A CD44 ellenes monoklonális antitest kezelés hatásmechanizmusa kísérletes artritiszben. Doktori értekezés
Dr. Hutás Gábor
Semmelweis Egyetem Molekuláris Orvostudományi Doktori Iskola
Témavezető: Dr. Gergely Péter egyetemi tanár
Hivatalos bírálók: Dr. Buzás Edit egy. docens Dr. Szekanecz Zoltán, egy. docens, az MTA doktora
Szigorlati bizottság elnöke: Szigorlati bizottság tagjai:
Dr. Rácz Károly egyetemi tanár Dr. László Valéria egyetemi docens Dr. Sütő Gábor egyetemi docens Dr. Fülöp András Kristóf egyetemi docens
Budapest 2009
Tartalomjegyzék
Rövidítések jegyzéke
5.
1. Bevezetés (irodalmi háttér)
7.
1.1
A humán és a kísérletes ízületi gyulladás
7.
1.2
A granulocita ellenes célzott kezelés perspektívái
7.
1.3
Immunológiai történések a gyulladt ízületben
8.
1.4
A granulocita-endotél kapcsolat lépései
9.
1.5
A granulocita-endotél kapcsolat szabályozásában szerepet játszó
10.
celluláris és humorális tényezők 1.5.1 A hialuronsav (HA) és a CD44 szerepe a rolling és adhézió
10.
mechanizmusában 1.5.2 A hialuronsav-kötő fehérjék (pl. TSG-6) szerepe a hialuronsav
12.
és CD44 közötti interakciók szabályozásában 1.5.3. A granulocita ellenes monoklonális antitestek és a CD44 hiány hatásai
12.
2.
Célkitűzések
13.
2.1
A kísérletes artritisz vizsgálómódszereinek értékelése
13.
2.2
A genetikai és környezeti tényezők szerepének vizsgálata
13.
PG indukált artritiszben 2.3
A granulociták viselkedésének vizsgálata CD44 KO egerekben
13.
illetve CD44 ellenes antitest kezelést követően
3.
Módszerek
14.
3.1
Génkiütött (knock out, KO) és kiméra egerek létrehozása
14.
3.2
Az autoimmun artritisz tanulmányozására használt állati modellek
15.
3.2.1 Humán porc proteoglikán (PG) indukált artritisz (PGIA)
16.
3.2.1.1 A genetikai és környezeti tényezők szerepe PG indukált artritiszben
17.
2
3.3
Sejtfelszíni marker vizsgálatok áramlási citometriával
18.
3.4
Granulocita és endotél kölcsönhatás in vitro vizsgálati lehetőségei
19.
3.4.1 Áramlási kamra vizsgálatok
19.
3.4.2 Migrációs kamra vizsgálatok
20.
3.5.
21.
A fluoreszcens képalkotás alapja
3.5.1. Epifluoreszcens és konfokális fluoreszcens mikroszkópia
22.
3.5.2. Két foton (2P) fluoreszcens pásztázó mikroszkópia
24.
3.5.3. In vitro fluoreszcens képalkotás lehetőségei
25.
a kísérletes reumatológiában 3.5.4 Intravitális epifluoreszcens video mikroszkópia
26.
3.5.5 Intravitális 2P mikroszkópia
29.
3.6
Monoklonális antitest kezelések protokolljai
31.
3.7
Perifériás vérkép elemzése és vérlemezke szám meghatározása
31.
3.8
Az ízületi duzzanat változásának megítélése
32.
3.9
Antitestek és reagensek
32.
3.10
Statisztikai módszerek
32.
4
Eredmények
33.
4.1
A genetikai és környezeti tényezők szerepe PG indukált artritiszben
33.
4.2
Fehérvérsejt rolling és adhézió a CD44 genetikai kiütése,
35.
illetve monoklonális antitesttel (IM7) való blokkolása után 4.3
A fehérvérsejt rolling és adhézió változása a
39.
CD44-HA interakció blokkolása (KM81 mAb) után 4.4
Az IM7 hatása a kiméra egereken
40.
4.5
Az IM7 fragmentumok hatása a fehérvérsejtek rollingjára
42.
4.6
A perifériás vérkép változásai CD44 ellenes mAb kezelést követően
43.
4.7
A mieloid differenciációs marker (Gr-1) ellenes mAb kezelés hatásai
44.
a perifériás vérképre 4.8
A mieloid differenciációs marker (Gr-1) ellenes mAb kezelés hatásai
45.
a fehérvérsejtek viselkedésére 4.9
A vérlemezkék szerepe az IM7 és anti-Gr-1 által kiváltott hatásokban
3
47.
4.10
A PSGL-1 és p- szelektin ellenes mAb, valamint a szolubilis p-szelektin 49. kezelés hatása az IM7 indukált fehérvérsejt-vérlemezke interakciókra
4.11
A heparin valamint a vérlemezke ellenes pAb kezelés hatása az IM7
51.
indukált fehérvérsejt-vérlemezke interakciókra
5
Megbeszélés
53.
6
Következtetések
57.
7.
Összefoglalás
58.
8.
Summary
59.
9.
Irodalomjegyzék
60.
10.
Saját publikációk jegyzéke
66.
11.
Köszönetnyilvánítás
70.
4
Rövidítések jegyzéke 2P
two photon (két foton)
AA
adjuváns indukált artritisz
AgIA
antigén indukált artritisz
AMSC
arthritic mouse synovial cell (artritiszes egér szinoviális sejt)
ATCC
American Type Culture Collection
BSA
bovin szérumalbumin
CD41
cluster of differentiation 41
CD44
cluster of differentiation 44
CIA
kollagén indukált artritisz
CFA
komplett Freud adjuváns
ECM
extracelluláris mátrix
EGFP
enhanced green fluorescent protein (felerősített zöld fluoreszcens fehérje)
EOMA
egér endotelioma sejtvonal
FcR
Fc receptor
G-CSF
granulocita kolónia stimuláló faktor
GAG
glükózaminoglikán
GAR Ig
goat anti rabbit Ig (kecskében termelt nyúl ellenes antitest)
GFP
green fluorescent protein (zöld fluoreszcens fehérje)
HA
hyaluronic acid (hialuronsav)
HABP
hyaluronan binding protein (hialuronsav kötő fehérje)
HLA-B27
humán leukocita antigén B27
IL-3
interleukin-3
IVM
intravitális video mikroszkópia
KO
knock out (génkiütött)
LFA-1
leukocyte function antigen-1
mAb
monoclonal antibody (monoklonális antitest)
MAC-1
membrane attack complex-1
MHC
major histocompatibility complex (fő hisztokimpatibilitási komplex)
pAb
polyclonal antibody (poliklonális antitest)
PBS
phosphate buffered saline (foszfát pufferes fiziológiás sóoldat)
5
PE
phycoerythrin
PG
proteoglikán-aggrekán
PGIA
humán proteoglikán kiváltott ízületi gyulladás
PMT
photomultiplier tube (fotoelektron sokszorozó detektor)
PSGL-1
p-szelektin glikoprotein ligand-1
RA
reumatoid artritisz
rm
recombinant mouse (rekombináns egér)
R6G
rhodamine 6G
SHG
second harmonic generation (optikai felharmonikus)
Tg
transzgenikus
TNF-
tumor nekrózis faktor-
TPE
two photon excitation (két foton excitáció)
TSG-6
tumor nekrózis faktor stimulált gén- 6
VLA
very late activation antigen
WT
wild type (vad típusú állat)
6
1.Bevezetés (irodalmi háttér) 1.1
A humán és a kísérletes ízületi gyulladás
A reumatoid artritisz (RA) a leggyakoribb humán autoimmun megbetegedés, prevalenciája 0.5-1%, éves incidenciája 0.03% a felnőtt összlakosságban.1 A betegséggel
kapcsolatos
direkt
és
indirekt
költségek
jelentős
társadalmi
következményekkel járnak. Az ízületi gyulladás során a fehérvérsejtek kölcsönhatásba lépnek az ereket bélelő endotél sejtekkel, megindul a fehérvérsejtek vándorlása az érfalon és a szinoviális hártyán keresztül az ízületi üreg felé. Ennek a folyamatnak a lépései szigorúan meghatározott sorrendben, szabályozottan követik egymást.2 A humán porc proteoglikán indukált artritisz (PGIA) a RA egyik leggyakrabban tanulmányozott állatmodellje. A klinikai és patológiai hasonlóságok következtében jól használható a gyulladás sejtes és molekuláris folyamatainak tanulmányozására.3 Munkacsoportunk a korábbiakban ismertette az in vivo fluoreszcens video mikroszkópia (IVM) jelentőségét az artritisz vizsgálatában.4 A módszer lehetővé teszi fluoreszcens festést követően a gyulladásban részt vevő sejtek viselkedésének közvetlen tanulmányozását, így akár bizonyos gyógyszeres kezelések sejtszintű hatása is tanulmányozhatóvá válik.
1.2
A granulocita ellenes célzott kezelés perspektívái
Az utóbbi években a B limfocita ellenes gyógyszerekkel elért eredmények bizonyították, hogy egy adott sejtpopulációra jellegzetes sejtfelszíni marker ellen kifejlesztett célzott molekulák biztonságos és hatékony terápiás eszközök lehetnek.5 A granulocita ellenes célzott monoklonális antitest kezelés szintén egy potenciális terápiás lehetőség lehet egyrészt a granulociták malignus megbetegedéseiben, a mielopoliferatív kórképekben,6 másrészt mindazon autoimmun kórképekben- többek között számos autoimmun poliartritiszben-, melyekben a granulociták részt vesznek a gyulladásos folyamat által kiváltott szöveti károsodásban.
7
1.3
Immunológiai történések a gyulladt ízületben
Az autoimmun ízületi gyulladás effektor fázisában mind a specifikus, mind a naiv immunrendszer
aktiválódása
elemeinek
megfigyelhető.
A
gyulladásos
válasz
kiváltásában első fontos lépés a specifikus ellenanyagok kapcsolódása meghatározott strukturális alkotórészekhez, mint pl. humán proteoglikán indukált artritiszben (PGIA) a különböző porc proteoglikánokhoz (PG). Az antigén-antitest kapcsolódás a naiv immunrendszer aktiválásához, a komplement kaszkád beindításához, valamint a granulocita és a monocita-makrofág rendszer tagjainak ízületbe való migrációjához vezet (1. ábra).
Y
Y
Y
Véráramlás iránya
Endotél Szinoviális hártya
C5a
Ízületi rés PG
PG
PG
PG
Porcszövet K. Mikecz RUSH UNIVERSITY MEDICAL CENTER
1. ábra. A naiv immunrendszer aktiválódása PG indukált artritiszben. A porc strukturális
elemeihez
kapcsolódó
antitestek
hatására
aktiválódik
a
komplementrendszer és megindul a granulocita- és a monocita- makrofág rendszer tagjainak ízületbe való migrációja.
8
1.4
A granulocita-endotél kapcsolat lépései
A gyulladás során a granulociták erekből való kilépése, ún. extravazációja elsősorban az ízületet körülvevő posztkapilláris venulákban történik. A neutrofil granulociták megtapadása az érfalon, átlépése az endotél, majd a szinoviális sejtek rétegén keresztül a gyulladt ízület üregébe egy számos, szigorúan meghatározott sorrendben egymás után történő lépcsőből álló folyamat.2 A gyulladásos sejtek az áramlás fő tengelyéből az érfal felé sodródva lelassulnak, majd a fehérvérsejtek endotélsejtekkel való első érintkezését (elfogás; capture) követően elkezdődik a vérsejteknek az endotél mentén a véráramlás irányába történő gördülő mozgása (rolling). A reverzibilis rolling folyamán a sejtek mozgása lelassul, mely megteremti a feltételeket a vérsejtek irreverzibilisnek tekinthető megtapadásához (adhézió), melyet a fehérvérsejteknek az endotél és szinoviális rétegen keresztüli átlépése (transzmigráció) követ (2. ábra).
Granulocita (neutrofil)
Limfocita
VÉRÁRAMLÁS IRÁNYA „Rolling” „Capture” (gördülő (elfogás) mozgás) Lassú „Rolling” Adhézió Transzmigráció
Endotél
Szelektinek CD44
Endotél felszínén lévő kemoattraktánsok
Egyéb szöveti kemoattraktánsok
Integrinek
K. Mikecz RUSH UNIVERSITY MEDICAL CENTER
2. ábra. A granulocita-endotél kölcsönhatás lépései. A granulociták a legelső érintkezést (elfogás; capture) követően gördülő mozgásba kezdenek az endotél felszínén, majd miután egyre jobban lelassulnak, megindul a fehérvérsejtek irreverzilis megtapadása (adhézió), melyet a sejtek érfalon és szinoviális rétegen történő átlépése (transzmigráció) követ.
9
1.5
A granulocita-endotél kapcsolat szabályozásában szerepet játszó celluláris
és humorális tényezők
A fehérvérsejtek megtapadása, majd átlépése az érfalon számos, az endotél- illetve a fehérvérsejtek felszínén lévő adhéziós molekulák közötti specifikus kölcsönhatás eredménye. A laza kapcsolódás és a gördülő mozgás létrejöttében a szelektinek (Lszelektin, E-szelektin, P-szelektin) és karbohidrát ligandjainak (pl. PSGL-1) kapcsolódása játszik fontos szerepet.7 8 Egyes kemokinek hatására a rolling mozgást végző fehérvérsejtek felszínén 1 (VLA-4, „very late activation antigen”) vagy 2 (Mac-2 vagy LFA-1 „leukocyte function antigen”) integrin aktiváció történik, ami az endotél membránjában lévő megfelelő receptorokkal (VCAM-1 vagy ICAM-1) reakcióba lépve a leukocita rolling leállását, és a gyulladásos sejtek endotélhez való szoros kitapadását okozza.9
1.5.1 A hialuronsav és a CD44 szerepe a rolling és adhézió mechanizmusában
A CD44 egy transzmembrán glikoprotein, mely megtalálható mind a fehérvérsejtek, mind az endotél felszínén (3. ábra).
KM81
IM7 intracelluláris vég
COOH NH2 extracelluláris vég HA-kötő domén (“Link” module)
K. Mikecz RUSH UNIVERSITY MEDICAL CENTER
10
sejtmembrán
3. ábra. A CD44 molekula szerkezete. A CD44 egy transzmembrán glikoprotein. C terminális vége intracellulárisan, N terminális vége extracellulárisan helyezkedik el. N terminális végéhez közel helyezkedik el a hialuronsav kötő domain, amelyik a fehérje funkciójáért felelős. A KM81 antitest a HA-kötő domainhez, míg az IM7 ettől C terminálisabban kötődik a CD44 molekulához.
Számos folyamatban feltételezik a CD44 szerepét, mint az embriogenezis,10 a csontszövet
remodellingje,11
tumormetasztázisok képződése,14
a 15
limfohematopoézis,12
az
angiogenezis,13
a
a fehérvérsejtek aktivációja;16 és a szelektinekhez
hasonlóan a leukociták érfal menti gördülő mozgását segíti az aktivált endotél felszínén lévő hialuronsavhoz kapcsolódva (4. ábra).16 17 18 19
N-acetil-glükózamin Glukuronsav
K. Mikecz RUSH UNIVERSITY MEDICAL CENTER
4. ábra. A hialuronsav szerkezete. A hialuronsav egy ismétlődő N-acetil-glükózamin és glukuronsav molekulákból álló, nem elágazó, nem szulfatált glükózaminoglikán (GAG) molekula, a sejtmembrán egyik fő alkotóeleme.
Gyulladásos stimulusok hatására a CD44 sejtfelszíni koncentrációja és hialuronsav kötő képessége növekszik, ugyanekkor az endotél felszínén is fokozódik a hialuronsav
11
expresszió. Bár a CD44 a hialuronsav fő receptora, leírták szerepét az L és E szelektin ligandjaként is.20
21
A CD44 kölcsönhatásba lépve a leukociták integrinjével szerepet
játszhat az endotélhez való adhézió,22 majd az érfalon való transzmigráció folyamatában.2 1.5.2 A hyalurosav-kötő fehérjék (pl. TSG-6) szerepe a hialuronsav és CD44 közötti interakciók szabályozásában A hialuronsav a biológiai membránban ún. hialuronsav kötő fehérjékkel (hyaluronan binding protein, HABP) való komplexekben található. Az egyik fontos ilyen fehérje a TSG-6 (tumor nekrózis faktor stimulált gén- 6 termelte fehérje). Ez egy ún. indukálható fehérje, a termelődése a gyulladás aktivitásával párhuzamosan emelkedik. A TSG-6 alapvetően egy direkt gyulladáscsökkentő és porcvédő hatást fejt ki,23 24 25 26 valamint szerepe lehet a CD44-HA kölcsönhatás szabályozásában is.27 28
1.5.3. A granulocita ellenes monoklonális antitestek és a CD44 hiány hatásai
A CD44 specifikus monoklonális antitestek számos betegségben bizonyították gyulladást csökkentő hatásukat, mint kísérletes artritisz,29 32
mellitus,
33
sclerosis multiplex,
34
és asthma bronchiale.
