A COCHLEA DOPAMINERG ÉS GLUTAMÁTERG NEUROTRANSZMISSZIÓJÁNAK VIZSGÁLATA Doktori (Ph.D.) Értekezés
dr. Halmos György Témavezető: Prof. Dr. Vizi E. Szilveszter
Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézet Budapest 2001. Szigorlati bizottság: Prof. Dr. Czigner Jenő Dr. Rejtő Kálmán Dr. Kiss János Opponensek:
Dr. Tretter László Dr. Vass Zoltán Dr. Hársing László (póttag)
Birálóbizottság:
Prof. Dr. Hadházy Pál (elnök) Prof. Dr. Bauer Miklós Prof. Dr. Sziklai István Dr. Küstel Marianna (póttag)
Semmelweis Egyetem Doktori Iskola 6. Doktori Iskola Vezető: Prof. Dr. Réthelyi Miklós 6/1. Program Programvezető: Prof. Dr. Palkovits Miklós VI. Alprogram: Neurofarmakológia Alprogramvezető: Prof. Dr. Vizi E. Szilveszter 1
Tartalomjegyzék Összefoglaló
5
Abstract
7
A. Bevezetés
9
B. Irodalmi háttér
11
B.1. A neurotranszmisszó alapjai B.1.1. A szinaptikus kapcsolat B.1.2. A cochlea neurotranszmitterei és azok receptorai B.1.2.1. Dopamin B.1.2.2. Glutamát B.1.3. Nem-szinaptikus kapcsolat B.2. A cochlea B.2.1. A cochlea mikroanatómiája B.2.1.1. Perifériás hallósejtek B.2.1.1.1. Belső szőrsejtek B.2.1.1.2. Külső szőrsejtek B.2.1.1.3. Deiters sejtek B.2.1.2. Hallórostok B.2.1.2.1. Afferens hallórostok B.2.1.2.2. Efferens hallórostok B.2.2. Neurotranszmisszó a cochleában B.2.2.1. Afferentáció B.2.2.2. Efferentáció B.2.2.3. A lateralis olivocochleáris efferensek védő funkciója, különös tekintettel a dopaminra B.2.3. A szőrsejtek kalcium-homeosztázisa B.3. A cochlea működése patológiás folyamatokban B.3.1. Ischaemiás halláskárosodás B.3.2. Akusztikus trauma B.3.3. Aminoglikozid ototoxicitás
11 11 13 13 14 15 16 16 16 16 17 17 18 18 18 19 19 22 24 26 27 27 30 30
C. Célkitűzések
32
D. Anyag és módszer
34
D.1. Állatok D.2. Felhasznált anyagok D.3. Izolált tengerimalac cochlea preparátum D.4. Dopamin felszabadulásának mérése D.4.1. In vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszer D.4.2. A perfundált szövet ingerlése D.4.2.1. Elektromos téringerlés
34 34 34 36 36 37 37
2
D.4.2.2. Veratridin-ingerlés D.4.3. Drogok hozzáadása D.4.4. A felszabadult dopamin mennyiségének értékelése D.5. Glutamát és dopamin felszabadulásának párhuzamos mérése D.5.1. In vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszer módosítása D.5.2. Magas nyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) glutamát meghatározás D.5.3. Drogok hozzáadása D.5.4. Elektromos téringerlés D.6. Aminoglikozid antibiotikumok hatásának vizsgálata a dopamin elszabadulására D.6.1. Akut hatás vizsgálata D.6.2. Krónikus neomycin kezelés D.7. Szőrsejtek intracelluláris Ca2+-koncentrációjának vizsgálata intakt tengerimalac Corti-szerven D.7.1. Corti szerv preparálása D.7.2. Intracelluláris Ca2+-mérés D.8. Statisztikai analízis
37 37 37 39 39 39
E. Eredmények
43
E.1. Ischaemiás modell hatása a dopamin felszabadulására E.1.1. Kontroll kísérletek E.1.2. Veratridin hatása különböző koncentrációkban E.1.3. Veratridin hatásának gátlása tetrodotoxinnal E.1.4. Glutamát receptor antagonisták hatása a dopamin felszabadulására E.2. Dopamin és glutamát felszabadulásának szimultán mérése E.2.1. Kontroll kísérletek E.2.1.1. Dopamin felszabadulása E.2.1.2. Glutamát felszabadulása E.2.2. Tetrodotoxin hatása E.2.2.1. Dopamin felszabadulása E.2.2.2. Glutamát felszabadulása E.2.3. Dopamin receptor agonista és antagonista hatása E.2.3.1. Dopamin felszabadulása E.2.3.2. Glutamát felszabadulása E.3. Aminoglikozid antibiotikumok hatása a dopamin felszabadulására E.3.1. Akut hatás E.3.2. Krónikus hatás E.4. Intracelluláris kalciumkoncentráció mérése. E.4.1. Az egyes sejttípusok azonosítása E.4.2. A sejtek töltődése fura-2/AM-mel E.4.3. A belső szőrsejtek ingerlése KCl-dal
43 43 43 45 46 48 48 48 49 50 50 50 50 50 51 52 52 54 55 55 55 57
F. Megbeszélés
58
F.1. Ischaemia hatása a dopamin felszabadulására F.2. Glutamát receptor antagonisták hatása a dopamin felszabadulására F.3. Dopamin és glutamát felszabadulásának szimultán mérése
59 61 62
3
40 40 40 41 41 41 41 42
F.4. Aminoglikozid antibiotikumok hatása a dopamin felszabadulására 64 2+ F.5. Intracelluláris Ca -koncentrációjának vizsgálata intakt tengerimalac Corti- 66 szerven F.6. Kutatásaink klinikai vonatkozásai 67 G. Rövidítések jegyzéke
69
H. Köszönetnyilvánítás
71
I. Irodalomjegyzék
72
J. A témában megjelent publikációk jegyzéke
84
4
ÖSSZEFOGLALÁS A cochleában a belső szőrsejtek (BSZ) és az afferens ideg közötti neurotranszmitter legnagyobb valószínűséggel a glutamát (Glu). Ischaemia és zaj hatására a BSZ-ből felszabaduló extrém mennyiségű Glu károsítja az afferens ideg dendritjét. A lateralis olivocochleáris efferens (LOC) axonja a BSZ alatt szinaptizál az afferens dendritjével. A LOC-ből felszabaduló dopaminról (DA) kimutatták, hogy zaj és ischaemia hatására létrejövő Glu-excitotoxicitás ellen nyújt védelmet. Kísérleteink során in vitro mikrotérfogatú perfúziós módszert használtunk izolált tengerimalac cochleából a DA felszabadulásának mérésére. A veratridin egy Na+csatorna aktivátor szer, mely ischaemiához hasonló intracelluláris állapotot hoz létre, hatását kizárólag neuronális sejteken fejti ki. Kísérleteink során kimutattuk, hogy veratridin hatására a DA nyugalmi- és elektromos inger kiváltotta felszabadulása szignifikánsan megemelkedett. Ezt a hatást ionotróp Glu-receptor antagonisták nem befolyásolták. Új módszert dolgoztunk ki, mely során az in vitro mikrotérfogatú perfúziós módszert HPLC-vel kombináltuk, így a DA-nal párhuzamosan Glu-mérés is lehetővé vált. Elektromos ingerlés hatására mindkét transzmitter felszabadulása szignifikánsan megemelkedett, mely hatást tetrodotoxin gátolta. Ezzel igazoltuk a transzmitterek idegi eredetét. A Glu felszabadulását DA receptor antagonista és agonista szer nem változtatta meg szignifikánsan, míg mind a DA agonista és antagonista megemelte a DA kiáramlását. Mivel ismert, hogy az aminoglikozid antibiotikumok halláskárosodást okoznak, ezért megvizsgáltuk hatásukat a DA felszabadulására. Azt találtuk, hogy neomycin koncentrációfüggően gátolta az elektromos ingerlés kiváltotta DA felszabadulást. A gentamicin és a kanamicin viszont nem befolyásolták a DA felszabadulását. Amikor krónikusan neomycinnel kezeltük állatokat a cochleáikkal végzett kísérletek során a DA felszabadulását nem befolyásolta a neomycin. Kísérleteink során bebizonyítottuk, hogy (1) az elektromos (axonális) ingerlésre felszabaduló DA és a Glu neuronális eredetű, (2) az ischaemiához és zajhatáshoz hasonló állapotban a belsőfül eredetű DA felszabadulása megemelkedik, mely Glureceptoroktól független. (3) Új módszert állítottunk be, mellyel párhuzamosan tudtunk izolált emlős cochleából DA- és Glu-felszabadulást mérni. (4) DA receptor agonistákkal 5
és antagonistákkal végzett kísérleteink során nem találtunk bizonyítékot a BSZ-eredetű Glu felszabadulásának preszinaptikus szabályozására.
(5) Neomycinnel végzett
kísérleteink során az aminoglikozid antibiotikumok ototoxicitásának egy új lehetséges hatáspontját, a DA felszabadulásának gátlását találtuk. Ezt a hatást alátámasztják a krónikus neomycin-kezelés után kapott eredmények is, melyek hátterében egy adaptív mechanizmus állhat. (6) A cochleában zajló transzmiszmitter kölcsönhatások jobb megértéséhez egy új preparátumot dolgoztunk ki, melynek segítségével egyszerre, saját környezetében mérhető a Corti érzékhám különböző sejtjeiben az intracelluláris kalciumion koncentráció.
6
ABSTRACT DOPAMATERGIC AND GLUTAMATERGIC NEUROTRANSMISSION IN THE COCHLEA Glutamate (Glu) is most likely the transmitter between the inner hair cell (IHC) and the afferent nerve terminal. The damage of the afferent nerve due to ischemia or acoustic trauma is caused by the extreme Glu release from the IHC. Axon terminals of the lateral olivocochlear efferent (LOC) fibers form synapse with dendrites of the afferent nerve beneath the IHCs. The LOC terminals, that release dopamine (DA) has a protective role against the Glu-excitotoxicity in case of ischemia and acoustic trauma. We used in vitro microvolume superfusion method to measure DA release from isolated guinea pig cochlea. Veratridine is a sodium-channel activator drug that causes intracellular changes similar to ischemia, acting only on neuronal elements. We found that both the resting and the evoked release of DA significantly increased in response to veratridine. This effect was not influenced by ionotrop Glu-receptor antagonists. We developed a new method, combining the in vitro microvolume superfusion technique with high performance liquid chromatography (HPLC), to simultaneously measure the release of DA and Glu. The release of both transmitters increased in response to electric field stimulation, that could be blocked by tetrodotoxin. This proves the neuronal origin of the transmitters. DA receptor antagonist and agonist drugs did not change significantly the release of Glu, while both agents increased the outflow of DA. Since the ototoxicity of aminoglycoside antibiotics is well-known, we also examined the effect of aminoglycosides on DA release. We found that neomycin decreased the electrically evoked release of DA in a concentration-dependent manner. Gentamicin and kanamycin had no significant effect on the release of DA. In the experiments where the cochleae were from chronic neomycin-treated animals, neomycin did not significantly change the release of DA. In our experiments, we proved (1) the neuronal origin of the cochlear DA and Glu, (2) the release of cochlear DA is elevated in a condition similar to ischemia and acoustic trauma, which seems to be independent from Glu receptors. (3) We set up a new method to measure simultaneously the release of DA and Glu from isolated mammalian cochleae. (4) In our experiments with DA receptor agonist and antagonist we did not find any evidence of presynaptic regulation of Glu released from IHCs. (5) 7
We found a new probable site of action of aminoglycoside antibiotics, as neomycin inhibited the release of DA. An adaptive mechanism may underlie the ineffectiveness of neomycin application in the chronically treated animals. (6) In favor of the better understanding of the transmitter interactions in the cochlea, we developed a new preparation, that enables us to simultaneously measure the intracellular calcium concentration of many different cell types of the organ of Corti.
8
A. Bevezetés A WHO Internetes honlapján közzétett legfrissebb, 2001. júliusi becslés szerint a föld teljes lakosságából 250 millió ember szenved közepes, vagy annál súlyosabb fokú halláskárosodásban. Ennek a tetemes népcsoportnak kb. 2/3-a a fejlődő országokban él, de a fejlett európai országok lakosságának is hozzávetőleg 4 %-a 40 dB-nél nagyobb halláscsökkenésben szenved. A percepciós halláskárosodás már évtizedek óta a klinikai és kísérletes vizsgálatok középpontjában áll. Bár a patomechanizmus sok tekintetben tisztázott, jelenleg sem ismert teljes egészében; így a definitív klinikai kezelés is várat magára. Az idegi típusú hallásromlások etiológiai okai közül kiemelkedik az ischaemiás halláskárosodás jelentőssége, hiszen minden bizonnyal ebbe a csoportba sorolhatóak az időskori halláscsökkenések (presbyacusis) legnagyobb része. A modern világ ismert civilizációs betegségei közé sorolható a zaj okozta halláskárosodás, mely a fokozódó technikai fejlődéssel egyre növeli ezt a nagyszámú betegcsoportot. Az európai országok nemzeti össztermékük 0,2 – 2 %-t költik a zaj okozta halláskárosodás megelőzésére, illetve a már kialakult károsodások kezelésére (201). Az akusztikus trauma és az ischaemia patomechanizmusa sok tekintetben igen hasonló, így kísérleteinkben együtt vizsgáltuk e két noxa belsőfülre gyakorolt hatását. Ischaemiás körülmények (magas intracelluláris nátrium- és kalciumion koncentráció) modellezésére
egy nátrium-csatorna
aktivátor
szert,
veratridint
alkalmaztunk.
Kísérleteink középpontjában a cochlea ingerületátvivő rendszerének két olyan transzmittere – a glutamát és a dopamin - állt, melyek az eddigi irodalmi adatok szerint központi szerepet játszanak a hallás fiziológiás és patológiás működésében. Az ototoxikus szerek közül a leggyakrabban halláskárosodást az aminoglikozid antibiotikumok okoznak. A fejlődő országok ebben is az élen járnak, de azért a fejlett európai országokban is eléri az 1,9 %-ot az ototoxikus halláskárosodások prevalenciája (202). A korábbi kutatások többféle morfológiai és funkcionális eltérést is észleltek az aminoglikozid antibiotikumok hatására. Kísérleteinkben, létrejöttének megértéséhez szerettünk volna közelebb kerülni egy, ezidáig még ismeretlen patomechanizmus feltárásával.
9
Végül dolgozatom tartalmaz egy új, jelenleg még további csiszolást igénylő módszert, illetve azzal elért kezdeti eredményeinket, mely az eddigi kutatásaink eredményeinek jobb megértését teszi lehetővé, az egyes élettani és kóros folyamatok sejt-szintű követése segítségével.
10
B. Irodalmi háttér B.1. A neurotranszmisszó alapjai Tekintettel arra, hogy ez a dolgozat nem ölelheti fel az ingerületátvitel minden részletét, és nem is célom teljes mélységéig ismertetni a neurofarmakológia alapjait, itt kizárólag a kísérleteink szempontjából kiemelkedő jelentőségű szempontokkal foglalkozom. Így ebben a fejezetben az ingerületátvitel morfológiai alapjainak ismertetését
követően
rövid
áttekintést
kívánok
adni
a
cochleán
belüli
információtovábbításért felelős transzmitterek közül a dopaminról, a glutamátról, és azok receptorairól. Végül röviden áttekintem a nem-szinaptikus kapcsolat lényegét, és annak lehetséges szerepét a hallás mechanizmusában. B.1.1. A szinaptikus kapcsolat Az idegsejtek axonjai és dendritjei között magasan specializált kapcsolatok, szinapszisok vannak, melyek segítségével a neuronok között gyors információátadás történik. A szinapszisban elkülöníthetjük a pre- és postszinaptikus membránt, melyek között helyezkedik el a szinaptikus rés. A két oldal között az információt neurotranszmitterek közvetítik. A neurotranszmitterek a preszinaptikus idegsejtben termelődnek, és azok vezikulumaiban tárolódnak. A sejt depolarizációjának hatására innen felszabadulnak, és a szinaptikus résbe jutnak, ahol diffúzióval elérhetik a posztszinaptikus membránt. Itt receptorával találkozva létrehozza a megfelelő hatást, mely a receptortól függően lehet aktiváció vagy gátlás. A posztszinaptikus oldal receptorai vagy tartalmaznak ioncsatornát (ionotróp receptorok), és a ligand bekötődésekor ionáramokat hoznak létre, vagy metabolikus változásokért felelős fehérjéket aktiválnak (metabotróp receptorok). A hatás létrehozását követően igen fontos a transzmitter inaktiválása, mely több úton történhet: (1) a transzmitter enzimatikus elbontásával, (2) a preszinaptikus membránon át visszavétellel, (3) az előzőek kombinációjával. Fontos megjegyezni, hogy egy szinapszisban egy akciós potenciál hatására több különböző transzmitter is felszabadulhat, és amennyiben a megfelelő receptorok is jelen vannak a posztszinaptikus membránon, úgy mindegyik hatása érvényesül, és egy összetett biológiai válasz jöhet létre egy stimulus hatására. A 11
szinapszisban létrejött ingerületátvitelt több tényező is befolyásolhatja, pre- illetve posztszinaptikusan. Preszinaptikusan autoreceptorok lehetnek jelen, melyekhez a felszabadított transzmitter kötődik, így annak ingerületét befolyásolják. Ide más idegsejtekből felszabadult anyagok is kötődhetnek, melyek vagy szinaptikus kapcsolatban vannak az idegvégződéssel (axo-axonális kapcsolat), vagy nemszinaptikus kapcsolat révén (l.d. B.1.3.). A posztszinaptikus sejten, a szinaptikus membránon
kívül
elhelyezkedő
receptorok
befolyásolhatják
a
szinaptikus
ingerületátvitel hatékonyságát, illetve ide is kötődhetnek távoli sejtek által termelt és ide diffundáló transzmitterek (nem-szinaptikus kapcsolat). A fenti szinaptikus elrendezéstől jelentős eltérések lehetnek, melyek az egyes sejttípusokra jellemzőek, a leggyakoribb az axodendritikus és axosomatikus kapcsolat, amikor a sejt axonja funkcionális kapcsolatot létesít a célsejt dendritjével, vagy sejttestjével. De ezen kívül két sejttest kapcsolata is fennállhat
(somato-somatikus
információátvitel
szinapszis),
(dendro-dendritikus
vagy
szinapszis).
dendritek A
között
központi
is
és
lehet
perifériés
idegrendszerben gyakori az axonokban a klasszikus szinaptikus szerveződés nélküli vezikulák csoportos jelenléte, melyek így több helyütt képesek ingerületátvitelre az axonterminálistól „proximálisan” (1,13,41,118) (B/1 ábra). B/1. ábra A szinapszis felépítése,
AP
működése és annak szabályozása (1) neurotranszmitterek termelődése (2) vezikulumokban tárolódása (3) depolarizáció (AP) hatására
VDCC
VDCC Ca2+
1
feszültség-függő Ca2+-csatornákon Ca2+
(VDCC) keresztül Ca2+ áramlik az
7
intracelluláris térbe, melynek
2
hatására a vezikulumok a szinaptikus 6
3
résbe ürítik tartalmukat
5
(4) a transzmitterek receptoraikhoz
4
kötődnek
8
(5) lebomlanak a szinaptikus résben (6) visszavételre is kerülhetnek (7) preszinaptikus receptor (8) posztszinaptikus receptor 12
B.1.2. A cochlea neurotranszmitterei és azok receptorai B.1.2.1. Dopamin A dopaminról először azt gondolták, hogy csak a noradrenalin prekurzoraként játszik szerepet a neurotranszmisszióban, később azonban kiderült, hogy a két katecholamin eloszlása az idegrendszerben igen különböző, sőt kimutatták, hogy a központi idegrendszeri katecholaminok több mint fele dopamin (13). A dopamin szintézise L-tirozinból történik: tirozin-hidroxiláz L-DOPÁ-vá (3,4-dihidroxi-Lfenilalanin) alakítja, majd ezt a DOPA-dekarboziláz alakítja dopaminná. Ebben a folyamatban a tirozin-hidroxiláz szabályozása igen szigorú: a sejtek depolarizációjának következtében megnyíló feszültségfüggő kalcium csatornákon keresztül beáramló Ca2+ a kalmodulinnal komplexet képez, ami aktiválja a tirozin-hidroxilázt foszforiláló protein-kinázt. Ennek a tirozin-hidroxiláznak az aktivitása a preszinaptikus D3dopaminreceptorok szabályozása alatt áll. Az enzim a foszforilációt követően aktivizálódik. A sejtplazmában szintetizálódott dopamint a vezikulákba egy energiaigényes transzportrendszer juttatja be. A dopamin metabolizmusának egyik lehetséges útja a noradrenegr sejtekben történő noradrenalin-szintézis, melyet a dopamin-b-hidroxiláz enzim végez, ez folyamat a szinaptikus vezikulákban játszódik le. A dopaminerg sejtek esetében a metabolizmus a monoamin-oxidázhoz, illetve a katekol-O-metiltranszferázhoz kapcsolódik, ilyenkor dihidroxi-fenilecetsav, illetve homovanilinsav keletkezik (1,97,200). A dopamin a pre- és posztszinaptikusan elhelyezkedő dopaminreceptorokat izgatja. A dopaminreceptorok metabotróp receptorok, működésük G fehérjéhez kötött. Molekuláris biológiai módszerekkel legalább 5 féle dopaminreceptort azonosítottak ezidáig, melyeket két nagy csoportba oszthatunk, a D1 és D2 típusúak. A D1 típusúak az adenilát-cikláz aktivációján keresztül a ciklikus adenozin-3’,5’-monofoszfát (cAMP) szintjét megemeli, melynek hatására fehérjefoszforilációs mechanizmusok aktiválódnak a sejtekben. A D1 típusú receptorok családjába két receptor tartozik, a D1 és a D5. A D2 típusú receptorok a cAMP szintet csökkentik az adenilát-cikláz gátlásával, de ezen kívül a Ca2+-áramokat gátolják, és a K+-áramokat aktiválják, így hyperpolarizálják a 13
sejteket. Ide tartozik a D2 (ennek 2 fajtája van a receptor harmadik citoplazmatikus hurkának hossza alapján: D2short és D2long), a D3 és a D4 receptor (13). B.1.2.2. Glutamát A glutamát a központi idegrendszer általános excitatoros transzmittere. Tekintettel arra, hogy a glutamát a sejtek anyagcseréjében is részt vesz, egyes szinapszisokban a glutamát neurotranszmitterként való szerepének bizonyítása nem könnyű feladat. Ez az oka annak, hogy a cochleában az afferens ingerületátvezetésben betöltött szerepe a mai napig nem teljesen bizonyított, bár ez indirekt bizonyítékok következtében egyre biztosabb (részletesen l.d. B.2.2.1.). A glutamát több biokémiai folyamat során szintetizálódhat, melyek közül a citromsav-ciklus során és a glutaminból keletkező glutamát játszik szerepet a neurotranszmisszóban. Előbbiben kulcsfontosságú enzim a glutamát-dehidrogenáz, utóbbiban a glutamináz. A neurotranszmisszóban szerepet játszó glutamát élesen elkülönül a sejtek anyagcseréjétől, a szinaptikus vezikulákba
való
juttatásáért
specifikus
protonpumpa
felelős.
