5. Močopohlavní soustava (systema urogenitale) 5.1. Močové ústrojí 5.1.1. Ledvina 5.1.1.1. nefron 5.1.1.2. cévy ledvin 5.1.2. Močovod 5.1.3. Močový měchýř 5.1.4. Močová trubice 5.2.Pohlavní ústrojí 5.2.1. Samčí pohlavní orgány 5.2.1.1. varle 5.2.1.2. vývodné pohlavní cesty 5.2.1.3. přídatné pohlavní žlázy 5.2.1.4. pyj 5.2.1.5. šourek 5.2.1.6. spermie 5.2.1.7. semeno 5.2.2. Samičí pohlavní orgány 5.2.2.1. vaječník 5.2.2.1.1. folikulogeneze 5.2.2.1.2. žluté tělísko 5.2.2.1.3. ovogeneze 5.2.2.1.4. oplození 5.2.2.2. vejcovod 5.2.2.3. děloha 5.2.2.3.1. stěna dělohy 5.2.2.3.2. děložní cyklus 5.2.2.4. pochva 5.2.2.5. zevní pohlavní orgány 5.2.3. Biotechnologie v reprodukci koní: Ing. Zdeněk Müller, CSc. 5.2.4. Použití biotechnologických metod v chovu čistokrevných koní
5.1. Močové ústrojí (organa urinaria) Močovou soustavu tvoří ledviny, ve kterých se tvoří moč, a vývodné cesty močové. Moč je dopravována z těla ven. Do moče tělo odkládá odpad metabolizmu a škodlivé látky, které lze vyloučit v podobě roztoku.
5.1.1. Ledvina (ren, nephros) V ledvině se filtrací krevní plazmy vytváří velké množství izotonické primární moče, která obsahuje řadu potřebných rozpuštěných látek. Následnou selektivní resorpcí použitelných látek a vody zpět do krve se primární moč zahušťuje a vzniká definitivní moč, které je asi 1% původního objemu primární moče. Ledvina udržuje vnitřní prostředí organizmu, hospodaří s vodou a koncentrací vodíkových iontů. Ledvina pomocí hormonů (renin, angiotensin) ovlivňuje krevní tlak a tvorbu krve. Uložení ledvin – ledviny jsou dvě a jsou uložené nad pobřišnicí (retroperitoneálně) na stropu břišní dutiny pod bedrovci v oblasti bederní páteře. Levá ledvina je mezi 18. hrudním a 2. bederním obratlem. Pravá ledvina mezi 16. hrudním a 1. bederním obratlem. Pravá ledvina je posunuta kraniálněji než je levá ledvina. Levá ledvina je připojena k bedrovcům a ke slezině. Pravá ledvina je připojena na brániční pilíře a je spojena se dvanáctníkem a hlavou slepého střeva. U kranio-mediální plochy ledvin jsou umístěny nadledviny. Ledviny a nadledviny jsou kryty tukovým pouzdrem a vazivovým pouzdrem, které je chrání před chladem a poškozením. Tvar ledvin – u koně je levá ledvina fazolovitého tvaru a pravá ledvina je srdčitá. Na povrchu jsou ledviny hladké, pokryté vazivovým pouzdrem (capsula fibrosa) a tukovým pouzdrem (capsula adiposa). Na mediální hraně ledviny se nachází prohlubeň, branka ledviny (hilus renalis), kde vystupuje močovod (ureter) a ledvinová žíla, vstupuje ledvinová tepna a nervy. Za ledvinovou brankou uvnitř ledviny je ledvinová pánvička (pelvis renalis). Stavba ledviny – u koně je podobná ledvině ovce a kozy. Je složena z 20-30 laloků, které zcela srůstají. Vnitřní parenchym ledviny je rozdělen na kůru ledviny (cortex renis) a dřeň ledviny (medulla renis). Tloušťka kůry je pouze 15-18 mm, což je méně než polovina tloušťky dřeně. Kůra ledviny je červenohnědé barvy s náznakem jemného zrnění. Dají se rozlišit korové lalůčky (lobuli corticales), které se vytvářejí kolem kolmých tepének (aa. radiatae). Dřeň ledviny je tvořena tmavší vnější zónou, která přechází ve světlejší vnitřní zónu. Kůru ledviny od dřeně odděluje jasně červená hraniční vrstva s tenkou vazivovou vrstvou, ve které probíhají obloukové tepny a žíly. Ledvina je u plodu před narozením tvořena z jednotlivých laloků, které během vývoje jedince postupně srůstají do jednoho orgánu. Nejprve srůstá korová část ledviny tak, že povrch ledviny je hladký. U koně srůstá dokonale i dřeň ledviny. Původně samostatné dřeňové pyramidy vytvářejí jednotnou dřeňovou lištu – papilární hřeben (crista renalis), ze které se do ledvinové pánvičky uvolňuje definitivní moč. U koně je papilární hřeben bez pseudopapil a je dlouhý asi 5 cm. Takto stavěné ledvině říkáme hladká unipapilární ledvina, kterou najdeme u koně, psa, kočky a malých přežvýkavců.
5.1.1.1. Nefron – je základní funkční jednotkou ledvin. U koně je, podle odhadu, asi 2,7 milionu nefronů v jedné ledvině. Každý nefron je samostatnou funkční jednotkou, která filtruje krev a vytváří malé množství definitivní moče. Ke každému nefronu přivádí krev samostatná přívodná tepénka a na opačném konci se nefrony sběracími kanálky spojují do papilárního vývodu. Každý nefron je tvořen z ledvinového tělíska, močového kanálku a sběracího kanálku. Ledvinové tělísko (corpusculum renis)se skládá z cévního klubíčka a dvojitého pouzdra. Přívodná krevní tepénka (arteriola glomerularis afferens) vytváří 30-50 tenkých stočených kapilárních kliček, které společně tvoří cévní klubíčko (glomerulus). Cévky klubíčka jsou typu fenestrované kapiláry, tedy kapiláry s jemnými otvory v plochých endotelových
buňkách. Cévky klubíčka se spojí a vytvoří tenčí odvodnou krevní tepénku (arteriola glomerularis efferens). Glomerulus je tedy vložen do průběhu tepny, vlastní kapilární síť je až dále. Cévní klubíčko je vmáčknuto do rozšířeného začátku močového kanálku, jehož stěny ho obklopí a vytvoří dvojité pouzdro – Bowmanovo pouzdro (capsula glomeruli). Vnější stěna pouzdra, parietální list, je pevná a ohraničuje štěrbinu pouzdra. Vnitřní stěna pouzdra, viscerální list, se těsně přikládá na fenestrované endotelové buňky krevního klubíčka se kterými se pevně spojuje společnou bazální membránou. Mezi těmito plochými buňkami jsou také póry. Glomerulární filtrační membrána je tedy tvořena fenestrovanými endotelovými buňkami glomerulu, polopropustnou společnou bazální membránou a plochými buňkami vnitřního listu pouzdra s póry. Přes tuto filtrační membránu se z krve uvolní tekutiny a nízkomolekulární látky, které tvoří primární moč. U zdravého jedince nemohou do primární moče proniknout krevní buňky. Primární moč se hromadí ve štěrbině mezi vnitřním a vnějším listem pouzdra a odchází do močového kanálku nefronu. Primární moče se vytvoří zhruba 100x větší množství než je množství definitivní moče. Močový kanálek (tubuli renales), který navazuje na ledvinové tělísko, si můžeme rozdělit na čtyři části. Je to trubička s různým průsvitem, vystlaná specializovaným epitelem a obklopená hustou sítí krevních kapilár. Zde se přes epiteliální buňky z primární moče zpět do krve vstřebávají živiny, minerální látky (ionty), potřebné látky a voda. Tím se primární moč zahušťuje a její objem se zmenší asi na 1% původního objemu. Tato definitivní (sekundární) moč je odváděna papilárními vývody do ledvinové pánvičky. První částí močového kanálku je proximální stočený kanálek (tubulus contortus proximalis), který navazuje na močový pól ledvinového tělíska. Kanálek je vystlán jednou vrstvou kubických epiteliálních buněk, které mají na volném povrchu lem mikroklků. Navazuje specificky utvořená část močového kanálku, kterou označujeme jako Henleyova klička (ansa nephroni), která z kůry ledviny zasahuje do její dřeně v podobě dlouhé úzké kličky ve tvaru písmene „U“. Je tvořena proximálním rovným kanálkem (sestupným raménkem) s nízkým až plochým epitelem. Silnějším vzestupným raménkem a přímým distálním kanálkem. Vzestupné raménku, které je silnější, je vystláno jednovrstevným kubickým epitelem, stejně jako navazující distální stočený kanálek (tubulus contortus distalis). Tyto kubické buňky jsou však bez mikroklků na apikálním povrchu. Močový kanálek nefronu končí sběracím kanálkem (tubulus renalis colligeus), který je součástí dřeňového paprsku. Do sběracího kanálku, který je vystlán kubickým epitelem, ústí několik nefronů. Zde už je definitivní moč, která je odváděna do papilárních kanálků (ductus papillaris) a přes papilární hřeben do ledvinové pánvičky. Papilární kanálky se slévají do širokých kanálků (recessus terminales), které ústí do předních a zadních výběžků ledvinové pánvičky. V konečné části papilárních kanálků se již objevuje vrstevnatý kubický epitel – urotel, který vystýlá močové cesty. Ledvinová pánvička (pelvis renalis) je dutina za brankou ledvinnou, kde se hromadí definitivní moč a přímo navazuje na močovod. Tvoří ji centrální rozšíření v místě výstupu močovodu a dva výběžky dutiny (recessus terminales), které směřují k pólům ledviny a přiléhají k papilárnímu hřebeni. U koně produkuje sliznice ledvinové pánvičky v tubulozních žlázkách žlutý hlen, který se stává součástí moče a barví moč koně do žluta. Proto je u koně v moči přítomna bílkovina i za fyziologických podmínek. Výstelku ledvinové pánvičky tvoří urotel, vrstevnatý kubický epitel.
5.1.1.2. Cévy ledvin - přivádějí krev do každé ledviny samostatnou tepnou ze srdečnice (aorty) a odvádějí krev z ledviny samostatnou žilou do zadní duté žíly. Ledvinami prochází asi 20% krve, která je ze srdce vytlačena do aorty. Krevní cévy ledviny lze popsat takto: ledvinová tepna – mezilaloková tepna – oblouková tepna – kolmá tepna kůry – přívodná tepénka glomerulu – glomerulus – odvodná tepénka
glomerulu – kapilární síť nefronu – přímé žilky kůry a pouzdra – obloukové žíly – mezilalokové žíly – ledvinová žíla. Ledvinová tepna vstupuje do branky ledvinné, za kterou se rozděluje na mezilalokové tepny pro jednotlivé úseky, které byly původně samostatnými ledvinovými laloky a následně srostly, ale krevní zásobení zůstalo přísně oddělené. Mezilaloková tepna se v ledvinovém laloku rozděluje na řadu obloukových tepen, které probíhají přesně na rozhraní kůry a dřeně. Z obloukových tepen směrem do dřeně ledviny odstupují přímé tepénky, které se ve dřeni rozdělují do husté kapilární sítě. Směrem do kůry ledviny odstupují z obloukové tepny kolmé tepny, ze kterých se oddělují přívodné tepénky do jednotlivých glomerulů. Z glomerulu odvádí krev odvodná tepénka, která se v blízkosti močového kanálku rozděluje na hustou síť kapilár. Do této kapilární sítě přicházejí potřebné látky a voda při zpětné resorpci z primární moče. Z kapilární sítě kůry i dřeně ledviny se tvoří žilky a žíly, které přivádějí krev do obloukové žíly v těsném sousedství obloukové tepny. Obloukové žíly se spojují do mezilalokových žil a ty do ledvinové žíly, která vystupuje z branky ledvinné a odvádí krev do zadní duté žíly. Část žilného řečiště kůry ledviny se odděluje a vstupuje do vazivového a tukového pouzdra ledviny a odsud se vrací do mezilalokových žil ledviny. Inervace ledviny je zajištěna autonomními nervy, které přicházejí z břišní dutiny. Tato postgangliová nervová vlákna sympatiku a parasympatiku vstupují do vaziva okolo velkých cév ledviny a ovlivňují průtok krve ledvinou.
5.1.2. Močovod (ureter) Je tvořen dlouhou svalovou trubicí, která vystupuje z branky ledvinné, probíhá kaudálním směrem nad pobřišnicí na stropu břišní dutiny. U přední hrany pánve se močovod stáčí mediálně. U samců vstupuje do laterálního vazu močového měchýře, překříží chámovod a dosahuje na dorzální plochu močového měchýře. U samic se močovod připojuje k širokým vazům děložním a opět směřuje na dorzální plochu močového měchýře. Před krčkem močového měchýře vstupuje močovod na levé i pravé straně velice šikmo do stěny močového měchýře. Močovody probíhají mezi svalovou stěnou a sliznicí až se pod ostrým úhlem otevírají do dutiny měchýře. Toto uspořádání konce močovodu zabraňuje při plnění močového měchýře zpětnému tlaku moče do ledviny. Stěna močovodu je tvořena ze dvou vrstev hladké svaloviny (vnější podélná a vnitřní kruhová). Vnitřní plocha stěny je pokryta sliznicí, která tvoří vysoké podélné řasy, s vrstevnatým kubickým epitelem – urotelem. Na vnějším povrchu močovodu je vrstva řídkého vaziva (tunica adventitia).