30 31
1. típusú diabetes
Ez legkönnyebben azzal
lehetne magyarázható, hogy az antitestek képesek blokkolni a sejtfelszíni CD44 receptor HA kötését, valamint az antitesttel kötött sejtfelszíni receptorok kiváltják a receptor-antitest komplex proteolitikus eltávolítását. Ennek alapján azt vártuk volna, hogy a CD44 génkiütött (knock out, KO) állatok védve lesznek a kísérletes gyulladással szemben, de a korábbi vizsgálatok ennek ellentmondó eredményekhez vezettek. Bár a CD44 ellenes antitest kezelés az ízületi gyulladás gyors megszűnéséhez vezetett DBA1 egereken kiváltott kollagén indukált artritiszben (CIA), a CD44 kiütése mérsékelt védettséget35 illetve semleges hatást31 eredményezett az állatokban a gyulladással szemben.
12
2. Célkitűzések 2.1 A kísérletes artritisz vizsgálómódszereinek értékelése Kutatócsoportunk fontos célkitűzése volt, hogy teszteljen, illetve tökéletesítsen különböző vizsgálómódszereket, melyekkel az ízületi gyulladás sejtes történéseinek dinamikája jól vizsgálható. Az ízületi gyulladás során lezajló változások részben modellezhetők in vitro, de a folyamat bonyolultsága, összetettsége miatt ezekben a rendszerekben (áramlási kamra, migrációs kamra) kapott előzetes eredményeket mindenképpen szükséges in vivo vizsgálatokkal is megerősíteni. Dolgozatomban a CD44-hialuronsav rendszer vizsgálata kapcsán szemléltetem e módszerek gyakorlati értékét.
2.2
A genetikai és környezeti tényezők szerepének vizsgálata PG indukált
artritiszben A humán RA egy igen szerteágazó, heterogén betegség, végeztünk kiegészítő vizsgálatokat azt illetően, vajon a PG indukált artritisz ilyen szempontból mutat-e vele hasonlóságot,
a
modellünk
mennyire
megbízható
az
emberi
megbetegedés
szempontjából.
2.3
A granulociták viselkedésének vizsgálata CD44 KO egerekben illetve CD44
ellenes antitest kezelést követően
A CD44 genetikai kiütése, illetve a marker monoklonális antitestekkel való blokkolása eltérő következményekkel járt. Mivel a CD44 fő szerepe a CD44 pozitív sejtek hialuronsavban gazdag membránokon való gördülő mozgásának és adhéziójának szabályozása, feltételeztük, hogy ennek a diszkrepanciának a hátterében a granulociták eltérő viselkedése áll. Kísérleteinkben kerestük a sejtszintű magyarázatot a CD44 genetikai ablációja és a CD44 marker monoklonális antitesttel való blokkolása által a gyulladásos folyamatra kiváltott eltérő következményekre.
13
3. Módszerek 3.1 Génkiütött (knock out, KO) és kiméra egerek létrehozása Kísérleteinkben nőstény Balb/c egereket használtunk. CD44 KO Balb/c egereket CD44 KO DBA1 egerek Balb/c egerekkel végzett sorozatos visszakeresztezésével nyertünk. A kiméra egereket letális besugárzást követően csontvelő transzplantációval állítottuk elő egy korábbiakban leírt módszer szerint.36 Mind WT, mind CD44 KO állatok 4 órás különbséggel, két alkalommal 4.5 Gy besugárzást kaptak (Gammacell, Atomic Energy of Canada). Egy másik csoport WT és CD44 KO állatból csontvelői sejteket gyűjtöttünk a femur és a tibia steril PBS-el való átmosásával. A csontvelői sejtek reszuszpendálása majd szűrése után a besugárzott állatok egyenként 2.5X107 csontvelői sejtet kaptak, részben intravénásan, részben intraperitoneálisan. Két kontroll csoportot kaptuk; WT állatokat, melyek WT állatból származó, és CD44 KO állatokat, melyek CD44 KO állatokból származó csontvelői sejteket kaptak. A kontroll csoportok mellett 2 kiméra csoportunk volt; WT állatok, melyek CD44KO, illetve CD44KO állatok, melyek pedig WT állatokból kaptak csontvelőt. Mivel a kiméra egerekben a fehérvérsejtek a donor, az endotél sejtek a recipiens állat genetikai állományát hordozzák, e módszerrel lehetővé vált az endoteliális és a leukocita sejtfelszíni CD44 hatásának elkülönített vizsgálata. 6 héttel a transzplantációt követően ellenőriztük a csontvelő rekonstrukcióját. Áramlási citometriával (FACS Calibur, BD Biosciences) megnéztük a perifériás leukociták CD44 expresszióját. A CD44 jelenlétére illetve hiányára az endoteliális oldalon a vaszkuláris endotélium jelzett CD44 ellenes antitest kötésével illetve ennek hiányával győződtünk meg. Az altatott egerek füleiben lévő erek CD44 okozta fluoreszcenciáját intravitális video mikroszkópiával vizsgáltuk 50 mikroliterben feloldott 4-8 mikrogram anti-CD44 mAb adása után.
14
3.2
Az autoimmun artritisz tanulmányozására használt állati modellek
A humán artritiszek mind patomehanizmusukban, mind klinikai megjelenésükben igen szerteágazó képet mutatnak.37 Jelenleg mintegy 30-40 indukált, spontán illetve transzgenikus modellt ismerünk, azonban e modellek egyike sem felel meg minden tekintetben egy-egy adott humán megbetegedésnek. A humán RA szempontjából– a klinikai, immunológiai és genetikai tényezőket egybevetve- a legjobb állatmodellek azok, melyek genetikailag fogékony állatokban a porc extracelluláris mátrix (ECM) komponenseivel végzett szisztémás immunizációval válthatók ki. A porc avaszkularitása miatt e nagy mennyiségben előforduló molekulák nincsenek kitéve az immunológiai „felügyeletnek” (surveillance), azaz a károsodott porcból felszabadulva autoantigénnek is tarthatók. A kollagén indukált artritiszt (CIA)38 patkányokon és egereken, proteoglikán indukált artritiszt (PGIA)39 egereken hoznak létre humán illetve bovin porc extracelluláris komponensével. Mind a két fent említett kísérleti artritisz létrehozásához az antigént adjuvánssal (általában inkomplett Freudadjuvánssal) együtt kell bejuttatni. Bizonyos fogékony patkánytörzsekben az adjuvánsként használt Mycobacterium butiricum és az ásványi olaj szuszpenziójának faroktőbe adott injekciója ún. adjuváns indukált artritiszt (AA) vált ki.40 41 42 A PGIA és az AA a perifériás artritisz mellett alkalmas a spondilitisz tanulmányozására is. A spondilitisz tanulmányozására szintén alkalmasak még azok a transzgenikus állatmodellek, ahol humán HLA B27-et és 2-mikroglobulint kódoló géneket juttattak be patkányokba.43 Ezeknél az állatoknál humán I. osztályú MHC-molekulák expresszálódnak, és az állatokban spontán a humán megbetegedéshez igen hasonló spondilartropátia fejlődik ki. Az antigén indukált artritisz (AgIA) monoartikuláris gyulladásos folyamatok vizsgálatára alkalmazható legjobban, de gyakran alkalmazzuk PGIA mellett kiegészítő modellként, amennyiben a kérdéses állattörzs nem fogékony PGIA illetve CIA számára. Gyakran szükséges megfelelő génkiütött illetve transzgenikus állat előállítása artritiszre fogékony genetikai háttérrel, ilyenkor az ún. visszakeresztezési (backcross) periódusban csak AgIA létrehozására van lehetőség az állatok előzetes tesztelése céljából. AgIA kiváltásához az állatokat valamely antigénnel (bovin szérumalbumin, ovalbumin, fibrin)
15
és komplett Freud adjuvánssal (CFA) szenzitizáljuk, majd az adott antigént intraartikulárisan- legtöbbször a térdízületbe- injektáljuk, ennek hatására igen gyorsan, 1-2 óra alatt kifejlődik a helyi gyulladásos reakció.
3.2.1 Humán porc proteoglikán (PG) indukált artritisz (PGIA) A WT, CD44 KO és WT/CD44 KO kiméra Balb/c nőstény állatokat 3 alkalommal intraperitoneálisan immunizáltuk humán porcból származó proteoglikán és szintetikus adjuváns keverékével.3 Az állatok többségénél a 9. és 15. nap között sokízületi gyulladás fejlődött ki, a CD44 KO állatoknál ez kicsit később, a 20. és 28. nap között következett be (5. ábra). A gyulladás mértékét egy 0 és 4 közötti skálán értékeltük („score” meghatározás) külön-külön mindegyik végtagon az alábbiak szerint: 0: manifeszt gyulladás hiánya 1: enyhe fokú, a boka és csuklóízületet nem, csak ujjakat, kéz- és lábközépcsontokat érintő gyulladás 2: mérsékelt fokú, de már boka illetve csuklóízületet is érintő gyulladás 3: súlyos fokú kiterjed, több ízületet illetve egész disztális végtagot érintő heveny gyulladás 4: már idültté váló, gyakran ankilózissal, illetve vénás keringészavarral, trombózissal járó kiterjedt gyulladás. Intravitális video mikroszkópia céljára azokat az állatokat használtuk, melyek legalább egyik alsó végtagi gyulladása az artritisz kezdetétől számított 1 héten belül elérte a 2, illetve 3 „score” értékeket. Az állatkísérleteket a chicagói Rush egyetem illetékes bizottsága előzetesen jóváhagyta.
16
K. Mikecz
A
RUSH UNIVERSITY MEDICAL CENTER
Ismételt imunizálás humán porc proteoglikánnal Genetikailag fogékony egértörzs (pl. Balb/c)
Progresszív, destruktív polyarthritis
B
C
5. ábra. Humán porc proteoglikán (PG) indukált artritisz. Genetikailag fogékony egértörzs ismételt szisztémás immunizációját követően a humán RA-hoz hasonló progresszív, destruktív poliartritisz klinikai és szöveti képe bontakozik ki.
3.2.1.1 A genetikai és környezeti tényezők szerepe PG indukált artritiszben A PG indukált artritisz klinikai és szöveti képe jelentős fokban függ az állatok genetikai hátterétől és különböző környezeti tényezőktől. Hasonlóan a humán RA-hoz, a PGIA heterogén betegségnek tűnik.44 Előzetes vizsgálatunkban különböző kolóniákból származó, azonos csoportú (Balb/c), de különböző alcsoportú egerek esetén tanulmányoztuk a PG indukált artritisz kifejlődését azonos protokoll szerinti immunizálást követően. Ezen alcsoportok azonos genetikai állománnyal bírnak, de egymástól szeparáltan, eltérő környezeti körülmények között lettek szaporítva, ezért a betegség klinikai aktivitásában, valamint a gyulladáshoz társult laboratóriumi paraméterekben lévő esetleges különbségből a környezeti tényezők szerepére lehet következtetni.
17
3.3
Sejtfelszíni marker vizsgálatok áramlási citometriával
Áramlási citometriával fluoreszcens módon jelzett antitestekkel jól felbecsülhető az egyes fehérvérsejt populációk esetében egy adott sejtfelszíni marker mennyisége. Vizsgálataink során ezzel a módszerrel elsősorban a CD44 és a Gr-1 sejtfelszíni markert vizsgáltuk (6. ábra). A Gr-1 egy granulocitákra szelektív differenciációs marker, nincs szerepe a granulocita-endotél interakciókban.45 A CD44 marker alacsonyabb koncentrációban a többi fehérvérsejten is jelen van, szerepe a leukociták hialuronsavban gazdag membránokkal való kölcsönhatásának szabályozása.
A
B
6. ábra. Sejtfelszíni marker vizsgálatok áramlási citometriával. A Gr-1 marker előfordulása a granulocitákon nagyfokú specificitást mutat. A CD44 szintén elsősorban a granulocitákra jellemző, de alacsonyabb koncentrációban a többi magvas vérsejt felszínén is megtalálható.
18
3.4
Granulocita és endotél kölcsönhatás in vitro vizsgálati lehetőségei
A granulocita-endotél kölcsönhatások rendkívül összetettek, az in vitro vizsgálatok csak kellő kritikával értékelhetők. A vérsejtek érfelszínen való viselkedésének in vitro tanulmányozására áramlási és migrációs kamra vizsgálatokat végeztünk. Ezen vizsgálatok hátránya nem csak az, hogy mind a valódi endotél réteg és véráramlás igen nehezen modellezhető, hanem a szorosan kapcsolt sejtszintű folyamatokat (rolling, adhézió, migráció) a kétféle kamra vizsgálatokra szétválasztjuk. In vitro vizsgálatokhoz nagy mennyiségű granulocitát az egér csontvelői sejtek tenyésztésével és megfelelő irányú differenciáltatásával nyerhetünk. Vizsgálataink során a csontvelői sejteket in vitro IL-3 és granulocita kolónia stimuláló faktor (G-CSF) tartalmú médiában tenyésztettük. In vitro endotél létrehozása meglehetősen nehéz feladat, vizsgálatainkhoz egér endotelioma (EOMA) sejtvonalat használtunk, mint a gyulladásos endotélhez hasonló szerkezetű szövetet.
3.4.1 Áramlási kamra vizsgálatok Az áramlási kamra vizsgálatok során egy kamrában meghatározott nyíróerő mellett vizsgálhatjuk egy vékony folyadékrétegben áramló sejtek adott felülethez való megtapadását, viselkedését (7. ábra). Az áramlási kamrát vákuummal rögzítettük az immobilizált szubsztráttal, vagy EOMA szövettenyészettel fedett tárgylemezre, a kamrában lévő sejteket fázis kontraszt mikroszkóppal vizsgáltuk (8. ábra).
http://bme.virginia.edu/lawrence/photos/FlowChamber.jpg
19
7. ábra. In vitro áramlási kamra vizsgálatok. Az immobilizált szubsztráttal vagy endotél sejttenyészettel fedett tárgylemezre egy tömítőgyűrű segítségével, vákuummal rögzítettük az áramlási kamrát. A kamrában lévő sejtek viselkedését meghatározott nyíróerő mellett fáziskontraszt mikroszkóppal vizsgáltuk.
8. ábra. Tenyésztett granulociták viselkedése immobilizált EOMA sejtvonalon. Fázis kontraszt mikroszkóppal az endotelioma síkjából kiemelkedő granulociták jól differenciálhatók és vizsgálhatók.
3.4.2 Migrációs kamra vizsgálatok
A gyulladásos sejtek ízületi migrációjának in vitro modellezésére migrációs kamra vizsgálatokat alkalmaztunk, gyakran áramlási citometriával kombináltan. (9. ábra). Az áramlási kamra apró lyukakkal ellátott membránjának egyik oldalára egér endotelioma tenyészetet (EOMA), ellenoldali felületére gyulladásos egér ízületéből származó szinoviális sejtréteget (arthritic mouse synovial cells, AMSC) növesztettünk. A granulociták a megfigyelési idő alatt a felső rekeszből az endotél és a szinoviális rétegen keresztül az alsó rekeszbe vándoroltak (9. ábra A). Az átvándorolt sejteket összegyűjtés
20
után megszámoltuk. Amikor zöld fluoreszcens protein transzgenikus (EGFP Tg) egerekből származó fluoreszkáló granulocitákat használtunk, lehetőség volt arra, hogy adott mennyiségű nem fluoreszkáló „teszt” sejt hozzáadása után a migrált sejtek számát áramlási citometriával is felbecsülhessük (9. ábra B).
Granulocita migráció iránya
EOMA sejtréteg Szinoviális sejtréteg
A
B
9. ábra. Migrációs kamra vizsgálatok. Az áramlási kamrában lévő fenesztrált membrán két oldalára EOMA illetve AMSC tenyészetet növesztve a migráció folyamata in vitro körülmények között is modellezhető volt (A). Amikor EGFP Tg állatokat használtunk, adott számú nem fluoreszkáló „teszt” sejt hozzáadása után a migrált sejtek száma áramlási citometria segítségével is jól felbecsülhetővé vált (B).
3.5.
