A blebbisztatin és származéka, a para-nitroblebbisztatin fototoxicitása Diplomamunka biológus mesterszak Molekuláris, Immun- és Mikrobiológiai szakirány
készítette:
RÁTI SZILVIA MARIANNA
témavezető:
MÁLNÁSI-CSIZMADIA ANDRÁS, egyetemi docens ELTE-TTK Biológiai Intézet, Biokémia Tanszék
EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNYEGYETEM TERMÉSZETTUDOMÁNYI KAR BIOLÓGIAI INTÉZET
Budapest, 2014
Tartalomjegyzék Tartalomjegyzék ......................................................................................................................... 2 1. A nem-izom miozin-II ATPáz blebbisztatinnal vizsgálható funkciói .................................... 3 2. A blebbisztatin........................................................................................................................ 7 3. A (-)-blebbisztatin gátlási mechanizmusa ............................................................................ 10 4. Fotoszenzitivitás, fototoxicitás ............................................................................................. 13 5. A (-)-para-nitroblebbisztain.................................................................................................. 16 6. Anyagok és módszer ............................................................................................................ 18 7. Eredmények .......................................................................................................................... 20 7.1. Optimalizáció................................................................................................................. 20 7.2. Sejtszám beállítása ......................................................................................................... 22 7.3. A reagensek kezelése ..................................................................................................... 24 7.4. A kontroll ....................................................................................................................... 24 7.5. A besugárzá ................................................................................................................... 25 7.6. Fénykép készítése .......................................................................................................... 26 7.7. Sejtek azonosítása, csoportosítása ................................................................................. 26 7.8. Sejtszámolás .................................................................................................................. 27 7.9. Módosítások összefoglalása .......................................................................................... 29 7.10. Kiértékelés ................................................................................................................... 29 8. Diszkusszió........................................................................................................................... 34 9. Összefoglalás ........................................................................................................................ 36 10. Summary ............................................................................................................................ 37 11. Függelék ............................................................................................................................. 38 Köszönetnyilvánítás ................................................................................................................. 43 Irodalomjegyzék ....................................................................................................................... 44
2
A (-)-blebbisztatin (1-fenil-1,2,3,4-tetrahidro-4-hidroxipirolo[2,3-β]-7-metilkinolin-4-1) a mai sejtkultúrás, és in vitro kutatások során egyre gyakrabban használt miozin-II ATPáz inhibitor molekula. A blebbiszatin elnevezést azért kapta, mert a legszembetűnőbb jelenség, amit képes gátolni, az a sejtek membránjának blebbesedése, ami nemcsak apoptózis alatt figyelhető meg (apoptotikus testek), de a citokinézis során is természetes jelenség. (1) (2) (3) (4) (5) A (-)-blebbisztatin rendelkezik néhány olyan tulajdonsággal, amely nem az inhibitor funkciójához rendelhető. In vivo kísérletek során problémát jelenthet az, hogy a molekula UV és kék fény hatására citotoxikussá válik. A citotoxicitás mértéke a hullámhosszal, és a besugárzott időtartammal együtt változik. A (-)-blebbisztatin számos származéka ismert. Ezek több, lényeges tulajdonságban is eltérhetnek, így találhatunk köztük olyat, amely jobban megfelel adott feltételeknek. Kutatásaim során egy olyan származékot, a (-)-para-nitroblebbisztatint vizsgáltam, amelyet az ELTE Biokémiai Tanszékén a Málnási-kutatócsoport tanulmányozott először. Munkám során a (-)-blebbisztatin és a (-)-para-nitroblebbisztatin fototoxikusságának spektrum, és idő függését vizsgáltam. Eredményeim által pontosabb képet kaphatunk a (-)blebbisztatin fototoxikus tulajdonságairól, ezáltal a kutatások során hatékonyabbá téve a szer és származéka a (-)-para-nitroblebbisztatin használatát.
1. A nem-izom miozin-II ATPáz blebbisztatinnal vizsgálható funkciói
A miozin-II ATPázok aktinnal aktiválható hidrolázok, melyek kémiai energiát alakítanak mechanikai energiává, azaz kemomechanikai transzduktorok. Három fő doménjük van; farok, nyaki és motor domén. A motor domén szekvenciája alapján négy alosztályt különböztetünk meg; a [1] váz- és a szívizom, [2] a vertebrális simaizom és a nem-izom, [3] alacsonyabb rendű eukarióta (például Dictyostelium) és [4] gomba miozin-II. (6) A (-)-blebbisztatin legfontosabb célfehérjéi a szkeletális és nem-izom miozin-II ATPáz izoformák. Az utóbbi motorfehérje egyre több funkciójára derül fény. A nem-izom miozin-II ATPáz motorfehérje csoport részt vesz többek között az osztódásban, a blebbesedésben, a migrációban, jeltovábbítási folyamatokban. (3) (7) (8)
3
A (-)-blebbisztatin minden vertebrális miozin-II ATPáz függő folyamatot reverzibilisen képes gátolni. Két perc elteltével gátolja a blebbesedést, az irányított sejtmigrációt, öt perc alatt a citokinézist is megakadályozza. Érdekes módon a reagens Drosophila melanogaster sejtekben semmilyen hatással nincs a miozin ATPázokra (9), ellenben hatását a sejtes nyálkagomba, azaz a Dictyostelium discoideum miozin-II ATPázokon is leírták. (10) (11) A nyálkagomba amőboid alakjában több olyan életjelenséget is gátol, amely nem-izom miozinII függő, például; szaporodás, növekedés. Emellett kiderült az, hogy ebben a szervezetben a (-)-blebbisztatin olyan folyamatokat is képes gátolni, amelyekhez nincs szükség nem-izom miozin-II-re. Az inaktív mutáns miozin-II, illetve a (-)-blebbisztatin által inaktivált miozin-II egyaránt aggregációkat hoz létre, amelyek indirekt módon akadályozzák az amőboid alak makropinocitózisát és fagocitózisát. A (-)-blebbisztatin olyan Dictyostelium sejtekre is hatással van, amelyekben a nem-izom miozin-II izoformái abszolút nincsenek expresszálva. Ezekben a sejtekben a (-)-blebbisztatin akadályozza az amőboid alakok áramló mozgását és a sejtek általi plakképződést. Ez arra utal, hogy a (-)-blebbisztatin specifikussága nem korlátozódik kizárólagosan a miozin-II motorfehérjére. (10) A trombin egy nem-izom miozin-II ATPáz függő mechanizmussal képes gátolni a parakrin és gap junction-okon keresztül terjedő Ca2+-hullámot, amely egyfajta intercelluláris kommunikációt tesz lehetővé. Ezt a jelenséget borjú szaruhártya endotheliális sejteken (Bovine Corneal Endothelial Cells, BCECs) vizsgálták. (8) A folyamat során a miozin könnyű lánca foszforilálódik. Kiderült, hogy (-)-blebbisztatin jelenlétében a trombin nem gátolja a kalciumion hullám terjedését. A kísérletet előzetesen fotoinaktivált (-)blebbisztatinnal is elvégezték. A 30 percig UV fénnyel megvilágított (-)-blebbisztatin nem tudta megakadályozni a trombin hatását, azaz a drog fotoinaktiválódott. A kísérletet 488 nmes megvilágítás mellett is megismételték. Ebben az esetben már két perc is inaktiválta a reagenst. Önmagában a (-)-blebbisztatinnak nincs hatása sem a parakrin, sem a gap junctionokon kersztül zajló intercelluláris kommunikációra, ami arra utal, hogy a miozin-II ATPáz csak a folyamat trombin indukálta gátláshoz szükséges. A sejtek dinamikáját lehetővé tevő, rugalmas celluláris sejtváz rendszer nagyon sok biológiai jelenség nélkülözhetetlen alapja. A belső sejtváz jó részét mikrotubulusok építik fel, de mellettük elengedhetetlenek az aktinból felépülő mikrofilamentumok, és az ezekhez kötődő nem-izom miozin-II ATPáz, amelyek együtt az úgynevezett kortikális filamentális aktomiozin hálót alkotják. A migráció, extravazáció, embriógenezis, rákos elváltozások metasztázisa, és még számos egyéb folyamat a kontrakcióra képes mikrofilamentumok nélkül 4
nem valósulhat meg. (12) A (-)-blebbisztatin lehetőséget nyújt ezen celluláris folyamatok in vivo vizsgálatára. A nem-izom miozinnak fontos szerepe van a mikrofilamentumok összeszerelődésében is. A miozin-II az egyetlen olyan fehérje a miozin szupercsaládba tartozó proteinek között, amely bipoláris, mindkét végénél megtalálható motor doménnel rendelkező filamentumot képez. Ha ezek a filamentumok ellentétes polaritású aktinszálakkal találkoznak, kontraháló rendszert hoznak létre. A nem-izom miozin-II által alkotott filamentumok hasonlóak, bár rövidebbek, mint a szkeletális miozin-II filamentumok. Ez a kontrakcióra képes, kortikális filamentális hálózat olyan aktomiozin szálakból és kötegekből kapcsolódik össze, amelyek fokális adhéziókhoz, vagy egyéb adhéziós struktúrákhoz rögzülnek. A kontrakciós rendszer többek között a lamellopódiumok, fillopódiumok és egyéb nyúlványos képződmények vázát is adja, amelyekkel a sejtek mozgásra, vagy éppen sejttestük rögzítésére képesek. A sejtváz elemei a fokális adhéziókon keresztül, nyúlványok nélkül is rögzítik a sejteket az extracelluláris mátrixhoz. (12) (13) A blebbisztatin képes ezt a kontraktilis rendszert teljesen szétszedni, és megakadályozza a lamellopódiumok képződését is. Lamellopódiumok helyett blebbisztatinos kezelés alatt fodorszerű struktúrák képződnek, a fokális adhéziók, fokális komplexek teljesen eltűnnek. Ezek a változások reverzibilisek, azaz a drog kimosása után négy órával minden struktúra visszanyeri eredeti szerkezetét. (12) Ha az endothélium megsérül, akkor a seb környékére endotheliális sejtek vándorolnak. Ezt a vándorlást is a miozin-II motorfehérje és az F-aktin teszi lehetővé, melynek mechanizmusát borjú aortális endotheliális sejteken (Bovine Aortic Endothelial Cells, BAECs) vizsgálták. (7) A migráló sejtekben a miozin-IIA ATPáz aszimmetrikus eloszlást mutat; a sejt anterior részében akkumulálódik. 30 μM (-)-blebbisztatinnal kezelve a migráló sejteket, a miozin-IIA a perinukleáris citoplazmában marad, és aszimmetrikus felhalmozódása nem figyelhető meg. 100 μM-nál a miozin-IIA a sejt hátulsó felében akkumulálódik. A (-)blebbisztatin az F-aktin eloszlására nincs hatással, ellenben befolyásolja a miozin-IIB ATPáz anterior megjelenését is, bár ez a motorfehérje izoforma a migráció során a sejtek hátulsó részében lokalizálódik. Ezekből az eredményekből úgy tűnik, hogy a miozin-II motorfehérjék poszterior felhalmozódásához nincs szükség a motor doménre, illetve az ATPáz aktivitásra, hiszen azt a (-)-blebbisztatinnal nem lehet gátolni. A sejtmotilitást lehetővé tevő struktúrák képződését ma már olyan módszerekkel, eszközökkel is követni tudjuk, amelyekhez nem kell a sejtbe juttatnunk nyomkövető anyagokat, amik esetleg befolyásolhatják a mérést. Ilyen műszer a kvarc-kristály mikromérleg 5
(QCM), vagy az impedancia szenzor. Mindkét eszköz tulajdonképpen hanganalízissel követi nyomon azt, hogy a sejten belül hol, milyen mértékű a filamentális rendszer föl- illetve leépülése. Ezáltal sokkal pontosabban vizsgálhatjuk akár a blebbisztatin vagy más drogok hatását is a szkeletális rendszerre. (14) A (-)-blebbiszatint optikai térképezésnél is használják például szívizom preparátumok esetében, hogy minimalizálják a mozgás-melléktermékeket, melyeket az összehúzódás vált ki. (4) Más drogokkal ellentétben a (-)-blebbisztatin kevésbé befolyásolja az ioncsatornák működését, ezért jobb elektromechanikai szétkapcsoló. Ezeknél a vizsgálatoknál figyelni kell arra, hogy a (-)-blebbisztatin ne csapódjon ki az érfalakra. Ennek elkerülésére a (-)blebbisztatint 42-45 C°-on kell a használt médiumba oldani. Másrészt a blebbisztatin a szövetek belső fluoreszcenciájában spektrális eltolódást okozhat, ami módosíthatja a zöldfluorofór képalkotást. (4) A nem-izom miozin-II ATPáz a Natural Killer (NK) sejtek tumoros, vagy fertőzött sejteket pusztító mechanizmusában is nélkülözhetetlen szerepet játszik. (15) Az NK sejtek felismerik a fertőzött, vagy valamilyen más szempontból nem egészséges sejteket, majd úgynevezett immunológiai szinapszist (IS) alakítva ki a célsejttel, mérgező granulumaikat a célsejt közvetlen közelébe, azaz az immunológiai szinapszisba képesek üríteni. A nem-izom miozin-II ATPáz az aktinnal együtt elősegítheti a vezikula fúzióját egyszerű erőgenerálással, vagy úgy, hogy a membrán alatt futó aktin filamentumot összeköti a vezikulumokat szállító mikrotubulusokkal. Ez utóbbi esetben a membránfúzióhoz szükséges fizikai közelséget biztosítja a motorfehérje. A nem-izom miozin-II ATPáz blebbisztatinnal történő blokkolása gátolja a lítikus granulómák membrán fúzióját, ezáltal az NK sejtek citotoxikus képességét. A miozin II ATPáz a citokinetikus gyűrű kontrakciójában is fontos szerepet kap. Ezt (-)blebbisztatinnal gátolni lehet, de a gátlás kék fénnyel megszűntethető. (2) Így különböző citokinézis vizsgálatokban adott területeken feloldható a (-)-blebbisztatin hatása. Nem mindegy azonban, hogy mennyi ideig történik a besugárzás, mivel bizonyos idő elteltével a sejtekre mérgező ROS termékek szabadulhatnak fel a fotobomlékony (-)-blebbisztatin molekulából.