5.1.3. Močový měchýř (vesica urinaria) je vakovitý útvar, ve kterém se hromadí definitivní moč. Prázdný močový měchýř je celý uložen na dně dutiny pánevní na stydké sponě. Při naplnění se rozšiřuje kraniálním směrem do dutiny břišní. Hrot močového měchýře (vertex vesicae) směřuje kraniálně, následuje velké tělo močového měchýře (corpus vesicae) a kaudálním směrem obrácený krček močového měchýře (cervix vesicae). Z povrchu močového měchýře odstupují dva postranní vazy (ligamenta vesicae lateralia), která ho připoutávají ke vnitřní stěně pánevní dutiny. Prostřední vaz (ligamentum vesicae medianum) poutá močový měchýř k pánevní sponě a je v něm urachus, zbytek prenatálního spojení s alantoidovým vakem. Až ke krčku močového měchýře zasahuje a k jeho povrchu je připojena pobřišnice (peritoneum), která přechází na vazy. Stěna močového měchýře je tvořena hladkou svalovinou ve třech vrstvách, vnější šikmou, střední kruhovou a vnitřní podélnou. Na krčku močového měchýře je z hladké
svaloviny formován kruhový svěrač (m. sphincter vesicae). Vnitřek močového měchýře je vystlán vysokou sliznicí, která je pokryta přechodním epitelem – urotelem. Sliznice se skládá v podélné řasy, které se při plnění močového měchýře vyhlazují. Dvě řasy, které směřují od vyústění močovodů ke krčku, zůstávají zachovány jako močové hřebeny (cristae urethrales) a dále zasahují do začátku močové trubice, u samců končí na semenném hrbolku. Krevní zásobení močového měchýře je zajištěno u samců z prostatické tepny, nebo vaginální tepny u samic. Inervaci zajišťují autonomní nervy.
5.1.4. Močová trubice (urethra) Tato trubice odvádí moč z těla ven. Svojí stavbou a délkou se výrazně liší u samců a u samic. U samic je močová trubice pružná a krátká. Probíhá na dně pánve kaudálním směrem, šikmo prochází stěnou pochvy a otevírá se na dno poševní předsíně těsně u panenské blány (hymen). U klisny je její délka asi 7-10 cm a je poměrně široká. U samců je dlouhá močová trubice rozdělena na pánevní část (pars pelvina) a pyjovou část (pars penina). Pánevní část začíná na krčku močového měchýře a končí na kaudální hraně desky sedací kosti, kde močová trubice opouští pánevní dutinu. Od vyústění prostaty je močová trubice společným vývodem cest močových a cest pohlavních. Pyjová část močové trubice je součástí pyje a končí otevřeným vývodem na žaludu pyje (glans penis). Stěnu močové trubice tvoří řídké vazivo, pod kterým je dvojitá svalová vrstva (vnější podélná, vnitřní kruhová) ke které se z laterální a dorzální strany přikládá příčně žíhaný sval močové trubice (m. urethralis). Vnitřní stěna je pokryta zřasenou sliznicí s epitelem, v přední části urotelem, který přechází ve vrstevnatý dlaždicový epitel. U krčku močového měchýře je ve stěně močové trubice vytvořen druhý hladkosvalový svěrač a příčně žíhaný sval močové trubice (m. urethralis), který zajišťuje funkci vůlí ovladatelného svěrače. U hřebce se ve sliznici kraniálního úseku močové trubice nacházejí tubuloalveolární hlenové žlázky.
5.2. Pohlavní ústrojí (organa genitalia) Pohlavní orgány jsou jediné orgány, které neslouží zachování jedince, ale slouží zachování druhu. Rozeznáváme samčí a samičí pohlavní ústrojí, které mají tyto hlavní funkce: - produkce pohlavních buněk - produkce pohlavních hormonů - pohlavní styk (páření) - spojení pohlavních buněk samce a samice (oplození) - vývoj nového jedince do porodní zralosti (březost) Pro tyto funkce jsou pohlavní orgány upraveny a v průběhu pohlavních cyklů, u samic také v období březosti, procházejí určitými změnami. Pohlavní ústrojí se vyvíjí z indiferentních základů, které se do konce embryonálního období diferencují na orgány samčí a orgány samičí. Četné útvary však zůstávají homologické, jak ukazuje několik příkladů v následující tabulce. Odstranění pohlavního ústrojí, nebo některých jeho částí, neohrožuje život jedince, čehož se využívá u zvířat, která nejsou zařazena do plemenitby. Odstranění pohlavních žláz usnadní výkrm na maso, maso ztratí nepříjemný pach, zvířata jsou mírnější a lépe ovladatelní, nevyhledávají jedince opačného pohlaví, přestanou se toulat.
Samec Varle - testis Závěs varlete – mesorchium Závěs nadvarlete - mesepididymis Vlastní vaz varlete – lig. testis proprium Vaz ocasu nadvarlete - lig.caudae epididymis Varletní štěrbina - bursa testicularis Šourek – scrotum Šev šourku – raphe scroti Pyj – penis
Samice Vaječník – ovarium Vaječníkové okruží – mesovarium Závěs vejcovodu – mesosalpinx Vlastní vaz vaječníku – lig .ovarii proprium Široký vaz děložní – lig.teres uteri Vaječníkový vak - bursa ovarica Velké stydké pysky – labia pudendi Stydká štěrbina – rima pudendi Poštěváček - clitoris
5.2.1. Samčí pohlavní orgány (organa genitalia masculina) Samčí pohlavní soustava je tvořena z pohlavní žlázy (varle) a vývodných pohlavních cest. Ve varlatech se tvoří samčí pohlavní buňky (spermie) a samčí pohlavní hormony. V první části vývodných cest, kanálku nadvarlete, spermie dozrávají a hromadí se. Chámovodem jsou spermie dopraveny do močové trubice, kde se smísí se sekrety přídatných pohlavních žláz a vytvoří semeno (sperma). To je při kopulaci dopraveno močovou trubicí v pyji do pohlavních orgánů samice.
5.2.1.1. Varle (testis, orchis) Varle je párový orgán, který vzniká embryonálně na urogenitální liště na stropu tělní dutiny. Varlata se tedy tvoří u předního okraje ledvin a odsud se přesouvají do místa jejich definitivního uložení. U většiny savců, včetně koně, varlata sestupují břišní dutinou a tříselným kanálem do šourku (scrotum), kde je nižší teplota než je teplota rektální. Nižší teplota je nezbytná pro úspěšné biologické dozrávání spermií v nadvarleti. Varle je při sestupu od stropu břišní dutiny vedeno vazivovým pruhem, kormidlem varlat (gubernaculum testis), které začíná na kaudálním okraji varlat a končí v kůži u vrcholu šourku. Varlata sestupují z břišní dutiny tříselným kanálem do poševního výběžku pobřišnice (processus vaginalis peritonei), který je v šourku a tvoří první obal varlete. Kormidlo varlat se postupně zkracuje, až z něho zůstane pouze krátký šourkový vaz (ligamentum scroti). Varlata u hřebečka sestupují do šourku od doby porodu do prvních dvou týdnů po porodu. Pokud varlata nesestoupí do šourku tak to označujeme za jednostranný nebo oboustranný kryptorchizmus. Takový samec je méně plodný nebo zcela neplodný, a protože se tato vada dědí, je vyřazován z chovu. U hřebce mají varlata vejčitý tvar. Jejich hmotnost je u každého 250-300 gr, levé varle bývá větší. Při umístění v šourku je podélná osa varlat hřebce skoro vodorovná, hlava nadvarlete směřuje kraniálně a ocas nadvarlete kaudálně, přičemž nadvarle je upevněno na dorzální ploše varlete. Na povrchu varlete je silné vazivové pouzdro (tunica albuginea) ve kterém klikatě probíhají viditelné krevní cévy. Vazivo tvoří kostru celého orgánu. Uvnitř varlete vazivo odděluje jednotlivé lalůčky a uprostřed varlete tvoří vazivový střed (mediastinum testis). Varletní lalůčky (lobuli testis) mají pyramidální tvar se širší základnou pod povrchem varlete a hrotem u středu varlete. V každém lalůčku je 2-5 stočených semenotvorných kanálků (tubuli
seminiferi contorti), které začínají slepě pod vazivovým pouzdrem varlete (tunica albuginea) a končí společně přímým kanálkem (tubuli seminiferi recti) ve vazivovém středu varlete. Stočený semenotvorný kanálek (tubulus seminiferus contortus) je ohraničen silnou bazální membránou na kterou nasedá vysoký zárodečný epitel. Kanálky mají silně zvlněný průběh, v lalůčku se proplétají a na mnoha místech vzájemně spojují. Délka jednoho rozvinutého kanálku je 50-80 cm (počítáme-li 200 lalůčků v jednom varleti, 4 kanálky v jednom lalůčku a 60 cm délku jednoho lalůčku, tak délka semenotvorných kanálků z jednoho varlete je asi 480 m a v součtu obou varlat skoro 1 kilometr). Šířka semenotvorného kanálku je 100-300 µm u plodného hřebce. U hřebečka před začátkem puberty je šířka kanálku mnohem menší, protože vnitřní epitel je jednovrstevný a řada kanálků nemá vnitřní lumen. Zárodečný (spermatogenní) epitel – je vysoký vícevrstevný epitel, ve kterém jsou podpůrné (Sertoliho) buňky a spermatogenní buňky v různém stádiu vývoje. Podpůrné (Sertoliho) buňky – jsou dosti pravidelně rozloženy v ploše epitelu kanálku. Jsou to tělní (somatické) buňky, které tvoří kostru vysokého zárodečného epitelu. Svými výběžky se vkládají mezi zárodečné buňky, které chrání, vyživují a podporují jejich zrání a přeměnu na spermie. Pro správný průběh spermatogeneze jsou Sertoliho buňky zcela nezbytné. Každá zárodečná buňka epitelu se fyzicky dotýká části Sertoliho buňky, která pro zrající zárodečnou buňku vytváří specifické biochemické prostředí. Každá Sertoliho buňka může podporovat jen určitý počet zárodečných buněk. Během pohlavního života samce je počet Sertoliho buněk v zárodečném epitelu konstantní. Spermatidy, které se přeměňují na spermie, jsou zanořeny do výběžků Sertoliho buňky, která jim dodává růstové faktory a živiny, odvádí zplodiny metabolizmu a likviduje zbytky cytoplazmy, kterých se spermatida zbavuje při své přeměně na malou spermii. Sertoliho buňka je objemově velká a vysoká buňka s mnoha výběžky. Bazální část této buňky nasedá na bazální membránu semenotvorného kanálku a apikální část buňky dosahuje až k vrcholu zárodečného epitelu, k lumen kanálku. V bazální části Sertoliho buňky je velké laločnaté jádro s výrazným jadérkem a může být přítomen barvitelný krystaloid nebo lipofuchsínová granula. Tělo Sertoliho buňky vytváří velké množství výběžků, které se vsouvají mezi jednotlivé zárodečné buňky a jsou s nimi spojeny pevnými spoji (desmozóm) a propustnými spoji (gap-junction). Do apikální části Sertoliho buňky se vmáčknou spermatidy, které se zde přeměňují na morfologicky hotové spermie. Sertoliho buňky se velmi málo dělí a přetrvávají v epitelu semenotvorného kanálku dlouhou dobu. Spermatogenní buňky zárodečného epitelu jsou zastoupenu spermatogonií, spermatocytem I. řádu, spermatocytem II. řádu, spermatidou a tvořící se spermií. Spermatogenezi můžeme rozdělit na tři základní fáze: fáze množení, fáze růstu a fáze zrání. Samostatnou fází vývoje je spermatohistogeneze, čili přeměna kulaté spermatidy na malou bičíkatou spermii. Fáze množení – probíhá u stěny semenotvorného kanálku ve vrstvě, kterou označujeme jako pásmo mitózy. Základní buňkou je spermatogonie, která představuje kmenovou buňku spermatogenního cyklu. Spermatogonie je kulatá až oválná buňka s kulovitým výrazným jádrem, která dosedá na bazální membránu semenotvorného kanálku. Tato buňka se mitoticky rozdělí na A-spermatogonii, která jako kmenová buňka zůstává u bazální membrány kanálku, a na B-spermatogonii, která se dále mitoticky dělí na řadu nových buněk, které tvoří vyšší vrstvu zárodečného epitelu. Výsledkem fáze množení jsou spermatocyty I. řádu (primární spermatocyty), které vstupují do druhé fáze, a tou je fáze růstu. Fáze růstu – spermatocyt I. řádu se zvětší, doplní zásobní látky, obnoví cytoskelet a projde S-fází buněčného cyklu, kdy se zdvojí genetický materiál buňky a buňka se stává tetraploidní. Tato buňka má 4 sady genetické informace – má 2 sady chromozomů a každý chromozom je tvořen ze dvou chromatid. Spermatocyt I. řádu se stává velkou kulovitou buňkou s kulovitým jádrem, které má barvitelný chromatin u jaderné membrány a střed jádra je světlý. V tomto
