A 8.1 ősi MHC haplotípus: kétélű kard

A 8.1 ősi MHC haplotípus: kétélű kard Doktori értekezés

Dr. Laki Judit

III. sz. Belgyógyászati Klinika, Semmelweis Egyetem, Budapest Molekuláris Orvostudományok Doktori Iskola

Témavezető:

Prof. Dr. Füst György

Hivatalos bírálók:

Dr. Novák Zoltán Dr. Szántai Eszter

Szigorlati bizottság elnöke:

Prof. Dr. Falus András

Szigorlati bizottság tagjai:

Dr. Madarasi Anna Dr. Vásárhelyi Barna

Budapest 2008

Tartalomjegyzék 1. Rövidítések jegyzéke

4. oldal

2. Bevezetés

5. oldal

2.1. Az MHC regió jellegzetességei

5. oldal

2.1.1.1. Immunregulációs gének

5. oldal

2.1.1.2. MHC I osztály

5. oldal

2.1.1.3. MHC II osztály

5. oldal

2.1.1.4. MHC III osztály: a központi MHC régió

6. oldal

2.1.2. Az MHC régiókon belüli blokkok: a humán genom egy különleges

7. oldal

része 2.1.3. A 8.1 ősi haplotípus (AH)

9. oldal

2.1.3.1. Citokinek

10. oldal

2.1.3.2. C4A komplement fehérje hiánya

11. oldal

2.1.3.3. Antigén prezentáció és feldolgozás

12. oldal

2.1.3.4. Betegség asszociáció

12. oldal

2.2. RAGE

14. oldal

2.3. Cisztás fibrózis

15. oldal

2.4. Colorectalis tumor

16. oldal

3. Célkitűzések

17. oldal

4. Módszerek

17. oldal

4.1. DNS extrakció

17. oldal

4.2. Génpolimorfizmusok meghatározása

18. oldal

4.3. Vizsgált populációk

22. oldal

4.4. Statisztikai analízis

27. oldal

5. Eredmények

28. oldal

5.1.1. RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjai közti szoros genetikai

28. oldal

kapcsoltság 1-es típusú diabeteses betegekben 5.1.2. RAGE -429 T>C polimorfizmus és MHC II és III osztályú gének

29. oldal

marker alléljei nyolc 1-es típusú diabeteses családban 5.1.3. RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjai közti szoros kapcsoltság

34. oldal

megerősítése magyar, ohioi és izlandi egészségesek csoportjában 5.1.4. A RAGE -429C és a diabeteses betegek klinikai tünetei közti

2

37. oldal

összefüggés 5.2.1. A 8.1AH MHC II és III marker alléljei egymással kapcsoltak,

39. oldal

haplotípust alkotnak 5.2.2. A 8.1AH MHC II és III marker alléljei és haplotípusaik gyakorisága

39. oldal

egészséges kontrollokban és CF-os betegekben 5.2.3. A CF-os betegcsoport felosztása 8.1AH-t hordozókra és nem

41. oldal

hordozókra –a 8.1AH hatása a kolonizációra 5.2.4. A kolonizáció mentes időszak hossza különbözik 8.1AH hordozók és

43. oldal

nem hordozók között 5.3.1. MHC III allélek és haplotípusok gyakorisága colorectalis tumoros

45. oldal

betegekben és egészséges kontrollokban 5.3.2. A 8.1 ősi haplotípus gyakoriságának összehasonlítása colorectalis tumoros

47. oldal

betegekben és egészséges kontrollokban, kor és nem szerint csoportosítva

5.3.3. A 8.1AH és klinikai jellemzők összefüggésének hiánya colorectalis

49. oldal

tumoros betegekben 6. Megbeszélés

50. oldal

6.1.1. RAGE -429C a 8.1AH alkotó allélje

50. oldal

6.1.2. RAGE -429C összefüggése a szénhidrát anyagcserével

51. oldal

6.2. A 8.1AH szerepe cisztás fibrózisban

52. oldal

6.3. A 8.1AH vizsgálata MHC III allélekkel

54. oldal

6.4. A 8.1AH szerepe colorectalis tumorban

54. oldal

7. Következtetések

56. oldal

7.1. RAGE -429C a 8.1AH alkotó allélje

56. oldal

7.2. A 8.1AH vizsgálata MHC III allélekkel

56. oldal

7.3. A 8.1AH szerepe cisztás fibrózisban

56. oldal

7.4 A 8.1AH szerepe colorectalis tumorban

57. oldal

7.5 A 8.1ősi haplotípus: kétélű kard

58. oldal

8.1. Összefoglalás

60. oldal

8.2. Summary

61. oldal

9. Irodalomjegyzék

62. oldal

10. Publikációk jegyzéke

76. oldal

11. Köszönetnyilvánítás

79. oldal

3

1. Rövidítések jegyzéke RAGE

receptor for advanced glycation end-products

AH

ancestral haplotype, ősi haplotípus

bp

bázispár

CEH

conserved

extended

haplotype,

konzervált

kiterjesztett

haplotípus CF

cisztás fibrózis

CFTR

cisztás fibrózis transzmembrán kondukciós regulátor (protein)

COPD

krónikus obstruktív tüdőbetegség

C2, C4

komplement 2, komplement 4

HBV

hepatitis B vírus

HCV

hepatitis C vírus

HIV

humán immundeficiencia vírus

HLA

humán leukocita antigén

HSP70

70kDa-os hősokk fehérje

LAK

limfokin-aktivált killer (ölősejt)

LTA

limfotoxin alfa

MHC

fő hisztokompatibilitási komplex

NK

natural killer (cell), természetes ölősejt

PCR

polimeráz láncreakció

RFLP

restrikciós fragmens hossz polimorfizmus

SDS

nátrium (sodium)-dodecil-szulfát

SNP

single

nucleotide

polymorphism,

egyes

polimorfizmus SSP PCR szekvencia specifikus polimeráz láncreakció TNF-α

tumor nekrózis faktor alfa

4

nukleotid

2. Bevezetés 2.1. Az MHC regió jellegzetességei 2.1.1.1. Immunregulációs gének A fő hisztokompatibilitási complex (MHC), vagy ahogyan emberben még hívják, a human leukocita antigén (HLA) regió a 6-os kromoszóma rövid karján található, és három további régióra osztható: I, II és a középső III osztályra. Az I és II osztályú MHC gének által kódolt sejtfelszíni molekulák segítségével a sejtek antigén peptideket mutatnak be T-sejteknek, így az immunválasz elindításában kulcsszerepet játszanak. Az MHC III régióban az immunválasz szabályázosában fontos citokinek és plazmafehérjék kódoltak. 2.1.1.2. MHC I osztály Az I osztály génjeinek terméke egy variábilis α-láncból és egy másik, konstans β2 mikroglobulin láncból áll. A polimorf I osztályú α-láncokat 6 gén kódolja: a „klasszikusnak” nevezett HLA-A, -B, -C gének és a „nem klasszikusnak” nevezett HLA-E, -F és –G gének. Az I osztályú molekulákat minden magvas sejt expresszálja, és ezzel mutatja be a saját (normális, fertőzés miatt vagy tumorosan módosult) antigéneket és intracelluláris kórokozók antigénjeit CD8+-limfocitáknak és NK-sejteknek. A kórosan módosult saját antigénjeinek vagy az intracelluláris kórokozók antigénjeinek felismerése a sejt lízisét okozó folyamatokat indít be.

2.1.1.3. MHC II osztály A II osztályú molekulák szintén α- és β-láncokból állnak, de az I osztályú molekulákkal ellentétben ezek mindegyike polimorf. Ezeket a lácokat a –DP, -DM, -DQ és –DR gének kódolják. Az MHC II osztályú gének termékeit az úgynevezett „hivatásos” antigén prezetáló sejtek, mint a dendritikus-sejtek, B-sejtek, makrofágok fejezik ki sejtfelszínükön. Ezek a hivatásos antigénbemutató sejtek a II osztályú molekulák segítségével prezentálják a paraziták, baktériumok antigénjeit és az allergéneket a szervezet CD4+ T-sejtjei számára. Az extracelluláris kórokozók antigénjeinek

5

felismerését követően a CD4+ T-sejtek a fertőző ágens eliminációjához vezető megfelelő immunválasz elindításában segítenek, ezért hívják őket T-helper, vagyis segítő T-sejteknek. A CD4+, T-helper-sejtek (Th-sejteknek) Th1 alcsoportja által termelt és ezért Th1 típusúnak nevezett citokinek az IL-2, IL-12, IFNγ, TNF-α, TNF-β vagy más néven LT-α. A Th1-sejtek CD8+ T-sejteket, NK-sejteket és makrofágokat aktiválnak. A Th-sejtek egy másik csoportja, a Th2-sejtek termelik a Th2 citokineket, ezek az IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13. A Th2-sejtek az antitesttermelés fő elősegítői, aktiválják a B-sejteket, hatásukra fokozódik az IgM és bizonyos típusú IgG-antitestek termelése, és szintén hat az IgE termelésére. Genetikai betegség asszociációs vizsgálatok általában a jelentős polimorfizmust mutató –DQ és –DR génekkel foglalkoznak. . 2.1.1.4. MHC III osztály: a központi MHC régió Az MHC III régióban hatvannál több gén található, ezzel egyike a humán genom „leggéndúsabb” területeinek (2). Ez a régió sok olyan, mind a természetes, mind a szerzett immunválasz szabályozásában fontos szerepet játszó gént kódol, mint például a hősokk fehérjék, komplement fehérjék, citokinek –tumor nekrózis faktor-alfa (TNF-α) vagy limfotoxin-alfa (LT-α). Így nem meglepő, hogy számos tanulmány kereste ezen gének egy-egy, funkcionális szempontból jelentős alléljeinek kapcsolatát gyulladásos és fertőző kórképekkel, tumorral. A TNF-α és TNF-β (más néven LT-α) közös molekulacsaládba tartoznak, génjeik az MHC III régióban, egymás mellett találhatók. A TNF-α-t legnagyobb részt az aktivált makrofágok

termelik,

az

akut

fázis

válaszban,

lokális

gyulladásban,

endothelaktivációban, citotoxikus hatásokban van szerepe. A LT-α leginkább aktivált Tsejtekből származik, szintén rendelkezik endothelaktivációs és citotoxikus hatással. A klasszikus út komplement komponensei közül a C4 (ezt két gén, a C4A és a C4B kódolja), a C2, az alternatív út komponensei közül a B-faktor kódolt a 6-os kromoszóma MHC III régiójában. A komplementkaszkád működésének eredménye sokrétű: sejtek, kórokozók lízise, opszonizáció, fagocitózis fokozása, kemotaktikus, gyulladáskeltő hatás, immunkomplexek eliminálása a keringésből. A C4 gének egy speciális genetikai modulban, az úgynevezett RCCX modulban kódoltak, mely a C4 gén(ek)en kívül még 3

6

másik gént is tartalmaz (RP, CYP21 és TNX gének). Ez a négy gén egy genetikai egységet alkot. Az RCCX modulból az apai és anyai kromoszómákat külön-külön tekintve 1, 2, legtöbb 3 kópia fordulhat elő, amely diploid szinten 1-6 kópiaszámok között változhat. Ezt a változatosságot növeli, hogy a C4 fehérjét C4A vagy C4B gén kódolja, valamint az is, hogy jelen van-e egy úgynevezett endogén retrovírus a gén 9. intronjában, mely így annak jelenlétében illetve hiányában rövid (S, short) illetve hosszú (L, long) lehet. A

hősokk

fehérjék

stressz

hatására

termelődnek,

molekuláris

chaperonként

(dajkafehérjeként) működve helyreállítják a fehérjemolekulák (stressz hatására) megváltozott szerkezetét, szerepük van antigének feldolgozásában és bemutatásában. Autoimmun betegségekben a hősokkfehérjék gyakran az immunválasz fő célpontjai. Az MHC III régióban a HSP70-1, HSP70-2, HSP70-Hom gének kódoltak.

2.1.2. Az MHC régiókon belüli blokkok: a humán genom egy különleges része A „konzervált, kiterjesztett haplotípus” (conserved extended haplotype = CEH), vagy „ősi haplotípus” (ancestral haplotype = AH), ahogyan még hívják, kifejezés egy közös őstől származó, a genom igen nagymértékben konzervált szakaszaiból álló, jelentősen konzervált haplotípus blokkokat jelöl. Az MHC régiókban található ilyen kiterjesztett és konzervált haplotípusok adják a humán genom ezen területének különlegességét. A blokkok igen polimorf szakaszokat foglalnak magukba, de ennek és az úgynevezett rekombinációs „hot-spotok” (olyan helyek, ahol DNS darabok cserélődhetnek ki különböző DNS-kópiák között) ellenére a blokkokat egymástól nagyon nagy távolságban lévő, fix, nem változó DNS-szakaszok alkotják. Az említett blokkok a következők: 1. a HLA-Cw/B blokk az MHC I régióban, 2. a HLA-DR/DQ blokk az MHC II régióban, 3. a komplotípus blokk (komplement gének csoportja) és 4. a TNF blokk (TNF-α és LT-α) az MHC III régióban. Egyes haplotípusok nem az összes említett blokkból, csak ezek közül néhány kombinációjából állnak, míg az igazi kiterjesztett, ősi haplotípusok mind a négy blokkot tartalmazzák. Ezen esetekben a blokkok, az AH tagjaiként jelenlévő allélek közötti

7

genetikai kapcsolat (kapcsoltság) keresztülnyúlik az MHC I, II és III régiókon, akár 4 Mb távolságban is, melyre emberben az MHC régiókon kívül máshol nincsen példa (3). Az ősi haplotípusok egyrészt populáció-specifikusak, és vannak egy-egy népcsoportra kifejezetten

jellemző

kiterjesztett

haplotípusok,

másrészt

viszont

különböző

populációkban előfordulhatnak, persze általában más gyakorisággal, ugyanazon haplotípusok (4). Nem minden ember rendelkezik ilyen kiterjesztett, ősi HLA haplotípussal, de megközelítőleg a Föld teljes lakosságának felében megtalálható belőlük legalább egy kópia (4). Az ősi haplotípusokat alkotó tagok, allélek nem véletlenszerűen kerültek egymás közelébe, ugyanarra a kromoszómára, ugyanabba a haplotípusba, hanem a köztük lévő szoros genetikai kapcsoltság, más néven „linkage disequilibrium” az, aminek hatására ugyanazon a DNS-szálon találjuk őket. Így már érthető, hogy a haplotípusok gyakorisága nem egyenlő az őket alkotó allélek külön-külön vett gyakoriságának szorzatával, ahogyan egymástól független helyzetben lévő allélek esetén várhatnánk. Sok olyan betegség asszociációs vizsgálat létezik, melyben csak egyes nukleotid polimorfizmusokat (SNP) néznek. Amennyiben ezek az SNP-k részét képezik egy haplotípusnak, kiterjesztett haplotípusnak, úgy a vizsgálók figyelmen kívül hagyják az egész haplotípus hatását. Olyan esetekben, amikor az immunválasznak döntő jelentősége lehet a kérdéses betegség kialakulásában vagy lefolyásában, az immunválaszt esetlegesen befolyásoló genetikai változók mind nagyobb csoportját célszerű vizsgálni. Ez első hallásra nem tűnik egyszerű feladatnak, de az MHC régiókban található kiterjesztett haplotípusok vizsgálata lehetőséget ad erre.

8

1. ábra: MHC I, II és III régiókban kódolt gének (1)

2.1.3. A 8.1 ősi haplotípus (AH) Az előbbiekben említett konzervált, kiterjesztett haplotípusok közé tartozik a 8.1 ősi haplotípus, melyben mind a négy blokk, a HLA-Cw/B, -DR/DQ, komplotípus és TNFblokk megtalálható. A blokkokban a következő allélek a haplotípus tagjai, „alkotórészei”: HLA-A1, HLA-B8, HLA-Cw7, TNFα -308A, TNFAB*a2b3, C2*C, Bf*S, C4A*Q0, C4B*1, HLA-DRB1*0301, HLA-DQA1*0501 és HLA-DQB1*0201. A 8.1AH

módosult

immunválaszt

kódol,

melyre

magas

autoantitest-,

keringő

immunkomplex- és TNF-α-szint mellett módosult citokin profil a jellemző (5,6). A módosult immunválasz további ismertetőjele a fokozott limfocita apoptózis, az allergénekre adott fokozott IgE válasz és az IgM+ B-sejtek emelkedett aránya; az NKés LAK-sejtek csökkent aktivitása, csökkent makrofág funkció és neutrofil chemotaxis, alacsonyabb összes limfocitaszám, mitogénre és hepatitis B vakcinációra adott csökkent humorális és limfoproliferatív válasz (1. táblázat) (5,6). Az immunológiai tulajdonságok genetikailag kódoltak, ezért a haplotípust alkotó allélek felelősek, melyek közül némelynek ismert a pontos szerepe, míg másoké még teljesen tisztázott.

9

1. táblázat: 8.1AH által kódolt immunválasz jellemzői 8.1AH által kódolt immunválasz jellemzői (5-12) ↑ fokozott:

↓ csökkent:

Autoantitest-szint

NK és LAK aktivitás

Keringő

immunkomplexek

szintje TNF-α termelés in vitro és in vivo

Makrofág funkció Mitogénre adott T-sejt válasz

Limfocita apoptózis

neutrofil kemotaxis

IgM+ B-sejtek aránya

összes limfocitaszám

2 típusú citokin profil

1 típusú citokin profil

Allergénekre adott IgE válasz

Hepatitis

B

vakcinációra

adott

humorális

és

limfoproliferatív válasz

2.1.3.1. Citokinek A 8.1 ősi haplotípusra jellemző, már említett módosult citokin profilt általában 2-es típusúként említik. 8.1AH-t hordozókban a Th1-es citokinek csökkent szintje jellemző, mint amilyen az IL-2, IL-12, IFNγ, így kerülnek relatív túlsúlyba a Th2-es citokinek. A Th1-es citokinek a celluláris, míg a Th2-es citokinek a humorális immunválaszt aktiválják. A, szintén jellemzően magas szérumszintű, TNF-α viszont a Th1-es citokinek közé tartozik, így a citokin miliőt mégsem célszerű tisztán Th2-esnek nevezni, célszerűbb inkább mind a magas TNF-α-szintet, mind a dominánsan Th2-es citokin profilt megemlíteni. Mind a TNF2-ként is nevezett TNF-α -308A allél, mind a szintén a 8.1AH részét képező TNF mikroszatelliták (például TNFA*a2b3c1) fokozott TNF-α termelést okoz. Az irodalmi adatok ezen a téren nem megegyezők, ennek okát a 8.1 ősi haplotípusban is kereshetjük. Az esetek körülbelül 60%-ában a TNF-α -308A (TNF2) allél nem önmagában, más genetikai tényezőktől függetlenül, hanem a 8.1AH részeként, annak tagjaival genetikailag kapcsolva van jelen. A haplotípusban viszont már nem csak a TNF2,

10

hanem emellett más allélek is megtalálhatók, melyek közül TNF-α mikroszatelliták (TNFAB*a2b3) szintén magas TNF-α-szintet eredményeznek (3,6,13). Így, az érzékelt fokozott TNF-α-termelés nem kizárólag a TNF2 allél jelenlétének, hanem a 8.1 ősi haplotípus tagjaiként jelenlévő, a TNF-α-szintre ható allélek együttes, egymást erősítő, összeadódó hatásáról. Az esetek kisebbik felében a TNF-α -308A (TNF2) allél nem a 8.1AH részeként van jelen, így a TNF-α-szintre ható, a haplotípusban jelenlévő egyéb allélek nincsenek jelen, vagy legalább is ennek a szoros genetikai kapcsoltság miatt nagyon alacsony a valószínűsége. Ez persze nem zárja ki, hogy más, nem a 8.1AH részeként szereplő, magas TNF-α-szintet eredményező egyéb allél jelen legyen, de ennek gyakorisága az allélek előfordulási gyakoriságának szorzatával egyenlő, mely igen alacsony érték. Tehát a TNF-α-szintre nem azok a többszörös genetikai tényezők hatnak, mint a 8.1AH esetében. Ez, természetesen, a helyzet leegyszerűsítése, de mégis az SNP-k szintjén túl igyekszik az összefüggéseket vizsgálni. 2.1.3.2. C4A komplement fehérje hiánya A C4A és C4B fehérje közötti fő különbség az antigénekkel létesített kovalens kötések módjai. Az amino-csoportot tartalmazó antigénekkel amid-kötést képez a C4A, így ennek inkább az immunkomplexekhez való kötődésben, és azok eliminációjában van szerepe. A C4B fehérje a hidroxil-csoportot tartalmazó célmolekulákkal észter-kötést alakít ki, ezért is okoz hemolízist a C4B a vörösvértestek felszínén lévő hidroxilcsoportokhoz való kötődése révén. A 8.1AH részeként C4A*Q0 mellett C4B1 jelenléte jellemző, ez gyakorlatilag azt jelenti, hogy C4A nincs jelen, C4B-ből egy kópia található az RCCX modulban, melyben a C4 gének is elhelyezkednek, melyben így egyetlen C4B szakasz egyedül, C4A nélkül található. Ezt nevezzük a korábbiakban már bemutatott mono-S (short) RCCX modulnak. A C4A*Q0 allél eredménye, hogy a komplement 4-es fehérje egyik alkotórésze, az „A” fehérje nem expresszálódik. Ezzel a komplement rendszer egyik központi tagjánál sérül a kaszkád, leginkább az immunkomplexek

eliminációját

érintve, vagyis

csökkent

clearance

miatt

az

autoantitestek és a keringő immunkomplexek tovább maradnak a keringésben. Ez magyarázza ezek emelkedett szintjét 8.1AH-t hordozókban, mely nem fokozott

11

termelésből

ered.

