsgálatból kizártuk. Az anyagok hígítására steril fiziológiás sóoldatot használtunk. A hatóanyagok adása után 5, 15, 30 és 60 perccel mértük a hatást (latenciát). A cut off idő a szöveti sérülések elkerülése végett 8 s volt. A hatást maximum possible effect (MPE) % formájában fejeztük ([Mért Latnecia-Kontroll Latencia]/[Cut offKontroll Latencia]x100%). Egy vizsgálatban egyszeres dózis esetén 10 állatot használtunk (+5 állat fiziológiás sóoldat kontroll), dózis-hatás görbe meghatározásához dózispontonként (3 dózis) 6-7 állatot (+5 állat fiziológiás sóoldat kontroll). 3.5.2 Antihiperalgéziás vizsgálatok carrageenan indukálta gyulladásos fájdalomban Antihiperalgéziás hatás vizsgálata: A lábak nyomásérzékenységének méréséhez Randall-Selitto (Randall and Selitto, 1957) módszert alkalmaztunk (Ugo Basile Type 37215, Comerio, It.). A kísérlet kezdetén meghatároztuk mindkét hátsó láb nyomásérzékenységét, ezután a jobb hátsó talpba 100 µl 1%-os carrageenan oldatot fecskendeztünk. Az adás után 60-120-180-perccel vizsgáltuk (az utolsó kísérleteknél csak 180 percnél) a hiperalgézia kialakulását. A 180 percnél mért értéket hiperalgéziás alapértékként határoztuk meg. Ezután injektáltuk a hatóanyagokat a fenti módszerrel intrathecalisan vagy subcutan. A naloxon antagonizmus vizsgálatánál a naloxont (vagy fiziológiás sóoldatot) 180 percnél adtuk és ezt követően 10 perccel a hatóanyagot, a naltrexont 165 percnél adtuk be és 180 percnél a hatóanyagot. Ezután lemértük mindkét talp talp nyomásérzékenységét 5, 15, 30 és 60 perccel a hatóanyag beadását követően. Az intrathecalis vildagliptin esetében egyszer megmértük a 120 perc utáni értéket is, subcutan vildagliptin esetén 15, 30, 60 és 180 perccel a vildagliptin adását követően mértük a hatást.

34

A különböző dózisban alkalmazott Ile-Pro-Ile hatásának összehasonlítására két módszert alkalmaztunk: először a beadás utáni 60 percben a görbe alatti területet hasonlítottuk össze; másodszorra meghatároztunk a 30 perces időpontban egy százalékos antihiperalgéziás hatást = (ipsilaterális érzékenység – hiperalgéziás alapérték) / (contralaterális érzékenység – hiperalgéziás alapérték) x 100%. A hatásokat mindkét módszerrel összehasonlítottuk. 3.6 Statisztikai analízis: Az in vitro mérés eredményeit egy szempontos ANOVA-t és Newman – Keuls post hoc tesztet használtunk. Az in vivo latencia-idő görbék elemzése során egy görbén belül egyszempontos repeated mesure ANOVA-t és Bonferroni post hoc tesztet használtunk, két görbe összehasonlítására kétszempontos ANOVA-t és Bonferroni tesztet. Az ED50 értékeket nem lineáris regresszióval határoztuk meg. Az analízisekhez GraphPad Prism 3.0 és 5.0 szoftvereket alkalmaztunk.

35

4. Eredmények: 4.1 Izolált L4, L5 hátsó gyöki ganglion-preparátumon végzett kísérletek eredményei: 4.1.1 Az előkísérletben kapott eredmények A kontroll kísérletben, valamint a hatóanyagok adása mellett kísérletenként 4-4 mintában mértük a fürdőfolyadék, 4 mintában a szövetkivonat immunreaktiv P-anyag és endomorphin 2 tartalmát. A P anyag esetén az összesített 24 fürdőfolyadék-mintából csupán 2 esetben találtunk az ELISA érzékenységi küszöbét csekély mértékben meghaladó értéket (egy nyugalmi

érték

Tyr-Pro

jelenlétében,

egy

nyugalmi

érték

Tyr-Pro-Ser(O-glukóz)

jelenlétében). Ezzel szemben a 12 szövetmintából 8-ban találtunk a detektálhatósági tartományba eső értékeket. Az immunreaktív endomorphin 2 tartalom magasnak bizonyult a fürdőfolyadékban TyrPro jelenlétében már nyugalmi körülmények között is, de a folyadékminta endomorphin 2 tartalma depolarizáló K+-stimulációval nem volt fokozható (7. ábra). Tyr-Pro adalék nélkül a biztonságos meghatározási tartomány határára eső tartalmak voltak a fürdőfolyadékban, alacsony, de mérhető fürdő-tartalmak Tyr-Pro-Ser(O-glukóz) jelenlétében. Minden esetben igen alacsony endomorphin 2 immunreaktivitások jelentek meg a szövetkivonatokban. Statisztikailag egyik változás sem volt szignifikáns.

EM 2 IR (pg/mg WTW)

15

Felszabadulás 3 mM K+ Felszabadulás 30 mM K+ Szöveti tartalom

10

5

7.

ábra

(1 Ty 0 -3 r-P ) ro -S er (O )G lu (1 0 -4 )

Ty r-P ro

-( Ko n

tro ll)

0

Immunreaktív

endomorphin

2

tartalmak

a

fürdőfolyadékban

illetve

a

szövetkivonatokban izolált L4 és L5 gerincvelő hátsógyöki ganglion-preparátomon az előkísérletben 36

4.1.2. Módosított kísérleti elrendezésű és feldolgozású főkísérlet A második kísérletsorozatban nem foglalkoztunk tovább sem a glikozilált peptiddel, sem a P-anyag szintjének mérésével, viszont megvizsgáltuk a DPP IV inhibitor hatását, és fokoztuk a tisztítás hatékonyságát (lásd a metodikánál). Endomorphin 2 immunreaktivitás volt mérhető a Tyr-Pro-t tartalmazó mintákban, önmagában és Ile-Pro-Ile jelenlétében is. Az endomorphin mennyisége a kombináció esetében a nyugalmihoz (3mM K) képest depolarizáció hatására 8-szorosára fokozódott. Az Ile-Pro-Ile önmagában nem fokozta a mennyisséget, sőt nem volt mérhető endomorphin 2 a csak IPI mintákban. A szöveti tartalom igen mérsékelten emelkedett Tyr-Pro hatására, de mélyen alatta maradt a felülúszókban mért mennyiségeknek. (8. ábra és 6. táblázat)

*

EM 2 IR (pg/mg WTW)

15

Felszabadulás 3 mM K+ Felszabadulás 30 mM K+ Szöveti tartalom

10 2

Ty r-P ro

+

(1 0

Ile -P ro -Il e

(n =4 )

)( n= 4)

-4

)( n= 4)

-3

Ile -P ro -Il e

(1 0

Ty r-P ro

-( Ko nt ro ll)

(n =4 )

0

8. ábra és 6. táblázat: A második (fő) kísérletsorozat eredményei * p<0,05 Tyr-Pro + Ile-ProIle 30K vs összes többiérték Hozzáadott anyag

Koncentráció (M)

0 (Kontroll) Tyr-Pro Ile-Pro-Ile Tyr-Pro + Ile-Pro-Ile

10-3 10-4 10-3 + 10-4

EM 2 immunreaktivitás (pg/mg nedves szövet 30 min alatt vagy pg/mg nedves szövet) Felszab. 3mM Felszab. 30 Szöveti n K+ mM K+ tartalom 4 0,11±0,06 0,08±0,08 0,16±0,11 4 1,07±0,09 1,08±0,26 0,44±0,08 0 0 4 0,08±0,05 4 1,60±0,37 12,7±2,29* 0,50±0,08

37

4.2 Az in vivo vizsgálatok eredményei 4.2.1. Az in vitro vizsgálatok eredményei alapján felállított alaphipotézis az in vivo vizsgálatokhoz Feltételeztük, hogy az izolált hátsógyöki ganglionon végzett kísérletek eredményei tendencia-szerűen kiterjeszthetők azokra a folyamatokra, amelyek a peptiderg primer afferensek centrális nyúlványain zajlanak a gerincvelői hátsó szarvban, in vivo. Hipotézisünk szerint az izolált L4-L5 ganglion esetén alkalmazott depolarizáció modellezhető lehet tartós C-rost aktivációt eredményező eljárással, például intraplantáris carrageenannel kiváltott gyulladással. Feltételeztük továbbá, hogy amennyiben a hátsószarvi indukált endomorphin 2 bioszintézis létrejön, s ennek van élettani-kórtani jelentősége, úgy a valószínűsített szubsztrátfragmenseknek helyben kell keletkezniük. Ezek alapján ahhoz, hogy a gyulladáskeltés mellett az in vitro modellhez hasonló állapotot idézzünk elő, elegendő lehet a DPP IV "szintáz" üzemmódjának serkentése Ile-Pro-Ile, vagy nem-peptid DPP IV inhibitor intrathecális bevitelével. 4.2.2. Dipeptidil-peptidáz inhibitorok antihiperalgéziás hatása az intraplantáris carrageenannel előidézett mechanikus hiperalgézia-modellben. Randall-Selitto szerint mérve a nociceptiv nyomásküszöböt, a kontroll értékek mindkét hátsó végtagon a 60-90 g közötti tartományba estek (l. 9.-19. -ábra). A carrageenannel injektált oldalon("ipsilaterális") a nyomásküszöb csökkenésének (azaz a hiperaléziának) a maximuma az előkezelést követő 180. percre alakult ki, s ezt követően vehikulum-kezelés mellett ezen a szinten maradt a leghosszabb kísérleti időtartamot figyelembe véve mintegy két órán át (l. 9.-19. ábra). Az ellenoldali talpon („contralaterális”, az összes ábrán nyitott szimbólumokkal jelölve) a nyomásküszöb a kísérletek teljes tartamára a kontroll szinten maradt. A "hiperalgéziás alap" (azaz a carrageenan-injektált oldalon mért nociceptiv nyomásküszöb 180 percnél) mérése után közvetlenül i.t. injektált 30 nmol / patkány Ile-ProIle antihiperalgéziás hatása már az 5 perces mérésnél megjelent a carrageenan-injektált oldalon, hatásmaximumát 30 percnél érte el, és 60 percre a hatás lecsengett. Bár a cerebrospinális folyadéktér közössége okán az ellenoldali hátsószarvi fél hasonló DPP IV inhibitor-koncentráció jelenlétében működik, ezen az oldalon nem változott a nociceptiv nyomásküszöb (9. ábra).

38

Nociceptiv küszöb (g)

***

100

Fiz.só old. (n=5)

75

IPI 30 nmol (n=9)

***

*

* 50

*** p<0,001 * p<0,05

25 0

0 60 120 180

195

210

225

240

Idő (min)

9. ábra 30 nmol/állat it. Ile-Pro-Ile (IPI) antihiperalgéziás

hatása patkányon

carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten Az antihiperalgéziás hatás antagonizálható volt koinjektált endomorphin antiszérummal (EM2 AS) (10. ábra), míg nem-reaktiv (kontroll) nyúlszérum (NRS) az Ile-Pro-Ile hatását nem

Nociceptiv küszöb (g)

befolyásolta (11. ábra). ***

100

75

***

50

+++

*** +++

*** +++

+++

*** IPI vs. Fiz.só old. p<0,001 +++ IPI vs.

25

0

Fiz.só old. (n=5) EM2 AS (n=5) IPI 30 nmol (n=6) IPI+E2AS (n=7)

0

180

195

210

225

IPI + EM2 AS p<0,001

240

Idő (min)

10. ábra Koinjektált 20 szoros higítású EM2 ellenes antiszérum hatása 30 nmol/állat it. adott Ile-Pro-Ile antihiperalgéziás hatására patkányon carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten

39

Nociceptiv küszöb (g)

100

Fiz.só old. (n=5) NRS (n=5) IPI 30 nmol (n=7) IPI + NRS (n=7)

*** ***

75 50

*** Fiz.só old. vs. IPI P<0,001

25 0

0

180

195

210

225

240

Idő (min)

11. ábra Koinjektált nem reaktiv szérum (NRS) hatása 30 nmol/állat It. adott Ile-ProIle antihiperalgéziás hatására patkányon carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten A hatást az intrathecalis Ile-Pro-Ile bevitele előtt 10 perccel s.c. injektált naloxon szintén antagonizálta, bár feltehetően farmakokinetikai okok miatt az antagonizmus csak a 15, 30 és

Nociceptiv küszöb (g)

60 perces mérési pontoknál vált szignifikánssá (12. ábra).

***

100

*** Fiz. só old. (n=5) NX 1mg/kg (n=5) IPI 30 nmol (n=7) IPI + NX (n=9)

***

*** 75

++

+++ +++

50

*** IPI vs. Fiz. só old.P<0,001 ** IPI vs. Fiz. só old. P<0,01 +++

25

++

0

NX 0

IPI vs. IPI+NX P<0,001 IPI vs. IPI+NX P<0,01

IPI

180 190

205

220

235

250

Idő (min)

12. ábra 1mg/kg sc. naloxon hatása 30 nmol/állat it. adott Ile-Pro-Ile antihiperalgéziás

hatására

patkányon

carrageenan

indukálta

gyulladásos

hiperalgéziában Randall-Selitto teszten Sem az i.t. adott endomorphin antiszérum, sem a s.c. naloxon-kezelés nem befolyásolta önmagában a nociceptiv nyomásküszöböket, sem a hiperalgéziás, sem az ellenoldali értéket (10. és 12. ábra). Az intrathecalisan injektált 30 nmol/patkány endomorphin 2 hasonló

40

hatáserősséggel,

hatásjelleggel

és

időbeni

lefutással

befolyásolta

a

nociceptiv

nyomásküszöböket (13. ábra).

