Základy moderní biologie – Přednáška 4.
Tomáš Doležal
4. Centrální dogma, rozluštění genetického kódu a zrod molekulární biologie. Od genu k proteinu - centrální dogma biologie Geny jsou zakódovány v DNA… - Jakým způsobem? - Jak se projevují? Již v roce 1902 anglický lékař Archibald Edward Garrod vyšetřoval dítě s vzácnou chorobou, která se projevuje tmavnutím moči na vzduchu (pojmenovaná alkaptonurie). V té době byla znovuobjevena Mendelova práce, která si pomalu hledala cestu i k lékařům. Garrod věděl, že rodiče dítěte byli bratranec se sestřenicí a proto přemýšlel, že by alkaptonurie mohla být vzácným recesivním dědičným onemocněním, kdy onemocní jedinec pouze pokud získá obě postižené alely genu. Takové případy jsou mnohem častější v rodinách, kde jsou si rodiče blízce příbuzní a mají tudíž větší šanci sdílet stejné alely. Garrod ovšem také správně vytušil, že postiženému dítěti zřejmě chybí nějaký enzym, který přeměňuje meziprodukty při tvorbě moči. Později zjistil, že se jedná o enzym metabolismu tyrosinu, který dioxygenuje kyselinu homogentisovou. Nadbytek kys. homogentisové při alkaptonurii se vylučuje močí, která stáním (oxidací) tmavne. Chybění tohoto enzymu se v rodině dědilo. Během dalšího desetiletí Garrod naschromáždil znalosti i o dalších dědičných metabolických poruchách a formuloval hypotézu: „jeden gen = jeden enzym“ V roce 1909 pak svoje poznatky publikoval ve svazku „Inborn Errors of Metabolism”. Sir Archibald Garrod těmito poznatky příliš předběhl dobu, ale dal tímto základ pro objasnění spojitosti mezi dědičnou informací, tedy geny, a proteiny, jako produkty této informace. Po objasnění struktury DNA v roce 1953 se konečně rozplynuly poslední pochyby o její roli jako nositelky dědičné informace. Po tomto objevu se Francis Crick začal intenzivně zajímat o biologické důsledky svého objevu a v druhé polovině 50. let se pustil do objasňování, jak se tvoří proteiny. Kolem roku 1958 dozrály myšlenky Francise Cricka v poměrně správný popis celého procesu syntézy proteinu: • • •
“messenger” RNA nese instrukce o vytvoření proteinu v cytoplazmě adaptorové molekuly (“mohou obsahovat nukleotidy”) rozpoznávají krátké sekvence v mRNA, které kódují aminokyseliny ribonukleoproteinové komplexy katalyzují poskládání jednotlivých aminokyselin v proteiny podle mRNA
Adaptorové molekuly se nakonec ukázaly být tRNA, které na základě komplementarity bazí rozeznávaly genetickou informaci v mRNA a přinášely na sobě navázané specické aminokyseliny. Proteiny se pak syntetizují na předpovězených ribonukleoproteinových komplexech, které byly nazvány ribozomy. Zbývalo rozluštit genetický kód. Hypotéza byla, že nejmenší jednotkou musí být triplet nukleotidů, který by mohl kódovat jednu aminokyselinu. Esenciálních aminokyselin bylo 20, tudíž 2 nukleotidy poskládané ze 4
Základy moderní biologie – Přednáška 4.
Tomáš Doležal
možných dávají max. 4x4=16 možných kombinací a to nestačí. Triplet dává 4x4x4=64 kombinací. Takový kód by byl degenerovaný, kdy více kombinací kóduje jednu aminokyselinu. Rozluštění genetického kódu Do začátku 60. let byl genetický kód pouhou spekulací. Až Marshall Nirenberg a Heinrich Matthaei vyvinuli metodu, jak „cracknout“ genetický kód a určit, který triplet je zodpovědný za jakou aminokyselinu. Nirenberg a Matthaei byli schopni syntetizovat řetězce mRNA s vybranými nukleotidy. Když takovýto umělý řetězec smíchali ve zkumavce se všemi ostatními ingrediencemi, potřebnými pro syntézu proteinů, byli schopni zjistit, jaký oligopeptid (řetězec aminokyselin) vzniká při jaké kombinaci nukleotidů. Během následujících 4 let spolu s dalšími vědci byli schopni rozluštit triplety pro všech 20 aminokyselin a tak v roce 1966 je znám genetický kód:
Genetickým kódem je v DNA, resp. v RNA, zakódována aminokyselinová sekvence proteinů, přičemž jedna aminokyselina je vždy kódována třemi po sobě jdoucími nukleotidy (tzv. triplet) dle výše uvedené tabulky. Protože genetický kód je degenerovaný (je více kombinací tripletů, než je aminokyselin), je většina aminokyselin kódována více než jedním tripletem (tj. více tripletů kóduje jednu stejnou aminokyselinu). Podle toho, jak jsou triplety za sebou uspořádány v kódující sekvenci, se řadí jednotlivé aminokyseliny za sebou v řetězci vznikajícího proteinu (více v panelu 3 níže). Centrální dogma bylo poprvé formulováno Francisem Crickem v roce 1958 (viz výše) a publikováno v časopise Nature v roce 1970: Central Dogma of Molecular Biology by Francis Crick (Nature 1970)
Základy moderní biologie – Přednáška 4.