A fluoreszcens képalkotás alapjai
A különböző sejtszintű folyamatok in vivo megfigyelésében óriási lehetőséget jelentett a fluoreszcens képalkotó módszerek fejlődése. Amikor bizonyos anyagokat nagy frekvenciájú (kis hullámhosszú) fénnyel világítunk meg, ezek a molekulák egy alacsonyabb frekvenciájú (nagyobb hullámhosszú) sugárzást bocsátanak ki, ezt a jelenséget fluoreszcenciának nevezzük. Fluoreszcens mikroszkópia során optikai szűrők
21
segítségével külön választható a minta gerjesztésére szolgáló magasabb, illetve a fluoreszcens minta által kibocsájtott alacsonyabb frekvenciájú fény, így a képalkotásban csak ezen utóbbiak vesznek részt (10. ábra).46
A
Excitáció
Emisszió
intenzitás
Gerjesztett állapot
csúcs eltolódás (stokes shift) abszorpció
emisszió
hullámhossz
Alapállapot http://mekentosj.com/science/fret/fluorescence.html http://en.wikipedia.org/wiki/Stokes_shift
10. ábra. A fluoreszcens képalkotás alapjai. Ha fluoreszcens anyagokat nagy energiájú (rövidebb hullámhosszú) fotonokkal megvilágítunk, ezek a molekulák kisebb energiájú (hosszabb hullámhosszú) fotonokat bocsátanak ki. Az elnyelt és a kibocsátott foton hullámhossza közötti különbség (csúcs eltolódás, stokes shift) teszi lehetővé a fluoreszcens leképezést.
3.5.1. Epifluoreszcens és konfokális fluoreszcens mikroszkópia
Fluoreszcens mikroszkópia során az excitációs filter segítségével választjuk ki a minta gerjesztésére szánt adott hullámhosszúságú fényt. A fluoreszcens molekulák által kibocsátott fény az emissziós filteren keresztül kerül a detektorba. A rendszerben a kétféle fény szétválasztását egy dikromatikus tükör segíti (11. ábra A). Ezzel a módszerrel elsősorban a vizsgált tárgy felületéről visszavert fluoreszcenciát vizsgálhatjuk (epifluoreszcens képalkotás). Előnye, hogy a módszer egyszerű,
22
segítségével olyan gyors folyamatok, mint a gyulladásos sejtek gördülő mozgása is jól követhetők. A konfokális mikroszkóp nem a tárgy felszínéről, hanem a tárgy belsejében kiválasztott síkról készít képet (11. ábra B). A műszer fontos kelléke az objektívtől optikailag azonos távolságra lévő két pontszerű nyílás (konfokális diafragma). A tárgyat megvilágító lézerfény az egyik diafragmán keresztül lép be a mikroszkópba, és a gyűjtőlencsén keresztül érkezik a kiválasztott sík egy pontjára. A tárgy által kibocsátott fényt ugyanez a lencse a másik diafragmára gyűjti, ahonnan egy ún. fotoelektronsokszorozó detektorba (photomultiplier tube, PMT) kerül. Ez az elrendezés biztosítja egyrészt, hogy a leképezendő tárgypont fókuszált megvilágítást kapjon, másrészt hogy a detektorra elsősorban a tárgypontból jövő fény kerüljön. Konfokális mikroszkóppal jó felbontású, kontrasztos képeket kaphatunk, azonban a módszer a látható tartományban működő lézer nagyfokú szöveti szóródása miatt a mélyebb szöveti struktúrák vizsgálatára nem alkalmas.
A
B detektor fotoelektron sokszorozó detektor
emissziós filter lyukdiafragma (detektor) szűrő
dikromatikus tükör
fókuszon kívüli fény excitációs filter
excitációs filter fókuszból érkező fény
fényforrás
dikromatikus tükör lézer
objektív
objektív
lyukdiafragma (fényforrás) vizsgálati síkok
minta minta
http://www.olympusconfocal.com/theory/confocalintro.html
11. ábra. A fluoreszcens mikroszkóp működése. Epifluoreszcens mikroszkópia során a minta felületéről nyert fluoreszenciát vizsgálhatjuk (A). A konfokális mikroszkópia során a homogén lézer fényforrás és a lyukdiafragmák alkalmazásával lehetőség van arra, hogy a detektorba csak a vizsgált síkból érkező fény kerüljön (B).
23
3.5.2. Két foton (2P) fluoreszcens pásztázó mikroszkópia A szövetek belsejében zajló folyamatok, mint a kapillárisokból az ízületi rés felé történő migráció, vagy a B és T limfociták nyirokszerveken belüli viselkedése esetében a fluoreszcens képalkotó technika területén az igazi áttörést a két foton mikroszkópia jelentette (12. ábra).47 48 A két foton gerjesztés (two photon excitation, TPE) jelenségét egy német származású amerikai fizikus, Goeppert-Mayer írta le 1931-ben doktori disszertációjában.49 Az első két foton excitáción alapuló mikroszkópról csak jóval később 1990-ben adott hírt Denk, Strickler, és Webb a Science hasábjain.50 Klasszikus fluoreszcencia esetén az elektronok gerjesztése nagy energiájú fotonokkal történik, azonban gerjesztés létrejöhet több alacsony energiájú foton energiájának együttes átadása következtében is.51 Az ún. „egy foton” fluoreszcencia gyakori esemény, azonban a „két foton” által kiváltott gerjesztés igen ritka, és csak nagy lézer intenzitás mellett jön létre, mely a konfokális mikroszkópiában alkalmazott folyamatos gáz lézer esetén a szövet roncsolását okozná. Ennek kiküszöbölésére a két foton mikroszkópiában a gerjesztés egy szilárd titánium- zafír lézerben ultragyors, nagy energiájú impulzusokkal történik. A lézer 140 femtoszekundumonként ad le egy impulzust (a femtoszekundum a nanoszekundum milliomod része), és bár az egyes impulzusok energiája igen nagy, a leadott teljes energia mégis kisebb, mint a konfokális mikroszkópiában alkalmazott gázlézer esetében. A kibocsátott hosszú hullámhosszú lézer impulzusokat az objektív összegyűjti, és ez a fókuszált fény egy mikrométernél is kisebb átmérőjű pontszerű területen hoz létre gerjesztést. A vizsgálat során a lézerfej mozgatásával a számítógép képet készít az adott síkról (pásztázás), ezt követően a minta függőleges elmozdítása után lehetőség van egy újabb „szelet” vizsgálatára. Fontos megemlíteni a „felharmonikus sugárzás” (second harmonic generation, SHG) jelenségét, mely bizonyos szabályos struktúrák, mint a kollagén esetében jelentkezik. 52 Ezek az anyagok speciális szerkezetük következtében spontán képesek az elnyelt sugárzáshoz képest kétszeres hullámhosszú fényt kibocsátani, ez a jelenség lehetővé teszi, hogy a kollagénben gazdag szövetekben, mint a nyirokcsomók vagy lép orientálódni tudjunk.
24
A
B
Konfokális
2 foton
Minta specimen
Minta specimen
lencse
lencse
rövid l
hosszú l
Gáz lézer
Szilárd lézer Ar/Kr
Folyamatos lézer
Titánium-zafír
Femtoszekundumos pulzusok!
E. Colt RUSH UNIVERSITY MEDICAL CENTER
(M. Goeppert-Mayer, 1931)
12. ábra. A konfokális és a két foton (2P) képalkotás összehasonlítása. Konfokális mikroszkópiánál a megvilágítás egy rövid hullámhosszú, folyamatos gázlézerrel történik. Gerjesztés a minta teljes szélességében bekövetkezik, azonban az optikai elrendezés következtében a képalkotásban csak a fókusz síkjából érkező fotonok vesznek részt. Két foton mikroszkópiánál egy hosszú hullámhosszú, femtoszekundumos pulzusokat leadó szilárdtest lézer a fényforrás, mely fluoreszcens gerjesztést csak a fókusz síkjában hoz létre, ezért a fényszórás valamint a fotohalványodás hatása minimális szintre csökkenthető.
3.5.3. In vitro fluoreszcens képalkotás lehetőségei a kísérletes reumatológiában Az áramlási kamrában a sejtek mozgását elsősorban fáziskontraszt mikroszkóppal követhetjük. A migrációs kamra vizsgálatok esetén a két foton mikroszkópia és a transzgenikus állatok alkalmazása új lehetőségeket teremtett, segítségükkel a migráló sejteken bekövetkező morfológiai változások is jól követhetők (13. ábra). Vizsgálataink arra utalnak, hogy a migráció a granulociták igen kifejezett alakváltozásával jár; a sejtek a membrán egyik oldalán szinte teljesen ellapulnak, majd az apró fenesztrációkon
25
keresztül mintegy „átfolynak” a membrán túlsó oldalára. A migrációra szolgáló membrán fenesztrációk helyei jól láthatók a membránhoz tapadt sejteken.
A
B
13. ábra. In vitro migráció vizsgálata két foton (2P) mikroszkópiával. Az ábrákon EGFP Tg egerek csontvelőjéből in vitro körülmények között tenyésztett granulociták viselkedését látjuk migrációs kamrában. A migrációs kamra fenesztrált membránjának síkja felett szabályos, gömb alakú granulociták észlelhetők (A). A membrán két oldalán ezzel szemben a sejtek amorf alakot vesznek fel, teljesen ellaposodnak (B). Ezen membránhoz tapadt, ellapult sejtekben könnyen észrevehetők a migrációs membrán apró kis fenesztrációi, melyeken keresztül a sejtek mintegy „átfolynak” a membrán túlsó oldalára (fehér nyíl).
3.5.4 Intravitális epifluoreszcens video mikroszkópia A gyulladt bokaízület vizsgálatára kidolgozott intravitális epifluoreszcens video mikroszkópos módszert és a hozzá tartozó műtéti technikát munkacsoportunk a korábbiakban ismertette (14. ábra).4
26
Objektív
meleg PBS
Calcaneus
Tibia Talus Szinoviális membrán K. Mikecz RUSH UNIVERSITY MEDICAL CENTER
14. ábra. Intravitális fluoreszcens video mikroszkópia egér bokaízületében. Az Achilles ín eltávolításával az objektív számára hozzáférhetővé tettük a bokaízület hátsó oldalát. A szövetek melegen és nedvesen tartása, a szivárgó vér eltávolítása és az „optikai híd” létrehozása céljából a bokát folyamatosan meleg PBS oldattal áramoltattuk át. Fluoreszcens festést követően az ízületi hártya posztkapilláris venuláiban lévő fehérvérsejtek mozgása jól tanulmányozhatóvá vált.
Altatást követően felmetszettük a bőrt és eltávolítottuk az Achilles inat, így feltártuk a bokaízület hátulsó (dorzális) oldalának szinoviális membránját, ahol 40X nagyítás mellett vizsgáltuk epifluoreszcens mikroszkóp (Nikon Eclipse E600FN) segítségével a posztkapilláris venulákban a gyulladásos sejtek viselkedését. A bokaízületet folyamatosan meleg (37oC) PBS folyadékkal áramoltattuk át, ezzel nemcsak biztosítottuk az állandó hőmérsékletet, megóvtuk a szöveteket a kiszáradástól és folyamatosan mostuk a szivárgó vérzéseket, hanem mintegy „optikai hidat” hoztunk létre az objektív lencse és a bokaízület között. A vérben lévő fehérvérsejtek láthatóvá tételére egy fluoreszcens mitokondriális festéket, rhodamine 6G-t (R6G, Molecular Probes) használtunk. A keringő leukociták és vérlemezkék nagyon hamar felveszik a vérből a R6G-t, ami pár órán keresztül viszonylag stabil festődést biztosít. A reagensek
27
beadása előtt, illetve azt követően meghatározott időpontokban 1 perces digitális video felvételeket készítettünk (CoolSnap, RS Photometrics) a szinoviális membránban lévő posztkapilláris venula egy kijelölt szakaszán a leukociták mozgásáról (15. ábra). A video felvételek készítését és analízisét MetaMorph szoftverrel (Molecular Devices) végeztük. A leukociták viselkedésének jellemzésére használt paramétereket korábbi közleményeinkben ismertettük.4
53
Először egy kijelölt 100 m hosszú érszakaszon
megszámoltuk az adherens sejtek számát. Ahhoz, hogy a különböző átmérőjű ereket össze tudjuk hasonlítani, az adherens sejtek számát az érfal 0.1 mm2 nagyságú felszínére számítva adtuk meg. Ezt követően 1 percen keresztül megszámoltuk az ezen az érszakaszon áthaladó rolling sejtek számát, majd a dX szorzattal (d jelenti az ér átmérőjét) ezt az értéket is az erek méretére normalizáltuk. A rolling sejtek sebességét m/s értékben határoztuk meg minden esetben 6 sejt sebességének átlagolásával. Ez alól kivételt jelentett, amikor a kezelés hatására a rolling sejtek száma annyira lecsökkent, hogy az 1 perces felvétel alatt ennél kevesebb számú rolling mozgást végző sejtet láttunk. A reagensek beadása előtti értékeket 100%-nak véve ennek arányában határoztuk meg az egyes kísérletekben a reagens hatására a rolling és adherens sejtek számában, valamint a rolling sejtek sebességében bekövetkezett változásokat. Ugyanezzel
az
in
vivo
technikával
végeztünk
kettős
immunfluoreszcenciás
vizsgálatokat is zölddel jelzett granulocita (anti-Gr1- Alexa Fluor 488), illetve vörössel jelzett vérlemezke ellenes (anti-CD41-PE) monoklonális antitestekkel.
28
15. ábra. Humán PG indukált artritisz in vivo epifluoreszcens video mikroszkópos képe. R6G festés után jól láthatók a fehérvérsejtek a gyulladt bokaízületi szinovium posztkapilláris venuláiban.
3.5.5 Intravitális két foton mikroszkópia
A gyors kamerával felszerelt epifluoreszcens mikroszkóp különösen alkalmas a könnyen hozzáférhető szövetekben zajló heves történések, mint a rolling és adhézió vizsgálatára. A lassúbb, de a mélyebb szöveti rétegekben zajló migráció vizsgálatára azonban a hosszabb hullámhosszúságú fényt használó 2P mikroszkópia alkalmasabb módszernek tünik.47 Ez utóbbival az erek és a granulociták eltérő festését követően a granulociták szöveteken belüli mozgásának térbeli dinamizmusa jól tanulmányozható (16. ábra). Vizsgálatainkban olyan transzgenikus (Tg) állatokat használtunk, melyeknél egy granulocita specifikus enzim, a lizozim génjének promoter régiójához a zöld fluoreszcens protein (EGFP) génjét kapcsolták hozzá. Az ereket a vizsgálathoz Texasred jelzett dextránnal tettük láthatóvá. A dextrán ismert plazmapótszer, sokáig bennmarad az érpályában és megfesti az erek lumenét.
29
16. ábra. Humán PG indukált artritisz in vivo 2P mikroszkópos képe. Az EGFP Tg egér granulocitái zöld fluoreszcenciát mutatnak, az ereket Texas-red jelzett dextránnal tettük láthatóvá (vörös festődés).
A két foton mikroszkópia nagyobb nagyítással lehetővé teszi az érlumenből az ízület felé tartó granulociták egyéni morfológiájának in vivo tanulmányozását (17. ábra), sőt a jövőben valószínűleg lehetőség lesz kalcium érzékeny festékek használatával az érfalon megtapadó, majd az érfalon átmigráló sejteken belüli szignál mechanizmusok közvetlen tanulmányozására is.
17. ábra. In vivo migráló granulociták 2P mikroszkópos képe EGFP Tg egér bokaízületében. Nagy nagyítással a szinovium ereiben megtapadó, illetve érfalon keresztüli migrációt megkezdő granulociták viselkedése sejtszinten is vizsgálható. Felvételünkön jól látható, hogy a granulociták „állábakat” növesztenek egy adott irányba, melyen keresztül később megindulhat a migráció az endotél alatti sejtközötti térbe, majd az ízületi üregbe.