stádiu probíhá v buňce dlouhá a složitá profáze prvního meiotického dělení, která zahrnuje i výměnu částí homologních chromozomů (crossing ower). Tato buňka vstupuje do fáze zrání a je zhruba uprostřed výšky zárodečného epitelu. Fáze zrání - je redukční meiotické dělení buněk. Zahrnuje dvě buněčná dělení těsně za sebou, přičemž mezi prvním a druhým dělením se nevytvoří interfázní jádro a je vynechána S-fáze buněčného cyklu. Spermatocyt I. řádu se nejprve rozdělí na dva menší spermatocyty II. řádu, které mají poloviční (haploidní) počet chromozomů, ale každý chromozom je tvořen ze dvou stejných chromatid. Každá buňka tedy má haploidní počet chromozomů, ale diploidní množství DNA. Spermatocyt II. řádu okamžitě vstupuje do druhého meiotického dělení, kdy se rozdělí na dvě spermatidy. Při tomto dělení se každý chromozom rozdělí na dvě samostatné chromatidy pro dvě dceřiná jádra. Spermatida je malá kulovitá buňka ve vrstvě u vrcholu zárodečného epitelu u lumen semenotvorného kanálku. Spermatida má poloviční počet chromozomů a každý chromozom má jen jednu chromatidu, je to buňka zcela haploidní. Tato buňka se vsune mezi výběžky Sertoliho buňky na vrcholu zárodečného epitelu a přemění se na malou spermii s bičíkem. Spermatohistogeneze – je proces přeměny kulaté spermatidy na spermii a je označován jako metamorfóza. Zahrnuje jak změny ve vnitřním uspořádání buňky, tak i změny tvaru a velikosti buňky. Nejprve se v kulaté spermatidě polohou Golgiho komplexu u jádra buňky určí apikální pól budoucí spermie, který směřuje do Sertoliho buňky. Z Golgiho komplexu se na povrchu apikální části jádra vytvoří akrozomální čapka. Jádro a celá buňka se smáčkne a prodlouží. Všechny buněčné organely, mimo tvořící se akrozom, se přesouvají k opačnému, bazálnímu, pólu jádra v prodlužující se buňce. Zde se k jádru přiloží centrozom se dvěma centrioly, a tím se vytvoří základ krčku spermie. Z distálního centriolu se prodlužováním mikrotubulů formují sady osových vláken budoucího bičíku spermie. Prodloužené jádro spermatidy se zmenšuje tím, že se zahušťuje chromatin a ještě se objemnější proteiny, histony, v chromatinu vymění za malé a konzervativní proteiny, protamíny. Chromatin se kondenzuje tak, že ztrácí vnitřní strukturu i při pozorování ve velkém zvětšení elektronovým mikroskopem. Kolem tvořícího se bičíku, který směřuje ze zárodečného epitelu do lumen semenotvorného kanálku, se nahromadí mitochondrie a po vzájemném spojení do řetízku vytvoří mitochondriální spirálu kolem spojovací části bičíku,těsně za krčkem spermie. Celá spermie zůstává pokryta zevní cytoplazmatickou membránou a u spojovací části bičíku spermie se vytvoří cytoplazmatická kapka, váček se zbytkem nepotřebné cytoplazmy, která se odpojí a vstřebá v nadvarletním kanálku. Morfologicky hotová spermie se odpojí od Sertoliho buňky do lumen semenotvorného kanálku a je pasivně posunována do vývodných cest varlete a kanálku nadvarlete. Biologicky nezralé spermie se ve vývodných cestách aktivně nepohybují, vlastní pohyblivost získávají až po smíchání se sekretem předstojné žlázy v močové trubici při ejakulaci. V určitou dobu se hotové spermie uvolňují ze zárodečného epitelu v jednom úseku semenotvorného kanálku a na sousedním úseku probíhá např. fáze množení a na vedlejším úseku fáze zrání apod. Spermatogenní cykly probíhají ve vlnách po epitelu v celém semenotvorném kanálku. Každý semenotvorný kanálek, jako jeden celek, uvolňuje plynule dané množství morfologicky hotových spermií. U hřebce vyprodukují varlata každý den asi 510 miliard spermií. Vmezeřené (intersticiální) vazivo - je řídké retikulární vazivo, které vyplňuje malé prostory mezi semenotvornými kanálky varlete, mechanicky je spojuje a fixuje, zajišťuje krevní a mízní síť parenchymu varlete a inervaci tkáně. Leydigovy (intersticiální) buňky – jsou součástí vmezeřeného vaziva a jsou ve vazivu jednotlivě nebo v malých skupinkách. Jsou vždy v těsném sousedství krevní cévy, kam také
předávají své produkty. Tyto buňky mají charakter rozptýlené (disiminované) žlázy s vnitřní sekrecí. Žláza produkuje samčí pohlavní hormon testosteron (dihydrotestosteron, androsteron). Tento hormon řídí vznik pohlaví, sexuální diferenciaci, tvorbu sekundárních pohlavních znaků, růst penisu a přídatných pohlavních žláz, formování pohlavního pudu a samčího pohlavního chování. Leydigovy buňky jsou větší buňky nepravidelného tvaru s excentricky uloženým světlým jádrem a výraznými jadérky. Cytoplazma buňky je zrnitá s přítomností sekrečních zrn a tukových kapének. U hřebce jsou v cytoplazmě Leydigových buněk silně barvitelná zrna bílkovin (Reinekovy krystaly) v podobě krátkých tyčinek. Přímé kanálky (tubuli recti) – vznikají spojením několika stočených semenotvorných kanálků z jednoho varletního lalůčku. Tyto kanálky ústí do vazivového středu varlete (rete testis). Jsou vystlány jednovrstevným cylindrickým až kubickým epitelem. Tvoří začátek pohlavních vývodných cest hřebce. Varletní síť (rete testis) – je soustava nepravidelných šťerbinovitých prostor ve vazivovém středu varlete, které jsou vzájemně propojené a vytvářejí prostorovou síť. Do těchto prostor, vystlaných jednovrstevným kubickým epitelem, vstupují přímé kanálky z varletních lalůčků a přivádějí masu morfologicky hotových spermií. Odvodné kanálky varlete (ductuli efferentes) – vedou z rete testis varletní brankou (porta mediastini) do hlavy nadvarlete. U hřebce to je 12-23 přímých kanálků, které se v hlavě nadvarlete spirálovitě stáčejí a tvoří kuželovité lalůčky spojené vazivem do jednoho útvaru – hlavy nadvarlete. Stěna kanálku je z vazivové blanky (membrana propria) na které je z vnější strany vrstva hladkosvalových buněk. Vnitřek je vystlán epitelem, který má vysoké cylindrické buňky s řasinkami, cylindrické buňky s mikroklky (buňky resorpční) a nižší sekreční buňky. Těmito kanálky jsou nepohyblivé spermie posunovány do dalších části vývodných pohlavních cest hřebce. U mladých pohlavně nedospělých hřebečků jsou varletní kanálky úzké, většinou bez viditelného lumen a vystlány jen jednou vrstvou buněk, kterou tvoří základní spermatogonie a podpůrné Sertoliho buňky. Varlata jsou celkově menší. Těsně před pubertou se ve vmezeřeném vazivu diferencují a množí Leydigovy buňky, které zvyšují produkci hormonu testosteronu. Kanálky varlete se rozšiřují a je v nich vidět volné lumen. V období puberty (1218 měsíců věku) se tvoří dostatečné množství pohlavních hormonů a může se tedy dokončit vývoj pohlavních orgánů a zahájit plynulá tvorba spermií schopných oplodnit vajíčko. Po dosažení pohlavní dospělosti běží spermatogeneze s produkcí spermií a tvorbou pohlavních hormonů ve varlatech po celý život hřebce. Vnější podmínky a věk hřebce ovlivňují kvalitu těchto funkcí a množství biologicky kvalitních spermií. Ve vysokém stáří hřebce dochází k destrukci zárodečného epitelu semenotvorných kanálků, zmnožení vaziva na úkor kanálků i Leydigových buněk, čímž poklesne tvorba testosteronu, který je nahrazen estrogeny z kůry nadledviny. To vede ke změně chování, temperamentu a vzhledu hřebce.
5.2.1.2.
Vývodné pohlavní cesty – slouží u hřebce (i všech ostatních samců) k transportu spermií z varlat do močové trubice. Během této doby spermie ve vývodných cestách biologicky dozrávají, hromadí se a přežívají před ejakulací. Vývodné cesty začínají přímými kanálky ve varleti, pokračují vývodnými kanálky varlat do nadvarletního kanálku a chámovodem do močové trubice.
Nadvarle (epididymis) – je kyjovitý útvar, který je pevně spojen s povrchem varlete a u hřebce je skutečně nad varletem (odtud jeho český název), tedy na jeho dorzální ploše. Popisujeme tři jeho části, hlavu, tělo a ocas nadvarlete. Základem nadvarlete je úzký, dlouhý, zřasený a stočený kanálek, který prochází celým nadvarletem a v ocasu nadvarlete na něho navazuje chámovod. Kanálek nadvarlete je tvořen silnou bazální membránou, na kterou nasedá
vysoký jednovrstevný, víceřadý, cylindrický, řasinkový epitel. V epitelu jsou také vysoké sekreční buňky bez řasinek. V určitých pravidelných odstupech jsou intraepiteliální žlázky. Na vnější straně kanálků jsou k bazální membráně připojeny hladkosvalové buňky. Mezi kličkami kanálku je řídké vmezeřené vazivo s bohatou sítí krevních a mízních kapilár. Spermie jsou kanálkem pasivně unášeny v tekutině, která se v kanálku nadvarlete tvoří a je kmitáním řasinek posunována směrem k ocasu nadvarlete. Sekret nadvarletního kanálku umožňuje biologické dozrávání spermií, čili kompletaci enzymatické výbavy spermií jak pro samostatný pohyb bičíku spermie, tak pro kapacitaci spermie v pohlavních orgánech klisny, při které dochází k aktivaci povrchových struktur spermie tak, aby se mohla spermie připojit na obaly vajíčka. Stejně se spermie připravují pro akrozomální reakci, která jim umožní jejich pronikání přes obaly vajíčka do cytoplazmy vajíčka a jeho oplození. Sekret také zajišťuje výživu spermií, ale svým složením zabraňuje aktivnímu pohybu spermií. Spermie se začnou aktivně pohybovat až v močové trubici hřebce po smíchání se sekrety přídatných pohlavních žláz. Vysoký obsah RNázy v sekretu také redukuje cytoplazmatickou dědičnost spermie a schopnost množení mitochondrií spermie v cytoplazmě vajíčka. Celková délka nadvarletního kanálku je značná, u hřebce se uvádí 72-81 metrů, avšak průměr kanálku je pouze 100-300 µm. Směrem k ocasu nadvarlete se postupně rozšiřuje až na 2-3 mm. V kanálku ocasu nadvarlete mají buňky epitelu schopnost resorbovat zbytky cytoplazmy spermie (cytoplazmatickou kapku) a také resorbovat odumřelé spermie, které nebyly využity k ejakulaci. Přetlak dozrálých spermií v ocasu nadvarlete je u mladých hřebců mezi pářením uvolňován polucí (samovolnou ejakulací bez pohlavního vzrušení), uvolněním spermií do moče při močení nebo jejich postupnou resorpcí epitelem ocasu nadvarlete. Hlava nadvarlete (caput epididymidis) – je pevně spojena s kraniální částí (hlavou) varlete hřebce širokou vazivovou blánou. Do hlavy nadvarlete vstupuje 12-23 varletních kanálků, které se postupně spojují do jednoho nadvarletního kanálku. Každý varletní odvodný kanálek před spojením s dalším kanálkem vytvoří samostatný lalůček hlavy nadvarlete. Tělo nadvarlete (corpus epididymidis) – plynule navazuje na hlavu nadvarlete, směřuje kaudálně a má tvar protáhlého oblouku. Tělo nadvarlete je připojeno k varleti dvojitou vazivovou blánou, ve které je vytvořena dutina – bursa testicularis. Ocas nadvarlete (cauda epididymidis) – je pokračováním těla nadvarlete, které se u kaudálního konce varlete hřebce rozšíří v tupě zakončený kužel a částečně přesahuje kaudální okraj varlete. Ocas nadvarlete je vazy fixován k varleti a také ke stěně šourku. Základem těla a ocasu nadvarlete je vývodný kanálek nadvarlete, který je stočený do četných meandrovitých kliček, které jsou vzájemně spojené řídkým vazivem. Směrem k ocasu nadvarlete se kanálek rozšiřuje a přibývá i vmezeřeného vaziva. Proto je ocas nadvarlete rozšířený a může sloužit ke shromáždění zralých spermií. Chámovod (ductus deferens) – je párová silnostěnná trubička, která spojuje konec ocasu nadvarlete levé a pravé strany s močovou trubicí. U hřebce chámovod nejprve tvoří několik kliček, vstoupí do semenného provazce, kde se vyrovná a se semenným provazcem prochází poševním kanálem do dutiny břišní. V dutině břišní se obrací dorzokaudálním směrem do dutiny pánevní. Zde se oba chámovody přiblíží k mediánní rovině a přikládají se na dorzální plochu močového měchýře, kde kříží močovody. Chámovody se v tomto úseku rozšíří a tvoří vřetenovité ampule chámovodu (ampulla ductus deferentis). Nad krčkem močového měchýře se chámovody opět zužují, vsouvají se pod tělo prostaty, spojí se s vývody měchýřkovitých žláz v krátký ejakulační kanálek, který vyústí uvnitř močové trubice na semenném hrbolku. Vyústění je na stropě močové trubice těsně za druhým svěračem močových cest.