6
2. A blebbisztatin
Az előző fejezetben láthattuk, hogy a (-)-blebbisztatin számos celluláris folyamatot képes a miozin-II ATPázon keresztül közvetlenül, de akár közvetve is befolyásolni. Kutatások során sokszor alkalmazzák, ezért fontos, hogy minél többet tudjunk meg a molekuláról. A (-)-blebbisztatin metil-5-metilantranilátból, négy lépésben állítható elő. (16) A szintézis lépései a következők; (a) pirrolidinont reagáltatnak metil-anthraniláttal foszfor-oxiklorid jelenlétében, így 41%-ban amidin keletkezik. (b) Az amidin ciklizációját a megfelelő kinolonná lítium bis-trimetilszilil-amid (LiHMDS) felesleg alkalmazásával lehet elérni. (c) A kinolon oxidációja Davis oxaziridin metodikával történik, melynek során egy hidroxil-csoport kerül a molekulára (d) A keletkezett (±)-blebbisztatinból -10 °C-on LiHMDS és oxaziridin származék felhasználásával akár 86%-os, NaHMDS segítségével, akár 90%-os (-)-blebbisztatin szintetizálható. (1. ábra)
7
1. ábra: A (±)-blebbisztatin szintézise. (a) pirrolidinont reagáltatnak metil-anthraniláttal foszforoxiklorid jelenlétében, (b) amidin ciklizációja a megfelelő kinolonná lítium bis-trimetilszilil-amid (LiHMDS) felesleg alkalmazásával, (c) kinolon oxidációja Davis oxaziridin metodikával, melynek során egy hidroxil-csoport kerül a molekulára. Az ábrát Marvin molekularajzoló programmal készítettem.
A szintézis során egy érdekes jelenséget figyeltek meg; a kinolon napfény hatására DMSO-ban spontán (±)-blebbisztatinná alakult. A jelenséget UV-fénnyel fokozni tudták. Ez tehát arra utal, hogy a környezetben található vízmolekulák képesek reakcióba lépni a kinolon gyűrűvel, és a hidroxil-csoport relatíve könnyen rákerül a molekulára. Ez a jelenség talán megerősíti azt a hipotézist, mely szerint a fototoxicitásért a reagensről leszakadó ROS termékek tehetők felelőssé. Röntgen-krisztallográfiás vizsgálatokból az is kiderült, hogy a gátlásért felelős inhibitor abszolút konfigurációja S-(-)-blebbisztatin. Enantiomerje, a (+)-blebbisztatin nincs jelentős hatással a miozin-II ATPázra, így akár kontrollként is használható adott kísérletekben. (16)
8
Ma már többféle blebbisztatin származékot tudnak előállítani réz katalizálta Ullmann Nariláció különböző módosításaival. (17) A (-)-blebbisztatin kis mérete révén könnyen átjut a plazmamembránon, pár perc alatt bejut a sejtekbe. Mivel a (-)-blebbisztatin specificitása igen nagy, emellett reverzibilisen gátol, jól alkalmazható olyan kísérletekben, amelyek tipikusan a szkeletális és nem-izom miozin-II izoformák funkcióját vizsgálják. Úgy tűnik, hogy a sejten belül, semmi máshoz nem képes akkora affinitással kötődni, mint ezekhez a motorfehérjékhez. (2. ábra) Valójában már a simaizom miozin-II ATPáz izoforma aktivitását sem képes számottevően gátolni. Emellett nagyon kicsi vagy egyáltalán semmilyen hatással nincs a miozin-I, -V és -X-es osztályokba tartozó motorfehérjékre. (5) (9) (5) (2)
2. ábra: A miozin-II ATPáz és a blebbisztatin. Ciánkékkel a Dictyostelium discoideum-ból származó miozin-II ATPáz látható. Pirossal jelölve a blebbisztatin, amely az aktin kötő árok és a nukleotid kötő zseb között található. A Gly240, és a Leu262 aminosavak, melyek a blebbisztatin OHcsoportjával hidrogén hidakat alakítanak ki, narancsszínűek, az ADP-VO4 ciklámen. Az ábrát Pymollal készítettem a 1YV3 PDB file alapján.
Jelenleg a miozin motorfehérjéknek 31 osztálya ismert. (18) Mindegyik osztályban közös a motor domén megléte, és annak működésének kémiai mechanizmusa. Ennek 9
fényében még inkább meglepő, hogy a (-)-blebbisztatin nagy szelektivitással csak néhány miozin-II ATPáz izoformához képes kapcsolódni. Mindemellett az a hidrofób árok a motor doménben, ahova a (-)-blebbisztatin köt, az egyik legkonzervatívabb része a motorfehérjének. Mégis néhány kis szekvenális és strukturális különbség lehetővé teszi ezt a nagyfokú specificitást. (19)
3. A (-)-blebbisztatin gátlási mechanizmusa Már 2004-ben ismert volt (3), hogy a (-)-blebbiszatin a miozin-ADP-Pi komplexhez képes nagy affinitással, reverzibilisen kötődni, ezáltal befolyásolja a foszfát enzimről való leszakadását. Azaz a (-)-blebbisztatin egy unkompetitív inhibitor molekula, nem verseng az ATP szubsztráttal, máshova képes bekötni, azaz allosztérikusan fejti ki hatását. Általánosan a miozinok egy motor domént, egy nyaki domént és egy farok domént tartalmaznak. (20) A motor domén két legfotosabb része az ATP és az aktin kötő régiók. Alaposabban szemügyre véve, a miozin motor domén négy szubdoménre osztható; Nterminális, alsó és felső, illetve konverter. (21) (6) Az alsó és felső, összesen 50 kDa-nyi szubdomént egy árok hasítja ketté. A (-)-blebbisztatin a miozin aktin-kötő 50 kDa-os szubdoménjénél lévő nagy árok csúcsánál található hidrofób zsebhez képes kapcsolódni. (1) (2. ábra) A kötés stabilizálását és orientációját hidrogén hidak alakítják ki, amelyek a miozin Leu262, Gly240 és a (-)-blebbisztatin hidroxil-csoportja között találhatóak. A kölcsönhatás erősségét ezen felül az a hidrofób effektus biztosítja, amely az erősen hidrofób komponens, és az azt kötő, hidrofób környezetet biztosító zseb között jön létre. Az aromás gyűrűről lelógó, az árok legmélyebb pontjához elérő metil-csoportnak is van némi szerepe a fehérje-lingandum kölcsönhatás kialakításában, bár a metil-csoport hiánya nem okoz különösebb változást a fehérje-inhibitor kapcsolódásában. (19) Kinetikus vizsgálatok és dokkolási szimulációk egyaránt bizonyítják, hogy a blebbisztatin az 50 kDa árokhoz kötve stabilizálja a miozin ún. átmeneti állapotát (20), úgy, hogy akadályozza az árok aktin-kötés által generálódó bezáródását. Az árok bezáródása előfeltétele az erősen kötődő aktomiozin komplex kialakulásának, és a foszfát távozásának. (22) Mivel ez a konformáció változás nem tud bekövetkezni, a miozin az ADP-Pi-t kötő átmeneti állapotban ragad. Ezek a vizsgálatok azonban azt még nem mutatták meg, hogy a (-)-
10
blebbisztatin közvetlenül, konkrét konformáció változást előidézve gyengítik az aktin-miozin kapcsolatot, vagy közvetve egyszerűen a foszfát távozását akadályozva éri el ugyanezt. Pirén-fluoreszcens-szenzor illetve elektronmikroszkópos vizsgálatok kiderítették, hogy a (-)-blebbisztatin nem változtatja meg a miozin-II konformációját, ezért sem ATP sem ADPPi kötött állapotban nem befolyásolja a motorfehérje aktin affinitását. (23) Azaz a (-)blebbisztatin nem közvetlenül, konformáció változást előidézve okozza a miozin gyenge aktin kötő állapotának stabilizálódását, hanem a foszfát elengedés akadályozásán keresztül. Az erős aktomiozin kölcsönhatás kialakulását maga az aktin indukálja, de ha az inorganikus foszfát a blebbiszatin miatt nem távozik a miozinról, az aktin nem képes előidézni az erős kötésnek megfelelő zárt-árok állású konformációs változást. A drog kis affinitással az apo-miozin-II S1 részéhez is köt, de semmilyen befolyással nincs annak nukleotid kötéséhez. (1) A blebbisztatin-miozin-ADP-Pi-komlpex kis affinitással köti az aktint, és az enzim erőgeneráló funkciója is sérül. Nem azért, mert ebben az állapotban az enzim egyáltalán nem köti az aktint, hiszen ma már tudjuk, hogy ez nem így van. Az erőgenerálás során a miozin pontosan ebben a gyenge aktin kötő komplex formában van, mégis a termodinamikai feltételeket felülíró kinetikai okokra visszavezethetően, az erőgeneráló aktin kötött erőkar lecsapás történik meg. (21) Mivel azonban a (-)-blebbisztatin miatt a foszfát nem képes távozni, a ciklus sem képes tovább gördülni, az aktin mozgatása megakad. Az aktin tulajdonképpen a miozin-II ATPáz enzim allosztérikus aktivátora, mely körülbelül hússzorosára (22) képes növelni a motorfehérje által végzett ATP hidrolízist. Az aktin nem a termék keletkezését gyorsítja, hanem annak leszakadását az enzimről. A (-)blebbisztatin ezzel ellentétben úgy képes gátolni az ATPáz aktivitást, hogy megakadályozza a foszfát termék távozását, illetve közvetve korlátozza a miozin-ADP-Pi-komplex aktinnal kialakított erős kapcsolódását. Meg
kell
különböztetnünk
a
(-)-blebbisztatin
ATPáz
gátló,
és
ennek
következményeként aktin mozgatás gátló hatását. Mivel a miozin-ADP-Pi komplex kis affinitással köti az aktint, a miozin-ADP-Pi pool elég nagy része aktint nem kötő állapotban van. Az erőkar lecsapása ilyenkor sokkal lassabb, és haszontalan, azaz erőgenerálás nem történik. Az erőkar lecsapása nélkül a foszfát nem tud leszakadni az enzimről, a lecsapás viszont a ciklus leglassabb lépése. Ezért a legtöbb miozin fej adott időpontban a legnagyobb valószínűséggel aktint egyáltalán nem, vagy csak gyengén kötött, miozin-ADP-Pi- komplex állapotban van. Így a (-)-blebbisztatin ezekhez kötődve nem okoz látványos változást az aktin mozgatás terén egészen addig, míg elegendő fejet nem von ki teljesen a ciklus forgalmából. 11