30
3.6
Monoklonális antitest kezelések protokolljai
Az altatott állatoknak a reagenseket intravénásan adtuk a szem érhártya vénás hálózatába. Kontrollnak poliklonális patkány immunglobulint alkalmaztunk, a kezelt állatok tisztított teljes, illetve fragmentált CD44 és Gr-1 ellenes antitesteket kaptak. A rutin vizsgálatokban a műtétet követően a kiválasztott érszakaszról készítettünk egy kontroll felvételt, majd az adott reagens beadását követően 5 percenként készítettünk felvételeket a fentiekben megadott módon 30 percig. Volt egy kísérletsorozat, melyben 2,4, illetve 24 órával a CD44 ellenes antitestek beadását követően történt a műtét, illetve a felvétel készítése. A harmadik esetben, az ún. intervenciós vizsgálatainkban meghatározott reagenseket (3. táblázat) adtunk 25 perccel a CD44 ellenes antitest alkalmazása előtt. Ezekben kísérletekben volt egy felvétel az adott reagens beadása előtt (0 perc), a reagens beadása után, közvetlenül a CD44 ellenes antitest kezelés előtt (25 perc), valamint a CD44 ellenes antitest beadását követően (25+5 perc). A vérlemezkék depléciójára egér vérlemezke GPIb (CD42b) ellenes poliklonális antitesteket (pAb) alkalmaztunk (Emfret Analytics), mely a keringő vérlemezkék számát fél órán belül a normál érték 15%-a alá csökkentette.
3.7
Perifériás vérkép elemzése és vérlemezke szám meghatározása
A perifériás fehérvérsejt számot Türk festéssel, a neutrofil granulociták arányát WrightGiemsa festett kenetek segítségével számítottuk ki. A sejtfelszíni CD44 illetve Gr-1 mennyiségét, illetve a heparinizált vérben lévő vérlemezkék számát áramlási citometriával határoztuk meg. A sejtfelszíni marker vizsgálatoknál a vörösvértesteket a specifikus antitestekkel való inkubáció előtt hipotónia indukálta lízissel távolítottuk el. A vérlemezke számolás céljából levett vérmintákat Tris puffert és kevés heparint is tartalmazó fiziológiás sóoldattal, valamint BSA-t tartalmazó Tyrode pufferrel hígítottuk. 900 g fordulatszámmal végzett centrifugálás után a felülúszóból előzetes hemolízis nélkül jelzett CD41 ellenes antitest hozzáadása után áramlási citometriával határoztuk meg a vérlemezkék számát.
31
3.8
Az ízületi duzzanat változásának megítélése
Egyik vizsgálatsorozatban a gyulladást kísérő duzzanat megítélése céljából a kezelések előtt, illetve azokat követően 24 órával egy digitális mikrokaliperrel (World Precision Instruments) megmértük az egerek csuklójának illetve bokájának méretét. Mindegyik végtagon meghatároztuk az adott ízület anteroposterior és laterális átmérőjét; a 8 különálló, mm-ben mért érték összege adta az ún. kumulatív ízületi vastagságot. Az anti- CD44 mAb illetve a patkány IgG kezelés esetében a kumulatív ízületi vastagság 24 óra alatt bekövetkezett változását regisztráltuk.
3.9
Antitestek és reagensek
A CD44 ellenes specifikus monoklonális antitesteket (IM7 és KM81) termelő hibridómákat a kereskedelemben vásároltuk (ATCC), az antitestek tisztítását protein G Sepharose oszlopon végeztük. Az IM7 Fab és Fab2 fragmentumokat ImmunoPure F(ab)2 készlettel készítettük és tisztítottuk. Számos antitestet vásároltunk a BD Biosciences-től, mint a Gr-1 ellenes mAb (RB6-8C5 klón), p- szelektin ellenes mAb (RB40-34 klón), p- szelektin glikoprotein ligand-1 ellenes mAb (PGSL-1, 4RA10 klón), PE-konjugált CD41-ellenes (vérlemezke specifikus) mAb, PE- konjugált IM7, valamint a különböző patkány IgG izotípusok (IgG1, IgG2a, IgG2b). Az Alexa-Fluor konjugált anti-Gr-1 mAb és a kecskében termelt tisztított patkány ellenes IgG (nehéz és könnyűlánc) az Invitrogen-től, a rekombináns egér (rm) p-szelektin –Fc fúziós fehérje az R&D Systemstől, a tisztított patkány IgG és nátrium-heparin a Sigmától került megvásárlásra. Az in vitro kezeléshez használt reagenseket PBS-ben hígítottuk, és 22 mikrométer pólusnagyságú filteren átáramoltatva sterilizáltuk. 3.10
Statisztikai módszerek
Az eredményeinket átlag±standard hiba formában, az átlagok arányában, mediánként illetve értéktartományként adtuk meg. Az adatelemzésekhez SPSS szoftvert használtunk (Chicago, IL, USA). Különböző csoportok összehasonlítására Student féle t tesztet illetve egymintás t tesztet használtunk. P≤0.05 esetén az észlelt különbséget szignifikánsnak tartottuk.
32
4. Eredmények
4.1
A genetikai és környezeti tényezők szerepe PG indukált artritiszben
Vizsgálataink azt mutatták, hogy azonos genetikai háttér mellett az egyes egér altörzsekben is jelentős különbség lehet a betegség klinikai megjelenésében, mely a genetikai mellett a környezeti tényezők szerepére utal (1. táblázat). Vizsgálataink egyértelmű összefüggést igazoltak a klinikailag kifejlődött artritisz illetve spondilitisz, valamint a szérumban megjelenő humán, illetve egér proteoglikán ellenes antitestek között. Ezzel szemben a későbbiekben vizsgált immunológiai paraméterek- egyetlen kivételtől eltekintve- nem mutattak semmiféle korrelációt a klinikai képpel (2. táblázat). Tekintettel az alcsoportok közötti jelentős különbségekre, a CD44 szerepét kutató vizsgálatainkban mindig azonos egér altörzset használtunk (Balb/c NCI).
Kolónia
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Artritiszes/összes állat (incidencia)
Artritisz „score”1
Artritisz kezdet („onset score”)2
Portage P08 Charles River
16/16 (100%)
11.0±1.1
2.3±0.3
Canada II Charles River
15/15 (100%)
10.3±1.3
2.5±0.4
Harlan Sprague Dawley
12/13 (92%)
9.7±1.5
2.8±0.5
Kingston K72 Charles River
13/14 (93%)
8.8±1.2
2.1±0.4
Raleigh R02 Charles River
15/15 (100%)
7.6±1.0
1.9±0.3
Taconic Farm Charles River
15/18 (83%)
7.5±1.4
1.6±0.3
NCI/Kingston (Charles River)
17/20 (85%)
6.8±0.9
1.5±0.2
BALB/cJ Jackson
16/19 (84%)
6.6±1.1
2.1±0.3
Raleigh R12 Charles River
10/13 (77%)
6.4±1.5
1.2±0.2
Hollister H2 Charles River
10/15 (67%)
3.8±0.8
1.1±0.2
Bailey’s BALB/c ByJ Jackson
15/20 (75%)
2.4±0.7
1.0±0.2
Altörzs
1. táblázat. PG indukált artritisz előfordulása különböző Balb/c egér altörzsekben. Az artritisz „score” és „onset score” értékek átlag± standard hibát jelölnek. 1
Az arthritis „score” az egyes állatok esetén, a betegség folyamán mért legmagasabb
összesített ízületi „score” érték (max. 16). 33
2
Az ún. „onset score” egy utólagosan számított 0 és 5 közötti érték, mely annál
nagyobb, minél korábban kezdődik az artritisz egy adott állat esetében. Eredményeink arra utalnak, hogy azonos genetikai állományú, de egymástól szeparáltan tenyésztett Balb/c egér alcsoportok esetén a betegség igen különböző penetranciát mutat, ami a környezeti faktorok fontosságára hívja fel a figyelmet.
Artritisz paraméterek
Spondilitisz
I (n=154)
N (n=24)
I (n=80)
N (n=47)
In vitro T sejt proliferáció (SI)
2.96±0.07
3.25±0.13
3.00±0.09
3.00±0.14
In vitro IL-2 produkció (CTLL-2) (SI)
2.67±0.07
2.73±0.15
2.68±0.10
2.66±0.11 2.39±0.18
In vitro IL-4 produkció
(ng/106
sejt)
2.65±0.14
2.91±0.34
2.79±0.22
In vitro IL-6 produkció
(ng/106
sejt)
1.83±0.01
2.17±0.33
1.88±0.14
1.86±0.19
In vitro IFNg produkció (ng/106 sejt)
8.06±0.28
8.50±1.07
7.61±0.37
*9.56±0.65
In vitro TNF produkció (ng/106 sejt)
0.74±0.01
0.77±0.02
0.74±0.01
0.75±0.02
Serum IL-4 (pg/ml)
15.29±2.41
22.80±5.92
15.52±3.32
18.49±4.46
Serum IL-6 (pg/ml)
166.45±20.21
106.18±26.97
97.59±14.94
65.05±20.61
Serum IL-1 (pg/ml)
96.36±11.55
41.7±11.29
163.78±27.72
143.10±31.16
26.14±2.62
34.59±6.27
25.05±3.65
33.49±4.55
**12.75±0.57
8.3±0.94
**23.33±0.78
8.85±0.86
Serum IFNg (pg/ml) Humán PG ellenes IgG1 (mg/ml)
*1.36±0.14
0.72±0.29
*1.44±0.21
0.82±0.17
PG ellenes IgG1 (g/ml)
**172.55±13.47
76.41±10.56
*174.99±18.95
116.68±17.7
PG ellenes IgG2a (g/ml)
**68.01±5.68
24.79±6.76
**72.1±8.18
34.57±6.16
Humán PG ellenes IgG2a (mg/ml)
Átlag±SE * p<0.05 ** p<0.01
I: Igen
N: Nem
2. táblázat. Humán proteoglikánnal (PG) immunizált Balb/c egerek immunológiai és klinikai jellegzetességei. Vizsgálataink egyértelmű összefüggést igazoltak a klinikailag kifejlődött artritisz illetve spondilitisz, valamint a szérumban megjelenő humán, illetve egér proteoglikán ellenes antitestek között. Ezzel szemben a vizsgált immunológiai paraméterek- egyetlen kivételtől eltekintve- nem mutattak semmiféle korrelációt a megbetegedés kifejlődésével.
34
4.2
Fehérvérsejt rolling és adhézió a CD44 genetikai kiütése, illetve
monoklonális antitesttel (IM7) való blokkolása után
Kísérleteinkben a fehérvérsejtek viselkedését vizsgáltuk a gyulladt ízület posztkapilláris venuláiban kezeletlen CD44 génkiütött (KO), illetve CD44 ellenes antitesttel (IM7) kezelt vad típusú (WT) egerekben. Humán proteoglikán (PG) indukált artritiszt hoztunk létre genetikailag fogékony egereken, hogy felmérjük a CD44 sejtfelszíni marker hiányának, illetve antitestekkel való blokkolásának következményeit a fehérvérsejtek viselkedésére. A gyulladt bokaízületet rhodamine 6G (R6G) fluoreszcens festék intravénás adása után intravitális video mikroszkópiával vizsgáltuk. A vad típusú és a CD44
génkiütött
állatoknál
hasonló
értéket
találtunk
a
granulocita-endotél
kölcsönhatások számában, azonban a CD44 génkiütött állatokban a rolling sejtek számát
szignifikánsan
magasabbnak,
az
adherensek
számát
szignifikánsan
alacsonyabbnak találtuk, mint a vad típusú állatokban (18. ábra). Ez összhangban van a korábban publikált adatokkal, melyek szintén azt mutatták, hogy a CD44 génkiütött állatokban az adherens és a rolling mozgást végző sejtek aránya a rolling felé tolódik el.30 36
A Rolling sejtek száma
100
50
0
C
Rolling sebessége
Adherens sejtek száma
60
25 Adherens sejtek száma/ /0.1 m2 érfelszín
150
* Rolling sebessége (m/s)
Rolling sejtek száma/ /perc/ér kerület (m)
200
B
20 15 10 5
WT
CD44 KO 40
*
20
0
0
*n=p<22.05 állat/csoport 18. ábra. A CD44 marker genetikai kiütésének hatása a leukociták viselkedésére PG indukált artritiszben. CD44 génkiütött állatokban a rolling sejtek számát
35
szignifikánsan magasabbnak, az adherens sejtek számát szignifikánsan alacsonyabbnak találtuk, mint a vad típusú állatokban. Az ér endotéllel kölcsönhatásba lépő fehérvérsejtek összesített száma azonban változatlan maradt.
Ismert a CD44 ellenes antitestek kifejezett gyulladáscsökkentő hatása, ennek alapján azt gondoltuk, hogy az antitest kezelés hasonló következményekkel fog járni a leukociták viselkedését illetően, mint a CD44 marker genetikai kiütése, csak ez a hatás az antitest beadását követően gyorsan, és erőteljesebben fog jelentkezni. Ennek igazolására IM7 beadását követően 30 percig rendszeresen ellenőriztük a granulociták viselkedését vad típusú egerek gyulladt bokaízületében. Mind a műtéti beavatkozás, mind a fluoreszcens képalkotó technika önmagában is okozhat változásokat az egyébként is dinamikus, állandóan változó fehérvérsejt-endotél kölcsönhatásokban, ezért a nem kezelt, illetve a patkány IgG-vel kezelt csoportban is számítottunk a fehérvérsejtek diamikájában bekövetkező esetleges változásokra. Valóban, a patkány IgG-vel kezelt kontrol egerekben a megfigyelési idő alatt az endotéllel interakcióba lépő sejtek, mind a rolling, mind az adherens sejtek száma mérsékelt emelkedést mutatott a kiindulási értékhez képest (19 ábra A). Kisebb csoport állaton tisztított patkány IgG1, IgG2 ill. IgG2 adását követően is hasonló változásokat találtunk. A CD44 ellenes IM7 antitestet általában 200 g dózisban alkalmaztuk, mivel előzetes vizsgálatainkban ez a mennyiség képes volt az ízületi gyulladás mértékének gyors csökkentésére PG indukált artritiszben. Ebben a dózisban alkalmazva az IM7 adása után a rolling sejtek számának gyors, jelentős fokú és irreverzibilis csökkenését találtuk, lényegében az antitest adását követő 5. és 30. perc között nem volt látható rolling sejt a felvételeken (19. ábra B). Az IM7 kezelés e mellett szignifikánsan csökkentette az adherens sejtek számát is, de ez a csökkenés mértékében csak kisfokban haladta meg a patkány IgG adása után megfigyelt adherens szám csökkenést.
36
A
B Anti-CD44 (IM7 200 g)
Patkány IgG 200 g 200
150
Százalékos változás
Százalékos változás
200
*
100 50
150
0
0
*
100 50 0
10 20 Idő (perc)
30
0
Rolling sejtek száma Rolling sebessége
** * *
*
10 20 Idő (perc)
30
Adherens sejtek száma
*n=p<8 .05 állat/csoport 19. ábra. A CD44 ellenes monoklonális antitest (IM7) kezelés hatása a leukociták viselkedésére PG indukált artritiszben. A vad típusú állatok patkány IgG kezelését követően a rolling mozgást végző és az adheráló sejtek számának enyhe csökkenését találtuk, ezzel szemben CD44 ellenes antitest (IM7) kezelést követően az adherens sejtek számának enyhe mérséklődése mellett a rolling sejtek számának azonnali, nagyfokú és irreverzibilis csökkenése jelentkezett.
A rolling sejtek eltűnésével párhuzamosan IM7 adása után az endotéliumhoz kitapadt leukociták sajátos morfológiai változáson mentek keresztül (20. ábra). A rolling leállását követően kevesebb, mint 1 percen belül a fehérvérsejtek felszíne egyenetlenné, „bolyhossá” vált. A két foton mikroszkópos felvételek az adherens és transzmigrált sejtek számának csökkenését, a transzendoteliális migráció leállását mutatták (21. ábra).
37
A
B IM7 előtt (0 min)
IM7 után (5 perc)
20. ábra. Az adherens granulociták morfológiájának változása IM7 kezelést követően. IM7 kezelést követően a granulociták felszíne egyenetlenné, „bolyhossá” vált.
38
21. ábra. Az adherens granulociták viselkedése IM7 adása után két foton (2P) mikroszkóp alatt. Két foton mikroszkópiával a kitapadt és migrált sejtek számának csökkenése volt észlelhető, a megtapadt sejtek transzendoteliális migrációja leállt.
Azok a vizsgálataink, melyekben a műtétet majd az intravitális video mikroszkópiát az IM7 injekció után későbbi időpontban végeztük azt igazolták, hogy 2-4 órával az antitest adását követően a rolling mozgást végző sejtek ismételten megjelennek, de 24 órával később a rolling sejtek gyakorisága 60, az adherenseké pedig 50%-al alacsonyabb még mindig a kezelés előtti értékek átlagához képest.