A
neuronok
depolarizációjának eredményeként a feszültségfüggő kalcium csatornákon keresztül beáramló Ca2+ okozza a vezikulák exocitózisát, és a glutamát szinaptikus résbe való ürülését (1). A szinaptikus résből a glutamát eliminálását aktív felvételi mechanizmusok végzik: neuronális- (GLT1, GLAST) és gliális (EAAC1, EAAT4) uptake rendszerek. A glutamát metabolizmusa elsősorban a gliákban zajlik glutamin-szintetáz hatására (40). A szinaptikus résbe jutott glutamát a receptoraihoz kötődve hozza létre hatását. A glutamátreceptorokat két nagy csoportra oszthatjuk: ionotróp és metabotróp receptorokra. Az ionotróp glutamátreceptorok három csoportra oszthatók: NMDA (N-metil-D-aszpartát), AMPA (a-amino-3-hiroxi-5-metil-4-izoxazol-propionsav) és kainát receptorokra. Nevüket szelektív agonistáikról kapták. Az utóbbi kettőt farmakológiai hasonlóságuk miatt gyakran nevezik nem-NMDA receptoroknak is. Az NMDA receptor egy ioncsatorna, mely aktivációjakor befele irányuló Na+és Ca2+-, kifele irányuló K+-áramot hoz létre. A receptoron több kötőhely található a glutamát/NMDA kötőhelyen kívül. A csatorna hatékony izgatásához elengedhetetlen a glicin-kötőhely egyidejű aktiválása. Kiemelném még a kötőhelyek közül a csatornában található gátló hatású dizocilpinről (MK-801) elnevezett MK-801 kötőhelyet. Az 14
NMDA receptorok különlegessége, hogy Ca2+-permeabilitása igen nagy. A receptor működésének fontos szabályozója egy olyan modulációs hely, melyet Ca2+ hatására protein-kinázok foszforilálnak. A nem-NMDA receptorok Na+-ra és K+-ra permeábilisek (bizonyos alegység összetétel esetén Ca2+-ra is), aktiválódásuk az endogén agonista kötőhelyre történő glutamát, AMPA vagy kainát bekötődéskor következik be (1,40). Kiemelendő még a GYKI-kötőhely, mely egy szelektív antagonistáról, a GYKI-52466-ról kapta nevét, melyen keresztül a receptor allosztérikusan gátolható (195,171). Az AMPA és kainát receptorok a gyors depolarizációt közvetítik a legtöbb glutamáterg szinapszisban a központi idegrendszerben. Az NMDA receptorok aktivitásához AMPA vagy kainát receptor által előidézett elődepolarizáció szükséges. Nemcsak a gyors excitatoros transzmissziót, hanem a szinaptikus plaszticitást is kötik ezen receptorok működéséhez. Az excitatoros szinapszisokban igen gyakori többféle ionotróp glutamátreceptor együttes előfordulása (13). A metabotróp receptorok több altípusát elkülönítették (mGluR1-7), melyek egyik csoportjának (mGluR1,5) másodlagos hírvivője a foszfatidil-inozitol rendszer, így serkentő hatású; másik csoportja (mGluR2,3,4,6,7) pedig az adenilát-cikláz rendszert gátolja (40). B.1.3. Nem-szinaptikus kapcsolat A szinaptikus kapcsolattal nem rendelkező varikozitásokból felszabaduló transzmitterek az extracelluláris térben diffundálva távoli receptorokon is kifejthetik hatásukat. Az ingerület ilyen fajta terjedését nevezzük nem-szinaptikus kapcsolatnak. Többek között jellemző, hogy ebben az információtovábbítási formában az extracelluláris térben igen kicsi az ingerületátvivő anyag koncentrációja, ennek megfelelően nagyobb a receptorok érzékenysége. Ez utóbbiból következik, hogy az ilyen kapcsolatok befolyásolása az elsődleges a kisebb hatóanyag koncentrációk esetén, amely a gyógyszerek beadását követően mérhető a szövetekben (190,191,194). A cochleában több helyütt is elképzelhető a nem-szinaptikus kapcsolatok által történő kommunikáció, melyek közül kísérleteink szempontjából három fontos lehetőséget emelek ki. Kimutatták a lateralis olivocochleáris efferensek „en passant” 15
boutonjainak szinaptikus kapcsolat nélküli jelenlétét is (91,143,198), így valószínű, hogy az ezekből a boutonokból felszabaduló transzmitterek - így a dopamin is - a primer afferens rostokon kívül a neuronok sokaságán fejtik ki neuromodulátor hatásukat. Másik lehetőség, hogy a glutamát afferens rostokat érintő excitotoxicitásában (részletesen l.d. B.3.1.) nemcsak a belső szőrsejtekből felszabaduló transzmitter játszik szerepet, hanem a szinapszisokból kidiffundáló és a nem-szinaptikus utakat felhasználó glutamát is, ahogyan ezt a központi idegrendszer más területein már leírták (190,193). A harmadik lehetőség a nitrogén monoxid (NO) által mediált nem-szinaptikus kölcsönhatások (85). Az NO neuromodulátor hatását már korábban leírták a cochleában (42), tekintettel arra, hogy az NO gáz halmazállapotú mediátor, így diffúziója szabadon végbemegy a sejtmembránon, tehát a neuronok között is (55). B.2. A cochlea B.2.1. A cochlea mikroanatómiája Ebben a fejezetben a Corti szerv sokféle sejtjei közül kizárólag csak a kísérleteink szempontjából kiemelkedő jelentőségűekkel foglalkozom, így a szenzoros epitélium sejtjei közül csak a külső és belső szőrsejtekről és a támasztósejtek közül csak a Deiters sejtekről esik szó. B.2.1.1. Perifériás hallósejtek B.2.1.1.1. Belső szőrsejtek A hallás valódi receptorsejtjei a belső szőrsejtek, róluk vezetődik el az ingerület 95 %-a a központi idegrendszeri struktúrák felé a n. cochlearison (afferens idegrost) keresztül (8,42,122,161). Ezek palack alakú sejtek egy sejtsorban helyezkednek el. Széles felszínükön horizontálisan elhelyezkedő sztereociliumsor látható. A szőrök egy úgynevezett cuticularis lemezt fúrnak át, mely egy fibrosus aktint, miozint, fimbrint és kalcium-kötő fehérjét tartalmazó réteg (52,155). A sejtek magja nagy, ovális, a plazmában elszórva mitokondriumok, mikrotubulusok, lizoszómák és világos vezikulumok helyezkednek el. A kutikuláris lemez alatt egy barázdált test (striated body) van, mely a külső szőrsejtekből hiányzik (154). A plazmamembrán alatt található 16
egy úgynevezett felszín alatti ciszternarendszer, mely valójában nem más, mint egy módosult simafelszínű endoplazmatikus retikulumrendszer. A belső szőrsejtek bázisánál sok afferens idegvégződés látható (141). B.2.1.1.2. Külső szőrsejtek: A külső szőrsejtek 3-4 sejtsorban helyezkednek el, hosszúkás alakú sejtek, melyek a Corti szervhez alapjuknál és csúcsuknál vannak rögzítve. Felszínüket szintén kutikuláris lemez fedi, melyet átfúrva, emelkednek ki a sztereociliumok, melyek W alakban helyezkednek el. A külső szőrsejtek igen prominens citoplazmatikus komponense a felszín alatti ciszternarendszer, mely az intracelluláris kalcium kompartmentalizálásában játszik igen fontos szerepet. Ezek a ciszternák a sejtek csúcsánál oválisokat képeznek, melyeket Hensen testeknek nevezünk. A sejtmag alatt a ciszternarendszer egy rétegűvé válik, melyet szubszinaptikus ciszternának hívunk. Nagy efferens szinapszisok vannak a sejtek bázisánál, melyek mellett kevés kis afferens dendrit is látható (141). A külső szőrsejtekkel szinaptizál az afferens rostok 5 %-a (42,122). A külső szőrsejtek feszültségfüggő hosszváltozásra képesek, mellyel egyrészt a cochlea erősítő funkcióját (cochlear amplifier) biztosítják, másrészt védelmet nyújt a membrana basilaris extrém kitérési ellen (20,30,31,120,127). B.2.1.1.3. Deiters sejtek: A Deiters sejtek a külső szőrsejtek támasztósejtjei, melyeket kehelyszerűen vesznek körbe, phalangealis nyúlványaik révén pedig a külső szőrsejtek apikális felszínét is elektromosan elszigetelik egymástól. Mikrotubulusokat és filamentumokat tartalmaznak, melyek a Corti szerv rigiditásának fenntartásában alapvető fontosságú. (Ilyen szerepe van még a belső és külső pillérsejteknek is.) (153). Az eredeti elképzelések szerint ezek a sejtek csak támasztó funkcióval bírnak, de az utóbbi évtizedekben egyre több bizonyíték van rá, hogy más szerepük is van, nevezetesen részt vehetnek a hanginger perifériás feldolgozásában valamilyen módon. Erre utal, hogy ezek a sejtek is depolarizálhatók, illetve, hogy ezek a sejtek is kapnak efferens
17
beidegzést (91). Másrészről a kreatin-kináz és a tubulovezikuláris membránstruktúra arra utal, hogy esetleg a külső szőrsejt motilitásban is szerepük lehet (159,160). B.2.1.2. Hallórostok B.2.1.2.1. Afferens hallórostok Az afferens rostok, mint már arról említés esett, kb. 90-95 %-a a belső szőrsejtekről vezetődik el, és csak kb. 5-10 %-a a külső szőrsejtekről (8,42,122,161). A humán cochleában kb. 36 000 afferens cochleáris idegrost van (116). A belső szőrsejtekről elvezetődő rostok myelinizáltak, bipolárisak, nagy sejttestük a gangion spiraleban helyezkedik el, ezeket nevezzük I. típusú afferenseknek (105,109,162). Az I. típusú afferensekre a divergencia jellemző, azaz egy belső szőrsejtről több (kb. 20) afferens vezetődik el (164). A II. típusú afferensek kisebbek, és zömében hiányzik róluk a myelinhüvely, ezek a rostok a külső szőrsejtekről visznek információt a központ felé. Ezen rostok a külső szőrsejtekről vezetődnek el, és a Corti alagutat keresztezve csatlakoznak a többi afferenshez. Ezeknek az afferenseknek a funkciója nem tisztázott, azonban feltételezik, hogy ezek az idegek a külső szőrsejtek kontraháltsági állapotáról szállítanak információt az agyba (42). Másik elképzelés szerint ezek a rostok filogenetikai maradványok, azaz az egyedfejlődés során egy rövid időszakban ugyancsak I. típusú rostok voltak, melyek maradványai lennének a II. típusú afferensek (152). Ezekre a rostokra a konvergencia jellemző, azaz 100 külső szőrsejtről is vezethet egy rost (32). B.2.1.2.2. Efferens hallórostok A cochlea efferens beidegzését elsőként Rasmussen írta le (134). Kezdetben is már kétféle, keresztezett, és keresztezetlen pályákat írtak le, pontos elkülönítésük csak később, a tracer technikák fejlődésével és elterjedésével vált lehetővé (197). Pontos funkciójukról sok adatunk van, azonban még a mai napig nem ismert teljes egészében. A cochlea efferens beidegzését két részre oszthatjuk: a laterális és a mediális olivocochlearis nyalábra (199). A lateralis olivocochlearis rostok kis fusiformis sejttestjei az azonos oldali oliva superior laterális magcsoportjaiban helyezkednek el, 18
míg a mediális olivocochleáris efferensek ovális, közepes és igen nagy neuronjai a mediális
oliva
superiorban
találhatók.
A
lateralis
efferensek
többségében
hüvelyezetlenek, míg a mediális köteg axonjai myelinizáltak. Az olivocochlearis nyaláb a vestibularis rosttal fut, és az Oort-féle vestibulocochlearis anasztomózis révén éri el a cochleát (163). A lateralis rendszer rostjainak 85-90 %-a a homolateralis cochleába projiciál, és a belső szőrsejtek alatt az afferens idegrost dendritjén alkot úgynevezett „en passant” és terminális axo-dendritikus szinapszist (57,89). Az mediális olivocochlearis rostok átkereszteződést követően (IV. agykamra fenekén) zömmel az ellenoldali belsőfülbe futnak, ahol szinapszist képeznek a külső szőrsejtekkel (57,198) (B/1 táblázat). Efferens
Lateralis olivocochlearis
Mediális olicochlearis
Sejttest
Oliva superior lateralis magjai
Oliva superior medialis
(kicsi, fusiformis sejtek)
magjai (nagy, ovális sejtek)
Myelin
Nincs
Van
Projekció
Ipsilateralis cochlea
Contralateralis cochlea
Szinapszis
Belső szőrsejt alatt az afferens dendritjén Külső szőrsejt bázisa
Transzmitter Acetilkolin, GABA, Dopamin,
Acetilkolin, GABA, CGRP
Neuropeptidek, (CGRP, dynorfinok, encephalinok), Szerotonin B/1 táblázat Az olivocochlearis efferensek főbb jellemzőinek összefoglalása Ezeken kívül a cochlea ereinek afferens beidegzése is jelentős, melyekről az utóbbi évek tanulmányai bebizonyították, hogy trigeminális eredetűek (186,187). B.2.2. Neurotranszmisszó a cochleában (B/2 ábra) B.2.2.1. Afferentáció A cochlea szenzoros epitéliumában a két fajta szőrsejt funkciója alapvetően eltér egymástól. A belső szőrsejtekről ugyan azt állítják, hogy a hallás valódi receptorsejtjei, mivel az afferensek 90-95 %-a róluk vezetődik el (l.d. B.2.1.2.1.), azonban fontos tudni, hogy ezek valójában passzív receptorsejtek, hiszen a finom hangolást (nagyfokú szenzitivitás és frekvencia specificitás) a külső szőrsejtek biztosítják (30,120). 19
A belső szőrsejtekből a mechanoelektromos transzdukció eredményeként transzmitter szabadul fel, mely az afferens izgalmi állapotát hozza létre. A transzmitterfelszabadulás
feltétele
a
felszültségfüggő
kalcium
csatornákon
a
kalciumionok sejtbe jutása (151). A mechanoszenzoros csatornákon kisfokú ionáramok azonban állandóan jelen vannak, így a feszültségfüggő kalcium csatornák valamilyen fokban állandóan aktiváltak (27,69). Ebből következik, hogy transzmitterfelszabadulás akusztikus inger nélkül is van, tehát az afferens rostoknak van nyugalmi kisülése (89,91). A szőrsejtek ingerületbe jövetele (pl. hanginger hatására), mely a szőrsejtek elhajlásának következménye a transzmitterfelszabadulás valószínűségét jelentősen megemeli. Ezzel ellentétben a sztereociliumok ellenkező irányú elhajlása a nyújtásaktivált kalciumcsatornák inaktiválását okozzák, mely a sejtek hyperpolarizációjához vezet, ez pedig a feszültségfüggő kalcium csatornákon keresztül kevesebb kalciumion beáramlást, és következményesen kevesebb transzmitterfelszabadulást eredményez. Ennek eredményeképpen az afferens rost kisebb tüzelési frekvenciája megfigyelhető (90,142). A
belső
szőrsejtekből
felszabaduló
ingerületátvivő
anyag
legnagyobb
valószínűség szerint a glutamát, ami a központi idegrendszer általános excitatoros transzmittere (62,16,42,45,46,100,112,122128). Korábbi állatkísérletek már találtak bizonyítékokat, hogy a belső szőrsejtekből glutamát szabadul fel, de ennek transzmitter szerepét nem sikerült minden kétséget kizáróan bizonyítani. Az elmúlt évben megjelent
Belsõ szõrsejt
Külsõ szõrsejt
Glu
Glu a9nAChR
ACh DA GABA NP 5-HT
ACh GABA NP
mAChR
D2
kainát NMDA
AMPA
nAChR
Lateralis Olivocochlearis Efferens
I. típusú II. típusú Afferens
Medialis Olivocochlearis Efferens 20
B/2 Ábra A cochlea szinapszisrendszerének összefoglalása. Részletesen l.d. a szövegben. (Rövidítések: ACh: acetilkolin, DA: dopamin, GABA: g-amino-vajsav, NP: neuropeptid, 5-HT: szerotonin)
közleményben (110) arról számolnak be, hogy humán sziklacsonton végzett kísérletek során bizonyították a glutamát afferens transzmitter szerepét. Kísérleteik során monoklonális antitestekkel a belső szőrsejtek szinaptikus régiójában azonosították cadaver temporális csontokon a glutamátot, a glutamin szintetázt és egy glutamát receptor alegységet (NMDAR2). Akusztikus stimuláció alatt többször detektálták már a glutamát-felszabadulást (42,73,122), mely azonban nem meggyőző, tekintetbe véve azt, hogy az ingerlés hatására tapasztalt glutamát felszabadulását a szőrsejtek kiirtását követően is regisztrálták (15). A korábbi kísérletek hitelességét rontja az a tény is, hogy kolinerg és GABAerg szinapszisból is felszabadulhat glutamát (34). Ez a glutamát ubikviter mivoltából adódik, ugyanis ez az aminosav a szervezet metabolikus folyamataiban is részt vesz (41). Nordang és mtsai (110) kimutatták a transzmitteren kívül annak szintézisében részt vevő enzimet és egyidejűleg annak receptorát is, ami együtt meggyőzően bizonyítja annak szerepét a neurotranszmisszióban. A nagyszámú közlemény, mely a glutamát receptor antagonistákkal és agonistákkal végeztek indirekt bizonyítékokat szolgáltatnak a glutamát afferens ingerületátvivő szerepéhez (42,122). A külső szőrsejtekből felszabaduló afferens traszmitter, tekintettel arra, hogy ezeknek a sejteknek az afferentációja nem bír olyan jelentőséggel, mint a belső szőrsejteké, nem áll annyira az intenzív kutatás középpontjában. Ugyan itt is valószínű a glutamát transzmitter szerepe (4,136), és a fenti közlemény (110) utal ebben a szinapszisban is részvételére, azonban különös gondot jelent itt is a metabolikus pooltól a transzmitter pool elkülönítése. Az afferens hallórostok dendritjén levő lehetséges receptorokkal igen sok tanulmány foglalkozik (42,122,151), hiszen a belső szőrsejt és az afferens rost közötti ingerületátvitelnek igen nagy klinikai jelentősége van (B.3.). A cochleában az ionotróp glutamát receptorok mindhárom (NMDA, AMPA, kainát) fajtáját azonosították. Korábbi
tanulmányok
kizárták
az
NMDA
receptorok
szerepét
az
afferens
transzmisszióban, ugyanis NMDA agonistákkal és antagonistákkal végzett kísérletek is hatástalannak bizonyultak a cochleáris potenciálokra (50,78). Ezeket a kísérleteket később nagyobb nagy intenzitású hangingerrel megismételve ennek ellenkezőjét találták, ugyanis mind az NMDA agonisták, mind az antagonisták szignifikánsan befolyásolták a szummációs akciós potenciált (124). Az utóbbi kísérletek nagyobb meggyőző erejét, azaz az erőteljesebb inger hatásosságát, az NMDA receptorok azon 21
tulajdonsága
biztosítja,
miszerint
hippocampusban
végzett
kísérletek
során
bizonyították, hogy ezeknek a receptoroknak az ingerléséhez erősebb, vagy sorozatos depolarizáció szükséges (26). Az AMPA és kainát receptorok jelenlétét az afferens dendriteken ugyancsak agonistákkal (14,76,77,88) és antagonistákkal (38,42,122) végzett kísérletek bizonyították. AMPA (125) és kainát (11) intracochleáris perfúziója során a szummációs akciós potenciál változását figyelték meg, míg a szőrsejtek potenciáljai nem változtak. Az antagonisták (CNQX, DNQX) ugyancsak az afferensek akciós potenciáljait változtatták meg (92). Érdekes, hogy a glutamát receptor agonisták minden esetben a várt szummációs akciós potenciálemelkedés helyett csökkenést okoztak, amit az afferens rostok nyugalmi aktivitásának következtében kialakult serkentés utáni gátlásnak tulajdonítanak (12). Az AMPA receptorokat később molekuláris biológiai módszerekkel is kimutatták (119). A cochleában elhelyezkedő metabotróp glutamát receptorokról szóló közlemények ellentmondásosak. RT-PCR és in situ hibridizációs technikával ugyan kimutattak több fajta metabotróp receptort is az afferens hallórostok dendritjén (108), de az agonisták hatására sem a másodlagos hírvivők emelkedett szintjét, sem megváltozott cochleáris potenciálokat nem tudtak regisztrálni (122). Újabb, mikroiontoforetikus technikával végzett kísérletek során azonban igazolták az
mGluR1 típusú receptorok jelenlétét is az afferens
transzmisszióban. Ez alapján úgy tűnik, hogy nem csak a korábban feltételezett afferens-regenerálódásában (149) van szerepük a metabotróp glutamát receptoroknak. B.2.2.2. Efferentáció Az oliva superior mediális sejtcsoportjaiból eredő mediális olivocochlearis rostok, mint már arról esett szó zömmel az ellenoldali belsőfülbe futnak, ahol szinapszist képeznek a külső szőrsejtekkel (B.2.1.2.2.). Tekintettel arra, hogy a mediális olivocochleáris efferentáció, és a külső szőrsejtműködés nem állt kutatásaink középpontjában, és ennek irodalma igen kiterjedt, itt erről csak egy viszonylag rövid összefoglalót adok. A mediális olivocochleáris rostok és a külső szőrsejtek között a fő ingerületátvivő az acetilkolin (31,168), de CGRP (42) és GABA (49,57,169) jelenlétét is kimutatták ebben a szinapszisban. Az izolált külső szőrsejtek kísérleti létrehozása óriási lehetőséget jelentett a mediális efferensek funkciójának vizsgálatához, a külső 22
szőrsejteken jelenlevő receptorok, ioncsatornák azonosításához (19). Az otoakusztikus emisszió felfedezése (82) ezen rostokról további funkcionális következtetéseket enged meg. Korábban azt gondolták, hogy nikotin- és muszkarinreceptorok is jelen vannak ebben a szinapszisban, mivel mindkettő receptorfajta antagonistái hatásosan gátolták a mediális olivocochleáris aktiválására létrejövő cochleáris potenciálokat. Később a Cortiszervben egy új nikotinreceptor alegységet, az a9-et fedezték fel (39), mely a fenti farmakológiai tulajdonságoknak megfelel. Ettől függetlenül jelenleg úgy tűnik, hogy muszkarinreceptor is szerepet játszik ezen szinapszis transzmissziójában (122). A mediális olivocochleráis rostok aktivitásukkal gátolják a külső szőrsejtek motilitását, ami a cochleáris erősítést csökkentéséhez vezet (104). Ennek egyik módja lehet a potenciált mozgássá átalakító mechanizmus hatékonyságának befolyásolása (168). Ennek a motilitást gátló hatásnak a hallás fiziológiás mechanizmusában haszna is lehet, például binaurális zajos környezetben csökkenti az idegi adaptáció okozta maszkolást, vagy az auditoros válasz elnyomásával elősegíti a szelektív hallást, amennyiben a figyelem máshová irányul (63). A mediális olivocochleáris rostok a lassú motilitás módosításával befolyásolni tudják a gyors szőrsejtmozgást is (36). A lateralis olivocochleáris rostok az azonos oldali oliva superior laterális magcsoportjaiból szállítanak információt a belsőfülbe, a belső szőrsejtek alatt az afferens idegrost dendritjein alkotnak szinapszist (17,91,198). Az utóbbi 5 évben egyes tanulmányok felvetették, hogy a lateralis olivocochleáris rendszert is két részre oszthatjuk: GABAerg és kolinerg efferensekre (143,198). A belső szőrsejt és az afferens idegrost közötti szinapszis modulációját végzik ezek a rostok, a belőle felszabaduló neurotranszmitterek kotranszmissziója révén. Az itt felszabaduló transzmittereket immunhisztokémiai és folyadékszcintillációs módszerekkel azonosították, ezek az acetilkolin, a dopamin, a GABA és különböző neuropeptidek (encephalinok, dinorphinok, CGRP) (138). Ezen kívül kimutattak szerotonint is a lateralis efferensekben, de ezek szerepe jelenleg nem ismert (58). Az acetilkolinról kimutatták, hogy a belső szőrsejtek alá juttatva fokozza az afferens spontán- és glutamát-kiváltotta kisülését. Ezzel szemben GABA nem változtatta meg a spontán aktivitást, viszonyt szignifikánsan csökkentette az I. típusú afferensek stimuláció-kiváltotta tüzelését (48). Az encephalinokat immun-hisztokémiával és HPLC-vel a lateralis efferensek szinaptikus végződéseiben mutatták ki (44), dinorfinok jelenlétét radioinnumassay-vel 23
igazolták (68), a CGRP-t immunhisztokémiai módszerrel azonosították a lateralis olivocochlearis
efferensek
terminálisaiban.