Ezt a hipotézist igazolják azok a mérések is, amelyek szerint sokkal nagyobb (-)-blebbisztatin koncentráció kell az aktin filamentum mozgás teljes blokkolásához, mint az ATPáz aktivitás gátlásához. (5), (2) Ez azt is bizonyítja, hogy a (-)-blebbisztatin-miozin-ADP-Pi-komplex gyengén kötve maradhat az aktinhoz. (5) A (-)-blebbisztatin IC50 értéke attól függően, hogy milyen miozin-II izoformáról van szó, különböző. Például nyúl szkeletális miozin-II esetén 0,5 μM, humán nem-izom miozinIIA esetén 5,1 μM, Dictyostelium esetén 4,9 μM. (5) A (-)-blebbisztatin hatásmechanizmusának alaposabb vizsgálata azt is kiderítette, hogy a drog a miozin ATPáz motorfehérje aktinra kifejtett összehúzó sebességét csökkenti úgy, hogy csökkenti az erőátvitel nagyságát. (24) A szerzők két lehetőséget vázolnak föl. Az egyik estben a (-)-blebbisztatin az ellenállást növelve, a másikban az erőgenerálást csökkentve lassítja az aktomiozin rendszer kontraháló sebességét. Stewart és munkatársai biofizikai magyarázatot adnak, és nem vizsgálják meg alaposabban a két lehetőség molekuláris hátterét, mégis érdemes néhány mondat erejéig erre kitérni. Az izom kontraháló sebességét lassítják azok az aktinhoz kötődő miozin fejek, amelyek már lecsapódtak, mivel ellenállást fejtenek ki. Ez annál is inkább így van, mert nukleotid-mentes, vagy közvetlenül a lecsapás utáni ADP-kötött állapotban a miozin erősen köti az aktint. Ha a (-)-blebbisztatint kötött miozin képes ugyanúgy megkötni az aktint, akkor ebből az következne, hogy azok a miozin fejek, amelyek (-)-blebbisztatinhoz kötődve kapcsolódnak az aktinhoz, szintén ezt az ellenállást növelik, azaz a (-)-blebbisztatin az ellenállást növelve csökkenti a kontrakció sebességét. Ebben az esetben az inhibitor egy olyan nem ciklizáló miozin-fej pool-t különítene el, amely ellenáll az aktin mozgásának, azaz növeli a rezisztenciát, mivel akár erősen is kötni tudja az aktint. Ha azonban a (-)-blebbisztatin gyengíti a miozin aktin kötését, az ellenállás nem fokozódik. Ráadásul a foszfát elengedésen keresztül az erőkar regenerációját is akadályozza, ezáltal kevesebb olyan aktin-miozin-komplex van jelen, amelyben megtörténhet az erőkar lecsapása így csökken az erőátvitel, csökken a kontrakció sebessége. Egy igen frappáns kísérlettel bizonyították be, hogy az utóbbi eset igaz, azaz az erőátvitel csökkenésén keresztül lassul a kontrakció sebessége. Megvizsgálták a miozin aktin filamentumra kifejtett szakítási erejét, illetőleg lemérték azt az időt, ami alatt a miozin adott hosszúságú aktin filamentumokat képes eltörni. Ha a törési, szakadási idő rövid, azaz a filamentumok gyorsan eltörnek, akkor ez azt jelenti, hogy az ellenállás nőtt meg. Ugyanis ugyanolyan erővel húzva egy nagyobb ellenállásnak kitett filamentumot, hamarabb el fog törni az erőtörvények miatt. Ezzel szemben, ha a törési idő lassabb, a filamentumok hosszabb 12
ideig maradnak eredeti hosszúságúak, ez azt jelenti, hogy az erőátvitel gyengül, hiszen ugyanolyan ellenállással szemben kisebb erővel húzva a filamentumokat, kevésbé fognak szétszakadni. A mérésekből kiderült, hogy az utóbbi történik, ami összhangban áll az előző vizsgálatokkal is. A miozin-ADP-Pi-komplex aktin kötő affinitása blebbisztatin nélkül is nagyon kicsi. Bár az erőkifejtés, azaz az erőkar lecsapása ebben a kis aktin affinitású állapotban jön létre, az erőkar regenerációja a foszfát távozása nélkül nem lehetséges. Azaz a (-)-blebbisztatin a foszfát-elengedés akadályozásán keresztül valóban elkülönít egy nem ciklizáló miozin-poolt, de ezek a miozinfejek nem növelik az ellenállást, mivel nem, vagy nem erősen kapcsolódnak az aktin szálhoz. Azt is tudjuk, hogy a (-)-blebbisztatin a foszfát elengedését úgy gátolja, hogy kötődve a miozinhoz a motor domén switch-2 részét egy zárt konformációs állásban rögzíti. (20) (22) (25) Ezáltal tehát közvetve befolyásolja, csökkenti a miozin aktin-affinitását. Ezt az aktomiozin szálak térbeli elrendeződésének vizsgálatával is igazolták. A vékony és vastag filamentumok összerendeződése az aktin-miozin kapcsolat kialakulása nélkül nem jöhet létre. Ez egy kalciumion függő folyamat, amelynek során a két filamentum többszörösen kapcsolódik, és közös kötegeket alkotnak. Negatív festésű elektronmikroszkóppal igazolták, hogy (-)-blebbisztatin – és Ca2+ - jelenlétében nem alakul ki kapcsolat a két filamentum között, azaz a (-)-blebbisztatin ténylegesen negatívan befolyásolja az aktin-miozin kapcsolódást. (25)
4. Fotoszenzitivitás, fototoxicitás A (-)-blebbisztatin miozin-II ATPáz gátló mechanizmusáról tehát már van információnk. Az évek során azonban egyre több érdekes tulajdonságra derült fény a (-)blebbisztatinnal kapcsolatosan. Kiderült például az, hogy kék fény hatására a molekula elveszíti gátló aktivitását, mindemellett citotoxikussá válik a sejtek számára. A molekula tehát egyszerre fotoszenzitív és fototoxikus. A két tulajdonság bizonyára összefügg. Sakamoto és munkatársai (2) 2004-ben fedezték fel, hogy kék fény (488 nm) hatására a (-)-blebbisztatin gyorsan elveszíti inhibíciós képességét. Tehát a (-)-blebbisztatin inhibíció reverzibilitását nemcsak a drog kimosásával, de kék fénnyel is kiválthatjuk. Sakamoto-ék motility assays kísérletekkel igazolták, hogy a zöld fény (532 nm) nem indukálja a gátlás 13
feloldását, viszont ugyanazt a térséget rövid ideig kék fénnyel (488 nm) bevilágítva, a területen minden filamentum mozogni kezdett. Visszatérve a zöld fényre, 10-15 másodperc után a mozgás újra blokkolódott. A szerzők szerint ez az idő túl lassú ahhoz, hogy a gátlás visszatérését a nem fotoinaktiválódott drog bevilágítási területre diffundálásával lehessen magyarázni. Szerintük inkább az inaktiválódott (-)-blebbisztatin lassabb disszociációs konstansa állhat a háttérben. Azaz nem arról van szó, hogy maga a fotoinaktiválás is reverzibilis lenne, hanem arról, hogy az irreverzibilisen fotoinaktiválódott drog nehezen tud disszociálni a miozinról, és így csak időbeli késéssel tud új, nem inaktiválódott (-)blebbisztatin kötődni a motorfehérjéhez. Ha ez a hipotézis igaz, akkor az inaktiváció nem azért következik be, mert a drog nem tud kötődni a miozinhoz. A kék fény indukálta konformáció változás tehát a drog allosztérikus hatását befolyásolja. Bár a (-)-blebbisztatin egy allosztérikus inhibitor, a legegyszerűbb magyarázata annak, hogy elveszíti miozin-II gátló hatását az, hogy nem tud hozzákötődni a fehérjéhez. A filamentum mozgás blokkolásának késése adódhat abból az egyszerű tényből is, hogy ahhoz, hogy az ATPáz aktivitás gátlását a fimamentum mozgásán is tapasztalhassuk, elegendő (-)blebbisztatinnak kell elegendő miozin fejet kivonnia az erőgeneráló ciklusból. Azaz elegendő időnek kell eltelnie ahhoz, hogy adott területre a kellő mennyiségű aktív (-)-blebbisztatin diffundáljon. A (-)-blebbisztatin fotoinaktivitása természetesen függ a besugárzás hullámhosszától és a lámpa teljesítményétől is. (22) 295 nm-en történő 5 másodperces besugárzás után a drog nem volt hatással a miozin ATPáz aktivitására. Ellenben 365 nm-es, szintén 5 másodperces radiáció után a drog megtartotta inhibíciós készségét. Érdekes módon 425 nm-es besugárzás már 1 másodperc után tönkretette a (-)-blebbisztatin inhibitor funkcióját. Magasabb teljesítményű lámpával és alacsonyabb hullámhosszal besugározva a (-)blebbisztatinnal kezelt aktomiozin filamentumokat, a mozgás gátlása egyre kevésbé oldható fel, azaz egyre kevesebb mozgó filamentum figyelhető meg. Ezt a szer fototoxikusságával magyarázzák. (2) A reagens tehát nemcsak az élő sejtekre fototoxikus. A molekuláról nagy valószínűséggel felszabaduló szabadgyökök az aktomiozin szálakat is roncsolni képesek. A (-)-blebbisztatin fototoxikusságát Mikulich (1) és munkatársai vizsgálták egy olyan UV lámpával, amelynek emissziója 390-470 nm-es tartományba esett, 420nm-es emissziós maximummal. Eredményeik alapján elmondható, hogy különféle sejtkultúrák esetén 25μM ()-blebbisztatin már 10 perc után szignifikáns pusztulást okozott. Ennek oka valószínűleg ROS termékek felszabadulása lehet, amit az is alátámaszt, hogy kék fény hatására a (-)blebbisztatin spektrális tulajdonságai megváltoznak. Mikulich-ék UV fénnyel történő 14