Silná stěna chámovodu je tvořena ze sliznice s cylindrickým epitelem, který má na několika úsecích mikroklky. Vlastní stěnu tvoří silná vrstva hladké svaloviny, která je uspořádána do hustých i protáhlých spirál. Při ejakulaci postupné prudké smrštění této svaloviny vystříkne spermie se sekretem do močové trubice. Na povrchu chámovodu je silná vazivová blána, která upevňuje chámovod k okolním tkáním a orgánům. Semenný provazec (funiculus spermaticus) – je protáhlý kuželovitý útvar mezi varletem a vnitřní stěnou břišní. Svojí širokou základnou přiléhá k nadvarleti a dosahuje na povrch varlete dvojitou vazivovou blanou. Zúžená část semenného provazce vstupuje do poševního kanálu a dosahuje až k vnitřní ploše stěny břicha. Je to vazivový útvar, který upevňuje varlata v šourku. Součástí semenného provazce je povrchová silná vazivová blána, která je součástí pobřišnice (processus vaginalis peritonei), obaluje celé varle a přirůstá k obalu nadvarlete. Semenným provazcem prochází chámovody, je zde varletní tepna a varletní žíla, mízní céva, nervy a řídké vazivo, které vše spojuje. Sval, zvedač varlat (m. cremaster), se přikládá k semennému provazci, odděluje se od vnitřního šikmého břišního svalu a příčného břišního svalu, prochází poševním kanálem a v šourku se připojuje k vazivovému obalu varlat (tunica vaginalis et fascia spermatica). Tento sval při smrštění přitahuje varlata ke stěně břišní.
5.2.1.3.
Přídatné pohlavní žlázy (glandulae genitales accessoriae) jsou uloženy v pánevní dutině samců v blízkosti chámovodů a močové trubice. Tyto žlázy v době ejakulace přidávají svůj sekret ke spermiím a malému množství tekutiny z nadvarlete jako semennou plazmu a tvoří tak společně ejakulát. Sekrety těchto žláz tvoří přirozené ředidlo spermií, dodávají látky pro výživu spermií a upravují spermiím prostředí v močové trubici hřebce i v pohlavním ústrojí klisny. Patří sem měchýřkovitá žláza, předstojná žláza a bulbouretrální žláza. Měchýřkovitá žláza (glandula vesicularis), starší název je váčky semenné (vesicula seminalis) – je párová žláza protáhlého tvaru v těsném sousedství ampule chámovodu na dorzální ploše močového měchýře. U hřebce má žláza hladký povrch. Uvnitř jsou oddělené váčky s hladkou stěnou, ale se zřasenou žlázovou sliznicí. Žláza je asi 10-15 cm dlouhá a 3-5 cm silná, tvoří bělavý, slabě zásaditý sekret, který se uvolňuje při ejakulaci do společného ejakulačního kanálku s chámovody. Předstojná žláza (prostata) – se u hřebce přikládá těsně k semenným váčkům a je tvořena ze dvou laloků spojených můstkem. Laloky jsou 5-9 cm dlouhé a 10 cm široké. U hřebce je pouze tělo prostaty na povrchu močové trubice, rozptýlená část ve stěně močové trubice zcela chybí. Žláza vyúsťuje četnými vývody vedle semenného hrbolku do močové trubice. Tvoří řídký mlékovitý sekret charakteristického pachu, který je součástí semenné plazmy. Bulbouretrální (Cowperova) žláza (glandula bulbourethralis) – je párová žláza na konci pánevního úseku močové trubice hřebce před jejím ohybem (bulbus urethralis) přes kaudální hranu sedací kosti. Oba laloky žlázy jsou oválné, asi 4 cm dlouhé a 2,5 cm široké. Do močové trubice ústí žláza 6-8 vývody s řadou malých otvorů, které jsou někdy pokládány za roztroušenou část žlázy. Vlastní sekreční část žlázy připomíná tubulózní žlázu s vysokým žlázovým epitelem, který se po vyprázdnění žlázy sníží.
5.2.1.4. Pyj (penis) – je pářící orgán samce, který slouží k dopravení semene (spermatu) do pohlavního ústrojí samice. Pro tuto funkci je vybaven topořivými tělesy, která při pohlavním vzrušení zvětší a zpevní pyj tak, aby mohl být zasunut do pochvy samice. Na pyji popisujeme kořen pyje, tělo pyje a žalud pyje. Kořen pyje (radix penis) – odstupuje jako dvě ramena hlavního topořivého tělesa od kaudální zaoblené plochy desky sedací kosti pánve. Ramena se spojují do jednoho útvaru, který směřuje kraniálně z hráze do mezinoží.
Tělo pyje (corpus penis) – je mohutná hlavní část pyje u hřebce, která je uložena v podkožním vazivu v mezinoží, prochází mezi semennými provazci kraniálním směrem na ventrální plochu břicha, kde končí v předkožce (preputium). Žalud pyje (glans penis) – je volný konec pyje, který má charakteristický tvar pro jednotlivé druhy zvířat a odpovídá místu, kam samec klade sperma do pohlavního ústrojí samice. Žalud pyje je ukryt v předkožce a vysouvá se při ztopoření pyje. Žalud pyje hřebce je mohutný, zúženým krčkem je oddělen od těla pyje, následuje kloboukovitá rozšířená korunka žaludu, ve které je centrální jamka s vyústěním močové trubice. Žalud pyje hřebce je při kopulaci přitisknut těsně na děložní čípek klisny a sperma je vstřiknuto do děložního krčku klisny. Základní tkání pyje je vazivo. Hlavní součástí pyje jsou topořivá tělesa, močová trubice, krevní cévy, nervy a pomocné svaly. Hlavní (párové) topořivé těleso (corpora cavernosa) – je vazivový útvar, který tvoří podstatnou část kořene a těla pyje. Tvoří ho pevná vazivová blána z hutného kolagenního vaziva (tunica albuginea) na povrchu pyje, která vysílá dovnitř hustou síť přepážek. Ty rozdělují vnitřní prostor na soustavu vzájemně propojených dutinek do prostorové sítě. Dutinky jsou vystlány endotelem a při ztopoření (erekci) se plní tepennou krví a tvoří vlastní topořivou tkáň. Krev přivádějí spirálovité tepny od hluboké tepny penisu (a. profunda penis) a jsou to tepny uzavíracího typu, které mají pod endotelem ztluštění z hladkosvalových buněk. Tato ztluštění mohou regulovat průtok krve, nebo cévu zcela uzavřít. Krev z topořivého tělesa odvádějí tenkostěnné žíly, kterých je méně, proto se krev v topořivém tělese hromadí a tím dochází k erekci. Hlavní topořivé těleso má na dorzální ploše mělký žlábek pro cévy (sulcus dorsalis penis) a na ventrální ploše hluboký žlábek pro močovou trubici a houbovité topořivé těleso (sulcus urethralis). Hlavní topořivé těleso začíná jako dvě samostatná ramena (kořen), která se spojí do jednoho tělesa, ale náznak středové přepážky je v celém průběhu zachován. Houbovité (nepárové) topořivé těleso (corpus spongiosum penis) – doprovází močovou trubici a při erekci pyje zabraňuje smáčknutí močové trubice, které by zabránilo ejakulaci. Vytváří tvar trubice, která začíná už v pánevní části jako tenká vrstva, která se po výstupu močové trubice z pánevní dutiny rozšíří a ve ventrálním žlábku pyje obaluje močovou trubici až k žaludu pyje. Na kraniálním konci pyje se houbovité topořivé těleso rozšíří v houbovité topořivé těleso žaludu pyje. Houbovité topořivé těleso má podobnou stavbu jako hlavní topořivé těleso, je však jemnější stavby a plní se žilnou krví o menším tlaku, proto je při úplné erekci méně tuhé než hlavní topořivé těleso. Samčí močová trubice začíná na krčku močového měchýře na dně pánevní dutiny. Lze ji rozdělit na pánevní část a houbovitou část. Do pánevní části močové trubice vstupují chámovody a vývody přídatných pohlavních žláz. Svalovina stěny močové trubice je tvořena vnitřní vrstvou hladké svaloviny a vnější vrstvou příčně žíhané svaloviny (m. urethralis), která tvoří vůlí ovladatelný svěrač močové trubice. Houbovitá část močové trubice je vložena do houbovitého topořivého tělesa ve ventrálním žlábku pyje a u hřebce končí až v mělké žaludové jamce na vrcholu žaludu pyje. Ve sliznici této části močové trubice jsou drobné tubuloalveolární žlázky. Epitel močové trubice v pánevní části je tvořen urotelem, který postupně přechází ve vrstevnatý dlaždicový epitel. Pomocné svaly pyje – jsou tři a napomáhají zavedení pyje do pochvy klisny a zatažení ochablého pyje po erekci zpět do předkožky. Zakládají se jako svaly párové.
Stahovač kořene pyje (m. ischiocavernosus) je příčně žíhaný sval, který odstupuje od desky sedací kosti a objímá ramena a krček pyje. Při smrštění pozvedává pyj a přitlačením cév pyje na spodinu sedací kosti zpomaluje odtok krve a tím zvyšuje erekci pyje. Napřimovač pyje (m. bulbospongiosus) je příčně žíhaný sval, který je pokračováním vnějšího svalu močové trubice (m. urethralis) z pánevní dutiny na povrch hlavního topořivého tělesa a zasahuje u hřebce až ke hrotu pyje. Při smrštění zvedá ztopořený pyj a umožňuje jeho zasunutí do pochvy klisny. Zatahovač pyje (m. rectractor penis) je pruh hladké svaloviny, který odstupuje od ocasních obratlů, obchází řitní kanál a hrází postupuje až k pyji. U hřebce tento svalový pruh zasahuje až ke hrotu pyje po jeho ventrální ploše. Při smrštění zatahuje ochablý pyj po erekci zpět do předkožkového vaku. Předkožka (preputium) – je jednoduchá kožní řasa, která má u hřebce ještě vnitřní kruhovou řasu. Je vytvořena na ventrální ploše břicha v mediální rovině v blízkosti pupku. Kožní řasa vytváří toulec ve kterém je uložena distální část pyje. Vnější předkožkový list je tvořen ochlupenou kůží a v místě předkožkového otvoru se vsouvá dovnitř, kde tvoří vnitřní předkožkový list. Ten je bez chlupů a povrch má charakter sliznice. Stejně je tvořena i vnitřní kruhová řasa. Vnitřní list přechází na povrch pyje jako pyjový list. Ve sliznici vnitřního listu jsou mízní uzlíky a specializované předkožkové žlázy, které tvoří předkožkový maz – smegma s charakteristickým samčím pachem. Při erekci a vysunutí pyje z předkožky se vnitřní list i kruhová řasa vyrovnají a pokrývají část těla pyje těsně za žaludem pyje. Podle stavby a velikosti hlavního topořivého tělesa pyje popisujeme základní dva typy pyje. První typ pyje označujeme jako vaskulární typ, který je u hřebce, kocoura a psa. U šelem je pyj doplněn pyjovou kostí (os penis) se žlábkem, která při erekci chrání močovou trubici. Hlavní topořivé těleso pyje má tenké vnitřní přepážky s malým podílem vaziva a větším podílem hladkosvalových buněk, velkými a prostornými váčky do kterých se vměstná velký objem krve. Pyj je v ochablém stavu rovný, měkký, při erekci se zvětší a prodlouží, čímž se vysune z předkožky a je schopen kopulace. Druhý typ pyje označujeme jako fibroelastický typ, který je u přežvýkavců a kance. Tento pyj má hodně kolagenního a elastického vaziva, hlavní topořivé těleso je malé. Pyj je v ochablém stavu tuhý a vytváří v mezinoží samce esovitou kličku. Při erekci se do topořivého tělesa vměstná menší množství krve, pyj se nezvětší, ale vyrovná se esovitá klička, pyj se vysune z předkožky a je schopen kopulace. Erekce u těchto samců nastupuje rychle.
5.2.1.5.
