Rudnóy Szabolcs. Doktori értekezés. Biológia Doktori Iskola (Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Dr

Sejtmagi és kloroplasztisz riboszomális DNS szakaszok vizsgálata a hexaploid búzában és rokonsági körében

Rudnóy Szabolcs Doktori értekezés

Biológia Doktori Iskola (Dr. Erdei Anna) Kísérletes Növénybiológia Doktori Program (Dr. Szigeti Zoltán)

Témavezetı:

Dr. Lásztity Demeter PhD egyetemi docens

Eötvös Loránd Tudományegyetem Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék Budapest 2007

Tartalomjegyzék Bevezetés............................................................................................................... 5 Irodalmi áttekintés .............................................................................................. 7 A búzák rendszertani elhelyezése és általános jellemzése.................................................7 A poliploidia és jelentısége általában, illetve a főfélék családjában (Poaceae) ............10 A búza eredetének és evolúciójának kutatási eredményei..............................................13 A riboszomális RNS gének és szerepük a búza eredetének és evolúciójának kutatásában .........................................................................................................................17

Célkitőzés ........................................................................................................... 23 Anyagok és módszerek...................................................................................... 24 A kísérletekhez felhasznált búzafajok, búzafajták..........................................................24 DNS-extrakció.....................................................................................................................24 A DNS amplifikációja (PCR).............................................................................................25 Gélelektroforézis és RFLP .................................................................................................27 PCR-termékek tisztítása, szekvenálás ..............................................................................28 Speciális PCR és klónozás..................................................................................................30 A szekvenciák kezelése, primertervezés, filogenetikai analízis ......................................32

Eredmények ....................................................................................................... 35 A direkt nrITS szekvenálás eredményei...........................................................................35 A plasztiszban kódolt riboszomális szekvenciák vizsgálati eredményei........................39 A speciális PCR-rel és klónozással elıállított nrITS szekvenciák vizsgálati eredményei ..............................................................................................................................................42

Az eredmények értékelése ................................................................................ 53 A direkt szekvenálások tapasztalatai................................................................................53 Az új módszerrel nyert eredmények értékelése ...............................................................57

Az eredmények összefoglalása, következtetések ............................................ 69 Összefoglalás ...................................................................................................... 71 Summary ............................................................................................................ 72 Publikációs jegyzék ........................................................................................... 73 Köszönetnyilvánítás .......................................................................................... 77 Irodalomjegyzék ................................................................................................ 78

2

Rövidítések jegyzéke bp

bázispár

CDS

„coding sequence” – kódoló szekvencia

cp

citoplazmatikus – pl. cpDNS

CTAB

cetil-trimetil-ammóniumbromid

dNTP

dezoxiribonukleotid-trifoszfát(ok)

EDTA

etilén-diamin-tetraacetát

(M) ée.

(millió) évvel ezelıtt

EMBL

„European Molecular Biology Laboratory”

ETS

„external transcribed spacer” – külsı átíródó elválasztó (szakasz)

FISH

fluoreszcens in situ hibridizáció

IGS

„intergenic spacer” – gének közötti elválasztó (szakasz)

ITS

„internal transcribed spacer” – belsı átíródó elválasztó (szakasz)

kbp

ezer bázispár (kilo-)

Mb

millió bázis (mega-)

mtsi

munkatársai

NCBI

„National Center for Biotechnology Information”

NOR

„nucleolus organizer region” – magvacska organizációs régió

nr

sejtmagi riboszomális (nukleo-) – pl. nrITS, nrDNS

NTS

„non-transcribed spacer” – nem átíródó elválasztó (szakasz)

nu

nukleotid

ORF

„open reading frame” – nyitott leolvasási keret (stop kodontól stop kodonig)

rDNS

riboszomális DNS (régió)

RFLP

„restriction fragment length polymorphism”

SNP

„single nucleotide polymorphism” – egynukleotidos polimorfizmus

sp.

„species” – faj

ssp.

„subspecies” – alfaj

TE

transzpozábilis elem(ek)

3

A dolgozatban fontosabb szerepet kapó taxonok pontos megnevezése

Aegilops L.

Secale cereale L.

Aegilops bicornis (Forsskål) Jaub. & Spach

Triticum L.

Aegilops longissima (Schweinf. & Muschl.

Triticum aestivum L.

in Muschl.) Eig Aegilops searsii Feldman & Kislev ex K. Hammer

Triticum aestivum subsp. aestivum Triticum aestivum subsp. macha (Dekapr. & Menabde) MacKey

Aegilops sharonensis Eig

Triticum aestivum subsp. spelta (L.) Thell.

Aegilops speltoides Tausch

Triticum monococcum L.

Aegilops tauschii Cosson

Triticum monococcum subsp. monococcum

Aegilops tauschii subsp. tauschii

Triticum monococcum subsp. aegilopoides

Aegilops tauschii subsp. strangulata (Eig) Tzvelev

(Link) Thell. Triticum timopheevii (Zhuk.) Zhuk.

Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.

Triticum turgidum L.

Avena L.

Triticum

Bromus L. Festuca L. Lolium L.

turgidum

subsp.

dicoccum

(Schrank ex Schübler) Thell. Triticum

turgidum

subsp.

dicoccoides

(Körn. ex Asch. & Graebner) Thell.

Pinus thunbergii Parl.

Triticum urartu Tumanian ex Gandilyan

Poa pratensis L.

Triticum zhukovskyi Menabde & Ericzjan

4

Bevezetés

„Ekkor a társaimat küldtem, hogy megtudakolják, hogy míly búzafogyasztó férfiak élnek e földön” Homérosz: Odüsszeia (X. 100-101.)

A búza az európai civilizáció kétségkívül legjelentısebb kultúrnövénye. A vadászógyőjtögetı civilizációt néhány ezer év alatt felváltó mezıgazdasági kultúra – mely a KözelKelet felıl észak és nyugat felé haladva lassan, de biztosan meghódította az egész földrészt – elsısorban a búza termesztésén alapult és ez a mai napig nem sokat változott. A termesztett búzák nagy része arról a vidékrıl származik, ahol Nyugat-Eurázsia elsı folyómenti városállamai alakultak, vagyis az úgynevezett „termékeny félhold” területérıl. Ez természetesen nem véletlen egybeesés, a búzatermesztı régiók, mint a növekvı népsőrőség szigetei emelkedtek ki a környezı legeltetı életformájú népek tengerébıl. A mottóban idézett sorok írója számára több, mint kétezer-hétszáz évvel ezelıtt ugyanazt jelentette a búza, mint a legutóbbi évszázadok magyar parasztjának, aki egyszerően az élet szóval jelölte azt. Az elsı kovásztalan lepénytıl a mai péktermékekig hosszú út vezetett, de a búzalisztbıl készülı kenyér napjainkig a legalapvetıbb, mindennapi táplálékunk maradt. Ma a búzatermesztés elsısorban a közönséges búza és azon belül is az ıszi búza kultivációját jelenti világszerte, bár vannak régiók, ahol a durumbúzát is jelentıs területeken vetik és egyéb fajok, illetve fajták is szerephez jutnak, például egyre bıvül a táplálkozástanilag kedvezıbbnek tartott tönkölybúza termesztése is. Egykor azonban az ıszi búza mellett ismert más fajok-fajták is sokkal elterjedtebbek voltak és a helyi viszonyoknak megfelelıen a fentiek mellett az alakor és a tönkebúzát is számos helyen ismerték és termesztették, sıt, termesztésük korábban kezdıdött, mint a közönséges búzáé. Jelentıségét tekintve nem meglepı, hogy mióta létezik növénytani tudomány, a búza állandóan a kutatás homlokterében állt, hiszen egyrészt kéznél volt, mint vizsgálati objektum, másrészt megismerése, tulajdonságainak feltérképezése és megváltoztatása, az elınyös változatok kihasználása nagyon is konkrét gazdasági elınyöket jelent. A ma fı kenyérgabonánkként termesztett közönséges búza allohexaploid élılény, vagyis testi sejtjeinek sejtmagjaiban három különbözı genomot hordoz, azaz három teljes, dupla kromoszómaszerelvényt. Amint ez ismertté vált, fölvetıdött a kérdés, hogy mely diploid fajok 5

lehettek az ısei a hexaploid búzának, a számos ma is ismert közelrokon faj közül melyek vehettek részt kialakulásában. Ennek ismerete a nemesítés és a génbankok megırzése szempontjából sem jelentéktelen. A hexaploid búza három genomját A, B, illetve D betőkkel jelölik és az A, ill. a D genom eredetére egyre több konkrét bizonyítékot sikerült találni. A B genom eredete azonban – dacára annak, hogy a közönséges búza a Föld legnagyobb területen termesztett növénye, és emiatt számtalan tudományos mőhely vizsgálja a legkülönbözıbb aspektusokból – a mai napig vita tárgyát képezi. Szándékunkban állt a hexaploid búza eredetérıl, evolúciójáról, rokonsági viszonyairól az utóbbi idıkben kifejlesztett molekuláris biológiai módszerekkel a lehetı legtöbbet megtudni, az A és D genomra vonatkozó eddigi eredményeket a mi módszereinkkel megerısíteni, vagy cáfolni, és a B genom eredetét tisztázni, illetve új eredményekkel megvilágítani. Ezek a célok vezettek elsısorban e disszertációban kifejtett munka elvégzéséhez.

6

Irodalmi áttekintés

A búzák rendszertani elhelyezése és általános jellemzése Búza néven elsısorban a Triticum nemzetség fajait nevezzük, de tágabb értelemben a közeli rokon Aegilops nemzetség fajait is szokták ezzel a névvel illetni. A búzák az egyszikő növényeken belül a főfélék családjába tartoznak, az említett két nemzetség részletes rendszertani besorolása az NCBI taxonómiai oldala (Benson és mtsi 2000) szerint a következı: Viridiplantae (Zöld növények)

Ország Törzs

Streptophyta Embryophyta Magnoliophyta (Virágos növények) Liliopsida (Egyszikőek)

Osztály Rend

Poales Poaceae (Főfélék)

Család Alcsalád

Pooideae Triticeae (Búzafélék)

Tribusz

Aegilops Triticum Számos csak vadon élı, illetve termesztett Aegilops és Triticum faj ismert, bár meg kell jegyezni, hogy termesztésben tudomásunk szerint inkább az utóbbi nemzetség fajait alkalmazta az emberiség. Mivel nagyon sok, egymáshoz nagyon hasonló forma létezik, rendszerük, felosztásuk bonyolult és sokszor változott, a jelenleg legszélesebben elismert osztályozás a korábbiaknál kevesebb fajt és több alfajt, illetve változatot tartalmaz. Így a Triticum nemzetségben hat, az Aegilops nemben 22 fajt különböztetnek meg (1.-2. táblázat). Mindkét nemzetség vadon élı fajai elsısorban Délnyugat-Eurázsia száraz, füves pusztáin ıshonosak, vagyis a Földközi-tenger keleti medencéjének térségétıl, Kisázsia és a Kaukázusontúl területein át, a Kaszpi-tengertıl délre és keletre esı fennsíkokig és sztyeppékig. Egynyári, kalászos főalkatú növények. A Triticum fajok népélelmezési

7

jelentısége közismert, míg az Aegilops-ok között több fontos gyomfaj, illetve legeltetı kultúrákban jelentıs takarmányfaj található. Szekciók Dicoccoidea (tetraploidok)

Monococcon (diploidok) T. urartu

A

A T. monococcum ssp. aegilopoides ssp. monococcum

AB T. turgidum ssp. turgidum ssp. carthlicum ssp. dicoccum ssp. durum ssp. paleocolchicum ssp. polonicum ssp. turanicum ssp. dicoccoides

Triticum (hexaploidok) ABD T. aestivum ssp. aestivum ssp. compactum ssp. macha ssp. spelta ssp. sphaerococcum T. zhukovskyi

AAG

AG T. timopheevii ssp. timopheevii ssp. armeniacum 1. táblázat. A Triticum nemzetség fajainak és alfajainak felosztása Van Slageren (1994) szerint. A vastagítottan kiemelt fajnevek után a haploid genomok betőjele látható.

Aegilops

Szekciók Comopyrum Cylindropyrum

Sitopsis

Vertebrata

umbellulata U comosa M markgrafii C speltoides S tauschii D triuncialis UC uniaristata N cylindrica CD bicornis Sb ventricosa DN kotschyi US longissima Sl crassa DM/DDM peregrina US searsii Ss juvenalis DMU biuncialis UM sharonensis Ssh vavilovii DMS columnaris UM geniculata UM neglecta UM/UMN 2. táblázat. Az Aegilops nemzetség fajainak felosztása Hammer (1980), Kimber és Sears (1987) és Van Slageren (1994) alapján a GrainTax projekt (2001) szerint. A táblázatban csak a fajneveket tüntettem föl, a haploid genomok betőjeleivel együtt.

A felsı ıskıkor idején az utolsó eljegesedés visszahúzódásával (14-12000 évvel ezelıtt) jelentıs klimatikus változások álltak be. Melegebbre és nedvesebbre fordult az éghajlat

8

Európában és a Közel-Keleten is, és az emelkedı csapadékmennyiség hatására a vegetáció is kezdett átalakulni. A főfélék még szélesebb körben terjedtek el, köztük a vad búza, árpa és rozs fajok. A kor vadászó-győjtögetı emberei 12-11000 évvel ezelıtt kerülhettek szorosabb kapcsolatba a vad búzákkal, amelyek a diploid alakor (T. monococcum) és a tetraploid tönkebúza (T. turgidum) vad alfajai lehettek (Salamini és mtsi 2002). Eleinte valószínőleg csak „arattak”, késıbbi találmány lehetett a tudatos termesztés, amellyel párhuzamosan szinte azonnal megindult az elınyösebbnek ítélt genotípusok szelekciója is. Az elsı mezıgazdák településeit korábbi leletek alapján Észak-Mezopotámia, illetve a Jordán folyó völgye területén feltételezték (Zohary és Hopf 1993), de újabb eredmények ettıl északabbra, a mai Törökország délkeleti vidékén emelkedı Karacadag-hegység környékére helyezik a búzatermesztés bölcsıjét (Heun és mtsi 1997).

1. ábra. A termékeny félhold

Az alakor és a tönke búzák mellett a rozs, árpa, lucerna, lencse, borsó, csicseriborsó, bükköny és len háziasítása és termesztése is hamar megindult (Zohary és Hopf 1993) és kb. 11000 éves leletek tanúsága szerint a mezıgazdaság viszonylag rövid idı alatt elterjedt a Közel-Kelet termékeny vidékein, sıt, kezdett kisugározni onnan, amikor egy új hibrid növényfaj jelent meg kb. 7000-10000 évvel ezelıtt, a hexaploid búza.

9

A poliploidia és jelentısége általában, illetve a főfélék családjában (Poaceae) Azokat az élılényeket, amelyek az emberhez hasonlóan testi sejtmagjaikban dupla kromoszómaszerelvényt hordoznak, diploid szervezeteknek nevezzük. Ha egy élılény testi sejtjeiben „többszörösen dupla” genommal rendelkezik, poliploidnak nevezzük, a „genomhalmozás” mértékétıl függıen lehet pl. tetraploid (négyszeres), hexaploid (hatszoros), oktoploid (nyolcszoros kromoszómakészlet), de természetesen nem csak páros számú többszörözıdés lehetséges, így a triploid szervezet, vagy szövet sejtmagja minden kromoszómából három homológ példányt hordoz. Ha a kromoszómakészletek azonos eredetőek, autopoliploidiáról beszélünk, ilyen például az autotetraploid dohány, különbözı eredet esetén a szervezet allopoliploid, amire példa lehet többek közt az allohexaploid búza. A poliploidia jelensége a növényvilágban – szemben az állati szervezetekkel – eléggé elterjedt. A harasztok, a nyitvatermık, az egy- és kétszikőek között is számos poliploid fajt találunk (Lawton-Rauh 2003), kultúrnövényeink között pedig különösen magas arányban fordulnak elı, példa rá a búzákon kívül az alma, banán, burgonya, cukornád, dohány, földimogyoró, gyapot, kávé, zab, stb. A poliploid növények gyakran nagyobbra nınek, több termést produkálnak, viszont sokszor gyengébb a reproduktív szaporodásuk és a természetes túlélésük (Zeven 1979). A poliploidia botanikai jelentısége azonban ezen jóval túlmutat: becslések szerint a mai zárvatermık legalább 50%-át, de lehetséges, hogy több, mint 70%-át evolúciós története folyamán egyszer, vagy többször érintette a poliploidia (Soltis és Soltis 1995, Wendel 2000). A természetben elıforduló allopoliploid növények nagy elterjedtsége egyrészt arra utal, hogy a poliploid hibridek szelektív elınyökkel bírnak diploid ıseikkel szemben, másrészt megmutatja, hogy a poliploidia jelentıs fajképzıdési folyamat (Liu és Wendel 2003). A mai diploid növényfajok közül is sok rejtetten hordozza régebbi poliploidizáció és az azt követı diploidizációs divergencia nyomait, sıt akár több ilyen ciklikus eseménysorozat is lejátszódhatott a részvételükkel. Ezért csak az idıben hozzánk legközelebbi poliploidizációs eseményeket ismerhetjük fel, illetve a következményeikként létrejött élılényeket, mint poliploidokat. Ilyenek Wendel (2000) szerint például a búza, szója, burgonyafélék, cukornád és gyapot. A poliploidia, gének többszörözıdésén keresztül, genom-szintő genetikai redundanciához vezet, s lehetıséget teremt számtalan genetikai kölcsönhatásra. Így lehetıvé teszi növényfajok számára új funkciók kifejlıdését és az élıhelyekhez és környezeti

10

feltételekhez való szélesebb körő alkalmazkodást, amit részben alá is támaszt az a megfigyelés, hogy az (allo)poliploidizációt gyakran követi az alaktani változatosság növekedése (Liu és Wendel 2003). Korábban a poliploid fajokat evolúciós zsákutcának vélték, illetve egy másik hagyományos elképzelés szerint csak az allopoliploidia volt jelentıs az evolúcióban, az autopoliploidia nem. Az újabb adatok megmutatták, hogy az autopoliploidok is gyakoriak, és hogy mindkét típusú poliploid genetikai diverzitása figyelemreméltóan magas. Észrevették, hogy az autopoliploidok kromoszóma kettızıdése növekedést eredményez az enzimek változatosságában, a heterozigózisban és allélok diverzitásában (Soltis és Soltis 1995). A poliploidizáció fajtájától függetlenül a fı következmény a szekvenciák megkettızıdése. A poliploidizáció következtében duplikálódott gének megtarthatják eredeti, vagy ahhoz hasonló funkciójukat, divergálhatnak, ill. az egyik kópia „elnémulhat” mutációs, vagy epigenetikai események következményeként. Újabb eredmények szerint az allopoliploidizációt gyakran kísérik gyors és idınként evolúciósan is konzervatív epigenetikai változások, mint pl. citozin metiláció, gének elnémítása, és a transzpozábilis elemek (TE-k) újraéledése (Liu és Wendel 2003). Li és mtsi (2004) kimutatták, hogy a TE típusok többségének kópiaszáma nı a poliploidizáció során és más eredmények is azt mutatják, hogy a transzpozíciós aktivitás, mintegy a poliploidizációra adott gyors válaszként, erısen megnı a poliploid növényfajokban (Kashkush és mtsi 2002, Mizumoto és mtsi 2003). Többek közt ennek a ténynek is tulajdonítják Li és mtsi (2004) a poliploid genomok méretének nem-additív növekedését, bár meg kell jegyezni, hogy több szerzı is a genomméret nem-additív csökkenésérıl számol be (Wendel 2000, Ozkan és mtsi 2003, Ma és mtsi 2004), amit elsısorban a poliploidizáció után lejátszódó kromoszomális átrendezıdésekkel magyaráznak. Mindenesetre figyelemreméltó az összefüggés a poliploidia ismeretében a genomok mérete és az ismétlıdı szekvenciák (vagyis fıleg TE-k) aránya között a búza, a kukorica és a rizs genetikai állományát tekintve (3. táblázat). búza Genom mérete (Mb) 17000 Ismétlıdı/transzpozábilis elemek aránya (%) 80 Kevéskópiás szekvenciák (pl. gének) aránya (%) 15

kukorica 2500 50 42

rizs 430 16 70

3. táblázat: Ismétlıdı és kevéskópiás szekvenciák aránya, ill. a genomok mérete a búza, a kukorica és a rizs sejtmagi genomjaiban. (Hozzávetıleges adatok) Paterson és mtsi (2003), valamint Li és mtsi (2004) alapján.

11

Evolúciósan is stabil allopoliploid növényfaj többnyire (bár nem feltétlenül) közeli rokon fajok hibridizációjával születik (Ma és Gustafson 2005) hiszen a szaporodási folyamatok kompatibilitása és a genomok összehangolhatósága fontos faktor. A főfélék fajai is hajlamosak a poliploidok képzésére, leggyakrabban egy nemzetségen belül, de ismeretesek intergenerikus allopoliploidok is, pl. Festuca (csenkesz) és Lolium (vadóc) fajok között (Pasakinskiene és mtsi 1997, Zwierzykowsky és mtsi 1998), de ilyen a közönséges búza is. Amint a 2. ábrán látható, a Triticeae csoport diploid fajai ugyancsak kiterjedt auto- és allopoliploidizációs hálózatot hoztak létre, nagyszámú intraspecifikus és intergenerikus hibrid kialakításával (Lilienfeld 1951, Dewey 1984, Hsiao és mtsi 1986, Kellogg és mtsi 1996).

2. ábra. A Triticeae csoport poliploidizációs rokonsági hálózata Kellogg és mtsi (1996) alapján. „2×”: diploid, „4×”: tetraploid, „6×”: hexaploid, „8×”: oktoploid. A nemzetségnév után zárójelben látható a genom betőjele, az elsı bető az anyai genomot jelöli (az X és Y genomok eredete nem tisztázott).

Ilyen intergenerikus hibridek az allopoliploid búzafajok is (T. turgidum, T. timopheevii, T. aestivum és T. zhukovskyi), amelyek eredetét, az ıket alkotó genomok szintjén, a citogenetikai módszertár kialakulása óta nagy intenzitással tanulmányozzák.

12

A búza eredetének és evolúciójának kutatási eredményei A poliploidizáció mellett a domesztikáció is olyan tényezı, mely jelentısen befolyásolhatja a növényi genom evolúcióját. Egyrészt segítheti bizonyos (akár poliploid) fajok elterjedését, vagy akár keletkezését is, másrészt, mivel relatíve kevés egyedre irányul, többnyire azt eredményezi, hogy a termesztett növényfajt kisebb genetikai diverzitás jellemzi a vad ısökhöz képest (Tanksley és McCouch 1997, Chantret és mtsi 2005). Harmadszor, a domesztikáció mezıgazdasági szempontból fontos specifikus gének és allélok elterjedéséhez vezet, amelyek a lényegi különbséget adják a kultúrnövény és vad rokonai között. A domesztikáció a búzák evolúciójában is nagyon fontos szerepet játszott (3. ábra).

3. ábra. A közönséges búza feltételezett származásának egyszerősített sémája. („M”: millió; „ée.”: évvel ezelıtt) Bálint és mtsi (2000), Huang és mtsi (2002), ill. Chantret és mtsi (2005) alapján.

