Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů
7. Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů Rekombinantní proteiny, které se mají použít jako proteiny terapeutické, je nutné dobře charakterizovat z hlediska jejich biofyzikálních a biochemických vlastností. Tato charakterizace slouží ke srovnání jednotlivých vyprodukovaných šarží rekombinantního proteinu, vytvoření podmínek stabilizace proteinu v průběhu produkce, skladování a transportu k zákazníkovi a také ke sledování charakteristik užitečných pro monitoring stability během dlouhodobého skladování. Ke stanovení vlastností terapeutických proteinů se využívají tytéž metody analýzy proteinů, které se používají pro přirozeně se vyskytující peptidy a proteiny. Není účelem tohoto textu opakovat základní poznatky biofyziky a biochemie proteinů, k tomu existuje nepřeberné množství literatury. V této kapitole se proto zaměříme jen na povšechné shrnutí základních informací o biofyzikální a biochemické podstatě proteinů a zmíníme některé specifické odlišnosti týkající se proteinů rekombinantních.
7.1. Strukturní rysy rekombinantních proteinů Není žádného rozdílu mezi primární, sekundární, terciární či kvartérní strukturou rekombinantního a přirozeného proteinu. Podrobnosti lze nastudovat např. v učebním textu BartošBartošová (2012): Základy molekulární biologie pro farmaceuty.
7.2. Sbalování rekombinantních proteinů Podobně jako přirozené proteiny i rekombinantní proteiny jsou funkční pouze tehdy, jestliže získají správnou terciární strukturu. O procesu sbalování proteinů v přirozených systémech podrobně píše již výše zmíněný učební text Bartoš-Bartošová (2012): Základy molekulární biologie pro farmaceuty. Jestliže pro předmět Molekulární biologie byla část textu zabývající se sbalováním proteinů nepovinná, je pro předmět Biotechnologie léčiv naopak velmi důležitá a povinná. Rekombinantní proteiny produkované v heterologních expresních systémech musí přijmout svoji funkční konformaci zpravidla v ne zcela optimálních podmínkách. Rekombinantní proteiny exprimované v bakteriích E. coli vytvářejí velmi často tzv. „inkluzní tělíska“, což jsou nerozpustné, nesprávně sbalené a nefunkční proteinové agregáty. Vznikají především v důsledku velké rychlosti exprese, protože expresní systémy jsou pro vysoce účinnou expresi konstruovány. Rekombinantní geny se v těchto systémech nacházejí pod kontrolou silných promotorů, jejichž indukcí ve vhodném fyziologickém stavu buňky (růst v exponenciální fázi) dochází k produkci extrémních množství proteinových molekul, které pak „nemají čas“ se správně sbalit. Nesprávně sbalené proteiny je pak nutné, pokud je to vůbec možné, tzv. refoldovat, tj. opětovně sbalit a převést do fyziologicky aktivního stavu technikami in vitro. K tomu se používají detergenty nebo denaturační činidla, která inkluzní tělíska rozpustí a po jejich následném odstranění je proteinovým molekulám umožněno se znovu sbalit, pomalu a tentokrát správně. Nesbalené proteiny jsou v přítomnosti denaturačních látek zpravidla vysoce stabilní a zároveň rozpustné. A po správném sbalení jsou také relativně stabilní. Opětovného sbalení proteinů lze dosáhnout několika způsoby. Jedním z postupů je rozředění roztoku proteinu (rozpuštěného
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů ve vysoce koncentrovaném denaturačním činidle) ve vodném pufru; tím se současně sníží koncentrace denaturantu, ale také proteinu. Podobně dojde ke zředění denaturačního činidla i proteinu poté, co se k roztoku proteinu v denaturačním činidle přidá vodný pufr. Druhého z uvedených postupů lze dosáhnout dialýzou proteinu, při které je roztok proteinu v denaturačním roztoku umístěn do sáčku s dialyzační membránou a ponořen do nádoby s velkým objemem vodného pufru. Koncentrace denaturačního činidla pak postupně klesá tak, jak jsou jeho molekuly vyměňovány za molekuly vody. Koncentrace proteinu zůstává víceméně nezměněna. Opětovného sbalení proteinu lze dosáhnout také tak, že je protein po rozpuštění v denaturujícím roztoku nejprve navázán na pevnou fázi a poté ekvilibrován vodným pufrem. V tomto případě je ale koncentrace proteinu velkou neznámou. Různé postupy mají své výhody a nevýhody a pro každý z proteinů je třeba hledat optimální proceduru. Pokud obsahuje protein v nativním stavu disulfidické můstky, je třeba v procesu sbalování zajistit správný průběh procesu oxidace. K tomu slouží různé postupy, např. oxidace na vzduchu, katalýza glutathionem nebo tvorba aduktu následovaná redukcí a oxidací, aj. Některé proteiny se sbalují snadno v souladu s koncepcí Anfinsenovy