Šourek (scrotum) – je vakovitý orgán, ve kterém jsou uložena varlata
s nadvarlaty a semenné provazce. Embryonálním základem šourku jsou dvě řasy kaudálního konce sinus urogenitalis, které u samce srůstají jako základ šourku, u samic zůstávají samostatné jako základ stydkých pysků. Tento základ šourku se u samců posouvá kranioventrálním směrem až do mezinoží, stydké krajiny, a tím se zvětšuje krajina hráze. U hřebce je na povrchu šourku jemná, tmavě pigmentovaná kůže bez chlupů, která je pevně spojena s vazivově svalovou vrstvou podkoží (tunica dartos), která je zakončena vazivovou blánou. Vrstva hladké svaloviny podkoží může kůži šourku silně zvrásnit a tak pomáhat regulaci teploty uvnitř šourku. Tato vrstva také vytváří střední přepážku mezi pravou a levou dutinou šourku a na vnějším povrchu se v tomto místě projevuje jako šev šourku (raphe scroti). Do vnitřní stěny šourku se vějířovitě zapojuje příčně žíhaný sval, zvedač varlete (m. cremaster), který zvedá varle dorzálním směrem. Další vrstvu stěny šourku tvoří silná vazivová blána, vnitřní povázka varlete, ke které se na vnitřní ploše připojuje nástěnný list poševního obalu (fascia spermatica externa et interna). Tyto dva vazivové listy vznikly vychlípením příčné břišní povázky a nástěnné pobřišnice poševním kanálem do dutiny šourku
a jsou k sobě volně přiloženy. Tyto obaly přecházejí ze stěny šourku na varle, nadvarle a semenný provazec jako okruží varlete (mesorchium), které varlata fixuje, ale dovoluje jim dost velký rozsah pohybu v dutině šourku. Močová trubice, přídatné pohlavní žlázy a penis jsou zásobovány krví z větví vnitřní stydké tepny (a. pudenda interna). Šourek s obaly varlat a předkožka jsou zásobovány krví ze zevní stydké tepny (a. pudenda externa). Samostatnou odbočkou srdečnice (aorty) v bederní oblasti je varletní tepna (a. testicularis), která zásobuje krví varlata, nadvarlata a podstatný úsek chámovodů. Tato tepna při průchodu semenným provazcem tvoří četné husté kličky (na 10 cm délky semenného provazce je 7 m tepny), které jsou opletené jemnými větvičkami varletní žíly. Krev, která odtéká z varlete a nedvarlete, ochlazuje přitékající krev tak, aby se udržela stálá nižší teplota varlat a nadvarlat (protiproudový chladič). Varletní žíla odvádí krev do zadní duté žíly. Z ostatních částí je krev odváděna do stydké žíly.
5.2.1.6. Spermie (spermatozoid, spermatozoon) – je samčí pohlavní buňka. Vzniká přeměnou (spermiohistogenezí) kulaté spermatidy na malou bičíkatou buňku schopnou samostatného pohybu mimo tělo samce. Cílem spermie je proniknutí přes obaly do vajíčka samice, kam donese jednu sadu chromozomů a aktivuje vajíčko k dělení a embryonálnímu vývoji nového jedince. Spermie je tvořena hlavičkou, krčkem, bičíkem a celá je pokryta cytoplazmatickou membránou. Hlavička spermie má oválný tvar a je zploštělá (tvar tenisové rakety). Základem hlavičky je buněčné jádro, které má maximálně zahuštěný (zkondenzovaný) chromatin, v němž ani při vysokém zvětšení v elektronovém mikroskopu není rozlišitelná vnitřní morfologická struktura. Kromě vysoké kondenzace DNA dochází také k výměně bílkovin, histonů, za výrazně menší a stabilnější molekuly protaminů. K rozvolnění chromatinu a zpětnému obnovení histonů dochází až v cytoplazmě vajíčka při oplození. Celé jádro je pokryto dvojitou jadernou membránou. Přední část hlavičky (u hřebce asi 60% plochy) je pokryta akrozomální čapkou. Ta je tvořena vnitřní akrozomální membránou, akrozomální hmotou (matrix) a vnější akrozomální membránou. Akrozomální matrix obsahuje řadu důležitých enzymů (akrozíny, hyaluronidáza aj.), které se uvolní při akrozomální reakci spermie a umožní spermii průnik přes obaly vajíčka až na jeho cytoplazmatickou membránu. Konec akrozomu směrem ke krčku spermie je zeslaben tím, že vnitřní a zevní akrozomální membrána na sebe naléhají. V mikroskopu je to světlejší proužek přes hlavičku spermie, který označujeme jako ekvatoriální segment. Za akrozomem pokračuje postakrozomální čapka ze specifických bílkovin, které tmelí jadernou a zevní cytoplazmatickou membránu. Tvoří pevný obal hlavičky a mají důležitou funkci při kapacitaci spermie a připojení spermie k obalům vajíčka. Konec hlavičku je prohlouben v podobě implantační jamky, do které se vkládá krček spermie. Krček spermie spojuje hlavičku a bičík spermie. Je tvořen ze dvou centriolů a segmentovaného provazce (columna striata). Proximální centriol v implantační jamce hlavičky spermie dává vznik implantační ploténce, ze které vystupují segmentované provazce. Tyto dále pokračují jako 9 hladkých silných vláken první poloviny délky bičíku. K proximálnímu centriolu je kolmo postaven distální centriol, ze kterého vyrůstají 2 středová vlákna a 9 dvojic vláken okolo. Ty tvoří základ celé délky bičíku a označujeme je jako axonema. Vlákna bičíku jsou tvořena z tubulínu a uspořádání je stejné jako u řasinek. Bičík spermie můžeme rozdělit na spojovací část bičíku, hlavní a koncovou část bičíku. Spojovací část bičíku je tvořena úsekem bičíku těsně za krčkem spermie, který je kryt spirálou mitochondrií. Mitochondrie jsou spojené do řetízku a v pravotočivé spirále obtáčejí proximální část bičíku spermie v 50-60 závitech. Tato část slouží k uvolnění energie pro pohyb bičíku.
Hlavní část bičíku navazuje terminálním prstencem na spojovací část a je nejdelší částí bičíku. Základní sada vláken (axonema) a postupně končící vnější sada hladkých silných vláken je pokryta pevnou fibrózní pochvou. Tato pochva je pružná a umožňuje energeticky úsporný pohyb bičíku a tím i celé spermie. Koncová část bičíku představuje krátký úsek s rozvolněnou a neúplnou sadou osových vláken. Rozměry spermie hřebce udané v mikro metrech (µm = tisícina milimetru) hlavička spermie
bičík spermie
délka
šířka
spojovací část
hlavní část
délka spermie
6,3
3,2
8,6
43,7
57,5 – 59,7
5.2.1.7. Semeno (sperma, ejakulát) – je suspense spermií v semenné plazmě. Lze tedy definovat buněčnou část (spermie) a tekutou část (semenná plazma). Počet spermií v ejakulátu je přibližně stejný u různých druhů hospodářských zvířat. Čím je větší objem ejakulátu, tím je menší hustota spermií a naopak. Přežvýkavci mají malý objem semene (1-10 ml) s vysokou hustotou spermií. Opakem je kanec s velkým objemem semene (až 500 ml) a nízkou koncentrací spermií. Průměrný objem semene hřebce je 70 ml a průměrná hustota je 150.000 spermií v 1 mm3 (150 milionů v 1 ml). Tyto hodnoty odpovídají připouštěcímu období hřebců, v mezidobí jsou hodnoty zcela odlišné. Semenná plazma je specifická tekutina, podobná krevní plazmě, která představuje hlavní část objemu semene (u hřebce 96-98%). Je tvořena především sekrety přídatných pohlavních žláz a z malé části sekretem kanálku nadvarlete a chámovodu. Semenná plazma má charakteristické složení, barvu, vůni a vzhled, které jsou typické pro jednotlivé druhy zvířat. Semenná plazma tvoří přirozené prostředí pro spermie, umožňuje jejich aktivní pohyb, dodává spermiím živiny a díky velké pufrovací schopnosti upravuje prostředí, ve kterém se spermie pohybují (močová trubice samce a vnitřní pohlavní cesty samice). Semenná plazma obsahuje minerální látky, bílkoviny, jednoduché cukry, kyselinu citronovou a askorbovou, enzymy a hormony. Podíl sekretu jednotlivých žláz na objemu semenné plazmy je také druhově specifický. Základní ukazatele semene hřebce Rozmezí
Průměr
Objem semene v ml
Více než 20
70
Koncentrace spermií v 1 mm3
Více než 50.000
150.000
pH
7,2
Procento pohyblivých spermií
Více než 70
Rychlost pohybu spermií v µm/s
50
Index endogenních reduktáz
Více než 160
170
Procento patologických spermií
Méně než 40
25
Procento spermií s primární změnou
Méně než 15
12
75
5.2.2. Samičí pohlavní orgány (organa genitalia feminina) Samičí pohlavní orgány lze rozdělit na základní pohlavní žlázu – vaječník, vývodné cesty – vejcovod, děloha, pochva a zevní pohlavní orgány. Tato soustava orgánů slouží u hospodářských savců ke tvorbě samičí pohlavní buňky – vajíčka, hormonů, transportu vajíčka, kopulaci, oplození vajíčka, vývoji embrya a plodu v děloze a porodu živého mláděte. V poševní předsíni se stýkají vývodné cesty pohlavní s vývodnými cestami močovými.
5.2.2.1. Vaječník (ovarium) Vaječník je párová samičí pohlavní žláza. Zakládá se z mediální močopohlavní zárodečné lišty v zárodku samic. Na povrchu základu vaječníku se vytvořil jednovrstevný kubický až cylindrický epitel. Základní (primordiální) zárodečné buňky (primordial germ cells – PGC) vznikají ve stěně žloutkového váčku na rozhraní žloutkového váčku a prvostřeva, odkud se uvolňují a putují embryem až do základů vaječníků. Zde se zařadí do povrchového epitelu, čímž vznikne povrchový zárodečný epitel vaječníků. Zhruba v polovině doby březosti klisny se zárodečný epitel vaječníku samičího plodu začne dělit – fáze množení. Mitoticky se dělí primordiální zárodečné buňky za vzniku ovogonií, které se v podobě buněčných provazců zanořují do povrchové vrstvy vaziva vaječníku. Sousední epiteliální buňky se také mitoticky množí a doprovázejí provazec ovogonií do kůry vaječníku, těmto útvarům se říká kortikální provazce. Takto se ve vaječníku samičího plodu vytvoří několik set tisíc (asi 400 000) primárních zárodečných buněk a dělení buněk zárodečného epitelu se zastaví. Převážná většina velkých primordiálních zárodečných buněk se ze zárodečného epitelu vaječníku odpojí a ztratí se v tělní dutině plodu. Zůstane jen malé množství kmenových zárodečných buněk. Zárodečný epitel na povrchu vaječníku se funkčně změní na krycí kubický epitel, který ale dále označujeme jako zárodečný epitel. Epiteliální buňky, které v kůře vaječníku doprovázejí provazec ovogonií, se dále dělí a vsouvají se mezi jednotlivé ovogonie, které se v této době již nemnoží, a tím je oddělují z kortikálního provazce. Ovogonie obalené jednou vrstvou těchto epiteliálních (folikulárních) buněk tvoří primordiální folikul, přičemž se ploché epiteliální buňky přikládají apikálním koncem k povrchu ovogonie a bazální konce buněk s bazální membránou epitelu tvoří vnější ohraničení primordiálního epitelu. Ve vaječnících plodu se vytvoří zhruba 60 000 – 80 000 primordiálních folikulů, které asi v 7 měsíci březosti (fetálního vývoje klisničky) všechny najednou vstoupí do první fáze redukčního (meiotického) dělení. Toto dělení se však zastaví v posledním stádiu (diplotene) prvního redukčního dělení, čímž z ovogonie vzniká oocyt a folikul s oocytem označujeme jako primární folikul. Další vývoj oocytů a folikulů bude popsán v kapitole ovogeneze a folikulogeneze. Do středového vaziva základu vaječníku vstupují krevní a mízní cévy a nervy a tím vznikne dřeň vaječníků, která zajišťuje jeho fungování. Umístění vaječníku – vaječníky vznikají jako párová žláza na dorzální stěně tělní dutiny, odkud sestupují kaudo-ventrálně k pánevní dutině. U klisny je sestup vaječníků jen malý, asi 8-10 cm od dorzální stěny břišní dutiny na šířku dlaně za ledvinami a asi 4-6 cm kraniálně od konců děložních rohů. Tvar a stavba vaječníku – u klisny je vaječník velký, 5-8 cm dlouhý a 2-3 cm široký. Má tvar bobu nebo kaštanu s výraznou prohlubní – ovulační jamkou. Je upevněn na