A negyedik legnagyobb virágos növénycsaládként számon tartott Poaceae korát kb. 70 millió évre becsülik, az árpát, búzát és rozst is tartalmazó Triticeae csoport kialakulását kb. 20-30 millió évvel ezelıttre teszik. A Triticum/Aegilops radiáció ideje jóval késıbbi folyamat

13

lehetett, a különbözı – meglehetısen tág határok között mozgó – becslések alapján 2,5-6 millió évvel ezelıtt alakulhattak ki azok az elsı ısi diploid fajok, amelyek késıbbi hibridizációikkal a közönséges búza létrejöttéhez vezettek (Kellogg 2001, Gaut 2002, Huang és mtsi 2002, Guyot 2004, Chantret és mtsi 2005). A búza A, B és D genomjai két spontán hibridizációs lépésben egyesülhettek. Az elsı lépésben (0,5-3 M ée.) egy, az A genomot képviselı Triticum faj és a B genomot hordozó ısi Aegilops képeztek egy tetraploid hibridet, mely feltételezések szerint azonos lehet a mai tönkebúza vad alfajával (T. turgidum ssp. dicoccoides). A B genomú faj lehetett a citoplazmadonor, tehát a turgidum/aestivum poliploid vonalon tıle származnak az anyai ágon öröklıdı sejtszervecskék, a plasztisz és a mitokondrium is. Liu és mtsi (2003) a fentebb megadottnál fiatalabbra becsülik az új fajt, számításaik szerint 230.000-1.350.000 ée. történhetett a tetraploidizáció. Korábban azt feltételezték – fıként citogenetikai adatok alapján –, hogy az A genomot adó ıs az alakor búza vad alfaja (T. monococcum ssp. aegilopoides) lehetett (pl. Gill és Chen 1987), de az újabb kutatások eredményei arra mutatnak, hogy a vele közeli rokon T. urartu volt inkább a donor, egyébiránt a másik tetraploid faj, a T. timopheevii esetében is. Dvořák és mtsi (1992) DNS-hibridizációs módszerrel, Ciaffi és mtsi (1997) a gliadin tartalékfehérje polimorfizmusának feltérképezésével, illetve Sallares és Brown (1999) genomspecifikus PCR technikával bizonyították, hogy az említett két tetraploid faj A genomja a T. urartu fajtól származik. A B genom eredete sokkal több megválaszolatlan kérdést vetett föl. Arra már korán fény derült, hogy az Aegilops nemzetség Sitopsis szekciójának fajai (2. táblázat) állnak legközelebb a mai búza B genomhoz, de az öt idetartozó faj mindegyike fölmerült, mint lehetséges donor (Bálint és mtsi 2000). A késıbbi munkák (pl. Dvořák és Zhang 1990, Mat Daud és Gustafson 1996) arra utaltak, hogy az Ae. speltoides felé billen a mérleg, de Belyayev és mtsi (2000) közel egyenlı mértékő in situ genomi DNS-hibridizációt találtak az Ae. speltoides, Ae. longissima és Ae. searsii fajok, ill. a tetraploid T. turgidum ssp. dicoccoides között, míg Liu és mtsi (2003) olyan kevéskópiás nem kódoló szekvenciát mutattak ki a B genomot hordozó tetra- és hexaploid búzavonalakból, amely csak az Ae. searsii-ben volt meg. A jelenlegi összesített álláspont a következı két pontban foglalható össze. Egyrészt a mai B genom annyira különbözik a Sitopsis szekció fajaitól, hogy egyértelmően nem állapítható meg, melyiküktıl származik, talán egy már nem is létezı ısi rokonuktól, noha legjobban az Ae. speltoides S genomjához hasonlít. Másrészt nem kizárt,

14

hogy a B genom polifiletikus eredető, vagyis több független vonal rekombinációjának eredménye. (Blake és mtsi 1999, Huang és mtsi 2002). A hexaploid közönséges búza felé vezetı második hibridizációs lépés (7000-9500 ée.) már az elızıekben vázolt módon létrejött tetraploid faj részvételével zajlott, de annak valószínőleg egy új változatával. A tönkebúza 10-12000 ée. háziasított, termesztett alfaja, a T. turgidum ssp. dicoccum lehetett a citoplazmadonor, tehát a nıivarú résztvevı, és a D genom ıse, a pollenadó, minden bizonnyal egy újabb Aegilops faj, az Ae. tauschii, ahogy azt számos citogenetikai, növénykórtani és molekuláris biológiai eredmény bizonyítja (Bálint és mtsi 2000). Az Ae. tauschii két alfaját különböztetik meg, ezek a ssp. tauschii és a ssp. strangulata. A két alfaj feltételezett szerepe az új faj képzıdésében vita tárgya, amely érinti a búza kialakulási helyének kérdését is. Számos polimorf izoenzim esetében csak a ssp. strangulata allélját találták meg a búzában (Caldwell és mtsi 2004), aminek alapján korábban azt feltételezték, hogy ez az alfaj lehetett a D genom donorja, de e hipotézis kizárólagosságát újabb adatok nem támasztják alá. Talbert és mtsi (1998) arra az eredményre jutottak, hogy a két alfaj egyaránt szerepet játszott a mai búza kialakulásában és hogy legalább két független eredete van a poliploid D genomnak. Lelley és mtsi (2000) alátámasztják a D genom polifiletikus eredetét és szintén nem támogatják azt a véleményt, hogy a ssp. strangulata volna a fı donor; egyúttal a mai Grúziát és környékét nevezik meg a búza legvalószínőbb kialakulási helyének, mert itt találták a legtöbb (szám szerint 3) régió-specifikus allélt, mely az Ae. tauschii és a kenyérbúza génállományában egyaránt elıfordul. (Itt egyébként adataik szerint a ssp. strangulata nem ıshonos.) Hasonló eredményekre jutottak Caldwell és mtsi (2004) is. Az ısi pelyvás jelleget hordozó T. aestivum ssp. spelta (tönköly) és ssp. macha alfajokat tartják többnyire a hibridizáció közvetlen eredményének, s egyúttal a többi alfaj (1. táblázat) ısének, bár egyes vélemények szerint csak az ázsiai tönköly tekinthetı ısi formának, az európai spelta inkább egy újabb kelető hibrid lehet, mely egy T. aestivum vonal és a T. turgidum ssp. dicoccum közremőködésével jöhetett létre (Yan és mtsi 2003); egyébként a két tönköly változat elkülönülı eredetét izoenzim-vizsgálatok is alátámasztják (Bálint és mtsi 2000). A mai állományok genetikai vizsgálatai alapján Grúzia, Örményország, ill. Iránnak a Kaszpi-tenger délkeleti partvidékéhez közeli területei tőnnek legnagyobb eséllyel a közönséges búza szülıföldjének (Dvořák és mtsi 1998, Lelley és mtsi 2000). Lehetséges, hogy növénycsoportok mai elterjedése, következésképpen génföldrajzi térképe nem

15

szükségszerően esik egybe a nyolcezer évvel ezelıttivel, mégis általános a vélemény, hogy a Kaukázusontúl – Kaszpi-vidék lehet a modern búza kialakulási helye. A pontos helyszín bizonytalanságában a nyilvánvaló nehézségeken túl az is szerepet játszhat, hogy a sikeres poliploidizációs hibridizáció nagy valószínőséggel nem csak egyszer játszódott le, vagyis az AABBDD genomú búza nem csak egyszer alakult ki. Soltis és Soltis (1995) megállapítása szerint egy poliploid faj ugyanazon diploid ısökbıl többször, függetlenül is létrejöhet, és ez inkább szabály, mint kivétel. A többszörös poliploidizáció erısebben gazdagíthatja a poliploid faj génállományát, mert az újabb és újabb keresztezıdések és hibridizációk következtében génáramlás mehet végbe. Ez természetesen jelentısen megnehezítheti az evolúciós történet megfejtését, hiszen különbözı markerek vizsgálata eltérı eredményekre vezethet.

16

A riboszomális RNS gének és szerepük a búza eredetének és evolúciójának kutatásában Az evolúciós kutatások terén, molekuláris szinten a fehérjék és nukleinsavak szekvenciája és szerkezete áll az érdeklıdés középpontjában. Mivel egyrészt a génekben mind a fehérjék, mind az RNS-ek szekvenciája kódolva van, másrészt az RNS-ekkel való bánásmód sok buktatót rejt magában, ezért a DNS vizsgálata terjedt legdinamikusabban világszerte. Ebben nagy szerepet játszanak az utóbbi két évtizedben kifejlesztett PCR (polymerase chain reaction) technikák. A PCR készülékek segítségével a DNS-molekulák adott szakaszai nagy számban felszaporíthatók (amplifikálhatók), majd különféle módszerekkel vizsgálhatóak. A búza eredetének és evolúciójának kutatásában számos módszert alkalmaztak már eddig is. Az elızı fejezetben említettem pl. a citogenetikai módszereket, a DNS-hibridizációt, az izoenzim-vizsgálatokat, stb. Az utóbbi évtizedek genetikai kutatásaiban nagy hangsúlyt kaptak a riboszomális RNS (rRNS) gének, amelyek több szempontból is ideális alanyai az ilyen típusú genetikai vizsgálatoknak (Hamby és mtsi 1988). Azon DNS-szakaszok szekvenciái adnak összehasonlítható eredményeket, amelyek különbözı taxonokban ugyanazt a funkciót látják el, nagyjából hasonló az evolúciós sebességük és egy kópiában vannak jelen egy genomban, vagy úgy viselkednek. Néhány egyéb gén mellett az rRNS molekulákat kódoló rDNS régiók tesznek eleget legjobban ezen kritériumoknak (Hamby és Zimmer 1991). Riboszomális RNS gének a sejtmagban, a kloroplasztiszban és a mitokondriumban is jelen vannak a növényi genetikai állományon belül. Elnevezésük Swedberg-féle centrifugális ülepedési állandóik (S) szerint történik (4. táblázat).

Sejtmag

Plasztisz

Mitokondrium

név

méret (nu)

név

méret (nu)

név

méret (nu)

5S 5,8 S 18 S 26 S

120 164 1810* 3388*

4,5 S 5S 16 S 23 S

95 121 1492 2888

5S 18 S 26 S

122 1955 3467

4. táblázat. A búza sejtmagi, plasztisz és mitokondriális rRNS típusainak felosztása és mérete (nukleotid). (Van Campenhout és mtsi 1998; Ogihara és mtsi 2002, 2005). *becslés (pontos, publikált adat nem hozzáférhetı)

17

Gyakorlatilag az összes növényi rDNS-fajtáról elmondható, hogy több példányban van jelen a genomban. A nukleáris NOR (nucleolus organizer region) rRNS gének egy, vagy több kromoszómán is elhelyezkedhetnek, több száz – több ezer tandemismétlıdı kópiát alkotva. Egy-egy ilyen kópiáról – amely 18S-5,8S-26S sorrendben tartalmazza a géneket – a transzkripció során egyetlen RNS molekula íródik át, amelybıl a nem kódoló elválasztó szakaszok (spacer) utólagos érési folyamat során kivágódnak és elemésztıdnek. Az átíródó elválasztó szakaszt ITS (internal transcribed spacer) névvel jelöljük; a transzkripciós egységek között elhelyezkedı IGS szakasz (intergenic spacer) nagy része nem íródik át (NTS: non-transcribed spacer). A növényi NOR rDNS régió szervezıdésérıl a 4. ábra ad áttekintést.

4. ábra. A növényi NOR rDNS régió szervezıdése vázlatosan. A szürkén satírozott rész egy átíródó szakaszt jelöl, melyrıl egységes, késıbb feldarabolódó transzkriptum készül. „ETS”: external transcribed spacer; a többi jelölést lásd a szövegben. Az ábra a gének és elválasztó szakaszok valódi méretarányait – a jobb áttekinthetıség érdekében – torzítva mutatja. (Hamby és Zimmer 1988 alapján)

Azt, hogy mely lokusz milyen taxonómiai kategóriák összehasonlítására alkalmas, elsısorban bázissorrendjének változékonysága szabja meg. Az rDNS kódoló régiói, az rRNS gének konzervatívabbak, evolúciójuk sokkal lassúbb, mint a nem kódoló elválasztó szakaszoké. Az utóbbiak közül az ITS, bár nem kódol, szekvenciáján keresztül jelentıs hatással bír a transzkripciót követı érési-kivágódási folyamatokra, ezért valamivel konzervatívabb, mint az IGS, amely az rDNS régió legváltozékonyabb szekvenciatípusa. A nem kódoló régiók közül leggyakrabban az ITS szakaszt (ITS1+5,8SrDNS+ITS2) vizsgálják, amely fıként faj-, esetleg nemzetség-, ill. populáció szinten szolgáltat információt (Baldwin

18

és mtsi 1995). Utóbbi mőben a szerzık összefoglalják az addigi növényi nrITS-alapú munkákat és megállapítják, hogy e marker hasznos sok zárvatermı család rendszertanában. A magas kópiaszám ellenére, a gyors együttes evolúció (ld. alább) hatására, a kópiák általában homogének; ahol mégis vannak eltérı paralógok, ott klónozást javasolnak a probléma feloldására. Véleményük szerint az ITS szekvenciák változásainak nagy része pontmutáció, és viszonylag kicsi az inszerciók/deléciók (indelek) aránya. A markert család alatti kategóriákban javasolják alkalmazni. Álvarez és Wendel (2003) öt év adatait összegyőjtve kijelentik, hogy 244 növényrendszertani dolgozat kétharmada használja az ITS szekvenciákat, egyharmada pedig csak ITS szekvencia vizsgálatokon alapul. A régió elınyeiként hozzák föl a kétszülıs öröklıdést, az univerzalitást, mely megkönnyíti a kísérletes munkát, a genomon belüli uniformitást, nemkülönben a genomok közötti variabilitást és végül a kis funkcióbeli evolúciós kényszert. Ugyanakkor mind Álvarez és Wendel (2003), ill. Bailey és mtsi (2003) felsorolnak több hátrányos tulajdonságot is (pl. lehetıség paralógok, kimérák, pszeudogének képzıdésére; homopláziát okozó kiegyenlítı báziscserék, stb.). Ajánlják a klónozást és a szekvenciák körültekintı felhasználását, megelızendı az olyan eseteket, mint pl. a Mayol és Rosselló (2001) által idézett két munka Quercus fajok analízisénél, ahol a „módszertani különbségek” eltérı eredményekhez vezettek. A NOR génjein túl az 5S rRNS gének, és az IGS-hez hasonló, át nem íródó elválasztó szakaszaik (NTS) is sokkópiás tandemismétlıdı sorozatokat alkotnak, a növényi genom egy, vagy több kromoszómáján elhelyezkedve. Az 5S régió a NOR-tól többnyire független (Hasterok és mtsi 2001), de pl. az Arabidopsis thaliana (Murata és mtsi 1997) és a rizs (Shishido és mtsi 2000) esetében ugyanazokon a kromoszómákon lokalizáltak. Újabb eredmények szerint a legtöbb vizsgált növényben két (vagy több) 5S rDNS-család fordul elı, egy hosszabb és egy rövidebb, amelyek elsısorban az NTS hosszúságában térnek el egymástól (Cloix és mtsi 2000, Singh és Singh 2001, Matyasek és mtsi 2002). Az organelláris genomok cirkuláris DNS-molekuláján általában csak néhány sorozat rRNS gén található, de az organellumok sejtenkénti nagy száma miatt gyakorlatilag itt is sokkópiás rendszerrıl beszélhetünk. A mitokondriális genom két, ill. három kópiában tartalmazza az rRNS géneket, míg a plasztisz két sorozatot hordoz, egymással ellentétes leolvasási irányban (Ogihara és mtsi 2000, 2002, 2005). A plasztiszra jellemzı rRNS gének (4. táblázat) a következı 5’→3’ sorrendben helyezkednek el a zöld színtest cirkuláris DNSén: 16S, 23S, 4,5S, 5S gének, de köztük nem csak elválasztó szakaszok vannak, hanem a 16S és a 23S gének között a trnI és trnA jelő tRNS gének is lokalizáltak (5. ábra).

19

5. ábra. A búza kloroplasztisz genom vázlatos szerkezete, az rRNS gének elhelyezkedésével (Ogihara és mtsi 2000, 2002; SHIGEN project 2006 alapján).

A multigén családok génjei általában fajon belül is divergáción mennek keresztül az evolúció során. Új gének képzıdésének egyik gyakori módja, hogy a duplikációkkal és egyéb módon kialakuló multigén családok tagjai mutációk rögzülésével új funkciók kódolásáért lesznek felelısek. Az rRNS gének esetében azonban más a helyzet (Arnheim és mtsi 1980). A sok kópia ellenére az egyféle sorozatok tagjai többnyire nem különböznek egymástól, s ez különösen igaz a génekre. Az együttes evolúciónak nevezett folyamat homogenizáló hatása következtében a diploid élılények jó részében az nrDNS régiók még az ITS szakaszokban sem hordoznak polimorfizmust, más részükben egyeden belül nem, de a fajon belül megfigyelhetı néhány százaléknyi polimorfizmus (Baldwin és mtsi 1995). Az együttes evolúció két legjelentısebb ismert mechanizmusa az egyenlıtlen átkeresztezıdés és a génkonverzió (Elder és Turner 1995). A poliploidokban bonyolultabb a folyamat: a szülıi rDNS-mintázatok megmaradhatnak (evolúciósan fiatal hibridek), ill. változatos módon felülírhatják egymást, pl. Wendel és mtsi (1995) öt, azonos eredető allotetraploid gyapotfaj

20

vizsgálatakor négyben az egyik, egynél pedig a másik diploid szülıfajra jellemzı rDNSmintázatot találták. A riboszomális DNS régiók a búza eredetének és evolúciójának kutatásában is nagy szerepet kaptak. Elsısorban a nukleáris régiókat elemezték, kevésbé kutatott a kloroplasztisz rDNS-e és alig a mitokondriumé. Mindazonáltal ma már ismert a búza teljes plasztisz és mitokondriális genomja is, vele természetesen az rDNS régiók. A sejtmagban a NOR lokuszainak felderítése fıként in situ hibridizációs, ill. deléciós térképezéses módszerrel történt. Mai ismereteink szerint a 18-5,8-26S sorozatok nagy része két lokuszban (Nor-B1 és Nor-B2) összpontosul, de léteznek kisebb kópiaszámú, úgynevezett minor Nor lokuszok is (5. táblázat).

Kromoszómakar* Nor lokusz 1BS 6BS 5DS 1AS 7DL 5AL 1BL 3DS

Nor-B1 Nor-B2 Nor-D3 Nor-A9 Nor-D4 Nor-A7 Nor-B6 Nor-D8**

Kópiaszám (2C) (becslés) 1300-2600 500-5637 130-400 100-140 kevés kevés kevés kevés

Hivatkozás Flavell és O'Dell 1979 Flavell és O'Dell 1979 Lassner és mtsi 1987 Mukai és mtsi 1991 Mukai és mtsi 1991 Jiang és Gill 1994 Jiang és Gill 1994 Jiang és Gill 1994

5. táblázat. A Nor lokuszok kromoszomális elhelyezkedése a búzában a becsült kópiaszámokkal. *„S”: rövid kar, „L”: hosszú kar a kromoszómán. **Csak a Wichita búzafajtában mutatták ki. Dubcovsky és Dvořák 1995, ill. Luo és mtsi 1998 alapján.

Az A genom Nor lokuszainak térképezése (Gerlach és mtsi 1980, Miller és mtsi 1983, Dubcovsky és Dvořák 1995) és összevetése a T. aestivum adataival hozzásegített a minor Nor lokuszok felderítéséhez és a T. urartu A genom donor szerepének tisztázásához (Sallares és Brown 1999). A NOR legvariábilisabb része, az IGS szakasz vizsgálata megmutatta, hogy a két fı NOR (1B és 6B kromoszómák, ld. 5. táblázat) eltérı allélok formájában lehet jelen a T. aestivum különbözı változataiban, ugyanakkor egyeden belüli változékonyságot nem találtak (May és Appels 1987). A Nor3 lokusz IGS régiója és egyéb markerek vizsgálatával Dvořák és mtsi (1998) eredményei segítettek megvilágítani a búza D genom eredetét. A B (S) genomot hordozó fajokból kevesebb eredménnyel rendelkezünk az IGS régiót, vagy a NOR-t illetıen, s

21

ezek sem sokkal járulnak hozzá a B genom eredetének tisztázásához (Sallares és Brown 1999, Baum és mtsi 2001). Minthogy az nrITS szakasz az utóbbi idıben a leggyakrabban használt evolúciós és filogenetikai marker lett (Álvarez és Wendel 2003), nem meglepı, hogy a búzafélék rokoni kapcsolatainak felderítésében is többször alkalmazták ezt a régiót. A közönséges búza és az Ae. speltoides ITS régióját elsıként Chatterton és mtsi (1992a, b) szekvenálták és 7, ill. 13 bp különbséget állapítottak meg az ITS-1, ill. az ITS-2 szakaszban a két faj közt. Ugyanezen szerzık késıbb két olyan tanulmányt publikáltak, amelyek további alapot adtak az ITS régió felhasználásához a búzafélék körében. 10 főféle ITS szekvenciáját feldolgozó munkájukban (Hsiao és mtsi 1994) hasznosnak és alkalmasnak ítélik az ITS régiót az egyszikőek közelrokon fajainak vizsgálatához; a Triticeae csoport 30 egygenomú, diploid fajának összevetésével (Hsiao és mtsi 1995) pedig arra az eredményre jutottak, hogy az összes vizsgált genom monofiletikus; úgyszintén az összes egynyári faj (köztük a Triticum és Aegilops fajok) egy monofiletikus, „mediterrán csoportot” képez. Zhang és mtsi (1998) négy Aegilops faj ITS-1 és ITS-2 szekvenciáit hasonlították össze, majd néhány évvel késıbbi munkájukban (Zhang és mtsi 2002) már a két tetraploid búzafaj és több, evolúciójuk szempontjából fontos Aegilops faj ITS szekvenciájának analízisét végezték el. Arra a konklúzióra jutottak, hogy az Ae. speltoides filogenetikai értelemben kissé kilóg a Sitopsis csoportból, ugyanakkor a legközelebb áll a tetraploid B és G genomokhoz. A T. monococcum ssp. boeoticum ITS szekvenciája jobban hasonlított a T. turgidum-éhoz, mint a T. urartu-é, ami meglepı, hiszen az utóbbi fajt inkább tartják az A genom ısének; a nem várt adatot újabb kelető hibridizáció eredményeként magyarázzák. Fontos eredmény, hogy a tetraploid fajokban heterogenitást mutattak ki az ITS régióban, ezt klónozással bizonyították, és rámutatnak, hogy az együttes evolúció nem volt képes tökéletesen homogenizálni a paralóg szekvenciákat. Az 5S rRNS gének és NTS régióik szintén kedvelt markerek a búzák filogenetikai vizsgálataiban Gerlach és Dyer (1980), ill. Mukai és mtsi (1990) alapvetı munkáitól kezdve. Van Campenhout és mtsi (1998) az 5S sorozatokat hordozó homológ kromoszómák megkülönböztethetıségét mutatták ki az ortológ 5S-NTS szekvenciák különbségeinek felderítésével. Több nem várt, vagy más adatokkal ellentmondó eredmény is született az 5S régió szekvenciái kapcsán (pl. Van Campenhout és mtsi 2001). Talán a legfontosabb ezek közül Baum és Bailey (2001) munkája, ahol Triticum és Aegilops fajokat vizsgálva az 5S sorozatokat 9 ortológ csoportba sorolták, de a várt eredmények mellett az 5S elemek váratlan hiánya, ill. elıfordulása a mintákban, a búza genomok olyan komplex evolúciójára utal, ami tovább szaporítja a válaszra váró kérdések számát. 22

Célkitőzés Mint az elıbbiekbıl kiderül, a búza rDNS régiók vizsgálata már eddig is hozott új és érdekes eredményeket és még sok lehetıséget kínál a búza eredetének és evolúciójának kutatásában. Az nrITS régió különösen alkalmas faji határok vizsgálatára, sokszor még közeli rokonok esetében is, így adott a felhasználási lehetısége a búza és rokonsági köre evolúciós és genomiális kutatásában. Fentieknek megfelelıen kísérletes munkám fı céljait az alábbi pontokban foglalom össze: 1. A hexaploid közönséges búza eredetének, evolúciója fıbb vonalainak vizsgálata riboszomális DNS régiók PCR-alapú vizsgálatán keresztül 2. Az A és D genom eredetére vonatkozó eddigi ismeretek bıvítése, megerısítése, vagy cáfolata az említett módszerekkel 3. A B genom eredetére vonatkozó ismeretek bıvítése új eredményekkel, és amennyiben lehetséges, a B genom eredetének tisztázása 4. Annak vizsgálata, hogyan jelenik meg a búza összetett genomi szerkezetének hatása a riboszomális DNS szekvenciákban

A megjelölt célok eléréséhez felhasznált anyagokat és módszereket a következı fejezetben részletezem.

23

Anyagok és módszerek

A kísérletekhez felhasznált búzafajok, búzafajták Triticum aestivum Mv15 és Galahad fajták, Triticum urartu Mv110, Triticum turgidum ssp. dicoccum Mv300, Triticum monococcum Mv515, Aegilops tauschii Mv363, Aegilops speltoides Mv621, Aegilops squarrosa Mv605. Az összes növényi vizsgálati anyag az MTA martonvásári Mezıgazdasági Kutatóintézetébıl származik, a megadott azonosítási jelek a martonvásári génbankban regisztrált nyilvántartási számot jelentik. Mivel a DNS-t részint kifejlett növény levelébıl, részint hidegkezelt csíranövénybıl vontam ki, így a növényi anyag nevelése is kétféle módon történt. Az elsı esetben a búzanövényeket 3 napig sötétben 1 mM CaSO4 oldaton tartottuk, ezt követıen pedig Knop tápoldaton folytatva a nevelést, a zöld növényeknél napi 17 órás megvilágítási periódust alkalmaztunk. A fényintenzitás 900 mW/m2 volt. A DNS-kivonáshoz két-három hetes növények friss, egészséges leveleit használtam föl. A másik esetben a búzaszemeket hidegben (4°C) csíráztattam és tartottam 3 hétig és ezt követıen használtam föl ıket, mert korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a hidegkezelés fokozza a demetilációt a búza DNS-ben (Horváth és mtsi 2003) és vizsgálataimhoz olyan növényekre volt szükségem, amelyek a lehetı legkevésbé metilált DNS-sel rendelkeznek.

DNS-extrakció A DNS kinyerésében néhány módosítással Doyle és Doyle (1987) módszerét alkalmaztam. A mintákat kifejlett búzanövény levelébıl, illetve csíranövény epikotiljából vettem, 20-50 mg növényi anyagot fölhasználva. A mintákat folyékony nitrogénnel elızetesen lehőtött, kis mérető dörzsmozsarakban dörzsöltem el, kvarchomok és folyékony nitrogén jelenlétében. Az eldörzsölt anyagot 1,5 mles centrifugacsövekbe vettem fel, 600-750 µl 2%-os CTAB lízis pufferben (lízis puffer: 2% CTAB, 100 mM Trisz-HCl, 1,4 M NaCl, 20mM EDTA). A csöveket 60-65°C-os vízfürdıben inkubáltam 40-60 percig, idınként keveréssel homogenizálva, majd a mintákat azonnal

24

centrifugába tettem és lecentrifugáltam a törmeléket (20000 g, 10 perc). Az extrakció során minden centrifugálás szobahımérsékleten zajlott. A fehérjéket két lépésben, kloroformos kicsapással távolítottam el. A mintákhoz egy térfogat (kb. 600 µl) kloroformot adtam, majd alaposan összeráztam és centrifugálással (20000 g, 15 perc) elválasztottam a vizes és a kloroformos fázist. A felülúszó és a DNS-t is tartalmazó vizes fázist új, tiszta centrifugacsıbe pipettáztam, a fehérjetartalmú kloroformos fázist elöntöttem. Ezután ezt a kloroformos tisztítási lépést megismételtem. A vizes fázisú felülúszóból a DNS-t két - két és fél térfogat jéghideg (-20°C-os) abszolút etanollal csaptam ki. A kicsapott DNS-t egy órára, vagy éjszakán át -20°C-os fagyasztóba tettem, hogy elısegítsem a DNS kiválását, majd centrifugálással (20000 g, 30 perc) leülepítettem a csapadékot. A felülúszó elöntése után a DNS csapadékot kétszerháromszor mostam a következı módszerrel: 200 µl 70%-os, -20°C-os etanolt adtam a csapadékhoz, majd rövid keverés után centrifugáltam (5000 g, 5 perc), végül az alkoholos felülúszót elöntöttem. Ezt a mosási eljárást tehát még egyszer, vagy kétszer megismételtem. Végül az alkoholt leöntöttem a csapadékról és a centrifugacsöveket kiszárítottam, így eltávolítottam a mintából a maradék alkoholt. Végezetül a csapadékot 50-100 µl mennyiségő, 0,1 M Trisz pufferben (pH=8), illetve 50-100 µl ultratiszta Milli-Q vízben (Millipore) vettem föl.