Saffieddine
és
mtsai
(138)
immunfluorescens kolokalizációs módszerrel valamennyi efferens transzmitter együttes jelenlétét kimutatták. A dinorfinoknak különleges szerepet tulajdonítanak a fülzúgás (tinnitus) létrejöttében. Ismert, hogy a dinorfinok a glutamát hatását az NMDA típusú receptorokon képesek potencírozni. Mivel a szőrsejtekből nyugalmi glutamát felszabadulás van, a dinorfinok fokozott felszabadulásuk révén az afferens rostok fokozottabb kisülését okozhatják, ami szubjektív tinnitusban nyilvánulhat meg (139). A dopamin cochleáris transzmitter szerepét 1978-ban Bobbin és Thompson még kizárta (16), tekintettel arra, hogy a szummációs akciós potenciálra szignifikáns hatást nem találtak. A dopamin cochleában betöltött transzmitter szerepére először Gil-Loyzaga és Praes-Herbute hívta fel a figyelmet 1989-ben magas nyomású folyadékkromatográfiával végzett tanulmányukban, amivel kimutatták dopamin jelenlétét a cochleában (60). Eybalin és mtsai (43) immunfluorescens technikával tyrozin-hidroxiláz pozitivitást, dopamin-b-hidoxiláz negativitást mutattak ki a lateralis efferensek varikozitásaiban, mely szintén dopamin jelenlétére utal. Laboratóriumunkban Gáborján és mtsai (53) in vitro mikrotérfogatú perfúziós rendszerrel neurokémiai bizonyítékot szolgáltattak a dopamin felszabadulására izolált tengerimalac cochlea lateralis olivocochleáris efferenséből. Kimutatták, hogy a dopamin felszabadulását preszinaptikusan D1 receptorok pozitívan regulálják, míg a D2 receptor által mediált negatív feed-back hatást kizártak. RT-PCR technikát alkalmazva D2long és D3 receptorokat azonosítottak a cochleában (81). B.2.2.3. A lateralis olivocochleáris efferensek védő funkciója, különös tekintettel a dopaminra A belső szőrsejtet ért akusztikus noxa, vagy ischaemia hatására abból extrém mértékű glutamát szabadul fel, ez a nervus cochlearis izgalma révén a cochleáris magvakba juttaja az ingerületet, ami átkapcsolódás után az oliva superior lateralis magvainak ingerületi állapotát okozza. Ezekből a magokból a lateralis olivocochleáris rostok a cochleába vezetik vissza az információt, mégpedig a belső szőrsejtek alatti
24
afferensek dendritjeihez (l.d. B.2.1.2.2.). Ezt a visszacsatoló kört nevezzük short-loop feed-back mechanizmusnak (127) (B/3 Ábra). A lateralis olivocochleáris rostoknak védő funkciót tulajdonítanak; zaj és ischemia esetén az extrém glutamát felszabadulás toxikus hatását posztszinaptikusan gátolja az afferens ideg dendritjén. Erre az első utalást Rajan tette 1985-ben (123), aki kísérleteivel bizonyította, hogy a lateralis efferens elektromos stimulációja csökkentette az intenzív hanginger kiváltotta cochleáris potenciálokat. Kimutatták, hogy intenzív akusztikus expozíció a cochlea potenciáljait jobban megváltoztatja,
amennyiben
az
efferenseket
sztrichninnel
gátolják
(123).
Mikroiontoforetikus technikával bizonyították, hogy a dopamin magában alkalmazva nincs különösebb hatása az afferens spontán aktivitására, ezzel szemben az NMDA- és AMPA-kiváltotta tüzelést dopamin és D1, illetve D2 dopamin-receptor agonisták dózisfüggően gátolták (111). Egy D2/D3 agonista szer, a piribedil intracochleáris perfúziója során azt találták, hogy intenzív zajexpozíció alatt, illetve ischaemia előtt alkalmazva, hatásukra a cochleáris potenciálok változása szignifikánsan kisebb volt. Ezzel morfológiailag korreál, hogy a piribedil alkalmazása
Glu
mellett
az
afferens
dendritek
károsodása
elmaradt,
ugyanakkor
a
károsodás
ugyanolyan
mértékű
szőrsejtek volt.
Ez
a
kísérletsorozat arra utal, hogy a dopamin közvetlenül az afferens rostokat védő
NMDA D2
funkciót
kainát AMPA
lát
el
ischaemia,
illetve
zajkárosodás esetén (28,29,57,131).
DA
Lateralis Olivoc oc hlearis Efferens
B/3
Ggl. spirale
Ábra
A
short-loop
feed-back.
Részletesen
l.d.
a
szövegben.
(Rövidítések:
Nucl.
cochl:
Nucleus
cochlearis, Oliva sup.: Oliva superior, DA: dopamin)
Oliva sup.
Nucl. cochl.
25
B.2.3. A szőrsejtek kalcium-homeosztázisa (B/4 ábra) A szervezetben a legtöbb biokémiai út, transzdukciós mechanizmus vagy sejtek közötti információátvitel intracelluláris szabad kalciumionok által szabályozott. Ebből adódik, hogy igen fontos a sejten belüli szabad kalciumion koncentráció szigorú regulációja. A kalcium a sejtek homeosztázisában alapvető fontosságú, így a fehérjefoszforilációban, az intracelluláris pH szint, sejtvolumen és a különböző ioncsatornák aktivitásának szabályozásában központi szerepet játszik (196). A transzdukciós mechanizmusoknak a cochleában kiemelt jelenőségük van, hiszen a hanginger elektromos jellé alakítása (mechanoelektomos transzdukció) és a külső szőrsejtek motilitása (elektromechanikus transzdukció) is ilyen folyamat. Az előbbiben fontos moduláló szerepet tölt be az intracelluláris szabad kalcium (115). Utóbbi folyamatban a lassú szőrsejtmozgásban van szerepe (167). A fenti élettani folyamatokon túl a kalcium szerepe kiemelkedő patológiás
Protein kinázok
Kalciumkötő fehérjék ATP
Ca
ADP
ATP
ADP
RyR
IP3R
2+
Ca
R
2+
Ca2+
Na+
Ligandum
Ca2+
NyACs
Ca2+
VDCC
Ca2+
Ca2+
Endoplazmatikus retikulum
Na+
Ca2+
Mitokondrium
B/4 Ábra. A szőrsejtek kalcium-homeosztázisa vázlatosan. (Rövidtések: R: receptor, NyACs: nyújtás aktivált csatorna, VDCC: feszültségfüggő kalcium csatorna, RyR: ryanodin receptor, IP3R: inozitol-trifoszfát receptor.) 26
folyamatokban is. Az intracelluláris kalciumszint emelkedése ozmotikus változásokat eredményez, melynek hatására víz áramlik a sejtekbe, mely a sejtek duzzadását, degenerációját, végül nekrózisát okozza. A tartósan magas kalciumszint olyan fehérjéket aktivál, melyek a sejt ledontását indukálják. Ezen kívül enzim túlaktiváció, szabadgyökképzés, membránkárosodás és DNS fragmentálódás következik be, mely ugyancsak sejthalálhoz vezet (47) (részletesen l.d. B.3.1.). Az intracelluláris szabad kalciumszint szabályozása a sejtekben több szinten valósul meg. Az első szint maga a plazmamembrán, ahol a beáramlás ligand aktivált kalcium
csatornákon
(elsősorban
NMDA
típusú
glutamát
receptorokon
és
nikotinreceptorokon), L-típusú feszültségfüggő kalcium csatornákon, és a szőrsejteken a nyújtás (stretch) aktivált csatornákon keresztül történik. A kiáramlás kalcium pumpákon és Na+-Ca2+ antiporteren keresztül zajlik. A második szintet az intracelluláris kalciumkötő fehérjék és organellumok jelentik. A kalciumkötő fehérjék pufferként, transport-fehérjeként, illetve enzimaktivitás szabályozóként is szerepet játszhatnak. Az endoplazmatikus retikulum, mely igen kifejezett a szőrsejtekben (l.d. B.2.1.1), és a mitokondriumok energiaigényes folyamatokkal kompartmentalizálják a kalciumot. A kalcium felszabadulása ezekből a raktárakból jól szabályozott módon, inozitoltriszfoszfát és ryanodin receptorokon keresztül történik (196). B.3. A cochlea működése patológiás folyamatokban Ebben a fejezetben kizárólag a kutatásainkkal kapcsolatba hozható noxákkal és azok lehetséges patomechanizmusaival foglalkozom, így az ischaemia, a zaj és az aminoglikozidok által okozott cochleáris károsodásokkal. B.3.1. Ischaemiás halláskárosodás A cochlea vérellátása igen sérülékeny, az autoreguláció igen érzékeny (178183,185. Az ellátó ereken történő elégtelen keringésen kívül több tényező okozhat keringészavart, így például az endolymphahydrops is (181,184). Kimutatták, hogy ischaemiás körülmények között sejtek tartós depolarizációja következtében a glutamát felszabadulása megnövekedik az idegrendszerben (101), de a 27
glutamát nem-szinapikus transzmisszó útján is előidézheti hatásait (190). Ennek oka legnagyobb valószínűséggel az energiaigényes Na+/K+ pumpa bénulása (140). Másrészről a glutamát neuronális és gliális visszavétele csökken, melynek oka az uptake rendszer elégtelen energiaellátásából adódik (101). Ennek a két folyamatnak az eredményeképpen a glutamátkoncentráció a szinaptikus résben extrém mértékben megnő (10 mM), ami a poszszinaptikus glutamátreceptorok fokozott ingerületét okozza. Az excitotoxicitás szempontjából kiemelkedő az ionotróp receptorok jelentősége, melyek maguk is ioncsatornák. Ezeken át nagy mennyiségű kation (elsősorban Na+ és Ca2+) áramlik a sejtekbe, ez az ozmolaritás szabályai szerint nagy mennyiségű vízbeáramlást okoz. Ez a vízbeáramlás a sejtek duzzadásához (101). Az NMDA receptorokon, a feszültségfüggő kalcium csatornákon belépő, illetve az intracellulárisan kompartmentalizált Ca2+ mobilizálásával proteázok és lipázok aktiválása következik be, mely hosszú távon a sejtek irreverzibilis önemésztődéséhez vezet (2,25,40). Ez a folyamatot valószínűleg a Corti szervben is lejátszódik, a belső szőrsejtekből felszabaduló extrém mértékű glutamát (9,65,100,112,128,131130) az afferens rostok duzzadásához, degenerációjához vezet (132). Úgy tűnik, hogy elsődleges a nem-NMDA receptorok aktivációja, és az NMDA receptorokon keresztül megvalósuló afferenspusztulás másodlagos (38,124). A kainát és AMPA inracochleáris alkalmazása során azonnali és jelentős afferensduzzadást észleltek (125,129), melyet nem-NMDA antagonistákkal ki tudtak védeni (126). Az afferensek duzzadását humán cadaver sziklacsontokon is megfigyelték, amikor a keringés leállása és a fixálás között hosszú idő telt el (164). A dopamin lehetséges védő hatásáról és az agonista piribedilről már esett szó (B.2.2.3.) (B/5 A Ábra). A sejtekbe jutott kalciumionok hatására a nitrogén monoxid szintetáz (NOS) is aktiválódik, ami fokozott nitrogén monoxid (NO) produkciót eredményez (103) (B/5B, ábra). A NO neuromodulátor és neurotranszmitter szerepet is betölt a
28
Belsõ szõrsejt
B/5 Ábra Ischaemiás
Glu uptake
Ischaemia
Glia +
K
ATP Na
+
Glu
Glu
Glu uptake
Glu Ischaemia
lehetséges mechanizmusa Részletesen l.d. a
+
Na
szövegben.
Na+
Ca2+
halláskárosodás
+
Na
NMDA
NOS
Ca2+
NO
AMPA
kainát
+ Na Ca2+
Afferens
cochleában (42). Izolált belső szőrsejtekből az NO felszabadulását bizonyították (170). A NO a DNS szintézist, a citromsav-ciklust és az elektrontranszport láncot is gátolja a vas-szulfid tartalmú enzimek inaktiválásával (156). A toxikus szabadgyök-képzésben is szerepet játszik az NO túlprodukciója, mivel reakcióba lép a szuperoxid anionnal (O2-), és peroxinitrit anion (OONO-) keletkezik, ami igen agresszív hidroxilionra (OH-)és nitrogén dioxidra (NO2-) bomlik (7). A NO a programozott sejthalált, az apoptosist is beindítja, amit pro-apoptotikus molekulák fokozott, a citoprotektív molekulák csökkent termelése, az ATP raktárak kimerítése, és katabolikus folyamatok (pl.: RNS, DNS, fehérjebontás) aktiválása közvetít (203). A NO hatására létrejövő apoptosist a ganglion spirale sejtjeiben is kimutatták (117,205). Cochleában NO- és szabadgyök-termelést kimutattak sejtaktivációt követően (74,94). Állatkísérletekben NOS inhibitorral sikerült kivédeni a baktériumtoxin által okozott cochleakárosodást (5). A NO-ról ezzel szemben kimutatták azt is, hogy a cochleáris véráramlást serkenti, szerepe központi a cochlea autoregulációs mechanizmusában (183,185).
29
B.3.2. Akusztikus trauma Állatkísérletekben alapvetően két folyamatot figyeltek meg az állatok zajexpozícióját követően: az egyik a szőrsejtkárosodás, a másik a primer afferens neuronok dendritjeinek destrukciója (122). A szőrsejtkárosodás a külső szőrsejtek első sorával kezdődik, melyet a belső szőrsejtsor degenerálódása követ, és legvégül figyelhető meg a második és harmadik külső szőrsejtsor pusztulása (144). A primer afferens rostok akusztikus trauma kiváltotta duzzadása, majd degenerációja és pusztulása ugyanannak a folyamatnak, azaz a glutamát excitotoxicitásnak a következménye, amit a B.3.1. pontban már kifejtettem. A két noxa, azaz az ischaemia és zajhatás, hasonló patomorfológiai következményének egyik oka a zaj hatására fellépő csökkent cochleáris véráramlás (113,172), és az endolympha oxigénszaturációjának romlása (173). Ezt több kísérletsorozat is bizonyítja. Egyrészt glutamát receptor agonistákkal végzett kísérletek a zajhatásra fellépő afferensduzzanathoz (135) hasonló morfológiai elváltozásokat tudtak létrehozni (42,122,129). Másrészt glutamát receptor antagonistákkal meg tudták akadályozni a zaj hatására kialakuló afferensduzzanatot (73,130), és a szummációs akciós potenciálértékek is kevésbé változtak (83,122,148). B.3.3. Aminoglikozid ototoxicitás Az aminoglikozid antibiotikumok gram-negatív baktériumok ellen hatékonyak. Támadáspontjuk
többes,
egyrészt
a
fehérjeszintézist
gátolják
a
bakteriális
riboszómákhoz való kötődés révén, másrészt foszfolipidekhez is kötődnek, amivel membránkárosodást is létrehoznak, harmadrészt szabadgyökképzés révén a fehérje-, zsír- és DNS-katabolizmust is indukálnak (66). Ezek a folyamatok nem kizárólag a baktériumokban, de a gazdaszervezetben is lejátszódhatnak (93). Bár ezeknek a gyógyszereknek az oto- és nefrotoxicitása jól ismert, a klinikai gyakorlat még a mai napig rákényszeríti az orvosokat az aminoglikozidok használatára súlyos gram-negatív fertőzésekben. Az ototoxikus antibiotikumok egy csoportja főleg vesztibulotoxikus, mint pl.: a streptomycin és a gentamicin, másik részük inkább cochleáris károsodást idéz elő, ilyenek az amikacin, a kanamycin és a neomycin (23).
30
Ezeknek az antibiotikumoknak nagy dózisa a legtöbb emberben toxikus, de egyes családokban már kis koncentrációk is halláskárosodást, süketséget okozhatnak (51). Az ototoxikus halláskárosodáshoz való genetikai fogékonyság intenzív kutatások tárgyát képezi, feltételezik egy öröklött mutáció szerepét. Kínai családokban, akiknél halmozottan
fordult
elő
aminoglikozidok
által
indukált
halláskárosodás,
a
mitokondriális 12S rRNS gén A1555G mutációját találták (121). Az aminoglikozidok által okozott halláskárosodás magas frekvenciákon kezdődik, és a progresszív, irreverzibilis külső szőrsejt-pusztulás a csiga bázisánál jól ismert tény (37,146,157). A belső szőrsejtek kevésbé tűnnek érzékenynek az aminoglikozidokra, bár amikacin hatására kimutattak ennek a sejttípusnak a degenerációját is. Elektromikroszkópos tanulmányok az érzékhám pontos károsodási sorrendjét mutatták ki. A szőrsejtek sztereociliumainak disztorziója, fúziója, majd elvesztése a sejttest pusztulásához vezet. A Deiters sejtek nyúlványai is eltűnnek. A külső szőrsejtek károsodása az első sorban kezdődik, majd a második és harmadik sorok is degenerálódnak. A szőrsejtek helyét támasztósejtek, főleg pillér- és Deiters sejtek foglalják el (150). A fenti morfológiai eltérésekkel párhuzamosan a funkcióban bekövetkező károsodások is megfigyelhetők: a cochleáris mikrofónia csökken, majd később irreverzibilis küszöbemelkedés következik be (137). Tekintettel arra, hogy elődlegesen külső szőrsejt-károsodás lép fel, az otoakusztikus emisszóban is eltéréseket regisztráltak aminoglikozidkezelést követően: a tranziens- és disztorziós kombinációs otoakusztikus emisszió amplitúdók megváltoztak. A morfológiai elváltozásokat követve kezdetben a magas, majd az alacsonyabb frekvenciatartományok komponensei változtak (80).
31
C. Célkitűzések I. Ischaemiás modell felállítása a cochleában Az irodalomban elsőként Intézetünkben sikerült in vitro mikroperfúziós módszerrel neurofarmakológiai bizonyítékot szolgáltatni a dopamin neurotranszmitter szerepéről (53). Izolált tengerimalac cochleán végzett, in vitro kísérleteinkkel (1) egyrészt további bizonyítékokat akartunk szolgáltatni a dopamin neurális eredetéről, (2) másrészt arra kerestük a választ, hogy gyógyszeresen modellezett zaj és ischaemia hatására a cochleában valóban emelkedik-e a dopamin felszabadulása. Korábbi kísérletekben igazolták, hogy az ischaemia (hypoglikémia + hypoxia) hatására létrejövő, főleg citoplazmatikus eredetű transzmitterfelszabadulást a kalciumiontól független intracelluláris nátriumion-szint emelkedés okozza (102). A veratridin egy neurotoxikus, nátrium-csatorna aktiváló szer, alkalmazása intracelluláris nátriumion koncentráció emelkedést okoz, hatását kizárólag depolarizálható sejtmembránokon hozza létre, azaz csak neuronális sejteken hat (22,21,33,175). A veratridin tehát ischaemiához hasonló intracelluláris viszonyokat teremt, és egyben alkalmas a dopamin neuronális eredetének igazolására. (3) Továbbá azt szerettük volna megvizsgálni, hogy gyógyszeresen befolyásolható-e a dopamin felszabadulása, mely a későbbiekben esetleg terápiás lehetőségekkel is kecsegtet. Kimutatták, hogy a központi idegrendszerben több helyen a glutamát receptorok izgatása a dopamin felszabadulását eredményezi (24,71,84). Idáig az irodalomban nem találtunk utalást arra, hogy a (4) cochleáris dopamin felszabadulásában az ionotróp glutamát receptorok szerepet játszanak-e, ezért erre is választ kerestünk kísérleteinkben. A glutamát receptor antagonisták alkalmazásának másik célja az volt, hogy kimutassuk, vagy kizárjuk a belsőfülben egy a cochleán belüli, visszacsatolási mechanizmus jelenlétét, mely védelmet biztosítana a külső noxák következtében létrejövő glutamát okozta excitotoxicitás ellen. Elképzeléseink szerint ennek lényege a belső szőrsejtekből felszabaduló glutamátnak a laterális olivocochleáris efferensre való közvetlen hatására létrejött dopamin felszabadulás lenne. II. A dopamin és glutamát felszabadulásának szimultán mérése a cochleából (5) Célunk volt egy új módszer beállítása, melynek segítségével izolált tengerimalac cochleából in vitro mikroperfúziós módszer segítségével párhuzamosan 32
detektálhatóvá válik a dopamin és a glutamát felszabadulása. Ezek során a kísérletek során a tetrodoxin, ami egy feszültségfüggő nátrium-csatorna gátló szer, alkalmazásával bizonyítani akartuk mind a dopamin, mind a glutamát neuronális eredetét. Ismert a dopamin
posztszinaptikus
gátló
hatása
a
glutamáterg
sejtekre
(42,57,59,111,112,122,127). (6) A dopamin agonistával és antagonistával végzett kísérleteink során arra kerestük a válasz, hogy a glutmát felszabadulására hatással van-e a dopamin. III. Aminoglikozid antibiotikumok új hatásmechanizmusa Az aminoglikozid antibiotikumok ototoxikus hatásának több mechanizmusa ismert (42,107,133,145). (7) Kísérleteinkkel az aminoglikozidok hatását vizsgáltuk a dopamin felszabadulására. Figyelembe véve, hogy a dopaminnak ischaemia és zaj esetén védő szerepet tulajdonítanak (28,29,57,59,111,122,123,127,128,130), az aminoglikozidok káros hatásának megértésében a dopamin-felszabadulás gátlása új patfiziológiai utat jelenthet. IV. Intracelluláris kalciummérés intakt Corti szerven (8) Végül jelenleg is folyó kísérleteinkben a fenti folyamatok intracelluláris mechanizmusainak jobb megértését tűztük ki célul. Ennek érdekében egy olyan preparátumot létrehozásán dolgoztunk, mely elsőként lehetőséget teremt a halló érzékhám különböző sejtjeiek intracelluláris kalciumion-koncentrációjának mérésére. Mindezt olyan körülmények között kívántuk elérni, melyben a sejtek saját környezetükben vizsgálhatók, nem elveszítve a más sejtekkel fennálló kapcsolataikat.