Nociceptiv küszöb (g)

100 75

*** +++

***

***

+++

+++

**

50

Fiz. só old. (n=5) NX 1 mg/kg sc. (n=5) EM2 30 nmol (n=7) EM2+NX (n=6) *** EM2 vs. Fiz. só old. p<0,001 +++ EM2 vs. EM2+NX p<0,001

25 NX EM2 0

0

180 190

205

220

235

250

Idő (min)

13. ábra 30 nmol/állat it. endomorphin 2 antihiperalgéziás hatása és annak antagonizumsa 1 mg/kg sc. adott naloxonnal (NX) patkányon carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten Az Ile-Pro-Ile antihperalgéziás hatása sajátos dózis-függési mintázatot mutatott (14. ábra). Az idő-hatásgörbék alapján szerkesztett dózis-hatásgörbék, akár a görbe alatti terület (nem mutattam be), akár a hatásmaximumnál, azaz 30 percnél mért értékekből számított MPE alapján (15. ábra) készültek, kifejezett törést mutattak 3 nmol/patkány és 10 nmol/patkány értékek között. +++

Nociceptiv küszöb (g)

100

++

75

+++

50

***

***

*** **

*** 3 nmol IPI vs. Fiz. só old. p<0,001 ** 3 nmol IPI vs. Fiz. só old. p<0,01 +++ 3 nmol IPI vs. 30 nmol IPI p<0,001 ++ 3 nmol IPI vs. 30 nmol IPI p<0,01

25 0 180

Fiz. só old. (n=10) 1 nmol IPI (n=7) 3 nmol IPI (n=15) 10 nmol IPI (n=18) 30nmol IPI (n=9)

195

210

225

240

Idő (min)

14. ábra It.adott Ile-Pro-Ile különböző dózisainak antihiperalgéziás hatása patkányon carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten

41

Antihiperalgéziás hatás (%)

Ile-Pro-Ile dózis-hatás összefüggés (30 percnél mért csúcs) 150

100

50

0 0.0

0.5

1.0

1.5

Log10[nmol]

15. ábra It. adott Ile-Pro-Ile dózis-hatás összefüggése a 30 percnél mért csúcshatásnál patkányon carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten Az elemszám növelése e két dózis-pontban rontotta mind a log-lineáris, mind a szigmoid illeszthetőség statisztikai mutatóit, azaz az "r2" és a konvergencia-kritériumokat. Az intrathecalisan injektált nem-peptid tipusú DPP IV inhibitor, a vildagliptin 3 nmol/patkány dózisban nagy hatáserősségű és tartós hatású antihiperalgéziás hatást mutatott. A 30 percnél jelentkező hatásmaximum változatlan szinten fennmaradt a 60 perces mérésnél is, és csupán 120 perc után mutatott csökkenő tendenciát. (16. ábra) A hatást mind a koinjektált endomorphin 2 antiszérum, mind a naloxon helyett affinitási- és farmakokinetikai tényezők miatt választott naltrexonnal történt s.c. előkezelés antagonizálta (17. és 18. ábra). A vildagliptin nemcsak intrathecális, hanem s.c. kezelés mellett is erős és tartós antihiperalgéziás hatást fejtett ki 1 mg/kg dózisban (19. ábra).

Nociceptiv küszöb (g)

100

*** 75

***

+

***

50

***

+++

*

25

0

0

60 120

180 195 210 225 240 255 270 285 300

Idő (min)

Fiz. só old. (n=5) Vildagliptin 3nmol (n=9) IPI 3 nmol (n=15) *** Vildagliptin vs. Fiz. só old. p<0,001 * Vildagliptin vs. Fiz. só old.p<0,05 +++ Vildagliptin vs. IPI p<0,001 + Vildagliptin vs. IPI p<0,05

16. ábra It. adott 3 nmol/állat Ile-Pro-Ile és 3 nmol/állat vildagliptin antihiperalgéziás hatásának összehasonlítása patkányon carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten

42

Sc. Naltrexon hatása az it. vildaglipin antinociceptiv hatására Nociceptiv küszöb (g)

100 80

***

***

60

+++

+++

40

*** *** +++

+++ *** Vildagliptin vs. Fiz. só old.

p<0,001 Vildagliptin vs. Vildagliptin + NTX p<0,001 +++

20 0

Fiz. só old. (n=5) NTX 0,5mg/kg (n=6) Vildagliptin 3 nmol (n=6) Vildagliptin + NTX (n=8)

0

180

195

210

225

240

Idő (min)

17. ábra sc. adott 0,5 mg/kg naltrexon (NTX) hatása 3 nmol/állat vildagliptin antihiperalgéziás

hatására

patkányon

carrageenan

indukálta

gyulladásos

hiperalgéziában Randall-Selitto teszten

Koinjektált szérumok hatása a vildagliptin antinociceptiv hatására Nociceptiv küszöb (g)

100 75

***

*** 50 +++

+++

+++

*** Vildagliptin vs. EM2 AS p<0,001 Vildagliptin vs. Vildagliptin + EM2AS p<0,001

+++

25 0

EM2 AS (n=4) Vildagliptin 3 nmol (n=6) Vildagliptin + NRS (n=6) Vildagliptin + EM2 AS (n=6)

***

***

0

180

195

210

225

240

Idő (min)

18. ábra 20 szoros higítású EM2 antiszérum (EM2 AS)és nem reaktív szérum hatása it. adott 3 nmol/állat vildagliptin antihiperlagéziás hatására patkányon carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten

43

Nociceptiv küszöb (g)

100

***

***

80 60

***

Saline (n=5) Vildagliptin 1mg/kg sc. (n=10)

***

*** p<0,001

40 20 0

0

180

210

240

270

300

Idő (min)

19. ábra 1 mg/kg sc. adott vildagliptin antihiperalgéziás hatása patkányon carrageenan indukálta gyulladásos hiperalgéziában Randall-Selitto teszten 4.2.3. Akut nociceptiv (tail flick) teszten kapott eredmények Először megvizsgáltuk és összehasonlítottuk az endomorphinok, a DAMGO és a morfin antinociceptiv hatását patkányon intrathecalis adás mellett tail flick teszten. Valamennyi peptid agonista esetén a hatásmaximumok az injektálást követő 5 percben jelentkeztek, a hatástartamok változóak voltak. Az endomorphinok hatása gyorsabban csengett le a DAMGO-énál. Mindkét endomorphin a DAMGO-nál és a morfinnál is kisebb hatáserősségűnek és rövidebb hatásúnak bizonyult (idő-hatásgörbéket nem mutattam be, 20. ábra és 7. táblázat) 100

EM2 EM1 DAMGO Morphine

MPE %

80 60 40 20 0

-3

-2

-1

0

1

2

log10(nmol) 20. ábra It. injektált endomorphinok (EM1 és EM2) és referencia opioidok dózis-hatás görbéje patkány tail flick teszten

44

7. táblázat It. injektált endomorphinok (EM1 és EM2) és referencia opioidok ED50 értékei patkány tail flick teszten Hatóanyag

ED50 (nmol/állat)

Endomorphin 1

6,8 (3,85-11,0; DF=15)

Endomorphin 2

13,3 (8,04-22,1; DF=21)

DAMGO

0,0059 (0,0035-0,0104; DF=23)

Morfin

0,11 (0,067-0,17; DF=26)

Tail flick teszten vizsgálva sem a Tyr-Pro, sem a DPP IV inhibitor Ile-Pro-Ile önmagában (nem ábrázoltam), sem a Tyr-Pro kombinációja Ile-Pro-Ile-vel nem bizonyult hatékonynak fiziológiás sóoldattal összehasonlítva még igen nagy dózisban (100 nmol TyrPro, 30 nmol Ile-Pro-Ile) sem. A kombináció esetében az alapértékhez viszonyítva a hatás elérte a szignifikancia határát, de a maximális hatás MPE értéke 20% alatt maradt. (21. ábra) A kombináció sc. adás mellett sem mutatott antinociceptiv hatást. A vildagliptin 30 nmol/állat dózisban önmagában adva hatástalannak bizonyult.

Latency (s)

8

Saline (n=10) 100 nmol YP + 30 nmol IPI (n=10) 30 nmol Vildagliptin (n=10) 30 nmol EM2 (n=8)

6

4

2 0

30

20

10

T (min)

21. ábra It. adott A DPP IV inhibitorok és az endomorphin 2 (EM2) hatása patkány tail flick teszten

45

5. Eredmények megbeszélése 5.1. Technikai szempontok Az izolált L4-L5 hátsógyöki ganglionon végzett előkísérlet szövetkivonási és mintatisztítási előiratait számos szempont alapján állítottuk fel. A választott, Garland és mtsai (Garland et al., 1997) által P-anyag kivonására alkalmazott eljárást minimális módosítással alkalmaztuk, és az eredeti közlemény alapján becsültük a várható szöveti P-anyag tartalmakat. A választásban jelentős szerepet játszott az a tény, hogy Sun én mtsi (Sun et al., 2001) idegszöveti endomorphin-tartalmak vizsgálatára lényegi elemeiben hasonló kivonási menetrendet használtak, és saját korábbi vizsgálatainkhoz hasonlóan ők is két immunreaktív endomorphin 2 speciest találtak mintáikban. A P-anyag_ELISA érzékeny mérési tartományát a gyártó ill. a forgalmazó által megadottnak fogadtuk el. A szöveti- illetve a szervfürdőben megjelenő immunreakitív anyagtartalmak csupán félkvantitatív, de értékes jelzésként értékelendők. A tisztított szövetmintákban jelenlevő anyagmennyiség lényegesen magasabb arányban érte el a meghatározhatósági tartományt, mint a szervfürdőben megjelenő mennyiségek (lásd eredmények). Bár izolált hátsógyöki ganglion-preparátumon is mérhető neuropeptidfelszabadulás (Eberhardt et al., 2008; Huang and Neher, 1996), ennek várható mennyiségi mutatói előre nem kalkulálhatók pontosan. Az immunreaktív endomorphin 2 tekintetében az előkísérletben kapott egyértelmű eredménycsoport lehetővé tette az ésszerű további kísérletmenet felállítását, illetve a kivonási eljárás biztonságos módosítását. A Tyr-Pro prekurzor -Ser(O-glukóz) származékainak tervezését és előállítását abban a hipotézis-fázisban indítottuk el, amikor a de novo endomorphin bioszintézis feltételezett helyét

az

intracelluláris

térre

lokalizáltuk.

Az

O-glikozilált

elemet

tartalmazó

peptidszármazákokat számos esetben sikerrel alkalmazták egyébkent nem penetráló peptidek intracelluláris térbe juttatására (Egleton et al., 2001; Negri et al., 1998) Tyr-Pro-Gly-Ser(OGlu), neurális szövetben a plazmamembrán GLUT-1 típusú glukóz-transzporter révén. Mivel esetünkben a feltételezett (de kísérletesen nem bizonyított) penetrációt egy további (feltételezett) lépés, a Tyr-Pro enzimatikus, intracelluláris felszabadítása kellett volna, hogy kövesse a potenciálisan szóba jövő enzimek körének kiszélesítése céljából két további származékot is előállított Szemenyei Erzsébet az MTA SZBK Izotóp Laboratóriumában, a Tyr-Pro-Gly-Ser(O-glukóz) valamint a Tyr-Pro-Gly-Gly-Ser(O-glukóz) peptideket. A peptidszintézis technikai nehézségei okán csak a Tyr-Pro-Ser(O-glukóz) mennyisége volt elegendő a 10-4 M végkoncentráció eléréséhez. Mivel már az előkísérlet során valószínűsíthetővé vált az endomorphin 2 képződésének extracelluláris volta, melyet a 46

főkísérlet eredményei és a későbbiekben elvégzett morfológiai vizsgálatai megerősítettek (Kozsurek, Puskár, Fekete és mtsi., előkészületben levő kézirat, lásd 7. fejezet), ezt a irányt nem vizsgáltuk tovább. Az izolált ganglionokon végzett főkísérletben az Ile-Pro-Ile önmagában történő alkalmazásakor nyert eredményekhez két fontos megjegyzést kell hozzáfűzni. Egyrészt az, hogy az endomorphin 2 antiszérum még nagy koncentráció esetén sem ismeri fel az Ile-ProIle tripeptidet. Másrészt, bár "szemre" a mért immunreaktív endomorphin 2 tartalmak alacsonyabbak, mint más kísérleti csoportokban, statisztikailag nem mondható ki a különbözőség. 5.2. Tartalmi megbeszélés Az izolált L4, L5 hátsógyöki ganglionokkal végzett kísérleteink eredményei arra utalnak, hogy az extracelluláris térben megjelenő immunreaktív endomorphin 2 nem a szöveti, vezikuláris készlet ún. frakcionális felszabadulásából származik, hanem a képződés valószínűsíthetően az idegsejtek membránjának külső felszínén történik. A de novo bioszintézist a magas koncentrációban jelenlevő Tyr-Pro prekurzor "irányítja", a másik feltételezett prekurzor fragmensnek, a Phe-Phe-Gly-nek endogén forrásból kell származnia. Ez utóbbi tripeptid-fragmens (és nem a dipeptid Phe-Phe) feltételezése abból adódik, hogy hagyományos képződési út mellett a C-terminálisan amidált végtermékek közvetlen prekurzorának glicinnel kell végződnie, melyből a peptidil-glicin alfa-amidáló monooxigenáz enzim (valójában ez két enzim), a "PAM" képez egy aminosavval rövidebb, amidált peptidet (Eipper et al., 1983). A tripeptid egyik lehetséges, de nem bizonyított, forrása a P-anyag, melynek domináns hidrolítikus termékei között szerepel a neutrális endopeptidáz által lehasított Phe-Phe-Gly (Turner, 1987). Az exogén Tyr-Pro szükségessége adódhat abból a tényből, hogy a két lehetséges prekurzor-forrás, azaz a neuropeptid Y és a prodinorfinból levezethető β-neo-endorfin propeptidjei élettani körülmények között nem képződnek a hátsógyöki ganglion sejtekben. (22. ábra)