klece, tak jak bylo popsáno v již zmíněném učebním textu. V průběhu sbalování prochází protein několika mezistupni, ve kterých se tvoří rozličné sekundární struktury a eventuální tvorba správné terciární struktury je výsledkem složité termodynamické rovnováhy. V podmínkách in vitro samozřejmě nejsou přítomny chaperony. Správného sbalení lze často dosáhnout s pomocí dalších látek, např. polyethylenglykolu. Jak už bylo řečeno dříve, jsou proteiny funkční ve vodném roztoku, ve kterém jsou taky vysoce hydratované. V reálných fyziologických podmínkách se však musí sbalit do aktivní konformace v roztoku, který obsahuje řadu iontů a nízko i vysokomolekulárních látek, často ve vysokých koncentracích. Tyto ionty a látky jsou pro udržení stabilní a správné konformace nezbytnými faktory. Po izolaci proteinů dochází ke ztrátě těchto stabilizátorů a je nezbytné je něčím nahradit. Tyto náhrady se používají ve vysokých koncentracích a spolu s vodou slouží jako rozpouštědla proteinů. Patří sem cukry, aminokyseliny, organické a anorganické soli a polyoly (alkoholické cukry). Neváží se k proteinům silně, ale naopak vytvářejí s povrchovými strukturami proteinu slabé interakce, čímž proteinu poskytují významnou stabilizační energii, aniž by interferovaly s jeho funkční strukturou. Rekombinantní proteiny exprimované v eukaryotických buňkách a secernované do média se zpravidla nacházejí v nativní konformaci. Podle typu buňky mohou být správně nebo nesprávně glykosylované. Řada glykoproteinů nemusí nutně obsahovat glykosidickou část, a přesto se sbalí do správné nativní konformace. Neglykosylované glykoproteiny ale mají zpravidla jinou farmakokinetiku, rozpustnost a stabilitu než přirozená forma proteinu.
7.2.1. Specifické techniky určené k charakterizaci sbalení rekombinantních proteinů Základními metodami, kterými je možno získat informace o sbalených strukturách proteinů, jsou cirkulární dichroismus (CD), fluorescenční spektroskopie a Fourierova transformace infračervené spektroskopie (Fourier transform infrared spectroscopies, FTIR). CD a FTIR se obecně používají k odhadu sekundárních struktur proteinů. Ve vzdálené UV oblasti (180-260 nm) lze těmito technikami odhalit přítomnost α helixů. Metoda FTIR však někdy falešně indikuje jako α helixy také smyčky. Na druhou stranu je tato metoda vhodná pro detekci β struktur a odlišení paralelních a antiparalelních forem. CD poskytuje v místech β struktur špatný signál.
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů V blízké UV oblasti (250-320 nm) lze metodou CD zjistit přítomnost aromatických aminokyselin, tedy tryptofanu, tyrosinu a fenylalaninu, a taky disulfidické můstky. Fluorescenční spektroskopií lze pozorovat tyrosin a tryptofan. Signály CD a fluorescence jsou často velmi změněny, pokud porovnáme standardně sbalený protein s proteinem, jehož konformace je nesprávným sbalením značně pozměněna. Žádná ze tří výše uvedených technik samozřejmě neposkytuje informaci o struktuře na atomární úrovni. Toho je možné dosáhnout jedině krystalografickou analýzou nebo nukleární magnetickou rezonancí (NMR). Ale na rozdíl od krystalografie a NMR jsou to metody rychlé a k měření jim stačí i malá koncentrace proteinu. Kromě toho umožňují studovat strukturu proteinů v různých prostředích. Je-li k dispozici přirozená forma proteinu, pak je především metodou CD v blízké UV oblasti nebo fluorescenční spektroskopií rychle zjistit, jestli má rekombinantní protein po izolaci nativní konformaci. Informaci o struktuře proteinu je možno získat taky díky tomu, že spektroskopické vlastnosti jsou funkcí teploty. Terciární struktura proteinu je tvořena sérií kooperativních interakcí mezi mnoha postranními řetězci a peptidovými vazbami. Jestliže dojde teplem k poškození jediné této interakce, pak to má za následek rozbourání dalších a v konečném důsledku to může vést až k rozbalení molekuly. U mnoha proteinů dochází k takovému kooperativnímu přechodu v úzkém rozmezí teplot. Na druhé straně, pokud nejsou proteiny kompletně sbaleny, může u nich docházet k nekoordinovaným tepelným přechodům, což lze pozorovat jako postupnou změnu signálu v širokém rozmezí teplot. Takové přechody lze zkoumat diferenciální skenovací kalorimetrií. K tomu, aby se struktura rozbalila, je zapotřebí teplo. Vysoce citlivým kalorimetrem je možné teplo spotřebované k rozbalení struktury změřit. Hydrodynamické vlastnosti proteinů se v průběhu sbalování výrazně mění, struktura proteinu přechází z relaxované struktury do podoby kompaktní globule. Ke studiu hydrodynamických vlastností se využívá centrifugačních metod