besugárzás alatt, 30 percen át követték nyomon a (-)-blebbisztatin spektrumának változását. 365 nm-nél egy izobesztikus pont alakult ki, amelyhez képest két oldalt az egyik csúcs – a 350 nm körüli tartományban - emelkedett, a másik – 400 és 500 nm között - csökkent az egyre tovább tartó besugárzás alatt. A mérési adatokat 5 percenként vették fel. Ebből a spektrumból arra következtettek, hogy UV-abszorbáló fototermékek keletkeznek. A fototoxicitás spektrum függését ez a tanulmány nem vizsgálta. Kolega (26) 20 μM (-)-blebbisztatinnal és egy inverz fluoreszcens mikroszkóp higany lámpájával kezelt BAECs kultúrákat. Az illumináció pontos hullámhosszáról így nem kapott információt, azt viszont megállapította, hogy a (-)-blebbisztatinnal kezelt sejtek 6 órás 450490 nm-es besugárzást követően elvesztették elterülő, letapadó alakjukat, lekerekedtek az aljzatról, és a legtöbben elpusztultak. A citotoxikusság dózisfüggést is mutatott. Az 5 μM (-)blebbisztatinnal kezelt sejtek 20 perces, míg a 20 μM (-)-blebbisztatinnal kezelt sejtek már 10 perces, 450-490 nm-es besugárzást követően majdnem 100%-os pusztulást szenvedtek. A radiációt követően a sejteket egy éjszakán át inkubálták (-)-blebbisztatin mentes médiumban. A (-)-blebbisztatin spektrális tulajdonságai 450–490 nm-es hullámhosszúságú fénnyel történő, egy órán át tartó radiációt követően is megváltoznak (7). Az eredendően jelen lévő 380-500 nm közötti abszorpció teljesen eltűnik, viszont két új csúcs jelenik meg 300 nm és 330 nm körül. Ha 365 nm-res hullámhosszúságú fénnyel történik az egy órás besugárzás, ez a két csúcs nem jelenik, meg, és a 380 – 500 nm közötti abszorbancia is eltűnik. A szerző időben nem követte nyomon a változást, így csak a végeredmény spektrumát elemezhette. Bár ezekből az adatokból arra következtethetünk, hogy a kétféle hullámhosszúságú fény, különböző fototermék keletkezését idézi elő, a fototoxicitásban Kolega (7) nem mutatott ki szignifikáns különbséget. A BAECs kultúrákat 20μM (-)-blebbisztatin jelenlétében a kétféle hullámhosszal 10 percen keresztül besugározva, ugyanolyan mértékű sejtpusztulást regisztrált. Fontos hangsúlyozni, hogy a besugárzást követően a (-)-blebbisztatint azonnal kimosva, és 18 óra inkubálás után figyelhető meg a pusztulás, azaz a fototoxikus termék azonnal hat. Ezt igazolandó, Kolega előre besugárzott (-)-blebbisztatinnal is kezelte a sejteket, amelyekre a fotokezelt szer már semmilyen hatással nem volt, akkor sem, ha a radiációt megismételték a fotoinaktivált drogban álló sejteken. (7) Mindezekből arra lehet következtetni, hogy a besugárzás eredményeképpen valamilyen rövid-életű intermedier keletkezik. Ez lehet ROS termék, amely távozik a molekuláról, vagy egy nagyon reaktív csoport, amely rajtamarad a ()-blebbisztatinon. Ez utóbbi feltételezést Kolega a fotokezelt drog sejten belüli fluoreszcens 15
nyomon követésével támasztotta alá. Úgy tűnik, a besugárzott (-)-blebbisztatin hozzá tud kötni olyan fehérjékhez a sejtben, amelyek immobilisak. Ezáltal adott fehérjék elveszíthetik funkciójukat, így okozva a sejt pusztulását. Az tehát, hogy a fototoxicitás ROS termékek felszabadulása miatt, vagy valamilyen intermedier fehérjéhez való kötödése, és ennek folyományaként az adott fehérje funkcióvesztése miatt következik be, még nem tisztázott. Elképzelhető az is, hogy az intermedier ROS termék felszabadulással keletkezik, azaz mind a ROS, mind az intermedier citotoxikus a sejtre.
5. A (-)-para-nitroblebbisztain
A (-)-para-nitroblebbisztatin (1-paranitrofenil-1,2,3,4-tetrahidro-4-hidroxipirolo[2,3-β]7-metilquinolin-4-1)
valójában
az
(-)-azidoblebbisztatin
szintéziséhez
szükséges
prekurzorként alkalmazták először, amelyből a nitro-csoport azido-csoportra történő cseréjével juthatunk a végtermékhez. (27) (28) A prekurzort aromás nitrálással állítják elő, melynek során a nitrilkation a fenil-csoport 4’-pozíciójú szénatomjára kerül. Az elektrofil nitrilkationt tömény salétromsav és tömény kénsav 1:2 arányú elegyével, azaz nitrálósavval hozzák létre. (29) A (-)-para-nitroblebbisztatin eltér attól a nitroblebbisztatin származéktól (1-fenil1,2,3,4-tetrahidro-4-hidroxipirolo[2,3-β]-7-nitrokinolin-4-1), amelynek spektrális és egyéb tulajdonságait már vizsgálták (16). Az utóbbiban a nitro-csoport ugyanis a triciklikus váz 7. szénatomjára kerül. (3. ábra) Ez a típusú nitroblebbisztatin kisebb kötési konstanssal, és kisebb miozin-II specificitással rendelkezik. (16)
16
3. ábra: A nitroblebbisztatin (A) és a (-)-para-nitroblebbisztatin (B). A nitroblebbisztatinban a nitro-csoport a 7. szénatomon található, míg a (-)-para-nitroblebbisztatinban a fenil-csoport 4. szénatomjáról lóg le, ami a blebbisztatin 15. szénatomja. Az ábrát Marvin molekula rajzolóval szerkesztettem.
A (-)-para-nitroblebbisztatin abszorpciós spektruma 480 nm-en történő besugárzást követően nem változik, és ezen a hullámhosszon a származék szignifikánsan kevésbé fototoxikus a sejtekre, mint a (-)-blebbisztatin (28). Mindemellett in vivo kísérletekből az is kiderült, hogy a (-)-para-nitroblebbisztatin ugyanolyan mértékben képes gátolni a sejtek blebbesedését, mint a (-)-blebbisztatin. Mikroszkópikus vizsgálatok során lényeges szempont, hogy a (-)-para-nitroblebbisztatin nem fluoreszcens, ezért nem zavarja a képalkotást. (28) A biológiai fluoreszcens képalkotási vizsgálatok általában abba a hullámhossz tartományba esnek, amelyben a (-)-blebbisztatin fönt vázolt tulajdonságai megjelennek. Sejtkultúrás vizsgálataink során tehát fontos információ, hogy milyen teljesítményű lámpával, mennyi ideig történhet besugárzás adott hullámhosszon annak érdekében, hogy a sejtek még életben maradjanak (-)-blebbisztatinos kezelés alatt. Méréseim információt szolgáltatnak a (-)blebbisztatin, és származéka a (-)-para-nitroblebbisztatin fototoxikusságának spektrum és idő függéséről.
17
6. Anyagok és módszer Mivel a (-)-blebbisztatint és több származékát illetve ezen molekulák fototoxikusságát laborunkban már vizsgálták, a korábban a kidolgozott protokollt alkalaztam. A (-)-blebbisztatin és a (-)-para-nitroblebisztatin citotoxikus hatásának spektrum függését emberi rákos sejtekre in vivo vizsgáltam, az ELTE Biológiai Intézet Genetika Tanszékétől kapott Hela sejttenyészeten. A Hela sejteket magas glükóz tartalmú, DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) tápoldatban tenyésztettem, amelyet 10% FBS-sel (Fetal Bovine Serum) 3,7g/l nátrium bikarbonáttal, és 40 μg/ml gentamicin antibiotikummal egészítettem ki. A sejttenyészet 37 C°-on, 5% CO2 tartalmú légtérben tartottam. A tápoldatot kétnaponta cseréltem. Az átoltást 3-4 naponta végeztem a következő protokoll szerint; 6 ml PBS- sel kétszer átmostam a sejteket, majd 1 ml EDTA hozzáadásával passzáltam. A centrifugálás 5 percig, 1,3 rpm-en történt. A besugárzáshoz használt 96-lyukú tenyésztőedénybe az előbbiekben ismertetett eljárással kerültek a sejtek, de ekkor a centrifugálás előtt 10 μl EDTA-val feloldott sejtet kivettem az edényből a Bürker-kamrás számoláshoz. Egy lyukba 200 μl, 150 sejt/μl koncentrációjú sejtszuszpenzió került. Az így előkészített 96-lyukú tenyésztőedényt 18 órán keresztül termosztátban 37 C°-on inkubáltam. A (-)-blebbisztatint 10 μM-os koncentrációban alkalmaztam. Ezt a koncentrációt Mikulich méréseire támaszkodva választottam. Mikulich és munkatársai különböző (-)blebbisztatin koncentrációkat (5-200 μM) alkalmazva 3 és 24 órás inkubálást követően vizsgálták különféle emberi rákos sejttenyészetek életképességét. Méréseikből kiderült, hogy a 10 μM-os (-)-blebbisztatin 3 órás inkubálás után nem citotoxikus. Kísérleteim során egy 96lyukú edényt 75 percig sugároztam be, azaz körülbelül 85-90 percig áztak a sejtek a (-)blebbisztatinban. Ebben az időintervallumban tehát 10 μM (-)-blebbisztatinnak nincs nem fényindukált mérgező hatása. A (-)-blebbisztatint egy 10 mM-os törzsoldatból hígítottam 10 μM koncentrációjúra, PBS (Phosphate-Buffer-Saline) segítségével. A 10 mM-os törzsoldatot egy 50 mM-os törzsoldatból készítettem dimetil-szulfoxiddal (DMSO), mivel ilyen hígításnál a PBS-ben a ()-blebbisztatin kicsapódik. A (-)-para-nitroblebbisztatint ugyanilyen módon használtam, és hígítottam. Minden lyukba 400 μl PBS-ben 0,4 μl drog volt. Miután feltöltöttem a megfelelő lyukakat, parafilmmel szorosan lefedtem a tenyésztőedényt. A 400 mm3 térfogatú lyukakat színültig töltöttem fel. Erre azért volt 18
szükség, hogy a megvilágítás során 90°-ban megdöntött edényben a sejtekről ne tudjon elfolyni a folyadék, mert ebben az esetben a sejtek hamar kiszáradtak volna. A parafilm a lyukból való elfolyást akadályozta meg.