A DNS amplifikációja (PCR) Mivel a legtöbb esetben ultratiszta vizet használtam a DNS oldására és vízben a DNS oldódása nem tökéletes (az oldat inhomogén), többnyire nem vizsgáltam fotométeres méréssel a DNS-extraktum minıségét és mennyiségét, hanem egy extraktumból több különbözı hígítással végeztem a PCR reakciót, így közelítve a reakció optimális templát koncentrációját. Az általam alkalmazott kinyerési eljárás után szinte mindig az 1 µl extraktum volt az optimális mennyiség. Az amplifikációhoz az esetek többségében a Perkin Elmer cég GeneAmp PCR System 2400 típusú készülékét alkalmaztam, amelyben maximum 24 darab, 0,2 ml-es PCR csı használható; illetve néhány esetben a Techne cég TC-312 típusú készülékét, mely 25×0,2ml férıhelyes. A PCR elegyek végsı térfogata minden esetben 50 µl volt. A reakcióelegyek összetételérıl tájékoztat az alábbi táblázat.

25

steril ultratiszta víz reakciópuffer 10×RB dNTP keverék MgCl2 primer 1 primer 2 Taq polimeráz mastermix térfogata

Kiindulási koncentráció 1 reakcióelegy (µl) 24 minta (28×) (µl) 8,75 245 5 140 2-2-2-2 mM 5 140 25 mM 4 112 10 mM 1 28 10 mM 1 28 0,25 7 5 u/µl 700 25

templát DNS-oldat

25

Teljes térfogat

50

6. táblázat. A PCR elegyek és a mastermix térfogata és összetétele

Elsıként a DNS templátot, vagyis a mintákat mértem be a PCR csövekbe, és a térfogatot steril Milli-Q vízzel kiegészítettem 25 µl-re. Ezután a mastermixet, azaz a PCR elegyek DNS templátot nem tartalmazó, a megfelelı reakciókörülményeket biztosító, azonos alapoldatát készítettem el, minden összetevıt belemérve, az enzim kivételével. Végül a Taq DNS-polimeráz enzimet is hozzáadtam a mastermix-hez, és rövid keverés után ebbıl az alapoldatból adtam minden csıhöz szintén 25 µl-t. A reakcióelegyekben 2 mM volt a végsı Mg2+ koncentráció.

Elızetes denaturáció Denaturáció 94 °C 94 °C 4 perc 30 mp

30 mp Primerkötés 51 °C 30 mp

Szintézis 72 °C

Szintézis 72 °C

30 mp*

7 perc Eltartás 4-10 °C

33 ciklus *ciklusonként + 1 mp

6. ábra. Az amplifikáció folyamán alkalmazott idık és hımérsékletek (az nrITS-PCR példáján)

26

Az enzim számára a polimeráz reakció megkezdéséhez szükséges oligonukleotidokként, a teljes ITS régió felszaporításakor az ITS1/ITS4, eukariótákhoz univerzálisan használt primerpárt alkalmaztam (White és mtsi, 1990; Vilgalys, 1998). A késıbbi kutatások során, részben más markerekhez, egyéb primereket is használtam, melyek közül többet számítógépes segédprogramok igénybevételével én terveztem (9. ábra, 11. táblázat). A reakció során beállított paraméterek a 6. ábrán láthatók. A polimeráz enzim aktiválásához és a templát DNS nagyfokú denaturációjának eléréséért az elsı ciklus beindítása elıtt 4 és fél percig tartó, 94°C-os inkubációt alkalmaztam, ezen kívül a Taq polimeráz ciklusonként csökkenı aktivitását a szálszintézis idejének ciklusonkénti 1 másodperces növelésével ellensúlyoztam. A reakció végeztével (kb. 2 óra múltán) a mintákat vagy azonnal vizsgáltam gélen, vagy 4, ill. –20°C-on tároltam rövidebb, ill. hosszabb ideig az elektroforézis elvégzése elıtt.

Gélelektroforézis és RFLP A gélelektroforézishez Horizon 11-14 típusú futtató rendszert (Gibco BRL) használtam. A gél elkészítéséhez és futtató pufferként egyaránt 0,5× Trisz-bórsav-EDTA (TBE) puffert alkalmaztam. A gél 0,8-1,1% agaróz tartalmú volt, a körülményektıl függıen. A kb. 50-60°Cra visszahőtött agarózoldathoz adtam hozzá a DNS kimutatására használt etidium-bromidot, 100 ml gélhez 12 µl mennyiségben (0,5 mg/ml törzsoldatból). A mintákból 5 µl-t kivéve és ehhez 1 µl 6×LB jelzıpuffert adva, ezeket a 6 µl térfogatú keverékeket juttattam a mintafelvevı zsebekbe. A PCR-termékek ellenırzéséhez 5,5-7,5 V/cm fajlagos feszültség mellett 35-60 percig hagytam vándorolni a DNS-mintákat az agaróz gélben. A futtatási idı letelte után a gélt UV fénnyel átvilágítva, 595±50 nm-en áteresztı interferenciaszőrıt alkalmazva, digitális, hőtött CCD-kamerával fényképeztem le, a WinView/32 és az Image-Pro Plus kameravezérlı és képfeldolgozó programok segítségével. A fotókat szabad szemmel, ill. néhány esetben a Phoretix-1D gélkiértékelı program felhasználásával vizsgáltam. Esetenként RFLP-analízist is végeztem, elsısorban a klónozások után a termékek szelekciója céljából. Az amplifikált ITS régiók emésztéséhez a Gibco BRL cég által gyártott ötfajta restrikciós endonukleázt használtam a munkám során. Ezek az EcoRI, az AluI, az MboI, a HinfI és a TaqI elnevezéső enzimek voltak. Az elıbbi négy enzimet 37°C-os

27

hımérsékleten, a TaqI enzimet 65°C-on alkalmaztam. Az oldatok összetételét a 7. táblázat tartalmazza. Anyagok Térfogat (µl) ® REAct puffer 2 Steril Milli-Q víz 7,8 0,2 Enzim (10u/µl) Mastermix térfogata 10 PCR minta 10 Össztérfogat 20 7. táblázat. A restrikciós enzimes emésztés anyagai és mennyiségük

Az emésztést PCR csövekben végeztem el, elsıként a PCR mintákat mértem be, majd összeállítottam az enzimek alapoldatát (puffer, víz és enzim), és hozzáadtam a mintákhoz. A kész oldatokat tartalmazó csöveket 37, ill. 65°C-os vízfürdıbe helyeztem, 4 órára, vagy éjszakán át. Az eredményt a PCR-termék detektálásához hasonló módon és eszközökkel, gélelektroforézis segítségével ellenıriztem, azzal a különbséggel, hogy 1,5%-os agaróz gélt és csak a gél elején egy mintafelvevı sort alkalmaztam. A futtatás paraméterei: 110 V (7,86 V/cm), 80 perc. A gél vizsgálatát az elıbbiekben leírt módon, UV fénnyel átvilágított géldokumentációs kamrában digitális kamerával fotózva és az elızıekben leírt programok használatával végeztem el.

PCR-termékek tisztítása, szekvenálás A PCR-termékek tisztítását kétféle módon végeztem, DNS-t specifikusan kötı mátrix (Prep-A-Gene mátrix, Bio-Rad), illetve ultraszőrı membrán (Amicon membrán, Millipore) segítségével. Az elıbbi módszerrel a PCR-termékek magas nátrium-perklorát tartalmú puffer segítségével a mátrixhoz kötve csapadékba vihetık, lecsapott állapotban tisztíthatóak és vízzel visszaoldhatók, majd a fölöslegessé vált kötımátrix centrifugálással eltávolítható. A másik eljárás során a megfelelı pórusmérető ultraszőrı membrán visszatartja a PCR-termék DNSmolekuláit, míg a fölösleges kismolekulájú anyagok (dNTP, oligonukleotidok, sók) átcentrifugálhatók, végül a DNS a membránról lemosható. A tisztítás eredményét mindkét esetben a már részletezett módon gélelektroforézissel ellenıriztem.

28

A szekvenáló reakcióhoz a BigDye™ Terminator Cycle Sequencing Kit-et (Applied Biosystems) használtam. A szekvenáló elegy összetételérıl a 8. táblázat tájékoztat: kit hígító puffer 5× PCR-termék primer víz összesen

8 µl -

4 µl 2 µl

20 µl

3 µl 2 µl 2,5 µl 3 µl ~6 µl 30 pmol a maradék 20 µl 20 µl 20 µl

1 µl 4 µl

20 µl

8. táblázat. A szekvenáló reakcióelegyek összetétele (az alkalmazott kit mennyiségétıl függıen)

A szekvenáló kit tartalmazza a szükséges nukleotidokat (dNTP és fluoreszcens ddNTP), a DNS-polimerázt (módosított Taq) és egyéb segédanyagokat. A gélelektroforézis eredményétıl függıen az egyes mintákból 4-8 µl mennyiséget használtam, a végsı térfogatot steril ultratiszta vízzel állítottam be 20 µl-re.

Denaturáció 96 °C

Szintézis 60 °C

10 mp Primerkötés 50 °C 28 ciklus

5 mp

4 perc Eltartás 4 °C

7. ábra. A szekvenáló reakció körülményei

A szekvenáló reakcióelegyekbıl a jelölt DNS-t 50µl 96%-os etanollal és 2µl 3M Naacetáttal csaptam ki, majd keverés és rövid szobahımérséklető inkubálás után a csapadékot lecentrifugáltam (20 perc, 20000 g, szobahımérséklet). A felülúszó eltávolítása után etanollal mostam a DNS-t, majd a csapadékot kiszárítottam (PCR-készülékben, 90°C, 1 perc). A kapilláris gélelektroforézis ABI PRISM 310 Genetic Analyser, ill. ABI PRISM 3100 Genetic Analyser készülékben (mindkettı Applied Biosystems) történt.

29

Speciális PCR és klónozás A hexaploid közönséges búza három genomjának azonosítása érdekében speciális PCR reakciót terveztem és alkalmaztam, amely eredetileg a Glomales rendbe tartozó arbuszkuláris mikorrhizagombák óriás spóráiból való eredményes amplifikációhoz használatos, ugyanis az ilyen spórák erısen metilált DNS-t tartalmaznak és szokásos PCR körülmények között nem, vagy csak nagyon gyenge eredménnyel amplifikálhatóak. A magasabb hımérséklető denaturáció azonban tapasztalatok szerint növelte a PCR eredményességét. Ezt a reakciót két lépésben végeztem, az elsı lépésben erısen denaturáló körülményeket teremtettem, ez természetesen a DNS-polimeráz enzim aktivitását is a szokottnál erısebben csökkenti, a második lépés éppen ezért egy normál PCR reakció, amely az elsı lépésben képzıdött PCRtermékek sokszorosítására szolgál.

1. reakció Elızetes denaturáció Denaturáció 99 °C 99 °C 10 perc

1 perc Primerkötés 51 °C

Szintézis 72 °C

Szintézis 72 °C

45 mp

2 perc Eltartás 4 °C

30 mp 10 ciklus 2. reakció Elızetes denaturáció Denaturáció 94 °C 94 °C 2 perc 30 mp

30 mp Primerkötés 51 °C 30 mp

Szintézis 72 °C

Szintézis 72 °C

45 mp*

7 perc Eltartás 4-10 °C

25 ciklus *ciklusonként + 1 mp

8. ábra. A kétlépéses amplifikáció reakciókörülményei, piros színnel kiemelve az elsı reakció erısen denaturáló lépései.

30

Az elsı reakció 25 µl térfogatban zajlik, és ez a teljes reakcióelegy képezi a második reakció templát oldatát. A primerek azonosak a két reakcióban. A reakciókhoz nem Taq, hanem Pfu polimerázt használtam, amely rendelkezik 3’→5’ exonukleáz aktivitással, ennek köszönhetıen a Taq-nál sokkal pontosabb, viszont lassabb nukleotid-beépítést tesz lehetıvé. Ennek megfelelıen növeltem a szintézisidıt.

1. reakció 2. reakció Kiindulási koncentráció 1 reakcióelegy (µl) 1 reakcióelegy (µl) steril ultratiszta víz 4,95 17,15 reakciópuffer 10×RB 2,5 2,5 dNTP keverék 2-2-2-2 mM 2,5 2,5 MgCl2 25 mM 1,25 1,25 primer 1 10 mM 0,5 0,5 primer 2 10 mM 0,5 0,5 Pfu polimeráz 0,3 0,6 5 u/µl mastermix térfogata 12,5 25 templát DNS-oldat Teljes térfogat * a templát oldat itt a teljes 1. reakcióelegy

12,5

25*

25

50

9. táblázat. A PCR elegyek összetétele

A polimeráz túl nagy aktivitáscsökkenését megelızendı az elsı reakcióban csak a tíz perces, 99°C-os denaturáló lépés utolsó másodperceiben mértem be a reakcióelegybe a polimeráz enzimet; az erısen denaturáló körülmények miatt a polimerázt teljes mértékben pótoltam a második reakcióban, a többi összetevıt csak a hiányzó félszeres mennyiségben. A keletkezett PCR-terméket a fentebb leírt módszerrel (membrán-ultraszőrés) tisztítottam, majd a „posztamplifikációs adenilálás” nevő reakció során elláttam az amplikonokat azzal a járulékos adenozin nukleotiddal, amelyre a TA típusú klónozáshoz mindenképpen szükség volt. Ezt a reakciót megemelt mennyiségő Taq polimeráz és dATP hozzáadásával végeztem (10. táblázat), 30 percig 72 °C hımérsékleten, majd az elegyet kloroformos-alkoholos módszerrel tisztítottam (ld. följebb). Az így elıkészített PCR-terméket T4 DNS-ligáz és pGEM plazmid vektor felhasználásával klónoztam JM109 baktérium sejtekbe (pGEM-T Easy Vector System II, Promega). A sejteket szélesztettem, majd az inzertet hordozó telepeket kék-

31

fehér szelekcióval különítettem el. A plazmid DNS-t forralással és erıs keveréssel izoláltam a sejtekbıl, a sejtes törmeléket centrifugálással távolítottam el. Az inzertet végül „normál” PCR reakcióban szaporítottam föl és azonnal, vagy restrikciós enzimes szelekció után szekvenáltam. Kiindulási koncentráció steril ultratiszta víz reakciópuffer 10×RB dATP MgCl2 Taq polimeráz térfogat

4 mM 25 mM 5 u/µl

1 reakcióelegy (µl) 1 6 5 12 1 25

templát DNS-oldat

25

Teljes térfogat

50

10. táblázat. A posztamplifikációs adenilálási reakció összetétele

A szekvenciák kezelése, primertervezés, filogenetikai analízis Az elektroferogram formájú DNS-szekvenciákat a Chromas Lite 2.01 program (Technelysium) felhasználásával ellenıriztem. Amennyiben ugyanannak a DNS-szakasznak a szekvenciája 3’ és 5’ irányból is rendelkezésemre állt, akkor ezeket a párokat is ellenıriztem egymáshoz képest. Az ellenırzött szekvenciákhoz hasonló, már leközölt adatokat a nemzetközi adatbázisokban (GenBank, EMBL) a BlastN 2.2.2 (Altschul és mtsi 1997), illetve a Fasta33_t (Pearson és Lipman 1988) programok segítségével kerestem. A DNS-szekvenciák pontos illesztését a ClustalW (Thompson és mtsi 1994) programmal, illetve ugyanazt az algoritmust felhasználó MEGA 3.1 (Kumar és mtsi 2004) programcsomaggal végeztem. A szekvenciákat az európai nemzetközi adatbázisban (EMBL) helyeztem el. A dolgozatban közölt összes DNS-szekvencia 5’→3’ irányban értendı. A PCR- és szekvenáló primerek tervezéséhez az elıbbiekben említett keresı és illesztıprogramok mellett felhasználtam még a Northwestern University (Illinois, USA) honlapján (http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) elérhetı Oligonucleotide 32

Properties

Calculator

programot,

illetve

a

GeneWalker

Evaluation

(CyberGene:

http://www.cybergene.se/primerdesign/genewalker/genewalker11.html) programot.

ITS1A ITS1P ITS1

ITS3

5,8S rRNS gén

18S rRNS gén ITS-1 ITS2

24f

F356

26S rRNS gén ITS-2 ITS4

F710

F1056

cp16S rRNS gén 1529R

R425

BKS1

cp23S rRNS gén cpITS-2

cp4,5S rRNS gén

cpITS-3

cp5S rRNS gén BKS2

9. ábra. A vizsgált DNS-régiók PCR-es felszaporításában, ill. szekvenálásában alkalmazott primerek és azok kötıhelyei. A kék színnel jelölt primereket White és mtsi (1990) publikálták elıször, a fekete színnel jelölteket én terveztem. Az aláhúzással jelölt primereket csak szekvenáláshoz használtam. A DNS-szakaszok valós méretarányait az ábra többnyire torzítva mutatja.

33

ITS1 ITS1P ITS1A ITS2 ITS3 ITS4 24f 1529R F356 F710 F1056 R425 BKS1 BKS2

TCCGTAGGTGAACCTGCGG CCGTACCATTTAGAGGAAGGAG GACGTCGCGAGAAGTCCA GCTGCGTTCTTCATCGATGC GCATCGATGAAGAACGCAGC TCCTCCGCTTATTGATATGC ATGGAGAGTTCGATCCTGGC GCGTGAAGAAGTGTCAAACC TTCCGCAATGGGCGAAAGC CCGACACTGACACTGAGAG GTTAAGTCTCGCAACGAGC TCCTCAGATACCGTCATTG TAAGCCCACCCCAAGATGAGTG AGCTATTTTGCCGCAGGACC

White és mtsi 1990 Gulyás és mtsi 2005 Gulyás és mtsi 2005 White és mtsi 1990 White és mtsi 1990 White és mtsi 1990 Rudnóy és mtsi 2002 Rudnóy és mtsi 2002 Rudnóy és mtsi 2002 Rudnóy és mtsi 2002 Rudnóy és mtsi 2002 Rudnóy és mtsi 2002 -

11. táblázat. Az alkalmazott primerek neve, szekvenciája és elsı hivatkozása

A filogenetikai elemzéseket a MEGA 3.1 programcsomag programjaival végeztem (Kumar és mtsi 2004), a törzsfák megjelenítése és szerkesztése ugyanezen programcsomag Tree Explorer nevő alkalmazásával történt. Az elemzésekhez kétféle, nemzetközileg is széles körben elfogadott eljárást használtam, a „szomszédcsatolás” és a „legnagyobb takarékosság” néven

ismert

faszerkesztési

módszereket.

Mindkét

módszer esetében

a program

alapértelmezett beállításait használtam, ezek a „szomszédcsatolás” eljárásnál a következık: •

Algoritmus: „Neighbor-Joining” (Saitou és Nei 1987)

•

Illesztési hézagok és hiányzó adatok kezelése: teljes törlés

•

Szubsztitúciós modell: Kimura-2-paraméter távolságmátrix (Kimura 1980)

•

Szubsztitúciós mintázat a leszármazási vonalakban: egyforma

•

Szubsztitúciós ráta a különbözı pozíciókban: egyforma

A „legnagyobb takarékosság” módszer alapértelmezett – és általam használt – beállításai: •

Algoritmus: „Maximum Parsimony” (Fitch 1971, Nei és Kumar 2000)

•

Keresési opció: heurisztikus keresés a „Close-Neighbor-Interchange” (CNI) algoritmussal (Nei és Kumar 2000)

•

Kiindulási fák a CNI módszer számára: random szekvencia-hozzáadással, 10 ismétléssel

•

Illesztési hézagok és hiányzó adatok kezelése: teljes törlés

A filogenetikai analízisek megbízhatóságát az ún. bootstrap elemzı módszerrel tettem próbára, ez a MEGA 3.1 programjaiban beépített funkcióként is szerepel. A bootstrap tesztek során minden esetben 1000 ismétlést és ugyanazt a véletlengenerációs kezdıszámot (64238) alkalmaztam.

34

Eredmények

A direkt nrITS szekvenálás eredményei Munkám elsı fázisában a közönséges búza, valamint rokonsága legfontosabb tagjainak nrITS szekvenciáját határoztam meg.

aestivum dicoccum monococcum

urartu

tauschii speltoides

(ABD)

(AB)

(A)

(A)

(D)

(S)

MvGB EMBL

MvGB15

MvGB300

MvGB515

MvGB110

MvGB363

MvGB621

AJ301799

AJ301801

AJ301800

AJ301803

AJ301802

AJ301804

ITS ITS-1 5,8S

604 223 164

602 221 164

605 223 164

603 223 164

602 221 164

602 221 164

ITS-2

217

217

218

216

217

217

12. táblázat. A növényi minták és a szekvenált teljes ITS régiók paraméterei. A vastag és dılt betős fajnevek a mintákat jelölik, zárójelben a haploid genomok betőjelével, az alatta levı sor (MvGB) a minták nyilvántartási számait a martonvásári kutatóintézet génbankjában. A következı sorban (EMBL) a teljes ITS szekvenciák azon hivatkozási számait tüntettem föl, amelyen a nemzetközi szekvenciaadatbázisban elérhetık. Az utolsó négy sor rendre a teljes ITS, az ITS-1, az 5,8S rRNS gén, és végül az ITS-2 régiók szekvenciájának hosszát jelöli, bázispárban.

Az ITS szekvenciák tiszták és egyértelmően olvashatóak lettek, kivéve a T. aestivum esetében, ahol az ITS-2 régióban 3 ponton (401., 405. és 568. pozíció) nem volt lehetséges pontosan meghatározni egy-egy bázist, azaz a szekvenciában e 3 ponton az N (azonosítatlan bázis) jel szerepel. A hat szekvencia illesztésének teljes hossza 609 nukleotid lett. Az 5,8S rRNS génben nem találtam eltérést a minták között, ami megfelel a várakozásoknak; a régió hossza minden mintában 164 bp (12. táblázat). Az ITS-1 szakasz hossza 221-223, míg az ITS-2 régióé 216218 nu között változott. A teljes ITS szakaszra nézve összesen 67 variábilis pozíciót találtam, ez magába foglalja a T. aestivum cv. Mv15 minta említett három azonosítatlan nukleotidját is (ld. 13. táblázat).

35

ITS-1

ITS-2

összesen

T. aestivum Mv15 T. turgidum ssp. dicoccum T. monococcum T. urartu Ae. tauschii Ae. speltoides

9 2 1

181 8 4 1 1 2

27 10 5 1 2 2

A genom2 poliploid Triticum3 Aegilops4

5

4 2 1

9 2 1

egyéb polimorf helyek

6

2

8

összesen

24

43

67

1

13. táblázat. A teljes nrITS régió specifikus variábilis pozícióinak száma és megoszlása. 1tartalmazza a 3 azonosítatlan bázist is; 2a T. monococcum és a T. urartu mintákra, mint A genomú fajokra specifikus polimorfizmusok; 3a két vizsgált poliploid búzafaj (T. aestivum és T. turgidum) itt szereplı mintáira specifikus helyek; 4a vizsgált két Aegilops fajra specifikus polimorfizmus.

Mint a 13. táblázatban is látható, az ITS-2 szakaszban csaknem kétszer annyi polimorf pozíció található az illesztés szerint, mint az ITS-1-ben. Feltőnı az Mv15 búza sok specifikus polimorf pozíciója, azaz a vártnál nagyobb eltérése a többi mintától és említésre méltó még a két diploid A genomú búzafaj 9 közös specifikus polimorfizmusa. A teljes illesztés egy részlete, mely a legtöbb variábilis pozíciót tartalmazta, a 10. ábrán látható.

monococcum urartu tauschii speltoides dicoccum aestivum

537 537 536 536 536 538

ATCCGACGCGCAGCCGGCATGACGGCCTCAAAATGACCCAGCAAACTGCAAGCGCACGTC ATCCGACGCGCAGCCGGCATGACAGCCTCAAAATGACCCAGCAAACG--AAGCGCACGTC ATCCGACGCGCAGCCGACATTATGGCCTCAGAACGACCCAGCAAACG--AAGCGCACGTC ATCCGACGCGCAACCGGCATTATGGCCTCAGAACGACCCAGCAAACG--AAGCGCACGTC ATCCGGCGCGCAGCTGGCATTATGGCCTTTGAACGACCCAACAAACG--AAGCGCACGTC ATACGACGCGTAGCCGGCATTATGGCCTCANAACGACCCAACAAACG--TAGCGCACGTC ** ** **** * * * *** * **** ** ****** ***** **********

596 594 593 593 593 595

10. ábra. Az nrITS szekvenciák illesztésének legvariábilisabb részlete, a régió 3’ vége közelében. A színes karakterek a variábilis pontokat, a csillagok a teljes egyezést jelölik.