a perfúzní (permeační) chromatografie. Rychlost pohybu proteinu při centrifugaci je závislá na jeho molekulové hmotnosti a hydrodynamické velikosti, eluce při perfúzní chromatografii je závislá pouze na hydrodynamické velikosti. Při obou metodách samozřejmě záleží na tom, jestli je protein sbalen správně nebo ne. U oligomerních proteinů je možno k odhadu sbalení proteinu použít výsledek stanovení molekulové hmotnosti kvartérní struktury. Prostřednictví elektroforézy v SDS-PAGE lze odhalit existenci silných interakcí, tedy kovalentních vazeb, mezi podjednotkami. Nekovalentní interakce lze sledovat izopyknickou centrifugací do rovnováhy nebo zonální izokinetickou centrifugací nebo experimenty s rozptylem světla. Při tzv. „statickém měření rozptylu světla“ se měří intenzita rozptýleného světla, při „dynamickém měření rozptylu světla“ se měří fluktuace rozptýleného světla tak, jak molekuly difundují dovnitř a ven z malé oblasti, ve které k rozptylu dochází. Statické měření rozptylu světla se často používá ve spojení s perfúzní chromatografií. Pro potvrzení, že má rekombinantní protein očekávanou molekulovou hmotnost, se v biotechnologii jako tzv. „zlatý standard“ využívá izopyknická centrifugace do rovnováhy. Dá se taky použít ke stanovení průměrné glykosylace. Sbalování proteinů lze sledovat taky specifickými chemickými modifikacemi nebo proteolytickým štěpením. Rozsah chemických modifikací nebo proteolytického štěpení závisí na tom, jestli jsou specifická místa exponována do rozpouštědla nebo ukryta uvnitř proteinu a tudíž nepřístupná těmto modifikacím. Například trypsin štěpí peptidové vazby na C konci bazických aminokyselin. Ačkoli řada
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů proteinů obsahuje několik bazických aminokyselin, ke štěpení dochází jen v několika málo z nich. Je to proto, že jsou tyto vazby ukryty uvnitř proteinové struktury. Teprve po denaturaci proteinu se odhalí všechny bazické aminokyseliny a štěpení trypsinem pak probíhá na více místech – toho se využívá při hmotnostní spektrofotometrii.
7.3. Stabilita rekombinantních proteinů Ačkoli se čerstvě připravený protein může sbalit do různých trojrozměrných struktur, nemusí tyto struktury vydržet v roztoku nekonečně dlouho. Proteiny nejsou chemicky ani fyzikálně stabilní látky. Povrch proteinů je z chemického hlediska vysoce heterogenní a obsahuje řadu reaktivních skupin. Pokud jsou tyto reaktivní skupiny vystaveny dlouhotrvajícímu „stresu vnějšího prostředí“, dochází v nich k chemickým změnám. Mnoho proteinů, např. růstové faktory a cytokiny, obsahuje taky zbytky cysteinu, které podléhají oxidaci a tvoří disulfidické můstky. K oxidaci dochází taky na metioninu. Peptidové vazby podléhají hydrolýze, hydrolyzovány jsou amidy asparaginu a glutaminu. Na peptidových vazbách, tryptofanu, tyrosinu a taky na amino a karboxy skupinách dochází k řadě dalších modifikací. V Tabulce 7. 1 jsou uvedeny příklady modifikací, ke kterým dochází v průběhu purifikace nebo během skladování. Fyzikální stabilitu proteinu je možno vyjádřit jako rozdíl volné energie, ΔGU, mezi nativním a denaturovaným stavem. Pozitivní hodnota znamená, že je většina proteinu v nativním stavu. Dokud je stav reverzibilní, nezáleží na tom, jak malé ΔGU je. V řadě případů ale reverzibilní stav přechází do stavu nevratného. Je tomu tak např. tehdy, když ΔGU klesá v důsledku zahřívání proteinu. V takovém případě protein denaturuje a vznikají agregáty, které jsou už nerozpustné. To můžeme zapsat schematicky jako: k
ΔGU Nativní stav
Denaturovaný stav
Agregovaný stav
Jakýkoli stresový faktor, který snižuje ΔGU a zvyšuje k, vyvolá akumulaci nevratně inaktivovaných forem proteinu. Takovým faktorem může být některá z výše popsaných chemických modifikací nebo fyzikální parametry, např. pH, iontová síla, koncentrace proteinu a teplota. Úkolem farmaceutické biotechnologie je vytvořit takovou formulaci terapeutického produktu, aby byla jeho stabilita co nejvyšší a poločas co nejdelší. Obvykle se používají stabilizační látky, které zvyšují hodnotu ΔGU. Volba stabilizátoru je ale závislá na druhu proteinu a podmínkách skladování produktu. Někdy může stabilizátor paradoxně stabilitu i snižovat. Proto je třeba volbu vhodných činidel pečlivě zvažovat a důkladně testovat. Jiným způsobem, jak zvýšit stabilitu terapeutického proteinu je lyofilizace nebo mrazové vysoušení – viz kapitola „Formulace biofarmaceutických produktů“. Lyofilizací dojde k minimalizaci tvorby agregátů během skladování, protože jak k chemickým modifikacím, tak i k tvorbě agregovaných struktur je zapotřebí voda.
