4. Lipid mikrodomének: A szerkezet és a funkció kapcsolata... 1.) Hogyan vizsgáljuk a raftok szerkezetét ? 2.) Hogyan viszgálhatjuk a raft mikrodomének funkcionális szerepét az immunválasz különböző fázisaiban ?
Hogyan elemezhetjük a mikrodomének összetételét, szerkezetét és funkcióit?
•
A fehérje és lipid komponensek detektálása: biokémiai módszerek (SGEUC + WB; proteomika2DIGE-MS; lipidomika-MS)
•
A raftok (caveolák) in situ detektálása sejteken: mikroszkópiás technikák (CLSM, SRM; FRET; 2-foton mikroszkópia) különféle markerek segítségével
•
”Loss of microdomain integrity” modellek: különféle stratégiák a plazmamembrán módosítására és a sejtfunkcióra gyakorolt hatás vizsgálatára
How the microdomains can be isolated from cells? „Chemical definition of rafts”: „DRM” Detergent-resistance: upon cold non-ionic detergent treatment (Triton X-100, Chaps, Brij, Lubrol) insoluble, „low buoyant density” (floating) mebrane fractions can be identified and isolated by SGUC Equilibrium sucrose density gradient ultracentrifugation (SGUC) 200-350.000 g / 18 hrs
sucrose 5%
DRM (LBD)
36%
40%
“SOL.”,heavy fractions”
Cell lysate Brown-, Simons-, Hoessli- groups (1982-)
SDS gel-Western blot CD25
CD48
CD71/TrfR
raft
0.1 % TritonX100 5 min., ice / 0.1% Brij, 37 0C
fluorescence Cell number
(end-point detection or kinetics)
Cell number
Flow cytometric analysis of DRM-association of proteins:
Cholesterol depletion, w. MBCD
Gombos I et al, Cytometry, 2004. 61: 117-126
Cell number
fluorescence Cytoskeletal anchoring (+/- Latrunculin B)
fluorescence
“raft” (20 nm-1 μm) „raft markerek” gangliozid (GM1,GM3)
fluorescens cholera toxin B
anti-CD48 mAb
anti-cholesterol antitest (ACHA)
“liquid ordered” (Lo) fázis pl. CD48
diIC18
GPI-protein
fluid fázis (Ld) GPI
glycerophospholipids:
PC,PE,PS…
cholesterol acilált fehérjék
(e.g. Src kinázok)
sphingomyelin
Mi az igazán jó lipid raft marker? E. Gratton et al. (Urbana-Champaign, IL)
LAURDAN (UV) és diANEPPHQ (VIS)
2-photon microscopy:
human and mouse macrophages
- nincs fejcsoport vagy zsírsav fajlagossága - uniform eloszlást mutat a fluid és a rendezett lipid fázisokban egyaránt - emissziós spektruma eltérő (shift), ha rendezett/kondenzált raft doménekben lokalizált - a GP érték független a próba lokális koncentrációjától
Generalized polarization (GP): GP = ( I(400-460)- G x I(470-530)) / ( I(400-460)+ G x I(470-530))
- 1 < GP < + 1 ‘condensed’ fluid ‘lipid packing density’
Fehérjék lokalizációja raftokban in situ CLSM-al - lipid markerek: GM1 ganglioside/labels FL-Cholera toxin B; perfringolysin/Fl-ACHA -“GPI/acyl-protein markerek” (sejtfüggő): e.g. CD48, CD55, CD59, CD14, AP, HAR, CD4, Lck, Lyn - negatív kontroll (nem-raft fehérje): transzferrin receptor (CD71)
CD25 vs. CD48 Cc: 0.67
CD25 vs.CD71 (TrfR) Cc: 0.033
(laterális feloldás korlátozott: ~ 250 nm)
GM1/CTX-B vs. CD25: Cc = 0.6
Pl: IL-2Rα (CD25) kolokalizációja a lipid raftok lipid és fehérje markereivel humán T limfóma sejteken
Microscopy-Nanoscopy? STED microscopy: a way to forget Abbe-limit
Lateral Resolution: d ~ 40-50 nm ! Will the molecular structure of rafts be resolvable?