47

22. ábra az SP, NPY és a β-neoendorphin szerkezet a lehetséges hasítási helyekkel. Nem hagyhatók figyelmen kívül azok az irodalmi adatok, melyek patkány gerincvelői hátsógyöki ganglionból (Sanderson Nydahl et al., 2004) illetve ganglion nodosumból (Niu et al., 2009) készült metszetek elektron-mikroszkópos elemzésekor immunreaktív endomorphin 2 előfordulásáról szóltak un "dense-core" vezikulumokban, azon terminálisokban, ahol teljes mértékű koexisztenciát tapasztaltak immunreaktív P-anyaggal. Bár az immunhisztokémiai eljárásokkal kombinált elektron-mikroszkópia adatainak kvantitatív összehasonlítása nem teljesen helytálló, úgy tűnik, hogy bár a kétirányú koexisztencia terminálisra vonatkoztatva helytálló, a P-anyag tárolt mennyisége jelentősen meghaladja az endomorphinét. Ennek feltárására kezdtünk kooperációba egy neuroanatómus munkacsoporttal (lásd 7. fejezet). Nem tekinthetünk el attól sem, hogy az irodalomban kis számban előfordulnak közlemények, melyek endomorphin 2 felszabadulásáról számolnak be. Ezek közül Williams és mtsi. valamint Lisi és Sluka közleménye (Lisi and Sluka, 2006; Williams et al., 1999), bár felszabadulásról írnak, csak az endmorphin megjelenését bizonyítja stimuláció hatására. Scanlin és mtsi. újszülött patkány DRG sejtkutúrából kalcium függő endmorphin 2 felszabadulást mértek, amely esetben µ receptor mediálta autoinhibíció gátolja a felszabadulást és okoz detektálási nehézséget (Scanlin et al., 2008). Az általunk mért jelenség kalcium függését vagy függetlenségét eddig nem tudtuk egyértelműsíteni, hiszen a kalcium függés még nem jelent automatikusan transzmitter felszabadulást. Az Ile-Pro-Ile hatásának jellege izolált ganglion preparátumon, mely szerint kizárólag nagy koncentrációjú Tyr-Pro jelenlétében vezet a szervfürdőben endomorphin-tartalom növekedéshez, míg önmagában hatástalan, arra utal, hogy a fokozódás oka nem a már előzetesen

megszintetizálódott

endomorphin

48

lebontásának

gátlása.

Emellett,

ha

a

"patkányagyi durva membránfrakción" végzett elemzések jó közelítéssel vehetők az idegszövet extracelluláris terében zajló peptid-hidrolítikus folyamatok modelljének, úgy a DPP IV enzim lassan bontja minkét endomorphint (féléletidő 20-25 perces tartományban), és még a Tyr-Pro dipeptid is relative hosszú fél-életidejű (~18 min) (Tomboly et al., 2002) (lásd 1.3.3.2 fejezet). Ezzel egybecseng csoportunk korábbi in vivo eredménye, mikor patkány oldalkamrába koinjektált endomorphin 1 - Ile-Pro-Ile kombináció mellett sem potencírozást, sem hatás-megnyúlást nem tapasztaltunk (Ronai et al., 1999), bár ennek ellentmondó irodalmi adatok is vannak (Shane et al., 1999). Jelenleg nincs rá megfelelő magyarázatunk, hogy az Ile-Pro-Ile milyen módon fokozza nagy feleslegben adott Tyr-Pro (amely egyrészről a hidrolízis végterméke, illetve a szintetikus út szubsztrátja) jelenlétében a DPP IV fordított irányú működését, de kísérleti eredmények alapján ez a működés feltételezhető. Az interpretációt tovább bonyolítja, hogy az Ile-Pro-Ile az enzim "lassan bomló kompetitív szubsztrátja" (Rahfeld et al., 1991), és nem alloszterikus inhibitora, így ez a tripeptid is az aktív centrumhoz kötődik. Segítséget nyújthat az interpretációhoz,

hogy

Kirby

és

mtsi.

közleménye szerint a DPP IV enzimnek dimerizált formája (is) létezik, sőt a dimerek is dimerizálhatnak (Kirby et al., 2010), ami magyarázatot jelenthet, hogyan képes egy aktív centrumhoz kötődő inhibitor a funciót nem egyeszerűen gátolni, hanem módosítani. Elméletileg minden enzim-katalizált reakció, így a peptidhidrolízis is kétirányú, de élettani

körülmények

között

termodinamikailag a hidrolítikus út favorizált. Az in vitro peptidszintetikus kémia évtizedek óta alkalmaz immobilizált peptidhidrolázokat szintetikus célra jó termelési hatásfokkal, de 23. ábra: A DPP 4 enzim szerkezete ad extrém kísérleti feltételek mellett (-100 °C dimer dimerjének formájában (Kirby et al., alatti hőmérséklet, azaz "cryo-szintézis", 2010) extrém hidrofób vagy extrém poláros közeg stb) (Clapes et al., 1995; Hansler et al., 1995; Schuster et al., 1991). Eredményeink arra utalnak, hogy a dipeptidil peptidáz IV esetében ez a fordított működés élettani körülmények között is lehetséges Ile-Pro-Ile és nagy koncentrációjú 49

Tyr-Pro jelenlétében. A DPP IV enzim általunk feltételezett működési "ciklusait" az alábbi sémán mutatom be (24. ábra):

24/A ábra A DPP IV enzim működése szubsztrát hiányában. Ha nincs jelen az általunk

szintetikus

feltételezett

szusztrátnak

Tyr-Pro

szükséges

mennyiségben a DPP IV enzimnek csak katabolikus funkciója működik és az endomorphin 2 lebontását végzi, azonban a lebontás sebessége is lassú

24/B ábra Feleslegben adott szintetikus szubsztrát (Tyr-Pro) esetén az enzim szintetikus

működése

fokozódik

és

endomorphin 2-t kezd szintetizálni de novo. Miközben a katabolikus funkciója is megmarad: a szubsztátok aránya határozná

meg

az

egyensúlyt

az

anabolizmus és a katabolizmus között

24/C ábra Depolarizáció és a katabolikus funkciót gátló Ile-Pro-Ile ill. vildagliptin jelenlétében felgyorsul, blokkolódik.

50

a a

szintetizáló

funkció

katabolikus

funkció

Az in vivo kísérletekben az endomorphinok eredetének vizsgálatán túl fontos szempontnak tekintettük a hátsó gyöki nociceptiv transzmisszió megfigyelését. Mivel az endomorphinok elsősorban a széli laminákban fordulnak elő, ezért elsősorban az ezt érintő változásokat tekintettem fontosnak, habár a nem zárható ki, hogy más területekrő induló szabályozó körök is részt vesznek a szabályozásban. További megjegyzés, hogy az antihiperalgéziás hatásokat egy tartós, de nem krónikus gyulladásos modellben, és csak a mechanikus nociceptiv küszöb változása tekintetében vizsgáltam. Ez azért jegyzendő meg, mert a mechanikus és a termális hiperalgézia sajátságai számos tekintetben egymástól eltérőek lehetnek (Scherrer et al., 2009). Tehát megfigyeléseink jelenleg nem terjeszthetőek ki sem termális hiperalgézia vonatkozásában, sem idegsérülés okozta fájdalmak kérdésében. Az it. injektált Ile-Pro-Ile erős antihiperalgéziás hatása mindkét tekintetben igazolta a munkahipotézist. Egyrészt bebizonyosodott, hogy e hatás opioid receptor-mediált, és hátterében az endomorphin 2 bioszintézisének indukciója áll. Egyértelműen bizonyítottnak tekinthető, hogy a DPP IV inhibitorok hatását opioid receptor mediálja, és azt, hogy a receptoron endomorphin 2 hat. Az endomorphin szint emelésére a miénktől eltérő lehetséges magyarázat lenne, hogy a hátsó szarvban endogénen jelen lévő endomorphin hatását a DPP IV inhibítor a lebomlás gátlásán keresztül potencírozza. Azonban ha ott jelentős mennyiségű endomorphin lenne, amely befolyásolni tudná a nociceptiot, akkor az önmagában adott antagonistáknak (naloxon, naltrexon, EM2-antiszérum) a gyulladásos oldalon fokozniuk kellene a hiperalgéziát, de ezt nem teszik. Másrészt azt is bizonyította, hogy a bioszintézishez szükséges prekurzor fragmensek endogén forrásból származnak. Ugyanez igazolódott a DPP IV enzim nem-peptid szerkezetű inhibitora, a vildagliptin esetén is, amely, bár csak egy dózisának hatását vizsgáltam, még nagyobb hatáserősségű antihiperalgéziás anyagnak bizonyult az Ile-Pro-Ile tripeptid-inhibitorral összehasonlitva. Figyelemreméltó, hogy mindkét DPP IV inhibitor teljes mértékben hatástalan volt az alkalmazható legnagyobb dózisban az akut nociceptiv tesztben, patkány tail-flicken. Az it. injektált endomorphin 2, morfin, valamint a

teljes

agonista

prototipus

µ-opioid

receptoragonista

enkefalin-analóg

DAMGO

antinociceptiv hatása megegyezik a korábbi irodalmi adatokkal (Drower et al., 1991; Horvath et al., 1999; Przewlocka et al., 1999; Xie et al., 2008; Yaksh and Henry, 1978). Az említett hatástalanságra az akut nociceptiv tesztben jelenleg még nem tudunk részletesebb magyarázatot adni. A lehetséges alternatívák szerint az indukált endomorphin 2 bioszintézis vagy nem az I laminában történik, vagy akut nociceptiós körülmények között nem elegendő mértékben (és a Tyr-Pro dipeptid hozzáadása sem elegendő a hatás kialakulásához), vagy az 51

itt keletkező endomorphin nem hat elégséges mértékben a lamina I-ben végződő primér nociceptiv afferensek preszinaptikus µ-opioid receptorainak sajátos jelátviteli útjára. Míg más preszinaptikus µ-opioid receptorok mind K+-csatornák, mind Ca2+-áramok modulációja révén befolyásolhatják a szinaptikus aktivitást, a hátsószarvi I. laminában a hatás csaknem kizárólag az N-típusú Ca2+-csatornák modulációja, kisebb mértékben a P/Q-típusú Ca2+-csatornák befolyásolása útján érvényesül (Heinke et al., 2011). Ez utóbbi esetleg magyarázatul szolgálna az endomorphinok általánosan ismert viszonylagosan gyenge antinociceptiv hatására. A II. lamina külső rétegében egy igen jelentős, posztszinaptikus lokalizációjú µopioid receptorpopuláció is található (Spike et al., 2003), és lehetséges, hogy az indukált endomorphin 2 bioszintézis elsődlegesen ebben a rétegben történik (lásd még 7. fejezet).

52

6. Megállapítások 1. Az endomorphin 2 prekurzornak tartott Tyr-Pro dipeptid hozzáadásával immunreaktív endomorphin 2 képződhet de novo bioszintetikus úton izolált hátsó gyöki ganglionon. 2. A mi in vitro kísérleti rendszerünkben a bioszintézis extracellulárisan megy végbe. 3. Bár a direkt bizonyíték hiányzik, az indirekt bizonyítékok alapján valószínűsíthető, hogy a dipeptidil peptidáz IV ténylegesen tészt vesz a bioszintézisben mint szintáz. 4. Az it. injektált DPP IV inhibitorok, az Ile-Pro-Ile és a vildagliptin antihiperalgéziás hatásúak patkányon tartós gyulladásos okozta hiperalgéziás modellen. 5. Mindkét inhibitor antihiperalgéziás hatása gátolható volt koinjektált EM2 antiszérummal vagy opioid receptor antagonistával (naloxon, naltrexon) történő subcutan előkezeléssel. 6. Ezáltal mindkettő hatását opioid receptorok közvetítik és endomorphin 2 képződésnek tulajdonítható 7. Mivel nem volt szükség exogén prekurzor fragmensek adására, azok valószínűleg endogénen megképződnek 8. Akut nociceptív modellen, amilyen a tail flick teszt, a DPP IV inhibítorok hatástalanok. Ilyen kísérletben még a Tyr-Pro pótlása esetén sem értünk el érdemi antinoceptiv hatást. 9. Emiatt az endomorphin 2 képződé szerepe eltérő kell, hogy legyen az akut és a nem-akut nociceptiv információ feldolgozásában.