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů Tabulka 7. 1: Reakce ovlivňující stabilitu proteinů a způsoby detekce příslušných modifikací
Modifikace
Jaká fyzikální vlastnost je ovlivněna
Metoda detekce
Oxidace Cys Disulfid Uvnitř řetězce Mezi řetězci Met, Trp, Tyr
Hydrofobicita Velikost Hydrofobicita
Reverzní HPLC, SDS-PAGE Perfúzní chromatografie Hmotnostní spektrofotometrie
Hydrolýza peptidových vazeb Migrace N-O Ser, Thr Migrace α-karboxy a βkarboxy Asp, Asn Deaminace Asn, Gln Acylace α-amino skupiny ε-amino skupiny Esterifikace/karboxyl ace Glu, Asp, C-konec Změny sekundární struktury
Velikost
Perfúzní chromatografie SDS-PAGE Reverzní HPLC
Hydrofobicita Chemismus Hydrofobicita Chemismus
Reverzní HPLC
Náboj
Iontoměničová chromatografie
Náboj
Iontoměničová chromatografie Hmotnostní spektrofotometrie
Náboj
Iontoměničová chromatografie Hmotnostní spektrofotometrie
Hydrofobicita Velikost Sek/terc struktura Sek/terc struktura Agregace Sek/terc struktura, agregace
Reverzní HPLC Perfúzní chromatografie Cirkulární dichroismus Furierova infračervená spektroskopie Rozptyl světla Analytická ultracentrifugace
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů
7.4. Přehled analytických a separačních metod Po zdárně provedené produkci terapeutického proteinu je nutné získaný produkt izolovat a upravit vhodným způsobem. Při vypracovávání izolační metody je nutné brát v úvahu vlastnosti izolovaného produktu, zejména jeho stabilitu za různých podmínek, rozpustnost atd. Izolační postup je značně závislý na tom, zdali je cílový produkt intracelulární, extracelulární nebo zdali je produktem celá buňka. Důležité je také znát koncentraci produktu v produkční směsi, např. antibiotika se zde vyskytují v koncentraci okolo 0,1 %, tj. přibližně v množství 2 – 3 % ze všech rozpuštěných látek. Tyto látky tvoří velmi pestrou směs organických sloučenin, které poněkud komplikují izolační proces – jedná se jednak o látky, které jsou obsaženy v kultivačním médiu produkčního organismu a jednak o mnoho dalších látek, které samotný organismus syntetizuje. Izolace produktů extracelulárních je značně jednodušší a nevyžaduje příliš složité metody čištění, je schůdná i ve velkoobjemových procesech. Pro účely farmaceutické však, na rozdíl od průmyslových aplikací, je nezbytná absolutní čistota produktu. Mnoho rekombinantních proteinů je však produkováno ve formě komplexní intracelulární směsi a tehdy je získání čistého produktu mnohem složitější. V současné době je vysoká poptávka po enzymech a proteinech nejen pro průmyslové účely (především amylázy, proteázy, celulázy, glukoamyláza, aj.), ale také po superčistých enzymech pro terapeutické, diagnostické a laboratorní výzkumné účely, proto je nutné pro každý produkt vypracovat vhodné metody izolace. Významnou roli i zde hrají výsledky výzkumu genetického inženýrství, které umožňují snížení produkce „kontaminujících“ proteinů a makromolekul, které komplikují izolaci. Genové inženýrství je při produkci terapeutických proteinů zacíleno na zvýšení výtěžků, modifikace proteinu např. přidáním různých chemických skupin, které umožňují snadnější izolaci, apod.
Obecný postup izolačních procesů můžeme shrnout následovně: 1) Separace buněk. Způsob separace a použité zařízení závisí na typu produkčního organismu (jedná-li se o bakterie, kvasinky, aktinomycety, houby, hmyzí, rostlinné nebo živočišné buňky), složení živné půdy a jiných faktorech. Buňky jsou separovány centrifugací nebo filtrací. 2) Dezintegrace buněk. Ta může být enzymatická, chemická nebo fyzikální. Každá má své výhody a nevýhody, ne všechny lze použít za všech podmínek.