Minél

tovább

maradnak

a

keringésben

autoantitestek

és

immunkomplexek, annál nagyobb az esély kóros folyamatok, autoimmun betegségek kialakulására. 2.1.3.3. Antigén prezentáció és feldolgozás Mivel MHC I és II osztályú génváltozatok is részét képezik a 8.1 ősi haplotípusnak (HLA-A1,

HLA-B8,

HLA-Cw7,

HLA-DRB1*0301,

HLA-DQA1*0501,

HLA-

*

DQB1 0201), feltételezhető, hogy az antigén prezentációjának és feldolgozásának a haplotípusra jellemző módja is hozzájárulhat a speciális immunválaszhoz. Nem feltétlenül minden, a haplotípust alkotó HLA allélnek van ebben szerepe, lehet, hogy némelyik csak véletlenszerűen került a haplotípusba az evolúció során. 2.1.3.4. Betegség asszociáció Immunológiai

jellegzetességei

magyarázzák,

hogy

a

8.1AH

hosszú

távon

„mellékhatásként” autoimmun betegségek kialakulásának a kockázatát növeli. A haplotípusnak vagy fragmentjeinek bizonyított az összefüggése számos olyan autoimmun betegséggel, kóros állapottal, melyek kialakulásában az immunválasznak döntő szerepe van: Addison-kór (14) Alkoholos májcirrhosis (15) Anti-Ro antitestekkel összefüggő örökletes szívblokk (16) Autoimmun hepatitis (17) Basedow-Graves betegség (18,19) Dermatitis herpetiformis (Duhring) (20-22) Dermatomyositis (23) Dohányzás (nőkben erősebb összefüggés) (24) EBV infekcióra adott csökkent válasz (25) Galambtenyésztők tüdőbetegsége (26) Glutén szenzitív enteropathia/coeliacia (27) Gyakori variábilis immundeficiencia (28) Hashimoto thyroiditis (18)

12

HCV infekcióhoz kapcsolódó cryoglobulinaemia (29) Hepatitis B vakcinációra adott csökkent válasz (7,30) HIV fertőzöttek csökkent túlélési esélye (31-33) HIV fertőzöttekben a CD4+ T-sejtek gyorsult vesztése (31) IgA deficiencia (28) Magas életkor elérése férfiakban (5,34) Myasthenia gravis (35) Polymyositis (22,23,36) Primer sclerotizáló cholangitis (37,38) Sarcoidosis (39) Scleroderma (40) Sjögren-syndroma (21,41) Szisztémás lupus erythematosus (SLE) (42,43) Zárványtestes myositis (22,36) 1 típusú diabetes mellitus (3,44,45) A 8.1AH tekintetében ellentmondásosnak tűnik, hogy, ha ez a genetikai kombináció autoimmun betegségek kialakulására hajlamosít, akkor mi magyarázhatja, hogy mégis 10 millió európai a hordozója (3). Pontosan a haplotípusra jellemző módosult immunválasz lehet ennek a feltételezett oka. A 8.1AH hordozóiban a magas TNF-α- és keringő

immunkomplex-szinttel

járó

immunológiai

sajátosságok

fertőzések

leküzdésében előnyösek, előnyösebbek lehetnek. Ez a lényeges tulajdonság pozitív szelekciót élvezhetett az evolúció során, és magyarázhatja akkumulációját a kaukázusi populációban (5). Hogy miért pont ebben a népcsoportban, arra nehéz választ találni. A 8.1AH földrajzi eloszlása Európában egy északnyugat-délkelet grádienst követ; Északnyugat-Európában a legmagasabb a gyakorisága, ez a kelta eredetű populációkban eléri a 20-25%-ot (saját eredmények, Laki és munkatársai, a kézirat szerkesztés alatt). Tekintve, hogy ez Európában az ír és brit populációt, valamint az ezekből származó észak-amerikai és ausztráliai populációt, így jelentős nagyságú népcsoportot érint.

13

2.2. RAGE Az angolul „advanced glycation end-products”-nak, AGE-nek nevezett, glikációval, tehát

nem

enzimatikus

glikozilációval

keletkező

végtermékek

diabetes,

veseelégtelenség, gyulladás és az öregedés természetes lefolyása során halmozódnak fel az emberi szervezetben (46). Az AGE-receptor, röviden AGER vagy RAGE az immunglobulin szupercsalád egy multiligand receptora. A ligandok jelenléte a receptor, a RAGE tartós expresszióját okozza; ha receptor ligandot köt, az pedig a gyulladásos citokinek, mint például a TNF-α vagy az IL-6, termelődéséhez vezető jelátviteli utak aktiválását okozza, így állandósítva a gyulladást (47-49). AGE mellett a RAGE további ligandja az Alzheimer-kórban és amyloidosisban felszaporodó amyloid-β-peptid, a gyulladásos marker S100/calgranulin, és a neuronális fejlődésben és tumorokban metasztázis képződésében szerepet játszó amphoterin (50). A RAGE gén a 6-os kromoszóma rövid karján, az MHC III régióban helyezkedik el. Mint ezt már említettem, az MHC régiókban található sok, az immunválasz szempontjából fontos gén, (51,52), mint amilyenek a HLA, a TNF-α (53) vagy egyes komplement fehérjék génjei (54). Hudson és munkatársai a következő polimorf helyeket azonosították a RAGE génen: −429T >C, 63 bázispárnyi deléció −407 és −345 pozíció között és a −374T>A. A gén promóter, szabályozó régiójában található −429C, −374A allélek és a 63 bázispárnyi deléció up-regulációs hatással jelentősen fokozzák a transzkripciós aktivitást (55). A 8.1AH számos más autoimmun betegség, a többi között 1-es típusú diabetes mellitus kialakulására hajlamosít (3,45). A RAGE promóter polimorfizmusok diabetesszel való kapcsolatáról viszont kevés és ellentmondó adat ismert. A, már említett munkacsoport vizsgálatai a RAGE −429C allél retinopathiával való kapcsolatát mutatta 2-es típusú diabeteses betegekben (55), bár ezt az összefüggést másik vizsgálat nem tudta megerősíteni (56). Közel ezer, 1-es típusú diabeteses beteg körében végzett finn tanulmány összefüggést talált a RAGE −374 T>A polimorfizmus és proteinuria valamint cardiovascularis betegség kialakulása között a nem megfelelően beállított, kontrollált szénhidrát-anyagcseréjű betegekben (57). Szintén 1-es típusú diabeteses betegekben a RAGE -1152 C>A polimorfizmust nephropathia kialakulásával szemben mérsékelten védő szerepűnek találták (58). Egy, a RAGE −429C allélt is tartalmazó haplotípus

14

szintén proteinuriával való összefüggését írták le 2-es típusú diabeteses betegekben (59). 2.3. Cisztás fibrózis A kaukázusi populációban leggyakoribb letális autoszómális recesszív genetikai betegséget, a cisztás fibrózist (CF) a 7-es kromoszómán található 230 kb-nyi ún. „cystic fibrosis transmembrane conductance regulator” (CFTR) génen bekövetkező mutációk okozzák. Ez a gén egy 1480 aminosavból álló, epitheliális membránok anion csatornájaként működő polipeptidet kódol (60). A leggyakoribb az 508 helyen fenilalanin delécióját okozó mutáció, innen a neve: ΔF508. A CF-os betegek túlnyomó többségének tüdejében krónikus bakteriális fertőzés/gyulladás zajlik, melyet nagyrészt Staphylococcus aureus és/vagy Pseudomonas aeruginosa okoz. Az ilyen krónikus fertőzést nevezik kolonizációnak, és ez felelős a CF-os betegek csökkent életkilátásaiért (61). A ΔF508 homozigóta betegek fenotípusban, klinikai

jellemzőkben nagy

különbségeket mutatnak, ez pedig arra enged következtetni, hogy mind a CFTR-en kívül más gének, mind környezeti faktorok befolyásolhatják a betegség kialakulását, lefolyását, súlyosságát (62-67). A tüdőbetegség kezdetét, súlyosságát nem könnyű megbecsülni (68,69), ezért a CF lefolyását módosító tényezők meghatározása igen nagy jelentőséggel bír (60). A betegséget befolyásoló kandidáns ún. módosító gének jelentős része a természetes és adaptív immunitásban játszik fontos szerepet; így például a transzformáló növekedési faktor β (70), a mannóz kötő fehérje (MBL) (71,72), nitrogén-oxid szintáz (73), a fő hisztokompatibilitási komplex régióban található gének (74,75) –mint a TNF-α is (62-67). Számos esetben vitás a CF módosító gének lehetséges szerepe, mivel sokszor a CF-os betegek állapotával való korreláció még kétséges. A TNF-α -308A (TNF2) allél egy jó példa a pulmonális fenotípussal, a betegség súlyosságával való ellentmondásos kapcsolatra. Vannak szerzők, akik a TNF2 allél csökkent FEV1-gyel való kapcsolatát írták le (65), míg más tanulmányok ilyen összefüggést nem tudtak igazolni (66,67). Mindegyik esetben SNP-ket vizsgáltak külön, nem haplotípus részeként, így veszítve el lehetséges fontos összefüggéseket. Különböző allélek és haplotípusok különböző populációkban eltérő eloszlást mutatnak. Ráadásul a

15

módosító gének interakciója a környezeti tényezőkkel, mint amilyen a dohányfüst, a betegség klinikai képének sokszínűségét okozhatja (76). 2.4. Colorectalis tumor A colorectalis tumor az egyik leggyakoribb tumor a nyugati országokban, és előfordulása folyamatosan növekszik. Jelenleg mind incidenciában, mind mortalitásban a második helyen áll Európában. A vastagbélrák lassan növekvő és későn metasztatizáló daganat, ezért aránylag sok idő áll rendelkezésre az időben történő diagnózis megállapításáig és a kezelés megkezdéséig. A magyar mortalitási adatok a colorectalis tumor halálozási gyakoriságának az elmúlt negyven évben majdnem háromszorosára való növekedését mutatják, ez a növekedés az utóbbi években megállt (77). Az életmód, étkezési szokások és más exogén rizikófaktor mellett örökletes tényezők szerepe is lényeges a tumorképződésre való hajlamban (78). Ilyen örökletes tényezők az MHC régiókban található polimorfizmusok, melyek kapcsolatát emlő tumorral (79-82), ovarium tumorral (83), méhnyakrákkal (84-86), gyomor tumorral (87), melanomával (88), HIV fertőzéshez kapcsolódó Kaposi sarcomával (89), fej és nyak carcinomával (90) és krónikus myeloid leukemiával (91) írták le. Gyakorlatilag mind a három MHC régió górcső alá került már az asszociációs vizsgálatokban, melyek sok esetben vezettek ellentmondó eredményre, nagyrészt valószínűleg alacsony esetszám miatt. Ezek mellet azonban találhatunk egymást megerősítő eredményeket allélek, haplotípusok szerepéről különböző tumorok, leginkább emlő- és colorectalis tumor esetén. Lehetséges, hogy vannak közös örökletes tényezők e két tumorfajta kialakulásában (92). Érdekes módon, nagyrészt olyan allélek kapcsolatát írták le emlő tumorral, melyek az MHC III régióban találhatók. Ide tartozik, például a TNF2 és a HSP70-2G (-1267G) allél, melyek homozigóta hordozói között magasabb az emlő tumor rizikója, Mestiri és munkatársai megfigyelései alapján (79). Ezzel összhangban van annak a vizsgálatnak az eredménye, mely szerint egy, az MHC III régión keresztülnyúló haplotípus mérsékelt kockázati tényezőt jelent emlő tumor kialakulására (80). Ugyanezen munkacsoport alacsony penetranciájú TNF allélek és colorectalis tumor kapcsolatát találta (93), de az említett MHC III haplotípus esetén ezt nem sikerült igazolni nagy betegszám mellett sem (94).

16

3. Célkitűzések 3.1. A RAGE gén az MHC II régió közvetlen szomszédságában található, előzetes vizsgálataink pedig arra utaltak, hogy a RAGE −429C and TNF2 allélek között szoros a genetikai kapcsoltság. Így elsődleges célunk annak tisztázása volt, hogy a RAGE -429 T>C polimorfizmus és a 8.1 AH részét is képező TNF -308 G>A, HLA-DQB1 és HLADRB1 polimorfizmus valamint az RCCX modul-változat között van-e genetikai kapcsoltság, linkage disequilibrium. További célunk annak vizsgálata volt, hogy a RAGE -429 polimorfizmus illetve a 8.1AH mutat-e valamilyen összefüggést 1-es típusú diabetesszel vagy ennek szövődményeivel. 3.2. A 8.1 ősi haplotípusra jellemző módosult immunválasz, a magas TNF-α- és keringő immunkomplex-szint kedvező lehet a fertőzések leküzdésében. Cisztás fibrózisos betegek a betegséget okozó genetikai eltérés miatt folyamatosan bakteriális infekciónak vannak kitéve. Vizsgáltuk, hogy a 8.1 ősi haplotípusnak van-e valamilyen szerepe a cisztás fibrózisban kialakuló krónikus infekcióban (kolonizációban). 3.3. A látszólag ellentmondásos eredmények és a tény, hogy egy-egy olyan allél esetén, mely valamely haplotípus tagja, célszerű SNP-ken túlmutató módon haplotípusokat vizsgálni, sarkalltak arra, hogy a centrális, MHC III régióban található, a 8.1AH részét képező allélek és az általuk alkotott haplotípus szerepét vizsgáljuk colorectalis tumor kialakulásában.

4. Módszerek 4.1. DNS extrakció DNS extrakció perifériás vérből, Miller által közölt kisózási módszernek megfelelően történt (95): Magyar betegcsoportok és egészséges kontrollok esetében a teljes genomiális DNS-t perifériás vérből származó mononukleáris sejtekből nyertük ki. 500 μl EDTA-val

17

(Merck & Co, Whitehouse Station, NJ, USA) vagy heparinnal alvadásgátolt vérhez 1 ml vörösvértest lízis puffert (0.32 M Sucrose, 1%-os Triton X-100, 5 mM MgCl2, 12 mM Tris-HCl) adtunk, majd fél perces erőteljes rázást követően, miután a vörösvértestek szétestek, maximális fordulatszámmal lecentrifugáltuk a mintákat. A fehérvérsejtek a cső alján pellet formájában, a vörösvértestek fragmentumai a felülúszóban találhatók. A felülúszó leöntését követően a fehérvérsejtek a még oldatban maradt vörösvértest fragmentumoktól 2 alkalommal 1-1 ml desztillált vízzel történő mosással tisztíthatók meg. Ezt követően a fehérvérsejteket 0.75 mg/ml proteináz-K (Fermentas International Inc, Ontario, Canada) enzimet és 1% SDSt (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) tartalmazó proteináz-K pufferrel (0.075 M NaCl, 0.024 M EDTA) lizáltuk, majd 55 °Con 30 percig rázó vízfürdőben emésztettük. A sejtek lizálást és a fehérjeemésztést követően a mintákat szobahőmérsékletre hűtöttük, majd 200μl telített NaCl oldat hozzáadásával és intenzív rázással precipitáltuk a fehérjéket. A kicsapódott fehérjék a cső alján centrifugálást követően üledékként összegyűlnek, a DNS molekulák a felülúszóban találhatók. A felülúszókat Eppendorf csövekbe pipettázva, 500 μl izopropanol hozzáadásával, 2 percet követően a DNS precipitálódik. Az így kicsapódott DNS 70 %-os, majd 100 %-os alkohollal további centrifugálással tisztítottuk, majd 50100 μl desztillált vízben oldottuk.

4.2. Génpolimorfizmusok meghatározása A polimeráz láncreakciókat az AB GeneAmp PCR System 9700 (Applied Biosystems, Foster City, California, USA) PCR készülékben végeztük el. A hasítási termékeket hagyományos gélelektroforézis segítségével 1x TBE pufferben (0.09M Tris, 0.09M bórsav, 0.002M EDTA, pH=8.0) választottuk szét, amelyhez 1 μg/ml

ethidium-bromidot

tartalmazó,

megfelelő

tömegszázalékú

agaróz

gélt

használtunk. A DNS-EtBr fragmentumokat UV-fénnyel megvilágítva, Syngene Chemigenious2 (Cambridge, UK) géldokumentációs rendszerben detektáltuk. 4.2.1. A TNF-α −308 G>A polimorfizmus vizsgálata PCR-RFLP módszer TNF-α -308 G>A polimorfizmus vizsgálatára (96):

18

Forward primer: 5’-AAT AGG TTT TGA GGG CCA TG-3’, reverse primer: 5’-ATC TGG AGG AAG CGG TAG TG-3’. PCR reakció 10 μl reakció pufferben történt, mely tartalmaz

dNTP-t

200-200

μM

koncentrációban,

a

primereket

1,5-1,5

μM

koncentrációban, 20 ng/μl templát DNS-t, 2 mM koncentrációban MgCl2-t, 10 mM koncentrációban Tris–HCl-t, 50 mM koncentrációban KCl-t és 0.025 U/μl HotStart Taq DNS polimerázt (Qiagen). A PCR reakció technikai paraméterei: I. denaturáció 94ºC-on 15 perc; II: 35 ciklus: 1. denaturáció 95ºC-on 10 másodperc, 2. primer bekötődés 57 ºCon 30 másodperc, 3. lánchosszabbítás 72 ºC-on 30 másodperc, majd III: végső lánchosszabbítás 1 ciklus 72 ºC-on 5 perc. 10 μl-nyi, PCR-termékeket tartalmazó elegyet 8 egységnyi NcoI restrikciós endonukleázzal 37 °C-on teljes éjszakán át inkubáltuk, majd a G allél jelenléte esetén 18+202 bp, és az A allél jelenléte esetén 220 bp hosszú restrikciós fragmentek detektálása gél elektroforézissel 3%-os agaróz gélen történt. TNF-α -308 G>A polimorfizmus vizsgálata SSP-PCR módszerrel (97): 10 µl PCR reakció elegyben: -308 G forward primer: 5’ ATA – GGT – TTT – GAG – GGG – CAT – GG 3’ 7 μg/ml koncentrációban, reverse primer: 5’ GGC – TGG – GTG – TGC – CAA – CAA – C 3’ 7 μg/ml koncentrációban, -308 A forward primer: 5’ ATA – GGT – TTT – GAG – GGG – CAT – GA 3’ 9 μg/ml koncentrációban, reverse primer: 5’ GGC – TGG – GTG – TGC – CAA – CAA – C 3’ 9 μg/ml koncentrációban, kontroll DNS-szakasz forward primer: 5’ TGC–CAA–GTG–GAG– CAC–CCA–A 3’ 6,5 μg/ml koncentrációban, reverse primer: 5’ GCA-TCT-TGC-TCTGTG-CAG-AT 3’ 6,5 μg/ml koncentrációban, 2-10 ng/μl templát DNS, 200 μM koncentrációban dNTP-k, 1,9 mM koncentrációban MgCl2, 20 mM koncentrációban Tris–HCl, 50 mM koncentrációban KCl és 0.03 U/µl DuplaTaq polimeráz (ZenonBio, Szeged, Magyarország). PCR program: I: 1 ciklus: 96°C-on 60 másodpercig, majd II: 5 ciklus: 96°C-on 20 másodpercig, 70°C-on 45 másodpercig, 72°C-on 25 másodpercig; III: 21 ciklus: 96°C-on 25 másodpercig, 65°C-on 50 másodpercig, 72°C-on 30 másodpercig; IV: 4 ciklus: 96°C-on 30 másodpercig, 55°C-on 60 másodpercig, 72°C-on 90 másodpercig; 1 ciklus 20°C 300 másodpercig amplifikációt követően az egyes allélekre specifikus PCR termékek detektálása gél elektroforézissel 2%-os agaróz gélen