4.3
A fehérvérsejt rolling és adhézió változása a CD44-HA interakció
blokkolása (KM81 mAb) után Az IM7 antitest a CD44 markerhez az N-terminális HA kötő domain-től proximálisan kapcsolódik. Mivel az IM7 érdemben nem változtatja meg a hialuronsav CD44 kötő képességét, felmerül a kérdés, hogy az IM7 hatásában jut-e valamiféle szerep a hialuronsavnak. Ennek eldöntésére kísérleteket végeztünk egy olyan CD44 ellenes antitesttel (KM81), melynek epitópja a HA kötő domain-en belül helyezkedik el. Ismert, hogy a KM81 mAb közvetlenül képes blokkolni a leukocita CD44 és az endoteliális HA közötti kölcsönhatást, ennek alapján arra vártunk, hogy a KM81 erőteljesebb rolling csökkentő hatást fog mutatni, mint az IM7. Ezzel szemben azt találtuk, hogy bár 200 g dózisban a KM81- hasonlóan az IM7-hez- szignifikánsan csökkentette a szinoviális endotéliumban a rolling sejtek számát, ez a hatás gyengébb volt, és lassabban fejődött ki a KM81 esetében (22. ábra).
39
A
B IM7 200 g /Patkány IgG hányados
1.5 1.0 0.5
0.0
KM81 200 g /Patkány IgG hányados
2.0 Relatív változás
Relatív változás
2.0
* 0
* * *
1.5 1.0 0.5
*
20 30 10 Idő (perc) Rolling sejtek száma/perc Rolling sebessége
0
* * * * 20 10 Idő (perc)
*
30
Adherens sejtek száma .05 *n=p<8 állat/csoport
22. ábra. CD44 ellenes antitestek rolling csökkentő hatásának összehasonlítása. Azonos dózisú KM81 hasonlóan az IM7-hez szignifikánsan csökkentette a rolling sejtek számát, azonban ez a hatás mérsékeltebb volt, és lassabban alakult ki.
KM81 adása után nem észleltünk szignifikáns változást az adherens fehérvérsejtek számában, de kevesebb, mint 10 perc után ugyanazok a morfológiai változások voltak észlelhetők a sejteken, mint amiket az IM7 adása után szinte azonnal láttunk. Összességében a KM81 adása után fellépő változások hasonlóak voltak azokhoz, melyeket IM7 adása után észleltünk, azonban e változások intenzitása mérsékeltebb volt. Úgy gondoljuk, hogy e jelenségek hátterében az antitestek CD44 iránti affinitásának különbsége és nem a CD44- HA interakciókra kifejtett eltérő hatása állhat.
4.4
Az IM7 hatása a kiméra egereken
Mivel mind a fehérvérsejtek, mind az endotélsejtek expresszálnak CD44 markert, fontos meghatározni, hogy az IM7 hatásait az endotél, vagy a leukociták felszínén lévő CD44hez kötődve fejti ki. Ennek eldöntésére vegyes genetikai állományú, ún. kiméra állatokat hoztunk létre vad típusú és CD44 génkiütött állatok közötti csontvelő
40
átültetésekkel. Azok a vad típusú állatok, melyek irradiációt követően CD44 KO állatokból kaptak csontvelőt, a fehérvérsejteken nem, csak az endotélsejteken hordoztak CD44 markert (leuko CD44 génkiütött állatok). Ezzel szemben a CD44 KO állatok, melyek vad típusú állatokból kaptak csontvelőt, az endotél sejteken nem hordoztak markert, viszont ezen állatok fehérvérsejtjei CD44 pozitívak voltak. Amint vártuk, a CD44 génkiütött állatok IM7 kezelése nem eredményezett változást a fehérvérsejtek viselkedésében (23. ábra). Ugyancsak változatlan maradt a fehérvérsejtek viselkedése IM7 kezelés után azokban a kiméra állatokban, melyeknél a leukocitákban hiányzott a CD44 marker (un. leuko CD44 génkiütött állatok), azonban a másik csoport kimérában, melyek a CD44 pozitív csontvelőt kapták és az endotéliumon hiányzott a CD44 marker (un. endo CD44 génkiütött állatok), IM7 kezelést követően a vad típusú állatokban észlelthez hasonló változásokat láttunk. A rolling sejtek eltűnése mellett az endo CD44 KO állatokban IM7 kezelés után ugyanazok a sejt morfológiai változások jelentkeztek, mint a vad típusú állatokon (20. ábra B). Ezek alapján kijelenthetjük, hogy az IM7 antitest a rolling leállítását és az adherens sejteken bekövetkező morfológiai változásokat teljes mértékben a fehérvérsejtek felszínén jelenlévő CD44 markerhez kötődve fejti ki.
2.0
IM7 200 g /Patkány IgG (Rolling sejtek)
„Teljes” CD44 KO Leuko CD44 KO Endo CD44 KO
Relatív változás
1.5
1.0
0.5
* * * * 0.0
0
10
20
Idő (perc)
41
* 30
*n=p<8 .05 állat/csoport
23. ábra. WT/CD44 KO kiméra egerek IM7 kezelése. CD44 génkiütött állatok IM7 kezelés után nem mutatták a WT állatok esetében észlelt jellegzetes eltéréseket. Azok a WT/CD44 KO kiméra állatok, melyek a leukocitákon hordozták a CD44 markert (endo CD44 KO) a vad típusú állatokhoz, a kimérák, melyek az endotélsejteken hordozták a CD44 markert (leuko CD44 KO) pedig a teljes CD44 KO állatokhoz hasonló választ adtak IM7 mAb adása után. Ezzel igazoltuk, hogy az IM7 mAb a megfigyelt változásokat a fehérvérsejtek felszínén lévő CD44-hez kötődve fejti ki.
4.5
Az IM7 fragmentumok hatása a fehérvérsejtek rollingjára
Felmerült a kérdés, hogy az IM7 mAb által kiváltott reakciók létrejöttéhez elég az antitest kapcsolódása a sejt felszínén lévő marker molekulához, vagy esetleg szükséges a CD44 Fc receptorai (FcR) közötti keresztkötés is. Ennek eldöntésére a teljes IM7 molekula mellett vizsgálatokat végeztünk Fab illetve (Fab’)2 fragmentumokkal is (24. ábra).
2.0
IM7 vagy GAR /Patkány IgG (Rolling sejtek) Kecske patkány-ellenes IgG (GAR) injeció
Relatív változás
1.5
IM7 (teljes antitest) 1.0
IM7 (Fab’)2 IM7 Fab
0.5
0.0
GAR (IM7 nélkül)
0
10
20
30 n= 5 állat/csoport
Idő (perc)
24. ábra. Vizsgálatok IM7 fragmentumokkal. IM7 (Fab’)2 fragmentum adása a teljes IM7 antitestre jellemző változásokat eredményezett a fehérvérsejtek viselkedésében,
42
IM7 Fab fragmentum adását követően azonban nem észleltünk változást. Azonban amennyiben IM7 Fab fragmentum adása után 25 perccel az állatok kecskében termeltetett patkány Fc ellenes antitestet kaptak (GAR), a típusos változások azonnal jelentkeztek.
Vizsgálatainkkal azt találtuk, hogy a (Fab’)2 fragmentumok beadása hasonló változásokat eredményez, mint a teljes antitest, azonban IM7 Fab fragmentumok beadása önmagában nem befolyásolja a leukociták viselkedését. Azonban abban az esetben, amikor 25 perccel a Fab fragmentum adását követően kecskéből származó, patkány Fc receptor ellenes antitestet (GAR) adtunk az állatoknak a fehérvérsejtek rolling mozgásának azonnali leállását, majd az IM7 kezelésre jellemző típusos morfológiai változásokat jelentkezését észleltük. Vizsgálataink arra utalnak, hogy az IM7 által kiváltott hatásokban a molekula Fc része nem vesz részt, de a sejtfelszíni CD44 molekulák közötti keresztkötések létrejötte mindenképpen szükséges.
4.6
A perifériás vérkép változásai CD44 ellenes mAb kezelést követően
Mivel mindkét tanulmányozott CD44 ellenes mAb szignifikánsan csökkentette a fehérvérsejtek rollingját a gyulladt ízületek ereiben (22. ábra) feltételeztük, hogy az endotéllel kapcsolatba nem lépő, azaz a keringésben lévő fehérvérsejtek száma emelkedni fog a kezeléseket követően. Egy kísérletsorozatban kvantitatív és kvalitatív perifériás vérkép meghatározást végeztünk kezelés előtt (0. óra), valamint 1, ill. 24 órával az IM7 illetve KM81 injekciója után. Mindkét antitestet a szokásos 200 g dózisban alkalmaztuk. Meglepetéssel tapasztaltuk, hogy mindkét antitest 1 órán belül jelentősen csökkentette a perifériás fehérvérsejtek, ezen belül is legkifejezettebben a neutrofil granulociták számát, ez utóbbi sejtek száma több mint 90%-al csökkent (25. ábra). 24 órával az antitestek beadása után a neutrofil granulociták száma mérsékelten emelkedett, de még mindig szignifikánsan alacsony maradt a kiindulási értékekhez képest.
43
Rat IgG 200 g
IM7 Neutrofilok száma a vérben (millió/ml
)
KM81 6 4
* *
2
*
0 0
1 24 Idő (órák)
.05 *n=p<9 állat/csoport
25. ábra. A perifériás neutrofil granulocita szám változása CD44 ellenes mAb kezelést követően. A neutrofil granulociták száma a perifériás vérben mindkét antitest adása után 1 órával jelentősen lecsökkent, majd 24 óra elteltével fokozatos emelkedést mutatott, de IM7 esetén még ekkor is szignifikánsan alacsonyabb volt a kiindulási értékekhez képest.
4.7
A mieloid differenciációs marker (Gr-1) ellenes mAb kezelés hatásai a
perifériás vérképre Az egér érett granulocitái nagy mennyiségben szekretálnak egy Gr-1/Ly-6 nevű mieloid differenciációs markert,45 az ellene termeltetett patkány monoklonális antitestet (antiGr-1) a neutrofil granulociták depléciójára alkalmazzák.54
55
Mivel a CD44 ellenes
antitestek is a perifériás neutrofil sejtszám jelentős csökkenéséhez vezettek, mindenképpen fontosnak tartottuk, hogy összehasonlítsuk a kétféle marker ellenes antitesteket. Vizsgálatainkkal azt találtuk, hogy közepes dózisokat (40 g) alkalmazva az IM7 hatékonysága a leukociták deplécióját illetően majdnem eléri az anti-Gr-1 hatását (26. ábra).
44
Patkány IgG IM7 Anti-Gr-1
)
Neutrofilok száma a vérben (millió/ml
40 g
6 4
* *
* *
2 0 0
1 Idő (órák)
24
*n=p<9 .05 állat/csoport 26. ábra. Az IM7 és az anti-Gr-1 mAb neutrofil granulocita depléciót okozó hatásának összehasonlítása. 40 g dózisban alkalmazva a granulocita depléció tekintetében az IM7 alig volt gyengébb az anti-Gr-1 antitestnél, mindkét mAb szignifikáns perifériás granulocitaszám csökkenést okozott.
A Gr-1 fehérjét differenciációs markernek tartjuk, bár pontos funkciója jelenleg még nem tisztázott. Feltételezik, hogy a Gr-1 ellenes mAb a granulociták deplécióját a lépben és a májban történő szekvesztrációval éri el, a sejtek innen már nem térnek vissza a keringésbe.
4.8
A mieloid differenciációs marker (Gr-1) ellenes mAb kezelés hatásai a
fehérvérsejtek viselkedésére
Feltételeztük, hogy összefüggés van a perifériás neutrofil depléció, és a gyulladás helyén észlelt rolling gátlás között az IM7 mAb adását követően, ennek alapján felmerült a kérdés, hogy a neutrofilok depléciójában hasonló hatást mutató anti-Gr-1 mAb vajon szintén képes-e a gyulladásos sejtek gördülő mozgásának leállítására. Kísérleteinkben úgy találtuk, hogy a vad típusú állatoknak adott Gr-1 ellenes mAb a
45
gyulladás folyamatára minden tekintetben a CD44 ellenes antitestekhez hasonló hatással bír, azaz a rolling mozgást végző sejtek gyors eltűnését (27. ábra) és az adherens sejtekben a jellegzetes morfológiai változások (28. ábra) megjelenését észleltük.
Rolling sejtek anti-Gr-1 /patkány IgG Adherents sejtek anti-Gr-1 /patkány IgG Rolling sejtek IM7/patkány IgG Adherents sejtek IM7/patkány IgG
Relatív változás
2.0 1.5 1.0 0.5 0.0
0
* * * * * * * *
* *
20
30
10
.05 *n=p<8 állat/csoport
Idő (percek)
27. ábra. A Gr-1 marker ellenes mAb kezelés hatása a fehérvérsejtek viselkedésére. 40 g dózisban az anti-Gr-1 mAb az IM7-hez hasonló hatást váltott ki a rolling megszűnését illetően.
A
B anti-Gr-1 előtt (0 min)
anti-Gr-1 után (5 min)
46
28. ábra. A Gr-1 marker ellenes mAb kezelés hatása a fehérvérsejtek morfológiájára. 40 g dózisban az anti-Gr-1 mAb az IM7-hez hasonló hatást váltott ki a granulociták morfológiáját illetően. A nyilak a rolling, a szaggatott vonal az adherens sejteket jelölik.
4.9
A vérlemezkék szerepe az IM7 és anti-Gr-1 által kiváltott hatásokban
Mint fentebb említettük, IM7 illetve anti-Gr-1 mAb kezelést követően a R6G által megfestett adherens fehérvérsejtek morfológiai változáson mentek keresztül. A sejtfelszín egyenetlenné, „bolyhossá” válásának hátterében a felvételek nagyításával egyértelműen látszott, hogy a sejtekhez intenzíven világító fluoreszcens partikulumok tapadnak (29. ábra A és B).
C A
Anti-CD44 (IM7)
IM7
D IM7
R6G festés
B
Anti-Gr-1(RB6-8C5)
R6G festés
29. ábra. A vérlemezkék szerepe az IM7 és az anti-Gr-1 által kiváltott hatásokban. CD44 illetve Gr-1 ellenes mAb kezelés után látható volt, hogy a fehérvérsejtekhez intenzíven fluoreszkáló partikulumok tapadnak (A és B). Ez a kép nagyon hasonlított ahhoz, mint amikor IM7 kezelés után az állat vérlemezkéit jelzett vérlemezke ellenes antitesttel (anti-CD41-Alexa488) megjelöltük (C). Kettős immunfluoreszcenciával
47
(vérlemezke ellenes vörös anti-CD41-PE, valamint granulocita ellenes zöld anti-Gr-1Alexa 488) jól elkülöníthetővé váltak a fehérvérsejtek és a felszínükre tapadt vérlemezkék (D).
Az IM7-el illetve Gr-1 ellenes antitesttel kezelt R6G festett sejtek morfológiai megjelenése nagyban hasonlított az ugyancsak IM7 kezelt, de vérlemezke marker (CD41) ellenes jelzett antitesttel megfestett fehérvérsejtek képéhez (29. ábra C). Ez arra utalt, hogy a különböző antitest kezeléseket (IM7, KM81, anti-Gr-1) követően a fehérvérsejtek felszínére kitapadó kis partikulumok voltaképpen vérlemezkék. Ennek igazolására IM7 kezelést követően kettős immunfluoreszens festést végeztünk PE jelzett vérlemezke ellenes (anti-CD41-PE, piros), valamint Alexa488 jelzett granulocita ellenes (anti-Gr-1-Alexa 488, zöld) antitestekkel (29. ábra D). A kettős immunfluoreszcencia festések igazolták, hogy az egymáshoz kapcsolód nagyobb, illetve kisebb objektumok granulociták, illetve vérlemezkék. Áramlási citometriával sikerült igazolnunk, hogy IM7 illetve Gr-1 ellenes mAb kezelést követően 1 órával a perifériás vérben jelentősen csökken a vérlemezkék száma (30. ábra), ami arra utal, hogy a fehérvérsejtek és a vérlemezkék együttesen távoznak a keringésből.
Vérlemezkék száma (CD41 + sejtek %-a)
0. min. 60. min.
16 14 12 10 8 6 4 2 0
* IgG
IM7
* Anti-Gr-1
*n=p<8 .05 állat/csoport
48
30. ábra. CD44 illetve Gr-1 ellenes kezelés hatása a perifériás vérlemezke számra. Áramlási citometriával igazoltuk, hogy IM7 illetve anti-Gr-1 mAb kezelést követően a perifériás vér vérlemezke száma szignifikáns csökkenést mutat.