36

monococcum urartu tauschii speltoides dicoccum

urartu 0,008412

tauschii 0,027344 0,025655

speltoides 0,030832 0,025622 0,016941

dicoccum 0,048616 0,043281 0,034336 0,027317

aestivum 0,068529 0,063051 0,052041 0,053825 0,061037

14. táblázat. Kimura-2-paraméter távolságmátrix a hat vizsgált teljes ITS szekvenciára. A számítás a MEGA 3.1 programcsomag felhasználásával készült, alapértelmezett beállításokkal. A legkisebb számított távolságot kék, a legnagyobbat piros szín jelzi.

urartu monococcum

tauschii

aestivum speltoides

dicoccum 0.005

11. ábra. „Szomszédcsatolás” eljárással készült gyökértelen törzsfa a fenti távolságmátrix (14. táblázat) adataiból generálva. A fa szerkesztése a MEGA 3.1 programcsomag felhasználásával történt (alapértelmezett beállításokkal), a fa megjelenítéséhez a MEGA 3.1 csomag Tree Explorer programját használtam. Skála: nukleotidcserék száma pozíciónként.

Amint a 14. táblázatban és a 11. ábrán látható, a legkisebb távolság a T. monococcum és a T. urartu minták között adódott, ami nem meglepı, tekintve, hogy közelrokon fajokról van szó, melyek egyaránt az A genomot hordozzák. A két Aegilops minta között is viszonylag kicsi az evolúciós távolság, viszont feltőnı a T. aestivum mintánk egyértelmő elkülönülése az

37

összes többi vizsgálati objektumtól, még a közvetlen ıseinek tekinthetı T. turgidum ssp. dicoccum és Ae. tauschii minták ITS szekvenciájától is. Ezt az elkülönülést világítja meg a sok specifikus bázis is a polimorf pozíciókban (13. táblázat). Ez a szeparáció mindenképpen igényelte az Mv15 búza ITS régiójának további vizsgálatát. BLAST keresési módszert alkalmazva a nemzetközi adatbázis ITS szekvenciái között azt találtam, hogy a leginkább hasonló találatok között búza és rozs ITS szekvenciák szerepeltek. Az Mv15 egyike azon martonvásári búzafajtáknak, melyek az 1RS rozs transzlokációs kromoszómaelemet hordozzák (Kıszegi és mtsi 2000), ez a kromoszómarészlet pedig az irodalmi adatok szerint tartalmaz NOR elemeket (Koebner 1995, Landjeva és mtsi 2006), tehát befolyásolhatta az eredményeinket. Ezt alátámasztja az az eredmény, amelyet a fenti faszerkesztési eljárással kaptam, miután csatoltam a kiindulási adatokhoz a rozs (Secale cereale) ITS szekvenciát (AF303400, Torrecilla és Catalan 2002) is.

monococcum

urartu

Secale

tauschii

aestivumMv15 speltoides

dicoccum 0.005

12. ábra. „Szomszédcsatolás” eljárással készült gyökértelen törzsfa a rozs („Secale”) ITS szekvencia bevonásával, Kimura-2-paraméter távolságmátrix adataiból generálva. A fa szerkesztése a MEGA 3.1 programcsomag felhasználásával történt (alapértelmezett beállításokkal), a fa megjelenítéséhez a MEGA 3.1 csomag Tree Explorer programját használtam. Skála: nukleotidcserék száma pozíciónként.

38

A plasztiszban kódolt riboszomális szekvenciák vizsgálati eredményei A direkt nrITS szekvenálás eredményei nem adtak egyértelmő válaszokat a fölvetett kérdésekre. Az Mv15 búzafajtánk által hordozott rozs kromoszómaelem, pontosabban ennek megjelenése az ITS szekvenciákban olyan váratlan akadályt jelent, amely megnehezíti az nrITS adatok elemzését. Ha a transzlokációs elem az nrITS adatok vizsgálatában nehézségeket okoz, akkor ez más genomi kromoszomális markerek esetében is fennállhat, amennyiben az adott marker megtalálható az 1RS elemen. A kloroplasztisz genetikai állománya viszont ilyen szinten független mindenfajta transzlokált kromoszómaelemtıl. A plasztiszban lokalizált markerek másik elınye, hogy a genomi rDNS-hez hasonlóan szintén több kópiában vannak jelen a sejtben. Fentiek megfontolásával esett a választásunk a plasztiszban található rDNS markerekre. Mivel a kloroplasztisz anyai ágon öröklıdik, ebben a vizsgálatban egy kivétellel azok a fajok szerepeltek, amelyek a közönséges búza fejlıdésének anyai vonalán találhatók, vagyis a T. aestivum (Mv15 fajta), a T. turgidum ssp. dicoccum, a Sitopsis szekcióból az Ae. speltoides és az apai vonalról az Ae. tauschii. Két régió szekvenálását céloztuk meg, az egyik a 16S rDNS, a másik pedig a 23S-4,5S-5S rRNS gének között elhelyezkedı cpITS-2 és cpITS-3 elválasztó (spacer) szakaszok. Az Mv15 fajta 16S génjének csaknem teljes szekvenciája egy korábbi munka eredményeként már rendelkezésünkre állt (AJ239003, Kovács és mtsi 2000). A T. turgidum ssp. dicoccum, Ae. speltoides és az Ae. tauschii minták 16S rRNS génjét csaknem teljes terjedelmében, 1483 nu hosszúságban szekvenáltam meg. A teljes gén a közönséges búza Chinese Spring fajtájában 1491 bp hosszú (AB042240, Ogihara és mtsi 2002), a mi szekvenciáink a gén „elejének” (5’-vég) elsı 8 nukleotidját nem tartalmazzák, tehát az említett referencia szekvencia 9. pozíciójától annak végsı, 1491. pozíciójáig vethetık össze. A három, újonnan meghatározott szekvenciát AJ555400 (T. turgidum ssp. dicoccum), AJ555401 (Ae. speltoides), ill. AJ555402 (Ae. tauschii) hivatkozási számok alatt helyeztem el a nemzetközi szekvencia-adatbázisban. A három szekvencia egymással teljesen azonosnak bizonyult, a korábban meghatározott Mv15 fajta 16S génjétıl egy ponton, a gén 1066. pozíciójában eltér, a mi szekvenciáink itt citozin bázist hordoznak, az Mv15 viszont timint (14. ábra). Ugyanez a pozíció a referencia szekvenciában szintén citozin. A referencia szekvenciaként használt Chinese Spring 16S géntıl két ponton tér el a három új szekvencia, ezek a gén elején találhatók, a gén 10. és 16. pozíciójában. Az Mv15 hasonló szekvenciájával

39

csak az utóbbi pozíció vethetı össze, de ott a miénkkel egyezik és a Chinese Spring tér el tılük (13. ábra).

16sUJ 1 --------TGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCA 52 Mv15 1 ---------GAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCA 51 C Spring 1 TCTCATGGAGAGTTCGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCA 60 ***** ********************************************* 13. ábra. A három újonnan meghatározott, egyforma 16S rDNS-szekvencia („16sUJ”), ill. az Mv15 és a Chinese Spring („C Spring”) búzafajták 16S rDNS-szekvenciái illesztésének egy részlete, a gén 5’ végén. A színes karakterek a variábilis pontokat, a csillagok a teljes egyezést jelölik.

16sUJ Mv15 C Spring

1030 1029 1038

GGTTAAGTCTCGCAACGAGCGCAACCCTCGTGTTTAGTTGCCA GGTTAAGTCTCGCAACGAGCGCAACCCTTGTGTTTAGTTGCCA GGTTAAGTCTCGCAACGAGCGCAACCCTCGTGTTTAGTTGCCA **************************** **************

1072 1071 1080

14. ábra. A három újonnan meghatározott, egyforma 16S rDNS-szekvencia, ill. az Mv15 és a Chinese Spring búzafajták 16S rDNS-szekvenciái illesztésének részlete. A színes karakterek a variábilis pontot, a csillagok a teljes egyezést jelölik.

A 23S és az 5S rRNS gének között elhelyezkedı szakasz két elválasztó régiót és köztük a 4,5S rDNS-t tartalmazza. Ezt a régiót szekvenáltam a T. aestivum cv. Mv15, T. turgidum ssp. dicoccum, Ae. speltoides és az Ae. tauschii mintáinkból. 512 bp mérető amplikon a reakciótermék, amely mind a négy vizsgálati minta esetében teljesen egyformának bizonyult és nem találtam különbséget a Chinese Spring búzafajta teljes kloroplasztisz genomjának azonos részletével összevetve sem. A vizsgált kloroplasztisz markerek invariabilitása miatt újra az nrITS régióra irányult a figyelmünk. Az Mv15 fajta ITS szekvenciája egyaránt mutatta a búza és a rozs jellegzetességeit is (ld. az elızı fejezetben). Természetszerőleg fölvetıdik a kérdés, hogy lehetıség van-e tisztán búza-, ill. tisztán rozsjellegő ITS szekvencia kinyerésére az Mv15 búzából, a következı kérdés pedig az lehet, hogy ha az idegen nrDNS nyoma megjelenik a szekvenciában, akkor hogyan befolyásolja azt a hexaploid élılény három rezidens genomja. Ha az 1RS kromoszómaelem rozs jellegek megjelenéséhez vezet az nrITS szekvenciában,

40

akkor talán a búza három genomja is különbözı nyomot hagy benne, csak éppen ezeket sokkal nehezebb észlelni, mert a közelrokon búzafajok ITS szekvenciája lényegesen jobban hasonlít egymásra, mint a rozsé a búzákéra. Mindez fölveti azt az igényt, hogy megpróbáljunk „belsı” információt nyerni a hexaploid búzából, tehát olyan módszert alkalmazni, amely alkalmas lehet az A, B és D genomok ITS szekvenciáinak önálló megjelenítésére ugyanabból a vizsgálati objektumból. A poliploid sejt legfıbb eszköze a diploid jellegő sejtmőködés elérésére a DNS metilációja. Ha van a közönséges búza sejtmagjaiban „rejtett” belsı nrITS információ, akkor legvalószínőbb, hogy ezek a metilált állapot miatt oly nehezen hozzáférhetık, mert a metilált DNS jóval nehezebben denaturálható. Tehát elsı lépésben olyan PCR reakciókörülményeket igyekeztem teremteni, amelyek lehetıvé teszik a sikeres amplifikációt az erısen metilált DNS-darabokról is. (Ennek részleteit lásd az „Anyagok és módszerek” rész „Speciális PCR és klónozás” fejezetében). Az erısen denaturáló speciális PCR termékeit elıször poliakrilamid gélen próbáltam szétválasztani, de ez a módszer nem vezetett eredményre, mert – mint késıbb kiderült – az akrilamid gél felbontása ebben a mérettartományban már nem alkalmas kis különbségek elválasztásához. Ezért folyamodtam a módszertani részben már kifejtett klónozáshoz.

41

A speciális PCR-rel és klónozással elıállított nrITS szekvenciák vizsgálati eredményei A közönséges búza két fajtáját használtuk ebben a vizsgálatsorozatban, az Mv15 fajtát, amelyet az eddigi kísérletekben is alkalmaztunk, és a Galahad fajtát, amelyre azért esett a választásunk, mert olyan búzafajtát kerestünk, amely egészen biztosan más nemesítési vonalból származik, mint az Mv15, biztosan nem tartalmaz rozs genetikai elemet és lehetıleg Európa más vidékérıl származik. A Galahad nyugat-európai nemesítéső fajta, melyet az Atlanti-óceán közelében fekvı országokban, pl. Franciaországban termesztettek. A magas denaturáló hımérséklettel mőködı, kétlépéses PCR, majd az azt követı klónozás és plazmidizolálás után összesen 67 ITS klónszekvenciát állítottam elı a két mintából; 20 klón az Mv15 fajtából, 47 pedig a Galahad fajtából származik. Az elıbbieket M01-tıl M20-ig, az utóbbiakat G01-tıl G47-ig terjedı azonosítási számokkal jelöltem. A klónok között jelentıs különbségek is adódtak, alapvetıen négy csoportot tudtam elkülöníteni. A legnépesebb csoport olyan klónszekvenciákat tartalmaz, amelyek leginkább a referenciaként használt T. aestivum ITS szekvenciákra hasonlítanak. A második csoportba a Galahad fajtából izolált klónok közül egy sem került, viszont az Mv15 fajtából izolált 20 klón fele ide sorolható, ezek a szekvenciák a rozs ITS régiójára hasonlítanak legjobban, bár bonyolítja a helyzetet, hogy az egyik ide sorolt klón (M09) kiméra tulajdonságú, ugyanis az ITS-1 szakasza teljes egyezést mutat az alakor búzákkal (T. monococcum), míg az ITS-2 szekvenciája ugyancsak 100%-ig egyezik, de a rozs megfelelı régiójával. A harmadik csoportba olyan klónok kerültek, amelyek a legnagyobb egyezést a D genom donor Ae. tauschii ITS szekvenciáival mutatják, bár kisebb mértékben más Aegilops fajokhoz is hasonlítanak. Végül a negyedik csoportot mindössze 2 ITS klón alkotja, ezek pedig legközelebb az A genom fajaihoz, az alakor búzákhoz állnak (T. monococcum és T. urartu). összes aestivum típus D genom típus A genom típus rozs típus ITS klónszekvencia

67

47

8

2

10

Mv15 fajtából

20

7

1

2

10

Galahad fajtából

47

40

7

0

0

ebbıl

15. táblázat. Az ITS klónszekvenciák száma (db) és megoszlása típusonként és fajtánként

42

Klónok aestivum A genom D genom rozs teljes ITS ITS-1 5,8S ITS-2 M01

+

602

222

164

216

M02

+

601

221

164

216

M03

+

601

221

164

216

602

221

164

217

601

221

164

216

602

221

164

217

601

221

164

216

602

221

164

217

(+)

603

223

164

216

+

601

221

164

216

M04

+

M05 M06

+ +

M07

+

M08

+

M09*

(+)

M10 M11

+

602

221

164

217

M12

+

602

221

164

217

M13

+

601

221

164

216

M14

+

601

221

164

216

M15

+

601

221

164

216

M16

+

602

221

164

217

M17

+

602

221

164

217

602

222

164

216

602

221

164

217

603

223

164

216

M18 M19

+ +

M20

+

Klónok aestivum D genom teljes ITS ITS-1 5,8S ITS-2 G01

+

602

221

164

217

G02

+

602

221

164

217

G03

+

602

221

164

217

G04

+

602

221

164

217

G05

+

602

221

164

217

G06

+

602

221

164

217

G07

+

602

221

164

217

G08

+

602

221

164

217

43

Klónok aestivum D genom teljes ITS ITS-1 5,8S ITS-2 G09

+

602

221

164

217

G10

+

602

221

164

217

G11

+

602

221

164

217

602

221

164

217

605

221

164

220

602

221

164

217

601

221

163

217

602

221

164

217

G12 G13

+ +

G14 G15

+ +

G16

+

G17

+

602

221

164

217

G18

+

602

221

164

217

G19

+

602

221

164

217

G20

+

602

221

164

217

602

221

164

217

G21

+

G22

+

602

221

164

217

G23

+

602

221

164

217

602

221

164

217

G24

+

G25

+

603

221

164

218

G26

+

602

221

164

217

G27

+

602

221

164

217

G28

+

602

221

164

217

G29

+

602

221

164

217

G30

+

602

221

164

217

602

221

164

217

G31

+

G32

+

602

221

164

217

G33

+

602

221

164

217

G34

+

602

221

164

217

G35

+

602

221

164

217

G36

+

602

221

164

217

G37

+

602

221

164

217

G38

+

602

221

164

217

602

221

164

217

G39

+

44

Klónok aestivum D genom teljes ITS ITS-1 5,8S ITS-2 G40

+

602

221

164

217

G41

+

602

221

164

217

G42

+

602

221

164

217

G43

+

602

221

164

217

G44

+

602

221

164

217

G45

+

602

221

164

217

G46

+

602

221

164

217

G47

+

602

221

164

217

16. táblázat. A búza ITS klónszekvenciák típusai és méretei (nu). A klónok jelölése: M01-M20 az Mv15 búzafajtából származó klónok; G01-G47: a Galahad fajta ITS klónjai. Dılt betővel azokat a méretszámokat jelöltem, amelyek eltérnek az adott referencia megfelelı méreteitıl, pl. egy aestivum típusú klón esetében a referencia ITS-1 mérete 221 bp, az ettıl eltérı ITS-1 méretet dılt betős szám jelzi. Referenciák: aestivum típus: T. aestivum cv. Pioneer (Z11761, Chatterton és mtsi 1992b); A genom típus: T. urartu (AJ301803, Rudnóy és mtsi 2004) és T. monococcum (L11581, Hsiao és mtsi 1995); D genom típus: Ae. tauschii (AJ301802, Rudnóy és mtsi 2004); rozs típus: S. cereale (AF303400, Torrecilla és Catalan 2002). *Az M09 klón kiméra jellegérıl ld. a szöveget, feljebb.

Az Mv15 klónok között nem akadt olyan, amelyik azonos lett volna az eredeti AJ301799 T. aestivum cv. Mv15 ITS szekvenciával. Az Mv15 aestivum típusú klónjai valójában két, alig különbözı szekvenciatípusba tartoznak, az M04-M06 klónok az egyik, az M11-M12-M16-M17-M19 klónok a másik csoportot alkotják és a csoportokon belül a klónok között nincs különbség. E két csoport egymástól mindössze 1, a referencia Pioneer búza ITSétıl pedig 4, ill. 3 ponton különbözik. A rozs típusú klónok teljesen azonosak voltak a rozs ITS szekvenciájával, ill. 1-2 bázisban tértek el tıle, kivéve az M02 klónt, amelynek az ITS-1 szakasza egyezett a rozséval, az ITS-2 része azonban 10 ponton eltért tıle, ezért alaposabban megvizsgáltam, de nem találtam olyan szekvenciát sem a sajátjaim, sem az EMBL adatbázisban lévık közt, amihez jelentısebben hasonlított volna. Az M08 volt az egyetlen az Mv15 klónjai közt, amely a D genomba sorolható referenciákkal komolyabb egyezést mutatott. A saját Ae. tauschii (AJ301802) ITS szekvenciánktól 4 ponton tér csak el, két-két pozícióban az ITS-1 és -2 szakaszokban egyaránt. Végül két olyan klónt találtam, mely az A genomhoz igen közel áll: az M05 klón 12 pozícióban tér el a referenciaként választott két

45

alakor ITS-tıl (T. urartu, T. monococcum, ld. 15. táblázat szövege), az M20 klón pedig mindössze 4 (/urartu), ill. 2 (/monococcum) ponton. A Galahad búzából nyert ITS klónok csak két fı csoportot alkottak, aestivum és D genom típusba soroltam ıket (15. táblázat). Természetesen elkészítettem és adatbázisba helyeztem a Galahad fajtából direkt PCR segítségével nyerhetı ITS szekvenciát is (AM040486), amely az eddig referenciaként használt Pioneer búzafajta ITS-étıl két bázisban tért csak el. A Galahad fajta aestivum típusú klónjai között sem volt egy sem, mely azonos lett volna a Pioneer búza ITS-ével, de hat klón is adott a Galahad ITS-sel azonos szekvenciákat. A Galahad fajta aestivum típusú klónjai nem olyan egységesek, mint az Mv15 esetében, ahol csak két szekvenciatípus képviseltette magát, többségük önálló eltérési pontokkal rendelkezik mind a Pioneer, mind a Galahad referencia ITS-hez képest. A D genom típusú klónok között viszonylag nagy volt a változatosság, 3-11 bázisban térnek el a referenciaként használt Ae. tauschii ITS szekvenciától. A mindkét fajtából származó összes klónt tekintve jellemzı, hogy a szekvenciák egy típuson belül többnyire különböztek egymástól egy, vagy néhány bázisban, ugyanakkor akadtak köztük azonos klónszekvenciák is, két esetben a két független fajta klónjai között is. Ez utóbbira példa az aestivum típusú klónok között az a csoport, amely az M04 és M06 számú klónok mellett nyolc Galahad klónt is tartalmazott, ill. a D genom típusúak között az M08 és G31 klónok, amelyek szintén 100%-ban azonosak. aestivum csoport

D genom csoport Poa A genom csoport

Rozs csoport 0.01

15. ábra. A szekvenciatípusok sematikus törzsfaábrázolása egy kellıen távoli külcsoport (Poa pratensis AY237834, Brysting és mtsi 2004) bevonásával. A fa szerkesztése („szomszédcsatolás” eljárással) és megjelenítése a MEGA 3.1 programcsomag felhasználásával történt. Skála: nukleotidcserék száma pozíciónként.

46

G19 G42 G05 G01 16. ábra. „Szomszédcsatolás” 65 G09 eljárással készült konszenzus G02 G13 törzsfa az összes klónszekvencia 25 G08 G06 és referenciák bevonásával. A fa G30 G35 szerkesztése, 1000 véletlenszerő 39 Galahad ismétlést (bootstrap) figyelembe G04 G32 25 véve, a MEGA 3.1 programcsomag G23 G22 „Neighbor-Joining” algoritmusának G03 37 G36 felhasználásával történt. G34 G46 Skála: nukleotidcserék száma Pioneer pozíciónként. Az egyéb turgidum 28 G17 magyarázatokat ld. a törzsfák G07 G37 ábrái után a szövegben. M11 G15 M16 41 G27 M17 M19 M12 29 G25 G26 M06 23 M04 G44 99 G28 31 G38 G29 G10 G41 11 G33 G18 G20 G47 15 G40 G43 G45 G11 G12 43 G39 tauschii 43 G24 53 33 G21 40 G16 64 21 M08 30 G14 66 35 G31 65

aestivum csoport

S (B) genomú fajok

searsii

sharonensis speltoides monAJ301800 53 57 M20 46 monL11581 urartu M05 76

89 44

M02 85 72

Aegilops típusú szekvenciák

D genom csoport

A genom csoport M09 M07 M18 M13 Rozs 100 M14 M01 M03 M10 11 M15

Rozs csoport

Poa

0.005

47

17. ábra. „Legnagyobb takarékosság” eljárással készült, 110 egyformán takarékos fa alapján számított konszenzus törzsfa az összes klónszekvencia és referenciák bevonásával. A fa szerkesztése, 1000 véletlenszerő ismétlést (bootstrap) figyelembe véve, a MEGA 3.1 programcsomag „Maximum Parsimony” algoritmusának felhasználásával történt. Skála: nukleotidcserék száma. Az egyéb magyarázatokat ld. a törzsfák ábrái után a szövegben.

22

52

23 62

88

88 96 42

M07 M01 M10 M03 M13 Rozs M18 M14 M15

aestivum csoport

S (B) genomú fajok D genom csoport

Aegilops típusú szekvenciák

67

G02 G08 G23 G32 G04 G22 20 G06 G30 G13 Galahad G35 G01 63 G09 G05 13 G19 64 G42 G46 turgidum G37 Pioneer G17 G07 G34 G11 G03 G36 32 M16 97 G15 M11 37 M17 G27 M19 M12 G25 G26 G10 G41 G33 G43 M04 34 G40 G45 G47 G18 G20 M06 G44 G28 G29 G38 speltoides 77 searsii sharonensis tauschii 29 G12 G39 M08 29 G14 47 G31 G24 42 G16 38 G21 urartu 45 monAJ301800 monL11581 M05 40 M20 47 M09

A genom csoport M02

Rozs csoport

Poa

5

48

Áttekinthetıbb a fa rendszere, ha kevesebb elemet tartalmaz, ezért az alábbi törzsfákon (18-19. ábra) az azonos klónszekvenciákból csak egyet szerepeltettem, és a kiméra jellegő M09 klónt is kihagytam az elemzésbıl, így a fenti 79 helyett csak 52 elemet tartalmaznak. G19 G42 G05 18. ábra. „Szomszédcsatolás” Galahad eljárással készült konszenzus 19 G02 törzsfa 52 szekvencia bevonásával. G01 23 A fa szerkesztése, 1000 G13 39 G04 véletlenszerő ismétlést (bootstrap) G23 figyelembe véve, a MEGA 3.1 G22 programcsomag „Neighbor33 M11 44 Joining” algoritmusának G15 G27 felhasználásával történt. G34 Skála: nukleotidcserék száma 28 Pioneer pozíciónként. Az egyéb turgidum 31 G07 magyarázatokat ld. a törzsfák G17 ábrái után a szövegben. 11 G37 G03 40 G36 99 G11 G25 G26 M04 28 G40 G38 35 G10 G18 G43 G12 41 G39 tauschii 40 G24 31 40 G21 41 G16 20 61 M08 26 67 G14 65

D genom csoport

searsii 77 sharonensis speltoides

97 55

M05 urartu monL11581 monAJ301800 64 59 M20 M02 100

S (B) genomú fajok

Aegilops típusú szekvenciák

70

aestivum csoport

A genom csoport M01 Rozs 100 26 M10 28 M15

Rozs csoport Poa

0.005

49

19. ábra. „Legnagyobb takarékosság” eljárással készült, 118 egyformán takarékos fa alapján számított konszenzus törzsfa 52 szekvencia bevonásával. A fa szerkesztése, 1000 véletlenszerő ismétlést (bootstrap) figyelembe véve, a MEGA 3.1 programcsomag „Maximum Parsimony” algoritmusának felhasználásával történt. Skála: nukleotidcserék száma. Az egyéb magyarázatokat ld. a törzsfák ábrái után a szövegben.