19

történt. Kontroll DNS szakasz PCR-terméke: 796bp hosszúságú, TNF-α -308 G allél és TNF-α -308 A allél jelenléte esetén a PCR-termék 330 bp hosszúságú. 4.2.2. RAGE -429 T>C polimorfizmus vizsgálata RAGE -429 T>C polimorfizmus vizsgálata PCR-RFLP módszerrel az irodalomban közölteknek megfelelően történt (55): Forward primer: 5’-GGG GGC AGT TCT CTC CTC-3’ , reverse primer: 5’-TCA GAG CCC CCG ATC CTA TTT-3’. A PCR reakció 50 μl reakció pufferben történt, mely a primerekből 50-50 pmol-nyi mennyiséget, 2-10 ng/μl templát DNS-t, 200-200 μmol/l koncentrációban

dNTP-ket,

2

mmol/l

koncentrációban

MgCl2-t,

20

mmol/l

koncentrációban Tris–HCl-t, 50 mmol/l koncentrációban KCl-t és 0.02 U/μl Taq DNS polimerázt (Promega Corp.,Madison, WI, USA) tartalmazott. A PCR reakció technikai paraméterei: I: 35 ciklus: 1. denaturáció 94ºC-on 1 percig, 2. primer bekötődés 56 ºC-on 1 percig, 3. lánchosszabbítás 72 ºC-on 2 percig, II: végső lánchosszabbítás 72 ºC-on 10 percig. A 10 μl-nyi, PCR-termékeket tartalmazó elegyet 2 egység AluI restrikciós endonukleázzal (Fermentas) 6 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd a T allél jelenléte esetén 345 bp, és a C allél jelenléte esetén 183+162 bp hosszú restrikciós fragmentek detektálása gél elektroforézissel 3%-os agaróz gélen történt. 4.2.3. HSP70-2 +1267A>G polimorfizmus vizsgálata HSP70-2 +1267A>G polimorfizmus vizsgálata az irodalomból ismert PCR-RFLP módszerrel történt (98,99): A 10 μl PCR reakció elegy tartalmazott forward primert: 5’-CAT CGA CTT CTA CA C GTC CA-3’ 1.5 μM mennyiségben, reverse primert: 5’-CAA AGT CCT TGA GTC CCA AC-3’ 1.5 μM mennyiségben, 20 ng/μl templát DNS-t, 200 μM koncentrációban dNTP-ket, 2 mM koncentrációban MgCl2-t, 10 mM koncentrációban Tris–HCl-t, 50 mM koncentrációban KCl-t és 0.02 U/μl Taq DNS polimerázt (Fermentas). A PCR reakció technikai paraméterei: I: denaturáció 95ºC-on 3 percig, II: 35 ciklus: 1. denaturáció 95ºC-on 20 másodpercig, 2. primer bekötődés 60 ºC-on 20 másodpercig, 3. lánchosszabbítás 72 ºC-on 20 másodpercig, III: végső lánchosszabbítás 72 ºC-on 6 percig. A 10 μl-nyi, PCR-termékeket tartalmazó elegyet 10 egység PstI restrikciós enzimmel 37°C-on, 6 órán keresztüli inkubálását követően az A allél jelenléte esetén

20

1117 bp, a G allél jelenléte esetén 936+181 bp hosszúságú fragmentek detektálása gél elektroforézissel, 2%-os agaróz gélen történt. 4.2.4. LTA 252 A>G polimorfizmus meghatározása LTA 252 A>G polimorfizmus vizsgálatát irodalmi adatok alapján (101) PCR RFLP módszerrel Bíró Adrienn végezte: Forward primer: 5’-CTCCTGCACCTGCTGCCTGGATC-3’, reverse primer: 5’GAAGAGACGTTCAGGTGGTGTCAT-3’. A PCR reakció 10 μl reakció pufferben történt, mely primereket 0,5-0,5 mM végkoncentrációban, 20 ng/μl templát DNS-t, dNTP-ket 0,2mM végkoncentrációban, 2 mMl koncentrációban MgCl2-t, 20 mmol/l koncentrációban Tris–HCl-t, 50 mM koncentrációban KCl-t és 0,025u/μl HotStarTaq polimerázt (Qiagen) tartalmazott. A PCR reakció technikai paraméterei: 1 ciklus: 95°Con 15 percig, 30 ciklus: 30 másodpercig 94 °C-on, 30 másodpercig 56 °C-on és 45 másodpercig 72°C-on, majd 1 ciklus 72 °C-on 7 percig. A 10 μl-nyi, PCR-termékeket tartalmazó elegyet 10 egység NcoI restrikciós endonukleázzal 3 órán át 37 °C-on inkubáltuk, majd az A allél jelenléte esetén 368 bp, és a G allél jelenléte esetén 235+133 bp hosszú restrikciós fragmentek detektálása gél elektroforézissel 2%-os agaróz gélen történt. 4.2.5. HLA-DQB1 és HLA-DRB1 allélek vizsgálata HLA-DQB1 allélek vizsgálata SSP-PCR módszerrel kereskedelmi forgalomban elérhető kittel (Olerup SSP TM DQ kit, Olerup SSP AB, Saltsjöbaden, Sweden) Pozsonyi Éva és Rajczy Katalin segítségével és felügyelete alatt történt. HLA-DRB1 allélek vizsgálata SSP-PCR módszerrel kereskedelmi forgalomban elérhető kittel (Olerup SSP TM DQ kit, Olerup SSP AB, Saltsjöbaden, Sweden) és szekvencia specifikus oligonukleotid próba-PCR módszerrel kereskedelmi forgalomban elérhető kittel (INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus kit, Innogenetics, Ghent, Belgium) Pozsonyi Éva és Rajczy Katalin segítségével és felügyelete alatt történt. 4.2.6. Az RCCX modul meghatározása

21

Az RCCX modulban a C4A és C4B polimorfizmusok genotípizálását az irodalomban közölt Southern blot módszer alapján (100) Szalai Csaba felügyeletével Kiszel Petra végezte: TaqI restrikciós endonukleázzal való emésztéssel határoztuk meg az C4 génszámot, a hosszú és rövid C4 gének arányát. 5 μg genomiális DNS TaqI restrikciós enzimmel (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA), egész éjszakán át, 65 ºC-on történt emésztését követően a DNS fragmentumokat újabb egy éjszaka alatt 0.8%-os agaróz gélen elektroforézissel választottuk szét. Az így kapott DNS fragmentumok széttöredezése érdekében a gélt 2 percig UV-illuminátoron hagytuk. Ezt követően a DNS szálakat 1.5 M NaCl és 0.5 M NaOH oldattal denaturáltuk, majd 7.4 pH-n 1.5 M NaCl, 0.5 M Tris-HCl oldattal neutralizáltuk. Az agaróz gélből vett mintákat vákuum blot készülék (BioRad Laboratories, Hercules, CA, USA) segítségével helyeztük Hybond N+ nylon hibridizációs membránra (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK), amelyhez 3M NaCl és 0.3M Na-citrát (SSC) 20xos oldatát használtuk. A DNS molekuláknak a hibridizációs membránhoz való keresztkötéséhez UV-fényt használtunk a blottolás végén, majd ezt a membránt 30 percig mostuk 42 ºC-os előmelegített 0.1 %-os SDS oldattal (150 mM NaCl, 50 mM Tris [pH=7.5], 5mM EDTA, 0.1% SDS). A membrán előhibridizálása lazac spermium DNS-sel

történt:

végkoncentrációban,

az

előzőleg

felforralt

prehibridizációs

lazac

folyadékban

spermium (10%

DNS-t

200μg/ml

dextrán-szulfát,

50%

formamid, 0.5M NaCl, 1% SDS) a membránhoz adtuk, melyet 16 órán keresztül, 42 ºCon, forgó hibridizációs kamrában inkubáltunk. A következő napon C4 génre specifikus DNS próbákat [α-32P]dCTP-vel jelöltük, majd a hibridizációt ezzel folytattuk további 16 órán keresztül. Ezt követően a membránt 0.1%-os SDS-2x SSC, majd 65 ºC-on 0.5%-os

SDS-0.1x

SSC

oldattal

mostuk.

autoradiográfiás módszerrel detektáltuk.

4.3. Vizsgált populációk 4.3.1.1. 1-es típusú diabeteses betegek

22

A

β-emissziós

radioaktív

jeleket

A Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinikáján gondozott 82, 1-es típusú diabeteses beteg DNS-mintáiban a HLA-DQB1 és HLA-DRB1 polimorfizmusokat SSP PCR módszerrel (Olerup SSP TM DQ, DR kit, Olerup SSP AB, Saltsjo¨baden, Sweden), és a RAGE -429 és TNF-α -308 polimorfizmusokat PCR RFLP módszerrel. Az RCCX modul genotípizálását 51 betegben Kiszel Petra az irodalomban közölt adatoknak megfelelően végezte. A vizsgált betegek közül 66 felnőtt (34 férfi, 32 nő, koruk: 41 + 12 év) és 16 gyermek (10 fiú, 6 leány, koruk: 11,5 + 5,0 év). 4.3.1.2. 1-es típusú diabeteses betegek és családjaik A Heim Pál Gyermekkórházban és a Semmelweis Egyetem I. sz. Gyermekgyógyászati Klinikáján gondozott 1-es típusú diabeteses gyerekek családjait is bevontuk a vizsgálatba. 10 ilyen családból összesen 74 egyén DNS-mintáit határoztuk meg a HLADQB1 és HLA-DRB1 polimorfizmusokat SSP PCR módszerrel (Olerup SSP TM DQ, DR kit, Olerup SSP AB, Saltsjo¨baden, Sweden), és a RAGE -429 és TNF-α -308 polimorfizmusokat PCR RFLP módszerrel. Az RCCX modul genotípizálását Kiszel Petra az irodalomban közölt adatoknak megfelelően végezte. Egészséges kontrollként 3 különböző kaukázusi populációból 123 magyar (34 férfi, 89 nő), 99 ohioi nő és 91 izlandi egyén (46 férfi, 45 nő) DNS-mintáiban a RAGE -429 és TNF-α -308 polimorfizmusok genotípizálását a fent említettek szerint végeztük. Az RCCX modul vizsgálatát Kiszel Petra 115 egészséges magyar, 75 egészséges ohioi és 49 egészséges izlandi kontrollban végezte. 4.3.2. Cisztás fibrózisos betegek 72 cisztás fibrózisos beteget vizsgáltunk, közülük 39 ΔF508 homozigóta -koruk 1-28 év (korok mediánja: 11 év, 25%-75%: 4-18 év) és 33 ΔF508 heterozigóta -koruk 3-35 év (korok mediánja: 12 év, 25%-75%: 6,5-17,5 év). A betegeket hét magyar CF gondozó központban kezelik. A diagnózis az összes beteg esetén mind a tipikus klinikai megjelenés, mind a kóros verejték-teszt és CFTR mutáció igazolása alapján született. A centrumokban évenként legalább egy vagy két alkalommal ellenőrzik a betegeket, a P. aeruginosa és S. aureus kolonizációt az ilyen ellenőrzések alkalmával levett köpetminták mikrobiológiai tenyésztési eredménye alapján határozták meg. A kolonozációt az első regisztrált pozitív köpettenyésztés idejétől számítottuk abban az

23

esetben, amennyiben következetesen pozitív is maradt. Az összes kolonizált beteg P. aeruginosával és/vagy S. aureusszal kolonizálódott. A vizsgált CF-os betegek között Burkholderia, Stenotrophomonas, Achromobacter vagy Nontuberculous mycobacteria kórokozókkal való kolonizációt nem észleltünk. Az összes beteg klinikai adatait követni tudtuk legalább a kolonizáció kezdetének évétől. Négy beteg kapott P. aeruginosa elleni védőoltást, egyikük sem kolonizálódott. A cisztás fibrózisos betegek kezelése és gondozása a nemzeti szakmai irányelveknek megfelelően történik az ország minden CF központjában. Minden betegtől, kiskorú beteg esetén a szülőktől kértünk és kaptunk a genetikai vizsgálatba írásban beleegyező nyilatkozatot. A vizsgálat a Magyar Etikai Bizottság és az 1983-ban módosított, 1975-ös Helsinki Nyilatkozat elveinek megfelelően zajlott. Elhunyt betegek DNS-mintáit nem vizsgáltuk. A vizsgálat a Semmelweis Egyetem Etikai Bizottságának jóváhagyásával zajlott. Kontrollként 139 egészséges felnőtt (56 férfi, 83 nő, koruk 29,4±3,9 év) DNS-mintáit használtuk. Az MHC III régióban TNF-α -308 polimorfizmust SSP-PCR módszerrel, a RAGE -429 és HSP70-2 +1267 polimorfizmusokat PCR RFLP módszerrel vizsgáltuk CF-os betegek és egészségesek DNS-mintáiban. Az MHC II HLA-DQB1 polimorfizmust SSP PCR módszerrel (Olerup SSP TM DQ kit, Olerup SSP AB, Saltsjo¨baden, Sweden), a HLADRB1 polimorfizmust szekvencia specifikus oligonukleotid próba PCR módszerrel (INNO-LiPA HLA-DRB1 Plus kit, Innogenetics, Ghent, Belgium) csak a CF-os betegekben vizsgáltuk. A HLA-DRB1*0301, HLA-DQB*0201, TNF-α -308A, RAGE -429C, és HSP70-2 1267G allélek együttes előfordulását tekintettük a 8.1AH jelenlétének, melyet a 2. ábra szemléltet.

24

2. ábra: HLA-DRB1*0301, HLA-DQB*0201, TNF-α -308A, RAGE -429C, és HSP70-2 1267G allélek hordozóit tekintettük 8.1AH-t hordozóknak.

4.3.3. Colorectalis tumoros betegek A Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinikáján Dr. Kocsis Judit és Dr. Tóth Éva Katalin által gondozott, 183 colorectalis tumoros beteget vizsgáltunk; 100 férfit és 83 nőt, életkoruk 65,7 + 10,5 év. Demográfiai és klinikai adatok a 2. táblázatban láthatók. Kontrollként 141 egészséges egyént (61 férfi, 80 nő) 60-79 éves populációt reprezentáló (koruk 68,4 + 6,6 év) vizsgáltunk. Betegektől és kontrolloktól is a vizsgálatba beleegyező írásos nyilatkozatot kaptunk. A vizsgálat a Semmelweis Egyetem Etikai Bizottságának jóváhagyásával zajlott.

25

2. táblázat: Colorectalis tumoros betegek demográfiai és klinikai adatai Változó Vizsgált betegek száma

183

Kor években, átlag + SD

65,7 + 10,5

Férfiak/nők

100/83

Tumor elhelyezkedése

colon

112

sigma

10

rectum

50

rectum+sigma

2

rectum+colon

3

colon

vagy

rectum

szervek érintettségével Dukes A/B/C/D

3/69/75/25

TNM-T 0/1/2/3/4/ nem meghatározott

1/5/36/104/20/17

TNM-N 0/1/2/ nem meghatározott

74/67/18/24

TNM-M 0/1/ nem meghatározott

84/30/69

Grade 1/2/3/nem meghatározott

19/107/47/10

A HSP70-2 1267AC és

más 6

LTA 252 A>G polimorfizmusok

meghatározását PCR RFLP módszerrel végeztük. A TNF-α -308 G
26

3. ábra: 8.1AH hordozónak a TNF-α -308A, RAGE -429C, HSP70-2 1267G és LTA +252G allélek egyidejű hordozóját tekintettük

4.4. Statisztikai analízis A statisztikai analízis GraphPad Prism V 4.00, Windows software package (GraphPad Software, San Diego Calif., USA, www.graphad.com) készült. Genotípusok, allélek és haplotípusok gyakoriságának összehasonlítsát χ2-teszt, χ2 for trend –teszt vagy Fisher exact-teszt segítségével végeztük. 0,05-nél kisebb p-értéket értékeltük szignifikánsnak. Linkage disequilibrium (LD) együttható számítására az Arlequin Software-t (Schneider, S., Roessli, D., and Excoffier, L. (2000) Arlequin: A software for population genetics data analysis. Ver 2.000. Genetics and Biometry Lab, Dept. of Anthropology, University of Geneva, http://lgb.unige.ch/arlequin) használtuk. Két allél kapcsolt, ha a LD együttható nagyobb, mint 0,4. „Power” analízist GraphPad StatMate software-rel (GraphPad Software) végeztünk. Bármely,

egyszeres

változós

analízisben

szignifikáns

különbséget

többszörös

logisztikus regressziós modellben is vizsgáltunk. CF-os betegekben a kolonizáció-mentes időszakok hosszúságát Mantel–Haenszel logrank-teszttel hasonlítottuk össze.

27

A vizsgált betegek és egészséges kontrollok korának összehasonlítására Mann– Whitney-tesztet használtunk. 5. Eredmények 5.1.1. RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjai közti szoros genetikai kapcsoltság 1es típusú diabeteses betegekben RAGE -429C allél kapcsoltságát vizsgáltuk HLA-DQB1, HLA-DRB1 és TNFα -308 G>A polimorfizmusokkal 82 1-es típusú diabeteses betegben (66 felnőtt, 16 gyerek). 54 betegben az RCCX modul genotípusát is meghatároztuk. A RAGE -429C allél statisztikailag szignifikáns, rendkívül szoros genetikai kapcsoltságot, úgynevezett linkage

disequilibriumot

(LD)

mutatott

a

8.1AH

vizsgált

tagjaival:

HLA-

DQB*0201(DQ2), HLA- DRB*0301(DR3), TNF2 allélekkel és mono-S-RCCX modullal, p=6,7x10-7 -től 5,1x10-9 -ig, D’= 0,6131-0,9068 terjedt (3. táblázat). A 82 betegben vizsgált, a 8.1AH részét képező allélek egymással is a RAGE -429C allélhez hasonló szoros linkage disequilibriumot mutattak (3. táblázat). 1-es típusú diabetesre nem csak a HLA-DQ2 és HLA-DR3, hanem a HLA-DQ8 és HLA-DR4 allélek is hajlamosítanak, mely utóbbiak viszont nem részei a 8.1 ősi haplotípusnak. Megvizsgáltuk ugyanezen 82, 1-es típusú diabeteses beteg csoportjában, hogy a RAGE -429C kapcsolt-e ezekkel, a HLA-DQ8 és HLA-DR4 allélekkel. Ellentétben a 8.1AH tagjaival észlelt szoros kapcsoltságával, a RAGE -429C LD együtthatója mind a HLA-DQ8, mind a HLA-DR4 esetén gyenge volt (p=0,031 és D’=0,0476, illetve p=0,023 ás D’=0,336).

28

3. táblázat: RAGE -429C allél és a 8.1 ősi haplotípus ismert alkotórészei: HLA-DQ2, HLA-DR3, TNF2 allél és a monomoduláris rövid RCCX modul (mono-S) közötti kapcsoltság (linkage disequilibrium, p-érték és D’-együttható) 82 magyar 1-es típusú diabeteses betegben

DQ2

DR3

p=6,23×10-8 RAGE -429 C

D’=0,8212

DQ2

p=5,13×10-9 D’=0,6131

TNF2

Mono-S

p=7,81×10-9

p=6,66x10-7

D’=0,7663

D’=0,9068

-4

p=0,0006

p=4,50x10

D’=0,9311

D’=0,7576 p=2,74x10

DR3

-5

D’=0,6982

(n=54) p=0,0001 D’=0,8921 (n=54) p=0,0371 D’=0,6274 (n=54) p=8,18x10-6

TNF2

D’=0,8921 (n=54)

5.1.2. RAGE -429 T>C polimorfizmus és MHC II és III osztályú gének marker alléljei nyolc 1-es típusú diabeteses családban Olyan családokban, ahol előfordul 1-es típusú diabetes mellitus, vizsgáltuk a RAGE 429 T>C polimorfizmus öröklődését. Emellett MHC II osztályú HLA-DQB1 és HLADRB1 haplotípust, MHC III osztályú TNFα -308 G>A polimorfizmust és az RCCX modult határoztunk meg.

A családfák és a családtagok haplotípusai –a 8 család

összesen 32 apai és anyai 6-os kromoszómáján 15 különböző MHC haplotípus- a 4. ábrán, a haplotípus szegregáció a RAGE -429T illetve RAGE -429C allélekkel a 4. táblázatban látható.