Minden (-)-blebbisztatinnal, illetve (-)-para-
nitroblebbisztatinnal végzett munkát sötétben kellett végezni, hogy a molekula ne módosuljon idő előtt. A besugárzást korábban többféle lámpával is kipróbálták. A leghatékonyabbnak egy FLS920P típusú spektrofluoriméter (Edinburgh Instruments) xenon lámpája bizonyult. A 96lyukú tenyésztőedénybe kirakott sejteket egy állvány segítségével a spektrofluoriméter lámpája elé lógattam úgy, hogy a sejteket hordozó edényfelület pontosan a fénysugár fókuszába essen. Az íriszt 100-ra, a ∆λ-át 18 nm-re állítottam, a lehető legnagyobb teljesítmény elérése érdekében. Mivel a 450 W-os xenonlámpa fotonkibocsátása a hullámhossz függvényében változik, a referencia detektor adatait mindig feljegyeztem, hogy lássam a körülbelüli fotonszámot. A besugárzásokat a következő hullámhosszakon végeztem: 320 nm, 360 nm, 400 nm, 440 nm, 480 nm. Az egyes hullámhosszokon rendre elvégeztem az 5 perces, 10 perces, 20 perces, 40 perces megvilágításokat. A besugárzás után eltávolítottam a sejtekről a drogot tartalmazó PBS-t, és 200 μl médiumban újabb inkubálás következett egy éjszakán át 37 C°-on. Másnap reggel leszívtam a tápoldatot a sejtekről, majd 5-10 μl Trypan blue festéket cseppentettem rájuk. Ez a festék csak a halott sejtek membránján képes áthatolni, így könnyen el lehet különíteni azokat az élőktől. A kiértékelést egy Olympus inverz fluoreszcens mikroszkóppal végeztem, úgy, hogy a belátható tér 1 × 1 mm2 területéről digitális fényképet készítettem. A fényképen látható sejteket megszámoltam, két kategóriát különítve el; élőket és halottakat. A kapott eredményeket százalékosan ábrázoltam a hullámhossz vagy az idő függvényében.
19
7. Eredmények A kísérlet során optimalizálni kellett minden olyan momentumot, amely alapján a méréseket a lehető legpontosabban meg lehet ismételni. A módszerek kidolgozása, tökéletesítése mindenképpen fontos eredménye ennek a projektnek. 7.1. Optimalizáció Mivel az előttem történő mérésekkel nem a citotoxikusság spektrum függését vizsgálták, az én méréseimet nagyon sok szempontból át kellett alakítani. Az előző mérések ugyanis azt vizsgálták, hogy 480 nm-es besugárzást követően van-e különbség a (-)blebbisztatin és többféle származékának citotoxikusságában. Az első méréseket fókuszban végeztem. Ebben az esetben, a nagyobb energiájú hullámhosszakon már az 5 perces besugárzás is pusztulást eredményezett. Ekkor az elhalás csak a fókuszpontba eső kis területen volt megfigyelhető, a 96-lyukú tenyésztőedény aljának nagyobb részén nem. A bevilágított kis terület élesen elkülönült a környezetétől (4. ábra), jelezve azt, hogy csak azok a sejtek pusztultak el, amiket ért az UV fény. Ez tehát bizonyítja, hogy a (-)-blebbisztatin UV fény hatására gyorsan bomló, fototoxikus termékek keletkezése közben átalakul. De a sejteken kívül keletkezett fototoxikus termék nem tud eldiffundálni, és bejutni olyan sejtekbe, amelyek nem kerültek a fókuszpontba. A termék közvetlenül a sejtek belsejében okoz csak problémát.
20
4. ábra: Besugárzás fókuszban. Jól látható az élesen elkülönülő határvonala a besugárzott területnek. Ez azt is bizonyítja, hogy a (-)-blebbisztatin citotoxicitása valóban UV fény által, a sejteken belül indukálható. A fotó blebbisztatinnal és 440 nm-es, 20 perces sugárzással kezelt Hela sejtekről készült.
Az o-fókuszos beállítással megpróbáltam a 96-lyukú tenyésztőedényben egyenletesebb foton eloszlást elérni. Így nem csak egy pontban, hanem az egész felületen egyenletesebb pusztulást értem el, lényegesen javítva ezzel a statisztikát. A DMSO-t tartalmazó PBS kontroll azt is megmutatta, hogy önmagában az UV besugárzás nincs szignifikánsan pusztító hatással a Hela sejtekre. Az UV fény leginkább az éppen osztódó sejtekre volt végzetes hatással. Ez a hatás sokszor nem azonnali pusztulást jelentett. A sejtek több esetben először gyors osztódásba kezdtek, kis sejtcsomókat hozva létre, amelyek azonban egy éjszaka után el is haltak. Ez a jelenség véletlenszerűen, akár droggal kezelt sejttenyészeteken is előfordult, függetlenül a besugárzás időtartalmától. (5. ábra)
21
5. ábra: Gyorsan osztódásnak induló, de hamar elpusztuló sejtek. A fotó egy 10 perces, 480 nmes fénnyel besugárzott PBS kontroll Hela sejttenyészetről készült, amelyen jól látható az elhalt sejtek által kialakított sejtcsomó.
7.2. Sejtszám beállítása Eredetileg egy lyukba 200 μl médiumba körülbelül 3 × 104 sejt került. A sejtszámot próbáltam ideálisabban beállítani, mivel 3 × 104 db túl soknak bizonyult. A sejtek már 18 óra elteltével, több helyen két rétegben is kinőttek. Sőt, a besugárzást követő inkubálás után a pontos sejtszámolást igencsak megnehezítette a sok helyen akár már három rétegben is kinőtt sejttömeg. (6. ábra) Több próbálkozás után a 1,5 × 103 sejt / lyuk sejtszám, azaz 7,5 ×103 sejt / ml koncentráció tűnt a legideálisabbnak.
22
6. ábra: Túlnőtt sejtkultúra. Az eredeti 150 sejt/µl koncentráció túl soknak bizonyult, főleg olyan esetekben, amikor a külső stressz nem volt erős. (-)-Blebbisztatinnal kezelt Hela sejtek 480 nm-es, 5 percig tartó besugárzás után.
A manuális számolás szempontjából ennél kevesebb sejtszám lett volna ideális. Ha azonban kevesebb sejttel végeztem a kísérletet, akkor sokszor előfordult, hogy a sejteket a festéskor véletlenül eltávolítottam a lyukból. Ekkor ugyanis a sejtek nem kapcsolódtak egymáshoz, közöttük rések maradtak, egymással kevésbé tudtak kapcsolatokat kialakítani. Mivel kevésbé tudtak egymásba kapaszkodni, a pipetta szívóerejének, kevésbé tudtak ellenállni, ezért sokszor felváltak az edény aljáról, amikor a médiumot eltávolítottam a festés előtt. (7. ábra)
23
7. ábra: A tenyésztőedény a sejtek véletlenszerű eltávolítását követően. Ha a sejtek túl kevesen voltak ahhoz, hogy egymáshoz is képesek legyenek kapcsolódni, könnyebben felváltak az aljzatról. Hela sejtkultúra festés után.
7.3. A reagensek kezelése A (-)-blebbisztatin nagyon könnyen kicsapódik mind vizes közegben, mind PBS-ben, ezért az 50 mM-os törzsoldatot DMSO-ban oldottam fel. Az előkészített 10 mM-os törzsoldatot 5-10 μl-es adagokban fagyasztottam le. Így elkerültem, hogy az egész drog minden mérésnél fel legyen olvasztva. A (-)-para-nitroblebbisztatinnal ugyanígy jártam el. A PBS-es hígításnál ügyeltem arra, hogy a drog ne csapódjon ki, és minél jobban elkeveredjen az oldószerben. Úgy tűnt, hogy 5ml PBS-ben nehezen keveredett el az 5 μl drog. A sokszori szuszpendálás sem segített, mert az oldott anyag könnyen kitapadt a műanyag pipettahegyek oldalára. Ezért a legjobb megoldásnak az tűnt, ha a (-)-blebbisztatint 1 μlenként hígítottam fel 1ml PBS-ben, úgy, hogy 1 μl drogra rázúdítottam a PBS oldószert, ezzel is elősegítve a szuszpendálás nélküli összekeveredést. Végül így került 400-400 μl oldat a lyukakba. A (-)-para-nitroblebbisztatinnal ugyanígy jártam el. Ügyeltem arra is, hogy a PBS kontroll lyukakba kerüljön 1 μl DMSO is, ezzel ellenőriztem, hogy nem a DMSO, hanem valóban a drog a citotoxikus.
7.4. A kontroll Kétféle kontrollt használtam: egyrészt minden esetben volt nulla perces megvilágítás, azaz volt olyan lyuk a 96-lyukú tenyésztőedényben, amely kapott drogot, de nem kapott fényt. 24
Másrészt minden megvilágítást PBS-sel kezelt sejteken is elvégeztem. Ezekben a lyukakban tehát DMSO is volt a PBS mellett. Az első kísérleteknél a PBS kontrollok egy edényben voltak a droggal kezelt sejtekkel. A mérések során úgy tapasztaltam, hogy a parafilm nem zárta le a folyadékkal tele lyukat kellő mértékben, mindig történt szivárgás, ezért sokszor a PBS-el kezelt sejtek akkor is nagy arányban pusztultak, amikor nem ezt vártam. Ebből következtettem arra, hogy ha egy PBS-kontroll lyuk túl közel volt a droggal kezelt lyukhoz, a drogot tartalmazó PBS összekeveredett a tiszta PBS-el, ami a nem várt pusztulást okozhatta. Ezek után a PBS kontrollt inkább külön 96-lyukú edényben kezeltem, úgy, hogy ugyanabból a sejtkolóniából lettek felnövesztve, ugyanakkor lettek kiszedve és visszatéve a termosztátból, mint a droggal kezelt sejtek. Ezek után a PBS-sel kezelt sejtek kevésbé, sokkal inkább a várt értéknek megfelelően pusztultak. 7.5. A besugárzá A besugárzásokat ∆λ = 9 nm-en végeztem. Ezzel a beállítással bár csökkentettem a lámpa által kibocsátott fotonok számát, de egzaktabbá tettem az egyes hullámhossz pontokat a skálán. Mivel az én méréseimhez inkább o-fókuszos beállításra volt szükség, problémát jelentett az, hogy minden edény pontosan ugyanabba az o-fókuszos beállításba kerüljön. Ezt az edény fénynyaláb előtti belógatásával nem lehetett elérni. Olyan megoldásra törekedtem, amelynek segítségével pontosan reprodukálhatóvá tudok tenni minden egyes beállítást. Ehhez a spektrofluorimétert át kellett alakítani. Kiszereltem a küvettatartót, és annak helyére egy a 96-lyukú tenyésztőedényhez készített tartót erősítettem. Ennek segítségével minden edényt pontosan ugyanabban az o-fókuszos beállításban tudtam bevilágítani. (8. ábra) Az o-fókuszos beállításra azért volt szükség, hogy a lyuk minél nagyobb területe kapjon egyenletes fényt.
25
8. ábra: A 96-lyukú tenyésztőedény rögzítése a spektrofluoriméterben. A képen jól látható a fény útjában, o-fókuszos állásban rögzített edény. Az egyes lyukakat az edény fémkarok közötti résben történő csúsztatásával lehetett a fény elé helyezni.