53

7. A kísérleti anyag alapján felállított további kutatási stratégia 1. Konfokális mikroszkópos munkacsoporttal való együttműködésben már végeztünk kísérleteket. Az alábbi ábrákon (25., 26. és 27. ábra) legelső fénymikroszkópos és elektronmikroszkós

eredményeinket

szeretném

bemutatni.

Az

elektronmikroszkópos

felvételek elemzése alapján úgy tűnik, hogy a gyulladás és hiperalgézia során elsősorban a membránhoz lokalizálható endomorphin mennyisége fokozódik. További kísérletek során célunk, hogy a kapott eredményeinket kolokalizáció szempontjából kvantifikáljuk. A fénymikroszkópos immunhisztokémia vizsgálatok eddigi eredményei arra utalnak, hogy az immunreaktív endomorphin 2 és a potenciális prekurzor-források (P-anyag, neuropeptid Y) koexisztenciája / kolokalizációja patkány gerincvelői hátsószarvban mind a lamina I-ben, mind a lamina II külső rétegében kimutatható. Szintén kolokalizáció mutatható ki a CART peptidedel. A CART esetében az összefüggést az adhatja, hogy a patkány CART N-terminális szekvenciája megegyezik a Diprotin A-val (Ile-Pro-Ile) és ez a szekvencia neutrális endopeptidáz hatására lehasadhat.

25. ábra A P-anyag, az endomorphin 2, a CART peptid és a neuropeptid Y kolokalizációja gerincvelő hátsó szarvában patkányon

54

26. ábra Endomorphin 2 kontroll patkányok hátsó szarvában. „Nyilak”: nem membránhoz lokalizált EM2, „Nyilfejek”: membránhoz lokalizálható EM2

27. ábra Endomorphin 2 ip. carrageenan és it. Ile-Pro-Ile kezelt patkányok hátsó szarvában. „Nyilak”: nem membránhoz lokalizált EM2, „Nyílfejek”: membránhoz lokalizálható EM2

55

2. A DPP IV inhibitorok és a direkt opioid agonisták antinociceptiv és hiperalgéziás hatásainak

kvantitatív

elemzését

tovább

folytatjuk.

Az

eredmények

publikációja

előkészületben. 3. Terveink között szerepel továbbá DPP IV inhibitorok és az endomorphin 2 szerepének és hatékonyságának

tanulmányozása

más

fájdalom

neuropathiás fájdalom, migrén.

56

modelleken:

krónikus

gyulladás,

8. Összefoglalás Az endomorphinokat (EM1: Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 és EM2: Tyr-Pro-Phe-Phe-NH2) fölfedezésük óta a

receptorok endogén ligandjának tekintik. Nagy szelektivitásúak,

azonban parciális agonisták, amely igen ritka tulajdonság az endogén ligandok között. A nociceptiv információt elsődlegesen feldolgozó központi idegrendszeri területeken az EM2 a domináns típus. Antinociceptiv hatás tekintetében azonban az in vitro tulajdonságaik alapján a vártnál kevésbé hatékonyak, elsősorban akut nociceptiv tesztekben. Az endomorphinok lebontásáért elsősorban a DPP IV enzim felel. Jelenleg nem ismert sem a prekurzorokat kódoló genomikus kód, sem olyan protein prekurzor, amelyből képződhetnek. Munkacsoportunk korábbi munkái során felmerült, hogy az EM2 nem riboszomális úton képződhetne di- ill. tripeptid prekurozorokból. Egyik lehetséges képződési útat a DPP IV enzim fordított irányú működése jelentheti. Patkány izolált L4 és L5 hátsó gyöki ganglionon végzett kísérleteink során megállapítottuk, hogy az EM2 képződése fokozódott magas koncentrációjú Tyr-Pro dipeptid jelenlétében. A DPP IV peptidáz funkciójának inhibitora, az Ile-Pro-Ile hozzáadásával, és magas (30 mM) kálium koncentrációval kiváltott depolarizáció mellett az EM2 mennyisége nagy mértékben tovább nőtt. Önmagában adott Ile-Pro-Ile mellett (Tyr-Pro nélkül) nem volt detektálható EM2. A szöveti mennyiségek mindvégig jelentősen alacsonyabbak maradtak a szervfürdőben mérhetőnél, ami felvetette egy extracelluláris képződés lehetőségét. Feltételeztük, hogy tartós gyulladással a C-rostok ingerlése révén modellezhetjük a gerincvelő hátsó szarvában is az in vitro kísérletek alapfeltételeit. Így hátsó végtagi talpbőrbe injektált carrageenan indukálta gyulladásos modellen vizsgáltuk az it. injektált DPP IV inhibitorok (Ile-Pro-Ile, vildagliptin) antihiperalgéziás hatását a mechanikus nociceptiv küszöböt vizsgálva Randall-Selitto módszerrel. Mindkét inhibitor antihiperalgéziás hatású volt, melyet gátolni lehetett koinjektált EM2 antiszérummal vagy sc. naloxon / naltrexon előkezeléssel. Emiatt a hatás opioid receptor mediáltnak és az EM2 képződés következményének tekinthető. Mivel nem volt szükség exogén bioszintetikus prekurzor fragmensek adására, amiatt feltételezhető, hogy azok endogénen megképződnek. A DPP IV inhibitorok antihiperalgéziás hatékonysága hasonló volt az azonos módon injektált EM2-höz. Az intrathecalisan injektált DPP IV inhibitorok teljesen hatástalanok voltak akut nociceptiv – patkány tail flick – teszten. Emiatt feltételezhető, hogy az endomorphin képződés szerepe eltér

az

akut

és

a

nem

akut

nociceptiv

57

információ

feldolgozásában.

9. Summary Since the discovery of the endomorphins (EM1: Tyr-Pro-Trp-Phe-NH2 and EM2: TyrPro-Phe-Phe-NH2) in 1997 they are claimed to serve as the selective endogenous agonists of the

-opioid receptors. They are highly selective but partial agonists, which is a rare property

among endogenous ligands. EM2 is the dominant endomorphin in CNS regions involved in the primary processing of nociceptive information. In acute nociceptive tests the potency of endomorphins is much lower than it would be expected from their in vitro potencies. Endomorphins are inactivated primarily by dipeptidyl peptidase IV enzyme. Neither the precursor protein(s) nor the genomic code(s) for them are identified as yet. Our group has proposed previously the possibility of a non-ribosomal, de novo biosynthetic pathway from di- and tripeptide fragments. We have also presumed that DPP IV might be causally involved in the biosynthesis, functioning as synthase. In the present experiments in rat isolated L4-L5 dorsal root ganglia I could demonstrate that the generation of immunoreactive EM2 was increased in the presence of high concentration of Tyr-Pro dipeptide. The addition of an inhibitor of the peptidase function of DPP IV, Ile-Pro-Ile, increased further EM2 generation in a depolarization-sensitive manner. In the presence of IlePro-Ile alone there was no detectable EM2. The tissue contents stayed far below the bath contents, which raised the possibility of an extracellular synthesis. We hypothesized that the activation of C-fibers by maintained inflammation may model the in vitro conditions in spinal dorsal horn in vivo. I tested the antihyperalgesic action of intrathecally injected DPP IV inhibitors (Ile-Pro-Ile, vildagliptin) in a hyperalgesic model created by intraplantar carrageenan injection and measuring the nociceptive threshold to pressure by the Randall-Selitto method. Both inhibitors exerted antihyperalgesic effect which could be antagonized by co-injection of EM2 antiserum or sc. naloxone/naltrexone pretreatment. Thus, the actions were opioid receptor-mediated and could be attributed to EM2 generation. Because the co-administration of biosynthetic precursor fragments was unnecessary, it was concluded that they must have been generated endogenously. The antihyperalgesic potencies of DPP IV inhibitors were similar to that of identically administered EM2. Intrathecally injected DPP IV inhibitors were completely ineffective in an acute nociceptive test, the rat tail flick assay. Thus, there are differences in the role of EM2 generation in spinal dorsal horn in acute- and non-acute nociceptive information processing.

58

Irodalomjegyzék: Abbadie, C., Lombard, M.C., Besson, J.M., Trafton, J.A., Basbaum, A.I., 2002. Mu and delta opioid receptor-like immunoreactivity in the cervical spinal cord of the rat after dorsal rhizotomy or neonatal capsaicin: an analysis of pre- and postsynaptic receptor distributions. Brain research 930, 150-162. Ahmad, S., Wang, L., Ward, P.E., 1992. Dipeptidyl(amino)peptidase IV and aminopeptidase M metabolize circulating substance P in vivo. J Pharmacol Exp Ther 260, 1257-1261. Al-Khrasani, M., Erdo, F., Szekely, J.I., Timar, J., Gyarmati, Z., Szemenyei, E., Toth, G., Kato, E., Ronai, A.Z., 2006. Analgesic effect of Tyr-Pro-releated peptides with or without EC 3.4.14.5 Inhibitor. Federation of European Biochemical Societies. FEBS Jurnal, Istanbul. Ali, Z., Wu, G., Kozlov, A., Barasi, S., 1996. The role of 5HT3 in nociceptive processing in the rat spinal cord: results from behavioural and electrophysiological studies. Neurosci Lett 208, 203-207. Arvidsson, U., Riedl, M., Chakrabarti, S., Lee, J.H., Nakano, A.H., Dado, R.J., Loh, H.H., Law, P.Y., Wessendorf, M.W., Elde, R., 1995. Distribution and targeting of a mu-opioid receptor (MOR1) in brain and spinal cord. J Neurosci 15, 3328-3341. Bar, K.J., Schurigt, U., Scholze, A., Segond Von Banchet, G., Stopfel, N., Brauer, R., Halbhuber, K.J., Schaible, H.G., 2004. The expression and localization of somatostatin receptors in dorsal root ganglion neurons of normal and monoarthritic rats. Neuroscience 127, 197-206. Basbaum, A.I., Bautista, D.M., Scherrer, G., Julius, D., 2009. Cellular and molecular mechanisms of pain. Cell 139, 267-284. Basbaum, A.I., Cruz, L., Weber, E., 1986. Immunoreactive dynorphin B in sacral primary afferent fibers of the cat. J Neurosci 6, 127-133. Bleakman, D., Alt, A., Nisenbaum, E.S., 2006. Glutamate receptors and pain. Seminars in cell & developmental biology 17, 592-604. Blessing, W.W., Oliver, J.R., Hodgson, A.H., Joh, T.H., Willoughby, J.O., 1987. Neuropeptide Y-like immunoreactive C1 neurons in the rostral ventrolateral medulla of the rabbit project to sympathetic preganglionic neurons in the spinal cord. Journal of the autonomic nervous system 18, 121-129. Bongers, J., Lambros, T., Ahmad, M., Heimer, E.P., 1992. Kinetics of dipeptidyl peptidase IV proteolysis of growth hormone-releasing factor and analogs. Biochimica et biophysica acta 1122, 147-153.

59

Botticelli, L.J., Cox, B.M., Goldstein, A., 1981. Immunoreactive dynorphin in mammalian spinal cord and dorsal root ganglia. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 78, 7783-7786. Brandsch, M., Ramamoorthy, S., Marczin, N., Catravas, J.D., Leibach, J.W., Ganapathy, V., Leibach, F.H., 1995. Regulation of taurine transport by Escherichia coli heat-stable enterotoxin and guanylin in human intestinal cell lines. The Journal of clinical investigation 96, 361-369. Brantl, V., Gramsch, C., Lottspeich, F., Henschen, A., Jaeger, K.H., Herz, A., 1985. Novel opioid peptides derived from mitochondrial cytochrome b: cytochrophins. Eur J Pharmacol 111, 293-294. Brantl, V., Gramsch, C., Lottspeich, F., Mertz, R., Jaeger, K.H., Herz, A., 1986. Novel opioid peptides derived from hemoglobin: hemorphins. Eur J Pharmacol 125, 309-310. Calignano, A., La Rana, G., Giuffrida, A., Piomelli, D., 1998. Control of pain initiation by endogenous cannabinoids. Nature 394, 277-281. Chan-Palay, V., Palay, S.L., 1977. Immunocytochemical identification of substance P cells and their processes in rat sensory ganglia and their terminals in the spinal cord: light microscopic studies. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 3597-3601. Chen, J.C., Tao, P.L., Li, J.Y., Wong, C.H., Huang, E.Y., 2003. Endomorphin-1 and -2 induce naloxone-precipitated withdrawal syndromes in rats. Peptides 24, 477-481. Chen, Y., Mestek, A., Liu, J., Hurley, J.A., Yu, L., 1993. Molecular cloning and functional expression of a mu-opioid receptor from rat brain. Mol Pharmacol 44, 8-12. Chiu, S., Wong, Y.W., Wan, Y.P., Chiu, P., Mishra, R.K., 1983. Are the pharmacological effects of L-prolyl-L-leucyl-glycinamide (PLG) mediated through specific receptor mechanisms? Progress in neuro-psychopharmacology & biological psychiatry 7, 739-742. Clapes, P., Torres, J.L., Adlercreutz, P., 1995. Enzymatic peptide synthesis in low water content systems: preparative enzymatic synthesis of [Leu]- and [Met]-enkephalin derivatives. Bioorganic & medicinal chemistry 3, 245-255. Cox, B.M., Goldstein, A., Hi, C.H., 1976. Opioid activity of a peptide, beta-lipotropin-(6191), derived from beta-lipotropin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 73, 1821-1823. D'Amour, F.E., Smith, D.L., 1941. A method for determining loss of Pain Sensation. J Pharmacol Exp Ther 72.