29

4. ábra: Nyolc magyar család 1-es típusú diabeteses gyermekkel. HLA-DQ, HLA-DR, RAGE -429, RCCX modul és TNFα -308 polimorfizmusok apai és anyai MHC haplotípusai szerepelnek az ábrán. Használt szimbólumok: a számok a családot jelölik, a és b az apai MHC haplotpust, c és d az anyai MHC haplotípust jelöli. Haplotípusok: 1. család

a: DQ2-DR3-L-C-2 b: DQ5-DR10-L-T-1 c: DQ8-DR4-L-T-1 d: DQ2-DR7-L-C-1

Haplotípusok: a: DQ2-DR3-L-C-2 2. család

b: DQ9-DR7-S-T-1 c: DQ2-DR7-L-C-1 d: DQ7-DR13-L-C-1

Haplotípusok: a: DQ2-DR3-S-C-2 3. család

b: DQ6-DR15-L-T-1 c: DQ5-DR16-L-T-1 d: DQ6-DR13-L-T-2

30

Haplotípusok: 4. család

a: DQ2-DR3-S-C-2 b: DQ5-DR1-L-T-1 c: DQ5-DR1-L-T-1 d: DQ2-DR3-L-T-1

Haplotípusok: a: DQ2-DR3-S-C-2 5. család

b: DQ5-DR1-L-T-1 c: DQ8-DR4-L-T-1 d: DQ5-DR1-L-T-1

Haplotípusok: a: DQ8-DR4-L-C-1 6. család

b: DQ7-DR11-L-T-1 c: DQ2-DR3-S-C-2 d: DQ7-DR11-L-T-1

Haplotípusok: a: DQ2-DR3-S-C-2 7. család

b: DQ7-DR11-L-T-1 c: DQ5-DR1-L-T-1 d: DQ2-DR3-L-T-1

31

Haplotípusok: 8. család

a: DQ2-DR3-S-C-2 b: DQ6-DR15-L-T-1 c: DQ2-DR3-S-C-2 d: DQ5-DR1-L-T-1

A nyolc 1-es típusú diabeteses családban a leggyakoribb haplotípus a HLA-DQ2 /HLADR3/S/RAGE -429C /TNF2, melyben az „S” a monomoduláris RCCX modult (rövid C4B génnel) jelöli. Ez a haplotípus szoros összefüggést mutat a 8.1 ősi haplotípussal (45), és hét alkalommal fordul élő a szülők között (4. táblázat). Ezen kívül a 8.1AH három variánsa 4 szülőben fordult elő, akikben a HLA-DQ2/HLA- DR3 haplotípussal RAGE -429T vagy -429C, hosszú vagy rövid RCCX modul és TNF-α -308A (TNF2) helyett -308G (TNF1) fordult elő (4. táblázat B része). Említésre méltó, hogy a haplotípusok közül az összes 8.1AH és kettő a három 8.1AH variánsból átörökítődött a diabeteses gyerekekbe. A 8.1AH és ennek variánsai mellett három további, RAGE -429C allélt tartalmazó MHC haplotípust hordozott 3 szülő (4. táblázat C része). Ezen haplotípusok mindegyike TNF-α -308G alléllel kapcsolt. A RAGE -429T allél nyolc különböző MHC II és III osztályú haplotípussal kapcsolt. Ezek közül kettő kivételével az összes haplotípusra igaz, hogy nem kapcsolt a mono-S RCCX modullal, és vagy TNF-α -308G vagy -308A allél van jelen. A RAGE -429T allél a leggyakrabban (7 szülőben) a HLA-DQ5, -DR1, TNF1 allélekkel és a mono-S RCCX modul hiányával kapcsolt. HLA-DQ5/DR1/TNF1 haplotípus RAGE -429C-vel kapcsoltan egyik szülőben sem fordult elő (4. táblázat D rész). Az összes haplotípus, melyben a 8.1AH ismert, általunk vizsgált négy alkotó allélje (HLA-DQ2, -DR3, mono-S, TNF2) közül legalább három jelen volt, minden esetben kapcsolt volt a RAGE -429C alléllel (5. táblázat). A 8.1AH tagjai közül 1 vagy 2 allélt tartalmazó hat haplotípus közül egy volt kapcsolt a RAGE -429C alléllel, míg a 8.1AH

32

tagjait egyáltalán nem tartalmazó 17 haplotípus közül 15 volt kapcsolt a RAGE -429T alléllel. 4. táblázat: RAGE 429 T>C polimorfizmus alkotta MHC II és III osztályú haplotípusok A.

8.1 kaukázusi ősi MHC haplotípus

1.

DQ2 - DR17 - S – 429C - TNF2 haplotípus 1T diabeteses családokban: 2a, 3a, 4a, 5c, 6a, 7a, 7b

B.

8.1 ősi haplotípus variánsai

2.

DQ2 - DR17 – L – -429C - TNF2 haplotípus 1T diabeteses családokban: 1a

3.

DQ2 - DR17 - L– -429T - TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 3d, 6d

4.

DQ2 - DR17- S – -429C - TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 8a

C.

RAGE -429C allélt tartalmazó más MHC haplotípusok

5.

DQ2 - DR7 - L - -429C – TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 1c

6

DQ7 - DR13 - L - -429C – TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 1d

7.

DQ8 - DR4 - L --429C - TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 5a

D.

RAGE -429T allélt tartalmazó más MHC haplotípusok

8.

DQ5 - DR1 - L –429T - TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 3b, 3c, 4b, 4d, 6c, 6d, 8d

9.

DQ5 - DR1 - S - -429T - TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 7d

10.

DQ5 - DR16 - L --429T - TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 2c, 8c

11.

DQ6 - DR13 - L --429T - TNF2 haplotípus 1T diabeteses családokban: 2d

12.

DQ6 - DR15 - L --429T - TNF1 haplotípus

33

1T diabeteses családokban: 2b, 7b 13.

DQ9 – DR7 - S – -429T – TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 1b

14.

DQ7 - DR11 - L - -429T - TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 5b, 5d, 6b

15.

DQ8- DR4 - L –429T - TNF1 haplotípus 1T diabeteses családokban: 4c, 8b

Rövidítések: S: monomoduláris RCCX modul rövid C4 génnel; L: RCCX modul(ok) hosszú C4 génnel az első modulban; -429C: RAGE -429C allél; -429T: RAGE -429T allél; TNF2: TNF-α -308A allél; TNF1: TNF-α -308G allél.

5. táblázat: A 8.1 ősi haplotípus ismert tagjai kapcsoltak a RAGE -429C alléllel DQ2/DR3/mono-S/ TNF2 haplotípus

RAGE -429 SNP allél

összes

C

T

mind a négy

7

0

7

három

2

0

2

kettő

0

2

1

egy

1

3

3

egy sem

2

15

26

összesen

12

20

32

5.1.3. RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjai közti szoros kapcsoltság megerősítése magyar, ohioi és izlandi egészségesek csoportjában A RAGE gén az MHC II osztályú gének és a C4 géneket is magában foglaló RCCX modul között található. Magyar, ohioi és izlandi egészséges egyénekben a TNF-α -308A (TNF2) gyakorisága 0,183, 0,192 illetve 0,093 (6. táblázat). A RAGE -429C allél gyakorisága megközelítőleg hasonló a TNF2 alléléhoz, az említett populációkban 0,175, 0,182 illetve 0,121. Mind a RAGE -429C és a TNF2 kétszer olyan gyakori, mint a mono-S RCCX modul a megfelelő populációkban.

34

A 123 magyar, 99 ohioi és 91 izlandi egészséges egyén vizsgálata a RAGE -429C és a TNF2 allél szoros kapcsoltságára derített fényt, p<0,0001 mindegyik LD együttható esetén (5. ábra). 115 magyar, 75 ohioi és 49 izlandi egészséges egyénben elvégzett RCCX modul meghatározásával a RAGE -429C allél és a mono-S RCCX modul szoros kapcsoltsága igazolódott, p<0,0001 mindegyik LD együttható esetén (6. ábra). 6. táblázat: RAGE -429, TNF -308 és RCCX modul genotípusok megoszlása három kaukázusi (magyar, ohioi és izlandi) populációban Egészséges magyar egyének n=123 (%)

Egészséges ohioi Egészséges izlandi nők

egyének

n=99 (%)

n=91 (%)

RAGE -429 TT

83 (67,5)

66 (66,7)

69 (75,8)

TC

37 (30,1)

29 (29,3)

22 (24,2)

CC

3 (2,4)

4 (4,0)

0 (0,0)

0,175

0,182

0,121

GG

82 (66,7)

65 (65,7)

74 (81,3)

GA

37 (30,1)

30 (30,3)

17 (18,7)

AA

4 (3,1)

4 (4,0)

0 (0,0)

0,183

0,192

0,093

Nem hordozó

95 (82,6)

58 (77,3)

42 (85,7)

Heterozigóta

19 (16,5)

17 (22,7)

7 (14,3)

Homozigóta

1 (0,9)

0 (0,0)

0 (0,0)

0,091

0,113

0,051

RAGE -429C allél gyakorisága TNFα -308

TNF2

allél

gyakorisága Mono-S-C4BRCCX

Mono-S genotípus gyakorisága

35

5. ábra: TNFα -308 G>A és

RAGE -429 T>C polimorfizmusok közötti linkage

disequilibrium (LD) egészséges magyar populációban (A), egészséges ohioi nőkben (B) és egészséges izlandi populációban (C). LD-együttható és p-érték Arlequin software-rel számítva. B

A 60

40

RAGE -429 TT

D' = 0.5161 p=<0.0001

összes eset %-a (n=101)

50

RAGE -429 TC RAGE -429 CC

30 20 10 0

TNFA GG

TNFA GA

50

30 20 10 0

TNFA AA

D' = 0.4981 p=<0.0001

40

TNFA GG

C 70 összes eset %-a (n=91 )

összes eset %-a (n=127)

60

60 50

D' = 0.5985 p=<0.0001

40 30 20 10 0

TNFA GG

TNFA GA

36

TNFA AA

TNFA GA

TNFA AA

6. ábra: Mono-S-RCCX modul és RAGE -429 T>C polimorfizmusok közötti linkage disequilibrium (LD) egészséges magyar populációban (A), egészséges ohioi nőkben (B) és egészséges izlandi populációban (C). LD-együttható és p-érték Arlequin software-rel számítva.

B

A 70

60

RAGE -429 TT

50

RAGE -429 TC

40 30

összes eset %-a ( n=80)

összes eset %-a (n=117)

70

RAGE -429 CC

D' = 1.000 p<0.0001

20 10 0

60

40 30 20 10 0

nincs mono-S

egy mono-S

D' = 0.7951 p<0.0001

50

két mono-S

nincs mono-S egy mono-S

két mono-S

C

összes eset %-a (n=49)

75

50

D' = 1.000

p<0.0001 25

0

nincs mono-S

egy mono-S

két mono-S

5.1.4. A RAGE -429C és a diabeteses betegek klinikai tünetei közti összefüggés A RAGE -429 TT, TC és CC genotípusú betegek között nem észleltünk különbséget proteinuria (p=0,97) vagy retinopathia (p=0,85) előfordulása tekintetében. A szénhidrátanyagcsere szabályozásában azonban találtunk különbséget. A regisztrált HbA1C-érték 61 diabeteses beteg esetén volt elérhető, ezeket összehasonlítottuk a RAGE -429C hordozókban és nem hordozók között (7. ábra). A HbA1C csúcsértékek szignifikánsan magasabbak voltak a RAGE -429C hordozókban, mint a nem hordozókban (7.a ábra). Ezen kívül, a rossz szénhidrát-anyagcserére jellemző magas HbA1C-érték (>10%) nagyobb arányban fordult elő a RAGE -429C hordozókban (17/28, 61%), mint a nem

37

hordozókban (11/33, 33%), (p=0,042) (7.b ábra). A RAGE -429C allélt hordozók esélye (OR), hogy legalább egy magas HbA1C-értékük legyen 3,09 (95% konfidencia intervallum: 1.08-8.82) az allélt nem hordozókkal szemben. Hasonló, bár gyengébb kapcsolatot észleltünk a HLA-DQ2 allélel, OR: 3.24 (95% konfidencia intervallum: 1.05-10.11, p=0,058). A HLA-DQ2/RAGE -429C haplotípust hordozó illetve nem hordozó betegeket összehasonlítva, magas HbA1C-érték nagyobb eséllyel fordult elő a haplotípust hordozókban, OR: 3.40 (95% konfidencia intervallum: 1,17-9,81, p=0,037). Ezzel szemben a magas HbA1C-értékek előfordulása nem mutatott összefüggést sem a DR3 (OR: 1,15, 95% konfidencia intervallum: 0,43-3,19, p=0,802), sem a TNF2 (OR: 1,22, 95% konfidencia intervallum: 0,42-3,187, p=0,787) alléllel, sem a mono-S RCCX modullal (OR: 4,038, 95% konfidencia intervallum: 0,68-23,95, p=0,654). 7. ábra: Mért legmagasabb HbA1C-értékek a RAGE -429C allélt hordozó és nem hordozó 1-es típusú diabteses betegben (p=0,013) (A rész), és magas HbA1Cértékek (>10%) előfordulása a RAGE -429C allélt hordozó és nem hordozó 1-es típusú diabteses betegben (p=0,039)(B rész)

38

5.2.1. A 8.1AH MHC II és III marker alléljei egymással kapcsoltak, haplotípust alkotnak Mivel a vizsgált HLA-DRB1*0301, HLA-DQB*0201, TNF-α -308A, RAGE -429C, és HSP70-2 1267G allélek egymással való kapcsolatát nézve minden p-érték szignifikáns és minden D’-érték nagyobb 0,4-nél, ezért kimondhatjuk, hogy az allélek egymással – szoros- linkage disequilibriumban állnak, vagyis genetiakilag kapcsoltak, haplotípust alkotnak. Az összefüggést a 7. táblázatban láthatók. 7. táblázat: A 8.1AH MHC II és III marker alléljeinek kapcsolata 72 magyar cisztás fibrózisos betegben DR3

TNF2

RAGE -429C HSP70-2G

D’=0.99

D’=0.54

D’=0.60

p < 0.0001 p < 0.0001 p < 0.0001 D’=0.96

D’=0.75

p < 0.0001 p = 0.0001

D’=0.67 p = 0.0007 D’=0.85 p = 0.0063

D’=0.44

D’=0.50

p = 0.0007

p = 0.0099 D’=0.60 p = 0.0004

DQ2 DR3 TNF2 RAGE -429C

5.2.2. A 8.1AH MHC II és III marker alléljei és haplotípusaik gyakorisága egészséges kontrollokban és CF-os betegekben HLA-DQB1, HLA-DRB1, TNF-α -308 G>A, RAGE -429 T>C és HSP70-2 -1267 A>G polimorfizmusokat határoztunk meg 7 magyar CF központban gondozott, összesen 72 CF-os beteg (39 ΔF508 homozigóta és 33 ΔF508 heterozigóta) DNS-mintáiban. A kontroll csoportban HLA-típizálást nem végeztünk, így a 139 egészséges kontroll esetében csak a három MHC III allél tekintetében van lehetőség a betegek és kontrollok összehasonlítására (8. táblázat). A 8.1AH marker alléljeinek és ezek haplotípusainak gyakoriságában nem találtunk különbséget a kontrollok és CF-os betegek között. A betegeket két csoportra, kolonizáltak (n = 44) és nem kolonizáltak (n = 28) csoportjára osztottuk. Drámai

39

különbséget észleltünk a nem kolonizált betegek esetén: egy kivételével (HSP70-2 1267G) minden allél és egy kivételével minden vizsgált haplotípus szignifikánsan gyakoribb volt a betegek ezen csoportjában, mint az egészséges kontrollokban. A legnagyobb különbséget a TNF2/HSP70-2-1267G/RAGE -429C haplotípus mutatta, ennek frekvenciája több mint háromszor magasabb a nem kolonizált betegekben, mint az egészséges kontrollokban. Ezzel ellentétben, a kolonizált betegek és az egészségesek között egyik allél vagy haplotípus tekintetében sem volt szignifikáns különbség (8. táblázat). A nem kolonizált CF-os betegek kora (9,8 ± 6,2 év) lényegesen eltért a kontrollokétól (29,4 ± 3,9 év). Az ezért végrehajtott, korra és nemre illesztett többszörös regressziós analízis eredményeként is megmaradt a szignifikáns különbség (p = 0,031) a TNF2/HSP70-2-1267G/RAGE -429C haplotípus előfordulási gyakoriságában a két csoport között. 8. táblázat: MHC III marker allélek és haplotípusok gyakorisága cisztás fibrózisos betegekben és egészséges kontrollokban Allél (haplotípus)

Cisztás fibrózisos betegek

Egészséges

Összes beteg Nem kolonizált Kolonizált

kontrollok

(n=72)

(n= 139)

betegek (n=28)

betegek (n=44)

Allél (haplotípus) gyakoriság TNF2 (-308A)

0,304***

0,105

0,118

-1267G 0,420

0,519

0,389

0,427

RAGE -429C (AGER- 0,181

0,286

0,198

0,188

HSP70-2

0,155

(HSP70-2G) C) TNF2-HSP70-2G

0,140

0,259***

0,097

0,072

TNF2-RAGE-C

0,104*

0,214**

0,047

0,061

HSP70-2G-RAGR-C

0,160

0,259*

0,153

0,137

TNF2-HSP70-2G-

0,104*

0,222***

0,056

0,062

RAG-C Egészséges kontrollokhoz viszonyított különbség (Fisher exact teszt) *p<0,05, **0,01***<0,001

40

5.2.3. A CF-os betegcsoport felosztása 8.1AH-t hordozókra és nem hordozókra –a 8.1AH hatása a kolonizációra A CF-os betegek klinikai adatait a 2. táblázat mutatja. A 8.1AH-t hordozók és nem hordozók között nincs jelentős különbség az átlag életkorban, a nemek vagy a ΔF508 homozigóták és heterozigóták arányában a 72 CF-os beteg között. A ΔF508 heterozigóta betegek között a 8.1AH-t hordozók életkora kis mértékben, nem szignifikánsan (p = 0.086) magasabb volt, mint az ezen haplotípust nem hordozóké (9. táblázat). Ezzel ellentétben, a 8.1AH-t hordozók és nem hordozók között statisztikailag jelentős különbséget észleltünk a kolonizáltak és nem kolonizáltak arányában és az életkorban a kolonizáció kialakulásakor. A P. aeruginosával és/vagy S. aureusszal kolonizált betegek életkora a kolonizáció kialakulásakor szignifikánsan magasabb volt 8.1AH hordozók esetén, mint a haplotípust nem hordozóknál (p=0,012) (9. táblázat). A 8.1AH hordozók egy negyede kolonizálódott szemben a 8.1AH nem hordozók két harmadával. A „power” analízis szerint a mintaszám elég nagy volt ahhoz, hogy szignifikáns különbséget 80% erőséggel bizonyíthassuk. Csak a már kolonizált betegeket vizsgálva a kolonizáció mentes időszak átlagos hossza több mint ötször hosszabb volt 8.1AH hordozókban, nem hordozókhoz viszonyítva (p = 0.036) (9. táblázat). Ezeket az egy változós analízissel kapott eredményeket a többszörös logisztikus regressziós analízis is megerősítette: korra, nemre és ΔF508 genotípusra adjusztálva a 8.1AH hordozók esélyhányadosa (OR, 95% CI) 0.112 (0.024–0.520; p = 0.005) a kolonizációra, a nem hordozókkal szemben (10. táblázat). Érdekességként említem meg, hogy az egyetlen 8.1AH-ra és ΔF508-ra nézve is homozigóta beteg 17 éves korában kolonizálódott, mely igen későinek számít. Azon a négy beteg közül, akik P. aeruginosa elleni védőoltásban részesültek, egyikük sem kolonizálódott, és egyikük sem hordozta a 8.1AH-t.