7.6. Fénykép készítése Mivel a fénykép készítését egy külön digitális fényképezőgéppel készítettem, a fotózás beállítása nagyon időigényes volt. Ráadásul a lefotózott területet a lyukon belül, megközelítőleg sem lehetett úgy beállítani, hogy minden lyukról, azonos helyről készüljön a kép. Ezek miatt a problémák miatt mikroszkópot váltottam. Az Olympus fénymikorszkóp beépített kamerájával sokkal jobb felbontású TIFF képeket tudtam készíteni. A beállítást a mikroszkóp asztalán lévő vonalzók segítségével még pontosabbá tudtam tenni, úgy, hogy ez nem került sok időbe. Így minden lyukról, körülbelül azonos helyen készülhetett az 1 mm2-es területről felvétel. 7.7. Sejtek azonosítása, csoportosítása A képen található sejteket három kategóriába sorolva számoltam meg; halott, csökkent életképességű (torz), élő. A halott sejtek megfestődtek, az élők és a rosszul lévők nem. A harmadik kategória bevezetését az indokolta, hogy azok a sejtek, amelyek nyilvánvalóan pár óra múlva elpusztultak volna, a protokoll szerint még élőnek számítottak, mert nem festődtek meg. Ez az eljárás azonban rontotta a statisztikát, nem adott reális képet a valóságról. A
26
csökkent életkáépességű kategória beiktatásával pontosabban lehetett leírni a mérési eredményeket. A rosszul lévő, torz sejteket festés nélkül is jól el lehet különíteni az élőktől. Ebbe a kategóriába akkor került egy sejt, ha morfológiája az átlagostól nagyon eltért a következő szempontok alapján: kisebb átmérő, lekerekedett, felvált alak, blebbesedés, csomósodás, torz alkat, illetve torz sejtmag. (9. ábra) Az egészséges, éppen osztódó sejtek szintén lekerekednek, sőt blebbesedhetnek is, de ez a blebbesedés sokkal kisebb mértékű, jól megkülönböztethető.
9. ábra: A három kategória. Piros ponttal az élő, feketével a halott, zölddel a csökkent életképességű sejtek vannak jelölve. A kép Hela sejtkultúráról készült (-)-para-nitroblebbiszatinos kezelés és 440 nm-es besugárzás után. .
7.8. Sejtszámolás A manuális sejtszámolást ideális esetben programokkal lehet kiváltani. Általában a legtöbb program pixelintenzitás, kontúr, átmérő, és egyéb statisztikusan jól elkülöníthető tulajdonság alapján dolgozik. Hosszas próbálkozás után úgy döntöttem, hogy a sokkal időigényesebb, ám több szempontból megbízhatóbb manuális számolást választom. Bármely sejtszámoló szoftver ugyanis természetesen adott sejttulajdonságok algoritmusra való fordításával tudja elkülöníteni egy képen azokat a pixeleket, területeket, amelyek sejtekként definiálhatóak. A 27
Hela sejtkultúrák két nap alatt az 1mm átmérővel rendelkező alapterületen a 96 lyukú tenyésztőedényben, több rétegben is kinőhetnek, szorosan sorakoznak egymás mellett, ezért alakjuk rendkívül változatos. A második rétegben ülő, kerekebb sejtek kontúrja fekete, míg az aljzaton ülőké fehér színű. Így a kontúr alapján történő elkülönítés sem használható. Talán a halott sejtek megszámlálása a legegyszerűbb, hiszen a trypan blue festék kellőképpen definiálja az elpusztult sejtet. Azonban itt sem vehető minden számolandó egység teljesen egyértelműnek. Az aljzat egyenetlenségei miatt ugyanis előfordulhat olyan terület, amelyről a festék nem tud elfolyni, úgynevezett „festék-pocsolyákat” képez. Ezekről pixelintenzitás és akár kontúr vagy egyéb tulajdonság alapján is nehezebb eldönteni, hogy valójában nem sejtekről van szó. A csökkent életképességű kategória program általi elkülönítése nehézségekbe ütközött. A blebbesedő, torz alakoknak sem az átmérője, sem a kontúrja, sem egyéb közös tulajdonsága nem volt elég pontos ahhoz, hogy algoritmussal definiálható legyen. A műtermékek sejtként való azonosítása is problémát jelentett. Amikor ugyanis a sejtek elpusztulnak, lekerekednek az edény aljáról, sok esetben a lekerekedett sejtek nyoma ott marad az aljzaton. De mivel nem festődnek meg, kontúrjuk alapján néhány program élő sejtként definiálta ezeket a műterméknek számító maradvány struktúrákat. (10. ábra)
10. ábra: Halott sejtek az aljzaton maradt lenyomatukkal. A felvált sejtek az aljzaton hagyják lenyomatukat, amit a sejtszámoló programok élő sejtként definiálnak. A kép Hela sejttenyészetről készült.
A legígéretesebb sejtszámoló programnak a Cell Profiler tűnt. A program főleg úszó sejtkultúrák fekete-fehér képeinek elemzésére íródott, amellyel elsősorban élő sejteket lehet számolni, de nagyon sok paramétert lehet változtatni adott sejtkultúrához igazodva, ráadásul van lehetőség a szoftver átalakítására is. A fönt vázolt nehézségek miatt azonban minden esetben lényegesen pontosabb eredményt adott a manuális számolás.
28
7.9. Módosítások összefoglalása Az újonnan kifejlesztett metodika tehát a következő volt; 75 sejt/µl koncentrációjú Hela sejtszuszpenziót 96-lyukú tenyésztőedénybe mértem, majd 18 órás inkubálás következett. Az egyenletesen letapadt, és osztódott sejtkultúrákat kiválogattam, a médiumot 10 µM koncentrációjú (-)-blebbisztatinra, vagy (-)-para-nitroblebbisztatinra cseréltem, amelyet PBSben oldottam fel. Minden lyukba 400 µl anyag került. Az edény tetejére parafilmet erősítettem, amellyel a folyadék kifolyását akadályoztam meg. Az így előkészített edényt a spektrofluoriméterben az előre beszerelt edénytartóba helyeztem úgy, hogy a különböző lyukakat az edény egy síkban történő elcsúsztatásával lehetett a fénysugár elé állítani, ofókuszban. Az edénytartó segítségével a tenyésztőedény minden bevilágításkor pontosan ugyanabba a helyzetbe kerülhetett. Az adott radiációkor nem bevilágított lyukakat fekete kartonlappal takartam le. A besugárzások 320, 360, 400, 440 és 480 nm-en történtek, 5, 10, 20 és 40 percig. A mérés két kontrollja a nem besugárzott, de szert kapott sejtkultúrák, illetve a csak PBS-sel kezelt 5, 10, 20 és 40 percig azonos hullámhosszakkal bevilágított sejtek voltak. A radiáció után újabb, egy éjszakás inkubáció következett. A kezelt sejtkultúrákat Trypan blue festés után Olympus mikroszkóppal fotóztam le, majd a sejteket három kategóriába sorolva manuálisan számoltam össze. A halott és az élő kategória mellett bevezettem a csökkentett életképességű (torz) csoportot. Ezek a sejtek a kiértékelés idején még életben voltak, nem festődtek meg, de torz alakjukból lehetett következtetni arra, hogy pár órán belül ezek is elpusztulnak. Ezzel a módszerrel minden mérést azonos paraméterek mellett lehetett elvégezni, azaz a kísérlet pontosabban reprodukálhatóvá vált. 7.10. Kiértékelés Az adatok kiértékelését Origin-nel és Berkeley Madonna programmal végeztem. Egy pont egy grafikonon négy független mérési eredmény átlagából adódik össze. A vártnak megfelelően, 75 perces inkubálás 10 μM-os (-)-blebbisztatinnal, vagy (-)para-nitroblebbisztatinnal, besugárzás nélkül semmilyen citotoxikus hatással nem volt a sejtekre. Az 5 perces fókuszos bevilágítások után kiderült, hogy az 520 nm-es radiáció nem toxikus, azaz sem a (-)-blebbisztatin, sem a (-)-para-nitroblebbisztatin nem érzékeny ezen a hullámhosszon. (11. ábra)
29
Bl citotoxikusságának függése
%(halott) % (torz) %(élő)
120
abundancia(%)
100
80
60
40
20
0 300
320
340
360
380
400
420
440
460
480
500
520
540
hullámhossz (nm) pNBl citotoxicitásának függése
% (halott)
120
% (torz) % (élő)
abundancia (%)
100
80
60
40
20
0 300
350
400
450
500
550
hullámhossz (nm) 11. ábra: A reagensek citotoxicitásának hullámhossz függése. Fölül a (-)-blebbisztatin, alul a (-)para-nitroblebbisztatin citotoxicitásának hullámhossz függése látható, fókuszos beállítással, 5 perces besugárzást követően.
Az eltérő hullámhosszokon különböző időintervallumokban történő besugárzásokat kiértékelve, és grafikusan ábrázolva a drog és származéka esetében is egyfajta lag fázis figyelhető meg a citotoxicitásban. (12.-13. ábra)
30
élő sejtek abundanciája (%)
100
320 nm 360 nm 400 nm 440 nm 480 nm
80 60 40 20 0 0
10
20
30
40
idő (perc)
élő sejtek abundanciája (%)
12. ábra: A (-)-blebbisztatin citotoxicitása különböző hullámhosszakon. A lag fázis az élő sejtek abundanciáján figyelhető meg leginkább. A szórásokat a Függelékben található grafikonok tartalmazzák.
320 nm 360 nm 400 nm 440 nm 480 nm
100 80 60 40 20 0 0
10
20
30
40
idő (perc) 13. ábra: pNBl citotoxicitása különböző hullámhosszakon. A 480 nm-es besugárzás kivételével jól látható a lag fázis. 480 nm-es radiációt követően a pNBl negyven perc elteltével sem számottevően citotoxikus. A szórásokat a Függelékben található grafikonok tartalmazzák.
A Berkeley Madonna programmal modellt illesztettem a citotoxikusság folyamatára. A mérési eredményekből kapott, adott hullámhosszhoz tartozó három grafikon pontjait betápláltam a programba, majd a feltételezett kinetikai modellt megadva illesztéseket 31
végeztettem a szoftverrel. A megszámolt sejtpopulációkat a citotoxikus folyamat lefutásának egyes állomásaiban lévő sejteknek feltételeztem. A legegyszerűbb modell szerint az élő populációból (A) keletkeznek a csökkent életképességű, torz sejtek (B), majd ezekből lesznek a halott (D) sejtek. (
D) Visszafelé a folyamat egyik lépése sem történik.
Az egyes sejtpopulációk megfeleltethetők a reagensek egyes állapotainak is. Az (A) stádiumban a drog alapállapotú. A (B) lépésben a reagens változása a sejtek állapotában is tükröződik, de ez a változás még nem letális. A (D) stádiumban a szer olyan módosuláson megy keresztül, amely a sejten belül apoptózist vált ki. Ezek az állapotok egyszerűen az egy lépésben módosuló reagens koncentrációjának fokozatos növekedésével is azonosíthatók. Az, hogy apoptózis, és nem nekrózis történik, igazolja, hogy a változás a sejteken belül megy végbe. A sejteken kívül módosult drog nem roncsolja a membránt. A lag fázis miatt azonban, ez a modell kiegészítésre szorul. Az élő sejtek populációja valószínűleg tartalmaz olyan sejteket (X), amelyek már nem teljesen egészségesek, azaz a citotoxikus folyamat bennük már visszafordíthatatlanul elkezdődött. Ezért a modellt ki kellett egészíteni még egy lépéssel. (
D) Az élőnek számolt sejtpopuláció tehát
valójában a teljesen egészséges, és a citotoxikus folyamat első szintjében lévő, külön nem detektálható sejtek összegét mutatja. Feltételezve, hogy a lemért hullámhosszokon ugyanaz a folyamat játszódik le, valamennyin elvégeztem az illesztést. A kapott sebességi konstansokat a hullámhossz függvényében ábrázoltam. (14-16. ábra)
32
Bl pNBl
k1 (1/perc)
0,1
0,01
1E-3 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
hullámhossz (nm) 14. ábra. A citotoxikus folyamat első lépésének k1 sebességi konstansa. Ez a konstans a sebesség meghatározó, mivel ez a legkisebb. A két reagens 440 nm-en elválik egymástól. 480 nm-en a különbség szignifikáns.