vaječníkovém okruží (mesovariu), které je dlouhé asi 15 cm a připojuje se k širokým vazům děložním, kraniální část dosahuje ke stropu břišní dutiny. Vlastní vaječníkový vaz připojuje vaječník k děložnímu rohu. Vaječníkové okruží a přiléhající vejcovodové okruží vytvářejí prohlubeň, vaječníkový vak, ve kterém je vaječník částečně ukryt. Obecná stavba vaječníku – základ celého vaječníku tvoří vazivo, které tvoří dřeň vaječníku, kůru vaječníku a pevnou vrstvu kolagenního vaziva na povrchu – bělavý obal (tunica albuginea). Dřeň vaječníku (medula ovarii) je uvnitř a je prostoupena cévami a nervy. Hlavní vrstvou je kůra vaječníku (cortex ovarií = zona parenchymatosa), kde jsou do vaziva zanořeny vaječníkové folikuly v různém stádiu svého vývoje a u pohlavně dospělých samic žlutá tělíska v různém stádiu regrese. Na pevném vazivovém obalu (tunica albuginea) je krycí epitel většinou kubický. Většina volného povrchu vaječníku slouží jako ovulační plocha, kde se při ovulaci uvolňují vajíčka do přiléhající nálevky vejcovodu a tvoří se žlutá tělíska. Stavba vaječníku klisny – je značně odlišná. Na většině povrchu vaječníku klisny je pevné vazivo kryté pobřišnicí a pod ním vazivo a cévy dřeně vaječníku. Kůra vaječníku s folikuly je uvnitř a k povrchu vaječníku dosahuje jen v místě, které je označeno jako ovulační jamka (fossa ovarii) a zde je na povrchu zárodečný epitel. 5.2.2.1.1. Folikulogeneze – růst a změny folikulu během růstových vln a vaječníkových cyklů vyvolaných a řízených pomocí hormonů. Folikul je buněčný útvar, který obklopuje a chrání vaječnou buňku – oocyt. Je tedy tvořen ze zárodečné buňky – oocytu, folikulárních buněk, hraniční bazální membrány a vazivových buněk obalu folikulu. Ve vnější vrstvě kůry vaječníku je velké množství primárních – zásobních folikulů. Ty jsou tvořeny malým oocytem a jednou vrstvou plochých folikulárních buněk s tenkou bazální membránou. Již před narozením klisničky a až do konce pohlavně aktivního života klisny dochází k růstu folikulů. V každé růstové vlně (která nemusí odpovídat pohlavnímu cyklu) začne růst určitý počet primárních folikulů (někdy až 100 primárních folikulů na jeden ovulační folikul). Začnou se na hormonální popud (FSH – folikuly stimulující hormon) zvětšovat folikulární buňky z plochých až na cylindrické a mitoticky dělit. Začne růst a zvětšovat svůj objem také oocyt. Takový folikul označujeme jako rostoucí folikul = sekundární folikul. Když jsou okolo oocytu dvě vrstvy folikulárních buněk, označované také jako granulózní buňky (mají v cytoplazmě barvitelná granula), začne se na rozhraní mezi cytoplazmatickou membránou oocytu a folikulárními buňkami vytvářet vrstva homogenní hmoty, tvořená především glykoproteiny, kterou nazýváme zona pellucida. Když je okolo rostoucího oocytu 3 a více vrstev folikulárních buněk tak se začnou mezi folikulárními buňkami objevovat prostory vyplněné folikulární tekutinou, které se postupně spojují do větších dutin. Takový folikul označujeme jako časně antrální folikul. V takovém folikulu většinou končí růst oocytu na velikosti 120-150 µm vnitřního průměru. Prostory mezi folikulárními buňkami se spojí do jedné velké folikulární dutiny (antrum folliculi) vyplněné folikulární tekutinou (liquor folliculi). Tím vznikne antrální folikul = terciální folikul s vnitřním průměrem 3-6 mm. Okolo časně antrálního folikulu se začne cirkulárně organizovat přiléhající vazivo kůry vaječníku a tvoří se vazivový obal, který označujeme jako theca folliculi. V dalším vývoji se tato vrstva viditelně dělí na vnější vrstvu (theca folliculi externa), která je z kolagenních vláken a fibrocytů, a na vnitřní vrstvu (theca folliculi interna) ve které je větší podíl buněk a jsou zde i buňky sekreční. V této vrstvě se tvoří vaječníkové hormony – estrogeny, které pronikají do folikulu a ve vrstvě granulózních buněk se kompletují. Vnitřní stěna folikulu je tvořena z několika vrstev granulózních (folikulárních) buněk okolo velké folikulární dutiny vyplněné folikulární tekutinou. Oocyt je zanořen ve folikulárních buňkách na stěně vnitřní folikulu odvrácené od povrchu vaječníku. Tento folikul dále roste množením folikulárních buněk, ale především přibývá folikulární tekutina a zvětšuje se folikulární dutina. Tento
folikul vyklene povrch vaječníku a označujeme ho jako ovulační (Graafův) folikul. Těsně před ovulací má tento folikul velikost několika centimetrů. Folikulární buňky stěny folikulu okolo oocytu se množí a vytvoří vejconosný hrbolek (cumulus oophorus), který vyzvedne oocyt na široké stopce do prostoru folikulární dutiny. Oocyt je v tomto stádiu obklopen průsvitnou vrstvou zona pellucida a několika vrstvami buněk cumulus oophorus. Vrstva buněk těsně na zona pellucida má pravidelné paprsčité uspořádání a je označena jako corrona radiata. Z původního množství asi 100 primárních folikulů, které v dané růstové vlně vstoupily do růstu, u klisny dorůstá jeden hlavní (dominantní) ovulační folikul a jeden záložní ovulační folikul. Ostatní folikuly postupně zanikají fyziologickou smrtí (apoptózou) a označujeme je jako atretické folikuly. Růst folikulu od primárního po ovulační trvá asi 3-4 vaječníkové cykly, což je asi 65-85 dnů. Zvýšením hladiny luteinizačního hormonu (LH) dojde k předovulačním změnám až k prasknutí folikulu = ovulaci. Nejprve se ztratí vazivové buňky na části stěny folikulu, která zvedá povrch vaječníku, čímž se tato stěna zeslabí. Potom se rozvolní folikulární buňky u báze vejconosného hrbolku pod oocytem. Následně prudce stoupne tlak folikulární tekutiny v dutině folikulu, až stěna folikulu praskne. Prudce se uvolní folikulární tekutina a z folikulu vytrhne a vyplaví uvolněné vajíčko do nálevky vejcovodu. Tento proces označujeme jako ovulaci. 5.2.2.1.2. Žluté tělísko (corpus luteum) - pokračující zvýšená hladina LH hormonu podnítí folikulární buňky stěny prasklého folikulu k růstu a přeměně na buňky žlutého tělíska (corpus luteum). Buňky se značně zvětší a ve své cytoplazmě ukládají tukové kapénky a žlutý lipochrom lutein. Tento útvar zcela zaplní dutinu prasklého folikulu a vyrůstá až nad povrch vaječníku, často do větší velikosti než byl ovulační folikul. Asi za 3 dny po ovulaci produkuje žluté tělísko dostatečné množství hormonu – progesteronu, který ukončí projevy říje a zamezí ovulaci dalšího folikulu. Pokud dojde k oplození vajíčka a sestupu časného embrya do dělohy, zůstává funkční žluté tělísko na vaječníku téměř celou březost = pravé (březostní) žluté tělísko (corpus luteum graviditalis). Pokud k oplození vajíčka nedojde tak 13. -14. den cyklu žluté tělísko přestane produkovat hormon progesteron a postupně zanikne = nepravé (cyklické) žluté tělísko (corpus luteum periodicum). Doroste nový ovulační folikul a cyklus se opakuje. Pokud na vaječníku zůstane funkční žluté tělísko, i když k oplození vajíčka nedošlo, tak ho označujeme jako přetrvávající (perzistující) žluté tělísko a takové se musí při rektálním vyšetření vaječníku odstranit, protože brání novým ovulacím. Občas z perzistujícího žlutého tělíska vznikne luteální cysta vaječníku. 5.2.2.1.3. Ovogeneze - představuje vznik a vývoj samičí zárodečné buňky od jejího vzniku do oplozeného vajíčka. Celý proces můžeme rozdělit na několik fází: fáze množení = zahájení a blok meiozy, fáze růstu = růst oocytu a folikulu, fáze zrání = odblokování a další průběh meiozy, aktivace vajíčka = dokončení meiozy po ovulaci, oplození vajíčka. Fáze množení – byla popsána výše s PGC. Primordiální pohlavní buňky (PGC) v zárodečném epitelu se intenzivně dělí za vzniku ovogonií, které se zanořují do stromatu kůry vaječníku. Zde za pomoci epiteliálních folikulárních buněk se formují primordiální folikuly s ovogonií jako buňkou s interfázním jádrem. Fáze zahájení meiozy a bloku meiozy – ještě během vývoje plodu (fetální období) se působením kombinace hormonů u všech ovogonií ve vaječníku plodu zahájí meiotické (redukční) dělení. Proběhne celá profáze prvního meiotického dělení až do stádia diplotene. Zde dojde k prvnímu bloku meiozy, dělení je ve všech zárodečných buňkách zastaveno, vznikne oocyt. Buňka je morfologicky stejná jako ovogonie, ale již není interfázní, je na konci první fáze dělení. Jádro oocytu proto označujeme jako zárodečný váček (germinal vesicle – GV). Tento stav přetrvává až do úplného dokončení růstu oocytu.
Fáze růstu – současně s růstem primárního folikulu roste i oocyt. Před zahájením růstu má oocyt vnitřní průměr asi 25 µm, zcela dorostlý oocyt klisny má vnitřní průměr 130-150 µm. Oocyt roste do objemu především hromaděním zásobních látek (glykogen, tukové kapénky, žloutková zrna), enzymů a dalších proteinů. Oocyt má jen malou aktivitu syntézy, většinu potřebných látek dostává téměř nebo zcela hotových z okolních folikulárních buněk přes propustné mezibuněčné spoje (gap-junction). V časně antrálním až malém antrálním folikulu (0,5-5 mm) je oocyt zcela dorostlý (fully grown). Tento oocyt získal schopnost znovuzahájit zastavenou meiozu (meiotická kompetence) a dokončit obě meiotická dělení. Fáze zrání – zcela dorostlý oocyt zareaguje na vlnu zvýšené hladiny LH hormonu v krvi odblokováním zastavené meiozy a jejím pokračováním nejprve do stádia první metafáze. Dojde k rozpadu jaderného obalu a ztrátě jadérka (germinal vesicle break down – GVBD), zformování chromozomů a jejich srovnání do metafázní figury v equatoriální rovině dělícího vřeténka. Buňka je tetraploidní = má dvě sady chromozomů a každý chromozom má dvě chromatidy. Proběhne první dělení, její anafáze, kdy v oocytu zůstane polovina chromozomů a druhá polovina chromozomů se odsune do malého pólového tělíska, které je vyloučeno z oocytu do prostoru mezi zevní cytoplazmatickou membránou oocytu a vrstvou zona pellucida (perivitelinní prostor). S vynecháním telofáze (zformování buněčného jádra), interfázního stádia buňky, vstupuje oocyt okamžitě do druhého meiotického dělení. Vytvoří se nové dělící vřeténko a chromozomy vytvoří novou metafázní figuru (druhá metafáze – M II). V tomto stádiu se meiotické dělení podruhé zablokuje – druhý blok meiozy. Vajíčko ve stádiu M II. – ovulační oocyt, je uvolněno při ovulaci z vaječníku do vejcovodu, kde čeká na příchod spermie. Fáze aktivace – uvolnění druhého bloku meiozy zajistí spermie, která při oplození pronikne přes obaly vajíčka do jeho cytoplazmy. Tomuto procesu říkáme aktivace vajíčka. Uvolní se zastavená meioza a dokončí se metafáze. V anafázi se v každém chromozomu od sebe oddělí chromatidy a putují k pólům dělícího vřeténka. Polovina chromatid zůstane ve vajíčku a polovina chromatid se přesune do druhého pólového tělíska mimo cytoplazmu vajíčka (do perivitelinního prostoru. Vznikne tak haploidní buňka = poloviční počet chromozomů a každý chromozom s jednou chromatidou. Zcela zralé vajíčko má pod zona pellucida 2-3 pólová tělíska (někdy se pólové tělísko z prvního meiotického dělení při druhém dělení také rozdělí). Z jaderného materiálu vajíčka se zformuje samičí prvojádro. 5.2.2.1.4. Oplození – proces oplození vajíčka probíhá v horní třetině vejcovodu, kam je vajíčko vyplaveno při ovulaci a kam přes dělohu musí doputovat spermie. Během cesty spermií pohlavním ústrojím klisny proběhne proces kapacitace spermií – spermie získají schopnost nalézt vajíčko a připojit se k jeho obalům (vrstvě folikulárních buněk z cumulus oophorus). Po připojení spermie na vajíčko proběhne akrozomální reakce, kdy praskne zevní akrozomální membrána a uvolní se akrozomální enzymy. Ty umožní proniknutí spermie přes obaly vajíčka až na cytoplazmatickou membránu vajíčka. Součinností vajíčka a spermie projde spermie cytoplazmatickou membránou do cytoplazmy vajíčka. Projde tam celá spermie včetně bičíku s mitochondriální spirálou. V momentu kontaktu spermie a cytoplazmy vajíčka proběhne kortikální reakce, kdy se z povrchové vrstvy kůry vajíčka uvolní kortikální granula do perivitelinního prostoru a vrstvy zona pellucida. Díky tomu se okamžitě změní biochemické složení obalů vajíčka a zamezí se průniku další spermie do vajíčka, polyspermickému oplození. V cytoplazmě vajíčka se hlavička spermie zbaví obalů a postupně se mění na samčí prvojádro. Přiblížením a splynutím samčího a samičího prvojádra vznikne jádro zygoty, která okamžitě vstoupí do prvního embryonálního dělení. Tím je proces oplození ukončen a nastupuje časný embryonální vývoj nového jedince. Syntéza nových proteinů podle genomu nového jedince však nastupuje až u 4-6 buněčného embrya, do té doby čerpá vajíčko z maternálních zásob. Pokud se v cytoplazmě vajíčka objeví více
prvojader (polyspermické oplození nebo partenogenetická aktivace vajíčka) tak vajíčko nebo časné embryo velice rychle zaniká a je vstřebáno sliznicí vejcovodu. Porovnání zrání spermie a vajíčka. Výsledkem meiotického (zracího) dělení spermatocytů jsou 4 plnohodnotné pohlavní buňky – spermie. Výsledkem meiotického zrání oocytu je jedno plnohodnotné vajíčko, připravené k oplození a dvě až tři vyloučená pólová tělíska. Pohlaví budoucího hříběte určuje hřebec, protože jeho spermie nesou rozdílné pohlavní chromozomy. Spermie nese buď X chromozom nebo Y chromozom. Vajíčko má vždy pouze X chromozom. Spojením vajíčka se spermií, která nese X chromozom vznikne jedinec s XX pohlavními chromozomy = samice. Kdežto splynutím vajíčka se spermií, která nese Y chromozom vznikne jedinec XY = samec.