32

23 22

aestivum csoport

S (B) genomú fajok D genom csoport

Aegilops típusú szekvenciák

72

Galahad G13 G01 G04 23 G22 G23 G02 G05 15 G19 62 G42 G03 G36 G11 G37 G17 Pioneer 97 16 G07 turgidum G34 M11 36 G15 G27 G25 M04 G10 32 G18 G26 G38 G40 G43 speltoides searsii 81 sharonensis tauschii G12 35 G39 65 40 M08 53 G14 G24 43 G16 40 G21 M05 urartu 91 M20 53 monAJ301800 49 monL11581 M02 Rozs 99 M15 95 M01 M10 Poa

A genom csoport

Rozs csoport

5

50

A MEGA 3.1 programcsomag „Neighbor-Joining” és „Maximum Parsimony” faépítési módszereinek, ill. bootstrap próbájának alapértelmezett opcióit használtam, melyek részleteit ld. az „Anyagok és módszerek” rész „Filogenetikai analízis” fejezetében. A 10%-nál magasabb bootstrap támogatottsági értékeket az adott ágak közelében jelenítettem meg. Ezek a számok kifejezik, hogy a konszenzus törzsfa felépítésénél figyelembe vett fák hány százalékánál jelent meg az adott ág önállóan. A B genomot reprezentálandó, a Sitopsis szekció három faját vontam be az analízisbe, ezeket a „speltoides” (Ae. speltoides, AJ301804, Rudnóy és mtsi 2004), ill. a „searsii” (Ae. searsii, AF149194) és „sharonensis” (Ae. sharonensis, AF149195) taxonok (mindkettı Wang és mtsi 2000) képviselik a fákon. Az alakor búzák csoportját három, már publikált szekvencia képviseli, ezek az „urartu” (T. urartu, ld. fönt), „monL11581” (T. monococcum, ld. fönt) és „monAJ301800” (T. monococcum, AJ301800, Rudnóy és mtsi 2004) egységek. A többnyire jól elkülönülı csoportokat a jobb láthatóság kedvéért különbözı színekkel jelöltem, így az aestivum csoportot fekete, a D genom csoportot zöld, az A genom csoportot sötétvörös és a rozs csoportot szürke szín jelzi. Az egységes csoportot nem alkotó, de egymás közelébe térképezıdı Sitopsis fajokat sötétcián színnel jelöltem. Külcsoportként általában a belcsoporthoz legközelebbi taxont szokás választani. Ez jelen esetben értelmezésbeli és egyéb problémákat is fölvet. Úgy találtam, hogy a Bromus és Avena ITS szekvenciák, amelyek a legkézenfekvıbbek, nem teljesen megfelelıek, ezért olyan külcsoportot kerestem, amely a vizsgált szekvenciák mindegyikétıl (beleértve a rozsét is) nagyjából egyforma evolúciós távolságban van. Így a rendelkezésre álló lehetıségek közül, több elızetes próba alapján a Poa pratensis (réti perje; AY237834, Brysting és mtsi 2004) fajt választottam külcsoportnak; a fenti fákon a külcsoportot („Poa”) piros szín jelzi. A belcsoport legjobban elkülönülı kládja a rozs csoport, ami három törzsfán külön ágként jelentkezik, a 16. ábra fáján pedig az A genom csoporttal kerül egy ágra. Ez összhangban van azzal a ténnyel, hogy az Aegilops és a Triticum nemzetség közelebbi rokonságban van egymással, mint a Secale nemzetséggel, noha mindhármat a Triticeae tribuszba sorolják. A rozs csoportba tartozó szekvenciák alig különböznek egymástól, leszámítva az M02 és M09 klónokat, amelyek egyedi tulajdonságairól már volt szó. A búzajellegő szekvenciák közül az A genom csoport szerepel a leginkább önálló helyzetben, de az elıbbieknek megfelelıen természetesen közelebb áll a fák nagy tömegét adó aestivum típusú szekvenciák csoportjához. A csoport magas, 88-97 %-os bootstrap támogatottsági értékekkel jelenik meg önálló kládként a fákon. 51

Az aestivum csoport mutatja a legegységesebb képet: erısen támogatott klád (97-99 % bootstrap értékek) és bármely két eleme között igen kicsi a távolság, ezt jól érzékeltetik a rövid végágak. Az aestivum csoport az Aegilops típusú szekvenciákhoz közelebb áll, mint az A genom csoporthoz, ez legtisztábban a 19. ábrán jelenik meg, ahol egy bifurkáció egyik ágán az A genom csoport, a másikon a maradék búzaféle szekvenciák helyezkednek el, az utóbbi ág pedig kettéválik az aestivum csoportra és az Aegilops típusú elemekre. A D genom csoport minden esetben monofiletikus és egységes csoportként térképezıdik. Emellett a parszimónia fákon feltőnı az Ae. tauschii ITS „ısi”, központi elhelyezkedése a csoport többi tagjához, a D típusú klónszekvenciákhoz képest, ami támogatja azt a közkelető véleményt, hogy az Ae. tauschii faj egy (vagy több) ısi formája lehetett a közönséges búza D genomjának ıse. Az Aegilops fajokkal rokonítható szekvenciák az elsı három törzsfán nem alkotnak egységes csoportot. Ennek oka az Ae. speltoides szekvencia különállása. Ez többnyire nem szerepel egy ágon a többi Aegilops jellegő elemmel, amelyek rendesen úgy jelennek meg, hogy az egységes D genom klád testvércsoport ága tartalmazza az Ae. searsii és Ae. sharonensis fajok ITS szekvenciáját. A Sitopsis szekció három itt szereplı faja csak a 19. ábra parszimónia törzsfáján kerül egy ágra, ahol az Aegilops klád az aestivum típusú szekvenciák testvércsoportját képezi és a leszármazást tekintve az S genom mutatkozik ısibbnek, köztük is elsısorban az Ae. speltoides, és a D genom csoport fiatalabbnak. Ezek a következtetések és ez a fa közelít legjobban a témával kapcsolatos mai elképzeléseinkhez, de nem szabad figyelmen kívül hagyni, hogy a másik három törzsfa nem pontosan ugyanezt a képet mutatja. Legfeltőnıbb az Ae. speltoides ITS szekvencia bizonytalan térképezıdése, elkülönülése a másik két S genomú fajtól és az, hogy a „szomszédcsatolásos” fákon jóval ısibb pozícióba kerül, mint a parszimónia fák esetében. Ez emlékeztet Zhang és mtsi (2002) eredményeire, akik azt találták, hogy ez a faj filogenetikailag „kilóg” a Sitopsis csoportból, de legközelebb áll a tetraploidok B és G genomjaihoz. Fontos eredmény, hogy a klónszekvenciák igen jól illeszkednek a törzsfákon kirajzolódó kládokba, ami támogatja az adott csoportokba való rendezésüket és megmutatja, hogy az itt alkalmazott speciális módszer segítségével képet alkothatunk a közönséges búza genomjaiban „rejtızködı” ITS formákról, amelyek a búza eredetkutatásához is támpontul szolgálhatnak, ill. fontos módszertani problémákra világíthatunk rá általuk.

52

Az eredmények értékelése

A direkt szekvenálások tapasztalatai Az Mv15 búzafajta mesterségesen bevitt rozs genetikai eleme erısen megnyilvánul a direkt nrITS szekvenciában, sıt, a klónozás után kapott szekvenciák felét is a rozs típus képviselte. Ez a tény egyrészt nem segítette céljaimat, hiszen az Mv15 direkt nrITS szekvencia létezı ITS kópiák hibridjének tekinthetı és összehasonlítva a legfontosabb rokonok ITS-eivel (11. ábra), nem mutat értelmezhetı evolúciós forgatókönyv irányába. A rozs jelleg annyira kifejezett benne, hogy jobban hasonlít a rozs ITS szekvenciájára, mint a búzákéra (12. ábra). Másrészt viszont ez az eredmény adta az ötletet ahhoz, hogy speciális eljárás segítségével „megszabaduljunk” a rozs típusú szekvenciáktól és feltárjuk a fajtára jellemzı egyetlen, vagy még jobb esetben az algenomokra jellemzı többféle ITS formát.

M08 G39 tauschii speltoides searsii sharonensis M04 M11 turgidum Pioneer Galahad urartu monL11581 M20 Rozs 2

20. ábra. „Maximum Parsimony” törzsfa a fıbb csoportokat reprezentáló néhány szekvencia bevonásával. Külcsoport: rozs. Skála: nukleotidcserék száma. A törzsfa szerkesztése, a színjelölés és a referenciák ugyanazok, mint a korábbi törzsfáknál (16-19. ábra).

53

Az Mv15 fajta aestivum típusú klónjai két, egymástól alig különbözı ITS szekvenciát mutatnak, ezeket reprezentálhatja a két típus egy-egy klónja, pl. az M04 és az M11. Ezek némi óvatossággal megfeleltethetıek egy olyan ITS szekvenciával, amelyet az Mv15-bıl lehetne kapni direkt PCR és szekvenálás módszerével, ha nem volna benne jelen a rozs 1RS elem. Ezt alátámasztja a két klón közti kis különbség és az aestivum csoport referencia tagjaival fennálló nagy hasonlóságuk. A 20. ábra törzsfája tartalmazza a fıbb csoportokat néhány kiragadott elemmel (referenciák és néhány klónszekvencia), ill. az Mv15-öt képviselı M04 és M11 klónokat. Ez a törzsfa „legnagyobb takarékosság” módszerrel készült, de a „minimum evolúció” és a „szomszédcsatolás” eljárás, ill. a bootstrap teszt alkalmazása sem befolyásolja fıbb vonalaiban az eredményt. A törzsfából az a következtetés vonható le, hogy a közönséges búzára jellemzı (általam aestivum típusúnak nevezett) ITS szekvenciák közelebbi rokonságban állnak az Aegilops típusú ITS-sel, mint az A genoméval. Ez adódhat abból, hogy a hexaploid genom legfiatalabb és emiatt talán legerısebben megnyilvánuló tagja (algenomja) az Ae. tauschii-ból származtatott D genom, de valószínőbb, hogy az S genom dominanciája jelenik meg, hiszen ebbe az aestivum csoportba beletartozik a tetraploid T. turgidum ssp. dicoccum is, amely nem hordozza a D genomot, viszont az S-sel rokon B genomot igen. Az itt feltüntetett törzsfán az S genom valóban közelebbi rokonságba kerül az aestivum csoporttal, mint a D genom, de ez már változhat a faszerkesztési eljárástól függıen. A plasztiszban lokalizált markereink közül a konzervatívabb 16S rRNS gén esetében találtam két ponton eltérést a Chinese Spring és az általam meghatározott három azonos szekvencia (T. turgidum ssp. dicoccum, Ae. speltoides, Ae. tauschii) között, ezek közül az egyik pozícióról tudjuk, hogy az Mv15 fajta korábban szekvenált 16S génje is eltér ott a Chinese Spring fajtáétól. A cp16S rRNS gén nagyon konzervatív, a Chinese Spring búza szekvenciája a kukoricáétól (X86563, Maier és mtsi 1995) négy, a rizsétıl (AY522330, Tang és mtsi 2004) és a cukornádétól (AP006714, Asano és mtsi 2004) mindössze két-két nukleotidban tér csak el. Ehhez képest meglepı, hogy a három új szekvencia és a korábban mások által meghatározott Mv15 génje egyáltalán különbözik egymástól és a Chinese Spring búzától (13. és 14. ábra). Bonyolítja a helyzetet, hogy a gén 5’ végén talált eltérések már abban a rövid részletben találhatóak, amelyhez a „bal oldali”, vagy forward PCR-primer köt (21. ábra). Ez fokozza a szekvencia bizonytalanságát, mert a primernek megfelelı részen általában romlik az elektroferogram olvashatósága, ráadásul a beépülı bázisokat nem a

54

célszekvencia határozza meg, hanem a primer, amely akár el is térhet attól kis mértékben, bár itt a primer nem tért el a vélt célszekvenciától (21. ábra).

24f 16sUJ Mv15 C Spring

1 1 1 1

----ATGGAGAGTTCGATCCTGGC-------------------------------------------TGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCA ---------GAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCA TCTCATGGAGAGTTCGATCCTGGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCATGCTTAACACATGCA ***** *********------------------------------------

20 52 51 60

21. ábra. A három újonnan meghatározott, egyforma 16S rDNS-szekvencia („16sUJ”), ill. az Mv15 és a Chinese Spring („C Spring”) búzafajták 16S rDNS-szekvenciái illesztésének egy részlete, a gén 5’ végén, kiegészítve az újonnan szekvenált gének fölszaporításához használt 24f PCR-primer szekvenciájával. A színes karakterek a variábilis pontokat, a csillagok a teljes egyezést jelölik.

Amint az ábrán látható, a 24f primer teljesen azonos a Chinese Spring megfelelı részletével, vagyis az elızetes várakozások szerint a T. turgidum, Ae. speltoides és Ae. tauschii cp16S génjével is. Megjegyzem, hogy a rizs, kukorica, cukornád, szója, dohány és az Arabidopsis megfelelı részletével is teljesen egyezik, viszont az általam szekvenált három búzaféle két ponton, ill. az Mv15 egy ponton biztosan különbözik a primertıl s ezzel az említett növényektıl is. A Pinus thunbergii (D17510, Tsudzuki és mtsi 1992) és más nyitvatermık 16S rDNS-e ellenben egy ponton eltér ettıl az „alapszabástól”, az Mv15 génje 6. pozíciójának megfelelı ponton ahhoz hasonlóan timint hordoz (zöld jelölés a 21. ábrán), az összes többi említett szekvencia citozinjával szemben. Egyrészt kizárható, hogy a szekvenciáinkban bármiféle nyitvatermı DNS nyilvánulhatott volna meg, másrészt az általam szekvenált három búzaféle, ill. az Mv15 fajta 16S génjében talált variabilitás egymást erısítı független kísérletek eredményei, mert az Mv15 szekvenciáját más laborban, más módszerrel és fıként más primerekkel határozták meg (Kovács és mtsi 2000). Az Mv15 génjének elején található eltérési pont (zöld jelölés a 21. ábrán) C → T csere eredménye, ha eltekintünk attól a kevéssé valószínő esettıl, hogy több lépésben jött létre a mutáció. Ez a fajta báziscsere elég gyakori és kapcsolódik a nagy jelentıségő DNS-metiláció jelenségéhez, ugyanis többek közt a mutációra hajlamos metilációs pontokon jelenik meg: a citozin deaminációja és metilációja révén a timin lesz az új bázis. Ez jellemzı pl. a pszeudogénekre. Pszeudogének képzıdését már kimutatták sejtmagi RNS gének esetében, de nem valószínő a plasztiszban. Tehát ez minden

bizonnyal

SNP,

vagyis

egynukleotidos

polimorfizmus

(single

nucleotide

polymorphism), bár az SNP definíciójához hozzátartozik, hogy a populáció legalább 1%-ában

55

elıfordul, ezt pedig itt nem volt szándékunk vizsgálni. A C→T csere az SNP-k között is a leggyakoribb változásnak számít (Vignal és mtsi 2002). Elképzelhetı, hogy ez az SNP kimondottan a búzafélékre jellemzı, de az is, hogy az ismertté vált szekvenciák számának növekedésével más növénycsoportokban is felbukkanhat. Ezen az SNP ponton tehát timin van az Mv15 fajtában, az anyai vonalon a tetraploid T. turgidumban, és az Ae. speltoides-ben, ill. az apai ágon az Ae. tauschii mintánkban is, ugyanakkor a Chinese Spring búzában az „eredeti” citozin található. Mindez emlékeztet Ishii és mtsi (2001) eredményeire, akik plasztisz mikroszatellit lokuszokat vizsgálva azt találták, hogy a T. turgidum és a belıle származtatott T. aestivum minimum két független plasztisz eredettel bír. Természetesen ennél messzebb menı következtetés levonásához sokkal kiterjedtebb vizsgálatra lenne szükség. A 16S génnél változékonyabbnak feltételezett, gének közötti elválasztó szakaszokat tartalmazó cpITS-2-3 régióban (9. ábra) nem találtam különbségeket a minták között. Valójában nem ez az invariabilitás a meglepı, hanem az elızıekben kifejtett variancia a 16S génben. Ez a régió a kísérletek elvégzése idején még kevés növényfajból volt ismert, mára több, mint 50 növényfaj teljes plasztisz genomja szerepel a nemzetközi adatbázisban, köztük az egyszikőek képviseletében a búza, a cukornád, a kukorica és a rizs. E négy növénybıl összehasonlítva a vizsgált régiót, a búza a rizstıl 5, a cukornádtól 13, a kukoricától pedig 18 nukleotidban tér el; az utóbbi kettı tartalmaz egy 5 bázisos inszerciót az elıbbi kettıhöz képest. A 16S rRNS génnel összevetve inkább vártunk eltérést ennél a régiónál, mely gének közötti nem kódoló szakaszokat is tartalmaz, de a vizsgált régió nem mutatott variabilitást a mintáink között. A direkt szekvenálások eredményei nem adtak kielégítı választ a kérdéseinkre. Az nrITS régió vizsgálatánál, fıként az általunk használt Mv15 búzafajta esetében, további feldolgozást igénylı eredmények születtek, amelyek ugyanakkor ötletet adtak ahhoz, hogy megvizsgáljuk az algenomok ITS-rokonsági viszonyait a hexaploid búzán belül. A plasztisz markereink közül a cpITS-2-3 szakasz nem bizonyult a vizsgált szinten változékonynak, a cp16S rRNS génnél talált SNP-nek viszont késıbb még lehet jelentısége különbözı plasztiszvonalba tartozó búzafajták azonosításakor.

56

Az új módszerrel nyert eredmények értékelése A speciális – metiláció „ellen” hatásos – PCR/klónozás módszer használatával sikerült kimutatni olyan nrITS kópiák jelenlétét a közönséges búza genomjaiból, amelyek a szokásos PCR technikával nem jelentek meg. A szülıi ITS típusokhoz hasonló formák megjelenése nem lehet a véletlen mőve, nem a PCR hibájának eredménye, hanem az egykori allopoliploidizációk, esetlegesen késıbbi hibridizációs események nyomai. Az Mv15 búzafajta esetében bebizonyosodott, hogy a direkt ITS szekvencia egyértelmően hibrid jellegő: a klónok között egy sem akadt, amelyik azonos lett volna vele, ellenben jól elkülönültek az aestivum típusú és a rozs jellegő szekvenciák, amelyek nyomai egyaránt megjelentek a direkt szekvenciában. A Galahad fajtánál más a helyzet: a 40 aestivum típusú klónszekvenciából hat azonos az eredeti direkt szekvenciával, tehát nem lehet kijelenteni, hogy az mőtermék lett volna, de a többi 34 eltérı klón arra figyelmeztet, hogy az rDNS sorozatok ITS kópiái itt sem azonosak. Erre utalnak a D genom típusú szekvenciák is, amelyek nyoma nem nyilvánul meg a direkt ITS szekvenciában, valószínőleg a metiláltság, ill. az abból következı rosszabb denaturálódási hajlandóság miatt. Technikai szempontból két fı kérdés merül föl: (1) milyen szekvencia képzıdik és hogyan a direkt PCR során, (2) mi az, ami rejtve marad és pontosan miért. (1) Az Mv15 fajtánál a hagyományos PCR eljárás esetében olyan szekvencia képzıdik, amely az aestivum és a rozs típusú ITS jellegzetességeit egyaránt mutatja, azaz az eltérési pontokon hol az egyikkel, hol a másikkal egyezik, sıt, önálló eltérési pontok is akadnak. Ez nyilván azt jelenti, hogy a végül kialakuló szekvencia létrejöttében több eredeti templát részt vesz. Ezek itt egyrészt az aestivum típusú ITS sorozatok, másrészt a rozs kromoszómaelem ITS kópiái, amelyek, úgy tőnik, nagyon erısen megnyilvánulnak az Mv15-ben. A szekvencia nem tipikus kiméra, amely az ITS esetében létrejöhetne pl. úgy, hogy a konzervatív 5,8S gén egyik oldalán az ITS-1 az egyik, a másik oldalon az ITS-2 a másik templátból származna. Ilyen típusú kiméra szekvencia képzıdésére volt példa a klónozásos módszernél az M09 klón esetében. Ehelyett elszórtan keverednek a rozsjellegő, illetve a Pioneer, mint referencia búzafajta ITS-ével egyezı bázisok elıfordulásai a variábilis pozíciókban. Ha több templát együttesen van jelen a kiindulási anyagban, a PCR jellemzı végeredménye az ún. kevert szekvencia, ami azt jelenti, hogy többféle amplikon képzıdik a reakció végére, ami az elektroferogramban azt eredményezi, hogy az eltérı hosszúságú és összetételő amplikonok

57

fluoreszcens jelei átfednek, összekeverednek, végeredményben olvashatatlan jelsorozatot adnak. Itt nem pontosan ez történt, hiszen olvasható, értékelhetı szekvencia az eredmény, bár hozzá kell tenni, hogy az Mv15 ITS-2 részében megjelenı három azonosíthatatlan bázis minden bizonnyal a kevert szekvencia eredménye. A rozs ITS 601, az átlagos búza (aestivum típusú) ITS viszont 602 nukleotid hosszúságú, tehát adott a lehetıség az elektroferogramban az eltérı szekvenciák egymáshoz képesti elcsúszására, ami igen jól láthatóan zavaros, szinte, vagy teljesen olvashatatlan jelsorozatot generál. Ugyan majdnem biztosra vehetı, hogy egynél több ITS féleség sokszorozódik ebben a reakcióban, mégis a végeredmény inkább azt sejteti, hogy képzıdik egy domináns szekvencia, amely az említett hibrid tulajdonságokkal bír. Ez nagy valószínőséggel a PCR reakció jellegzetességeinek köszönhetı. Már a kilencvenes évek elején felfigyeltek rá (Wagner és mtsi 1994), hogy amikor ugyanazoknak a primereknek több kötıhelyük van a genomban (pl. géncsaládok esetén), elıfordul, hogy a termékek nem a valós arányaikban jelennek meg a reakció végén. Erre a szerzık két esetet tételeznek föl: a szelektív (PCR selection) és a sodró PCR-t (PCR drift). A szelektív PCR mindig az egyik szekvencia felé szelektíven hatásosabb, míg a sodródásnál véletlenszerően egyik, vagy másik szekvencia lesz dominánsabb a reakció végére. A vizsgálatok szerint mindkét jelenség a PCR korai ciklusaiban hat legerısebben. Ez esetünkben nem ad teljes magyarázatot, hiszen nem szól a hibrid szekvencia létrejöttérıl, de magyarázza a domináns szekvencia képzıdését: az elsı ciklusokban a többféle ITS kópia közül az egyiket nagyobb eréllyel sokszorosítja a Taq polimeráz és ez lesz késıbb az uralkodó forma, noha minden bizonnyal ettıl eltérı kópiák is jelen lesznek a reakciótermékben. Mivel az erısen denaturáló PCR és a klónozás kombinációjával nem jelent meg a direkt szekvenciával egyezı forma a termékek között, nagyon valószínő, hogy nem egy eleve a genetikai állományban létezı ITS kópia vált meghatározóvá, hanem a PCR során alakult ki ez a bizonyos hibrid ITS. Ha ez történt, az bizonyosan a PCR korai ciklusaiban következett be és összefüggésbe hozható a Taq polimeráznak azzal a tulajdonságával, hogy nem rendelkezik 3’→5’ exonukleáz aktivitással. Ez oda vezethet, hogy amikor több, nagyon hasonló templátról készülnek egyidejőleg másolatok, akkor ezek nagy eséllyel renaturálódhatnak hibrid kettıs szálakat képezve, ami a kisebb hibajavítási képesség miatt elıbb-utóbb keverék hibrid amplikonokat eredményezhet. Hogy ez szelekció, vagy sodródás útján valósulna meg, sok független kísérlet futtatásával lehetne csak kideríteni, de mivel a szóba jöhetı ITS formák különbsége viszonylag csekély, és a primerek kötıhelyei szinte bizonyosan egyformák, valószínőbbnek tartom, hogy a véletlennek van nagyobb szerepe a kialakuló hibrid szekvencia létrejöttében.