4.10
A PSGL-1 és p- szelektin ellenes mAb, valamint a szolubilis p-szelektin
kezelés hatása az IM7 indukált fehérvérsejt-vérlemezke interakciókra Számos reagensről feltételeztük, hogy befolyásolhatják az IM7 mAb által kiváltott választ. Egy kísérletsorozatban az állatokat 25 perccel a 200 g IM7 mAb adása előtt előkezeltük különböző adott koncentrációjú reagenssel, majd egyrészt IVM vizsgálattal megnéztük a fehérvérsejtek viselkedését és vérlemezke kötését, valamint a perifériás vérben meghatároztuk a neutrofil granulociták számát a reagens adása előtt, IM7 adása előtt és utána 5 perccel (3. táblázat).
rolling sejtek száma (kiindulási érték százaléka)
vérlemezkékkel fedett sejtek (összes sejt százaléka)
neutrofil granulociták száma (kiindulási érték százaléka)
átlag és szélső értékek
átlag és szélső értékek
átlag és szélső értékek
25 perc
+IM7 (5 perc)
25 perc
+IM7 (5 perc)
25 perc
+IM7 (5 perc)
Előkezelés PBS (n=5)
114 (91-116)
2 (0-5)
2 (0-4)
91 (86-100)
94 (86-110)
11 (4-23)
patkány IgG (n=5)
96 (93-104)
0 (0-2)
1 (0-3)
95 (91-99)
106 (97-121)
17 (7-23)
anti-PSGL (n=3)
47 (32-70)
5 (2-10)
1 (0-1)
82 (70-86)
20 (11-34)
anti-p-sel (n=3)
88 (81-98)
9 (0-15)
11 (6-19)
40 (21-58)
113 (100115) 85 (69-89)
3 (2-8)
0 (0-1)
13 (8-33)
10 (7-19)
95 (90-106)
16 (3-27)
2 (1-6)
1 (0-5)
97 (75-128)
31(20-45)
76 (54-84)
24 (18-49)
0 (0-1)
4 (2-17)
120 (83-126)
37 (29-60)
rmP-sel-Fc (n=3) vérlemezke-ellenes pAb (n=5) heparin (n=5)
98 (97-100) 100 (98-100)
25 (6-31)
3. táblázat. Különböző reagensekkel végzett előkezelések következményei az IM7 által kiváltott hatásokra. 200 g IM7 mAb injekciója előtt 25 perccel az állatok különböző reagenseket kaptak, az IVM felvételeken a rolling sejtek számát, a vérlemezkékkel fedett sejtek számát, valamint a perifériás vérben a neutrofil
49
granulociták számát vizsgáltuk a reagens beadása előtt, IM7 adása előtt (25 perc), valamint 5 perccel azt követően (+IM7 5 perc).
A PSGL-1 ellenes mAb önmagában nagyfokban csökkentette a gördülő mozgást végző fehérvérsejtek számát még az IM7 mAb injekció adása előtt, de nem volt hatással az IM7 után jelentkező rolling megszűnésre, vérlemezke és neutrofil leukocita deplécióra amikor összehasonlítottuk a patkány IgG-vel kezelt kontroll állatokkal. Az anti-pszelektin mAb önmagában is képes volt enyhe fokú neutrofil deplécióra és a vérlemezkékkel fedett sejtek számának kisfokú emelésére, de képes volt mérsékelten gátolni az IM7 okozta rolling csökkenést, és közepes mértékben gátolni az IM7 mAb indukálta vérlemezke depléciót. Ezek a változások nehezen értékelhetők annak tükrében, hogy a vérlemezkék adhéziójának folyamatában feltételezik az interakciót a vérlemezkék p-szelektinje és a fehérvérsejtek PSGL-1 proteinje között.56 Ezt követően vizsgáltuk a rekombináns egér (rm) p-szelektin-Fc fúziós protein adása után jelentkező változásokat is. Meglepetésünkre a rekombináns p-szelektin-Fc fúziós protein adása után teljes mértékben azonos változásokat észleltünk, mint IM7 mAb adása után (rolling leállása, vérlemezke és neutrofil granulocita depléció). Amikor az állatok a rekombináns-p-szelektin-Fc fúziós protein után IM7 antitestet kaptak, további változásokat már nem észleltünk. Az anti-CD44, anti-Gr-1 és szolubilis p-szelektin-Fc fúziós protein kezeléssel kapott hasonló eredmények közös hatásmechanizmust sejtetnek. Leírtak egy egértörzset, amelyben a p-szelektin citoplazmatikus farki részén egy deléció miatt a p-szelektin szabaddá vált, ez a mutáció olyan, mintha a vad típusú egeret nagy mennyiségű rm-pszelektinnel kezelnének.57 Érdekes módon az egerekben ez a mutáció egy prokoaguláns állapotot hozott létre. Egy másik tanulmány leírta, hogy nagy dózisú TNF- kezelést követően anti-Gr-1 mAb adása súlyos intravascularis koagulációt eredményezett.58 Ezek a vizsgálatok a koaguláns rendszer szerepét vetik fel a p-szelektin, anti-Gr-1 és IM7 mAb kezelés hatásmechanizmusában.
50
4.11
A heparin valamint a vérlemezke ellenes pAb kezelés hatása az IM7
indukált fehérvérsejt-vérlemezke interakciókra
A koagulációs rendszer szerepének felderítésére vizsgálatokat végeztünk heparin kezeléssel, illetve vérlemezke depletáló poliklonális antitestekkel (3. táblázat, 31. és 32. ábra).
PBS IM7 előtt
Vérlemezke depléció IM7 előtt
Heparin IM7 előtt
31. ábra Az előzetes vérlemezke depléció illetve heparin előkezelés következményei az IM7 kiváltotta vérlemezke-granulocita interakciókra. A vérlemezke depléciót, illetve heparin kezelést követően elmaradt a vérlemezkék IM7 kiváltotta kitapadása a
A kumulatív ízületi vastagság változása (mm) 24 óra alatt.
granulociták felszínére.
PBS előkezelés Vérlemezke depléció Heparin előkezelés
0.4
* *
0.0 -0.4 -0.8 -1.2
* * * Patkány IgG
IM7
*n=p<6 .05 állat/csoport
51
32. ábra Az előzetes vérlemezke depléció illetve heparin előkezelés következményei az IM7 gyulladásgátló hatására. A vérlemezke depléció illetve a heparin kezelés jelentős fokban mérsékelte az IM7 mAb gyulladáscsökkentő hatását, bár még ekkor is szignifikáns gyulladáscsökkentést találtunk a kiindulási értékekhez képest.
Vérlemezke depletáló poliklonális antitest kezelés az IM7 kiváltotta eseményeket bár nagymértékben antagonizálta, de nem szüntette meg teljesen Heparin hasonló antagonista hatást fejtett ki anti-Gr-1 vagy rm p-szelektin kezelés előtt beadva (nem publikált adatok). Mivel mind a vérlemezke-depletáló antitestek, mind a heparin jelentős mértékben volt képes antagonizálni az IM7 kezelés sejtszintű történéseit, arra kerestük a választ, vajon képesek-e PG indukált artritiszben az IM7 mAb gyulladásgátló hatásának mérséklésére. Az artritisz korai progresszív fázisában lévő egerek PBS, 100 g vérlemezke depletáló antitest, illetve 40 U heparin tartalmú injekciót, majd 25 perccel később 200 g patkány IgG-t illetve IM7 mAb-t kaptak. A nagy dózisú IM7 24 óra elteltével – amint már korábban is leírtuk29- szignifikánsan csökkentette az ízületi duzzanatot. A kontroll csoportban sem a vérlemezke depléció, sem a heparin előkezelés sem volt hatással az ízületi duzzanatra, azonban a kezelt csoportban jelentős fokban mérsékelték az IM7 mAb gyulladáscsökkentő hatását, bár még ekkor is szignifikáns gyulladáscsökkentést találtunk a kiindulási értékekhez képest.
52
5. Megbeszélés Dolgozatomban áttekintettem az ízületi gyulladás kapcsán a granulocita és az endotél közötti kapcsolat főbb elemeit, valamint röviden ismertettem a granulocita-endotél kölcsönhatás vizsgálatában használatos in vitro és in vivo vizsgálati módszerek lényegét. A CD44 marker elleni kezelés kapcsán egy konkrét területen bemutattam az intravitális képalkotó módszerek alkalmazásának lehetőségeit. Számos in vivo megfigyelés igazolta, hogy a CD44 adhéziós molekula szerepet játszik a fehérvérsejtek gördülő mozgásának szabályozásában a gyulladás helyén az endotél által expresszált hialuronsavon,18
58
azonban az eddig vizsgált állatmodellekben a CD44
genetikai kiütése sokkal kevésbé volt képes kivédeni a gyulladást, mint a CD44 ellenes antitestek
alkalmazása.
Vizsgálataink
célja
az
volt,
hogy
a
fehérvérsejtek
viselkedésének követésével megpróbáljuk megérteni ezt a diszkrepanciát a CD44 hiánya és antitestekkel való blokkolása között PG indukált artritiszben, mivel az eddigi vizsgálatok számos, egymásnak részben ellentmondó adatokat közöltek.28 29 30 35 59 Azt tapasztaltuk, hogy CD44 hiányában megváltoznak a fehérvérsejt- endotél kölcsönhatás kezdő lépései (gördülő mozgás és adhézió) az egerek gyulladt szinoviális ereiben. A génkiütött állatok esetében a gördülő mozgást, illetve az adhéziót végző sejtek aránya a „rolling” sejtek irányába tolódott el, ez megfelel korábbi eredményeinknek,36
60
bár nem tisztázott, hogy a CD44 mediált hialuronsav kötés
kiesésének mi a szerepe a fehérvérsejtek viselkedésének ilyen jellegű megváltozásában. A vad típusú egerekből származó neutrofil granulociták nem lépnek érdemben kölcsönhatásba az immobilizált hialuronsavval,36 de HA és HA kötő fehérjék (pl. TNF indukált protein-6, TSG-6) immobilizált komplexein ugyanezek a sejtek jelentős fokú interakciót (adhézió és gördülő mozgás) mutatnak.28 Mind a hialuronsav,58 mind a TSG6 nagy mennyiségben termelődik a gyulladás helyén.61 Úgy gondoljuk, hogy gyulladásos
körülmények
között
nagy
mennyiségű
hialuronsavban
gazdag
multimolekuláris komplex képződik, mely elősegíti a fehérvérsejtek CD44 mediált adhézióját és gördülő mozgását, azonban a CD44 génkiütött állatok nem tudják hasznosítani ezt a mechanizmust. CD44 KO állatok esetén a csökkent adhézió hozzájárulhat ahhoz, hogy CIA és PGIA esetén az artritisz enyhébb intenzitású, és később kezdődik.35 58 A CD44 hiány jelentette mérsékelt védelemmel szemben CD44
53
ellenes specifikus antitestekkel kifejezett gyulladáscsökkentő hatás volt elérhető számos gyulladásos modellben,29 32 33 34 59 62 63 mely alapján felmerült a gyanú, hogy ebben az esetben a gyulladáscsökkentés egy másféle mechanizmussal jön létre. Úgy tapasztaltuk, hogy a gyulladt szinoviális membrán ereiben lévő fehérvérsejtek (többségükben neutrofil granulocita) CD44 molekuláin az antitestekkel létrehozott keresztkötések egy azonnali reakciót váltanak ki. A sejtek gördülő mozgása megszűnik, a sejtek felszínére vérlemezkék tapadnak, majd a vérlemezkékkel fedett fehérvérsejtek eltűnnek a keringésből. Ez merőben különbözik a CD44 hiányos egereken észlelt változásokkal, és az antitestek hatásmechanizmusa hátterében úgy tűnik, hogy nem a CD44–HA kölcsönhatás antitestek okozta gátlása áll. Ugyanekkor ezek a hatások utánozhatók a Gr1 granulocita felszíni marker ellenes antitesttel, ennek a markernek pedig nem ismert, hogy szerepe lenne a sejt adhézióban, illetve kapcsolatban állna a CD44-el. Feltételeztük, hogy a leukociták felszínén az IM7 adása után megfigyelt vérlemezke depléció a vérlemezke p-szelektin és a neutrofil PSGL-1 receptorok kölcsönhatásának eredménye, ezért kíváncsiak voltunk, hogy rekombináns egér (rm) p-szelektin milyen hatással bír a vérlemezkék viselkedésére. Meglepetésünkre azt tapasztaltuk, hogy a szolubilis p-szelektin adása a CD44 ellenes antitestekkel mindenben egyező reakciót eredményez. A CD44 ill. a Gr-1 ellenes antitestek, valamint a szolubilis p-szelektin által kiváltott azonos in vivo reakciók a háttérben közös hatásmechanizmust sejtetnek. Kimutattuk, hogy a bivalens antitestek által kiváltott keresztkötéseknek fontos szerepe van a leukociták és vérlemezkék viselkedésére kifejtett hatásban. In vitro ismert, hogy az antitestekkel kiváltott CD44 keresztkötések az Src családba tartozó tirozin kinázok aktivációjához vezetnek,64 65 ezek a kinázok pedig szerepet játszanak az integrin mediált szignál mechanizmusokban. Szintén az src családba tartozó tirozin kinázok aktiválásához vezet a granulociták in vitro kezelése p-szelektinnel, mely az aM2 (CD11b/CD18, Mac-1) integrinen keresztül a vérlemezkék neutrofilokhoz kötődését indukálja.66 Ez arra utal, hogy a neutrofil felszínén lévő CD44 és PSGL-1 keresztkötések
szignálmechanizmusok
útján
gyors
integrin
következményes vérlemezke adhézióhoz vezetnek (33. ábra).
54
aktivációhoz
és
vérlemezke
integrin (IIb)(3)
Fibrinogén/ fibrin
heparin + granulocita +
Src +
+
Anti-Gr-1
IM7
Szolubilis p-szelektin
33. ábra. A sejtfelszíni molekulákon létrehozott keresztkötések által kiváltott granulocita adhézió és vérlemezke aktiváció mechanizmusa. A granulociták felszíni molekuláin (CD44, Gr-1, p-szelektin) bivalens antitestekkel illetve szolubilis receptorokkal létrehozott keresztkötések szignál mechanizmusok útján az src családba tartozó kinázok aktiválását eredményezik. Az src kinázok pedig a Mac-1 integrinek aktiválásán keresztül a granulociták érfalhoz való adhéziójához, illetve fibrinogén kötéséhez vezetnek. A fibrinogén pedig következményes vérlemezke kitapadáshoz, a vérlemezke integrin aktiváción keresztül a vérlemezkék aktivációjához, majd a granulocita memránjának megváltozásán keresztül további vérlemezkék megkötéséhez vezet. Feltételezhetően a heparin kezelés a fibrinogén aktiválódásának meggátlásával képes kivédeni a vérlemezke kötést és aktiválódást.
A heparinnak az IM7 által kiváltott reakciókra adott erőteljes antagonista hatása a koagulációs rendszer és a sejt adhéziós mechanizmusok közötti kölcsönhatásra utal. A p-szelektinnel kezelt egerekben, valamint azokban az állatokban, amelyekben genetikai manipuláció következtében a sejtfelszíni p-szelektin szabaddá vált57 excesszív fibrin depozíció volt megfigyelhető. Hasonló jelenséget észleltek előzetes TNF- stimulációt
55
követő anti-Gr1 kezelés mellett is.67 Ismert, hogy a Mac-1 integrin specifikus kötőhelyén képes fibrinogén/fibrin megkötésére,68 feltételezzük, hogy a neutrofilokon az aktivált Mac-1 által kiváltott fibrin/fibrinogén kötés lehet az IM7 által kiváltott reakciósorozatban a kezdeti lépés. A heparin kezelést, illetve a vérlemezke depléciót követően az IM7 által kiváltott vérlemezke depozicióban illetve neutrofil szám csökkenésben kiváltott negatív hatás arra utal, hogy a CD44 keresztkötés növeli a neutrofilok felszínén a prokoaguláns aktivitást, amely a progresszív vérlemezke akkumuláción keresztül a sejtmembrán nagyfokú megváltozásához vezet. Bár mind a vérlemezkék mind a koagulációs rendszer sejtfelszínhez kötött komponensei hozzájárulnak a neutrofilokon bekövetkezett elváltozásokhoz és a sejtek gyors eltűnéséhez, az IM7 kezelt egerekben antikoaguláns kezelés mellett illetve vérlemezke depléció után is szignifikáns gyulladáscsökkentő hatást észleltünk, a neutrofilok 4070%-a ilyen esetben is eltűnt a keringésből. Ez lehetővé teszi, hogy legyen a kombinált anti-CD44 és antikoaguláns kezelés számára egy biztonságos „terápiás ablak”, ahol még nincs prokoaguláns hatás, de a granulocitaszám csökkentése bár kisebb fokú, de még mindig szignifikáns.