41

9. táblázat: Cisztás fibrózisos betegek adatai (n=72) a 8.1 ősi haplotípus (AH) hordozásának megfelelően csoportosítva 8.1AH+

8.1AH-

(n=14)

(n=58)

5/9

34/24

16.5

10

(8.3-20.5)

(4-17)

ΔF508 homozigóta/ heterozigóta

5/9

34/24

0,123

P. aeruginosával kolonizált

2

14

0,721

S. aureusszal kolonizált

1

15

0,169

1

11

0,437

4

40

nő/férfi korc (év)

P. aeruginosával+ S. aureusszal kolonizált Összes kolonizált

p-értékb 0,123 0,086

0,012 Nem kolonizált

10

18

ΔF508 homozigóta

3,0 (1,0-8,0)

14,0; 17,0

ΔF508 heterozigóta

4,0 (3,0-10,0)

3,0; 18,0

Összes beteg

15,5 (5,4-17,8) 3,0 (0,8-8,0)

Kor a kolonizáció kezdeténc (év)d

a

Betegek száma és koruk mediánja került feltüntetésre

b

Mann-Whitney teszt vagy χ2 teszt

c

Betegek átlagéletkora (mediánja, 25%-75% percentilis)

d

Csak a már kolonizált betegek kerültek feltüntetésre

42

0,036

10. táblázat: A 8.1 ősi haplotípus (8.1AH) kolonizációval való összefüggésének erőssége 72 cisztás fibrózisos beteg esetében, többváltozós logisztikus regressziós analízissel számítva Esélyhányados (OR) (95% konfidencia intervallum, CI) *

p-érték

Nem illesztett

0,180 (0,050-0,651)

0,009

Korra és nemre illesztett

0,100 (0,022-0,455)

0,003

0,112 (0,024-0,520)

0,005

Korra, nemre és ΔF508 genotípusra illesztett

*8.1AH hordozók vs. nem hordozók

5.2.4. A kolonizáció mentes időszak hossza különbözik 8.1AH hordozók és nem hordozók között Túlélési görbével, Mantel–Haenszel log rank teszttel hasonlítottuk össze a kolonizációmentes időszakokat a betegcsoportban. Az összes CF-os beteget együtt vizsgálva, a 8.1AH-t hordozók körében a kolonozáció-mentes időszak hossza igen szignifikáns különbséget mutatott (p < 0,0001) (8.a ábra). ΔF508 homozigóta betegekben a S. aureus és/vagy P. aeruginosa kolonizációtól mentes periódus szintén szignifikánsan hosszabb volt 8.1AH hordozókban, mint a haplotípust nem hordozókban (p=0,029) (8.b ábra). Ugyanilyen összefüggést figyelhettünk meg ΔF508 heterozigóta betegekben, a 8.1AH hordozókban jelentősen hosszabb volt a kolonizáció-mentes időszak hossza (p=0,004) (8.c ábra). A 8.b ábrán a függőlegesen végződő görbék azt mutatják, hogy ΔF508 homozigóta betegek esetében a görbe által jelzett legmagasabb életkorú mind 8.1AH hordozók és nem hordozók kolonizálódnak. Ezzel szemben az 8.a és 8.c ábrán a görbék vízszintesen végződnek, mutatva, hogy az összes CF-os beteg és a ΔF508 heterozigóta betegek esetén a görbe által jelzett legidősebb betegek nem kolonizáltak. A CF-os betegekről közölt legtöbb adat P. aeruginosa kolonizációt említ, ezért elvégeztük a fenti analízist a P. aeruginosával kolonizáltak körében is (n=31). A kolonizáció egy folyamat, és nem kizárólag P. aeruginosa az első kolonizáló törzs, de a betegek ezen csoportjában mindenkiben megtalálható a P. aeruginosa. Az eddigi

43

megfigyelésekhez hasonló eredményt kaptunk; a 8.1AH hordozókban jelentősen hosszabb kolonizáció-mentes időszakot észleltünk, mint a haplotípust nem hordozókban (p= 0.025, az adatokat a táblázatban nem tüntettük fel). 8. ábra: Kolonizáció-mentes periódus (a): ΔF508 homozigóta és ΔF508 heterozigóta cisztás fibrózisos betegekben (n=72), (b): ΔF508 homozigóta cisztás fibrózisos betegekben (n=39), és (c): és ΔF508 heterozigóta cisztás fibrózisos betegekben (n=33). A 8.1 AH-t hordozók (folytonos vonal) és nem hordozók (szaggatott vonal) között szignifikáns a különbség az egyes csoportokban; (a): p<0,0001, (b): p=0,029, (c):

CF-es betegek százaléka (%)

p=0,004, (Mantel-Haenszel logrank teszt).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

8.1 AH+ 8.1 AH-

0

10

20

30

kolonizáció mentes időszak (év)

CF-es betegek százaléka (%)

8 .a ábra

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

8.1 AH+ 8.1 AH-

0

5

10

15

20

25

kolonizáció mentes időszak (év)

8 .b ábra

44

CF-es betegek százaléka (%)

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

8.1 AH+ 8.1 AH-

0

10

20

30

kolonizáció mentes időszak (év)

8 .c ábra

5.3.1. MHC III allélek és haplotípusok gyakorisága colorectalis tumoros betegekben és egészséges kontrollokban LTA 252 A>G, TNF-α -308 G>A, HSP70-2 -1267 A>G és RAGE -429 T>C egyes nukleotid polimorfizmus genotípusok hordozóinak megoszlását hasonlítottuk össze 183 colorectalis tumoros betegben és 141 korra és nemre illesztett egészséges kontrollban (11. táblázat). Ezen polimorfizmusok ritka alléljei a 8.1AH részét képezik. Egyik SNP esetén sem észleltünk különbséget a betegek és a kontroll csoport között. Ezzel szemben teljesen más volt a helyzet a 8.1AH-t alkotó allélek alkotta haplotípus gyakorisága tekintetében (11. táblázat). A LTA 252G-TNFα -308A haplotípus esetében marginális volt a szignifikancia, míg a 3-lókuszos és 4-lókuszos haplotípus jelentősen magasabb arányban fordult elő a tumoros betegekben, mint egészségesekben (p=0,008 illetve p=0,006). Bár a betegek és kontrollok kora hasonló volt (p=0.110), enyhe különbséget (p=0.031) figyelhettünk meg a két csoport között nemek szerinti megoszlásban (a betegek között viszonylag több férfi volt). Ezért többszörös logisztikus regressziót alkalmazva vizsgáltuk a LTA 252G+TNFα -308A +HSP70 1267G + RAGE -429C haplotípus (a továbbiakban: 8.1AH) korra és nemre illesztett gyakoriságát. A betegek és egészséges kontrollok közti különbség az illesztésnek megfelelő korrekciót követően is szignifikáns

45

maradt, a 8.1AH hordozóknak a nem horodzókkal szemben 2,5-szeres az esélye colorectalis tumor kialakulására. 11. táblázat: MHC III allélek és haplotípusok gyakorisága colorectalis tumoros betegekben és egészséges kontrollokban allélek/haplotípusok hordozói

Kontrollok

Colorectalis tumoros p-érték (χ2 for

(n=141)

betegek (n=183)

trend-teszt)

Esetszám (%) Kor (év) medián (IQ range)

68,0

(61,9- 66,0 (59,5-74,0)

0,418*

60/81

100/83

0.034**

AA

69 (48,4)

84 (45,9)

0,278

AG

64 (45,4)

80 (43,7)

GG

8 (5,7)

19 (10,4)

GG

111 (78,7)

132 (72,1)

GA

30 (21,3)

48 (26,2)

AA

0 (0,0)

3 (1,6)

HSP70 -1267 AA

65 (46,7)

69 (37,7)

AG

57 (40,4)

87 (47,5)

GG

19 (13,5)

27 (14,8)

TT

101 (71,6)

135 (73,8)

TC

35 (24,8)

44 (24,0)

CC

5 (3,5)

4 (2,2)

112 (79,4)

132 (72,1)

Heterozigóta hordozó

29 (20,6)

48 (26,2)

homozigóta hordozó

0 (0,0)

3 (1,6)

122 (86,5)

137 (74,9)

19 (13,5)

45 (24,6)

73,0) Férfiak/nők LTA 252

TNFα -308

RAGE -429

0,110

0,214

0,545

LTA 252G + TNFα -308A Nem hordozó

0,081

LTA 252G + TNFα -308A + HSP70 1267G Nem hordozó Heterozigóta hordozó

46

0,008

homozigóta hordozó

0 (0,0)

1 (0,5)

130 (92,2)

148 (80,9)

11 (7,8)

35 (19,1)

LTA 252G + TNFα -308A + HSP70 1267G +

RAGE -

429C Nem hordozó Heterozigóta hordozó

0,003

*Mann-Whitney-teszt, **Fisher exact-teszt 5.3.2. A 8.1 ősi haplotípus gyakoriságának összehasonlítása colorectalis tumoros betegekben és egészséges kontrollokban, kor és nem szerint csoportosítva Mivel logisztikus regressziós vizsgálattal jelentős összefüggést észleltünk a kor (p=0,026), a nem (p=0,047), colorectalis tumor kialakulásának veszélye és a 8.1AH között (12. táblázat), a következő lépésben azt vizsgáltuk, hogy van-e különbség a 8.1AH és a colorectalis tumor esélyhányadosa között különböző korú illetve nemű betegek esetében. A betegeket koruk mediánja (67 év) szerint osztottuk csoportokra. A 67 évnél fiatalabb betegek az 1., a 67 évnél idősebb betegek a 2. korcsoportba kerültek. A 8.1AH hordozók lényegesen magasabb arányban (p=0,008) fordultak elő az 1. korcsoportba tartozó betegekben, mint a kontrollokban, de ez a különbség nem volt szignifikáns az idősebb betegcsoport és a kontrollok között (9. ábra). Az 1. korcsoportban a nemre illesztett esélyhányados a 8.1AH-t hordozók körében majdnem hatszorosa a haplotípust nem hordozókhoz képest (13. táblázat). Nemek trekintetében is jelentős különbségeket észleltünk. A 8.1AH hordozók gyakorisága magasabb volt beteg nőkben, mint egészséges nőkben (9. ábra). Korra való illesztést követően a 8.1AH hordozó nőkben az esélyhányados több mint négyszeres volt a haplotípust nem hordozókkal szemben, míg férfiakban nem észleltünk különbséget 8.1AH hordozók és nem hordozók között (14. táblázat).

47

12. táblázat: A LTA 252A+TNFα -308A+HSP70 1267G + RAGE -429C haplotípust hordozók korra és nemre illesztett kockázata colorectalis tumor kialakulására a haplotípust nem hordozókkal szemben Változó

Esélyhányados (95% konfidencia p-érték intervallum)

Hordozók:nem hordozók

2,514 (1,208-5,232)

0,014

Férfiak:nők

1,547 (0,983-2,434)

0,059

Kor

0,971 (0,946-0,998)

0,034

9. ábra: LTA 252A+ TNFα -308A +HSP70 1267G +RAGE -429C haplotípus előfordulási gyakorisága colorectalis tumoros betegekben és egészséges kontrollokban 67 év alatt (A rész), 67 év felett (B rész), nőkben (C rész) és férfiakban (D rész).

48

13. táblázat: A LTA 252A+TNFα -308A+HSP70 1267G + RAGE -429C haplotípust hordozók nemre illesztett kockázata colorectalis tumor kialakulására a haplotípust nem hordozókkal szemben (diagnóziskor különböző korok) Csoport

Esélyhányados (95% konfidencia p-érték intervallum)

Kor < 67 év

4,073 (1,317-12,596)

0,015

Kor > 67 év

2,036 (0,721-5,752)

0,180

Összes beteg

2,788 (1,355-5,735)

0,005

14. táblázat: A LTA 252A+TNFα -308A+HSP70 1267G + RAGE -429C haplotípust hordozó nők és férfiak korra illesztett kockázata colorectalis tumor kialakulására a haplotípust nem hordozókkal szemben Csoport

Esélyhányados (95% konfidencia p-érték intervallum)

Nők

3,771 (1,302-10,927)

0,014

Férfiak

1,684 (0,612-4,633)

0,312

Összes beteg

2,490 (1,202-5,161)

0,014

5.3.3. A 8.1AH és klinikai jellemzők összefüggésének hiánya colorectalis tumoros betegekben Sem a Dukes stádiumok, sem a TNM-index, sem a grade, sem pedig a tumor elhelyezkedése tekintetében nem találtunk statisztikailag szignifikáns különbséget a 8.1AH hordozók és nem hordozók között. Érdekes módon, a 33 8.1AH-t hordozó beteg között egyben sem észleltük a sigmában elhelyezkedő tumort, míg a haplotípust nem hordozók 7.1%-ban (11/156) a tumor a sigmában helyezkedett el, bár a különbség statisztikailag nem szignifikáns (p=0,1281).

49

6. Megbeszélés 6.1.1. RAGE -429C a 8.1AH alkotó allélje Az 1-es típusú diabetes mellitusos családok körében elvégzett, MHC II és III osztályú allélek öröklődési, szegregációs vizsgálata az MHC régiók genetikája terén számos fontos jellegzetességre mutatott rá. Megerősíti, hogy az MHC régiókban akár pár ezer kilobázist is felölelő, nagy fokban konzervált haplotípusok találhatók. Megfigyeléseink alapján a 8.1AH eddig ismert és általunk vizsgált négy alkotó-allélje közül legalább három allélt tartalmazó haplotípus minden esetben kapcsoltságot mutat RAGE -429C allélel. A HLA-DQ2, HLA-DR3, RAGE -429C allélek, a monomoduláris rövid RCCX genotípus C4A gén nélkül rövid C4B génnel (mono-S) és a TNF2 allél együttes, többszöri, ismételt előfordulása 1-es típusú diabeteses családokban, az ősi MHC haplotípusoknak meggyőző és kellő erejű bizonyítéka. 82, egymással rokoni kapcsolatban nem lévő 1-es típusú diabetes mellitusos beteg és három különböző, egészséges kaukázusi csoportban elvégzett populációs vizsgálat is megerősítette a RAGE -429C allél és a 8.1AH kapcsoltságát. Mindamellett, az 1-es típusú diabetes mellitusos családokban többszörös, rekombináns MHC haplotípusok jelenlétét mutatták eredményeink. A nyolc vizsgált családban, például, HLA-DQ2 és HLA-DR3 allélt tartalmazó MHC haplotípusból 10 különbözőt találtunk. A 10 haplotípusból hét esetben (70%) volt jelen a RAGE -429C allél és a 8.1AH ismert tagjaiként mono-S RCCX és TNF2. A fennmaradó három haplotípus (vagyis 30%) a hosszú C4B gén, TNF1 és RAGE -429T allél variációja. Ezen genetikai változók dichotómikus természete arra utal, hogy legnagyobb valószínűséggel genetikai rekombináció eredményeként keletkeztek. A családokban a 8.1AH-n kívül más ősi MHC haplotípusok rekombináns variánsai is előfordultak. Mindenképp érdemes kihangsúlyozni, hogy a RAGE -429C allél gyakorisága a TNF-α 308A alléléhoz hasonló, mely a 8.1AH kaukázusi populációkbéli gyakoriságának körülbelül a fele. Autoimmun, infektív vagy gyulladásos betegségekkel kapcsolatos MHC asszociációs vizsgálatokban célszerű lenne a klasszikus I és II osztályú allélek mellett

a

centrális

MHC

III

régióban

lévő

RAGE

és

TNF-α

promóter

polimorfizmusokat, az RCCX modult és a C4 poligénes változatait is vizsgálni.

50

Az elvégzett, szisztematikus viszgálatunk az első, mely a RAGE -429C allél és 8.1AH kapcsoltságát populációs szinten bizonyítja. Eredményeink összhangban vannak Price és munkatársai megfigyelésével, akik a 8.1AH-ra nézve homozigóta 6 egyénből izolált sejtvonalon mutatták ki a RAGE -429C allél és a 8.1AH kapcsoltságát (3). Kutatócsoportunk egy másik SNP, szintén az MHC III régióban elhelyezkedő HSP70-2 gén -1267A>G polimorfizmusának vizsgálata kapcsán a HSP70-2 -1267G allél 8.1 ősi haplotípusssal való szoros kapcsoltságát írta le (102), valamint nem közölt eredmény, hogy a LTA 252G allél szintén a 8.1 ősi haplotípust alkotó allélek közé tartozik. 6.1.2. RAGE -429C összefüggése a szénhidrát anyagcserével 1-es típusú diabetes mellitusban Irodalmi adatok azt jelzik, hogy a RAGE gén polimorfizmusok leginkább a diabeteses szövődményekkel mutatnak összefüggést, de az eredmények nem minden esetben megegyezőek. Hudson és munkatársai megfigyelései szerint a RAGE -429C allél gyakorisága magasabb 2-es típusú diabeteses betegekben retinopathia esetén (55). Sem JiXiong és munkatársai nem tudták alátámasztani ezt az összefüggést kínai, 2-es típusú diabeteses betegek körében elvégzett vizsgálataik alapján (103), sem egy szintén 2-es típusú diabeteses betegeket vizsgáló szlovén tanulmány (56) nem erősítette meg a korábbi megfigyelést. 1-es típusú diabetes és RAGE promóter polimorfizmusok kapcsolatát idáig csak két tanulmány vizsgálta. Egy finn vizsgálat azt mutatta, hogy egy másik RAGE SNP ritka alléljének homozigóta változata, a RAGE -374 AA genotípus védő hatású olyan szövődmények kialakulásával szemben, mint a cardiovascularis megbetegedés és albuminuria, 1-es típusú diabeteses betegekben (57). A másik vizsgálatban a RAGE -1152 C>A polimorfizmus nephropathiával szembeni mérsékelt védő szerepét találták (58). Korábbi vizsgálataink a RAGE -429C és a RAGE -374A allél erős negatív asszociációját mutatták (nem közölt eredmények). Az általunk észlelt, RAGE -429C allél és magas HBA1C-értékek (rossz szénhidrát-anyagcsere) összefüggése alapján elmondható, hogy eredményeink összhangban vannak a finn munkacsoport által észleltekkel. Ezek a megfigyelések azt jelzik, hogy az 1-es típusú diabetes lefolyása, legalább is részben függhet a transzkripciós aktivitást fokozó RAGE promóter allélektől. Bár, érdekes módon, a magas HBA1C-értékekkel a RAGE -429C allél mellett csak a HLA-DQ2 allél mutatott összefüggést, és a 8.1AH más alkotóeleme közül (mint

51

a TNF2 allél, HLA-DR3 allél, mono-S RCCX modul) egyik sem. Ez a megfigyelés azt jelzi, hogy az összefüggés nem magyarázható a RAGE -429C allél 8.1AH-sal való szoros kapcsoltságával.

6.2. A 8.1AH szerepe cisztás fibrózisban A cisztás fibrózisos betegek körében elvégzett vizsgálat új, korábban mások által nem közölt eredményeket hozott. Ezek alapján megállapíthatjuk, hogy cisztás fibrózisos betegekben a 8.1 ősi haplotípus jelenléte összefüggést mutat a mind S. aureus, mind P. aeruginosa által okozott kolonizáció ritkább előfordulásával és jelentősen későbbi kezdetével. Érdekességként említem meg, hogy az egyetlen olyan beteg, aki a 8.1AH-ra nézve homozigóta volt, 17 éves koráig nem kolonizálódott annak ellenére, hogy CFTR genotípusa ΔF508 homozigóta. Ez azért különösen érdekes, mert a ΔF508 homozigóta betegekre igen korai, az első pár életévben kialakuló kolonizáció az általánosan jellemző. Egyetlen más, a kolonizáció kialakulásának idejével ilyen erős összefüggést mutató genetikai tényező sem ismert. De Rose és munkatársai megfigyelése szerint (104) az Fc-gamma-receptor IIA gén R/R homozigóta formája bakteriális infekció veszélye nagyobb P. aeruginosával kolonizált CF-os betegekben, mint a nem kolonizáltakban vagy egészséges kontrollokban. Az észlelt különbség azonban kevéssé szignifikáns (p = 0,042), mint a saját vizsgálatunkban a 8.1AH esetében. Eredményeink azt sugallják, hogy a 8.1AH befolyásolhatja cisztás fibrózisban a betegség lefolyását, ezért ezen haplotípus meghatározása CF-os betegekben gyakorlati, klinikai jelentőséggel bír, amennyiben segít a prognózis megbecsülésében. P. aeruginosa elleni oltás igazoltan magasabb kötődési affinitással rendelkező antitestek képződéséhez vezet, így előzve meg, vagy legalább is késleltetve a bakteriális infekció létrejöttét, mely következményesen a légzésfunkció megőrzéséhez vezet (105). A betegség patofiziológiája –a légutakban lévő sűrű nyák- miatt a CF-os betegek immunrendszere folyamatos kihívásoknak van kitéve anélkül, hogy a szó klasszikus értelmében immunkomprimáltak lennének. Ezért lehetséges, hogy az immunválasz genetikailag kódolt jellemzőinek eltérése az infekciók tekintetében detektálható különbségeket okoz.