60

D'Mello, R., Dickenson, A.H., 2008. Spinal cord mechanisms of pain. British journal of anaesthesia 101, 8-16. David, F., Bernard, A.M., Pierres, M., Marguet, D., 1993. Identification of serine 624, aspartic acid 702, and histidine 734 as the catalytic triad residues of mouse dipeptidylpeptidase IV (CD26). A member of a novel family of nonclassical serine hydrolases. The Journal of biological chemistry 268, 17247-17252. Day, A.R., Freer, R.J., Liao, C.S., 1981. Morphiceptin ( beta-casomorphin (1-4) amide): a peptide opioid antagonist in the field stimulated rat vas deferens. Research communications in chemical pathology and pharmacology 34, 543-546. Deacon, C.F., Johnsen, A.H., Holst, J.J., 1995. Degradation of glucagon-like peptide-1 by human plasma in vitro yields an N-terminally truncated peptide that is a major endogenous metabolite in vivo. The Journal of clinical endocrinology and metabolism 80, 952-957. Drower, E.J., Stapelfeld, A., Rafferty, M.F., de Costa, B.R., Rice, K.C., Hammond, D.L., 1991. Selective antagonism by naltrindole of the antinociceptive effects of the delta opioid agonist cyclic[D-penicillamine2-D-penicillamine5]enkephalin in the rat. J Pharmacol Exp Ther 259, 725-731. Eberhardt, M., Hoffmann, T., Sauer, S.K., Messlinger, K., Reeh, P.W., Fischer, M.J., 2008. Calcitonin gene-related peptide release from intact isolated dorsal root and trigeminal ganglia. Neuropeptides 42, 311-317. Egleton, R.D., Mitchell, S.A., Huber, J.D., Palian, M.M., Polt, R., Davis, T.P., 2001. Improved blood-brain barrier penetration and enhanced analgesia of an opioid peptide by glycosylation. J Pharmacol Exp Ther 299, 967-972. Eipper, B.A., Mains, R.E., Glembotski, C.C., 1983. Identification in pituitary tissue of a peptide alpha-amidation activity that acts on glycine-extended peptides and requires molecular oxygen, copper, and ascorbic acid. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 80, 5144-5148. Erchegyi, J., Kastin, A.J., Zadina, J.E., 1992. Isolation of a novel tetrapeptide with opiate and antiopiate activity from human brain cortex: Tyr-Pro-Trp-Gly-NH2 (Tyr-W-MIF-1). Peptides 13, 623-631. Evans, C.J., Keith, D.E., Jr., Morrison, H., Magendzo, K., Edwards, R.H., 1992. Cloning of a delta opioid receptor by functional expression. Science (New York, N.Y 258, 1952-1955. Fairbanks, C.A., Stone, L.S., Kitto, K.F., Nguyen, H.O., Posthumus, I.J., Wilcox, G.L., 2002. alpha(2C)-Adrenergic receptors mediate spinal analgesia and adrenergic-opioid synergy. J Pharmacol Exp Ther 300, 282-290. 61

Fisher, A., Mann, A., Verma, V., Thomas, N., Mishra, R.K., Johnson, R.L., 2006. Design and synthesis of photoaffinity-labeling ligands of the L-prolyl-L-leucylglycinamide binding site involved in the allosteric modulation of the dopamine receptor. J Med Chem 49, 307-317. Fisher, K., Coderre, T.J., 1996. The contribution of metabotropic glutamate receptors (mGluRs) to formalin-induced nociception. Pain 68, 255-263. Fujiwara, T., Tsuji, E., Misumi, Y., Takami, N., Ikehara, Y., 1992. Selective cell-surface expression of dipeptidyl peptidase IV with mutations at the active site sequence. Biochemical and biophysical research communications 185, 776-784. Garland, A., Necheles, J., White, S.R., Neeley, S.P., Leff, A.R., Carson, S.S., Alger, L.E., McAllister, K., Solway, J., 1997. Activated eosinophils elicit substance P release from cultured dorsal root ganglion neurons. The American journal of physiology 273, L1096-1102. Garry, M.G., Hargreaves, K.M., 1992. Enhanced release of immunoreactive CGRP and substance P from spinal dorsal horn slices occurs during carrageenan inflammation. Brain research 582, 139-142. Gerald, C., Walker, M.W., Criscione, L., Gustafson, E.L., Batzl-Hartmann, C., Smith, K.E., Vaysse, P., Durkin, M.M., Laz, T.M., Linemeyer, D.L., Schaffhauser, A.O., Whitebread, S., Hofbauer, K.G., Taber, R.I., Branchek, T.A., Weinshank, R.L., 1996. A receptor subtype involved in neuropeptide-Y-induced food intake. Nature 382, 168-171. Gibson, S.J., Polak, J.M., Bloom, S.R., Sabate, I.M., Mulderry, P.M., Ghatei, M.A., McGregor, G.P., Morrison, J.F., Kelly, J.S., Evans, R.M., et al., 1984. Calcitonin gene-related peptide immunoreactivity in the spinal cord of man and of eight other species. J Neurosci 4, 3101-3111. Gilbert, P.E., Martin, W.R., 1976. The effects of morphine and nalorphine-like drugs in the nondependent, morphine-dependent and cyclazocine-dependent chronic spinal dog. J Pharmacol Exp Ther 198, 66-82. Goldberg, I.E., Rossi, G.C., Letchworth, S.R., Mathis, J.P., Ryan-Moro, J., Leventhal, L., Su, W., Emmel, D., Bolan, E.A., Pasternak, G.W., 1998. Pharmacological characterization of endomorphin-1 and endomorphin-2 in mouse brain. J Pharmacol Exp Ther 286, 1007-1013. Goldstein, A., Tachibana, S., Lowney, L.I., Hunkapiller, M., Hood, L., 1979. Dynorphin-(113), an extraordinarily potent opioid peptide. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 76, 6666-6670. Greenwell, T.N., Martin-Schild, S., Inglis, F.M., Zadina, J.E., 2007. Colocalization and shared distribution of endomorphins with substance P, calcitonin gene-related peptide, gamma-

62

aminobutyric acid, and the mu opioid receptor. The Journal of comparative neurology 503, 319-333. Guieu, R., Fenouillet, E., Devaux, C., Fajloun, Z., Carrega, L., Sabatier, J.M., Sauze, N., Marguet, D., 2006. CD26 modulates nociception in mice via its dipeptidyl-peptidase IV activity. Behavioural brain research 166, 230-235. Guo, T.Z., Davies, M.F., Kingery, W.S., Patterson, A.J., Limbird, L.E., Maze, M., 1999. Nitrous oxide produces antinociceptive response via alpha2B and/or alpha2C adrenoceptor subtypes in mice. Anesthesiology 90, 470-476. Hackler, L., Kastin, A.J., Erchegyi, J., Zadina, J.E., 1993. Isolation of Tyr-W-MIF-1 from bovine hypothalami. Neuropeptides 24, 159-164. Hackler, L., Zadina, J.E., Ge, L.J., Kastin, A.J., 1997. Isolation of relatively large amounts of endomorphin-1 and endomorphin-2 from human brain cortex. Peptides 18, 1635-1639. Hahn, E.F., Carroll-Buatti, M., Pasternak, G.W., 1982. Irreversible opiate agonists and antagonists: the 14-hydroxydihydromorphinone azines. J Neurosci 2, 572-576. Hansler, M., Ullmann, G., Jakubke, H.D., 1995. The application of papain, ficin and clostripain in kinetically controlled peptide synthesis in frozen aqueous solutions. J Pept Sci 1, 283-287. Heinke, B., Gingl, E., Sandkuhler, J., 2011. Multiple targets of mu-opioid receptor-mediated presynaptic inhibition at primary afferent Adelta- and C-fibers. J Neurosci 31, 1313-1322. Helyes, Z., Pinter, E., Sandor, K., Elekes, K., Banvolgyi, A., Keszthelyi, D., Szoke, E., Toth, D.M., Sandor, Z., Kereskai, L., Pozsgai, G., Allen, J.P., Emson, P.C., Markovics, A., Szolcsanyi, J., 2009. Impaired defense mechanism against inflammation, hyperalgesia, and airway hyperreactivity in somatostatin 4 receptor gene-deleted mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 106, 13088-13093. Henschen, A., Lottspeich, F., Brantl, V., Teschemacher, H., 1979. Novel opioid peptides derived from casein (beta-casomorphins). II. Structure of active components from bovine casein peptone. Hoppe-Seyler's Zeitschrift fur physiologische Chemie 360, 1217-1224. Heymann, E., Mentlein, R., 1978. Liver dipeptidyl aminopeptidase IV hydrolyzes substance P. FEBS letters 91, 360-364. Hokfelt, T., Elde, R., Johansson, O., Luft, R., Nilsson, G., Arimura, A., 1976. Immunohistochemical evidence for separate populations of somatostatin-containing and substance P-containing primary afferent neurons in the rat. Neuroscience 1, 131-136.

63

Honor, P., Menning, P.M., Rogers, S.D., Nichols, M.L., Basbaum, A.I., Besson, J.M., Mantyh, P.W., 1999. Spinal substance P receptor expression and internalization in acute, short-term, and long-term inflammatory pain states. J Neurosci 19, 7670-7678. Hopsu-Havu, V.K., Glenner, G.G., 1966. A new dipeptide naphthylamidase hydrolyzing glycyl-prolyl-beta-naphthylamide. Histochemie. Histochemistry 7, 197-201. Horvath, A., Kastin, A.J., 1989. Isolation of tyrosine-melanocyte-stimulating hormone release-inhibiting factor 1 from bovine brain tissue. The Journal of biological chemistry 264, 2175-2179. Horvath, G., Szikszay, M., Tomboly, C., Benedek, G., 1999. Antinociceptive effects of intrathecal endomorphin-1 and -2 in rats. Life Sci 65, 2635-2641. Hosohata, K., Burkey, T.H., Alfaro-Lopez, J., Varga, E., Hruby, V.J., Roeske, W.R., Yamamura, H.I., 1998. Endomorphin-1 and endomorphin-2 are partial agonists at the human mu-opioid receptor. Eur J Pharmacol 346, 111-114. Huang, E.Y., Chen, C.M., Tao, P.L., 2004. Supraspinal anti-allodynic and rewarding effects of endomorphins in rats. Peptides 25, 577-583. Huang, L.Y., Neher, E., 1996. Ca(2+)-dependent exocytosis in the somata of dorsal root ganglion neurons. Neuron 17, 135-145. Hughes, J., Smith, T.W., Kosterlitz, H.W., Fothergill, L.A., Morgan, B.A., Morris, H.R., 1975. Identification of two related pentapeptides from the brain with potent opiate agonist activity. Nature 258, 577-580. Hui, R., Wang, W., Chen, T., Lu, B.C., Li, H., Zhang, T., Wu, S.X., Li, Y.Q., 2010. Origins of endomorphin-2 immunopositive fibers and terminals in the spinal dorsal horn of the rat. Neuroscience 169, 422-430. Hung, K.C., Wu, H.E., Mizoguchi, H., Tseng, L.F., 2002. Acute antinociceptive tolerance and unidirectional cross-tolerance to endomorphin-1 and endomorphin-2 given intraventricularly in the rat. Eur J Pharmacol 448, 169-174. Jackman, H.L., Tan, F., Schraufnagel, D., Dragovic, T., Dezso, B., Becker, R.P., Erdos, E.G., 1995. Plasma membrane-bound and lysosomal peptidases in human alveolar macrophages. American journal of respiratory cell and molecular biology 13, 196-204. Janecka, A., Staniszewska, R., Gach, K., Fichna, J., 2008. Enzymatic degradation of endomorphins. Peptides 29, 2066-2073. Kajander, K.C., Sahara, Y., Iadarola, M.J., Bennett, G.J., 1990. Dynorphin increases in the dorsal spinal cord in rats with a painful peripheral neuropathy. Peptides 11, 719-728.