56
6. Következtetések A különböző in vivo és in vitro képalkotó módszerek első alkalommal engednek közvetlenül betekinteni az ízületi gyulladás során lezajló granulocita-endotél kölcsönhatások, és a gyulladásos sejtek ízületbe való migrációjának folyamatába. A képalkotó módszerek (elsősorban a 2P mikroszkópia) fejlődésével a közeljövőben várhatóan a gyulladásos sejteken belüli szignál mechanizmusok is vizsgálhatóvá válnak. Vizsgálatainkkal hozzájárultunk a granulocita felszíni CD44 szerepének jobb megértéséhez, és a granulocita felszíni markerek elleni antitestek által kiváltott neutrofil depléció mechanizmusának közelebbi megértéséhez. Igazoltuk, hogy kísérletes artritiszben a CD44 ellenes antitestek fő hatásmechanizmusa a granulociták depléciója. Úgy találtuk, hogy a sejtfelszínen nagy mennyiségben jelen lévő markereken (mint pl. Gr-1, CD44 és PSGL-1) az antitestekkel, illetve szolubilis receptorokkal létrehozott keresztkötések hasonló mechanizmussal hozzák létre a granulociták keringésből való eltávolítását. Ez óvatosságra int azt illetően, hogy az adott sejtfelszíni marker ellenes antitestek hatásmechanizmusa nem feltétlenül a sejtfelszíni marker funkciójának blokkolása, hanem ettől független mechanizmusokkal az adott sejt károsítása és keringésből való eltávolítása útján is létrejöhet. Vizsgálataink ugyanakkor rámutatnak a sejt adhéziós rendszer és a koagulációs rendszer közötti finom kapcsolatra is, valamint jelzik, hogy a különböző, célzott sejt ellenes antitest kezelések könnyen beindíthatnak olyan mechanizmusokat, melyek beláthatatlan következménnyel járhatnak. A granulocita sejtfelszíni markerek elleni célzott kezelés lehetőséget ad a gyulladás effektor fázisának leállítására, és ezzel a szöveti destrukció átmeneti leállítására, de nem jelent oki terápiát, a gyulladást fenntartó specifikus autoimmun reakciót nem érinti. Ennek következtében – figyelembe véve az átmeneti neutropénia, illetve a koagulációs rendszer aktiválása révén jelentkező potenciális veszélyeket- elsősorban kiegészítő terápiaként jöhet szóba a jövőben elsősorban agresszív betegség esetén a gyulladás aktív szakaszában gyors tünetmentesség elérésére.
57
7. Összefoglalás A granulociták központi szerepet játszanak a krónikus ízületi gyulladás effektor szakaszában. Az ereken át migráló, majd az ízület üregébe belépő sejtek számos, az ízület irreverzibilis, progresszív károsodását eredményező folyamatot indítanak el. Ennél fogva a granulociták elleni célzott kezelés a jövőben egy potenciális terápiás eszköz lehet a kezünkben. A fluoreszcens képalkotó módszerek fejlődése lehetővé tette, hogy első ízben nyomon tudjuk követni in vivo a gyulladásos sejtek mozgását a gyulladt ízületben. A granulocita sejtfelszíni marker CD44 elleni antitestek számos állati immunmediált gyulladásos modellben nagyfokú hatékonyságot mutatottak, ezzel szemben a CD44 génkiütött (KO) állatokban nem találtunk lényeges védettséget a gyulladásos betegségekkel szemben. Humán PG indukált kísérletes poliartritiszben in vivo videomikroszkópiával igazoltuk, hogy a CD44 genetikai hiánya, illetve a CD44 blokkolása specifikus antitestekkel eltérő következményekkel jár a granulociták viselkedésére. A granulociták „gördülő” mozgása fokozódik CD44 genetikai hiánya esetén, azonban vad típusú állatokban a célzott antitestek a „gördülő” mozgás azonnali és teljes leállásához vezetnek. E mellett antitest kezelés hatására a vérlemezkék a granulociták felszínéhez kötődnek, majd a vérlemezkékkel fedett leukociták eltűnnek a keringésből. Az antitestek e hatásához szükség van a CD44 molekulákon létrejött keresztkötésekre, ugyanakkor ez a jelenség nem csak a CD44, hanem más, a granulociták felszínén nagy mennyiségben jelen lévő molekula ellenes antitestekkel ill. szolubilis receptorokkal való kezelést követően is bekövetkezik. Az antikoaguláns kezelés a mellett, hogy megakadályozza a vérlemezkék depozícióját képes mind a gyulladáscsökkentő hatás mérséklésére és a vérlemezkék granulocitákhoz való megtapadásának meggátlására. Vizsgálataink arra utalnak, hogy a nagy mennyiségben lévő sejtfelszíni markereken létrehozott keresztkötések a granulocitákban egy meghatározott esemény-sorozatot indítanak el, mely a koagulációs rendszer aktiválásával együtt a granulociták keringésből történő eliminációjához vezet. A CD44 elleni antitestek által kifejtett nagyfokú gyulladáscsökkentő hatás a granulocita depléió következménye. Vizsgálatunk arra is felhívja a figyelmet, hogy a különböző sejtfelszíni markerek ellen létrehozott célzott antitest kezelések a koagulációs rendszer aktiválásával nem kívánt eredményeket is okozhatnak.
58
8. Summary Granulocytes play a central role in the effector phase of chronic autoimmune arthritis. Migrating inflammatory cells entering the joint cavity induce events leading to progressive, irreversible tissue damage. Therefore focused anti-granulocyte treatment may be a therapy of choice in treating inflammatory conditions in the future. The improvement of fluorescent imaging techniques makes it possible for the first time to directly observe the recruitment of inflammatory cells in the arthritic joints. I give a short description of both in vitro and in vivo techniques used in the investigation of granulocyte-endothelial interactions under inflammatory conditions. CD44, the leukocyte adhesion receptor for hyaluronan, has been considered a therapeutic target on the basis of the robust anti-inflammatory effect of CD44-specific antibodies in animal models of immune-mediated diseases. However, CD44 deficiency does not provide substantial protection against inflammation. Using intravital video microscopy in a murine model of rheumatoid arthritis, we show that CD44 deficiency and anti-CD44 antibody treatment exert disparate effects on leukocyte recruitment in inflamed joints. Leukocyte rolling, which is increased in CD44-deficient mice, is promptly abrogated in anti-CD44-treated wild-type mice. CD44-specific antibodies also trigger platelet deposition on granulocytes and subsequent depletion of this leukocyte subset in the circulation. These in vivo effects require CD44 cross-linking and are reproducible with an antibody against Gr-1, a molecule that, like CD44, is highly expressed on granulocytes. Anticoagulant pretreatment, which prevents platelet deposition, mitigates both granulocyte depletion and the suppressive effect of CD44specific antibody on joint swelling. Our observation suggest that cross-linking of prominent cell surface molecules, such as CD44 or Gr-1, can initiate a rapid selfelimination program in granulocytes through engagement of the coagulation system. We conclude that the robust anti-inflammatory effect of CD44-specific antibodies in arthritis is primarily the result of their ability to trigger granulocyte depletion. Our study also implicates that different antibody treatments against certain cell surface markers may cause unwanted side effects by interfering with the coagulation system.
59
9. Irodalomjegyzék 1
Lawrence RC. Rheumatoid arthritis classification and epidemiology. In: Klippel JH, Dieppe PA (szerk.), Rheumatology. London: Mosby-Year Book; 1994. 2
Springer TA. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm. Cell, 1994 Jan 28; 76(2):301-14. Review. 3
Glant TT, Finnegan A, Mikecz K. Proteoglycan-induced arthritis: immune regulation, cellular mechanisms and genetics. Crit Rev Immunol, 2003;23(3):199-250. Review. 4
Gal I, Bajnok E, Szanto S, Sarraj B, Glant TT, Mikecz K. Visualization and in situ analysis of leukocyte trafficking into the ankle joint in a systemic murine model of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 2005 Oct;52(10):3269-78. 5
Grillo-Lopez AJ, White CA, Varns C, Shen D, Wei A, McClure A, Dallaire BK. Overview of the clinical development of rituximab: first monoclonal antibody approved for the treatment of lymphoma. Semin Oncol, 1999 Oct;26(5 Suppl 14):66-73. 6
Jin L, Hope KJ, Zhai Q, Smadja-Joffe F, Dick JE. Targeting of CD44 eradicates human acute mieloid leukemic stem cell. Nat Med, 2006 Oct;12(10):1164-74. 7
Sperandio M, Smith ML, Forlow SB, Olson TS, Xia L, McEver RP, Ley K. P-selectin glycoprotein ligand-1 mediates L-selectin-dependent leukocyte rolling in venules. J Exp Med, 2003 May 19;197(10):1355-63. 8
Ley K, Teddler TF. Leukocyte interactions with vascular endothelium. New insights into selectin-mediated attachment and rolling. J Immunol, 1995 Jul 15;155(2):525-8. 9
Smith CW, Marlin SD, Rothlein R, Toman C, Anderson DC. Cooperative interactions of LFA-1 and Mac-1 with intracellular adhesion molecule-1 in facilitating adherence and transendothelial migration of human neutrophils in vitro. J Clin Invest, 1989 Jun;83(6):2007-17. 10
Wheatley SC, Isacke CM, Crossley PH. Restricted expression of the hyaluronan receptor, CD44, during postimplantation mouse embryogenesis suggests key roles in tissue formation and patterning. Development, 1993 Oct;119(2):295-306. 11
Yamazaki M, Nakajima F, Ogasawara A, Moriya H, Majeska RJ, Einhorn TA. Spatial and temporal distribution of CD44 and osteopontin in fracture callus. J. Bone Joint Surg Br, 1999 May;81(3):508-15. 12
Lesley J, Hyman R, Kincade PW. CD44 and its interaction with extracellular matrix. Adv Immunol, 1993;54:271-335. Review.
60
13
Trochon V, Mabilat C, Bertrand P, Legrand Y, Smadja-Joffe F, Soria C, Delpech B, Lu H. Evidence of involvement of CD44 in endothelial cell proliferation, migration and angiogenesis in vitro. Int J Cancer, 1996 May 29;66(5):664-8. 14
Lesley J, Hyman R, English N, Catterall JB, Turner GA. CD44 in inflammation and metastasis. Glycoconj J, 1997 Aug;14(5):611-22. 15
Herrlich P, Zoller M, Pals ST, Ponta H. CD44 splice variants: metastases meet lymphocytes. Immunol Today, 1993 Aug;14(8):395-9. 16
Lesley J, Howes N, Perschl A, Hyman R. Hyaluronan binding function of CD44 is transiently activated on T cells during an in vivo immune response. J Exp Med, 1994 Jul 1;180(1):383-7. 17
Lesley J, Hyman R. CD44 structure and function. Frontiers Biosci, 1998 Jul 1;3:d616-630. Review. 18
DeGrendele HC, Estess P, Picker LJ, Siegelman MH. CD44 and its ligand hyaluronate mediate rolling under physiologic flow: A novel lymphocyte-endothelial cell primary adhesion pathway. J Exp Med, 1996 Mar 1;183(3):1119-30. 19
Aruffo A, Stamenkovic I, Melnick M, Underhill CB, Seed B. CD44 is the principal cell surface receptor for hyaluronate. Cell, 1990 Jun 29;61(7):1303-13. 20
Dimitroff CJ, Lee JY, Fuhlbrigge RC, Sackstein R. A distinct glycoform of CD44 is an L-selectin ligand on human hematopoietic cells. Proc Natl Acad Sci USA, 2000 Dec 5;97(25):13841-6. 21
Hidalgo A, Peired AJ, Wild MK, Vestweber D, Frenette PS. Complete identification of E-selectin ligands on neutrophils reveals distinct functions of PSGL-1, ESL-1, and CD44. Immunity, 2007 Apr;26(4):477-89. 22
Nandi A, Estess P, Siegelman M. Bimolecular complex between rolling and firm adhesion receptors required for cell arrest; CD44 association with VLA-4 in T cell extravasation. Immunity, 2004 Apr;20(4):455-65. 23
Mindrescu C, Thorbecke GJ, Klein MJ, Vilcek J, Wisniewski HG. Amelioration of collagen-induced arthritis in DBA/1J mice by recombinant TSG-6, a tumor necrosis factor/interleukin-1-inducible protein. Arthritis Rheum, 2000 Dec;43(12):2668-77. 24
Bárdos T, Kamath RV, Mikecz K, Glant TT. Anti-inflammatory and chondroprotective effect of TSG-6 (tumor necrosis factor-alpha-stimulated gene-6) in murine models of experimental arthritis. Am J Pathol, 2001 Nov;159(5):1711-21. Erratum in: Am J Pathol, 2002 Mar;160(3):1193. 25
Glant TT, Kamath RV, Bárdos T, Gál I, Szántó S, Murad YM, Sandy JD, Mort JS, Roughley PJ, Mikecz K. Cartilage-specific constitutive expression of TSG-6 protein (product of tumor necrosis factor alpha-stimulated gene 6) provides a
61
chondroprotective, but not antiinflammatory, effect in antigen-induced arthritis. Arthritis Rheum, 2002 Aug;46(8):2207-18. 26
Szántó S, Bárdos T, Gál I, Glant TT, Mikecz K. Enhanced neutrophil extravasation and rapid progression of proteoglycan-induced arthritis in TSG-6-knockout mice. Arthritis Rheum, 2004 Sep;50(9):3012-22. 27
Getting SJ, Mahoney DJ, Cao T, Rugg MS, Fries E, Milner CM, Perretti M, Day AJ. The link module from human TSG-6 inhibits neutrophil migration in a hyaluronan- and inter-alpha -inhibitor-independent manner. J Biol Chem, 2002 Dec 27;277(52):5106876. Epub 2002 Oct 24. 28
Lesley J, Gal I, Mahoney DJ, Cordell MR, Rugg MS, Hyman R, Day AJ, Mikecz K. TSG-6 modulates the interaction between hyaluronan and cell surface CD44. J Biol Chem, 2004 Jun 11;279(24):25745-54. Epub 2004 Apr 1. 29
Mikecz K, Brennan FR, Kim JH, Glant TT. Anti-CD44 treatment abrogates tissue edema and leukocyte infiltration in murine arthritis. Nat Med, 1995 Jun;1(6):558-63. 30
Mikecz K, Dennis K, Shi M, Kim JH. Modulation of hyaluronan receptor (CD44) function in vivo in a murine model of rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum, 1999 Apr;42(4):659-68. 31
Naor D, Nedvetzki S, Assayag N, Thurmond RL, Huang JF, Turley EA. The mechanism of molecular redundancy in autoimmune inflammation in the context of CD44 deficiency. Ann N Y Acad Sci, 2005 Jun;1050:52-63. Review. 32
Weiss L, Slavin S, Reich S, Cohen P, Shuster S, Stern R, Kaganovsky E, Okon E, Rubinstein AM, Naor D. Induction of resistance to diabetes in non-obese diabetic mice by targeting CD44 with a specific monoclonal antibody. Proc Natl Acad Sci USA, 2000 Jan 4;97(1):285-90. 33
Brocke S, Piercy C, Steinman L, Weissman IL, Veromaa T. Antibodies to CD44 and integrin α4, but not L-selectin, prevent central nervous system inflammation and experimental encephalomyelitis by blocking secondary leukocyte recruitment. Proc Natl Acad Sci USA, 1999 Jun 8;96(12):6896-901. 34
Katoh S, Matsumoto N, Kawakita K, Tominaga A, Kincade PW, Matsukura S. A role for CD44 in an antigen-induced murine model of pulmonary eosinophilia. J Clin Invest, 2003 May;111(10):1563-70. 35
Stoop R, Kotani H, McNeish JD, Otterness IG, Mikecz K. Increased resistance to collagen-induced arthritis in CD44-deficient DBA/1 mice. Arthritis Rheum, 2001 Dec;44(12):2922-31. 36
Khan AI, Kerfoot SM, Heit B, Liu L, Andonegui G, Ruffell B, Johnson P, Kubes P. Role of CD44 and hyaluronan in neutrophil recruitment. J Immunol, 2004 Dec 15;173(12):7594-601.