Při metodě enzymatické se nejvíce využívá lysozym, enzym komerčně získávaný z vaječného bílku, který hydrolyzuje vazby v mukopeptidech bakteriálních buněčných stěn, u G- bakterií je obvykle nutný i přídavek dalších chemických činidel, např. EDTA nebo specifických enzymů. U grampozitivních stafylokoků se k odstranění buněčné stěny využívá lysostafin. Ve velkoobjemových výrobách se tato metoda obvykle nepoužívá, a to z ekonomických důvodů.
Při metodě chemické se používají alkálie (pH 11-12), které se nechají působit zpravidla 20 minut. Alkálie se mohou využívat při malo- i velkoobjemové produkci. Jiným postupem je působení detergentů (iontové – laurylsulfát sodný, cetyl trimetyl ammonium bromid – nebo neiontové Triton X-100 nebo X-450 nebo Tween). Přítomnost detergentů může ovlivňovat následné purifikační kroky, proto je vhodné je odstranit iontoměničovou chromatografií nebo ultrafiltrací, což je ale jeden purifikační krok navíc.
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů
K metodám fyzikálním patří osmotický šok. Při tomto postupu se buňky promyjí pufrem, čímž dojde k odstranění živného média. Poté se buňky umístí do 20% pufrovaného roztoku sacharózy, po pomalém ustanovení rovnováhy se buňky rychle resuspendují do vody o teplotě 4 °C, přičemž dojde k uvolnění intracelulárních látek; když byla tato metoda použita při purifikaci rekombinantního lidského růstového hormonu, pak již po prvním kroku čištění byla čistota produktu cca 90 %. Jinou fyzikální metodou je drcení buněk s abrazivy (sklo, oxid hlinitý). Tato metoda je vhodná pro laboratorní i průmyslové aplikace. Vznik při ní teplo, a proto je nutné drcenou suspenzi chladit. V laboratorním měřítku lze použít i ultrazvuk.
3) Oddělení buněčných stěn se prování podobně jako separace buněk centrifugací nebo filtrací. 4) Izolace produktu z kapaliny. Po filtraci nebo odstředění kultivační kapaliny získáme buněčnou hmotu (biomasu) a víceméně čirý roztok. K izolaci produktu z kapaliny se používají různé metody, izolace se provádí buď přímo z roztoku získaného v předcházejícím kroku nebo po jeho úpravě, např. zahuštění na odparce nebo pomocí membránové filtrace apod.
Extrakce využívá systému dvou nemísitelných rozpouštědel; při izolaci proteinů se používá často roztok polyethylenglykolu (PEG) a dextranu nebo PEG a specifické soli jako K3PO4 nebo NH4SO4. Oddělení žádaného proteinu z roztoku, který obsahuje celou řadu jiných rozpuštěných látek, závisí na správně zvolených podmínkách extrakce (pH, teplota, MW a koncentrace zúčastněných polymerů, iontová síla roztoku, přítomnost polyvalentních solí např. SO42- a PO43- apod.). Extrakce se provádí buď v klasickém extraktoru, nebo se urychluje pomocí centrifugace. Použití PEG někdy komplikuje izolaci a další kroky, neboť PEG může s některými typy proteinů vytvářet nespecifické vazby.
Srážení je „vysolování proteinů“ pomocí solí (nejčastěji NH4SO4). Při tomto postupu je nutné se zaměřit na optimalizaci pH, teploty, koncentrace proteinu, typ soli; v menším měřítku se používá i srážení organickými rozpouštědly (etanol, aceton, 2-propanol, aj.). Je nutné pracovat při teplotě 0°C, aby nedošlo k denaturaci proteinů.
Chromatografické metody (gelová, ionexová, bioafinitní, adsorpční) a elektromigrační metody (elektroforéza, isoelektrická fokusace, izotachoforéza) jsou v porovnání s předchozími metodami ekonomicky náročnější, proto se nepoužívají pro čištění levných produktů ve velkoobjemových výrobách. Nicméně jsou velmi často používané jednak v laboratorní praxi a jednak i v průmyslovém měřítku při čištění terapeutických a diagnostických proteinů, díky těmto metodám je možné výsledný protein získat v čistotě až 99,8 %.