33
D. Anyag és módszer D.1. Állatok Kísérleteinkhez pigmentált, 200-350 gramm súlyú, hím tengeri malacot használtunk, melyeket a Humán Rt-től (Gödöllő) szereztünk be. Az állatok felhasználásakor a National Institute of Health erre vonatkozó irányadóját figyelembe véve mindvégig az állatok szenvedésének minimalizálására törekedtünk. A kísérleteket a Magyar Tudományos Akadémia Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetének Állateikai Kódexe alapján végeztük. D.2. Felhasznált anyagok Kísérleteinkhez fiziológiáshoz hasonló, perilympha-szerű oldatot használtunk (70), melynek összetétele a következő volt: 150 mM NaCl, 3,5 mM KCl, 1 mM CaCl, 1 mM MgCl, 2,75 mM HEPES, 2,25 mM Tris-OH. Az oldat vegyhatását sósav hozzáadásával 7,4-re korrigáltuk, ozmolaritását 300 mosm/kg H2O-re titráltuk a,Dglükóz hozzáadásával. Kísérleteinket mindvégig 37 oC-on termoregulált körülmények között 100 %-os O2 szaturáció mellett végeztük. Az alkalmazott tetrodotoxin (TTX), veratridin, dizocilpin (MK-801), GYKI52466, szulpirid, bromokriptin mezilát, neomycin szulfát, gentamicin szulfát és kanamycin A vegyületeket a Sigma (St.Louis, MO, USA) gyártotta. A [7.8-3H]dopamint (specifikus activitás: 1.81 TBq/mmol, 49.0 Ci/mmol) az Amersham International (Anglia) állította elő. Az intracelluláris kalciumkoncentráció méréséhez fura-2/AM-et és 0,025% (w/v) Pluronic F-127 detergenst használtunk. D.3. Izolált tengerimalac cochlea preparátum (D/1 ábra) A tengeri malacok dekapitálása után, a nyaki csigolyákat eltávolítottuk. Az occipitális csontot szabaddá preparáltuk, majd a koponyán a foramen magnumból kiinduló sagittalis metszést ejtettünk. Az emberi os temporale pars petrosájának megfelelő csontos bulla tympanit kiemeltük, és felnyitottuk. A további preparálást 34
perilympha-szerű oldatban végeztük (összetételét l.d. D.2.). Sztereómikroszkópos szemellenőrzés mellett a cochleáról a borító mucoperiosteumot eltávolítottuk, majd a csiga csontos vázát körkörösen lepattintottuk, a stria vascularist lefejtettük, a modiolust a cochlea bázisánál eltörtük. Az így nyert preparátumunk az alábbi idegi struktúrákat tartalmazta: a ganglion spiralet, az afferens hallórostokat, az efferens idegek axonjait és axon terminálisait, illetve a belső- és külső szőrsejteket.
A
B
C
D
D/1 ábra A. A kinyitott bulla tympaniban látható a nyálkahártyával fedett csiga. B. A csiga csontos tokjának lepattintásával láthatóvá válnak a csiga kanyarulatai, annak szélén a stria vasularissal (fekete nyíl). C. A stria vascularist lefejtettük. D. A modiolust eltörtük csiga bázisánál, az így létrejött preparátumbanaz érzékhám vizsgálata elérhetővé vált.
35
D.4. Dopamin felszabadulásának mérése D.4.1. In vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszer (192)(D/2 ábra) A fent leírt módon elkészített preparátumainkat 1 ml perilympha-szerű oldatba helyeztük, melyhez 10 mM trícium izotóppal jelölt dopamint adtunk. Egy órás inkubációt követően a cochlea-preparátumokat egyenként 100 mM belső térfogatú plexiüveg kamrákba helyeztük. Ezt követően 0,3 ml/perc áramlási sebességgel a kamrákat perilympha-oldattal áramoltattuk át. Egy órás előperfúziót követően a kifolyót 3 perces frakciókba gyűjtöttük, melyek mindegyike így 0,9 ml-t tartalmaz a kifolyóból. Az inkubáció, az előperfúzió és a perfúzió során mindvégig 100% O2-nel szaturáltuk az oldatot és a hőmérsékletet 37oC-on tartottuk. 20 frakció összegyűjtését követően a cochlea preparátumokat a perfúziós kamrákból kivettük és 0,5 ml 10 %-os triklórecetsavba
helyeztük
egy
napra,
majd
100
ml-t
lemértünk
szöveti
radioaktivitásként. Az egyes frakciók rádióaktivitásának meghatározásához azok 0,5 mlét 2ml szcintilliációs koktéllal (Ultima GOLD, Packard, USA) kevertük össze, majd folyadék szcintillációs spektrometriával mértük meg, melyhez Packard TR 1900 (USA) készüléket használtunk. Az egyes frakciókra jutó dopamin-felszabadulást az egész szövet radioaktivitásának az adott frakcióra jutó aktivitásának arányaként határoztuk
D/2 Ábra Az in vitro preparátum
mikrotérfogatú perfúziós rendszer (1- perfúziós oldat,
5
2- perfúziós pumpa, 3- termosztát, 4-
4 6
mikrotérfogatú 5
1
kamra, 5elektromos ingerlő
3
2
elektródák, 6mintagyűjtés, az
meg.
áramlás irányát nyilak jelzik) 36
D.4.2. A perfundált szövet ingerlése D.4.2.1. Elektromos téringerlés Elektromos téringerlést a szövetet tartalmazó kamra alsó és felső pólusába épített platina elektródokon át alkalmaztunk 3 percen át 60 V feszültséggel, 2 Hz-es frekvenciával 0,5 ms-os időtartamig (Grass S88, USA), így egy ingerlési periódus 360 négyszögimpulzust tartalmazott. Az elektromos téringerlést általában a 3. és 13. mintagyűjtési periódus alatt alkalmaztuk. Egyek kísérletekben kizárólag a 3. periódus alatt ingereltünk, míg bizonyos kísérletek során nem végeztünk elektromos ingerlést. D.4.2.2. Veratridin-ingerlés Azokban a kísérletekben, melyekben csak a 3. mintagyűjtési periódus alatt alkalmaztunk elektromos téringerlést, ott a perfundált szövetet a 8-10 periódusok alatt 30 µM veratridint tartalmazó oldattal ingereltük. Azokban az esetekben, mikor nem végeztünk elektromos téringerlést, a szövetet a 3-5. frakció alatt ingereltük veratridinnel. D.4.3. Drogok hozzáadása A kísérletek legnagyobb részében, amikor elektromos téringerlést alkalmaztunk, a vizsgált drogot a két ingerlés között adtuk a perfundáló oldathoz (6. frakció), és azt a mintagyűjtés végéig alkalmaztuk. A glutamát receptor antagonistákat ettől eltérően a mintagyűjtés előtt 6 perccel, tehát még az előperfúzió alatt a rendszerhez adtuk. A veratridin-ingerlés eseteiben az antagonistákat és a TTX-t a stimuláció előtt 2 frakcióval kezdtük alkalmazni és a veratridinnel egyidőben függesztettük fel. D.4.4. A felszabadult dopamin mennyiségének értékelése Az elektromos téringerlés által kiváltott felszabadulását a következők szerint számítottuk ki: az ingerlés előtt (2., 12. frakció) és után (6., 16. frakció) mért bazális kiáramlás átlagát kivontuk a stimuláció hatására létrejött teljes radioaktív kiáramlásból. 37
Ezzel a módszerrel görbe alatti területet számoltunk (FRS1 és FRS2) (D/3 A ábra). A drogok perfundáló oldathoz való adása előtti és utáni stimuláció-kiváltotta dopaminkiáramlások arányit kiszámítottuk (FRS2/FRS1), és a kontrollhoz hasonlítottuk. A nyugalmi dopamin-felszabadulásának változását a 11-12. frakciók átlagának (FRR2) és az 1-2. frakciók átlagának (FRR1) hányadosával fejeztük ki (FRR2/FRR1)(D/3 A ábra). A veratridinnel történt ingerlés esetén a görbe alatti területet (FRSver) a veratridin-hatás alatti és az összes radioaktivitás-kiáramlás különbségéből számítottuk ki (D/3 B ábra).
fr (%)
4
3
2
FRSver
1
Sver
S1
0
minta
14 12
fr (%)
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
10 8
FRS 2
6 4
FRS 1
2
FRR 2
FRR 1
0 1
2
3
S1
4
5
6
7
8
minta
9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
S2
D/3 ábra Stimuláció hatására felszabaduló dopamin mennyiségének értékelése. Az fr(%) a frakcionális felszabadulást jelzi, mely az adott minta radioaktivitását jelenti a szövet radioaktivitásának arányában. Az S1 és S2 az elektromos téringerlést, az Sver a veratridin-ingerlést jelzi. Az FRR1 és FRR2 a nyugalmi dopamin-felszabadulást jelenti. Az időegység alatt felszabaduló radioaktivitásból kivontuk a nyugalmi kiáramlást, és így megkaptuk a görbe alatti területeket (FRS1, FRS2, FRSver). 38
D.5. Glutamát és dopamin felszabadulásának párhuzamos mérése Ebben a kísérletsorozatban a perfundáló oldatokat baktériumszűrőn áramoltattuk át a kísérletek előtt, majd steril edényekben tároltuk. A perfúziós rendszert sterilizáltuk a kísérletek előtt, a kifolyó mintákat sterilizált kémcsövekbe fogtuk fel, és glutamát meghatározásra szánt mintákat azonnal szárazjégbe helyeztük, majd –70oC-on tároltuk a magas nyomású folyadékkromatográfiás mérésekig. D.5.1. In vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszer módosítása A cochlea-preparátumokat [3H]dopaminnal inkubáltuk, majd előperfúziót követően in vitro mikrotérfogatú perfúziós rendszer kamráiba helyeztük a már leírt módon (l.d. D.4.1.), azzal a különbséggel, hogy a frakciókat csak 24 percig gyűjtöttük (8 minta). A 0,9 ml-es frakciókból (3 perc alatt 0,3 ml/perc sebességgel kifolyó) 0,5 mlt folyadék szcintillációs spektrometriás dopamin-meghatározásra, a fennmaradó 0,4 ml-t pedig magas nyomású folyadékkromatográfiás glutamát meghatározásra használtunk fel. D.5.2. Magas nyomású folyadékkromatográfiás (HPLC) glutamát meghatározás (158) A kifolyók 0,4 ml-ét használtuk a glutamát tartalom meghatározására, melyhez egy Gilson folyadékkromatográfiás rendszert használtunk (Gilson Medical Electronics Inc., Middleton, WI, USA). Az aminosavak szeparálását egy 3 µm-es Nucleosil C-18 oszlopon végeztük, mely 150 x 4,6 mm nagyságú volt. A koncentrációkat egy belső standardot használó két-pontos kalibrációs görbével határoztuk meg. Az oszlopot ezt követően „A” oldattal ekvilibráltuk, mely 11,25 % metanol-acetonitrilt (3,5:1 v/v) tartalmazott 0,01 M-os kálium foszfát pufferben (pH=7,2). A mobilis B fázis 22,2 % acetonitrilt tartalmazott metanolban (95). Az analízist 1,0 ml/perc áramlási sebesség mellet végeztük. A perfúziós oldatot 3000 g-vel centrifugáltuk 15 percig 0-4oC-on, a felülúszót –70oC-on tartottuk az analízisig. A derivatizációt 50µl OPA (o-ftaldialdehid) és 200 µl minta összekeverésével végeztük, melyhez belső standardként 50µl 2µM-os 39
a-amino-zsírsavat adtunk 2 perccel az oszlopra injektálás előtt. Az egyensúly beállta után az így kapott származékból 200µl térfogatot az oszlopra töltöttünk, és „A” pufferrel átmostuk, majd az oszlopot az elemzőbe helyeztük. A derivatizációt és a dúsítást speciális programmal végeztük. D.5.3. Drogok hozzáadása Az glutamát méréses kísérletsorozatban a felhasznált drogokat (TTX, szulpirid, bromokriptin mezilát) 6 perccel a mintagyűjtés előtt (az előperfúzió alatt) adtuk a perfundáló oldathoz és a kísérlet végéig alkalmaztuk. D.5.4. Elektromos téringerlés Azokban a kísérletekben, melyekben a dopamin felszabadulással párhuzamosan glutamát koncentrációmérés is történt, ott az ingerlési paraméterek a következők voltak: 3 perc alatt 60 V feszültséggel, 10 Hz frekvenciával és 2 ms időtartammal 1800 impulzust alkalmaztunk. D.6.
Aminoglikozid
antibiotikumok
hatásának
vizsgálata
a
dopamin
felszabadulására D.6.1. Akut hatás vizsgálata Az aminoglikozid antibiotikumok akut hatásának vizsgálatakor a D.4.1. fejezetben leírt módon in vitro, mikrotérfogatú perfúziós módszert alkalmaztunk. A kifolyót 20 x 3 perces frakcióban foguk fel, elektromos téringerlést a 3. és 13. mintagyűjtési periódus alatt alkalmaztunk. Az aminoglikozid antibiotikumokat (neomycin, gentamicin, kanamycin) a 6. frakció alatt adtuk a perfúziós folyadékhoz és a kísérlet végéig alkalmaztuk. Kísérleteink eredményeit a D.4.4. pontban leírtak szerint értékeltük.
40
D.6.2. Krónikus neomycin kezelés A krónikus kezelés során a tengerimalacok 14 napon keresztül 50 mg/kg/die neomycint kaptak szubkután, majd a 15. napon a már leírt módon (D.3.) cochleájukat izoláltuk. Ezt követően in vitro mikrotérfogatú perfúziós módszer segítségével, a D.6.1. fejezetben leírtak szerint vizsgáltuk a dopamin felszabadulását elektromos téringerlés hatására, neomycin különböző koncentrációjú (30, 100, 300, 1000 µM) oldatainak a jelenlétében. D.7.
Szőrsejtek
intracelluláris
Ca2+-koncentrációjának
vizsgálata
intakt
tengerimalac Corti-szerven D.7.1. Corti szerv preparálása A preparálásnál a D.3. pontban leírtakhoz lényegében hasonlóan jártunk el, azzal a kivétellel, hogy a csiga csontos vázát nem teljesen pattintottuk le, hanem csak a csúcsi részről távolítottuk el a csontot. A stria vascularist nem fejtettük le, és a modiolust a cochlea bázisánál nem törtük el. Az érzékhám felületének óvatos scarificálásával távolítottuk el a Reissner membránt és a membrana tectoriát. D.7.2. Intracelluláris Ca2+-mérés A preparátumunkat 10 µM fura-2/AM és 0,025% (w/v) Pluronic F-127 detergenst
tartalmazó
perilympha-szerű
oldattal
töltöttük
szobahőmérsékleten,
sötétkamrában, folyamatos rázást biztosítva 60 percig. A töltés alatt 100 % O2-nel szaturáltattuk az oldatot. Ezt követően az extracelluláris kalciumfestéket kimostuk, és 20 percig az oldatban hagytuk a preparátumunkat deészterifikálás végett. A preparátumot perfundáló kamrában rögzítettük úgy, hogy a kifejtett cochlea részlet legyen felül, majd ezt Gibraltar BX1 (Burleigh) asztalon rögzítettük, és 40X vízimmerziós objektívvel vizsgáltuk Olympus BX51 WI mikroszkópon. A perfúziós kamrát 2 ml/perc sebességgel áramoltattuk át perilympha-szerű oldattal. A preparátumot 340 és 380 nm-es ultraibolya (UV) fénnyel gerjesztettük, melyet egy T.I.L.L. Polychrome II monokromátorral állítottunk elő. Az UV megvilágítást egy, a fény útjába 41
állított, változtatható diafragmával szabályoztuk. Az emittált fényt (l=510±20 nm) egy hűtött CCD kamerával (Photometrics Quantix) detektáltuk, melyet az Axon Imaging Workbanch 2.2 software-rel végeztük. Ingerléshez a perfundáló folyadékhoz adott 100 mM koncentrációjú kálium klorid (KCl) oldatot használtunk. Az intracelluláris kalciumion-koncentrációt az alábbi képlet segítségével számítottuk ki: [Ca2+]i = Kd x Fmax380/Fmin380 x (R-Rmin)/(Rmax-R) ahol az R a 340 nm-es és 380 nm-es gerjesztés alatti emisszió-intenzitások hányadosa; az Rmin a szabad Ca2+-mentes közegben számított hányados, az Rmax a magas Ca2+-os közegben mért hányad; az Fmax380 a fluoreszcens intenzitás 380 nm-es gerjesztéskor, Ca2+-mentes közegben; az Fmin380 ugyanez az érték magas Ca2+-os közegben. A sejtek intenzitás-értékeit korrigáltuk az fura-2-vel töltött sejt közelében mért aktuális háttérintenzitással. A rendszert jellemző Kd, Fmax380/Fmin380, Rmin and Rmax paramétereket empirikusan határoztuk meg a Calcium Calibration Buffer Kit with Magnesium #2 alapján, és az alábbi értékekkel számoltunk: Kd = 197 ± 7 nM, Fmax380/Fmin380 = 8,51 ± 0,27, Rmin = 0,29 ± 0,01 és Rmax = 5,14 ± 0,20 (n = 4).
D.8. Statisztikai analízis Az értékeket átlag ± S.E.M.-ként adtuk meg. Az n a cochleák számát jelenti. A statisztikai analízist ANOVA teszttel végeztük. Newman-Keuls vagy Tukey-féle post hoc tesztet alkalmaztunk a szignifikancia meghatározásához A szignifikancia mértékét a következők szerint határoztuk meg: *p<0,05; **p<0,01; ***p<0,001.
42
E. Eredmények E.1. Ischaemiás modell hatása a dopamin felszabadulására E.1.1. Kontroll kísérletek A [3H]dopamin nyugalmi felszabadulása (az első két minta átlaga) a kontroll kísérletek kezdetekor 1.45 ± 0,13 %-a volt a teljes szöveti radioaktivitásnak. A 11. és 12. minták átlaga 1,13 ± 0,08 % volt, ugyanez az érték a a 19-20. frakciókor 1,06 ± 0,07 % volt, melyből látható, hogy a kísérlet során mindvégig konstans maradt a bazális dopamin kiáramlás. Az elektromos téringerlés hatására a [3H]dopamin felszabadulása szignifikánsan megemelkedett. Az első stimuláció (S1) hatására a szöveti radioaktivitás 4,12 ± 0,22 %a szabadult fel (FRS1), a másodikra (S2) 3,61 ± 0,35 % (FRS2). Az első és második stimuláció hatásai között nem volt szignifikáns különbség (p>0,05), az FRS2/FRS1 hányados 0.91 ± 0.09 volt, mely azt jelzi, hogy a téringerlés hatása reprodukálható (E/1 ábra). E.1.2. Veratridin hatása különböző koncentrációkban A veratridin egy nátrium-csatorna aktivátor, neurotoxikus szer, mely az ingerelhető sejtek membránját depolarizálja, tehát csak idegi struktúrákon hatásos (21,22,33,175). Korábbi kísérletek bizonyították, hogy ischaemia hatására a sejtekben nátrium koncentrációja jelentősen megemelkedik, mely felelős a transzmitterek kalcium-független felszabadulásáért, illetve az axonális tüzeléssel összefüggő felszabadulás-gátlásért (102). Ebből adódóan feltételezhető, hogy a veratridin az ischaemiához hasonló állapotot hoz létre. Kísérleteinkben a kisebb (10 mM) veratridin koncentráció kisebb mértékben emelte meg a [3H]dopamin nyugalmi felszabadulását (FRR2 / FRR1= 1,06 ± 0,13, p>0,05), hatására azonban jelentősen növekedett az elektromos ingerlés hatására létrejött kiáramlás (FRS2/FRS1= 5,00 ± 0,65, p<0,05).
43
12
kontroll Ver - 10 µM Ver - 30 µM
5 4
10
8
***
3
6
2
4
1
2
0
0
FRS2/FRS1
fr (%)
arány
6
14
*** ***
FRR2/FRR1
ver-30 ver-10 S1 1
S2
2 3 4 5 6
7 8 9
kontroll 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20minta
veratridin E/1 ábra A kontroll kísérletek során jól reprodukálható csúcsokat kaptunk elektromos stimuláció hatására. A 10 és 30 µM-os veratridin perfúziója szignifikánsan megemelte a stimuláció-kiváltotta [3H]dopamin felszabadulást. A nyugalmi kiáramlást szignifikánsan csak a nagyobb koncentrációjú veratridin oldat befolyásolta. Konc.
n
FRS2/FRS1
p (kontrollal
FRR2/FRR1
szemben)
(mM) Kontroll
6
0.91±0.09
p (kontrollal szemben)
0.74±0.08
Veratridin
10
9
5.00±0.65
0.0005
1.06±0.13
0.09
Veratridin
30
4
4.28±0.75
0.0002
2.26±0.06
0.000001
E/1 táblázat A kontrollhoz képest mind a két koncentrációjú oldat szignifikánsan megemelte az elektromos téringerlés kiváltotta [3H]dopamin felszabadulást, de csak a 30 µM koncentrációjú veratridin okozott szignifikáns emelkedést a bazális kiáramlásban. 30 mM veratridin szignifikánsan hatott a dopamin bazális felszabadulására (FRR2/FRR1= 2,26±0,06, p<0,05), és az elektromos stimulálás hatására a dopaminkiáramlás még ezt követően tovább emelkedett, így az ingerlés hatására létrejött
44
felszabadulás-növekedés szignifikáns volt (FRS2/FRS1= 4,28±0,75, p<0,05) (E/1 ábra, E/1 táblázat). E.1.3. Veratridin hatásának gátlása tetrodotoxinnal Ebben a kísérletsorozatban a 3. frakció alatt alkalmaztunk belső kontrollként elektromos ingerlést (S1) a fenti paraméterekkel (D.4.2.1.), majd a 8. és 12. mintaszedési periódusban, tehát nem elektromos ingerléssel egyidőben, 30 mM koncentrációjú veratridint tartalmazó perfundáló oldattal
áramoltattunk át (FRSver).