62
37
Szanto S, Gonda A, Mikecz K, Glant TT. Állatkísérletes arthritismodellek. Hun Immunol, 2005;4(1):14-8. 38
Courtenay JS, Dallman MJ, Dayan AD, Martin A, Mosedale B. Immunisation against heterologous type II collagen induces arthritis in mice. Nature, 1980 Feb 14;283(5748):666-8. 39
Glant TT, Mikecz K, Arzoumanian A, Poole AR. Proteoglycan induced arthritis in BALB/c mice. Clinical features and histopathology. Arthritis Rheum, 1987 Feb;30(2):201-12. 40
Houri JM, O'Sullivan FX. Animal models in rheumatoid arthritis. Curr Opin Rheumatol, 1995 May;7(3):201-5. 41
Issekutz AC, Issekutz TB. Quantitation and kinetics of polimorphonuclear leukocyte and lymphocyte accumulation in joints during adjuvant arthritis in the rat. Lab Invest, 1991 May;64(5):656-63. 42
Szekanecz Z, Halloran MM, Volin MV, Woods JM, Strieter RM, Kenneth Haines G 3rd, Kunkel SL, Burdick MD, Koch AE. Temporal expression of inflammatory cytokines and chemokines in rat adjuvant-induced arthritis. Arthritis Rheum, 2000 Jun;43(6):1266-77. 43
Taurog JD, Maika SD, Satumtira N, Dorris ML, McLean IL, Yanagisawa H, Sayad A, Stagg AJ, Fox GM, Le O’Brien A, Rehman M, Zhou M, Weiner AL, Splawski JB, Richardson JA, Hammer RE. Inflammatory disease in HLA-B27 transgenic rats. Immunol Rev, 1999 Jun;169:209-23. Review. 44
Adarichev VA, Vegvari A, Szabo Z, Kis-Toth K, Mikecz K, Glant TT. Congenic strains displaying similar clinical phenotype of arthritis represent different immunologic models of inflammation. Genes Immun, 2008 Oct;9(7):591-601. Epub 2008 Jul 24. 45
Fleming TJ, Fleming M, Malek TR. Selective expression of Ly-6G on mieloid lineage cells in mouse bone marrow. RB6-8C5 mAb to granulocyte-differentiation antigen (Gr-1) detects members of the Ly-6 family. J Immunol, 1993 Sep 1;151(5):2399-408. 46
Damjanovich S, Fidy J, Szőllősi J. Orvosi biofizika, 2. Kiadás. Medicina Kiadó, 2006. 47
Zinselmeyer BH, Lynch JN, Zhang X, Aoshi T, Miller MJ. Video-rate two-photon imaging of mouse footpad- a promising model for studying leukocyte recruitment dynamics during inflammation. Inflamm Res, 2008 Mar;57(3):93-6. 48
Beltman JB, Marée AF, Lynch JN, Miller MJ, de Boer RJ: Lymph node topology dictates T cell migration behavior. J Exp Med, 2007 Apr 16;204(4):771-80. Epub 2007 Mar 26.
63
49
Göppert-Mayer M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Ann Phys, 1931(9):273-94 50
Denk W, Strickler JH, Webb WW. Two photon laser scanning microscopy. Science, 1990 Apr 6;248(4951):73-6. 51
Kaiser W, Garrett C. Two-Photon Excitation in CaF2:Eu2+. Phys Rev Lett, 1961(7): 229-31. 52
Franken PA, Hill AE, Peters CW, Weinreich G. Generation of Optical Harmonics. Phys Rev Lett, 1961(7):118-9. 53
Szanto S, Gal I, Gonda A, Glant TT, Mikecz K. Expression of L-selectin, but not CD44, is required for early neutrophil extravasation in antigen-induced arthritis. J Immunol, 2004 Jun 1;172(11):6723-34. 54
Wipke BT, Allen PM. Essential role of neutrophils in the initiation and progression of a murine model of rheumatoid arthritis. J Immunol, 2001 Aug 1;167(3):1601-8. 55
Thakur ML, Li J, Chandy B, John EK, Gibbons G. Transient neutropenia: neutrophil distribution and replacement. J Nucl Med, 1996 Mar;37(3):489-94. 56
Evangelista V, Manarini S, Sideri R, Rotondo S, Martelli N, Piccoli A, Totani L, Piccardoni P, Vestweber D, de Gaetano G, Cerletti C. Platelet/polimorphonuclear leukocyte interaction: P-selectin triggers protein-tyrosine phosphorylation-dependent CD11b/CD18 adhesion: role of PSGL-1 as a signaling molecule. Blood, 1999 Feb 1;93(3):876-85. 57
Andre P, Hartwell D, Hrachovinova I, Saffaripour S, Wagner DD. Pro-coagulant state resulting from high levels of soluble P-selectin in blood. Proc Natl Acad Sci USA, 2000 Dec 5;97(25):13835-40. 58
Puré E, Cuff CA. A crucial role for CD44 in inflammation. Trends Mol Med, 2001 May;7(5):213-21. Review. 59
Verdrengh M, Holmdahl R, Tarkowski A. Administration of antibodies to hyaluronanreceptor (CD44) delays the start and ameliorates the severity of collagen II arthritis. Scand J Immunol, 1995 Sep;42(3):353-8. 60
Gonda A, Gal I, Szanto S, Sarraj B, Glant TT, Hunyadi J, Mikecz K. CD44, but not L-selectin, is critically involved in leucocyte migration into the skin in a murine model of allergic dermatitis. Exp Dermatol, 2005 Sep;14(9):700-8. 61
Milner CM, Day AJ. TSG-6: a multifunctional protein associated with inflammation. J Cell Sci, 2003 May 15;116(Pt10):1863-73. Review.
64
62
Nedvetzki S, Walmsley M, Alpert E, Williams RO, Feldmann M, Naor D. CD44 involvement in experimental collagen-induced arthritis (CIA). J Autoimmun, 1999 Aug;13(1):39-47. 63
DeGrendele HC, Estess P, Siegelman MH. Requirement for CD44 in activated T cell extravasation into an inflammatory site. Science, 1997 Oct 24;278(5338):672-5. 64
Taher TE, Smit L, Griffioen AW, Schilder-Tol EJ, Borst J, Pals ST. Signaling through CD44 is mediated by tyrosine kinases. Association with p56lck in T lymphocytes. J Biol Chem, 1996 Feb 2;271(5):2863-7. 65
Li R, Wong N, Jabali MD, Johnson P. CD44-initiated cell spreading induces pyk2 phosphorylation, is mediated by src family kinases, and is negatively regulated by CD45. J Biol Chem, 2001 Aug 3;276(31):28767-73. 66
Piccardoni P, Sideri R, Manarini S, Piccoli A, Martelli N, deGaetano G, Cerletti C, Evangelista V. Platelet/polimorphonuclear leukocyte adhesion: a new role for SRC kinases in Mac-1 adhesive function triggered by P-selectin. Blood, 2001 Jul 1;98(1):108-16. 67
Norman KE, Cotter MJ, Stewart JB, Abbitt KB, Ali M, Wagner BE, Wallace WA, Forlow SB, Hellewell PG. Combined anticoagulant and antiselectin treatments prevent lethal intravascular coagulation. Blood, 2003 Feb 1;101(3):921-8. Epub 2002 Sep 19. 68
Flick MJ, Du X, Degen JL. Fibrin(ogen)-alpha M beta 2 interactions regulate leukocyte function and innate immunity in vivo. Exp Bio Med (Maywood), 2004 Dec;229(11):1105-10. Review.
65
10. Saját publikációk jegyzéke A disszertáció alapjául szolgáló közlemények:
Hutas G, Bajnok E, Gal I, Finnegan A, Glant TT, Mikecz K. CD44-specific antibody treatment and CD44 deficiency exert distinct effects on leukocyte recruitment in experimental arthritis. Blood, 2008 Dec 15;112(13):4999-5006. IF:10.432
Farkas B, Boldizsar F, Tarjanyi O, Laszlo A, Lin SM, Hutas G, Tryniszewska B, Mangold A, Nagyeri G, Rosenzweig HL, Finnegan A, Mikecz K, Glant TT. BALB/c mice genetically susceptible to proteoglycan-induced arthritis and spondylitis show colony-dependent differences in disease penetrance. Arthritis Res Ther, 2009 Feb 16;11(1):R21 Epub 2009 Feb 16. IF:4.485
Egyéb közlemények:
Hutás G, Egelston C, Rózsa B, Katona G, Géher P, Glant TT, Mikecz K. A két foton laser scanning fluoreszcens mikroszkópos képalkotás perspektívái a kísérletes reumatológiában. Magyar Reumatológia, 2009.3 Vol 50. 171-173.
Hutas G. Ocrelizumab, a humanized monoclonal antibody against CD20 for inflammatory disorders and B-cell malignancies. Curr Opin Investig Drugs, 2008 Nov;9(11):1206-15.
Hutas G. Golimumab, a fully human monoclonal antibody against TNF alpha. Curr Opin Mol Ther, 2008 Aug;10(4):393-406.
O'neill SK, Cao Y, Hamel KM, Doodes PD, Hutas G, Finnegan A. Expression of CD80/86 on B Cells Is Essential for Autoreactive T Cell Activation and the Development of Arthritis. J Immunol, 2007 Oct 15;179(8):5109-16. IF:6.068
66
Hutás G, Sármán B, Pusztai P, Végső G, Somogyi A. Diabeteszes mastopathia 1-es típusú, hosszú ideje fennálló diabetes mellitusban. Diabetologia hungarica, 2000.8:177182. Az előadás témájában elhangzott előadások, poszterek: Hutas G1, Bajnok E2, Gal I2, Finnegan A3, Glant TT2, Mikecz K2. 1Department of Rheumatology, Semmelweis University Medical School, Budapest, Hungary 2Section of Molecular Medicine, Department of Orthopedic Surgery 3Section of Rheumatology, Department of Internal Medicine, Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA. The mechanism of action of anti CD44 monoclonal antibody (mAb) therapy in experimental arthritis. EULAR Scientific Meeting, Copenhagen, Denmark, 2009. Poster.
Mikecz K, Bajnok E, Gal I, Farkas B, Glant TT, Hutas G. Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA. Drastic Inhibition of Leukocyte Recruitment and Synovitis by Anti-CD44 or Anti-Granulocyte Treatment in a Murine Model of Rheumatoid Arthritis. ACR/ARHP Scientific Meeting, Boston, MA, USA, 2007. Poster. Hutás G1, Bajnok É2, Gál I2, Finnegan A2, Glant TT2, Mikecz K2. 1Budai Irgalmasrendi Kórház, Budapest, 2Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA. A CD44ellenes monoklonális antitest kezelés hatásmechanizmusa kísérletes arthritisben. MRE Vándorgyűlés, Budapest, 2008. Előadás. Egyéb közlemények, előadások: Hutas G1, Egelston C2, Rozsa B3, Katona G3, Geher P1, Glant TT2, Mikecz K2. 1
Department of Rheumatology, Semmelweis University Medical School, Budapest,
Hungary, 2Department of Orthopedic Surgery, Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA, 3Institute of Experimental Medicine, Hungarian Academy of Sciences, Budapest, Hungary. The perspectives of two photon laser scanning
67
fluorescence microscopy imaging in experimental rheumatology. EULAR Scientific Meeting, Copenhagen, Denmark, 2009. Abstract. Hutás G1, Bajnok É2, Day AJ3, Glant TT2, Mikecz K2. 1Budai Irgalmasrendi Kórház, Budapest, 2Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA,
3
University of
Manchester, Manchester, United Kingdom. A TSG-6 protein szerepe az extracelluláris mátrix felépítésében és a gyulladásos sejtek migrációjában. MRE Vándorgyűlés, Budapest, 2008. Poszter.
Doodes PD, Hamel K, Cao Y, Rodeghero R, Wang Y, Hutas G, Finnegan A. Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA. CCR5 Utilized for Resolution not Initiation of Proteoglycan Induced Arthritis. ACR/ARHP Scientific Meeting, San Francisco, USA, 2008. Poster. Hutas G1, Bajnok E1, Murad YM1, Radacs M1, Day AJ2, Mikecz K1. 1Rush University Medical Center, Chicago, IL, 2University of Manchester, Manchester, United Kingdom. Roles of TSG-6-Hyaluronan Complexes in Extracellular Matrix Assembly and Inflammatory Cell Recruitment. Midwest Connective Tissue Workshop, Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA, 2007. Poster Hutas G1, Bajnok E1, Murad YM1, Radacs M1, Day AJ2, Mikecz K1. 1Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA, 2University of Manchester, Manchester, United Kingdom. Roles of TSG-6-Hyaluronan Complexes in Extracellular Matrix Assembly and Inflammatory Cell Recruitment. ACR/ARHP Scientific Meeting, Boston, MA, USA, 2007. Poster.
Bajnok E, Gal I, Sarraj B, Ludanyi K, Hutas G, Glant TT, Mikecz K. Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA. Suppression of Joint Inflammation by Fucoidin Treatment Indicates a Therapeutic Potential for Selectin Inhibitors in Systemic Autoimmune Arthritis. ACR/ARHP Scientific Meeting, Washington DC, USA, 2006. Poster.
68
Hutas G1, Bajnok E1, Ludanyi K1, Murad YM1, Milner CM2, Day AJ2, Glant TT1, Mikecz K1. 1Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA, 2University of Oxford, Oxford, United Kingdom. TSG-6 Exerts an Anti-inflammatory Effect in Autoimmune Arthritis through Interaction with Cell Surface CD44. ACR/ARHP Scientific Meeting, Washington DC, USA, 2006. Poster. Hutas G1, Bajnok E1, Ludanyi K1, Murad YM1, Milner CM2, Day AJ2, Glant TT1, Mikecz K1. 1Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA, 2University of Oxford, Oxford, United Kingdom. TNF-induced Gene-6 (TSG-6) Excerts an Anti-inflammatory Effect in Autoimmune Arthritis through Interaction with Cell Surface CD44. Midwest Connective Tissue Workshop, Rush University Medical Center, Chicago, Illinois, USA, 2006. Poster. Hutas G1, Bajnok E1, Murad YM1, Radacs M1, Day AJ2, Mikecz K1. 1Rush University Medical Center, Chicago, IL, USA, 2University of Oxford, Oxford, United Kingdom. TSG-6 mediated Assembly of Hyaluronan-based Matrix Particles and Their Influence on Leukocyte Adhesion. Midwest Connective Tissue Workshop, Rush University Medical Center, Chicago, Illinois, USA, 2006. Poster.
Hutás G. Budai Irgalmasrendi Kórház, Budapest. Szeropozitiv poliarthritisz differenciál-diagnosztikai
problémájaként
jelentkező
szisztémás
vasculitis-
esetismertetés. MRE Vándorgyűlés, Budapest, 2004. Poszter.
Hutas G. Budai Irgalmasrendi Kórház, Budapest. Symptoms of enthesitis in ankylosing spondylitis. 11. Gasteiner Symposium on Morbus Bechterew, Bad Hofgastein, Austria, 2003. Lecture.
69
11. Köszönetnyilvánítás. Köszönetet szeretnék mondani Dr. Mikecz Katalin professzornőnek, aki kutatómunkámat irányította, és annak gyakorlati megvalósításában elengedhetetlenül fontos segítséget nyújtott. Köszönet illeti Gergely Péter professzor urat, aki programvezetőként segítette munkámat.
Köszönet illeti mindazon kollégáimat és munkatársaimat, akik munkájukkal, tanácsukkal
hozzájárultak
munkámhoz,
illetve
akiknek
korábbi
munkássága
megteremtette kutatásaim alapját. Külön köszönettel tartozom Dr. Glant Tibor professzor úrnak, Alison Finnegan professzornőnek, Dr. Gál Istvánnak, Dr. Bajnok Évának, Colt Egelstonnak, Bara Sarrajnak, Ludányi Katalinnak, Farkas Bálintnak, Radács Mariannak, Nagyéri Györgynek, Dr. Boldizsár Ferencnek, Dr. Tunyogi Csapó Miklósnak, Győrfy Zsuzsannának, Beata Tryniszawskanak, Jennifer Salenak, Sonja Velinsnek akik munkámhoz elméleti és gyakorlati segítséget nyújtottak.
Külön köszönet illeti Szekanecz Zoltán professzor urat, aki segítséget nyújtott ennek a kutatói ösztöndíjnak megszerzéséhez, és köszönet jár itthoni szakmai felettesemnek, Géher Pál professzor úrnak és munkatársaimnak, hogy szakmai utazásomat támogatták. Amerikai kutatásomat és eredményeim publikációit a National Institute of Health (NIH) pályázati támogatásai fedezték. Kutatási anyagom magyarországi és európai kongresszusokon való publikációit az EULAR ösztöndíj, valamint gyógyszeripari vállalatok támogatásai tették lehetővé.
Végül és nem utolsósorban nagyon hálás vagyok családomnak, feleségemnek, szüleimnek, és feleségem családjának támogatását, hogy a családi háttér biztosításával nyugodt körülmények között végezhettem munkámat.
70