52

Az infekciók elleni védekezésben a gazdaszervezet-patogén kölcsönhatás döntő jelentőségű. Bár nem tudunk biztos magyarázatot adni arra, hogy miért kolonizálódnak később a 8.1AH-t hordozó CF-os betegek, megfigyelésünk mégis összhangban van számos, a haplotípusról eddig közölt jellemzőkkel. A 8.1AH ismert jellemzői, mint a fokozott TNF-α termelés, a keringő immunkomplexek elégtelen kezelése, az antigén prezentáció és feldolgozás, valamint az antitesttermelés sajátosságai (3,5,106), mind befolyásolhatják

a

mikroorganizmusok

elleni

védekező

mechanizmusokat.

Megfigyelésünket megerősíti és részben kiegészíti 100 ír cisztás fibrózisos beteg körében elvégzett hasonló vizsgálat még nem közölt eredménye (Laki és munkatársai, kézirat szerkesztés alatt): a 8.1AH-t hordozó betegekben fertőzést követően jelentősen kisebb arányban alakul ki krónikus fertőzés, azaz kolonizáció (p=0,027). További érdekes és értékes megfigyelés, hogy a 8.1AH ír CF-os betegekben alacsony mortalitással mutatott szoros összefüggést (p=0.016). A 8.1AH hordozók módosult immunválasza genetikailag kódolt. A haplotípus az autoimmun betegségekre való fokozott hajlam mellett infekciókkal szemben rezisztenciát fejthet ki (5,106). MHC I és II allélek, melyek közül néhány a 8.1AH-ban is megtalálható, az antigénprezentációban és feldolgozásban betöltött különleges szerepük miatt számos esetben voltak CF módosító géneket vizsgáló tanulmányok fontos célpontjai. Ilyen feltételezett módosító gén a TNF-α is, melynek sokat vizsgált TNF2 allélje az esetek körülbelül 60%-ában a 8.1AH részeként van jelen. Így megfigyeléseink segítségével érthetővé válhat az önmagában vizsgált TNF2 allél és a cisztás

fibrózis

súlyosságának

kapcsolatáról

közölt

egymásnak

ellentmondó

eredmények lehetséges oka is (62-67). Ezek az adatok tovább erősítik annak a fontosságát, hogy az egyszeres polimorfizmusok, SNP-k helyett haplotípusokat vizsgáljunk, ha a kérdéses SNP valamely haplotípus részeként is jelen van. Ezt korábban más szerzők is javaslatként vetették fel betegség asszociációs vizsgálatok kapcsán (105,107,108). A bemutatott vizsgálat, melyben a cisztás fibrózis a bakteriális infekciókra való fokozott hajlam modelljéül szolgált, alkalmazható lehet más betegségek infekciós komplikációi, például szepszis vagy COPD esetén is.

53

6.3. A 8.1AH vizsgálata MHC III allélekkel Az 1-es típusú diabeteses betegek, 1-es típusú diabeteses családok, a magyar, ohioi és izlandi egészséges populációk, valamint cisztás fibrózisos betegek vizsgálatakor a már ismert, a 8.1AH részeként jelenlévő MHC II és III allél (HLA-DRB1*0301, HLADQB1*0201, TNF-α -308A), az MHC III régióban a mono-S-RCCX modul valamint három, a 8.1AH összefüggésében még nem vizsgált allél (RAGE -429C, HSP70-2 +1267G és LTA +252G) között rendkívül szoros kapcsoltságot észleltünk. A HLADRB1, HLA-DQB1 és az RCCX modul vizsgálatánál egyszerűbb és kevésbé költséges az SNP-k vizsgálata. Tekintve, hogy a TNF-α -308A, RAGE -429C, HSP70-2 1+267G és LTA +252G allélek egy haplotípust alkotnak, mely része a 8.1AH-nak, ezek segítségével relatíve egyszerűbben vizsgálható ez a kiterjesztett MHC haplotípus. Ezt a módszert, a 8.1 ősi haplotípus MHC III SNP-k segítségével történő meghatározását először alkalmaztam, melyet kutatócsoprtunk további munkája során sikerrel folytatott.

6.4. A 8.1AH szerepe colorectalis tumorban Eredményeink azt mutatják, hogy szignifikánsan magasabb a colorectalis tumor kialakulásának kockázata a nem hordozókkal szemben a 8.1AH hordozókban. Ez az ősi haplotípus a konzervált kiterjesztett haplotípusok közül a leggyakoribb a kaukázusi populációban. Továbbá az, aki a 8.1AH-t alkotó allélek közül hármat hordoz, nagy valószínűséggel hordozza az egész kiterjesztett haplotípust. A jelen vizsgálat eredménye, mely szerint a 8.1AH tagjaként ismert allélek kombinációjaként összeálló három vagy négy alléles haplotípust hordozók gyakorisága jelentősen magasabb volt colorectalis tumoros betegekben, azt jelzi, hogy a 8.1AH-t hordozóknak tényleg nagyobb a kockázata colorectalis tumor kialakulására. Ez a megfigyelés összhangban van Kubler és munkatársai ovarium tumoros betegekben észlelt tapasztalataival (83). A szerzők ovarium tumoros betegekben az MHC II osztályú, a 8.1AH részét képező DRB1*0301/DQA1*0501/DQB1*0201 haplotípus, frekvenciáját

szignifikánsan

magasabbnak

(20,2%)

találták,

mint

egészséges

kontrollokban (8,6%), az esélyhányados 2,12. Ez nagyon hasonló ahhoz, melyet mi észleltünk (esélyhányados: 2,514) a 8.1AH-t hordozó colorectalis tumoros betegekben. Familiáris esetekben az ovarium tumor előfordulása öröklődő nonpolyposus colorecatlis

54

tumorral kapcsolt, Lynch syndroma II típusaként ismert (109). Egy másik tanulmány szerint colorectalis tumoros betegek első fokú rokonainak nagyobb az esélye ovarium tumor kialakulására (110). Mindezt saját megfigyelésünkkel kiegészítve lehetséges, hogy a két tumornak közös genetikai hajlamosító tényezői vannak. A 8.1AH-t hordozóknak magasabb a kockázata, hogy fiatalabb korban alakuljon ki colorectalis tumoruk. Ebben a fiatalabb csoportban a haplotípust hordozók esélye a tumor kialakulására majdnem hatszoros a 8.1AH-t nem hordozókkal szemben. Ez a megfigyelés összhangban áll azzal, hogy a fiatalabb életkorban diagnosztizált colorectalis

tumor

előfordulása

esetén

a

rokonokban

nagyobb

ezen

tumor

kialakulásának a veszélye (78,111). Azoknak, akiknek első fokú rokonában 50 évesnél korábban diagnosztizáltak colorectalis tumort, ennek kialakulásának az esélye 2:3, míg abban az esetben, ha a tumort 50 évesnél idősebb korban diagnosztizálták, ez 4:6 (111). Igazolódni látszik, hogy a colorectalis tumor familáris formájának előfordulása legnagyobb részt genetikai okoknak az eredménye (112). 30 polimorfizmus vizsgálatából kiderült, hogy közülük néhány, alacsony penetranciájú allél, mely az anyagcserét, detoxikáló enzimeket, mitogén kiváltotta jelátviteli utat vagy a gyulladásos választ (TNF2) befolyásolja, fokozott kockázatot jelent colorectalis tumor kialakulására (93). Vizsgálatunk alapján hasonló genetikai tényezőnek tűnik az MHC régióban kódolt kiterjesztett haplotípus. Bár az említett munkacsoport számos MHC III osztályú allél és haplotípus tekintetében nem talált összefüggést colorectalis tumorral, magát a 8.1 ősi haplotípus előfordulását nem vizsgálták (94). Eredményeink szerint a 8.1AH nemtől függően mutatott kockázatot colorectalis tumor kialakulására. Az összefüggés nőkben erős, szignifikáns volt, de férfiakban ilyen összefüggést nem észleltünk. Érdemes megjegyezni, hogy az eddigi irodalmi adatok alapján egy összefoglaló közlemény a 8.1AH és a hosszú élet közötti pozitív kapcsolatot valószínűsíti, mely összefüggés –szintén- nemtől függő(5). Míg igen idős, nyolcvankilencven éves férfiak között magasabb arányban vannak jelen a 8.1AH-t hordozók, ilyen korcsoportú nőkben hasonló összefüggést nem észleltek. Nehéz megítélni, hogy az általunk megfigyelt, a 8.1AH nőkben colorectalis tumorral való összefüggése valamilyen mértékben hozzájárulhat-e ahhoz, hogy ezen ősi haplotípus férfiakban igen, de nőkben nem mutat összefüggést a hosszú életkorral.

55

7. Következtetések 7.1. RAGE -429C a 8.1AH alkotó allélje Vizsgálatainkkal igazoltuk, hogy az RAGE -429C allél a 8.1 ősi haplotípus egyik marker allélje. Új eredményeink segítségével hozzájárulhatunk az ősi haplotípusokról, különösen a kaukázusi populációban leggyakoribb kiterjesztett haplotípusról, a 8.1AHról alkotott ismereteink bővítéséhez. Saját megfigyelésünk, hogy a RAGE -429T>C, HSP70-2 -1267A>G és a TNF-α -308G>A polimorfizmusok és az RCCX modul meghatározásával, a 8.1 ősi haplotípussal kapcsolt allélek jelenléte esetén nagy valószínűséggel megjósolhatók a 8.1AH részét képező MHC II osztályú allélek, sőt, maga a 8.1AH is. Így az említett MHC III polimorfizmusok (RAGE -429, HSP70-2 1267 és a TNF-α -308) a 8.1 ősi haplotípust jelölő SNP-nek számítanak (113,114). 7.2. A 8.1AH vizsgálata MHC III allélekkel A RAGE -429T>C polimorfizmus RFLP módszerrel, valamint a TNF-α -308G>A polimorfizmus SSP-PCR módszerrel való vizsgálatának bevezetését követően a 8.1AH részeként azonosítottunk újabb alléleket az MHC III régióban. Ezek, vagyis a RAGE 429C, HSP70-2 1+267G és LTA +252G allélek és a már ismert 8.1AH tag, a TNF-α 308A segítségével sikerült viszonylag egyszerű és kevésbé költséges módszerrel vizsgálni a 8.1 ősi haplotípust. Ezen módszer alkalmazása meghonosodott kutatócsoportunk további munkájában. 7.3. A 8.1AH szerepe cisztás fibrózisban Bár a 8.1 ősi haplotípus immunológiai jellegzetességei közül sokat ismerünk, ilyen a többi között a magas TNF-α-szint in vitro (9,10) és in vivo (6), immunkomplexek és autoantitestek magas szintje (106) vagy a jellemzően 2-es típusú citokin profil (11,12), attól még távol vagyunk, hogy teljes részleteiben megértsük, a 8.1AH milyen mechanizmus révén hajlamosít autoimmun betegségek kialakulására. Eredményeink, a 8.1AH cisztás fibrózisban betöltött szerepével kapcsolatosan felvetett hipotézis megerősítése nagy létszámú betegcsoportban –akár több ország részvételévelszületett alátámasztó eredményekkel lehetséges. Amennyiben az itt bemutatott megfigyelések reprodukálhatók, a 8.1AH meghatározásával a CF-os betegek

56

kolonizáció szempontjából nézve alacsony és magas rizikójú csoportokra oszthatók, melynek antibiotikus, immunprofilaktikus (vakcinációs) és terápiás következményei lehetnek. Ennek segítségével pedig CF-os betegcsoportok megfelelően, az eddigieknél esetleg pontosabban stratifikálhatók immunológia, mikrobiológiai, gyógyszertani vizsgálatokban. A CF-os betegek esetén rutinszerűen alkalmazott preventív antibiotikus kúrák nem kívánt vagy toxikus mellékhatásai –rezisztens törzsek kialakulása, oto-, nephrotoxicitás- szempontjából sem közömbös a 8.1AH feltételezett védő szerepe kolonizáció kialakulásában; ha a genetikailag kódolt módosult immunválasszal rendelkező betegekben az antibiotikus prevenció nem hoz jelentős többlet előnyt, az lehetséges változásokat eredményezhet a prevenciós protokollban is. Az időben felismert és ennek megfelelően kezelt CF-os betegek bizonyíthatóan nagy előnyre tesznek szert a később, csak már kiteljesedett klinikai tünetek alapján diagnosztizált társaikhoz képest. Ez nem csak szakmailag, infekciós és egyéb szövődmények, hanem gazdaságilag, a különböző költségek terén is mérhető és igazolható (115). Emiatt számos nyugat-európai országban elkezdődött az újszülöttek CF-szűrése. Prof. Stuart Elborn, Dr. Anil Mehta és Dr. Keith Brownlee vezetésével 2009 januárjától az e módon már kiszűrt betegek mellett a brit CF központokban már gondozott britt betegek 8.1AH hordozására való szűrését tervezik, melyhez ausztrál, svéd, dán és cseh CF gondozó központok is csatlakoztak. Az igen nagyszámú beteg részvételével létrejövő retrospektív és prospektív vizsgálattal a felvetett kérdések remélhetőleg jó eséllyel, megfelelően tisztázhatók. A ΔF508 allél és a 8.1AH Európában hasonló földrajzi eloszlást mutat (45,116), mindkettő tipikusan kaukázusinak mondható. Az említett szükséges kiterjesztett vizsgálatok arra a kérdésre is választ adhatnak, hogy az evolúció során a ΔF508 allél hordozóiban szelekciós előnyt kifejtve a 8.1AH hozzájárulhatott-e a cisztás fibrózis fennmaradásához. 7.4 A 8.1AH szerepe colorectalis tumorban Colorectalis tumoros betegekben az egészséges kontrollokhoz vizsonyítva magasabb arányban volt jelen a 8.1AH, mely a kórkép kialakulásában kockázati tényzőként szerepel. A 8.1 ősi haplotípusra jellemző módosult immunválasz jellegzetességei közül, jelenlegi tudásunk szerint, kiemelhetjük a csökkent komplement-szintet, valamint a

57

TNF-α,

keringő immunkomplexek és autoantitestek magas szintjét (45,106). Ezek

mindegyike befolyásolhatja az immunválaszt a tumorsejtek felismerésében. Ismert, hogy a krónikus gyulladással járó állapotok tumor kialakulására hajlamosítanak. Az ilyen, krónikus gyulladás esetén magas a TNF-α-szint, ez a citokin pedig valószínűleg elősegíti a tumorképződést (117). Ezek az adatok is alátámasztják –és vice versacolorectalis tumoros betegek körében kapott megfigyeléseinket. Természetesen még számos vizsgálat szükséges ahhoz, hogy megértsük, a 8.1AH mily módon hajlamosít colorectalis vagy ovariumtumor (83) kialakulására. Még nem ismert, hogy a 8.1 ősi haplotípus által kódolt immunválasz pontosan melyik komponense lehet felelős azért, hogy az ilyen haplotípust hordozók között magasabb a colorectalis tumor kialakulásának esélye. Ha rájövünk, hogy melyik a „gyenge láncszem” a 8.1AH immunológiai jellegzetességei közül, közelebb kerülve a hatékony tumor ellenes védekező mechanizmusok pontos megértéséhez lehetséges, hogy hozzájárulhatunk ahhoz, hogy ezeket tovább erősíteni, fokozni is tudjuk. Ennek mélyebb megismerése a tumor ellenes terápiában, szűrésben vagy megelőzésben is hasznosítható információt adhat. Eredményeinket összefoglalva, a 8.1AH hordozóknak magasabb a kockázata colorectalis tumor kialakulására. Ezt az összefüggést erősebbnek észleltük fiatalabb korban diagnosztizált betegekben és nőkben. Gyakorlati szempontból is jelentősége lehet, ha a colorectalis tumorra pozitív családi anamnesissel rendelkező betegekben vizsgálhatnánk a 8.1AH jelenlétét. Ebben az esetben, ugyanis a betegeknek, akiknek fokozott a kockázata a tumor kialakulására, szűrővizsgálatként gyakoribb colonoscopia megfontolandó lehet. 7.5 A 8.1ősi haplotípus: kétélű kard A 8.1AH által kódolt, genetikailag meghatározott módosult immunválasz, mely hatékonyabb lehet bakteriális fertőzésekkel szemben, így előnyös cisztás fibrózisban kolonizáció kialakulásával szemben, magasabb kockázatot jelent, így hátrányos colorectalis tumor kialakulása szempontjából. Két különböző kórképben a 8.1AH a betegség lefolyása szempontjából különböző, pozitív illetve negatív összefüggést mutat. A, már említett feltételezés szerint a 8.1 ősi haplotípust hordozók pozitív szelekciós előnyt élvezhettek az evolúció során a haplotípus által kódolt, fertőzésekkel szemben hatékonyabb immunválasz miatt. Ez a szelekciós előny magyarázhatja a 8.1AH-t

58

hordozók magas arányát. Az antibiotikus érában viszont a fertőzések leküzdése már nem csupán a gazdaszervezet hatékony vagy kevésbé hatékony immunválaszán múlik – bár bizonyos esetekben ennek még mindig jelentős hatása van-, így a korábban előnyös, módosult immunválasz bizonyos tekintetben fölöslegessé válhat, mely már nem a kórokozóban, hanem magában a gazdaszervezetben tesz, tehet kárt, kedvezőtlen folyamatoknak engedve teret.

59

8.1 Összefoglalás A „konzervált, kiterjesztett haplotípus” (CEH), vagy „ősi haplotípus” (AH), ahogyan még hívják, kifejezés egy közös őstől származó, a genom igen nagymértékben konzervált szakaszaiból álló, jelentősen konzervált haplotípus blokkokat jelöl. A fő hisztokompatibilitási komplex (MHC) régiókban számos, a természetes vagy veleszületett immunválaszban fontos szerepet játszó gén található. Ezen gének variánsai, alléljei alkotnak az MHC I, II és III osztályú régiókat is érintő, néhány megabázis távolságon keresztülnyúló konzervált, kiterjesztett haplotípusokat. A 8.1AHt, a többi között, HLA-A1, HLA-B8, HLA-Cw7, TNFα -308A, TNFAB*a2b3, C2*C, Bf*S, C4A*Q0, C4B*1, HLA-DRB1*0301, HLA-DQA1*0501 és HLA-DQB1*0201 allélek alkotják. A 8.1AH hordozókra jellemző módosult ctikoin profil, magas TNF-α-, autoantitest és keringő immunkomplex-szint. Ezek a jellegzetességek magyarázhatják, hogy a 8.1AH hosszú távon „mellékhatásként” autoimmunbetegségek kialakulásához vezet. A 8.1AH ezen immunológiai sajátosságai fertőzések leküzdésében előnyösek lehetnek, emiatt a haplotípus pozitív szelekciót élvezhetett az evolúció során, mely magyarázhatja akkumulációját a kaukázusi populációban. 1. Igazoltuk, hogy a RAGE -429C allél a 8.1AH része, munkacsoportunk egy másik vizsgálatában ugyanezt találta LTA +252G és HSP70-2 +1267G allélek tekintetében is. 2. A TNF-α -308A, RAGE -429C, LTA +252G és HSP70-2 +1267G allélek segítségével egyszerűbben határozhatjuk meg a 8.1AH-t. 3. Megfigyelésünk szerint a 8.1AH késlelteti a kolonizáció kialakulását cisztás fibrózisban, valószínűleg a bakteriális infekciók elleni hatékonyabb immunválasznak köszönhetően. 4. További eredményünk a 8.1AH-t hordozók colorectalis tumorra való jelentősen magasabb kockázatát mutatta. A genetikailag kódolt módosult immunválasz fertőzésekkel szemben hatékonyabb, de tumorok kialakulásával szemben kevésbé előnyös lehet. Azok a betegség asszociációs tanulmányok, melyek SNP-kel foglalkoznak, ha az SNP valamely haplotípus részét képezi, úgy lehetséges, hogy –részben- a haplotípus hatását érzékelik, és tévesen értékelhetik az eredményeket. Ezért hangsúlyozandó SNP-k helyett a haplotípusok betegség módosító hatásának vizsgálata.