Ezekkel a kísérletekkel a veratridin hatására létrejövő, reverzibilis, szignifikáns,
3.5 3
fr (%)
nyugalmi dopamin-felszabadulást tanulmányoztuk (FRSver=5,69±0,54%). Ver-30 +TTX
2.5 2 1.5 1 0.5
S1
0 1
3
Sver 5
7
9
minták 11
13
15
17
19
TTX
E/2 ábra A kontroll elektromos stimuláció után 30 µM veratridinnel ingereltük a szövetet, melynek hatására ugyancsak szignifikánsan megemelkedett a [3H]dopamin felszabadulás. Ezt az emelkedést teljes mértékben antagonizálta a tetrodotoxin. Ezt követően a fenti ingerlés után tetrodotoxint (TTX) adtunk a perfundáló folyadékhoz 1 mM koncentrációban a 6-10. frakciók alatt, tehát a veratridin alkalmazása előtt 2 frakción át, illetve azzal párhuzamosan. A non-szelektív Na+-csatorna blokkoló TTX teljes mértékben antagonizálta a veratridin hatását, bizonyítva ezzel a dopamin neuronális eredetét (FRSver=0,16±0,06, p<0,001) (E/2 ábra, E/2 táblázat). Az elektromos téringerlést belső kontrollként használtuk, tekintettel arra, hogy a TTX teljes mértékben meggátolta a veratridin hatását, így bizonyosodtunk meg arról, hogy a szövet válaszadó képessége azonos volt a kontrolléval. 45
E.1.4. Glutamát receptor antagonisták hatása a dopamin felszabadulására Ismert, hogy a veratridin képes glutamátot felszabadítani, mely preszinaptikus ionotróp receptorokon hatva más transzmitterek felszabadulását okozza (195). NMDA és non-NMDA receptor antagonistákat használtunk, hogy kizárjuk a veratridin indirekt hatását, mely dopamin felszabaduláshoz vezethet. Kísérleteinkben alkalmazott dizocilpin (MK-801) egy szelektív, nem-kompetitív NMDA-receptor antagonista (84). A GYKI-52466 bizonyítottan szelektíven gátolja a nem-NMDA-receptor-mediálta idegi depolarizációt in vivo és in vitro (195). Ebből következik, hogy a kísérleteink során alkalmazott GluR antagonisták lefedik az ionotróp glutamát receptorok teljes skáláját. A glutamát receptor antagonistákkal (GluR) végzett első kísérletsorozathoz nem használtunk elektromos stimulációt. Kontrollként, a 6-8. frakció alatt áramoltattuk át a cochlea preparátumot 30 mM veratridin-tartalmú oldattal, mely a már említett módon megemelte a dopamin kiáramlását. Ezt követően GluR antagonistákat alkalmaztunk a veratridin ingerlés előtt és alatt, a 4-8. frakciók alatt. Azt tapasztaltuk, hogy sem az NMDA-receptor antagonista dizocilpin (3 mM) (FRSver=4,46±0,50, ns), sem pedig a nem-NMDA-receptor antagonista GYKI-52466 (100 mM) (FRSver=4,68±1,27, ns) nem befolyásolta a veratridin-kiváltotta dopamin-felszabadulást (E/3 A,B ábra, E/2 táblázat).
Konc. (mM)
n
FRSver
30
4
5,69±0,54
+ TTX
1
4
0,16±0,06
0.00005
+ dizocilpin
3
4
4,46±0,50
0.15
100
4
4,68±1,27
0.49
Veratridin
+ GYKI-52466
p (veratridinnel szemben)
E/2 Táblázat A TTX a veratridin által okozott [3H]dopamin felszabadulás-emelkedést teljes mértékben meggátolta, ezzel szemben a GluR antagonisták szignifikánsan nem változtattak azon.
46
A második kísérleti felállásban az E.1.2. fejezetben leírt kísérletsorozathoz hasonlóan elektromos ingerlést a 3. és 13. frakció alatt alkalmaztunk, veratridint a 6. frakciótól a kísérlet végéig adtunk a perfúziós folyadékhoz 30 mM koncentrációban. A GluR antagonistákat a frakciószedést megelőzően 6 perccel, azaz még az előperfúzió ideje alatt adtuk az átáramoltató folyadékhoz, és akárcsak a veratridint, a kísérlet végéig alkalmaztuk. Ezekben a kísérletekben szintén hatástalannak találtuk a GluR antagonistákat: sem a bazális sem pedig a veratridin + elektromos ingerlés kiváltotta [3H]dopamin-felszabadulást nem befolyásolták. A veratridin és az elektromos stimuláció kiváltotta felszabaduláshoz (FRS2/FRS1= 4,28 ± 0,75) képest a dizocilpine (3 mM)
(FRS2/FRS1=3,96±0,76,
ns),
vagy
a
GYKI-52466
(100
mM)
(FRS2/FRS1=2,88±0,60, ns) nem okozott szignifikáns változást (E/3 C,D ábra, E/3 táblázat).
Konc. (mM)
n
Veratridin
30
4
4.28±0.75
Dizocilpin
3
4
3.96±0.76
0.77
100
6
2.88±0.60
0.18
GYKI-52466
FRS2/FRS1
p (veratridinnel szemben)
E/3 táblázat A veratridin-kiváltotta [3H]dopamin-felszabadulásra nem volt szignifikáns hatással egyik GluR antagonista sem.
47
3,5
B
3,0
fr (%)
4,0
Ver-30 GYKI MK801
FRSver
A
2,0
3,0 2,5
1,0
2,0 1,5
minta 1,0
10
3
4
5
6
7
8
9
10
0,0
Ver-30
11
D 6
Ver-30 MK801 GYKI
8
MK801 GYKI52466
arány
12
2
fr (%)
C
1
Ver-30 MK-801 GYKI
4
6 2
4
2
S2
S1
0 1
3
5
7
9
11
13
minta 15
17
19
0
FRS2/FRS1
FRR2/FRR1
E/3 ábra A GluR antagonisták (dizocilpin (MK-801) és GYKI-52466) szignifikánsan nem változtatták meg sem a [3H]dopaminnak a veratridin-kiváltotta (A,B), sem a bazális, sem pedig az elektromos stimuláció okozta felszabadulását (C,D).
E.2. Dopamin és glutmát felszabadulásának szimultán mérése E.2.1. Kontroll kísérletek E.2.1.1. Dopamin felszabadulása Kontroll kísérleteink során a kísérletek elején a [3H]dopamin nyugalmi felszabadulása az összes szöveti radioaktivitás 3,15 ± 0,19 % volt (az első két minta átlaga). Elektromos téringerlés (eltér az eddigi ingerlési paraméterektől, l.d. D.5.4.) hatására a [3H]dopamin kiáramlása szignifikánsan megemelkedett, a görbe alatti terület 48
(számítását l.d. D.4.4.) 0,55 ± 0,22 volt. A 5
%
4,5
Kontoll
végére
a
bazális
[3H]dopamin
felszabadulás (az utolsó két minta átlaga) 3,17
TTX
4
kísérlet
± 0,20 %-ra tért vissza, ami szignifikánsan
3,5
nem tér el a kezdeti értéktől (E/4 ábra).
3 2,5 2
E/4 ábra Az elektromos téringerlés hatására
1,5
[3H]dopamin
1 0,5 1
2
3
szignifikánsan
megemelkedett, majd visszatért az eredeti
S
0
kiáramlása
minta 4
5
6
7
szintre. TTX hatására mind a bazális, mind a stimuláció-kiváltotta
8
felszabadulás
szignifikánsan csökkent.
TTX E.2.1.2. Glutamát felszabadulása
A glutamát felszabadulását a bazális glutamát-szint százalékaként adtuk meg. Ebből adódik, hogy az első két frakció átlaga 100 ± 2,99 %. Az elektromos téringerlés szignifikánsan megemelte a glutamát felszabadulását, mely 2,58-szoros növekedést ért el (a görbe alatti terület 329 ± 44,16 volt). A stimulációt követően a felszabadulás közel az alapértékre tért vissza (az utolsó két minta átlaga 131,81 ± 12,23 % volt) (E/5 ábra). 300
Kontroll
%
TTX
250 200
E/5 ábra Elektromos téringerlés hatására
150
szignifikánsan
100
felszabadulása, melyet az alkalmazott TTX
50
teljes mértékben antagonizált.
S
minta
0 1
2
3
megemelkedett
4
5
6
7
8
TTX
49
a
glutamát
E.2.2. Tetrodotoxin hatása E.2.2.1. Dopamin felszabadulása Az mintagyűjtés előtt 6 perccel 1 µM TTX-t tartalmazó oldattal perfundáltuk a preparátumot, melynek hatására nem csak a stimuláció-kiváltotta [3H]dopaminfelszabadulás csökkent szignifikánsan (görbe alatti terület: -0,75 ± 0,39, p<0,01), hanem a nyugalmi kiáramlás is 3,38 ± 0,45 %-ról (1-2. frakciók átlaga) 1,70 ± 0,30 %-ra (7-8. frakciók átlaga) esett (E/4 ábra, E/4 táblázat). E.2.2.2. Glutamát felszabadulása Az előzőekhez (E.2.2.1.) hasonlóan alkalmazott TTX blokkolta a stimuláció által okozott glutamát-felszabadulás növekedést (görbe alatti terület: 14,04 ± 54,21, p<0,05) (E/5 ábra, E/5 táblázat). E.2.3. Dopamin receptor agonista és antagonista hatása E.2.3.1. Dopamin felszabadulása A specifikusan D2 dopamin receptor agonista bromokriptin (20 µM koncentrációban, a frakciószedés előtti 6. perctől alkalmazva a kísérlet végéig) hatására nem változott meg a [3H]dopamin nyugalmi felszabadulása (2,61 ± 0,23 %, ns). Ezzel szemben
az
elektromos
téringerlés
hatására
létrejött
[3H]dopamin-kiáramlást
szignifikánsan megemelte (görbe alatti terület: 2,58 ± 0,38, p<0,01). A D2 dopamin antagonista szulpirid 100 µM koncentrációban a bromokriptinhez hasonlóan a nyugalmi [3H]dopamin kiáramlást nem változtatta meg (2,67 ± 0,23 %, ns), viszont a stimuláció-kiváltotta felszabadulás hatását szignifikánsan megnövelte (görbe alatti terület: 2.85 ± 0.20, p<0.01) (E/6 ábra, E/4 táblázat).
50
12
% Kontoll
10 8
Bromokriptin
E/6 ábra A dopamin receptor (DR)
Szulpirid
agonista (bromokriptin) és antagonista
6
(szulpirid) vegyületek (a frakciószedés
4
előtti 6. perctől alkalmazva)
2
szignifikánsan megemelték a
S 0 1
2
3
[3H]dopamin stimuláció-kiváltotta
minta 4
5
6
7
felszabadulását.
8
DR ag., antag.
E.2.3.2. Glutamát felszabadulása A korábban már leírt módon (l.d. D.5.3.) alkalmazott 20 µM koncentrációjú bromokriptin és a 100 µM koncentrációjú szulpirid oldat egyaránt hatástalan volt a glutamát bazális és a stimuláció-kiváltotta felszabadulására (görbe alatti területek: bromokriptin esetén 399,90 ± 50,46, ns, szulpiridnél 147,27 ± l78,27, ns). Itt jegyzem meg, hogy ezeknek a kísérleteknek a pontossága nem éri el a dopamin mérésekét, mely a nagy szórásból jól látható (E/7 ábra, E/5 táblázat).
300
Control
%
Brom okriptin
250
E/7 ábra Sem bromokriptin, sem
Szulpirid
200
szulpirid (a frakciószedés előtti 6.
150
perctől alkalmazva) nem
100
változtatta meg a glutamát
50
S
m inta
0 1
2
3
4
5
6
7
8
DR ag., antag.
51
felszabadulását szignifikánsan.
Kontroll
Koncentráció (mM)
n Görbe alatti terület ± S.E.M. 6 0,55 ± 0,22
p (kontrollal szemben)
Tetrodotoxin
1
4
-0,75 ± 0,39
0,009
Bromokriptin
20
4
2,58 ± 0,38
0,0003
100
4
2,85 ± 0,20
0,0003
Szulpirid
E/4 táblázat A [3H]dopamin elektromos téringerlés hatására létrejött felszabadulását a TTX lecsökkentette, a bromokriptin és a szulpirid pedig szignifikánsan megemelte.
Koncentráció
n Görbe alatti terület
p (kontrollal
(mM)
± S.E.M.
szemben)
Kontroll
6
329,77 ± 44,16
Tetrodotoxin
1
4
14,04 ± 54,21
0,047
Bromokriptin
20
4
399,30 ± 50,46
0,54
100
4
147,27 ± 178,27
0,13
Szulpirid
E/5 táblázat A glutamát stimuláció-kiváltotta felszabadulását a tetrodotoxin teljesen blokkolta, míg a bromokriptin és a szulpirid nem volt szignifikáns hatással. A mérések viszonylagos pontatlanságát a nagy szórásértékek jelzik.
E.3. Aminoglikozid antibiotikumok hatása a dopamin felszabadulására E.3.1. Akut hatás Ezekben a kísérletekben az elektromos téringerlést a D.4.2.1. pontban leírt paraméterekkel végeztük, a 3. és 13. mintagyűjtési periódus alatt. Az aminoglikozid antibiotikumokat a két ingerlés között (6. frakció alatt) adtuk a perfundáló folyadékhoz. A kontroll kísérletek során a kiáramlott [3H]dopamin mennyiségét az elektromos stimuláció szignifikánsan megemelte, majd az visszatért az alapértékre 4 frakciószedési periódus, azaz 12 perc múlva (E/8 ábra). A kiváltott felszabadulás megfelelően
52
stabilnak mutatkozott az első és második stimuláció hatására (az FRS2/FRS1 arány 0,99 ± 0,06, n=12) (E/6 táblázat).
A neomycin hatására az elektromos téringerlés kiváltotta [3H]dopaminfelszabadulás koncentráció-függően csökkent (FRS2/FRS1 értékeket l.d. a E/6 táblázatban)(E/8 ábra). A nyugalmi dopamin kiáramlásra kizárólag az 1 mM-os neomycin koncentráció volt hatással, mégpedig a téringerlés-kiváltotta felszabadulással ellentétesen, azaz a [3H]dopamin nyugalmi kiáramlását fokozta. Ezt valószínűleg egy nem-specifikus hatás okozza. Fontos megjegyezni, hogy ez a neomycin hatás nem fordulhat elő fiziológiás körülmények között, hiszen ez a koncentráció a klinikailag előforduló szérum szintet jóval meghaladja. Kísérleteinkben csak azért alkalmaztuk, hogy a stimuláció-kiváltotta dopamin felszabadulás csökkenésében a koncentrációfüggőséget demonstráljuk. 6
%
kontroll 100 µM neomycin 1 mM neomycin
5
4
3
2
1
neomycin
0 1
6
11
16
minta
S1 S2 E/8 ábra A két ingerlés között a perfúzós folyadékhoz adott neomycin oldat koncentráció-függő
módon
csökkentette
a
[3H]dopamin
stimuláció
kiváltotta
felszabadulását. Látható, hogy a fiziológiástól nagymértékben eltérő koncentráció (1 mM) a nyugalmi felszabadulást fokozta (magyarázatát l.d. a szövegben).
A fenti kísérleteket megismételtük a gentamycin és a kanamycin több koncentrációjával (10, 30, 100 µM gentamycin és 30, 100 µM kanamycin), de ezek
53
közül egyik antibiotikum sem volt hatással sem a nyugalmi, sem az elektromos téringerlés hatására fellépő [3H]dopamin-felszabadulásra (E/6 táblázat). Koncentráció
n
FRS2/FRS1
p (kontrollal szemben)
Kontroll Neomycin
Gentamicin
Kanamycin
30 µM 100 µM 300 µM 1000 µM 10 µM 30 µM 100 µM 30 µM
12 6 5 7 4 4 4 4 4
0,99 ± 0,06 0,88 ± 0,09 0,73 ± 0,03 0,72 ± 0,07 0,32 ± 0,11 1,01 ± 0,03 1,13 ± 0,10 1,04 ± 0,05 0,99 ± 0,02
0,33 0,020 0,015 0,00011 0,84 0,28 0,64 0,98
100 µM
4
1,02 ± 0,12
0,79
E/6 táblázat A neomycin koncentráció-függően csökkentette a [3H]dopamin elektromos téringerlés által kiváltott felszabadulását, míg a másik két aminoglikozid antibiotikum (gentamicin
és
kanamycin)
nem
volt
szignifikáns
hatássala
transzmitter
felszabadulására.
E.3.2. Krónikus hatás Az állatok D.6.2. pontban leírt neomycin előkezelését követően a cochleákat izoláltuk, és előző pontban leírtak szerint vizsgáltuk a [3H]dopamin felszabadulását elektromos stimuláció és különböző koncentrációjú (100, 300, 1000 µM) neomycin perfúzió hatására. Meglepő módon egyik koncentrációjú neomycin oldat sem okozott az előkezeletlen állatokéhoz hasonló hatást, az FRS2/FRS1 értékek a következők voltak: 100 µM-nál 0,91 ± 0,07; 300 µM-nál 0,97 ± 0,09 és 1 mM-nál 0,93 ± 0,08 (egyik sem szignifikáns a kontrollhoz képest) (E/9 ábra).
54
FRS2/FRS1
1.2
akut
krónikus
1
***
0.8
*
0.6
***
0.4 0.2 0
kontroll
30 µM
100 µM
300 µM
1000 µM
E/9 ábra A krónikusan neomycin-kezelt állatok izolált cochleájával végzett kísérletek során nem észleltünk változást a [3H]dopamin elektromos stimuláció kiváltotta felszabadulásában a neomycin bármely koncentrációjú oldatának perfúziójának hatására sem (sötét oszlopok). Ezzel szemben a kezeletlen állatok cochleájából a [3H]dopamin kiáramlása a neomycin hatására koncentráció-függően csökkent (fehér oszlopok).
E.4. Intracelluláris kalciumkoncentráció mérése. E.4.1. Az egyes sejttípusok azonosítása A preparátumon DIC mikroszkópiával felkerestük a megfelelő látóteret, melyen felülnézetből láthatóak voltak a támasztósejtek, a külső szőrsejtek három sora, a külső és belső pillérsejtek által alkotott Corti alagút teteje, a belső szőrsejtsor. A gangion spirale sejttestjei általában nehezen voltak azonosíthatóak a modiolus által okozott csonttömeg árnyékolása miatt (E/10 A. Ábra).
E.4.2. A sejtek töltődése fura-2/AM-mel A megfelelő terület illetve sejtek DIC-vel való azonosítását követően ugyanazt a látóteret UV fénnyel világítottuk meg, és az emittált fényt detektáltuk. Az E/10 B, ábrán látható, hogy a belső szőrsejtsor fluoreszcenciája megfelelő, a pillérsejtek nem töltődtek, a külső szőrsejtek belső sora részben töltődött, míg a második és harmadik sor
55
nem (E/10 B. Ábra).
Ezzel a kísérletsorozattal elsőként sikerült imn situ a belső
szőrsejtek intracelluláris kalcium koncentrációjának változását regisztrálni.
TS
TS
KSZ
KSZ
CA BSZ
GS
CA BSZ GS
1. 2. 3. 4. 5.
E/10 Ábra. A. A DIC képen láthatóak a halló érzékhám azonosított sejtjei (Rövidítések: TS: támasztósejt; KSZ: külső szőrsejt; CA: Corti alagút; BSZ: belső szőrsejt; GS: gangion spirale) B. Ugyanez a látótér UV fénnyel megvilágítva, a körberajtolt területen, illetve kiemelve, számozva mellette látható a kiválasztott 5 belső szőrsejt melyek kalciumion koncentráció-változását mértük.
56
E.4.3. A belső szőrsejtek ingerlése KCl-dal A belső szőrsejtekből kiválasztottunk ötöt (E/10 B. Ábra), melynek kalciumionkoncentrációját monitoroztuk 100 mM KCl oldat perfúziója közben. A KCl oldattal való ingerlést a 6-10 percek és a 12-17 percek alatt alkalmaztuk. A 3. sejt kivételével a belső szőrsejtek szignifikáns intracelluláris kalciumion koncentráció-változással válaszoltak az első ingerre, majd az újabb ingerlés hatástalan maradt (E/11. Ábra). A 100 mM KCl a Nernst egyenletnek megfelelően depolarizálja a sejtek membránját, így az intracelluláris kalcium koncentráció jelentősen megemelkedett.
KCl 100 mM
KCl 100 mM Sejt 1 Sejt 2 Sejt 3 Sejt 4 Sejt 5
50 nm 100 sec
E/11 Ábra Az egyes sejtek intracellulárs kalciumion koncentrációjának változása az idő függvényében. Látható, hogy a 3. sejt kivételével minden sejten szignifikáns emelkedést okozott az első KCl ingerlés, melyet nem követett újabb változás a második hatására.
57
F. Megbeszélés
A dopamin védő funkciója a belsőfülkárosodások ellen néhány éve ismert. A lateralis olivocochlearis efferensekből felszabadulva posztszinaptikusan gátolja a glutamát hatását, azaz zaj és ischaemia esetén az excitotoxicitás által okozott afferensduzzadás, -degeneráció
ellen nyújt védelmet (28,29,42,57,59,111,122,123,127,131).
Kísérleteink középpontjában ezért a dopamin által közvetített neurokémiai változások részletesebb megismerése volt. Az in vitro mikrotérfogatú perfúziós technikát több mint 15 éve használják különböző idegi elemeket tartalmazó struktúrákból felszabaduló ingerületátvivő anyagok
vizsgálatára
(192).
Alkalmazása
a
belsőfül
neurotranszmissziójának
kutatásának terén azonban csak a közelmúltban kezdődött meg laboratóriumunkban (53,54). Az irodalomban elsőként sikerült ezzel a módszerrel neuropharmakológiai bizonyítékot szolgáltatni arra, hogy a cochleában a lateralis olivocochleáris rostok axon terminálisai képesek a dopamint felvenni és axonális stimulálás hatására felszabadítani. A magas nyomású folyadékkromatográfiás vizsgálatok bizonyították, hogy a kísérletek során mért tríciált aktivitás több mint 90 %-t a dopamin adja, derivátumait, illetve adrenalint és noradrenalint csak elenyésző mennyiségben lehetett kimutatni a radioaktív kifolyóban. D1 és D2 agonistákkal és antagonistákkal végzett kísérletek során bízonyítást nyert, hogy a dopamin preszinaptikus szabályozása D1 receptorokon keresztül zajlik, míg a D2 receptorok részvétele a folyamatban kizárható volt (53). További kísérletek során azonosították a dopamin felszabadulásában szerepet játszó feszültségfüggő kalcium csatornákat. Tekintettel arra, hogy a nem szelektív feszültségfüggő kalcium csatornát blokkoló kadmiumon kívül, kizárólag az w-conotoxin csökkentette szignifikánsan a dopamin felszabadulását, így valószínű, hogy a dopamin felszabadulásában N-típusú feszültségfüggő kalcium csatornák játszanak szerepet (54).
58
F.1. Ischaemia hatása dopamin felszabadulására
A
veratridint
tanulmányokban
gyakran
használják
(3,56,147,165,174).
transzmitter-felszabadulást
Kimutatták,
hogy a
veratridin
vizsgáló kizárólag
ingerelhető sejtmembránon hatásos, csak az idegi eredetű sejteken gátolja meg a nátrium csatornák inaktiválását, és tartja azokat hosszabb ideig nyitva (21,22,33,175). A veratridin egy igen erős méreg, azonban a nátrium csatornák inaktiválódását gátolva az ischaemiához igen hasonló sejt szintű változásokat hoz létre a szövetekben (3,22,56,174,145). Mint korábbi kísérletek bizonyították, oxigén és glükózmegvonással szimulált ischaemia hatására a sejtekben jelentős nátrium- és kalciumion beáramlás figyelhető meg. Ez az ozmolaritás szabályai szerint víz beáramlásához vezet, mely folyamat a sejtek duzzadásával, degenerációjával, illetve halálával végződhet (102). Ischaemiában a glutamát excitotoxicitás lényege hasonló: a fokozott glutamát felszabadulás és a csökkent felvételének hatására az ionotróp glutamát receptor megnyílása után fokozott kation-, majd víz-beáramlás történik a sejtekbe, mely azok duzzadásához, később pusztulásához vezet (101). A korábbi kísérletek alapján ugyanez a mechanizmus a cochleában is lejátszódik: a belső szőrsejtekből nagy hanginger vagy vérellátási zavar hatására extrém mennyiségű glutamát jut a szinaptikus résbe, mely a nervus cochlearis afferens dendritjén tartósan ingerli az ionotróp glutamát receptorokat. Ezeknek a receptoroknak az ingerlése ioncsatornákat nyit meg, a kóros mennyiségű glutamát hatására nátrium és kalcium áramlik be a sejtekbe. Ez a fentiek alapján az afferens végkészülékek degenerációjához, pusztulásához, illetve hallásromláshoz vezet (részletesen
l.d.