64

Kakidani, H., Furutani, Y., Takahashi, H., Noda, M., Morimoto, Y., Hirose, T., Asai, M., Inayama, S., Nakanishi, S., Numa, S., 1982. Cloning and sequence analysis of cDNA for porcine beta-neo-endorphin/dynorphin precursor. Nature 298, 245-249. Kangawa, K., Matsuo, H., 1979. alpha-Neo-endorphin : a "big" Leu-enkephalin with potent opiate activity from porcine hypothalami. Biochemical and biophysical research communications 86, 153-160. Kemp, T., Spike, R.C., Watt, C., Todd, A.J., 1996. The mu-opioid receptor (MOR1) is mainly restricted to neurons that do not contain GABA or glycine in the superficial dorsal horn of the rat spinal cord. Neuroscience 75, 1231-1238. Kerr, R.C., Maxwell, D.J., Todd, A.J., 1998. GluR1 and GluR2/3 subunits of the AMPA-type glutamate receptor are associated with particular types of neurone in laminae I-III of the spinal dorsal horn of the rat. Eur J Neurosci 10, 324-333. Kieffer, B.L., Befort, K., Gaveriaux-Ruff, C., Hirth, C.G., 1992. The delta-opioid receptor: isolation of a cDNA by expression cloning and pharmacological characterization. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 89, 12048-12052. Kieffer, T.J., McIntosh, C.H., Pederson, R.A., 1995. Degradation of glucose-dependent insulinotropic polypeptide and truncated glucagon-like peptide 1 in vitro and in vivo by dipeptidyl peptidase IV. Endocrinology 136, 3585-3596. Kirby, M., Yu, D.M., O'Connor, S., Gorrell, M.D., 2010. Inhibitor selectivity in the clinical application of dipeptidyl peptidase-4 inhibition. Clin Sci (Lond) 118, 31-41. Kozsurek, M., Lukacsi, E., Fekete, C., Wittmann, G., Rethelyi, M., Puskar, Z., 2007. Cocaineand amphetamine-regulated transcript peptide (CART) is present in peptidergic C primary afferents and axons of excitatory interneurons with a possible role in nociception in the superficial laminae of the rat spinal cord. Eur J Neurosci 26, 1624-1631. Labuz, D., Przewlocki, R., Przewlocka, B., 2002. Cross-tolerance between the different muopioid receptor agonists endomorphin-1, endomorphin-2 and morphine at the spinal level in the rat. Neurosci Lett 334, 127-130. Lazarus, L.H., Ling, N., Guillemin, R., 1976. beta-Lipotropin as a prohormone for the morphinomimetic peptides endorphins and enkephalins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 73, 2156-2159. Li, C.H., Barnafi, L., Chretien, M., Chung, D., 1965. Isolation and amino-acid sequence of beta-LPH from sheep pituitary glands. Nature 208, 1093-1094. Li, C.H., Lemaire, S., Yamashiro, D., Doneen, B.A., 1976. The synthesis and opiate activity of beta-endorphin. Biochemical and biophysical research communications 71, 19-25. 65

Lisi, T.L., Sluka, K.A., 2006. A new electrochemical HPLC method for analysis of enkephalins and endomorphins. Journal of neuroscience methods 150, 74-79. Lojda, Z., 1979. Studies on dipeptidyl(amino)peptidase IV (glycyl-proline naphthylamidase). II. Blood vessels. Histochemistry 59, 153-166. Lord, J.A., Waterfield, A.A., Hughes, J., Kosterlitz, H.W., 1977. Endogenous opioid peptides: multiple agonists and receptors. Nature 267, 495-499. Mains, R.E., Eipper, B.A., Ling, N., 1977. Common precursor to corticotropins and endorphins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 3014-3018. Marguet, D., Baggio, L., Kobayashi, T., Bernard, A.M., Pierres, M., Nielsen, P.F., Ribel, U., Watanabe, T., Drucker, D.J., Wagtmann, N., 2000. Enhanced insulin secretion and improved glucose tolerance in mice lacking CD26. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 97, 6874-6879. Marker, C.L., Lujan, R., Loh, H.H., Wickman, K., 2005. Spinal G-protein-gated potassium channels contribute in a dose-dependent manner to the analgesic effect of mu- and delta- but not kappa-opioids. J Neurosci 25, 3551-3559. Marley, E., Poole, S., Stephenson, J.D., 1977. Prostaglandins and the central nervous system. Postgraduate medical journal 53, 649-651. Martin-Schild, S., Gerall, A.A., Kastin, A.J., Zadina, J.E., 1998. Endomorphin-2 is an endogenous opioid in primary sensory afferent fibers. Peptides 19, 1783-1789. Martin-Schild, S., Gerall, A.A., Kastin, A.J., Zadina, J.E., 1999. Differential distribution of endomorphin 1- and endomorphin 2-like immunoreactivities in the CNS of the rodent. The Journal of comparative neurology 405, 450-471. Martin-Schild, S., Zadina, J.E., Gerall, A.A., Vigh, S., Kastin, A.J., 1997. Localization of endomorphin-2-like immunoreactivity in the rat medulla and spinal cord. Peptides 18, 16411649. Martin, R.A., Cleary, D.L., Guido, D.M., Zurcher-Neely, H.A., Kubiak, T.M., 1993. Dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) from pig kidney cleaves analogs of bovine growth hormone-releasing factor (bGRF) modified at position 2 with Ser, Thr or Val. Extended DPPIV substrate specificity? Biochimica et biophysica acta 1164, 252-260. Martin, W.R., Eades, C.G., Thompson, J.A., Huppler, R.E., Gilbert, P.E., 1976. The effects of morphine- and nalorphine- like drugs in the nondependent and morphine-dependent chronic spinal dog. J Pharmacol Exp Ther 197, 517-532.

66

Marvizon, J.C., Chen, W., Murphy, N., 2009. Enkephalins, dynorphins, and beta-endorphin in the rat dorsal horn: an immunofluorescence colocalization study. The Journal of comparative neurology 517, 51-68. McConalogue, K., Grady, E.F., Minnis, J., Balestra, B., Tonini, M., Brecha, N.C., Bunnett, N.W., Sternini, C., 1999. Activation and internalization of the mu-opioid receptor by the newly discovered endogenous agonists, endomorphin-1 and endomorphin-2. Neuroscience 90, 1051-1059. Mentlein, R., 1999. Dipeptidyl-peptidase IV (CD26)--role in the inactivation of regulatory peptides. Regulatory peptides 85, 9-24. Mentlein, R., Dahms, P., Grandt, D., Kruger, R., 1993a. Proteolytic processing of neuropeptide Y and peptide YY by dipeptidyl peptidase IV. Regulatory peptides 49, 133-144. Mentlein, R., Gallwitz, B., Schmidt, W.E., 1993b. Dipeptidyl-peptidase IV hydrolyses gastric inhibitory polypeptide, glucagon-like peptide-1(7-36)amide, peptide histidine methionine and is responsible for their degradation in human serum. European journal of biochemistry / FEBS 214, 829-835. Mentlein, R., Heymann, E., Scholz, W., Feller, A.C., Flad, H.D., 1984. Dipeptidyl peptidase IV as a new surface marker for a subpopulation of human T-lymphocytes. Cellular immunology 89, 11-19. Mestre, C., Pelissier, T., Fialip, J., Wilcox, G., Eschalier, A., 1994. A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats. Journal of pharmacological and toxicological methods 32, 197-200. Millan, M.J., Seguin, L., Honore, P., Girardon, S., Bervoets, K., 1996. Pro- and antinociceptive actions of serotonin (5-HT)1A agonists and antagonists in rodents: relationship to algesiometric paradigm. Behavioural brain research 73, 69-77. Mitro, A., Lojda, Z., 1988. Histochemistry of proteases in ependyma, choroid plexus and leptomeninges. Histochemistry 88, 645-646. Mizoguchi, H., Narita, M., Oji, D.E., Suganuma, C., Nagase, H., Sora, I., Uhl, G.R., Cheng, E.Y., Tseng, L.F., 1999. The mu-opioid receptor gene-dose dependent reductions in G-protein activation in the pons/medulla and antinociception induced by endomorphins in mu-opioid receptor knockout mice. Neuroscience 94, 203-207. Mollereau, C., Parmentier, M., Mailleux, P., Butour, J.L., Moisand, C., Chalon, P., Caput, D., Vassart, G., Meunier, J.C., 1994. ORL1, a novel member of the opioid receptor family. Cloning, functional expression and localization. FEBS letters 341, 33-38.

67

Monory, K., Bourin, M.C., Spetea, M., Tomboly, C., Toth, G., Matthes, H.W., Kieffer, B.L., Hanoune, J., Borsodi, A., 2000. Specific activation of the mu opioid receptor (MOR) by endomorphin 1 and endomorphin 2. Eur J Neurosci 12, 577-584. Moore, K.B., Saudek, C.D., 2008. Therapeutic potential of dipeptidyl peptidase-IV inhibitors in patients with diabetes mellitus. American journal of therapeutics 15, 484-491. Mussap, C.J., Geraghty, D.P., Burcher, E., 1993. Tachykinin receptors: a radioligand binding perspective. Journal of neurochemistry 60, 1987-2009. Nagy, G.G., Watanabe, M., Fukaya, M., Todd, A.J., 2004. Synaptic distribution of the NR1, NR2A and NR2B subunits of the N-methyl-d-aspartate receptor in the rat lumbar spinal cord revealed with an antigen-unmasking technique. Eur J Neurosci 20, 3301-3312. Nair, R.M., Kastin, A.J., Schally, A.V., 1971. Isolation and structure of hypothalamic MSH release-inhibition hormone. Biochemical and biophysical research communications 43, 13761381. Nakanishi, S., Teranishi, Y., Watanabe, Y., Notake, M., Noda, M., Kakidani, H., Jingami, H., Numa, S., 1981. Isolation and characterization of the bovine corticotropin/beta-lipotropin precursor gene. European journal of biochemistry / FEBS 115, 429-438. Narita, M., Mizoguchi, H., Oji, G.S., Tseng, E.L., Suganuma, C., Nagase, H., Tseng, L.F., 1998. Characterization of endomorphin-1 and -2 on [35S]GTPgammaS binding in the mouse spinal cord. Eur J Pharmacol 351, 383-387. Narita, M., Ozaki, S., Ioka, M., Mizoguchi, H., Nagase, H., Tseng, L.F., Suzuki, T., 2001a. Different motivational effects induced by the endogenous mu-opioid receptor ligands endomorphin-1 and -2 in the mouse. Neuroscience 105, 213-218. Narita, M., Ozaki, S., Ioka, M., Mizoguchi, H., Nagase, H., Tseng, L.F., Suzuki, T., 2001b. Lack of the involvement of mu1-opioid receptor subtype on motivational effects induced by the endogenous mu-opioid receptor ligands endomorphin-1 and -2 in the mouse. Neurosci Lett 308, 17-20. Nausch, I., Mentlein, R., Heymann, E., 1990. The degradation of bioactive peptides and proteins by dipeptidyl peptidase IV from human placenta. Biological chemistry Hoppe-Seyler 371, 1113-1118. Negri, L., Lattanzi, R., Tabacco, F., Scolaro, B., Rocchi, R., 1998. Glycodermorphins: opioid peptides with potent and prolonged analgesic activity and enhanced blood-brain barrier penetration. Br J Pharmacol 124, 1516-1522. Nishimura, S.L., Recht, L.D., Pasternak, G.W., 1984. Biochemical characterization of highaffinity 3H-opioid binding. Further evidence for Mu1 sites. Mol Pharmacol 25, 29-37. 68

Niu, L., Chen, T., Wang, Y.Y., Li, Y.Q., 2009. Neurochemical phenotypes of endomorphin-2containing neurons in vagal nodose neurons of the adult rat. Neurochemistry international 55, 542-551. Noda, M., Furutani, Y., Takahashi, H., Toyosato, M., Hirose, T., Inayama, S., Nakanishi, S., Numa, S., 1982a. Cloning and sequence analysis of cDNA for bovine adrenal preproenkephalin. Nature 295, 202-206. Noda, M., Teranishi, Y., Takahashi, H., Toyosato, M., Notake, M., Nakanishi, S., Numa, S., 1982b. Isolation and structural organization of the human preproenkephalin gene. Nature 297, 431-434. Ohsawa, M., Mizoguchi, H., Narita, M., Chu, M., Nagase, H., Tseng, L.F., 2000. Differential mechanisms mediating descending pain controls for antinociception induced by supraspinally administered endomorphin-1 and endomorphin-2 in the mouse. J Pharmacol Exp Ther 294, 1106-1111. Pan, L., Xu, J., Yu, R., Xu, M.M., Pan, Y.X., Pasternak, G.W., 2005a. Identification and characterization of six new alternatively spliced variants of the human mu opioid receptor gene, Oprm. Neuroscience 133, 209-220. Pan, W., Kastin, A.J., 2007. From MIF-1 to endomorphin: the Tyr-MIF-1 family of peptides. Peptides 28, 2411-2434. Pan, Y.X., Xu, J., Bolan, E., Abbadie, C., Chang, A., Zuckerman, A., Rossi, G., Pasternak, G.W., 1999. Identification and characterization of three new alternatively spliced mu-opioid receptor isoforms. Mol Pharmacol 56, 396-403. Pan, Y.X., Xu, J., Bolan, E., Moskowitz, H.S., Xu, M., Pasternak, G.W., 2005b. Identification of four novel exon 5 splice variants of the mouse mu-opioid receptor gene: functional consequences of C-terminal splicing. Mol Pharmacol 68, 866-875. Pasternak, G.W., Hahn, E.F., 1980. Long-acting opiate agonists and antagonists: 14hydroxydihydromorphinone hydrazones. J Med Chem 23, 674-676. Pierce, T.L., Grahek, M.D., Wessendorf, M.W., 1998. Immunoreactivity for endomorphin-2 occurs in primary afferents in rats and monkey. Neuroreport 9, 385-389. Polgar, E., Shehab, S.A., Watt, C., Todd, A.J., 1999. GABAergic neurons that contain neuropeptide Y selectively target cells with the neurokinin 1 receptor in laminae III and IV of the rat spinal cord. J Neurosci 19, 2637-2646. Polgar, E., Watanabe, M., Hartmann, B., Grant, S.G., Todd, A.J., 2008. Expression of AMPA receptor subunits at synapses in laminae I-III of the rodent spinal dorsal horn. Molecular pain 4, 5. 69