5.2.2.2. Vejcovod (tuba uterina) Vejcovod tvoří začátek vývodných pohlavních cest samice. Je to úzká trubice, která se rozšířeným začátkem, nálevkou vejcovodu, přikládá k povrchu vaječníku a svým konce vstupuje do děložního rohu. Vejcovod je tedy párová trubice, která klikatě probíhá v závěsu vejcovodu (mesosalpinx) na kraniálním okraji širokých vazů děložních mezi vaječníkem a dělohou. U klisny je vejcovod dlouhý až 30 cm a široký 2-3 mm. Nálevka vejcovodu (infundibulum tubae uterinae) tvoří rozšířený začátek vejcovodu, přiložený k povrchu vaječníku, zachytává ovulované vajíčko a vede ho do lumen vejcovodu. Na dně nálevky je 2 mm široký otvor, břišní ústí, kterou komunikuje vejcovod s břišní dutinou. Na volném okraji nálevky vejcovodu jsou slizniční řasy, které vybíhají v třásně (fimbriae tubae). Následuje mírně rozšířený úsek vejcovodu, kde dochází k oplození vajíčka spermií. Po oplození je časné embryo transportováno úzkým klikatým úsekem vejcovodu až do děložního rohu. Transport vajíčka a časného embrya vejcovodem do dělohy trvá u klisny asi 5-7 dnů a embryo za tu dobu dosáhne stádia moruly. U klisny je na přechodu vejcovodu a děložního rohu vytvořena papila se svěračem, která zabraňuje případné komunikaci přes vejcovod mezi dutinou břišní a dutinou dělohy. Stěna vejcovodu je tvořena ze sliznice, svalové vrstvy a povrchového vaziva. Sliznice vystýlá vejcovod a její výška a vzhled se mění v průběhu říjivých cyklů. Plně vyvinutá sliznice vytváří vysoké rozvětvené řasy, které téměř vyplňují celý lumen vejcovodu. Na sliznici je jednovrstevný víceřadý cylindrický epitel s řasinkami, který zajišťuje pohyb vajíčka a časného embrya včetně tekutiny směrem do rohu děložního. Součástí sliznice jsou četné epiteliální žlázové buňky a slizniční žlázky. Svalová vrstva je ze dvou listů hladké svaloviny, vnější podélná a vnitřní kruhová svalovina. Na vnější povrch vejcovodu zasahuje pobřišnice (seróza), která tvoří povrchovou vrstvu vaziva.
5.2.2.3. Děloha (latinsky – uterus, řecky – metra, hystera) Děloha je dutý svalový orgán, ve kterém se z časného embrya vyvíjí nový jedinec (mládě) až do porodní zralosti. Embryonálně se zakládá stejně jako vejcovody z Müllerových vývodů prvoledvin. U hospodářských savců, včetně klisny, popisujeme na děloze děložní rohy, děložní tělo a děložní krček s děložním čípkem. Děloha je u dospělé samice na rozhraní dutiny břišní a dutiny pánevní. Děložní rohy směřují kraniálně do dutiny břišní, kdežto děložní krček směřuje v dutině pánevní kaudálně. Podle uspořádání částí dělohy popisujeme tři základní typy
dělohy. Děloha dvourohá (uterus bicornis) má dva děložní rohy, společné děložní tělo a jeden kanálek děložního krčku. Tento typ dělohy je u klisny, prasnice, samic přežvýkavců a šelem. Dalším typem je děloha dvojitá (uterus duplex), která má dva děložní rohy, dvě oddělená děložní těla a dva samostatné kanálky děložního krčku, které ústí do společné pochvy. Tento typ dělohy mají zajícovití a někteří hlodavci. Třetím typem je děloha jednoduchá (uterus simplex), která nemá děložní rohy, má pouze děložní tělo velikosti hrušky, do kterého přímo ústí vejcovody a má jeden kanálek děložního krčku. Tento typ dělohy je u primátů a u člověka. Děložní rohy (cornua uteri) jsou dva a jejich délka je různá podle druhu zvířat. Klisna má děložní rohy poměrně krátké, v rozmezí 20-25 cm u nebřezí dělohy. Rohy se od děložního těla rozbíhají směrem dopředu a do stran v kaudální části dutiny břišní a míří směrem dorzálním k vaječníkům, které jsou u kaudálního okraje ledvin. Delší (35-45 cm) a zatočené děložní rohy má kráva. Nejdelší rohy děložní má prasnice (120-140 cm) u které velmi připomínají průběh tenkého střeva, ale mají tužší konzistenci. Do děložních rohů ústí vejcovody. Děložní tělo (corpus uteri) je jednotná dutina mezi děložními rohy a děložním krčkem. U klisny je děložní tělo prostorné a dlouhé 20-25 cm, kdežto u krávy a prasnice je dlouhé pouze 3-5 cm. U klisny se hříbě většinou vyvíjí v děložním těle, kdežto u krávy a prasnice jsou mláďata v děložním rohu. Děložní rohy a tělo uzavírají děložní dutinu, která kaudálně přechází v kanálek děložního krčku. Děložní krček (cervix uteri) – je pokračováním dělohy od těla děložního k pochvě. Je to tuhý válcovitý útvar, jehož délka je u klisny 6-7 cm. Delší krček děložní má prasnice (15 cm) i kráva (10-12 cm). Středem děložního krčku prochází úzký klikatý kanálek děložního krčku (canalis cervicis), který je trvale uzavřen stahem silné vrstvy hladké svaloviny stěny děložního krčku a zátkou z čirého hustého hlenu, který kanálek zcela zaplňuje. Krček děložní musí dokonale oddělit vnitřní prostředí těla v děložní dutině od vnějšího prostředí, které zasahuje do pochvy. Děložní krček se zcela otevírá pouze při porodu, kdy je součástí porodních cest a musí jím projít hříbě. V období vrcholu říje je kanálek děložního krčku prostupný pro spermie mírným ochabnutím hladké svaloviny stěny krčku a zřídnutím hlenu zátky, který vytéká do pochvy. V této době se dá do krčku děložního zasunout inseminační pipeta. Sliznice děložního krčku vytváří u klisny vysoké podélné řasy, které do sebe zaklesnou a téměř uzavřou dutinu krčku a zbývá jen úzký rovný kanálek. U krávy a prasnice jsou vytvořeny příčné kruhové řasy sliznice. Sliznice děložního krčku obsahuje četné žlázky, které tvoří hlen a je pokryta jednovrstevným cylindrickým epitelem. Čípek děložní (portio vaginalis cervicis) je zakončení děložního krčku směrem do pochvy. Sliznice děložního čípku je paprskovitě zřasená, složená do tvaru 1-2 cm vysoké růžice. Uprostřed růžice je malá prohlubeň začátku kanálku děložního krčku. Na čípku končí děložní sliznice s cylindrickým epitelem a přechází ve sliznici poševní s vrstevnatým dlaždicovým epitelem. U klisny je čípek děložní výrazný, kdežto u prasnice je nálevkovité ústí krčku děložního bez čípku. Při kopulaci přitiskne hřebec žalud pyje na čípek děložní klisny a vstřikne sperma přímo do děložního krčku. Upevnění dělohy – zajišťuje široká duplikatura pobřišnice (mesometrium), která kaudálně tvoří široký děložní vaz (ligamentum latum uteri). Mezi oběma listy pobřišnice je ve vazivu množství snopců hladké svaloviny, cévy a nervy. Široké vazy děložní odstupují od stěny dutiny pánevní a částečně od stropu dutiny břišní. Sestupují ventromediálně a upínají se na postranní část dělohy a na menší zakřivení děložních rohů. Směrem dopředu je jako součást této duplikatury pobřišnice vytvořeno a spojeno vaječníkové okruží a okruží vejcovodu. Pobřišnice přechází plynule na povrch dělohy jako perimetrium.
5.2.2.3.1. Stavba stěny dělohy – je ze třech základních vrstev: sliznice (endometrium), svalové stěny (myometrium) a povrchového vaziva – serózy (perimetrium). Děložní sliznice (endometrium) klisny je 2-4 mm vysoká vrstva sliznice, která vytváří vysoké podélné a příčné řasy, které jsou nevyhladitelné. Má šedo-růžovou až hnědavou barvu podle fáze cyklu. Na povrchu je jednovrstevný cylindrický epitel, který přechází i na povrch sliznice děložního krčku. Vlastní list sliznice (lamina propria) má charakter retikulárního vaziva, které má v povrchové vrstvě více buněčných elementů a v hlubší vrstvě větší podíl retikulárních a kolagenních vláken s množstvím krevních a mízních cév. Do vaziva sliznice je vloženo velké množství děložních žlázek, jejichž velikost, počet a sekreční aktivita se mění podle fází děložního cyklu. Děložní žlázky (glandulae uterinae) jsou tubulózní a v rozvětvené sekreční části je vystýlá vysoký sekreční epitel. Žlázky jsou v endometriu umístěny šikmo a jsou vývrtkovitě stočené. Ve sliznici děložního krčku tyto žlázky chybí. Myometrium – střední svalová vrstva stěny dělohy. Hladká svalovina je rozdělena do dvou vrstev, mezi kterými je řídké vazivo s bohatou sítí cév a nervů. Vnitřní a silnější vrstva hladké svaloviny s kruhovou orientací svalových trámců je nejslabší na děložních rozích a nejsilnější v podobě svěračů na děložním krčku. Vnější a tenčí vrstva hladké svaloviny s podélnou orientací svalových trámců přechází plynule v kraniální části do stěny vejcovodů a v kaudální části do stěny pochvy. Během březosti klisny se s růstem plodu a plodových obalů stěna dělohy roztahuje. Svalové trámce se díky vnitřnímu retikulárnímu vazivu po sobě posouvají, až 10 x se prodlužují jednotlivé svalové buňky a tyto buňky se také intenzivně množí. Svalovina stěny dělohy musí udržet tlak a váhu celého plodu a při porodu musí svými stahy plod z dělohy vytlačit do porodních cest (je to jeden z mála případů, kdy se hladká svalovina alespoň částečně podrobuje vůli jedince). Perimetrium – je vazivová vrstva a pobřišnice na povrchu dělohy. Na vnější podélné vrstvě svaloviny je vytvořena vrstva řídkého vaziva, do kterého přecházejí trámce svalových buněk, cévy a nervy a je označována jako parametrium. Toto vazivo se vsouvá mezi dva listy pobřišnice v širokých vazech děložních. Povrch dělohy je pokryt tenkou serózou – pobřišnicí, která po stranách dělohy vytváří děložní vazy. 5.2.2.3.2. Děložní cyklus – cyklické změny na endometriu v závislosti na vaječníkovém cyklu, ovulaci a oplození vajíčka. Pravidelné děložní cykly, které jsou u klisny výrazné v připouštěcím období, můžeme rozdělit na tři fáze: proliferace, sekrece, regrese. Fáze proliferace – probíhá 18. den cyklu až 1. den následujícího pohlavního (říjového) cyklu. Dochází ke zvyšování děložní sliznice (endometria). Děložní žlázky se zvětšují, prodlužují, vývrtkovitě stáčejí a rozšiřuje se jejich lumen. Zvětšuje se krevní zásobení sliznice, mění se barva sliznice na červeno-hnědou a vazivo sliznice je prosáklé tkáňovým mokem. Může dojít k drobnému krvácení na povrch endometria. Fáze sekrece – probíhá 2. – 12. den říjivého cyklu. Děložní žlázky vylučují do děložní dutiny mléčně zakalený sekret – děložní mléko, které obsahuje glykogen, lipidy, hlenové látky a další složky. Je to živný roztok, ve kterém se koupe čerstvé embryo a přijímá živiny celým svým povrchem. Pokud došlo k oplození vajíčka a sestupu časného embrya do dělohy, tak tato fáze a sekrece děložního mléka trvá až do vzniku funkční placenty. Pokud k sestupu embrya do dělohy nedojde, tak tato fáze 12. den cyklu končí. Fáze regrese – probíhá 13. – 18. den říjivého cyklu. Zastaví se sekrece děložního mléka, omezí se krevní zásobení endometria, zmenšují se děložní žlázky a celá sliznice i s epitelem se sníží. Celé endometrium se vrací do stádia klidu. Protože nedošlo k zabřeznutí, tak se celý cyklus znovu opakuje.
Říjový (pohlavní) cyklus klisny zahrnuje časově koordinované cyklické změny vaječníků, ovulaci, změny sliznice vejcovodů, děložní cyklus, cyklické změny sliznice pochvy, vnější projevy říje včetně změn chování klisny a pachové změny, které vnímá hřebec. Říjový cyklus trvá u klisny v hlavním připouštěcím období 21 dnů a je výrazný. Mimo toto období je cyklus nevýrazný a může se prodloužit až na 26 dnů. Puberta je u mladé klisny období od prvních projevů cyklických změn do sladění všech cyklů tak, aby došlo k zabřeznutí.