60

8.2 Summary The term ”conserved extended haplotype” or as also known ”ancestral haplotype” (AH) defines highly conserved haplotype—blocks of highly conserved genomic sequences— derived from a common remote ancestor. The main histocompatibility complex (MHC) or human leukocyte antigen (HLA) regions harbour genes -such as HLA-A, B, C, DQ, DR, heat shock proteins, complement components and cytokines like TNF-α and LT-α -that play important roles in the innate or acquired immune response. Variations, alleles of these genes make up conserved extended haplotypes in the MHC regions, extending through class I, class II and class III regions in few megabase. The so-called 8.1 AH consists of, among others, HLA-A1, HLA-B8, HLA-Cw7, TNFα -308A, C2*C, Bf*S, C4A*Q0, C4B*1, HLA-DRB1*0301, HLA-DQA1*0501 és HLA-DQB1*0201 alleles. Individuals carrying the 8.1 AH have altered cytokine profile, increased TNF-α production, high titers of autoantibodies and circulating immune complexes. These features are thought to be beneficial in response to infections and are thought to have had positive selection during evolution, thereby resulting in accumulation in the Caucasian population. However, the 8.1AH may lead to the development of autoimmune diseases as a long-term side effect. 1.We have shown RAGE -429C and in another study LTA +252G and HSP70-2 +1267G alleles to be member alleles of the 8.1AH. 2.The detection of TNF-α -308A, RAGE -429C, LTA +252G and HSP70-2 +1267G alleles may simplify the detection of the 8.1AH. 3.According to our studies carrier state of this haplotype may modify the clinical course of cystic fibrosis by delaying the onset of colonization, possibly by exerting a more efficient immune response against bacterial infections. 4.In another study we found carriers of the 8.1 AH to have a significantly higher risk for colorectal cancer than non-carriers. So the genetically encoded alteration of the immune response of 8.1AH carriers which is more efficient against infections may not be advantageous in terms of tumours. Disease association studies focusing on single alleles lose the context and detection of the effect of the complex haplotype they belong to, therefore the importance of haplotype analysis rather than determination of single alleles as modifier factors in disease association studies is to be emphasized.

61

9. Irodalomjegyzék

1

Walsh, E. C., Mather, K. A., Schaffner, S. F., Farwell, L., Daly, M. J., Patterson, N., Cullen, M., Carrington, M., Bugawan, T. L., Erlich, H., Campbell, J., Barrett, J., Miller, K., Thomson, G., Lander, E. S., and Rioux, J. D. 2003. An integrated haplotype map of the human major histocompatibility complex. Am J Hum Genet 73:580-90.

2

Gruen, J. R. and Weissman, S. M. 1997. Evolving views of the major histocompatibility complex. Blood 90:4252-65.

3

Price, P., Witt, C., Allcock, R., Sayer, D., Garlepp, M., Kok, C. C., French, M., Mallal, S., and Christiansen, F. 1999. The genetic basis for the association of the 8.1 ancestral haplotype (A1, B8, DR3) with multiple immunopathological diseases. Immunol Rev 167:257-74.

4

Yunis, E. J., Larsen, C. E., Fernandez-Vina, M., Awdeh, Z. L., Romero, T., Hansen, J. A., and Alper, C. A. 2003. Inheritable variable sizes of DNA stretches in the human MHC: conserved extended haplotypes and their fragments or blocks. Tissue Antigens 62:1-20.

5

Caruso, C., Candore, G., Colonna Romano, G., Lio, D., Bonafe, M., Valensin, S., and Franceschi, C. 2000. HLA, aging, and longevity: a critical reappraisal. Hum Immunol 61:942-9.

6

Lio, D., Candore, G., Colombo, A., Colonna Romano, G., Gervasi, F., Marino, V., Scola, L., and Caruso, C. 2001. A genetically determined high setting of TNF-alpha influences immunologic parameters of HLA-B8,DR3 positive subjects: implications for autoimmunity. Hum Immunol 62:705-13.

7

Salazar, M., Deulofeut, H., Granja, C., Deulofeut, R., Yunis, D. E., MarcusBagley, D., Awdeh, Z., Alper, C. A., and Yunis, E. J. 1995. Normal HBsAg presentation and T-cell defect in the immune response of nonresponders. Immunogenetics 41:366-74.

8

Marsh, D. G., Meyers, D. A., and Bias, W. B. 1981. The epidemiology and genetics of atopic allergy. N Engl J Med 305:1551-9.

62

9

Garcia-Merino, A., Alper, C. A., Usuku, K., Marcus-Bagley, D., Lincoln, R., Awdeh, Z., Yunis, E. J., Eisenbarth, G. S., Brink, S. J., and Hauser, S. L. 1996. Tumor necrosis factor (TNF) microsatellite haplotypes in relation to extended haplotypes,

susceptibility

to

diseases

associated

with

the

major

histocompatibility complex and TNF secretion. Hum Immunol 50:11-21. 10

Abraham, L. J., French, M. A., and Dawkins, R. L. 1993. Polymorphic MHC ancestral haplotypes affect the activity of tumour necrosis factor-alpha. Clin Exp Immunol 92:14-8.

11

Candore, G., Colucci, A. T., Modica, M. A., and Caruso, C. 1991. HLA-B8,DR3 T cell impairment is completely restored by in vitro treatment with interleukin-2. Immunopharmacol Immunotoxicol 13:551-61.

12

Caruso, C., Candore, G., Colucci, A. T., Cigna, D., Modica, M. A., Tantillo, G., and Salerno, A. 1993. Natural killer and lymphokine-activated killer activity in HLA-B8,DR3-positive subjects. Hum Immunol 38:226-30.

13

Dawkins, R., Leelayuwat, C., Gaudieri, S., Tay, G., Hui, J., Cattley, S., Martinez, P., and Kulski, J. 1999. Genomics of the major histocompatibility complex: haplotypes, duplication, retroviruses and disease. Immunol Rev 167:275-304.

14

Betterle, C., Scalici, C., Presotto, F., Pedini, B., Moro, L., Rigon, F., and Mantero, F. 1988. The natural history of adrenal function in autoimmune patients with adrenal autoantibodies. J Endocrinol 117:467-75.

15

Saunders, J. B., Wodak, A. D., Haines, A., Powell-Jackson, P. R., Portmann, B., Davis, M., and Williams, R. 1982. Accelerated development of alcoholic cirrhosis in patients with HLA-B8. Lancet 1:1381-4.

16

Julkunen, H., Siren, M. K., Kaaja, R., Kurki, P., Friman, C., and Koskimies, S. 1995. Maternal HLA antigens and antibodies to SS-A/Ro and SS-B/La. Comparison with systemic lupus erythematosus and primary Sjogren's syndrome. Br J Rheumatol 34:901-7.

17

Lohr, H. F. 2002. [Autoimmune hepatitis and overlap syndrome: therapy]. Schweiz Rundsch Med Prax 91:1347-51.

18

Skanes, V. M., Barnard, J., Farid, N., Marshall, W. H., Murphy, L., Rideout, D., Taylor, R., Xidos, G., and Larsen, B. 1986. Class III alleles and high-risk MHC

63

haplotypes in type I diabetes mellitus, Graves' disease and Hashimoto's thyroiditis. Mol Biol Med 3:143-57. 19

Baldini, M., Pappalettera, M., Lecchi, L., Orsatti, A., Meroni, L., Tozzi, R., Scalamogna, M., and Cantalamessa, L. 1995. Human lymphocyte antigens in Graves' disease: correlation with persistent course of disease. Am J Med Sci 309:43-8.

20

Wilson, A. G., Clay, F. E., Crane, A. M., Cork, M. J., and Duff, G. W. 1995. Comparative genetic association of human leukocyte antigen class II and tumor necrosis factor-alpha with dermatitis herpetiformis. J Invest Dermatol 104:8568.

21

Otley, C. and Hall, R. P., 3rd. 1990. Dermatitis herpetiformis. Dermatol Clin 8:759-69.

22

O'Hanlon, T. P., Carrick, D. M., Arnett, F. C., Reveille, J. D., Carrington, M., Gao, X., Oddis, C. V., Morel, P. A., Malley, J. D., Malley, K., Dreyfuss, J., Shamim, E. A., Rider, L. G., Chanock, S. J., Foster, C. B., Bunch, T., Plotz, P. H., Love, L. A., and Miller, F. W. 2005. Immunogenetic risk and protective factors for the idiopathic inflammatory myopathies: distinct HLA-A, -B, -Cw, DRB1 and -DQA1 allelic profiles and motifs define clinicopathologic groups in caucasians. Medicine (Baltimore) 84:338-49.

23

Chinoy, H., Salway, F., John, S., Fertig, N., Tait, B. D., Oddis, C. V., Ollier, W. E., and Cooper, R. G. 2007. Tumour necrosis factor-alpha single nucleotide polymorphisms are not independent of HLA class I in UK Caucasians with adult onset idiopathic inflammatory myopathies. Rheumatology (Oxford) 46:1411-6.

24

Fust, G., Arason, G. J., Kramer, J., Szalai, C., Duba, J., Yang, Y., Chung, E. K., Zhou, B., Blanchong, C. A., Lokki, M. L., Bodvarsson, S., Prohaszka, Z., Karadi, I., Vatay, A., Kovacs, M., Romics, L., Thorgeirsson, G., and Yu, C. Y. 2004. Genetic basis of tobacco smoking: strong association of a specific major histocompatibility complex haplotype on chromosome 6 with smoking behavior. Int Immunol 16:1507-14.

25

Caruso, C., Candore, G., Colucci, A. T., Cigna, D., Sammartano, F., and Ammatuna, P. 1993. HLA-B8,DR3 phenotype and the antibody response against Epstein-Barr virus. Immunol Invest 22:41-51.

64

26

Rittner, C., Sennekamp, J., Mollenhauer, E., Rosinger, N., Niese, D., Luttkenhorst, M., Baur, M. P., and Stroehmann, I. 1983. Pigeon breeder's lung: association with HLA-DR 3. Tissue Antigens 21:374-9.

27

Hall, M. A., Lanchbury, J. S., and Ciclitira, P. J. 1996. HLA class II region genes and susceptibility to dermatitis herpetiformis: DPB1 and TAP2 associations are secondary to those of the DQ subregion. Eur J Immunogenet 23:285-96.

28

Volanakis, J. E., Zhu, Z. B., Schaffer, F. M., Macon, K. J., Palermos, J., Barger, B. O., Go, R., Campbell, R. D., Schroeder, H. W., Jr., and Cooper, M. D. 1992. Major histocompatibility complex class III genes and susceptibility to immunoglobulin A deficiency and common variable immunodeficiency. J Clin Invest 89:1914-22.

29

Lenzi, M., Frisoni, M., Mantovani, V., Ricci, P., Muratori, L., Francesconi, R., Cuccia, M., Ferri, S., and Bianchi, F. B. 1998. Haplotype HLA-B8-DR3 confers susceptibility to hepatitis C virus-related mixed cryoglobulinemia. Blood 91:2062-6.

30

Alper, C. A., Kruskall, M. S., Marcus-Bagley, D., Craven, D. E., Katz, A. J., Brink, S. J., Dienstag, J. L., Awdeh, Z., and Yunis, E. J. 1989. Genetic prediction of nonresponse to hepatitis B vaccine. N Engl J Med 321:708-12.

31

Cameron, P. U., Mallal, S. A., French, M. A., and Dawkins, R. L. 1990. Major histocompatibility complex genes influence the outcome of HIV infection. Ancestral haplotypes with C4 null alleles explain diverse HLA associations. Hum Immunol 29:282-95.

32

Cameron, P. U., Mallal, S. A., French, M. A. H., and Dawkins, R. L. 1992. Central MHC genes between HLA-B and complement C4 confer risk for HIV-1 disease progression. Oxford University Press, New York.

33

Keet, I. P., Klein, M. R., Just, J. J., and Kaslow, R. A. 1996. The role of host genetics in the natural history of HIV-1 infection: the needles in the haystack. Aids 10 Suppl A:S59-67.

34

Proust, J., Moulias, R., Fumeron, F., Bekkhoucha, F., Busson, M., Schmid, M., and Hors, J. 1982. HLA and longevity. Tissue Antigens 19:168-73.

65

35

Degli-Esposti, M. A., Andreas, A., Christiansen, F. T., Schalke, B., Albert, E., and Dawkins, R. L. 1992. An approach to the localization of the susceptibility genes for generalized myasthenia gravis by mapping recombinant ancestral haplotypes. Immunogenetics 35:355-64.

36

Garlepp, M. J. 1993. Immunogenetics of inflammatory myopathies. Baillieres Clin Neurol 2:579-97.

37

Donaldson, P. T. 2004. Genetics of liver disease: immunogenetics and disease pathogenesis. Gut 53:599-608.

38

Worthington, J., Cullen, S., and Chapman, R. 2005. Immunopathogenesis of primary sclerosing cholangitis. Clin Rev Allergy Immunol 28:93-103.

39

Olenchock, S. A., Heise, E. R., Marx, J. J., Jr., Mentnech, M. S., Mull, J. C., Spurgeon, D. E., Hancock, J. S., Elliott, J. A., Pearson, D. J., Price, C. D., and Major, P. C. 1981. HLA-B8 in sarcoidosis. Ann Allergy 47:151-3.

40

Kallenberg, C. G., Van der Voort-Beelen, J. M., D'Amaro, J., and The, T. H. 1981. Increased frequency of B8/DR3 in scleroderma and association of the haplotype with impaired cellular immune response. Clin Exp Immunol 43:47885.

41

Anaya, J. M., Delgado-Vega, A. M., and Castiblanco, J. 2006. Genetic basis of Sjogren's syndrome. How strong is the evidence? Clin Dev Immunol 13:209-22.

42

Christiansen, F. T., Zhang, W. J., Griffiths, M., Mallal, S. A., and Dawkins, R. L. 1991. Major histocompatibility complex (MHC) complement deficiency, ancestral haplotypes and systemic lupus erythematosus (SLE): C4 deficiency explains some but not all of the influence of the MHC. J Rheumatol 18:1350-8.

43

Smerdel-Ramoya, A., Finholt, C., Lilleby, V., Gilboe, I. M., Harbo, H. F., Maslinski, S., Forre, O., Thorsby, E., and Lie, B. A. 2005. Systemic lupus erythematosus and the extended major histocompatibility complex--evidence for several predisposing loci. Rheumatology (Oxford) 44:1368-73.

44

Hanifi Moghaddam, P., de Knijf, P., Roep, B. O., Van der Auwera, B., Naipal, A., Gorus, F., Schuit, F., and Giphart, M. J. 1998. Genetic structure of IDDM1: two separate regions in the major histocompatibility complex contribute to susceptibility or protection. Belgian Diabetes Registry. Diabetes 47:263-9.

66

45

Candore, G., Lio, D., Colonna Romano, G., and Caruso, C. 2002. Pathogenesis of autoimmune diseases associated with 8.1 ancestral haplotype: effect of multiple gene interactions. Autoimmun Rev 1:29-35.

46

Bucciarelli, L. G., Wendt, T., Qu, W., Lu, Y., Lalla, E., Rong, L. L., Goova, M. T., Moser, B., Kislinger, T., Lee, D. C., Kashyap, Y., Stern, D. M., and Schmidt, A. M. 2002. RAGE blockade stabilizes established atherosclerosis in diabetic apolipoprotein E-null mice. Circulation 106:2827-35.

47

Bierhaus, A., Schiekofer, S., Schwaninger, M., Andrassy, M., Humpert, P. M., Chen, J., Hong, M., Luther, T., Henle, T., Kloting, I., Morcos, M., Hofmann, M., Tritschler, H., Weigle, B., Kasper, M., Smith, M., Perry, G., Schmidt, A. M., Stern, D. M., Haring, H. U., Schleicher, E., and Nawroth, P. P. 2001. Diabetesassociated sustained activation of the transcription factor nuclear factor-kappaB. Diabetes 50:2792-808.

48

Lander, H. M., Tauras, J. M., Ogiste, J. S., Hori, O., Moss, R. A., and Schmidt, A. M. 1997. Activation of the receptor for advanced glycation end products triggers a p21(ras)-dependent mitogen-activated protein kinase pathway regulated by oxidant stress. J Biol Chem 272:17810-4.

49

Yeh, C. H., Sturgis, L., Haidacher, J., Zhang, X. N., Sherwood, S. J., Bjercke, R. J., Juhasz, O., Crow, M. T., Tilton, R. G., and Denner, L. 2001. Requirement for p38 and p44/p42 mitogen-activated protein kinases in RAGE-mediated nuclear factor-kappaB transcriptional activation and cytokine secretion. Diabetes 50:1495-504.

50

Bucciarelli, L. G., Wendt, T., Rong, L., Lalla, E., Hofmann, M. A., Goova, M. T., Taguchi, A., Yan, S. F., Yan, S. D., Stern, D. M., and Schmidt, A. M. 2002. RAGE is a multiligand receptor of the immunoglobulin superfamily: implications for homeostasis and chronic disease. Cell Mol Life Sci 59:1117-28.

51

Gleeson, M. H., Walker, J. S., Wentzel, J., Chapman, J. A., and Harris, R. 1972. Human leucocyte antigens in Crohn's disease and ulcerative colitis. Gut 13:43840.

52

van den Berg-Loonen, E. M., Dekker-Saeys, B. J., Meuwissen, S. G., Nijenhuis, L. E., and Engelfriet, C. P. 1977. Histocompatibility antigens and other genetic

67

markers in ankylosing spondylitis and inflammatory bowel diseases. J Immunogenet 4:167-75. 53

Franciotta, D., Cuccia, M., Dondi, E., Piccolo, G., and Cosi, V. 2001. Polymorphic markers in MHC class II/III region: a study on Italian patients with myasthenia gravis. J Neurol Sci 190:11-6.

54

Carroll, M. C. 1998. The role of complement and complement receptors in induction and regulation of immunity. Annu Rev Immunol 16:545-68.

55

Hudson, B. I., Stickland, M. H., Futers, T. S., and Grant, P. J. 2001. Effects of novel polymorphisms in the RAGE gene on transcriptional regulation and their association with diabetic retinopathy. Diabetes 50:1505-11.

56

Globocnik Petrovic, M., Steblovnik, K., Peterlin, B., and Petrovic, D. 2003. The - 429 T/C and - 374 T/A gene polymorphisms of the receptor of advanced glycation end products gene are not risk factors for diabetic retinopathy in Caucasians with type 2 diabetes. Klin Monatsbl Augenheilkd 220:873-6.

57

Pettersson-Fernholm, K., Forsblom, C., Hudson, B. I., Perola, M., Grant, P. J., and Groop, P. H. 2003. The functional -374 T/A RAGE gene polymorphism is associated with proteinuria and cardiovascular disease in type 1 diabetic patients. Diabetes 52:891-4.

58

Poirier, O., Nicaud, V., Vionnet, N., Raoux, S., Tarnow, L., Vlassara, H., Parving, H. H., and Cambien, F. 2001. Polymorphism screening of four genes encoding advanced glycation end-product putative receptors. Association study with nephropathy in type 1 diabetic patients. Diabetes 50:1214-8.

59

Kankova, K., Stejskalova, A., Hertlova, M., and Znojil, V. 2005. Haplotype analysis of the RAGE gene: identification of a haplotype marker for diabetic nephropathy in type 2 diabetes mellitus. Nephrol Dial Transplant 20:1093-102.

60

Ratjen, F. and Doring, G. 2003. Cystic fibrosis. Lancet 361:681-9.

61

Koch, C. and Hoiby, N. 1993. Pathogenesis of cystic fibrosis. Lancet 341:10659.

62

Davies, J. C., Griesenbach, U., and Alton, E. 2005. Modifier genes in cystic fibrosis. Pediatr Pulmonol 39:383-91.

63

Acton, J. D. and Wilmott, R. W. 2001. Phenotype of CF and the effects of possible modifier genes. Paediatr Respir Rev 2:332-9.

68

64

Lester, L. A., Kraut, J., Lloyd-Still, J., Karrison, T., Mott, C., Billstrand, C., Lemke, A., and Ober, C. 1994. Delta F508 genotype does not predict disease severity in an ethnically diverse cystic fibrosis population. Pediatrics 93:114-8.

65

Hull, J. and Thomson, A. H. 1998. Contribution of genetic factors other than CFTR to disease severity in cystic fibrosis. Thorax 53:1018-21.

66

Yarden, J., Radojkovic, D., De Boeck, K., Macek, M., Jr., Zemkova, D., Vavrova, V., Vlietinck, R., Cassiman, J. J., and Cuppens, H. 2005. Association of tumour necrosis factor alpha variants with the CF pulmonary phenotype. Thorax 60:320-5.

67

Arkwright, P. D., Pravica, V., Geraghty, P. J., Super, M., Webb, A. K., Schwarz, M., and Hutchinson, I. V. 2003. End-organ dysfunction in cystic fibrosis: association with angiotensin I converting enzyme and cytokine gene polymorphisms. Am J Respir Crit Care Med 167:384-9.