5) Konečné úpravy produktu. Jedná se o odpařování, které se provádí se na vakuových odparkách; procesy je třeba optimalizovat – viz kapitola 8 – především pro termolabilní látky. Např. pro enzymy jsou nejvhodnější deskové (filmové) odparky. Dále je produkt nutno podrobit sušení, tedy odnímání vody a těkavých látek z produktu. Sušárny existují v mnoha variantách, máme sušárny pásové, lískové, bubnové, rozprašovací a fluidní. Fluidní sušárny, ve kterých se sušený materiál profoukává teplým vzduchem, jsou velmi časté ve farmaceutickém průmyslu. Není účelem tohoto učebního textu zabývat se detailně analytickými metodami, k tomu účelu odkazujeme na učebnice a příručky analytické chemie. Zde se zabýváme pouze shrnutím základních charakteristik jednotlivých metod a popisem specifických vlastností využitelných farmaceutickým biotechnologem.
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů 7.4.1. Western blotting Tato metoda se používá k detekci velmi nízkých koncentrací molekul v prostředí bohatém na proteiny, nukleové kyseliny a další složky buněk. Kromě samotných proteinů je jí možno detekovat i proteinové agregáty nebo produkty štěpení vzniklé v důsledku nesprávné exprese, degradací v průběhu izolace nebo samotného skladování proteinu. Při této technice jsou proteiny rozdělené na polyakrylamidovém gelu přeneseny na membránu procesem přesávání (blotting), který byl původně použit na nukleové kyseliny (Southern blotting, Northern blotting). Ekvivalentní termín pro přesávání a následnou detekci proteinů označuje jako Western blotting. Používají se membrány nitrocelulózové, nylonové nebo polyvinylidin difluoridové (PVDF). Je možné použít taky techniku „dot blot“ nebo „slot blot“, při níž nejsou proteiny děleny na polyakrylamidovém gelu, ale jednoduše přes membránu přefiltrovány – během filtrace se proteiny na membráně uchytí. Přenosu proteinů na membránu z polyakryamidového gelu je možno dosáhnout působením kapilárních sil roztoku, který proteiny unáší z gelu na membránu nebo působením elektrického pole (elektroblotting). Po přenosu je třeba na membráně detekovat příslušný terapeutický protein. K tomu je možno využít jednak různé kolorimetrické postupy, ale především specifické metody detekce toho kterého proteinu. Využívají se především protilátky a taková technika se pak označuje jako imunoblotting. Protilátka reaguje specificky s proteinem v tom místě, kde se tento na membráně nachází. Identifikace vzniklého komplexu je pak zabezpečena např. značením samotné protilátky radioaktivním jódem, 125I. Protilátka může být taky konjugována s enzymem, např. křenovou peroxidázou nebo alkalickou fosfatázou, které po inkubaci s chromogenním substrátem vyvolají barevnou reakci. Podobně je možno dosáhnout chemiluminiscence. Protilátky je taky možné označit biotinem, který pak reaguje s avidinem nebo streptavidinem kovalentně napojeným na křenovou peroxidázu nebo alkalickou fosfatázu; následuje barevná reakce. Detekční systémy velmi často používají dvou protilátek. Primární protilátka se specificky váže na rekombinantní strukturu. Sekundární protilátka je pak vlastní detekční reagencií, bývá označena radioaktivně nebo konjugována s výše zmíněnými enzymy. Funkcí sekundární protilátky je rozpoznat primární protilátku. Použití sekundárních protilátek zjednodušuje detekci, protože jedna sekundární protilátka rozpoznává mnoho primárních protilátek a může být tedy připravována relativně levně. V současnosti je komerčně dostupná pestrá škála značených sekundárních protilátek. Kromě toho jsou pro běžně používané rekombinantní proteiny dostupné i primární protilátky. K dispozici jsou taky protilátky proti cukerné složce glykoproteinů.
7.4.2. ELISA Tato metoda (enzyme-linked immunosorbent assay) je určena ke kvantifikaci malých množství proteinů v roztocích a slouží jako nástroj kontroly procesu purifikace rekombinantních proteinů. Při této metodě se využívá především schopnosti proteinů vázat se v malém, ale detekovatelném, množství na plastový povrch mikrotitračních destiček. Primární protilátka se váže na tuto destičku a ta je potom podrobena opracování roztokem s příslušným rekombinantním proteinem. Po odmytí přebytečného materiálu je na primární protilátku navázaný antigen (rekombinantní protein) detekován další protilátkou, která je značena nebo konjugována s enzymem tak, jak bylo popsáno
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů u metody Western blotting. Kromě této tzv. „sandwich“ metody, kdy je rekombinantní protein umístěn mezi dvě protilátky, existují i jiné formáty metody ELISA. Ačkoli je princip Western blottingu a ELISA v zásadě stejný, je rozhodujícím rozdílem v případě ELISA možnost kvantifikace obsahu rekombinantního proteinu v preparátu na základě stanovené kalibrační řady. Pokud je namísto enzymatického značení protilátky použito značení radioaktivního, označujeme metodu jako radioimunoanalýza (radioimmunoassay, RIA).