Przewlocka, B., Mika, J., Labuz, D., Toth, G., Przewlocki, R., 1999. Spinal analgesic action of endomorphins in acute, inflammatory and neuropathic pain in rats. Eur J Pharmacol 367, 189-196. Przewlocki, R., Labuz, D., Mika, J., Przewlocka, B., Tomboly, C., Toth, G., 1999. Pain inhibition by endomorphins. Annals of the New York Academy of Sciences 897, 154-164. Puschel, G., Mentlein, R., Heymann, E., 1982. Isolation and characterization of dipeptidyl peptidase IV from human placenta. European journal of biochemistry / FEBS 126, 359-365. Rahfeld, J., Schierhorn, M., Hartrodt, B., Neubert, K., Heins, J., 1991. Are diprotin A (IlePro-Ile) and diprotin B (Val-Pro-Leu) inhibitors or substrates of dipeptidyl peptidase IV? Biochimica et biophysica acta 1076, 314-316. Randall, L.O., Selitto, J.J., 1957. A method for measurement of analgesic activity on inflamed tissue. Archives internationales de pharmacodynamie et de therapie 111, 409-419. Reinscheid, R.K., Nothacker, H.P., Bourson, A., Ardati, A., Henningsen, R.A., Bunzow, J.R., Grandy, D.K., Langen, H., Monsma, F.J., Jr., Civelli, O., 1995. Orphanin FQ: a neuropeptide that activates an opioidlike G protein-coupled receptor. Science (New York, N.Y 270, 792794. Rexed, B., 1952. The cytoarchitectonic organization of the spinal cord in the cat. The Journal of comparative neurology 96, 414-495. Richardt, A., Kemme, T., Wagner, S., Schwarzer, D., Marahiel, M.A., Hovemann, B.T., 2003. Ebony, a novel nonribosomal peptide synthetase for beta-alanine conjugation with biogenic amines in Drosophila. The Journal of biological chemistry 278, 41160-41166. Richter, B., Bandeira-Echtler, E., Bergerhoff, K., Lerch, C., 2008. Emerging role of dipeptidyl peptidase-4 inhibitors in the management of type 2 diabetes. Vascular health and risk management 4, 753-768. Robertson, B., Grant, G., 1985. A comparison between wheat germ agglutinin-and choleragenoid-horseradish peroxidase as anterogradely transported markers in central branches of primary sensory neurones in the rat with some observations in the cat. Neuroscience 14, 895-905. Ronai, A.Z., Szemenyei, E., Kato, E., Kocsis, L., Orosz, G., Al-Khrasani, M., Toth, G., 2006. Endomorphin synthesis in rat brain from intracerebroventricularly injected [3H]-Tyr-Pro: a possible biosynthetic route for endomorphins. Regulatory peptides 134, 54-60. Ronai, A.Z., Timar, J., Mako, E., Erdo, F., Gyarmati, Z., Toth, G., Orosz, G., Furst, S., Szekely, J.I., 1999. Diprotin A, an inhibitor of dipeptidyl aminopeptidase IV(EC 3.4.14.5) produces naloxone-reversible analgesia in rats. Life Sci 64, 145-152. 70

Rossi, G.C., Leventhal, L., Pan, Y.X., Cole, J., Su, W., Bodnar, R.J., Pasternak, G.W., 1997. Antisense mapping of MOR-1 in rats: distinguishing between morphine and morphine-6betaglucuronide antinociception. J Pharmacol Exp Ther 281, 109-114. Rossi, G.C., Pan, Y.X., Brown, G.P., Pasternak, G.W., 1995. Antisense mapping the MOR-1 opioid receptor: evidence for alternative splicing and a novel morphine-6 beta-glucuronide receptor. FEBS letters 369, 192-196. Roumy, M., Zajac, J.M., 1998. Neuropeptide FF, pain and analgesia. Eur J Pharmacol 345, 111. Russell, J.S., Chi, H., Lantry, L.E., Stephens, R.E., Ward, P.E., 1996. Substance P and neurokinin A metabolism by cultured human skeletal muscle myocytes and fibroblasts. Peptides 17, 1397-1403. Sakurada, C., Sakurada, S., Hayashi, T., Katsuyama, S., Tan-No, K., Sakurada, T., 2003. Degradation of endomorphin-2 at the supraspinal level in mice is initiated by dipeptidyl peptidase IV: an in vitro and in vivo study. Biochemical pharmacology 66, 653-661. Sakurada, S., Hayashi, T., Yuhki, M., Orito, T., Zadina, J.E., Kastin, A.J., Fujimura, T., Murayama, K., Sakurada, C., Sakurada, T., Narita, M., Suzuki, T., Tan-no, K., Tseng, L.F., 2001. Differential antinociceptive effects induced by intrathecally administered endomorphin1 and endomorphin-2 in the mouse. European journal of pharmacology 427, 203-210. Sakurada, S., Zadina, J.E., Kastin, A.J., Katsuyama, S., Fujimura, T., Murayama, K., Yuki, M., Ueda, H., Sakurada, T., 1999. Differential involvement of mu-opioid receptor subtypes in endomorphin-1- and -2-induced antinociception. Eur J Pharmacol 372, 25-30. Sanchez-Blazquez, P., Rodriguez-Diaz, M., DeAntonio, I., Garzon, J., 1999. Endomorphin-1 and endomorphin-2 show differences in their activation of mu opioid receptor-regulated G proteins in supraspinal antinociception in mice. J Pharmacol Exp Ther 291, 12-18. Sanderson Nydahl, K., Skinner, K., Julius, D., Basbaum, A.I., 2004. Co-localization of endomorphin-2 and substance P in primary afferent nociceptors and effects of injury: a light and electron microscopic study in the rat. Eur J Neurosci 19, 1789-1799. Sandkuhler, J., 2009. Models and mechanisms of hyperalgesia and allodynia. Physiological reviews 89, 707-758. Sartania, N., Benyhe, S., Magyar, A., Ronai, A.Z., Medzihradszky, K., Borsodi, A., 1996. Opioid binding profile of morphiceptin, Tyr-MIF-1 and dynorphin-related peptides in rat brain membranes. Neuropeptides 30, 225-230. Satoh, M., Minami, M., 1995. Molecular pharmacology of the opioid receptors. Pharmacology & therapeutics 68, 343-364. 71

Sawynok, J., Reid, A., 1996. Interactions of descending serotonergic systems with other neurotransmitters in the modulation of nociception. Behavioural brain research 73, 63-68. Scanlin, H.L., Carroll, E.A., Jenkins, V.K., Balkowiec, A., 2008. Endomorphin-2 is released from newborn rat primary sensory neurons in a frequency- and calcium-dependent manner. Eur J Neurosci 27, 2629-2642. Schafer, M., Imai, Y., Uhl, G.R., Stein, C., 1995. Inflammation enhances peripheral muopioid receptor-mediated analgesia, but not mu-opioid receptor transcription in dorsal root ganglia. Eur J Pharmacol 279, 165-169. Scherrer, G., Imamachi, N., Cao, Y.Q., Contet, C., Mennicken, F., O'Donnell, D., Kieffer, B.L., Basbaum, A.I., 2009. Dissociation of the opioid receptor mechanisms that control mechanical and heat pain. Cell 137, 1148-1159. Schreff, M., Schulz, S., Wiborny, D., Hollt, V., 1998. Immunofluorescent identification of endomorphin-2-containing nerve fibers and terminals in the rat brain and spinal cord. Neuroreport 9, 1031-1034. Schulz, R., Eisinger, D.A., Wehmeyer, A., 2004. Opioid control of MAP kinase cascade. Eur J Pharmacol 500, 487-497. Schuster, M., Aaviksaar, A., Haga, M., Ullmann, U., Jakubke, H.D., 1991. Protease-catalyzed peptide synthesis in frozen aqueous systems: the "freeze-concentration model". Biomedica biochimica acta 50, S84-89. Shane, R., Wilk, S., Bodnar, R.J., 1999. Modulation of endomorphin-2-induced analgesia by dipeptidyl peptidase IV. Brain research 815, 278-286. Silverman, J.D., Kruger, L., 1988. Lectin and neuropeptide labeling of separate populations of dorsal root ganglion neurons and associated "nociceptor" thin axons in rat testis and cornea whole-mount preparations. Somatosensory research 5, 259-267. Sim, L.J., Liu, Q., Childers, S.R., Selley, D.E., 1998. Endomorphin-stimulated [35S]GTPgammaS binding in rat brain: evidence for partial agonist activity at mu-opioid receptors. Journal of neurochemistry 70, 1567-1576. Skofitsch, G., Jacobowitz, D.M., 1985. Galanin-like immunoreactivity in capsaicin sensitive sensory neurons and ganglia. Brain Res Bull 15, 191-195. Spetea, M., Monory, K., Tomboly, C., Toth, G., Tzavara, E., Benyhe, S., Hanoune, J., Borsodi, A., 1998. In vitro binding and signaling profile of the novel mu opioid receptor agonist endomorphin 2 in rat brain membranes. Biochemical and biophysical research communications 250, 720-725.

72

Spike, R.C., Puskar, Z., Andrew, D., Todd, A.J., 2003. A quantitative and morphological study of projection neurons in lamina I of the rat lumbar spinal cord. Eur J Neurosci 18, 24332448. Stefano, G.B., Digenis, A., Spector, S., Leung, M.K., Bilfinger, T.V., Makman, M.H., Scharrer, B., Abumrad, N.N., 1993. Opiate-like substances in an invertebrate, an opiate receptor on invertebrate and human immunocytes, and a role in immunosuppression. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, 1109911103. Stone, L.S., Fairbanks, C.A., Laughlin, T.M., Nguyen, H.O., Bushy, T.M., Wessendorf, M.W., Wilcox, G.L., 1997. Spinal analgesic actions of the new endogenous opioid peptides endomorphin-1 and -2. Neuroreport 8, 3131-3135. Sullivan, A.F., Dashwood, M.R., Dickenson, A.H., 1987. Alpha 2-adrenoceptor modulation of nociception in rat spinal cord: location, effects and interactions with morphine. Eur J Pharmacol 138, 169-177. Sun, R.Q., Wang, Y., Zhao, C.S., Chang, J.K., Han, J.S., 2001. Changes in brain content of nociceptin/orphanin FQ and endomorphin 2 in a rat model of neuropathic pain. Neurosci Lett 311, 13-16. Sundstrom, G., Dreborg, S., Larhammar, D., 2010. Concomitant duplications of opioid peptide and receptor genes before the origin of jawed vertebrates. PloS one 5, e10512. Szemenyei, E., Barna, I., Mergl, Z., Keresztes, A., Darula, Z., Kato, E., Toth, G., Ronai, A.Z., 2008. Detection of a novel immunoreactive endomorphin 2-like peptide in rat brain extracts. Regulatory peptides 148, 54-61. Terskiy, A., Wannemacher, K.M., Yadav, P.N., Tsai, M., Tian, B., Howells, R.D., 2007. Search of the human proteome for endomorphin-1 and endomorphin-2 precursor proteins. Life Sci 81, 1593-1601. Todd, A.J., 2010. Neuronal circuitry for pain processing in the dorsal horn. Nat Rev Neurosci 11, 823-836. Todd, A.J., McGill, M.M., Shehab, S.A., 2000. Neurokinin 1 receptor expression by neurons in laminae I, III and IV of the rat spinal dorsal horn that project to the brainstem. Eur J Neurosci 12, 689-700. Todd, A.J., Puskar, Z., Spike, R.C., Hughes, C., Watt, C., Forrest, L., 2002. Projection neurons in lamina I of rat spinal cord with the neurokinin 1 receptor are selectively innervated by substance p-containing afferents and respond to noxious stimulation. J Neurosci 22, 41034113. 73

Tolle, T.R., Berthele, A., Laurie, D.J., Seeburg, P.H., Zieglgansberger, W., 1995. Cellular and subcellular distribution of NMDAR1 splice variant mRNA in the rat lumbar spinal cord. Eur J Neurosci 7, 1235-1244. Tolle, T.R., Berthele, A., Zieglgansberger, W., Seeburg, P.H., Wisden, W., 1993. The differential expression of 16 NMDA and non-NMDA receptor subunits in the rat spinal cord and in periaqueductal gray. J Neurosci 13, 5009-5028. Tomboly, C., Peter, A., Toth, G., 2002. In vitro quantitative study of the degradation of endomorphins. Peptides 23, 1573-1580. Traub, R.J., 1996. The spinal contribution of substance P to the generation and maintenance of inflammatory hyperalgesia in the rat. Pain 67, 151-161. Tseng, L.F., Narita, M., Suganuma, C., Mizoguchi, H., Ohsawa, M., Nagase, H., Kampine, J.P., 2000. Differential antinociceptive effects of endomorphin-1 and endomorphin-2 in the mouse. J Pharmacol Exp Ther 292, 576-583. Tuchscherer, M.M., Seybold, V.S., 1989. A quantitative study of the coexistence of peptides in varicosities within the superficial laminae of the dorsal horn of the rat spinal cord. J Neurosci 9, 195-205. Turner, A.J., 1987. Endopeptidase-24.11 and neuropeptide metabolism. In: Turner, A.J. (Ed.), Neuropeptides and Their Peptidases. Uhl, G.R., Kuhar, M.J., Snyder, S.H., 1977. Neurotensin: immunohistochemical localization in rat central nervous system. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 74, 4059-4063. Vanhoof, G., Goossens, F., De Meester, I., Hendriks, D., Scharpe, S., 1995. Proline motifs in peptides and their biological processing. Faseb J 9, 736-744. Versteeg, D.H., 1982. Neurohypophyseal hormones and brain neurochemistry. Pharmacology & therapeutics 19, 297-325. Villhauer, E.B., Brinkman, J.A., Naderi, G.B., Burkey, B.F., Dunning, B.E., Prasad, K., Mangold,

B.L.,

Russell,

M.E.,

Hughes,

T.E.,

2003.