0,1
k2 (1/perc)
Bl pNBl
0,01
1E-3 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
hullámhossz (nm) 15. ábra: A citotoxikus folyamat második lépésének k2 sebességi konstansa. A két reagens citotoxikusságában nincs szignifikáns különbség ennél a lépésnél.
33
k3 (1/perc)
0,1
Bl pNBl 0,01
1E-3 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
hullámhossz 16.ábra. A citotoxikus folyamat harmadik lépésének k3 sebességi konstansa. A k3 értékek sem különböznek szignifikánsan.
A 480 nm-en történt besugárzások k2 és k3 értékeit több mérési ponttal lehetne pontosan meghatározni, azaz ezeket tekinthetjük definiálatlan pontoknak. Azonban az illesztés ezen a hullámhosszon megfelelőnek bizonyul, ha az előző hullámhosszokon kapott k2 és k3 értékhez közeliekkel végezzük.
8. Diszkusszió
A két reagens citotoxikussága tehát főleg a 480 nm-es besugárzást követően történő folyamatok k1 értékeiben különbözik egymástól. A (-)-blebbisztatin k1 értéke ezen a hullámhosszon körülbelül 5,8-szor nagyobb, azaz ha 480 nm-es besugárzással kezeljük a drogokat tartalmazó sejteket, a (-)-para-nitroblebbisztatinnak jóval több idő kell ahhoz, hogy citotoxikussá váljon. Vitatható, hogy a kinetikai modell pontosan minek feleltethető meg a valóságban. Mondhatjuk azt, hogy tulajdonképpen kizárólag a sejtek reakcióját modelleztük, azaz a sejtek általános stresszválaszát, és nem a reagensek citotoxicitását láthatjuk. A detektálható jel ténylegesen a sejtek fenotipikus változása stressz hatására. Mivel azonban a folyamat kinetikus lefutása a két drog esetében eltér, a két stressz-hatásnak is el kell térnie. Azaz jogosan következtethetünk arra, hogy a kinetikus modell valóban a drogok citotoxikus hatását tükrözi. 34
Az első lépés a leglassabb mindkét reagens esetében. Az ehhez tartozó k1 érték a rate limiting konstans, amely az egész folyamat sebességét meghatározza. A különböző hullámhosszakhoz tartozó k1, k2, és k3 értékekben nem figyelhető meg lineáris változás, amit nem is várhatunk. A k értékek a (-)-blebbisztatin esetében a 400 – 440 nm-es tartományban a legnagyobbak, ahol a molekula elnyelési maximuma van (430 nm). A C15-ös helyzetű nitro-csoport tehát 440-480 nm-es besugárzás hatása ellen stabilabbá teszi a blebbisztatin molekulát. Ebből arra lehet következtetni, hogy a blebbisztatin fotoszenzitivitását az 1 fenil-csoport, amelyről a nitro-csoport lelóg, erősen befolyásolja. A benzol gyűrűben lévő delokalizált elektronfelhő könnyebben gerjeszthető, és ez a gerjesztett állapot valószínűleg átadódhat a blebbisztatin vázáról lelógó hidroxil-csoportra és a kettős kötéssel kapcsolódó oxigénre. De ha egy pozitív töltésű nitrilkation kerül a gyűrű mellé, a nitro-benzol sokkal kevésbé lesz reakcióképes, fotonjait nehezebb gerjeszteni. Ezzel magyarázható, hogy a (-)-para-nitroblebbisztatin kevésbé toxikus. Valójában még nem bizonyított, hogy a blebbisztatin kék, vagy UV-fénnyel történő gerjesztésekor tényleg az oxigén és a hidroxidion szakad le a molekuláról. Úgy tűnik, hogy a (-)-blebbisztatin miozin-II motor doménjéhez való kötését a hidroxil-csoport stabilizálja. (31) Több adat is bizonyítja (2), (22), (26), (8) hogy a kék és az UV fény irreverzibilisen elrontja a drog inhibitor funkcióját. Ha a gátló hatás elvesztése azért következik be, mert a reagens többé nem tud stabilan kötődni a motorfehérjéhez, akkor arra következethetünk, hogy a fehérje-inhibitor kölcsönhatásban lényeges szerepet játszó hidroxil-csoporttal történhet valami. Ezt a kérdést affinitás vizsgálatokkal lehetne eldönteni. Az eredmények alapján elmondható, hogy a (-)-blebbisztatin a kék és UV fényű fluoreszcens mikroszkópos vizsgálatok során 20 perc elteltével maradandó károsodásokat okoz a vizsgált sejtpopuláció több mint 50%-ában, míg a (-)-para-nitroblebbisztatin csak UV fényre válik citotoxikussá
35
9. Összefoglalás
A miozin-II ATPáz több izoformája is ismert, amelyekhez a (-)-blebbisztatin, és származéka a (-)-para-nitroblebbisztatin egyaránt nagy affinitással képes kötődni. A (-)blebbisztatin a miozin-II ATPáz inhibitoraként igen sok folyamatra hatással van azokban a sejtekben, amelyekben ez a motorfehérje család expresszálódik, ezért számos in vivo kutatás során alkalmazzák. Az inhibitort néhány órán belül eltávolítva azonban, a sejtek teljes mértékben regenerálódni tudnak, azaz a (-)-blebbisztatin reverzibilisen gátolja célfehérjéit, emellett besugárzás nélkül 75 perc elteltével sem válik citotoxikussá. UV és kék tartományban történő besugárzást követően a (-)-blebbisztatin citotoxikus lesz. 20 perces radiáció után, hullámhossztól függően, a sejtpopuláció körülbelül 50%-a elpusztul. A folyamat irreverzibilis, a drog kimosásával a sejt nem képes regenerálódni. 440 nm alatti hullámhosszon történő, 40 perces besugárzást követően a reagens és származéka egyaránt 100%-os pusztulást okoz. A (-)-para-nitroblebbisztatin a miozin-II ATPáz izoformák hasonló affinitású inhibitoraként a sejtes kutatások során felválthatja a (-)-blebbiszatint, mivel kék fény hatására kevésbé gerjeszthető, nem válik citotoxikussá. A (-)-blebbisztatin és a (-)-para-nitroblebbisztatin citotoxikussága élesen elválik egymástól 440–480 nm-es tartományban. Az előbbi molekula citotoxikus hatása erőteljesebb. A (-)-para-nitroblebbisztatin 40 perces 480 nm-en történő besugárzás után alig éri el a 15%-os pusztulást, míg a (-)-blebbisztatin több mint 50%-ban fototoxikus. A (-)-blebbisztatinnak és származékának citotoxikussága háromlépéses kinetikai modellel jellemezhető. Mindkét esetben az első lépés a leglassabb. 480 nm-en a két reagens k1 értékei szignifikánsan különböznek. A (-)-blebbisztatin k1 értéke kb. 5,8-szor nagyobb, mint a (-)-para-nitroblebbisztatiné, azaz a származék citotoxikus hatása számottevően lassabban következik be. .
36
10. Summary
There are many myozin II ATPase isoforms which are able to attach with the small inhibitor molecule (-)-blebbistatin and it’s derivate the (-)-para-nitroblebbistatin with high affinity. The two molecules affect many intracellular processes. This is the reason, why researchers commonly use this drug at in vivo studies. The cells can completely regenerate themselves, if the drug is removed within a few hours. It means that the reagent is a reversible inhibitor. Moreover, the blebbistatin is not cytotoxic without any radiation treatment after 75 minutes. After UV or blue light radiation the drug turns out cytotoxic. 20 minutes radiation enough to kill more than 50% of the cells. The process is irreversible, washing out the reagent cannot help stopping it. After 40 minutes radiation under 440 or lower nm causes 100% cell damage. The (-)-para-nitroblebbistatin could substitute the (-)-blebbistatin as a myosin II ATPase inhibitor in cellular researches, because it’s cytotoxic effect cannot be generate by blue light. The cytotoxic effects of the two reagents are different at the range of 440 - 480 nm. The (-)-blebbistatin is more effective. After 40 minutes radiation at blue light (480 nm) the (-)para-nitroblebbistatin kills 15% of the cells, meanwhile (-)-blebbistatin causes more than 50 % cell death. The phototoxic effect of the two drugs has a three step kinetic model. The first step is the lowest in both cases. During the radiation at 480 nm, the k1 values of the two reagents are significantly different. The (-)-blebbistatin has a k1 which approximately 5.8 times faster than his derivate’s one. It means, that the (-)-para-nitroblebbistatin needs more time to become cytotoxic.
37
11. Függelék Rövidítések: Bl – (-)-blebbisztatin pNBl – (-)-para-nitroblebbisztatin
A grafikonok egyes pontjai négy független mérés eredményeinek átlagát mutatják.
Bl citotoxicitása 320 nm-es besugárzás után 100
abundancia (%)
80 60
% (élő) % (torz) % (halott)
40 20 0 0
10
20
30
40
idő (perc)
Bl citotoxicitása 360 nm-es besugárzás után 100
abundancia (%)
80
% (élő) % (torz) % (halott)
60 40 20 0 0
10
20
30
idő (perc)
38
40
Bl citotoxicitása 400 nm-es besugárzás után 100
abundancia (%)
80
% (élő) % (torz) % (halott)
60 40 20 0 0
10
20
30
40
idő (perc)
Bl citotoxicitása 440 nm-es besugárzás után 100
abundancia (%)
80
% (élő) % (torz) % (halott)
60 40 20 0 0
10
20
30
idő (perc)
39
40
Bl citotoxicitása 480 nm-es besugárzás után % (élő) % (torz) 80 % (halott)
abundancia (%)
100
60 40 20 0 0
10
20
30
40
idő (perc)
pNBl citotoxicitása 320 nm-es besugárzás után 100
abundancia (%)
80 60
% (élő) % (torz) % (halott)
40 20 0 0
10
20
30
idő (perc)
40
40
pNBl citotoxicitása 360 nm-es besugárzás után
100
abundancia (%)
80 60
% (élő) % (torz) % (halott)
40 20 0 0
10
20
30
40
idő (perc) pNBl citotoxicitása 400 nm-es besugárzás után
abundaqncia (%)
100
% (élő) % (torz) % (halott)
50
0 0
10
20
30
idő (perc)
41
40
pNBl citotoxicitása 440 nm-es besugárzás után 120 % (élő) % (torz) % (halott)
abundancia (%)
100 80 60 40 20 0 0
10
20
30
40
idő(perc) pNBl citotoxicitása 480 nm-es besugárzás után 100
abundancia (%)
80 60
% (élő) % (torz) % (halott)
40 20 0 0
10
20
30
idő (perc)
42
40
Köszönetnyilvánítás Mindenekelőtt
szeretném
megköszönni
laborvezetőmnek,
Málnási-Csizmadia
Andrásnak azt, hogy egy nem megszokott szakdolgozati témát bízott rám. Bár sokszor éreztem úgy, hogy a feladat meghaladja a képességeimet, ő mindig bíztatott, ösztönzött, hogy ne adjam fel, és a kitartásnak idővel tényleg meg lett az eredménye. Azzal, hogy a témában nem tudtam egy már előre mások által kifejlesztett technikára, módszerre támaszkodni, kiváltképpen
megismerhettem
egy
kutatómunka
nehézségeit,
szembetalálkozhattam
buktatóival, de mindezek mellett megízlelhettem azt az örömöt is, ami egy-egy sikeres megoldás után tölti el az embert. Azt hiszem, minden labortársam nevét is felsorolhatnám itt, köszönetet mondva, hiszen a közösség, amelybe a Málnási-kutatócsoport tagjaként kerültem, példaértékű. Különösen köszönöm Ozorócyné Szász Ilonának, Végner Lászlónak, Lőrincz Istvánnak, Várkuti Boglárkának, Rauscher Annának, Képiró Miklósnak, Szegvári Gábornak, Horváth Ádám Istvánnak a rengeteg segítséget és támogatást. A családomnak és barátaimnak nagyon köszönöm a türelmet és a támogatást, hiszen a legfontosabb dolgot adták a munkámhoz, a biztos hátteret. Háttér nélkül ugyanis nem létezik semmi, amit előtérbe lehet helyezni. Vellai Tibornak, a Genetika Tanszék vezetőjének köszönöm a Hela sejtvonalat.