7.4.3. Elektromigrační metody Základem elektromigračních metod je elektroforetický pohyb ionizovaných částic ve stejnosměrném elektrickém poli. Metody je možno využít k analytickým i preparativním účelům. Nejčastějšími typy elektroforéz jsou zónová elektroforéza, izoelektrická fokusace a izotachoforéza. Všechny elektromigrační metody mají zásadní význam pro laboratorní praxi ve všech odvětvích souvisejících s biotechnologiemi, jako je biochemie, molekulární biologie, genetické inženýrství, bioanalytická chemie, apod. a také v lékařské praxi (diagnostika, imunochemie, atd.). Pomocí těchto metod je možná přesná a efektní analýza od jednoduchých organických sloučenin jako jsou aminokyseliny, steroidy, peptidy, alkaloidy, vitamíny, barviva, antibiotika apod. až po složité makromolekulární komplexy (membránové receptory, enzymy, imunoglobuliny, proteinové hormony, plasmatické proteiny, alergeny, atd.).
Zónová elektroforéza. Při zónové elektroforéze jsou ionty, koloidní částice i částice větších rozměrů, tedy i proteiny vystaveny působení stejnosměrného proudu homogenního elektrického pole. Nosný elektrolyt má konstantní vlastnosti z hlediska pH i složení, nabité částice se pohybují v elektrickém poli směrem k elektrodě s opačným nábojem. Vzhledem k tomu, že nosičem, na kterém proces probíhá, může být např. gel, uplatňuje se zde zároveň rovněž i efekt molekulového síta. Při konvenční elektroforéze jsou tedy složky analyzovaného vzorku děleny na základě svých rozdílů v celkovém náboji, objemu a tvaru. V současné době se elektroforéza nejčastěji provádí v gelovém prostředí, a to převážně na agaróze. pH pufru se volí obvykle tak, aby měly všechny separované proteiny stejný náboj – liší se pak v poměru náboj/hmota. Čím vyšší je tento poměr (menší molekula), tím rychleji se tato molekula pohybuje. Vzorek je nakonec rozdělen v sérii oddělených pásů v pořadí podle hustoty jejich náboje. Na agarózovém gelu se s úspěchem rozdělují enzymové komplexy, lipoproteiny, nukleové kyseliny, viry a řada dalších látek. Jiným typem nosiče je polyakrylamid. Polyakrylamidový gel má menší póry a mimo dělení na základě nábojové hustoty se zde uplatňuje i efekt molekulového síta, čehož se využívá k lepšímu rozdělení proteinů se stejnou hustotou náboje. Mohou se připravovat i gradientové gely, u kterých se využívá elektrického pohybu makromolekul prostředím s gradientem hustoty. U takových gelů nezávisí na náboji molekuly, ale pouze na její velikosti, molekula putuje ve směru elektrického pole tak daleko, jak jí dovoluje hustota pórů. Na podobném principu pracují i SDS-elektroforézy (SDS-PAGE), které využívají působení detergentu SDS, který se váže na molekuly proteinů a maskuje jejich nativní náboj svým negativním nábojem; v důsledku toho jsou proteiny od sebe separovány pouze na základě svého objemu na principu molekulového síta použitého gelu.
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů Izoelektrická fokusace. Tato metoda využívá skutečnosti, že každý protein má určitý izoelektrický bod, pI (to je pH, při kterém efektivní elektrický náboj nabývá nulové hodnoty). V prostředí s gradientem iontů lze na základě rozdílu pI od sebe jednotlivé proteiny oddělit. Např. pokud naneseme směs proteinů na gel při pH 7, pak ty proteiny, které mají pI nižší než 7, nesou negativní náboj, a ty, co mají pI vyšší než 7, mají pozitivní náboj. Po zavedení elektrického pole se začnou jednotlivé proteiny pohybovat k opačně nabitému pólu, a jakmile se dostanou do oblasti pH, která odpovídá jejich pI, stávají se neutrální a jejich pohyb se zastaví. Protože difuzi zón brání elektrické pole, nedochází k rozšiřování zón jako u jiných separačních metod. Díky tomu je tato dělící metoda velmi účinná, je schopna rozlišit látky lišící se v pI pouze o 0,01 pH. Jako nosiče se používají směsi různých amfolytů, které se po zavedení elektrického pole seřadí podle rostoucí hodnoty pI (např. v řadě látky podobné proteinům, polyaminopolykarboxylové sloučeniny, atd.).
Dvourozměrná gelová elektroforéza. Dvě výše zmíněné metody lze kombinovat v tzv. 2D elektroforézu. V prvním rozměru jsou proteiny děleny izoelektrickou fokusací podle jejich pI a pak jsou děleny v kolmém směru metodou SDS-PAGE, kde se rozdělí na základě molekulových hmotností. Opačné pořadí zvolit nelze, protože denaturované proteiny po SDS-PAGE už nelze dělit podle pI.