PANEL 3.
Tomáš Doležal
Základy moderní biologie – Přednáška 4.
Tomáš Doležal
Zrod molekulární biologie Nyní tedy víme, jak vypadá DNA a také víme princip, jakým způsobem se v ní kóduje genetická informace. Ale jak v ní hledat konkrétní geny, jak se v ní naučit číst, naučit se s ní pracovat a analyzovat ji? Odpovědí byl bouřlivý (někdy pomalý a velmi pracný, jindy velmi rychlý) vývoj biotechnologických postupů. DNA je příliš malinká, než abychom v ní mohli číst přímým pozorováním (je možné ji vidět, ať už jako vlákno pomocí elektronové mikroskopie, nebo obrovský shluk vláken poskládaných do kompaktního chromozomu pomocí normálního světelného mikroskopu, dokonce je možné ji vidět ve velkém množství vysráženou ve zkumavce pouhým okem, ale bohužel jednotlivá písmenka seřazená pěkně za sebou v jednom vlákně DNA takto nepřečteme). Bylo třeba vyvinout nepřímé metody. Základem je získat určitou DNA v dostatečném množství, které nám umožní s ní dále pracovat (různých postupů pro různé aplikace je nepřeberně). Kromě malých bakteriálních plazmidů jsou DNA molekuly příliš dlouhé a obsahují příliš mnoho písmen, než aby se s nimi dalo snadno pracovat vcelku. Je třeba tedy DNA rozbít na menší kousky, se kterými by se již snáze pracovalo. Tyto kousky je nutné ale nějakým způsobem udržet, případně vybraný konkrétní kousek znovu namnožit. Pro tento úkol byly velmi rychle využity bakteriální buňky, které jsou pro to doslova stvořené. Některé bakterie totiž v sobě kromě své chromozomální DNA s esenciálními geny mají také malou plazmidovou DNA, se kterou lze poměrně snadno manipulovat, aniž by to bakterie poškozovalo. Především si ale mohou bakterie mezi sebou tuto plazmidovou DNA předávat procesem zvaným transformace (základ Griffithova experimentu při ustanovování DNA jako nositelky dědičné informace). Vědci se brzy naučili, že mohou kousky své DNA vložit do těchto bakteriálních plazmidů, transformovat je zpět do bakterií, kde se jim spolu s množením bakterií v kultuře namnoží i jejich vybraný kousek DNA a může zároveň být takto „uložen“ pro další práci.
Problém s tímto postupem byl v začátcích v tom, že vědci neměli kontrolu nad rozkouskováním a vkládáním úseků DNA do plazmidů. DNA byla rozbíjena mechanicky, přičemž pokaždé vznikly jinak dlouhé a v jiném
Základy moderní biologie – Přednáška 4.
Tomáš Doležal
místě naštípané úseky DNA. Průlom v biotechnologiích přinesl až objev enzymů zvaných restrikční endonukleázy, populárně také zvané molekulární nůžky. Ty umožnily vědcům (1) rozstříhat DNA v konkrétních místech („molecular scissors“) a (2) specificky spojit dva úseky DNA, ať už pocházely z jakéhokoliv zdroje („molecular paste“).V dobách, kdy svět ovládaly prokaryotické organismy, bakterie byly neustále atakovány kousky genetické informace (v podobě virů) – ty bakterie, které se uměly tomuto bránit, měly evoluční výhodu nad ostatními. Jednou ze strategií, jak se bránit virům, je rozštípat jejich nukleovou kyselinu na kousky. K tomu bakterie vyvinuly arzenál enzymů, zvaných restrikční endonukleázy, které právě toto dělají. Tyto enzymy ovšem neštěpí DNA kdekoliv, ale pouze v místech jedné konkrétní sekvence. Vlastní DNA bakterií je pak v těchto místech chráněna proti rozstřihání pomocí metylace DNA v místě rozpoznávací sekvence. Příklad štepení EcoRI restrikční endonukleázy a specifické spojení dvou různých fragmentů DNA:
Nyní jsme tedy schopni základní manipulace s DNA – její izolace, rozkouskování, uchování a dokonce jejího specifického rozstříhání a spojování cizorodých fragmentů do sebe (rekombinantní DNA). Ale pro její analýzu jí potřebujeme nějakým způsobem zviditelnit. Dvě základní metody, které nám to umožňují, jsou elektroforéza a hybridizace.