500 nm
S. Hell & coworkers Nature 2006. 440: 935-939
A raftok funkcionális szerepének vizsgálata Koncepció: „a raftok szerkezeti integritásának megbontása” („loss of rafts” vs. „loss of specific function” ?) ● az alapvető lipid komponensek (sphingomyelin (SM), gangliozidok (GSL), vagy koleszterin (CHOL)) szintézisének, transzportjának, membrán szintjének manipulálása ● „cholesterol depletio:” reverzibilis extrakció ciklodextrinnel/irreverzibilis szegregáció komplexálás révén (Filipin)/oxidáció CHOL-oxidase enzimmel ● „deprivatio:” a sejtmembrán lipid szintek szupresszálása szintézis vagy transzport gátlók révén
Lipid raft moduláció I.: “a membrán CHOL-szint csökkentése” “cholesterol-depletio”: methyl-β-cyclodextrin (MBCD) [5-10 mM], 1520`, 37oC membrane cholesterol (30-50%), reverzibilis ! raft (GSL, SPM, GM) koleszterin MBCD Ciklikus heptasaccharide, szelektív zárványképző molekula
A membrán koleszterin szint manipulálásának egyéb lehetőségei “Laterális koleszterin szegregáció/térbeli depletio”: Pro: Igen hatékony; ágens: Filipin; Működés: 1:1 komplexet képez a koleszterinnel, mintegy „extrahálja” a lipid raftokból nagy komplexekbe membránpórusokba Kontra: erősen perturbálja a membránt: 25-50 nm átmérőjű pórusokat képez (nem előnyös ha sejtfiziológiai vizsgálatok követik) „A membrán koleszterin oxidációja cholesterol oxidase enzimmel” Az oxidált koleszterol (kolesztanon) elveszti raftofil jellegét! A raftok instabillá válnak és „feloldódnak” ... A koleszterin bioszintézis kulcsenzimének (a rate-limiting HMGcoA reductase) gátlásával is csökkenthető: Különböző statin származékokkal (pl. lovastatin, simvastatin)
Lipid raft moduláció II. UFA, PUFA diet (pl. linolénsav, DHA) (nagy térkitöltés miatt „hígítja/ destabilizálja a rendezett raftokat
exogén SMase enzim csökkenti a membrán SM szintet: destabilizálja a raftokat
raft
Fumonisin B1: gátolja a SM bioszintézisét
SM synthesis
ER
Nucleus GSL transport
L-cycloserine GSL transzportgátlás
Példa 1: Az Immunológiai szinapszis képződés gyakorisága (B sejt-T sejt konjugáció) függ az APC (B sejt) felszínén található raftok mennyiségétől APC+TH
APC CHOL-depleted +TH
80% 29% egér Th-sejt-B lymphoblast (APC) szinapszis modell CTL
B lymphoblast (JY)
humán APC (JY sejt)szinapszis modell
70 60 50 40 30 20 10 0
(n: 294)
(n: 270) (n: 394) (n: 241)
Example 2. The membrane MHC-II rafts of APCs control effieciency of antigen presentation to T cells and their activation
2PK3 MCD
Az MHC-II-lipid raft mikrodomének az APC-n szabályozzák az antigén-
specifikus T sejt válasz érzékenységi küszöbét! cholesterol
raft
MHC-II
2PK3 (APC)
100
Fluoreszcencia intenzitás
Ratio of conjugated APCs (%)
MCD
80 60 40 20 0
control
10 mM MCD
+MCD
kontroll
20 M cytochalasin D
T-sejt aktiváció, kalcium szignál 160 140
20 M P4 20 M P4 + MCD 20 M P4 + MCD 0.1 M P4 + MCD 0.1 M P4 + MCD
120 100 80 60 40 20 0
120
240
360
480
600 idő (s)
A fehérjék raft-transzlokációjának modellje: a fehérje konformáció változása módosítja a fehérje-lipid kölcsönhatásokat ( Lipid shell model of rafts: Anderson, Jacobson, Science, 2002)
Példa: Az immunsejtek antigén receptorai „raftofillé” válnak a ligandkötés hatására „nyújtott/streched fehérje konformáció”: kedveli a hosszú, telített zsírsavláncú lipideket (pl.raft/caveola lipidek: GSL, SM)
„a relaxált konformáció”: a flexibilis, telítetlen zsírsavas lipideket kedveli (pl. fluid fázis képző glycerophospholipidek: PC, PE )
Activation (e.g. MHC/p-TCR) Crosslinking (e.g.. BCR, FcεRI)
(modell) “kis (~20 nm) GPI domének” (fehérjék+lipid shell) mind a külső és a belső rétegben; instabil (τ: ~ms) kondenzált koleszterin-GSL komplex 1.