43
Irodalomjegyzék 1. Blebbistatin, a myosin inhibitor, is phototoxic to human cancer cells under exposure to blue light. Mikulich, Aliaksandr, Kavaliauskiene, Simona és Juzenas, Petras. : Elsevier, 2012. DOI: 10.1016/j.bbagen.2012.04.003. 2. Blebbistatin, a Myosin II Inhibitor, Is Photoinactivated by Blue Light. Sakamoto, Takeshi; Limouze, John; Combs, Christian A.; Straight, Aaron F.; Sellers, James R.;. 2, : Biochemistry, 2005., 44. kötet. DOI:10.1021/bi0483357. 3. Mechanism of Blebbistatin Inhibitor of Myosin II. Kovács, Mihály; Tóth, Judit; Hetényi, Csaba; Málnási-Csizmadia, András; Sellers, James R. 34, : Journal of Biological Chemistry, 2004., 279. kötet. DOI: 10.1074/jbc.M405319200. 4. Properties of blebbistatin for cardiac optical mapping and other imaging applications. Swift, Luther M.; Asfour, Huda; Posnack, Nikki G.; Arutunyan, Ara; Kay, Matthew W.; Sarvazyan, Narine. : Muscle Physiology, 2012. DOI: 10.1007/s00424-012-1147-2. 5. Specificity of blebbistatin, an inhibitor of myosin II. Limouze, John; Straight, Aaron F.; Mitchison, Timothy; Sellers, James R. : Journal of Muscle Research and Cell Motility, 2004., 25. kötet. 6. Sellers, J. R. Myosins: a diverse superfamily. hely nélk. : Elsevier, 2000. 7. The Role of Myosin II Motor Activity in Distributing Myosin Asymmetrically and Coupling Protrusive Activity to Cell Translocation. Kolega, John. : Molecular Biology of the Cell, 2006., 17. kötet. DOI: 10.1091/mbc.E06-05-0431. 8. The Myosin II ATPase Inhibitor Blebbistatin Prevents Thrombin-Induced Inhibition of Itrercellular Calcium Wave Propagation in Corneal Endothelial Cells. Ponsaerts, Raf; D'hondt, Catheleyne; Bultynck, Geert; Srinivas, Sangly P.; Vereecke, Johan; Himpens, Bernard. 11, hely nélk. : IOVS, 2008., 49. kötet. DOI: 10.1167/iovs.07-1533. 9. Dissecting Temporal and Spatial Control of Cytokinesis with a Myosin II Inhibitor. Straight, Aaron F.; Cheung, Amy; Limouze, John; Chen, Irene; Westwood, Nick J.; Sellers, James R.; Mitchison, Timothy J.;. : Science, 2003., 299. kötet. DOI: 10.1126/science.1081412. 10. Blebbistatin and blebbistatin-inactivated myosin II inhibit myosin II-indipendent processes in Dictyostelium. Shu, Shi, Liu, Xiong és Korn, Edward D. 5, : PNAS, 2005., 102. kötet. DOI: 10.1073/pnas.0409528102. 11. Jakucs, Erzsébet. A mikológia alapjai. Budapest : ELTE Eötvös Kiadó, 2003. ISBN 963 463 593 8. 12. Functions of Nonmuscle Myosin II in Assembly of the Cellular Contractile System. Shutova, Maria; Yang, Changsong; Vasiliev, Jury M.; Svitkina, Tatyana;. 7, : Plos one, 2012., 7. kötet. DOI: 10.1371/journal.pone.00400814. 13. Szabó, Gábor. Sejtbiológia. Budapest : Medicina Könyvkiadó Rt., 2004. ISBN 963 242 773 4. 44
14. Dynamic Changes of Acoustic Load and Complex Impedance as Reporters for the Cytotoxicity of Small Molecule Inhibitors. Tarantola, Marco; Sunnick, Eva; Schneider, David; Marel, Anna-Kristina; Kunze, Angelika; Janshoff, Andreas;. : Chemical Research in Toxicology (ACS), 2011., 24. kötet. DOI: 10.1021/tx200115q. 15. Myosin IIA is required for cytolytic granule exocytosis in human NK cells. Andzelm, Milena M.; Chen, Xi; Krzewiski, Konrad; Orange, Jordan S.; Strominger, L. Jack;. 10, : The Journal of Experimental Medicine, 2007., 204. kötet. DOI: 10.1084/jem.20071143. 16. Absolute Stereochemical Assignment and Fluorescence Tuning of the Small Molecule Tool, (-)Blebbistatin. Lucas-Lopez, Cristina; Patterson, Stephen; Blum, Till; Straight, Aaron F.; Tóth, Judit; Slawin, Alexandra M. Z.; Mitchison, Timothy J.; Sellers, James R.; Westwood, Nicholas J.;. : Eur. J. Chem., 2005. DOI: 10.1002/ejoc.200500103. 17. Application of the copper catalysed N-arylation of amidies in the synthesis of analogues of the chemical tool, blebbistatin. Lawson, Christopher P. A. T.; Slawin, Alexandra M. Z.; Westwood, Nicholas J.;. : The Royal Society of Chemistry, 2011., 47. kötet. DOI: 10.1039/c0cc03624b. 18. Sebé-Pedrós, Arnau, és mtsai. Evolution and classification of myosins, a paneukaryotic whole genome approach. : Genome Biology and Evolution, 2014. 10.1093/gbe/evu013 . 19. The small molecule tool (S)-(-)-blebbistatin: novel insights of relevance to myosin inhibitor design. Lucas-Lopez, Cristina; Allingham, John S.; Lebl, Tomas; Lawson, Christopher P. A. T.; Brenk, Ruth; Sellers, James R.; Rayment, Ivan; Westwood, Nicholas J.;. : Org Biomol Chem, 2008., 6. kötet. DOI: 10.1039/b801223g.. 20. The structural basis of blebbistatin inhibition and specificity for myosin II. Allingham, John S.; Smith, Robert; Rayment, Ivan;. 4., : Nature Structural & Molecular Biology, 2005., 12.. kötet. DOI: 10.1038/nsmb908. 21. Emerging complex pathways of the actomyosin powerstroke. Málnási-Csizmadia, András; Kovács, Mihály;. 12, : Elsevier, 2010., 35. kötet. DOI:10.1016/j.tibs.2010.07.012. 22. Kinetic Mechanism of Blebbistatin Inhibitor of Nonmuscle myosin IIB. Ramamurthy, Bhagavathi; Yengo, Christopher M.; Straight, Aaron F.; Mitchison, Timothy J.; Sweeney, Lee H.;. 46, : Biochemistry, 2004., 43. kötet. DOI: 10.1021/bi0490284. 23. Myosin complexed with ADP and blebbistatin reversibly adopts a conformation resembling the start point of the working stroke. Takács, Balázs; Billington, Neil; Gyimesi, Máté; Kintses, Bálint; Málnási-Csizmadia, András; Knight, Peter J.; Kovács, Mihály;. 15, : PNAS, 2010., 107. kötet. DOI: 10.1073/pnas.0907585107. 24. Actin Sliding Velocities are Influenced by Driving Forces of Actin-Myosin Binding. Stewart, Travis J.; Jackson Jr., Del Ray; Smith, Ryan D.; Shannon, Steven F.; Cremo, Christine R.; Baker, Josh E.;. 1, : Cellular and Molecular Bioengineering, 2013., 6. kötet. DOI: 10.1007/s12195-013-0274-y. 25. Blebbistatin Stabilizes the Helical Order of Myosin Filaments by Promoting the Switch 2 Closed State. Zhao, Fa-Qing; Padrón, Raúl; Craig, Roger;. : Biophysical Journal, 2008., 95. kötet. DOI: 101529/biophysj.108.137067. 45
26. Phototoxicity and photoinactivation of blebbistatin in UV and visible light. Kolega, John. : Elsevier, 2004. DOI: 10.1016/j.bbrc.2004.06.045. 27. Azidoblebbistatin, a photoreactive myosin inhibitor. Képiró, Miklós; Várkuti, Boglárka H.; Bodor, Andrea; Hegyi, György; Drahos, László; Kovács, Mihály; Málnási-Csizmadia, András;. 24, : PNAS, 2012., 109. kötet. DOI: 10.1073/pnas.1202786109. 28. Para-nitroblebbistatin, the non-cytotoxic and photostable myosin II inhibitor. Képiró, Miklós; Várkuti, Boglárka H.; Végner, László; Vörös, Gergely; Hegyi, György; Varga, Máté; MálnásiCsizmadia, András;. kiadás alatt. 29. Furka, Árpád. Szerves Kémia. Budapest : Nemzeti TAnkönyvkiadó Rt., 1998. ISBN 9963 19 2784 9. 30. Field-driven photoemission from nanostructures quenches the quiver motion. G. Herink, D. R. Solli, M. Gulde & C. Ropers. : Nature, 2011., 483. kötet. doi:10.1038/nature10878. 31. The small molecule tool (S)-(-)-blebbistatin: novel insights of relevance to myosin inhibitor design. Lucas-Lopez, Cristina; Allingham, John S.; Lebl, Tomas; Lawson, Christopher P. A. T.; Brenk, Ruth; Sellers, James R.; Rayment, Ivan; Westwood, Nicholas J.;. : Org Biomol Chem, 2008., 6. kötet. DOI: 10.1039/b801223g..
46
NYILATKOZAT
Név: Ráti Szilvia Marianna Neptun azonosító: kbixce ELTE Természettudományi Kar, biológus mesterszak Diplomamunka címe: A blebbisztatin és származéka, a para-nitroblebbisztatin fototoxicitása
A diplomamunka szerzőjeként fegyelmi felelősségem tudatában kijelentem, hogy a dolgozatom önálló munkám eredménye, saját szellemi termékem, abban a hivatkozások és idézések standard szabályait következetesen alkalmaztam.
Tudomásul veszem, hogy plágiumnak számít: – szó szerinti idézet közlése idézőjel és hivatkozás megjelölése nélkül; – tartalmi hivatkozás a forrás megjelölése nélkül; – más személy publikált gondolatainak saját gondolatként való feltüntetése.
Kijelentem továbbá, hogy a diplomamunka leadott nyomtatott példányai és elektronikus változata szövegükben, tartalmukban megegyeznek.
Budapest, 2014.05.16.
_______________________________ a hallgató aláírása
47