68

1993. Correlation between genotype and phenotype in patients with cystic fibrosis. The Cystic Fibrosis Genotype-Phenotype Consortium. N Engl J Med 329:1308-13.

69

Burke, W., Aitken, M. L., Chen, S. H., and Scott, C. R. 1992. Variable severity of pulmonary disease in adults with identical cystic fibrosis mutations. Chest 102:506-9.

70

Arkwright, P. D., Laurie, S., Super, M., Pravica, V., Schwarz, M. J., Webb, A. K., and Hutchinson, I. V. 2000. TGF-beta(1) genotype and accelerated decline in lung function of patients with cystic fibrosis. Thorax 55:459-62.

71

Garred, P., Pressler, T., Madsen, H. O., Frederiksen, B., Svejgaard, A., Hoiby, N., Schwartz, M., and Koch, C. 1999. Association of mannose-binding lectin gene heterogeneity with severity of lung disease and survival in cystic fibrosis. J Clin Invest 104:431-7.

72

Gabolde, M., Guilloud-Bataille, M., Feingold, J., and Besmond, C. 1999. Association of variant alleles of mannose binding lectin with severity of pulmonary disease in cystic fibrosis: cohort study. BMJ 319:1166-7.

73

Texereau, J., Marullo, S., Hubert, D., Coste, J., Dusser, D. J., Dall'Ava-Santucci, J., and Dinh-Xuan, A. T. 2004. Nitric oxide synthase 1 as a potential modifier

69

gene of decline in lung function in patients with cystic fibrosis. Thorax 59:1568. 74

Aron, Y., Polla, B. S., Bienvenu, T., Dall'ava, J., Dusser, D., and Hubert, D. 1999. HLA class II polymorphism in cystic fibrosis. A possible modifier of pulmonary phenotype. Am J Respir Crit Care Med 159:1464-8.

75

Duthie, A., Doherty, D. G., Donaldson, P. T., Scott-Jupp, R., Tanner, M. S., Eddleston, A. L., and Mowat, A. P. 1995. The major histocompatibility complex influences the development of chronic liver disease in male children and young adults with cystic fibrosis. J Hepatol 23:532-7.

76

Rubin, B. K. 1990. Exposure of children with cystic fibrosis to environmental tobacco smoke. N Engl J Med 323:782-8.

77

László Lakatos, P. L. L. 2005. A colorectalis daganatok korszerű kezelése. Lege Artis Medicinae 15:177-86.

78

Turnbull, C. and Hodgson, S. 2005. Genetic predisposition to cancer. Clin Med 5:491-8.

79

Mestiri, S., Bouaouina, N., Ahmed, S. B., Khedhaier, A., Jrad, B. B., Remadi, S., and Chouchane, L. 2001. Genetic variation in the tumor necrosis factor-alpha promoter region and in the stress protein hsp70-2: susceptibility and prognostic implications in breast carcinoma. Cancer 91:672-8.

80

de Jong, M. M., Nolte, I. M., de Vries, E. G., Schaapveld, M., Kleibeuker, J. H., Oosterom, E., Oosterwijk, J. C., van der Hout, A. H., van der Steege, G., Bruinenberg, M., Boezen, H. M., Te Meerman, G. J., and van der Graaf, W. T. 2003. The HLA class III subregion is responsible for an increased breast cancer risk. Hum Mol Genet 12:2311-9.

81

Gopalkrishnan, L., Patil, S., Chhaya, S., Badwe, R., and Joshi, N. 2006. HLA alleles in pre-menopausal breast cancer patients from western India. Indian J Med Res 124:305-12.

82

Lavado, R., Benavides, M., Villar, E., Ales, I., Alonso, A., and Caballero, A. 2005. The HLA-B7 allele confers susceptibility to breast cancer in Spanish women. Immunol Lett 101:223-5.

70

83

Kubler, K., Arndt, P. F., Wardelmann, E., Krebs, D., Kuhn, W., and van der Ven, K. 2006. HLA-class II haplotype associations with ovarian cancer. Int J Cancer 119:2980-5.

84

Dao, D. D., Sierra-Torres, C. H., Robazetti, S. C., de Gomez, M. N., Konig, R., Lema, C., Lester, L. J., Au, W. W., and Tyring, S. K. 2005. HLA-DQB1 and cervical cancer in Venezuelan women. Gynecol Oncol 96:349-54.

85

Yang, Y. C., Chang, T. Y., Lee, Y. J., Su, T. H., Dang, C. W., Wu, C. C., Liu, H. F., Chu, C. C., and Lin, M. 2006. HLA-DRB1 alleles and cervical squamous cell carcinoma: experimental study and meta-analysis. Hum Immunol 67:331-40.

86

Lema, C., Fuessel-Haws, A. L., Lewis, L. R., Rady, P. L., Lee, P., TurbatHerrera, E. A., He, Q., Nguyen, L. T., Tyring, S. K., and Dao, D. D. 2006. Association between HLA-DQB1 and cervical dysplasia in Vietnamese women. Int J Gynecol Cancer 16:1269-77.

87

Watanabe, Y., Aoyama, N., Sakai, T., Shirasaka, D., Maekawa, S., Kuroda, K., Wambura, C., Tamura, T., Nose, Y., and Kasuga, M. 2006. HLA-DQB1 locus and gastric cancer in Helicobacter pylori infection. J Gastroenterol Hepatol 21:420-4.

88

Fensterle, J., Trefzer, U., Berger, T., Andersen, M. H., Ugurel, S., and Becker, J. C. 2006. HLA-B8 association with late-stage melanoma--an immunological lesson? BMC Med 4:5.

89

Dorak, M. T., Yee, L. J., Tang, J., Shao, W., Lobashevsky, E. S., Jacobson, L. P., and Kaslow, R. A. 2005. HLA-B, -DRB1/3/4/5, and -DQB1 gene polymorphisms in human immunodeficiency virus-related Kaposi's sarcoma. J Med Virol 76:302-10.

90

Koskinen, W. J., Partanen, J., Vaheri, A., and Aaltonen, L. M. 2006. HLADRB1, -DQB1 alleles in head and neck carcinoma patients. Tissue Antigens 67:237-40.

91

Chhaya, S. U. 2006. Human leukocyte antigens in Indian patients with chronic myeloid leukemia. Leuk Lymphoma 47:291-5.

92

Meijers-Heijboer, H., Wijnen, J., Vasen, H., Wasielewski, M., Wagner, A., Hollestelle, A., Elstrodt, F., van den Bos, R., de Snoo, A., Fat, G. T., Brekelmans, C., Jagmohan, S., Franken, P., Verkuijlen, P., van den Ouweland,

71

A., Chapman, P., Tops, C., Moslein, G., Burn, J., Lynch, H., Klijn, J., Fodde, R., and Schutte, M. 2003. The CHEK2 1100delC mutation identifies families with a hereditary breast and colorectal cancer phenotype. Am J Hum Genet 72:1308-14. 93

de Jong, M. M., Nolte, I. M., te Meerman, G. J., van der Graaf, W. T., de Vries, E. G., Sijmons, R. H., Hofstra, R. M., and Kleibeuker, J. H. 2002. Lowpenetrance genes and their involvement in colorectal cancer susceptibility. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 11:1332-52.

94

de Jong, M. M., Niens, M., Nolte, I. M., te Meerman, G. J., van der Graaf, W. T., Mulder, M. J., van der Steege, G., Bruinenberg, M., Schaapveld, M., Sijmons, R. H., Hofstra, R. M., de Vries, E. G., and Kleibeuker, J. H. 2005. The human leukocyte antigen region and colorectal cancer risk. Dis Colon Rectum 48:303-6.

95

Miller, S. A., Dykes, D. D., and Polesky, H. F. 1988. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res 16:1215.

96

Day, C. P., Grove, J., Daly, A. K., Stewart, M. W., Avery, P. J., and Walker, M. 1998. Tumour necrosis factor-alpha gene promoter polymorphism and decreased insulin resistance. Diabetologia 41:430-4.

97

Ahmad, T., Armuzzi, A., Neville, M., Bunce, M., Ling, K. L., Welsh, K. I., Marshall, S. E., and Jewell, D. P. 2003. The contribution of human leucocyte antigen complex genes to disease phenotype in ulcerative colitis. Tissue Antigens 62:527-35.

98

Vargas-Alarcon, G., Londono, J. D., Hernandez-Pacheco, G., Gamboa, R., Castillo, E., Pacheco-Tena, C., Cardiel, M. H., Granados, J., and Burgos-Vargas, R. 2002. Heat shock protein 70 gene polymorphisms in Mexican patients with spondyloarthropathies. Ann Rheum Dis 61:48-51.

99

Schroeder, S., Reck, M., Hoeft, A., and Stuber, F. 1999. Analysis of two human leukocyte antigen-linked polymorphic heat shock protein 70 genes in patients with severe sepsis. Crit Care Med 27:1265-70.

100

Blanchong, C. A., Zhou, B., Rupert, K. L., Chung, E. K., Jones, K. N., Sotos, J. F., Zipf, W. B., Rennebohm, R. M., and Yung Yu, C. 2000. Deficiencies of human complement component C4A and C4B and heterozygosity in length

72

variants of RP-C4-CYP21-TNX (RCCX) modules in caucasians. The load of RCCX genetic diversity on major histocompatibility complex-associated disease. J Exp Med 191:2183-96. 101

Seidemann, K., Zimmermann, M., Book, M., Meyer, U., Burkhardt, B., Welte, K., Reiter, A., and Stanulla, M. 2005. Tumor necrosis factor and lymphotoxin alfa genetic polymorphisms and outcome in pediatric patients with nonHodgkin's lymphoma: results from Berlin-Frankfurt-Munster Trial NHL-BFM 95. J Clin Oncol 23:8414-21.

102

Kiszel, P., Kovacs, M., Szalai, C., Yang, Y., Pozsonyi, E., Blasko, B., Laki, J., Prohaszka, Z., Fazakas, A., Panczel, P., Hosszufalusi, N., Rajczy, K., Wu, Y. L., Chung, E. K., Zhou, B., Blanchong, C. A., Vatay, A., Yu, C. Y., and Fust, G. 2007. Frequency of carriers of 8.1 ancestral haplotype and its fragments in two Caucasian populations. Immunol Invest 36:307-19.

103

JiXiong, X., BiLin, X., MingGong, Y., and ShuQin, L. 2003. -429T/C and 374T/A polymorphisms of RAGE gene promoter are not associated with diabetic retinopathy in Chinese patients with type 2 diabetes. Diabetes Care 26:2696-7.

104

De Rose, V., Arduino, C., Cappello, N., Piana, R., Salmin, P., Bardessono, M., Goia, M., Padoan, R., Bignamini, E., Costantini, D., Pizzamiglio, G., Bennato, V., Colombo, C., Giunta, A., and Piazza, A. 2005. Fcgamma receptor IIA genotype and susceptibility to P. aeruginosa infection in patients with cystic fibrosis. Eur J Hum Genet 13:96-101.

105

Lang, A. B., Horn, M. P., Imboden, M. A., and Zuercher, A. W. 2004. Prophylaxis and therapy of Pseudomonas aeruginosa infection in cystic fibrosis and immunocompromised patients. Vaccine 22 Suppl 1:S44-8.

106

Candore, G., Modica, M. A., Lio, D., Colonna-Romano, G., Listi, F., Grimaldi, M. P., Russo, M., Triolo, G., Accardo-Palumbo, A., Cuccia, M. C., and Caruso, C. 2003. Pathogenesis of autoimmune diseases associated with 8.1 ancestral haplotype: a genetically determined defect of C4 influences immunological parameters of healthy carriers of the haplotype. Biomed Pharmacother 57:274-7.

73

107

Degli-Esposti, M. A., Leaver, A. L., Christiansen, F. T., Witt, C. S., Abraham, L. J., and Dawkins, R. L. 1992. Ancestral haplotypes: conserved population MHC haplotypes. Hum Immunol 34:242-52.

108

Slieker, M. G., Sanders, E. A., Rijkers, G. T., Ruven, H. J., and van der Ent, C. K. 2005. Disease modifying genes in cystic fibrosis. J Cyst Fibros 4 Suppl 2:713.

109

Lynch, H. T., Albano, W. A., Lynch, J. F., Lynch, P. M., and Campbell, A. 1982. Surveillance and management of patients at high genetic risk for ovarian carcinoma. Obstet Gynecol 59:589-96.

110

Tung, K. H., Goodman, M. T., Wu, A. H., McDuffie, K., Wilkens, L. R., Nomura, A. M., and Kolonel, L. N. 2004. Aggregation of ovarian cancer with breast, ovarian, colorectal, and prostate cancer in first-degree relatives. Am J Epidemiol 159:750-8.

111

de Jong, A. E. and Vasen, H. F. 2006. The frequency of a positive family history for colorectal cancer: a population-based study in the Netherlands. Neth J Med 64:367-70.

112

Hemminki, K. and Chen, B. 2004. Familial risk for colorectal cancers are mainly due to heritable causes. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev 13:1253-6.

113

Miretti, M. M., Walsh, E. C., Ke, X., Delgado, M., Griffiths, M., Hunt, S., Morrison, J., Whittaker, P., Lander, E. S., Cardon, L. R., Bentley, D. R., Rioux, J. D., Beck, S., and Deloukas, P. 2005. A high-resolution linkage-disequilibrium map of the human major histocompatibility complex and first generation of tag single-nucleotide polymorphisms. Am J Hum Genet 76:634-46.

114

Daly, M. J., Rioux, J. D., Schaffner, S. F., Hudson, T. J., and Lander, E. S. 2001. High-resolution haplotype structure in the human genome. Nat Genet 29:229-32.

115

Sims, E. J., McCormick, J., Mehta, G., and Mehta, A. 2005. Neonatal screening for cystic fibrosis is beneficial even in the context of modern treatment. J Pediatr 147:S42-6.

116

Bobadilla, J. L., Macek, M., Jr., Fine, J. P., and Farrell, P. M. 2002. Cystic fibrosis: a worldwide analysis of CFTR mutations--correlation with incidence data and application to screening. Hum Mutat 19:575-606.

74

117

Yan, B., Wang, H., Rabbani, Z. N., Zhao, Y., Li, W., Yuan, Y., Li, F., Dewhirst, M. W., and Li, C. Y. 2006. Tumor necrosis factor-alpha is a potent endogenous mutagen that promotes cellular transformation. Cancer Res 66:11565-70.

75

10.1. Saját publikációk jegyzéke –az értekezéshez csatolt közlemények 1. Laki J, Kiszel P, Vatay Á, Kovács M, Körner A, Madácsy L, Blatniczky L, Almássy Z, Szalai Cs, Rajczy K, Pozsonyi É, Karádi I, Fazakas Á, Hosszúfalusi N, Pánczél P, Arason G J, Wu YL, Zhou B, Yang Y, Yu CY, Füst G. The HLA 8.1 ancestral haplotype is strongly linked to the C allele of -429T>C promoter polymorphism of receptor of the advanced glycation endproduct gene. Mol Immunol. 2007 Jan;44(4):648-55. 2. Laki J, Laki I, Németh K, Újhelyi R, Bede O, Endreffy E, Bolbás K, Gyurkovits K, Csiszér E, Sólyom E, Dobra G, Halász A, Pozsonyi É, Rajczy K, Prohászka Z, Fekete G, Füst G. The 8.1 ancestral MHC haplotype is associated with delayed onset of colonization in cystic fibrosis. Int Immunol. 2006 Nov;18(11):1585-90.

76

10.2. Saját publikációk jegyzéke –az értekezéshez nem csatolt közlemények

3. Varga L, Széplaki G, Laki J, Kocsis A, Kristóf K, Gál P, Bajtay Z, Wieslander J, Daha MR, Garred P, Madsen HO, Füst G, Farkas H. Depressed activation of the lectin pathway of complement in hereditary angioedema. Clin Exp Immunol. 2008 Jul;153(1):68-74. Epub 2008 May 5. 4. Jakab L* and Laki J*, Sallai K, Temesszentandrási G, Pozsonyi T Kalabay L, Varga L, Gombos T, Blaskó B, Bíró A., Madsen HO, Radics, J, Gergely P, Füst G, Czirják L, Garred P, Fekete B. Association between early onset and organ manifestations of systemic lupus erythematosus (SLE) and a down regulating promoter polymorphism in the MBL2 gene. Clinical Immunology 2007 Oct 15. 5. Széplaki G, Varga L, Laki J, Dósa E, Rugonfalvi-Kiss S, Madsen HO, Prohászka Z, Kocsis A, Gál P, Szabó A, Acsády G, Karádi I, Selmeci L, Garred P, Füst G, Entz L. Low C1-Inhibitor Levels Predict Early Restenosis After Eversion Carotid Endarterectomy. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007 Oct 4. 6. Szabó A, Laki J, Madsen HO, Dósa E, Prohászka Z, Rugonfalvi-Kiss S, Kókai M, Acsádi G, Karádi I, Entz L, Selmeci L, Romics L, Füst G, Garred P, Cervenak L. Early rise in serum VEGF and PDGF levels predisposes patients with a normal MBL2 genotype to restenosis after eversion endarterectomy. Stroke. 2007 Aug;38(8):2247-53. 7. Kiszel P, Kovács M, Szalai C, Yang Y, Pozsonyi E, Blaskó B, Laki J, Prohászka Z, Fazakas A, Pánczél P, Hosszúfalusi N, Rajczy K, Wu YL, Chung EK, Zhou B, Blanchong CA, Vatay A, Yu CY, Füst G. Frequency of carriers of 8.1 ancestral haplotype and its fragments in two Caucasian populations. Immunol Invest. 2007;36(3):307-19.

77

8. Tóth ÉK, Kocsis J, Madaras B, Bíró A, Pocsai Z, Fust G, Blaskó B, Karádi I, Ádány R, Laki J. The 8.1 ancestral MHC haplotype is strongly associated with colorectal cancer risk. Int J Cancer. 2007 Jun 26;121(8):1744-1748. 9. Széplaki G, Varga L, Laki J, Dósa E, Madsen HO, Prohászka Z, Szabó A, Acsády G, Selmeci L, Garred P, Füst G, Entz L. Elevated complement C3 is associated with early restenosis after eversion carotid endarterectomy. Thromb Haemost. 2006 Oct;96(4):529-34. 10. Harcos P, Laki J, Kiszel P, Széplaki Z, Szolnoki Z, Kovács M, Melegh B, Széplaki G, Füst G, Blaskó B. Decreased frequency of the TNF2 allele of TNFα -308 promoter polymorphism is associated with lacunar infarction. Cytokine. 2006 Feb 9. 11. Rugonfalvi-Kiss S, Dosa E, Madsen HO, Endresz V, Prohászka Z, Laki J, Karádi I, Gonczol E, Selmeci L, Romics L, Fust G, Entz L, Garred P. High rate of early restenosis after carotid eversion endarterectomy in homozygous carriers of the normal mannose-binding lectin genotype. Stroke. 2005 May; 36(5):944-8.

78

12. Köszönetnyilvánítás Köszönettel tartozom témavezetőmnek, Füst György Professzor Úrnak a sok segítségért, a Semmelweis Egyetem III. sz. Belgyógyászati Klinika Kutató Laboratóriumában dolgozó többi témavezetőnek: Dr. Prohászka Zoltánnak, Dr. Cervenak Lászlónak, Dr. Varga Liliannak, Dr. Farkas Henriettnek; számos közös munkában nyújtott segítségért kollégáimnak: Dr. Vatay Ágnesnek, Dr. Bíró Adriennek, Dr. Széplaki Gábornak, Dr. Blaskó Bernadettnek, Kovács Margitnak, Dr. Kiszel Petrának, Dr. Szalay Csabának, Dr. Rajczy Katalinnak és Pozsonyi Évának, Dr. Oroszlán Melindának, Herczenik Eszternek, Dr. Udvarnoki Katalinnak. A vizsgált betegek gondozóinak klinikánkon, Prof. Karádi István és Prof. Romics László Professzor Uraknak, Dr. Pánczél Pálnak, Dr. Hosszúfalusi Nórának, Dr. Kocsis Juditnak, Dr. Tóth Éva Katalinnak, Dr. Fazakas Ádámnak. Köszönöm a Magyar Cisztás Fibrózis Munkacsoport összes tagjának lelkes és lelkiismeretes segítségét. Végül, de nem utolsó sorban hálás köszönettel tartozom a kitartó és pótolhatatlan szakmai és emberi támogatásért családomnak: szüleimnek, Dr. Gál Ilonának és Dr. Laki Istvánnak és testvéremnek, Dr. Laki Évának.

79