58

(2) Az erısen denaturáló PCR és a klónozás együttes alkalmazásával több ITS féleség is kimutathatóvá vált, amelyek közül egyesek egyértelmően részt vettek az Mv15 hibrid jellegő direkt szekvenciájának létrejöttében, míg másoknak a nyoma nem fedezhetı fel abban, illetve a Galahad búza direkt ITS szekvenciájában. Ezek tehát olyan ITS kópiák, amelyek jelen vannak a genetikai állományban, de a szabvány körülmények között futtatott PCR során nem kapunk róluk információt, vagyis nem készül róluk kimutatható számú másolat. Ez szinte bizonyosan a metiláció, a metilált állapot eredménye, ami összefügg a búza allopoliploid voltával. A poliploid növények „kihasználják” a megtöbbszörözött genetikai állomány nyújtotta lehetıségeket, mint pl. ugyanazon gén elınyösebb variánsának használata, de a normális mőködéshez

szükségük

van

egyfajta

kvázi-diploid

állapot

fenntartására,

amivel

megakadályoznak olyan nemkívánatos interakciókat, amelyek a független genomok egyidejő mőködésével kialakulhatnának. Ezt fıként a gének, genomok elnyomásával, elcsendesítésével érik el (Soltis és Soltis 1995, Cunado és mtsi 2005). Az újonnan kialakuló allopoliploidokra jellemzı a gyors, nem-Mendeli genom evolúció, amelyben a metiláció a legfontosabb epigenetikus változás, és szerepe lehet többek között a bevándorló szekvenciák (transzpozon, transzgén) elnyomásában is (Wendel 2000). Liu és Wendel (2003) szerint az allopoliploidizációt gyakran kísérik gyors és evolúciósan is konzervatív epigenetikai változások, amelyek közt pl. a citozin metiláció fontos szerepet játszik. Az allopoliploid növénynek ugyanabból a lokuszból több lehetséges gén áll rendelkezésére, de az esetek nagy többségében ezek közül csak az egyik genom alléljai mőködnek, a többi elnyomott állapotban van, elsısorban metiláció útján. A kevés kivétel közé tartoznak búzánál bizonyos izoenzim és endospermium-fehérje gének, amelyek sok búzavonalban egynél több genomból is kifejezıdhetnek egyidejőleg (Galili és Feldman 1983, Wendel 2000). Így tehát a búzában sok szekvencia van metilált állapotban, ezek pedig a PCR során a funkcionáló lokuszoktól eltérıen viselkednek. Többen vizsgálták a funkcionáló és a funkciós kényszer alól kikerült szekvenciák viselkedését a PCR során (Buckler és mtsi 1997, Rauscher és mtsi 2004, Razafimandimbison és mtsi 2004), de az eredmények némiképp ellentmondóak és a metiláció közvetlen szerepérıl nem szólnak. Tapasztalatok szerint azonban a metilált, és fıként az erısen metilált DNS jóval nehezebben amplifikálható PCR-ben, ugyanakkor az erısen denaturáló lépések jelentısen fokozzák a siker lehetıségét. Erısen metilált DNS-t tartalmazó gombaspórák vizsgálatakor találták azt, hogy a szokottnál magasabb denaturációs hımérséklet jelentısen növeli a PCR hatékonyságát (Parádi, személyes közlés). Az erısen denaturáló közeg megvalósítható DMSO jelenlétével a reakcióelegyben, vagy a szokottnál 59

sokkal magasabb hımérséklet alkalmazásával a PCR denaturációs lépéseiben. Én az utóbbi módszert használtam kísérleteim során. A Galahad búzafajta esetében az aestivum típusú ITS szekvenciák közt akadt olyan (6 klón), amelyik teljesen megegyezett a direkt szekvenciával, de a nagy részük (34 klón) eltért attól többé, vagy kevésbé (1-10 bázis). Ennek több oka is lehet, amit késıbb bıvebben kifejtek, de a csoport egészét mégis reprezentálja a direkt ITS szekvencia, míg a teljes D genom csoportot olyan klónszekvenciák alkotják, amelyek nyoma nem jelenik meg a direkt szekvenálás során. Ezek a szekvenciák nagy valószínőséggel metilált állapotuk miatt nem szaporodnak föl a szokásos eljárásban. Ez arra utal, hogy a D algenom rDNS sorozatai elcsendesített, metilált állapotban vannak. Az Mv15 fajtánál négyféle ITS csoportot kaptunk a klónok elemzése után, ezek között nem meglepı az aestivum típus gyakorisága, jelentıs a rozs típusúak száma, emellett kis számban megjelent a D genom típusú és az A genomra jellemzı szekvencia is. Az aestivum típusú klónszekvenciák egységesebb képet mutatnak, mint a Galahad esetében és alig térnek el a referenciáktól. Mivel nyomuk megjelenik a hibrid jellegő direkt ITS szekvenciában, nem valószínő, hogy metilált állapotban lennének jelen a genomban. Ugyanez igaz a rozs típusú kópiákra, melyek itt a legszámosabb csoportot képviselik, az Mv15 ITS klónjainak a fele idetartozik. Ha azt tekintjük, hogy a rozs jellegő szekvenciák eredetileg egyetlen rövid, transzlokációval bevitt kromoszómakar (1RS) sorozatain foglalnak helyet, feltőnı az igen erıs megnyilvánulásuk. Erre véleményem szerint több magyarázat lehetséges: egy kevéssé valószínő lehetıség, hogy az együttes evolúció homogenizáló hatása kezdett érvényesülni és az 1RS rDNS sorozatai terjedni kezdtek az Mv15 genetikai állományában a többi, eredeti sorozat rovására, de ennek az eltelt idı rövidsége miatt nagyon kicsi az esélye, bár találtak már példát az rDNS sorozatok viszonylag gyors homogenizálódására allopoliploid növényben (Kovarik és mtsi 2004, 2005). Egy másik magyarázat az lehet, hogy a búza metiláz enzimek a rozs eredető kromoszómarész DNS-ét sokkal kisebb eréllyel metilálják, tehát egyfajta inkompatibilitás miatt a transzlokációs elem csendesítése, expressziós szabályozása csorbát szenved, s így a rajta elhelyezkedı rDNS lokuszok erısen kifejezıdnek. Ez azonban ellentmond korábbi eredményeknek, amelyek azt mutatják, hogy a rozs genetikai elem a búza „háttér” elıtt igen kevéssé nyilvánul meg, feltehetıleg azért, mert sok helyen és köztük kulcspozíciókban metilált, s emiatt regulációs fehérjék kapcsolódási nehézségei miatt a kérdéses gén inaktív marad (Houchins és mtsi 1997). Mindez leginkább Razafimandimbison és mtsi (2004) eredményeire emlékeztet, akik három trópusi fafaj esetében azt találták, hogy bármilyen PCR körülmények között elsısorban a nem funkcionáló pszeudogén nrITS (benne 60

az 5,8S rRNS génnel) kópiák amplifikálódtak, ráadásul ık is találtak kiméra jellegő kevert szekvenciát elemzéseik során. Ugyanakkor a pszeudogén nrDNS sorozatok metiláltsági állapotát nem elemezték a fenti munkában. A D és A genom típusú szekvenciák, a Galahad vonalhoz hasonlóan, csak a speciális módszerrel kerültek elı, valószínőleg metilált állapotban vannak jelen a genomban. Az ellentmondás a metiláció szerepében a következı: tudjuk, hogy a rozs nrDNS a tritikále és a transzlokációs búza vonalakban kulcspozíciókban metilált és az egyedfejlıdés során többnyire jóval kisebb eréllyel expresszálódik, mint a búza kromoszómák hasonló sorozatai, ugyanakkor a PCR során normál és erısen denaturáló körülmények között is jól sokszorozódik. Viszont az erısen metilált DNS-rıl tudjuk, hogy megnehezíti a sikeres PCR-t és az eredményekben ezt igazolják az A és D genom típusú ITS kópiák, amelyek csak az erısen denaturáló PCR során jelennek meg. Az ellentmondás feloldása az lehet, hogy a metiláltság mértéke és a kópiaszám együttesen befolyásolja a DNS amplifikálhatóságát a PCR-ben, másfelıl a génexpresszió során a metiláltság mértékénél annak mintázata (metilált kulcspozíciók) nagyobb jelentıségő lehet. Azt, hogy a kapott klónszekvenciák funkcióképes rDNS sorozatokhoz tartoznak-e, nem könnyő eldönteni. Az rDNS régió, bár a gének konzervatív volta miatt statikusnak tőnhet, valójában dinamikusan változó lokusz, az evolúció során viszonylag rövid idı alatt is képes számában, elhelyezkedésében és szekvenciájában is változni. A szerkezeti változás természetesen elsısorban a nem kódoló szakaszokat érintheti. Dubcovsky és Dvořák (1995) feltételezték, hogy a Triticeae fajaiban a fajképzıdés során a NOR lokusz többször változtathatta a helyét a kromoszómákon, de anélkül, hogy belsı átrendezıdésen ment volna keresztül, oly módon, hogy kisebb kópiaszámú lokuszokat képezve szétszóródik a genomban, az új helyen megsokszorozódik a kópiaszám, a régi helyen pedig ezután törlıdik az eredeti NOR lokusz. A lokuszok áthelyezıdése közben elıfordulhat, hogy idegen genomi régióba kerül a lokusz, vagy egy része (minor lokusz), ilyenkor inaktívvá válhat, de az eredeti helyén is megtörténhet, hogy kikerül a funkcionáló sorozatok közül. A funkciójukat vesztett géneket pszeudogéneknek nevezzük. Buckler és mtsi (1997) szerint az rRNS pszeudogénekre jellemzı a kis becsült másodlagos szerkezeti stabilitás (vagyis magasabb szabadenergia-szint), a magas szubsztitúciós hányados és a sok csere a deaminációs metilálási pozíciókban. Továbbá, míg a funkcionáló ITS sok hajtőt tartalmaz és kompakt, stabil másodlagos szerkezete van, addig a pszeudogén rDNS sorozatokhoz tartozó ITS régiók nagy arányban tartalmaznak random cseréket, melyek destabilizálják a hajtőket és a másodlagos szerkezetet. Razafimandimbison 61

és mtsi (2004) az ITS pszeudogén jellegének megállapításához becsülték a legkisebb szabadenergiájú másodlagos szerkezetet az MFold program (Zuker 2003, http:// mfold.burnet.edu.au/) segítségével, és vizsgálták a nukleotid szubsztitúciós mintázatot. Az általuk pszeudogénnek tekintett ITS régiókra jellemzı volt az alacsony GC tartalom, ehhez kapcsolódóan a magas mutációs ráta A-ra és T-re, és a magasabb szabadenergia, vagyis a kevésbé stabil másodlagos szerkezet. Ezen kívül pszeudogénnek tekintették, ha az 5,8S rRNS gén egynél több mutációt tartalmazott. Ennek alapján hasonló vizsgálatokat végeztem az összes, általam elıállított klónnal és valamennyi, referenciaként használt szekvenciával. Sem a GC tartalmakban, sem a minimális szabadenergia értékekben nem találtam szignifikáns különbségeket, ezért nem is láttam értelmét a hosszú és nem informatív adatsorok közlésének. Az 5,8S génben hat klón mutatott egy darab, kettı klón pedig két darab eltérést az alapszabáshoz képest. Összegezve, a kísérleti eredményeket egyáltalán nem jellemzik pszeudogén jellegő szekvenciák, amit alátámaszt az is, hogy az Mv15 fajtánál a kapott aestivum és rozs típusú ITS-ek nagyon hasonlítanak a referenciákhoz, vagy azonosak velük, és ugyanez igaz a Galahad búza aestivum típusú klónszekvenciái egy részére is. Feltőnı ugyanakkor, hogy az azonos és a referenciákkal is egyezı klónokon kívül jócskán akadnak az aestivum és a rozs típusú klónok között is olyanok, amelyek egy, vagy néhány nukleotidban eltérnek, nem is beszélve a D genom csoport tagjairól, amelyek 3-11 bázisban térnek el a referenciáktól. Ennek két oka lehet, (1) vagy a módszer hibája, (2) vagy pedig a két vizsgált búzafajta genomjában valóban több különbözı ITS paralóg létezik, még a csoportokon belül is. (1) A módszer hibája a PCR során esetlegesen keletkezı hibás nukleotid-beépítésekbıl, ill. a klónozás mőveletében esetleg megjelenı mutációkból tevıdhet össze. A PCR-ben használt hıstabil DNS-polimeráz enzimek beépítési hibarátáját már a nyolcvanas évek óta többen tanulmányozták. Cline és mtsi (1996) vizsgálták a leggyakrabban használt polimerázok megbízhatóságát, és azt találták, hogy a Taq polimeráz átlagos hibarátája 8(±3,9)×10-6, a Pfu polimerázé pedig 1,3(±0,2)×10-6 (mutációs gyakoriság/bp/duplikáció). Ha az egyszerőség kedvéért minden ciklust duplikációnak tekintünk, és az átlagos 602 nukleotid hosszúságú amplikonnal számolunk, akkor a következı átlagos várható mutációs gyakoriságokat kapjuk: 1,3×10-6 × 602 bp × 35 ciklus = 0,027391 (Pfu), illetve 8×10-6 × 602 bp × 33 ciklus = 0,158928 (Taq). Legrosszabb esetben összeadódhat a két érték, ekkor 0,186319 az eredmény, vagyis az egy nukleotidot sem éri el. A klónozás hibalehetıségét jóval nehezebb megbecsülni. Drake és mtsi (1998) szerint az E. coli átlagos mutációs rátája 0,0025 62

/genom/replikáció, de ez erısen módosulhat a klónozás folyamatában, hiszen speciális helyzetrıl van szó, amennyiben egy jelentısen megváltoztatott genomú E. coli sejtvonal plazmidjának mutációs rátája lenne a kérdés. JM109 típusú baktériumsejteket használtam, amelyek az inzert stabilabban tartása érdekében hibás rekombináz és endonukleáz génekkel rendelkeznek, így csak a replikációs hiba léphet föl a gyakorlatban. Megint csak az egyszerőség kedvéért feltételezem, hogy az ideális reakció szerint egyetlen kompetens E. coli sejtbe egyetlen plazmid kerül, amely szintén csak egy darab inzertet, vagyis adott szekvenciájú amplikont tartalmaz. Az inzertet is tartalmazó pGEM plazmid „genom” mérete 3619 bp. Ha 20 generációt feltételezünk (ez a 220, azaz kb. egymillió sejttel reálisnak tőnik), akkor 219 db osztódás történik, vagyis a várható mutációs gyakoriság 0,0025 × 602/3619 bp × 219 replikáció = 218, tehát a 220 sejtbıl átlagosan 218 db várható, hogy mutációt hordoz az inzertben. Ez az adott telep sejtjeinek 0,021%-a, tehát olyan kicsi arány, amely még a klónozást követı PCR-ben sem jelentkezhet észrevehetıen. Az itt ismertetett módszer során elıször Pfu polimerázt használtam az erısen denaturáló PCR-ben, ezután következett a klónozás, majd a plazmid DNS-bıl Taq polimerázzal újabb PCR, végül a ciklusos szekvenáló reakció, módosított Taq polimeráz enzimmel. A szekvenáló reakció hibarátája gyakorlatilag elhanyagolható, akárcsak a klónozás elıtti adenilálási reakcióé. A várható mutációk száma jóval egy bázis alatt van és véleményem szerint még ez az érték is túlbecslés. Az alkalmazott módszer tehát elég biztosnak tőnik ahhoz, hogy a kapott szekvenciákat megbízhatónak ítéljem. Igaz, ezzel csak a pontmutációs gyakoriságot becsültem, egyéb hibák is felmerülhetnek, hiszen tudjuk, hogy legalább egy kiméra szekvencia megjelent a kísérletekben, az M09 klónban, ahol az ITS-1 a T. monococcum, az ITS-2 pedig a rozs (S. cereale) ITS megfelelı részletével egyezik, s valószínőnek látszik, hogy ez a PCR hibájaként alakulhatott ki. Az ilyen hibákat azonban viszonylag könnyő kiszőrni a teljes ITS, illetve az ITS-1 és -2 szakaszok párhuzamos elemzésével. (2) A relatíve kis hibalehetıség miatt sokkal nagyobb a valószínősége annak, hogy a klónszekvenciák a valós viszonyokat tükrözik. Ez esetben az Mv15 fajtában (legalább) kétféle aestivum típusú, ötféle rozs típusú, két A genom és egy D genom típusú ITS paralóg létezhet, míg a Galahad fajtában huszonhatféle aestivum és hétféle D genom típusú forma. Mint korábban említettem, még diploid növényfajoknál is elıfordul, hogy többféle ITS paralóg található bennük (Baldwin és mtsi 1995), hibrid eredető poliploid fajnál ez nem meglepı, annál inkább a szekvenciák változatossága, a paralóg formák nagy száma. Ez arra utal, hogy a fiatal poliploid fajnak számító közönséges búzában számos olyan kisebb-nagyobb nrDNS

63

sorozat létezik, amely különbözik egymástól és egyrészt a régebbi hibridizációk nyomait ırzi, másrészt az újabb kelető genetikai-epigenetikai változások bizonyítéka. Az Mv15 nemesítése 1974-1985 között zajlott Martonvásáron, a ’60-as évek második felében Lukjanyenko által nemesített Kavkaz fajta alapján (Bedı és mtsi 1993, Kıszegi és mtsi 2000). Így a fajta rozs genetikai eleme mindössze néhány évtizedes múltra tekinthet vissza, de hogy mikor történhetett a transzlokáció, amely spontán is létrejöhet, tehát hogy mióta folyik az 1RS elem belsı evolúciója ezen a búzavonalon, kérdéses. A rozs típusú szekvenciák többsége azonos a Secale fajok ITS-ével, de néhány klón egy-két bázisban eltér, ami mégis arra figyelmeztet, hogy a rendelkezésre álló rövid idı is elegendı lehet eltérı paralógok képzıdésére. Még figyelemreméltóbb az M02 klón, amelynek ITS-1 szakasza egyezik a rozséval, az ITS-2 azonban 10 ponton is különbözik attól, ugyanakkor különbözik a szóba jöhetı összes ITS-tıl is, ami arra utal, hogy nem kiméra szekvenciáról van szó, mint pl. az M09 esetében. D genom típusú szekvenciákat mindkét fajtából sikerült izolálni: a Galahad fajtából hetet, az Mv15-bıl egyet, az azonban azonos a Galahad egyik idetartozó klónjával. A klónok 3-11 bázisban különböznek a referenciaként használt Ae. tauschii ITS-tıl és ha feltételezzük, hogy 8000 évvel ezelıtt nem sokban térhetett el a diploid faj ITS szekvenciája a jelenlegitıl, akkor kijelenthetjük, hogy ezek a változások az azóta eltelt idıben fixálódtak ezekben a D genom típusú szekvenciákban. Ez arra utal, hogy az allopoliploid faj algenomjai sokkal gyorsabban és másként változhatnak, mint a diploid szülıfajok genomjai, legalábbis az nrITS régiót tekintve. Az A genom esetében hasonló a helyzet, két ilyen klónszekvenciát izoláltam, de csak az Mv15 fajtából sikerült kimutatni, ezek az M05 és M20 klónok. T. urartu (AJ301803)

T. monococcum (L11581)

T. monococcum (AJ301800)

ITS-1 + 5,8 S + ITS-2

Σ

ITS-1 + 5,8 S + ITS-2

Σ

ITS-1 + 5,8 S + ITS-2

Σ

M05

9+1+2

12

9+1+2

12

9+1+5

15

M20

2+0+2

4

0+0+2

2

0+0+5

5

17. táblázat. Az A genom típusú klónszekvenciák eltérése az ITS-1, 5,8S rRNS gén és az ITS-2 szakaszokban a referenciaként választott diploid A genomú fajoktól (bp).

A jelenlegi elképzelések szerint a közönséges búza A genomja a T. urartu-tól származik (Dvořák és mtsi 1992, Ciaffi és mtsi 1997, Sallares és Brown 1999), bár korábban felvetıdött a T. monococcum donor szerepe is (pl. Gill és Chen 1987). Összehasonlítva a két klónt az A 64

genomot hordozó diploid fajok ITS szekvenciájával, hasonló mértékő egyezést kapunk (17. táblázat), de az M20 klón esetében feltőnı, hogy az ITS-1 szakasza teljesen egyezik a T. monococcum fajokéval, míg a T. urartu ITS-1 szakaszától két bázisban eltér. Ez az azonosság nem valószínő, hogy a T. monococcum faj A genom donor szerepét támogatná, hiszen kicsi az esélye, hogy az elsı hibridizációs lépés óta eltelt legalább félmillió évben ne divergált volna egymástól a donor és az A algenom ITS-1 szekvenciája. Sokkal inkább idıben közeli hibridizációs eseményre utal, vagyis arra, hogy az Mv15 vonalán valamikor a közelebbi múltban részleges hibridizáció történhetett a T. monococcum egyik változatával, talán egy termesztett alakor vonallal. A kapott két klón és az egyezések/eltérések mértéke nem elegendı ahhoz, hogy egyik, vagy másik A genomú diploid faj donor voltát bizonyítsa, hiszen pl. az M05 klón egyenlı mértékben különbözik a T. urartu és az egyik T. monococcum ITS-étıl, ami inkább arra enged következtetni, hogy a 0,5-3 millió évvel ezelıtti hibridizáció idejében vagy nem különült még el a két faj, vagy ha igen, az ITS-ük még nem különbözött jelentısen egymástól és a ma köztük meglévı csekély különbségek azóta alakultak ki. Mind az A, mind a D genomról kaptunk információt, de egyértelmően B genom típusú ITS szekvencia egyik klónozásnál sem került elı. Ugyanakkor jellemzı az aestivum szekvenciatípus, ami egyik diploid rokonfaj ITS régiójához sem hasonlít kiugróan, viszont szinte egyezik a tetraploid T. turgidum ssp. dicoccum (termesztett tönkebúza) ITS-ével. Itt jegyzem meg, hogy az ismertetett módszerrel a tönke mintánkból is megpróbálkoztam eltérı klónszekvenciákat elıállítani, de csak (a rá és a hexaploid fajtákra jellemzı) aestivum típusú klónokat kaptam. Tudjuk, hogy a B genomot adó donor szerepe a mai napig kérdéses, de biztosan a Sitopsis szekcióba tartozó öt Aegilops faj közül való, és nem kizárt egynél több faj hozzájárulása sem. Így tehát olyan ITS szekvenciát kerestem a klónok között, amely ezen fajok valamelyikével mutat jelentısebb hasonlóságot. A klónok közül legjobban a D genom típusúak hasonlítanak a Sitopsis fajok ITS-éhez, aminek oka, hogy az Ae. tauschii és a Sitopsis fajok (fıként az Ae. speltoides) ITS-e is meglehetısen hasonlít (ld. a törzsfákat a 1619. ábrákon), sıt az egész Aegilops nemzetségben viszonylag kicsi a régió variabilitása. Ugyanakkor ezek a klónok egyértelmően kevésbé különböznek az Ae. tauschii-tól, mint bármelyik Sitopsis fajtól. Szinte bizonyos, hogy itt érhetı tetten az együttes evolúció homogenizáló hatása, amelyet pl. Kovarik és mtsi (2004) figyeltek meg allotetraploid dohány mintáknál, ahol az rDNS lokuszok száma és elhelyezkedése additívnak bizonyult a diploid ısökébıl levezetve, viszont a restrikciós mintázat nem: az egyik szülı rDNS-ét majdnem, vagy teljesen fölülírták a hibrid típusú szekvenciák. Mivel egyik vad poliploid mintájuk