2.
Ab
3.
4. L
“core raftok” (ligand/Ab-stabilizált raftok a külső rétegben; stabil (τ: ~ s)
“szignál raftok” (a küldő és belső réteg raftjai kontaktusban) stabil (τ: ~min)
“ tutajozó fehérjék”: - GPI-horgonyzott fehérjék (EC layer) - acilált (duplán palmitoilált,miristoilált,prenylált) (IC layer) - transzmembrán fehérjék (ED, TRMD, CPD)
?
A raft mikromének szubcelluláris dinamikája - extracellular ligand - antibody - pathogen-associated ligand (long lifetime, large, stable rafts)
death, stress signals
Signal raft EXT. actin cytoskeleton
INT.
R
- lipid biosynthesis/regulation - FAS/cholesterol/SPL - PUFA
endocytosis/internalization
Miozin dynein
R
R
R
ER
microtubules
Mit tudunk a membrán mikrodoménekről? Biokémia/Biofizika “rendezett lipid fázisú” (Lo) domének
- DIG / GEM / DRM - CHOL/SM, GSL magas% - alacsony sűrűség, Triton-X100 detergens rezisztencia - mikroszkóppal detektálható fehérje és lipid (co) klaszterek - szubmikroszkópikus diffúziós barrierek (SPT)
Lipid összetétel - cholesterol - sphingomyelin, PIP2 - GSL/gangliosides (cerebrosides)
Morfológia/szövetspecificitás Caveola (caveolin +): flaskaszerű membrán invagináció - endothel sejtek - adipocyták - Izom sejtek - fibroblasztok - astrocyták, fagociták “RAFT” (caveolin -): (~ 20 nm – 1 μm) - Minden magvas sejt - Különösen magas expresszió: Leukociták, T/B sejtek, tumoros sejtek Szerkezeti fehérjék: - caveolins - flotillins - cavatellins
caveola
Funkció “Transduciszómák/ szignaloszómák” - Szignál komplexek „toborzása” - “kémiai kapcsolótáblák” - párbeszéd a jelátviteli útvonalak között - az aktivációt gátló molekulák dinamikus és időleges kizárása
Constitutive protein composition (inducible) - GPI-anchored proteins - RTKs, NRTKs - Ras-MAP kinase cascade elements - G-proteins - adaptors (e.g.LAT), NOS, PKCs, PLD - coreceptors of lymphocytes (e.g. CD4, CD19)
További fontos nyitott kérdések: Milyen
celluláris mechanizmusok kontrollálják a raftok méretét és lipid/fehérje összetételét intracelluláris transzportjuk során és a sejtek felszínén ?
Mekkora
a raft mikrodomének fehérje/lipid összetételbeli diverzitása?
Mi a mechanizmusa a külső és belső mebrán rétegben levő raftok vertikális összekapcsolódásának? Mi
az egzakt mechanizmusa a citoszkeleton dinamika vezérelte raft-összeolvadásnak (koaleszcencia)?
A membrán-váz (szkeleton) szerepe a receptor kompartmentalizációban és a jelátvitelben