5.2.2.4. Pochva (vagina) Pochva je pářící orgán samice. Je to trubice se svalovou stěnou, která je pružná a má schopnost se značně rozšířit, je to podstatná část porodních cest. Pochva kraniálně navazuje na děložní krček a kaudálně přechází v poševní předsíň. Hranici mezi pochvou a poševní předsíní tvoří panenská blána (hymen) a vyústění močové trubice. Pochva je uložena v mediální rovině pánevní dutiny mezi konečníkem, který je nad ní a močovou trubicí, která je pod ní. Pochva je na vnějším povrchu pokryta řídkým vazivem (adventitia), které ji připojuje k okolním orgánům a tkáním. Pouze v přední části u děložního krčku je kryta pobřišnicí (u klisny se v tomto místě dělá řez pro vstup do peritoneální dutiny při ovariektomii – odstranění vaječníků). Vlastní stěna pochvy je ze dvou vrstev hladké svaloviny. Vnější vrstva s podélně orientovanými trámci hladkosvalových buněk je pokračováním svaloviny dělohy a je tenká. Podstatně silnější je vnitřní kruhová vrstva hladké svaloviny, která přechází na stěnu poševní předsíně, kde vytváří kruhové svěrače. Vnitřní stěna pochvy je pokryta sliznicí, která má u klisny bledě růžovou barvu. Sliznice tvoří podélné řasy, které v kraniální části pochvy přecházejí na čípek děložní. Sliznice je bezžlázová a je pokryta vrstevnatým dlaždicovým epitelem, který ve vrcholné fázi řije rohovatí a zrohovatělé buňky se odlupují. Dutina pochvy je u mladých klisen kaudálně částečně uzavřená panenskou blánou (hymen), která je tvořena příčnou řasou sliznice do výše několika milimetrů. Je viditelná u mladé klisny do prvního připuštění, potom po ní zůstává na sliznici vazivová jizva. Poševní předsíň (vestubulum vaginae) – navazuje kaudálně za hymen na pochvu a končí stydkými pysky. Na dno poševní předsíně vyúsťuje močová trubice a stává se tak společnou cestou pohlavních i močových orgánů. U klisny je vyústění močové trubice na dně poševní předsíně bez suburetrální výdutě. Stěna poševní předsíně má velmi podobnou stavbu jako stěna pochvy. Z vnější strany je stěna tvořena vrstvou řídkého vaziva (adventitia), která připojuje orgán k okolním tkáním. Střední svalová vrstva je z hladké svaloviny a vnitřní list kruhové svaloviny spolu s přibývající příčně žíhanou svalovinou tvoří vůlí ovladatelný svěrač poševní předsíně. Sliznice na vnitřní straně poševní předsíně klisny je zbarvena rezavě hnědě s viditelnou cévní pletení. Na rozdíl od pochvy jsou v poševní předsíni vytvořeny žlázy jejichž sekret usnadňuje zasunutí pyje do pochvy při kopulaci. U klisny chybí velké předsíňové žlázy a jsou zde pouze dvě řady malých tubulózních žláz (glandulae vestibulares minores) na každé straně. Jedna řada je v laterální části stěny a druhá řada má vývody ve ventrální části předsíně. Dále jsou u klisny ve stěně poševní předsíně vytvořena ze žilného řečiště dvě plochá topořivá tělesa (bulbi vestibuli).
5.2.2.5. Zevní pohlavní orgány = ochod, vateň (vulva) – jsou tvořeny dvěma velkými stydkými pysky (labia pudendi, vulvae) s dorzální a ventrální spojkou (commissurae labiorum dorsalis et ventralis), které tak ohraničují stydkou štěrbinu (rima pudendi). U klisny na rozdíl od jiných samic dorzální spojka stydkých pysků ostrá a ventrální spojka zaoblená. Stydké pysky představují modifikovanou kožní řasu. Na povrchu jsou kryty kůží
s četnými kožními a mazovými žlázami a jemnými chloupky. Ve stydké štěrbině přechází kůže ve sliznici předsíně s vrstevnatým dlaždicovým epitelem. Uvnitř stydkých pysků je bohaté podkožní vazivo s tukovou tkání a trámci hladké svaloviny. V hloubce je příčně žíhaný sval (m. constrictor vulvae) ovládaný vůlí. U klisny jsou stydké pysky tmavě pigmentovány a to i na vnitřní straně ve stydké štěrbině. Mezi řití a stydkými pysky je úzký pruh kůže, která je pokračováním kůže z řitě na stydké pysky. V hloubce pod kůží je masa svaloviny a vaziva, která odděluje řitní kanál od poševní předsíně. Tuto část označujeme jako hráz (perineum). Poštěváček (clitoris) je u samice ve ventrální spojce stydkých pysků a má stejný základ a stavbu jako kořen a žalud pyje. Odstupuje dvěma rameny vazivového (topořivého) tělesa (crura clitoridis) od oblouku sedací kosti. Ramena se spojí a vytvoří tělo poštěváčku (corpus clitoridis), které kaudálně končí žaludem poštěváčku (glans clitoridis). Žalud proniká do poševní předsíně ve ventrální spojce stydkých pysků. Základem žaludu je topořivé těleso poštěváčku (corpus cavernosum clitoridis), které je plněno žilnou krví. U klisny má poštěváček velký a výrazný žalud, který je obklopen řasou sliznice, jež tvoří předkožku poštěváčku (preputium clitoridis).
5.2.3. Biotechnologie v reprodukci koní – Ing. Zdeněk Müller, CSc. 1. Umělé řízení pohlavního cyklu klisny – pro tento účel se nejčastěji používá hormon Prostaglandin F2 alfa nebo jeho analog. Podáním tohoto hormonu se rozruší žluté tělísko na vaječníku, přeruší se daný cyklus a nastoupí cyklus nový. Tento postup tedy může být účinný v sekreční fázi žlutého tělíska, t.j. od 5. do 12. dne po ovulaci. Na podporu ovulace v říji se používá humánní choriový gonadotropín a v poslední době se úspěšně používá equinní (koňský) chriový gonadotropín. Je možné také použít přípravky na úrovni RH gonadotropních hormonů. 2. Umělá inseminace – použití čerstvého, krátkodobě konzervovaného nebo dlouhodobě konzervovaného spermatu hřebce, které se deponuje do děložního krčku nebo do dělohy klisny v normální nebo stimulované říji. Čerstvé sperma, získané do umělé vaginy, se ihned použije pro inseminaci. Krátkodobě konzervované sperma – je sperma naředěné a uchovávané při teplotě +4oC po dobu 12 - 48 hodin. Dlouhodobě konzervované sperma – sperma naředěné a v připravených dávkách zmrazené v tekutém dusíku při teplotě -196oC. Takové sperma si uchovává oplozovací schopnost po desítky let, lze s ním obchodovat, dopravovat ho na velké vzdálenosti a dělat banky spermatu vzácných hřebců. Výhody inseminace: – několikanásobně vyšší využití nejlepších hřebců - vhodná a snadná kombinace hřebců v chovu - využití vzdálených hřebců – z jiné země nebo kontinentu 3. Transfer (přenos) embryí – vyjmutí embrya z dělohy matky a jeho přenesení do dělohy jiné klisny. Přenášet lze pouze ranná vývojová stádia (do 8 dní po ovulaci) a pohlavní cyklus dárkyně i příjemkyně embrya musí být přesně sladěn. U koní, na rozdíl od skotu, stále ještě setrvává přenos embryí v oblasti vývoje a výzkumu. U klisny se nedaří vyvolání superovulace, což představuje získání většího
počtu embryí v jednom pohlavním cyklu. Problematické je rovněž zmrazování embryía následná mikromanipulace. 4. Výhody transferu embryí u koní: - získání více potomků za jeden rok od kvalitní klisny - získání potomka od neplodné klisny (chronický zánět dělohy) - získání potomka od klisny, která je současně sportovně úspěšná - využití mladých, pohlavně nedospělých klisen jako dárkyň embryí Postup transferu embrya u klisny: a) synchronizace pohlavního cyklu dárkyně embrya a příjemkyně embrya pomocí gonadotropních hormonů a prostaglandinu b) výplach dělohy dárkyně pro získání embrya. Celá děloha se 3x-4x vypláchne speciálním roztokem c) separace embrya. Z vypláchnuté tekutiny se musí získat embryo, které má velikost 0,2-0,6 mm sedimentací a filtrací roztoku. Získaná embrya se posoudí a několikrát se opláchnou kultivačním mediem. d) vlastní přenos embrya do dělohy připravené příjemkyně. Provádí se buď chirurgickou cestou, nebo nechirurgickou cestou. Chirurgickou cestou se zavádí embryo operačně přes stěnu břišní do lumen děložního rohu. Postup je složitější, ale úspěšnější. Při nechirurgickém přenosu se embryo speciální pipetou zavádí přes krček děložní do děložního těla. Postup je jednodušší, ale méně úspěšný. e) případná konzervace embryí. Krátkodobá konzervace embrya je v kultivačním médiu, což je speciální živný roztok na buňky a buněčné suspense, kde se embryo zchladí na +4oC a uchovává 24-72 hodin. Při dlouhodobé konzervaci se embryo ve speciálním zmrazovacím médiu s přídavkem kryoprotektiv (glycerín, etylenglykol, DMSO) zmrazí v tekutém dusíku na -196oC. Tato metoda je prozatím velmi problematická a málo úspěšná. 5. Mikromanipulace na embryu koní: - dělení časného embrya – je nepohlavní rozmnožování (klonování = vytváření identických sourozenců) tím, že se časné embryo ve stádiu moruly nebo časné blastocysty rozdělí na stejné díly (maximálně 4), dokultivuje v kultivačním médiu a přenese připraveným příjemkyním do dělohy (u skotu běžné, u koní málo úspěšné). - klonování časného embrya – embryo ve stádiu 8 buněk se rozdělí na jednotlivé buňky. Každá buňka se v kultivačním médiu spojí s ooplastem (oocyt bez DNA), vloží do prázdné zona pellucida a dokultivuje do stádia vhodného pro přenos do dělohy příjemkyně. Teoreticky může vzniknout 8 identických sourozenců. Prakticky je tato metoda velmi málo účinná a dnes se již nepoužívá. - oplození oocytu in vitro (ve zkumavce) – oocyty získané před ovulací z ovulačních folikulů, nebo získané po ovulaci výplachem vejcovodů, se v kultivačním médiu smíchají se suspensí pohyblivých spermií hřebce a při tělesné teplotě kultivují 24 hodin. Vybereme oplozená vajíčka, dokultivujeme do stádia vhodného k přenosu a přeneseme do dělohy připravené příjemkyně. Praktické uplatnění v chovu koní má tato metoda velmi malé, u ostatních druhů zvířat (i u člověka) se stává běžnou. - ovlivnění pohlaví potomstva – je další biotechnologickou metodou a jsou zde dvě základní cesty: a) určení pohlaví (sexace) embrya – před přenosem embrya do dělohy příjemkyně lze určit genetické pohlaví tohoto embrya a rozhodnout se zda přenést nebo ne. Metoda je teoreticky zvládnutá, ale u embryí koní prakticky velmi problematická.
b) změna poměru pohlaví (separace spermií) – speciálními postupy se v ředěném ejakulátu hřebce oddělují spermie s X chrmozomem od spermií s Y chromozomem. Dělení spermií není absolutní, a proto se pouze ovlivňuje poměr pohlaví mláďat ve prospěch hřebečku nebo klisniček. Maximálně dosažená účinnost metody je necelých 90% hřebečků a 10% klisniček. - mikrochirurgické injekční oplození vajíčka (ICSI – intra cytoplasmic sperm injection) – pomocí mikromanipulátoru a mikroinjektoru se v kultivačním médiu vpraví jedna spermie do cytoplazmy vajíčka. Oplozené vajíčko se dokultivuje do stádia vhodného k přenosu a přenese do dělohy připravené příjemkyně (kterou může být sama dárkyně). Metoda je v asistované reprodukci lidí běžná, v reprodukci koní je ve stádiu experimentálního ověřování. - klonování přenosem jádra – je stále velmi diskutovanou metodou nepohlavního rozmnožování zvířat i když je u rostlin zcela běžná. Do ooplastu (oocyt bez DNA) se přenese jádro tělní buňky a u tohoto konstruktu se vyvolá dělení. Vznikne tak zygota s genetickým materiálem dárce tělní buňky. Dokultivované embryo se přenese do dělohy připravené příjemkyně a očekáváme narození klonovaného jedince. Metoda je velmi náročná, finančně nákladná a stále velmi málo účinná (jen několik desetin procenta). - tvorba transgenních zvířat – navazuje na klonování. Je to tvorba jedince s přidaným, nebo naopak vyblokovaným genem v jeho dědičné informaci. Metoda je velmi náročná a nákladná se v reprodukci koní zatím nepoužívá.
5.2.4. Použití biotechnologických metod v chovu čistokrevných koní je zatím omezeno i předpisy chovatelských svazů a sdružení. Jako příklad zde uvádíme „Řád plemenné knihy – česká plemenná kniha anglického plnokrevníka“, kterou vede Jockey Club ČR. V článku G – Zápis chovatelských výsledků – je v odstavci 24 uvedeno: Zápis do Plemenné knihy se provádí na základě: - připouštěcího lístku a hlášení chovatelského výsledku - identifikace hříběte - ověření původu hříběte DNA testem V odstavci 30 téhož článku je uvedeno: V plnokrevném chovu je povolena pouze přirozená plemenitba, tak jak je definována Mezinárodní dohodou o chovu a dostizích. Jestliže je potomek plnokrevné klisny produktem umělé inseminace, přenosu embrya, transplantace, klonování nebo jakékoliv jiné formy genetické manipulace, pak tento potomek nesmí být do Plemenné knihy zapsán.