65

erısebben tartotta meg a szülıi rDNS mintázatokat, arra is következtetnek még, hogy a termesztés, ill. a többszörös eredet gyorsítja az rDNS homogenizációját. Mindkét vizsgált búzafajtánknál találtam aestivum és D genom típusú klónokat, az egyiknél (Mv15) A genom típusúakat is, és egyiknél sem B genom típusút. Ez egyrészt arra utal, hogy minél közelebbi hozzánk idıben az adott hibridizáció, annál valószínőbb a szülıi ITS elıfordulása, megmaradása a hibrid, poliploid genomban. Másrészt lehetséges, hogy a két fajta evolúciója egymáshoz képest hálózatos úton zajlott, hiszen különbség köztük az egyik ısi genom, az A elvesztése, ill. megtartása, viszont egyeznek abban, hogy a másik ısi genomot, a B-t nem hordozzák, és a legfiatalabb algenom, a D is hasonló bennük, van közös D típusú ITS formájuk. Eredményeink alapján arra lehet következtetni, hogy a hibridizáció után elıbb megváltoznak az ITS szekvenciák és csak késıbb kezdenek törlıdni. Erre utal, hogy az ısi A és B genom típus szinte, vagy teljesen eltőnt, a fiatalabb D típus megváltozott és számban lecsökkent, de a még fiatalabb rozs típus az Mv15-ben nagy számban és többnyire kevés változással megtalálható. Az A és B genomok hibridizációja után a jelek szerint elegendı idı állt rendelkezésre, hogy az együttes evolúció, a lokuszok közti génkonverzión keresztül, homogenizálja a szülıi nrITS formákat, mégpedig egy új, hibrid típusú szekvencia irányába. Ez a hibrid forma a klónok között nagy számban elıforduló aestivum típus lehet, míg az eredeti szülıi kópiák eltőntek, ill. számuk minimálisra csökkent – ez akár változhat is a különbözı vonalon evolválódott fajták, változatok között. Ez a folyamat már nagyjából a végére érhetett, mire a stabilizálódott tetraploid faj a második hibridizációs lépéshez érkezett. Mivel a D genom belépése csak kb. nyolcezer éve történt, a szülıi kópiák nyomai még megtalálhatóak, de már csökkent számban és különféleképp megváltozott szekvenciával, ami arra utal, hogy ezek a sorozatok már kikerülhettek a funkcionáló nrDNS körébıl. Valószínő tehát, hogy az aestivum típusú ITS kópiák tartoznak a funkcionáló nrDNS sorozatokhoz, de ezt nem lehet kizárni a többi típusnál sem. Az aestivum szekvenciacsoport sem volt homogén a fajtákon belül, az Mv15-nél kétféle, a Galahadnál huszonhatféle szekvencia tartozik ide, amire a legkézenfekvıbb magyarázat a nemesítés hatása lehet: régebben elkülönült búzavonalakban az együttes evolúció némileg eltérı aestivum típusú ITS formákat eredményezhetett és ezek kerülhettek egybe az intenzív keresztezési eljárások során. A két, általam vizsgált fajtából kapott, részben különbözı eredmények erısítik azt a véleményt, hogy a közönséges búza fontos jellemzıje a hálózatos evolúció. Sang és mtsi (1995) Paeonia fajoknál mutattak ki ilyet az nrITS régió felhasználásával. Sallares és Brown (2004) szerint már az A genomú búzáknál (T. urartu és T. monococcum) is hálózatos evolúció 66

játszódott le. Liu és mtsi (2003) hibridizációs (FISH) eredményeik alapján valószínősítik, hogy a B genom polifiletikus eredető. Ishii és mtsi (2001) bizonyították, hogy a közönséges búza legalább két független anyai eredettel bír, tehát minimum két tetraploid tönke vonalból származik a plasztisza. Tovább bonyolítja a képet Dvořák és mtsi (2006) eredménye, akik azt találták, hogy a vad tönke (T. turgidum ssp. dicoccoides) közvetlenül is részt vett a közönséges búza evolúciójában, ellentétben a korábbi elképzelésekkel. A D genom polifiletikus eredetére szintén egyre több eredmény utal (Talbert és mtsi 1998, Lelley és mtsi 2000, Caldwell és mtsi 2004), sıt fölvetıdött, hogy a G genom (T. timopheevii és T. zhukovskyi) is hozzájárulhatott a T. aestivum evolúciójához (Baum és Bailey 2001). Soltis és Soltis (1995) megállapítása szerint egy poliploid genomkombináció ugyanazon diploid genomokból többször, egymástól függetlenül is létrejöhet, és ez inkább szabály, mint kivétel. Az ilyen vonalak, melyekben más-más irányban hathat az együttes evolúció homogenizáló hatása, keresztezıdhetnek; az ısökkel, vagy közeli rokonokkal újra hibridizálódhatnak, s e folyamatokat felgyorsítja az emberi tényezı: a termesztéssel, szelekcióval, nemesítéssel, elterjesztéssel kapcsolatos újabb génáramlási lehetıségek. Így valószínő, hogy a dolgozatomban ismertetett módszert más búzafajtákra kiterjesztve az enyémektıl eltérı eredmények is születhetnek, s akár létezhet olyan vonala a közönséges búzának, amelyben az ısi B genom maradványai is felfedezhetıek, illetve más, újabb kelető hibridizációk nyomai kimutathatók. A hexaploid közönséges búzából direkt PCR és szekvenálás, ill. az itt bemutatott módszer felhasználásával különbözı információkat lehet nyerni az nrITS régióról. Az Mv15 fajta esetében bebizonyítottam, hogy a direkt módszerrel kapott ITS szekvencia nem valós ITS kópiák amplikonja, hanem többféle templát hibrid, keverék szekvenciája. A Galahad fajtánál a direkt szekvencia hat klónban megjelent, de elıkerültek azonos típusú, többé, vagy kevésbé eltérı ITS-ek is. Ugyanez más búzafajtáknál is elıfordulhat, hiszen lehetséges, hogy a mieinktıl eltérı szekvenciájú és arányú ITS-eket tartalmaznak. Valójában a múltban meglepıen egyszerően túlléptek a kutatók azon a tényen, hogy a búza allohexaploid genomi struktúrája miatt a PCR-ben többféle, vagy hibrid termék megjelenésére is számítani lehet. Igaz, hogy a három algenom homeológ lokuszai közül kettı többnyire szupresszált állapotban van, de egyrészt ez nem feltétlenül igaz minden lokuszra, másrészt ettıl még a keletkezı PCR termékben nyomot hagyhatnak az esetleg eltérı paralóg szekvenciák. Napjainkig csaknem 900.000 olyan nukleotid szekvenciát helyeztek el a szabadon hozzáférhetı nemzetközi adatbázisban (GenBank), amely a közönséges búzából 67

származik. Ezek nagy része és fıként a régebbiek hagyományos PCR és szekvenálás kombinációjával készültek, így tartalmazhatnak olyan hibákat is, amelyek eltérı paralóg szekvenciák közremőködésével jöttek létre és az eredményük nem valós, hibrid szekvencia. Ugyanez áll minden allopoliploid élılény nukleotid szekvenciáira, elsısorban az rDNS lokuszt értve ez alatt, de valójában minden olyan DNS elemnél figyelmet érdemel ez, amely egynél több kópiában van jelen az adott genomban, függetlenül a kópiák származásától. A dolgozatban bemutatott módszer tehát egyrészt alkalmas a hagyományos PCR során önállóan nem megjelenı nrITS formák feltárására, ezzel összefüggésben információkat ad a búza evolúciós történetérıl; másrészt fontos módszertani problémára hívja fel a figyelmet: poliploid, illetve több homeológ genetikai elemet tartalmazó vizsgálati objektum esetén, korrekt szekvenciák feltárásához erısen denaturáló PCR körülmények, magas átírási hőségő DNS-polimeráz és klónozás kombinációját érdemes alkalmazni.

68

Az eredmények összefoglalása, következtetések Munkám általam legfontosabbnak tartott eredményeit az alábbi pontokban foglalom össze: •

A közönséges búza direkt nrITS szekvenciája hibrid jellegő is lehet (Mv15)

•

A T. aestivum direkt nrITS szekvencia szinte megegyezik a T. turgidum ITS-sel, valószínőleg ısi szekvenciáknak az együttes evolúció által homogenizált hibridje, és így nem alkalmas a búza evolúciós történetének vizsgálatára

•

Egykori hibridizációk nyomai speciális módszerrel kimutathatók a búzából

•

E speciális módszer használata nélkül ezek a szekvenciák többnyire rejtve maradnak

•

A D genom egyértelmően azonosítható a búzából, az A genom nyomai fellelhetıek, de ezek lehetnek késıbbi hibridizációk nyomai is, a B genomnak megfelelı szekvencia nem került elı az általunk vizsgált búzavonalakból

•

A búzában és más allopoliploid élılényekben óvatossággal kezelendık a direkt szekvenálással kapott eredmények és a hibák elkerülésére alkalmasnak ígérkezik az itt ismertetett módszer A „Célkitőzés” fejezetben munkám fı céljait négy pontban jelöltem meg, ennek

tükrében az alábbiakban részletezem röviden az elért eredményeket: 1. Munkám során a plasztiszban és a sejtmagban kódolt rDNS régiók felhasználhatóságát vizsgáltam a búza eredetének, evolúciójának vizsgálatában. Eredményeim szerint a cp16S rRNS gén, ill. a cp23S és 5S gének közötti régió alig, vagy nem használható ilyen célokra; a 16S génben talált SNP jellegő polimorfizmus bizonyult az egyetlen variábilis pozíciónak. Ellenben a sejtmagi ITS régió jól használható és a kísérleti körülmények és módszerek megfelelı beállításával egykori hibridizációk nyomai is kimutathatók a búzából 2. Mint a legfiatalabb algenom, a D genom eredetére sikerült a legtöbb bizonyítékot találni, s eredményeim alátámasztják az elfogadott hipotézist, amely szerint a donor az Aegilops tauschii. Az A genom eredetét tekintve eredményeim nem cáfolják, de nem is erısítik meg a T. urartu kizárólagos donor szerepét, de felvetik a lehetıségét, hogy a donor nrITS szekvenciája nem egyezett meg a mai két alakor búzafaj valamelyikével (T. urartu és T. monococcum), hanem inkább egy (közös) ısi alakor ITS szekvenciára utalnak

69

3. Egyértelmően B genom eredető szekvenciát nem sikerült kimutatni a vizsgált fajtákból. Ennek az lehet az oka, hogy az A és B genom hibridizációja óta eltelt idıben az együttes evolúció homogenizálhatta az eredeti szülıi nrITS formákat, mégpedig egy új, hibrid típusú szekvencia irányába. Erre utal a közönséges búza és ıse, a tönkebúza (T. turgidum) nrITS szekvenciája között lévı nagy hasonlóság is. Az ilyen homogenizáció lehet egyenlıtlen a szülıi formák között, s a jelek szerint itt is ez történt: a B genom típus eltőnt, de az A genom típusból is csak két ITS klónszekvencia került elı 4. Bemutattunk egy módszert, amely alkalmas régebbi hibridizációs események nyomainak feltárására a búza genomjában, a hagyományos PCR eljárás során többnyire rejtve maradó minor nrITS kópiák felszínre hozásán keresztül. Ilyen módon információk nyerhetık a búza összetett genomi szerkezetének egyes elemeirıl közvetlen módon is

70

Összefoglalás A közönséges búza allohexaploid élılény, vagyis testi sejtjeinek sejtmagjaiban három algenomot, három teljes, dupla kromoszómaszerelvényt hordoz, amelyeket A, B és D betőkkel jelölünk. Noha eredetükre egyre több bizonyítékot sikerült találni, elsısorban a B genom eredete máig vita tárgyát képezi. Szándékunkban állt a hexaploid búza eredetérıl, evolúciójáról, rokonsági viszonyairól az utóbbi idıkben kifejlesztett molekuláris biológiai módszerekkel a lehetı legtöbbet megtudni, az A és D genomra vonatkozó eddigi eredményeket a mi módszereinkkel megerısíteni, vagy cáfolni, és a B genom eredetét tisztázni, illetve új eredményekkel megvilágítani, ezen túl megvizsgálni, hogyan jelenik meg a búza összetett genomi szerkezetének hatása a riboszomális DNS szekvenciákban. Kutatásunkat a plasztiszban és a sejtmagban kódolt riboszomális DNS régiók PCRalapú vizsgálatával végeztem. A plasztiszban kódolt markereink (16S rRNS gén, ill. 23S–5S rRNS gének közötti elválasztó szakasz) invariabilitását tapasztalhattuk a vizsgált minták között, egy SNP jellegő mutáció kivételével, amelyet a 16S gén 5’ vége közelében találtunk és amelynek jelentısége lehet különbözı plasztiszvonalba tartozó búzafajták azonosításakor. Bebizonyítottuk, hogy az nrITS régió alkalmas marker a búza eredetének, evolúciójának kutatására, de nem direkt PCR és szekvenálás módszerével, hanem speciális PCR reakciót követı klónozás és szekvenálás útján. A speciális PCR során magas denaturációs hımérsékletet és nagy átírási hőségő Pfu polimerázt használtunk, a terméket klónoztuk és a klónokat szekvenáltuk. Így sikerült a hagyományos eljárás során rejtve maradó szekvenciákat kimutatni, amelyek egykori hibridizációk nyomait hordozzák, így segítségükkel következtetni lehet a hibridizációban részt vett elemek eredeti ITS szekvenciáira. Munkánk során a D genom eredetére sikerült a legtöbb bizonyítékot találni. Eredményeink alátámasztják azt az elfogadott hipotézist, mely szerint a D genom donor az Aegilops tauschii. Az A genom eredetét tekintve eredményeink valószínősítik a T. urartu, vagy netán egy ısibb alakor forma donor szerepét, ugyanakkor utalnak a T. monococcum hozzájárulására is. Egyértelmően B genom eredető szekvenciát nem sikerült kimutatni a vizsgált fajtákból, aminek az lehet az oka, hogy az együttes evolúció az eredeti szülıi nrITS formákat homogenizálhatta, mégpedig egy új, hibrid típusú szekvencia irányába. Bemutattunk egy módszert, amely alkalmas egyrészt a hagyományos PCR során önállóan nem megjelenı nrITS formák feltárására, másrészt az allopoliploid vizsgálati objektum korrekt, kiméra és hibrid jellegtıl mentes szekvenciáinak megállapítására.

71

Summary Bread wheat as an allohexaploid plant bears in somatic cells three complete double chromosome sets, namely subgenomes A, B and D. Although more and more results help to reveal their evolution, there are some open questions, for instance origin of genome B that is still a matter of debate. Aims of our work were i) getting new results on evolution and relationships of hexaploid bread wheat by molecular methods, ii) confirm or deny earlier results on origin of genomes A and D, iii) clarify or light the origin of genome B by new results and last but not least iiii) examine the effect of wheat complex genomic structure on ribosomal DNA sequences. Our studies were carried out by PCR-based analysis of ribosomal DNA sequences coded in the plastid and the nucleus. Invariability of our plastid markers (16S rRNA gene and spacer region between 23S and 5S rRNS genes) among the samples was observed except an SNP-like mutation found near the 5’ end of cp16S rRNA gene that could have some significance when identifying wheat samples with different plastid origin. We proved that nuclear ribosomal ITS region is suitable for studying origin and evolution of wheat, mainly in application of special PCR technique followed by cloning, instead of conventional direct PCR. In this special PCR method high denaturing temperature and proofreading DNA polymerase enzyme (Pfu) were used, and the PCR product was cloned and sequenced. In this way sequences remaining unamplified by the conventional method succeeded to amplify. These sequences bear traces of earlier hibridizations and help us to draw conclusions about original ITS sequences of the plants involved in hibridization. 8 of the total 67 cloned sequences proved to constitute the group of D genome type and our results support the donor role of Aegilops tauschii. Two clones gave A genome type sequences, one of them differs equally from T. urartu and T. monococcum, referring a common ancestor donor, while the other indicates later contribution of T. monococcum. Sequence of unambiguously B genome origin was not found in the studied samples probably due to the effects of concerted evolution that homogenized the original parental nrITS forms into new hybrid type sequences. In the present work a method was shown that is suitable for amplification nrITS forms remaining unamplified from wheat by conventional PCR, and for determination of correct, non-chimeric sequences of allopoliploid research objects.

72

Publikációs jegyzék

A témához kapcsolódó publikációk Dolgozatok referált tudományos folyóiratokban: Rudnóy S, Páldi E, Bratek Z, Szegı D, Rácz I, Lásztity D (2004): ITS regions in hexaploid bread wheat and its supposed progenitors. Cereal Research Communications 32(4): 423-428. Teljes közlemények konferencia-kiadványokban: Rudnóy S, Bratek Z, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2005): Studies on chloroplast and nuclear rDNA in hexaploid bread wheat and its relatives. Acta Biologica Szegediensis, 49(1-2): 35-36. Rudnóy S, Bratek Z, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2002): Chloroplast 16S rRNA sequences from different Triticum species. Acta Biologica Szegediensis, 46(3-4): 47-48.

Egyéb publikációk Dolgozatok referált tudományos folyóiratokban: Sramkó G, Gulyás G, Matus G, Rudnóy S, Illyés Z, Bratek Z, Molnár VA (2007): Leaf width, nrDNA and cpDNA and cpDNA ITS sequence variation within Central European Bulbocoidum vernum and B. versicolor (Colchicaceae) populations: are they really two taxa? Acta Biologica Hungarica in press. Gulyás G, Sramkó G, Molnár VA, Rudnóy S, Illyés Z, Balázs T, Bratek Z (2005): Nuclear ribosomal ITS paralogs as evidence of recent interspecific hybridization in the genus Ophrys (Orchidaceae). Acta Biologica Cracoviensia Series Botanica 47(2): 1-7. Halász K, Bratek Z, Szegı D, Rudnóy S, Rácz I, Lásztity D, Trappe J (2005): Tests of species concepts on the small, white European group of Tuber spp. based on morphology and rDNA ITS sequences with special reference to Tuber rapaeodorum. Mycological Progress 4(4): 281-290.

73

Parádi I, Páldi E, Rudnóy S, Bratek Z, Kovács G, Rácz I, Lásztity D (2003): Changes in the content of modified nucleotides in wheat rRNA during greening. Biologia Plantarum 47(1): 33-38. Kovács GM, Rudnóy S, Vágvölgyi C, Lásztity D, Rácz I, Bratek Z (2001): Intraspecific invariability of the internal transcribed spacer region of rDNA of the truffle Terfezia terfezioides in Europe. Folia Microbiologica 46(5): 423-426. Rudnóy Sz, Bratek Z, Halász K, Rácz I, Lásztity D (2000): A fehér nyárral (Populus alba L.) ektomikorrhizás kapcsolatban álló két gombafaj táptalaj szelekciója és molekuláris taxonómiai vizsgálata. Botanikai Közlemények 86-87(1-2): 121-128. Teljes közlemények konferencia-kiadványokban: Illyés Z, Rudnóy S, Bratek Z (2005): Aspects of in situ, in vitro germination and mycorrhizal partners of Liparis loeselii. VIII. Magyar Növényélettani Kongresszus, Szeged 2002. június 24-27. Acta Biologica Szegediensis, 49(1-2): 137-139. Illyés Z, Szegı D, Rudnóy Sz (2003): A hagymaburok (Liparis loeselii) hazai populációi az európai állományok tükrében. III. Kárpát-medencei Biológiai Szimpózium, 2003. október 28-30, Budapest, Elıadások összefoglalói: 275-278. Bratek Z, Vörös I, Takács T, Parádi I, Rudnóy S, Halász K (2002): Advantages of application of mycorrhizated plants in environment-friendly agriculture and forestations. VII. Magyar Növényélettani Kongresszus, Szeged 2002. június 24-27. Acta Biologica Szegediensis, 46(3-4): 187-188. Rudnóy S, Bratek Z, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2002): FLC-like factors in wheat (cv. Mv15) and Conyza sp. VII. Magyar Növényélettani Kongresszus, Szeged 2002. június 24-27. Acta Biologica Szegediensis, 46(3-4): 45-46. Rudnóy Sz, Bratek Z, Albert L, Barna T, Lásztity D (2000): Kiskunsági fehérnyárasok mikorrhiza viszonyainak feltárása. Kutatói Nap 1998-1999. Szerk.: Horváth B., BajaKecskemét-Sopron 2000, Alföldi Erdıkért Egyesület, 94-97. Bratek Z, Albert L, Bagi I, Pálfy B, Takács T, Rudnóy S, Halász K (1999): New and rare hypogeous fungi of Carpathian basin. Actes du Ve Congrès International, Science et Culture de la Truffe et des autres Champignons Hypoges Comestibles. 4 au 6 mars 1999, Aix-en-Provence, France, Federation Française des Trufficulteurs, 2.55-56.

74

Összefoglalók konferencia-kiadványokban: Sramkó G, Gulyás G, Rudnóy Sz, Illyés Z, Pénzes Zs, Molnár VA (2006): Fı leszármazási vonalak az Ophrys fuciflora fajkomplexben (Orchidaceae) az nrDNS ITS régió szekvencia változatossága alapján. VII. Aktuális Flóra- és Vegetációkutatás a Kárpátmedencében, Debrecen, 2006. február 24-26. Kitaibelia 11(1): 27. Szegı D, Bratek Z, Rudnóy S, Zöld-Balogh Á, Soós V (2004): Morphological and molecular studies on mycorrhizae between Terfezia terfezioides and Robinia pseudoacacia. Premier Symposium sur les Champignons Hypogés du Bassin Méditerranéen. Rabat, Maroc, 6-8 avril 2004, 54. Molnár VA, Gulyás G, Rudnóy Sz, Illyés Z, Bratek Z (2004): Az Ophrys fuciflora agg. DNSalapú vizsgálata. Aktuális Flóra- és Vegetációkutatás a Kárpát-medencében VI., Keszthely, 2004. február 26-29. Elıadások és Poszterek, Összefoglaló kötet: 7. Penksza K, Galli Zs, Illyés Z, Rudnóy Sz, Bauer L, Bucherna N. Kiss E, Bratek Z, Heszky LE (2003): Adatok a Festuca ovina csoportba tartozó fajok taxonómiai revíziójához. 6. Magyar Ökológus Kongresszus, Gödöllı, 2003. augusztus 27-29. Elıadások és Poszterek összefoglalói: 216. Bratek Z, Parádi I, Halász K, Rudnóy Sz (2000): A Kárpát-medence szarvasgombáinak élıhely-preferenciái. V. Magyar Ökológus Kongresszus, Debrecen 2000. október 25-27. Acta Biologica Debrecina Oecologica Hungarica suppl. 11(1): 46. Berecz B, Bratek Z, Halász K, Rudnóy Sz, Parádi I (2000): A gánti bauxitmeddıhányó mikorrhizagombái. V. Magyar Ökológus Kongresszus, Debrecen 2000. október 25-27. Acta Biologica Debrecina Oecologica Hungarica suppl. 11(1): 197. Parádi I, Halász K, Rudnóy Sz, Bratek Z (2000): Hazai szikes élıhelyeken elıforduló mikorrhizagombák. V. Magyar Ökológus Kongresszus, Debrecen 2000. október 25-27. Acta Biologica Debrecina Oecologica Hungarica suppl. 11(1): 290. Rudnóy Sz, Bratek Z, Lásztity D, Halász K, Berecz B (2000): Ektomikorrhizát képzı gombák azonosítása molekuláris alapon. V. Magyar Ökológus Kongresszus, Debrecen 2000. október 25-27. Acta Biologica Debrecina Oecologica Hungarica suppl. 11(1): 134. Bratek Z, Albert L, Bagi I, Pálfy B, Takács T, Rudnóy S, Halász K (1999): New and rare hypogeous fungi of Carpathian Basin. Vth International Congress on Science and Cultivation of Truffle. Aix-en Provence (France), 4 au 6 Mars, Abstracts 19.

75

Bratek Z, Rudnóy S, Parádi I, Láng F (1998): Natural habitats and preliminary studies on cultivation of Terfezia terfezioides. Sixth International Mycological Congress Jerusalem (Israel), Aug. 23-28. Abstracts 161. Bratek Z, Rudnóy S, Parádi I (1998): Artificial mycorrhizal infection of black locust (Robinia pseudoacacia) by Terfezia terfezioides under greenhouse conditions. Second International Conference on Mycorrhizae. Uppsala (Sweden), July 5-10. Abstracts 33. Tudományos fórumon tartott elıadások: Illyés Z, Szegı D, Rudnóy Sz, Bratek Z (2004): A Liparis loeselii egyes európai populációinak

összehasonlító

vizsgálata

molekuláris

markerekkel.

Magyar

Növényélettani Társaság, 2004. évi közgyőlés, Budapest 2004. május 13. Molnár VA, Gulyás G, Rudnóy Sz, Illyés Z, Bratek Z (2004): Az Ophrys fuciflora agg. DNSalapú vizsgálata. Aktuális Flóra- és Vegetációkutatás a Kárpát-medencében VI., Keszthely 2004. február 26-29. Illyés Z, Szegı D, Rudnóy Sz (2003): A hagymaburok (Liparis loeselii) hazai populációi az európai állományok tükrében. III. Kárpát-medencei Biológiai Szimpózium, Budapest 2003. október 28-30. Penksza K, Galli Zs, Illyés Z, Rudnóy Sz, Bauer L, Bucherna N, Kiss E, Bratek Z, Heszky L (2003): Adatok a Festuca ovina csoportba tartozó fajok taxonómiai revíziójához. 6. Magyar Ökológus Kongresszus, Gödöllı 2003. augusztus 27-29. Penksza K, Galli Zs, Bauer L, Kiss E, Bucherna N, Illyés Z, Rudnóy Sz, Bratek Z, Heszky L. (2003): A Kárpát-medence Festuca ovina csoportjának újabb taxonómiai eredményei. Magyar Biológiai Társaság Botanikai Szakosztályának 1388. szakülése. Budapest 2003. március 10. Rudnóy Sz, Bratek Z, Lásztity D, Halász K, Berecz B (2000): Ektomikorrhizát képzı gombák azonosítása molekuláris alapon. V. Magyar Ökológus Kongresszus, Debrecen 2000. október 25-27. Rudnóy Sz, Bratek Z, Albert L, Barna T, Lásztity D (1999): Kiskunsági fehérnyárasok mikorrhiza viszonyainak feltárása. Alföldi Erdıkért Egyesület Kutatói Napja. Sopron 1999. november 12.

76

Köszönetnyilvánítás Ezúton szeretném köszönetemet kifejezni témavezetımnek, Dr. Lásztity Demeternek, türelmes, támogató és inspiráló szakmai vezetéséért és együttmőködéséért. Köszönöm Dr. Szigeti Zoltánnak, a Növényélettani és Molekuláris Növénybiológiai Tanszék, ill. a Kíséretes Növénybiológia Doktori Program vezetıjének, hogy lehetıvé tette számomra a munkát az általa vezetett tanszéken és doktori programban. Köszönettel tartozom Dr. Bratek Zoltánnak a sokéves együttmőködésért és a lehetıségért, hogy az általa vezetett laboratóriumban akadálytalanul és teljes támogatással folytathattam a kísérleteimet. Nagyon köszönöm Dr. Rácz Ilonának a számtalan jóakaratú és hasznos tanácsot és segítséget, nem utolsósorban dolgozatom lektorálásában nyújtott támogatását. Köszönöm továbbá Berecz Bernadett, Dr. Gárdonyi Márk, Halász Krisztián, Illyés Zoltán, Palatinszky Márton, Dr. Páldi Emil, Dr. Parádi István, Dr. Tamás László, Tóth Attiláné és Vladár Péter segítségét és munkám eredményes befejezéséhez való hozzájárulását. Végül, de nem utolsósorban köszönöm szüleimnek és családomnak a nélkülözhetetlen támogatást és hátteret, amely talán a legfontosabb feltétele az eredményes munkának.