1-[[(3-hydroxy-1-

adamantyl)amino]acetyl]-2-cyano-(S)-pyrrolidine: a potent, selective, and orally bioavailable dipeptidyl peptidase IV inhibitor with antihyperglycemic properties. J Med Chem 46, 27742789. Wakisaka, S., Kajander, K.C., Bennett, G.J., 1991. Increased neuropeptide Y (NPY)-like immunoreactivity in rat sensory neurons following peripheral axotomy. Neurosci Lett 124, 200-203.

74

Wang, L., Sadoun, E., Stephens, R.E., Ward, P.E., 1994. Metabolism of substance P and neurokinin A by human vascular endothelium and smooth muscle. Peptides 15, 497-503. Wang, L.H., Ahmad, S., Benter, I.F., Chow, A., Mizutani, S., Ward, P.E., 1991. Differential processing of substance P and neurokinin A by plasma dipeptidyl(amino)peptidase IV, aminopeptidase M and angiotensin converting enzyme. Peptides 12, 1357-1364. Wiesenfeld-Hallin, Z., Hokfelt, T., Lundberg, J.M., Forssmann, W.G., Reinecke, M., Tschopp, F.A., Fischer, J.A., 1984. Immunoreactive calcitonin gene-related peptide and substance P coexist in sensory neurons to the spinal cord and interact in spinal behavioral responses of the rat. Neurosci Lett 52, 199-204. Williams, C.A., Wu, S.Y., Dun, S.L., Kwok, E.H., Dun, N.J., 1999. Release of endomorphin2 like substances from the rat spinal cord. Neurosci Lett 273, 25-28. Wilson, A.M., Soignier, R.D., Zadina, J.E., Kastin, A.J., Nores, W.L., Olson, R.D., Olson, G.A., 2000. Dissociation of analgesic and rewarding effects of endomorphin-1 in rats. Peptides 21, 1871-1874. Wirkner, K., Sperlagh, B., Illes, P., 2007. P2X3 receptor involvement in pain states. Molecular neurobiology 36, 165-183. Wolfe, D., Hao, S., Hu, J., Srinivasan, R., Goss, J., Mata, M., Fink, D.J., Glorioso, J.C., 2007. Engineering an endomorphin-2 gene for use in neuropathic pain therapy. Pain 133, 29-38. Wrenger, S., Reinhold, D., Hoffmann, T., Kraft, M., Frank, R., Faust, J., Neubert, K., Ansorge, S., 1996. The N-terminal X-X-Pro sequence of the HIV-1 Tat protein is important for the inhibition of dipeptidyl peptidase IV (DP IV/CD26) and the suppression of mitogeninduced proliferation of human T cells. FEBS letters 383, 145-149. Wu, H.E., Darpolor, M., Nagase, H., Tseng, L.F., 2003. Acute antinociceptive tolerance and partial cross-tolerance to endomorphin-1 and endomorphin-2 given intrathecally in the mouse. Neurosci Lett 348, 139-142. Wu, H.E., Hung, K.C., Mizoguchi, H., Fujimoto, J.M., Tseng, L.F., 2001. Acute antinociceptive tolerance and asymmetric cross-tolerance between endomorphin-1 and endomorphin-2 given intracerebroventricularly in the mouse. J Pharmacol Exp Ther 299, 1120-1125. Wu, H.E., MacDougall, R.S., Clithero, A.D., Leitermann, R.J., Terashvili, M., Tseng, L.F., 2004. Opposite conditioned place preference responses to endomorphin-1 and endomorphin-2 in the mouse. Neurosci Lett 365, 157-161. Wu, L., Chen, J., Zhong, D., Lin, C., Wang, X., 2002. Proteolysis of endomorphin-1 by brain synaptic membrane-associated peptidases. Acta neurobiologiae experimentalis 62, 1-5. 75

Xie, H., Woods, J.H., Traynor, J.R., Ko, M.C., 2008. The spinal antinociceptive effects of endomorphins in rats: behavioral and G protein functional studies. Anesth Analg 106, 18731881. Yaksh, T.L., 1999. Spinal systems and pain processing: development of novel analgesic drugs with mechanistically defined models. Trends in pharmacological sciences 20, 329-337. Yaksh, T.L., Henry, J.L., 1978. Antinociceptive effects of intrathecally administered human beta-endorphin in the rat and cat. Canadian journal of physiology and pharmacology 56, 754759. Yasuda, K., Raynor, K., Kong, H., Breder, C.D., Takeda, J., Reisine, T., Bell, G.I., 1993. Cloning and functional comparison of kappa and delta opioid receptors from mouse brain. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 90, 67366740. Young, M.R., Fleetwood-Walker, S.M., Mitchell, R., Munro, F.E., 1994. Evidence for a role of metabotropic glutamate receptors in sustained nociceptive inputs to rat dorsal horn neurons. Neuropharmacology 33, 141-144. Zadina, J.E., Hackler, L., Ge, L.J., Kastin, A.J., 1997. A potent and selective endogenous agonist for the mu-opiate receptor. Nature 386, 499-502. Zadina, J.E., Kastin, A.J., 1985. Interactions between the antiopiate Tyr-MIF-1 and the mu opiate morphiceptin at their respective binding sites in brain. Peptides 6, 965-970. Zadina, J.E., Kastin, A.J., Ge, L.J., Hackler, L., 1994. Mu, delta, and kappa opiate receptor binding of Tyr-MIF-1 and of Tyr-W-MIF-1, its active fragments, and two potent analogs. Life Sci 55, PL461-466. Zadina, J.E., Kastin, A.J., Krieg, E.F., Jr., Coy, D.H., 1982. Characterization of binding sites for N-Tyr-MIF-1 (Tyr-Pro-Leu-Gly-NH2) in rat brain. Pharmacology, biochemistry, and behavior 17, 1193-1198. Zadina, J.E., Paul, D., Gergen, K.A., Ge, L.J., Hackler, L., Kastin, A.J., 1996. Binding of TyrW-MIF-1 (Tyr-Pro-Trp-Gly-NH2) and related peptides to mu 1 and mu 2 opiate receptors. Neuroscience letters 215, 65-69. Zangen, A., Ikemoto, S., Zadina, J.E., Wise, R.A., 2002. Rewarding and psychomotor stimulant effects of endomorphin-1: anteroposterior differences within the ventral tegmental area and lack of effect in nucleus accumbens. J Neurosci 22, 7225-7233. Zhang, X., Wiesenfeld-Hallin, Z., Hokfelt, T., 1994. Effect of peripheral axotomy on expression of neuropeptide Y receptor mRNA in rat lumbar dorsal root ganglia. Eur J Neurosci 6, 43-57. 76

Saját publikációk A disszertáció alapjául szolgáló közlemények 1. Király K, Lambeir AM, Szalai J, Szentirmay A, Luyten W, Barna I, Puskár Z, Kozsurek M, Rónai AZ. The dipeptidyl peptidase IV (CD26, EC 3.4.14.5) inhibitor vildagliptin is a potent antihyperalgesic in rats by promoting endomorphin-2 generation in the spinal cord. Eur J Pharmacol. 2011 Jan 10;650(1):195-9. 2. Király K, Szalay B, Szalai J, Barna I, Gyires K, Verbeken M, Rónai AZ. Intrathecally injected Ile-Pro-Ile, an inhibitor of membrane ectoenzyme dipeptidyl peptidase IV, is antihyperalgesic in rats by switching the enzyme from hydrolase to synthase functional mode to generate endomorphin 2. Eur J Pharmacol. 2009 Oct 12;620(1-3):21-6. 3. Rónai AZ, Király K, Szebeni A, Szemenyei E, Prohászka Z, Darula Z, Tóth G, Till I, Szalay B, Kató E, Barna I. Immunoreactive endomorphin 2 is generated extracellularly in rat isolated L4,5 dorsal root ganglia by DPP-IV. Regul Pept. 2009 Oct 9;157(1-3):1-2. Egyéb impakfaktoros nemzetközi folyóiratban megjelent közlemények 1. Spetea M, Windisch P, Guo Y, Bileviciute-Ljungar I, Schütz J, Asim MF, Berzetei-Gurske IP, Riba P, Kiraly K, Fürst S, Al-Khrasani M, Schmidhammer H. Synthesis and Pharmacological Activities of 6-Glycine Substituted 14-Phenylpropoxymorphinans, a Novel Class of Opioids with High Opioid Receptor Affinities and Antinociceptive Potencies (†). J Med Chem. 2011 Jan 14. 2. Sobor M, Timár J, Riba P, Friedmann T, Király KP, Gyarmati S, Al-Khrasani M, Fürst S. Effects of opioid agonist and antagonist in dams exposed to morphine during the perinatal period. Brain Res Bull. 2011 Jan 15;84(1):53-60. 3. Sobor M, Timár J, Riba P, Király KP, Gyarmati S, Al-Khrasani M, Fürst S. Does the effect of morphine challenge change on maternal behaviour of dams chronically treated with morphine during gestation and further on during lactation? Pharmacol Biochem Behav. 2010 May;95(3):367-74.

77

4. Timár J, Sobor M, Király KP, Gyarmati S, Riba P, Al-Khrasani M, Fürst S. Peri, pre and postnatal morphine exposure: exposure-induced effects and sex differences in the behavioural consequences in rat offspring. Behav Pharmacol. 2010 Feb;21(1):58-68. 5. Riba P, Friedmann T, Király KP, Al-Khrasani M, Sobor M, Asim MF, Spetea M, Schmidhammer H, Furst S. Novel approach to demonstrate high efficacy of mu opioids in the rat vas deferens: a simple model of predictive value. Brain Res Bull. 2010 Jan 15;81(1):17884. 6. Zádori ZS, Shujaa N, Köles L, Király KP, Tekes K, Gyires K. Nocistatin and nociceptin given centrally induce opioid-mediated gastric mucosal protection. Peptides. 2008 Dec;29(12):2257-65. 7. Al-Khrasani M, Spetea M, Friedmann T, Riba P, Király K, Schmidhammer H, Furst S. DAMGO and 6beta-glycine substituted 14-O-methyloxymorphone but not morphine show peripheral, preemptive antinociception after systemic administration in a mouse visceral pain model and high intrinsic efficacy in the isolated rat vas deferens. Brain Res Bull. 2007 Oct 19;74(5):369-75. 8. Király KP, Riba P, D'Addario C, Di Benedetto M, Landuzzi D, Candeletti S, Romualdi P, Furst S. Alterations in prodynorphin gene expression and dynorphin levels in different brain regions after chronic administration of 14-methoxymetopon and oxycodone-6-oxime. Brain Res Bull. 2006 Jul 31;70(3):233-9.

78

Köszönetnyilvánítás: Semmelweis Egyetem, Farmakológiai és Farmakoterápiás Intézet Dr. Rónai András Dr. Riba Pál Prof. Gyires Klára Prof. Fürst Zsuzsanna Dr. Friedmann Tamás Dr. Szebeni Andrea Dr. Szentirmay Apolka Szalai Istvánné, Judit Gulyás Antal Balogh Jenő Serfőző Zsuzsanna És az Intézet össszes dolgozójának Magyar Tudományos Akadémia, Kísérletes Orvostudományi Kutatóintézet Dr. Barna István Till Ibolya Magyar Tudományos Akadémia, Szegedi Biológiai Kutatóközpont Biokémiai Intézet, Neurobiológiai Egység Dr. Tóth Géza Dr. Szemenyei Erzsébet Dr. Darula Zsuzsuzsa Semmelweis Egyetem, III. sz. Belgyógyászati Klinika – Magyar Tudományos Akadémia, Metabolizmus és Atherosclerosis Kutatócsoport Dr. Prohászka Zoltán Semmelweis Egyetem, Anatómiai, Szövet- és Fejlődéstani Intézet Dr. Puskár Zita Dr. Kozsurek Márk Lukácsi Erika Gyimesi Klára Laboratory of Medical Biochemistry, University of Antwerp, Wilrijk, Belgium Anne-Marie Lambeir Medical School, K.U.Leuven, Belgium Walter Luyten Semmelweis Egyetem, I. sz. Gyermekgyógyászati Klinika Dr. Szalay Balázs Végül, de nem utolsó sorban családomnak. Elsősorban feleségemnek Orsinak, aki átolvasta a dolgozatot és kijavította számtalan helyesírási hibámat.

79