B.3.1.).
Mindezek
alapján
elmondható,
hogy a
veratridin
alkalmazásával hatását szimuláltuk izolált emlős cochleán. Mivel az ischaemia és zajhatás patomechanizmusa hasonló (B.3.2.), így feltételezhetjük, hogy a veratridinnel végzett kísérleteink az ischaemia mellett egyben zaj hatását is modellezték. Kísérleteinkben azt találtuk, hogy a veratidin hatására szignifikánsan
megemelkedett a dopamin felszabadulása (E/1 Ábra; E/1 Táblázat). Úgy tűnik, hogy az elektromos stimuláció hatására fellépő dopamin kiáramlás érzékenyebb a veratridinre, mint a bazális felszabadulás, hiszen előbbit már a 10 µM-os veratridin koncentráció is szignifikánsan megváltoztatta, igaz a nagyobb koncentráció (30 µM) hatása elhúzódóbb volt. A veratridin alkalmazásával tehát bizonyítottuk, hogy olyan kísérleti körülmények 59
között, melyek hasonlítanak az ischaemia és a zajhatás okozta változásokhoz, emelkedik a dopamin felszabadulása a cochleában. Ezek a kísérletek, illetve az, hogy a veratridin hatása blokkolható volt tetrodotoxinnal, azt bizonyítják (E/2 Ábra), hogy kísérleti modellünkben a dopamin neuronális struktúrákból származott. Mivel más dopamint tartalmazó struktúra nem ismert a cochleában (42,122), feltételezhetjük, hogy a dopamin felszabadulás eredete a lateralis olivocochlearis efferensek axon-terminálisai volt. A veratridinnel végzett kísérletek mindezeken túl azt is bizonyítják, hogy a dopamin felszabadulása fokozható exogén anyagokkal. Korábbi kísérletes tanulmányok már bizonyították, hogy dopamin agonista szer (piribedil) védelmet nyújt ischaemiás és akusztikus trauma következtében létrejövő halláskárosodások ellen (29,57,131). Amennyiben a dopamin lokális felszabadulása gyógyszeresen fokozható, úgy ez terápiás lehetőségekhez juttathat bennünket a közeljövőben az idegi halláskárosodások terápiájában.
60
F.2. Glutamát receptor antagonisták hatása a dopamin felszabadulására
A dopamin felszabadulásáért felelős short-loop feed-back mechanizmusról, (B.2.2.3.; B/3 ábra) és a dopamin glutamáterg sejteket posztszinaptikusan gátló hatásáról is esett már szó (B.2.2.3.). Ezen a mechanizmuson kívül elképzelhető lenne egy cochleán belüli mechanizmus is, melyben a nagy mennyiségben felszabadult glutamát (szinaptikus vagy nem-szinaptikus kapcsolat révén) serkentené a dopamin felszabadulását a lateralis olivococleaáris efferensek axonterminálisaiból (F/1 Ábra).
Belsõ szõrsejt
F/1 Ábra A feltételezett dopamin felszabaduláson keresztül megvalósuló lokális fékező mechanizmus.
Glu
Glu
A glutamát fokozott felszabadulása lokálisan emelné a dopamin felszabadulását.
GluR NMDA
AMPA
kainát
Az
D2
általunk
alkalmazott
glutamát
antagonsta dizocilpine és GYKI-52466 az ionotróp glutamát receptorok teljes
DA
spektrumát gátolja (195,171). Glutamát receptor
Lateralis Olivocochlearis Efferens
Afferens
antagonistákkal
kísérleteink
során
végzett
nem
tudtuk
bizonyítani egy a cochleán belüli fékező
mechanizmus
működését.
Kísérleteink során azt tapasztaltuk, hogy a veratridin hatására megemelkedett dopamin felszabadulásra az ionotróp glutamát receptorok nem voltak szignifikáns hatással (E/2,3 Táblázat; E/3 ábra). A veratridin hatására létrejövő intracelluláris nátriumion koncentráció emelkedés depolarizálja a belső szőrsejteket, melyekből nagy mennyiségű glutamát szabadul fel. Amennyiben ez a glutamát közvetlenül hatna a lateralis olivocochlearis efferensek dendritjére, úgy az antagonisták hatására csökkennie kellett volna a dopamin felszabadulásának. Mivel ezt 61
a hatást kimutatni nem tudtuk, így valószínűnek látszik, a glutamát felszabadulás dopaminon keresztül megvalósuló fékező hatása kizárólag az úgynevezett short-loop feed-back mechanizmuson keresztül jön létre. A glutamát receptorok hatástalanságának másik lehetséges magyarázata az, hogy a veratridin által felszabadított glutamát mennyisége nem volt elegendő a dopaminerg axonterminálison levő glutamát receptorok izgatásához. Ennek a lehetőségnek a további vizsgálata szükséges, de ehhez a glutamát felszabadulás fokozásának más módját kell választani, tekintettel arra, hogy a veratridin koncentrációjának további emelése irreverzibilis, nem fiziológiás körülményeket hoz létre. F.3. Dopamin és glutamát felszabadulásának szimultán mérése
A glutamát cochleáris neurotranszmisszióban betöltött kulcsszerepéről már több ízben volt szó, így felszabadulásának mérése hasznos lehet a cochlea fiziológiás és patológiás mechanizmusainak megértésében. A glutamát felszabadulását a csigában már mérték több módszerrel (15,35,72,73,76,77,98,99). A mi kísérleteink célja az volt, hogy a dopamin felszabadulásának méréskor már sikerrel alkalmazott in vitro mikroperfúziós módszert magas nyomású folyadékkromatográfiával kombinálva, párhuzamosan tudjuk mérni izolált tengerimalac cochleából a felszabaduló glutamátot és dopamint. A rendelkezésre álló korábbi anatómiai és élettani adatok alapján a két transzmitter közötti interakció
nagyon
valószínű
(17,42,43,57,91,111,112,122,127,128,131,143,198).
Korábbi kísérleteink során ezzel szemben mi azt találtuk, hogy az iontotróp glutamát receptor antagonisták nem befolyásolták a dopamin felszabadulását, igaz ez még nem zárja ki a két transzmitter közötti kölcsönhatást. A párhuzamos mérések előnye még az is, hogy az ingerlés hatására mindkét transzmitter felszabadulásának megemelkedése bizonyítja a stimulus hatékonyságát. Ezen kísérletsorozatban a legjelentősebb eredményt az adja, hogy korábban még nem alkalmazott módszerrel sikerült kimutatni glutamát és dopamin felszabadulását egyazon cochleából egyszerre. Kísérleteink során elektromos ingerlés hatására szignifikáns kiáramlás-emelkedést észleltünk mindkét transzmitter részéről, melyet tetrodotoxin mindkét esetben gátolt, bizonyítva a glutamát és dopamin neuronális eredetét az új kísérleti rendszerben (E/4; E/5 Ábrák). 62
A D2 dopamin receptor agonistával és antagonistával végzett kísérleteink során arra kerestük a választ, hogy a dopamin, közismert posztszinaptikus gátló hatásán kívül (28,29,42,111,122,127,166), van-e hatással a glutamát felszabadulására. Ezt a hatást nem sikerült kimutatni, tekintettel arra, hogy szignifikáns változást sem a dopamin receptor agonista, sem pedig az antagonista nem okozott a glutamát felszabadulásában (E/7 Ábra). Itt azonban meg kell jegyezni, hogy méréseink pontossága nem érte el a kívánt mértéket, melynek hátterében állhat például a metabolikus és transzmitter glutamát-poolok elkülönítésének nehézsége (l.d. részletesen B.2.2.1.). Ugyanezekkel a kísérleteinkkel meglepő eredményt kaptunk a dopamin felszabadulásának tekintetében (E/6 Ábra). Korábbi kísérletek kizárták a D2 receptorok részvételét a dopamin felszabadulásának preszinaptikus szabályozásában (53), mi ezzel szemben mind a dopamin agonista, mind az antagonista hatására dopamin-szint emelkedést észleltünk a kifolyókban. Ennek hátterében egyrészt állhat az, hogy a detektálható glutamát felszabadulás érdekében jelentősen megemeltük az elektromos téringerlés paramétereit. Másrészt magyarázatra szorul az a tény is, hogy mind az agonista, mind az antagonista azonos irányú eltérést okozott. Az antagonista hatása magyarázható azzal, hogy a lateralis olivocochleáris terminálisain a szulpirid a preszinaptikus receptorok blokkolásával a lokális feed-back mechanizmust kikapcsolta (189). A bromokriptin parciális agonistaként a D2 receptorhoz kapcsolódva kisebb agonista aktivitást fejt ki, mint maga a dopamin. Így mikor a bromocriptin a dopaminnal, azaz az endogén liganddal kompetícióba lépett, a ligandkötőhelyek elfedésével a dopaminerg axonterminálisokon elhelyezkedő autoreceptorok relatív gátlását eredményezte. További magyarázat lehet a D2 receptorok deszenzitizációja az agonista magas koncentrációja miatt (177).
63
F.4. Aminoglikozid antibiotikumok hatása a dopamin felszabadulására
Bár a különböző szerek ototoxikus hatása a halláskutatás kiemelt területe, a pontos hatásmechanizmust még nem sikerült teljes mértékben feltárni. Több mechanizmust feltételeznek az aminoglikozidok halláskárosító mechanizmusának hátterében (F/2 ábra). Ezek közül az egyik az L-típusú feszültségfüggő kalcium csatornák blokkolása, melyet izolált külső szőrsejteken mutattak ki (107) (F/2 Ábra ). Más kísérletek azt mutatták, hogy ezeknek az antibiotikumoknak a tartós használata a külső szőrsejtek másodlagos hírvivő rendszerét, az inozitol-trifoszfát/diacil-glicerol utat gátolja (145,146) (F/2 Ábra ). További eredmények alapján feltételezhető, hogy az aminoglikozidok a mediális olivocochleáris efferens terminálisainak preszinaptikus muszkarinreceptoraihoz kötődnek, és ezeket gátolva kikapcsolják az acetilkolin negatív feed-back szabályozását. Ennek a folyamatnak az eredményeként az acetilkolin felszabadulása jelentősen megnő (42) (F/2 Ábra ), ezzel, és az előző kettő mechanizmussal a belsőfülben a külső szőrsejtek által megvalósuló cochleáris erősítő funkció zavart szenved. Más tanulmányok a glutamáterg transzmisszó zavarára mutatnak rá kísérleteik során. Aminoglikozid antibiotikumok hatására az afferens rostok dendritjén elhelyezkedő NMDA receptorok aktivációját figyelték meg, ami ion- és következményes vízbeáramlással az ischaemiás és zaj okozta afferensduzzadást ésdegenerációt okoz (133) (F/2 Ábra ). Ez utóbbi mechanizmust támasztják alá azok a megfigyelések, miszerint a ganglion spirale sejtjeinek degenerációja az aminoglikozidototoxicitás elsődleges manifesztációi (157).
64
Belsõ szõrsejt
Külsõ szõrsejt VDCC
Glu DAG
Ca2+
IP3
PIP2
ACh
kainát NMDA D2
DA
Lateralis Olivocochlearis Efferens F/2
Ábra
Az
AMPA
I. típusú II. típusú Afferens
aminoglikozid
antibiotikumok
Medialis Olivocochlearis Efferens
feltételezett
cochleát
károsító
mechanizmusai. Részletesen l.d. a szövegben.
Kísérleteink során abból a kísérleti megfigyelésből indultunk ki, hogy zajhatásnak kitett állatok aminoglikozidokkal történő további kezelése során szignifikánsan magasabb küszöbemelkedést tapasztaltak, mint a külön-külön kezelés során (18). Mivel a dopaminnak védő funkciót tulajdonítanak a zaj elleni védelemben (28,29,42,43,57,59,111,122,123,127,131),
így
feltételezhetjük,
hogy
a
fenti
mechanizmusokon kívül az aminoglikozidok negatívan befolyásolják a cochleáris dopamin felszabadulását. Ennek egyik módja lehet az aminoglikozidok feszültségfüggő kalcium csatornákra kifejtett gátló hatása, melyet már több neuronális szöveten kimutattak (87,188) többek között külső szőrsejteken is (107). In vitro mikrotérfogatú perfúziós módszerrel végzett kísérleteink során azt találtuk, hogy a neomycin koncentráció-függő módon gátolta a dopamin ingerlés hatására történő felszabadulását 65
(E/8 Ábra; E/6 Táblázat). Ennek legvalószínűbb hatásmódja a lateralis olivocochleáris efferens rostokon található feszültségfüggő kalcium csatornák gátlása, melyek a laboratóriumunkban
korábban
végzett
kísérletek
alapján
(54)
legnagyobb
valószínűséggel N-típusú csatornák. Az a tény, hogy a gentamicin és a kanamycin nem változtattak a dopamin felszabadulásán (E/6 Táblázat), arra enged következtetni, hogy csak a neomycin vesz részt ebben a hatásmechanizmusban. A neomycinnel hosszabb ideig kezelt állatok izolált cochleáival végzett kísérletek során az előzőekkel ellentétben a perfundáló oldatban alkalmazott neomycin egyik koncentrációban sem változtatta meg a dopamin felszabadulását (E/9 Ábra). Ez a krónikusan kezelt állatokban egy adaptív mechanizmust feltétélez, ami vagy a receptorok
down-regulációjának,
vagy
a
dopamin
felszabadulás
ellentétes
szabályozásának kifejlődésének következménye. F.5. Intracelluláris Ca2+-koncentrációjának vizsgálata intakt tengerimalac Cortiszerven
Az intracelluláris szabad kalciumszint halló érzékhámban különös jelentőséggel bír, hiszen a hanginger elektromos jellé alakítása, illetve a külső szőrsejtek motilitása is transzdukciós mechanizmusok eredményei. Ennek finom szabályozásáról már volt szó (l.d. B.2.3.) Az elektromechanikus transzdukcióért felelős külső szőrsejtek motilitását két részre oszthatjuk, gyors és lassú motilitásra (6,19,20,79). A gyors mozgás a valódi amplifikációért felelős, melynek létrejöttében nemrég azonosítottak egy proteint (206), ennek működése klorid- és bikarbonát ionokhoz kötött (114). A lassú mozgás a cochlea merevségéért felelős, melynek szerepe egyrészt védő a basilaris membrán extrém kitérései ellen (204), másrészt a hanginger iránti szenzitivitást szabályozza (36). Ennek a mechanizmusában nagy valószínűséggel kalciumionok szerepe kiemelkedő (167). A membrán depolarizáció a külső szőrsejtekben feszültségfüggő kalcium csatornák kinyílását eredményezi. A megnövekedett intracelluláris magas kalcium koncentráció az intracelluláris kalcium raktárakból (kalciumkötő fehérjék és orgaellumok) további kalcium
mobilizálást
eredményez.
Ennek
a
folyamatnak
az
eredményeként
összehúzódnak a külső szőrsejtek. A mechanoelektrikus transzdukcióban nagy valószínűséggel moduláló szerepet tölt be a kalcium, hiszen a kalciumot használó 66
másodlagos hírvivő rendszerek tehetetlensége nem teszi lehetővé az esetenként 20 kHzes jelátvitelt (196). Az izolált külső- (19), belső szőrsejt-preparátumok (67), illetve ganglion spirale sejtek (106) kifejlesztése lehetővé tette ezeknek a sejteknek izolált vizsgálatát, a membrán
ioncsatornáinak
tipizálását,
az
ionáramok
karakterizálását,
illetve
intracelluláris kalcium koncentráció mérést. Ezek a kísérletek nagy előrelépést jelentettek a hanginger perifériás feldolgozásának jobb megértéséhez, azonban a fiziológiás viszonyoktól távol kerültek a sejtek izolálásával. Intakt Corti szerven végzett kísérletek során bebizonyosodott, hogy ugyanolyan a kísérleti körülmények között például a külső szőrsejtek nyugalmi potenciálja szignifikánsan eltér egymástól: izolált külső szőrsejten: -45 és -57 mV közötti; míg intakt Corti szerv ugyanezen sejtjében -76 mV (96). Mindezek figyelembevételével célunk az volt, hogy egy olyan izolált intakt Corti szerv preparátumot hozzunk létre, melyen egyszerre és saját környezetükben vizsgálhatók a halló érzékhám idegi struktúrái. Kísérleteink során a legnagyobb nehézséget az okozta, hogy meg kellett találnunk az egyensúlyt, mely biztosította egyrészről, hogy a preparátumunkban a sejtek intaktak maradjanak, ugyanakkor másrészt minden fölösleges struktúrát eltávolítsunk a sejtek megfelelő töltéséhez és vizualizálásához. Kísérleteink során az első kálium klorid (KCl) ingerlés hatásossága bizonyítja, hogy sejtjeink ingerelhetők, a második ingerlés hatástalanságának hátterében valószínűleg az áll, hogy az ismételt ingerlés időben túl közel volt az előzőhöz, így az a sejteket refrakter állapotban találta (E/11 Ábra). Az ok, amiért ilyen nagy koncentrációt alkalmaztunk az, hogy - kontroll kísérletekről lévén szó – biztosak akartunk lenni abban, hogy stimulus erőssége megfelelő. Ez eddig elvégzett kontroll kísérletek folytatásaként a közeljövőben eddigi eredményeink pontosabb megértése, a cochlea fiziológiás és patológiás folyamataink sejtszintű detektálása válik lehetővé egy olyan preparátumon, mely az eddig ismertekhez képest közelebb áll a fiziológiás viszonyokhoz. F.6. Kutatásaink klinikai vonatkozásai
Kísérleteink középpontjában a cochlea neurotranszmitterei közül két olyan anyag állt, melyek kulcsfontosságúak a belsőfül patológiás folyamataiban. Az 67
ischaemiás és zaj okozta halláskárosodás mechanizmusában a glutamát és a dopamin úgy tűnik ellentététes hatásúak. Ezt igazolják azok a kísérletek, melyekben glutamát receptor
antagonistákkal
sikerült
kivédeni
zaj
és
ischaemia
okozta
hallásküszöbemelkedést és morfológiailag az afferensduzzadást (111,148). Ugyanakkor a dopaminnal és antagonistáival ugyanez a hatás volt elérhető (28,29,57,59,42,122,166). A piribedil egy dopamin receptor agonista, melyet klinikumban Parkinson kór kezelésére használnak (75). Állatkísérletek alapján a cochleában a piribedil védő hatását találták a glutamát excitotoxicitás esetén (29,61). Mindezek a tanulmányok azt sugallják, hogy ezekkel a kémiai ingerületátvitelt befolyásoló vegyületekkel gyógyszeres védelmet lehetne nyújtani ischaemiás, illetve a zaj okozta halláskárosodás ellen. Az egyik nehézséget klinikai alkalmazásuk tekintetében a szisztémás mellékhatások jelentik, míg a másik probléma az, hogy még kevéssé ismert hatásuk a hallás fiziológiás folyamatára. Előbbi viszonylag könnyen kivédhető
lokális
alkalmazással,
mint
például
Meniére
szindrómában
az
aminoglikozidok topikális alkalmazása (10). Utóbbit ezzel szemben nehezebbnek tűnik megoldani. A kísérleteinkben is alkalmazott dizocilpinről (MK-801) kimutatták, hogy bár a hypoxiában és zajban védő hatásúnak mutatkozott vegyület önmagában alkalmazva megemelte a normális hallásküszöböt (148). Kísérleteinkben
patológiás
körülmények
között
(ischaemia,
zaj
és
aminoglikozid-ototoxicitás) a dopamin-felszabadulás szabályozásának pontosabb megértéséhez jutottunk közelebb, melynek terápiás haszna lehet a jövőben, amennyiben a neuromodulátor szerek biztonságos alkalmazására lehetőség nyílik.
68
G. Rövidítések jegyzéke
5-HT – szerotonin ACh – acetilkolin ADP - adenozin-5-difoszfát Ag. – agonista AM – acetoxi-metilészter AMPA - a-amino-3-hidroxi-5-metil-4-izoxazol-propionsav ANOVA – analysis of variance Antag. – antagonista AP – akciós potenciál ATP – adenozin-5-trifoszfát BSZ – belső szőrsejt CA – Corti alagút cAMP – ciklikus adenozin-3’,5’-monofoszfát CGRP – calcitonin gene related peptid CNQX – 6-cyano-7-nitroquinoxalin-2,3-dion DA – dopamin DAG – diacilglicerol dB - decibel DIC – differenciális interferencia kontrasztmikroszkópia DNQX – 6,7-dinitroquinoxalin-2,3-dion DNS - dezoxiribonukleinsav DOPA – 3,4-dihidroxi-L-fenilalanin DR – dopamun receptor fr – frakcionális felszabadulás FRR – nyugalmi frakcionális felszabadulás FRS – stimuláció alatti frakcionális felszabadulás GABA - g-amino-vajsav GS – ganglion spirale HEPES – N-2-hidroxietilpiperazin-N’-2-etánszulfonsav HPLC – magas nyomású folyadékkromatográfia 69
IP2 – inozitol-4,4-biszfoszfát IP3 – inozitol-1,4,5-triszfoszfát Konc. – koncentráció KSZ – külső szőrsejt mGluR – metabotróp glutamát receptor mtsai – munkatársai n – cochleák száma NMDA – N-metil-D-aszpartát NO2- - nitrogén dioxid NP – neuropeptid Nucl. cochl. – nucleus cochlearis NyACs – nyújtás-aktivált csatorna O2- - szuperoxid anion OH- - hidroxilion OONO- - peroxinitrit anion R – receptor RNS – ribonukleinsav rRNS – riboszomális ribonukleinsav Ry – ryanodin S – stimulus S.E.M. – standard error of the means sup. – superior Sver – veratridin-stimuláció TS: támasztósejt TTX – tetrodotoxin UV – ultraibolya VDCC – voltage dependent calcium channel (feszültségfüggő kalcium csatorna) ver – veratridin w/v – tömegszázalék WHO – World Health Organization (Egészségügyi Világszervezet)
70
H. Köszönetnyilvánítás
Elsősorban köszönetet szeretnék mondani témavezetőmnek, Vizi E. Szilveszter Profeszor Úrnak, akinek a segítsége, útmutatásai nélkül nem készülhetett volna el az értekezés. Szeretnék köszönetet mondani volt és jelenlegi főnökeimnek, Z. Szabó László Professzor Úrnak és Csokonai Vitéz Lajos Tanár Úrnak, akik kutatási tevékenységemet támogatták. Köszönet
illeti
minden
kollégámat,
akik
a
Semmelweis
Egyetem
Egészségtudományi Karának Fül-orr-gégeklinikáján Ph.D. napomon helyettem is dolgoztak a betegellátásban. Köszönet illeti Dr. Gáborján Anitát, aki a Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetben izolált tengerimalac cochleán az in vitro mikrotérfogatú perfúziós technikával való dopamin-mérést beállította, és megtanította. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Lendvai Balázsnak, aki cikkeim és jelen értekezés kéziratainak formai és szakmai ellenőrzését végezte. Köszönöm Dr. Zelles Tibornak az intracelluláris kalcium-koncentrációméréshez nyújtott segítségét. A kalcium-méréshez használt preparátum létrehozásához nyújtott segítségéért Dr. Tóth Miklóst illeti köszönet. A glutamát felszabadulásának méréséért nyújtott segítségéért köszönettel tartozom Baranyi Máriának. Kísérleteimet az MTA Kísérleti Orvostudományi Kutatóintézetében, az Európai Unió 5. Keretprogramjának Centre of Excellence pályázatának (ICA1-CT-2000-70004) keretein belül végeztem. A Ph.D. tandíjamat az OMKER Rt. vállalta a teljes képzés ideje alatt, ezért a cégnek, és személy szerint Sztanoj Miklós Úrnak szeretnék köszönetet mondani. A kongresszusi utazásaimat részben a Solvay Pharma és az AstraZeneca cég szponzorálta, ezért nekik is szeretnék köszönetet mondani. Végül, de nem utolsó sorban köszönettel tartozom családomnak kutatómunkám és az értekezés megírása alatti megértésükért és támogatásukért.