77

Irodalomjegyzék Altschul SF, Madden TL, Schäffer AA, Zhang J, Zhang Z, Miller W, Lipman DJ (1997): Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. NUCLEIC ACIDS RES 25: 3389-3402. Álvarez I, Wendel JF (2003): Ribosomal ITS sequences and plant phylogenetic inference. MOL PHYLOGENET EVOL 29: 417-434. Arnheim N, Krystal M, Schmickel R, Wilson G, Ryder O, Zimmer E (1980): Molecular evidence for genetic exchanges among ribosomal genes on non-homologous chromosomes in man and apes. PNAS 77: 7323–7327. Asano T, Tsudzuki T, Takahashi S, Shimada H, Kadowaki K (2004): Complete nucleotide sequence of the sugarcane (Saccharum officinarum) chloroplast genome: a comparative analysis of four monocot chloroplast genomes. DNA RES 11: 93-99. Bailey CD, Carr TG, Harris SA, Hughes CE (2003): Characterization of angiosperm nrDNA polymorphism, paralogy, and pseudogenes. MOL PHYLOGENET EVOL 29: 435– 455. Baldwin BG, Sanderson MJ, Porter JM, Wojciechowski MF, Campbell CS, Donoghue MJ (1995): The ITS region of nuclear ribosomal DNA: a valuable source of evidence on angiosperm phylogeny. ANN MISSOURI BOT GARD 82: 247-277. Bálint AF, Kovács G, Sutka J (2000): Origin and taxonomy of wheat in the light of recent research. ACTA AGRON HUNG 48: 301-313. Baum BR, Bailey LG (2001): The 5S rRNA gene sequence variation in wheats and some polyploid wheat progenitors (Poaceae: Triticeae). GENET RES CROP EVOL 48: 3551. Baum BR, Johnson DA, Bailey LG (2001): Defining orthologous groups among multicopy genes prior to inferring phylogeny, with special emphasis on the Triticeae (Poaceae). HEREDITAS 135: 123-138. Bedı Z., Balla L, Szunics L, Láng L, Kramarikné-Kissimon J (1993): A martonvásári 1B/1R transzlokációt hordozó búzafajták agronómiai tulajdonságai. (Agronomic properties of Martonvásár wheat varieties bearing the 1B/1R translocation.) NÖVÉNYTERMELÉS 42: 391–398. Belyayev A, Raskina O, Korol A, Nevo E (2000): Coevolution of A and B genomes in allotetraploid Triticum dicoccoides. GENOME 43: 1021-1026. Benson DA, Karsch-Mizrachi I, Lipman DJ, Ostell J, Rapp BA, Wheeler DL (2000): GenBank. NUCLEIC ACDIS RES 28: 15-18.

78

Blake NK, Lehfeldt BR, Lavin M, Talbert LE (1999): Phylogenetic reconstruction based on low copy DNA sequence data in an allopolyploid: The B genome of wheat. GENOME 42: 351-360. Brysting AK, Fay MF, Leitch IJ, Aiken SG (2004): One or more species in the arctic grass genus Dupontia? – a contribution to the Panarctic Flora project. TAXON 53: 365-382. Buckler ES, Ippolito A & Holtsford TS (1997): The evolution of ribosomal DNA: divergent paralogues and phylogenetic implications. GENETICS 145:821-832. Caldwell KS, Dvorak J, Lagudah ES, Akhunov E, Luo MC, Wolters P, Powell W (2004): Sequence polymorphism in polyploid wheat and their D-genome diploid ancestor. GENETICS 167: 941-947. Chantret N, Salse J, Sabot F, Rahman S, Bellec A, Laubin B, Dubois I, Dossat C, Sourdille P, Joudrier P, Gautier M-F, Cattolico L, Beckert M, Aubourg S, Weissenbach J, Caboche M, Bernard M, Leroy P, Chalhoub B (2005): Molecular basis of evolutionary events that shaped the Hardness locus in diploid and polyploid wheat species (Triticum and Aegilops). PLANT CELL 17: 1033-1045. Chatterton NJ, Hsiao C, Asay KH, Wang RR-C, Jensen KB (1992a): Nucleotide sequence of the internal transcribed spacer region of rDNA in diploid wheat, Triticum speltoides L. (Tausch) Gren. ex Richter (Gramineae). PLANT MOL BIOL 20: 157-158. Chatterton NJ, Hsiao C, Asay KH, Wang RR-C, Jensen KB (1992b): Nucleotide sequence of the internal transcribed spacer region of rDNA in wheat, Triticum aestivum L. (Gramineae). PLANT MOL BIOL 20: 159-160. Ciaffi M, Dominici L, Lafiandra D (1997): Gliadin polymorphism in wild and cultivated einkorn wheats. THEOR APPL GENET 94: 68-74. Cline C, Braman JC, Hogrefe HH (1996): PCR fidelity of Pfu DNA polymerase and other thermostable DNA polymerases. NUCLEIC ACIDS RES 24: 3546-3551. Cloix C, Tutois S, Mathieu O, Cuvillier C, Espagnol MC, Picard G, Tourmente S (2000): Analysis of 5S rDNS arrays in Arabidopsis thaliana: physical mapping and chromosome-specific polymorphisms. GENOME RES 10: 679-690. Cunado N, Blazquez S, Melchor L, Pradillo M, Santos JL (2005): Understanding the cytological diploidization mechanism of polyploid wild wheats. CYTOGEN GENOME RES 109: 205-209. Dewey DR (1984): The genomic system of classification as a guide to intergeneric hybridization with the perennial Triticeae. In: Gene manipulation in plant improvement, ed. Dewey DR. Plenum Press, New York, 209-279. Doyle JJ, Doyle JL (1987): A rapid DNA isolation procedure for small amounts of fresh leaf tissue. PHYTOCHEM BULL BOT SOC AM 19: 11-15.

79

Drake JW, Charlesworth B, Charlesworth D, Crow JF (1998): Rates of spontaneous mutation. GENETICS 148: 1667–1686 Dubcovsky J, Dvořák J (1995): Ribosomal RNA multigene loci: Nomads of the Triticeae genomes. GENETICS 140: 1367-1377. Dvořák J, Zhang H-B (1990): Variation in repeated nucleotide sequences sheds light on phylogeny of the wheat B and G genomes. PNAS 87: 9640-9644. Dvořák J, di Terlizzi P, Zhang H-B, Resta P (1992): The evolution of polyploid wheats: identification of the A genome donor species. GENOME 36: 21-31. Dvořák J, Luo M-C, Yang Z-L, Zhang H-B (1998) The structure of Aegilops tauschii genepool and the evolution of hexaploid wheat. THEOR APPL GENET 97: 657–670. Dvořák J, Akhunov ED, Akhunov AR, Deal KR, Luo MC (2006): Molecular characterization of a diagnostic DNA marker for domesticated tetraploid wheat provides evidence for gene flow from wild tetraploid wheat to hexaploid wheat. MOL BIOL EVOL 23:1386-1396. Elder JF, Turner BJ (1995): Concerted evolution of repetitive DNA sequences in eukaryotes. Q REV BIOL 70: 297-320. Fitch WM (1971): Towards defining the course of evolution: minimum change for a specific tree topology. SYST ZOOL 20: 406-416. Flavell RB, O’Dell M (1979): The genetic control of nucleolus formation in wheat. CHROMOSOMA 71: 135-152. Galili G, Feldman M (1983): Diploidization of endosperm protein genes in poliploid wheats. 6th International Wheat Genetics Symposium, Kyoto, 1119-1123. Gaut BS (2002): Evolutionary dynamics of grass genomes. NEW PHYTOL 154: 15–28. Gerlach WL, Dyer TA (1980): Sequence organization of the repeated units in the nucleus of wheat which contains 5S-rRNA genes. NUCLEIC ACIDS RES 8: 4851-4865. Gerlach WL, Miller TE, Flavell RB (1980): The nucleolus organizers of diploid wheats revealed by in situ hybridization. THEOR APPL GENET 58: 97-100. Gill BS, Chen PD (1987): Role of cytoplasm-specific introgression in the evolution of the polyploid wheats. PNAS 84: 6800-6804. GrainTax project (2001): http://www.k-state.edu/wgrc/Taxonomy/taxintro.html. Wheat Genetics Resource Center, Kansas State University. Gulyás G, Sramkó G, Molnár VA, Rudnóy S, Illyés Z, Balázs T, Bratek Z (2005): Nuclear ribosomal DNA ITS paralogs as evidence of recent interspecific hybridization in the genus Ophrys (Orchidaceae). ACTA BIOL CRACOV SER BOT 47: 61-67.

80

Guyot R (2004): Mechanisms of Triticeae genome evolution. Thesis, Zurich University Hamby RK, Sims LE, Issel LE, Zimmer EA (1988): Direct ribosomal RNA sequencing: optimization of extraction and sequencing methods for work with higher plants. PLANT MOL BIOL REPTR 6: 175-192. Hamby RK, Zimmer EA (1988): Ribosomal RNA sequences for inferring phylogeny within the grass family (Poaceae). PLANT SYST EVOL 160: 29-37. Hamby RK, Zimmer EA (1991): Ribosomal RNA as a phylogenetic tool in plant systematics. In: Molecular systematics of plants, eds. Soltis PS, Soltis DE, Doyle JJ. Chapman and Hall, New York, 50-91. Hammer K (1980): Vorarbeiten zur monographischen Darstellung von Wildpflanzensortimenten: Aegilops L. KULTURPFLANZE 28: 33-180. Hasterok R, Jenkins G, Langdon T, Jones RN, Maluszynska J (2001): Ribosomal DNA is an effective marker of Brassica chromosomes. THEOR APPL GENET 103: 486-490. Heun M, Schäfer-Pregl R, Klawan D, Castagna R, Accerbi M, Borghi B, Salamini F (1997): Site of einkorn wheat domestication identified by DNA fingerprinting. SCIENCE 278: 1312-1314. Horváth E, Szalai G, Janda T, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2003): Effect of vernalisation and 5-azacytidine on the methylation level of DNA in wheat (Triticum aestivum L., cv. Martonvásár 15). PLANT SCIENCE 165: 689-692. Houchins K, O’Dell M, Flavell RB, Gustafson JP (1997): Cytosine methylation and nucleolar dominance in cereal hybrids. MOL GEN GENET 255: 294-301. Hsiao R, Wang R-C, Dewey DR (1986): Karyotype analysis and genome relationships of 22 diploid species in the Triticeae. CAN J GEN CYTOL 28: 109-120. Hsiao C, Chatterton NJ, Asay KH, Jensen KB (1994): Phylogenetic relationships of 10 grass species: an assessment of phylogenetic utility of the internal transcribed region in nuclear ribosomal DNA in monocots. GENOME 37: 112-120. Hsiao C, Chatterton NJ, Asay KH, Jensen KB (1995): Phylogenetic relationships of the monogenomic species of the wheat tribe Triticeae (Poaceae), inferred from nuclear rDNA (internal transcribed spacer) sequences. GENOME 38: 211-223. Huang S, Sirikhachornkit A, Su X, Faris J, Gill B, Haselkorn R, Gornicki P (2002): Genes encoding plastid acetyl-CoA carboxylase and 3-phosphoglycerate kinase of the Triticum/Aegilops complex and the evolutionary history of polyploid wheat. PNAS 99: 8133-8138. Ishii T, Mori N, Ogihara Y (2001): Evaluation of allelic diversity at chloroplast microsatellite loci among common wheat and its ancestral species. THEOR APPL GENET 103: 896–904.

81

Jiang J, Gill BS (1994): New 18S-26S ribosomal RNA gene loci: Chromosomal landmarks for the evolution of polyploid wheats. CHROMOSOMA 103:179–185. Kashkush K, Feldman M, Levy AA (2002): Gene loss, silencing and activation in a newly synthesized wheat allotetraploid GENETICS 160: 1651–1659. Kellogg EA, Appels R, Mason-Gamer RJ (1996): When genes tell different stories: the diploid genera of Triticeae (Gramineae). SYST BOT 21: 321-347. Kellogg EA (2001): Evolutionary history of the grasses. PLANT PHYSIOL 125: 1198-1205. Kimber G, Sears ER (1987): Evolution in the genus Triticum and the origin of cultivated wheat. In: Wheat and wheat improvement, 2nd edn, ed. Heyne EG. American Society of Agronomy, Madison, WI, 154-164. Kimura M (1980): A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences. J MOL EVOL 16: 111-120. Koebner RMD (1995): Generation of PCR-based markers for the detection of rye chromatin in a wheat background. THEOR APPL GENET 90: 740-745. Kovács G, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2000): Nucleotide sequence of chloroplast 16S rDNA (Accession No: AJ239003) from hexaploid wheat Triticum aestivum L. PLANT PHYSIOL (PGR00-01) 122: 292. Kovarik A, Matyasek R, Lim KY, Skalicka K, Koukalova B, Knapp S, Chase M, Leitch AR (2004): Concerted evolution of 18-5.8-26S rDNA repeats in Nicotiana allotetraploids. BIOL J LINN SOC 82: 615-625. Kovarik A, Pires JC, Leitch AR, Lim KY, Sherwood AM, Matyasek R, Rocca J, Soltis DE, Soltis PS (2005): Rapid concerted evolution of nuclear ribosomal DNA in two Tragopogon allopolyploids of recent and recurrent origin. GENETICS 169: 931-944. Kıszegi B, Linc G, Juhász A, Láng L, Molnár-Láng M (2000): Occurrence of the 1RS/1BL wheat-rye translocation in Hungarian wheat varieties. ACTA AGRON HUNG 48: 227-236. Kumar S, Tamura K, Nei M (2004): MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. BRIEF BIOINFORM 5:150-163. Landjeva S, Korzun V, Tsanev V, Vladova R, Ganeva G (2006): Distribution of the wheat– rye translocation 1RS.1BL among bread wheat varieties of Bulgaria. PLANT BREEDING 125: 102-104. Lassner M, Anderson O, Dvořák J (1987): Hypervariation associated with a 12-nucleotide direct repeat and inferences on intragenomic homogenization of ribosomal RNA gene spacer based on the DNA sequence of a clone from the wheat Nor-D3 locus. GENOME 29: 770–781.

82

Lawton-Rauh A (2003): Evolutionary dynamics of duplicated genes in plants. MOL PHYLOGENET EVOL 29: 396-409. Lelley T, Stachel M, Grausgruber H, Vollmann J (2000): Analysis of relationships between Aegilops tauschii and the D genome of wheat utilizing microsatellites. GENOME 43: 661-668. Li WL, Zhang P, Fellers JP, Friebe B, Gill BS (2004): Sequence composition, organization, and evolution of the core Triticeae genome. PLANT J 40: 500-511. Lilienfeld FA (1951): Genome analysis in Triticum and Aegilops. – Concluding review. CYTOLOGIA 16: 101-123. Liu B, Segal G, Rong JK, Feldman M (2003): A chromosome-specific sequence common to the B genome of polyploid wheat and Aegilops searsii. PLANT SYST EVOL 241: 5566. Liu B, Wendel JF (2003): Epigenetic phenomena and the evolution of plant allopolyploids. MOL PHYLOGENET EVOL 29: 365-379. Luo M-C, Yang Z-L, Dvořák J (1998): Position effects of ribosomal RNA multigene loci on meiotic recombination in wheat. GENETICS 149: 1105-1113. Ma X-F, Fang P, Gustafson JP (2004): Polyploidization-induced genome variation in triticale. GENOME 47(5): 839-848. Ma X-F, Gustafson JP (2005): Genome evolution of allopolyploids: a process of cytological and genetic diploidization. CYTOGENET GENOME RES 109:236-249. Maier RM, Neckermann K, Igloi GL, Kossel H (1995): Complete sequence of the maize chloroplast genome: gene content, hotspots of divergence and fine tuning of genetic information by transcript editing. J MOL BIOL 251: 614-628. Mat Daud H, Gustafson JP (1996): Molecular evidence for Triticum speltoides as a B-genome progenitor of wheat (Triticum aestivum). GENOME 39: 543-548. Matyasek R, Fulnecek J, Lim KY, Leitch AR, Kovarik A (2002): Evolution of 5S rDNA unit arrays in the plant genus Nicotiana (Solanaceae). GENOME 45: 556-562. May CE, Appels R (1987): Variability and genetics of spacer DNA sequences between the ribosomal RNA genes of hexaploid wheat (Triticum aestivum). THEOR APPL GENET 74: 617-624. Mayol M, Rosselló JA (2001): Why nuclear ribosomal DNA spacers (ITS) tell different stories in Quercus. MOL PHYLOGENET EVOL 19: 167–176. Miller TE, Hutchinson J, Reader SM (1983): The identification of the nucleolus organiser chromosomes of diploid wheat. THEOR APPL GENET 65: 145-147.

83

Mizumoto K, Takumi S, Ogihara Y, Nakamura C (2003): Origin, dispersal and genomic structure of a low-copy-number hypervariable RFLP clone in Triticum and Aegilops species. GENES GENET SYST 78:291-300. Mukai Y, Endo TR, Gill BS (1990): Physical mapping of the 5S rRNA multigene family in common wheat. J HEREDITY 81: 290–295. Mukai Y, Endo TR, Gill BS (1991): Physical mapping of the 18S-26S rRNA multigene family in common wheat: Identification of a new locus. CHROMOSOMA 100: 71–78. Murata M, Heslop-Harrison JS, Motoyoshi F (1997): Physical mapping of the 5S ribosomal RNA genes in Arabidopsis thaliana by multi-color fluorescence in situ hybridization with cosmid clones. PLANT J 12:31–37. Nei M, Kumar S (2000): Molecular evolution and phylogenetics. Oxford University Press, New York Ogihara Y, Isono K, Kojima T, Endo A, Hanaoka M, Shiina T, Terachi T, Utsugi S, Murata M, Mori N, Takumi S, Ikeo K, Gojobori T, Murai R, Murai K, Matsuoka Y, Ohnishi Y, Tajiri H, Tsunewaki K (2000): Chinese spring wheat (Triticum aestivum L.) chloroplast genome: complete sequence and contig clones. PLANT MOL BIOL REPTR 18: 243–253. Ogihara Y, Isono K, Kojima T, Endo A, Hanaoka M, Shiina T, Terachi T, Utsugi S, Murata M, Mori N, Takumi S, Ikeo K, Gojobori T, Murai R, Murai K, Matsuoka Y, Ohnishi Y, Tajiri H, Tsunewaki K (2002): Structural features of a wheat plastome as revealed by complete sequencing of chloroplast DNA. MOL GENET GENOMICS 266: 740746. Ogihara Y, Yamazaki Y, Murai K, Kanno A, Terachi T, Shiina T, Miyashita N, Nasuda S, Nakamura C, Mori N, Takumi S, Murata M, Futo S, Tsunewaki K (2005): Structural dynamics of cereal mitochondrial genomes as revealed by complete nucleotide sequencing of the wheat mitochondrial genome. NUCLEIC ACIDS RES 33: 62356250. Özkan H, Tuna M, Arumuganathan K (2003): Nonadditive changes in genome size during allopolyploidization in the wheat (Aegilops-Triticum) group. J HEREDITY 94:260264. Pasakinskiene I, Anamthawat-Jónsson K, Humphreys MW, Jones RN (1997): Novel diploids following chromosome elimination and somatic recombination in Lolium multiflorum × Festuca arundinacea hybrids. HEREDITY 78: 464-469. Paterson AH, Bowers JE, Peterson DG, Estill JC, Chapman BA (2003): Structure and evolution of cereal genomes. CURR OPIN GENETICS REV 13: 644–650. Pearson WR, Lipman DJ (1988): Improved tools for biological sequence comparison. PNAS 85: 2444-2448.

84

Rauscher JT, Doyle JJ, Brown AHD (2004): Multiple origins and nrDNA internal transcribed spacer homeologue evolution in the Glycine tomentella (Leguminosae) allopolyploid complex. GENETICS 166: 987-998. Razafimandimbison SG, Kellogg EA, Bremer B (2004): Recent origin and phylogenetic utility of divergent ITS putative pseudogenes: a case study from Naucleeae (Rubiaceae). SYST BIOL 53:177-192. Rudnóy S, Bratek Z, Páldi E, Rácz I, Lásztity D (2002): Chloroplast 16S rRNA sequences from different Triticum species. ACTA BIOL SZEGED 46: 47-48. Rudnóy S, Páldi E, Bratek Z, Szegı D, Rácz I, Lásztity D (2004): ITS regions in hexaploid bread wheat and its supposed progenitors. CEREAL RES COMM 32: 423-428. Saitou N, Nei M (1987): The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. MOL BIOL EVOL 4: 406-425. Salamini F, Özkan H, Brandolini A, Schäfer-Pregl R, Martin W (2002): Genetics and geography of wild cereal domestication in the Near East. NATURE REV GENET 3: 429-441. Sallares R, Brown TA (1999): PCR-based analysis of the intergenic spacers of the Nor loci on the A genomes of Triticum diploids and polyploids. GENOME 42:116-128. Sallares R, Brown TA (2004): Phylogenetic analysis of complete 5’ external transcribed spacers of the 18S ribosomal RNA genes of diploid Aegilops and related species (Triticeae, Poaceae). GEN RES CROP EVOL 51: 701-712. Sang T, Crawford DJ, Stuessy TF (1995): Documentation of reticulate evolution in peonies (Paeonia) using internal transcribed spacer sequences of nuclear ribosomal DNA: Implications for biogeography and concerted evolution. PNAS 92: 6813-6817. SHIGEN project (SHared Information of GENetic resources) (2006): ORGANELLE database. (http://www.shigen.nig.ac.jp/organelle/index.jsp) National Institute of Genetics, Japan. Shishido R, Sano Y, Fukui K (2000): Ribosomal DNAs: an exception to the conservation of gene order in rice genomes. MOL GEN GENET 263: 586–591. Singh D, Singh M (2001): Organization of 5S ribosomal RNA genes in tea (Camellia sinensis). GENOME 44: 143-146. Soltis DE, Soltis PS (1995): The dynamic nature of polyploid genomes. PNAS 92: 80898091. Talbert LE, Smith LY, Blake NK (1998): More than one origin of hexaploid wheat is indicated by sequence comparison of low-copy DNA. GENOME 41: 402-407. Tang J, Xia H, Cao M, Zhang X, Zeng W, Hu S, Tong W, Wang J, Wang J, Yu J, Yang H, Zhu L (2004): A comparison of rice chloroplast genomes. PLANT PHYSIOL 135: 412-420.

85

Tanksley SD, McCouch SR (1997): Seed banks and molecular maps: Unlocking genetic potential from the wild. SCIENCE 277: 1063-1066. Thompson JD, Higgins DG, Gibson TJ (1994): CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, positionspecific gap penalties and weight matrix choice. NUCLEIC ACIDS RES 22: 46734680. Torrecilla P, Catalan P (2002): Phylogeny of broad-leaved and fine-leaved Festuca lineages (Poaceae) based on nuclear ITS sequences. SYST BOT 27: 241-251. Tsudzuki J, Nakashima K, Tsudzuki T, Hiratsuka J, Shibata M, Wakasugi T, Sugiura M (1992): Chloroplast DNA of black pine retains a residual inverted repeat lacking rRNA genes: nucleotide sequences of trnQ, trnK, psbA, trnI and trnH and the absence of rps16. MOL GEN GENET 232: 206-214. Van Campenhout S, Aert R, Volckaert G (1998): Orthologous DNA sequence variation among 5S ribosomal RNA gene spacer sequences on homoeologous chromosomes 1B, 1D, and 1R of wheat and rye. GENOME 41: 244-255. Van Campenhout S, Stappen JV, Volckaert G (2001): The specific isolation of complete 5S rDNA units from chromosome 1A of hexaploid, tetraploid and diploid wheat species using PCR with head-to-head oriented primers. GENOME 44: 529-538. Van Slageren MW (1994): Wild wheats: a monograph of Aegilops L. and Amblyopyrum (Jaub. & Spach) Eig (Poaceae). WAGENINGEN AGRICULTURE UNIVERSITY PAPERS (7) 513 pp. Vignal A, Milan D, SanCristobal M, Eggen A (2002): A review on SNP and other types of molecular markers and their use in animal genetics. GENET SEL EVOL 34: 275-305. Vilgalys R (1998): Conserved primer sequences for PCR amplification and sequencing from nuclear ribosomal RNA. Vilgalys lab, Duke University Szabolcs Luca http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm Wagner A, Blackstone N, Cartwright P, Dick M, Misof B, Snow P, Wagner GP, Bartels J, Murtha M, Pendleton J (1994): Surveys of gene families using PCR: PCR selection and PCR drift. SYST BIOL 43: 250-261. Wang J-B, Wang C, Shi S-H, Zhong Y (2000): ITS regions in diploids of Aegilops (Poaceae) and their phylogenetic implications. HEREDITAS 132: 209-213. Wendel JF, Schnabel A, Seelanan T (1995): Bidirectional interlocus concerted evolution following allopolyploid speciation in cotton (Gossypium). PNAS 92: 280-284. Wendel JF (2000): Genome evolution of polyploids. PLANT MOL BIOL 42: 225-249. White TJ, Bruns TD, Lee S, Taylor JW. (1990): Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: PCR protocols: A guide to

86

methods and applications, eds. Innis MA, Gelfand DH, Sninsky JJ, White TJ. Academic Press Inc, San-Diego, 315-322. Yan Y, Hsam SLK, Yu JZ, Jiang Y, Ohtsuka I, Zeller FJ (2003): HMW and LMW glutenin alleles among putative tetraploid and hexaploid European spelt wheat (Triticum spelta L.) progenitors. THEOR APPL GENET 107: 1321-1330. Zeven AC (1979): Polyploidy and domestication: the origin and survival of polyploids in cytotype mixtures. BASIC LIFE SCI 13: 385-407. Zhang W-J, Qu L-J, Gao W, Gu H-Y, Chen J-K, Chen Z-L (1998): ITS1 and ITS2 sequences of four possible donors to bread wheat genome and their phylogenetic relationships. ACTA BOT SINICA 40: 994-1000. Zhang W, Qu L-J, Gu H, Gao W, Liu M, Chen J, Chen Z (2002): Studies on the origin and evolution of tetraploid wheats based on the internal transcribed spacer (ITS) sequences of nuclear ribosomal DNA. THEOR APPL GENET 104: 1099–1106. Zohary D, Hopf M (1993): Domestication of plants in the Old World. The origin and spread of cultivated plants in West Asia, Europe and the Nile Valley. Clarendon Press, Oxford, UK. Zwierzykowsky Z, Tayyar R, Brunell M, Lukaszewski AJ (1998): Genome recombination in intergeneric hybrids between tetraploid Festuca pratensis and Lolium multiflorum. J HEREDITY 89: 324-328. Zuker M (2003): Mfold web server for nucleic acid folding and hybridization prediction. NUCLEIC ACIDS RES 31: 3406-3415.

87