Elektroforéza Základem gelové elektroforézy je záporný elektrický náboj nukleových kyselin, v elektirckém poli tedy mohou cestovat ke kladné elektrodě - v agarozovém nebo polyakrylamidovém gelu pak můžeme rozdělit DNA fragmenty podle jejich délky (na sekvenci až na speciální aplikace v podstatě nezáleží, rozhodující je velikost fragmentu - kratší fragmenty se snáze proplétají póry gelu a putují rychleji) a následně zviditelnit barvením vláken DNA např. ethidium bromidem:
Základy moderní biologie – Přednáška 4.
Tomáš Doležal
Hybridizace Hybridizace využívá důležité vlastnosti nukleových kyselin – rádi se párují do dvou komplementárních řetězců (podstata Watsonova a Crickova objevu – dvojšroubovice DNA a párování bazí, princip exprese genetické informace – DNA se přepisuje do RNA na základě komplementarity, vazba tRNA na mRNA atd.) Zde se přímo nabízí metoda pro zviditelnění DNA na základě její sekvence – ona kýžená touha číst v DNA. Hybridizaci nukleových kyselin můžeme využít k detekci fragmentu DNA či RNA na základě jeho sekvence. K tomu je třeba si vyrobit próbu s komplementární sekvencí k hledanému fragmentu a tuto próbu naznačit (radioktivně nebo fluorescenčními barvičkami), abychom ji později mohli detekovat. Příklad detekce vybrané sekvence na chromozomu pomocí fluorescenční in situ hybridizace (FISH):
Základy moderní biologie – Přednáška 4.
Tomáš Doležal
Polymerázová řetězová reakce (Polymerase Chain Reaction - PCR) Množení vybraných úseků DNA pomocí klasických metod zaklonování fragmentů do plazmidových DNA bylo pomalé a velice náročné. Převrat přišel s objevem polymerázové řetězové reakce v roce 1983. Pomocí PCR je možné během krátké doby namnožit vybraný úsek DNA do velkého počtu kopií. Specifické určení úseku DNA zajistí tzv. primery, krátké sekvence DNA, které rozeznávají začátek a konec vybraného úseku. Primery jsou zpravidla dlouhé alespoň 18 nukleotidů, což ve většině případů zajistí, že bude specificky rozpoznána jedna unikátní oblast v celém genomu, z kterého chceme DNA množit. Pro PCR potřebujeme: 1. DNA, kterou chceme namnožit a která tedy bude sloužit jako templát 2. Primery, krátké oligonukleotidové sekvence, které na základě komplementarity vyhledají správnou sekvenci a ze kterých začne syntéza nových řetězců 3. Termostabilní DNA polymerázu (nejčastěji Taq polymeráza, izolovaná z termorezistentních bakterií Thermophillus aquaticus) 4. dATP, dGTP, dCTP a dTTP – deoxyribonukleotidtrifosfáty (souhrnně značené jako dNTP), které slouží jako stavební kameny pro syntézu nových řetězců Reakce je pak vlastně jen střídání vysokých a nízkých teplot, kdy se při 94°C rozdělí řetězce původní templátové DNA (denaturace DNA), na které pak mohou nasednout primery (při teplotách mezi 48-68°C) a z nich začne syntéza nových řetězců. Pak se znovu DNA zahřeje a vše se opakuje. Po 20-30 takovýchto cyklech máme miliony nově syntetizovaných fragmentů, které jsou ohraničeny sekvencí dvou primerů, použitých pro PCR: Princip PCR popsal již v roce 1971 Dr. Kjell Kleppe (Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG. Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases. Journal of Molecular Biology. 1971 Mar 14; 56(2): 341-61.):
Základy moderní biologie – Přednáška 4.
Tomáš Doležal
"... one would hope to obtain two structures, each containing the full length of the template strand appropriately complexed with the primer. DNA polymerase will be added to complete the process of repair replication. Two molecules of the original duplex should result. The whole cycle could be repeated, there being added every time a fresh dose of the enzyme." Nicméně o opravdovou aplikaci PCR se zasloužil až Kary B. Mullis, který v roce 1983 pracoval ve firmě Cetus Corp. a který v roce 1993 za to získal Nobelovu cenu.