71
I. Irodalomjegyzék
1. 2. 3.
4. 5. 6. 7.
8. 9. 10. 11. 12. 13.
14. 15. 16. 17. 18.
Ádám, V., 2001. A kémiai idegingerület átvitel molekuláris alapjai. In: Orvosi biokémia (2. kiadás), szerk.: Ádám, V., Medicina, Budapest, pp 525-548. Ádam-Vizi, V., 1992. External Ca2+-independent release of neurotransmitters. J. Neurochem. 58, 395-405. Ádam-Vizi, V., Deri, Z., Bors, P., Tretter, L., 1993. Lack of involvement of [Ca2+]i in the external Ca2+-independent release of acetylcholine evoked by veratridine, ouabain and alpha-latrotoxin: possible role of [Na+]i. J. Physiol. Paris 87, 43-50. Altschuler, R.A., Sheridan, C.E., Horn, J.W., Wenthold, R.J., 1989. Immunocytochemical localization of glutamate immunoreactivity in the guinea pig cochlea. Hear. Res. 42, 167-174. Amaee, F.R., Comis, S.D., Osborne, M.P., 1995. N-methyl-L-arginine protects the guinea pig cochlea from the cytotoxic effects of pneumolysin. Acta. Otolaryngol. 115, 386-391. Ashmore, J.E., 1987. A fast motile response in guinea pig outer hair cells: the cellular basis of the cochlear amplifier. J. Physiol. 388, 323-347. Beckman, J.S., Beckman, T.W., Chen, J., Marshall, P.A., Freeman, B.A., 1990. Apparent hydroxyl radical production by peroxynitrite: implications for endothelial injury from nitric oxide and superoxide. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 1620-1624. Berglund, A.-M., Ryugo, D.K., 1987. Hair cell innervation by spiral ganglion neurons in the mouse. J. Comp. Neurol. 255, 560-570. Billet, T.E., Thorne, P.R., Gavin, J.B., 1989. The nature and progression of injury in the organ of Corti during ischemia. Hear. Res. 41, 189-198. Blakley, B.W., 2000. Update on intratympanic gentamycin for Meniere’s disease. Laryngoscope, 110, 236-40. Bledsoe S.C., Bobbin, R.P., Chihall, D.M., 1981. Kainic acid: an evaluation of its action on cochlear potentials. Hear. Res. 4, 109-120. Bledsoe S.C., Bobbin, R.P., Puel, J.-L., 1988. Neurotransmission in the inner ear. In: Physiology of the ear, editors: Jahn, A.F., Santos-Sacchi, J., Raven Press, New York, pp 385-406. Bloom, F.E., 1996. Neurotransmission and the central nervous system. In: Goodman and Gilman’s The pharmacological basis of theurapeutics. (9th ed.), editors: Hardman, J.G., Limbird, L.E., Molinoff, P.B., Ruddon, R.W., Gilman, A.G., McGraw-Hill, New York, pp 267-293. Bobbin, R.P., 1979. Glutamate and aspartate mimic the afferent transmitter in the cochlea. Exp. Brain Res. 34, 389-393.. Bobbin, R.P., Ceasar, G., Fallon, M., 1990. Potassium induced release of GABA and other substances from the guinea pig cochlea. Hear. Res. 46, 83-94. Bobbin, R.P., Thompson, M.H., 1978. Effects of putative transmitters on afferent cochlear transmission. Ann. Otol. Rhinol. Laryngol. 87, 185-190. Brown, J.J., 1987. Morphology of labeled efferent fibers in the guinea pig cochlea. J. Comp. Neurol. 260, 605-618. Brown, J.J., Brummett, R.E., Meikle, M.B., Vernon, J., 1978. Combined effects of noise and neomycin. Cochlear changes in the guinea pig. Acta Otolaryngol. 8, 394-400. 72
19. 20. 21. 22. 23.
24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38.
Brownell, W.E., 1984. Microscopic observation of cochlear hair cell motility. Scan. Elect. Microsc. 3, 1401-1406. Brownell, W.E., Bader, C.R., Bertrand, D., Ribaupierre, Y., 1985. Evoked mechanical responses of isolated cochlear hair cell. Science 227, 194-196. Carvalho, C.M., Ferreira, I.L., Duarte, C.B., Malva, J.O., Tretter, L., Ádám-Vizi, V., Carvalho, A.P., 1995. Relation of [Ca2+]i to dopamine release in striatal synaptosomes: role of Ca2+ channels. Brain Res. 669, 234-244. Catterall, W.A., 1980. Neurotoxins that act on voltage-sensitive sodium channels in excitable membranes. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20, 15-43. Chambers, H.F., Sande, M.A., 1996. Antimicrobial agents: The aminoglycosides. In: Goodman and Gilman’s The pharmacological basis of theurapeutics. (9th ed.), editors: Hardman, J.G., Limbird, L.E., Molinoff, P.B., Ruddon, R.W., Gilman, A.G., McGraw-Hill, New York, pp. 1103-1121. Cheramy, A., Romo, R., Godeheu, G., Baruch, P., Glowinski, J., 1986. In vivo presynaptic control of dopamine release in the cat caudate nucleus--II. Facilitatory or inhibitory influence of L-glutamate. Neuroscience 19, 1081-1090. Choi, D.W., 1987. Ionic dependence of glutamate neurotoxicity in cortical cell culture. J. Neurosci. 7, 369-379. Collingridge, G.I., Herron, C.E., Lester, A.J., 1988. Frequency-dependent Nmethyl-D-aspartate receptor-mediated synaptic transmission in rat hippocampus. J. Physiol. 399, 301-312. Corey, D.P., Hudspeth, A.J., 1979. Ionic basis of receptor potentials in a vertebrate hair cell. Nature 281, 625-627. d’ Aldin, C., Eybalin, M., Puel, J.-L., Characon, G., Ladrech, S., Renard, N., Pujol, R., 1995. Synaptic connections and putative functions of the dopaminergic innrevation of the guinea pig cochlea. Eur. Arch. Otorhinolar. 252, 270-274. d’ Aldin, C., Puel, J.-L., Leducq, R., Crambes, O., Eybalin, M., Pujol, R., 1995. Effect of a dopaminerg agonist in the ginea pig cochlea. Hear. Res. 90, 202-211. Dallos, P., 1985. Response characteristics of mammalian cochlear hair cells. J. Neurosci. 5, 1597-1608. Dallos, P., HE, D.Z., Lin, X., Sziklai, I., Mehta, S., Evans, B.N., 1997. Acetylcholine, outer hair cell electromotility, and the cochlear amplifier. J. Neurosci. 17, 2212-2226. Dannhof, B.J., Burns, V., 1993. The innervation of the organ of Corti in the rat. Hear. Res. 66, 8-22. Diamant, S., Avraham, B., Atlas, D., 1987. Neomycin inhibits K+- and veratridine-stimulated noradrenaline release in rat slices and brain synaptosomes. FEBS Lett. 219, 445-450. Docherty, M., Bradford, H.F., Wu, J.-Y., 1987. Co-release of glutamate and aspartate from cholinergic and GABAergic synaptosomes. Nature 330, 64-66. Drescher, M.J., Drescher, D.G., Medina, J.E., 1983. Effect of sound stimulation at several levels on concentrations of primary amines, including neurotransmitter candidates in perilymph of the guinea pig inner ear. J. Neurochem. 41, 309–320. Dulon, D., Schacht, J., 1992. Motility of cochlear outer hair cells. Am. J. Otol. 13, 108-112. Duvall, A.J., Wersall, J., 1964. Site of action of streptomycin upon inner ear sensory cells. Acta Otolaryngol. 57, 581-598. Ehrenberger, K., Felix, D., 1991. Glutamate receptors in afferent cochlear 73
39. 40. 41. 42. 43.
44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56.
neurotransmission in guinea pigs. Hear. Res. 52, 73-80. Egoyhen, A.B., Johnson, D.S., Boulter, D., Vetter, J., Heinemann, S., 1994. a9: An acetylcholine receptor with novel pharmacological properties expressed in rat cochlear hair cells. Cell 79, 705-715. Erdő, S., 1997. Excitátoros aminosavak. In: Humán farmakológia, szerk: Vizi, E.S., Medicina, Budapest, pp 196-202. Erulkar, S.D., 1989. Chemically mediated synaptic transmission. In: Basic Neurochemistry (4th ed.), editors: Siegel, G., Agranoff, B., Albers, R.W., Molinoff P., Raven Press, New York, pp 151-168. Eybalin, M., 1993. Neurotransmitters and neuromodulators of the mammalian cochlea. Physiol. Rev. 73, 309-373. Eybalin, M., Charachon, G., Renard, N., 1993. Dopaminergic lateral efferent innervation of the guinea-pig cochlea: immunoelectron microscopy of catecholamine-synthesizing enzymes and effect of 6-hydroxydopamine. Neuroscience. 54, 133-142. Eybalin, M., Cupo, A., Pujol, R., 1984. Met-enkephalin caracterization in the cochlea: high performance liquid chomatography and immunoelectron microscopy. Brain Res. 305, 313-322. Eybalin, M., Pujol, R., 1983. A radioautographic study of [3H]L-glutamate and [3H]L-glutamine uptake in the guinea pig cochlea. Neuroscience. 9, 863-871. Eybalin, M., Pujol, R., 1989. Cochlear neuroactive substances. Arch. Otorhinolaryngol. 246, 228-234. Farber, J.L., 1990. The role of calcium in lethal cell injury. Chem. Res. Toxicol. 3, 503-508. Felix, D., Ehrenberger, K., 1992. The efferent modulation of mammalian inner hair cell afferents. Hear. Res. 64, 1-5. Fex, J., Altschuler, R.A., 1984. Glutamic acid decarboxylase immunoreactivity of olovocochlear neurons in the organ of Corti of guinea pig and rat. Hear. Res. 15, 123-131. Fex, J., Martin, M.R., 1980. Lack of effect of DL-aminoadipate, an excitatory amino acid antagonist, on cat auditory nerve responses to sounds. Neuropharmacology, 19, 809-811. Fischel-Ghodsian, N., 1999. Genetic factors in aminoglicoside toxicity. Ann. N. Y. Acad. Sci. 884, 99-109. Flock, A., Bretscher, A., Weber, K., 1982. Immunohistochemical localization of several cytoskeletal proteins in inner ear sensory and supporting cell. Hear. Res. 7, 75-89. Gáborján, A., Lendvai, B., Vizi, E.S., 1999. Neurochemical evidence of dopamine release by lateral olivocochlear efferents and its presynaptic modulation in guinea-pig cochlea. Neuroscience 90, 131-138. Gáborján, A., Vizi, E.S., 1999. Characterization of voltage dependent calcium channels on the lateral olivocochlear efferent fibers of guinea pig. Neurosci. Lett. 269, 49-51. Garthwaite, J., 1991. Glutamate, nitric oxide, and cell-cell signaling in the nervous system. Trends Neurosci. 14, 60-67. Gerevich, Z., Tretter, L., Ádám-Vizi, V., Baranyi, M., Kiss, J.P., Zelles, T., Vizi, E.S., 2001. Analysis of high intracellular [Na+]-induced release of [3H]noradrenaline in rat hippocampal slices. Neuroscience 104, 761-768. 74
57. 58. 59. 60. 61. 62. 63. 64.
65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74.
Gil-Loyzaga, P., 1995. Neurotransmitters of the olivocochlear lateral efferent system: with an emphasis on dopamine. Acta Otolaryngol. 115, 222-226. Gil-Loyzaga, P., Bartolomé, V., Vincente-Torres, M.A., Carricondo, F., 2000. Serotonergic innervation of the organ of Corti. Acta Otolaryngol. 120, 128-132. Gil-Loyzaga, P., Fernández-Matheos, P., Vincente-Torres, M.A., Remezal, M., Cousillas, H., Arce, A., Esquifino, A., 1993. Effect of noise stimulation on cochlear dopamine metabolism. Brain Res. 623, 177-180. Gil-Loyzaga, P., Pares-Herbute, N., 1989. HPLC detection of dopamine and noradrenaline in the cochlea of adult and developing rats. Dev. Brain Res. 48, 157-160. Gil-Loyzaga, P., Vicente-Torres, M.A., Fernandez-Mateos, P., Arce, A., Esquifino, A., 1994. Piribedil affects dopamine turnover in cochleas stimulated by white noise. Hear. Res. 79, 178-182. Godfrey, D.A., Carter, J.A., Berger, S.J., Matschinsky, F.M., 1976. Levels of putative transmitter amino acids in the guinea pig cochlea. J. Histochem. Cytochem. 24, 468-470. Guinan, J.J., 1996. Physiology of olivocochlear efferents. In: The cochlea. editors: Dallos, P., Popper, A.N., Fay, R.R., Springer, New York, pp 435-502. Hámori J., Takács, J., Petrusz P., 1990. Immunogold electron microscopic demonstration of glutamate and GABA in normal and deafferented cerebral cortex: Correlation between transmitter content and synaptic vesicle size. J. Histochem, Cytochem. 38, 1767-1777. Haruta, A., Matsuda, K., Tono, T., Komune, S., Matsubara, A., Usami, S.-I., 1998. Changes of perilymphatic glutamate and cochlear blood flow following ischaemia. Acta Otolaryngol. Suppl. 539, 44-47. Hawkins, J.E., 1973. Ototoxic mechanism. Audiology 12, 383-393. He, D.Z., Zheng, J., Edge, R., Dallos, P., 2000. Isolation of cochlear inner hair cells. Hear. Res. 145, 156-160. Hoffman, D.W., Zamir, N., Rubio, J., Altschuler, R.A., Fex, J., 1985. Proenkephalin and prodynorpfin-related neuropeptides in the cochlea. Hear. Res. 17, 47-50. Huthsped, A.J., 1983. Transduction and tuning by verebrate hair cells. Trends Neurosci. 6, 366-369. Ikeda, K., Saito, Y., Nishiyama, A., Takasaka, T., 1991. Effects of pH on intracellular calcium levels in isolated cochlear outer hair cells of guinea pigs. Am. J. Physiol. 261, C231-C236. Imperato, A., Honore, T., Jensen, L.H., 1990. Dopamine release in the nucleus caudatus and in the nucleus accumbens is under glutamatergic control through non-NMDA receptors: a study in freely-moving rats. Brain Res. 530, 223-228. Jäger, W., Goiny, M., Herrera-Marschitz, M., Hökfelt, T., Flock, Å., Brundin, L., 1998. Sound evoked efflux of excitatory amino acids in the guinea pig cochlea in vitro. Exp. Brain Res. 121, 425–432. Jäger, W., Goiny, M., Herrera-Marschitz, M., Brundin, L., Fransson, A., Canlon, B., 2000. Noise-induced aspartate and glutamate efflux in the guinea pig cochlea and hearing loss. Exp. Brain Res. 134, 426-434. Janssen, R., Schweitzer, L., Jensen, K.F, 1991. Glutamate neurotoxicity in the developing rat cochlea: physiological and morphological approaches. Brain Res. 552, 255-264. 75
75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. 82. 83. 84. 85. 86. 87.
88. 89. 90. 91. 92. 93.
Jenner, P., 1992. Parkinson’s disease: pathological mechanisms and actions of piribedil. J. Neurol. Suppl. 239, S2-S8. Jennison, G.L., Bobbin, R.P., 1985. Quinsqualate excites spiral ganglion neurons of the guinea pig. Hear. Res. 20, 261-265. Jennison, G.L., Bobbin, R.P., Thalmann, R., 1985. Potassium-induced release of endogeneous amino acids in the guinea pig cochlea. J. Neurochem. 6, 1845– 1853. Jennison, G.L., Winbery, S., Bobbin, R.P., 1986. Comparative actions of quinsqualate and N-methyl-D-aspartate, excitatory amino acid agonists, on guinea pig cochlear potentials. Comp. Biochem. Physiol. C. 84, 385-389. Kachar, B., Brownell, W.E., Altschuler R., Fex, J., 1986. Electrokinetic shape changes of cochlear outer hair cells. Nature 322, 365-368. Kakigi, A., Hirakawa, H., Harel, N, Mount, R.J., Harrison R.V., 1998. Basal cochlear lesions result in increased amplitude of otoacoustic emissions. Audiol. Neurootol. 3, 361-372. Karadaghy, A.A., Lasak, J.M., Chomchai, J.S., Khan, K.M., Drescher, M.J., Drescher, D.G., 1997. Quantitative analysis of dopamine receptor messages in the mouse cochlea. Molec. Brain Res. 44, 151-156. Kemp, D.T., 1978. Stimulated acoustic emissions from within the human auditory system. J. Acoust. Soc. Am. 64, 1386-1391. Khan M.J., Seidman, M.D., Quirk, W.S., Shivapuja, B.G., 2000. Effects of kynurenic acid as a glutamate receptor antagonist in the guinea pig. Eur. Arch. Otorhinolaryngol. 257, 177-181. Kiss, J.P., Tóth, E., Lajtha, A., Vizi, E.S., 1994. NMDA receptors are not involved in the MK-801-induced increase of striatal dopamine release in rat: a microdialysis study. Brain Res. 641, 145-148. Kiss, J.P., Vizi, E.S., 2001. Nitric oxide: a novel link between synaptic and nonsynaptic transmission. Trends Neurosci. 24, 211-215. Kleinlogel, S., Oestreicher, E., Arnold, T., Ehrenberger, K., Felix, D., 1999. Metabotropic glutamate receptors group I are involved in cochlear neurotransmission. Neuroreport 10, 1879-1882. Knaus, H.G., Striessnig, J., Koza, A., Glossmann, H., 1987. Neurotoxic aminoglycoside antibiotics are potent inhibitors of [125I]-Omega-Conotoxin GVIA binding to guinea-pig cerebral cortex membranes. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 336, 583-586 Kusakari, J.E., Arakawa, E., Rokugo, M., Ohyama, K., Inamura, M., 1984. Effect of kainic acid upon N1 latency. Laryngoscope 94, 1365-1369. Liberman, M.C., 1980. Efferent synapses in the inner hair cell area of the cat cochlea: an electron microscopic study of serial sections. Hear. Res. 3, 189-204. Liberman, M.C., 1982. Single-neuron labeling in the cat auditory nerve. Science 216, 1239-1241. Liberman, M.C., Dodds, L.W., Pierce, S., 1990. Afferent and efferent innervation of the cat cochlea quantitative analysis with light and electron microscopy. J. Comp. Neurol. 301, 443-460. Littman, T., Bobbin, R.P., Fallon, M., Puel, J.-L., 1989. The quinoxalinediones DNQX, CNQX and two related congeners suppress hair cell-auditory nerve transmission. Hear. Res. 40, 45-54. Lim, D.J., 1986. A review: effects of noise and ototoxic drugs at the cellular level 76
94. 95. 96. 97. 98.
99.
100.
101. 102.
103. 104. 105. 106. 107.
108. 109.
in the cochlea. Am. J. Otolaryngol. 7, 73-99. López-González, M.A., Lucas, M., Delgado, F., Diaz, P., 1997. The production of free oxygen radicals and nitric oxide in the rat cochlea. Neurochem. Int. 33, 55-59. Mally, J., Baranyi, M., Vizi, E.S., 1996. Change in the concentrations of amino acids in CSF and serum of patients with essential tremor. J. Neural. Transm. Gen. Sect. 103, 555-560. Mammano, F., Kros, C.J., Ashmore, J.F., 1995. Patch clamped responses from outer hair cells in the intact adult organ of Corti. Pflügers Arch. Eur. J. Physiol. 430, 745-750. Martényi, F., 1997. Dopamin. In: Humán farmakológia, szerk: Vizi, E.S., Medicina, Budapest, pp 179-184. Matsuda, K., Komune, S., Tono, T., Yamasaki, M., Haruta, A., Kato, E., 2000. A role of glutamate in drug-induced ototoxicity: in vivo microdialysis study combined with on-line enzyme fluorometric detection of glutamate in the guinea pig cochlea. Brain Res. 852, 492-495. Matsuda, K., Ueda, Y., Haruta, A., Tono, T., Komune, S., 1998. High potassiuminduced glutamate release in the cochlea: in vivo microdialysis study combined with on-line enzyme fluorometric detection of glutamate. Brain Res. 794, 343346. Matsubara, A., Kawabata, Y., Takumi, Y., Usami, S.-I., Shinkawa, H., Haruta, A., Matsuda, K., Tono, T., 1998. Quantitative immunogold cytochemistry reveals sources of glutamate release in inner ear ischaemia. Acta Otolaryngol. Suppl. 539, 48-51. Mayer, M.L., Westbrook, G.L., 1987. Cellular mechanisms underlying excitotiycity. Trends Neurosci. 10, 59-61. Milusheva, E.A., Doda, M., Baranyi, M., Vizi, E.S., 1996. Effect of hypoxia and glucose deprivation on ATP level, adenylate energy charge and [Ca2+]odependent and independent release of [3H]dopamine in rat striatal slices. Neurochem. Int. 28, 501-507. Moncada, S., Palmer, R.M., Higgs, E.A., 1991. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev. 43, 109-142. Mountain, D.C., 1980. Changes in endolymphatic potential and crossed olivocochlear bundle stimulation alter cochlear mechanics. Science 210, 71-72. Morrison, D., Schindler, R.A., Wersall, J., 1975. Quantitative analysis of the afferent innervation of the organ of Corti in guinea pig. Acta Otolaryngol. 79, 1123. Nakagawa, T., Komune, S., Uemura, T., Akaike, N., 1991. Excitatory amino acid response in isolated spiral ganglion cells of guinea pig cochlea. J. Neurophysiol. 65, 715-723. Nakagawa, T., Kakehata, S., Akaike, N., Komune, S., Takasaka, T., Uemura, T., 1992. Effects of Ca2+ antagonists and aminoglycoside antibiotics on Ca2+ current in isolated outer hair cells of guinea pig cochlea. Brain Res., 580, 345347. Niedzielski, A.S., Safieddine, S., Wenthold R.J., 1995. Expression of metabotropic glutamate receptors in inner ear afferent neurons and the organ of Corti. Assoc. Res. Otolaryngol. 19, 700. Nomura, Y., 1976. Nerve fibers in the human organ of Corti. Acta Otolaryngol. 77
110. 111. 112. 113. 114. 115. 116. 117. 118. 119. 120. 121.
122. 123. 124. 125. 126. 127.
82, 317-324. Nordang, L., Oestreicher, E., Arnold, W., Anniko, M., 2000. Glutamate is the afferent neurotransmitter in the human cochlea. Acta Otolaryngol. 120, 359-362. Oestreicher, E., Arnold, W., Ehrenberger, K., Felix, D., 1997. Dopamine regulates the glutamatergic inner hair cell activity in guinea pigs. Hear. Res. 107, 46-52. Ohmori, H., 1996. Afferent and efferent synaptic transmission in hair cells. News Physiol. Sci. 11, 161-166. Okamoto, A., Tamura, T., Yokoyama, K., Kobayashi, N., Hasegawa, M., 1990. Effect of loud sound exposure on cochlear blood flow. Acta Otolaryngol. 109, 378-382. Oliver, D., HE, D.Z., Klocker, N., Ludwig, J., Schulte, U., Waldegger, S., Ruppersberg, J.P., Dallos P., Fakler, B., 2001. Intracellular anions as the voltage sensor of prestin, the outer hair cell motor protein. Science 292, 2340-2343. Ono,T,. Schacht, J., 1989. Acoustic stimulation increases phosphoinositid breakdown in the guinea pig cochlea. Neurochem. Int. 14, 327-330. Otte, J., Schuknecht, H.F., Kerr, A.G., 1978. Ganglion cell populations in normal and pathological human cochleae: Implication for cochlear implantation. Laryngoscope 88, 1231-1246. Pai, N., Zdanski, C.J., Gregory, C.W., Prazma, J., Carrasco, V., 1998. Sodium nitroprussid/nitric oxide causes apoptosis in spiral ganglion cells. Otolaryngol. Head Neck Surg. 119, 323-330. Palkovits, M., Vizi, E.S., 1997. Az idegrendszer működésének anatómiai és funkcionális alapjai. In: Humán farmakológia, szerk: Vizi, E.S., Medicina, Budapest, pp 137-160. Parks, T.N., 2000. The AMPA receptors of auditory neurons. Hear. Res. 147, 7791. Patuzzi, R., Robertson, D., 1988. Tuning in the mammalian cochlea. Physiol. Rev. 68, 1009-1082. Prezant, T.R., Agapian, J.V., Bohlman, M.C., Bu, X., Oztas, S., Qiu, W.-Q., Arnos, K.S., Cortopassi, G.A., Jaber, L., Rotter, J.I., Shohat, M., FischelGhodsian, N., 1993. Mitochondrial ribosomal RNA mutation associated with both antibiotic-induced and non-syndromic deafness. Nature Gen. 4, 289-294. Puel, J.-L., 1995. Chemical synaptic transmission in the cochlea. Prog. Neurobiol. 47, 449-476. Puel, J.-L., Bobbin, R.P., Fallon, M., 1988. An ipsilateral cochlear efferent loop protects the cochlea during intense sound exposure. Hear. Res. 37, 65-70. Puel, J.-L., Ladrech, S., Chabert, R., Pujol, R., Eybalin, M., 1991. Electrophysiological evidence for the presence of NMDA receptors in the guinea pig cochlea. Hear. Res. 51. 255-264. Puel, J.-L., Pujol, R., Ladrech, S., Eybalin, M., 1991. a-amino-3-hydroxy-5methyl-4-isoxazole propionic acid (AMPA) electrophysiological and neurotoxic effects in the guinea pig cochlea. Neuroscience 45, 63-72. Puel, J.-L., Pujol, R., Tribillac, F., Ladrech, S., Eybalin, M., 1994. Excitatory amino acid antagonists protect cochlear auditory neurons from excitotoxicity. J. Comp. Neurol. 341, 241-256. Pujol, R., 1994. Lateral and medial efferents: a double neurochemical mechanism to protect and regulate inner and outer hair cell function in the cochlea. Br. J. 78
128. 129. 130. 131. 132. 133. 134. 135. 136. 137. 138.
139. 140. 141. 142. 143. 144. 145. 146. 147.
Audiol. 28, 185-191. Pujol, R., Eybalin, M., Puel, J.-L., 1995. Recent advances in cochlear neurotransmission: physiology and pathophysiology. News Physiol. Sci. 10, 178183. Pujol, R., Lenoir, M., Robertson, D., Eybalin, M., Johnston, B.M., 1985. Kainic acid selectivity alters auditory dendrites connected with cochlear inner hair cells. Hear. Res. 18, 145-151. Pujol, R., Puel, J.-L., 1999. Excitotoxicity, synaptic repair, and functional recovery in the mammalian cochlea: a review of recent findings. Ann. N. Y. Acad. Sci. 884, 249-254. Pujol, R., Puel, J.-L., d’Aldin, C.G., Eybalin, M., 1993. Pathophysiology of the glutamergic synapses in the cochlea. Acta Otolaryngol. 113, 330-334. Pujol, R., Rebillard, G., Puel, J.-L., Lenoir, M., Eybalin, M., Decasens, M., 1990. Glutamate neurotoxicity in the cochlea: a possible consequence of ischaemic or anoxic conditions occuring in ageing. Acta Otolaryngol. Suppl. 476, 32-36. Pullan, L.M., Stumpo, R.J., Powel, R.J., Paschetto, K.A., Britt, M., 1992. Neomycin is an agonist at a polyamine site on the N-methyl-D-aspartate receptor. J. Neurochem. 59, 2087-2093. Rasmussen, G.L., 1942. An efferent cochlear bundle. Anat. Rec. 82, 441. Robertson, D., 1983. Functional significance of dendritic swelling after loud sounds in the guinea pig cochlea. Hear. Res. 9, 263-278. Ryan, A.F., Schwartz, I.R., 1984. Preferential glutamine uptake by cochlear hair cells: implications for the afferent cochlear transmitter. Brain Res. 290, 376-379. Rybak, L.P., 1986. Drug ototoxicity. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 26, 79-99. Safieddine, S., Prior, A.M., Eybalin, M., 1997. Choline acetyltransferase, glutamate decarboxylase thyrosine hydroxilase, calcitonin gene-related peptide and opioid peptides coexist in lateral efferent neurons of rat and guinea-pig. Eur. J. Neurosci. 9, 356-367. Sahley, T.L., Nodar, R.H., 2001. A biochemical model of peripheral tinnitus. Hear. Res. 152, 43-54. Sanchez-Prieto, J., Gonzalez, P., 1988. Occurence of large Ca2+-independent release of glutamate during anoxia in isolated nerve terminals (synaptosomes). J. Neurochem. 50, 1322-1324. Santi, P.A., 1988. Cochlear microanatomy and ultrastructure. In: Physiology of the ear, editors: Jahn, A.F., Santos-Sacchi, J., Raven Press, New York, pp 173199. Santos-Sacchi, J., 1988. Cochlear physiology. In: Physiology of the ear, editors: Jahn, A.F., Santos-Sacchi, J., Raven Press, New York, pp 271-293. Satake, M., Liberman., M.C., 1996. Morphological subclasses of lateral olivocochlear terminals? Ultrastructural analysis of inner spiral bundle in cat and guinea pig. J. Comp. Neurol. 371, 621-632. Saunders, J.C., Dear, S.P., Schneider, M.E., 1985. The anatomical consequences of acoustic injury: A review and tutorial. J. Acoust. Soc. Am. 78, 833-860. Schacht, J., 1986. Molecular mechanisms of drug-induced hearing loss. Hear. Res. 22, 297-304. Schacht, J., 1998. Aminoglycoside ototoxicity: prevention in sight? Otolaryngol. Head Neck Surg. 118(5), 674-677. Schoffelmeer, A. N., Mulder, A. H., 1983. 3H-noradrenaline release from rat 79
148. 149.
150. 151. 152. 153. 154. 155. 156. 157. 158. 159. 160. 161. 162. 163. 164. 165. 166.
neocortical slices in the absence of extracellular Ca2+ and its presynaptic alpha 2-adrenergic modulation. A study on the possible role of cyclic AMP. Naunyn Schmiedebergs Arch. Pharmacol. 323, 188-192. Selvadurai, D.K., Etheridge, S., Jones, P., Mulheran, M., Cook, J.A., 2000. Pharmacological protection of auditory function against noise and hypoxia with MK-801. Clin. Otolaryngol. 25, 570-576. Seren, M.S., Aldinio, C., Zanoni, R., Leon, A., Nicoletti, F., 1989. Stimulation of inositol phospholipid hydrolysis by excitatory amino acids is enhanced in brain slices from vulnerable regions after transient global ischemia. J. Neurochem. 53. 1700-1705. Serra, A., Grasso, D.L., Cocuzza, S., Trombetta, L., La Mantia I., 1999. Normal and altered cytoarchitecture of the inner ear. Ann. N. Y. Acad. Sci. 884, 69-84. Sewell, W.F., 1996. Neurotransmitter and synaptic transmission. In: The cochlea. editors: Dallos, P., Popper, A.N., Fay, R.R., Springer, New York, pp 503-533. Simmonds, D.D., Manson-Gieselke, L., Hendrix, T.W., Morris, K., Williams, S.J., 1991. Postnatal maturation of spiral ganglion neurons: A horseradish peroxidase study. Hear. Res. 55, 81-91. Slepeczky, N.B., 1996. Structure of the mammalian cochlea. In: The cochlea. editors: Dallos, P., Popper, A.N., Fay, R.R., 1996, Springer, New York, pp 44129. Slepecky, N.B., Chamberlain S.C., 1982. Distribution and polarity of actin in the sensory cells of the chinchilla cochlea. Cell Tissue Res. 224, 15-24. Slepecky, N., Chamberlain S.C., 1985. Immunoelectron microscopic and immunofluorescent localization of cytoskeletal and muscle-like contractile proteins in inner ear sensory hair cells. Hear. Res. 20, 245-260. Snyder, S.H., Bredt, D.S. 1992. Biologic roles of nitric oxide. Sci. Am. 266, 6877. Sone, M., Schachern, P.A., Paparella, M.M., 1998. Loss of spiral ganglion cells as primary manifestation of aminoglycoside ototoxicity. Hear. Res.115, 217-223. Sperlágh, B., Zsilla, G., Baranyi, M., Kékes-Szabó, A., Vizi, E.S., 1997 Agedependent changes of presynaptic neuromodulation via A1-adenosine receptors in rat hippocampal slices. Int. J. Dev. Neurosci. 15, 739-747. Spicer, S.S., Schulte, B.A., 1992. Creatine kinase in epithelium of the inner ear. J. Histochem. Cytochem. 40, 185-192. Spicer, S.S., Schulte, B.A., 1993. Cytologic structures unique to Deiters cells of the cochlea. Anat. Rec. 237, 421-430. Spoendlin. H., 1973. Innervation of the cochlear receptor. In: Basic mechanisms in hearing. editor: Moller, A., Academic Press, New York, pp 185-230. Spoendlin, H., 1981. Differentiation of cochlear afferent neurons. Acta Otolaryngol. 91, 451-456. Spoendlin, H., 1988. Neural anatomy of the inner ear. In: Physiology of the ear, editors: Jahn, A.F., Santos-Sacchi, J., Raven Press, New York, pp 201-219. Spoendlin. H., Schrott, A., 1988. The spiral ganglion and the innervation of the human organ of Corti. Acta Otolaryngol. 105, 403-410. Stys, P. K., Waxman, S. G., Ransom, B.R., 1992. Ionic mechanisms of anoxic injury in mammalian CNS white matter: role of Na+ channels and Na(+)-Ca2+ exchanger. J. Neurosci. 12, 430-439. Sun, W., Salvi, R.J., 2001. Dopamine modulates sodium currents in cochlear 80
167. 168. 169. 170. 171. 172. 173. 174. 175. 176. 177. 178. 179. 180. 181. 182. 183. 184. 185.
spiral ganglion neurons. Neuroreport 12, 803-807. Surin, A.M., Reimann-Philipp, U., Fechter, L.D., 2000. Simultaneous monitoring of slow cell motility and calcium signals of the quinea pig outer hair cell. Hear. Res. 146, 121-133. Sziklai, I., Dallos, P., 1993. Acetylcholine controls the gain of the voltage-tomovement converter in isolated outer hair cells. Acta Otolaryngol. 113, 326-329. Sziklai, I., He, D.Z., Dallos, P., 1996. Effect of acetylcholine and GABA on the transfer function of electromotility in isolated outer hair cells. Hear. Res. 95, 8799. Takumida, M., Anniko, M., 2001. Direct evidence of nitric oxide production in the guinea pig organ of Corti. Acta Otolaryngol. 121, 342-345. Tarnawa, I., Vizi, E.S., 1998. 2,3-Benzodiazepine AMPA antagonists. Rest. Neurol. Neurosci. 13, 41-57. Thorne, P.R., Nuttall, A.L., 1987. Laser Doppler measurements of cochlear blood flow during loud sound exposure in the guinea pig. Hear. Res. 27, 1-10. Thorne, P.R., Nuttall, A.L., 1989. Alterations in oxygenation of cochlear endolymph during loud sound exposure. Acta Otolaryngol. 107, 71-79. Tretter, L., Ádám-Vizi, V., 1998. The neuroprotective drug vinpocetin prevents veratridine-induced [Na+]i and [Ca2+]i rise in synaptosomes. Neuroreport 8, 18491853. Ulbricht, W., 1998. Effects of veratridine on sodium currents and fluxes. Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 133, 1-54. Usami, S.-I., Hozawa, J., Tazawa, M., Yoshihara, T., Igarashi, M., Thompson, G.C., 1988. Immunocytochemical study of catecholaminergic innervation in the guinea pig cochlea. Acta Otolaryngol. 447, 36-45. Van den Buuse, M., 1997. Pretreatment with quinpirole inhibits the central antihypertensive effects of rilmenidine and alpha-methyldopa in conscious rats. Eur. J. Pharmacol. 322, 191-199. Vass, Z., 1995. A cochlearis vérkeringés neurohumorális szabályozásának szerepe nagyothallás kialakulásában. Kandidátusi Értekezés. Vass, Z., Bari, F., Jancsó, G., 1994. Possible involvment of capsaicin-sensitive sensory nerves in the regulation of cochlear blood flow in the guinea pig. Acta Otolaryngol. 114, 156-161. Vass, Z., Bari, F., Barzó, P., Czigner, J., 1992. A cochlea autoregulatios mechanizmusának vizsgálata laser-Dopplerrel. Fül-Orr-Gégegyógy. 38, 189-192. Vass, Z., Brechtelsbauer, P.B., Nuttall, A.L., Miller, J.M., 1995. Effect of endolympahtic hydrops on capsaicin evoked increase in cochlear blood flow. Acta Otolaryngol. 115, 754-758. Vass, Z., Nuttall, A.L., Coleman, J.K.M., Miller, J.M., 1995. Capsaicin-induced release of substance P increases cochlear blood flow in the guinea pig. Hearing. Res. 89, 86-92. Vass, Z., Nuttall, A.L., Miller, J.M., 1996. Az endotheliumtól függô nitrogén monoxid vasoretulatiós szerepe a cochlea erek dilatatiós tónusának kialakításában. Fül-Orr-Gégegyógy. 42, 123-130. Vass, Z., Nuttall, A.L., Miller, J.M., 1996. A cochlea vazodilatációs tónuszavara kísérletesen létrehozott endolympha hydropsban. Fül-Orr-Gégegyógy. 42, 217225. Vass, Z., Nuttall, A.L., Miller, J.M., 1997. A nitrogén monoxid végleges 81
186. 187. 188. 189. 190. 191. 192. 193. 194. 195. 196. 197.
198. 199. 200. 201. 202. 203.
messzenger szerepének igazolása a cochlea keringésére, a capsaicin szenzitív primér szenzoros neuronokon keresztül. Fül-Orr-Gégegyógy. 43, 25-32. Vass, Z., Susan, E.S., Nuttall, A.L., Miller, J.M., Brechtelsbauer P.B., 1997. Trigeminal ganglion innervation of the cochlea- retrograde transport study. Neuroscience 79, 605-615. Vass, Z., Susan, E.S., Nuttall, A.L., Miller, J.M., 1998. Direct evidence of trigeminal innervation of the cochlear blood vessels. Neuroscience 84, 559-567. Vizi, E.S., Chaudhry, I.A., Goldiner, P.L., Ohta, Y., Nagashima, H., Foldes, F.F., 1991. The pre- and postjunctional components of the neuromuscular effect of antibiotics. J. Anasth. 5, 1-9. Vizi, E.S., 1979. Presynaptic modulation of neurochemical neurotransmission. Prog. Neurobiol. 12, 181-290. Vizi, E.S., 1984. Non-synaptic interaction between neurons. Wiley, Oxford. Vizi, E.S., 2000. Role of high-affinity receptors and membrane transporters in nonsynaptic communication and drug action in the central nervous system. Pharmacol. Rev. 52, 63-89. Vizi, E.S., Hársing, L.G. Jr., Zimányi, I., Gaál, G., 1985. Release and turnover of NA in isolated median eminence: lack of negative feedback modulation. Neuroscience 16, 907-916. Vizi, E.S., Kiss, J. P., 1998. Neurochemistry and pharmacology of the major hippocampal transmitter systems: synaptic and nonsynaptic interactions. Hippocampus 8, 566-607. Vizi, E.S., Lábos, E., 1991. Non-synaptic interactions at presynaptic level. Prog. Neurobiol. 37, 145-163. Vizi, E.S., Mike, A., Tarnawa, I., 1996. 2,3-Benzadiazepines (GYKI 52466 and analogs): negative allosteric modulators of AMPA receptors. CNS Drug Rev. 2, 91-126. Wangemann, P., Schacht, J., 1996. Homeostatic mechanisms in the cochlea. In: The cochlea. Editors: Dallos, P., Popper, A.N., Fay, R.R., 1996, Springer, New York, pp 130-185. Warr, W.B., 1975. Olivcocochlear and vestibular efferent neurons of the feline brainstem: Their location, morphology and number determined by retrograde axonal transport and acetylcholinesterase histochemistry. J. Comp. Neurol. 161, 159-182. Warr, W.B., Boche, J.B., Neely, S.T., 1997. Efferent innervation of the inner hair cell region: origins and terminations of two olivocochlear systems. Hear. Res. 108, 89-111. Warr, W.B., Guinan, J.J., 1979. Efferent innervation of the organ of Corti: Two separate systems. Brain Res. 173, 152-155. Weiner, N., Molinoff, P.B., 1989. Catecholamines. In: Basic neurochemistry (4th ed.), editors: Siegel, G.J., Agranoff, B.W., Albers, W.R., Molinoff, P.B., Raven Press, Yew York, pp 233-251. WHO, 1997. Prevention of noise-induced hearing loss, Report of an informal consultation. Geneva, 28-30 October 1997. WHO, 1994. Report of an informal consultation on strategies for prevention of hearing impairment from ototoxic drugs. Geneva, 21-23 November 1994. Wood, K.A., Youle, R.J., 1994. Apoptosis and free radicals. Ann. N. Y. Acad. Sci. 738, 400-407. 82
204. 205. 206.
Zenner, H.P., 1986. Motile responses on outer hair cells. Hear. Res. 22, 83-90. Zdanski, C.J., Carrasco, V., Johnson, K., Prazma, J., Pillsbury, H.C., 1998. Inhibition of nitric oxide synthase causes elevation of hearing tresholds. Otolaryngology-Head and Neck Surgery. 119, 159-163. Zheng, J., Shen, W., He, D.Z., Long, K.B., Madison, L.D., Dallos, P., 2000. Prestin is the motor protein of cochlear outer hair cells. Nature 405, 149-155.
83
J. A témában megjelent publikációk jegyzéke Közlemények: 1. Halmos, G., Gáborján, A., Répássy, G., Z. Szabó, L., Vizi, E.S., 2000. Veratridine-
evoked release of dopamine in guinea pig isolated cochlea. Hear. Res. 144, 89-96. 2. Gáborján, A., Halmos, G., Répássy, G., E.S. Vizi, E.,S., 2001. A new aspect of
aminoglycoside ototoxicity: Impairment of cochlear dopamine release. Neuroreport 12(15), 3327-3330. 3. Halmos G., Lendvai, B., Gáborján, A., Baranyi, M., Z. Szabó, L., Csokonai Vitéz, L.,
2002. Simultaneous measurement of glutamate and dopamine release from isolated guinea pig cochlea. Neurochem. Int. 40(4) (közlésre elfogadva) Előadások 1. Halmos, G., Gáborján, A., Répássy, G., Z.Szabó, L., Vizi E.S., 1999. The effect of
veratridine on the release of dopamine at the axon terminal of the lateral olivocochlear efferent fibres. 2nd European Congress of Pharmacology, Budapest (Poszter), Fund. Clin. Pharmacol. 13/Suppl.1., 343s. 2. Vizi, E.S., Gáborján, A., Répássy, G., Halmos, G., Z.Szabó, L., 1999.
Neurotransmitters in the cochlea: Role of dopaminergic innervation. International Békésy Centenary Conference on Hearing and Related Sciences, 1999, Budapest. 3. Halmos, G., Gáborján, A., Z.Szabó, L., Vizi, E.S., 1999. Neurotranszmitter
rendszerek kölcsönhatásai a zaj elleni védelemben. Magyar Fül-orr-gégeorvosok Egyesülete Audiológiai Szekciójának XXXVI. Vándorgyûlése, Gyõr. 4. Gáborján, A., Halmos, Gy., Répássy, G., Vizi, E.S., 1999. Efferens moduláció a
belsõfül
mûködésében.
Magyar
Fül-orr-gégeorvosok
Egyesülete
Audiológiai
Szekciójának 36. Vándorgyûlése, Gyõr. 5. Halmos, G., Gáborján, A., Z.Szabó, L., Vizi, E.S., 1999 Effect of ototoxic drugs on
cochlear neurotransmission and outer hair cell function. 31st Annual Scientific Symposium of the HMAA, 1999, Sarasota, Florida.
84
6. Halmos, G., Gáborján, A., Baranyi, M., Halmos, P., Z. Szabó, L., Vizi, E.S., 2000.
Simultaneous measurement of glutamate and dopamine release from isolated guinea pig cochlea. 4th European Congress of Oto-Rhino-Laryngology, HNS, Berlin (Poszter), Laryngo-Rhino-Otologie 79/Suppl. 1., S100. 7. Halmos, G., Gáborján, A., Baranyi, M., Z. Szabó, L., Vizi, E.S., 2000. Glutamát és
dopamin felszabadulásának szimultán mérése izolált tengerimalac cochleából. Magyar Fül-orr-gégeorvosok 36. Nemzeti Kongresszusa, Hévíz. 8. Halmos, G., Zelles, T., Lendvai, B., Csokonai Vitéz, L., Vizi, E.S., 2001. Szőrsejtek
intracelluláris Ca2+-koncentrációjának vizsgálata intakt tengerimalac Corti-szerven. Magyar Fül-orr-gégeorvosok Egyesülete Audiológiai Szekciójának 37. Vándorgyûlése, Pécs.
85