Detekce proteinů v PAGE. Elektroforetické gely s dělenými proteiny se barví Coomassie brilliant blue nebo stříbrem. Principem barvení Coomassie brilliant blue jsou hydrofobní interakce barviva s proteinem, k vybarvení dojde tedy v místě výskytu proteinu na gelu. Při použití standardů lze touto metodou i odhadnout koncentraci proteinu. Barvení stříbrem je citlivější, ale složitější na provedení. Kromě toho je při barvení stříbrem kvantifikace méně přesná. V procesu barvení oběma metodami dochází k denaturaci proteinů. Pokud chceme získat z gelů nativní proteiny, pak se provádí barvení nedenaturačních gelů mědí nebo jinými kovovými ionty.
Kapilární elektroforéza. Kapiláry mají průměr 25-50 μm a neobsahují polyakrylamidový gel. Proteiny v nich putují skrze tekuté médium a po výstupu z kapiláry jsou detekovány UV nebo fluorescenčním detektorem. Pohyb proteinů v kapiláře závisí na molekulové hmotnosti a celkovém náboji proteinu. Reprodukovatelnost a validace pohybu proteinů v kapiláře je složitá, a proto se tato metoda k rutinním účelům často nevyužívá.
7.4.4. Chromatografické metody Chromatografické metody byly popsány v kapitole 5.
7.4.5. Hmotnostní spektrometrie Tato metoda byla původně využívána jen ke stanovení hmotnosti malých molekul. V současnosti je však použitelná i pro makromolekuly o molekulové hmotnosti nad 100 000. A díky přesnosti metody je možné sledovat i posttranslační modifikace typu acetylace nebo glykosylace. Metodu lze vhodně využít nejen při analýze nativních proteinů, ale také ke studiu procesů, které protein podstupuje při stabilitních studiích. Pokud např. dojde ke zvýšení molekulové hmotnosti proteinu
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů o 16, pak to může znamenat, že došlo k oxidaci; respektive došlo k oxidaci metioninu na metionyl sulfoxid. Při hmotnostní spektrometrii jsou proteiny štěpeny na peptidy, separovány HPLC a u získaných peptidů je změřena molekulová hmotnost. Spektra peptidů pozorovaná na záznamu z HPLC se označují jako „proteinové fingerprinty“. Hmotnostní spektrometrií lze u každého vrcholu záznamu zjistit molekulovou hmotnost. Pokud se tato liší od „standardní“ verze peptidu, pak v daném místě došlo zřejmě k nějaké modifikaci. Hmotnostní spektrometrii lze využít taky ke stanovení sekvence aminokyselin v polypeptidovém řetězci. S výjimkou leucinu a izoleucinu má každá aminokyselina svoji specifickou molekulovou hmotnost, kterou lze hmotnostní spektrometrií změřit. Existuje celá řada metod, jak odštěpit z konců polypeptidového řetězce jednotlivé aminokyseliny, molekulovou hmotnost těchto aminokyselin nebo peptidů lze potom určit na základě poměrů hmotnosti k náboji ionizovaných forem. Pro peptidy se metoda označuje MALDI-TOF (matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight). U ionizovaného peptidu se poměr hmotnosti k náboji stanoví na základě doby letu v okamžiku, kdy projde od místa ionizace k detektoru.
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů
7.5. Shrnutí kapitoly Ke stanovení vlastností terapeutických proteinů se využívají tytéž metody analýzy proteinů, které se používají pro přirozeně se vyskytující peptidy a proteiny. Rekombinantní proteiny produkované v heterologních expresních systémech musí přijmout svoji funkční konformaci zpravidla v ne zcela optimálních podmínkách. V bakteriích E. coli vytvářejí velmi často nerozpustné, nesprávně sbalené a nefunkční proteinové agregáty, inkluzní tělíska. Nesprávně sbalené proteiny je pak nutné opětovně sbalit a převést do fyziologicky aktivního stavu technikami in vitro. Používají se detergenty nebo denaturační činidla, která inkluzní tělíska rozpustí a po jejich následném odstranění je proteinovým molekulám umožněno se znovu sbalit, pomalu a tentokrát správně. Detergenty se odstraňují rozředěním roztoku nebo dialýzou proteinu. Pokud obsahuje protein v nativním stavu disulfidické můstky, je třeba v procesu sbalování zajistit správný průběh procesu oxidace.
Pokračuj 7.2.1.
Biofyzikální a biochemická analýza rekombinantních proteinů
7.6. Příklady a úlohy k zamyšlení 1) Z uvedeného seznamu dekontaminačních metod vyberte ty, které jsou vhodné k odstranění virů, bakterií, kontaminující DNA nebo proteinů:
